WO2001009141A1

WO2001009141A1 - Derives de biotine polymerisables, polymere de la biotine et polymere reagissant a la stimulation de l'avidine

Info

Publication number: WO2001009141A1
Application number: PCT/JP2000/005113
Authority: WO
Inventors: Noriyuki Ohnishi; Mikiko Yoshida; Kazunori Kataoka; Katsuhiko Ueno
Original assignee: National Institute Of Advanced Industrial Science And Technology; Japan Chemical Innovation Institute
Priority date: 1999-07-29
Filing date: 2000-07-28
Publication date: 2001-02-08
Also published as: EP1201667A4; EP1201667B1; DE60022762D1; DE60022762T2; EP1201667A1; US7052917B1

Description

明細書重合性ビォチン誘導体、ビォチン高分子化合物及びァビジン刺激応答性高分子化合物技術分野

本発明は現在盛んに行われている（ィミノ）ピオチン誘導体の固定化法として、優れた手法を提供する。さらにその誘導体を用いて（ィミノ）ピオチン部位が固定化された機能性高分子の提供に関する。背景技術

ピオチンとアビジンの高い結合性（例えば Methods Enzymol.184,5-13. 184, 14-45参照）を利用した技術が、ィムノアヅセィ（例えば特開平 4一 3 6 3 6 5 9号公報、同 6— 1 6 0 3 8 7号公報)、バイオセンサ一（例えば特開平 1 0— 2 8 2 0 4 0号公報、同 9 - 2 9 2 3 9 7号公報、同 8— 9 4 5 1 0号公報）、 DNA操作（例えば特開平 4一 2 6 7 8 9 6号公報）、分離材（例えば特開平 5— 3 4 0 9 4 5号公報、同 4一 3 1 1 3 9 7号公報）、臨床療法（例えば J. Nucl Med Commun 1991; 12: 211- 234. Int J. cancer 1990;45:1184-1189 )などに適用されている。

上記各種方法を行うためには、蛋白（糖蛋白）、抗体、酵素、発色団、デキストラン等にピオチンを固定化することが必要であり、そのために種々のピオチン固定化試薬が発売されている (Methods Enzymol.184, 123-138)。これは、生体系物質のアミノ基、硫黄基、カルボン酸、アルコール等の反応性の官能基にピオチン固定化試薬を反応させてピオチンを固定化するものである（例えば Molecular Probes Handbook of fluorescent Probes and Research Chemicals Chapter4参照)。かかる固定化反応にはピオチンの誘導体が用いられる (例え Molecular Probes Handbook of fluorescent Probes and Research Chemicals Chapter4 ,p87参照)。また、この試薬を用いてポリエチレングリコ一ル末端にピオチンを固定化した例も報告されている（Bioconjugate Chem.l997,8，545~551)。

以上に記載したピオチンの固定化は、元来ある物質、たとえば蛋白などの一つの官能基について一つの反応を行いピオチンを固定化するという概念に基づくものである（例えば特開平 6— 1 4 8 1 9 0号公報参照)。

上記の通り、ピオチンの有用性は種々の分野で実証されており、その工業的応用は新しい機能を発現する製品を導く可能性がある。しかしながら、上記ピオチン固定化試薬は高価であり、これらを用いたピオチン固定化法では、その工業的使用は難しい。また、水溶液中あるいは生理的食塩水中で降温操作により凝集する、上限臨界溶液温度（U C S T ) を有する感熱性高分子は分離剤、 D D S等に応用が期待され (Macromol.Chem., Rapid Commun.13, 577-581(1992))、その高分子の出現が待望されている。

一方、上述したようにピオチン固定化試薬は反応性の官能基に固定化するため、官能基の保護が必要な場合があり、また立体障害が大きい官能基の場合や高分子鎖にピオチン骨格を固定化する場合などは、ピオチン固定化の反応自体が困難である。例えばマクロな高分子である蛋白などにピオチンを固定化する場合は、官能基が少なく充分な量のピオチンが固定できず、しかも蛋白表面に存在する官能基のみにしか固定化されない。高分子の重合度が高くなれば同様に従来の固定化法ではピオチンの固定化を思い通りに設計することは困難になる。

従って、本発明は、上記種々の分野に応用可能なピオチン成分を含有し、更に多官能性、多重機能性の高分子を合成、設計可能とすることを目的とする。

更に、本発明は、上記ピオチン成分含有高分子を工業的に製造でき、優れた経済性及び効率性で合成、設計することを目的とする。

また、本発明は、水溶液中で降温操作により凝集し、更に生理的食塩水中でも上限臨界溶液温度（U C S T ) を有する感熱性高分子、および水溶液中で昇温操作により凝集し、水溶液中で下限臨界温度（L C S T ) を有する感熱性高分子を提供することを目的とする。発明の開示

本発明の上記目的は、下記一般式（I ) で示される重合性ピオチン誘導体を用いることにより達成されることが見いだされた。一般式（

式（I ) 中、 R ²は水素原子又はアルキル基を示す。 R ³及び R ⁴はそれそれ独立に水素原子、アルキル基又はァリール基を示す。

Tは酸素原子又は = N H基を表す。

Wは単結合又はカルボニル基、チォカルボ二ル基もしくは炭素数 1〜 5のアルキレン基を示す。 Uは単結合又は一 N H—基を示す。 Xは単結合又は炭素数 1〜 8の炭化水素結合、酸素原子もしくは一 N H—基を示す。 Yは単結合又はカルボニル基、チォカルポニル基、一 N H基一、 1， 2—ジォキシエチレン基もしくは 1， 2—ジァミノエチレン基を示す。 Zは単結合又はカルボニル基、チォカルボニル基、炭素数 1〜5のアルキレン基、酸素原子もしくは一 N H—基を示す。 Vは単結合又は炭素数 1 ~ 5のアルキレン基を示す。即ち、本発明においては、生体機能を有する上記重合性ピオチン誘導体（以下、単にビォチンモノマ一とも称する）を重合することにより、容易かつ工業的、経済的に（イミノ）ビォチンを固定化した高分子の合成が可能になる（なお、以下本明細書において用いる「ピオチン」は、具体的に化合物名として挙げられた場合を除き、イミノビォチンをも含めた意味で用いる）。

出発物質のピオチンを固定化したピオチンモノマ一は工業的にも成り立つ経済性と効率性がある。

また公知のビォチン固定化技術の如き、高分子中の官能基に反応させてピオチンを固定化するものではないため、例えば、ピオチン固定化試薬に反応する官能基を有するモノマ —と共重合させてもその官能基を未反応のまま含有する、ピオチンを固定化した形式の共重合体を合成することができる。

更に高分子鎖が官能基を包み込み、ピオチン固定化を従来の技術により行えない場合などであっても、高分子の設計を適宜行うことにより、任意の割合で長鎖の高分子側鎖としてピオチン骨格を組み込むという高分子設計が可能となる。

例えば、ピオチンまたはイミノビォチン部位を有する、水溶液で下限溶液臨界温度 (LCST)又は上限溶液臨界温度（UCST) を有する熱応答性高分子を見出すに至った。本発明の重合性ピオチン誘導体を、アクリルアミド及びメ夕クリルアミドから選択される少なくとも 1種のモノマ一成分と共重合させて得た高分子は、水溶液中及び生理的食塩水中で U C S T (上限臨界溶液温度）を有する感熱性高分子化合物であることがわかった。

更に、 LCST を有する熱応答性高分子にピオチンを固定化することにより、 LCST以上で非常に凝集力の強い熱応答性高分子となることを見出した。

これらの高分子はピオチンを固定化していることから、種々のアビジン固定化リガンド、或いはアビジンの 4力所の結合部位を介して、種々のビォチン化リガンドを簡便に固定化することができる。なお、本明細書における「アビジン」は、ストレブトァビジンを含む意味で用いる。

さらに、本発明の熱応答性高分子誘導体は、水溶液中、生理的食塩水中、緩衝溶液中で LCST 以上又は UCST 以下で凝集力の大きなを熱応答性有するため、各種物質の分離、固定化酵素、検量、制御等に有効に適用する事ができる。図面の簡単な説明

図 1は、昇温時と降温時の温度と透過率の関係であり、アクリルアミド /ピオチノ一ルァクリレート共重合体（仕込み比 2 0 ) の水中における U C S T pポリマ一濃度 10mg/ml)を示す。

