WO2002088186A1 - Anti-cd40 monoclonal antibody - Google Patents

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WO2002088186A1
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Toshifumi Mikayama
Hitoshi Yoshida
Walker R Force
Xingjie Chen
Nobuaki Takahashi
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Kirin Beer Kabushiki Kaisha
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Definitions

  • the present invention relates to an antibody or a functional fragment thereof that recognizes the human CD40 antigen present on the surface of human B cells, dendritic cells (DC), and the like. Specifically, the present invention relates to an anti-human CD40 antibody or a functional fragment thereof which is substantially agonistic against human CD40 antigen on the surface of dendritic cells (DC), and a conventional anti-human CD40 antibody. The present invention relates to an agonistic anti-human CD40 antibody or a functional fragment thereof, which is expected to have a higher therapeutic effect as compared with the above. '' Background technology
  • CD40 is a 50 kDa molecular weight antigen present on the surface of cell membranes and is expressed on B cells, dendritic cells (DCs), certain cancer cells, and thymic epithelial cells. CD40 is known to play an important role in the proliferation and differentiation of B cells and DCs. CD40 has been identified as an antigen expressed on the surface of human B cells (EA Clark et. Al., Pro Natl. Acad. Sci. USA 83: 4494, 1986, I. Stamenkovic et. Al., EMBO J.
  • CD40 is considered to be a member of the TNF receptor family to which low-affinity NGF receptors, TNF receptors, CD27, 0X40, and CD30 belong. ing.
  • the ligand for human and mouse CD40 (CD40L) has recently been cloned and found to be a type I membrane protein and expressed on activated CD4 + T cells. CD40L has also been shown to introduce strong activation signals into human and mouse B cells.
  • dendritic cells have been shown to express CD40 more than B cells, and it has become clear that they play an important role.
  • CD40 binds to CD40L, it activates antigen presenting cells (APCs), that is, enhances the expression of costimulatory molecules such as CD80 (B7-1) and CD86 ( ⁇ 7-2), or the production of IL-12 (Caux, C., et al .: Act ivat ion of human dendritic cells through CD40 cross-linking. J. Exp. Med., 180: 1263, 1994), (Shu, U., et al .: Activated T cells induce interleukin-12 production by monocyte via CD40-CD40 ligand interaction. Eur.
  • Dendritic cells have strong antigen-presenting ability and strong helper T (T) cell activating ability. It is also believed that dendritic cells control the differentiation of naive Th cells into Till or Th2 cells.
  • Dendritic cells (DC1) obtained by culturing peripheral blood monocytes, which are myeloid dendritic cells, with GM-CSF and IL-4 and matured with CD40L have the ability to produce IL-12 in vitro. Stimulates and activates naive Th cells and induces IFNr-producing T cells (ie, promotes Thl differentiation). Since this action is inhibited by the anti-IL-12 antibody, it is considered to be a reaction mediated by IL-12.
  • lymphoid dendritic cells obtained by culturing lymphoid tissue T regions or plasmacytoid T cells present in peripheral blood with IL_3 and CD40 ligand do not have the ability to produce IL-12, and allogeneic naive Tli It has been shown to stimulate and activate cells, induce IL-4 producing T cells, and promote Th2 differentiation.
  • TM cells are involved in the activation of cell-mediated immunity, and Th2 cells are thought to enhance humoral immunity and simultaneously play a role in suppressing cell-mediated immunity.
  • Cytotoxic T cells (CTL) activated with the help of TM cells can remove cytoplasm-growing pathogens (such as many viruses, Listeria, Mycobacterium tuberculosis, and Toxoplasma gondii) and tumor cells .
  • Anti-CD40 monoclonal antibodies that recognize CD40 expressed on the membrane surface show various biological activities against B cells.
  • Anti-CD40 monoclonal antibodies are roughly classified into those that are agonistic for the interaction between CD40 and CD40L and those that are antagonistic.
  • Activation of B cells is known as an action of agonistic antibodies.
  • anti-CM0 antibodies induce cell adhesion (Barrett et al., J. Immunol. 146: 1722, 1991; Gordon et al., J. Immunol. 140: 1425, 1988), increase cell size (Gordon et al., J. I Thigh leakage 1140: 1425, 1988; Valle et al., Eur. J. Immunol. 19: 1463, 1989), only with anti-IgM antibody, anti-CD20 antibody or phorbol ester activation Induced B cell division (Clark and Ledbetter, Proc. Natl. Acad. Sci.
  • a B cell clone can be established from human primary cultured B cells (Bancherau et al., Science 241: 70, 1991), it has been reported that apoptosis of germinal center central cells is inhibited via CD40 regardless of the function of antigen receptor Yuichi (Liu et al., Nature 342: 929, 1989). .
  • CD40 was identified as an antigen expressed on the surface of human B cells, many of the isolated antibodies mainly have the function of inducing proliferation and differentiation of human B cells and inducing cell death in cancer cells. Oxford University Press. Oxford, WC Flansow et.
  • Anti-CD40 antibodies have been shown to mature DCs (ZH Zhouet. Al., Hybridoma, 18: 471 1999). Furthermore, it has been reported that the role of CD4 T cells in antigen-specific CD8 T cell priming lies in the activation of DCs through CD40-CD40L signaling, and the activation of dendritic cells (DCs) by anti-CD40 monoclonal antibody (mAb). (Shoenberger, SP, et. Al .: T-cell help for cytotoxic T lymphocytes is mediated by C interac t ions. Nature, 480, 1998).
  • an anti-CD40 antibody can protect the living body from not only tumor cells expressing CD'40 but also non-expressing tumor cells in mice (French, RR, et. Al .: CD40).
  • ant ibody evokes a cytotoxic T-cell response that erad icates 1 Sir tioma and bypasses T cel l lp. Nature Medicine, 5, 1999).
  • anti-CD40 antibodies or ligands can suppress the growth of lymphoma cell lines expressing CD40 and induce cell death (Funakoshi S et al., Blood, 83: 2782, 1994), (Funakoshi S et al., Journal of I Marauding Therapy, 19, 93, 1996),
  • agonistic antibodies are those of CD40L.
  • the activating effect on B cells and the inhibitory effect on proliferation of B cell tumors do not always match. It is desirable to develop antibodies that have both DC activating ability and tumor cell growth inhibitory action.
  • some agonistic antibodies may or may not inhibit the binding of CD40L to CD40 (Chal la A et al., Allergy, 54: 576, 1999). For example, since the antibody produced by G28-5 (ATCC No.
  • HB-9110 competes with CM0L, it has no effect in combination with CD40L.
  • the degree of activation of CM0 expressing cells varies depending on the antibody. Even an antibody that shows weak agonistic activity by itself may be significantly more active in the presence of the antibody than the activity of the CD40 ligand alone when used in combination with the CD40 ligand. Conversely, even antibodies that exhibit agonistic activity by themselves, by inhibiting CD40 ligand, have a lower activity in the presence of antibody than CD40 ligand alone. (Pound et al., International Immunology, 11:11, 1999).
  • Antibodies that do not compete with CD40 ligand have been shown to be able to suppress tumor cell proliferation by themselves, but to inhibit proliferation in the presence of CD40 ligand (Joseph A etal., Cancer Research, 60: 3225). , 2000). For this reason, it is desirable to develop an antibody that binds to CD40 and suppresses cell proliferation by itself, but does not inhibit the binding of CD40 ligand to CD40.
  • therapeutic agents that are more effective than soluble CD40L.
  • soluble CD40L binds and activates CD40, but at the same time suppresses the function of CD40L that exists in vivo. This does not occur if the antibody does not compete with CD40L, and a better therapeutic effect can be expected due to the synergistic effect.
  • CD40 plays an important role in the immune response as described above, by inhibiting the binding of CD40 and its ligand, a drug for immunosuppression during organ transplantation and a therapeutic drug for autoimmune diseases is developed. It is expected to be possible. Sawada-Hase and colleagues report that monocytes in peripheral blood of patients with Crohn's disease have an increased percentage of cells that strongly express CD40. However, an antibody that inhibits the binding of CD40 to its ligand is not well understood. Such inhibitory antibodies may be useful, for example, for functional analysis of CD40 and for treatment of diseases that require CD40 activation.
  • an inhibitory antibody against CD40 ligand may be effective as a disease drug involving the binding of CD40 to CD40 ligand.
  • CD40L is expressed on activated platelets (V. Henn et. Al., Nature 391: 591, 1998), and there is a risk of thrombosis when using anti-CD40L antibodies as therapeutic agents. It has been reported to exist (T. Kawai et. Al., Nat. Medi. 6: 114, 2000). From such a viewpoint, it can be expected that an antibody against CD40 rather than an anti-CD40L antibody will be superior in safety as an antibody therapeutic agent that inhibits the binding between CD40 and its ligand.
  • the anti-CD40 antibody is required to suppress the binding of CD40L to CD40 and not to activate CD40 by itself.
  • the present inventor has used an antibody (M2) against a tag (FLAG), which has been previously engineered to a soluble ligand, to enhance the action of a soluble CD40 ligand on a B cell line (Ramos cell) and neutralize the effect.
  • FLAG a tag
  • 5D12 ATCC No. HB-11339
  • the present inventor has newly found that the antagonist antibody 5D12 has agonist activity by cross-linking alone, even in the absence of CD40L.
  • the action of the mouse CD40 antibody is enhanced by cross-linking of biotin and avidin (Johnson et al., Eur JI thigh unol, 24,: 1835, 1994).
  • immobilization of CD40 antibody using an anti-immunoglobulin antibody immobilized on a plate increases tumor cell growth inhibitory activity. was considered to be an effect.
  • an anti-antagonistic antibody could exhibit agonistic activity by adding an anti-immunoglobulin antibody to a culture solution and crosslinking the anti-CD40 antibody.
  • the antibody used for therapy has antigenicity
  • antibodies that bind to the CD40 antibody will be generated in the human body, and cross-linking of the CD40 antibody will produce an activity like a CD40 ligand. Is done. Therefore, it is very important to keep the antigenicity of the antibody low from the viewpoint of the safety of the drug.
  • a humanized antibody is developed as a therapeutic drug based on the sequence of the variable region of a mouse antibody, it is known that the humanized antibody has immunogenicity. It may be possible, and there is a risk of becoming an agonistic antibody. Even if the antigenicity is low, the anti-CD40 antibody may be cross-linked by the antibody receptor (FcR).
  • FcR antibody receptor
  • angiogonistic antibodies specifically bind to CD40 and inhibit CD40L binding.
  • a human antibody that inhibits and does not activate CD40 even by cross-linking, and that has weak binding to FcR would be desirable. .
  • the present invention provides an anti-human anti-human antibody that is substantially angiotensive against human CD40 antigen on the surface of dendritic cells (DC) by employing an evaluation system using DC cells.
  • DC dendritic cells
  • the present inventors have conducted intensive studies on the production of an antibody against human CD40, and as a result, a novel agonistic antibody that is considered to have a higher therapeutic effect on diseases than conventionally known anti-CD40 antibodies, and The present invention was successfully completed by successfully producing an gonistic antibody. That is, the present invention is as follows. ,
  • (b) has an activity on dendritic cells to mature the dendritic cells higher than the G28-5 antibody
  • the antibody or the functional fragment thereof of the present invention is one in which maturation of dendritic cells is performed at a concentration of 20 xg / ml or less.
  • the promotion of CD95 expression in B cell established cell lines is performed at an antibody concentration of 20 g / ml or less.
  • B cell established cell lines include, for example, amos or HS-Sulton.
  • the antibody of the present invention or a functional fragment thereof is added to dendritic cells having a concentration of lxlO 6 cells / ml and an antibody having a concentration of 0.1 l ⁇ g / ml or more is added, 100 pg / g / ml or more, and when a concentration of 1 g / ml or more of the antibody is added, 1000 g / ml or more, preferably 10,000 g / ml or more of IL-12 is produced. It is.
  • the above-described antibody or a functional fragment thereof of the present invention can enhance the expression of CD95 on B cell-established cell lines (Ramos cells) at an antibody concentration of 0.0 Og / nil to 10 ig / ml. It is about 2 to 3 times or more that of the control G28-5 antibody. For example, at an antibody concentration of 0.1 Ol g / nil, it is about 2 to 6 times more than that of the control G28-5 antibody, and at an antibody concentration of 0.1 lg / ml, it is about 2 times that of the control G28-5 antibody.
  • control G28- It is about 2 to 6 times more than 5 antibodies.
  • Hypridoma KM302-1 (Accession number FERMBP-7578), M341-1-19 (Accession number FERM BP-7759), 2105 (Accession number FERM BP-8024) or Flot 102 (Accession number ATCC PTA-3337) ).
  • An antibody or a functional fragment thereof having the amino acid sequences of the heavy chain variable region and light chain variable region of the antibody produced by the above method.
  • 2 The heavy chain variable region and the light chain variable region of the antibody produced by 105, the heavy chain variable region and the light chain variable region of the antibody produced by the hybridoma U0 shown in SEQ ID NOs: 36 and 38, respectively, SEQ ID NO: A heavy chain variable region and a light chain variable region of the antibody produced by hybridoma 115, shown in 40 and 42, respectively; and eightybridomas KM643-4-11, shown in SEQ ID NOS: 52 and 54, respectively.
  • Variable regions shown in SEQ ID NOs: 39 and 41, heavy and light chain variable regions encoded by nucleic acid sequences isolated from hybridoma 115, shown in SEQ ID NOs: 51 and 53, respectively A heavy chain variable region and a light chain variable region encoded by a nucleic acid sequence isolated from KM643-4-1 1; hybrididoma F2-103 represented by SEQ ID NOS: 59 and 61, respectively.
  • An antibody or a functional fragment thereof having the amino acid sequence of the mature portion of the heavy chain variable region and light chain variable region.
  • CD40 ligand mitigates or neutralizes the effect of increasing CD95 expression on B cell established cell lines
  • the antibody of the above (9) or a functional fragment thereof is obtained by adding an antibody at a concentration of 0.1 ⁇ g / ml to Ramos cells at a concentration of lxlO solid / ml supplemented with a saturating amount of CD40L-expressing cells. When added, it can suppress the expression of CD95 in Ramos cells to about 10% or less of the control.When the antibody is added at a concentration of 1 ⁇ s / ml, the expression of CD95 in Ramos cells can be suppressed.
  • the antibody of (9) or a functional fragment thereof is soluble in the LxlO spiked with CD40L (1 ig / inl)
  • the proliferation of tonsillar B cells increases from about 80 It is controlled by more than 95%.
  • the addition of an antibody at a concentration of O.Olg / ml to lOg / ml inhibits the proliferation of tonsillar B cells by about 95% or more, especially at a concentration of 0.001 xg / ml.
  • the proliferation of tonsillar B cells is suppressed by about 80% or more.
  • Examples of the antibodies (1) to (14) or functional fragments thereof include human antibodies.
  • a pharmaceutical composition comprising the antibody of any of (1) to (15) or a functional fragment thereof as an active ingredient.
  • An immunostimulating agent, an antitumor agent or a therapeutic agent for an autoimmune disease comprising the antibody or the functional fragment thereof according to any one of the above (1) to (8) as an active ingredient.
  • An immunosuppressant a therapeutic agent for an autoimmune disease, a therapeutic agent for allergy, or a blood coagulation factor VIII, comprising as an active ingredient the antibody or the functional fragment thereof according to any one of the above (9) to (14). Inhibitory syndrome treatment.
  • the epitope of human CD40 recognized by the monoclonal antibody of the present invention is a well-known method such as examining the binding to the overlapping synthetic oligopeptide obtained from the primary amino acid sequence of human CD40.
  • a phage display peptide library kit (New Engl and Biolabs) can also be used for epitope mapping.
  • the present invention also includes an antibody or a functional fragment thereof that recognizes a novel epitope of human CD40 that is recognized by an antibody or a functional fragment thereof produced by each of the above-described hybridomas.
  • the present invention further provides a nucleic acid (RNA or cDNA) encoding at least the variable region of the heavy chain and the Z or light chain of an antibody, isolated from the individual hybridomas described above, a vector containing the nucleic acid, A host cell carrying the nucleic acid is provided.
  • RNA or cDNA nucleic acid
  • a host cell carrying the nucleic acid is provided.
  • the inventors have reported that, as described below, a known monoclonal antibody 5D12 (ATCC No.HB-11339) that is antagonistic to CD40 on B cells is antagonistic against CD40 on DC cells. It was found that there was no. Furthermore, the present inventors have found that even with an antagonistic antibody that blocks the action of CD40L, many monoclonal antibodies themselves exhibit agonistic activity due to cross-linking with an anti-immune glopurin antibody.
  • human CD40J refers to Clark et al. (EA Clark et. Al., Pro Natl. Acad. Sci. USA 83: 4494, 1986) or Stamenkovic et al. EMBO J. 8: 1403, 1989), especially those expressed on the surface of B cells, D macrophages, endothelial cells, epithelial cells, or their tumor cells. Antigen polypeptide.
  • Anti-CD40 monoclonal antibody refers to any of monoclonal antibodies against cell-expressed CD40, full-length CD40 or partial-length CD40, and more preferably binds to the extracellular portion of CD40 and expresses CD40.
  • the term “antibody” refers to a gene encoding a heavy chain variable region and a heavy chain constant region and a light chain variable region and a light chain constant region that constitute immunoglobulin (collectively referred to as "antibody gene”).
  • the antibodies of the present invention include antibodies having any of the immunoglobulin classes and isotypes.
  • the “functional fragment” of the antibody in the present invention means a part (partial fragment) of the antibody as defined above, which retains one or more actions of the antibody on the antigen. (ab ') 2 , Fab', Fab, Fv, disulfide bond FV, single-chain FV (scFV), and polymers thereof (D. L King., Applicat ions and Engineering of Monoc lonal Ant ibodies., 1998 TJ International Ud).
  • “human antibody” means an antibody that is an expression product of a human-derived antibody gene.
  • “Agonistic” refers to the action of promoting the binding of its ligand to CD40 expressed on the cell surface such as B cells, tumor cells or dendritic cells, or the effect of CD40 ligand on CD40-expressing cells
  • An effect that exerts one or more effects on cells expressing CD40, and “agonistic antibody” means an antibody having such an agonistic effect.
  • Anguistic gonistic refers to the action of inhibiting the binding of its ligand to CD40 expressed on cell surfaces such as B cells, tumor cells or dendritic cells, or the effect of CD40 ligand on CD40-expressing cells An effect that neutralizes one or more of the effects is referred to, and "an gonistic antibody” means an antibody that has such an effect.
  • the “dendritic cell (DC)” referred to in the present invention is also called a dendritic leukocyte and refers to a group of cells having a strong antigen-presenting function.
  • the dendritic cells used are derived, for example, by culturing CD34-positive progenitor cells contained in bone marrow, cord blood or peripheral blood. Alternatively, it can be obtained by culturing CD14-positive monocytes in peripheral blood in the presence of GM-CSF and IL-4.
  • Immature DC (I thigh mature DC) refers to DCs that are CD14 negative, CDla strong positive, CD83, CD86 positive, and thigh C class II positive.
  • mature D means that CD14 negative, CDla positive and CD83, CD86, MHC class II strong positive.
  • activating DC means a change caused by DC in response to stimulation by CD40.For example, it matures immature DC and highly expresses CD80, CD86 and HLA-ClassII. In addition, it means that it enhances the production of IL-12 or, if T cells coexist, stimulates T cells to promote proliferation.
  • activating B cells and B cell lines means changes caused by cells in response to stimulation by CD40, for example, DNA synthesis, promotion of thymidine incorporation, and increase of CD95 expression.
  • the mouse used for immunization is preferably a mouse that produces human antibodies (Tomizuka. Et al., Proc Natl Acad Sc USA, 2000 Vol 97: 722). Recombinant-produced antibody that reacts with CD40 expressed on cells other than B cells rather than selecting clones that specifically react with B cells by selecting monoclonal antibodies that bind to soluble human CD40 It is thought that it is easy to obtain.
  • Hypridoma was isolated using the method of Koehler and Milstein et al. (Nature., 1975 Vol. 256: 495), which is commonly used in the production of monoclonal antibodies. Fabrication can be performed.
  • soluble CD40L is analyzed using a surface plasmon resonance measurement device such as BIAcore 2000 (Biacore) to select antibodies that do not compete with CD40L.
  • BIAcore 2000 Biacore 2000
  • Antibodies that inhibited B-lymphoma cell growth inhibition with the antibody alone were selected.
  • antibodies as indicators of whether they act on DC they have the advantage that they do not compete with CD40L, act on dendritic cells or B cells, and suppress the growth of CD40-expressing cancer cells. Antibodies can be produced.
  • the antibody of the present invention can be obtained by culturing the obtained hybridoma.
  • a gene encoding a human monoclonal antibody or its variable region is cloned from an antibody-producing cell such as a B cell or a hybridoma, inserted into an appropriate vector, and then cloned into a host (eg, a mammalian cell line, E. coli, Yeast cells, insect cells, plant cells, etc.) to produce recombinant antibodies produced using genetic recombination techniques (PJ Delives., Antibody Production Essential Technologies, 1997 WILEY, P. Shepherd and C.
  • a known nutrient medium or known nutrient medium such as that used to grow, maintain, and preserve hybridomas and produce monoclonal antibodies in culture supernatants, according to various conditions such as sex, the purpose of the study, and the culture method. It can be carried out using any nutrient medium derived and prepared from the same basic medium.
  • the selection of agonistic antibodies is performed by analysis using human B lymphoma, and it is possible to select antibodies that promote CD95 expression. Further, the antibody is added to the purified DC culture solution, and the antibody to be matured is selected. Or, immature]) Select an antibody that shows T cell proliferation activity in a mixed lymphocyte reaction using C cells. Further, an antibody having an IL-12 production promoting effect is added to mature DC. Also, select an antibody that has the activity of suppressing the growth of CD40-expressing tumor cells or inducing cell death. Competition with CD40L can be determined by using a surface plasmon resonance measurement device such as BIACore based on whether or not the antibody inhibits the binding between soluble CD40 and soluble CD40 ligand. Alternatively, it is determined whether the effect of CD40 ligand on B cell lines is enhanced.
  • Antagonistic antibodies are selected by analysis using a human B lymphoma, and by adding soluble CD40L having FLAG as a tag in the presence of anti-FLAG antibody, the soluble CD40L It is possible to select antibodies that more strongly inhibit the binding to CM0 on the former cells. By introducing a gene encoding CD40L instead of soluble CD40L, it is also possible to use recombinant cells expressing a large amount of CD40L on the cell surface. The human antibody is then cross-linked with an anti-human IgG antibody to exclude those clones that activate B lymphomas due to the cross-linking. Furthermore, select an antibody that exhibits T cell proliferation inhibitory activity in a mixed lymphocyte reaction using purified and matured DC cells, or an antibody that inhibits IL-12 production when CD40 ligand is added to mature DCs.
  • the antibody obtained as described above has at least one of the following properties that is considered useful for therapeutic effects.
  • agonistic antibodies Act on dendritic cells to produce IL-12 in the presence of LPS (lipopolysaccharide) and IFNT.
  • LPS concentration in this case is LONG / ml from lOpg / ml
  • the concentration of IFNT is 10- 2 M from 10- 4 M.
  • the amount of IL-12 produced is lower than that in the test using the G28-5 antibody, a known agonistic anti-CD40 antibody. Many.
  • IL-12 When dendritic cells at a concentration of lxlO 6 cells / ml are added at an antibody concentration of 0.1 l / g / ml or more, IL-12 of 100 pg / ml or more is produced, or at a concentration of lg / ml or more. In this case, at least 1000 pg / ml of IL-12, preferably at least 100 pg / ml, of IL-12 is produced. (See Examples 9 and 13)
  • (b) binds to dendritic cells and has an action to mature dendritic cells. Moreover, when the antibody is cultured with dendritic cells at a concentration of 20 g / ml or less, preferably 0.1 to 15 g / ml, more preferably 5 to 15 g / ml, its maturation activity is G28-5 Higher results are obtained than with antibodies. (See Example 9)
  • the activity to promote the expression of CD95 is higher than that of the G28-5 antibody against B cell established cell lines.
  • the activity to promote the expression of CD95 is higher than that of the G28-5 antibody as compared with the test using the G28-5 antibody as a control.
  • the magnification of the test using the G28-5 antibody as a control at the antibody concentration of 10 xg / ml, lg / m0.l ⁇ / mK0.Olyg / ml is as follows: (table 1).
  • B cell established cell lines include Ramos cells, HS-Sulton cells Is mentioned.
  • Ramos cells are Burkitt's lymphoma and are model cells of human germinal center B cells.
  • HS-Sul ton cells are Burkitt's lymphoma. (See Example 6, Example 12)
  • the activity of inhibiting the DNA synthesis, thymidine incorporation and proliferation against B cell established cell lines (Ramos cells or HS-Sulton cells) is higher than that of the G28-5 antibody.
  • the antibody concentration in this case is at least 0.05 mg / ml, preferably between 0.1 and 15 g / ffll. (See Example 8)
  • CD40L can bind to CD40 to the same extent as in the absence of the antibody, even when the antibody has been bound to CD40 in advance (that is, even when the antibody is present).
  • CD40 ligand and CD40 may be membrane-expressed or soluble proteins.
  • Antibodies having the above properties are produced, for example, by Hybridoma KM302-1 (FERM BP-7578) and Hybridoma KM34-tolu 19 (FERM BP-7759).
  • the nucleotide sequence and amino acid sequence of the heavy chain (H chain) and light chain (L chain) variable regions of the monoclonal antibody produced by the hybridoma KM341-19 were determined (Example 17).
  • the present invention provides a DNA encoding at least the heavy chain variable region or the full-length heavy chain of the monoclonal antibody produced by the hybridoma 34 lot 19, and an MA encoding the light chain variable region.
  • Such DNAs include those described in Example 17 as well as other DNAs encoding the same amino acid sequence due to codon degeneracy.
  • the present invention also provides a monoclonal antibody defined by at least the amino acid sequence of the heavy chain variable region or the amino acid sequence of the full-length heavy chain disclosed in Example 17 and the amino acid sequence of the light chain variable region, or a functional antibody thereof. Provide fragments.
  • ligand action means both the action of a ligand expressed on T cells or other cells and the action of a free ligand on CD40. (See Example 7 and Example 14) (h) neutralizing one or more of the effects of the ligand for CD40 on the B cell-established cell line on CD40-expressing cells, and inhibiting the CD40 on the B cell-established cell line by crosslinking with an anti-immunoglobulin antibody; Does not exhibit gonistic effects. Its effect is weaker than 5D12.
  • “Effect on CD40-expressing cells” means activation of the expressing cells, thymidine incorporation and proliferation in B cells, and enhancement of CD95 expression in B-cell established cell lines. In DC, it means maturation, enhanced expression of CD86 and HLA-DR, uptake of thymidine by coexisting T cells, promotion of proliferation, and production of IL-12 and IL-10.
  • Cross-linking with an anti-immunoglobulin antibody is performed by the presence of 0.1 g / ml or more of an anti-immunoglobulin antibody in the culture solution. (See Example 7)
  • Cross-linking CD40L or CD40L expressed in cells reduces or neutralizes the activity of increasing the expression of CD95 on B cell established cell lines. It also reduces or neutralizes the activity of CD40L, which has been enhanced by cross-linking with an antibody against the tag.
