CN111876331B - 一种粪菌移植技术的粪菌收集、冻存及解冻方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种粪菌移植技术的粪菌收集、冻存及解冻方法，包括步骤如下：(1)粪菌的制备；(2)将步骤(1)制备的粪菌进行玻璃化冷冻，得到冻存的粪菌；(3)将步骤(2)得到冻存的粪菌进行解冻与复苏。本发明采用了玻璃化冷冻技术，极大地提高冷冻速率(＞20000℃/min)，使细胞在快速降温的过程中迅速形成“玻璃态”，避免了细胞内外形成冰晶，不会对粪菌中的菌群造成过度损伤，且在冷冻保护剂加入了抗冻蛋白，避免了冷冻保护剂的细胞毒性，使得解冻后粪菌液中的菌群的存活率提高至90％以上。

Description

一种粪菌移植技术的粪菌收集、冻存及解冻方法

技术领域

本发明涉及一种粪菌移植技术的粪菌收集、冻存及解冻方法，属于粪菌移植技术领域。

背景技术

粪菌移植(fecal microbiota transplantation，FMT)是一种从健康捐赠者的粪便中分离功能菌群，将其移植至患者消化道，从而重建患者肠道菌群的微生态治疗方法，目前该方法已被用于多种胃肠道和代谢性疾病的治疗，如慢性功能性便秘、难治性艰难梭菌感染、炎性肠病等。

追溯FMT的起源，最早用于治疗人类疾病的文字记载是中国东晋时期(公元300-400年)葛洪所著的《肘后备急方》(也称《肘后方》)，文中描述用人粪治疗食物中毒、腹泻、发热并濒临死亡的患者，“饮之，即活”。中国明代李时珍所著的《本草纲目》(1596年版)记载了多达二十多种用人粪治病的疗方。近代关于FMT的文献报道可以追溯到1958年，美国科罗拉多大学医学院外科医生BenEiseman及其同事，利用健康人的大便制成粪水对4例常规抗生素、激素治疗无效的严重伪膜性肠炎患者实施灌肠。结果成功治愈其中3例垂危患者，另1例患者死于与肠道感染无关的其他疾病。

2013年，首项FMT治疗复发性难辨梭状芽孢杆菌性肠炎的临床对照研究证明FMT的疗效显著优于万古霉素。FMT在动物实验和临床试验中均显示出其他治疗方法无法比拟的优越性。《Science》和《TIME》将其评为2013年生物医学的十大突破之一。

中国专利文献CN110540941A公开了一种从粪便中提取保存菌液的方法，包括如下步骤：(1)粪菌液制备；(2)将步骤(1)所得粪菌液加入冻干保护剂后冷冻干燥，得粪菌冻干粉；(3)将步骤(2)所得粪菌冻干粉放入-80℃冰箱保存；(4)取用步骤(3)所得粪菌冻干粉时，恢复至液体取用。该发明中的粪菌保存采用的是冷冻干燥技术，冷冻干燥技术的时长一般均超过20h甚至更长，且从设备成本方面，一台实验室级别的冷冻干燥机价格在几万不等，商用冷冻干燥机几百万不等，设备价格昂贵，不利于广泛推广和使用。

目前临床开展的粪菌移植治疗皆为取供体新鲜粪便制备标准菌液进行治疗。这种新鲜粪菌标准液需要将从粪便采集到治疗过程的时间控制在6h以内，时间紧迫，并且合格供体不易寻找，供体筛选费用较高，这些问题都阻碍了粪菌移植的临床应用。因此寻求快捷、高活性的粪菌冻存以及解冻的方法尤为重要。

发明内容

针对现有技术中粪菌储存冷冻操作时间长、解冻后活性率低及技术成本较高的问题。本发明提供了一种粪菌移植技术的粪菌收集、冻存及解冻方法。

本发明的技术方案如下：

一种粪菌移植技术的粪菌收集、冻存及解冻方法，包括步骤如下：

(1)粪菌的制备：向供体粪便中加入无菌0.85％NaCl溶液进行第一次均质处理，进行第一次过滤后得滤液，再向滤液中加入无菌0.85％NaCl溶液进行第二次均质处理，进行第二次过滤，将所得滤液经4000～6000转/分钟的速率离心10～15min，得到粪菌；

