WO1998042859A1 - PROCESS FOR PRODUCING α-MONOGLUCOSYLHESPERIDIN-RICH SUBSTANCE - Google Patents

PROCESS FOR PRODUCING α-MONOGLUCOSYLHESPERIDIN-RICH SUBSTANCE Download PDF

Info

Publication number
WO1998042859A1
WO1998042859A1 PCT/JP1998/000977 JP9800977W WO9842859A1 WO 1998042859 A1 WO1998042859 A1 WO 1998042859A1 JP 9800977 W JP9800977 W JP 9800977W WO 9842859 A1 WO9842859 A1 WO 9842859A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
hesperidin
weight
solution
hesperetin
monoglucosyl
Prior art date
Application number
PCT/JP1998/000977
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Toshio Miyake
Takashi Yumoto
Original Assignee
Kabushiki Kaisha Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Kabushiki Kaisha Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo filed Critical Kabushiki Kaisha Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo
Priority to US09/194,190 priority Critical patent/US6048712A/en
Priority to EP98905832A priority patent/EP0908524B1/en
Priority to DE69821428T priority patent/DE69821428T2/de
Publication of WO1998042859A1 publication Critical patent/WO1998042859A1/ja

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/44—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides
    • C12P19/60—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides having an oxygen of the saccharide radical directly bound to a non-saccharide heterocyclic ring or a condensed ring system containing a non-saccharide heterocyclic ring, e.g. coumermycin, novobiocin