図 2は、生理的食塩水中におけるアビジンを認識したコポリマーの透過率変化（降温時）であり、アクリルアミド /ピオチノ一ルアタリレート共重合体（仕込み比 2 0 ) の生理的食塩水中（コポリマ一濃度 6mg/ml) におけるアビジン認識能と U C S Tの変化（降温時の透過率のみ）を示す。

図 3は、 N—イソプロピルァクリルァミドとピオチノ一ルァクリレ一トコポリマ一のァビジン添加による L C S T変化（降温時）を示す。

発明を実施するための最良の形態

更に本発明について詳細に説明する。

上記式（I ) で示される重合性ピオチン誘導体において、好ましくは R ²は水素原子又は炭素数 1 ~ 3のアルキル基を示し、 R ³及び R ⁴はそれぞれ水素原子、炭素数 1〜 3のァルキル基又はフエ二ル基を示す。特に好ましくは、 R ²は水素原子又はメチル基を示し、 R ³及び R ⁴はそれそれ水素原子、メチル基又はフエ二ル基を示す。アルキル基及びァリ一ル基は、必要に応じて更に置換基を有していてもよい。

式（I ) において、一V—Z— Y— X— U— W—で表される結合基としては、具体的には、下記表一 1に記載のものが挙げられる。表一 1

例 V Z Y X U W

力ルポニル基

灰素数 1 ~ 5酸素原子又は

(1) 又はチ才カル単結合単結合単結合

のアルキル基一 N H—基

ボニル基

カルボニル基カルボニル基灰素数 1 ~ 5酸素原子又は酸素原子又は

(2) 又はチ才カル単結合又はチ才カルのアルキル基一 N H—基一 N H—基

ボニル基ボニル基カルボニル基 1,2-ジ才キシェチ力ルポニル基炭素数 1 ~ 5

(3) 単結合又はチ才カルレン基又は 1,2-ジ単結合又はチ才カルのアルキル基

ポニル基アミノエチレン基ポニル基炭素数 1 ~ 5

(4) 単結合単結合単結合単結合単結合

のアルキル基炭素数 1 ~ 5 酸素原子又は

(5) 単結合単結合単結合単結合

のアルキル基 - N H—基灰素数 1 ~ 5 炭素数 1〜8の一 N H—

(6) カルボニル基一 N H—基カルボニル基のアルキル基炭化水素結合更に好ましくは、式（I) で示される重合性ピオチン誘導体として、下記式（l a) (I c) で表される重合性ピオチン誘導体が挙げられる。

—般式（l a)

-般式（l b)

一般式（l a) ~ ( I c) 中、 R¹は単結合又は炭素数 1〜 4のアルキレン基を示し、 R ⁵は炭素数 2又は 3のアルキレン基を示す。

X¹は酸素原子又は硫黄原子を示し、 X²〜X⁵はそれそれ独立に、酸素原子又は一 N H—基を示す。

T、 R²、 R³及び R⁴はそれそれ上記式（I) で定義される通りある。式（l a) において、好ましくは、 R¹は炭素数 1 ~5のアルキレン基、より好ましくは炭素数 2〜4のアルキレン基を示し、 R⁵は炭素数 2又は 3のアルキレン基を示し、 R² は好ましくは水素原子又はメチル基を示し、 X¹は酸素原子又は硫黄原子を示し、 X²及び X ³はそれそれ独立して酸素原子又は一 NH—基を示す。 Tは酸素原子又は =NH基を示す。

式（l b) において、好ましくは、 R¹は炭素数 1~5のアルキレン基、より好ましくは炭素数 2〜 4のアルキレン基を示し、 R ²は好ましくは水素原子又はメチル基を示し、 R ³及び R ⁴はそれそれ独立に水素原子、アルキル基又はァリール基を示し、より好ましくは水素原子を示す。 X⁴は好ましくは酸素原子又は一 NH—基を示す。 Tは酸素原子又は =NH基を示す。

式（I c) において、好ましくは、 R¹は炭素数 1〜5のアルキレン基、より好ましくは炭素数 2~4のアルキレン基を示し、 R²は好ましくは水素原子又はメチル基を示し、 R ³及び R ⁴はそれそれ独立に水素原子、アルキル基又はァリール基を示し、より好ましくは水素原子を示す。 X⁵は好ましくは酸素原子又は一 NH—基を示す。 Tは酸素原子又は =NH基を示す。

上記一般式（l a) で示される重合性ピオチン誘導体は、一般に下記一般式（a l) で示されるピオチン又はピオチン誘導体の側鎖カルボキシル水酸基を適当な脱離基に変換後、下記一般式（a2) で示されるアクリル誘導体と縮合反応させることにより得ることがでぎる。

その具体的方法を以下に示す。

例えば、下記に示す通り、下記のピオチン（i ) のカルボキシル基を塩化チォニル Zトルェン中で 2時間還流した後、 2—ヒドロキシェチルァクリレート（ii) と縮合反応することにより 2—ピオチニルェチルァクリレート（A) を得ることができる。

2-ビォチ二ルェチルァクリレー卜（A) また、下記に示す通り、（ィミノ）ピオチン（i' ) と N— （3—ァミノプロピル）メタクリルアミド塩酸塩（iii) を、ジフエニルホスフォニルアジド（DPPA)、トリェチルァミン（TEA) 及び N， N—ジメチルホルムアミド（DMF) の存在下反応させることにより、 N—ビォチ二ルー N' - (メタ）ァクロィルトリメチレンアミド（B) 又は N —ィミノピオチェル一 N' — （メタ）ァクロィルトリメチレンアミド（C) を得ることができる。

（ iii )

N-ビ才チニル- N' -(メタ)ァクロィル卜リメチレンアミに ( B )

N-イミノビォチこル-Νに（メタ)ァク□ィル卜リメチレンアミに（C)

(ここで、 R²¹は水素原子又はメチル基を示す。）上記一般式（lb) で示される重合性ピオチン誘導体は、一般に下記一般式（b l) で示されるピオチン誘導体を、適当なアクリル化剤（b 2) (メタクリル化剤等も含む。例えばアクリル酸、アクリル酸クロリド、無水アクリル酸、ァクリロキシスクシンイミド等のアクリル化剤、メタクリル酸、メタクリル酸クロリド、無水メタクリル酸、メタクリロキシスクシンィミド等のメ夕クリル化剤等）と反応させて得ることができる。ァクリル化剤 (b2)

FT

""Z ヽ X⁴— H

(b1)

ここで、式（b l) のピオチン誘導体は、式（a l ) のピオチン又はピオチン誘導体を適当な還元剤で還元することによりアルコール体（X⁴ =酸素原子）を得ることができ、更に該アルコール体の水酸基を脱離基機能を有する官能基に変換後、ァミン誘導体（X⁴ =一 NH—) と置換反応させることにより得ることができる。

その具体的製造方法を以下に示す。

例えば、下記に示す通り、市販のピオチン（Merck製)を、例えばソジゥムボロハイドライド、ジイソブチルアルミニウムハイドライド、 THFボラン、リチウムアルミニウムハイドライド (Flaster and Kohn,J.Heterocycl.Chem.(1981), 18(7), 1425-36)) 等の還元剤にて還元してピオチノ一ル（iv) を得、ピオチノ一ル（iv) をアクリル化剤と反応し、再結晶にてピオチノ一ルァクリレート（D) を得ることができる。

ビ才チノ一ルァクリレー卜（D) また、上記ピオチノ一ル（iv) を、メタクリル剤と反応させて、ピオチノ一ルメタクリレート（E ) を得ることができる。

+ メタクリル化剤

ビ才チノール（iv )

ビ才チノ一ルメ夕クリレー卜（E) また、下記に示す通り、ピオチノ一ル（iv) の水酸基を脱離機能を有する官能基に変換後、ァミン誘導体と置換反応した後ピオチンアミン（V ) を得、ピオチンアミンもしくはその塩等を縮合剤（ジェチルリン酸シアニド、ジフエニルリン酸アジド等）の共存下、ァクリル化剤と反応することにより、ピオチンアミンアクリルアミド（F ) を得ることがでぎる。

+ アクリル化剤

ビ才チンアミン（V )