(2)玻璃化冷冻：在20～25℃条件下，向步骤(1)得到的粪菌中加入预处理液，搅拌2～5min后，以4000～6000转/分钟的速率离心10～15min，除去上清液，然后加入冷冻保护剂，平衡10～20s后，将粪菌液滴在冷冻载体中，滴完后将冷冻载体完全浸入液氮中，得到冻存的粪菌；

(3)解冻与复苏：将步骤(2)得到冻存的粪菌取出后在20～28℃下放置5～10s，然后在37℃下，水浴10～20s，加入预热至37℃的解冻液，以4000～6000转/分钟的速率离心10～15min，除去上清液，再次加入解冻液，以4000～6000转/分钟离心10～15min，将沉淀悬浮于无菌0.85％NaCl溶液，最后制得解冻与复苏的粪菌液。

优选地，步骤(1)中，所述第一次均质处理和第二次均质处理中供体粪便和无菌0.85％NaCl溶液的质量体积比为1:5，单位：g/mL。

优选的，步骤(1)中，所述第一次过滤为采用5～10mm不锈钢滤网进行过滤，第二次过滤为采用2.0mm、1.0mm、0.5mm和0.25mm的不锈钢滤网依次进行4次过滤。

优选地，步骤(2)中，所述预处理液为甘油、乙二醇、丙烯乙二醇、乙酰胺、甲醇中的一种或几种的水溶液。

优选地，步骤(2)中，所述预处理液的浓度为3～6％(v/v)；粪菌与预处理液的质量体积比为1:(1.5～2)，单位：g/mL。

优选地，步骤(2)中，所述冷冻保护剂为复合冷冻保护剂，包括渗透性保护剂、非渗透性保护剂、抗冻蛋白、增稠剂、厌氧培养基。

优选地，所述渗透性保护剂为甘油、二甲基亚砜、乙二醇、丙烯乙二醇、乙酰胺、甲醇中的一种或几种。

优选地，所述非渗透性保护剂为低分子量的单糖(葡萄糖、果糖、山梨醇或甘露醇)、二糖(蔗糖或海藻糖)、多糖及大分子量的聚乙二醇、聚蔗糖或透明质酸中的一种或几种。

优选地，所述抗冻蛋白为天然动物源性蛋白或天然植物源性蛋白。

优选地，所述增稠剂为纤维素醚、阿拉伯胶、角豆树胶、瓜耳豆胶、汉生胶、甲壳糖或海藻酸钠中的一种或几种；

优选地，所述的厌氧培养基的配方为：蛋白胨0.2～0.4％，消化血清粉1～1.5％，酵母浸膏0.3～0.6％，牛肉膏0.15～0.3％，牛肝膏(粉)0.1～0.2％，葡萄糖0.2～0.5％，KH₂PO₄ 0.2～0.4％，可溶性淀粉0.3～0.7％，L-半胱氨酸盐0.03～0.05％，硫乙醇酸钠0.02～0.05％，pH7.0～7.5，单位为质量百分浓度g/100mL。

进一步优选地，所述冷冻保护剂的各组分的配比为：

渗透性保护剂：6～12％(v/v)

非渗透性保护剂：0.3～0.5mol/L

抗冻蛋白：1～40mg/mL

增稠剂：0.5～1.5％(w/v，mg/mL)

厌氧培养基：5～10％(v/v)

