WO1996007904A1 - Verfahren zur toxikologischen prüfung von werkstoffen, insbesondere kunststoffen, und vorrichtung zur durchführung des verfahrens - Google Patents
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Definitions
- the invention relates to a method according to the preamble of claim 1 and to an apparatus according to claim 7.
- articles from e.g. Plastic, but also ceramic or metal alloys which e.g. have direct and prolonged contact with living tissue as an implant.
- Examples are e.g. Endoprostheses, catheters, probes, pacemakers, heart valves, vascular prostheses, breast implants, but also sutures, adhesive trays, tooth replacement and many other articles.
- body tolerance must be ensured, in other words, the material used for the production must be physiologically harmless.
- plastics of particular interest in this connection are polymers which are predominantly considered to be inert and thus non-toxic. Possible causes of plastic toxicity are primarily secondary and can be attributed, for example, to material contamination, processing aids used in the production process, antioxidants, free residual monomers or else hydrolytic microbiological and other degradation products and thermal decomposition products.
- the toxicological testing of, for example, plastics is currently being carried out both in cell cultures (for example direct contact method, eluate method, agar overlay test) and in animal experiments (for example skin and mucous membrane test and muscle implant test on rabbits). By improving cell culture technology, in vitro methods for the toxicological investigation of materials have been used more and more in recent years.
- a disadvantage of the described method is that the morphological changes in the cells can only be observed after one to three days and early damage to the cells is not detected or is not detected with sufficient sensitivity. In addition, only non-specific cell damage can be detected with the known method.
- a further disadvantage is the subjective statement, which can only be quantified via a point system, and which is obtained with the described method.
- cells are used whose cell membrane contains arachidonic acid as an essential component and which have been labeled with [ J H] arachidonic acid before the test.
- the labeled cells are incubated with the same number of cells in a test batch in the presence of the material to be tested and in a parallel, material-free control batch. At defined times, the radioactivity is determined in the cell-free supernatant of the batches. A statement about the toxicity of the tested material can then be derived from the difference between the values measured for the test and the control approach.
- Arachidonic acid is an essential component of the lipid fraction of membranes in many cells.
- Membrane damage eg in the case of tissue inflammation, leads to the release of arachidonic acid.
- This fact has been known for a long time.
- Stark et al in "Alternative Methods in Toxicology 1" pages 179-203, 1983 described that hepatoma cells release previously incorporated [ * ⁇ ] arachidonic acid in the presence of, for example, n-butanol. From Chemical Abstracts 112 (1990): 212040u; Lamont GS et al .; Old. Methods Toxicol.
- human or animal and individual plant cell lines and unicellular organisms can be used. It is only important that the cells used contain arachidonic acid as an integral component in their membrane and can be labeled with [ 3 H] arachidonic acid with relatively little effort.
- the selection of suitable cells or the incorporation of [- ⁇ ] arachidonic acid into the cell membrane presents no problem for the person skilled in the art. It is conceivable that, for example, human monocytes, which can be obtained from human venous blood according to common methods, are used. The use of lymphocytes is also conceivable.
- the promyelocytic human cell line U937 is preferably used in the method according to claim 2. It is a cell line commonly used in virological experiments, e.g. at the European Collection of Animal Cell Cultures (ECACC), Center for Applied Microbiology & Research, Porion Down, Salisbury Wilts SP4 OJG, U.K. under the number ECACC: 850131440.
- ECACC European Collection of Animal Cell Cultures
- the marked cells are incubated in the presence of the material and without material.
- the radioactivity is measured in the cell-free supernatant of the respective approaches and related to one another.
- the radioactivity can be measured in a conventional liquid scintillation counter. consequences.
- the values in the test and control approaches are approximately the same. There is a slight toxic effect if the radioactivity in the cell-free supernatant of the test batch is not more than twice as high as in the control batch. Moderate to strong toxicity can be inferred from values that are more than twice as high.
- arachidonic acid such as phospholipids and fatty acids in general, tend to spread at phase boundaries due to their chemical and physical properties. It cannot therefore be excluded that part of the arachidonic acid released in the process according to the invention adsorbs on the surface of the material to be examined and also on the surface of the vessel in which the test is carried out. Such adsorption of released arachidonic acid could lead to slightly false negative test results in case of doubt.