0

入

HN NH 0

^H"T 、†^H NH ビ才チンアミンァクリルアミド（F) 同様に、ピオチンアミン（V ) もしくはその塩を縮合剤（ジェチルリン酸シアニド、ジフエ二ルリン酸アジド等）の共存下メタクリル化剤と反応することによりピオチンアミンメタクリルアミド（G ) を得ることができる。

+ メタクリル化剤

ビ才チンアミン（V

更に、下記に示す通り、ノルビオチンアミン（vi) もしくはその塩を縮合剤（ジェチルリン酸シアニド、ジフヱニルリン酸アジド等）の共存下にてアクリル化剤と反応することにより、ノルビオチンアミンアクリルアミド（H ) が得られる。

+ アクリル化剤

ノルビ才チンアミン（vi )

ノルビ才チンアミンァクリルアミド（H)

同様に、ノルビオチンアミン（vi) またはその塩を縮合剤（ジェチルリン酸シアニド、ジフエニルリン酸アジド等）の存在下メタクリル酸と反応することにより、ノルビオチンアミンメタクリルアミド（J ) を得る。

+ メ夕クリル化剤

ノルビ才チンアミン（vi )

ノルビ才チンアミンメタクリルアミド（J) 上記一般式（I c ) で示される重合性ピオチン誘導体は、一般に下記一般式（c 1 ) で示されるピオチン誘導体を、 THF、 DMSO、エーテル、 DMF、時クロロメタン、クロロホルム、酢酸ェチル、アセトン、脂肪族炭化水素、ベンゼン、トルエン等の非プロトン性溶媒中で、式（c 2) で示されるイソシァネート化合物と反応させることにより得ることができる。

具体的には、例えば、ビォチノ一ル（iv) を塩化メチレン等の溶媒中でメタクロィルイソシァネート（vii) と反応させることにより、ピオチノ一ルメタクロイルカルパメート (K) を得ることができる。

ビ才チノ一ル（iv ) メタクロイルイソシァネ一卜（vii )

ビ才チノ一ルメタクロイルカルバメート（K) 上記のようにして得られた本発明の新規重合性ピオチン誘導体（ピオチンモノマ一）は、ピオチンモノマ一そのもの、あるいは該ビォチンモノマ一と共重合性を有するモノマーとともに、通常の方法に従い、例えば可溶な溶媒中に適当なラジカル開始剤を用いて重合することにより、ピオチン成分を含有する高分子誘導体（以下単にピオチン高分子と称することもある）を得ることができる。これにより、有用性の高いピオチンが固定化された高分子化合物を容易にかつ工業的に得ることができる。ここで、「ピオチン成分」とは、ァビジン（ストレプトアビジンを含む）と高い結合性を有する部分をいい、具体的には、下記式（II) で示される成分（ピオチン成分及びイミノビォチン成分を含む）を言う。一般式 ( I I )

T ： = 0又は = N H

ビ才チン成分本発明では、他の任意のモノマー成分と共重合させることにより、各モノマーの機能をそなえたピオチン高分子の合成、設計が可能である。その結果、多官能性、多重機能性高分子の合成が可能になる。高分子そのものの特性をいかしつつ、さらにこのピオチンモノマ一を重合することによりピオチンモノマーの有用性を利用できる相乗効果のあるビォチンポリマーの製造が可能になる。

上記重合性ピオチン誘導体と共重合させることのできる共重合成分としては、重合性のあるものであれば特に限定されず、ビニル系、ビニリデン系、ブタジエン系等の種々の重合性モノマ一を挙げることができる。更に具体的には、アクリルアミド、メタクリルアミド、スチレン、 N—アルキルアクリルアミド、アクリル酸メチルエステル、酢酸ビニル、メタクリロニトリルメチルメタクリレート、イソプレンなどを挙げることができる。共重合比は特に限定的ではなく、必要に応じて任意の割合で共重合させることができる。

反応後得られた高分子誘導体は、通常の方法に従い精製することが好ましい。例えばァルコール系溶媒に注ぎ沈殿させることにより精製することができる。本発明のピオチン高分子の具体的設計例、応用例を以下に述べる。

例えば、本発明に従うポリマ一を架橋材を用いてゲル化すると、ゲル内部にまでビォチンを固定化したゲルの容易な設計 ·合成が可能となる。また磁性体にコ一チングしたり、分離材料として用いたりすることも容易になる。

また、ピオチンモノマーの特異性を考慮し、他のモノマーとの共重合による分子設計で新たな特異性が出現するポリマ一を得ることもできる。

例えば、 P N I P AM (ポリ一 N—アルキルアクリルアミド）は L C S T (下限臨界溶液温度）を示す公知の高分子であるが (J.MacromoLSci.Chem.，ん， 1441(1968))、例えば N— ィソプロピルァクリルアミドとピオチンモノマーを共重合したものは、 L C S T特性を失うことなく、分子認識能も有することができる。

L C S T (下限臨界溶液温度）を有するポリマーは、相転移温度より高温側にて凝集し、低温側にて溶解する性質を示し、各種分離剤、薬物放出制御、人工筋肉、センサー、ァクチユエ一夕一、細胞培養用担体等に広く利用される。本発明で用いることのできる水溶液中で LCST を示す高分子のモノマ一成分としては特に限定はされないが、具体的には、ポリ- N-メチル（メタ）アクリルアミド、ポリ- N-ェチル（メタ）アクリルアミド、ポリ- N-プロピル（メタ）アクリルアミド、ポリ- N-イソプ口ピル（メタ）アクリルアミド、ポリ- N-ブチル（メタ）アクリルアミド、ポリ- N-アタリロイルピロリドン、ポリ- N-ァクリロイルモルホリン、ポリ- Ν,Ν-ジメチル（メタ）ァクリルアミド、ポリ- Ν，Ν-ジェチル（メタ）アクリルアミド等のポリ- (メタ）アクリルアミド誘導体、 Ν-ビニルァセトアミド、 Ν-ビニルブチルアミド、 Ν-ビニルイソブチルアミド等のポリ- Ν-ビニルアミド誘導体、ポリビニルアセテート部分的加水分解物誘導体、メチルセルロース誘導体、ポリ-メチルビニルエーテル、ポリ-ェチルビ二ルェ一テル等のアルキルビ二ルェ一テル誘導体などが挙げられる。

一方、ァクリルアミド又はメタクリルアミドと本発明のピオチンモノマ一とを共重合させて得た高分子は U C S T (上限臨界溶液温度）特性を水溶液中および生理食塩水中で示すことが見出された。

U C S Τを有する高分子誘導体（以下単に U C S Tポリマーと称することもある）は、上記アクリルアミド又はメタクリルアミドと本発明のピオチンモノマ一との仕込み比（モル比）は、前者対後者の仕込み比が 3 ~ 3 0の間であることが好ましい。 U C S Tの測定方法としては、得られたポリマーを水又は食塩水中に溶解し、石英セルに入れ、その光路に 5 5 0 n mの光源をあて、その透過率と温度の関係について調べる方法を採用することができる。

この U C S Tポリマ一は、温度刺激応答性ポリマ一としてその応用範囲には、上記と同様の分野において考えられるが、 L C S Tポリマーとは逆に、高温側にて溶解し、低温側にて凝集するものであるため、 L C S Tポリマーとは異なる材料開発の可能性があり、刺激応答材料として魅力の有る製品として期待される。

特に、低温にて凝集する U C S Tポリマ一を含有する被覆膜上での細胞培養用担体においては、 U C S Tポリマ一を被覆した担体上に培養された培養細胞とたん体を低温にて分離することができる（組織培養、 17,9,349-353(1990))。また、高温側の溶液中に共存する薬物と結合したポリマーが、温度変化を受け、低温環境に対応した凝集ポリマーに変化することにより、その薬物をポリマー内部に包含することになる。つまり、薬物放出制御が行われる（Macromolecules 1994,27,947-952)。

本発明では、上記高分子化合物に、更に親水性又は疎水性のモノマ一を共重合成分として含有させることができる。これにより、水溶液中での L C S Tや U C S Tを変化させることができる。ここで、親水性、疎水性とは、高分子の主成分となるモノマーに対する親水性または疎水性であることを意味する。

