CN111466367B - 用于保存细胞的组合物 - Google Patents

Abstract

本发明属于细胞保存领域，具体涉及一种用于保存细胞的组合物,包括细胞内冻存保护剂以及细胞外冻存保护剂；所述的细胞内冻存保护剂为两性离子分子；所述的细胞外冻存保护剂为两性离子聚合物；所述的两性离子聚合物为UCST功能单元与LCST功能单元的聚合物。本发明利用温敏型两性离子聚合物特殊的温敏响应性质，即温敏型两性离子聚合物在≤0℃，0℃‑37℃，≥37℃的具有不同物理状态，将两性离子分子分别结合UCST型温敏型两性离子聚合物，LCST型温敏型两性离子聚合物，以及UCST/LCST型温敏型两性离子聚合物来保存细胞，保存效率极高。

Description

用于保存细胞的组合物

技术领域

本发明属于细胞保存领域，具体涉及一种用于保存细胞的组合物。

背景技术

细胞作为生命的基本单元，不仅可以使活体实验转移到体外，还可以用于细胞治疗，因此细胞保存尤为重要。目前最常用的保存细胞的手段是冷冻保存，在极度低温下细胞新陈代谢停止，处于“休眠”或“假死”的状态。然而，细胞的冷冻保存过程中，冰晶形成和生长将对细胞造成溶质损伤和机械损伤，添加冻存保护剂可保护细胞成活。目前，最常用的冷冻保存策略是添加二甲基亚砜(DMSO)作为冻存保护剂，但DMSO具有内在毒性，应用于人体将引起许多不良反应。随着细胞治疗技术的不断发展，有效的细胞保存方法是细胞治疗行业领域不可或缺的支撑手段。因此，开发无毒高效的新型冻存保护剂意义重大。在一条完整的细胞治疗产业链中，各环节针对细胞不仅需要进行长期保存细胞，进行超低温冻存(－80℃或－196℃)，建立“生命银行”细胞库。而且在细胞运输、检测评价、药物筛选等过程中需要将细胞置于低体温下(1-35℃)短期保存细胞，进行低体温保存。现阶段并没有一种综合方法可以实现在两种条件下“一体化”的保存细胞。细胞被采集出来，分别需要低体温条件下运输、超低温条件下长期保存，然后在使用时经过多步清洗步骤去除冻存保护液，再更换低体温保护方法运输、检测，最后投入细胞治疗使用之中。这些冗杂的步骤，不仅加剧了细胞染菌的风险和细胞数目的减少，同样会对细胞造成伤害，从而增加细胞治疗的潜在风险。现阶段缺少一种综合方法可以实现在两个条件下“一体化”的保存细胞，同时解决超低温冻存条件下冰晶造成的冷冻损伤，和低体温条件下细胞“失巢凋亡”是科学问题的关键，这对细胞保存领域有十分重要的意义。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中的缺点，提供一种用于保存细胞的组合物。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种用于保存细胞的组合物，包括细胞内冻存保护剂以及细胞外冻存保护剂；所述的细胞内冻存保护剂为两性离子分子；所述的细胞外冻存保护剂为两性离子聚合物；所述的两性离子聚合物为UCST功能单元与LCST功能单元的聚合物。

所述的两性离子分子为甜菜碱、L-左旋肉碱、氧化三甲胺中的一种或者组合物。

所述的LCST功能单元为NIPAm、HPA、TEGA中的一种；所述的UCST功能单元为SBMA，DMAPS中的一种。

所述的两性离子聚合物为UCST功能单元与LCST功能单元的质量投料比为4：1-1:1。

所述的两性离子聚合物为UCST功能单元与LCST功能单元的质量投料比为1:1。

所述的两性离子聚合物为poly(SBMA-co-NIPAm)，其中SBMA和NIPAm的质量投料比为4：1-1:1。

所述的两性离子聚合物为poly(SBMA-co-NIPAm)，其中SBMA和NIPAm的质量投料比为1:1。

两性离子分子与所述的两性离子聚合物的质量投料比为1:4-10。

两性离子分子与所述的两性离子聚合物的质量投料比为1:10。

所述的两性离子分子为甜菜碱，所述的两性离子聚合物为poly(SBMA-co-NIPAm)；其中，两性离子分子与所述的两性离子聚合物的质量比为1：10；poly(SBMA-co-NIPAm)中SBMA与NIPAm的质量投料比为1:1。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

(1)本发明利用温敏型两性离子聚合物特殊的温敏响应性质，即温敏型两性离子聚合物在≤0℃，0℃-37℃，≥37℃的具有不同物理状态，将两性离子分子分别结合UCST型温敏型两性离子聚合物，LCST型温敏型两性离子聚合物，以及UCST/LCST型温敏型两性离子聚合物来保存细胞，保存效率极高。

(2)对比三种类型温敏型两性离子聚合物：UCST型温敏型两性离子聚合物，LCST型温敏型两性离子聚合物，UCST/LCST型温敏型两性离子聚合物，冻存复苏后可以发现UCST型温敏型两性离子聚合物，UCST/LCST型温敏型两性离子聚合物表现良好,LCST功能单体在聚合物中占比会影响冻存后细胞的质量。