  • ligands for CD40 both free ligands and ligands expressed on specific cells
  • CD40-expressing cells they cause intracellular signal transduction, and finally CD95 (Fas) on the cell surface. Is expressed. Therefore, the antagonistic antibody of the present invention inhibits the above signal transduction by binding to CD40 to neutralize the expression of CD95.
  • the antibody concentration is at least lg / ml, preferably at least 0.1 lg / ml.
  • CD40L reduces or neutralizes the activity of activating DC.
  • DC When DC is stimulated by a ligand on coexisting T cells, it activates T cells and promotes thymidine incorporation.
  • T cells are activated by the interaction between DCs and T cells.
  • the angiogonistic antibody of the present invention inhibits the above interaction by binding to CD40, and as a result, thymidine incorporation is suppressed.
  • the antibody concentration in this case is at least 0.001 g / nil, preferably from 0.1 to 10 g / ml.
  • the above-mentioned angios gonistic antibodies are, for example, Hypridoma KM28 Tol 10 (FEM BP-7579), KM281-2-10-1-2 (FERM BP-7580) ( May 9, 2001, incorporated administrative agency Produced by the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology Patent Organism Depositary (Tsukuba Izumi, Ichiro Pref. 1-1, 1-1, Central 6th), 4D11 (FERM BP-7758).
  • Antibodies of the present invention can be of different subclasses by genetic engineering modifications, which are well known to those skilled in the art, i.e., substituting the region defining the subclass of the antibody heavy chain with a region defining another subclass. Can be converted (see, for example, EP 314161).
  • the variable region of the heavy chain can be directly linked to the constant region of another subclass.
  • the subclass of the antibody of the present invention to IgG2 or IgG4
  • the degree of binding to the Fc receptor can be reduced.
  • Kabat et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institute of Health, Bethesda, Md.
  • a pharmaceutical composition containing a purified preparation of the antibody of the present invention is also included in the scope of the present invention.
  • a pharmaceutical composition preferably comprises a physiologically acceptable diluent or carrier in addition to the antibody, and is a mixture with other antibodies or other drugs, such as antibiotics.
  • Suitable carriers include physiological foods It includes, but is not limited to, saline, phosphate buffered saline, phosphate buffered saline glucose solution, and buffered saline.
  • the antibody may be freeze-dried (freeze-dried) and reconstituted when necessary by adding a buffered aqueous solution as described above. Routes of administration are oral and parenteral, including intravenous, intramuscular, subcutaneous and intraperitoneal injection or drug delivery.
  • the effective amount administered as a combination of the effective amount of the antibody of the present invention with a suitable diluent and a pharmacologically usable carrier is 0.1 mg to 100 mg / kg body weight at a time. It is given every 2 to 8 weeks.
  • the agonistic antibody is an immunostimulating agent (antiviral agent, anti-infective agent), an antitumor agent, or a therapeutic agent for autoimmune diseases.
  • an immunostimulating agent antiviral agent, anti-infective agent
  • an antitumor agent or a therapeutic agent for autoimmune diseases.
  • a plurality of these diseases may occur simultaneously.
  • it can be used as an adjuvant with a vaccine such as a cancer-specific peptide.
  • Ango bistick antibody can be used as an immunosuppressant during organ transplantation (rejection or prophylactic or therapeutic agent for GVHD during transplantation such as knee island transplantation or kidney transplantation) or as an autoimmune disease (eg, rheumatism, It is useful as a therapeutic agent for arteriosclerosis, multiple sclerosis, systemic lupus erythematosus, idiopathic thrombocytopenia, Crohn's disease), a therapeutic agent for allergy such as asthma, and a therapeutic agent for blood coagulation factor VIII inhibition syndrome. However, a plurality of these diseases may occur simultaneously. .
  • an anti-CD40 antibody When an anti-CD40 antibody is used as a treatment for a disease associated with CM0, it can be expected that an antibody having a better therapeutic effect can be obtained by selecting an antibody based on the function of DC cells as an index.
  • an antibody having a strong immune enhancing effect can be obtained.
  • an antibody having a strong CTL inducing action can be obtained.
  • CTL induction an antibody with a high effect of removing virus-infected cells and tumor cells can be obtained.
  • an antibody that binds to CD40 but does not inhibit the binding of CD40 ligand to CD40 is desirable.
  • An antibody that efficiently activates DC cells would have a synergistic effect, and would be a therapeutic that could be used in tumors that do not express CD40. This antibody is considered to be useful as a therapeutic agent for viral infection and an antitumor agent.
  • an antibody that specifically binds to CM0, suppresses CD40L binding, and does not activate CD40 can not only suppress the action of ligand on B cells but also suppress the action on DC cells. desired.
  • the antibody obtained so far has been used as an indicator of its effect on B cells, so it is of great significance to obtain an antibody that also has a strong inhibitory effect on dendritic cells and develop it as a drug .
  • the anti-CD40 antibody may be completely reversed by cross-linking, an antibody that does not activate CD40 even by cross-linking is required.
  • FIG. 1 shows the results of the KM302-1 antibody promoting CD95 expression.
  • FIG. 2 shows that A and G gonistic antibodies neutralize the action of CD40 ligand on Ramos cells.
  • FIG. 2B is a diagram showing that an anginal gonistic antibody neutralizes the action of CD40 ligand on Ramos cells.
  • FIG. 3 is a diagram showing that the KM28 antibody 10 neutralizes the action of CD40 ligand on Ramos cells.
  • FIG. 4 shows the results of cross-linked KM28 antibody 10 not promoting CD95 expression.
  • FIG. 5 shows the results of the cross-linked 5D12 antibody promoting CD95 expression.
  • FIG. 6 is a graph showing the effect of the KM302-1 antibody on inhibiting the growth of tumor cells.
  • FIG. 7 is a diagram showing the results of the KM302-1 antibody promoting DC cell maturation.
  • FIG. 8 shows the results of the KM302-1 antibody promoting IL-12 production in DC cells.
  • FIG. 9 is a view showing that the action of the CD40 ligand on DC by the thigh 281-to-10 antibody is neutralized.
  • FIG. 10 shows that the KM28 antibody 10 neutralizes the action of CD40 ligand on DC.
  • FIG. 11 is a diagram showing that immature DC-MLR is activated by KM302-1 antibody.
  • FIG. 12 shows the results of the promotion of CD95 expression in amos cells by the KM341-1-19 antibody and the like.
  • FIG. 13 shows the results of the KM34-1-19 antibody promoting IL-12 production in mature DC cells.
  • FIG. 14 shows the results of the KM34-1-19 antibody promoting IL-10 production in mature DC cells.
  • FIG. 15 shows that the 4D11 antibody and the like neutralize the action of CD40 ligand on Ramos cells.
  • FIG. 16 is a diagram showing the antitumor effect of the KM302-1 antibody in a human tumor cell transplanted mouse model.
  • FIG. 17 shows the effect of the KM341-1-19 antibody on inhibiting the growth of tumor cells.
  • C Fig. 18 shows that F4-465, 4D11, and KM281- 10 produce antigen-specific IgG.
  • FIG. 18 shows that F4-465, 4D11, and KM281- 10 produce antigen-specific IgG.
  • FIG. 19 is a diagram showing that F4-465, 4D11, and thigh 1-10 suppress the production of antigen-specific IgM.
  • FIG. 20 shows that F4-465 suppresses the proliferation of tonsillar B cells.
  • EL-4 cells are a mouse-derived T cell line and can be easily obtained (ATCC No .: TIB-39).
  • Ramos B cells (ATCC No .: CRL-1596) and mouse anti-CD40 antibody producing hybridomas G28-5 (HB-9110) and 5012 (-11339) were purchased from ATCC.
  • PCR was performed using the following primers (95 ° C for 5 seconds, 55 ° C for 30 seconds, 72 ° C for 30 seconds) ⁇ 20 cycles of cells. The outer region was amplified.
  • Primer 1 5'-CCCAGATCTGTCCATCCAGAACCACCCACTGCATGCAGAG-3 '(SEQ ID NO: 1)
  • Primer 2 5'-ACAAGATCTGGGCTCTACGTATCTCAGCCGATCCTGGGGAC-3 * (SEQ ID NO: 2)
  • the amplified cDNA was inserted into the pFastBac vector (Gibco BRL) after the melittin signal sequence and before the FC region derived from human IgGl or mouse IgG2a.
  • recombinant baculovirus was prepared according to the manufacturer's instructions. Tn5 cells were infected with the recombinant virus and cultured for 4 days. The supernatant was treated with a 0.22 nm filter overnight, supplemented with protein in G sepharose (Amers am Pharmacia), and gently shaken at 4 ° C. After one night, sepharose was transferred to the column and washed with 20 volumes of PBS.
  • the human CD40 FC protein was eluted with a 20 mM glycine buffer (pH 3.0).
  • a vector for expressing CD40 on the cell surface was obtained from Randolph J. Noelle (Inui, S et al., EJI, 20, 1747-1753, 1990).
  • the full-length cDNA was digested with 3 ⁇ 4al and pCDNA3 (INVITR0GEN).
  • the vector was introduced into EL-4 cells and cultured in the presence of 0.5 mg / ml G418 (Gibco BRL) to obtain a stable expression strain.
  • CD40 expression was confirmed by FACS analysis using a FITC-conjugated anti-human CD40 antibody (Pharniiiigeii).
  • mice used for immunization have a homozygous genetic background for both endogenous Ig heavy chain and / c light chain disruption, and have a chromosome 14 fragment containing the human Ig heavy chain locus ( SC20) and the human Ig K chain transgene (KCo5) at the same time.
  • SC20 human Ig heavy chain locus
  • KCo5 human Ig K chain transgene
  • This mouse contains a strain A mouse with a human Ig heavy chain locus and a human Ig c chain transgene. It was prepared by crossing with strain B mice.
  • Strain A is a mouse strain that is homozygous for both endogenous Ig heavy chain and ⁇ light chain disruption and has a chromosome 14 fragment (SC20) that is capable of transmitting progeny, as reported by Tomizuka et al.
  • strain B is a homozygote for both endogenous Ig heavy chain and ⁇ light chain disruption, and is a mouse strain (transgenic mouse) carrying a human Ig / c chain transgene (KCo5). It is described in a report by ishwild et al. (Nat Biotechnol., 1996 Vol 14: 845).
  • mice of strain A and female mice of strain B were crossed between male mice of strain A and female mice of strain B, or female mice of strain A and male mice of strain B ( Ishida & Lonberg, IBC s 11 th Antibody Engineering, Abstract 2000) was used for the following immunization experiments.
  • the human antibody-producing mouse is available from Kirin Brewery Co., Ltd. under a contract. By immunizing the mice, the following hybrididomas, KM302-L KM341-1-19, pp.
  • the preparation of the monoclonal antibody in this example was prepared according to the general method described in "Introduction to Monoclonal Antibody Experimental Procedures" (written by Tamoe Ando et al., Published by Kodansha 1991).
  • human CD40 as an immunogen, human CD40 human FC prepared in Example 1 and CD40-expressing EL-4 cells were used.
  • a human antibody-producing mouse producing the human immunoglobulin prepared in Example 2 was used as the animal to be immunized.
  • CM0: hFc Human antibody producing mice were immunized with CM0: hFc at 2 to 100 g / individual. Antigen solution mixed with an equal volume of incomplete Freund's adjuvant (Sigma) except for the first time Then, it was injected subcutaneously in several places. Immunization was performed 3 to 4 times about every 10 days to 3 weeks. The first time used incomplete Freund's adjuvant (Sigma). Blood was collected from the tail of the mouse, and human antibodies to CD40 and ⁇ in the serum were measured using EUSA ( 3 to 4 days before removal of the spleen, CD40: Fc dissolved in PBS was injected from the tail vein. Immunized.
  • mice Human antibody-producing mice were immunized with mouse EL-4 cells expressing human CD40.
  • EL-4 cells were suspended in PBS at 10 8 cells / ml, and gently mixed with an equal amount of RIBI adjuvant previously emulsified with PBS. Cells were immunized 3-5 times approximately every 10 days to 3 weeks. When no adjuvant was used, X-ray irradiation with SOOOrad was used.
  • the spleen was surgically obtained from the immunized mouse, and the collected spleen cells were mixed with mouse myeloma SP2 / 0 (ATCC No .: CRL 1581) at a ratio of 5: 1, and polyethylene glycol 1500 (Boehringer Mannhe) was used as a fusion agent.
  • a large number of hybridomas were produced by cell fusion using the following method. The selection of hybridomas was performed using a HAT-containing EM medium containing 10% fetal calf serum (Fetal Calf Ser, FCS) and hypoxanthine (H), aminopterin (A), and thymidine (T). (Manufactured by Gibco BRL).
  • hybridomas producing human monoclonal antibodies having specific reactivity were obtained.
  • each human anti-human CM0 monoclonal antibody of the present invention is produced.
  • the hybridoma clones were named using symbols. Those with an “antibody” following the symbol are produced by each hybridoma. Or a recombinant antibody produced by a host cell carrying an antibody gene (full length or variable region) isolated from the hybridoma. Also, within the context of the context, the name of the hybrid clone may represent the name of the antibody.
  • the following hybridoma clones represent single clones.
  • the human CD40 mouse FC (lg / nil) 50 1 / well prepared in Example 1 was added to each well of a 96-well microplate for ELISA (Maxisorp, manufactured by Nunc), and incubated at 4 ° C. Mouse FC was adsorbed to the microplate. Next, the supernatant was discarded, a blocking reagent (Block Ace, Dainippon Pharmaceutical) was added to each well, and the mixture was incubated at room temperature to block. The culture supernatant (50 l) of each hybridoma was added to each well and allowed to react. After that, each well was washed with a phosphate buffer solution (PBS-T) containing 0.1% Tween20.
  • PBS-T phosphate buffer solution
  • the culture supernatant of the positive well is analyzed by FACS, the well that stains Ramos cells is selected, and the cells are cloned by the limiting dilution method. Got a loan cell. HK positivity was confirmed by ELISA using human CD40 mouse FC. As a result, 173 clones of anti-human CD40 antibody were obtained from 20 mice. Some of them are shown in Table 3 (agonistic antibodies) and Table 4 (anguistic antibodies). Among the agonistic antibodies, at least thighs 341-19 and 2105 were significantly different from ligands in competition tests using CD40L-expressing cells, CD40-expressing cells and antibodies. Did not show strong competition.
  • each monoclonal antibody was identified by using a peroxidase-labeled anti-human IgGl antibody, anti-human IgG2 antibody, anti-human IgG3 antibody or anti-human IgG4 antibody (diluted 2,000-fold, The procedure was the same as in the above-described ELISA for human immunoglobulin chains, except that 50 l / ⁇ l, manufactured by The Binding Site) was used. Reaction test of each monoclonal antibody to human CD40 expressing cells
  • the Ramos cell line was suspended at a concentration of 2xlO B / ml in a staining buffer (SB) of PBS containing 0.1% NaN 3 and 2% FCS.
  • the cell suspension 100 1Z was dispensed into a 96-well round bottom plate (manufactured by Becton Dickinson).
  • the culture supernatant (50H ⁇ ) of each hybridoma was added, and incubated at ice temperature for 30 minutes.
  • Using a human IgG1 antibody against human serum albumin as a negative control the concentration was adjusted to Ing / ml in a hybridoma culture medium, 50 l was added, and the mixture was incubated at ice temperature for 15 minutes.
  • the G28-5 antibody-producing hybridoma was obtained from ATCC (ATCC No. -9110).
  • Anti-040 antibody-producing hybridoma was converted to periinsulin (5 g / ml, Gibco BL), human Transferrin (5 g / ml, Gibco BRL Co.), ethanol ⁇ Min (0. 01MM, manufactured by Shi lumps Co.), sodium selenite (2. 5 l0- 5 nM, Sigma) containing eRDF medium (Far East (Manufactured by Pharmaceutical Company).
  • the cells were cultured in a spinner flask, and the culture supernatant was recovered when the viable cell ratio of the hybridoma reached 90%.
  • the collected supernatant was subjected to 10 / m and 0.2 m filters (manufactured by Germanic Science) to remove miscellaneous waste such as hybridomas. ⁇
  • the anti-CD40 antibody was purified from the culture supernatant by the following method.
  • Culture supernatant containing anti-CD40 antibody is purified using Hyper D Protein in A column (manufactured by NGK) or Protein in G column (Amersham Pharmacia Biotech) for purification of mouse IgGl according to the attached instructions.
  • Affinity purification was carried out using PBS (-) as a solution and 0.1 M sodium citrate buffer (pH 3) as an elution buffer. The eluted fractions were adjusted by the addition l MTr i s- HC1 (pH 8. 0) or Na 2 HP0 4 solution near pH 7. 2.
  • the prepared antibody solution was replaced with PBS (-) using a dialysis membrane (10000 cut, manufactured by Spectrum Laboratories) or SP force ram (Amersham Pharmacia Biotech), and a membrane with a pore size of 0.22 m was used. Filter-filtered and sterilized with MILLEX-GV (MILLIP0RE). The concentration of the purified antibody was calculated by measuring the absorbance of 280 dishes and setting 1 mg / ml as 1.450D.
  • the axis indicates the expression intensity of CD95.
  • the addition of the antibody is indicated by a bold line, and the absence of the antibody is indicated by a thin line.
  • the KM302-1 antibody promotes the expression of CD95 more than the known antibody G28-5 antibody. In other words, it was shown to be a more effective agonistic. [Example 7] Inhibition of CD95 expression in Ramos cells by anti-CD40 antagonistic antibody
  • Ramos cell suspension at 6 cells / ml was seeded on a 96-well plate at 50 1 / well.
  • the culture medium of the hybridoma culture supernatant or the purified antibody was adjusted to 2 ig / ml with a medium, and 100 1 / well was added to a 96-well plate.
  • 4 g / ml of soluble CD40 ligand (ALEXIS CORPORATION) and 4 g / ml of anti-FLAG antibody (M2, Sigma) were added to the medium, and 50 xl / wdl was added to a 96-well plate. After overnight culture, collect cells and R-PE labeled anti-CD95 antibody
  • Figures 2A, 2B and 3 show the results.
  • the horizontal axis in the figure shows the expression intensity of CD95.
  • Antibodies produced by the hybridomas KM281-1-10, KM281-2-10-1-2, KM283-5, KM292-24, and KM225-2-56 express CD95 to the same extent as the negative control. Suppressed.
  • the KM281- 10 antibody (lower panel) is a known antibody, 5D12 antibody.
  • Ramos cell suspension at 6 cells / ml was seeded at 50 xl / well in a 96-well plate.
  • Eight hybridoma culture supernatants or purified antibodies were adjusted to 2 g / nil with a medium, and 100 xl / well was added to a 96-well plate.
  • Anti-human IgG antibody (Sigma, 13382) or anti-mouse IgG antibody (Biosource, Cliff 13401) was added to the medium at a concentration of 4 g / ml, and 50 xl / well was added to a 96-well plate. After overnight culture, the cells were collected and analyzed using R-PE labeled anti-CD95 antibody (Pharmingen NJ) using FACS.
  • Figures 4 and 5 show the results.
  • the horizontal axis in the figure shows the expression intensity of CD95.
  • Antibodies produced by the hybridomas No. 81-1-10 and KM281-2-10-1-2 suppressed CD95 expression.
  • the antibodies produced by the hybridomas 5D12, KM283-5, KM292-1-24, and KM225-2-56 inversely enhanced CD95 expression.
  • [Example 8] Inhibition of proliferation of Ramos cells by anti-CD40 agonistic antibody l. OxlO 5 / ml Ramos cells, HS-Sulton suspension were seeded on a% well plate at lOOz 1 / well.
  • Recombinant human IL-4 was purchased from Genzyme teclme.
  • Anti-human CD14 MACS beads were purchased from Miltenyi Biotech GmbH. Ly immediate hoprep was purchased from Nycomed Pharma AS.
  • the culture medium used was 1640 (Gibco BRL), 10% heat inactivated FCS (Cell Culture Technologies), lOmM HEPES (Sigma), 55 2-mercaptoethanol (Gibco BRL), and streptomycin sulfate (Meiji Seika) at the time of DC induction. I used it.
  • the cells were washed at the time of staining using PBS (Sigma) supplemented with 2% FCS (Cell Culture Technologies) and 0.02% Azaid. At the time of cell freezing, a cell bunker manufactured by Nippon Zenyaku Kogyo was used.
  • Mononuclear cells were prepared from peripheral blood by density gradient centrifugation using Lymphoprep (PBMC). This was separated into a CD14 positive fraction and a negative fraction by positive selection with anti-human CD14 MACS beads. Combined with recombinant human GM-CSF (50ng / ml) in the positive fraction Recombinant human IL-4 (100ng / ml) was added, and the cells were cultured in a 6-well plate in RPMI 1640 medium supplemented with 10% FCS. The cell concentration at the start of the culture was 3 ⁇ per well with lx iOVml. During the culture, the medium was changed once every two days.
  • PBMC Lymphoprep
  • an anti-HLA-DR antibody (isotype control: rat IgG2a), an anti-CD86 antibody (isotype control: rat IgGl), and an anti-CD83 antibody (isotype control: rat IgG2b) were used.
  • an antibody was added and the mixture was incubated at 4 ° C. for 30 minutes, washed three times, and analyzed using a FACS Cal ibur manufactured by Beckton Dickinson.
  • LPS 400 pg / ml
  • IFN T 10_3 ⁇ 4
  • an anti-CD40 antibody or an isotype control was added at 10 ig / ml, and the production of IL-12 was measured for the supernatant 24 hours later by ELISA (Pharmingen).
  • Fig. 7 shows the effect of the agonistic antibody KM302-1 antibody on DC maturation
  • Fig. 8 shows the effect of mature DC on IL-12 production.
  • the degree of maturation was compared using the G28-5 antibody as a control.
  • the expression of KM302-1 antibody was further increased as compared with the G28-5 antibody, that is, the maturity was enhanced.
  • the secretion of IL-12 was enhanced by the treatment of mature DC with the KM302-1 antibody.
  • KM302-1 antibody is It has been shown to act as an antibody.
  • Blood peripheral blood collected from a normal human was centrifuged at 2000 ⁇ 10 minutes to absorb serum. The blood cell fraction was resuspended in PBS and gently mounted on Ficoll (Amersham Pharmacia). Centrifuge at 2,000 nm for 30 minutes to collect the PBMC portion of the middle layer. After washing twice with PBS, MACS was used for specific cell separation.
  • MACS Mosenchymal cells Separation of monocytes for DC culture was performed using MACS (Miltenyi Biotec GmbH) according to the attached instructions. Briefly, MACS Buffer 8001, MACS CD14 (Miltenyi Biotec GmbH, 502-01) 200 1 was added to eight PBMC lxlOs, and the mixture was treated at 4 ° C for 15 minutes. The cells were adsorbed to the MACS LS column and washed. Cells adsorbed on the column were collected as monocytes. MACS HLA-DR is added to cells that do not adhere to the column.
  • the obtained monocytes contain lOOOgZml of IL-4 (R & D system), 50ng / ml of G-CSF (KIRIN), and 10% of FCS (SIGMiV) in a 6-well culture dish at lxlO 6 cell Zml concentration.
  • the cells were cultured in an R0 medium (a PPMI medium supplemented with i3-mercaptophenol (Gibco) and HEPES (SIGMA)). After 5 days of culture, 10 ng / ml LPS (DIFC0) was added to differentiate into mature DC.
  • MLR was performed by mixing T cells and mature DC isolated from different humans.
  • the cell ratio of the T cell ZDC is 1:80, respectively, and the number of T cells is 2 ⁇ 10 5 cells.
  • FIG. 10 shows that the KM283-5 and 5D12 antibodies were unable to suppress DC-MLR, that is, only the abdominal 28-antibody 10 was an angiogenetic antibody that neutralized the action of CD40 ligand on DC.
  • Fig. 11 shows the results of examining the effect of the agonistic antibody KM302-1 antibody on ML using immature DC. Activation of DC promotes interaction with T cells and increases thymidine incorporation. This indicated that KM302-1 is an agonistic antibody that acts on immature DC.
  • soluble CD40 human FC was immobilized on a CM chip (CM5, Biacore). Then 25 (/ ml) of anti-CD40 antibody was added to bind to CD40. Further, 10 (/ x g / ml) of soluble CM0L was added and allowed to bind. The difference in the amount of binding before and after the addition of CD40L was measured. When control IgG was added, the binding amount of CD40L was 100 RU. After adding the KM302-1 antibody, the binding amount of CD40L was 110 RU, and after adding the KM283-5 antibody, it was 18 RU. This indicated that the KM302-1 antibody did not inhibit the binding of CD40L to CD40.
  • the purified antibody of High Priestess dormer obtained in Example 4 were analyzed according to the method of Example 6, were selected clones producing Agonisuto antibody (1 cell per Ueru 5XL 0 4 pieces, cell concentration. 5xl0 5 cells Zm 1).
  • Figure 12 shows the results.
  • the horizontal axis indicates the antibody concentration in the culture solution, and the vertical axis indicates the average fluorescence intensity, that is, the CD95 expression intensity.
  • the KM341-1-19, 2105 antibody was shown to promote CD95 expression on Ramos cells more than the known mouse antibody G28-5 antibody at a concentration of 0.01 zg / nil or higher. Was. In other words, it was shown that the agonistic was more effective.
  • IL-12 was measured by the ELI SA (Pharmingen) method.
  • Figures 13 and 14 show the results. It was shown that IL-12 secretion was enhanced by treatment with KM34-1-19 antibody.
  • concentrations of IL-12 and IL-10 in the culture solution are 254 and 51 pg / ml, and KM341 -Less than when 1-19 antibody was added at 12 g / ffll.
  • the KM34 antibody 19 acts as an effective agonistic antibody against DC. 0.
  • the activity of agonizing the secretion of IL-12 into mature DC of KM34 antibody 19 at l ⁇ g / ml is higher than that of G28-5 antibody at lOO tg / ml, and KM341- antibody at l ⁇ g / ml.
  • the agonist activity of secreting IL-12 into mature DCs of the 19 antibody was more than 100 times higher than that of the G28-5 antibody at 100 g / ml (FIG. 13).
  • the agonist activity of KM34-1-19 antibody to secrete IL-10 into mature DC was more than 10 times higher than that of 100 g / ml G28-5 antibody (FIG. 14).
  • the KM341-1-19 antibody has a subclass of IgG2, has lower binding to Fc receptor than IgGl and IgG3, and has weaker activation of the sensitizing complement system of killer activity of metacells. From this, it is considered that the danger that the function of the CD40-expressing cell or the cell itself is reduced by the antibody is low.
  • a 6- ml OxlO / ml Ramos cell suspension was seeded at 50 1 / well in a flat-bottom 96-well plate ( 4 x 5xl0 cells per 1-well). The purified antibody diluted with the medium was added to a 96-well plate at 100 z1 / well.
  • Recombinant mouse L cells expressing human CD40 ligand Spriggs, MKet. Al., J. Exp.Med., 176: 1543, 1992; Garrone, P. et.al., J. Exp.Med. , 182: 1265, 1995.