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing a substance having a high content of ⁇ -monoglucosylhesberidin, and more particularly to a method for producing a solution containing ⁇ -glucosylhesperidin and hesperidin.
  • the present invention relates to a method for producing a substance having a high content of ⁇ ; -monodalcosylhesberidin by separating ⁇ -monoglucosylhesperidin by precipitating it and collecting it.
  • Japanese Patent Application Laid-Open No. 3-75993 discloses that a glycosyltransferase (an enzyme having ⁇ -glucosyltransferase activity) is allowed to act on hesperidin in the presence of partially degraded starch (-darcosyl sugar compound).
  • a method for producing enzymatically treated hesperidin having increased water solubility by generating ⁇ -glucosyl hesperidin represented by the following formula [ ⁇ ] is disclosed.
  • this ⁇ -glucosylhesperidine has glucose (G) at the 4-position of glucose of hesperidin represented by the formula [I] with ⁇ 1,4 bond. It is a compound in which ⁇ (1 to 20) bonds are sequentially bonded, or a mixture of ⁇ -glucosylhexylidines having different numbers of glucose.
  • hesperidin In this enzymatic reaction, 40 to 80% of hesperidin contained in the raw material solution is converted to ⁇ -darcosyl hesperidine by enzymatic treatment, but 20 to 60% is not yet converted. It remains as reaction hesperidin. Unreacted hesperidin (hesperidin) is an unreacted hesperidin for ⁇ -darcosyl hesperidin, which increases its solubility in aqueous solution when ⁇ -gnorecosyl hesperidin coexists. When the gin ratio is high, unreacted hesperidin is insolubilized and precipitated in a short time.
  • One of the means to prevent the precipitation of unreacted hesperidin is to add a paste such as carboxymethyl cellulose (CMC) to the liquid containing hesperidin to increase the viscosity of the aqueous solution.
  • a paste such as carboxymethyl cellulose (CMC)
  • CMC carboxymethyl cellulose
  • unreacted hesperidin is precipitated by separating out by filtration or the like to reduce the ratio of unreacted hesperidin to -glucosyl hesperidin.
  • ⁇ -darcosylhesveridin When an enzyme having rhamnosidase activity is acted on, ⁇ -darcosylhesveridin remains almost unchanged and unreacted hesperidin is hydrolyzed to separate rhamnose. It is converted to ⁇ -monoglucosyl hesperetin represented by the following formula [III], and is remarkably excellent in water solubility, and enzymatically treated hesperidin that does not cause turbidity even after a long period of time can be obtained. And so on.
  • the inventors have found that ⁇ -monodalcosyl hesperidin can be efficiently separated and collected (separated) from the obtained mixture, and have completed the present invention.
  • an ⁇ -monoglucosylhesperidin-rich substance can be produced extremely efficiently by simply separating the precipitated a-monoglucosylhesperidin from the original mixture by solid-liquid separation.
  • the method of converting hesperidin to / 3-monoglucosyl hesperetin by using an enzyme having ⁇ -rhamnosidase activity on hesperidin to improve the water solubility is to prevent white turbidity in canned oranges.
  • the law is practiced industrially.
  • the ability of a solution containing -glucosyl hesperidin and unreacted hesperidin to react with glucoamylase or ⁇ -rhamnosidase, or the ability of glucoamylase or ⁇ -rhamnosidase to act is not limited.
  • the enzymatic agent having the activity of each of peptidase and -D-dalcosidase acts on the glucose (G) ⁇ bound to the glucose 4-position as it is, leaving the rhamnose of ⁇ -glucosylhesperidine as it is.
  • Japanese Patent Application Laid-Open No. 880177/1990 discloses a method for preventing the precipitation of heparidine and crystals by adding solubilized hesperidin to an aqueous solution containing heparidine.
  • the solubilized hesperidin is disclosed as a compound in which 1 to more than 10 glucoses are sequentially bonded to the 4-position of the glucose group in hesberidin by -1,4 bonds.
  • Such a solubilized hesperidin can be produced by allowing glycosyltransferase to act on hesveridin in the presence of cyclodextrin or the like.
  • CGTase 1,4-a-D-glucan; 1,4- «-D- (1,4-glucano) transferase ( ⁇ .C.2.4.1.19) More specifically, it states that it can be produced using a glycosyltransferase collected from a culture of a Bacillus A2-5a strain.
  • the gazette discloses a technical idea that a solubilized hesperidin is added to unreacted hesperidin and mixed to prevent crystallization of hesperidin in a hesperidin-containing substance. Only disclosure. What is obtained by the method described in the publication is a mixture of -dalcosylhepsperidine and hesperidin, and the product contains unreacted hesperidin as it is. A problem with canned food prepared by such a method is that the sap tends to become cloudy. As a countermeasure, in the examples of the publication, ⁇ -monoglucosylhesperidin and a-diglucosylhesperidin fractions are collected and used.
  • An object of the present invention is to solve the problems associated with the prior art as described above, and to provide a simple treatment for a solution containing ⁇ -glucosylhepsperidine and hesperidin.
  • the purpose of the present invention is to provide a method for fractionating a high content of -mono-glucosylhesperidin.
  • Glucoamylase and ⁇ -rhamnosidase are allowed to act simultaneously or separately on the solution (a) containing ⁇ -dalcosylhesperidine and hesperidin, and then the resulting mixture (enzyme reaction solution) ) Precipitating and separating ⁇ -monodarcosylhesperidine from (b-1) (method I), or adding glucoamylase and ⁇ -rhamnosidase, ⁇ -D-glucose to the above solution (a).
  • enzymatic agents having the respective activities of peptidase are allowed to act simultaneously or separately, the ability to precipitate and separate ⁇ -monoglucosylhesperidine from the resulting mixture (enzyme reaction solution) (b-2); Law II),
  • the method is characterized in that ⁇ -monodalcosylhesperidin is separated from the solution (a) by any of the methods described above and collected.
  • the above-mentioned enzyme reaction solution is contacted with a porous adsorption resin before precipitation and separation of -monoglucosylhesberidin.
  • a porous adsorption resin After adsorbing ⁇ -monoglucorenolesperidin, 3-monoglucosinolehsperetin, hesperetin and the like to the resin, and then washing out dextrin and the like by washing with water, It is desirable to elute a-mono gnoreco sinore hesperidin, -mono gnoreco sinore hesperetin, and hesperetin with a solvent (eg, alcohol), and further, the elution obtained in this manner.
  • a solvent eg, alcohol
  • the para-monoglucosylhesperidine contained in the eluate is precipitated and fractionated in a lower alcohol (eg, methanol).
  • a solution containing ⁇ -glucosyl hesperidin and hesperidin is substantially free of hesperidin, ⁇ -monoglucosyl hesperetin, hesperetin and the like.
  • a highly water-soluble ⁇ -monodalcosylhesperidin-rich material can be easily obtained.
  • a solution containing ⁇ -glucosylhesperidine and hesperidin is added to a solution containing ⁇ -glucosylhepsperidine and hesperidin.
  • the rhamnosidase and / 3-D-glucosidase are allowed to act simultaneously or separately (provided that 3D-darcosidase is added before the glucosylamine and -leramnosidase).
  • a solution containing -glucosyl hesperidin and hesperidin ⁇ As a solution to be subjected to such an enzyme treatment, a solution containing ⁇ -glucosyl hesperidin and hesperidin may be used.
  • the content ratio, concentration, etc. are not particularly limited, but preferably, the concentration of ⁇ -darcosyl hesperidin in the solution to be treated is 0.1 to 30% by weight, preferably 1 to 1%. 0% by weight, and the concentration of hesperidin is from 0.22 to 15% by weight, preferably from 0.2 to 5% by weight, and glucosyl hesperidin / hesperidin (weight ratio). ) It is desirable that the strength is 100 ⁇ 1 to 200, preferably 100 ⁇ 1 to 20.
  • Examples of the solution containing ⁇ -glucosylhepsperidine and hesperidin include those shown in the following 1 to 2.
  • glycosyltransferase is present in the presence of partially degraded starch ( ⁇ -darcosyl sugar compound) with hesveridin.
  • any of glucoamylase, ⁇ -rhamnosidase and ⁇ -glucosidase can be used as long as they have the respective enzyme activities.
  • Specific examples of the darcoamylase include, for example, “Dalkzym NL4, 2” (manufactured by Amano Pharmaceutical Co., Ltd.), “Cellulase Pamamano,
  • Examples of such enzymes include commercially available enzyme preparations, such as the enzyme which cuts the ⁇ -1,4 glucoside bond in glucose units.
  • ⁇ -rhamnosidase examples include, for example, “Hesperidinase” (manufactured by Tanabe Seiyaku Co., Ltd.), “naringinase” (manufactured by Hinabe Seiyaku Co., Ltd.), Commercially available enzyme preparations such as Cellulase Paku-Amano 3 (manufactured by Amano Pharmaceutical Co., Ltd.) are preferred, and "Hesberidinase” is preferably used.
  • ⁇ D-dalcosidase include commercially available enzyme preparations such as "Cellulase A Kuyamano> 3" (manufactured by Amano Pharmaceutical Co., Ltd.).
  • the enzyme ⁇ having glucosylase activity was 100 parts by weight of ⁇ -darcosyl hesperidin and ⁇ -darcosyl hesperidin in a solution containing ⁇ -darcosyl hesperidin and hesperidin. It is preferably used in an amount of about 0.1 to 10 parts by weight, more preferably about 0.1 to 1 part by weight.
  • the enzyme preparation having ⁇ -rhamnosidase activity is preferably used in an amount of 0.0 part by weight per 100 parts by weight of hesperidin in the solution containing ⁇ -glucosyl hesperidin and hesperidin. It is used in an amount of 5 to 50 parts by weight, more preferably about 1.5 to 15 parts by weight.
  • the enzyme preparation having ⁇ -glucosidase activity is preferably used in an amount of 100 parts by weight of hesperidin in a solution containing glucosyl hesperidin and hesperidin. It is used in an amount of about 0.1 to 20 parts by weight, more preferably about 0.1 to 10 parts by weight.
  • commercially available enzyme preparations having two or more of the following activities: glucocorase activity, ⁇ -rhamnosidase activity, and / 3-glucosidase activity ⁇ Example: “Cellulase enzyme” When Amano> 3 ”(manufactured by Amano Pharmaceutical Co., Ltd.) is used, the amount can be adjusted appropriately.
  • ⁇ ⁇ 3-7 preferably ⁇ 3-4, usually 40-70 ° C, preferably 50-60 ° C, usually 0.5-72 hours, preferably Or 6 to 48 hours.
  • ⁇ -darcosyl hesperidin is converted into the above ⁇ -i-rhamnosidase (eg, hesperidinase).
  • the hesperidin is hydrolyzed by the above-mentioned rhamnosidase under the action of -rhamnosidase to give / 3--monodarcosyl hesperetin (70--mono-gnoreccosyl hesperetin).
  • Glucoamylase and high rhamnosidase are allowed to act on a solution containing ⁇ -glucosylhesperidine and hesperidin, and -monoglucosylhesperidine is precipitated from the resulting mixture (enzyme reaction solution).
  • ⁇ -glucosyl hesperidin is converted into ⁇ -monoglucosyl speridin or hesperidin is converted into mono-glucosyl hesperidin first or simultaneously.
