JPH0466099A - フラボノール配糖体の改質法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 この発明は、フラボノール配糖体の改質法に関し、詳し
くはグルコース残基を転移させたクエルセチン配糖体に
ガラクトース残基を導入させてクエルセチン配糖体の改
質を図シ、食品業界、医薬品業界、香粧品業界での利用
の便宜を図るものである。

〔従来の技術〕

フラボノール配糖体を工業的に利用するに当っては二つ
の大きな問題点がある。その一つはフラボノール配糖体
が一般に水に難溶性の物質であることによる。もう一つ
の問題点はその起源を植物に依存するため、工業的に利
用するにあたってはフラボノールを高含有する植物等か
ら抽出されるルチン及びその知友分解物等の一部の７フ
ポノール類に限られていることである。それゆえ、フラ
ボノールに由来する抗酸化機能、紫外線吸収機能、その
他フラボノールの持つ有用な機能を産業上に利用するに
当って制約を受ける。フラボノール配糖体の水に対する
溶解度の問題点の解決法として、フラボノイドの一つで
あるルチンを一旦アルコール若しくは多価アルコールに
溶解させた後、無機顔料の粒子表面に微小結晶状に析出
させる方法が提案されている（特開昭６Ｏ−２０８９０
８）。

しかし、この場合もルチン及びクエルセチンは、結晶状
態となっているため、フラボノイドの持つ機能を充分に
発揮することができず、また、用途が限定される。この
ように取シ扱いの難しいルチンをシクロデキヌトリンで
包接化合物として水への溶解速度の改善を図る方法など
が知られているが、これらの方法は、水難溶性のフラボ
ノイドの根本的な水に対する溶解度の改善方法とはいえ
ない。これらの物質の改質法として、ルチンのフェノー
ル性水酸基に２−とドロキシエチル基を導入してトロキ
セルチン、に導く方法やルチン着しくはクエルセチンの
フェノール性水酸基に２．ｓ−ジヒドロキシプロピル基
またはホヌ、ワーー十基音導入する方法（特開平１−８
０８４７６）が提案されている。また、ルチンやルチン
に部分加水分解作用を有する酵素を作用させて得られ不
クエルセチン−３−モノグルコシド（以下、イソケルセ
チンと称す）にでん粉質の存在下糖転移活性を有する酵
素（ＥＣ２，４，１１９）を却いてブドウ糖を転移させ
て、改質を図る方法（特公昭５４−３２０７８、特開平
１−２１８２９８）なども提案されている。

〔発明が解決しようとする問題点〕

クエルセチンまたはルチンのアグリコン部のフェノール
性水酸基に２−ヒドロキシエチル基するいは２，８−ジ
ヒドロキシゾロビル基若しくはホスフェート基を導入し
てルチンの改質を図る方法は、フェル七チン骨格に由来
する共役係に電子的な影響を殆ど及ぼさないため、母体
化合物の紫外線吸収特性がほぼそのまま保持されている
。しかし、クエルセチン若しくはクエルセチン配糖体の
アグリコン骨格中のフェノール性水酸基に由来する抗酸
化特性が消失若しくは大幅な減少をきたすといった大き
な問題点がある。一方、ルチンまたはイソケルセチンに
糖転移活性を有する酵素を作用させてグルコース残基を
転移させた糖転移クエルセチン配糖体は、フェノール性
水酸基に基づく抗酸化特性を維持しつつ、かつ、母体化
合物の紫外線吸収特性を保持している。それゆえ、酸化
防止剤として食品添加物などに、また紫外線吸収剤とし
て日焼は防止化粧料などに配合され、はぼ満足すべき結
果を与えるが、食品加工時によく用いられるα−１，４
・ゲルカンマ／Ｌ／　）ヒドラーゼ（ＥＣ８，２，１，
２、以下β・アミラーゼと称す）およびα−１，４・グ
ルカングルコヒドラーゼ（ＥＣ８，２，１，８、以下グ
ルコアミアラーゼと称す）の作用により、糖鎖構造部が
部分加入分解を受けてクエルセチン配糖体組成が変化し
、それに伴って溶解度に変化をきたすといった問題点が
ある。本発明告は、これらの問題点を解消すると同時に
オリゴ糖鎖に由来する新しい機能を併せもつフラボノー
／ｌ／配糖体について鋭意検討をすすめてきた。