  • the 4D11 antibody expressed CD95 to the same extent as the negative control without the addition of CD40L-expressing cells even at a concentration of 0.1 l ⁇ g / ml.
  • a concentration of l ⁇ g / ml 4D11, F4-465, and KM281-1-10 suppressed the expression of CD95 to the same extent as the negative control without the addition of CD40L-expressing cells.
  • Table 6 shows the relative values of the average fluorescence intensity for each antibody concentration, with the control without the addition of the antagonistic antibody as 100.
  • the KM302-1 antibody is a subclass of IgG4 and survives cancer-bearing mice with a single dose of 10 g despite weak activation of the antibody-dependent cellular cytotoxicity mechanism (ADCC) and complement system via the Fc receptor. The period was extended.
  • ADCC antibody-dependent cellular cytotoxicity mechanism
  • the difference in absorbance from the wells containing only cells and no medium containing antibodies was measured to determine the number of surviving cells.
  • the growth inhibitory effect was compared with the G28-5 antibody using a 96-well bottom plate.
  • KM34 antibody 19 or G28-5 antibody prepared at 2 xg / ml using the medium was added. The results are shown in FIG. Dead cells were observed in the wells to which the KM341-1-19 antibody was added, the number of cells was significantly smaller than in the wells to which the G28-5 antibody or ligand had been added, the absorbance was lower, and the growth of tumor cells was suppressed. It was shown that cell death was induced.
  • KM341-1-19, 2105, 110, 115, 28 thigh 10, 4 D11, Yeast 43-4-11, F4-465, F2-103, F5-77 was collected by centrifugation.
  • TRIZ0L Gibco BRL
  • Cloning of the variable region of the antibody cDNA was performed using CLARTTECH's SMART RACE cDNA. This was performed using amplificationKit according to the attached instructions.
  • a 1 st Strand cDNA was prepared using the total RNA of Example 1 as type II.
  • UMP and hh2 primer were used and Advantage 2 PCR kit (Clonthec, cat # 1910) was used at 94 ° C for 5 seconds, 72 ° C for 3 minutes, 5 cycles, 94 ° C for 5 seconds, 70 ° C. The test was performed at 0 ° C for 0 second, 72 ° C for 3 minutes, 5 cycles, 94 ° C for 5 seconds, 68 ° C for 10 seconds, 72 ° C for 3 minutes, and 25 cycles.
  • hh6 primer 5'-GGT CCG GGA GAT CAT GAG GGT GTC CTT-3 '(SEQ ID NO: 3)
  • hh3 primer 5'-GTG CAC GCC GCT GGT CAG GGC GCC TG-3' (SEQ ID NO: 4)
  • hh2 primer 5'-GCT GGA GGG CAC GGT CAC CAC GCT G-3 ′ (SEQ ID NO: 5)
  • the amplified PCR product was purified using a PCR puriiication kit (QIAGEN), and the nucleotide sequence was determined using hh4 as a primer.
  • sequence was determined by subcloning into PCRScript (Stratagene, Lajolla, CA) or PCR-Blunt (Invitrogene, Carlsbad, CA). An antibody heavy chain-specific primer was synthesized based on the sequence information.
  • 643Hsal primer was synthesized; in the case of F4-465, HI 95 5 'primer was synthesized; in the case of F2-103, F2-103H primer was synthesized; in the case of F5-77, F5-77H primer was synthesized.
  • l st cDNA was amplified from Strainlc ⁇ A, which was sequenced from the opposite direction using antibody specific primers one as ⁇ .
  • hh4 primer 5'-GGTGCCAGGGGGAAGACCGATGG-3, (SEQ ID NO: 6) 341H Primer: 5'-atatgtcgacGCTGAATTCTGGCTGACCAGGGCAG-3 '(SEQ ID NO: 7)
  • the light chain (light chain) of KM341-1-19, 2105, 110, 115, KM281-1-10, 4 D11, SUB 43-4-11, F2-103, F5-77 uses UMP and hk2 primer Amplification was performed by repeating a cycle of 98 ° C for 1 second and 68 ° C for 30 seconds 30 times.
  • the light chain of F4-465 was amplified using UMP and hL2 primer by repeating 30 cycles of 98 ° C for 1 second and 68 ° C for 30 seconds.
  • the amplified PCR product was purified by PCR purification kit, and the nucleotide sequence was determined using the hk6 or hL2 primer. Based on this sequence, a light chain-specific primer was synthesized.
  • KM341-1-19 341K primer, 2105: 2053KBgl primer, 110, 115: lOKBgl primer, KM28: 10: 281KBgl primer, 4D11: 4Dl lKBgl, KM643
  • 643KBgl primer was synthesized, in the case of F4-465, Lamda 5 'primer, and in the case of F-103, F5-77, the F2-103K primer was synthesized.
  • hk2 primer 5'-GTT GAA GCT CTT TGT GAC GGG CGA GC-3 '(SEQ ID NO: 16)
  • hL2 primer 5'-TCT TCT CCA CGG TGC TCC CTT CAT-3' (SEQ ID NO: 17)
  • 341K primer 5 ' -atat aga tct GAACTGCTCAGTTAGGACCCAGAGG-3 '(SEQ ID NO: 18) 2053KBgl: atatagatctCGCGGGGAAGGAGACTGCTCAGTT (SEQ ID NO: 19)
  • HOKBgl atatagatctAGTCAGACCCAGTCAGGACACAGC
  • SEQ ID NO: 20 281KBgl: atagatctGAGCTGCTCAGTTAGGACCCAGAGGG (SEQ ID NO: 21)
  • Lamda 5 ' -AACTCCAGATCTGCCTCAGGAAGCAGCATC (SEQ ID NO: 24)
  • F2-103K aactccagatctagggcaagcagtggtaac (Rooster number 25)
  • hk6 primer 5'-TGGCGGGAAGATGAAGACAGATGGTG-3 '(SEQ ID NO: 26)
  • the translation start point of the H chain DNA is an ATG codon starting from the adenine (A) at position 50 from the 5 'end of SEQ ID NO: 27, and a stop codon is TGA starting from thymine (T) at position 1472.
  • the boundary between the antibody variable region and the constant region is located between adenine (A) at position 493 and guanine (G) at position 494 from the 5 'end.
  • the H chain variable region extends from the N-terminal of SEQ ID NO: 28 to the 148th serine (S) residue, and the 149th alanine (A) and subsequent regions are constant regions.
  • the signal sequence of the H chain was predicted to be from the N-terminal to the 20th serine (S) of SEQ ID NO: 28.
  • the N-terminus of the mature form is thought to be glutamine (Q) at position 21 of SEQ ID NO: 28.
  • the translation start point of the L chain DNA is an ATG codon starting from A at position 29 from the 5 'end of SEQ ID NO: 29, and the variable region extends from adenine (A) at position 400 from the 5' end.
  • the variable region extends from the N-terminal of SEQ ID NO: 30 to the lysine (K) at position 124.
  • the signal sequence of the L-chain extends from the N-terminus of SEQ ID NO: 30 to the glycine (G) at position 20; It was found to be glutamic acid (E). 341-1-19 H chain (SEQ ID NO: 27)
  • the translation start point of H chain DNA is an ATG codon starting from adenine (A) at position 70 from the 5 'end of SEQ ID NO: 31, and the boundary between the antibody variable region and the constant region is adenine (A) at position 495 from the 5' end. ) And the 496th guanine (G).
  • the variable region of the H chain extends from the N-terminus of SEQ ID NO: 32 to the serine (S) residue at position 142, and the alanine (A) at position 149 onwards is the constant region.
  • the gene sequence prediction software (Signal P ver. 2) predicted the signal sequence of the H chain to be the 19th cystein (0) from the N-terminus of SEQ ID NO: 32. Glutamic ac id (E).
  • the translational start point of the L chain DNA is an ATG codon starting from A at position 28 from the 5 'end of SEQ ID NO: 33, and the variable region extends from adenine (A) at position 405 from the 5' end.
  • the variable region is the 126th residue from the N-terminus of SEQ ID NO: 34.
  • the signal sequence of the L chain was predicted to be 20th Glycine (G) from the N-terminal of SEQ ID NO: 34 by the gene sequence prediction software (Signal P ver. 2).
  • the N-terminus of the mature form is considered to be the 21st Glutamic acid (E) of SEQ ID NO: 34. -
  • the translation initiation point of the H chain DNA is an ATG codon starting from adenine (A) at position 60 from the 5 'end of SEQ ID NO: 35.
  • the boundary between the antibody variable region and the constant region is adenine (A) at position 479 from the 5' end.
  • the 480th guanine (G) In the amino acid sequence, the variable region of the H chain extends from the N-terminus of SEQ ID NO: 36 to the serine (S) residue at position 140, and the alanine (A) at position 141 and beyond is the constant region.
  • the gene sequence prediction software (Signal P ver. 2), the signal sequence of the H chain was predicted to be Cysteine at position 19 (0) from the N-terminus of SEQ ID NO: 36. It is thought to be the 20th glutamine (Q).
  • the translation initiation point of the L chain MA is an ATG codon starting from A at position 35 from the 5 'end of SEQ ID NO: 37, and the variable region extends from adenine (A) at position 421 from the 5' end. In the amino acid sequence, the variable region extends from the N-terminal of SEQ ID NO: 38 to the lysine (K) at position 129.
  • the gene sequence prediction software (Signal P ver. 2) predicted that the signal sequence of the L chain was Cysteine (0 to 22) from the N-terminus of SEQ ID NO: 38. It is considered to be the 23rd val ine (V) of 38.
  • the translation initiation point of the H chain DNA is an ATG codon starting from adenine (A) at position 60 from the 5 'end of SEQ ID NO: 39.
  • the boundary between the antibody variable region and the constant region is adenine (A) at position 479 from the 5' end.
  • the 480th guanine (G) In the amino acid sequence, the variable region of the H chain extends from the N-terminus of SEQ ID NO: 40 to the serine (S) residue at position 140, and the alanine (A) at position 141 and beyond is the constant region.
  • the signal sequence of the H chain was predicted to be Cysteine at position 19 (0) from the N-terminus of SEQ ID NO: 40.
  • Glutamine (Q) is thought to be the 20th glutamine (Q).
  • the translation start point of the L chain DNA is an ATG codon starting from A at position 35 from the 5 'end of SEQ ID NO: 41, and the variable region extends from adenine (A) at position 421 from the 5' end.
  • the variable region is the lysine at position 129 from the N-terminus of SEQ ID NO: 42.
  • the translation start point of H chain DNA is an ATG codon starting from adenine (A) at position 52 from the 5 'end of SEQ ID NO: 43.
  • the boundary between the antibody variable region and the constant region is from the 5' end. It is located between 468th adenine (A) and 469th guanine (G).
  • the variable region of the H chain extends from the N-terminus of SEQ ID NO: 44 to the 139th serine (S) residue, and the alanine (A) after the 140th is the constant region.
  • the gene sequence prediction software (Signal P ver. 2) predicted that the signal sequence of the H chain was from the N-terminal of SEQ ID NO: 44 to the 19th serine (S).
  • the N-terminus of the mature form is thought to be glutamine (Q) at position 20 of SEQ ID NO: 44.
  • the translation start point of the L chain DNA is an ATG codon starting from A at position 41 from the 5 'end of SEQ ID NO: 45, and the variable region extends from adenine (A) at position 424 from the 5' end.
  • the variable region extends from the N-terminal of SEQ ID NO: 46 to the lysine (K) at position 128.
  • the signal sequence of the light chain was predicted to be 20th Glycine (G) from the N-terminal of SEQ ID NO: 46 by the gene sequence prediction software (Signal P ver. 2).
  • the N-terminus of the mature form is considered to be Glutamic acid (E) at position 21 of SEQ ID NO: 46.
  • the translational start point of the H chain DNA is an ATG codon starting from the 16th adenine (A) from the 5 'end of SEQ ID NO: 47, and the boundary between the antibody variable region and the constant region is 456th adenine (A) from the 5' end. ) And 457th Gwangin (G).
  • the H chain variable region extends from the N-terminus of SEQ ID NO: 48 to the 147th serine (S) residue, and the 148th alanine (A) and subsequent regions are constant regions.
  • the gene sequence prediction software (Signal P ver. 2), the signal sequence of the H chain was predicted to be from the N-terminal of SEQ ID NO: 48 to the 26th serine (S).
  • the N-terminus of the mature form is considered to be glutamine (Q) at position 27 of SEQ ID NO: 48.
  • the translation start site of L chain ⁇ A starts from the A at position 59 from the 5 'end of SEQ ID NO: 49 It is an ATG codon and the variable region extends from the 5 'end to the 442nd adenine (A). In the amino acid sequence, the variable region extends from the N-terminal of SEQ ID NO: 50 to the lysine (K) at position 128.
  • the gene sequence prediction software (Signal P ver. 2) predicted that the signal sequence of the L chain was Cysteine (0 to 22) from the N-terminal of SEQ ID NO: 50. It is considered to be the 21st Al anine (A) of
  • KNQFSLKLSSVTAADTAVYYCTRPWRYFGWFDPWGQGTLVTVSSAS 4D11 L chain (SEQ ID NO: 49) GGAAATCAAACGTACG
  • amino acid sequences of A and H and L chains encoding the H chain variable region and L chain variable region of KM643-4-11 are shown below.
  • the translational start point of the H chain DNA is the ATG codon starting from the first adenine (A) from the 5 'end of SEQ ID NO: 51, and the boundary between the antibody variable region and the constant region is the 447th adenine (5' end) from the 5 'end. Located between A) and 448th guanine (G).
  • the variable region of the H chain extends from the N-terminus of SEQ ID NO: 52 to the 149th serine (S) residue, and the 150th and subsequent alanine (A) are constant regions. According to the gene sequence prediction software (Signal P ver.
  • the signal sequence of the H chain was predicted to be from the N-terminal of SEQ ID NO: 52 to the 20th serine (S).
  • the N-terminus of the mature form is considered to be glutamine (Q) at position 21 of SEQ ID NO: 52.
  • the translation start point of the L chain DNA is an ATG codon starting from A at position 38 from the 5 'end of SEQ ID NO: 53, and the variable region extends from adenine (A) at position 409 from the 5' end.
  • the variable region extends from the N-terminal of SEQ ID NO: 54 to the lysine (K) at position 124.
  • the gene sequence prediction software (Signal P ver. 2) predicted the signal sequence of the strand to be Glycine (G) at position 20 from the N-terminal of SEQ ID NO: 54.
  • the N-terminus of the mature form is considered to be Glutami c acid (E) at position 21 of SEQ ID NO: 54.
  • the translational start point of the H chain DNA is an ATG codon starting from adenine (A) at position 47 from the 5 'end of SEQ ID NO: 55.
  • the boundary between the antibody variable region and the constant region is adenine (A) at position 484 from the 5' end. ) And the 445th guanine (G).
  • the H chain variable region extends from the N-terminal of SEQ ID NO: 56 to the 146th serine (S) residue, and the 147th alanine (A) and subsequent regions are constant regions.
  • the gene sequence prediction software (Signal P ver. 2) predicted that the signal sequence of the H chain was from the N-terminal of SEQ ID NO: 56 to the 19th serine (S).
  • the N-terminus of the mature form is thought to be glutamine (Q) at position 20 of SEQ ID NO: 56.
  • the translational start point of the L chain DNA is an ATG codon starting from the A at the 81st position from the 5 'end of SEQ ID NO: 57, and the variable region extends from the 5' end to the 440th position (C). In the amino acid sequence, the variable region extends from the N-terminus of SEQ ID NO: 58 to Threonine (T) at position 120.
  • the gene sequence prediction software (Signal P ver. 2) predicted that the signal sequence of the L chain was from the N-terminus of SEQ ID NO: 58 to the 19th Alanine (G). The N-terminus of the mature form is thought to be Serine (S) at position 20 in SEQ ID NO: 58.
  • F4-465 L chain (SEQ ID NO: 57)
  • the translation initiation point of H chain MA is an ATG codon starting from adenine (A) at position 32 from the 5 'end of SEQ ID NO: 59.
  • the boundary between the antibody variable region and the constant region is adenine (A) at position 463 from the 5' end. ) And 464th guanine (G).
  • the H chain variable region extends from the N-terminus of SEQ ID NO: 60 to the 144th serine (S) residue, and the 145th alanine (A) and subsequent regions are constant regions.
  • Gene sequence prediction The software (Signal P ver. 2) predicted the signal sequence of the H chain to be the 19th Cystein (0) from the N-terminal of SEQ ID NO: 60. The mature N-terminal was Glutamic acid at the 20th position of SEQ ID NO: 60 (E).
  • the translation start point of the L chain DNA is an ATG codon starting from A at position 29 from the 5 'end of SEQ ID NO: 61, and the variable region extends from adenine (A) at position 415 from the 5' end. In the amino acid sequence, the variable region extends from the N-terminus of SEQ ID NO: 62 to the lysine (K) at position 129.
  • the gene sequence prediction software (Signal P ver. 2) predicted that the signal sequence of the L chain was Cystein (0 to 22) from the N-terminus of SEQ ID NO: 62. It is thought to be the 23rd Asp (D).
  • the translational start point of H chain DNA is an ATG codon starting from adenine (A) at position 100 from the 5 'end of SEQ ID NO: 63.
  • the boundary between the antibody variable region and the constant region is adenine (A) at position 528 from the 5' end. ) And the 529th guanine (G).
  • the H chain variable region extends from the N-terminus of SEQ ID NO: 64 to the 143rd serine (S) residue, and the 144th alanine (A) and subsequent regions are constant regions.
  • the gene sequence prediction software (Signal P ver. 2) predicted that the signal sequence of the H chain would be Cysteine (0 to 19) from the N-terminus of SEQ ID NO: 64. It is considered to be the 20th Glutamic ac id (E).
  • the translation initiation site of L-chain activation is the ATG codon starting from A at position 59 from the 5 'end of SEQ ID NO: 65, and the variable region extends from adenine (A) at position 445 from the 5' end.
  • the variable region is the lysine at position 129 from the N-terminus of SEQ ID NO: 66.
  • the antibody expression vector is prepared by incorporating the DNA fragment containing the antibody variable region obtained above into a suitable vector such as N5KGKIDECPliarmaceuUcals, US Patent 6001358).
  • a host cell for expression for example, CHO-Ras (Katakura Y., et al., Cytotechnology, 31: 103-109, 1999) is suitably used.
  • Introduction of the vector into the host cell can be carried out, for example, by electroporation.
  • Antibody expression base Kuta one about 2 was linearized with restriction enzyme, Bio- under conditions of 350 V, 500 F using a Rad electrophoreter, introducing the gene into 4Xl0 7 amino CH0- Ras cells are seeded in 96 well culture Plate . Add the drug corresponding to the selection of the expression vector and continue the culture. When colonies are observed, antibody-expressing strains are selected by the method described in Example 4. Antibody purification from the selected cells can be performed according to Example 5.
  • Example 19 Inhibition of Antigen-Specific Antibody Production by CM0 Antagonistic Antibody Mouse that has a homozygous genetic background for endogenous CD40 disruption and has a human CD40 gene transgene ( 2002, Vol. 14: 319), 4-hydroxy-3-nitropenyl acety 1-chiken r-globulin conjugates (NP-CGG: Prof. Hitoshi Kikutani, Institute for Microbial Diseases, Osaka University) (ARAM: Antigen recognition activation motif) and lOO ⁇ (NP-CGG Sensitized by intraperitoneal injection. Each monoclonal antibody was administered in the tail vein in an amount of 30 or 100 xg immediately before antigen sensitization.
  • Anti-human albumin human IgG4 antibody 100 g was administered as a negative j 'control. Seven days after sensitization, blood was collected from the orbital venous plexus, and the amount of NP-specific IgGl and IgM antibodies in the serum was measured by ELISA. In the ELISA method, 50 U / well of NP-conjugated bovine serum albumin (NP-BSA: 2.5 zg / ml) was added to each well of a 96-well microplate for ELISA (Maxisorp, manufactured by Nunc), and 4 ° C. C, and NP-BSA was adsorbed.
  • NP-BSA NP-conjugated bovine serum albumin
  • Example 20 Inhibition of Tonsil B Cell Proliferation by CD40 Antagonistic Antibody Human tonsils were obtained from Children's Hospital (San Diego, CA, USA). The tonsils were cut into small pieces, minced, and passed through a 70 micrometer nylon mesh cell strainer to prepare a cell suspension.
  • the count when B cells proliferated by stimulation with CD40L and no antibody was added was 100, and the force when B cells were not stimulated with no CD40L added was 0.
  • a relative force value of 30 was measured, in this experiment, it was expressed that 70% growth inhibition had occurred.
  • 5D12 a known antagonistic antibody, did not show growth inhibition of more than 50% even at an antibody concentration of 100 micrograms m1.
  • F4-465 exhibited about 80% growth inhibition at a concentration of only 0.01 microgram Zm1 and about 95% at a concentration of 0.1 to 10 microgram Zm1 ( Figure 20). . All publications, patents, and patent applications cited in this specification are incorporated herein by reference in their entirety. Industrial applicability
  • the present invention provides an antibody against CD40.
  • the antibodies of the present invention include both those that act agonistically on CD40 and those that act antagonistically on CD40, and are therefore useful as immunostimulants, immunosuppressants, etc., respectively. Sequence listing free text
  • Sequence number 1 Synthetic DNA SEQ ID NO 2: Synthetic DNA SEQ ID NO 3: Synthetic DNA SEQ ID NO 4: Synthetic DNA SEQ ID NO 5: Synthetic NOTE SEQ ID NO 6: Synthetic DNA SEQ ID NO 7: Synthetic Thigh A SEQ ID NO 8: Synthetic Awake SEQ ID NO 9: Synthetic DNA Sequence No. 10: Synthetic DNA SEQ ID No. 11: Synthetic MA SEQ ID No. 12: Synthetic DNA SEQ ID No. 13: Synthetic II A SEQ ID No. 14: Synthetic DNA SEQ ID No. 15: Synthetic DNA SEQ ID No. 16: Synthetic DNA SEQ ID No. 17: Synthetic DNA SEQ ID No.