  • Either the glucoamylase and the rhamnosidase may proceed first or simultaneously.
  • the content of each component in the obtained enzyme reaction solution was / 3-monog with respect to 1 part by weight of mono-dalcosyl hesperidin.
  • the lucosyl hesperetin power is 0.5 parts by weight or less, and hesperidin and hesperetin are 0.1 parts by weight or less, respectively.
  • other components such as saccharides are often contained in an amount of 1 part by weight or more based on 1 part by weight of ⁇ -monodalcosylhesperidine in the enzyme reaction solution.
  • Glucoamylase and ⁇ -rhamnosidase are added in any order and allowed to act, followed by S-D-glucosidase.
  • the content of each component in the obtained enzyme reaction solution was 0.4 parts by weight or less for hesperetin, and ⁇ -monoglucosyl hesperetin and hesperidin for 1 part by weight of ⁇ ⁇ monodarcosylhesberidin. It is not more than 0.1 parts by weight.
  • other components such as saccharides are added in an amount of 1 part by weight based on 1 part by weight of ⁇ -monoglucosylhepsperidine in the enzyme reaction solution. It is often included in the above amount.
  • Method I rhamnosidase is first allowed to act first and then glucosidase is allowed to act.
  • ⁇ -monoglucosyl hesperidin and ⁇ -glucosyl hesperidin are obtained by enzymatic treatment of a solution containing ⁇ -glucosyl hesperidin and hesberidin, as described above.
  • Enzyme-treated solution containing luhesperidin also called enzyme-treated ⁇ -monodalcosyl hesperidin-containing solution
  • the following enzyme-treated solution that is, “0.5 parts by weight or less of hesperetin per 1 part by weight of ⁇ -monoglucosyl hesperidin, and ⁇ —mono-glucosyl hesperetin and hesperidin, respectively, 0.1 parts by weight or less, and when there are many other components such as sugars, 1 part by weight
  • the enzyme treatment solution contained in the above amount is mixed.
  • any method can be used as long as it can efficiently remove free sugar from the enzyme-treated solution, but a method using a porous adsorption resin is simple. .
  • porous adsorption resin specifically, for example, non-polar resins such as HP20, HP-50, XAD-2, and intermediate polar resins such as XAD-7 are preferably used.
  • a column containing a porous adsorbent resin, activated with a high-concentration aqueous ethanol solution, or the like, is charged with the enzyme-treated ⁇ -monodalcosyl hesperidin-containing solution in a concentration of 10 to 10 ⁇ m.
  • the above-mentioned enzyme-treated mono-glucosyl hesperidin-containing solution is brought into contact with the resin by, for example, passing the solution at a temperature of 60 ° C, and the resin is treated with poly-mono-glucosyl to obtain a mixture of -Adsorb monoglucosyl hesperetin, hesperetin, etc.
  • this operation results in less than 0.5 part by weight of / 3-monodalcosyl hesperetin and less than 0.5 part by weight of hesperidin and hesperetin, respectively, based on 1 part by weight of a-monoglucosyl hesperidin.
  • 0.1 parts by weight or less, and other components such as saccharides are in an amount of 0.1 parts by weight or less.
  • hesperetin is not more than 0.4 parts by weight per 1 part by weight of ⁇ -monoglucosyl hesperidin, and / 3-monoglucosyl hesperetin and hesperidin are respectively obtained by this operation.
  • An eluate containing not more than 0.1 part by weight and other components such as saccharides not more than 0.1 part by weight can be obtained.
  • Examples of the above-mentioned anolecol include lower alcohols having 1 to 5 carbon atoms, such as methanol, ethanol, propanol and butanol.
  • the mono-glucosyl hesperidine in the above eluate was precipitated in a lower alcohol, separated by solid-liquid separation, and collected to obtain a high content of ⁇ -mono-glucosyl hesperidin. Can be.
  • the ⁇ -monoglucosyl hesperidin power dissolves easily in a heated lower alcohol, while lowering it to a temperature below room temperature (eg, 15 to 25 ° C).
  • room temperature eg, 15 to 25 ° C.
  • Cosyl hesperetin is 0.5 parts by weight or less
  • hesperidin and hesperetin are each 0.1 parts by weight or less
  • other components such as saccharides are contained in an amount of 0.1 parts by weight or less.
  • Dissolve dry matter that may be present in lower alcohols, preferably methanol. 0.2 to 20 ml, preferably 1 to 1.0 m.] Of methanol was added to the dried product lg, and 20 to; I 20 ° C, preferably 6 to 20 ml. Dissolve by heating to a temperature of 0 to 90 ° C.
  • solid-liquid separation using a centrifugal separator or the like can yield a high content of mono-glucosylhesberidin.
  • the precipitated ⁇ -monoglucosylhesperidin crystals can be washed with a lower alcohol to obtain a higher ⁇ -monoglucosylhesperidin content with a higher ⁇ -monoglucosylhesperidin content. can get.
  • hesperetin is not more than 0.4 parts by weight, and / 3 -monoglucosyl is peretine and hesperidin is not more than 0.1 parts by weight, based on 1 part by weight of mono-glucosyl hesperidin. And other components such as sugars in an amount of 0.1 parts by weight or less.
  • Hesperidin Most preferably, no beretin is contained at all, but if it is contained, the content of hesperidin coexisting with ⁇ -monoglucosylhesperidin is determined by the content of ⁇ -monoglucosyl.
  • hesperetin is desirably less than or equal to 10 parts by weight, preferably less than or equal to 0.05 parts by weight, and particularly preferably from 0 to 0.01 parts by weight.
  • Such ⁇ -monoglucosyl hesperidin-rich substances are excellent in water solubility and, for example, have a solid content of 30% by weight. Even when the solution is kept at room temperature (eg, 25 ° C) for 4 weeks, the formation of flocs (f10c: aggregates) such as the precipitation of hesperidin, hesperetin, etc. with the naked eye can not see.
  • such a substance having a high content of ⁇ -monoglucosyl hesperidin can be suitably used for applications such as an anti-fading agent for natural dyes.
  • 0.001 to 0.2% by weight per sample weight colored with the natural dye is preferable. Is preferably used in an amount of 0.05 to 0.1% by weight, more preferably 0.01 to 0.05% by weight.
  • Hesvelidin has a unique ultraviolet absorption spectrum, is almost colorless because there is no noticeable absorption in the visible region, and is conventionally susceptible to fading with ultraviolet light. Attempts have been made to prevent the discoloration of pigments, especially natural pigments, but hesperidin was hardly soluble in water, and did not achieve its effect. In addition, even with enzyme-treated hesperidin with increased water solubility, unreacted hesperidin may precipitate and precipitate with the conventional product. There was a problem.
  • the ⁇ -monoglucosylhepsperidine-rich material according to the present invention is a water-soluble substance that hardly causes precipitation, and thus can be widely used for preventing discoloration of natural pigments.
  • paprika, / 3-carotene Effective for carotenoids such as astaxanthin, flavonoids such as mosquito, peach skin, safflower yellow, bitred, cocoon pigment, gardenia blue and red yeast rice pigment It can be used effectively.
  • a combination of one or both of enzyme-treated rutin and L-ascorbic acid has a synergistic effect in preventing the discoloration of the natural pigment. Is obtained.
  • the -mono-glucosyl hesperidin-rich substance is present in the tangerines and the solution (the solution in the canned tangerines).
  • the ⁇ -monoglucosyl hesperidin-rich substance can be used to prevent clouding of citrus beverages containing hesperidin (eg, Satsuma mandarin orange, navel, orange, etc.).
  • the amount of the ⁇ -monoglucosyl hesperidin-rich material used is 0.01 to 10 parts by weight with respect to 1 part by weight of hesperidin (unreacted hesperidin) present in the solution.
  • it is 0.1 to 2 parts by weight, more preferably 0.1 to 1 part by weight.
  • the ⁇ -monoglucosyl hesperidin-rich material has unique visual external absorption characteristics and has the characteristics of extremely light color, etc., so that it can be used as a UV cut agent in cosmetics. Can be.
  • hesperidin, ⁇ -monognorecosyl hesperetin, and the like are substantially free from hesperidin and hesperetin. Excellent water solubility, cloudy.
  • the pH was adjusted to 9.0 with 4 N sulfuric acid, and 1 g of dextrin, a cyclodextrin-ringo-canotransferase (produced by Hayashibara Biochemical Laboratories Co., Ltd.) derived from Stirrothermofilum, was added to the solution. Add 15 units per unit, and add 4N-sulfuric acid dropwise while heating to 60 ° C to adjust the pH to 8.0. Adjusted to 3 and reacted for 6 hours.
  • Hesperidin The identity was confirmed using the reagent hesperidin (Kyokyo Kasei).
  • the peak at R. ⁇ . 10.34 was defined as ⁇ -monoglucosylhesperidin, and the peak group having a smaller R. ⁇ . than this peak and this peak was defined as ⁇ -glucosylhesperidin fraction.
  • Hesperidin Analyzed by high performance liquid chromatography and calculated based on the reagent Hesperidin (Tokyo Kasei).
  • the enzymatically treated hesperidin solution (Solution B) was packed in a column packed with 1.5 liters of mesoporous adsorption resin (XAD-7) and activated with a high-concentration aqueous ethanol solution. After passing through the column, the column was washed with twice the column volume of water, and then the adsorbed component to the resin was desorbed with 3 liters of an aqueous solution of 80 (V / V) ⁇ % ethanol. After removing ethanol in the desorbing solution, the solution was freeze-dried to obtain a solid (B-r).
  • XAD-7 mesoporous adsorption resin
  • This solid (B-r) contains-monoglucosyl hesperidin power 81% by weight 0 ,-monoglucosyl hesperetin power 18% by weight, and other components in an amount of 1% by weight. Hesperidin and hesperetin were not detected.
  • Glucoa milase glucozyme, Nagase Sangyo
  • Hesperidinase Hesperidinase No. 2, Tanabe Seiyaku
  • solution A enzyme-treated hesperidin solution
  • This C solution was treated with 1.5 liters of a medium-polarity porous adsorption resin (XAD7) as in Example 1, and lyophilized to give a solid (Cr).
  • the solid (C-r) contains 85% by weight of ⁇ -monoglucosyl hesperidin, 2% by weight of / 3-monoglucosyl hesperetin, 12% by weight of hesperetin, and other components. Was contained in an amount of 1% by weight, and hesperidin was not detected.
  • This solid (C—r—c) has an ⁇ -monoglucosyl hesperidin strength of 96% by weight; 5% mono-dalcosyl hesperidin; 2% by weight; hesveletin 1% by weight; Was contained in an amount of 1% by weight, and hesperidin was not included. .——
  • Solution D was treated with 1.5 liters of mesoporous sorbent resin (XAD-7) as in Examples 1 and 2 and lyophilized to give a solid (D-r).
  • XAD-7 mesoporous sorbent resin
  • This solid (D-r) contains 76% by weight of ⁇ -monoglucosyl hesperidin, 23% by weight of hesperidin, 1% by weight of other components, Sill hesperetin and hesperetin were not detected.