所述冷冻保护剂的溶剂为无菌纯化水。

优选的，步骤(2)中，所述粪菌与冷冻保护剂的质量体积比为1:(1.2～2)，单位：g/mL。

优选地，步骤(2)中，所述冷冻载体为覆盖着铝箔的金属盒。

优选地，步骤(2)中，所述粪菌液滴的体积控制在0.5～1μL，在滴加粪菌时，冷冻载体的底部浸入液氮中。

优选地，步骤(3)中，所述解冻液为0.2～0.4mol/mL的蔗糖溶液，粪菌每次与解冻液加入量的质量体积比为1:(10～14)，单位：g/mL。

本发明中各有效成分、技术及其作用机制：

玻璃化冷冻：玻璃化是液态物质在较高的降温速率下，由液相直接转变成为一种玻璃化的固体状态的过程。相比程序化冷冻，溶液实现玻璃化需更高的液体黏滞系数，高效的降温速率，更小的液体总体积。其中冷冻保护剂的固化是通过黏度极度增加，而非通过结晶，形成无结构的玻璃化固体，这种固态物质能保持其溶液状态的分子和离子分布。由于没有形成冰晶，因此不会对细胞结构造成过度损伤。

冷冻保护剂：包括渗透性和非渗透性两大类。其中渗透性保护剂的分子量小，能渗透到细胞内，在细胞内外产生一定浓度差，降低细胞内外未结冰溶液中电解质浓度，从而保护细胞免受高浓度电解质的损伤；同时细胞内水分不会过度外渗，避免细胞过分脱水皱缩；非渗透性冷冻保护剂比渗透性冷冻保护剂毒性低，且有促进玻璃化作用，能部分替代其他非渗透性冷冻保护剂，降低冷冻液的毒性。解冻比冷冻更易形成使细胞致死的冰晶，因此克服解冻时所形成的致死冰晶至关重要。如本发明中的非渗透性保护剂，即聚乙二醇、聚蔗糖、透明质酸等大分子物质可以优先结合溶液中的水分子，从而降低溶液中自由水含量，减少冰晶的形成；使溶液中电解质浓度降低，从而减轻冷冻中溶质对细胞产生的损伤，解冻与复苏时也能使细胞外液的渗透压变化更加稳定。

增稠剂：因玻璃化冷冻技术中需要较高的液体粘滞系数，所以本发明中添加了增稠剂，以进一步促进液体的粘滞系数。

抗冻蛋白：能在低温条件下生存的生物体内发现的蛋白质，该蛋白质可非依数性地降低溶液冰点，对冷冻细胞起高效的保护作用，还能与细胞膜相互作用，封闭离子通道，阻止溶质渗透，保护细胞膜的完整性；并有效降低冷冻保护剂的浓度，避免冷冻保护剂浓度过高对冷冻样本的毒性作用。

解冻与复苏：采用快速解冻技术，在0～40s由-196℃迅速上升至30～35℃，瞬间通过危险温区，使冰晶来不及形成。为了避免冷冻保护剂对菌株产生毒害作用，解冻后立即除去冷冻保护剂，使用蔗糖溶液分步将冷冻保护剂脱出。

有益效果

(1)本发明采用了玻璃化冷冻技术，该技术具有简便、快捷、冷冻效率高特点；相较于传统方法将粪菌使用冷冻保护剂冻干后在-80℃冰箱保存，玻璃化冷冻法能够极大地提高冷冻速率(＞20000℃/min)，使细胞在快速降温的过程中迅速形成“玻璃态”，避免了细胞内外形成冰晶，不会对粪菌中的菌群造成过度损伤，且本发明在冷冻保护剂中加入了抗冻蛋白，有效地降低了冷冻保护剂(渗透性、非渗透性)的浓度，避免了冷冻保护剂的细胞毒性，本发明中加入的增稠剂也有效增加了冷冻保护剂的粘滞系数，加强了冷冻保护剂的“玻璃态”作用，有效地避免冰晶的形成，使得解冻后粪菌的菌群的存活率提高至90％以上。

(2)本发明采用快速解冻的技术，在解冻与复苏的过程中，瞬间通过危险温区，使冰晶来不及形成，极大地缩短了解冻时间，降低了解冻风险，使得解冻后粪菌中的菌群的存活率提高至90％以上。为了避免冷冻保护剂对粪菌中的菌群产生毒害作用，解冻后立即除去冷冻保护剂，用蔗糖溶液阶梯法，分步将冷冻保护剂脱出。

