JP2012157271A

JP2012157271A - 高硫酸化コンドロイチン硫酸類の合成方法、高硫酸化コンドロイチン硫酸類、および解析用試薬

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Publication number: JP2012157271A
Application number: JP2011018629A
Authority: JP
Inventors: Nobuo Sugiura; 信夫杉浦
Original assignee: Aichi Medical University
Current assignee: Aichi Medical University
Priority date: 2011-01-31
Filing date: 2011-01-31
Publication date: 2012-08-23
Anticipated expiration: 2031-01-31
Also published as: JP5885136B2

Abstract

【課題】高硫酸化コンドロイチン硫酸類の合成方法を提供する。
【解決手段】高硫酸化コンドロイチン硫酸類の合成方法は、コンドロイチンに、硫酸基転移酵素Ｃ４ＳＴ−１を作用させ、コンドロイチン硫酸のＡ構造を形成するステップ（Ａ１）と、前記Ａ構造に、硫酸基転移酵素ＧａｌＮＡｃ４Ｓ−６ＳＴを作用させ、コンドロイチン硫酸のＥ構造を形成するステップ（Ａ２）と、前記Ｅ構造に、硫酸基転移酵素ＵＳＴを作用させ、コンドロイチン硫酸のｔｒｉＳ構造を形成するステップ（Ａ３）と、を含む。
【選択図】図２

Description

本発明は、高硫酸化コンドロイチン硫酸類の合成方法、高硫酸化コンドロイチン硫酸類、および解析用試薬に関する。

コンドロイチン硫酸（ｃｈｏｎｄｒｏｉｔｉｎｓｕｌｆａｔｅ：ＣＳ）は、アミノ糖誘導体とヘキソース誘導体の繰り返し構造を有する直鎖状の多糖体であるグリコサミノグリカン（ｇｌｙｃｏｓａｍｉｎｏｇｌｙｃａｎ）の１つである。コンドロイチン硫酸は、コアタンパク質に結合したプロテオグリカンとして動物組織に広く分布しており、動物の発生・分化・成長および再生に重要な役割を担っている。コンドロイチン硫酸は、たとえば軟骨中の主要成分として、水和力や弾性に寄与して軟骨組織形成に役立っている。また、コンドロイチン硫酸は、多様な生理活性分子との結合性を示し、生理活性分子の貯留や、安定化あるいはマスキングの役割を持ち、細胞膜受容体と協働して、シグナル伝達機構を制御している。また、コンドロイチン硫酸は、神経系においては神経細胞の軸索の伸展促進や阻害効果を示し、免疫系細胞においては顆粒に存在し、免疫物質の蓄積や放出を制御している。マラリヤ原虫やウイルスなどの感染においては、コンドロイチン硫酸は、受容体となるとともに、感染阻害効果を示すことが知られている。多くの場合、以下に述べるＤ構造やＥ構造のようなコンドロイチン硫酸が、特に高い生理活性を示すことが知られている。

コンドロイチン硫酸は、分子量数万（糖鎖数２０〜４００個）の直鎖多糖体構造を有する。この構造は、グルクロン酸（ＧｌｃＡ）とＮ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）とがβ１−３およびβ１−４で交互に結合した二糖の繰り返しを基本構造とする。コンドロイチン硫酸は、コンドロイチン（ｃｈｏｎｄｒｏｉｔｉｎ：ＣＨ）が、たとえば図１に示すような多様な硫酸基修飾を受けた物質である。

具体的には、コンドロイチン硫酸（ＣＳ）は、コンドロイチン（ｃｈｏｎｄｒｏｉｔｉｎ：ＣＨ）の二糖単位のうちＧａｌＮＡｃ残基４位が硫酸化（４Ｓ）されたＡ構造（ＣＳＡ）、ＧａｌＮＡｃ残基６位が硫酸化（６Ｓ）されたＣ構造（ＣＳＣ）、ＧｌｃＡ残基２位とＧａｌＮＡｃ残基６位の二糖単位の２カ所が硫酸化（２Ｓ，６Ｓ）されたＤ構造（ＣＳＤ）、ＧａｌＮＡｃ残基の４位と６位の２カ所が硫酸化（４Ｓ，６Ｓ）されたＥ構造（ＣＳＥ）、ＧｌｃＡ残基２位、ＧａｌＮＡｃ残基４位および６位の計３カ所が硫酸化（２Ｓ，４Ｓ，６Ｓ）されたｔｒｉＳ構造（ＣＳｔｒｉＳまたはＣｔｒｉＳ）など、様々な修飾二糖単位を含む。また、本明細書中では、Ａ構造とＣ構造が１つのポリマー中に混在した構造をＡＣ構造またはＡＣ混在構造（ＣＳＡＣ）と呼び、Ａ構造とＤ構造が１つのポリマー中に混在した構造をＡＤ構造またはＡＤ混在構造（ＣＳＡＤ）と呼び、Ｄ構造とＥ構造が１つのポリマー中に混在した構造をＤＥ構造またはＤＥ混在構造（ＣＳＤＥ）と呼ぶ。コンドロイチン硫酸は、これらの硫酸基修飾構造が組み合わさった、きわめて複雑な多糖体構造を有する。

コンドロイチンの糖鎖骨格を特異的に硫酸化する硫酸基転移酵素は、広く動物細胞が産生しており、硫酸基を修飾する糖残基の水酸基位置特異的に、それぞれ別個の酵素が存在する（非特許文献１）。ヒトでは、ＧａｌＮＡｃ残基の４位を硫酸化するコンドロイチン４硫酸基転移酵素として、Ｃ４ＳＴ−１、Ｃ４ＳＴ−２、Ｃ４ＳＴ−３の３個のアイソザイムが知られている。また、デルマタン硫酸骨格（ＧｌｃＡがＩｄｏＡにエピメリ化したもの）のＧａｌＮＡｃ残基４位を硫酸化する酵素であるＤ４ＳＴも存在する。また、ＧａｌＮＡｃ残基の６位に硫酸基を転移するコンドロイチン６硫酸基転移酵素として、ヒトではＣ６ＳＴ−１、Ｃ６ＳＴ−２の２個のアイソザイムがある。４位が硫酸化されたＧａｌＮＡｃ（４Ｓ）残基の６位に特異的に硫酸基修飾しＥ構造をつくる酵素は、ＧａｌＮＡｃ４Ｓ−６硫酸基転移酵素（ＧａｌＮＡｃ４Ｓ−６ＳＴ）と呼ばれる。ＧａｌＮＡｃ（６Ｓ）残基の非還元末端側のＧｌｃＡ残基の２位に硫酸基修飾しＤ構造をつくる酵素は、ウロン酸二硫酸基転移酵素（ＵＳＴ）と呼ばれる。

ＴｒｅｎｄｓｉｎＧｌｙｃｏｓｃｉｅｎｃｅａｎｄＧｌｙｃｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＶｏｌ．１２、Ｎｏ．６７（２０００）３０７−３１９

上述したように、Ｄ構造やＥ構造を有するコンドロイチン硫酸は、高い生理活性を有している。そのため、高頻度に硫酸化されたコンドロイチン硫酸が求められている。しかしながら、従来の硫酸化方法では、求められる程度に高度に硫酸化したコンドロイチン硫酸を合成することは困難であった。

本発明はこうした状況に鑑みてなされたものであり、その目的とするところは、高硫酸化されたコンドロイチン硫酸類を合成する技術を提供することにある。

上記課題を解決するために、本発明のある態様の高硫酸化コンドロイチン硫酸類の合成方法は、コンドロイチンに、硫酸基転移酵素Ｃ４ＳＴ−１を作用させ、コンドロイチン硫酸のＡ構造を形成するステップ（Ａ１）と、Ａ構造に、硫酸基転移酵素ＧａｌＮＡｃ４Ｓ−６ＳＴを作用させ、コンドロイチン硫酸のＥ構造を形成するステップ（Ａ２）と、Ｅ構造に、硫酸基転移酵素ＵＳＴを作用させ、コンドロイチン硫酸のｔｒｉＳ構造を形成するステップ（Ａ３）と、を含む。