具体的には、上記の通り主成分となるモノマ一との関係であるため一概に言えないが、親水性モノマ一としてはアクリル酸、メタクリル酸、アクリルアミド、メタクリルアミド等を、疎水性モノマーとしては、アクリル酸エステル、メタクリル酸エステル、塩化ビニル、塩化ビニリデン、スチレンなどを挙げることが出来る。

本発明の高分子化合物の分子量は特に限定されず、高分子化合物の UCSTや LCST などの性質はその分子量にあまり依存しない。現実的には通常重量平均分子量 500 〜 1000000程度、さらに好ましくは 1000 ~ 100000程度である。

分離剤を目的とする場合、好ましい UCST又は LCSTは 0〜 50 °C、特に好ましくは 0 〜 40 °Cである。

本発明において、 LCST 又は UCST の範囲（スイッチング範囲）は狭ければ狭いほど良く、本発明によれば、実用的な 5 °C以下のスイッチング範囲の LCST 又は UCST を有する熱応答性高分子が得られる。

本発明のピオチンモノマーは生体機能を有する高分子材料として有用なモノマ一であり、その用途は多岐にわたる（例えば、 Chemical Sensors Vol.12 No.l(1996)p.8 〜 11 参照）。それはピオチンそのものがアビジンを分子認識するだけではなく、その他コラーゲンなどの蛋白とも結合するというように複数の物質を認識することができる生体機能材料ということができるからである。またアビジンを介したサンドィツチ構造を利用してァフィニテイク口マトグラフィ一や、多くの抗体を認識することを利用した免疫化学などの広範な分野に、その応用が考えられる。

本発明の熱応答性高分子は（ィミノ）ピオチンを固定化しているため、共有結合の生成によりリガンドを固定化する必要はなく、アビジンービォチンのァフィ二ティ一の利用によりリガンドを固定化する事が可能である。

或いはアビジンはピオチンを認識する部位が 4力所あるため、アビジンの結合部位の一つをピオチン固定化熱応答性高分子に使用し、残りのピオチン結合部位を用いて、任意のピオチン化抗体、ピオチン化酵素、ピオチン化ヒートショックプロテイン等を固定化できる。

また予めアビジン固定化リガンドを調整すれば、直接ピオチン固定化熱応答性高分子にリガンドの固定化が可能である。

固定化したリガンドに、モノクローナル抗体あるいはポリク口一ナル抗体を用いれば、水溶液中の微生物の分離、濃縮が非常に容易にできる。即ち本発明の熱応答性高分子ににアビジン化あるいはピオチン化された特定の微生物に対するモノクローナル抗体あるいはポリクロ一ナル抗体を結合させ、溶液中の微生物と十分に接触させ、溶液の温度を昇温し微生物とともに熱応答性高分子を凝集させ、容易にデカンテ一シヨンにより微生物を回収することができる。例えば、これにピオチン化サルモネラ抗体を結合させることにより、食品けん濁液中のサルモネラ菌だけを簡単に濃縮、分離することが出来る。適当な抗体および検出試薬と組み合わせることで、従来より格段に感度のより微生物検査キットゃ診断薬に適用することが出来る。

更に本発明の熱応答性高分子に任意の核酸のビォチン化された対塩基を結合させることにより、特定の遺伝子の精製、濃縮、検出等に用いることができる。

本発明の刺激応答性材料に結合ないし吸着した標的物質は、例えば、 ①塩濃度を上げる、 ② p Hを変える（酸性又はアルカリ性にする）、 ③阻害剤、基質等を加える、 ④尿素、 S D Sなどの変性剤を加える、 ⑤有機溶媒、金属イオンなどを加える、 ⑥温度を変える、などの方法により容易に溶出することができる。

本発明の熱応答型分離材料は、更に具体的には、細菌、残留農薬の検出等の如き検査薬、診断薬への応用、微生物や細胞培養の生体物等のバイオプロダクトの分離、酵素や分子シャペロン等の固定化による生体反応機能の活性化 ·維持などに特に有効に利用できる。更に、本発明のピオチンを固定化したビォチンモノマ一は工業的にも成り立つ経済性と効率性がある。実施例

以下実施例において、本発明を更に具体的に詳述するが、本発明はこれらの実施例に何ら限定されるものではない。

実施例 1 〔2—ピオチニルェチルァクリレート（化合物 A) の合成〕

ピオチン（化合物 i、 Merck 製） 500mg、 2-ヒドロキシェチルアタリレート 200mg、塩化チォニル 20ml及びトルエン 20mlを室温にて混合し、還流を 2時間行った。溶媒を減圧下除去し、クロ口ホルム一メタノール混合溶媒にてカラムクロマトを行い、溶媒を除去して、 2 —ピオチニルェチルァクリレート（化合物 A) lOOm を粉末物質として得た (収率 14%)。

N MR分析で目的化合物 Aを良く指示した（inDMSO)。

NHおよびアクリル基結合 H： 5H， d 5.8〜 6、 6a, 3a, OCH₂： 6H, multi, δ 4.1-4.3, 6 α : 1H, multi, δ 3.1、 6 ? : 1H, d , δ 2.8、 CH₂ : 8Η , ά 1~1.6₀ 実施例 2 〔Ν—ビォチ二ルー Ν' —メタクロィルトリメチレンアミド（化合物 Β) の合成〕

Ν- (3—ァミノプロピル）メタクリルアミド塩酸塩（化合物 iii) 18 gとピオチン 24 gとトリエチルァミン 30 gを 300 m 1の N, N—ジメチルホルムアミド（DMF) に溶解し、 0°Cに冷却した。この混合物中にジフエ二ルホスフォニルアジド 28 gを 50 ml の DMFに溶解させた溶液を 1時間かけて滴下した。滴下終了後、 0°Cで 3時間攪拌し、更に室温で 12時間攪拌を行った。反応終了後減圧下、溶媒を留去し、残留物をクロロホルムーメタノール混合溶媒を展開溶媒に用いてカラムクロマトグラフィーを行ったところ、目的物である N—ビォチ二ルー N' —メタクロィルトリメチレンアミド（化合物 B) 22 gを白色粉末として得た（収率 59%)。

N MR分析で目的化合物 Bを良く指示した（iriDMSO)。

CONH： 2H, br.s, δ 7.9、 NH, NH： 2H, d, δ 6.4、 H2, H3： 2Η, s, δ 5.6, δ 5.3、 3a、 6a： 2H, br.d, δ 4.2、 CH₂： 4H, s, δ 3.0、 6 a ,G β : 2H, multi, δ 2.8、 4Η ： 1Η, multi, δ 2.6、 COCH₂： 2H, br.s, δ 2.1、 CHs： 3H， δ 1.8、 CH₂： 8H， δ 1.2〜実施例 3 〔N—イミノビォチニルー N ' —メタクロィルトリメチレンアミド（化合物 C ) の合成〕

実施例 2の N— （3—ァミノプロピル）メタクリルアミド塩酸塩 18 gの代わりに N— ( 3 —ァミノプロピル）メタクリルアミド臭化水素酸塩 18 gを、ピオチン 24 gの代わりにイミノビォチン 24 gをそれそれ用いた以外は実施例 2と全く同様にして、 N -イミノビォチニル一 N ' —メタクロィルトリメチレンアミド（化合物 C ) の臭化水素酸塩 15 gを得た（収率 42 % )。

N M R分析で目的化合物 Cの臭化水素酸塩を良く指示した（inDMSO)。

NH, NH： 2H, d, δ 8.0 〜 8.2、 CONH： 2Η, br.s, δ 7.9、 =ΝΗ · HBr： 2H, s， δ 7.5, H2, H3： 2Η, s, δ 5.6, δ 5.3、 3a、 6a： 2H， br.d, δ 4.2、 CH₂： 4H, s， δ 3.0、 6 cc ,6 β ： 2Η, multi, δ 2.8、 4Η： 1Η, multi, δ 2.6、 COCH₂： 2H， br.s, δ 2.1、 CH₃： 3H, δ 1.8、 CH₂： 8H, δ 1.2〜 1.5。実施例 4 〔ピオチノ一ルァクリレート（化合物 D ) の合成〕