- additional control approaches can be provided in which the adsorption of arachidonic acid on the surfaces of the material to be examined and also on the test vessel is determined separately or individually.
- a typical control approach could, for example, contain a cell-free solution containing arachidonic acid.
- a time-dependent measurement of the possible decrease in the arachidonic acid content in the solution could then be used to determine the adsorption on the respective surfaces and to take this into account later when evaluating the actual test series.
- Such control approaches should be provided in particular if new materials whose arachidonic acid binding and release behavior are still unknown are examined.
- the method according to the invention can be carried out, for example, in service laboratories. With appropriate equipment, all steps of the process can be carried out in such a laboratory. However, it is also possible to separate the individual process steps.
- cells labeled with [ 3 H] arachidonic acid are produced to a large extent in a special company and are supplied in storable form to, for example, companies that want to carry out the further steps of the method directly in-house . It is also conceivable, for example, that only the test and control batches are incubated directly in, for example, the plastics processing company and that the samples are evaluated centrally at another location.
- test is carried out with human cell lines.
- results obtained in this test come closest to human conditions and therefore provide a good prediction of the physical compatibility of the materials tested.
- the cells used in the test and labeled with [ 3 H] arachidonic acid are provided in lyophilized or cryopreserved form.
- lyophilized cells can also be stored over longer periods of time under appropriate conditions. It is sufficient at the beginning of the test to take up the lyophilized cells in, for example, cell culture medium or distilled water and to pipette them into the test and control batches. The test can then optionally begin immediately after a short pre-cultivation to reactivate the lyophilized cells. Carrying out the test is even easier if, as provided in claim 4, the cell cultures are already immobilized in the reaction vessels.
- claim 5 advantageously provides that the material to be tested is inserted into the test batch in a separate liquid-permeable vessel or in a suitable frame. In this way, a particularly simple separation of material and e.g. Cell culture medium possible.
- a last embodiment of the method provides that the test is carried out at different temperatures.
- Statements about the type of toxicity of the material can be derived from the test results obtained at different temperatures. If it turns out, for example, that identical values are measured at reaction temperatures of 4 ° C. and 37 ° C., it can be concluded that the toxic effect of the material is enzyme-independent. If, on the other hand, there is an increase in toxicity at 37 ° C., the cause for this can be enzyme activation.
- Further subclaims relate to a device for carrying out the method according to the invention. This device has at least one reaction vessel which contains an immobilized cell culture of a defined cell number. It is understood that these are also cells in which [ ⁇ H] arachidonic acid has previously been incorporated. After filling the reaction vessel with cell culture medium, the device is immediately ready for use.
- the cells are lyophilized or cryopreserved.
- a liquid-permeable container or frame can be inserted into the reaction vessel for receiving the material to be tested.
- reaction vessels are combined in one carrier.
- a common microtiter plate For example, are a common microtiter plate.
- the cells are then centrifuged in sterile 15 ml polystyrene centrifuge tubes at 200 g and 4 ° C for five minutes, washed twice under the same conditions with 5 ml of serum-free RPMI and resuspended in serum-free RPMI.
- the cell suspension set to 10 "cells / ml is then incubated in a new 260 ml cell culture bottle for one hour at 37 ° C.
- Example 2 Testing of reaction vessels for their membrane-toxic effect.
- the abbreviation MTF means membrane toxicity factor.
- the membrane toxicity factor is the quotient of the radioactivity measured in the different reaction vessels. In the present case, its size defines the degree of plastic toxicity. It can be seen here that reaction vessels made of polypropylene at 4 ° C. and also at 37 ° C. result in a significantly higher [ 3 H] arachidonic acid release in the cells cultivated in them. This leads to the conclusion that polypropylene is significantly more toxic than polystyrene, the toxic effect of polypropylene presumably being enzyme-independent.
- Example 3 Testing a vascular prosthesis for its mebrantoxic effect.