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Description

明 細 書 抗 CD40モノクローナル抗体 技術分野
本発明は、 ヒトの B細胞、 樹状細胞 （DC) 等の表面に存在するヒト CD40抗原を 認識する抗体又はその機能的断片に関する。具体的には、 本発明は榭状細胞 （DC) 表面のヒ卜 CD40抗原に対して実質的にアン夕ゴニスティックである抗ヒト CD40 抗体又はその機能的断片、および従来の抗ヒ卜 CD40抗体に比べてより治療効果の 高いことが期待されるァゴニスティックな抗ヒト CD40 抗体又はその機能的断片 に関する。 ' 背景技術
1. CD40
CD40は分子量 50kDaの細胞膜表面に存在する抗原であり、 B細胞、榭状細胞（DC)、 ある種の癌細胞、 そして胸腺上皮細胞に発現している。 CD40は B細胞や DCの増 殖、 分化に重要な働きをしていることが知られている。 CD40は、 ヒト B細胞表面 に発現する抗原として同定され（E. A. Clark et. al. , Pro Nat l. Acad. Sci. USA 83 : 4494, 1986, I. Stamenkovic et. al. , EMBO J. 8 : 1403, 1989)、 アミノ酸配 列の相同性から、 CD40は、低親和性 NGFレセプ夕一や TNFレセプ夕一、 CD27、 0X40、 CD30などが属している TNFレセプターフアミリーの 1つのメンバーとして考えら れている。 ヒトおよびマウスの CD40に対するリガンド （CD40L) は、 近年遺伝子 クローニングされ、 Π型膜蛋白質であること、 及び活性化した CD4 + T細胞に発 現していることが分かった。 CD40L は、 強力な活性化シグナルをヒトおよびマウ スの B細胞に導入することも分かっている。
また、樹状細胞には B細胞よりも多くの CD40発現が確認されており、重要な役 割を担っていることが明らかとなってきた。 CD40が CD40Lと結合すると、 抗原提 示細胞 （APC) の活性化、 すなわち CD80 (B7-1) や CD86 (Β7-2) などの補助刺激 分子の発現、あるいは IL-12の産生が増強される（Caux, C. , et al.： Act ivat ion of human dendritic cells through CD40 cross-linking. J. Exp. Med. , 180:1263, 1994), (Shu, U. , et al.： Activated T cells induce interleukin-12 production by monocyte via CD40-CD40 ligand interaction. Eur. L I龍 unol., 25:1125， 1995)。 樹状細胞は強い抗原提示能を有し、 強力なヘル パ一 T (T )細胞活性化能を持っている。 また、 ナイーブ （naive) Th細胞の Till 又は Th2細胞への分化を樹状細胞が制御していると考えられている。 ミエロイド 系樹状細胞である末梢血単球を GM-CSF及び IL-4とともに培養して CD40Lにより 成熟させた樹状細胞（DC1)は in vitroにおいて、 IL- 12産生能を有し、異系 naive Th細胞を刺激活性化し、 IFNr産生 T細胞を誘導する （すなわち Thlへの分化を 促す）。 この作用は抗 IL- 12抗体により阻害されることから、 IL- 12を介した反応 と考えられる。 一方リンパ組織 T領域や、 末梢血に存在する plasmacytoid T細 胞を IL_3、 CD40リガンドとともに培養したリンパ球系樹状細胞 （DC2) は、 IL - 12 産生能は有さず、 そして異系 naive Tli細胞を刺激活性化し、 IL- 4産生 T細胞を 誘導し、 Th2への分化を促進することが示されている。 TM細胞は細胞性免疫の活 性化にかかわり、 Th2 細胞は液性免疫能を高めると同時に細胞性免疫能の抑制に 関与すると考えられている。 TM細胞のヘルプで活性化された細胞傷害性 T細胞 (CTL) は、 細胞質内で増殖する病原体 （多くのウィルス、 リステリア菌、 結核菌、 およびトキソプラズマ原虫など） や腫瘍細胞を除去することができる。
膜表面に発現した CD40を認識する抗 CD40モノクローナル抗体が、 B細胞に対 していろいろな生物活性を示すことは示されてきた。抗 CD40モノクローナル抗体 は、 CD40と CD40Lとの相互作用に対してァゴニスティックなものと、 アンタゴニ スティックなものとに大別される。
2. ァゴニスティック抗体
ァゴニスティック抗体の作用として、 B細胞の活性化が知られている。 たとえ ば、 抗 CM0抗体が細胞接着を誘導する (Barrett et al., J. Immunol. 146: 1722, 1991; Gordon et al. , J. Immunol. 140: 1425, 1988)、 細胞の大きさを増進する (Gordon et al. , J. I腿漏 1· 140: 1425, 1988; Valle et al. , Eur. J. Immunol. 19: 1463, 1989)、 抗 IgM抗体、 抗 CD20抗体または phorbol esterのみで活性化 された B細胞の分裂を誘導する (Clark and Ledbetter, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 4494, 1986; Gordon et al. , LEUCOCYTE TYPING III. A. J. McMic eal ed. Oxford University Press. Oxford, p.426; Paulie et al. , J. Immunol.142: 590， 1989)、IL4存在下で B細胞の分裂を誘導する（Valle et al. , Eur. J. Immunol. 19: 1463, 1989; Gordon et al. , Eur. J. Immunol. 17: 1535, 1987)、 IL - 4 刺 激、 T細胞除去培養細胞の IgE (Jabara et al., J. Exp. Med. 172: 1861, 1990; Gascan et al. , J Immunol. 147:8, 1991)、 IgG、 IgM (Gascan et al. , J. Immunol. 147: 8, 1991) の発現を誘導する、 IL- 4による B細胞からの可溶性 CD23ZFcsRII の分泌と (Gordon and Guy, Immunol. Today 8:339, 1987; Cairns et al. , Eur. J. I匪 unol. 18: 349, 1988)細胞上の発現増強（Chal la A, Allergy, 54: 576, 1999) をする、 IL-6の生産を促進する （Clark and Shu, J. Immunol. 145: 1400, 1990) ことが報告されている。 さらには、 CDw32 +接着細胞存在下で、 IL- 4及び抗 CD40 抗体を添加することにより、 ヒト初代培養 B細胞から、 B細胞クローンを樹立す ることや (Bancherauet al. , Science 241:70, 1991), 胚中心の中心細胞のアポト —シスが、 抗原レセプ夕一の働きにかかわらず、 CD40 を介して阻害されること (Liu et al., Nature 342: 929, 1989) が報告されている。 以上のように CD40 は、 ヒト B細胞表面に発現する抗原として同定されたため、 単離された抗体の多 くは、 主にヒト B細胞に対する増殖分化誘導機能、 癌細胞における細胞死誘導活 性を指標に評価されてきた（Katira, A. et. al. , LEUKOCYTE TYPING V. S. F. Schlossossman, et. al. eds. p.547. Oxford University Press. Oxford, W. C. Flansow et. al. , LEUKOCYTE TYPING V. S. F. Schlossossman, et. al. eds. p.555. Oxford University Press. Oxford, J. D. Pound et. al. , International Immunology, 11: 11, 1999, ) 。
抗 CD40抗体が DCを成熟させることが示された（Z. H. Zhouet. al. , Hybridoma, 18:471 1999)。 さらに、 抗原特異的 CD8T細胞プライミングにおける CD4T細胞の 役割は、 CD40 - CD40Lシグナリングを介した DCの活性化にあることが報告され、 抗 CD40モノクローナル抗体（mAb)により、 樹状細胞 （DC) の活性化における CD4 ヘルパー T細胞の役割を代替できることが示された（Shoenberger, S. P. , et. al.： T - cell help for cytotoxic T lymphocytes is mediated by C請 - CD狐 interac t ions. Nature, 480, 1998)。 また、 マウスにおいて抗 CD40抗体の投与に より CD'40 を発現する腫瘍細胞のみならず非発現腫瘍細胞からも生体を防御可能 であることが示された (French, R. R. , et. al. ： CD40 ant ibody evokes a cyto toxic T-ce l l response that erad icates 1卿 tioma and bypasses T cel l he lp. Nature Med ic ine, 5, 1999)。
今まで報告されてきた抗体は DC 細胞に対する効果を指標に単離されているも のは少ない。 しかし DC細胞の機能修飾という点からは、 B細胞に作用する抗体を 選別したのでは、治療薬としては不充分である可能性が高い。マウス CD40に対す る抗体のモノクローナル抗体では、 抗体の認識するェピトープによって、 DCには 反応するが血管内皮細胞には反応しないクローンと、逆に DCには反応しないが血 管内皮細胞には反応するクローンとが存在すると報告されている （Van Den Berg, TK, e t. al. , I醒 unology, 88 : 294, 1996)。 ヒト CD40抗体に関してもェピトープ によって DCへの結合や作用の異なることが推測される。
抗 CD40抗体又は CD40リガンドにより CD40を発現するリンパ腫細胞株の増殖を 抑制し、細胞死を誘導できることが分かっている（Funakoshi S e t al. , Bl ood, 83 : 2782, 1994)、 (Funakoshi S e t al.， Journal of I匪漏 therapy, 19, 93, 1996)、
(Z. H. Zhou et. al. , Hybridoma, 18 : 471 1999)、 (Joseph A e t al.， Cancer Research, 60 : 3225, 2000)。 ァゴニスティック抗体において興味深いことは、 抗 体の働きが CD40Lの機能と必ずしも一致しないことである。 B細胞に対する活性 化作用と B細胞腫瘍に対する増殖抑制作用も、 必ずしも一致しない。 DC活性化能 と腫瘍細胞増殖抑制作用を併せ持つ抗体の開発が望ましい。 また、 ァゴニスティ ック抗体の中には、 CD40Lの CD40への結合を、 阻害するものも、 しないものも存 在する （Chal la A et al. , Al lergy, 54 : 576, 1999)。 例えば、 G28-5 (ATCC No. HB-9110) の生産する抗体は CM0Lと競合するため、 CD40L との併用効果はな い。抗体によって CM0発現細胞の活性化の程度にも差がある。単独で弱いァゴニ スティック活性を示す抗体でも、 CD40 リガンドと併用することによって、 CD40 リガンド単独による活性よりも、抗体存在下で活性が著しく促進する場合がある。 逆に、 単独でァゴニスティック活性を示す抗体でも、 CD40リガンドを阻害するこ とによって、 CD40リガンド単独による活性よりも、 抗体存在下での活性を低下さ せてしまう場合がある (Pound et al. , Internat ional Immunology, 11 : 11, 1999)。 CD40リガンドと競合しない抗体では、それ自身による腫瘍細胞の増殖抑制作用は 弱くとも、 CD40リガンド存在下ではより強い増殖抑制ができることが示されてい る （Joseph A e tal.， Cancer Research, 60 : 3225, 2000)。 このことから、 CD40 に結合し、 それ自身で細胞増殖を抑制する抗体でありながら、 CD40 リガンドの CD40に対する結合は阻害しないような抗体を開発することが望ましい。 このよう な特徴を生かすことにより、 可溶性 CD40Lよりも有効な治療薬を開発できる可能 性がある。 たとえば、 可溶性 CD40Lは CD40と結合し活性化するが、 同時に生体内 に存在している CD40Lの働きを抑制する。 CD40Lと競合しない抗体ならば、 この ようなことは起こらず、 相乗効果により、 より良い治療効果が期待できる。
3. アンタゴニスティック抗体
一方、 上記のように、 CD40が免疫反応において重要な役割を担っていることか ら、 CD40とそのリガンドの結合を阻害することで、 臓器移植時の免疫抑制や自己 免疫疾患の治療薬が開発できると期待される。 Sawada-Hase らは、 クローン病患 者の末梢血中の単球では CD40 を強く発現する細胞の割合が上昇していることを 報告している。 しかしながら、 CD40とそのリガンドの結合を阻害する抗体につい ては、 まだ良く分かっていない。 そのような阻害性抗体は、 たとえば、 CD40の機 能解析や、 CD40の活性化が必要な疾患の治療に有効である可能性がある。 また、 CD40リガンドに対する阻害抗体も、 CD40と CD40リガンドとの結合が関与する疾 患薬として有効である可能性が示されている。 しかしながら、 CD40L は活性化し た血小板に発現するという報告 （V. Henn et. al. , Nature 391 : 591, 1998) が あるため、 抗 CD40L抗体を治療薬として使った場合、 血栓を引き起こす危険性が 存在することが報告されている （T. Kawai et. al. , Nat. Medi. 6 : 114， 2000)。 このような観点から、 CD40とそのリガンドの結合を阻害する抗体治療薬としては、 抗 CD40L抗体よりも、むしろ CD40に対する抗体の方が安全性に優れると期待でき る。 抗 CD40抗体としては CD40Lの CD40への結合を抑制し、 なおかつ、 抗体自身 が CD40を活性化しないことが必要とされる。
ヒト CD40に特異的に結合し、 CD40Lの CD40への結合を抑制し、なおかつ、 CD40 を活性化しない抗体についての報告は、 過去に膨大な量の研究がなされてきたに もかかわらず、 5D12 と命名されたマウス抗ヒト CD40抗体のわずか 1例のみであ る Kwekkeboom et. Al. , I腿 imology 79 : 439, 1993) 。 まして、 B 細胞に対 して中和活性を示す抗体が、 DC細胞に対しても同様に、 CD40リガンドの作用を中 和できるかどうかは知られていなかった。 さらに、 ピオチン化した抗マウス CD40 抗体の作用が、 アビジンでの架橋によって増強されることが報告されている (Johnson et al. , Eur J Im醒 ol， 24, ： 1835, 1994)。 本発明者は可溶性リガン ドに予め遺伝子工学的に付与された、 タグ （FLAG) に対する抗体 （M2) を用いて、 可溶性 CD40リガンドの B細胞株 （Ramos細胞） に対する作用を増強し、 その中和 活性を測定したところ、 5D12 (ATCC No. HB-11339) がわずかにしか中和活性を示 さないことを確認した。
本発明者は新たに、 アンタゴニスト抗体である 5D12が架橋によって、 CD40Lの 非存在下であっても、 抗体単独でァゴニスト活性を持つことを見出した。 従来、 マウス CD40 抗体の作用がピオチンとアビジン架橋によって増強されることが報 告されている （Johnson et al. , Eur J I腿 unol, 24, ： 1835, 1994)。 また、 プレ —卜に固相化した抗免疫グロプリン抗体を用いて、 CD40抗体を固相化することで、 腫瘍細胞の増殖抑制活性が増加することが知られていたが、 これは固相化による 効果と考えられていた。 しかし、 培養液中に抗免疫グロブリン抗体を添加し、 抗 CD40抗体を架橋することによって、アンタゴニスティック抗体であってもァゴニ スティック活性を示す可能性があることは知られていなかった。 治療に用いる抗 体に抗原性があれば、 ヒトの体内で CD40抗体に結合する抗体が生じ、 CD40抗体 が架橋されることによって、 あたかも CD40リガンドのような活性を生じる、全く 逆の作用が懸念される。 したがって洽療薬の安全性の点から、 抗体の抗原性を低 く押さえることが非常に重要であると考えられる。 マウス抗体の可変領域の配列 をもとに、 ヒト化技術により、 治療薬として開発する場合、 ヒト化抗体は免疫原 性があることが知られているため、投与後に抗ヒト化抗 CD40抗体ができる可能性 があり、 ァゴニスティック抗体となる危険がある。 また抗原性が低くとも、 抗体 レセプ夕一 （FcR) によって抗 CD40抗体が架橋される可能性もある。 これらの点 から、 アン夕ゴニスティック抗体は、 CD40に特異的に結合し、 CD40Lの結合を抑 制し、 かつ、 架橋によっても CD40を活性化しないヒト抗体であって、 FcRへの結 合が弱いことが望ましいと考えられる。 . 発明の開示
上述のように、 近年 DC細胞の機能解析が進み、 CD40は DC細胞の働きを制御す る、 重要な遺伝子として認識され始めた。 このような背景から、 本発明は、 DC細 胞を用いた評価系を採用することにより、 樹状細胞（DC)表面のヒト CD40抗原に 対しても実質的にアン夕ゴニスティックである抗ヒト CD40 抗体又はその機能的 断片、および従来の抗ヒ卜 CD40抗体に比べてより治療効果の高いことが期待され るァゴニスティックな抗ヒト CD40 抗体又はその機能的断片を提供することを目 的とする。
本発明者らは、 ヒト CD40に対する抗体の作製に関して鋭意研究した結果、従来 知られている抗 CD40抗体に比して、より疾患への治療効果が高いと考えられる新 規なァゴニスティック抗体、 及びアン夕ゴニスティック抗体を作製することに成 功し、 本発明を完成した。 すなわち、 本発明は以下の通りである。 ，
( 1 ) 以下の（a)〜（ί)から選ばれる少なくとも 1つの性質を有する、 ヒト CD40 に対する抗体又はその機能的断片。
(a) 樹状細胞に作用し、 LPS及び IFNァの存在下で IL- 12を生産させる
(b) 樹状細胞に作用し、 該樹状細胞を成熟させる活性が G28-5抗体よりも高い
(c) B細胞樹立細胞株に対して、 CD95の発現を促進する活性が G28-5抗体より も高い
(d) B細胞樹立細胞株に対して増殖を抑制する活性が G28- 5抗体よりも高い
(e) B細胞樹立細胞株に対して細胞死を誘導する
(f) CD40リガンドの CD40に対する結合を阻害しない
( 2 ) 上記本発明の抗体又はその機能的断片は、 樹状細胞の成熟が、 20 x g/ml以 下の濃度で行われるものである。 また、 B細胞樹立細胞株に対して CD95の発現の 促進は、 20 g/ml以下の抗体濃度で行われる。 B細胞樹立細胞株としては、 例え ば amo s又は HS-Sul t onが挙げられる。 (3) また、 上記本発明の抗体又はその機能的断片は、 lxlO6個/ mlの濃度の樹状 細胞に、 0. l^g/ml以上の濃度の抗体が添加された場合は、 100pg/ml以上の IL - 12の生産をもたらすものであり、 1 g/ml以上の濃度の抗体が添加された場合は、 1000pg/ml以上、好ましくは 10000pg/ml以上の IL- 12の生産をもたらすものであ る。
(4)さらに、上記本発明の抗体又はその機能的断片は、 B細胞樹立細胞株（Ramos 細胞） に対する CD95の発現促進が、抗体濃度 0. O g/nilから 10 ig/mlの範囲に おいて、対照である G28- 5抗体の約 2倍から 3倍以上となるものである。例えば、 抗体濃度 0. Ol g/nilでは、対照である G28 - 5抗体の約 2倍から 6倍以上であり、 抗体濃度 0. l g/mlでは、 対照である G28 - 5抗体の約 2倍から 7倍以上であり、 抗体濃度 l^g/mlでは、 対照である G28-5抗体の約 2倍から 7倍以上であり、 そ して抗体濃度 10 zg/mlでは、対照である G28 - 5抗体の約 2倍から 6倍以上である。
(5) ハイプリドーマ KM302- 1 (受託番号 FERMBP- 7578)、 M341-1-19 (受託番号 FERM BP- 7759)、 2105 (受託番号 FERM BP-8024) または F卜 102 (受託番号 ATCC PTA-3337) により生産される抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域のアミノ酸 配列を有する抗体又はその機能的断片。
Figure imgf000009_0001
(6) 受託番号 ATCC PTA- 3302および ATCC PTA- 3303であるプラスミド DNAにそ れぞれコードされる、ハイプリドーマ F2-103の産生する抗体の重鎖可変領域およ び軽鎖可変領域、 受託番号 ATCC PTA- 3304および ATCC PTA-3305であるプラスミ ド ]) NAにそれぞれコードされる、 ハイプリドーマ F5-77の産生する抗体の重鎖可 変領域および軽鎖可変領域、 または受託番号 AKC PTA-3306および ATCC PTA-3307 であるプラスミド DNAにそれぞれコードされる、ハイプリドーマ F5- 157の産生す る抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域の、 マチュア部分のアミノ酸配列を有
Figure imgf000010_0001
( 7 ) 配列番号 2 8および 3 0にそれぞれ示される、 ハイプリドーマ ΚΜ34卜卜 19 の産生する抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域、 配列番号 3 2および 3 4に それぞれ示される、ハイプリドーマ 2 105の産生する抗体の重鎖可変領域および軽 鎖可変領域、 配列番号 3 6および 3 8にそれぞれ示される、 ハイプリ ドーマ U 0 の産生する抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域、 配列番号 4 0および 4 2に それぞれ示される、 ハイプリドーマ 1 15の産生する抗体の重鎖可変領域および軽 鎖可変領域、 配列番号 5 2および 5 4にそれぞれ示される、 八イブリ ドーマ KM643-4- 1 1の産生する抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域、配列番号 6 0お よび 6 2にそれぞれ示される、ハイプリド一マ F2- 103の産生する抗体の重鎖可変 領域および軽鎖可変領域、 または配列番号 6 4および 6 6にそれぞれ示される、 ハイプリドーマ F5— 77の産生する抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域の、マ チユア部分のアミノ酸配列を有する抗体又はその機能的断片。
( 8 ) 配列番号 2 7および 2 9にそれぞれ示される、 ハイプリドーマ KM341-卜 19 から単離された核酸配列にコードされる重鎖可変領域および軽鎖可変領域、 配列 番号 3 1および 3 3にそれぞれ示される 、イブリドーマ 2105から単離された核 酸配列にコードされる重鎖可変領域および軽鎖可変領域、 配列番号 3 5および 3 7にそれぞれ示される、 ハイプリドーマ 1 10から単離された核酸配列にコードさ れる重鎖可変領域および軽鎖可変領域、 配列番号 3 9および 4 1にそれぞれ示さ れる、 ハイプリドーマ 1 15から単離された核酸配列にコードされる重鎖可変領域 および軽鎖可変領域、 配列番号 5 1および 5 3にそれぞれ示される、 ハイブリ ド 一マ KM643-4-1 1 から単離された核酸配列にコードされる重鎖可変領域および軽 鎖可変領域、 配列番号 5 9および 6 1にそれぞれ示される、 ハイプリ ドーマ F2 - 103 から単離された核酸配列にコードされる重鎖可変領域および軽鎖可変領域、 または配列番号 6 3および 6 5にそれぞれ示される 、イブリドーマ F5— 77から 単離された核酸配列にコードされる重鎖可変領域および軽鎖可変領域の、 マチュ ァ部分のアミノ酸配列を有する抗体又はその機能的断片。
( 9 ) 以下の（g)〜（j)から選ばれる少なくとも 1つの性質を有する、 ヒト CD40 に対する抗体又はその機能的断片。
(g) CD40に対するリガンドの作用を中和する
( ) B細胞樹立細胞株上の CD40に対するリガンドが CD40発現細胞に与える影 響の 1つ以上を中和又は緩和し、 かつ、 抗免疫グロブリン抗体による架橋によつ て前記 B細胞樹立細胞株上の CD40に対するァゴニスティックな作用が 5D12より 弱い
(i) B細胞樹立細胞株に対して、 CD40リガンドが、 CD95の発現を増加させる作 用を緩和又は中和する
(j ) 樹状細胞に発現する CD40に対してアン夕ゴニスティックな作用を有する
( 1 0 ) 上記 （9 ) の抗体又はその機能的断片は、 飽和量の CD40L発現細胞を添 加した lxlO 固/ mlの濃度の Ramos細胞に、 0. 1 ^ g/mlの濃度の抗体が添加され た場合は、 Ramos細胞の CD95の発現を対照の約 10 %以下に抑制しうるものであり、 1 μ- s/mlの濃度の抗体が添加された場合は、 Ramos細胞の CD95の発現が陰性コン トロールと同レベルまで抑制されるものであり、 lO ^ g/mlの濃度の抗体が添加さ れた場合は、 Ramos細胞の CD95の発現が陰性コントロールと同レベルまで抑制さ れるものである。
( 1 1 ) 上記 （9 ) の抗体又はその機能的断片は、 インビト口において、 可溶性 CD40L (1 ig/inl) を添加した lxlO5個の扁桃腺 B細胞に、 0.001 zg/ml から 10 z g/mlの濃度の抗体が添加された場合に、扁桃腺 B細胞の増殖が約 80から 9 5 % 以上抑制されるものである。 例えば、 O.Ol g/mlから lO g/ml の濃度の抗体が 添加された場合は、 扁桃腺 B細胞の増殖が約 95 %以上抑制されるものであり、 特に、 0.001 xg/ml の濃度の抗体が添加された場合は、 扁桃腺 B細胞の増殖が約 80 %以上抑制されるものである。
(1 2) ハイプリドーマ KM28卜卜 10 (受託番号 FERM BP- 7579)、 4D11 (受託番号 FERM BP- 7758) または F4-465 (受託番号 ATCC PTA-3338) により生産される抗体 の重鎖可変領域および軽鎖可変領域のアミノ酸配列を有する抗体又はその機能的 断片。
Figure imgf000012_0001
(1 3) 配列番号 44および 46にそれぞれ示される、 ハイブリド一マ KM28卜 1-10の産生する抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域、配列番号 48および 5 0にそれぞれ示される、ハイプリドーマ 4D11の産生する抗体の重鎖可変領域およ び軽鎖可変領域、 または配列番号 56および 58にそれぞれ示される、 ハイブリ ドーマ F4-465の産生する抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域の、マチュア部 分のアミノ酸配列を有する抗体又はその機能的断片。
(14) 配列番号 43および 45にそれぞれ示される、 ハイプリドーマ KM28卜 卜 10から単離された核酸配列にコードされる重鎖可変領域および軽鎖可変領域、 配列番号 47および 49にそれぞれ示される、八イブリドーマ 4D11の産生する抗 体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域、 または配列番号 55および 57にそれぞ れ示される、 Λイブリドーマ F 4- 465から単離された核酸配列にコードされる重鎖 可変領域および軽鎖可変領域の、 マチュア部分のアミノ酸配列を有する抗体又は その機能的断片。
(15) 上記 （1) 〜 （14) の抗体又はその機能的断片としては、 ヒト抗体の ものが挙げられる。
(16) 上記 （1) 〜 （15) のいずれかの抗体又はその機能的断片を有効成分 として含む医薬組成物。 '
(17) 上記 （1) 〜 （8) のいずれかに記載の抗体又はその機能的断片を有効 成分として含む、 免疫賦活化剤、 抗腫瘍剤又は自己免疫疾患治療剤。
(18) 上記 （9) 〜 （14) のいずれかに記載の抗体又はその機能的断片を有 効成分として含む、 免疫抑制剤、 自己免疫疾患治療剤、 アレルギー治療剤又は血 液凝固第 VIII因子阻害症候群治療剤。