この態様によると、ｔｒｉＳ構造などの高硫酸化構造を高頻度に有する高硫酸化コンドロイチン硫酸類を効率的に合成することができる。

なお、本明細書中で「コンドロイチン硫酸類」というときには、コンドロイチン硫酸およびその誘導体を意味するものとする。また、本明細書中で「高硫酸化」とは、コンドロイチン硫酸類を構成する複数の二糖単位のうち少なくとも５０％が２硫酸化（Ｄ構造、Ｅ構造、およびＤＥ構造など）または３硫酸化（ｔｒｉＳ構造）されていることを意味する。これに加えて、またはこれに代えて、「高硫酸化」とは、後述の「硫酸化度」が１００％以上であることを意味してもよい。

本発明の別の態様は、高硫酸化コンドロイチン硫酸類の合成方法である。この高硫酸化コンドロイチン硫酸類の合成方法は、コンドロイチンに、硫酸基転移酵素Ｃ４ＳＴ−１および硫酸基転移酵素Ｃ６ＳＴ−１を作用させ、１分子のコンドロイチン中にＡ構造とＣ構造とを形成するステップ（Ｂ１）と、Ｃ構造に、硫酸基転移酵素ＵＳＴを作用させ、Ｄ構造を形成するステップ（Ｂ２）と、Ｄ構造の形成後、Ａ構造に硫酸基転移酵素ＧａｌＮＡｃ４Ｓ−６ＳＴを作用させ、Ｅ構造を形成するステップ（Ｂ３）と、を含む。

この態様によると、ＤＥ構造などの高硫酸化構造を高頻度に有する高硫酸化コンドロイチン硫酸類を効率的に合成することができる。

本発明の別の態様は、高硫酸化コンドロイチン硫酸類である。この高硫酸化コンドロイチン硫酸類は、上述したいずれかの態様の高硫酸化コンドロイチン硫酸類の合成方法により合成される。

この態様によると、ｔｒｉＳ構造やＤＥ構造などを高頻度に有する高硫酸化コンドロイチン硫酸類を提供することができる。

本発明の別の態様は、解析用試薬である。この解析用試薬は、上述したいずれかの態様により合成された高硫酸化コンドロイチン硫酸類を含み、生理活性分子または細胞表面分子と、当該高硫酸化コンドロイチン硫酸類とを特異的に相互作用させる。

この態様によると、ｔｒｉＳ構造やＤＥ構造などを高頻度に有し、生理活性分子または細胞表面分子との相互作用解析に有用な解析用試薬を提供することができる。

本発明によれば、高硫酸化されたコンドロイチン硫酸類を合成することができる。

コンドロイチン硫酸類の主な二糖単位構造を示す図である。図２（Ａ）は、第１の実施の形態に係る合成方法を示す図である。図２（Ｂ）は、第２の実施の形態に係る合成方法を示す図である。

以下、本発明を実施するための形態について詳細に説明する。

本発明者は、コンドロイチン（ＣＨ）またはコンドロイチン硫酸（ＣＳ）に硫酸基転移酵素を組み合わせて段階的に反応させることで、特定の糖水酸基位置に高頻度で硫酸基が結合した高硫酸化コンドロイチン硫酸を合成できる合成方法を見出した。この合成方法により合成されたコンドロイチン硫酸は、天然には存在しない程度に高度な硫酸基修飾がなされている。また、合成されたコンドロイチン硫酸は、コンドロイチンまたはコンドロイチン硫酸を化学的に硫酸化したときのようなランダムな硫酸化は起こっていない。したがって、合成されるコンドロイチン硫酸の性質をある程度制御することが可能となる。

図２（Ａ）は、第１の実施の形態に係る合成方法を示す図である。図２（Ｂ）は、第２の実施の形態に係る合成方法を示す図である。図１、図２（Ａ）および図２（Ｂ）に基づいて、高硫酸化コンドロイチン硫酸類の合成経路を説明する。

（第１の実施の形態）
第１の実施の形態の合成方法（経路Ａ）は、ステップＡ１〜Ａ３を含む。ステップＡ１は、コンドロイチンに、硫酸基転移酵素Ｃ４ＳＴ−１を作用させ、ほぼ完全にＡ構造［ＧｌｃＡ−ＧａｌＮＡｃ（４Ｓ）］を有するコンドロイチン硫酸のＡ構造（ＣＳＡ）を形成するステップである。ステップＡ２は、ステップＡ１で形成されたＡ構造に、硫酸基転移酵素ＧａｌＮＡｃ４Ｓ−６ＳＴを作用させ、大部分がＥ構造［ＧｌｃＡ−ＧａｌＮＡｃ（４Ｓ，６Ｓ）］であるコンドロイチン硫酸のＥ構造（ＣＳＥ）を形成するステップである。ステップＡ３は、ステップＡ２で形成されたＥ構造に、硫酸基転移酵素ＵＳＴを作用させ、天然には微量にしか存在しないｔｒｉＳ構造［ＧｌｃＡ（２Ｓ）−ＧａｌＮＡｃ（４Ｓ，６Ｓ）］を含む高硫酸化ＣｔｒｉＳを形成するステップである。

経路Ａにより、二糖単位が高頻度で２硫酸化（Ｅ構造など）または３硫酸化（ｔｒｉＳ構造）された高硫酸化コンドロイチン硫酸類が得られる。得られる高硫酸化コンドロイチン硫酸類は、二糖単位のうち少なくとも５０％が２硫酸化（Ｅ構造など）または３硫酸化（ｔｒｉＳ構造）された構造を有する。また、後述の硫酸化度が１００％以上である構造を有している。

（第２の実施の形態）
第２の実施の形態の合成方法（経路Ｂ）は、ステップＢ１〜Ｂ３を含む。ステップＢ１は、コンドロイチンに、硫酸基転移酵素Ｃ４ＳＴ−１および硫酸基転移酵素Ｃ６ＳＴ−１を同時にまたは順不同で作用させ、Ａ構造［ＧｌｃＡ−ＧａｌＮＡｃ（４Ｓ）］とＣ構造［ＧｌｃＡ−ＧａｌＮＡｃ（６Ｓ）］とが１分子中に混在したＣＳＡＣを形成するステップである。ステップＢ２は、ステップＢ１で形成されたＣＳＡＣ中のＣ構造に、硫酸基転移酵素ＵＳＴを作用させ、Ｃ構造がＤ構造［ＧｌｃＡ（２Ｓ）−ＧａｌＮＡｃ（６Ｓ）］となったＣＳＡＤを形成するステップである。ステップＢ３は、Ｄ構造の形成後、ステップＢ２で形成されたＣＳＡＤ中のＡ構造に硫酸基転移酵素ＧａｌＮＡｃ４Ｓ−６ＳＴを作用させ、Ａ構造の大部分をＥ構造に変換させ、ＤＥ構造に富む高硫酸化ＣＳＤＥを形成するステップである。なお、図２（Ｂ）では、例示的に図の左側にＣＳＡ、右側にＣＳＣが並んだＣＳＡＣを示したが、ＣＳＡとＣＳＣとの並びはこれに限られない。たとえば、ＣＳＣとＣＳＡとの順序は逆であってもよい。また、ＣＳＡが連続する構造、またはＣＳＣが連続する構造を有していてもよい。ＣＳＡＤ、ＣＳＤＥについても同様である。

ステップＢ１では、ＣＨにＣ４ＳＴ−１とＣ６ＳＴ−１を同時に作用させることが好ましい。これにより、酵素量に応じた割合で１つの分子中にＡ構造とＣ構造とを有するＣＳＡＣが１つのステップで合成できる。ここで「同時に作用させる」とは、Ｃ４ＳＴ−１とＣ６ＳＴ−１とを同一の系で、少なくとも一時的に反応がオーバーラップすればよいことを意味する。つまり、Ｃ４ＳＴ−１とＣ６ＳＴ−１との作用の開始時刻および終了時刻の少なくともいずれかは、異なっていてもよい。

経路Ｂにより、二糖単位が高頻度で２硫酸化（ＤＥ構造など）された高硫酸化コンドロイチン硫酸類が得られる。得られる高硫酸化コンドロイチン硫酸類は、二糖単位のうち少なくとも５０％が２硫酸化（ＤＥ構造など）された構造を有する。また、後述の硫酸化度が１００％以上である構造を有している。