Landscapes

  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Description

糸 » α -モノ グルコ シルヘスペリ ジン高含有物の製造方法
【発明の技術分野】 · 本発明は、 α -モノ グルコ シルヘスべリ ジ ン高含有物の製造方法に 関し、 さ らに詳しく は α -グルコ シルヘスペ リ ジンとヘスペ リ ジンと を含有する溶液を処理して α -モノ グルコシルヘスペリ ジ ンを析出分 離し、 これを採取する こ とによる α; -モノ ダルコ シルヘスべリ ジン高 含有物の製造方法に関する。
【発明の技術的背景】 ヘスべリ ジン （Hes peri di n ) は、 下記式 [ I ] ：
Figure imgf000003_0001
ルチノース
[ I ] で示される よ う にヘスペレチ ン （ 5， 7， 3 ' - ト リ ヒ ドロキ シ - 4 ' -メ ト キシフ ラノくノ ン） の 7 位の水酸基に、 ルチノ ース （ L -ラ ムノ シノレ- （ α 1 — 6 ) -グルコース） が /3 -結合したものをいう。 こ のヘスペ リ ジンは柑橘類の未熟な果皮に含まれ、 毛細血管の強化、 出血予防、 血圧調整等の生理作用を有する ビタ ミ ン P と して医薬品、 化粧品等に供される。 またこのヘスペリ ジンは、 アルカ リ 性水溶液 には可溶であるカ 、 水、 酸に難溶であり、 室温では、 5 0 リ ッ 卜ル の水に僅かに 1 g (約 0 . 0 0 2 W Z V Q'0 ) 程度しか溶けず、 こ の ヘスペリ ジ ンカ、 例えば、 缶詰の液汁に少量でも含まれている と、 液汁が白濁し商品価値が損なわれる。
従来、 ヘスペ リ ジンによる液汁の白濁を防止する との観点から、 種々 の方法が提案されている。
例えば、 特開平 3 - 7 5 9 3号公報には、 ヘスペリ ジンに澱粉部分 分解物 （ -ダルコ シル糖化合物） 共存下で糖転移酵素 （ α -グルコ シル転移活性を有する酵素） を作用させて、 下記式 [ Π ] で示され る α -グルコ シルヘスペ リ ジンを生成させて、 水溶性を高めた酵素処 理ヘスペリ ジ ンの製造方法が開示されている。
[ £¾ -グルコシルヘスぺリジン ] 0 Η
8 1
Figure imgf000004_0001
• · · · [ I I ]
. この α -グルコシルヘスペリ ジンは、 上記式 [ I I ] に示されるよ う に、 式 [ I ] で示されるヘスペリ ジンのグルコースの 4位の位置に グルコース （ G ) が α 1 , 4結合で順次 η個 （ 1 〜 2 0個） 結合し た化合物、 またはこれらグルコース数の異なる α グルコ シルヘスべ リ ジンの混合物である。
こ の酵素反応においては、 原料液に含まれるヘスペ リ ジ ンの 4 0 〜 8 0 %が酵素処理によ り α -ダルコシルヘスペリ ジンに変換される が、 2 0 〜 6 0 %は未反応ヘスペ リ ジンと して残存して しま う。 未 反応ヘスペ リ ジ ン （ヘスペ リ ジ ン） は、 α -グノレコ シルヘスペ リ ジ ン が共存する と、 水溶液中での溶解性が高ま るカ^ α -ダルコ シルヘス ペリ ジンに対して未反応ヘスペリ ジンの比率が高いと、 短時間に未 反応ヘスペリ ジンが不溶化して析出 して く る。
この未反応ヘスペリ ジンの析出を防ぐ手段の一つと して、 C M C (カルボキシメ チルセルロース） 等の糊料をヘスペリ ジ ン含有液に 添加し、 水溶液の粘性を上げる こ とが考え られる力、'、 このよ う な糊 料の添加は商品イ メ ージ上好ま し く な く、 また輸出商品には使用で きないなど、 一般的な方法とは言いがたい。
他方、 未反応ヘスペ リ ジンを析出させ、 ろ過などで分離除去して -グルコシルヘスペ リ ジ ンに対して未反応ヘスペ リ ジ ンの比率を低 減させる こ とによ り、 未反応ヘスペ リ ジンの析出を遅らせる方法が ある。
しかしこ の方法を採用 しても、 長時間経過する とやはり未反応へ スペリ ジ ンが析出する との問題点があ り、 本質的な解決になってい ない。
また、 ク ロマ ト分離などの方法で、 α -ダルコ シルヘスペ リ ジンと 未反応ヘスペ リ ジンとを含有する水溶液から α -ダルコ シルヘスペ リ ジン区分のみを取り 出 して用いる方法もある力^ コス トアッ プにな り、 経済的な方法とは言いがたい。 - . このよ う な問題点を解決すベ く 本発明者らは鋭意研究を重ねて、 先に、 α -グルコシルヘスペリ ジンと未反応ヘスペリ ジ ンとを含有す る溶液に、 α -いラムノ シダ一ゼ活性を有する酵素を作用させる と、 α -ダルコ シルヘスべリ ジンは殆ど変化せずそのままである力 、 未反 応ヘスペ リ ジ ンは、 加水分解されてラムノ ースを分離して下記式 [ I I I ] で示される ^ -モノ グルコ シルヘスペレチンに変換され、 著 し く 水溶性に優れ、 長期間経過しても白濁などが生じないよ う な酵 素処理ヘスペ リ ジンが得られる こ となどを見出 している。
Figure imgf000006_0001
• · · · [ I I I ]
また、 「サイ ク ロデキス ト リ ン合成酵素によるヘスペリ ジン配糖 体生成と天然色素の安定化」 と題する米谷、 寺田らの論文 （日本食 品科学工学会誌、 第 4 2巻第 5号、 第 3 7 6 〜 3 8 2頁、 1 9 9 5 年 5月刊） には、 糖受容体のヘスペリ ジンと糖供与体の /3 C D と糖 転移酵素の C G T a s e を反応させて、 ヘスペ リ ジ ン配糖体 （ H s p — G n ) を得た後、 このヘスペリ ジン配糖体の精製段階で、 この ヘスペリ ジン配糖体に α -ラムノ シダーゼを作用させる と、 未反応へ スぺリ ジンのみが加水分解され、 セフ アデッ ク ス L Η — 2 0.カラ.ム ク ロマ ト グラフ ィ 一によ り効果的にヘスペリ ジ ン配糖体 （精製物） と未反応ヘスペリ ジンとを分離でき る との知見を得たこ とが記載さ れ、 得られたヘスペリ ジン配糖体 （精製物） を天然色素溶液に添加 したところ、 紫外線による天然色素の退色を抑制できたこ とが記載 されている。
しかしながら、 式 [ IV] で示される -モノ グルコシルヘスベリ ジ ンについては、 こ の米谷、 寺田 らの論文に記載の方法では、 含有さ れているヘスペレチンを予め A m b e r 1 i t e X A D — 1 6で分 離し、 得られた /3 -モノ グルコシルヘスペレチ ンと α -モノ グルコ シ ルヘスペリ ジンと α -ジグルコシルヘスペリ ジ ンとの混合物から、 さ らに α -モ ノ グノレコ シノレヘスペ リ ジ ン と α - ジグノレコ シノレヘスペ リ ジ ンとを高価なカラムク ロマ ト グラ フ ィ 一によ り分離する方法である ため、 α -モノ ダルコシルヘスペリ ジン高含有物のみを効率よ く 採取 するこ とが困難であ り、 これをよ り簡単 · 安価に採取できれば、 医 薬品、 化粧品、 食品添加物な ど広範な用途へのい っ そ う の利用が期 待できる。
Figure imgf000008_0001
• · · · [ I V ] なお、 前記の特開平 3 - 7 5 9 3号公報では、 -ダルコ シルヘス ペリ ジンとヘスペリ ジ ンの混合液にグルコア ミ ラーゼ （ Ε . C . 3. 2. 1 . 3 ) を作用させ、 -グルコ シルヘスペリ ジンを α -モノ グルコ シル ヘスペリ ジンに変え、 ダイヤイオ ン Η Ρ - 2 0 カラムに通液し水洗し た後、 エタ ノ ール水溶液中のェタ ノ ール濃度を段階的に高めながら a -モノ ダルコ シルヘスペリ ジン画分を採取する方法が開示されてい る。 この特開平 3 7 5 9 3号公報に記載の方法においても、 α モ ノ ダルコシルヘスペリ ジン高含有物を安価に供給する こ とは困難で ある と思われる。
そこで、 本発明者らはさ らに鋭意研究を重ねた結果、 -グルコ シ ルヘスペリ ジンとヘスペ リ ジ ンとを含有する溶液に、
グルコア ミ ラ一ゼと レラムノ シダ一ゼ （ Ε . C . 3. 2. 1 · 40 ) を作 用させた後、 α -モノ グルコシルヘスペリ ジンを析出分離し、 これを 採取する方法、 あるいは グノレコア ミ ラ一ゼと - L -ラムノ シダ一ゼ、 /3 - D -グノレコ シダ一ゼ - ( E . C . 3. 2. 1 . 2 1 ) を作用させた後、 α -モノ グルコ シルヘスベリ ジ ンを析出分離し、 これを採取する方法
のう ちの何れかの方法を採用する こ とによ り、
得られた混合物から α -モノ ダルコ シルヘスペ リ ジ ンを効率良ん分 離 ' 採取 （分取） できるこ となどを見出 して、 本発明を完成するに 至つた。
本発明では、 析出した a -モノ グルコ シルヘスペリ ジンを元の混合 物から固液分離するだけで、 極めて効率良く α -モノ グルコ シルヘス ペリ ジン高含有物を製造する こ とができる。
なお、 ヘスペリ ジンに α -いラムノ シダ一ゼ活性を有する酵素を作 用させてヘスペリ ジンを /3 -モノ グルコ シルヘスペレチンに変換し、 水溶性を向上させる方法はみかん缶詰シラ ッ プの白濁防止法と して 工業的に行なわれている。
しかし本発明のよう に、 -グルコ シルヘスペ リ ジンと未反応ヘス ペリ ジンとを含有する溶液にグルコア ミ ラーゼ、 α -いラムノ シダ一 ゼを作用させる力、、 またはグルコア ミ ラーゼ、 α -いラムノ シダ一ゼ 及び - D -ダルコシダ一ゼの各活性を有する酵素剤を作用させて、 α -グルコ シルヘスペリ ジンのラムノ 一スはそのままでグルコース 4位 に多数結合しているグルコース （ G ) ηのう ちの 1 個のみ残して加 水分解して α -モノ グルコ シルヘスペ リ ジンと し、 一方ヘスペ リ ジン のラムノ ースを加水分解して /3 -モノ グルコ シルヘスペレチン （ 7 - 0 - ^ -モノ グルコシルヘスペレチン） に変える力、、 さ らには /3 -モノ グルコシルヘスペレチンの /3 -グルコースを加水分解してヘスペレチ ンに変えるかするこ とによ り、 効率良く α -モノ グルコ シルヘスペ リ ジ ンのみを析出分離し、 これを採取する方法は示唆すらされていな カヽった。
また特開平 8 8 0 1 7 7号公報には、 可溶化ヘスペ リ ジ ンを、 へ スぺリ ジンが含有されている水溶液に添加するへスぺ リ ジ ン.結晶.の 析出防止方法が開示され、 こ の可溶化ヘスペ リ ジ ンは、 ヘスベ リ ジ ン中のグルコース基の 4位の位置にグルコースが - 1 , 4 結合で順 次 1 〜十数個結合した化合物であ り、 こ のよ う な可溶化ヘスペ リ ジ ンは、 糖転移酵素をサイ ク ロデキス ト リ ン等の存在下にヘスベ リ ジ ンに作用させる こ とで生産でき、 該糖転移酵素と しては、 例えば C G T a s e すなわち、 1 ， 4 - a D -グルカ ン ； 1 ， 4 - « - D - ( 1 ， 4 -グルカノ ） トラ ンスフェ ラ一ゼ （ Ε . C . 2. 4. 1 . 1 9 ) 、 さ らに具 体的には、 バチルス属の A 2 - 5 a 菌株培養物から採取された糖転移 酵素を利用 して生産できる 旨記載されている。
しかしながら、 該公報には、 可溶化ヘスペ リ ジ ンを未反応へスぺ リ ジ ンに添加混合してヘスペ リ ジ ン含有物中のヘスペ リ ジ ン結晶析 出を防止する との技術思想の開示にと どま る。 また該公報に記載の 方法で得られる ものは -ダルコ シルヘスペリ ジンとヘスペ リ ジンの 混合物であ り、 生成物には、 未反応ヘスペ リ ジ ンがそのま ま含有さ れているため、 例えばこのよ う な方法で調製した缶詰ではその液汁 が次第に白濁しやすいという 問題点がある。 この対処方法と して、 該公報の実施例では、 α -モノ グルコシルヘスペリ ジ ンと a -ジグル コ シルヘスペ リ ジン画分を採取し用いている。 しかしながら、 前記 2成分画分を経済的に採取する こ とは、 技術的に困難を伴う。 【発明の目的】 本発明は、 上記のよう な従来技術に伴う 問題点を解決しょ う とす る ものであって、 α -グルコシルヘスペリ ジンとヘスペ リ ジンとを含 有する溶液に簡単な処理を施すこ とによ り、 《 -モノ グルコ シルヘス ペリ ジン高含有物を分取する方法を提供する こ とを目的と している。
【発明の概要】 本発明に係る α -モノ ダルコ シルヘスペリ ジン高含有物の製造方法 では、