(1 9) ここで、 本発明のモノクローナル抗体の認識するヒト CD 40のェピト —プは、 ヒト CD 40の一次アミノ酸配列から得られたオーバーラップする合成 オリゴペプチドへの結合を調べるなどの周知の方法によって決定することができ る (例えば Ed Harlow and David Lane (eds. ) , Ant i bodies： A Laboratory Manual, 1988 Cold Spring Harbor Laboratory Press; US Patent No. 4708871)。 ファー ジディスプレイによるペプチドライブラリ一キット （New Engl and Bio labs) をェ ピトープマッピングに用いることもできる。 本発明は、 上述した個々のハイプリ ドーマによって産生される抗体又はその機能的断片の認識するヒト CD 40の新 規なェピトープを認識する抗体又はその機能的断片をも包含する。
(20) 本発明はさらに、 上述した個々のハイプリドーマから単離された、 抗体 の重鎖および Zまたは軽鎖の少なくとも可変領域をコードする核酸 （RNA または cDNA)、 該核酸を含むベクタ一、 該核酸を保持する宿主細胞を提供する。 以下、 本発明を詳細に説明する。 本明細書は、 本願の優先権の基礎である PCT 出願 PCT/US01/13672(2001年 4月 27日出願）、日本国特許出願 2001- 142482号（2001 年 5月 11 日出願）、 日本国特許出願 2001 - 310535号 （2001年 10月 5日出願） 及 び米国特許出願 USSN 10/040, 244 (2001年 10月 26日出願）の明細書及び/又は図面 に記載される内容を包含する。 発明者らは、 後述するように、 B細胞上の CD40に対してアンタゴニスティック である公知のモノクローナル抗体 5D12 (ATCC No. HB-11339) 力 DC細胞上の CD40 に対してはアンタゴニスティックではなかったという知見を得た。 さらに発明者 は、 CD40L の作用をブロックするアンタゴニスティック抗体であっても、 多くの モノクローナル抗体が抗免疫グロプリン抗体による架橋によって、 それ自身がァ ゴニスティック活性を示してしまうことを見出した。
本明細書で使用する用語の定義は以下のとおりである。
本発明でいう 「ヒト CD40J とは、 クラークら （E. A. Clark e t. al.， Pro Nat l. Acad. Sc i. USA 83 : 4494, 1986) 又はスタメンコビックら （I. Stamenkovic e t. al. , EMBO J. 8 : 1403, 1989)により示されているアミノ酸配列を有するポリぺプ チドを意味し、 特に B細胞、 D マクロファージ、 内皮細胞、 上皮細胞、 あるい はそれらの腫瘍細胞表面に発現する抗原ポリペプチドである。
「抗 CD40モノクローナル抗体」 とは、 細胞発現 CD40、 全長 CD40又ほ部分長 CD40 に対するモノクローナル抗体のいずれをも意味するが、より好ましくは CD40の細 胞外部分に結合し、 CD40を発現している細胞にァゴニスティックまたはアンタゴ ニスティックな作用をもたらすモノクローナル抗体を意味する。
さらに、 本発明で 「抗体」 とは、 ィムノグロブリンを構成する重鎖可変領域及 び重鎖定常領域並びに軽鎖の可変領域及び軽鎖の定常領域をコードする遺伝子 (「抗体遺伝子」 と総称する） に由来するものである。 本発明の抗体には、 いずれ のィムノグロプリンクラス及びアイソタイプを有する抗体をも包含する。 本発明 における抗体の 「機能的断片」 とは、 前記で定義した抗体の一部分 （部分断片） であって、 抗体の抗原への作用を 1 つ以上保持するものを意味し、 具体的には F (ab' ) 2 、 Fab'、 Fab, Fv、 ジスルフィ ド結合 FV、 一本鎖 FV (scFV)、 およびこれ らの重合体等が挙げられる （D. L King. , Appl icat ions and Engineering of Monoc lonal Ant ibodies. , 1998 T. J. Internat ional Ud)。 本発明で 「ヒト抗体」 とは、 ヒト由来の抗体遺伝子の発現産物である抗体を意 味する。
「ァゴ二スティック」 とは、 B 細胞、 腫瘍細胞又は榭状細胞などの細胞表面上 に発現する CD40に、そのリガンドが結合することを促進する作用、あるいは、 CD40 リガンドが CD40発現細胞に与える影響の 1つ以上を、 CD40を発現する細胞に与 える作用を意味し、 「ァゴニスティック抗体」 とは、そのようなァゴニスティック 作用を有する抗体を意味する。
「アン夕ゴニスティック」 とは、 B 細胞、 腫瘍細胞又は樹状細胞などの細胞表 面上に発現する CD40にそのリガンドが結合することを阻害する作用、あるいは、 CD40リガンドが CD40発現細胞に与える影響の 1つ以上を中和する作用を意味し、 「アン夕ゴニスティック抗体」 とはそのような作用を有する抗体を意味する。 本発明で言う 「樹状細胞 （DC)」 とは、 榭状白血球とも呼ばれ、 強力な抗原提示 機能を有する細胞の一群を指す。 用いる樹状細胞は、 例えば骨髄、 さい帯血又は 末梢血中に含まれる CD34陽性前駆細胞を培養することによって誘導される。ある いは、末梢血中の CD14陽性単球を GM- CSF及び IL- 4の存在下で培養することによ り得られる。
「未熟な DC」 (I腿 mature DC) とは、 CD14陰性、 CDla強陽性、 CD83, CD86陽性、 腿 Cクラス I I陽性である DCを意味する。
「成熟 D (：」 とは、 CD14陰性、 CDla陽性で CD83、 CD86、 MHCクラス I I強陽性と なったものを意味する。
本発明で 「DCを活性化する」 とは、 CD40による刺激に応答して DCが起こす変 化を意味し、 例えば未成熟 DCを成熟化させ、 CD80、 CD86、 HLA-ClassII を高発 現させる、 さらには IL- 12の産生を増強する、 あるいは T細胞が共存する場合に は、 T細胞に刺激を与え、 増殖を促すことを意味する。
本発明で B細胞、 B細胞株を活性化するとは、 CD40による刺激に応答して細胞 が起こす変化を意味し、例えば DNA合成を生じ、チミジン取り込みを促進し、 CD95 の発現量を増加させることをいう。
2 . 抗体の取得 本件発明の抗体を取得するためには、 抗原として組換え体で生産 ·精製した可 溶性ヒト CD40、 又はヒ卜 CD40を発現する遺伝子組換えマウス細胞株をマウスに 免疫することが好適である。 免疫に使用するマウスはヒト抗体を産生するマウス (Tomizuka. e t al.， Proc Nat l Acad Sc i USA. , 2000 Vol 97 : 722) であることが 望ましい。組換え体で生産 ·精製した可溶性ヒト CD40に結合するモノクローナル 抗体を選別することで、 B 細胞特異的に反応するクローンを選抜するよりも、 B 細胞以外の細胞に発現する CD40にも反応する抗体を得やすいと考えられる。免疫 したマウスのリンパ節の細胞ゃ脾細胞を使用し、 モノクローナル抗体の製造にお いて慣用されているケーラー及びミルシュタインらの方法 （Nature. , 1975 Vol. 256 : 495) を用いてハイプリ ドーマの作製を行うことができる。
また、 BIAcore 2000 (ビアコア社） などの表面プラズモン共鳴測定装置を用い て可溶性 CD40Lの CD40への結合を解析し、 CD40Lと競合しない抗体を選別する。 また Bリンパ腫の細胞増殖抑制を抗体単独で抑制する抗体を選別した。 さらに抗 体の選別を DCに作用するか否かを指標として行うことにより、 CD40Lと競合せず、 樹状細胞又は B細胞に働き、かつ CD40発現癌細胞の増殖を抑制するという利点を 備えた抗体を作製 ·選別しうる。
本発明の抗体は、取得されたハイプリドーマを培養することによって得られる。 また、 B 細胞やハイプリドーマ等の抗体産生細胞からヒトモノクローナル抗体又 はその可変領域をコ一ドする遺伝子をクローニングし、 適当なベクターに組み込 んで、 これを宿主 （例えば哺乳類細胞株、 大腸菌、 酵母細胞、 昆虫細胞、 植物細 胞など） に導入し、 遺伝子組換え技術を用いて産生させた組換型抗体を調製する ことができる (P. J. De lves. , ANTIBODY PRODUCTION ESSENTIAL TECHNIQUES. , 1997 WILEY、 P. Shepherd and C. Dean. , Monoc lonal Ant ibod ies. , 2000 OXFORD UNIVERSITY PRESS, J. W. God ing. , Monoc lonal Ant ibod ies : princ ipl es and pract ice. , 1993 ACADEMIC PRESS) 0 さらに、 トランスジエニック動物作製技術を 用いて目的抗体の遺伝子が内在性遺伝子に組み込まれたトランスジエニックなゥ シ、 ャギ、 ヒッジまたはブ夕を作製し、 そのトランスジエニック動物のミルク中 からその抗体遺伝子に由来するモノク口一ナル抗体を大量に取得することも可能 である。 ハイプリドーマをインビトロで培養する場合には、 培養する細胞種の特 性、 試験研究の目的及び培養方法等の種々条件に合わせて、 ハイプリ ドーマを増 殖、 維持及び保存させ、 培養上清中にモノクローナル抗体を産生させるために用 いられるような既知栄養培地又は既知の基本培地から誘導調製されるあらゆる栄 養培地を用いて実施することが可能である。
3 . スクリーニング
ァゴニスティック抗体の選抜には、 ヒト Bリンフォーマを用いた解析によって 行い、 CD95発現を促進する抗体の選別が可能である。 さらに純化した DCの培養 液に抗体を添加し、 成熟させる抗体を選ぶ。 あるいは、 未熟な]) C細胞を用いた混 合リンパ球反応で T細胞増殖活性を示す抗体を選ぶ。さらに成熟した DCに添加し IL-12生産促進作用のある抗体を選ぶ。 また、 CD40を発現する腫瘍細胞の増殖を 抑制もしくは細胞死誘導活性を持つ抗体を選ぶ。 CD40Lとの競合は BIACoreのよ うな表面プラズモン共鳴測定装置を用いて、 可溶性 CD40と可溶性 CD40リガンド の結合を抗体が阻害するかどうかで判別できる。あるいは、 B細胞株に対する CD40 リガンドの作用を増強するかどうかで判別する。
アンタゴニスティック抗体の選抜には、 ヒト Bリンフォーマを用いた解析によ つて行い、 さらに FLAGをタグとして有する可溶性 CD40Lを抗 FLAG抗体存在下で 添加することで、可溶性 CD40Lの、 ヒ卜 Bリンフォーマ細胞上の CM0への結合を より強力に阻害する抗体の選別が可能である。 可溶性 CD40Lの代りに、 CD40Lを コードする遺伝子の導入により、 細胞表面に多くの CD40Lを発現している組換え 細胞を用いることも可能である。 次いでヒト抗体を抗ヒト IgG抗体で架橋するこ とで、 架橋によって Bリンパ腫を活性化してしまうクローンを除外する。 さらに 純化し成熟させた DC細胞を用いた混合リンパ球反応で T細胞増殖抑制活性を示す 抗体や、 あるいは成熟した DCに CD40リガンドを添加した場合に IL-12生産抑制 作用のある抗体を選ぶ。
以上のようにして得られた抗体は、 少なくとも以下のいずれかの治療効果上有' 用と考えられる性質を有するものである。
(1) ァゴニスティック抗体の場合 (a) 樹状細胞に作用し、 LPS (リポポリサッカライド）及び IFNTの存在化で IL-12 を生産させる。 この場合の LPS濃度は lOpg/mlから lOng/mlであり、 IFNTの濃度 は 10— 4Mから 10— 2Mである。 1 xg/ml以上の抗体濃度、 好ましくは 0.1 g/ml以上 の抗体濃度において、公知のァゴニスティック抗 CD40抗体である G28- 5抗体を対 照とした試験よりも IL- 12の生産量が多い。 lxlO6個 /mlの濃度の樹状細胞に抗体 濃度 0. l /g/ml以上が添加された場合に 100pg/ml以上の IL- 12が生産され、ある いは l g/ml以上が添加された場合に 1000pg/ml以上の、好ましくは lOOOOpg/ml 以上の IL- 12が生産される。 （実施例 9、 実施例 1 3を参照のこと）
(b) 樹状細胞に結合し、樹状細胞を成熟させる作用を有する。 しかも、 20 g/ml 以下の濃度、 好ましくは 0. l〜15 g/ml、 さらに好ましくは 5〜15 g/ml の濃度 で抗体を樹状細胞とともに培養すると、 その成熟させる活性は G28- 5抗体よりも 高い結果が得られる。 （実施例 9を参照のこと）
(c) B細胞樹立細胞株に対して、 CD95の発現を促進する活性が G28- 5抗体より も高い。 この場合、 10 xg/ml以上、 好ましくは l g/nil以上、 さらに好ましくは 0. l^g/ml以上、 より好ましくは 0.0l g/ml以上、 最も好ましくは 0.001 g/ml を超える抗体濃度において、 G28- 5抗体を対照とした試験よりも CD95の発現を促 進する活性が G28-5抗体よりも高い。 CD95の発現を促進する活性について、 抗体 濃度 10 xg/ml、 l g/m 0. l^ /mK 0. Ol^g/mlにおいて G28 - 5抗体を対照とし た試験の倍率は以下の通りである （表 1)。
表 1
Figure imgf000018_0001
CD95の発現が促進するということは、抗体が B細胞樹立細胞株を活性化したこ とを意味する。 ここで、 B細胞樹立細胞株としては、 Ramos細胞、 HS- Sulton細胞 が挙げられる。 なお、 Ramos細胞はバーキッ卜リンパ腫であり、 ヒトの胚中心の B 細胞のモデル細胞である。 HS- Sul ton細胞はバーキットリンパ腫である。 （実施例 6、 実施例 1 2を参照のこと）
(d) B細胞樹立細胞株 （Ramos細胞又は HS- Sul ton細胞） に対して DNA合成、 チ ミジン取り込み、 増殖を抑制する活性が G28- 5抗体よりも高い。 この場合の抗体 濃度は、 少なくとも 0. 05 M g/ml、 好ましくは 0. i〜15 g/ffllである。 （実施例 8 を参照のこと）
(e) B細胞樹立細胞株に対して細胞死を誘導する。 （実施例 1 6を参照のこと）
(f) CD40 リガンドの CD40 に対する結合を阻害しない。 「阻害しない」 とは、 CD40に予め抗体が結合した状態であつても （つまり抗体が存在する場合であつて も）、 該抗体が存在しない場合と同程度に、 CD40Lが CD40に結合できることを意 味する。 CD40 リガンドと CD40はいずれかあるいは双方が膜発現型あるいは可溶 性タンパクであっても良い。 （実施例 1 1を参照のこと）
上記性質を有する抗体は、 例えば、 ハイプリドーマ KM302- 1 (FERM BP- 7578)、 ハイプリドーマ KM34卜卜 19 (FERM BP-7759) により産生される。
ハイプリドーマ KM341-卜 19により産生されるモノク口一ナル抗体の重鎖（H鎖） および軽鎖 （L 鎖） 可変領域の塩基配列およびアミノ酸配列が決定された （実施 例 1 7 )。 本発明はハイプリドーマ ΚΜ34卜卜 19の生産するモノクローナル抗体の 少なくとも重鎖可変領域、 もしくは重鎖全長をコードする DNA、 ならびに軽鎖可 変領域をコードする MAを提供する。 当該 DNAは実施例 1 7において記載された ものの他、 コドン縮重により同じアミノ酸配列をコードする他の DNAをも包含す る。 また、 本発明は、 実施例 1 7において開示された少なくとも重鎖可変領域の アミノ酸配列、 もしくは重鎖全長のアミノ酸配列と、 軽鎖可変領域のアミノ酸配 列によって規定されるモノクローナル抗体もしくはその機能的断片を提供する。
(2) アン夕ゴニスティック抗体の場合
(g) CD40 に対するリガンドの作用を中和する。 ここで、 「リガンドの作用」 と は、 T細胞又は他の細胞上に発現するリガンドの作用、 及び CD40に対する遊離の リガンドの作用のいずれをも意味する。 （実施例 7、 実施例 1 4を参照のこと） (h) B細胞樹立細胞株上の CD40に対するリガンドが CD40発現細胞に与える影 響の 1つ以上を中和し、 かつ、 抗免疫グロブリン抗体による架橋によって前記 B 細胞樹立細胞株上の CD40に対するァゴニスティックな作用を示さない。その作用 は 5D12よりも弱い。 「CD40発現細胞に与える影響」 とは、 発現細胞の活性化を意 味し、 B細胞においてはチミジン取り込み、 増殖を、 B細胞樹立細胞株においては CD95の発現増強などを意味する。 また、 DCにおいては成熟化、 CD86、 HLA- DR発 現増強、 共存する T細胞のチミジン取り込み、 増殖の促進、 IL- 12や IL- 10の生 産などを意味する。 抗免疫グロブリン抗体による架橋は、 培養液中に 0. 1 g/ml 以上の抗免疫グロプリン抗体を存在させることにより行われる。 （実施例 7を参 照のこと）
(i) B細胞樹立細胞株に対して、 架橋した CD40Lあるいは、 細胞に発現させた CD40Lが CD95の発現を増加させる活性を緩和又は中和する。タグに対する抗体な どで架橋し、作用が増強された CD40Lに対しても、活性を緩和あるいは中和する。 CD40に対するリガンド （遊離のリガンド、 特定の細胞に発現するリガンドの両者 を含む) が、 CD40発現細胞に結合すると、 細胞内でシグナル伝達を起こして、 最 終的に細胞表面上に CD95 (Fas) を発現する。 従って、 本発明のアンタゴニステ イツク抗体は、 CD40 に結合することにより、 上記シグナル伝達を阻害して CD95 の発現を中和する。 この場合の抗体濃度は、 l g/ml以上、 好ましくは 0. l g/ml 以上である。 （実施例 7、 実施例 1 4を参照のこと）
(j) DC上の CD40に対してアン夕ゴニスティックである。 すなわち、 CD40Lが DCを活性化する活性を緩和又は中和する。 DCが共存する T細胞上のリガンドによ つて刺激されると、 T細胞を活性化し、 チミジン取り込みなどを促進させる。 異 なった個体由来の DCと T細胞とを共存させる混合リンパ球反応では、 DCと T細 胞が相互作用を起こすことで、 T細胞の活性化が起こる。 本発明のアン夕ゴニス ティック抗体は、 CD40に結合することにより、 上記相互作用を阻害し、 結果とし てチミジンの取り込みが抑制される。 この場合の抗体濃度は、 少なくとも 0. 001 g/nilであり、 好ましくは 0. l〜10 g/mlである。 （実施例 1 0を参照のこと） 上記アン夕ゴニスティック抗体は、 例えば、 ハイプリドーマ KM28卜卜 10 (FE M BP-7579) , KM281-2-10-1-2 (FERM BP-7580) (2001年 5月 9 日付、 独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（茨城県つくば巿東 1丁目 1番地 1中 央第 6) )、 4D11 (FERM BP-7758) により産生される。
(3) 本発明の抗体は、 当業者に周知である遺伝子工学的改変、 すなわち抗体重鎖 のサブクラスを規定する領域を他のサブクラスを規定する領域に置換することに より、 異なるサブクラスのものに変換しうる （例えば、 EP 314161 公報を参照の こと）。 重鎖 （heavy chain) の可変領域を、 そのまま他のサブクラスの定常領域 (constant region) につなげることができる。 例えば、 本件発明の抗体のサブク ラスを IgG2あるいは IgG4に変換することにより、 Fcレセプターに対する結合度 を低下させることが可能である。具体的には、 Kabat ら（Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institute of Health, Bethesda, Md. (1991) ) によ る 、 ヒ ト抗体重鎖、 Εϋ index 118 (Ala)， 119 (Ser)部位に Nhel site (GCTAGC) を導入し、 この制限酵素を使って 消化することにより、 アミノ酸を変えずに、 他のサブクラスの IgGとつなぎかえ ることができる。 さらに、 定常領域のアミノ酸配列を人為的に改変すること、 あ るいはそのような配列を有する定常領域配列と本発明の抗体の可変領域とを結合 することにより、 Fcレセプターに対する結合度を低下させるこや（Lund J., et al. , J. I腿画 1. 1991 voll47:2657-2662 ), CDC活性を増加または減少することも可 能である（Tao M.， et. Al.， J. Exp. Med. 1991 vol 1025-1028, Idusogie E E. , et. Al. , J. Immunol. 2001 voll66:2571-5) 。 また、 ADCCや CDCなどの作用を 避けるために、 予めサブクラスが IgG2や IgG4の抗体のみを選別することも可能 である。 また、 本件発明の抗体に、 放射性核種、 細菌毒素、 化学療法剤、 プロド ラッグなどを結合させることにより癌などの疾患の治療効果をさらに増強するこ とも可能である。
4. 医薬組成物
また、 本発明の抗体の精製された製剤を含有する医薬組成物もまた、 本発明の 範囲内に含まれる。 このような医薬組成物は、 好ましくは、 抗体に加えて、 生理 学的に許容され得る希釈剤またはキャリアを含んでおり、 他の抗体または抗生物 質のような他の薬剤との混合物であってもよい。 適切なキャリアには、 生理的食 塩水、 リン酸緩衝生理食塩水、 リン酸緩衝生理食塩水グルコース液、 および緩衝 生理食塩水が含まれるが、 これらに限定されるものではない。 或いは、 抗体は凍 結乾燥 （フリーズドライ） し、 必要とされるときに上記のような緩衝水溶液を添 加することにより再構成して使用してもよい。.投与経路は、 経口ルート、 並びに 静脈内、 筋肉内、 皮下および腹腔内の注射または配薬を含む非経腸的ルートであ る。
この場合、 本発明の抗体の有効量と適切な希釈剤及び薬理学的に使用し得るキ ャリアとの組合せとして投与される有効量は、 1 回につき体重 1kgあたり 0. lmg 〜100mgであり、 2日から 8週間間隔で投与される。
本発明の抗体を含む医薬組成物を使用する場合は、 ァゴニスティック抗体につ いては、 免疫賦活化剤 (抗ウィルス剤、 抗感染症剤）、 抗腫瘍剤、 自己免疫疾患治 療剤であり、 これらの疾患が複数併発してもよい。 あるいは、 ガン特異的ぺプチ ドなどのワクチンとアジュバントとして併用することもできる。 また、 アン夕ゴ 二スティック抗体については、 臓器移植時における免疫抑制剤 （膝島移植や腎臓 などの移植時における拒絶反応、 GVHDの予防又は治療剤） として、 あるいは自己 免疫疾患 （例えば、 リウマチ、 動脈硬化治療薬、 多発性硬化症、 全身性エリ トマ トーデス、 特発性血小板減少症、 クローン病など） 治療剤、 喘息などアレルギー 治療剤、血液凝固第 VI I I因子阻害症候群の治療薬として有用であり、 これらの疾 患が複数併発してもよい。 .
CM0が関与する疾患の治療手段として、 抗 CD40抗体を用いる場合、 DC細胞の 機能を指標に、 抗体を選択することにより、 より良い治療効果をもたらす抗体が 得られると期待できる。
ァゴニスティック抗体では、より DCの活性化ができる抗体を選抜することによ り、 免疫増強の作用の強い抗体が得られることが期待される。 さらに成熟 DC の IL-12の生産促進を指標とすることで、 CTL誘導作用の強い抗体が得られる。 CTL 誘導により、ウィルス感染細胞や腫瘍細胞を除去する効果の高い抗体が得られる。 また、 相乗効果が期待できることから CD40 に結合する抗体でありながら、 CD40 リガンドの CD40に対する結合は阻害しないような抗体が望ましい。癌治療を考え た場合、 CD40を発現する癌細胞に直接細胞死を誘導あるいは増殖を抑制し、 かつ DC細胞を効率的に活性化する抗体があれば、相乗的な効果が期待され、 CD40を発 現しない腫瘍にも使用可能な治療薬となると考えられる。 この抗体はウィルス感 染症の治療薬ゃ抗腫瘍薬として有用と考えられる。
一方、 CM0に特異的に結合し、 CD40Lの結合を抑制し、 なおかつ、 CD40を活性 化しない抗体についても、 B細胞に対するリガンドの作用を抑制するのみならず、 DC細胞への作用を抑制できることが望まれる。 しかし、 今まで得られた、 抗体は B 細胞に対する効果を指標にとられてきたことから、 樹状細胞にも強い抑制作用 を持つ抗体を取得し、 医薬品として開発することには大きな意義がある。 さらに 上述のように抗 CD40抗体は架橋によって、全く逆の作用が懸念されるため、架橋 によっても CD40を活性化しない抗体が必要とされる。これま.でに報告されたヒト CD40に対する、 マウス等の非ヒト哺乳動物由来のモノクローナル抗体、 およびマ ウスモノクローナル抗体の可変領域とヒト免疫グロプリンの定常領域からなるキ メラ抗体や CDRグラフティングによるヒト型化抗体は、 抗原性を持つことが懸念 されるため、 CD40リガンドとの結合を阻害する抗体としてはヒト抗体が望ましい。 図面の簡単な説明
図 1は、 KM302- 1抗体が、 CD95発現を促進する結果を示す図である。
図 2 AJま、アン夕ゴニスティック抗体が Ramos細胞に対する CD40リガンドの働 きを中和することを示す図である。
図 2 Bは、アン夕ゴニスティック抗体が Ramos細胞に対する CD40リガンドの働 きを中和することを示す図である。
図 3は、 KM28卜卜 10抗体が Ramos細胞に対する CD40リガンドの働きを中和す ることを示す図である。
図 4は、 架橋された KM28卜卜 10抗体が CD95発現を促進しない結果を示す図で ある。
図 5は、 架橋された 5D12抗体が、 CD95発現を促進する結果を示す図である。 図 6は、 KM302- 1抗体による腫瘍細胞に対する増殖抑制効果を示す図である。 図 7は、 KM302- 1抗体が、 DC細胞の成熟化を促進する結果を示す図である。 図 8は、 KM302- 1抗体が、 DC細胞に IL- 12生産を促進する結果を示す図である。 図 9は、 腿 281-卜 10抗体による、 DCに対する CD40リガンドの働きを中和する ことを示す図である。
図 1 0は、 KM28卜卜 10抗体による、 DCに対する CD40リガンドの働きを中和す ることを示す図である。
図 1 1は、 KM302- 1抗体による未成熟 DC— MLRを活性化することを示す図であ る。
図 1 2は、 KM341- 1-19抗体等が、 amos細胞の CD95発現を促進する結果を示す 図である。
図 1 3は、 KM34卜 1- 19抗体が、 成熟 DC細胞の IL- 12生産を促進する結果を示 す図である。
図 1 4は、 KM34卜 1- 19抗体が、 成熟 DC細胞の IL- 10生産を促進する結果を示 す図である。
図 1 5は、 4D1 1抗体等が、 Ramos細胞に対する CD40リガンドの働きを中和する ことを示す図である。
図 1 6は、 KM302- 1 抗体が、 ヒト腫瘍細胞移植マウスモデルにおいて抗腫瘍効 果を示す図である。
図 1 7は、 KM341- 1-19抗体が、 腫瘍細胞に対して増殖抑制効果を示す図である c 図 1 8は、 F4- 465， 4D1 1, KM281-卜 10が抗原特異的 IgGの産生を抑制すること を示す図である。
図 1 9は、 F4- 465， 4D11, 腿 28卜 1 - 10が抗原特異的 IgMの産生を抑制すること を示す図である。
図 2 0は、 F4- 465が扁桃腺 B細胞の増殖を抑制することを示す図である。 発明を実施するための最良の形態
以下、 実施例により本発明をさらに具体的に説明する。 但し、 本発明はこれら 実施例に技術的範囲が限定されるものではない。
〔実施例 1〕 抗原の作製
(1)細胞
EL-4細胞は、 マウス由来の T細胞樹立株であり、 容易に入手することができる (ATCC No.： TIB- 39)。 Ramos B 細胞 (ATCC No.： CRL-1596) 並びにマウス抗 CD40 抗体産生ハイプリドーマ G28- 5 (HB- 9110)及び5012 ( -11339)は、 ATCCから購入 した。
(2) 抗原の発現と精製
ヒト CD40cDNA (Genbank Access ion Number : NM_001250) を錶型として、 以下 のプライマーを用いて、 PCRにより （95°C 5秒、 55°C 30秒、 72°C 30秒） X 20 サイクルの条件で細胞外領域を増幅した。
プライマー 1 ： 5' -CCCAGATCTGTCCATCCAGAACCACCCACTGCATGCAGAG-3' (配列番号 1) プライマー 2 ： 5' -ACAAGATCTGGGCTCTACGTATCTCAGCCGATCCTGGGGAC-3* (配列番号 2)
増幅した cDNAは、 pFas tBacベクタ一 （Gibco BRL) の、 メリチンシグナル配列 の後、 ヒト IgGl由来 FC又はマウス IgG2a由来 FC領域の前に挿入した。 CD40生 産のため、 組換えバキュロウィルスは、 使用説明書にしたがって作成した。 Tn5 細胞を組替えウィルスで感染させた後、 4日間培養した。 上清は、 0. 22nmフィル 夕一で処理した後、 Prote inG sepharose (Amers am Pharmac i a) を添カロし、 4°C で静かに振盪した。 一晩後、 sepharoseをカラムに移し、 20倍容量の PBSで洗浄 した。 ヒト CD40 FC蛋白質は、 20mMグリシン緩衝液 （pH3. 0) により溶出した。 CD40を細胞表面に発現させるためのベクタ一は、 Randolph J . Noel leから入手 した (Inui, S et al. , EJI, 20, 1747-1753, 1990) . 全長 cDNAは ¾alにより酵素 切断し、 pCDNA3 (INVITR0GEN) に挿入した。ベクタ一を EL- 4細胞に導入し、 0. 5mg /mlの G418 (Gibco BRL) 存在下で培養することにより安定発現株を得た。 CD40 の発現は、 FITC-結合抗ヒト CD40抗体 （Pharniiiigeii) を使い、 FACS解析により確 認した。