なお、第１の実施の形態および第２の実施の形態で用いる硫酸化反応前のコンドロイチン類は、市販の化学的脱硫酸化したコンドロイチンを原料として用いることが出来る。また、コンドロイチンオリゴ糖（ｏｌｉｇｏＣＨともいう）に大腸菌由来のコンドロイチンポリメラーゼ（Ｋ４ＣＰ）を作用させて合成したコンドロイチン（ＣＨ）類を用いることもできる（ステップ０）。この方法で得られたＣＨ類は任意の糖鎖長のコンドロイチンを合成することが可能なのでより好ましい。ステップ０により合成されたＣＨ類を用いることにより、経路Ａおよび経路Ｂの高硫酸化コンドロイチン硫酸類の合成を効率的に行うことができる。ただし、既に合成されたＣＨを使用できるのであれば、ステップ０は省略できる。ステップ０で使用するコンドロイチンオリゴ糖は２糖以上であれば糖鎖長に制限はないが、４糖（コンドロイチン四糖：ＣＨ４）以上のコンドロイチンオリゴ糖であることが好ましく、６糖（コンドロイチン六糖：ＣＨ６）以上のコンドロイチンオリゴ糖であることがさらに好ましい。コンドロイチンオリゴ糖は、コンドロイチンを加水分解酵素で限定分解することにより得られる。また、コンドロイチンオリゴ糖には、還元末端が標識されていてもよい。このような標識として、たとえばヘキサメチレンジアミン基（ＨＭＤＡ）、ピリジルアミン基（ＰＡ）、およびベンジルアミド基（ＡＢ）が考えられる。

まず、以下の実験例１〜８について詳細に説明する前に、各実験例および各比較実験例に共通する測定方法、硫酸化度、ＣＨの調製、および硫酸基転移酵素の調製について説明する。

（蛍光不飽和二糖分析方法）
各実験例で合成されたコンドロイチン硫酸類は、以下の方法で定量および組成分析した。合成コンドロイチン硫酸類をコンドロイチナーゼＡＢＣまたはコンドロイチナーゼＡＣＩＩ（生化学工業製）で完全に分解し、その分解物をＳｅｎｓｈｕＰＡＫＤＯＣＯＳＩＬカラム（４．６×１５０ｍｍ、センシュウ科学社製）で分離し、シアノアセトアミドを反応させるポストカラム微量蛍光二糖分析ＨＰＬＣシステム（ＴｏｙｐｄａＨ．ｅｔａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５（２０００）２２６９−２２７５）を使用して分析した。濃度既知の不飽和二糖標準品（生化学工業社製）を同時に分析し、標準品との比較から、各二糖成分の組成比を算出し、二糖成分量の合計から元のコンドロイチン硫酸の含量を算出した。

（硫酸化度）
本明細書では、硫酸化の程度を表す指標として、「硫酸化度」を規定した。コンドロイチンの二糖単位では、ＧｌｃＡ残基２位、ＧａｌＮＡｃ残基４位および６位の３か所が、硫酸化されうる。硫酸化されていない二糖単位の割合をＡ（％）、１硫酸化されている二糖単位の割合をＢ（％）、２硫酸化されている二糖単位の割合をＣ（％）、３硫酸化されている二糖単位をＤ（％）（ただし、Ａ＋Ｂ＋Ｃ＋Ｄ＝１００％）とすると、硫酸化度は以下の式１により定義される。
硫酸化度＝Ａ×０＋Ｂ×１＋Ｃ×２＋Ｄ×３（％）・・・（式１）

第１の実施の形態または第２の実施の形態に示した合成方法を用いた場合、硫酸化度は、１００％以上であることが好ましく、１２０％以上であることがより好ましく、１４０％以上であることがさらに好ましい。

（ＣＨ類の調製（ステップ０））
高硫酸化コンドロイチン硫酸類を合成するための基質として、還元末端が標識されていないコンドロイチン六糖（ＣＨ６）、還元末端ヘキサメチレンジアミン（ＨＭＤＡ）標識コンドロイチン六糖（ＣＨ６−ＨＭＤＡ）、還元末端ピリジルアミン（ＰＡ）基標識コンドロイチン六糖（ＣＨ６−ＰＡ）、還元末端ベンジルアミド（ＡＢ）基標識コンドロイチン六糖（ＣＨ６−ＡＢ）の４つをそれぞれ用いた。還元末端が標識されたｏｌｉｇｏＣＨを原料として合成されたコンドロイチン硫酸類は、後述の用途のとおり、固定化や検出に使用できる点で有用である。なお、高硫酸化コンドロイチン硫酸類を合成するための基質として、ここではコンドロイチン六糖を示したが、糖鎖長が２糖以上のコンドロイチンオリゴ糖を使用できる点は、上述の通りである。

ＣＨ６およびｏｌｉｇｏＣＨは、天然コンドロイチン硫酸を化学的に脱硫酸化したコンドロイチン（生化学工業社製）をヒツジ睾丸由来ヒアルロニダーゼ（シグマ社製）で限定分解することにより合成した（Ｎ．Ｓｕｇｉｕｒａｅｔａｌ．Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊ．Ｊ．２５（２００８）５２１−５３０）。

ＣＨ６−ＨＭＤＡは、ＣＨ６に１００倍量のＨＭＤＡと５０倍量のＮａＢＨ_３ＣＮをｐＨ５に調製した水溶液中で、７０℃で一晩（１９時間）反応させ、ゲルろ過（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ３０カラム、ＧＥヘルスケア社製）することにより合成した。

ＣＨ６−ＰＡは、ＣＨ６に１００倍量のアミノピリジンと１５倍量のＮａＢＨ_３ＣＮをｐＨ６．２に調製した水溶液中で、９０℃で一晩（２０時間）反応させ、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ３０カラムでゲルろ過精製することにより合成した（Ｎ．Ｓｕｇｉｕｒａｅｔａｌ．Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊ．Ｊ．２５（２００８）５２１−５３０）。

ＣＨ６−ＡＢは、ＣＨ６に１００倍量の２−アミノベンズアミドと２００倍量のＮａＢＨ_３ＣＮを３０％酢酸−ＤＭＳＯ混合液中で、６５℃で一晩（１６時間）反応させ、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ３０カラムでゲルろ過精製することにより合成した（Ａ．Ｋｉｎｏｓｈｉｔａｅｔａｌ．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６９（１９９９）３６７−３７８）。

ＣＨ６（０．２４ｍｇ）、ＣＨ６−ＨＭＤＡ（０．２６ｍｇ）、ＣＨ６−ＰＡ（０．２６ｍｇ）、ＣＨ６−ＡＢ（０．２７ｍｇ）をそれぞれ、大腸菌由来コンドロイチンポリメラーゼ（Ｋ４ＣＰ：Ｔ．Ｎｉｎｏｍｉｙａｅｔａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７（２００２）２１５６７−２１５７５）０．５μｇ、ＵＤＰ−ＧｌｃＡ６ｎｍｏｌ、およびＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ６ｎｍｏｌを含む５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．２，０．１５ＭＮａＣｌ，０．２ｍＭＭｎＣｌ_２水溶液３．２ｍｌ中にて、３０℃で４８時間振盪させながら反応させた。反応後、１００℃で５分間加熱して酵素を失活させ、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ３０カラムでゲルろ過精製して、ＣＨ類（ＣＨまたは還元末端標識ＣＨ）が得られた。具体的には、ＣＨ（１０ｋ）、ＣＨ（１０ｋ）−ＨＭＤＡ、ＣＨ（１０ｋ）−ＰＡ、ＣＨ（１０ｋ）−ＡＢが、それぞれ１．６ｍｇ、１．８６ｍｇ、１．５４ｍｇ、１．７２ｍｇ得られた。得られたＣＨ類の基本骨格は、分子量が約１万（１０ｋ：糖鎖数約４６個）であった。

コンドロイチン（ＣＨ）の分子量は、１万（１０ｋ）に限られず、約１０００（１ｋ）〜約１００万（１０００ｋ）であってもよい。これらの分子量は、酵素量、基質量および反応時間などにより調整することができる。

（硫酸基転移酵素の調製）
ステップＡ１およびステップＢ１にて使用する硫酸基転移酵素であるＣ４ＳＴ１（アクセッション番号：ＮＭ＿０１８７１３）、ステップＢ１にて使用するＣ６ＳＴ１（アクセッション番号：ＮＭ＿００４２７３）、ステップＡ３およびステップＢ２にて使用するＵＳＴ（アクセッション番号：ＮＭ＿００５７１５）、ステップＡ２およびステップＢ３にて使用するＧａｌＮＡｃ４Ｓ−６ＳＴ（アクセッション番号：ＮＭ＿０１５８９２）を調製した。これらの酵素は、以下のとおり、動物細胞安定発現株の培養により発現・精製したものを用いたが、他の発現系、例えば大腸菌、酵母、昆虫細胞、無細胞系で発現および精製したものを用いてもよい。また、天然物から精製した酵素を用いてもよい。