α -ダルコ シルヘスペリ ジンとヘスペ リ ジンとを含有する溶液（a ) に、 グルコア ミ ラ一ゼと α いラムノ シダ一ゼとを同時にまたは別々 に作用させた後、 得られた混合物 （酵素反応液） （b - 1 )から α -モノ ダルコシルヘスペリ ジンを析出分離するか （第 I 法） 、 あるいは 上記溶液（a )に、 グルコア ミ ラーゼと α いラムノ シダ一ゼ、 ^ - D -グルコ シダ一ゼの各活性とを有する酵素剤類を同時にまたは別々 に 作用させた後、 得られた混合物 （酵素反応液） （b - 2 )から α -モノ グ ルコシルヘスペリ ジンを析出分離する力、 （第 I I 法） 、
の何れかの方法によ り、 上記溶液（ a )から α -モノ ダルコ シルヘス ペリ ジンを分離し、 これを採取する こ とを特徴と している。
本発明の好ま しい態様においては、 -モノ グルコ シルヘスべリ ジ ンを析出分離させる前に、 上記酵素反応液を多孔性吸着樹脂と接触 させ、 α -モノ グノレコシノレヘスペリ ジン、 3 -モノ グルコ シノレへスぺ レチン、 ヘスペレチ ン等を該樹脂に吸着させ、 次いで水洗によ りデ キス 卜 リ ン等を流出させた後、 有機溶剤 （例 ： アルコール） で a -モ ノ グノレコ シノレヘスペ リ ジ ン、 -モ ノ グノレコ シノレヘスペ レチ ン 、 ヘスペレチンを溶出させる こ とが望ま し く、 さ らにはこのよ う に して得られた溶出液中に含まれる使用された有機溶剤を除去してお く こ とが好ま しい。 さ らに、 本発明の好ま しい態様においては、 低 級アルコール （例 ： メ タ ノ ール） 中で、 この溶出液中に含まれる ひ -モノ グルコ シルヘスペリ ジンを析出させ、 分取する こ とが望ま しい, 本発明によれば、 α グルコ シルヘスペリ ジ ンとヘスペ リ ジ ンとを 含有する溶液から、 ヘスペリ ジ ン、 ^ -モノ グルコシルヘスペ レチ ン ヘスペレチ ンな どをほとんど含まず、 著し く 水溶性に優れた α -モノ ダルコ シルヘスペリ ジ ン高含有物が容易に得られる。
【発明の具体的説明】 以下、 本発明に係る α -モノ グルコシルヘスペ リ ジン高含有物の製 造方法について具体的に説明する。
本発明に係る α -モノ グルコシルヘスペリ ジ ン高含有物の分取 （製 造） 方法では、 α -グルコシルヘスペリ ジンとヘスペ リ ジンとを含有 する溶液に、 グルコア ミ ラ一ゼと α -いラムノ シダーゼと /3 - D -グル コ シダ一ゼとを同時にまたは別々 に作用させ （但し、 3 D -ダルコ シ ダ一ゼを、 グルコア ミ ラ一ゼおよび -レラムノ シダ一ゼょ り先に作 用させる こ とはない） 、 得られた酵素処理液から -モノ ダルコ シル ヘスペ リ ジンを析出分離し、 これを採取している力、
この際に用いられる 「 グルコ シルヘスペリ ジンとヘスペ リ ジ ン とを含有する溶液」 についてまず初めに説明する。
「 -グルコシルヘスペリ ジンとヘスペリ ジンとを含有する溶液 Ί このよう な酵素処理の対象となる溶液と しては、 α -グルコ シルへ スペリ ジ ンとヘスペリ ジンとを含有する ものであれば、 その含量比、 濃度な どは特に限定されないが、 好ま し く は、 処理すべき溶液中の α -ダルコ シルヘスペ リ ジン濃度が、 0 . 1 〜 3 0重量 <¾、 好ま し く は 1 〜 1 0重量％であ り、 ヘスペリ ジン濃度が、 0 . 0 2 〜 1 5重 量％、 好ま し く は 0 . 2 〜 5重量％であ り、 グルコ シルヘスペリ ジ ン /ヘスペ リ ジ ン （重量比） 力く、 1 0 0 Ζ 1 〜 2 0 0、 好ま し く は 1 0 0 Ζ 1 〜 2 0である ものが望ま しい。
α -グルコシルヘスペリ ジンとヘスペリ ジ ンとを含有する溶液と し ては、 例えば、 下記①〜②に示すものが挙げられる。
① ： 特開平 3 - 7 5 9 3号公報に記載されている よう に、 ヘスベ リ ジ ンに澱粉部分分解物 （ α -ダルコ シル糖化合物） 共存下で糖転移酵素
( α ダルコ シル転移活性を有する酵素） を作用させてな り、 グ ルコシルヘスペ リ ジンと未反応のヘスペリ ジ ンとを含有している も の。
② ： 上記のよ う に して得られた α -ダルコ シルヘスペ リ ジ ン含有物中 のヘスペ リ ジンを析出させた後、 さ らにろ過などによ りヘスペ リ ジ ンを分離除去して α -グルコ シルヘスペリ ジンに対してヘスペ リ ジ ン の比率を低減させたもの。 「グルコア ミ ラーゼ、 a - L -ラムノ シダーゼ、
β - D -グルコ シダ一ゼの各活性を有する酵素剤 Ί
本発明においては、 グルコア ミ ラーゼ、 α -いラムノ シダ一ゼ、 β - グルコ シダーゼは、 それぞれの酵素活性を有する ものであれば、 何れも用いるこ とができる。 . . ダルコア ミ ラーゼと しては、 具体的には、 例えば、 「ダルクザィ ム N L 4 , 2 」 （天野製薬 （株） 製） 、 「セルラ一ゼ Α ァマノ 、
3」 （天野製薬 （株） 製） 、 「ダルコチーム」 （長瀬産業 （株） 製） 、 「ュニァ一ゼ 3 0」 （ （株） ヤクル ト製） 、 「十 リ ンギナーゼ」 (田辺製薬 （株） 製） などの市販の酵素剤のよ う に、 α - 1， 4 グル コシ ド結合をグルコース単位で切断しう る酵素が挙げられる。
α -いラムノ シダーゼと しては、 具体的には、 例えば、 「ヘスペ リ ジナ一ゼ」 （田辺製薬 （株） 製） 、 「ナ リ ンギナーゼ」 （ [日辺製薬 (株） 製） 、 「セルラーゼ Α く ァマノ 3 」 （天野製薬 （株） 製） 等の市販の酵素剤が挙げられ、 好ま し く は 「ヘスべリ ジナーゼ」 力 用いられる。
^ D -ダルコ シダ一ゼと しては、 具体的には、 例えば、 「セルラ一 ゼ Aく ァマノ 〉 3」 （天野製薬 （株） 製） 等の市販の酵素剤が挙げ られる。
これらの酵素剤のう ちグルコア ミ ラ一ゼ活性を有する酵素剂は、 上記 α -ダルコ シルヘスペリ ジ ンとヘスペリ ジ ンとを含有する溶液中 の α -ダルコ シルヘスペ リ ジン 1 0 0重量部当た り、 好ま し く は 0 . ◦ 1 〜 1 0重量部、 さ らに好ま し く は 0 . 1 〜 1 重量部程度の量で 用いられる。 α -いラムノ シダ一ゼ活性を有する酵素剤は、 上記 α -グルコ シル ヘスペ リ ジンとヘスペリ ジンとを含有する溶液中のヘスペ リ ジ ン 1 0 0重量部当たり、 好ま し く は 0 . 0 5 〜 5 0重量部、 さ らに好ま し く は 1 . 5 〜 1 5重暈部程度の量で用いられる。
ま ナこ β グルコシダ一ゼ活性を有する酵素剤は、 上記 .グル.コ シルヘスペ リ ジンとヘスペリ ジ ンとを含有する溶液中のヘスペ リ ジ ン 1 0 0重量部当たり、 好ま し く は 0 . 0 1 〜 2 0重量部、 さ らに 好ま し く は 0 . 1 〜 1 0重量部程度の量で用いられる。 なお、 グル コア ミ ラ一ゼ活性、 α -いラムノ シダ一ゼ活性、 /3 - グルコ シダ一 ゼ活性のう ち 2つ以上の活性を有する市販の酵素剤 {例 ： 「セルラ ーゼ Α く アマノ > 3 」 （天野製薬 （株） 製） } を用いる場合には、 その量を適宜加減し設定する こ とができる。
また、 これらの酵素を、 上記 α -グルコシルヘスペ リ ジンとヘスべ リ ジンとを含有する溶液中の α -グルコシルヘスペリ ジ ンあるいはへ スぺリ ジンに作用させるには、 通常、 ρ Η 3 〜 7、 好ま し く は ρ Η 3 〜 4 で、 通常 4 0 〜 7 0 °C、 好ま し く は 5 0 〜 6 0 °Cの温度で、 通常 0 . 5 〜 7 2 時間、 好ま し く は 6 〜 4 8 時間程度保持すればよ い。
このよう な条件で上記 α -グルコシルヘスペリ ジンとヘスペ リ ジ ン とを含有する溶液を酵素処理した場合、 α -ダルコ シルヘスペリ ジ ン は、 上記 α -いラムノ シダ一ゼ （例 ： ヘスペリ ジナーゼ） 処理によ つ ては、 その作用を実質上受けない。
しカヽしな力くら この -ダルコ シルヘスペリ ジンは、 グルコア ミ ラー ゼの加水分解作用を受けて、 この α -ダルコシルヘスペ リ ジ ンのヘス ペレチ ン骨格 7位のグルコースに - 1 , 4結合で η個順次結合 （ η = 1 〜十数個） しているグルコースが 1 個残して加水分解され、 上 記式 [ I I ] 中、 η = 1 の α -モノ グノレコシルヘスペリ ジンになる。
なお、 α -グルコ シルヘスペリ ジン （含む α -モノ グルコ シルヘス ペリ ジン） に S -D グルコ シダ一ゼを作用させても実質上加水分解さ れない。
一方のヘスペ リ ジンは、 上記の -いラムノ シダ一ゼの作用を受け てそのラムノ 一ス基が加水分解され、 /3 -モノ ダルコ シルヘスペレチ ン （ 7 0 - -モノ グノレコ シルヘスペレチン） になる。
この 3 モノ グルコ シルヘスペレチンに、 さ らに /3 - D -グノレコ シダ —ゼが作用する と、 この 3 -モノ ダルコ シルヘスペレチ ンのヘスペレ チ ン骨格 7位に結合している S -グルコース基が加水分解されて、 β -モノ グルコ シルヘスペレチンは、 水に難溶性のヘスペレチ ンになる < 従って、 本発明では、 上記 α -グルコ シルヘスペリ ジンとヘスペ リ ジンとを含有する溶液への上記各酵素の添加順序と しては、
α -グルコ シルヘスペリ ジンとヘスペリ ジ ンとを含有する溶液に、 グルコア ミ ラーゼと ひ -いラムノ シダ一ゼを作用させ、 得られた混合 物 （酵素反応液） から -モノ グルコ シルヘスペリ ジ ンを析出分離す る第 I 法では、 α グルコシルヘスペ リ ジンの α -モノ グルコ シルへ スペリ ジン化と、 ヘスペリ ジ ンの -モノ グルコ シルヘ スペレチ ン化 の何れか一方を先に、 あるいは同時に進行させればよいため
、 グルコア ミ ラーゼと -いラムノ シダ一ゼの何れか一方を先に、 あ るいは同時に進行させればよい。 得られた酵素反応液中の各成分含 量は、 モノ ダルコシルヘスペリ ジ ン 1 重量部に対して /3 -モノ グ ルコシルヘスペレチン力 0 . 5重量部以下で、 ヘスペ リ ジ ン及びへ スぺレチンがそれぞれ 0 . 1 重量部以下である。 また、 糖類等その 他の成分は、 該酵素反応液中の α -モノ ダルコ シルヘスペリ ジン 1 重 量部に対して 1 重量部以上の量で含まれる こ とが多い。
α -ダルコシルヘスペリ ジンとヘスペリ ジンとを含有する溶液に、 グノレコア ミ ラ一ゼ、 - L -ラ厶ノ シダ一ゼ、 /3 - D -グノレコ シダ一ゼを 同時に、 または何れか一種を先に して順次作用させ、 得られた混合 物 （酵素反応液） から α -モノ グルコシルヘスペリ ジンを析出分離す る第 I I 法では、
①グルコア ミ ラ一ゼと、 いラムノ シダ一ゼと、 3 - D -グルコ シ ダ一ゼを同時に添加する方法、
②グルコア ミ ラ一ゼと -いラムノ シダ一ゼとを添加して作用させ た後、 ^ - D -グルコシダ一ゼを添加して作用させる方法、
③グルコア ミ ラーゼと α -いラムノ シダ一ゼを任意の順序で添加し て作用させた後、 S - D -グルコ シダ一ゼを作用させる方法、
④ヘスペリ ジ ンのヘスペレチ ン化を先に進めるべく、 -ラムノ シダ一ゼと /3 グルコシダ一ゼとを作用させた後、 グルコア ミ ラ ー ゼを作用させる方法等が挙げられる。 何れの場合も、 これらの各酵 素は一度にあるいは少量ずつ添加する こ とができる。
得られた酵素反応液中の各成分含量は、 α · モ ノ ダルコ シルヘスべ リ ジン 1 重量部に対して、 ヘスペレチ ンが 0 . 4 重量部以下で、 β -モノ グルコシルヘスペレチンとヘスペリ ジンがそれぞれ 0 . 1 重量 部以下の量である。 そ して、 糖類等のその他の成分は、 該酵素反応 液中の α -モノ グルコシルヘスペリ ジン 1 重量部に対して、 1 重量部 以上の量で含まれる こ とが多い。
本発明では、 これらのう ちでは、 第 I 法では、 いラムノ シダ一 ゼを先に作用させた後、 グルコア ミ ラ一ゼを作用させる こ とが望ま しい。
また、 第 I I 法では、 a - L -ラムノ シダーゼを作用させた後、 グル コア ミ ラ一ゼと /S D-グルコシダ一ゼを作用させるこ とが反応効率の 点から望ま しい。