(3)利用温敏型两性离子聚合物特殊的温敏响应特性，将为超低温和低体温条件下细胞的“一体化”保存提供了可能。

本发明的创新性如下：1)本发明所提供的基于温敏型两性离子聚合物保存细胞的方法还未见报道，无论UCST型温敏型两性离子聚合物，还是UCST/LCST型温敏型两性离子聚合物均表现良好,其意义都在于将为超低温和低体温条件下细胞的“一体化”保存提供可能。无DMSO的添加避免细胞受到化学试剂的损害，细胞存活率更高，清洗和保存都简便易行；2)本发明利用两性离子分子结合温敏型两性离子聚合物具有强大的保存能力，同时冻存复苏后细胞形态和功能完整。

附图说明

图1是本发明利用温敏型两性离子聚合物冻存的原理图；

图2是本发明人肺癌细胞GLC-82复苏后的细胞成活率图；

图3为本发明细胞贴壁能力测试图；

图4为本发明毒性测试图；

图5为本发明不同实施例的细胞成活率对照图；

图6为本发明对照例的细胞成活率对照图。

具体实施方式

为了使本技术领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合附图和最佳实施例对本发明作进一步的详细说明。

本发明的利用温敏型两性离子聚合物冻存关键步骤如下：(1)选取具有LCST功能单元，例如NIPAm、HPA、TEGA等，和具有UCST功能单元，例如SBMA，DMAPS等，通过自由基共聚进行温敏型两性离子聚合物的合成，例如poly(SBMA-co-NIPAm)，在合成产物的实验过程中反应物两种不同的单体的投料比被调控，根据聚合物在≤0℃，0℃-37℃，≥37℃的温敏响应情况获得不同类型温敏响应两性离子聚合物。(2)利用两性离子分子，如甜菜碱、L-左旋肉碱、氧化三甲胺作为细胞内冻存保护剂，两性离子聚合物作为细胞外冻存保护剂，两者协同调节渗透压降低冰晶损伤，实现细胞高效无毒冻存。

本发明为了解决现有细胞保存的不足之处，首次采用温敏型两性离子聚合物作为细胞冻存保护剂，开发出一种无毒高效保存细胞的方法，如图1，利用两性离子分子和温敏型两性离子聚合物分别作为细胞内/外冻存保护剂冷冻保护细胞，温敏型两性离子聚合物由于具有特殊的温敏响应在不同温度范围内可形成水凝胶包围在细胞周围为细胞提供物理及化学保护，二者协调达到良好的冻存效果。(细胞内冻存保护剂betaine进入到细胞发挥功能,抑制细胞内冰晶的形成，同时和细胞外冻存保护剂一同调节渗透压；同时细胞外冻存保护剂在冰点温度下，聚合物相变可有效抑制冰晶的形成。)冻存复苏后的细胞其贴壁能力和正常的细胞一样,其细胞形态均与正常细胞一致，没有发生改变。细胞在复苏后细胞的生长曲线与未冻的细胞基本一致，没有显著差异，复苏后的细胞同样保持了其正常的增殖能力，本发明首次将温敏型两性离子聚合物应用于细胞冻存，利用其特殊的温敏响应为细胞在超低温和低体温条件下的“一体化”保存提供了可能。

实施例1：(1)UCST/LCST型温敏型两性离子聚合物的合成；通过自由基共聚进行温敏型两性离子聚合物如poly(SBMA-co-NIPAm)的合成。SBMA和NIPAm的投料比，分别为1：1。室温下，溶于甲醇和水之中，抽真空氮气环境下反应12小时，透析冻干得白色粉末分别得到温敏型两性离子聚合物S1-N1。配制一定浓度的温敏型两性离子聚合物溶液可观察到不同温度下不同类型温敏型两性离子聚合物的物理状态。

(2)利用温敏型两性离子聚合物保存细胞：将两性离子分子甜菜碱与温敏两性离子聚合物poly(SBMA-co-NIPAm)结合，利用1640完全培养基配制成冻存保护液，调控甜菜碱与两性离子聚合物poly(SBMA-co-NIPAm)S1-N1的质量比分别为1％B(B为甜菜碱，下同)，1％B+0.5％S1-N1，1％B+1％S1-N1，1％B+1.5％S1-N1，1％B+2％S1-N1，1％B+4％S1-N1，1％B+6％S1-N1，1％B+8％S1-N1，1％B+10％S1-N1；将1.5毫升冻存保护液与含有1×10⁶细胞悬液物理混合于1.8毫升的冻存管之中，放置于5％C0₂，37℃培养箱孵育1小时后转移冻存管至梯度冻存盒梯度慢冻CLC-82细胞。37℃水浴复苏细胞，通过荧光染色的方法检测冻存管中细胞的存活率，如图2所示，其中2a为冻存复苏后细胞活死染色荧光图。图2b：冻存复苏后细胞成活率统计结果的柱状图。结果表明，当1％B+10％S1-N1时，细胞成活率能够达到96.83％。