〔問題点を解決するための手段〕

本発明者は、上期問題点を濫みてクエルセチン配糖体の
持つ紫外線吸収機能や抗酸化性機能等の優れた長所は保
持しつつ、クエルセチン配糖体のα−１，４結合で構造
されるグルコース配鎖構造部に新たにガラクトース残基
を導入することにょシ改質を図る研究を推し進めた結果
、ガラクトース残基を転移させたクエルセチン配糖体が
安定であシ、且つ水溶性を発現することを見出し、本発
明に至ったものである。以下、詳細に説明する。

この発明に使用するフラボノール配糖体は、既゛に本出
願人が特許出願した方法（時開　平１−２１８２９３）
若しくはこれに準する方法でルチン及びインケルセチン
にでん粉質の存在下でグルコース残基転移活性を有する
酵素を作用させてα−１，４結合で構成されるグルコー
ス糖鎖構造を導入した一般式で示されるフラボノール配
糖体の単−物又は糖鎖長の異なる混合物が採用される。

また、これらの糖鎖長の異なるフラボノール配糖体混合
物のβ・アミラーゼ、グ〃コアミラーゼ等Ｏアミラーゼ
処理による糖鎖長を調整したものを用いてもよい。

本発明に用いるガラクトース源は、β・ガラクトシダー
ゼの基質となシ、ガラクトース残基の１分子以上が該ク
エルセチン配糖体に転移され得るものであればよく、例
えば、乳糖単独、乳糖に公知の方法（Ａｇｒｉｃ、　Ｒ
ｉａｌ、（ｈｅｍ、、　４３巻３０５８〜３０６１頁（
１９８４年））でガラクトース残基を転移させて得られ
るガラクトオリゴ糖あるいは乳糖を起源とする市販のガ
ラクトオリゴ糖、または大豆などの豆を起源とするガラ
クトオリゴ糖、その他が挙げられる。ガラクトース源の
添加量は、反応混合物全体に対して１〜８０重量％の量
でよく、望ましぐは１０〜７０重量％、よシ望ましくは
２０〜６０重量％程度の量がこの目的に好適である。

この発明に使用するβ−ガラクトシダーゼは、ｔ＜ｆ　
ｌス”ｊ　−キｘ　ラ：’　７−　（Ｂａｃ目１ｕｓ：
　ｃｉｒｃｕｌａｎｓ　）、バｆｌＶ７．　　マセラン
ス（Ｂ、ｍａｃｅｌａｎｓ）などのバチルス属、ラクト
バチルス　ブルガリカス（１，ａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕ
ｓ　ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）、ラクトバチルスラクチス
（１，，１ａｃｔｉｓ　）、ラクトバチルス　ズラン１
！　Ａ／　ム（Ｌ、ｐｌａｎｔａｌｕｍ　）等のラクト
バチルス属、エシェリヒア　コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈ
ｉａ　ｃｏｌｉ　）等のエシェリヒア属、ア７ベルギル
ス　オリーゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｏｒｙｚａｅ
　）、７　スヘＨギＨ７＝ガー（Ａ、ｎｉｇｅｒ　　）
等のアスペルギルス属、クリベロミセスラクチス（Ｋｌ
ｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅａ　１ａｃｔｉｓ　）、クリペロ
ミセヌ　フラギリヌ（Ｋ、　ｆｒａｇｉｌｉｓ　）　等
のクリベロミセス属、ストレプトコッカス　サーモフィ
ルス（５ｔｒｅｐｔＯＣＯＣＣｕＳ　ｔｈｅｒｍｏｐｈ
ｉｌｕｓ　）等のストレプトコツカス属、へりクス　ポ
マチア（ｌ（ｅｌｉｘ　ｐｏｍａｔｉａ）等のヘリクヌ
属、ベニシウム　クリソゲナム（ｐｅｎｉｃｉｌｉｕｍ
　ｃｒｙｓｐｇｅｎｕｍ）、ペニシリウム　ムルチカラ
−（ｐ、　ｍｕｌｔｉｃｏｌｏｒ　）等のペニシリウム
属、サツカロミセス　フラギリヌ（５ａｃｃｈａｒｏｍ
ｙｃｅｓ　ｆｒａｇｉｌｉｓ　）等のサツカロミセス属
、その他等の微生物を起源とするもの、ホラ貝（（ｈａ
ｌｏｎｉａ　ｌａｍｐａｓ　）等の貝類を起源とするも
の、ジャック　ビーン（和名：タチナタマメ、（ａｎａ
ｖａｌｉａ　ｅｎｓｉｆｏｒｍｉｓ　）などの植物を起
源とすルモノ、あるいは牛の肝蔵や哺乳動物の小腸を起
源とするものが知られておシ、いずれもこの発明に自由
に使用することができる。これらの酵素は、必ずしも精
製して使う必要はなく、通常は粗酵素で目的を達成しう
る。また、市販の酵素剤（例えば、大和化成株式会社製
、商品名ＢＩＯＬＡＣＴＡ　　Ｇ−１０、天野製薬株式
会社製、商品名ラクターゼＦ「アマノ」およびラクター
ゼ　ＹＬ「アマノ」株式会社ヤクルト本社製、商品名ラ
クターゼ　Ｙ−ＡＯ，に、Ｉ化成株式会社製商品名ラク
ターゼＰ、その他等）も使用することができる。また、
クエルセチン配糖体とガラクトース源を添加した培養液
に、β−ガラクトシダーゼを添加する代りに、糖転移活
性を有するβ−ガラクトシダーゼ生産菌を植菌し、発酵
法によシ糖転移反応を行うこともできる。さらに、β−
ガラクトシダーゼあるいはβ−ガラクトシダーゼを生産
する微生物を常法に従って固定化したものを使用して反
応を進めてもよい。これらのβ−ガラクトシダーゼは、
単一種の微生物、植物又は動物を起源とするものを用い
てもよく、起源の異なる２種以上の酵素を併用すること
もできる。また、β−ガラクトシダーゼ生産菌を２種以
上植菌して発酵法により糖転移反応を行ってもよい。β
−ガラクトシダーゼの使用量は、特に限定されるもので
はない。この酵素の使用量は、起源および酵素の剤形に
よって大きく変動する。例えば同一酵素を用いる場合で
も、酵素溶液として使用するか、あるいは固定化して用
いるかによってもその使用量は異なる。そのため、一義
的には決められないので一例を挙げて示すと、ＢＩＯＬ
ＡＣＴＡ　　Ｇ−１０を使用するときは通常１０〜２０
００単位／１基質程度の量が有利である。尚、酵素単位
については実施例において詳述される。また、酵素の活
性化剤として、必要に応じてＭｎ”、Ｍｇ　”、ｃ　ａ
　２”等の金属イオンを酵素と併用してもよい。その添
加量は通常微量でよく、反応混合系に対して０．１〜５
００　ｐｐｍの範囲から選択される。この転移反応にお
ける反応系のｐＨは、使用する酵素の至適ｐＨ付近が望
ましく、通常約２〜９の範囲から選択されるのがよい。