附图说明：

图1为冷冻前后对主要粪菌菌门相对丰度的分析图。

具体实施方式

下面结合具体的实施例对本发明做进一步的描述，以更好地理解本发明，但本发明的保护范围并不仅限于此。

同时下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

实施例1

一种粪菌移植技术的粪菌的收集、冻存及解冻方法，包括以下步骤：

(1)粪菌的制备：将供体新鲜粪便放在氮气生物工程厨内，称重约50g置于搅拌器中，加入250mL无菌0.85％NaCl溶液进行第一次均质处理，将粪便浆体经5mm不锈钢滤网过滤去除其中的大颗粒物质；再加入250mL无菌0.85％NaCl溶液在匀浆器中进行第二次均质处理得到粪菌浆体；然后将粪菌浆体逐级经过2.0mm、1.0mm、0.5mm和0.25mm的不锈钢滤网过滤以去除未吸收的食物残渣和小颗粒物质；以4000转/分钟的速率离心10min，得到5g粪菌；

(2)玻璃化冷冻：在25℃条件下，向步骤(1)得到的粪菌中加入9mL预处理液，用磁力搅拌器搅拌2min，以4000转/分钟的速率离心10min，除去上清液，然后加入8mL冷冻保护剂重悬，平衡10s后，用电动多通道移液枪将重悬粪菌液滴在覆盖着铝箔的金属盒中，金属盒底部浸入液氮，每滴液体量控制在0.5μL，通过接触金属表面在-196℃下进行冷冻，滴完后将金属盒封盖，并将其完全浸入液氮中，得到冻存的粪菌；

(3)解冻与复苏：将步骤(2)得到冻存的粪菌取出后在20℃下的空气内放置5s；将含粪菌的金属冷冻盒在37℃下，水浴10s，轻轻摇动，加入65mL预热至37℃的0.2mol/mL蔗糖溶液脱除冷冻保护剂后，移入离心管，以4000转/分钟的速率离心10min后，除去上清液，再加入65mL浓度为0.4mol/mL蔗糖溶液脱除冷冻保护剂，以4000转/分钟离心10min，最后将沉淀再悬浮于0.85％NaCl溶液，最后制得解冻与复苏的粪菌液。

其中，所述的预处理液为4％(v/v)甘油；

所述的冷冻保护剂的配方包括以下成分：

甘油+乙二醇：6％(v/v)，其中甘油与乙二醇的体积比为1:1

透明质酸：0.3mol/L

鱼抗冻蛋白：5mg/mL

阿拉伯胶：0.5％(w/v，mg/mL)

厌氧培养基：5％(v/v)

所述厌氧培养基的配方为：蛋白胨0.2％，消化血清粉1％，酵母浸膏0.3％，牛肉膏0.3％，牛肝膏(粉)0.2％，葡萄糖0.2％，KH2PO4 0.2％，可溶性淀粉0.3％，L-半胱氨酸盐0.03％，硫乙醇酸钠0.02％，调PH7.0，单位为质量百分浓度g/100mL。

所述冷冻保护剂的溶剂为无菌纯化水。

实施例2

一种粪菌移植技术的粪菌收集、冻存及解冻方法，包括以下步骤：

(1)粪菌的制备：将供体新鲜粪便放在氮气生物工程厨内，称重约50g置于搅拌器中，加入250mL无菌0.85％NaCl溶液进行进行第一次均质处理，将粪便浆体经7mm不锈钢滤网过滤去除其中的大颗粒物质；再加入250mL无菌0.85％NaCl溶液在匀浆器中进行第二次均质处理得到粪菌浆体；然后将粪菌浆体逐级经过2.0mm、1.0mm、0.5mm和0.25mm的不锈钢滤网过滤以去除未吸收的食物残渣和小颗粒物质；以5000转/分钟的速率离心12min，得到8g粪菌；

(2)玻璃化冷冻：在25℃条件下，向步骤(1)得到的粪菌中加入14mL预处理液,用磁力搅拌器搅拌3min，以5000转/分钟的速率离心12min，除去上清液，然后加入13mL冷冻保护剂重悬，平衡15s后，用电动多通道移液枪将重悬粪菌液滴在覆盖着铝箔的金属盒中，金属盒部分浸入液氮，每滴液体量控制在0.7μL，通过接触金属表面在-196℃下进行冷冻，滴完后将金属盒封盖，并将其完全浸入液氮中，得到冻存的粪菌；