ＰＣＲの鋳型として、Ｃ４ＳＴ１用にｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ３−ＤＥＳＴ−Ｃ４ＳＴ１、Ｃ６ＳＴ１用にｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ３−ＤＥＳＴ−Ｃ６ＳＴ１、ＵＳＴ用にｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ３−ＤＥＳＴ−ＵＳＴ、ＧａｌＮＡｃ４Ｓ−６ＳＴ用にｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ３−ＤＥＳＴ−ＧａｌＮＡｃ４Ｓ−６ＳＴ（いずれも産業技術総合研究所糖鎖医工学研究センター提供）をそれぞれ使用した。これらを鋳型として、ＦＬＡＧタグを含む硫酸転移酵素遺伝子のＤＮＡフラグメントをＰＣＲで増幅した。増幅されたＤＮＡフラグメントを、ｐＩＲＥＳｐｕｒｏ発現ベクター（クロンテック社製）のＭＣＳ領域にライゲーションし、Ｃ４ＳＴ１用にｐＩＲＥＳｐｕｒｏ−ＦＬＡＧ−Ｃ４ＳＴ１、Ｃ６ＳＴ１用にｐＩＲＥＳｐｕｒｏ−ＦＬＡＧ−Ｃ６ＳＴ１、ＵＳＴ用にｐＩＲＥＳｐｕｒｏ−ＦＬＡＧ−ＵＳＴ、ＧａｌＮＡｃ４Ｓ−６ＳＴ用にｐＩＲＥＳｐｕｒｏ−ＦＬＡＧ−ＧａｌＮＡｃ４Ｓ−６ＳＴプラスミドをそれぞれ作製した。これらのプラスミドＤＮＡをＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ２０００（インビトロジェン社製）を用いて動物細胞株ＨＥＫ２９３Ｔにトランスフェクションした。継代細胞をピューロマイシンでセレクションして、各硫酸基転移酵素安定高発現株を樹立した。

Ｃ４ＳＴ１、Ｃ６ＳＴ１、ＵＳＴ、ＧａｌＮＡｃ４Ｓ−６ＳＴの安定高発現ＨＥＫ２９３Ｔ細胞株を、１０％ウシ胎児血清および５μｇ／ｍｌピューロマイシン含有ＧｌｕｔａＭａｘ−ＤＭＥＭ液体培地（インビトロジェン社製）にて３７℃で７日間培養し、培養液上清を抗ＦＬＡＧ抗体固定化樹脂（シグマ社製）カラムに通し、１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ，１５０ｍＭＮａＣｌ，５％ｇｌｙｃｅｒｏｌ，０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０，ｐＨ７．４緩衝液で洗除後、１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ，１５０ｍＭＮａＣｌ，２０％ｇｌｙｃｅｒｏｌ，２００μｇ／ｍｌＦＬＡＧｐｅｐｔｉｄｅ，ｐＨ７．４緩衝液で溶出させて、精製酵素液とした。Ｃ４ＳＴ１は９８０ｐｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｌ，Ｃ６ＳＴ１は１５８０ｐｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｌ，ＵＳＴは２８０ｐｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｌ，ＧａｌＮＡｃ４Ｓ−６ＳＴは９５０ｐｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｌの酵素液がそれぞれ得られた。

［実験例］
以下、実験例１〜４は経路Ａ、実験例５〜８は経路Ｂに関する実験例を示す。ＣＨ類として、実験例１、５ではＣＨ（１０ｋ）−ＨＭＤＡを、実験例２、６ではＣＨ（１０ｋ）を、実験例３、７ではＣＳＡＣ（１０ｋ）−ＰＡを、実験例４、８ではＣＳＡＣ（１０ｋ）−ＡＢを、それぞれ用いた。酵素液は、上述の調製により得られた酵素液を用いた。

［実験例１］
（ステップＡ１）
ＣＨ（１０ｋ）−ＨＭＤＡ０．５ｍｇを、Ｃ４ＳＴ１溶液１．８ｍｌ、３’−ホスホアデニル５’−ホスホ硫酸（ＰＡＰＳ、シグマ社製）１１．５μｍｏｌおよび２ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）を含む５０ｍＭＴｒｉＳ−ＨＣｌ，ｐＨ６．８緩衝液（３ｍｌ）に溶解させ、３７℃で２４時間反応させた。反応液をＳｕｐｅｒｄｅｘ３０カラムでゲルろ過精製することで、９８％以上のＧａｌＮＡｃ残基が４位硫酸化されたＣＳＡ（１０ｋ）−ＨＭＤＡが０．３４ｍｇ得られた。

（ステップＡ２）
得られたＣＳＡ（１０ｋ）−ＨＭＤＡ０．２ｍｇを、ＧａｌＮＡｃ４Ｓ−６ＳＴ溶液０．５２ｍｌ、ＰＡＰＳ４．６μｍｏｌおよび２ｍＭＤＴＴを含む５０ｍＭＴｒｉＳ−ＨＣｌ，ｐＨ６．８緩衝液（１ｍｌ）に溶解させ、３７℃で２４時間反応させた後、ＧａｌＮＡｃ４Ｓ−６ＳＴ０．２６ｍｌおよびＰＡＰＳ２．３μｍｏｌを追加し３７℃でさらに２４時間反応させた。反応液をＳｕｐｅｒｄｅｘ３０カラムでゲルろ過精製することで、ＧａｌＮＡｃ残基の４位と６位が共に硫酸化された二糖単位を９２．５％、４位硫酸化された二糖単位を７．５％もつＣＳＥ（１０ｋ）−ＨＭＤＡが０．２２ｍｇ得られた。

（ステップＡ３）
得られたＣＳＥ（１０ｋ）−ＨＭＤＡ０．２ｍｇを、ＵＳＴ溶液０．９５ｍｌ、ＰＡＰＳ４．６μｍｏｌおよび２ｍＭＤＴＴを含む５０ｍＭＴｒｉＳ−ＨＣｌ，ｐＨ６．８緩衝液（１．６ｍｌ）に溶解させ、３７℃で２４時間反応させた。反応液をＳｕｐｅｒｄｅｘ３０カラムでゲルろ過精製することで、ＧｌｃＡ残基の２位とＧａｌＮＡｃ残基の４位と６位が共に硫酸化された三硫酸化二糖単位を１８％、ＧａｌＮＡｃ残基の４位と６位が共に硫酸化された二糖単位を７５％、４位硫酸化された二糖単位を８％もつＣｔｒｉＳ（１０ｋ）−ＨＭＤＡが０．１４ｍｇ得られた。

実験例１では、二糖単位のうち約９２％が少なくとも２硫酸化された構造（Ｅ構造、ｔｒｉＳ構造など）を有する高硫酸化コンドロイチン硫酸類を合成することができた。この場合、硫酸化度は、０％×０＋８％×１＋７５％×２＋１８％×３＝約２１２（％）であった。

［実験例２］
（ステップＡ１）
ＣＨ（１０ｋ）０．４ｍｇを、Ｃ４ＳＴ１溶液１．６ｍｌ、ＰＡＰＳ１０μｍｏｌおよび２ｍＭＤＴＴを含む５０ｍＭＴｒｉＳ−ＨＣｌ，ｐＨ６．８緩衝液（３ｍｌ）に溶解させ、３７℃で２４時間反応させた。反応液をＳｕｐｅｒｄｅｘ３０カラムでゲルろ過精製することで、９８％以上のＧａｌＮＡｃ残基が４位硫酸化されたＣＳＡ（１０ｋ）が０．３６ｍｇ得られた。

（ステップＡ２）
得られたＣＳＡ（１０ｋ）０．１２ｍｇを、ＧａｌＮＡｃ４Ｓ−６ＳＴ溶液０．３６ｍｌ、ＰＡＰＳ３．２μｍｏｌおよび２ｍＭＤＴＴを含む５０ｍＭＴｒｉＳ−ＨＣｌ，ｐＨ６．８緩衝液（１ｍｌ）に溶解させ、３７℃で２４時間反応させた後、ＧａｌＮＡｃ４Ｓ−６ＳＴ０．１５ｍｌおよびＰＡＰＳ０．８μｍｏｌを追加し３７℃でさらに２４時間反応させた。反応液をＳｕｐｅｒｄｅｘ３０カラムでゲルろ過精製することで、ＧａｌＮＡｃ残基の４位と６位が共に硫酸化された二糖単位を８６％、４位硫酸化された二糖単位を１３％もつＣＳＥ（１０ｋ）が０．１３ｍｇ得られた。