また、この転移における反応系の温度は、使用する酵素
の至適温度付近が望ましく、通常２０〜７０°Ｃの範囲
から選択されるのがよい。

このようにして、クエルセチン配糖体のα・ｌ、４結合
で構成されるグルコーヌ糖鎖構造部にガることかでき、
本発明の目的は達せられる。さらに、所望によシ反応系
をイオン交換樹脂又はイオン交換膜等による処理、ボー
ラヌポリマー構造ヲ有スる樹脂、シリカゲル、アルミニ
ウムオキシド、セルロース、その他等を吸着剤とする吸
着クロマトグラフ処理、活性度、アルキルシリ〃化シリ
カゲル又はアリールシリル化シリカゲル等を吸着剤とす
る逆相分配クロマトグラフ処理、あるいはその他の方法
によって精製してもよい。

〔この発明の作用及び効果〕

本発明によって得られたフラボノール配糖体の混合物は
、α−１，４結合で構成されるグルコースからなる糖鎖
構造を導入したクエルセチン配糖体にガラクトーヌ残基
が転移しておシ、水に対する溶解度が極めて高く、α−
１，４結合で構成されるグルコース鎖に作用して加水分
解するアミラーゼ群に対しても安定なため、それらの有
する色（相）、抗酸化性及び紫外線吸収性などの特性を
水系の溶媒中で各種目的に合せて有効に発揮させること
ができる。

参考例１ ルチン１０２を水２１に分類させ、ナリンギナーゼ製剤
（天野製薬株式会社製、商品名ナリンギナーゼ°ゞアマ
ノ”　）Ｉｆを加えて２４時間、６０°Ｃで保持した。

この系のｐＨは６であった。これを１０℃以下に冷却し
、イソケルセチンからなる析出物６ｆを得た。この析出
物５ｆとコーンスターチ８０ｆｔ−ｐＨ６，７の０．０
１Ｍリン水素二ナトリウムーリ、ン酸二水素ナトリウム
酸緩衝液５１に加えて均軍にし、これにシクロデキヌト
リングルカノトランスフェラーゼ製剤（天野製薬株式会
社製、商品名コンチザイム）２ｍｌを加えて５５℃で２
０時間保持した。この溶液２０μｌを純水１　ｇ／で希
釈し、下記の条件で高速液体クロマトグラフ分析を行っ
た結果、反応生成物はグルコース残基が１〜６個転移し
たインケルセチン誘導体の混合物で構成されていた。