(3)解冻与复苏：将步骤(2)得到冻存的粪菌取出后在25℃下的空气内放置7s；将含粪菌的金属冷冻盒在37℃下，水浴15s，轻轻摇动，加入100mL预热至37℃的0.2mol/mL蔗糖溶液脱除冷冻保护剂后，移入离心管，以5000转/分钟的速率离心12min后，除去上清液，再加入100mL浓度为0.4mol/mL蔗糖溶液脱除冷冻保护剂，以5000转/分钟离心12min，最后将沉淀再悬浮于0.85％NaCl溶液，最后制得解冻与复苏的粪菌液。

其中，所述的预处理液为3％(v/v)乙二醇；

所述的冷冻保护剂的配方包括以下成分：

丙烯乙二醇：7％(v/v)

棉子糖：0.4mol/L

冬黑麦抗冻蛋白：9mg/mL

甲壳糖：0.7％(w/v，mg/mL)

厌氧培养基：7％(v/v)；

所述厌氧培养基的配方为：蛋白胨0.3％，消化血清粉1.2％，酵母浸膏0.5％，牛肉膏0.2％，牛肝膏(粉)0.15％，葡萄糖0.3％，KH2PO4 0.3％，可溶性淀粉0.5％，L-半胱氨酸盐0.04％，硫乙醇酸钠0.03％，调PH7.3，单位为质量百分浓度g/100mL。

所述冷冻保护剂的溶剂为无菌纯化水。

实施例3

一种粪菌移植技术的粪菌收集、冻存及解冻方法，包括以下步骤：

(1)粪菌的制备：将供体新鲜粪便放在氮气生物工程厨内，称重约50g置于搅拌器中，加入250mL无菌0.85％NaCl溶液进行进行第一次均质处理，将粪便浆体经10mm不锈钢滤网过滤去除其中的大颗粒物质；再加入250mL无菌0.85％NaCl溶液在匀浆器中进行第二次均质处理得到粪菌浆体；然后将粪菌浆体逐级经过2.0mm、1.0mm、0.5mm和0.25mm的不锈钢滤网过滤以去除未吸收的食物残渣和小颗粒物质；以6000转/分钟的速率离心15min，得到11g粪菌；

(2)玻璃化冷冻：在室温条件下，向步骤(1)得到的粪菌中加入20mL预处理液，用磁力搅拌器搅拌5min，以6000转/分钟的速率离心15min，除去上清液，然后加入18mL冷冻保护剂重悬，平衡20s后，用电动多通道移液枪将重悬粪菌液滴在覆盖着铝箔的金属盒中，金属盒部分浸入液氮，每滴液体量控制在1.0μL，通过接触金属表面在-196℃下进行冷冻，滴完后将金属盒封盖，并将其完全浸入液氮中，得到冻存的粪菌；

(3)解冻与复苏：将步骤(2)得到冻存的粪菌取出后在28℃下的空气内放置10s；将含粪菌的金属冷冻盒在37℃下，水浴20s，轻轻摇动，加入150mL预热至37℃的0.2mol/mL蔗糖溶液脱除冷冻保护剂后，移入离心管，以6000转/分钟的速率离心15min后，除去上清液，再加入150mL浓度为0.4mol/mL蔗糖溶液脱除冷冻保护剂，以6000转/分钟离心15min，最后将沉淀再悬浮于0.85％NaCl溶液，最后制得解冻与复苏的粪菌液。

其中，所述的预处理液为5％(v/v)丙烯乙二醇；

所述的冷冻保护剂的配方为：

甘油+二甲基亚砜：6％(v/v)，其中甘油与二甲基亚砜的体积比为1:1

海藻糖：0.5mol/L

甘蓝抗冻蛋白：15mg/mL

汉生胶：1.0％(w/v，mg/mL)