4-1)ピオチン（化合物 i ) からピオチノ一ル（化合物 iv) の合成

リチウムアルミニウムハイドライド 1.96g ( 51.64mmol) を脱水ェ一テル 250mlに少しずつ入れて撹拌し、この中にピオチン（化合物 i ) 1.96g(8.02mmol)をピリジン 50ml に溶かした熱い溶液を滴下し、室温にて 30分撹拌した。その後 30分還流し、反応を終了した。過剰のリチウムアルミニウムハイドライドは水等にてつぶし、ピリジンを減圧下除去した。残査に 6N塩酸を入れ、 pHをほぼ 2に合わせた後クロ口ホルムにて抽出し、溶媒を除去すると、白色粉末を得た。メタノールから再結晶してビォチノ一ル（化合物 iv) 1.6mgを得た（収率 85 % )。

4-2)ビォチノール（化合物 iv) とアクリル化剤の反応によるピオチノ一ルアタリレート (化合物 D ) の合成反応式 1

ビ才チノール（iv)

ビ才チノ一ルァクリレ一卜（D) ピオチノ一ル（化合物 iv) 230mg (lmmol)、トリェチルァミン 273mg (3mmol)、無水アタリル酸 252mg (2mmol)、ジメチルァミノピリジン 12.9mg (O.lmmol)及びジクロ口メタン 5mlを室温にて混合した後還流し、反応溶液を NaHC0₃飽和水溶液、飽和食塩水、水にて洗い反応を終了した。溶媒にて抽出し、クロ口ホルム一メタノール混合溶媒を展開溶媒としてカラムクロマトを行ったところ、ビォチノールアタリレート（化合物 D) 170mgを白色粉末として得た（収率 59 % : ビォチンメチルエステルからビォチノールァクリレートまで収率約 50%)。

NMR分析及び質量分析（MS) の結果は目的化合物 Dを良く指示した

NMR (in CDCL) Hi, H2, H3： δ 6.4〜66.1、 Η3： 1H， d, δ 5.9、 NH： 1H， s, δ 5.6， δ 5.1、 6a： 1H， multi, δ 4.5、 3a： 1H， tri, δ 4.3、 OCH₂： 2H， tri, δ 4.1、 H4： 1H， multi, δ 3.1、 6 a： 1H, quart, δ 2.9、 6 9 ： 1H, d, δ 2.6、 CIL： 8H,

MS 質量 =285 実施例 5 〔ピオチノ一ルメ夕クリレート（化合物 E) の合成〕実施例 4で得たピオチノ一ル（化合物 iv) 550mg (2.3mmol)、トリェチルァミン (EtsN) 1.4g (7mmol)、無水メタクリル酸 1.6g (4.6mmol)、ジメチルァミノピリジン 60mg (0.5mmol)及びジクロロメタン（溶媒） 4ml を室温にて混合した後還流し、 NaHCOs飽和水溶液にて洗い反応を終了した。クロ口ホルムにて抽出し、クロ口ホルム一メタノール混合溶媒にてカラムクロマトを行ったところ、ピオチノ一ルメタクリレート (化合物 E) 630mgを白色粉末として得た（収率 40%)。

N MR分析及び質量分析（MS) の結果は目的化合物 Eを良く指示した。

NMR (inDMSO) NH： 1H, s, δ 6.4、 ΝΗ： 1Η, s, δ 6.3、 H2， H3： 1H, s, δ 6.0 -5.6, 6a： 1H, multi, δ 4.3、 3a, OCH₂： 3H, multi, δ 4.1、 6 a： 1H, quart, 0" 3.1、 6 ? : 1H, d, (J 2.8、 CH₃： 3H, s， δ 1.9、 CH₂： 8H, δ 1~1.6。

MS 質量 =3 00 実施例 6 〔ピオチンアミンアクリルアミド (ィ匕合物 F)の合成〕

反応式 2

6-1)ビォチノールトシレート（ィ匕合物 viii)の合成

0°Cにて P-トルエンスルフォニルクロライド 2400mg(12.6mmol)を混合したドライピリジン 25ml溶液に実施例 2で得たピオチノ一ル（化合物 iv) lg (4.3mmol)を入れた。その後 0 °Cにて 15時間放置した。反応後、反応液を水にあけ、ジクロロメタンにて抽出した後溶媒を除去し、ビォチノールトシレート（化合物 viii) 900mgを得た（収率 54 % )。 6-2)ピオチンフタルイミド誘導体（化合物 ix) の合成

上記で得たピオチノ一ルトシレート（化合物 viii)900mg (2.3mmol)を脱水ジメチルホルムアミド（DMF) 14ml に溶かし、フタルイミドカリウム塩 481mg (2.6mmol)をいれて 60 °Cにて 20時間加熱した。反応終了後、水をいれるとフタルイミド誘導体が析出した。これをろ過し乾燥して、ピオチンフタルイミド誘導体（化合物 ix) 570m を得た（収率 68%) o

6-3)ピオチンアミン（化合物 X ) の合成

メタノールにゆつくりヒドラジンモノ水和物 626mg を入れ（0.5M、 MeOH溶液にする）、さらに上記で得られたピオチンフタルイミド誘導体（化合物 ix) 570mgをいれた。チヅソ雰囲気下 40 °Cにて 20 時間反応させたところ、ピオチンアミン (BiNH₂)未精製物

(化合物 X ) 411m_gを得た（収率ほぼ 100 % )。

6-4)ピオチンアミンアクリルアミド（化合物 F ) の合成

上記ピオチンアミン（化合物 X ) を塩酸により塩酸塩にして得たピオチンアミン塩酸塩 133mg (0.5mmol)とァクリル酸 36 μ. 1 (0.5mmol)をジメチルホルムアミド（DMF；溶媒） 4mlに溶かし、 0 °Cに保ち、撹拌した。これにジフエ二ルリン酸アジド（DPPA)165〃 1 (0.6mmol)を滴下し CTCに保った。さらにトリエチルァミン 208 μ. 1(1.5 mmol)を 1ml の DMFに溶かした溶液を滴下し 0 °Cにて 2 ~ 4時間撹拌した。

その後室温に保ち終夜反応させた。反応終了後 DMFを飛ばし、クロ口ホルムにて抽出し、 1N塩酸と NaHC0₃、水にてクロ口ホルム層を洗い、溶媒を除去した。残査を THF - n-へキサン混合溶媒に溶かしビォチンアミンアクリルアミド（化合物 F ) 40mg (収率 25 % ) を沈澱物として得た。

N M R分析及び質量分析（M S ) の結果は目的化合物 Fを良く指示した。

N M R (inDMSO) CONH： 1H, s， δ 7.9、 HI , H2, H3： 3H, ,multi, δ 7.5-6.9, ΝΗ, ΝΗ： 1Η, s, δ 6.4, δ 6.3、 6a： 1Η, multi, δ 4.3、 3a： 1H, multi, δ 4.1、 CONHCH2, H4： 3H, multi, 6 3.5-3.0, 6 ひ： 1H， quart, δ 2.8、 6 ?： 1H, d, δ 2.5、 CH 2 ： 8H, δ l~1.6o

MS 質量 =284 実施例 7 〔ピオチンアミンメタクリルアミド（化合物 G) の合成〕

ピオチンアミン塩酸塩 lOOmg (0.38mmol)とメタクリル酸 38 j l(0.43mmol)を DMF

(溶媒） 5ml に溶かし、 0°Cに保ち撹拌した。これに DPPA130 Z l(0.5mmol)を滴下し 0 °Cに保った。さらにトリエチルアミン 156 I (l.lmmol)を 1mlの DMFに溶かした溶液を滴下し 0 °Cにて 2 ~ 4時間撹拌した。その後室温に保ち終夜反応させた。反応終了後 DMF を減圧下除去し、クロ口ホルムにて溶解し、 1N塩酸と NaHC0₃、水にてクロロホルム層を洗い、溶媒を除去した。これを THF-nへキサン混合溶媒に溶かしピオチンアミンメタクリルアミド（化合物 G) 40mgを沈澱物として得た（収率 35%)。

NMR分析及び質量分析（MS) の結果は目的化合物 Gを良く指示した。

CONH： 1H, s, δ 7.9、 Hi, H2, H3： 3H, multi, 7.5-6.9, NH, NH： 1H, s, δ

6.4, δ 6.3、 6a： 1H, multi, 64.3、 3a： 1H, multi, δ 4.1、 CO HCH₂、 H4： 3H, multi, δ 3.5-3.0, 6 ひ： 1H， quart, δ 2.8、 6 3 : 1H, d, δ 2.5、 CH₂： 6H, δ