〔実施例 2〕 免疫用マウスの作製
免疫に用いたマウスは、内因性 Ig重鎖及び/ c軽鎖破壊の両者についてホモ接合 体の遺伝的背景を有しており、 かつ、 ヒト Ig重鎖遺伝子座を含む 14番染色体断 片（SC20)及びヒト Ig K鎖トランスジーン （KCo5) を同時に保持する。 このマウス はヒト Ig重鎖遺伝子座を持つ系統 Aのマウスと、 ヒト Ig c鎖トランスジーンを 持つ系統 Bのマウスとの交配により作製した。系統 Aは、 内因性 Ig重鎖及び κ軽 鎖破壊の両者についてホモ接合体であり、 子孫伝達可能な 14 番染色体断片 (SC20)を保持するマウス系統であり、 例えば富塚らの報告 （Tomi zuka. et al.， Proc Nat l Acad Sc i USA. , 2000 Vol 97 : 722) に記載されている。 A系統マウスを 免疫することによって、 以下に示すハイプリドーマ、 F2-103, F5- 77を取得した。 また、系統 Bは内因性 Ig重鎖及び κ軽鎖破壊の両者についてホモ接合体であり、 ヒト Ig /c鎖トランスジーン （KCo5) を保持するマウス系統 （トランスジエニック マウス） であり、 例えば F i shwi ldらの報告 （Nat B iot echnol. , 1996 Vol 14 : 845) に記載されている。
系統 Aの雄マウスと系統 Bの雌マウス、 あるいは系統 Aの雌マウスと系統 Bの 雄マウスの交配により得られた、血清中にヒ卜 Ig重鎖及び/ 軽鎖が同時に検出さ れる個体（Ishida&Lonberg, IBC s 11 th Ant ibody Engineering, Abs t rac t 2000) を、 以下の免疫実験に用いた。 なお、 前記ヒト抗体産生マウスは、 契約を結ぶこ とによって、 麒麟麦酒株式会社より入手可能である。 前記マウスを免疫すること によって、 以下に示すハイプリドーマ、 KM302-L KM341-1-19, 議 43- 4- 11、 2053、 2105、 3821、3822、285、 110、 115、 腿 281 -卜 10、KM28卜 2- 10- 1- 2、KM283_5、KM292-卜 24、 觀 5-2- 56、 KM341-6-9, 4D1 5H10、 11EK 5G3、 3811、 3411、 3417を取得した。 また、 Kuroiwa らが報告しているヒト抗体 Lambda 鎖を保持するキメラマウス (Kuroiwa et. Al. , Nat Biotechnol. , 2000 vo l 18 : 1086) も以下の免疫実験に 用いた。 このマウスからはハイプリ ドーマ F4 - 465を取得した。
〔実施例 3〕 ヒ卜 CD40に対するヒ卜モノクローナル抗体の調製
本実施例におけるモノクローナル抗体の作製は、 単クローン抗体実験操作入門 (安東民衛ら著作、講談社発行 1991) に記載される一般的方法に従って調製した。 免疫原としてのヒト CD40は、 実施例 1で調製したヒト CD40ヒト FCと CD40発現 EL - 4細胞を用いた。 被免疫動物は、 実施例 2で作製したヒト免疫グロブリンを産 生するヒト抗体産生マウスを用いた。
ヒト抗体産生マウスに、 CM0 :hFcを 1個体当たり 2から 100 g/回で免疫した。 抗原溶液は初回を除いて等量の不完全フロイントアジュバント （シグマ） と混合 し、皮下に数力所に分けて注入した。約 10日から 3週間ごとに 3-4回免疫を行つ た。 初回は不完全フロイン卜アジュバント （シグマ） を用いた。 マウスの尾から 採血し、 血清中の CD40に対するヒト抗体ァおよび κを、 EUSAを用いて測定した ( 脾臓を摘出する 3-4日前に尾静脈より、 PBSに溶解した CD40 : Fcを 注射し 最終免疫した。
ヒト抗体産生マウスに、ヒ卜 CD40を発現するマウス EL-4細胞を免疫した。 EL - 4 細胞 108個 /mlで PBSに懸濁し、 予め PBSでェマルジョン化した等量の RIBIアジ ュバントと緩やかに混合した。細胞は約 10日から 3週間ごとに 3-5回免疫を行つ た。 アジュバントを用いない場合は、 SOOOradで X線照射し用いた。
免疫されたマウスから脾臓を外科的に取得し、 回収した脾臓細胞をマウスミエ ローマ SP2/0 (ATCC No.： CRL 1581) と 5 ： 1で混合し、 融合剤としてポリェチレ ングリコール 1500 (Boehr inger Mannhe im社製） を用いて細胞融合させることに より多数のハイプリドーマを作製した。ハイプリドーマの選択は、 10%のゥシ胎児 血清 （Fe t al Cal f Ser腹、 FCS) とヒポキサンチン（H)、 アミノプテリン（A)、 チミ ジン（T)を含有する HAT含有丽 EM培地 （Gibco BRL社製） 中で培養することによ り行った。 さらに、 HT含有 DMEM培地を用いて限界希釈法によりシングルクロー ンにした。 培養は、 96ウェルマイク口タイ夕一プレート （べクトンディツキンソ ン社製）中で行った。抗ヒト CD40ヒ卜モノクローナル抗体を産生するハイプリ ド 一マクローンの選択 （スクリーニング） は、 実施例 4で後述する酵素標識免疫吸 着アツセィ （ELISA) および蛍光活性化セルソ一ター （FACS) により測定すること により行った。
ヒトモノクローナル抗体産生ハイプリドーマの ELISAによるスクリーニングは、 以下に述べる 3種類の ELISAおよび FACS解析により、 ヒ卜免疫グロブリンァ鎖 (hlg r ) 及びヒト免疫グロブリン軽鎖 κを有し、 かつヒト CD40に特異的な反応 性を有するヒトモノクローナル抗体を産生する多数のハイプリ ドーマを得た。 な お、 本実施例を含め以下のいずれの実施例中、 並びに実施例における試験結果と して示した表または図中においては、各々の本発明のヒト抗ヒト CM0モノクロ一 ナル抗体を産生するハイプリドーマクローンは記号を用いて命名した。 また、 当 該記号の次に 「抗体」 を付したものは、 それぞれのハイプリドーマにより産生さ れる抗体、 または当該ハイプリドーマから単離された抗体遺伝子 （全長あるいは 可変領域） を保持する宿主細胞により生産された組換え抗体を意味する。 また文 脈上明らかな範囲において、 ハイプリド一マクローンの名称が抗体の名称をあら わす場合がある。
以下のハイプリドーマクローンはシングルクローンを表わす。
ァゴニスティック抗体：
KM302-K KM341 - 1- 19、 讓 3-4- 11、 2053、 2105、 3821、 3822、 285、 110、 115、 F 1- 102、 F2-103, F5— 77、 F5-157
アン夕ゴニスティック抗体：
腿 28卜卜 10、 KM281-2-10-1-2, KM283- 5、 題 292 - 1-24、 KM225 - 2 - 56、 願 41- 6- 9、 4D1 K 5謂、 11E1、 5G3、 3811、 3411、 3417、 F4-465 それらの内 3 つのハイプリドーマクローン KM 302-1、 KM 281-1-10および KM 28卜 2- 10-1- 2を平成 13年 （2001年） 5月 9日付で、 クローン KM34卜 1-19および 4D11 を平成 13年 （2001年） 9月 27 日付で、 クローン 2105を平成 14年 （2002 年） 4月 17 日付で独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センタ一 （茨 城県つくば巿東 1丁目 1番地 1中央第 6 ) にブダぺスト条約に基づき国際寄託し た。 F2- 103、 F5- 77および F5-157の重鎖および軽鎖の可変領域を有するプラスミ ドを 2001年 4月 19日付で， ハイプリドーマクローン F卜 102および F4- 465を 2001 年 4月 24日付で ATCC (Amer ican Type Cul ture Col lect ion, 10801 Univers i ty Blvd. , Manassas, Vi rginia, USA) (アメリカ国立菌培養収集所、アメリカ合衆国 ヴ ァ一ジニァ州 20110-2209 マナサス 10801 ュニバーシティブルバード）にブダぺ スト条約に基づき国際寄託した （表 2 )。 2
Figure imgf000029_0001
〔実施例 4〕 ハイプリドーマのスクリーニング
ヒ卜免疫グロブリンァ鎖を有するモノクローナル抗体の検出
実施例 1で作製したヒト CD40マウス FC ( l g/nil) 50 1/ゥエルを、 ELISA用 96穴マイクロプレート （Maxisorp、 Nunc社製） の各ゥエルに加え、 4°Cでインキ ュペートし、 ヒト CD40マウス FCをマイクロプレートに吸着させた。 次いで、 上 清を捨て、 各ゥエルにブロッキング試薬 （ブロックエース、 大日本製薬） を加え 室温でインキュベートしブロックした。 各ゥエルに、 各々のハイプリ ドーマの培 養上清 （50 l) を加え、 反応させた後、 各ゥエルを、 0. l%Tween20含有リン酸緩 衝液（PBS- T) で洗浄した。 次いで、 過酸化酵素で標識されたャギ抗ヒ卜 IgG ( r ) 抗体 （シグマ、 A0170) を 1%FBS含有 PBS-Tで 5, 000倍に希釈した溶液 （50 /2 1/ ゥエル） を、 各ゥエルに加え、 インキュベートした。 マイクロプレートを、 PBS- Tで 3回洗浄後、 発色基質液 （TMB、 ゥエル、 住友べ一クライト社製） を 各ゥエルに加え、 室温下で 30分間インキュベートした。 各ゥエルに、 停止液 （50 IZゥエル） を加え、 反応を止めた。 波長 450nmでの吸光度をマイクロプレート リーダーで測定した。陽性 wel lの培養上清を FACSにて解析し， Ramos細胞を染色 する wel lを選び、 その細胞を限界希釈法でクローニングし、 lwel lについて 1ク ローンの細胞を得た。 ヒト CD40マウス FCを用いた ELI SAで h K陽性を確認した。 その結果、 20個体のマウスから 173クローンの抗ヒト CD40抗体が取得できた。 その一部を表 3 (ァゴ二スティック抗体） 及び表 4 (アン夕ゴニスティック抗体） に示す。 ァゴニスティック抗体のうち、 少なくとも腿 341-卜 19と 2105は、 C D 4 0 Lが発現している細胞、 C D 4 0が発現している細胞および抗体を用いた競 合試験でリガンドとの顕著な競合を示さなかつた。
表 3 ァゴニスティック抗体
Figure imgf000030_0001
表 4 アン夕ゴニスティック抗体
八ィプリドーマ ？几原 サブクラス 架橋の DC-MLR
影響
匪 1-1-10 CD40マウス FC IgGl 小 抑制
KM281-2-10-1-2 CD40マウス FC IgGl 小 未実施
KM283-5 CD40マウス FC IgG4 大 抑制せず 腦 5-2 - 56 CD40マウス FC IgG4 大 未実施
KM292-1-24 CD40マウス FC IgG2 大 未実施
KM341-6-9 ヒト CD40発現 EL-4 IgGl 大 未実施
4D1 1 CD40マウス FC IgGl 小 未実施
5H10 CD40マウス FC IgGl 小 未実施
1 1E1 CD40マウス FC IgGl 小 未実施
5G3 CD40マウス FC IgG2 大 未実施
3811 ヒト CD40発現 EL-4 IgGl 大 未実施
341 1 ヒト CD40発現 EL-4 IgG2 大 未実施
3417 ヒト CD40発現 EL-4 IgG2 大 未実施
F4-465 ヒ卜 CD40発現 EL-4 IgGl 未実施 未実施 ヒト免疫グロブリン軽鎖 κ (Ig /c ) を有するモノクローナル抗体の検出は、 過 酸化酵素で標識したャギ抗ヒト Ig / 抗体（1, 000倍希釈、 50 1/ゥエル、 Sou thern Biotechnology社製） を用いた他は、 上述したヒト免疫グロブリンァ鎖の ELISA と同様に行った。
各モノクローナル抗体のサブクラス同定は、 それぞれ過酸化酵素で標識したヒ ッジ抗ヒト IgGl抗体、 ヒッジ抗ヒト IgG2抗体、 ヒッジ抗ヒト IgG3抗体又はヒッ ジ抗ヒ卜 IgG4抗体 （各 2， 000倍希釈、 50 l/ゥヱル、 The B inding Si te社製） を用いた他は、 上述したヒト免疫グロブリンァ鎖の ELISAと同様に行った。 ヒト CD40発現細胞に対する各モノクローナル抗体の反応試験
CD40が発現していると報告されている Ramos細胞株に対する各モノクローナル 抗体の反応性の検討を FACS解析で行った。
2xlOB/mlの濃度で Ramos細胞株を 0. l%NaN3、 2%FCS含有 PBSの染色バッファー (SB) に浮遊させた。細胞浮遊液（100 1Zゥエル） を 96_we l l丸底プレート （ベ クトンディッキンソン社製） に分注した。 各々のハイプリ ドーマの培養上清 （50 H \ ) を加え、 氷温下 30分間インキュベートした。 陰性コントロールとしてヒト 血清アルブミンに対するヒト IgGl 抗体を用い、 ハイプリ ドーマ培養培地で I n g/mlの濃度に調製し、 50 l添加後氷温下 15分間インキュベートした。 SBで洗 浄した後、 250倍希釈した R-PE蛍光標識抗ヒト抗体（Southern B iotechnology社 製） 50 1 を加え、 氷温下 15分間インキュベートした。 SBで 2回洗浄した後、 300- 500 1の FACS緩衝液に懸濁し、 FACS (FACSort, FACScan, べクトンディッ キンソン社製） で各細胞の蛍光強度を測定した。 その結果、 Ramos 細胞株に結合 活性を有する抗体を選別した。
〔実施例 5〕 各抗体の調製
モノクローナル抗体を含む培養上清の調製は以下の方法にて行った。
G28-5抗体生産ハイプリドーマは ATCCより入手した（ATCC No. -9110)。抗 040 抗体産生ハイプリドーマをゥシインシュリン （5 g/ml、 Gibco B L社製）、 ヒト トランスフェリン （5 g/ml、 Gibco BRL 社製）、 エタノールァミン （0. 01mM、 シ ダマ社製）、亜セレン酸ナトリウム （2. 5 l0-5 nM, シグマ社製）含有 eRDF培地 （極 東製薬社製） に馴化した。 スピナ一フラスコにて培養し、 ハイプリドーマの生細 胞率が 90%になった時点で培養上清を回収した。 回収した上清は、 10 / m と 0. 2 m のフィルター （ゲルマンサイエンス社製） に供し、 ハイプリドーマ等の雑排 物を除去した。 ■
上記培養上清からの抗 CD40抗体の精製は以下の方法で行った。 抗 CD40抗体を 含む培養上清を Hyper D Prote in Aカラム （日本ガイシ製） あるいはマウス IgGl の精製には Prot e in Gカラム （アマシャムフアルマシアバイオテク） を用い、 付 属の説明書に従い吸着緩衝液として PBS (-)、 溶出緩衝液として 0. 1 Mクェン酸ナ トリゥム緩衝液（pH 3)を用いてァフィ二ティー精製した。溶出画分は l MTr i s- HC1 (pH 8. 0) あるいは Na2HP04溶液を添加して pH7. 2付近に調整した。 調製された抗 体溶液は、 透析膜 （10000カット、 Spect rum Laborator ies社製） あるいは SP力 ラム （アマシャムフアルマシアバイオテク） を用いて PBS (-)に置換し、 孔径 0. 22 mのメンブランフィルタ一 MILLEX- GV (MILLIP0RE製） でろ過滅菌した。 精製抗 体の濃度は 280 皿の吸光度を測定し、 1 mg/ml を 1. 45 0D として算出した。
〔実施例 6〕 Ramos細胞における抗 CD40ァゴニスティック抗体による CD95発現 促進
5. OxlO5個/ mlの Ramos細胞懸濁液を 96ゥエルプレートに lOO ^ l/we l lで播種 した （1ゥエルあたり 5xl04個）。 ハイプリドーマ培養上清又は精製抗体を 20 g/mlに培地で希釈し、 96ゥエルプレートに 100 /2 1/wel lの濃度で添加した。ー晚 培養後、 細胞を集め R- PE標識抗 CD95抗体 （Riarmiiigeii N;0 を用い、 FACSCanあ るいは FACSsort (べクトンデッキンソン） を使って解析した。 図 1に結果を示す。 図中横軸は CD95の発現強度を示す。抗体添加を太線、未添加を細線により示した。 KM302- 1抗体は、 公知の抗体である G28- 5抗体に比して、 CD95発現をより促進す ることが示された。 すなわち、 より効果の高いァゴニスティックであることが示 された。 〔実施例 7〕 Ramos細胞における抗 CD40アン夕ゴニスティック抗体による CD95 発現抑制
1. OxlO6個/ mlの Ramos細胞懸濁液を 96ゥエルプレートに 50 1/wellで播種し た。 ハイプリドーマ培養上清又は精製抗体を 2 ig/mlに培地で調整し、 96ゥエル プレートに 100 1/well添加した。 可溶性 CD40リガンド (ALEXIS CORPORATION) を 4 g/mIと抗 FLAG抗体 （M2、 シグマ） 4 g/mlとを培地に添加し、 96ゥエルプ レートに 50 xl/wdl添加した。 一晩培養後、 細胞を集め R- PE標識抗 CD95抗体
(P armingenNJ) を用い、 FACSを使って解析した。 図 2A、 図 2B、 図 3に結果を 示す。図中横軸は CD95の発現強度を示す。 KM281-1-10, KM281-2-10-1-2, KM283-5, KM292-卜 24、 KM225-2-56の各ハイプリドーマが生産した抗体では陰性コントロー ルと同程度まで CD95の発現を抑制した。
図 3において、 KM281-卜 10抗体 （下パネル） は、 公知の抗体である 5D12抗体
(中央パネル） がわずかにしか CD95発現を抑制しなかったのに比して、 CD95発 現をより抑制することが示された。 すなわち、 より効果の高いアン夕ゴニスティ ックであることが示された。 これによつてヒトモノクローナル抗体がアン夕ゴニ スティック抗体であることが示された。 抗免疫グロプリン抗体による架橋の影響
1. OxlO6個/ mlの Ramos細胞懸濁液を 96ゥエルプレートに 50 xl/wellで播種し た。 八イブリドーマ培養上清又は精製抗体を 2 g/nilに培地で調整し、 96ゥエル プレートに 100 xl/well添加した。 抗ヒト IgG抗体 （シグマ、 13382) あるいは抗 マウス IgG抗体 （Biosource、 崖 13401) を 4 g/mlとなるよう培地に添加し、 96 ゥエルプレートに 50 xl/well添加した。一晩培養後、細胞を集め R- PE標識抗 CD95 抗体 （PharmingenNJ) を用い、 FACSを使って解析した。 図 4、 図 5に結果を示す。 図中横軸は CD95の発現強度を示す。 願81 - 1 - 10、 KM281- 2- 10- 1- 2の各ハイプリ ドーマが生産した抗体では CD95 の発現を抑制した。 しかし、 5D12、 KM283-5, KM292-1-24, KM225-2-56の各ハイプリドーマが生産した抗体では CD95の発現を 逆に増強した。 〔実施例 8〕 Ramos細胞における抗 CD40ァゴニスティック抗体による増殖抑制 l. OxlO5個/ ml の Ramos細胞、 HS- Sulton懸濁液を ％ゥエルプレートに lOO z 1/wellで播種した。 精製抗体あるいは可溶性 CD40リガンドと抗 FLAG抗体 （M2) との等量混合物を培地に添加し、 2 日培養後、 lOO Ci/inl の ¾- Thymidine (Amer sham Pharmacia)を 10 l添加した。 18時間後、 Macro96 Harvester (SKATRON) を用 いて、 Printed Filtermat A(Wallac) にハーべス ト し 、 乾燥後 Betap;Scint (Wallac)に良く浸し、 パッケージング後、 1205 BETAPLATE 液体シン チレーシヨンカウンターで活性測定した。 図 6に結果を示す。 図中、 縦軸は細胞 による ¾チミジンの取り込み量を、横軸は培養液中の抗体あるいは CD40L濃度を 示す。 Ramos細胞、 HS-Sulton細胞ともに、 KM302-1抗体を添加した場合に、 従来 の G28- 5抗体や CD40Lと比較して、 チミジンの取り込みが低く、 KM302- 1抗体が 腫瘍細胞の増殖を効果的に抑えられるァゴニスティック抗体であることが示され た。
〔実施例 9〕 CD40ァゴニスティック抗体による樹状細胞の活性化
(1) 材料及び方法
組換え型ヒト IL- 4は Genzyme teclme社より購入した。 抗ヒト CD14 MACS beads は Miltenyi Biotech GmbH社より購入した。 Ly即 hoprepは Nycomed Pharma ASよ り購入した。培養に用いた培地は、 DC誘導時には匪 1640 (Gibco BRL)に 10¾ heat inactivated FCS(Cell Culture Technologies), lOmM HEPES (Sigma), 55 2- mercaptoethanol (Gibco BRL) , 硫酸ストレプトマイシン （明治製菓） を加えて用 いた。 染色時の細胞洗浄には 2% FCS (Cell Culture Technologies), 0.02% Azaid 添加 PBS (Sigma)を用いた。 細胞凍結時には日本全薬工業社製のセルバンカーを 用いた。
(2) 単球由来 DCの誘導
末梢血より Lymphoprepを用いた密度勾配遠心により単核球を調製した（PBMC)。 これを抗ヒト CD 14 MACS beads でポジティブセレクションすることにより CD14 陽性画分と陰性画分に分離した。 陽性画分に組換え型ヒト GM-CSF (50ng/ml)と組 換え型ヒト IL-4 (lOOng/ml)を添加して、 10%FCSを添加した RPMI 1640培地にて 6 wel l プレートで培養した。 培養開始時の細胞濃度は l x iOVmlで 1 we l l に 3ml ずつで行った。 培養中は 2日に 1度の培地交換を行った。 培地交換は培養液の 1 割を遠心チューブにとり遠心し、 上清を除去後、 とった培養液の 2倍容量の新し い培養液（サイトカインなどを上記濃度で含む） で懸濁し、 各 we l lに戻した。 培 養 6 日目には細胞を回収し、 細胞数を計算後、 上記培地に l X lOVml の濃度で懸 濁し、抗 CD40抗体又はそのアイソタイプ対照を添加して 24 we 11プレートでさら に 4日間の培養を行った。 この間培地交換は行わなかった （1ゥエルあたりの細 胞数 lxlO6個、 細胞濃度 lxlO5個 Zm 1 )。
(3) 細胞染色及びフローサイトメーターによる解析
染色には抗 HLA-DR抗体（アイソタイプ対照： rat IgG2a)、 抗 CD86抗体（ァイソ タイプ対照：ラット IgGl)、 抗 CD83抗体（アイソタイプ対照：ラット IgG2b)を用い た。まず、抗体を加え 30分、 4°Cでィンキュベートした後、 3回の洗浄し、 Beckton Dickinson社製 FACS Cal iburを用いて解析を行った。
(4) Mature DCに対する IL- 12 secre t ion能の亢進
上記のように未成熟 DCを得た後、 LPS (400pg/ml)と IFN T (10_¾)を加えさら に 2日間の培養後成熟 DCを得た。 これに抗 CD40抗体またはアイソタイプ対照を 10 i g/ml加え、 24時間後の上清について IL- 12の産生を ELISA (Pharmingen社製） 法にて測定した。
(5) 結果および考察
ァゴニスティック抗体である KM302- 1抗体が、 DCの成熟化に及ぼす抗体の影響 を図 7に、 成熟 DCの IL- 12生産に及ぼす影響を図 8に示す。 G28- 5抗体を対照と して成熟の度合いを比べた。 CD86、 HLA- DRの発現を見た結果、 G28- 5抗体と比較 して、 KM302-1 抗体ではさらに発現が上昇し、 すなわち成熟度が亢進させること が示された。 また、 IL- 12の分泌については成熟 DCへの KM302-1抗体の処理によ つて亢進することが示された。 以上より KM302- 1抗体が、 DCに対するァゴニステ ィック抗体として作用することが示された。
〔実施例 10〕 DC-MLR
正常ヒトから採取した血液 （末梢血） を、 2000ΓΡΙΠ 10分遠心し、 血清を吸い取 つた。 血球分画を PBSで再懸濁し、 Ficoll (Amersham Pharmacia) の上に静かに 載せた。 2000nmi30分遠心し、 中間層の PBMC部分を回収する。 PBSで 2回洗浄し た後、 MACSを用い特定の細胞分離に使用した。
DC培養のための単球の分離は、 MACS (Miltenyi Biotec GmbH) を用い添付の説 明書にしたがって行った。簡単に説明すると、 PBMC lxlO8個に対して、 MACS Buffer 800 1, MACS CD14 (Miltenyi Biotec GmbH, 502-01) 200 1 を添加し、 4°Cで 15分処理した。 MACS LSカラムに細胞を吸着させ、 洗浄した。 カラムに吸着した 細胞を単球として回収した。 カラムに吸着しなかった細胞に、 MACS HLA-DR
(Miltenyi Biotec GmbH, 461-01) を添加し、 BSカラムで HLR— DR陽性細胞を除 去し、 T細胞画分とした。 FACSにより CD3陽性細胞の比率を計測し、 T細胞画分 全体の細胞数より実質的な T細胞数を算出した。 得られた単球は、 6ゥエル培養 皿に、 lxlO6細胞 Zml の濃度で lOOngZml の IL— 4 (R&D system) ， 50ng/ml の G-CSF (KIRIN) , 10%の FCS(SIGMiV)を含む R0培地 （PPMI培地に、 i3-メルカプ卜ェ 夕ノール （Gibco) , HEPES (SIGMA) を添加したもの） で培養した。 培養 5日後に、 10ng/mlの LPS (DIFC0) を添加し、 成熟 DCに分化させた。
MLRは、 異なるヒトから分離した、 T細胞と成熟 DCを混合することにより行つ た。 T細胞 ZDCの細胞比をそれぞれ、 1 : 80とし、 T細胞数は、 2xl05細胞 Zゥェ ルとする。 まず最初に、 DCに抗体を加え 30分間反応させる。 その後、 T細胞を加 え、 4日培養した後に、 lOO Ci/mlの 3H-T ymidine (Amersham Pharmacia)を 10 PL 1 添加した。 14 時間後、 Macro96 Harvester (SKATR0N)を用いて、 Printed Filtermat A (Wal lac)にハーべストし、 乾燥後 Betap;Scint (Wallac)に良く浸し、 パッケージング後、 1205 BETAPLATE液体シンチレーシヨンカウンターで活性測定 した。 また未成熟 DCを用いた MLRは、 異なるヒ卜から分離した、 T細胞と成熟 DC を混合することにより行った。 T細胞/ DCの細胞比をそれぞれ、 1 : 40 として同 様に行った。 図 9、 図 10に結果を示す。 KM28卜卜 10抗体の添加によりチミジンの 取り込みが低く、 MLRが抑えられることが示された。また、図 10において KM283- 5， 5D 12抗体は DC- MLRを抑制できず、 すなわち腹 28卜卜 10抗体のみが DCに対する CD40 リガンドの働きを中和するアン夕ゴニスティック抗体であることが示され た。 さらに、 ァゴニスティック抗体である KM302- 1抗体が、 未成熟 DC を用いた ML に及ぼす抗体の影響を調べた結果を図 1 1に示す。 DCが活性化することにより、 T 細胞との相互作用が促進され、 チミジンの取り込みが増加している。 これによ り KM302- 1は未成熟 DCに作用するァゴニスティック抗体であることが示された。
〔実施例 1 1〕 CD40抗体による CD40Lの CD40への結合に及ぼす影響
BIAcore 2000 (ビアコア） を用いて、 抗 CD40抗体を、 固定化された CD40ヒト FCに結合させた後、 可溶性 CD40Lの CD40への結合量の変化を測定した。 装置に 付属した説明書に従い、 可溶性 CD40ヒ卜 FCを CMチップ（CM5,ビアコア） に固定 化した。 次いで 25 ( /ml ) の抗 CD40抗体を添加し、 CD40に結合させた。 さら に 10 ( /x g/ml) の可溶性 CM0Lを添加し結合させた。 CD40L添加前後の結合量の 差を測定した。 コントロール I gGを添加した場合、 CD40Lの結合量は 100RUとな つた。 KM302- 1抗体添加後では、 CD40Lの結合量は 1 10RUとなり、 KM283-5抗体添 加後では、 18RUとなった。 これにより、 KM302- 1抗体は CD40Lの CD40への結合を 阻害しないことが示された。
〔実施例 12〕 Ramos細胞における抗 CD40ァゴニスティック抗体による CD95発現 促進