「 -モノ ダルコシルヘスペ リ ジ ンの分取 Ί 本発明では、 上記のよう に、 α -グルコシルヘスペ リ ジンとヘスべ リ ジンとを含有する溶液を酵素処理して得られる、 α -モノ グルコ シ ルヘスペリ ジンを含有する酵素処理液 （酵素処理 α モノ ダルコシル ヘスペリ ジ ン含有液と も言う ） 力、ら、 α -モノ グルコ シルヘスベリ ジ ンを分取する。
このよう に酵素処理液から α -モノ グルコ シルヘスペ リ ジンを分取 するには、 第 I 法では、 低級アルコールに、 下記酵素処理液すなわ ち、 「 α -モノ グルコ シルヘスペリ ジ ン 1 重量部に対して、 β -モ ノ ダルコシルヘスペレチンが 0 . 5重量部以下で、 ヘスペ リ ジン及び ヘスペレチンがそれぞれ 0 . 1 重量部以下であ り、 そ して糖類その 他の成分が多 く の場合 1 重量部以上の量で含まれる酵素処理液」 を 混合し、
第 I I 法では、 下記酵素処理液すなわち、 「 α -モノ グルコ シルへ スぺリ ジン 1 重量部に対して、 ヘスペレチ ンが 0 . 4 重量部以下で、 ^ —モノ グルコシルヘスペレチンとヘスペリ ジンがそれぞれ 0 . 1 重 量部以下であ り、 そ して糖類等その他の成分が多 く の場合 1 重量部 以上の量で含まれる酵素処理液」 を混合するが、
本操作に先だって酵素処理液中の遊離糖分を除去してお く こ とが 望ま しい。 遊離糖分の除去方法は、 酵素処理液中の遊離糖分を効率 良く 除去出きる方法であればどんな方法でもよいが、 多孔性吸着樹 脂を用いる方法が簡便である。 .
多孔性吸着樹脂と しては、 具体的には、 例えば、 H P 2 0、 H P - 5 0、 X A D — 2等の非極性樹脂、 X A D — 7等の中間極性樹 脂が好ま し く 用いられる。 これらの方法では、 カラムに多孔性吸 着樹脂を充填し、 高濃度のエタ ノ 一ル水溶液等で活性化しておいた カラムに上記酵素処理 α -モノ ダルコ シルヘスペ リ ジ ン含有液を 1 0 〜 6 0 °Cの温度で通液する等の方法で、 該樹脂に上記酵素処理 -モ ノ グルコシルヘスペ リ ジ ン含有液を接触させ、 ひ -モノ グルコ シルへ スぺリ ジ ン、 /3 -モノ グルコ シルヘスペ レチ ン、 ヘスペ レチ ン等を吸 着させる。
次いで、 充填樹脂容量の 1 〜 4倍量程度の水で洗浄して遊離糖を 主体とする夾雑物を除去した後、 アルコール、 アルコール一水 〔ァ ルコール Z水 = 5 0 〜 1 0 0ノ 2 5 〜 1 ) 等の溶離液を 1 0 〜 6 0 °Cの温度で通液する等の方法で、 該樹脂に吸着している モノ グル コ シノレヘスペ リ ジ ン、 /3 -モノ ダルコ シルヘスペ レチ ン、 ヘスペ レチ ン等を溶出させる。
第 I 法では、 本操作によ り、 a -モノ グルコ シルヘスペ リ ジ ン 1 重 量部に対して、 /3 -モノ ダルコ シルヘスペレチ ンが 0 . 5 重量部以下 で、 ヘスペリ ジ ン及びヘスペレチンがそれぞれ 0 . 1 重量部以下で あ り、 そ して糖類等のその他の成分が 0 . 1 重量部以下の量である 溶出液が得られ、
また第 I I 法では、 本操作によ り α モノ グルコシルヘスペ リ ジ ン 1 重量部に対して、 ヘスペレチンが 0 . 4 重量部以下で、 /3 -モノ グ ルコシルヘスペレチンとヘスペリ ジンとがそれぞれ 0 . 1 重量部以 下であ り、 そ して糖類等その他の成分が 0 . 1 重量部以下の量であ る溶出液が得られる。
上記ァノレコールと しては、 メ タノ ール、 エタ ノ ール、 プロパノ 一 ル、 ブタノ 一ル等の炭素数が 1 〜 5 の低級アルコールが挙げられる。
次いで上記溶出液中のひ -モノ グルコ シルヘスペリ ジンを低級ァル コール中で析出させ、 固液分離し、 これを採取する こ とによ り、 α -モノ グルコ シルヘスペ リ ジン高含有物を得る こ とができる。
本操作は、 α -モノ グルコ シルヘスペリ ジ ン力 、 加温された低級ァ ルコール中には容易に溶解する一方、 それを室温 （例 ： 1 5 〜 2 5 °C ) 以下の温度に下げる と α -モノ グルコ シルヘスペ リ ジンが容易に 析出 して く る現象と、 /S モノ グルコ シルヘスペレチ ンは低級アルコ —ル中に溶解しやすく、 室温以下の温度に下げても ；5 -モノ グルコ シ ルヘスペレチンは析出 しに く い現象を見出 して、 完成させたもので め ο
以下に、 析出分離操作を第 I 法、 第 I I 法毎に詳述するが、 第 I 法、 第 I I 法と も、 酵素処理された上記溶出液を上記低級アルコー ルに溶解するに先立ち、 乾燥物と してお く こ とが好ま しい。
ぐ析出分取操作〉
第 I 法 ：
α モノ グルコシルヘスペリ ジン 1 重量部に対して、 ^ -モノ グル コシルヘスペレチンが 0 . 5重量部以下で、 ヘスペリ ジン及びヘス ペレチンがそれぞれ 0 . 1 重量部以下であ り、 そ して糖類等のその 他の成分が 0 . 1 重量部以下の量で含まれる こ とのある乾燥物を低 級アルコール、 好ま し く はメ タノ ールに溶解する。 該乾燥物 l g に 対して、 メ タノ ールを 0 . 2 〜 2 0 m l 、 好ま し く は 1 〜 1 . 0 m. 】 加え、 2 0 〜 ； I 2 0 °C、 好ま し く は 6 0 〜 9 0 °Cの温度に加熱して 溶解する。
その後、 この溶液を冷却、 例えば、 室温以下〜上記アルコールの 融点以上の温度に冷却しあるいは室温下に放置する と、 ほとんど α -モノ グルコ シルヘスペリ ジンのみが析出して く る。 このよ う に溶液 を冷却する際には、 予め微粉末状に調製しておいた α -モノ グルコ シ ルヘスペリ ジンを該溶液に種晶と して少量加える等の操作を行えば、 よ り迅速に α -モノ グルコ シルヘスペリ ジンが析出 して く る。
その後、 遠心分離機等で固液分離すれば -モノ グルコ シルヘスべ リ ジン高含有物を得る こ とができる。
固液分離に際しては、 析出 した α -モノ グルコ シルヘスべ リ ジン結 晶を低級アルコールで洗浄すれば、 よ り α -モノ ダルコ シルヘスべ リ ジン含有率の高い α -モノ グルコ シルヘスペリ ジン高含有物が得られ る。
第 I I 法 ：
上記第 I 法において、 -モノ グルコシルヘスペリ ジン 1 重量部に 対して、 ヘスペレチンが 0 . 4重量部以下で、 /3 -モノ グルコ シルへ スぺレチンとヘスペリ ジンがそれぞれ 0 . 1 重量部以下であ り、 そ して糖類等のその他の成分が 0 . 1 重量部以下の量で含まれる こ と のある乾燥物を用いる以外は、 第 I 法と同様に操作すれば、 該乾燥 物から α -モノ ダルコ シルヘスペリ ジン高含有物が得られる。
このよ う に して得られた α -モノ グルコ シルヘスペ リ ジ ン高含有物 ( (a )、 （ b ) ) 中には、 α -モノ グルコ シルヘスペ リ ジ ン力 8 5重量 0ο 以上、 好ま し く は 9 5重量％以上の量で含有され、 またこの. -モノ ダルコ シルヘスペリ ジンと共存するヘスペ リ ジン、 /3 モノ グルコ シ ノレヘスペレチン （ 7 -◦ - -モノ ダルコ シノレヘスペレチン） 、 ヘスべ レチンは、 何れも全 く 含まれないこ とが最も望ま しいが、 これらを 含む場合には、 この α -モノ グルコ シルヘスペリ ジンと共存するヘス ペリ ジ ンの含有量は、 この α -モノ グルコシルヘスペ リ ジ ン 1 重量部 に対して 0 . 1 0重量部以下、 好ま し く は 0 . 0 5重量部以下、 特 に好ま し く は 0 〜 0 . 0 1 重量部の量であ り、 また /3 モノ グルコ シ ルヘスペレチン （ 7 -◦ - /3 -モノ グルコ シルヘスペレチン） の含有量 は、 0 . 1 0重量部以下、 好ま し く は 0 . 0 5重量部以下、 特に好 ま し く は 0 〜 0 . 0 2重量部の量であるこ とが望ま しい。 しかも 、 ヘスペレチン含有量は、 ◦ . 1 0重量部以下、 好ま し く は 0 . 0 5重量部以下、 特に好ま し く は 0 〜 0 . 0 1 重量部の量であるこ と が望ま しい。
このよ う な α -モノ グルコシルヘスペリ ジン高含有物 （（a ) ( b ) ) は、 水溶性に優れ、 例えば、 固形分濃度が 3 0重量％の -モノ グルコ シ ルヘスべリ ジン高含有物溶液を室温 （例 ： 2 5 °C ) で 4週間保持し ても、 肉眼ではヘスペ リ ジン、 ヘスペレチ ン等の析出など、 フ ロ ッ ク （ f 1 0 c ： 凝集塊） の生成が殆ど見られない。
このよう に して得られた -モノ グルコシルヘスペ リ ジ ン高含有物 中の α -モノ ダルコ シルヘスペ リ ジ ンは、 体内に摂取される と生体内 酵素の作用を受けて元のヘスペリ ジンに戻り、 ビ夕 ミ ン Ρ と しての 諸機能を発揮するこ とができる。 この場合、 α -モノ グルコ シルヘス ペリ ジン （あるいはその高含有物） をビタ ミ ン C と併用すれば、 毛 細血管の抵抗性の増強等のビタ ミ ン Ρ作用において相乗効果.を発 :揮 するこ とができる。
また、 このような α -モノ グルコ シルヘスペ リ ジン高含有物は、 天 然色素の退色防止剤等の用途に好適に使用でき る。
このよう に α -モノ ダルコ シルヘスペ リ ジン高含有物を天然色素の 退色防止に用いる場合、 天然色素で着色された試料重量当た り、 0 . 0 0 1 〜 0 . 2重量％、 好ま し く は 0 . 0 0 5 〜 0 . 1 重量％、 よ り好ま し く は 0 . 0 1 〜 0 . 0 5重量％の量で使用する こ とが望ま しい。
こ こでさ らに詳説すれば、 ヘスべリ ジンは特有の紫外部吸収スぺ ク トルを持ち、 可視部に目立った吸収がないためほとんど無色であ り、 従来、 紫外線で退色の起きやすい色素、 特に天然色素の退色防 止に利用が試みられてきたが、 ヘスペリ ジ ンは水にほとんど溶けな かったため効果を発揮するまでに至らなかった。 また水溶性を高め た酵素処理ヘスペリ ジンであっても、 従来品では、 未反応ヘスペ リ ジンの析出 · 沈澱が発生する恐れがあ り、 その場合商品イ メ ー ジを 損ねるためその利用には問題があった。
これに対して本発明に係る α -モノ グルコ シルヘスペリ ジン高含有 物は、 沈澱発生の恐れのほとんどない水溶性のものであるため、 天 然色素の退色防止に幅広く 利用できる。 特にパプリ カ、 /3 -カロチ ン、 ァスタキサンチン等のカロチノ ィ ド系色素に有効であるカ 、 ブ ドウ 果皮、 ベニバナ黄等のフラボノ イ ド色素、 ビ一 ト レッ ド、 ゥコ ン色 素、 クチナシ青、 紅麹色素等に も効果的に使う こ とができる。
この場合、 酵素処理ルチン、 L -ァスコルビン酸 （または L -ァス コルビン酸ソ一ダ） の何れか 1 つまたは両方を併用するこ と.によ.り、 上記天然色素の退色防止に相乗効果が得られる。
また、 この α モノ グルコシルヘスペリ ジン高含有物をみかん缶詰 の白濁防止に用いる場合、 該 -モノ グルコ シルヘスペ リ ジン高含有 物は、 みかんおよび溶液 （みかん缶詰の内の溶液） 中に存在するへ スぺリ ジン （未反応ヘスペリ ジン） 1 重量部に対して、 0 . 1 〜 1 0重量部、 好ま し く は 0 . 1 〜 2重量部、 よ り好ま し く は 0 . 1 〜 1 重量部の量であるこ とが望ま しい。
さ らに、 この α -モノ グルコ シルヘスペリ ジン高含有物は、 ヘスべ リ ジンを含有するカ ンキッ類飲料 （例 ： 温州みかん、 ネーブル、 ォ レンジなど。 ） の白濁防止に使用する こ とができ、 この場合、 用い る α -モノ グルコ シルヘスペリ ジン高含有物の使用量は、 溶液中に存 在するヘスペリ ジン （未反応ヘスペリ ジン） 1 重量部に対して 0 . 0 1 〜 1 0重量部、 好ま しく は 0 . 1 〜 2重量部、 よ り好ま し く は 0 . 1 〜 1 重量部であるこ とが望ま しい。
また、 この α -モノ グルコ シルヘスペリ ジン高含有物は、 特有の視 外部吸収特性を持つと共に、 色が極めて薄い等の特質を持っため、 U Vカ ツ ト剤などと して化粧品などに利用する こ とができる。 【発明の効果】 本発明によれば、 α -グルコ シルヘスペリ ジ ンとヘスペリ ジ ンとを 含有する溶液から、 ヘスペリ ジ ン、 ^ -モノ グノレコシルヘスペレチン ヘスペ レチンなどをほとんど含まず、 著し く 水溶性に優れ、 白濁 .