厌氧培养基：10％(v/v)

所述厌氧培养基的配方为：蛋白胨0.4％，消化血清粉1.5％，酵母浸膏0.6％，牛肉膏0.3％，牛肝膏(粉)0.2％，葡萄糖0.5％，KH2PO4 0.4％，可溶性淀粉0.7％，L-半胱氨酸盐0.05％，硫乙醇酸钠0.05％，调PH 7.5，单位为质量百分浓度g/100mL。

所述冷冻保护剂的溶剂为无菌纯化水。

对比例1

一种粪菌移植技术的粪菌收集、冻存及解冻方法，具体步骤同实施例1所述，不同之处在于，玻璃化冷冻过程中，加入冷冻保护剂重悬后，置于冷冻管中，采用程序性冷冻仪，从20℃起，以2℃/min逐步降温至-7℃，在-7℃平衡5min，人工诱导冰晶，在-7℃停留10min,然后以0.3℃/min从-7℃缓慢降至-30℃，再以30℃/min迅速降至-120℃，转入液氮罐(-196℃)中储存。

对比例2

一种粪菌移植技术的粪菌收集、冻存及解冻的方法，具体步骤同实施例1所述，不同之处在于，解冻与复苏过程为37℃水浴解冻后，以4000转/分钟，离心15min后，将沉淀再悬浮于0.85％NaCl溶液，最后制得解冻与复苏的粪菌液。

对比例3

一种粪菌移植技术的粪菌收集、冻存及解冻的方法，具体步骤同实施例1所述，不同之处在于，无抗冻蛋白的添加。

对比例4

一种粪菌移植技术的粪菌收集、冻存及解冻的方法，具体步骤同实施例1所述，不同之处在于，无增稠剂的添加。

实验例1粪菌中总菌落存活率的测定

玻璃化冷冻前活菌数检测：将待测样品梯度稀释，采用倾注平板计数法检测活菌数。

玻璃化冷冻后活菌数检测：向实施例1～3和对比例1～4制备的解冻与复苏的粪菌液中加入无菌0.85％NaCl溶液，补足至原体积，活菌检测方法同上。

测玻璃化冷冻前后的活菌数，按下列公式计算存活率：

存活率＝玻璃化冷冻后活菌数/玻璃化冷冻前活菌数。

表1冷冻后粪菌的存活率(

％)

注：a：P＜0.05vs对比例1；b：P＜0.05vs对比例2；c：P＜0.05vs对比例3；d：P＜0.05vs对比例4。

由表1可知，冷冻后，实施例1～3之间的粪菌存活率无显著差别(P＞0.05)；实施例1～3粪菌的存活率均在90％以上，显著高于对比例3的81.39％和对比例4的88.37％(P＜0.05)，说明抗冻蛋白及增稠剂均可有效提升粪菌储存的存活率，且同时显著高于对比例1的55.7％、对比例2的72.71％，说明本发明中的玻璃化冷冻、解冻与复苏程序相较于程序性冷冻及常规解冻制备的粪菌液，其存活率得到了显著提升。

实验例2粪菌中菌群结构分析

冷冻前后菌群结构分析：将待测样品按照核酸提取试剂盒说明书进行操作，构建菌群16S rRNA基因克隆文库、高通量测序，对实施例1～3玻璃化冷冻前后菌群门水平上的结构进行分析，结果如图1和表2所示。

表2冷冻前后对主要粪菌菌门相对丰度的影响(

％)

由图1和表2可知，从菌群门水平分析，含量较高的前4种菌门约占总菌门总丰度的98％以上，冷冻前后，实施例1～3菌群门水平的相对丰度无显著差异(P＜0.05)，说明玻璃化冷冻后，对粪菌的整体菌群分布无显著影响，保持了原粪菌的菌群平衡。

Claims (4)

1.一种粪菌移植技术的粪菌收集、冻存及解冻方法，其特征在于，包括步骤如下：

（1）粪菌的制备：向供体粪便中加入无菌0.85%NaCl溶液进行第一次均质处理，进行第一次过滤后得滤液，再向滤液中加入无菌0.85%NaCl溶液进行第二次均质处理，进行第二次过滤，将所得滤液经4000~6000转/分钟的速率离心10~15min，得到粪菌；