（ステップＡ３）
得られたＣＳＥ（１０ｋ）０．００５ｍｇを、ＵＳＴ溶液０．０５ｍｌ、ＰＡＰＳ０．３μｍｏｌおよび２ｍＭＤＴＴを含む５０ｍＭＴｒｉＳ−ＨＣｌ，ｐＨ６．８緩衝液（０．１５ｍｌ）に溶解させ、３７℃で２４時間反応させた。反応液をＳｕｐｅｒｄｅｘ３０カラムでゲルろ過精製することで、ＧｌｃＡ残基の２位とＧａｌＮＡｃ残基の４位と６位が共に硫酸化された三硫酸化二糖単位を５１％、ＧａｌＮＡｃ残基の４位と６位が共に硫酸化された二糖単位を３９％、４位硫酸化された二糖単位を８％もつＣｔｒｉＳ（１０ｋ）が０．００３ｍｇ得られた。

実験例２では、二糖単位のうち約９０％が少なくとも２硫酸化された構造（Ｅ構造、ｔｒｉＳ構造など）を有する高硫酸化コンドロイチン硫酸類を合成することができた。この場合、硫酸化度は、２％×０＋８％×１＋３９％×２＋５１％×３＝約２３９（％）であった。

［実験例３］
（ステップＡ１）
ＣＨ（１０ｋ）−ＰＡ０．１ｍｇを、Ｃ４ＳＴ１溶液０．４ｍｌ、ＰＡＰＳ２．５μｍｏｌおよび２ｍＭＤＴＴを含む５０ｍＭＴｒｉＳ−ＨＣｌ，ｐＨ６．８緩衝液（１ｍｌ）に溶解させ、３７℃で２４時間反応させた。反応液をＳｕｐｅｒｄｅｘ３０カラムでゲルろ過精製することで、９８％以上のＧａｌＮＡｃ残基が４位硫酸化されたＣＳＡ（１０ｋ）−ＰＡが０．０８ｍｇ得られた。

（ステップＡ２）
得られたＣＳＡ（１０ｋ）−ＰＡ０．０３ｍｇを、ＧａｌＮＡｃ４Ｓ−６ＳＴ溶液０．０９ｍｌ、ＰＡＰＳ０．８μｍｏｌおよび２ｍＭＤＴＴを含む５０ｍＭＴｒｉＳ−ＨＣｌ，ｐＨ６．８緩衝液（０．２５ｍｌ）に溶解させ、３７℃で２４時間反応させた後、ＧａｌＮＡｃ４Ｓ−６ＳＴ０．０３ｍｌおよびＰＡＰＳ０．２μｍｏｌを追加し３７℃でさらに２４時間反応させた。反応液をＳｕｐｅｒｄｅｘ３０カラムでゲルろ過精製することで、ＧａｌＮＡｃ残基の４位と６位が共に硫酸化された二糖単位を６８％、４位硫酸化された二糖単位を２９％もつＣＳＥ（１０ｋ）−ＰＡが０．０４ｍｇ得られた。

（ステップＡ３）
得られたＣＳＥ（１０ｋ）−ＰＡ０．００５ｍｇを、ＵＳＴ溶液０．８ｍｌ、ＰＡＰＳ０．８μｍｏｌおよび２ｍＭＤＴＴを含む５０ｍＭＴｒｉＳ−ＨＣｌ，ｐＨ６．８緩衝液（１．８ｍｌ）に溶解させ、３７℃で２４時間反応させた。反応液をＳｕｐｅｒｄｅｘ３０カラムでゲルろ過精製することで、ＧｌｃＡ残基の２位とＧａｌＮＡｃ残基の４位と６位が共に硫酸化された３硫酸化二糖単位を１１％、ＧａｌＮＡｃ残基の４位と６位が共に硫酸化された二糖単位を５４％、４位硫酸化された二糖単位を２８％もつＣｔｒｉＳ（１０ｋ）−ＰＡが０．００３ｍｇ得られた。

実験例３では、二糖単位のうち約６５％が少なくとも２硫酸化された構造（Ｅ構造、ｔｒｉＳ構造など）を有する高硫酸化コンドロイチン硫酸類を合成することができた。この場合、硫酸化度は、７％×０＋２８％×１＋５４％×２＋１１％×３＝約１６９（％）であった。

［実験例４］
（ステップＡ１）
ＣＨ（１０ｋ）−ＡＢ０．１ｍｇを、Ｃ４ＳＴ１溶液０．４ｍｌ、ＰＡＰＳ２．５μｍｏｌおよび２ｍＭＤＴＴを含む５０ｍＭＴｒｉＳ−ＨＣｌ，ｐＨ６．８緩衝液（０．８ｍｌ）に溶解させ、３７℃で２４時間反応させた。反応液をＳｕｐｅｒｄｅｘ３０カラムでゲルろ過精製することで、９８％以上のＧａｌＮＡｃ残基が４位硫酸化されたＣＳＡ（１０ｋ）−ＡＢが０．０８ｍｇ得られた。

（ステップＡ２）
得られたＣＳＡ（１０ｋ）−ＡＢ０．０２ｍｇを、ＧａｌＮＡｃ４Ｓ−６ＳＴ溶液０．０６ｍｌ、ＰＡＰＳ０．５２μｍｏｌおよび２ｍＭＤＴＴを含む５０ｍＭＴｒｉＳ−ＨＣｌ，ｐＨ６．８緩衝液（０．２ｍｌ）に溶解させ、３７℃で２４時間反応させた後、ＧａｌＮＡｃ４Ｓ−６ＳＴ０．０３ｍｌおよびＰＡＰＳ０．２６μｍｏｌを追加し３７℃でさらに２４時間反応させた。反応液をＳｕｐｅｒｄｅｘ３０カラムでゲルろ過精製することで、ＧａｌＮＡｃ残基の４位と６位が共に硫酸化された二糖単位を５７％、４位硫酸化された二糖単位を４１％もつＣＳＥ（１０ｋ）−ＡＢが０．０２ｍｇ得られた。

（ステップＡ３）
得られたＣＳＥ（１０ｋ）−ＡＢ０．００１ｍｇを、ＵＳＴ溶液０．１５ｍｌ、ＰＡＰＳ０．９μｍｏｌおよび２ｍＭＤＴＴを含む５０ｍＭＴｒｉＳ−ＨＣｌ，ｐＨ６．８緩衝液（０．２ｍｌ）に溶解させ、３７℃で２４時間反応させた。反応液をＳｕｐｅｒｄｅｘ３０カラムでゲルろ過精製することで、ＧｌｃＡ残基の２位とＧａｌＮＡｃ残基の４位と６位が共に硫酸化された３硫酸化二糖単位を８％、ＧａｌＮＡｃ残基の４位と６位が共に硫酸化された二糖単位を４８％、４位硫酸化された二糖単位を４０％もつＣｔｒｉＳ（１０ｋ）−ＡＢが０．０００８ｍｇ得られた。

実験例４では、二糖単位のうち約５６％が少なくとも２硫酸化された構造（Ｅ構造、ｔｒｉＳ構造など）を有する高硫酸化コンドロイチン硫酸類を合成することができた。この場合、硫酸化度は、４％×０＋４０％×１＋４８％×２＋８％×３＝約１６０（％）であった。

［実験例５］
（ステップＢ１）
ＣＨ（１０ｋ）−ＨＭＤＡ０．３ｍｇを、Ｃ４ＳＴ１溶液０．６６ｍｌ、Ｃ６ＳＴ１溶液０．２７ｍｌ、ＰＡＰＳ６．９μｍｏｌおよび２ｍＭＤＴＴを含む５０ｍＭＴｒｉＳ−ＨＣｌ，ｐＨ６．８緩衝液（２ｍｌ）に溶解させ、３７℃で２４時間反応させた。反応液をＳｕｐｅｒｄｅｘ３０カラムでゲルろ過精製することで、ＧａｌＮＡｃ残基の４位硫酸化が４８％、６位硫酸化が５１％のＣＳＡＣ（１０ｋ）−ＨＭＤＡが０．１９ｍｇ得られた。