- a piece of a vascular prosthesis made of polyester was placed in a polystyrene tube, which is loaded with 1 ml of a cell suspension labeled with [ 3 H] arachidonic acid (Example 1), for one hour at 4 ° C. and another Incubated at 37 ° C for one hour.
- [ 3 H] arachidonic acid (Example 1)
- Example 1 A piece of a vascular prosthesis made of polyester (surface area approx. 3 mm ⁇ ) was placed in a polystyrene tube, which is loaded with 1 ml of a cell suspension labeled with [ 3 H] arachidonic acid (Example 1), for one hour at 4 ° C. and another Incubated at 37 ° C for one hour.
- the [H] arachidonic acid release in the cell culture supernatant was determined and compared with the release in the control batches (cells without addition of the test material). The results are shown in Tables 2a and 2b.
- test batch containing the vascular prosthesis material shows no increased [ 3 H] arachidonic acid release compared to the polystyrene tube serving as the control batch. It can be concluded from this that the tested vascular prosthesis material is harmless with regard to its membrane toxicity.
- the test item was reaction vessels made of polypropylene.
- the specimen surface was 15.30 and 60 mm.
- the reaction tubes were placed in 1 ml polystyrene tubes
- test specimen with the 15 mm 2 surface area released 247 cpm / ml [ 3 H] arachidonic acid.
- test specimen For the 30 mm 2 test specimen it was already 802 cpm / ml and for the 60 mm 2 test specimen the value was 3789, which documents the relationship between the test result and the test specimen surface.
- polystyrene has no or negligible toxic effects. It is therefore advisable to use a polystyrene tube as a control when testing different reaction vessels. If materials added to the batch are to be tested, then it makes sense to use polystyrene reaction vessels.
- Another, possibly interesting application of the method according to the invention is to check individual batches of materials for inhomogeneities.
- Preliminary tests have shown that, for example, plastic articles in a batch have hidden inhomogeneities which may play a role in the biocompatibility. This may be due to the fact that the additive materials used in the production of plastics are distributed differently and then occur in the articles made from the plastics at different concentrations.
- the inventive Methods therefore also contribute to determining inhomogeneities within a batch of, for example, plastic articles and, if appropriate, to making standardization possible.
- reaction vessels 11a and 11b each contain a suspension of U937 cells 12 labeled with [ 3 H] arachidonic acid in nutrient solution (for example RPMI) 13.
- a cover 14 is provided to cover the reaction vessels 11a, 11b.
- an insert 15 which has two separate containers 17a and 17b which are provided with liquid passages 16 and can be inserted into the reaction vessels 11a, 11b. If desired, the material to be tested can now be entered into the container. In the case shown, there are several plates 18 e.g. a plastic, which are arranged in the container 17a. The test batch is thus incubated in the reaction vessel 11a, while the control is incubated in the reaction vessel 11b, the container 17b of which remains empty.
- the liquid passages 16 can be dimensioned such that they do not allow cells to pass through. In this case, one selectively measures the toxic effect of the substances which are released from the material to be examined to a surrounding medium. If the liquid wedge passages are made larger (cell-permeable), the toxic effect, which can be attributed to direct surface contact of the cells with the material, may also be measured.
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Abstract
Ein Verfahren zur toxikologischen Prüfung von Werkstoffen, insbesondere Kunststoffen, bei dem Zellen unter definierten Reaktionsbedingungen zusammen mit dem zu prüfenden Werkstoff in Flüssigkeitsansätzen inkubiert werden und anhand der Reaktion der Zellen auf den Grad der Toxizität des Werkstoffes zurückgeschlossen wird, ist dadurch gekennzeichnet, daß Zellen eingesetzt werden, deren Zellmembranen Arachidonsäure als essentiellen Baustein enthalten und in deren Membranen zuvor [3H]Arachidonsäure eingebaut worden ist, die markierten Zellen in einem Testansatz in Gegenwart des zu prüfenden Werkstoffes und in einem werkstofffreien Kontrollansatz inkubiert werden, wobei Testansatz und Kontrollansatz auf gleiche Zellzahlen eingestellt sind, zu definierten Zeiten im zellfreien Überstand der Ansätze die Radioaktivität bestimmt wird, und aus dem Unterschied zwischen den für den Test und den Kontrollansatz gemessenen Werten eine Aussage über die Toxizität des geprüften Materials abgeleitet wird.