（2）玻璃化冷冻：在20~25℃条件下，向步骤（1）得到的粪菌中加入预处理液，搅拌2~5min后，以4000~6000转/分钟的速率离心10~15min，除去上清液，然后加入冷冻保护剂，平衡10~20s后，将粪菌液滴在冷冻载体中，滴完后将冷冻载体完全浸入液氮中，得到冻存的粪菌；

其中，所述预处理液为甘油、乙二醇、丙烯乙二醇、乙酰胺、甲醇中的一种或几种；所述预处理液的浓度为3~6%（v/v)；粪菌与预处理液的质量体积比为1:（1.5~2），单位：g/mL；

所述冷冻保护剂为复合冷冻保护剂，包括渗透性保护剂、非渗透性保护剂、抗冻蛋白、增稠剂、厌氧培养基；所述冷冻保护剂的各组分的配比为：渗透性保护剂：6~12%（v/v)，非渗透性保护剂：0.3~0.5mol/L，抗冻蛋白：1~40mg/mL，增稠剂：0.5~1.5%（w/v，mg/mL），厌氧培养基：5~10%（v/v）；所述冷冻保护剂的溶剂为无菌纯化水；

所述渗透性保护剂为甘油、二甲基亚砜、乙二醇、丙烯乙二醇、乙酰胺、甲醇中的一种或几种；所述非渗透性保护剂为低分子量的单糖、二糖、多糖及大分子量的聚乙二醇、聚蔗糖或透明质酸中的一种或几种；所述抗冻蛋白为鱼抗冻蛋白、冬黑麦抗冻蛋白或甘蓝抗冻蛋白；所述增稠剂为纤维素醚、阿拉伯胶、角豆树胶、瓜耳豆胶、汉生胶、甲壳糖或海藻酸钠中的一种或几种；所述的厌氧培养基的配方为：蛋白胨0.2~0.4%，消化血清粉 1~1.5%，酵母浸膏0.3~0.6%，牛肉膏 0.15~0.3%，牛肝膏0.1~0.2%，葡萄糖0.2~0.5%，KH₂PO₄ 0.2~0.4%，可溶性淀粉0.3~0.7%，L-半胱氨酸盐 0.03~0.05%，硫乙醇酸钠 0.02~0.05%，pH7.0~7.5，单位为质量百分浓度g/100mL；

所述粪菌与冷冻保护剂的质量体积比为1:（1.2~2），单位：g/mL；

（3）解冻与复苏：将步骤（2）得到冻存的粪菌取出后在20~28℃下放置5~10s，然后在37℃下，水浴10~20s，加入预热至37℃的解冻液，以4000~6000转/分钟的速率离心10~15min，除去上清液，再次加入解冻液，以4000~6000转/分钟离心10~15min，将沉淀悬浮于无菌0.85%NaCl溶液，最后制得解冻与复苏的粪菌液；

所述解冻液为0.2~0.4mol/mL的蔗糖溶液，粪菌每次与解冻液加入量的质量体积比为1:（10~14），单位：g/mL。

2.如权利要求1所述的粪菌收集、冻存及解冻方法，其特征在于，步骤（1）中，所述第一次均质处理和第二次均质处理中供体粪便和无菌0.85%NaCl溶液的质量体积比为1:5，单位：g/mL。

3.如权利要求1所述的粪菌收集、冻存及解冻方法，其特征在于，步骤（1）中，所述第一次过滤为采用5~10mm不锈钢滤网进行过滤，第二次过滤为采用2.0mm、1.0mm、0.5mm和0.25mm的不锈钢滤网进行4次过滤。

4.如权利要求1所述的粪菌收集、冻存及解冻方法，其特征在于，步骤（2）中，所述冷冻载体为覆盖着铝箔的金属盒；所述粪菌液滴的体积控制在0.5~1μL，在滴加粪菌时，冷冻载体的底部浸入液氮中。

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