（ステップＢ２）
得られたＣＳＡＣ（１０ｋ）−ＨＭＤＡ０．１４ｍｇを、ＵＳＴ溶液１．１３ｍｌ、ＰＡＰＳ３．３μｍｏｌおよび２ｍＭＤＴＴを含む５０ｍＭＴｒｉＳ−ＨＣｌ，ｐＨ６．８緩衝液（２ｍｌ）に溶解させ、３７℃で２４時間反応させた後、ＵＳＴ０．５６ｍｌおよびＰＡＰＳ１．６μｍｏｌを追加し３７℃でさらに２４時間反応させた。反応液をＳｕｐｅｒｄｅｘ３０カラムでゲルろ過精製することで、ＧｌｃＡ残基の２位とＧａｌＮＡｃ残基の６位が共に硫酸化された二糖単位を４８％、４位硫酸化された二糖単位を５２％もつＣＳＡＤ（１０ｋ）−ＨＭＤＡが０．１４ｍｇ得られた。

（ステップＢ３）
得られたＣＳＡＤ（１０ｋ）−ＨＭＤＡ０．１ｍｇを、ＧａｌＮＡｃ４Ｓ−６ＳＴ溶液０．１８ｍｌ、ＰＡＰＳ２．３μｍｏｌおよび２ｍＭＤＴＴを含む５０ｍＭＴｒｉＳ−ＨＣｌ，ｐＨ６．８緩衝液（０．３ｍｌ）に溶解させ、３７℃で２４時間反応させた。反応液をＳｕｐｅｒｄｅｘ３０カラムでゲルろ過精製することで、ＧａｌＮＡｃ残基の４位と６位が共に硫酸化された二糖単位を２０％、ＧｌｃＡ残基の２位とＧａｌＮＡｃ残基の６位が共に硫酸化された二糖単位を４８％、４位硫酸化された二糖単位を３２％もつＣＳＤＥ（１０ｋ）−ＨＭＤＡが０．３２ｍｇ得られた。

実験例５では、二糖単位のうち約６８％が少なくとも２硫酸化された構造（ＤＥ混在構造など）を有する高硫酸化コンドロイチン硫酸類を合成することができた。この場合、硫酸化度は、０％×０＋３２％×１＋６８％×２＋０％×３＝約１６８（％）であった。

（参考実験１）
ＣＨ（１０ｋ）−ＨＭＤＡ０．２ｍｇを、Ｃ６ＳＴ１溶液０．６ｍｌ、ＰＡＰＳ４．６μｍｏｌおよび２ｍＭＤＴＴを含む５０ｍＭＴｒｉＳ−ＨＣｌ，ｐＨ６．８緩衝液（２ｍｌ）に溶解させ、３７℃で２４時間反応させた。反応液をＳｕｐｅｒｄｅｘ３０カラムでゲルろ過精製することで、９８％以上のＧａｌＮＡｃ残基が６位硫酸化されたＣＳＣ（１０ｋ）−ＨＭＤＡが０．１４ｍｇ得られた。実験例５のステップＢ１にかえて実験例１のステップＡ１と本参考実験１の反応とを組み合わせることにより、ＣＳＡＣ（１０ｋ）−ＨＭＤＡを合成してもよい。

［実験例６］
（ステップＢ１）
ＣＨ（１０ｋ）０．２ｍｇを、Ｃ４ＳＴ１溶液０．４４ｍｌ、Ｃ６ＳＴ１溶液０．２０ｍｌ、ＰＡＰＳ４．５μｍｏｌおよび２ｍＭＤＴＴを含む５０ｍＭＴｒｉＳ−ＨＣｌ，ｐＨ６．８緩衝液（２ｍｌ）に溶解させ、３７℃で２４時間反応させた。反応液をＳｕｐｅｒｄｅｘ３０カラムでゲルろ過精製することで、ＧａｌＮＡｃ残基の４位硫酸化が４２％、６位硫酸化が５６％のＣＳＡＣ（１０ｋ）が０．１４ｍｇ得られた。

（ステップＢ２）
得られたＣＳＡＣ（１０ｋ）０．０７ｍｇを、ＵＳＴ溶液１．１ｍｌ、ＰＡＰＳ３．２μｍｏｌおよび２ｍＭＤＴＴを含む５０ｍＭＴｒｉＳ−ＨＣｌ，ｐＨ６．８緩衝液（２ｍｌ）に溶解させ、３７℃で２４時間反応させた後、ＵＳＴ０．５５ｍｌおよびＰＡＰＳ１．６μｍｏｌを追加し３７℃でさらに２４時間反応させた。反応液をＳｕｐｅｒｄｅｘ３０カラムでゲルろ過精製することで、ＧｌｃＡ残基の２位とＧａｌＮＡｃ残基の６位が共に硫酸化された二糖単位を４２％、４位硫酸化された二糖単位を４４％、６位硫酸化された二糖単位を８％もつＣＳＡＤ（１０ｋ）が０．０４ｍｇ得られた。

（ステップＢ３）
得られたＣＳＡＤ（１０ｋ）０．００６ｍｇを、ＧａｌＮＡｃ４Ｓ−６ＳＴ溶液０．０３ｍｌ、ＰＡＰＳ０．３μｍｏｌおよび２ｍＭＤＴＴを含む５０ｍＭＴｒｉＳ−ＨＣｌ，ｐＨ６．８緩衝液（０．１５ｍｌ）に溶解させ、３７℃で２４時間反応させた。反応液をＳｕｐｅｒｄｅｘ３０カラムでゲルろ過精製することで、ＧａｌＮＡｃ残基の４位と６位が共に硫酸化された二糖単位を１９％、ＧｌｃＡ残基の２位とＧａｌＮＡｃ残基の６位が共に硫酸化された二糖単位を４４％、４位硫酸化された二糖単位を２６％、６位硫酸化された二糖単位を８％もつＣＳＤＥ（１０ｋ）が０．００７ｍｇ得られた。

実験例６では、二糖単位のうち約６３％が少なくとも２硫酸化された構造（ＤＥ混在構造など）を有する高硫酸化コンドロイチン硫酸類を合成することができた。この場合、硫酸化度は、３％×０＋３４％×１＋６３％×２＋０％×３＝約１６０（％）であった。

（参考実験２）
ＣＨ（１０ｋ）０．２ｍｇを、Ｃ６ＳＴ１溶液０．５ｍｌ、ＰＡＰＳ４．２μｍｏｌおよび２ｍＭＤＴＴを含む５０ｍＭＴｒｉＳ−ＨＣｌ，ｐＨ６．８緩衝液（２ｍｌ）に溶解させ、３７℃で２４時間反応させた。反応液をＳｕｐｅｒｄｅｘ３０カラムでゲルろ過精製することで、９８％以上のＧａｌＮＡｃ残基が６位硫酸化されたＣＳＣ（１０ｋ）が０．１５ｍｇ得られた。実験例６のステップＢ１にかえて実験例２のステップＡ１と本参考実験２の反応とを組み合わせることにより、ＣＳＡＣ（１０ｋ）を合成してもよい。

［実験例７］
（ステップＢ１）
ＣＨ（１０ｋ）−ＰＡ０．０５ｍｇを、Ｃ４ＳＴ１溶液０．１１ｍｌ、Ｃ６ＳＴ１溶液０．０５ｍｌ、ＰＡＰＳ１．１μｍｏｌおよび２ｍＭＤＴＴを含む５０ｍＭＴｒｉＳ−ＨＣｌ，ｐＨ６．８緩衝液（０．５ｍｌ）に溶解させ、３７℃で２４時間反応させた。反応液をＳｕｐｅｒｄｅｘ３０カラムでゲルろ過精製することで、ＧａｌＮＡｃ残基の４位硫酸化が３８％、６位硫酸化が６１％のＣＳＡＣ（１０ｋ）−ＰＡが０．１４ｍｇ得られた。