MS 質量 =299 実施例 8 〔ノルビオチンアミンアクリルアミド（化合物 H)の合成〕

ノルビオチンアミン塩酸塩（Merck 製） 125mg (0.5mmol)とァクリル酸 36 μ. 1 (0.5mmol)をジメチルホルムアミド（DMF；溶媒） 3ml に溶かし、 0°Cに保ち、撹拌した。これにジフエ二ルリン酸アジド (DPPA)165〃 1 (0.6mmol)を滴下し 0°Cに保った。さらにトリェチルァミン 208〃 1(1.5 mmol)を 1mlの DMFに溶かした溶液を滴下し 0 °Cにて 2~ 4時間撹拌した。

その後室温に保ち終夜反応させた。反応終了後 DMFを飛ばし、クロ口ホルムにて抽出し、 1N塩酸と NaHC0₃、水にてクロ口ホルム層を洗い、溶媒を除去した。残査を THF-n へキサン混合溶媒に溶かしノルビオチンアミンアクリルアミド（化合物 H)30mgを沈殿物として得た（収率 20 %)。

N M R分析は目的化合物 Hを良く指示した（inDMSO)

N M R (inDMSO) CONH： 1H, s， δ 7.8、腿， ΝΗ： 1H, s， δ 6.4, δ 6.3、 Hi, Η2： 1H， s， δ 5.6, δ 5.3、 6a： 1H, multi, δ 4.3、 3a： 1H, multi, δ 4.1、 CONHCH_2> H4： 3H, multi, δ 3.5〜 3.0、 6 α ： 1Η, quart, δ 2.8、 6 3 ： 1H, d, δ 2.5、 CH₃： 3H, δ 1.8、 C¾： 8H, δ 1 ~ 1.6。実施例 9 〔ノルビオチンアミンメタクリルアミド（化合物 J ) の合成〕

ノルビオチンアミン塩酸塩 94mg (0.38mmol)とメタクリル酸 38 l(0.43mmol)を DMF (溶媒） 3ml に溶かし、 0 °Cに保ち、撹拌した。これに DPPA130 l(0.5mmol)を滴下し 0 °Cに保った。さらにトリエチルアミン 156 1 ( l.lmmol)を 1mlの DMFに溶かした溶液を滴下し 0 °Cにて 2〜 4時間撹拌した。その後室温に保ち終夜反応させた。反応終了後 DMF を除去し、クロ口ホルムにて抽出後、 1N塩酸と NaHCCk 水にてクロロホルム層を洗い、溶媒を除去した。これを THF-n へキサン混合溶媒に溶かしノルビオチンアミンメタクリルアミド（化合物 J ) 30mgを沈澱物として得た（収率 30 % )。

N M R分析は目的化合物 Jを良く指示した（inDMSO)

CONH： 1H， s， δ 7.8、 ΝΗ, ΝΗ： 2Η, d, 6.4、 Hi , H2： 1H， s， δ 5.6, δ 5.3、 6a： 1H， multi, δ 4.3、 3a： 1H, multi, δ 4.1、 CONHCIL, H4： 3H， multi, δ 3.5-3.0, 6 a : 1H， quart, δ 2.8、 6 ? : 1H, d, δ 2.5、 CH₃： 3H, δ 1.8、 CH₂： 6H,

実施例 1 0 〔ピオチノ一ルメタクロイルカルパメート（化合物）の合成〕

メタクロィルイソシァネート（化合物 vii) 266mg を塩化メチレン 20ml に溶かし 0 °C に保ち、ビォチノール 500mg を含む塩化メチレン溶液を徐々に滴下し、 1時間攪拌し、更に室温で 10時間攪拌した。

反応終了後、飽和重曹水 30ml を加え、クロ口ホルムにて抽出した。クロ口ホルム層を減圧下溶媒を留去し、残査をシリカゲルを用いてカラムクロマトを行った。得られた粗目的物をィソプロパノールを用いて再結晶を行い、ビォチノールメタクロイルカルバメート (化合物） 120mgを得た（収率 16%)。

N M R分析で目的化合物 Kを良く指示した。

CONHCO： 1H, s, δ 8.4〜 8.5、 ΝΗ： 1H, s, δ 6.2、 Η2， Η3： 1H， s，S 5.8， δ 5.6、 NH： 1H, s, δ 5.5、 6a： 1H， multi, δ 4.5、 3a： 1H, multi, δ 4.3、 OCH₂： 2H, tri, δ 4.2、 4H： 1H， multi, δ 3.2、 6 ： 1H, quart, δ 2.9、 6 ^ : 1H, d, δ 2.7、 CH₃ ： 3H, s， δ 1.9、 CH₂： 8H, δ 1.2〜 1.7。

尚、上記 N M Rデータの各プロトン表示は下記の通りである。

ビ才チノ一ルァクリレー卜

ビ才チンアミンァクリルアミド

ノルビ才チンアミンァクリルアミド

ビ才チノールメタクリレー卜

ビ才チンアミンメタクリルアミド

ノルビ才チンアミンメタクリルアミド

(アミドは酸素原子の代わりに Ν Ηに変わる）

実施例 1 1 ~ 1 5 〔アクリルアミド /ピオチノ一ルァクリレート共重合体の合成〕

アクリルアミド 710mg、ピオチノ一ルァクリレート（化合物 B ) 142mg、ジメチルスルフォキシド 10ml及び 2 , 2 ' ーァゾビス（2， 4—ジメチルバレロニトリル） 8.5mg を混合し、チッソ雰囲気下脱気した。その後徐々に温度を昇温し、攪拌しながら 45 °Cにて反応を 2〜 3時間行った。最後に 65 °C付近にまで昇温して反応を完結させた。反応系に溶媒（ジメチルスルフォキシド）を数 ml加え、エタノールに注ぐと沈殿を生じた（収率 95%以上）。沈殿は乾燥した後、水に溶解し透析した。水を除去してポリマーの精製を終了した。

上記アクリルアミドとピオチノ一ルァクリレートとの仕込み比（モル比）を種々変え、開始剤を 2種類（上記開始剤 2， 2 ' —ァゾビス（2 , 4—ジメチルバレロニトリルの代わりに、ァゾビスイソプチロニトリルを使用。各々の反応温度は異なり分子量も異なる）使用して重合したポリマーの結果を表一 2に示す。

表一 2 アクリルアミドとビォチノールァクリレー卜の共重合高分子の仕込み比

(モル比）.を変化した場合に、測定溶液の透過率が 5 0 %を示す温度

分子量測定は TOSOの G4000PWを使用した。

生食中：生理的食塩水中にて透過率を測定した場合

水中：蒸留水中にて透過率を測定した場合。

仕込み比：モル比

2,2 ' -ァゾビス (2,4-ジメチルバレロニ卜リル)使用の場合の重合温度は 45°C~65°C

ァゾビスイソプチロニトリル使用の場合の重合温度は 80°C

実施例 11、 12の透過率測定溶液濃度： 6mg ml

実施例 13の水中透過率測定溶液濃度： lOmg/ml

実施例 13の生食中透過率測定溶液濃度： 6mg/ml

実施例 14の透過率測定溶液濃度： 22.4mg ml

実施例 15の透過率測定溶液濃度： 6mg/ml

A A m：アクリルアミド ■ B A ：ビ才チノールァクリレー卜

また、アクリルアミド /ピオチノ一ルアタリレート共重合体（仕込みモル比 2 0 ： 1 ) の N M Rデータ（inDMSO) は以下の通りであった。 4ピーク：（5 7.5 ~ 6.5、 s ： δ 6.4、 s ： δ 4.3、 s ： δ 4.1、 s ： δ 3.1、 broad： δ 2.8、 broad： δ 2.1、 broad： (5 1.5〜 1.3。

尚、仕込み比（モル比）が変化しても下記と同様のピークを示した。更に、ピオチノ一ルァクリレ一卜のホモポリマーの場合は、 5 7.5 ~ 6.5部分のピークが約 1本になり、その他は共重合体と同じところにピークが見られた。更に、上記アクリルアミド /ピオチノ一ルアタリレート共重合体（仕込みモル比 2 0 ： 1 ) の上限臨界溶液温度（U C S T ) を図 1〜図 3に示す。