(結晶析出） が生じないよう な α -モノ グルコ シルヘスペリ ジ ン高含 有物が収率よ く 簡単に得られる。
【実施例】 以下、 本発明に係る α モノ グルコ シルヘスペ リ ジ ン高含有物の分 取 （製造） 方法について実施例に基づいてさ らに具体的に説明する 力^ 本発明は、 このよう な実施例によ り何等限定される ものではな い。
なお、 以下の例において、 「％」 は、 特にその趣旨に反しない限 り 「重量 Q6」 の意味である。
【参考例 1 】
ヘスペ リ ジ ン 5 0 . 0 gを 0 . 2 5 N -苛性ソーダ （ N a 0 H ) 0 . 9 リ ツ トルに溶解し、 そこに D E 8 のデキス ト リ ン 1 5 0 gを加え 溶解した。
4 N 硫酸で p H 9 . 0 に調整し、 ノくチルス ' ステア ロザーモフ ィ ルス由来のシク ロデキス ト リ ングルカノ トラ ンスフ ィ ラーゼ （株式 会社林原生物化学研究所 販売） をデキス ト リ ン 1 g 当た り 1 5単位 加え、 6 0 °Cまで加温しながらさ らに 4 N -硫酸を滴下して p H 8 . 3 に調整し、 6 時間反応させた。
その後、 再び 4 N -硫酸を滴下して p H 7. 0 に調整し、 6 8 °Cに 加温して 4 0時間反応させた。
反応終了後、 酵素を加熱失活させた後、 濾過して酵素処理ヘスべ リ ジ ン溶液 （ A液） を得た。 . · .
A液を下記条件下に H P L C分析したと ころ、 反応前液中のヘス ペ リ ジ ンの 7 2 %が α -グルコ シルヘスペ リ ジ ンにな っ てお り、 残り 2 8 %は未反応のままであっ た。
< H P L C分析条件〉
カラム ： C 1 8
溶離液 ： メ タ ノ 一ル Ζ水 Ζ酢酸 = 3 0 / 6 5 / 5
検出 ： 2 8 0 n m
温度 ： 4 0 °C
流速 ： 0. 5 m 1 Z分
「ヘスペ リ ジ ン、 3 -モノ グルコ シルヘスペ レチ ン、 " -モノ グル コ シルヘスペ リ ジ ン、 α -グルコ シルヘスペ リ ジ ンな どの確認 ] ヘスペ リ ジ ン、 /3 -モノ グノレコ シノレヘスペ レチ ン、 a -モ ノ グノレコ シルヘスペ リ ジ ン、 α -グルコ シルヘスペ リ ジ ンな どの確認は以下の 方法で行つ た。
1. ヘスペ リ ジ ン ： 試薬ヘスペ リ ジン （柬京化成） を用いて同一- である こ とを確認した。
2. ；8 -モノ ダルコ シルヘスペ レチ ン ：
試薬ヘスペ リ ジン （東京化成） に a L ラムノ シダ一ゼを作用させ、 高速液体ク ロマ トグラ フ ィ ーで分析 （上記分析条件） する。 次いで、 ヘスペ リ ジ ンの R . T . ( = 1 0. 9 0 ) の後の単一ピーク （ R . T. = 1 2. 1 3 ) 画分を採取し加水分解しグルコースを検出する。 さ らに本ピークの紫外部吸収スぺク トルがヘスペ リ ジ ンと一致する こ とを確認し、 このピークを S モノ グルコ シルヘスペレチン （ヘス ペレチン一 7 —グルコ シ ド） と した。 . .
3. -モノ グノレコ シノレヘスペ リ ジ ン、 α -グノレコ シノレヘスペ リ ジ ン 試薬ヘスペ リ ジン （東京化成） を用いての反応物を高速液体ク ロ マ トグラフ ィ 一で分析 （上記分析条件） する。 各ピ一クの紫外部吸 収スぺク トルがヘスペリ ジンと一致するこ とを確認する。 またグル コア ミ ラーゼを作用させ、 高速液体ク ロマ トグラフ ィ ーで分析 （上 記分析条件） する。 その結果、 いずれもヘスペ リ ジ ンの R. Τ.
( = 1 0. 9 0 ) の前の単一ピーク （ R. Τ. = 1 0. 3 4 ) にな つた
さ らに本画分 （ R . Τ. = 1 0. 3 4 ) を採取し、 α -グルコ シダ —ゼ （ Ε . C . 3.2. 1.20) を作用させて加水分解する とグルコースと ヘスペリ ジンが生成するこ とを確認する。 R. Τ. = 1 0. 3 4 の ピークを α モノ グルコ シルヘスペリ ジンと し、 本ピーク及び本ピー ク よ り R . Τ. の小さいピーク群を α -グルコ シルヘスペ リ ジ ン画分 と した。
「ヘスペ リ ジン、 -モノ グノレコ シルヘスペレチン、 《 -モノ グル コシルヘスペリ ジン、 《 -グルコ シルヘスペ リ ジ ンなどの重量の測定 またヘスペリ ジン、 /3 モノ グルコ シノレヘスペレチ ン、 《 -モノ グ ノレコシノレヘスペリ ジン、 α -グルコ シルヘスペ リ ジンな どの重量の測 定は以下の方法で行った。
1 . ヘスペ リ ジン ： 高速液体ク ロマ トグラフ ィ ーで分析し、 試薬 ヘスペリ ジン （東京化成） をも とに算出 した。
2 . 3 -モノ グノレコ シノレヘスペ レチ ン ：
高速液体ク ロマ トグラフ ィ ーで分析し、 試薬ヘスペリ ジン .(東.京 化成） をも とに分子量換算し算出 した。
3 . α -モノ グルコ シルヘスペ リ ジ ン ：
高速液体ク ロマ トグラフィ ーで分析し、 試薬ヘスペ リ ジン （東京 化成） をも とに分子量換算し算出 した。
4 . α -グルコ シルヘスペリ ジ ン画分 ：
本品 （試料） の乾燥品 1 . 0 gを水 5 0 m 1 に溶解し、 こ の溶液 を予め高濃度のェタ ノ 一ル水溶液で活性化し水で充分水洗しておい た X A D 7樹脂 1 0 0 m 1 に S V = 1 で通液し、 その後水洗し、 5 0 %エタ ノ ール水溶液 2 0 0 m 1 で溶出する。 この液 （溶出液） か らエタ ノ ールを除いてから濃縮 · 乾燥し重量を求める。 高速液体 ク ロマ ト グラフ ィ ーで分析し、 も しヘスペ リ ジ ン、 ^ -モノ ダルコ シ ルヘスペレチンが含まれていたな らば、 前述の 1 , 2 に基づいて算 出 した値を減じて α -ダルコ シルヘスペリ ジ ン画分重量を算出する。 【実施例 1 】
参考例 1 の酵素処理へスぺ リ ジ ン溶液 〔 Α液） に、 ヘスペ リ ジナ —ゼ （ヘスペ リ ジナ一ゼ 2号， 田辺製薬 製） 2 gを加え、 4 N -硫 酸で p H 4 に調整し、 5 5 °Cで 2 4 時間反応させた後、 グルコア ミ ラ一ゼ （ダルコチーム， 長瀬産業 製） 1 . 0 gを加え、 さ らに 5 5 °Cで 2 4 時間反応を継続させた。 反応終了後、 得られた反応液を 9 0 °Cで 2 0 分間保持して酵素を 加熱失活させてから濾過して酵素処理ヘスペ リ ジ ン溶液 （ B液） を 得た。 B液を参考例 1 に記載の条件で H P L C分析したと こ ろ、 B 液中の α _ダルコシルヘスペリ ジンはその殆ど力 α -モノ グルコ シノレ ヘスペ リ ジンに変化し、 また Β液中の未反応ヘスペリ ジンは.、 殆ど ( 9 9 %以上） が ^ -モ ノ グルコ シルヘスペレチ ン （ヘスペレチン一 モノ グルコサイ ド） に変わっていた。
1 . 5 リ ッ トルの中間極性多孔性吸着樹脂 （ X A D - 7 ) が充填さ れ、 高濃度のエタノ ール水溶液で活性化しておいたカラムに上記酵 素処理ヘスペリ ジン溶液 （ B液） を通過させ、 次いで、 カラム容量 の 2倍量の水で洗浄してから 8 0 ( V / V ) <%エタ ノ ール水溶液 3 リ ッ トルで樹脂への吸着成分を脱着した。 脱着液中のエタ ノ ールを 除去してから、 凍結乾燥し固形物 （ B - r ) を得た。
この固形物 （ B — r ) には、 -モノ グルコ シルヘスペリ ジン力 8 1 重量 0 、 -モノ グルコ シルヘスペレチン力 1 8重量％、 その他の 成分が 1 重量％の量で含まれてお り、 またヘスペ リ ジ ンとヘスペレ チンは検出されなかった。
この固形物 （ B — r ) に 9 9 ( V / V ) %メ タノ ーノレ 1 0 0 m l を加えて 8 0 °Cで加熱溶解後、 室温下に放置し結晶を析出させた。 析出 した結晶は、 9 9 ( V / V ) %メ タノ ールで洗浄してから乾燥 させて固形物 （ B — r 一 c ) 1 2 gを得た。 この固形物 （ B — r 一 c ) には、 α -モノ グルコシルヘスペリ ジン力 9 8重量％、 β モ ノ グルコ シルヘスペレチン力 1 重量％、 その他の成分が 1 重量％の量 で含まれており、 またヘスペ リ ジンとヘスペレチンは検出されな力、 つた。
併せて結果を表 1 〜 2 に示す。
【実施例 2】
参考例 1 に記載の酵素処理ヘスペリ ジ ン溶液 （ A液） にグルコア ミ ラ一ゼ （グルコチーム， 長瀬産業 製） l g、 ヘスペリ ジナ一ゼ (ヘスペリ ジナ一ゼ 2号， 田辺製薬 製） 2 g、 セルラ一ゼ A < アマ ノ > 3 [天野製薬 （株） 製] 1 0 gを加え、 4 N -硫酸で p H
4. 0 に調整し、 5 5 °Cで 4 8 時間反応させた。
反応終了後、 酵素を加熱失活させてから濾過して酵素処理ヘスべ リ ジン溶液 （ C液） を得た。
C液を参考例 1 に記載の条件で H P L C分析したと こ ろ、 A液中 に存在していた α -グルコシルヘスペリ ジンは、 C液中では、 ほとん どが -モノ グルコシルヘスペリ ジンに変化し、 また Α液中に存在し ていた未反応ヘスペリ ジ ンは、 C液中ではほとんど （ 9 9 %以上） がヘスペレチ ンに変わっていた。
この C液を実施例 1 で行つ たよ う に、 1. 5 リ ツ トルの中間極性 多孔性吸着樹脂 （ X A D 7 ) で処理し、 凍結乾燥して固形物 （ C - r ) を得た。 この固形物 （ C — r ) には、 α -モノ グルコ シルヘスべ リ ジン力 8 5重量％、 /3 -モノ グルコシルヘスペレチ ン力 2重量％、 ヘスペレチ ンが 1 2重量％、 その他の成分が 1 重量％の量で含まれ、 ヘスペリ ジ ンは検出されなかっ た。
この固形物 （ C 一 r ) に 9 9 ( V / V ) %メ タ ノ 一ノレ 2 0 0 m 】 を加え 8 0 °Cで加熱溶解した後、 室温下に放置し、 結晶を析出させ た。 析出 した結晶は、 9 9 ( V / V ) %メ タ ノ ールで洗浄してから 乾燥させ固形物 （ C— r 一 c ) 8 gを得た。
この固形物 （ C— r — c ) には、 α -モノ グルコ シルヘスペ リ ジ ン 力 9 6重量％、 ；5 -モノ ダルコ シルヘスペレチ ンが 2重量％、 ヘスべ レチンが 1 重量％、 その他の成分が 1 重量％の量で含有され、 ヘス ペリ ジンは含まれていなかった。 .——
併せて結果を表 1 〜 2 に示す。
【比較例 1 】
参考例 1 の酵素処理ヘスペ リ ジン溶液 （ Α液） にグルコア ミ ラー ゼ （ダルコチーム， 長瀬産業 製） 1 . O gを加え、 4 N -硫酸で p H 4 . 0 に調整し、 5 5 °Cで 4 8 時間反応させた。
反応終了後、 酵素を加熱失活させてから濾過して酵素処理ヘスべ リ ジン溶液 （ D液） を得た。
D液を参考例 1 に記載の条件で H P L C分析したと ころ、 A液中 には存在していた α -ダルコシルヘスペリ ジ ンは、 D液中では、 ほと んどが -モノ グルコ シルヘスペリ ジンに変化し、 また Α液中には存 在していた未反応ヘスペリ ジンは、 D液中でも変化はなかっ た。
この D液を実施例 1、 2で行ったよう に 1 . 5 リ ッ トルの中間極 性多孔性吸着樹脂 （ X A D - 7 ) で処理し、 凍結乾燥して固形物 ( D - r ) を得た。
この固形物 （ D— r ) には、 α モノ グルコ シルヘスペ リ ジ ンが 7 6重量％、 ヘスペリ ジンが 2 3重量％、 その他の成分が 1 重量％の 量で含まれ、 /3 -モノ ダルコシルヘスペレチ ンとヘスペレチンは検出 されなかつた。
この固形物 （ D — r ) に、 実施例 1、 2 と同様に 9 9 ( V / V ) %メ タノール 1 0 0 m 1 を加え、 8 0 °Cで加熱したカ^ 固形物 （ D 一 r ) は一部しか溶解せず、 結晶を析出させて分取するのは困難で あった。 さ らに、 9 9 ( VZ V ) %メ タノ ール 1 0 0 m l を追加し 8 0 °Cで加熱したが、 固形物 （ D— r ) は一部しか溶解せず、 結晶 を析出させて α モノ グルコシルヘスペリ ジンを分取するのは困難で めった
併せて結果を表 1 〜 2 に示す。
【表 1 】
l 「酵素処理へスぺリ ジ ン中の成分重量比 （重量 1
Figure imgf000033_0002
【表 2 】
¾ 「結晶品の成分重量比 （重量 Ί
Figure imgf000033_0001