カラム二マイクロボンダパック　０１８、カラム径４．
６　ｖｍ　、カラム長２５０ｍ＋溶謀：メタノール／ア
セトニトリル／酢酸／水−７，／１／１／１２ 流速：１ｇ／／分 検畠器：紫外・可視分光検呂器 測定波長：　８５１　ｎｍ 移したイソケルセチン誘、導体混合物１ｆとβ−アミラ
ーゼ製剤（ナガセ生化学工業株式会社製、商品名マルト
チーム　２０６）１０岬を水５０ｄｌに溶かし、希リン
酸水溶液でｐＨ５に調整したのち、６０°Ｃで５時間保
持した。この溶液１０μｌを純水１　ｗｌで希釈し、参
考例１と同一の方法で高速液体クロマトグラフ分析を行
った。その結果、β−アミラーゼ処理物は、グルコース
残基が３個以上付加した糖転移インケルセチン誘導体が
部分的に加水分解を受け、グルコース残基１個と２個転
移したイソケルセチン誘導体の混合物に変化していた。

参考例３ 参考例１の方法で調製したグルコ−７残基の転移したイ
ソケルセチン誘導体混合物ＩＰとグルコアミラーゼ製剤
（ナガセ生化学工業株式会社製、商品名、グルコチーム
）５１１ｇを水５０＋／に溶がして、希リン酸溶液でｐ
Ｈ５，Ｑに調整し、６０℃で５時間保持した。この溶液
１０μｌを純水１　ｓｔで希釈し、参考例１と同一の方
法で高速液体クロマトグラフ分析を行った。その結果、
グルコアミラーゼ処理物は、グルコース残基が２個以上
付加した糖転移イソケルセチン誘導体が部分的に加水分
解ヲ受け、グルコース残基が１個転移したイソケルセチ
ン誘導体に変化していた。

実験例−１ 純水にルチン、イソケルセチン、実施例１による本発明
品を溶解後、４℃で１週間放置したときの沈澱の有無及
びその量を観察する。

表中の記号 ：沈澱なし ＋：沈澱あシ ←：沈沈澱− 什←：沈澱非常に多い これらの著効はフェル七チン配糖体にグルコーヌ残基と
ガラクトース残基を導入することによシもたらされたも
のである。

実験例２ 実験例１による本発明品１ｆとグルコチーム５１１１ｐ
ヲＩ）Ｈ５の０．０５Ｍリン酸二水素ナトリウム−リン
酸水素二ナトリウム緩衝溶液５０ｇ／に溶かせ、６０°
Ｃで５時間保持した。この溶液１０μｌを純水１　ｇ／
で希釈し、高速液体クロマトグラフ分析を参考例１と同
一の条件で行った。その結果、酵素処理前と処理後のク
ロマトグラムには殆ど変化が認められなかった。この結
果はα−１，４グルコース糖鎖構造を導入したクエルセ
チン配糖体にガラクトース残基を導入した本発明品は、
アミラーゼ処理に対して安定化したことを証明している
。

以下に本発明の実施例を示す。

（β−ガラクトシダーゼ活性の測定） ０．１％ｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトグリコ
シドを含有する０、　０５　Ｍリン酸緩衝液（ｐＨは酵
素の至適ｐＨに調整する）　０．２　ｇ／に、０．０５
Ｍリン酸緩衝液に適度に希釈した酵素溶液（２〜５ミリ
単位）　０．１　ｍｌを加えて４０°Ｃで１５分反応さ
せた後、反応液にＩＭｉ酸ナトリウム液２　ｍｌを加え
て反応を止め、分光光度計を用いてＩＭｉ酸ナトナトリ
ウム液照として４２０ｎｍでの吸光度を測定し、次式に
よシ酵素単位を求める。

酵素単位−吸光度Ｘ０．０ＩＸ１／酵素濃度（２／　ｍ
ｌ　）。

尚、これらの条件下でのｐ−二トロフェノールの分子吸
光係数は１５，０００であって、上記式よシ求めた１酵
素単位は１分間光ｐｐ−ニトロフェニルーβ−Ｄ−ガラ
クトシドからｐ−ニトロフェノールの１μＭを遊離させ
る量に相当する。