（ステップＢ２）
得られたＣＳＡＣ（１０ｋ）−ＰＡ０．０２ｍｇを、ＵＳＴ溶液０．３ｍｌ、ＰＡＰＳ０．９μｍｏｌおよび２ｍＭＤＴＴを含む５０ｍＭＴｒｉＳ−ＨＣｌ，ｐＨ６．８緩衝液（０．５ｍｌ）に溶解させ、３７℃で２４時間反応させた後、ＵＳＴ０．１５ｍｌおよびＰＡＰＳ０．４５μｍｏｌを追加し３７℃でさらに２４時間反応させた。反応液をＳｕｐｅｒｄｅｘ３０カラムでゲルろ過精製することで、ＧｌｃＡ残基の２位とＧａｌＮＡｃ残基の６位が共に硫酸化された二糖単位を３０％、４位硫酸化された二糖単位を３８％、６位硫酸化された二糖単位を３１％もつＣＳＡＤ（１０ｋ）−ＰＡが０．０１１ｍｇ得られた。

（ステップＢ３）
得られたＣＳＡＤ（１０ｋ）−ＰＡ０．００５ｍｇを、ＧａｌＮＡｃ４Ｓ−６ＳＴ溶液０．０２ｍｌ、ＰＡＰＳ０．２μｍｏｌおよび２ｍＭＤＴＴを含む５０ｍＭＴｒｉＳ−ＨＣｌ，ｐＨ６．８緩衝液（０．１５ｍｌ）に溶解させ、３７℃で２４時間反応させた。反応液をＳｕｐｅｒｄｅｘ３０カラムでゲルろ過精製することで、ＧａｌＮＡｃ残基の４位と６位が共に硫酸化された二糖単位を３１％、ＧｌｃＡ残基の２位とＧａｌＮＡｃ残基の６位が共に硫酸化された二糖単位を３０％、４位硫酸化された二糖単位を７％、６位硫酸化された二糖単位を２８％もつＣＳＤＥ（１０ｋ）−ＰＡが０．００５ｍｇ得られた。

実験例７では、二糖単位のうち約６１％が少なくとも２硫酸化された構造（ＤＥ混在構造など）を有する高硫酸化コンドロイチン硫酸類を合成することができた。この場合、硫酸化度は、４％×０＋３５％×１＋６１％×２＋０％×３＝約１５７（％）であった。

（参考実験３）
ＣＨ（１０ｋ）−ＰＡ０．１ｍｇを、Ｃ６ＳＴ１溶液０．２５ｍｌ、ＰＡＰＳ２．１μｍｏｌおよび２ｍＭＤＴＴを含む５０ｍＭＴｒｉＳ−ＨＣｌ，ｐＨ６．８緩衝液（１ｍｌ）に溶解させ、３７℃で２４時間反応させた。反応液をＳｕｐｅｒｄｅｘ３０カラムでゲルろ過精製することで、９８％以上のＧａｌＮＡｃ残基が６位硫酸化されたＣＳＣ（１０ｋ）−ＰＡが０．０８ｍｇ得られた。実験例７のステップＢ１にかえて実験例３のステップＡ１と本参考実験３の反応とを組み合わせることにより、ＣＳＡＣ（１０ｋ）−ＰＡを合成してもよい。

［実験例８］
（ステップＢ１）
ＣＨ（１０ｋ）−ＡＢ０．１ｍｇを、Ｃ４ＳＴ１溶液０．２２ｍｌ、Ｃ６ＳＴ１溶液０．１０ｍｌ、ＰＡＰＳ２．１μｍｏｌおよび２ｍＭＤＴＴを含む５０ｍＭＴｒｉＳ−ＨＣｌ，ｐＨ６．８緩衝液（０．８ｍｌ）に溶解させ、３７℃で２４時間反応させた。反応液をＳｕｐｅｒｄｅｘ３０カラムでゲルろ過精製することで、ＧａｌＮＡｃ残基の４位硫酸化が３９％、６位硫酸化が５９％のＣＳＡＣ（１０ｋ）−ＡＢが０．０７ｍｇ得られた。

（ステップＢ２）
得られたＣＳＡＣ（１０ｋ）−ＡＢ０．０１ｍｇを、ＵＳＴ溶液０．１５ｍｌ、ＰＡＰＳ０．５μｍｏｌおよび２ｍＭＤＴＴを含む５０ｍＭＴｒｉＳ−ＨＣｌ，ｐＨ６．８緩衝液（０．３ｍｌ）に溶解させ、３７℃で２４時間反応させた後、ＵＳＴ０．０９ｍｌおよびＰＡＰＳ０．２５μｍｏｌを追加し３７℃でさらに２４時間反応させた。反応液をＳｕｐｅｒｄｅｘ３０カラムでゲルろ過精製することで、ＧｌｃＡ残基の２位とＧａｌＮＡｃ残基の６位が共に硫酸化された二糖単位を２４％、４位硫酸化された二糖単位を３８％、６位硫酸化された二糖単位を３５％もつＣＳＡＤ（１０ｋ）−ＡＢが０．００８ｍｇ得られた。

（ステップＢ３）
得られたＣＳＡＤ（１０ｋ）−ＡＢ０．００１ｍｇを、ＧａｌＮＡｃ４Ｓ−６ＳＴ溶液０．０５ｍｌ、ＰＡＰＳ０．５μｍｏｌおよび２ｍＭＤＴＴを含む５０ｍＭＴｒｉＳ−ＨＣｌ，ｐＨ６．８緩衝液（０．１ｍｌ）に溶解させ、３７℃で２４時間反応させた。反応液をＳｕｐｅｒｄｅｘ３０カラムでゲルろ過精製することで、ＧａｌＮＡｃ残基の４位と６位が共に硫酸化された二糖単位を２６％、ＧｌｃＡ残基の２位とＧａｌＮＡｃ残基の６位が共に硫酸化された二糖単位を２４％、４位硫酸化された二糖単位を１２％、６位硫酸化された二糖単位を３４％もつＣＳＤＥ（１０ｋ）−ＡＢが０．０００７ｍｇ得られた。

実験例８では、二糖単位のうち約５０％が少なくとも２硫酸化された構造（ＤＥ混在構造など）を有する高硫酸化コンドロイチン硫酸類を合成することができた。この場合、硫酸化度は、４％×０＋４６％×１＋５０％×２＋０％×３＝約１４６（％）であった。

（参考実験４）
ＣＨ（１０ｋ）−ＡＢ０．１ｍｇを、Ｃ６ＳＴ１溶液０．２５ｍｌ、ＰＡＰＳ２．１μｍｏｌおよび２ｍＭＤＴＴを含む５０ｍＭＴｒｉＳ−ＨＣｌ，ｐＨ６．８緩衝液（０．８ｍｌ）に溶解させ、３７℃で２４時間反応させた。反応液をＳｕｐｅｒｄｅｘ３０カラムでゲルろ過精製することで、９８％以上のＧａｌＮＡｃ残基が６位硫酸化されたＣＳＣ（１０ｋ）−ＡＢが０．０８ｍｇ得られた。実験例８のステップＢ１にかえて実験例４のステップＡ１と本参考実験４の反応とを組み合わせることにより、ＣＳＡＣ（１０ｋ）−ＡＢを合成してもよい。

［比較実験例］
次に、図２に示した経路Ａおよび経路Ｂの反応に用いた３つ以上の酵素を同時に反応させた比較実験例１および比較実験例２の結果を示す。

（比較実験例１）
経路Ｂに用いる４つの酵素であるＣ４ＳＴ１、Ｃ６ＳＴ１、ＵＳＴ、ＧａｌＮＡｃ４Ｓ−６ＳＴを同時に反応させた。具体的には、ＣＨ（１０ｋ）−ＨＭＤＡ０．１ｍｇを、Ｃ４ＳＴ１溶液０．２６ｍｌ、Ｃ６ＳＴ１溶液０．０９ｍｌ、ＵＳＴ溶液０．７６ｍｌ、ＧａｌＮＡｃ４Ｓ−６ＳＴ溶液０．１８ｍｌ、ＰＡＰＳ２．３μｍｏｌおよび２ｍＭＤＴＴを含む５０ｍＭＴｒｉＳ−ＨＣｌ，ｐＨ６．８緩衝液（１．５ｍｌ）に溶解させ、３７℃で４８時間反応させた。反応液をＳｕｐｅｒｄｅｘ３０カラムでゲルろ過精製した。得られた硫酸化糖鎖は、４Ｓが６６．３％、６Ｓが１２．０％の二糖単位組成であり、２硫酸化二糖単位は合成できなかった。この場合、硫酸化度は、２１．７％×０＋７８．３％×１＋０％×２＋０％×３＝約７８．３（％）であった。