即ち、図 1は昇温時と降温時の温度と透過率の関係を示す図であり、上記アクリルアミド /ピオチノ一ルアタリレート共重合体（仕込みモル比 2 0 ： 1 ) の水中における U C S T (コポリマ一濃度 1 0 mg / ml) を示す。

図 2は生理的食塩水中におけるアビジンを認識したコポリマーの透過率変化（降温時）を示す図であり、ァクリルアミド /ピオチノ一ルァクリレート共重合体（仕込み比 2 0 ) の生理的食塩水中（コポリマー濃度 6mg/ml) におけるアビジン認識能と U C S Tの変化 (降温時の透過率のみ）を示す。

図 3は、 N—イソプロピルァクリルァミドとビォチノールァクリレ一トコポリマ一のァビジン添加による L C S T変化（降温時）を示す図であり、上記コポリマ一を含有する水溶液中にアビジンを添加すると、その透過率変化が少なくなり、コポリマーが溶け易くなることが判る。

このように、本発明のビォチンモノマ一を共重合成分として含有する共重合体は、温度刺激応答材料としての特性を有することがわかる。実施例 1 6 [ピオチン固定化ポリ- N-イソプロピルアクリルアミドの合成]

300 m l容のフラスコ内に N-イソプロピルァクリルアミド 0.488 g：、 N-メタクロィル - Ν'-ピオチニルプロピレンジァミン 0.159 gおよび蒸留水 9 4 m 1を添加し室温でよく撹拌した。そこに 0.1 gの過硫酸カリウムを添加し、室温で 6時間撹拌した。得られた溶液を一昼夜透析し、 LCST を有するピオチン化ポリ- N-イソプロピルアクリルアミド溶液を得た。得られた溶液の下限臨界溶液温度 (LCST)を測定したところ、 31 であった。この LCSTは生理食塩水中や lOOmMのリン酸緩衝液 (pH7.0)中でもほとんど変化しなかった _c さらに LCST 以上に加温したポリマーの凝集能力は非常に高く、下層に沈殿し、デカンテ一シヨンによりポリマーを回収することができた。

尚、 LCSTは可視光の透過率を用いて求めた。実施例 1 7 [水溶液中からのアビジンの分離]

実施例 1 6で得られたポリ -N-ィソプロピルァクリルァミド水溶液 50〃 1、 1.0% ァビジン溶液 50 1、 1.0Mリン酸ナトリゥム緩衝液 (pH7.0) 100〃 1、蒸留水 800 1を試験中で良く混合した後、氷水中に置き溶液の温度が LCST 以下にした。凝集物をデカンテ —シヨンにより回収し、上清部分 100 // 1を取り出し、 SDS による変性処理後、 SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動 (SDS-PAGE)により上清からァビジンに対応するパンドが無くなつていることを確認した。実施例 1 8 [卵白中からのアビジンの特異的分離]

実施例 1 6で得られた LCST を有するポリ- N-イソプロピルアクリルアミド水溶液 50 M l , 1.0%アビジン溶液 50 1、 1.0M リン酸ナトリゥム緩衝液 (pH7.0)100 1、蒸留水 450 1、 2.5%の卵白溶液 400 1を試験中で良く混合した後、氷水中に置き溶液の温度が LCST 以上にした。凝集物をデカンテーシヨンにより回収し、上清部分 100 1 を取り出し、 SDS による変性処理後、 SDS-PAGE により上清からアビジンに対応するバンドのみが無くなつていることを確認した。実施例 1 9 [[ピオチン固定化ポリ- N-イソプロピルアクリルアミドへのアビジン化酵素の固定化]

実施例 1 6で得られたポリ- N-イソプロピルアクリルアミド水溶液 100 〃 1、市販のァビジン化ペルォキシダ一ゼ溶液（lmg/ml)1000 μ. 1、 1.0M リン酸ナトリゥム緩衝液 (pH7.0)100 〃 1及び蒸留水 700 〃 1を添加し、良く混合した。得られた溶液を冷却し、デカンテ一シヨンにより凝集物を回収し、上清 1900 〃 1を取り除いた後、新たに 0.1M リン酸緩衝液（pH 7.0) 1900〃 1を添加し、アビジン化ペルォキシダ一ゼを固定化した LCST を示すポリ- N-イソプロピルアクリルアミド水溶液を調製した。この溶液は LCST 以下では溶解し、 LCST以上では凝集した。溶液の温度を恒温槽により変化させ、溶解、凝集およびデカンテ一シヨンによる回収の操作を行い、それぞれの上清のペルォキシダ一ゼの活性を下記に示すペルォキシダ一ゼの活性測定法により測定した。なお、デカンテ一シヨンによる回収後は毎回上清 1900 〃 1を取り除き、新たに 0.1M リン酸緩衝液（pH 7.0) 1900 pi 1を添加した。

(ペルォキシダ一ゼ活性測定法）

lOOmM 過酸化水素 100〃 1、 50mM フエノール、 50mM 4-ァミノアンチピリン 100 1、 1.0M リン酸ナトリゥム緩衝液 (pH 7.0)100〃 1、蒸留水 580 JJL 1を吸光度計のセル内で予め混合し、そこへサンプル 20 1を添加し、再び良く混合した後、生成物を 500nmの吸収の増加により測定した。なお、反応は 3 0 °Cで行った。

上記の方法により繰り返し凝集、溶解を行った場合の上清の酵素活性を測定した結果を下記表— 3に示す。なお、酵素活性は最初の溶解時の活性を 100 とした場合の比活性で示した。

表一 3

この結果よりポリ- N-ィソプロピルァクリルアミドに固定化されたアビジン化ペルォキシダ一ゼはポリ- N-イソプロピルアクリルアミドと共に溶解、凝集を繰り返しかつ同作業の繰り返しによっても活性は無くならないことが明らかとなった ₍ 実施例 2 0 [アビジン化ポリ- N-イソプロピルアクリルアミドへのピオチン化酵素の固定] まず、アビジンのピオチン結合サイト 3力所が空いている状態のアビジン化ポリ- N-ィソプロピルアクリルアミドを得るため、実施例 1 で得られたポリ- N-イソプロピルァクリルアミド水溶液 50 1に 1.0%ァビジン溶液 500 1、 1.0M リン酸ナトリゥム緩衝液 (pH7.0) 100〃 1、蒸留水 350 1を試験中で良く混合した後、 40 °Cの恒温槽中に置き溶液の温度を LCST 以上にした。凝集物をデカンテーシヨンにより回収し、ポリマ一との結合部位以外のピオチン結合サイトが空いているアビジン化ポリ- N-ィソプロピルァクリルアミドを得た。このポリ- N-イソプロピルアクリルアミド水溶液 100 ju 1 , 市販のピオチン化ペルォキシダーゼ溶液 (lmg/ml)1000 ju 1、 1.0M リン酸ナトリゥム緩衝液（pH 7.0) 100 1及び蒸留水 700 1を添加し、良く混合した。得られた溶液を冷却し、デカンテ一シヨンにより凝集物を回収し、上清 1900 1を取り除いた後、新たに 0.1M リン酸緩衝液（pH 7.0) 1900〃 1を添加し、ピオチン化ペルォキシダ一ゼを固定化したァビジン化ポリ- N-イソプロピルアクリルアミドを調製した。このポリ- N-イソプロピルァクリルアミドを使って、実施例 1 9と同様に溶解、凝集回収を繰り返し、上清の酵素活性を測定した結果を下記表一 4に示す。なお、酵素活性についても同様に最初の溶解時の活性を 100とした場合の比活性で示した。

表一 4

ポリ- N-ィソプロピルァポリ- N-ィソプロピルァクリ

繰り返し数

クリルアミド水溶液のぺルアミド凝集、回収後の上清

(回）

ル才キシダーゼ活性）のペルォキシダーゼ活性）

1 1 0 0 1

2 1 0 1 1

3 1 0 0 1

5 9 8 0

1 0 9 7 0

2 0 9 5 0 この結果よりアビジンの固定化されたポリ- N-ィソプロピルァクリルアミドに結合したピオチン化ペルォキシダ一ゼはポリ- N-イソプロピルアクリルアミドと共に溶解、凝集を繰り返しかつ同作業の繰り返しによっても活性は無くならないことが明らかとなった。実施例 2 1 [ポリ- N-イソプロピルアクリルアミドへの分子シャペロンの固定化]