（ガラクトース残基転移クエルセチン配糖体の分析法） 高速液体クロマトグラフィーにより、下記の条件で測定
した。

カラム二マイクロポンダパック　０１８、カラム径４．
６　ｍｍ　、カラム長２５０ＩＩＩＩ＋溶謀：メタノー
ル／アセトニトリル／酢酸／水！！７／１／１／１２ 流速：１ｇ／／分 検出器：紫外・可視分光検出器 測定波長：　８５１　ｎｍ 反応収率は次式で求めた。

算ピーク面積 尚、この測定条件では、原料クエルセチン配糖体のピー
クと反応生成物のピークは完全に分離した。

実施例１ 参考例１の方法で調製したグルコーヌ残基が１〜６個転
移したインケルセチン配糖体混合物２０？、乳糖２００
１を０．１　Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）１００ｍ／
に溶かせ、大和化成株式会社製バチルヌ　サーキュラン
ス由来のβ−ガラクトシダーゼ（酵素力価２０，０００
単位）１１を加えて６０°Ｃで４時間攪拌した。反応終
了後混合物を水１１で希釈し、スチレンージビニールペ
ンゼ、ン共重合体から々るポーラヌポリマー１０００ｇ
／を充填したカラムに１時間で通液し、次いでイオン交
換水５１を１．５時間で通液した。次いで、４０Ｖ／Ｖ
％メタノー１ｖ２１を１時間で通液して吸着物を溶出し
た。このメタノール液を濃縮して、黄色の固形物２５１
を得た。得られた固形物から１■を取りだし、これにイ
オン交換水１０ｇ＋／を加えて溶かし、ガラクトース残
基とグルコース残基の転移したイソケルセチン誘導体の
分析に供した。その結果、ガラクトース残基の転移生成
物は１５成分以上のフラボノール配糖体で構成され、原
料に相当するピークは殆ど消失していた。

この固形物１００＃を５％塩酸１５ｇ／に溶かして５時
間１００℃で加熱し、加水分解した。２０℃まで冷却後
５％水酸化ナトリウム液でＩ）Ｈ５まで中和し、冷蔵庫
で一夜装置した後、析出物と濾液に分割した。析出物は
クエルセチンの分析試料に、濾液は糖の分析に供した。

析出物と糖の分析は高速液体クロマトグラフを用いて下
記の条件で行った。

■析出物の分析 カフム：マイクロポンダパック　０１８、カラム径４．
６　ｍ　、カラム長２５０ｍ 溶謀：メタノール１５％酢酸水溶液−２／３流速：１ｇ
／／分 検出器：紫外・可視分光検出器 測定波長：　８５１１ｍ 分析の結果、ガラクトース残基とグルコース残基の転移
したクエルセチン配糖体に相当するピークは消失し、ク
エルセチンに相当する単一のピークを検出した。また、
濾液中のクエルセチン配糖体の分析を同一の条件で行っ
たが、ガラクトース残基とグルコニス残基の転移したク
エルセチン配糖体に相当するピークは消失していた。

■濾液の分析 カラム：化学修飾型アミノプロピルシリカ（東京化成工
業株式会社製；　Ｋａａｅｉｓｏｒｂ　ＬＣＮＨ２５ｕ
ｐｅｒ） カラム径４．６　ｗｓ　、カラム長２５０■溶謀ニアセ
トニトリル／水寓４／１ 流速：１ｍ／／分 検出器：示差屈折計 分析の結果、濾液からグルコースとガラクトースに相当
する２本のピークを検出した。

別途調整した標準液とのピーク面積の比較から、グルコ
ースとガラクトースの組成比を求めるとその比は８．５
：１．８であった。

高速液体クロマトグラフィー分析結果から明らかなよう
に、本発明品イソケルセチン誘導体のα−１，４結合か
らなるグルコース糖鎖構造部にガラクトース残基が１モ
ル以上転移したイソケルセチン誘導体であることは明ら
かである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 クェルセチン配糖体として一般式 ▲数式、化学式、表等があります▼ （ただし、Ｇ＾１＾ｃはグルコース残基を、Ｒはラムノ
   ース残基又は水素原子を、ｎは１〜６の整数を表わす。 また、グルコース残基とラムノース残基との結合は、６
   、１結合であり、グルコース残基とグルコース残基との
   結合はα・１、４結合である。）で示される１種又は２
   種以上の混合物に乳糖又はガラクトオリゴ糖の存在下で
   ガラクトース残基転移作用を有する酵素を作用させ、ガ
   ラクトース残基を導入することによるフラボノール配糖
   体の改質法。