(3)细胞贴壁能力测试：将细胞样品用PBS缓冲液洗涤并重悬在1640完全培养基中，然后将细胞悬液分别置于24孔板中培养(37℃，5％CO₂)。经过12小时细胞完全贴壁后，每个样品在倒置显微镜下随机选择视野观察并记录细胞形态以及贴壁细胞的数目，如图3中3a所示。其中，对照为用10％DMSO冻存复苏的细胞。图中可以看出冻存复苏后的细胞其贴壁能力和正常的细胞一样,其细胞形态均与正常细胞一致，没有发生改变。

(4)细胞增殖能力测试：将细胞样品置于12孔板中，加入1640培养基进行培养(37℃，5％CO2)，并用刚从培养瓶中消化下来的新鲜细胞作为对照。经过12小时细胞完全贴壁后作为起始时间点，每个样品在倒置显微镜下随机选择3个视野，4天内每24小时记录一次每个视野中的贴壁细胞数量，并每天更换培养基保证细胞正常生长，统计细胞增殖能力结果如图3中3b所示。细胞粘附、增殖能力也被考察图3b给出了细胞在复苏后细胞的生长曲线与未冻的细胞基本一致，没有显著差异，说明复苏后的细胞保持了其正常的增殖能力。

(5)细胞毒性测试：细胞毒性测试结果如图4所示，分别为完全培养基(对照组)，含有冻存保护剂放的完全培养基(1％B+1％S1-N1)，以及含DMSO的完全培养基(2％DMSO)，用这三种培养基培养正常的细胞，看细胞形态和成活。图中可以看出B+S1-N1实验组细胞形态与对照组几乎没有区别。DMSO组软骨细胞生长状态受到了严重的影响，细胞形态发生了变化，细胞甚至死亡。

对照例1：对照例1与实施例1的区别仅在于，步骤(2)中只加入两性离子聚合物poly(SBMA-co-NIPAm)保存细胞；结果如图6所示，表明只加入poly(SBMA-co-NIPAm)时，其细胞增值能力最高只能达到49％。

实施例2：UCST型温敏型两性离子聚合物的合成；实施例2与实施例1的区别仅在于，步骤(1)中SBMA和NIPAm的投料比为4：1。透析冻干得白色粉末分别得到温敏型两性离子聚合物S4-N1。

实施例3：LCST型温敏型两性离子聚合物的合成；实施例3与实施例1的区别仅在于，步骤(1)中SBMA和NIPAm的投料比为1：4。透析冻干得白色粉末分别得到温敏型两性离子聚合物S1-N4。结果表明，LCST功能单体在聚合物中占比会影响冻存后细胞的质量。

图5示出betaine(1％B)以及betaine结合S1-N1,S4-N1,S1-N4这三种类型的温敏两性离子聚合物保存细胞用于细胞的超低温冻存，复苏后细胞的成活率。从图中可以看出相对于单独的两性离子分子betaine(1％B)，与温敏型两性离子聚合物结合后复苏后细胞的成活率更高，尤其是对于S1-N1组，细胞成活率能够达到96.83％。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (6)

1.一种用于保存细胞的组合物，其特征在于，包括细胞内冻存保护剂以及细胞外冻存保护剂；所述的细胞内冻存保护剂为两性离子分子；

所述的两性离子分子为甜菜碱、L-左旋肉碱、氧化三甲胺中的一种或者组合物;所述的细胞外冻存保护剂为两性离子聚合物；

所述的两性离子聚合物为UCST功能单元与LCST功能单元的聚合物；

所述的LCST功能单元为NIPAm、HPA、TEGA中的一种；所述的UCST功能单元为SBMA，DMAPS中的一种；

所述的两性离子聚合物为UCST功能单元与LCST功能单元的质量投料比为4：1-1:1；

两性离子分子与所述的两性离子聚合物的质量投料比为1:4-1:10。

2.根据权利要求1所述的用于保存细胞的组合物，其特征在于，所述的两性离子聚合物为UCST功能单元与LCST功能单元的质量投料比为1:1。

3.根据权利要求1所述的用于保存细胞的组合物，其特征在于，所述的两性离子聚合物为poly（SBMA-co-NIPAm），其中SBMA和NIPAm的质量投料比为4:1-1:1。

4.根据权利要求1所述的用于保存细胞的组合物，其特征在于，所述的两性离子聚合物为poly（SBMA-co-NIPAm），其中SBMA和NIPAm的质量投料比为1:1。

5.根据权利要求1所述的用于保存细胞的组合物，其特征在于，两性离子分子与所述的两性离子聚合物的质量投料比为1:10。

6.根据权利要求1所述的用于保存细胞的组合物，其特征在于，所述的两性离子分子为甜菜碱，所述的两性离子聚合物为poly（SBMA-co-NIPAm）；其中，两性离子分子与所述的两性离子聚合物的质量比为1：10；poly（SBMA-co-NIPAm）中SBMA与NIPAm的质量投料比为1:1。

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