実施例 4で得られたハイプリドーマの精製抗体を実施例 6の方法に従って解析 し、 ァゴニスト抗体を生産するクローンを選別した （1ゥエルあたりの細胞数 5xl 04個、 細胞濃度 . 5xl05個 Zm 1 )。 図 12に結果を示す。 図中横軸は培養液中 の抗体濃度を、 縦軸は平均蛍光強度、 すなわち CD95 発現強度を示す。 KM341- 1- 19， 2105抗体は、 0. 01 z g/nil以上の濃度で公知のマウス抗体である G28- 5抗体に 比して、 Ramos細胞に対して CD95発現をより促進することが示された。 すなわち、 より効果の高いァゴニスティックであることが示された。 また、 0. O l g/ml で 腹 34卜卜 19, 2105抗体の Ramos細胞に CD95発現を増進するァゴニス卜活性は 10 z g/mlの G28- 5抗体の活性より高かった（図 12)。それぞれの抗体濃度において、 CD95の発現が G28- 5抗体を添加した場合の何倍に相当するかを表 5にまとめた。
表 5
Figure imgf000038_0001
〔実施例 13〕 CD40ァゴニスティック抗体による樹状細胞の活性化
実施例 9の方法に従って、 CD40ァゴニスティック抗体による成熟 DCの IL-12 および IL-10生産に及ぼす影響を調べた。 IL- 10は ELI SA (Pharmingen社製）法に て測定した。 図 13および図 14 に結果を示す。 KM34卜 1- 19抗体の処理によって IL- 12の分泌が亢進することが示された。 一方、 5000radで X線照射した、 CD40 リガンド発現組換え L細胞を 2xl05個 /ml共存させた場合でも、 IL-12と IL-10の 培養液中濃度は 254、 51pg/mlであり、 KM341- 1-19抗体を 1 2 g/ffll添加した場合 より少なかった。
以上より KM34卜卜 19抗体が、 DCに対して効果的なァゴニスティック抗体とし て作用することが示された。 0. l ^ g/mlで KM34卜卜 19抗体の成熟 DCに IL- 12を 分泌させるァゴニス卜活性は lOO t g/ml の G28- 5抗体の活性より高く、 l ^ g/ml で KM341-卜 19抗体の成熟 DCに IL-12を分泌させるァゴニスト活性は lOO g/ml の G28- 5抗体の活性より 100倍以上高かった （図 13)。 また、 1 g/mlで KM34卜 1-19抗体の成熟 DCに IL- 10を分泌させるァゴニスト活性は 100 g/mlの G28 - 5 抗体の活性より 10倍以上高かった （図 14)。 また、 KM341- 1-19抗体は、 サブクラ スが IgG2であり、 IgGlや IgG3より Fcレセプ夕一への結合性が低く、 而細胞の キラー活性の感作ゃ補体系の活性化も弱い。 このことから抗体によって、 CD40発 現細胞の機能あるいは細胞そのものが減少してしまうという危険性が低いと考え られる。 また Fcレセプ夕一による架橋を受けにくいことから、体内でのァゴニス ト活性が、 架橋によって大きく変動することがなく、 薬効を制御し易いと期待さ れる。 〔実施例 14〕 Ramos細胞における抗 CD40アン夕ゴニスティック抗体による CD95 発現抑制
1. OxlO6個/ mlの Ramos細胞懸濁液を平底 96ゥエルプレートに 50 1/we l lで播 種した （1ゥエルあたり細胞数 5xl04個）。 培地で希釈した精製抗体を 96ゥエル プレートに 100 z 1/we l l添加した。 ヒト CD40リガンドを発現する組換えマウス L 細胞 (Spriggs, M. K. e t. al. , J. Exp. Med. , 176 : 1543, 1992 ; Garrone, P. e t. al. , J. Exp. Med. , 182 : 1265, 1995などを参照のこと） を 1. OxlO5個/ mlに調製し、 50 1/wel l で添加した （1ゥエルあたり Ramos 細胞の細胞数 5xl04個、 細胞濃度 2. 5x10s個/ ml、 1ゥエルあたりマウス L細胞の細胞数 5xl03個、 細胞濃度 2. 5xl04 個/ ml)。 一晩培養後、 細胞を集め R- PE標識抗 CD95抗体を用い、 FACSを用いて解 析した。 図 15に結果を示す。 図中縦軸は平均蛍光強度、 すなわち CD95の発現強 度を示す。公知の抗体である 5D12抗体がわずかにしか抑制しなかったのに比較し て、 4D11抗体では 0. l ^ g/mlの濃度でも CD40L発現細胞を添加しない陰性コント ロールと同程度まで CD95 の発現を抑制した。 また、 l ^ g/ml の濃度で は， 4D11, F4-465, KM281-1-10が CD40L発現細胞を添加しない陰性コントロールと 同程度まで CD95の発現を抑制した。 これによつて 4D11、 F4 - 465， KM281 -卜 10抗体 が、 より効果的なアン夕ゴニスティック抗体であることが示された。 それぞれの 抗体濃度において、 アンタゴニスティック抗体無添加の対照を 100とした平均蛍 光強度の相対値を表 6に示す。
表 6
Figure imgf000039_0001
〔実施例 15〕 抗 CD40ァゴニスティック抗体による Ramos細胞移植モデルにおけ る抗腫瘍効果
生後 5週齢の C. B. 17/Icr-sc idJc lマウス（日本クレア） に抗ァシァロ GM1抗体 を静脈注射した。 1 日後に腫瘍細胞として Ramos細胞をマウス 1 匹当たり 5xl06 個静脈注射した。 1 日後に KM302 - 1抗体あるいは陰性対照として抗ヒトアルブミ ンヒト IgG抗体を静脈注射した。 投与量は KM302- 1抗体をマウス 1匹当たり 1、 10、 100 i g、 陰性対照抗体 100 /2 gをそれぞれ 5個体のマウスに 1回投与した。 結 果を図 16に示す。 陰性対照投与群は移植 34日後にすべて死亡したのに対して、 KM302- 1抗体 10 g、100 gを投与された群では 5匹すベて生存しており、 KM302- 1 抗体の抗腫瘍効果が確認された。 KM302-1抗体は IgG4サブクラスであり、 Fcレセ プターを介した抗体依存性細胞傷害機構 （ADCC) や補体系の活性化が弱いにもか かわらず、 10 g単回投与で担ガンマウスの生存期間の延長が見られた。
〔実施例 16〕 抗 CD40ァゴニスティック抗体による Ramos細胞の増殖抑制
10%FBS添加 RPMI 1640培地で lxlO4個 /mlに調製した Ramos細胞懸濁液 100 l を 96ゥエルプレートに分注し、 20 g/mlに培地を用いて調製した腿 341-1- 19抗 体あるいは可溶性リガンド溶液を添加した。 可溶性リガンドにはリガンドと同濃 度 （反応溶液中の濃度が 10 / g/ml) の抗 FLAG抗体 （M2) を共存させ活性を強め た。 5日間培養後、 各ゥエルに 20 1 の MTS試薬 （Promega) を加え 2から 3時間 反応させた。 波長 490nmで細胞や抗体を含まない培地のみのゥエルとの吸光度の 差を測定し、 生存している細胞数を測定した。 また、 同様に 96ゥエル ϋ底プレー トを用いて G28- 5抗体と増殖抑制作用を比較した。 2 x g/ml に培地を用いて調製 した KM34卜卜 19 抗体あるいは G28-5 抗体を添加した。 結果を図 17 に示す。 KM341-1-19抗体を添加したゥエルでは死細胞が観察され、細胞数は G28- 5抗体や リガンド添加のゥエルに比較して顕著に少なく、 吸光度も低くなり、 腫瘍細胞の 増殖が抑制され、 細胞死が誘導されることが示された。
〔実施例 17〕 抗体遺伝子の cDNAクローニング
KM341 - 1 - 19, 2105, 110, 115, 腿 28卜卜 10 , 4 D11, 讓 43 - 4-11, F4 - 465、F2- 103, F5-77 抗体を生産するハイプリドーマを培養し、 細胞を遠心によって集めた。 こ れに TRIZ0L (Gibco BRL) を添加し、 取扱説明書にしたがって TotalRNAを抽出し た。 抗体 cDNA の可変領域のクローニングは、 CL0NTECH 社の SMART RACE cDNA amplificationKitを用い、 添付の説明書にしたがって行った。 の total RNA を铸型として 1st Strand cDNA を作製した。 KM34卜卜 19， 2105, 110, 115, 函 1+10, 4D11, KM643-4-11, F2-103, F5-77重鎖 (H鎖) の増幅には、 Takara 社の Z— TaQを用い， ϋΜΡと Wi6プライマ一で、 98°C 1秒、 68°C30秒のサイクルを 30回繰り返した。 さらに、 この反応液 1 lを铸型とし、 ΝϋΜΡと hli3プライマー を用いて、 98 1秒、 68°C30秒のサイクルを 20回繰り返した。 F4- 465重鎖の増 幅には、 UMPと hh2プライマーを用い、 Advantage 2PCRkit (Clonthec , cat#1910) を使って、 94°C5秒、 72°C3分 5サイクル、 94°C 5秒、 70°C0秒、 72°C3分、 5 サイクル、 94°C5秒、 68°C10秒、 72°C3分、 25サイクルで行った。 hh6プライマー 5'-GGT CCG GGA GAT CAT GAG GGT GTC CTT-3' (配列番号 3 ) hh3プライマー 5'-GTG CAC GCC GCT GGT CAG GGC GCC TG - 3' (配列番号 4 ) hh2プライマー 5'-GCT GGA GGG CAC GGT CAC CAC GCT G-3' (配列番号 5) この後、 増幅した PCR産物を PCR puriiication kit (QIAGEN) により精製し、 hh4 をプライ マ一 と して塩基配列の決定を行っ た。 ある いは、 PCRScript (Stratagene, Lajolla, CA)又は PCR— Blunt (Invi trogene, Carlsbad, CA) にサブクロ一ニングし配列を決定した。 配列情報を基に、 抗体重鎖特異的プ ライマ一を合成した。腿 341- 1-19の場合 341Hプライマー、 2105の場合は 2105Hsal プライマー， 110, 115 の場合には llOHsal プライマー， KM28卜卜 10 の場合には 281Hsal プライマ一， 4D11の場合は 4DllSalプライマー、 KM643-4- 11の場合に は 643Hsalプライマ一 ， F4- 465の場合は HI卜 9 5'プライマ一、 F2- 103の場合は F2-103Hプライマ一、 F5-77の場合は F5-77Hプライマ一を合成した。 抗体重鎖特 異的プライマーと hh4を用いて、 lstStrainlc丽 Aから cDNAを増幅し、 これを铸型 として抗体特異的プライマ一を使って逆方向からの配列を決定した。
hh4プライマー： 5'-GGTGCCAGGGGGAAGACCGATGG-3， （配列番号 6 ) 341H プライマ一： 5'-atatgtcgacGCTGAATTCTGGCTGACCAGGGCAG-3' (配列番号 7 )
2105Hsal： atatgtcgacTCCCAGGTGTTTCCATTCAGTGATCAG (配列番号 8 ) HOHsal： atatgtcgacTTCCATTCGGTGATCAGCACTGAACAC (配列番号 9) 281Hsal： atatgtcgacTTTGAGAGTCCTGGACCTCCTGTG (配列番号 10)
4DllSal atatgtcgacGAGTCATGGATCTCATGTGCAAG (配列番号 11) 643Hsal atatgtcgacCCAGGGCAGTCACCAGAGCTCCAGAC (配列番号 12)
Hl l-9 5' -ACC GTG TCG ACT ACG CGG GAG TGA CT (配列番号 13)
F2-103H accgtgtcgacgctgatcaggactgcaca (配列番号 14)
F5-77H： accgtgtcgacggtgatcaggactgaacag (酉己歹！]番号 15)
KM341-1-19, 2105, 110, 115, KM281-1-10 , 4 D11, 讓 43- 4-11, F2-103, F5-77 の軽鎖 （L鎖） は、 UMPと hk2プライマーを使って、 98°C 1秒、 68°C 30秒のサイ クルを 30回繰り返して増幅した。 F4- 465の軽鎖は、 UMPと hL2プライマーを使つ て、 98°C 1秒、 68°C30秒のサイクルを 30回繰り返して増幅した。 増幅した PCR 産物を、 PCR purif icat ion ki tにより精製し、 hk6もしくは hL2プライマーを用 いて塩基配列を決定した。 この配列を基に、 軽鎖特異的プライマーを合成した。 KM341-1-19の場合 341Kプライマ一、 2105の場合は 2053KBglプライマー， 110， 115 の場合には l lOKBglプライマー， KM28卜卜 10の場合には 281KBglプライマー， 4 D11 の場合は 4 Dl lKBgl、 KM643-4-11 の場合には 643KBgl プライマー、 F4- 465 の場合は Lamda 5'プライマー， F-103, F5- 77の場合は F2- 103Kプライマーを合成し た。
341— 1一 19、 110, 115, KM643-4-11, KM281- 1- 10、 4 D1 K 2105 の場合は、 軽 鎖特異的プライマーと hk6プライマーを使って lslSt rand cDNAから d)NAを増幅 し、 これを铸型として両方向からの配列を決定した。 F4- 465、 F2 - 103, F5 - 77につ いては、 PCRScript (Stratagene, Laj ol la, CA)又は PCR— Blunt (Invi t rogene, Carlsbad, CA) にサブクローニングし配列を決定した。
hk2プライマー： 5' - GTT GAA GCT CTT TGT GAC GGG CGA GC-3' (配列番号 16 ) hL2プライマー： 5' - TCT TCT CCA CGG TGC TCC CTT CAT- 3' (配列番号 17 ) 341Kプライマー： 5 ' -a t a t aga t c t GAACTGCTCAGTTAGGACCCAGAGG-3 ' (配列番号 18) 2053KBgl： atatagatctCGCGGGGAAGGAGACTGCTCAGTT (配列番号 19 ) HOKBgl： atatagatctAGTCAGACCCAGTCAGGACACAGC (配列番号 20 ) 281KBgl： atatagatctGAGCTGCTCAGTTAGGACCCAGAGGG (配列番号 21 )
4DllKBgl： atatagatctTAAGCAAGTGTAACAACTCAGAGTAC (配列番 号 22 )
643KBgl： atatagatctGAGGAACTGCTCAGTTAGGACCCAGAGG (配列 番号 23 )
Lamda 5'： -AACTCCAGATCTGCCTCAGGAAGCAGCATC (配列番号 24 )
F2-103K： aactccagatctagggcaagcagtggtaac (酉己列番 25 )
hk6プライマー： 5' - TGGCGGGAAGATGAAGACAGATGGTG-3' (配列番号 26 )
341— 1一 19の H鎖全長、 及び L鎖可変領域をコードする DNA並びに H鎖及び L 鎖のアミノ酸配列をそれぞれ以下に示す。
H鎖 DNAの翻訳開始点は、 配列番号 27の 5 '末端から 50番目のアデニン （A) からはじまる ATGコドンであり、 終止コドンは 1472番目のチミン （T) からはじ まる TGAである。抗体可変領域と定常領域の境界は 5 '末端から 493番目のァデニ ン （A) と 494番目のグァニン （G) 間に位置する。 アミノ酸配列において、 H鎖 可変領域は配列番号 28の N末端から 148番目のセリン （S)残基までであり、 149 番目のァラニン（A)以降が定常領域である。遺伝子配列予測ソフトウェア（S ignal P ver. 2) により、 H鎖のシグナル配列は配列番号 28の N末端より 20番目のセリ ン （S) までと予測された。 成熟体の N末端は配列番号 28の 21番目のグルタミン (Q) であるものと考えられる。
L鎖 DNAの翻訳開始点は、配列番号 29の 5 '末端から 29番目の Aからはじまる ATGコドンであり、 可変領域は 5 '末端から 400番目のアデニン （A) までである。 アミノ酸配列において、可変锒域は配列番号 30の N末端から 1 2 4番目のリジン (K) までである。 精製された L鎖蛋白質の N末端分析により、 L鎖のシグナル配 列は配列番号 30の N末端より 20番目のグリシン （G) までであり、 成熟体の N 末端は配列番号 30の 21番目のグルタミン酸（E) であることが明らかとなった。 341-1-19 H鎖 （配列番号 27)
Figure imgf000044_0001
GCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGAGGATCC
341-1-19 H鎖アミノ酸配列 （配列番号 28)
TYYRSKWYRDYVGSVKSRIIINPDTS丽 QFSLQLNSVTPEDTAIYYCTRAQWLGGDYPYYYSMDVWGQGTTV
Figure imgf000044_0002
VVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIE KTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPE題 YKTTPPMLDSDGSFF LYS LTVDKS WQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
341 - 1 - 19 L鎖 （配列番号 29) ：
Figure imgf000045_0001
TAGCAACACTTTCGGCCCTGGGACCAAAGTGGATATCAAACGTACG
341 - 1 - 19 L鎖アミノ酸配列 （配列番号 30)
MEAPAQLLFLLLLWLPDTTGEIVLTQSPATLSLSPGERATL5
NRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNTFGPGTKVDIKRT
2105の H鎖可変領域、及び L鎖可変領域をコードする DNA並びに H鎖及び L鎖 のアミノ酸配列をそれぞれ以下に示す。
H鎖 DNAの翻訳開始点は、 配列番号 31の 5 '末端から 70番目のアデニン （A) からはじまる ATG コドンであり， 抗体可変領域と定常領域の境界は 5 '末端から 495番目のアデニン （A) と 496番目のグァニン （G) 間に位置する。 アミノ酸配 列において、 H鎖可変領域は配列番号 32の N末端から 142番目のセリン （S) 残 基までであり、 149番目のァラニン （A) 以降が定常領域である。 遺伝子配列予測 ソフトウェア （Signal P ver. 2) により、 H鎖のシグナル配列は配列番号 32の N 末端より 19番目の cystein (0 までと予測された。 成熟体の N末端は配列番号 32の 20番目の Glutamic ac id (E) であるものと考えられる。
L鎖 DNAの翻訳開始点は、配列番号 33の 5 '末端から 28番目の Aからはじまる ATGコドンであり、 可変領域は 5 '末端から 405番目のアデニン （A) までである。 アミノ酸配列において、可変領域は配列番号 34の N末端から 1 2 6番目のリ (K) までである。 遺伝子配列予測ソフトウェア （Signal P ver. 2) により、 L鎖 のシグナル配列は配列番号 34の N末端より 20番目の Glyc ine (G) までと予測さ れた。 成熟体の N末端は配列番号 34の 21番目の Glutamic ac id (E) であるもの と考えられる。 -
2105 H鎖 （配列番号： 31)
Figure imgf000046_0001
CCAAGG
2105 H鎖アミノ酸配列 （配列番号： 32)
Figure imgf000046_0002
MNSLRAEDTALYYCARDRLFRGVRYYGMDVWGQGTTVTVSSASTK 2105 L鎖 （配列番号： 33) CAAACGTACGGTG
2105 L鎖アミノ酸配列 （配列番号： 34)
Figure imgf000047_0001
YCQQRSHWLTFGGGTKVEIKRTV
110の H鎖可変領域、 及び L鎖可変領域をコードする DNA並びに H鎖及び L鎖 のアミノ酸配列をそれぞれ以下に示す。
H鎖 DNAの翻訳開始点は、 配列番号 35の 5 '末端から 60番目のアデニン （A) からはじまる ATG コドンであり、 抗体可変領域と定常領域の境界は 5 '末端から 479番目のアデニン （A) と 480番目のグァニン （G) 間に位置する。 アミノ酸配 列において、 H鎖可変領域は配列番号 36の N末端から 140番目のセリン （S) 残 基までであり、 141番目のァラニン （A) 以降が定常領域である。 遺伝子配列予測 ソフトウェア （Signal P ver. 2) により、 H鎖のシグナル配列は配列番号 36の N 末端より 19番目の Cys te in (0 までと予測された。 成熟体の N末端は配列番号 36の 20番目のグルタミン （Q) であるものと考えられる。
L鎖 MAの翻訳開始点は、配列番号 37の 5 '末端から 35番目の Aからはじまる ATGコドンであり、 可変領域は 5 '末端から 421番目のアデニン （A) までである。 アミノ酸配列において、可変領域は配列番号 38の N末端から 1 2 9番目のリジン (K) までである。 遺伝子配列予測ソフトウェア （S ignal P ver. 2) により、 L鎖 のシグナル配列は配列番号 38の N末端より 22番目の Cys te in (0 までと予測さ れた。 成熟体の N末端は配列番号 38の 23番目の val ine (V) であるものと考え られる。
110 H鎖 （配列番号： 35)
CAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGCTAGCACCAAGGG
110 H鎖アミノ酸配列 （配列番号： 36)
Figure imgf000048_0001
MNSLRAEDTAVYYCAREGYNILTGYFGYWGQGTLVTVSSASTK
110 L鎖 （配列番号： 37)
Figure imgf000048_0002
ACCAAGGTGGAAATCAAACGTACG
110 L鎖アミノ酸配列 （配列番号： 38) DFATYYCQQYYSFPWTFGQGTKVEIKRT
115の H鎖可変領域、 及び L鎖可変領域をコードする DNA並びに H鎖及び L鎖 のアミノ酸配列をそれぞれ以下に示す。
H鎖 DNAの翻訳開始点は、 配列番号 39の 5 '末端から 60番目のアデニン （A) からはじまる ATG コドンであり、 抗体可変領域と定常領域の境界は 5 '末端から 479番目のアデニン （A) と 480番目のグァニン （G) 間に位置する。 アミノ酸配 列において、 H鎖可変領域は配列番号 40の N末端から 140番目のセリン （S) 残 基までであり、 141番目のァラニン （A) 以降が定常領域である。 遺伝子配列予測 ソフトウェア （S ignal P ver. 2) により、 H鎖のシグナル配列は配列番号 40の N 末端より 19番目の Cys te in (0 までと予測された。 成熟体の N末端は配列番号 40の 20番目のグルタミン （Q) であるものと考えられる。
L鎖 DNAの翻訳開始点は、配列番号 41の 5 '末端から 35番目の Aからはじまる ATGコドンであり、 可変領域は 5 '末端から 421番目のアデニン （A) までである。 アミノ酸配列において、可変領域は配列番号 42の N末端から 1 2 9番目のリジン
(K) までである。 遺伝子配列予測ソフトウェア （Signal P ver. 2) により、 L鎖 のシグナル配列は配列番号 42の N末端より 22番目の Cys te in (0 までと予測さ れた。 成熟体の N末端は配列番号 42の 23番目の val ine (V) であるものと考え られる。
115 H鎖 （配列番号： 39)
CAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGCTAGCACCAAGG
115 H鎖アミノ酸配列 （配列番号： 40)
Figure imgf000050_0001
MNSLRAEDTAVYYCAREGYNILTGYFGYWGQGTLVTVSSASTK 115 L鎖 （配列番号： 41)
Figure imgf000050_0002
ACCAAGGTGGAAATCAAACGTACG
115 L鎖アミノ酸配列 （配列番号： 42)
SSDLAWYQQKPGKAPELLISAASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISCLQSE DFATYYCQQYYSFPWTFGQGTKVEIKRT
281— 1一 10の H鎖可変領域、及び L鎖可変領域をコードする DNA並びに H鎖及 び L鎖のアミノ酸配列をそれぞれ以下に示す。
H鎖 DNAの翻訳開始点は、 配列番号 43の 5 '末端から 52番目のアデニン （A) からはじまる ATG コドンであり、 抗体可変領域と定常領域の境界は 5 '末端から 468番目のアデニン （A) と 469番目のグァニン （G) 間に位置する。 アミノ酸配 列において、 H鎖可変領域は配列番号 44の N末端から 139番目のセリン （S) 残 基までであり、 140番目のァラニン （A) 以降が定常領域である。 遺伝子配列予測 ソフトウェア （S ignal P ver. 2) により、 H鎖のシグナル配列は配列番号 44の N 末端より 19番目のセリン （S) までと予測された。 成熟体の N末端は配列番号 44 の 20番目のグルタミン （Q) であるものと考えられる。
L鎖 DNAの翻訳開始点は、配列番号 45の 5 '末端から 41番目の Aからはじまる ATGコドンであり、 可変領域は 5 '末端から 424番目のアデニン （A) までである。 アミノ酸配列 おいて、可変領域は配列番号 46の N末端から 1 2 8番目のリジン (K) までである。 遺伝子配列予測ソフトウェア （S ignal P ver. 2) により、 L鎖 のシグナル配列は配列番号 46の N末端より 20番目の Glycine (G) までと予測さ れた。 成熟体の N末端は配列番号 46の 21番目の Glu tamic ac id (E) であるもの と考えられる。
281 - 1 - 10 H鎖 （配列番号： 43)
Figure imgf000051_0001
CTGGTCACCGTCTCCTCAGCTAGCACCAAGG
281- 1 - 10 H鎖アミノ酸配列 （配列番号： 44) VTAADTAVYYCARAPLHGDYKWFHPWGQGTLVTVSSASTK
281- 1 - 10 L鎖 （配列番号： 45)
Figure imgf000052_0001
CAAGGGACACGACTGGAGATCAAACGTACG
281- 1- 10 L鎖アミノ酸配列 （配列番号： 46)
Figure imgf000052_0002
AVYYCQQYGSSPITFGQGTRLEIKRT
4D11の H鎖可変領域、及び L鎖可変領域をコードする DNA並びに H鎖及び L鎖 のアミノ酸配列をそれぞれ以下に示す。
H鎖 DNAの翻訳開始点は、 配列番号 47の 5 '末端から 16番目のアデニン （A) からはじまる ATG コドンであり、 抗体可変領域と定常領域の境界は 5 '末端から 456番目のアデニン （A) と 457番目のグァニン （G) 間に位置する。 アミノ酸配 列において、 H鎖可変領域は配列番号 48の N末端から 147番目のセリン （S) 残 基までであり、 148番目のァラニン （A) 以降が定常領域である。 遺伝子配列予測 ソフトウェア （Signal P ver. 2) により、 H鎖のシグナル配列は配列番号 48の N 末端より 26番目のセリン （S) までと予測された。 成熟体の N末端は配列番号 48 の 27番目のグルタミン （Q) であるものと考えられる。
L鎖丽 Aの翻訳開始点は、配列番号 49の 5 '末端から 59番目の Aからはじまる ATGコドンであり、 可変領域は 5 '末端から 442番目のアデニン （A) までである。 アミノ酸配列において、可変領域は配列番号 50の N末端から 1 2 8番目のリジン (K) までである。 遺伝子配列予測ソフトウェア （Signal P ver. 2) により， L鎖 のシグナル配列は配列番号 50の N末端より 22番目の Cys te in (0 までと予測さ れた。 成熟体の N末端は配列番号 50の 21番目の Al anine (A) であるものと考え られる。 '
4D11 H鎖 （配列番号： 47)
Figure imgf000053_0001
CTCCTCAGCTAGC
4D11 H鎖アミノ酸配列 （配列番号： 48)
Figure imgf000053_0002
KNQFSLKLSSVTAADTAVYYCTRPWRYFGWFDPWGQGTLVTVSSAS 4D11 L鎖 （配列番号： 49) GGAAATCAAACGTACG
4 D11 L鎖アミノ酸配列 （配列番号： 50)
MDMRVPAQLLGLLLL LPGARCAIQLTQSPSSLSASVG ASNLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQFNSYPTFGQGTKVEIKRT
KM643- 4- 11の H鎖可変領域、及び L鎖可変領域をコードする爾 A並びに H鎖及 び L鎖のアミノ酸配列をそれぞれ以下に示す。