（比較実験例２）
経路Ａに用いる３つの酵素であるＣ４ＳＴ１、ＵＳＴ、ＧａｌＮＡｃ４Ｓ−６ＳＴを同時に反応させた。具体的には、ＣＨ（１０ｋ）−ＨＭＤＡ０．１ｍｇを、Ｃ４ＳＴ１溶液０．３３ｍｌ、ＵＳＴ溶液０．７６ｍｌ、ＧａｌＮＡｃ４Ｓ−６ＳＴ溶液０．１８ｍｌ、ＰＡＰＳ２．３μｍｏｌおよび２ｍＭＤＴＴを含む５０ｍＭＴｒｉＳ−ＨＣｌ，ｐＨ６．８緩衝液（１．５ｍｌ）に溶解させ、３７℃で４８時間反応させた。反応液をＳｕｐｅｒｄｅｘ３０カラムでゲルろ過精製した。得られた硫酸化糖鎖は、４Ｓが３０．５％の二糖単位組成であり、２硫酸化二糖単位および３硫酸化二糖単位は合成できなかった。この場合、硫酸化度は、６９．５％×０＋３０．５％×１＋０％×２＋０％×３＝約３０．５（％）であった。

ＣＨ（１０ｋ）−ＨＭＤＡを基質として３つ以上の酵素を同時に反応させた場合、２硫酸化二糖単位および３硫酸化二糖単位は合成できなかった。したがって、高硫酸化コンドロイチン硫酸類を合成するためには、図２の経路Ａまたは経路Ｂの順序で反応を行う必要があることが明らかとなった。なお、経路ＢのステップＢ１においてのみ複数の酵素（Ｃ４ＳＴ１とＣ６ＳＴ１）を同時に反応させても合成効率を維持できる。

次に、図２の経路ＢのステップＢ２において、ＣＳＡが存在しない状況下でＣＳＣからＣＳＤへの合成反応が進むかどうかを検討した結果を比較実験例３として示す。

（比較実験例３）
実験例５のステップＢ１で得られたＣＳＣ（１０ｋ）−ＨＭＤＡ０．１ｍｇを、ＵＳＴ溶液０．７６ｍｌ、ＰＡＰＳ２．３μｍｏｌおよび２ｍＭＤＴＴを含む５０ｍＭＴｒｉＳ−ＨＣｌ，ｐＨ６．８緩衝液（１．５ｍｌ）に溶解させ、３７℃で２４時間反応させた後、ＵＳＴ０．３８ｍｌおよびＰＡＰＳ１．１μｍｏｌを追加し３７℃でさらに２４時間反応させた。反応液をＳｕｐｅｒｄｅｘ３０カラムでゲルろ過精製した。得られた硫酸化糖鎖は、ＧｌｃＡ残基の２位とＧａｌＮＡｃ残基の６位がいずれも硫酸化された二糖単位（Ｄ構造）が４％であり、６位硫酸化された二糖単位が９４％残ったものであった。

ＣＳＡが存在しない状況下では、ＣＳＣ（１０ｋ）−ＨＭＤＡからＣＳＤ（１０ｋ）−ＨＭＤＡへの合成効率は著しく低下した。このことから、ＣＳＤ（１０ｋ）−ＨＭＤＡを効率よく合成するためには、ＣＳＣ構造に加えてＣＳＡ構造が同一分子中に存在する必要があることが明らかとなった。

以上、説明したように、いずれの基質の場合も、経路ＡでＣｔｒｉＳ、経路ＢでＣＳＤＥを、いずれも高収率で合成することができた。一方、これらの経路を経ない場合（３つ以上の酵素を同時に反応させた場合）には、高硫酸化コンドロイチン硫酸類を合成することはできなかった。なお、各反応に使用する基質の量を増やした場合、経路ＡのＣｔｒｉＳ、経路ＢのＣＳＤＥとも、さらに合成効率を向上させることができると考えられる。

（用途）
本発明に係る合成方法により合成された高硫酸化コンドロイチン硫酸類は、たとえば以下の用途に使用することができる。

本発明の合成方法により合成された高硫酸化コンドロイチン硫酸類は、糖鎖と特異的に作用する生理活性分子との相互作用解析などの機能性研究試薬に利用することができる。

本発明の合成方法（実験例１）により合成された還元末端ＨＭＤＡ修飾体は、活性エステルやエポキシなどで活性化したプレートやチップなどの担体に共有結合で固定化することができる。そのため、本発明の合成方法により合成された還元末端がＨＭＤＡで修飾された高硫酸化コンドロイチン硫酸類は、各種生理活性分子などや細胞表面分子との親和性解析（分子間相互作用解析）に有用である。

本発明の合成方法により合成された高硫酸化コンドロイチン硫酸類は、還元末端をＰＡやＡＢで修飾した場合（ＰＡ修飾：実験例３、ＡＢ修飾：実験例４）、蛍光で検出できる。そのため、本発明の合成方法により合成された還元末端がＰＡやＡＢで修飾された高硫酸化コンドロイチン硫酸を、１ｐｍｏｌ以下の極めて微量使用する場合にも、当該高硫酸化コンドロイチン硫酸をトレース可能である。

以上、本発明を上述の実施の形態や実験例を参照して説明したが、本発明は上述の実施の形態や実験例に限定されるものではなく、実施の形態や実験例の構成を適宜組み合わせたものや置換したものについても本発明に含まれるものである。また、当業者の知識に基づいて実施の形態や実験例における組合せや工程の順番を適宜組み替えることや各種の設計変更等の変形を実施の形態に対して加えることも可能であり、そのような変形が加えられた実施の形態や各実験例も本発明の範囲に含まれうる。

Claims

コンドロイチンに、硫酸基転移酵素Ｃ４ＳＴ−１を作用させ、コンドロイチン硫酸のＡ構造を形成するステップ（Ａ１）と、
前記Ａ構造に、硫酸基転移酵素ＧａｌＮＡｃ４Ｓ−６ＳＴを作用させ、コンドロイチン硫酸のＥ構造を形成するステップ（Ａ２）と、
前記Ｅ構造に、硫酸基転移酵素ＵＳＴを作用させ、コンドロイチン硫酸のｔｒｉＳ構造を形成するステップ（Ａ３）と、を含む高硫酸化コンドロイチン硫酸類の合成方法。
コンドロイチンに、硫酸基転移酵素Ｃ４ＳＴ−１および硫酸基転移酵素Ｃ６ＳＴ−１を作用させ、１分子のコンドロイチン中にＡ構造とＣ構造とを形成するステップ（Ｂ１）と、
前記Ｃ構造に、硫酸基転移酵素ＵＳＴを作用させ、Ｄ構造を形成するステップ（Ｂ２）と、
前記Ｄ構造の形成後、前記Ａ構造に硫酸基転移酵素ＧａｌＮＡｃ４Ｓ−６ＳＴを作用させ、Ｅ構造を形成するステップ（Ｂ３）と、を含む高硫酸化コンドロイチン硫酸類の合成方法。
前記硫酸基転移酵素Ｃ４ＳＴ−１および前記硫酸基転移酵素Ｃ６ＳＴ−１を同時に作用させることにより、前記Ａ構造と前記Ｃ構造とを形成する請求項２に記載の合成方法。
前記高硫酸化コンドロイチン硫酸類を構成する複数の二糖単位のうち、少なくとも５０％が２硫酸化または３硫酸化されている請求項１〜３のいずれか１項に記載の合成方法。
前記高硫酸化コンドロイチン硫酸類は、硫酸化度が１００％以上である請求項１〜４のいずれか１項に記載の合成方法。
コンドロイチンオリゴ糖にコンドロイチンポリメラーゼを作用させることにより、前記コンドロイチンを合成するステップをさらに含む請求項１〜５のいずれか１項に記載の合成方法。
請求項１〜６のいずれか１項の合成方法により合成された高硫酸化コンドロイチン硫酸類。
請求項７に記載の高硫酸化コンドロイチン硫酸類を含み、生理活性分子または細胞表面分子と、当該高硫酸化コンドロイチン硫酸類とを特異的に相互作用させるための解析用試薬。
前記高硫酸化コンドロイチン硫酸類は、担体固定化用の末端修飾基が付加されている請求項８の解析用試薬。
前記高硫酸化コンドロイチン硫酸類は、蛍光検出用の末端修飾基が付加されている請求項８の解析用試薬。