Claims

求 の 範 囲
1 .
α -ダルコ シルヘスペリ ジンとヘスペリ ジンとを含有する溶液に、 グルコア ミ ラーゼと α いラムノ シダ一ゼとを同時に、 または何れか 一方を先に して順次作用させ、
得られた混合物から -モノ グルコ シルヘスペリ ジ ンを析出分離し これを採取する こ とを特徴とする α -モノ ダルコ シルヘスペリ ジ ン高 含有物の製造方法。
2 .
α -グルコ シルヘスペリ ジンとヘスペリ ジンとを含有する溶液に、 グルコア ミ ラ一ゼと α -いラムノ シダ一ゼと - D -グルコシダーゼを 同時に、 または何れか一種を先に して順次作用させ、
得られた混合物から α -モノ グルコ シルヘスペリ ジ ンを析出分離し . これを採取する こ とを特徴とする -モノ グルコ シルヘスペ リ ジン高 含有物の製造方法。
3 .
低級アルコ一ル中で析出させる こ とによ り -モノ グルコ シルヘス ペリ ジ ン高含有物を分離し、 これを採取する こ とを特徴とする請求 項 1 または 2 に記載の方法。
4 .
-モノ グルコ シルヘスペ リ ジ ン高含有物が モノ グルコ シルへ スペ リ ジ ンを 8 5重量％以上の量で含むこ とを特徴とする請求項 1 〜 3 の何れかに記載の方法。
PCT/JP1998/000977 1997-03-24 1998-03-10 PROCESS FOR PRODUCING α-MONOGLUCOSYLHESPERIDIN-RICH SUBSTANCE WO1998042859A1 (en)

Priority Applications (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US09/194,190 US6048712A (en) 1997-03-24 1998-03-10 Process for producing α-monoglucosyl hesperidin-rich substance
EP98905832A EP0908524B1 (en) 1997-03-24 1998-03-10 Process for producing alpha-monoglucosylhesperidin-rich substance
DE69821428T DE69821428T2 (de) 1997-03-24 1998-03-10 Verfahren zur herstellung einer alpha-monoglucosylhesperidin-reichen substanz

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP9/69588 1997-03-24
JP6958897 1997-03-24

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO1998042859A1 true WO1998042859A1 (en) 1998-10-01

Family

ID=13407147

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP1998/000977 WO1998042859A1 (en) 1997-03-24 1998-03-10 PROCESS FOR PRODUCING α-MONOGLUCOSYLHESPERIDIN-RICH SUBSTANCE

Country Status (6)

Country Link
US (1) US6048712A (ja)
EP (1) EP0908524B1 (ja)
KR (1) KR100274927B1 (ja)
DE (1) DE69821428T2 (ja)
TW (1) TW521087B (ja)
WO (1) WO1998042859A1 (ja)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013018779A1 (ja) * 2011-08-01 2013-02-07 株式会社林原 α－グルコシルヘスペリジンの結晶とその用途

Families Citing this family (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2841472B1 (fr) * 2002-06-28 2006-02-24 Agronomique Inst Nat Rech Composition nutritionnelle ou therapeutique contenant le compose hesperidine ou l'un de ses derives
EP1771149A1 (en) * 2004-07-23 2007-04-11 The Procter and Gamble Company Skin care composition containing a flavonoid and vitamin b3
CN1988882A (zh) * 2004-07-23 2007-06-27 宝洁公司 基于基底的护肤制品
US20060018861A1 (en) * 2004-07-23 2006-01-26 Minghua Chen Skin care composition
CN1988881A (zh) * 2004-07-23 2007-06-27 宝洁公司 包含类黄酮和维生素b3的护肤组合物
ES2764221T3 (es) 2006-08-24 2020-06-02 Nestle Sa Absorción duradera de flavonoides
US20080261898A1 (en) * 2007-04-17 2008-10-23 Liao Heather H Composition and method for cancer treatment and prevention
FR2919501B1 (fr) * 2007-08-02 2010-12-31 Oreal Utilisation d'hesperidine ou de l'un de ses derives pour la prevention et/ou le traitement des peaux relachees
CN101815502B (zh) 2007-09-04 2013-10-09 欧莱雅 橙皮苷和微生物的组合在影响皮肤的屏障功能中的用途
FR2980360B1 (fr) 2011-09-27 2013-10-11 Oreal Utilisation cosmetique de l'hesperidine ou de l'un de ses derives dans la prevention et/ou le traitement des odeurs corporelles.
MY177500A (en) * 2014-03-03 2020-09-16 Hayashibara Co Glycosyl hesperetin and process for producing the same and uses thereof

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH037593A (ja) * 1989-06-03 1991-01-14 Hayashibara Biochem Lab Inc α―グリコシル　ヘスペリジンとその製造方法並びに用途

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3583894A (en) * 1968-03-29 1971-06-08 Us Agriculture Enzyme preparation of hesperetin dihydrochalcone glucoside
JPS5648849A (en) * 1979-09-24 1981-05-02 Takeda Chem Ind Ltd Method for improving quality of citrus food
GB8727223D0 (en) * 1987-11-20 1987-12-23 Unilever Plc Preparing l-rhamnose
DK0387042T3 (da) * 1989-03-08 1995-04-03 Hayashibara Biochem Lab Fremstilling og anvendelser af alpha-glycosyl-rutin
JP2816030B2 (ja) * 1991-03-27 1998-10-27 東洋精糖株式会社 モノグルコシルルチンの分離方法
SG54274A1 (en) * 1992-11-27 1998-11-16 Hoechst Ag Alpha-l-rhamnosidase for obtaining rhamnose a process for its preparation and its use
JP3536138B2 (ja) * 1994-09-12 2004-06-07 江崎グリコ株式会社 ヘスペリジンの結晶析出防止法並びにみかん又はみかん果汁を含む液状食品の白濁防止法
JP3833775B2 (ja) * 1996-06-26 2006-10-18 株式会社林原生物化学研究所 酵素処理ヘスペリジンおよびその製造方法ならびに酵素処理ヘスペリジンの使用方法
JP3155466B2 (ja) * 1996-07-03 2001-04-09 東洋精糖株式会社 水溶性ケルセチン配糖体含有物およびその製造方法

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH037593A (ja) * 1989-06-03 1991-01-14 Hayashibara Biochem Lab Inc α―グリコシル　ヘスペリジンとその製造方法並びに用途

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
See also references of EP0908524A4 *
SHUN YONEYA ET AL.: "Formation of Hesperidin Glycosides and Stabilization of Natural Pigments by Cyclodextrin Syntetases (in Japanese), Kometani T. et al., Synthesis of Hesperidin Glycosides by Cyclodextrin Glucanotransferase and Stabilization of the Natural Pigments (in English)", JOURNAL OF THE JAPANESE SOCIETY FOR FOOD SCIENCE AND TECHNOLOGY, vol. 42, no. 5, May 1995 (1995-05-01), pages 376 - 382, XP002968014 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013018779A1 (ja) * 2011-08-01 2013-02-07 株式会社林原 α－グルコシルヘスペリジンの結晶とその用途
JPWO2013018779A1 (ja) * 2011-08-01 2015-03-05 株式会社林原 α−グルコシルヘスペリジンの結晶とその用途
JP2017071655A (ja) * 2011-08-01 2017-04-13 株式会社林原 α−グルコシルヘスペリジンの結晶とその用途
JP2018080204A (ja) * 2011-08-01 2018-05-24 株式会社林原 α−グルコシルヘスペリジンの結晶とその用途

Also Published As

Publication number Publication date
US6048712A (en) 2000-04-11
KR100274927B1 (ko) 2000-12-15
TW521087B (en) 2003-02-21
KR19980080520A (ko) 1998-11-25
EP0908524A4 (en) 2002-02-20
EP0908524A1 (en) 1999-04-14
DE69821428T2 (de) 2004-12-16
EP0908524B1 (en) 2004-02-04
DE69821428D1 (de) 2004-03-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Williams et al. Novel monoterpene disaccharide glycosides of Vitis vinifera grapes and wines
JP3833775B2 (ja) 酵素処理ヘスペリジンおよびその製造方法ならびに酵素処理ヘスペリジンの使用方法
KR100377546B1 (ko) 효소적 방법에 의한 진세노사이드 컴파운드 케이의 제조방법
WO1998042859A1 (en) PROCESS FOR PRODUCING α-MONOGLUCOSYLHESPERIDIN-RICH SUBSTANCE
Grohmann et al. Acid-catalyzed hydrolysis of hesperidin at elevated temperatures
Bassanini et al. A Sustainable One‐Pot, Two‐Enzyme Synthesis of Naturally Occurring Arylalkyl Glucosides
JPWO2002022847A1 (ja) 精製アントシアニンの製造法および結晶性アントシアニン
JP3833811B2 (ja) α−モノグルコシルヘスペリジン高含有物の製造方法
JP3967563B2 (ja) ３”−α−モノグルコシルナリンジン含有組成物、その製造方法およびその利用方法
CN106543243A (zh) 一种红景天苷衍生物及其制备方法
JP3398463B2 (ja) 着色料及び／又はビタミンを含む食品等の安定化法
CA2348933A1 (en) Process for the enzymatic cleavage of rutinosides
JP4023539B2 (ja) 有効物質の抽出方法および精製方法
KR100218553B1 (ko) 진세노사이드 rg3의 제조방법
KR100186757B1 (ko) 20(에스)-진세노사이드 알에이치1 및 20(에스)-프로토파낙사트라이올의 제조방법
KR100444370B1 (ko) 나린지나제 효소를 이용한 진세노사이드 에프원의 제조방법
JP2011051933A (ja) α−グリコシルアントシアニン
KR100218552B1 (ko) 미량 진세노사이드의 제조방법
KR20220074338A (ko) 루틴글리코사이드의 제조방법 및 이를 포함하는 노화방지용 화장료 및 식품 조성물
CN113308506A (zh) 一种生物催化合成二氢杨梅素-7-葡萄糖苷的方法
WO2019045112A1 (ja) イノシトール誘導体の製造方法
KR20000045693A (ko) 진세노사이드 알지1의 제조방법
JPH1072481A (ja) フェノール化合物のルチノース配糖体の製造方法
JP2000333693A (ja) 配糖体より糖の遊離方法
JPH0466099A (ja) フラボノール配糖体の改質法

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): US

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): DE FR GB

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 09194190

Country of ref document: US

ENP Entry into the national phase

Ref country code: US

Ref document number: 1998 194190

Date of ref document: 19981211

Kind code of ref document: A

Format of ref document f/p: F

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 1998905832

Country of ref document: EP

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 1998905832

Country of ref document: EP

WWG Wipo information: grant in national office

Ref document number: 1998905832

Country of ref document: EP