H鎖 DNAの翻訳開始点は、 配列番号 51の 5 '末端から 1番目のアデニン （A) か らはじまる ATGコドンであり、抗体可変領域と定常領域の境界は 5 '末端から 447 番目のアデニン （A) と 448番目のグァニン （G) 間に位置する。 アミノ酸配列に おいて、 H鎖可変領域は配列番号 52の N末端から 149番目のセリン （S) 残基ま でであり、 150番目のァラニン （A) 以降が定常領域である。 遺伝子配列予測ソフ トウエア （S ignal P ver. 2) により、 H鎖のシグナル配列は配列番号 52の N末端 より 20番目のセリン （S) までと予測された。 成熟体の N末端は配列番号 52の 21番目のグルタミン （Q) であるものと考えられる。
L鎖 DNAの翻訳開始点は、配列番号 53の 5 '末端から 38番目の Aからはじまる ATGコドンであり、 可変領域は 5 '末端から 409番目のアデニン （A) までである。 アミノ酸配列において、可変領域は配列番号 54の N末端から 1 2 4番目のリジン (K) までである。 遺伝子配列予測ソフトウェア （Signal P ver. 2) により、 【鎖 のシグナル配列は配列番号 54の N末端より 20番目の Glyc ine (G) までと予測さ れた。 成熟体の N末端は配列番号 54の 21番目の Glutami c ac id (E) であるもの と考えられる。
KM643-4-11 H鎖 （配列番号： 51)
KM643 - 4 - 11 H鎖アミノ酸配列 （配列番号： 52)
Figure imgf000055_0001
KM643 - 4 - 11 L鎖 （配列番号： 53)
Figure imgf000055_0002
GATCAAACGAAC
M643-4-11 L鎖アミノ酸配列 （配列番号： 54)
Figure imgf000055_0003
YCQQRSNTFGGGTKVEIKR F4-465の H鎖可変領域、 及び L鎖可変領域をコードする DNA並びに H鎖及び L 鎖のアミノ酸配列をそれぞれ以下に示す。
H鎖 DNAの翻訳開始点は、 配列番号 55の 5 '末端から 47番目のアデニン （A) からはじまる ATG コドンであり、 抗体可変領域と定常領域の境界は 5 '末端から 484番目のアデニン （A) と 445番目のグァニン （G) 間に位置する。 アミノ酸配 列において、 H鎖可変領域は配列番号 56の N末端から 146番目のセリン （S) 残 基までであり、 147番目のァラニン （A) 以降が定常領域である。 遺伝子配列予測 ソフトウェア （Signal P ver. 2) により、 H鎖のシグナル配列は配列番号 56の N 末端より 19番目のセリン （S) までと予測された。 成熟体の N末端は配列番号 56 の 20番目のグルタミン （Q) であるものと考えられる。
L鎖 DNAの翻訳開始点は、配列番号 57の 5 '末端から 81番目の Aからはじまる ATGコドンであり、 可変領域は 5 '末端から 440番目の （C) までである。 ァミノ 酸配列において、可変領域は配列番号 58の N末端から 1 2 0番目の Threonine(T) までである。 遺伝子配列予測ソフトウェア （Signal P ver. 2) により、 L 鎖のシ グナル配列は配列番号 58の N末端より 19番目の Alanine (G) までと予測された。 成熟体の N末端は配列番号 58の 20番目の Serine (S) であるものと考えられる。
F4-465 H鎖 （配列番号： 55)
Figure imgf000056_0001
CTACTACGGTATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAGCTAGCACCAA F4-465 H鎖アミノ酸配列 （配列番号： 56)
MDWTWRILFLVAAATGAHSQVQLVQSGSELKKPGASVKVPCKASGYTFTSYAMNWYRQAPGQGLEWMGWINT SSAST
F4-465 L鎖 （配列番号： 57)
Figure imgf000057_0001
GGTTACCAACTACCTAGACTGGATTCGTGACCAACATA
F4-465 L鎖アミノ酸配列 （配列番号： 58)
Figure imgf000057_0002
EGSTVEKTVAPTECS
F2 - 103の H鎖可変領域、 及び L鎖可変領域をコードする DNA並びに H鎖及び L 鎖のアミノ酸配列をそれぞれ以下に示す。
H鎖 MAの翻訳開始点は、 配列番号 59の 5 '末端から 32番目のアデニン （A) からはじまる ATG コドンであり、 抗体可変領域と定常領域の境界は 5 '末端から 463番目のアデニン （A) と 464番目のグァニン （G) 間に位置する。 アミノ酸配 列において、 H鎖可変領域は配列番号 60の N末端から 144番目のセリン （S) 残 基までであり、 145番目のァラニン （A) 以降が定常領域である。 遺伝子配列予測 ソフトウェア （Signal P ver. 2) により、 H鎖のシグナル配列は配列番号 60の N 末端より 19番目の Cystein (0 までと予測された。 成熟体の N末端は配列番号 60の 20番目の Glutamic acid (E) であるものと考えられる。
L鎖 DNAの翻訳開始点は、配列番号 61の 5 '末端から 29番目の Aからはじまる ATGコドンであり、 可変領域は 5 '末端から 415番目のアデニン （A) までである。 アミノ酸配列において、可変領域は配列番号 62の N末端から 1 2 9番目のリジン (K) までである。 遺伝子配列予測ソフトウェア （Signal P ver. 2) により、 L鎖 のシグナル配列は配列番号 62の N末端より 22番目の Cys tein (0 までと予測さ れた。 成熟体の N末端は配列番号 62の 23番目の Asp (D) であるものと考えられ る。
F2- 103 H鎖 （配列番号： 59)
Figure imgf000058_0001
CTCCAAGAGCACCTCT
F2-103 H鎖アミノ酸配列 （配列番号： 60)
MEFGLSWVFLVAILKGVQCEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGFTFSTY丽 HWVRQAPGKGLVWVSRINS DGSSTTYADSVKGRFTISRDNAKNTLYLQ丽 SLRAEDTAVYYCARDRVLWIGELSYYGMDVWGQGTTVTVSS ASTKGPSVFPLAPSSKSTS
F2-103 L鎖 （配列番号： 61)
CTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGA F2-103 L鎖アミノ酸配列 （配列番号： 62)
MDMRVPAQLLGLLLLWLPGAKCDIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSISNWLAWYQQKPGKAPKLLLYK
Figure imgf000059_0001
EVTHQGL
F5-77の H鎖可変領域、 及び L鎖可変領域をコードする DNA並びに H鎖及び L 鎖のアミノ酸配列をそれぞれ以下に示す。
H鎖 DNAの翻訳開始点は、 配列番号 63の 5 '末端から 100番目のアデニン （A) からはじまる ATG コドンであり、 抗体可変領域と定常領域の境界は 5 '末端から 528番目のアデニン （A) と 529番目のグァニン （G) 間に位置する。 アミノ酸配 列において、 H鎖可変領域は配列番号 64の N末端から 143番目のセリン （S) 残 基までであり、 144番目のァラニン （A) 以降が定常領域である。 遺伝子配列予測 ソフトウェア （S ignal P ver. 2) により、 H鎖のシグナル配列は配列番号 64の N 末端より 19番目の Cys te in (0 までと予測された。 成熟体の N末端は配列番号 64の 20番目の Glutamic ac id (E) であるものと考えられる。
L鎖醒の翻訳開始点は、配列番号 65の 5 '末端から 59番目の Aからはじまる ATGコドンであり、 可変領域は 5 '末端から 445番目のアデニン （A) までである。 アミノ酸配列において、可変領域は配列番号 66の N末端から 1 2 9番目のリジン
(K) までである。 遺伝子配列予測ソフトウェア （S ignal P ver. 2) により、 L鎖 のシグナル配列は配列番号 66の N末端より 22番目の Cys tein (0 までと予測さ れた。 成熟体の N末端は配列番号 66の 23番目の Asp (D) であるものと考えられ る。
F5-77 H鎖 （配列番号： 63)
Figure imgf000060_0001
AGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCC
F5-77 H鎖アミノ酸配列 （配列番号： 64)
Figure imgf000060_0002
STKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFP
F5-77 L鎖 （配列番号： 65)
GGGCCTGA
F5-77 L鎖アミノ酸配列 （配列番号： 66)
MDMRVPAQLLGLLLLWFPGSRCDIQMTQSPSSVSGSVGDRVTITCRASQGISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYA
EQLKSGTASVVCLLNNFYP EA VQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYAC EVTHQGL
[実施例 18] 抗体たんぱく質の動物細胞における発現
前記で取得した抗体の可変領域を含む DNA断片を N5KGKIDECPliarmaceuUcals， US patent6001358) などの適当なベクタ一に組み込むことにより、 抗体発現べク 夕一を作製する。 発現のための宿主細胞には、 例えば CHO-Ras (Katakura Y. , et al. , Cytotechnology, 31: 103-109, 1999) が好適に用いられる。 宿主細胞への ベクターの導入は例えばエレクトロポレーシヨンにより実施できる。 抗体発現べ クタ一約 2 を制限酵素で線状化し、 Bio- Rad electrophoreterをもちいて 350V、 500 F の条件で、 4xl07個の CH0— Ras 細胞に遺伝子を導入し、 96well culture Plate に播種する。 発現ベクターの選択マ一力一に対応した薬剤を添加して培養 を継続する。 コロニーが観察されたら、 実施例 4に示した方法によって、 抗体発 現株を選別する。 選別した細胞からの抗体精製は、 実施例 5にしたがって行うこ とができる。
〔実施例 19〕CM0アン夕ゴニスティック抗体による抗原特異的抗体産生抑制作用 マウス内因性 CD40 破壊についてホモ接合体の遺伝子背景を有し、 かつ、 ヒト CD40遺伝子のトランスジーンを有しているマウス （Yasui. et al. Int. I讓 unol. 2002 Vol 14 ： 319) に 4-hydroxy-3-n i t rop enyl ace ty 1-chiken r -globulin conjugates (NP- CGG:大阪大学微生物病研究所 菊谷 仁教授より分与）とァラム (ARAM: Antigen recognition activation motif)の複合体を lOO^ (NP- CGG量と して） 腹腔内注射することにより感作した。 各モノクローナル抗体は抗原感作直 前に 30または 100 x gの量を尾静脈内投与した。 陰 j'生対照として抗ヒトアルブミ ンヒト IgG4抗体 lOO gを投与した。 感作 7日後、 眼窩静脈叢より採血し、 血清 中の NP特異的 IgGlおよび IgM抗体量を ELISA法により測定した。 ELISA法は NP を結合した牛血清アルブミン （NP- BSA : 2. 5 z g/ml) 50 U/ゥエルを、 ELI SA用 96 穴マイクロプレート （Maxisorp、 Nunc 社製） の各ゥエルに加え、 4°Cでインキュ ペートし、 NP- BSAを吸着させた。 次いで、 上清を捨て、 各ゥエルにブロッキング 試薬 （スーパ一ブロック、 Pi erce社製） を加え室温でインキュベートしブロック した後、 各ゥエルを 0. l%Tween20含有リン酸緩衝液 （PBS- T) で 3回洗浄した。 次 いで、 各ゥエルに 10%ブロックエース含有 PBS-Tで希釈した各血清 （50 l/ゥェ ル）を加え、 37°Cで 2時間ィンキュペートし反応させた。マイクロプレートを PBS - T で 3回洗浄後、アルカリフォスファターゼで標識されたャギ抗マウス IgGlまたは IgM抗体 （コスモバイオ、 1070- 04または 1020-04) を 10 %ブロックエース含有 PBS- Tで 1, 000倍に希釈した溶液（50 l/ゥエル） を、 各ゥエルに加え、 37でで 2 時間インキュベートした。 次いで、 マイクロプレートを PBS-Tで 3回洗浄後、 発 色基質液 ゥエル、 Sigma 104, phosphatase subs t rate) を各ゥエルに加え、 波長 405M1での吸光度をマイクロプレートリーダーで測定した。その結果を図 18、 図 19に示す。 図中縦軸は NP- CGGを C57BL/6マウスに 2回注射した後採血してプ ールした血清について、 IgGl抗体の場合は 10， 000倍希釈したものを、 IgM抗体の 場合は 100倍したものをそれぞれ 1ュニットとして換算した値を示す。 F4- 465、 4 D11および KM28卜卜 10抗体は 100 gの投与により NP特異的な IgGlおよび IgM 抗体産生を強く抑制した。
〔実施例 20〕 CD40アン夕ゴニスティック抗体による扁桃腺 B細胞の増殖抑制 ヒト扁桃腺はチルドレンズ ·ホスピタル （サン ディエゴ、 米国カリフォルニア 州） より入手した。 扁桃腺を小片に裁断し、 細かく刻み、 70マイクロメーターの ナイロンメッシュ細胞ストレーナ一を通すことにより、 細胞懸濁液を調製した。
PBSにて数回洗浄の後、 細胞数を計数し、 9 0 %ヒト血清 （ICN)、 1 0 %丽 SOで 凍結保存した。 細胞は融解の後、 1 0 %ヒト血清、 2 . 5マイクログラム Zm 1 のアンフォテリシン （ファンギゾン、 ギブコ ZBRL) を添加した標準的 RPM I培地に再懸濁して使用した。
1 105個の細胞を 96穴ゥエルに加え、 抗ヒト CD 40抗体を 0.01、 0.1、 1.0および 10マイクログラム Zm 1の濃度で添加した。試験は各濃度につき三連 で実施した。 f 1 a g標識した CD 40 L (A l e x i s) 1マイクログラム Z m 1、 CD 40 Lェンハンサ一抗体 （A l e x i s) 1マイクログラム //m 1を 各ゥエルに添加して 3日間培養の後、 1マイクロ C iの [3H]チミジンを各ゥェ ルに添加した。 12〜15時間後に細胞を回収、 液体シンチレーシヨンカウンタ 一により扁桃腺 B細胞の増殖を計測した。 B細胞が CD 40Lの刺激により増殖 し、抗体を添加されなかった場合のカウントを 100、 CD 40 Lが添加されず、 B細胞が刺激されなかった場合の力ゥントを 0とした。 例えば相対的な力ゥント の値として 30が計測された場合、 本実験では、 70 %の増殖阻害が起こったと 表現することとした。
公知のアンタゴニスティック抗体である 5D12は、抗体濃度 100マイクログラ ムノ m 1でも 50 %を超える増殖抑制を示さなかった。
F4- 465はわずか 0. 01マイクログラム Zm 1の濃度で約 80 %の増殖抑制を示 し、 0. 1〜10マイクログラム Zm 1の濃度で約 95 %の増殖抑制を示した（図 20)。 本明細書で引用した全ての刊行物、 特許及び特許出願は、 そのまま参考として 本明細書に取り入れるものとする。 産業上の利用可能性
本発明により、 CD40に対する抗体が提供される。 本発明の抗体は、 CD40に対し てァゴニスティックに作用するもの及びアン夕ゴニスティックに作用するものの 両者が含まれるため、 それぞれ、 免疫賦活剤、 免疫抑制剤等として有用である。 配列表フリーテキスト
配列番号 1 ：合成 DNA 配列番号 2 ：合成 DNA 配列番号 3 ：合成 DNA 配列番号 4 ：合成 DNA 配列番号 5 ：合成賺 配列番号 6 ：合成 DNA 配列番号 7 ：合成腿 A 配列番号 8 ：合成醒 配列番号 9 ：合成 DNA 配列番号 10 ：合成 DNA 配列番号 11 ：合成 MA 配列番号 12 ：合成 DNA 配列番号 13 ：合成丽 A 配列番号 14 ：合成 DNA 配列番号 15 ：合成 DNA 配列番号 16 ：合成 DNA 配列番号 17 ：合成 DNA 配列番号 18 ：合成 MA 配列番号 19 ：合成 DNA 配列番号 20 ：合成 DM 配列番号 21 ：合成還 A 配列番号 22 ：合成蘭 A 配列番号 23 ：合成 DNA 配列番号 24 ：合成 DNA 配列番号 25 ：合成醒 配列番号 26 ：合成丽 A

Claims

請 求 の 範 囲
1 . 以下の（a)〜（f)から選ばれる少なくとも 1つの性質を有する、 ヒト CD40 に対する抗体又はその機能的断片。
(a) 樹状細胞に作用し、 LPS及び IFN rの存在下で IL-12を生産させる
, (b) 樹状細胞に作用し、 該樹状細胞を成熟させる活性が G28- 5抗体よりも高い
(c) B細胞樹立細胞株に対して、 CD95の発現を促進する活性が G28- 5抗体より も高い
(d) B細胞樹立細胞株に対して増殖を抑制する活性が G28-5抗体よりも高い
(e) B細胞樹立細胞株に対して細胞死を誘導する
(f) CD40リガンドの CD40に対する結合を阻害しない
2 . 樹状細胞の成熟が、 20 x g/ml以下の抗体濃度で行われるものである請求 項 1記載の抗体又はその機能的断片。
3 . B細胞樹立細胞株に対して CD95の発現の促進が、 20 g/ml以下の抗体濃 度で行われるものである請求項 1記載の抗体又はその機能的断片。
4 . B細胞樹立細胞株が Ramos又は HS- Sul tonである請求項 1記載の抗体又 はその機能的断片。
5 . lxlO6個/ mlの濃度の樹状細胞に、 0. 1 /z g/ml以上の濃度の抗体が添加さ れた場合に、 100pg/ml以上の IL-12の生産をもたらすものである、 請求項 1記載 の抗体又はその機能的断片。
6 . 1χ10Β個/ mlの濃度の樹状細胞に、 1 i g/ml以上の濃度の抗体が添加され た場合に、 i000pg/ml以上の IL- 12の生産をもたらすものである、 請求項 1記載 の抗体又はその機能的断片。
7 . lxlO6個 /mlの濃度の榭状細胞に、 1 /i g/ml以上の濃度の抗体が添加され た場合に、 10000pg/ml以上の IL-12の生産をもたらすものである、 請求項 1記載 の抗体又はその機能的断片。
8 . B細胞樹立細胞株 （Ramos細胞） に対する CD95の発現促進が、 抗体濃度 0. O g/nilから 10 / g/nilの範囲において、対照である G28- 5抗体の約 2倍から 3 倍以上である、 請求項 1記載の抗体又はその機能的断片。
9 . B細胞樹立細胞株 （Ramos細胞） に対する CD95の発現促進が、 抗体濃度 0. 01 g/mlにおいて、 対照である G28- 5抗体の約 2倍から 6倍以上である、 請求 項 1記載の抗体又はその機能的断片。
1 0 . B細胞樹立細胞株 （Ramos細胞） に対する CD95の発現促進が、 抗体濃 度 0. l g/mlにおいて、 対照である G28- 5抗体の約 2倍から 7倍以上である、 請 求項 1記載の抗体又はその機能的断片。
1 1 . B細胞樹立細胞株 （Ramos細胞） に対する CD95の発現促進が、 抗体濃 度 1 /x g/mlにおいて、 対照である G28-5抗体の約 2倍から 7倍以上である、 請求 項 1記載の抗体又はその機能的断片。
1 2 . B細胞樹立細胞株 （Ramos細胞） に対する CD95の発現促進が、 抗体濃 度 10 i g/mlにおいて、対照である G28- 5抗体の約 2倍から 6倍以上である、請求 項 1記載の抗体又はその機能的断片。
1 3 . ハイプリドーマ腿 302-1 (受託番号 FERM BP .7578)、 KM341-1-19 (受託 番号 FE應 BP- 7759)、 2105 (受託番号 FE腹 BP-8024) または F1- 102 (受託番号 ATCC PTA-3337) により生産される抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域のアミノ酸 配列を有する抗体又はその機能的断片。
1 4 . 受託番号 ATCC PTA- 3302および ATCC PTA- 3303であるプラスミド DNA にそれぞれコードされる 、イブリ ドーマ F2- 103の産生する抗体の重鎖可変領域 および軽鎖可変領域、 受託番号 ATCC PTA- 3304および ATCC PTA- 3305であるブラ スミド DMにそれぞれコードされる、 ハイプリドーマ F5- 77の産生する抗体の重 鎖可変領域および軽鎖可変領域、 または受託番号 ATCC PTA- 3306 および ATCC PTA-3307であるプラスミド腿 Aにそれぞれコードされる、八イブリドーマ F5-157 の産生する抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域の、 マチュア部分のアミノ酸 配列を有する抗体又はその機能的断片。
1 5 . 配列番号 2 8および 3 0にそれぞれ示される、 ハイプリ ドーマ KM341-卜 19の産生する抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域、配列番号 3 2お よび 3 4にそれぞれ示される イブリドーマ 2105の産生する抗体の重鎖可変領 域および軽鎖可変領域、 配列番号 3 6および 3 8にそれぞれ示される、 八イブリ ドーマ 110の産生する抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域、 配列番号 4 0お よび 4 2にそれぞれ示される、 ハイプリドーマ 1 15の産生する抗体の重鎖可変領 域および軽鎖可変領域、 配列番号 5 2および 5 4にそれぞれ示される、 ハイプリ ドーマ KM643- 4- 1 1の産生する抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域、配列番号 6 0および 6 2にそれぞれ示される、ハイブリ ドーマ F2- 103の産生する抗体の重 鎖可変領域および軽鎖可変領域、 または配列番号 6 4および 6 6にそれぞれ示さ れる 、イブリドーマ F5— 77の産生する抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域 の、 マチュア部分のアミノ酸配列を有する抗体又はその機能的断片。
1 6 . 配列番号 2 7および 2 9にそれぞれ示される、 ハイブリ ド一マ KM341- 1- 19 から単離された核酸配列にコードされる重鎖可変領域および軽鎖可 変領域、配列番号 3 1および 3 3にそれぞれ示される、ハイプリドーマ 2105から 単離された核酸配列にコ一ドされる重鎖可変領域および軽鎖可変領域、 配列番号 3 5および 3 7にそれぞれ示される、 ハイプリド一マ 1 10から単離された核酸配 列にコードされる重鎖可変領域および軽鎖可変領域、 配列番号 3 9および 4 1に それぞれ示される、 ハイプリドーマ 1 15から単離された核酸配列にコードされる 重鎖可変領域および軽鎖可変領域、配列番号 5 1および 5 3にそれぞれ示される、 ハイプリドーマ KM643- 4- 1 1 から単離された核酸配列にコードされる重鎖可変領 域および軽鎖可変領域、 配列番号 5 9および 6 1にそれぞれ示される、 ハイプリ ドーマ から単離された核酸配列にコードされる重鎖可変領域および軽鎖 可変領域、 または配列番号 6 3および 6 5にそれぞれ示される、 ハイプリドーマ F5 - 77 から単離された核酸配列にコードされる重鎖可変領域および軽鎖可変領 域の、 マチュア部分のアミノ酸配列を有する抗体又はその機能的断片。 ■
1 7 . 以下の（g)〜（j )から選ばれる少なくとも 1つの性質を有する、 ヒト CD40に対する抗体又はその機能的断片。
(g) CD40に対するリガンドの作用を中和する
( ) B細胞樹立細胞株上の CD40に対するリガンドが CD40発現細胞に与える影 響の 1つ以上を中和又は緩和し、 かつ、 抗免疫グロブリン抗体による架橋によつ て前記 B細胞樹立細胞株上の CD40に対するァゴニスティックな作用が 5D 12より 弱い
( i) B細胞樹立細胞株に対して、 CD40リガンドが、 CD95の発現を増加させる作 用を緩和又は中和する
(j) 樹状細胞に発現する CD40に対してアン夕ゴニスティックな作用を有する
1 8. 飽和量の CD40L発現細胞を添加した lxlO6個/ mlの濃度の Ramos細胞に、 0.1 iig lの濃度の抗体が添加された場合に、 Ramos細胞の CD95の発現を対照の 約 10%以下に抑制しうるものである、請求項 1 7記載の抗体又はその機能的断片 c
1 9. 飽和量の CD40L発現細胞を添加した lxlO6個/ mlの濃度の Ramos細胞に、 1 ^g/ilの濃度の抗体が添加された場合に、 Ramos細胞の CD95の発現が陰性コン トロールと同レベルまで抑制されるものである、 請求項 1 7記載の抗体又はその 機能的断片。
20. 飽和量の CD40L発現細胞を添加した lxlO6個/ mlの濃度の Ramos細胞に、 10 g/mlの濃度の抗体が添加された場合に、 Ramos細胞の CD95の発現が陰性コン トロールと同レベルまで抑制されるものである、 請求項 17記載の抗体又はその 機能的断片。
21. インビト口において、 可溶性 CD40L (l/zg/ml) を添加した lxlO5個の 扁桃腺 B細胞に、 0.001 ig/mlから 10/zg/mlの濃度の抗体が添加された場合に、 扁桃腺 B細胞の増殖が約 80から 95 %以上抑制されるものである、 請求項 1 7 記載の抗体又はその機能的断片。
22. インビト口において、 可溶性 CD40L (1 g/ml) を添加した lxlO5個の 扁桃腺 B細胞に、 0.01/ g/nilから 10 ig/mlの濃度の抗体が添加された場合に、 扁桃腺 B細胞の増殖が約 95 %以上抑制されるものである、 請求項 1 7記載の抗 体又はその機能的断片。
23. インビト口において、 可溶性 CD40L (l g/ml) を添加した lxlO5個の 扁桃腺 B細胞に、 0.001 g/ml の濃度の抗体が添加された場合に、 扁桃腺 B細胞 の増殖が約 80 %以上抑制されるものである、 請求項 1 7記載の抗体又はその機 能的断片。
24. ハイブリド一マ KM281- 1- 10 (受託番号 FERM BP- 7579)、 4D11 (受託番 号 FERM BP- 7758) または F4- 465 (受託番号 ATCC PTA- 3338) により生産される抗 体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域のアミノ酸配列を有する抗体又はその機能 的断片。
2 5 . 配列番号 4 4および 4 6にそれぞれ示される、 ハイプリ ドーマ KM281-1-10の産生する抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域、配列番号 4 8お よび 5 0にそれぞれ示される 、イブリドーマ 4D 1 1の産生する抗体の重鎖可変領 域および軽鎖可変領域、 または配列番号 5 6および 5 8にそれぞれ示される、 ハ イブリドーマ F4- 465の産生する抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域の、マチ ユア部分のアミノ酸配列を有する抗体又はその機能的断片。
2 6 . 配列番号 4 3および 4 5にそれぞれ示される、 ハイプリ ドーマ KM281- 1-10 から単離された核酸配列にコードされる重鎖可変領域および軽鎖可 変領域、配列番号 4 7および 4 9にそれぞれ示される、ハイブリ ドーマ 4D 1 1の産 生する抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域、 または配列番号 5 5および 5 7 にそれぞれ示される、八イブリドーマ F4- 465から単離された核酸配列にコードさ れる重鎖可変領域および軽鎖可変領域の、 マチュア部分のアミノ酸配列を有する 抗体又はその機能的断片。
2 7 . ヒト抗体である、 請求項 1〜2 6のいずれかに記載の抗体又はその機 能的断片。
2 8 . 請求項 1〜2 6のいずれかに記載の抗体又はその機能的断片を有効成 分として含む医薬組成物。
2 9 . 請求項 1〜1 6のいずれかに記載の抗体又はその機能的断片を有効成 分として含む、 免疫賦活化剤、 抗腫瘍剤又は自己免疫疾患治療剤。
3 0 . 請求項 1 7〜 2 6のいずれかに記載の抗体又はその機能的断片を有効 成分として含む、 免疫抑制剤、 自己免疫疾患治療剤、 アレルギー治療剤又は血液 凝固第 VI II因子阻害症候群治療剤。
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