市販のピオチン化されたヒ一トショックプロティン HSP70を lOOmMのリン酸ナトリゥム緩衝液 (pH 7.0)によく混合させた後、 5 1を取り出し、変性処理後、 SDS-PAGEにより HSP70 のバンドを確認した。続いて実施例 2 0で調製した、ポリマ一との結合部位以外のピオチン結合サイトが空いているアビジン化ポリ- N-イソプロピルアクリルアミド水溶液 50 1を加え、良く混合したのち、実施例 1 7と同様に溶液を加熱して本化合物を凝集後、デカンテ一シヨンにより回収し、上清の HSP70 を同様に SDS-PAGE により確認したところ上清には HSP70 は無く、ポリ -N-ィソプロピルァクリルァミドに固定化されたアビジンと結合していることが確認された。実施例 2 2 [微生物の分離濃縮方法]

市販のピオチン化サルモネラ抗体を実施例 1 9と同様にポリ -N-ィソプロピルァクリルアミドに固定化した。固定化したことは SDS-PAGE を用い確認を行った。続いてこのサルモネラ菌が 1個/ m 1になるように調整した菌けん濁液 20 m 1にこのポリ -N-ィソプロピルァクリルァミド水溶液 1 m 1を添加してよく撹拌後、実施例 1 6と同様に溶液を加熱し、ポリ- N-イソプロピルアクリルアミドを凝集後、デカンテ一シヨンにより回収し、上清を取り除き 1 m 1の溶液とした。この溶液を予め滅菌し、 50てにインキュベートしていたブレインハートインフユ一ジョン寒天培地 20 m lに添加し、すばやく混合後、シャ —レに広げ、寒天が固まるまで放冷し、 37 で 48時間インキュベートした。 48時間後のコロニー数を計測した結果を下記表一 5に示した。また、これら総ての操作はクリーンベンチ内にて行った。また、対照として、ポリ- N-イソプロピルアクリルアミドを添加せず、最初に調整した菌けん濁液 1 m 1中の菌数を同様に測定した。表一 5

この結果より、サルモネラ菌は本発明のポリ一N—イソプロピルァクリルアミドにより濃縮されていることが明らかである。実施例 2 3 [ポリ- N-ィソプロピルァクリルアミドへの核酸の固定化]

市販のピオチン化ラベルされた DNA断片 500〃 1 (50 ~ lOOObp) に蒸留水 450 1、実施例 2 0で調製したポリマ一との結合部位以外のピオチン結合サイトが空いているアビジン化ポリ- N-イソプロピルアクリルアミド水溶液を加え、良く混合したのち、実施例 1 7と同様に溶液を加熱し、ポリ- N-イソプロピルアクリルアミドを凝集後、デカンテ一シヨンにより回収し、上清の DNA断片をァがロースゲル電気泳動により確認したところ、いずれの DNA断片もポリ- N-イソプロピルァクリルアミドに結合していることが示唆された。 RNA についても同様の実験を行い、ポリ- N-イソプロピルアクリルアミドへの結合を確認した。産業上の利用可能性

本発明の重合性ビォチン誘導体（ピオチンモノマ一）は重合性が高く、本モノマ一を用いることにより、種々の分野に適用可能なピオチン成分を含有する高分子誘導体が容易に製造できる。

特に本発明によれば、他のモノマーとの共重合により、各モノマーの機能をそなえた高分子の合成、設計が可能であり、特に、ピオチン成分のピオチン—アビジン結合性に起因する有効性を利用しつつ、他の共重合成分や添加剤を工夫することにより、広範な範囲に適用可能な種々の多官能性、多重機能性の高分子を合成、設計することが可能となる。例えば、ピオチンモノマーとアクリルアミドまたはメタクリルアミドとの共重合体は、 U C S Tを水溶液中及び生理食塩水中で示すため、刺激応答材料としても魅力ある製品となる。また、ピオチンモノマーと L C S Tを示す高分子のモノマ一との共重合体は、 L C S T以上で非常に高い凝集力を有するため、反応を行うときは水溶液中で均一系で反応を行い、反応終了後、昇温操作でリガンド固定化高分子が凝集し、リガンドの固定化した高分子を濾過により容易に回収することができる。

これらの本発明の熱応答性高分子を用いることにより、優れた分離剤、検査薬、固定化酵素、変性蛋白改質剤等を得ることができる。。

本発明の重合性ビチオン誘導体は、生体機能を有する高分子材料として有用なモノマ一であり、その用途は、ィムノアツセィ、バイオセンサ一、 D N A操作、分離材、臨床療法など多岐にわたる。それは、ピオチンそのものがアビジンを分子認識するだけでなく、その他多くの抗体やコラーゲンなども認識する生体機能材料であるためであり、例えばアビジンを介したサンドィツチ構造等により種々応用できる。

更に、本発明の重合性ピオチン誘導体を用いて得られる高分子化合物は、工業的に製造可能であり、優れた経済性及び効率性を有する。

Claims

請求の範囲

1. 下記一般式（I) で示される重合性ピオチン誘導体。

一般式（ I )

式（I) 中、 R ²は水素原子又はアルキル基を示す。 R ³及び R ⁴はそれぞれ独立に水素原子、アルキル基又はァリール基を示す。

Tは酸素原子又は =NH基を表す。

Wは単結合又はカルボニル基、チォカルボ二ル基もしくは炭素数 1〜 5のアルキレン基を示す。 Uは単結合又は一 NH—基を示す。 Xは単結合又は炭素数 1~8の炭化水素結合、酸素原子もしくは— NH—基を示す。 Yは単結合又はカルポニル基、チォカルボニル基、一 NH基一、 1， 2—ジォキシエチレン基もしくは 1 , 2—ジアミノエチレン基を示す。 Zは単結合又はカルボニル基、チォカルボニル基、炭素数 1〜5のアルキレン基、酸素原子もしくは一 NH—基を示す。 Vは単結合又は炭素数 1〜5のアルキレン基を示す。

2. 下記一般式（l a) 〜（I c) で示される重合性ピオチン誘導体。

一般式（l b)

一般式（l a) - (I c) 中、 R¹は単結合又は炭素数 1 ~ 4のアルキレン基を示し、 R ⁵は炭素数 2又は 3のアルキレン基を示す。

X¹は酸素原子又は硫黄原子を示し、 X²〜X⁵はそれぞれ独立に、酸素原子又は— N H—基を示す。

T、 R²、 R³及び R⁴はそれそれ請求項 1に記載される通りである。

3. 請求の範囲第 1項記載の一般式（I) で示される重合性ピオチン誘導体を重合又は他の共重合成分と共重合することを特徴とするピオチン成分を含有する高分子化合物の製造方法。

4. 請求の範囲第 1項記載の一般式（I) で示される重合性ピオチン誘導体を重合成分又は共重合成分として含有するピオチン成分を含有する高分子化合物。

5. 請求の範囲第 1項記載の一般式（I) で示される重合性ピオチン誘導体と、アクリルアミド又はメタクリルアミドとを共重合成分として含有する、水溶液中で UCST (上限臨界溶液温度）を有する高分子化合物。

6. 請求項の範囲第 1項記載の一般式（I) で示される重合性ピオチン誘導体と、水溶液中で LCST (下限臨界溶液温度）を有する高分子のモノマー成分とを共重合成分として含有する、水溶液中で LCSTを有する高分子化合物。

7. 親水性モノマー又は疎水性モノマ一を更に共重合成分として含有する請求の範囲第 4 項から第 6項のいずれかに記載の高分子化合物。

8. アビジン固定化抗体またはアビジンの結合部位を介してピオチン化抗体を固定化した請求の範囲第 4項から第 7項のいずれかに記載の高分子化合物。

9. 請求の範囲第 8項記載の高分子化合物を用いた分離剤。

10. 請求の範囲第 8項記載の高分子化合物を用いた微生物の分離又は濃縮による微生物検査薬。

1 1. 請求の範囲第 8項記載の高分子化合物を用いた固定化酵素。

12. アビジン固定化ヒートショックプロテインもしくはピオチン化ヒ一トショックプロティンをアビジンの結合部位を介して固定化した請求の範囲第 4項から第 7項のいずれかに記載の高分子誘導体。