Description
Verfahren zur toxikologischen Prüfung von Werkstoffen, insbeson¬ dere Kunststoffen, und Vorrichtung zur Durchführung des Verfah¬ rens.
Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren nach dem Oberbegriff des Anspruch 1 sowie auf eine Vorrichtung nach Anspruch 7.
Insbesondere auf dem medizinischen Sektor werden zunehmend Ar¬ tikel aus z.B. Kunststoff, aber auch Keramik oder Metallegierungen gefertigt, die z.B. als Implantat unmittelbaren und längeren Kontakt mit lebendem Gewebe haben. Beispiele sind z.B. Endoprothesen, Katheter, Sonden, Herzschrittmacher, Herzklappen, Gefäßprothe- sen, Brustimplantate aber auch Nahtmaterial, Haftschalen, Zahner¬ satz und viele andere Artikel mehr. Bei allen diesen Artikeln muß die Körperverträglichkeit gewährleistet sein, mit anderen Worten, der zur Herstellung verwendete Werkstoff muß physiologisch unbe¬ denklich sein.
Bei den in diesem Zusammenhang besonders interessanten Kunst¬ stoffen handelt es sich um Polymere, die überwiegend als inert und damit untoxisch gelten. Ursachen einer eventuellen Kunst- stofftoxizität sind hauptsächlich sekundär und können z.B. auf Materialverunreinigungen, im Herslellungsprozeß eingesetzte Ver¬ arbeitungshilfsmittel, Antioxidantien, freie Restmonomere oder auch hydrolytische mikrobiologische und sonstige Abbauprodukte sowie thermische Zersetzungsprodukte zurückzuführen sein.
Gegenwärtig wird die toxikologische Prüfung von z.B. Kunststoffen sowohl in Zellkulturen (z.B. Direktkontakt-Methode, Eluatmetho- de, Agar-Overlay-Test) als auch im Tierversuch (z.B. Haut- und Schleimhautlest sowie Muskelimplantattest am Kaninchen) durchge¬ führt. Durch Verbesserung der Zellkulturtechnik sind in den letzten Jahren verstärkt In-vitro-Methoden für die toxikologische Untersu¬ chung von Werkstoffen eingesetzt worden. Ein derartiges Untersu¬ chungsverfahren ist z.B. in der Deutschen Oplikerzeitung (DOZ) Nr. 3 1982 auf Seite 96 f beschrieben. Hier werden Kontakllin- senwerksloffe auf Polymerbasis auf ihre Eignung untersucht. Dazu werden Zellkulturen in direktem Oberflächenkontakt mit den zu un¬ tersuchenden Polymeren inkubiert und über einen längeren Zeil¬ raum der morphologische Zustand der Zellen mikroskopisch beob¬ achtet. In Abhängigkeit von dem Zellzustand kann dann meist ge¬ nauer als im Tierversuch auf den Grad der Toxizität des getesteten Polymerwerkstoffes zurückgeschlossen werden.
Nachteilig an dem beschriebenen Verfahren ist allerdings, daß die morphologischen Veränderungen der Zellen erst nach ein bis drei Tagen zu beobachten sind und frühzeitig auftretende Zell¬ schädigungen nicht oder nicht ausreichend empfindlich erfaßt wer¬ den. Außerdem können mit dem bekannten Verfahren nur unspezifische Zellschädigungen erfaßt werden. Ein weilerer Nach¬ teil ist die subjektive und nur über ein Punktesystem quantifizier¬ bare Aussage, die mit der beschriebenen Methode erhalten wird.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, ein Verfahren zu schaffen, das die von Werkstoffen an lebenden Zellen ausgelösten pathobiochemischen Mechanismen empfindlich, objektiv und syn¬ chron zum Schädigungsbild in vivo erfaßt und darüber hinaus fein differenzierbare quantitative Aussagen liefert. Eine weitere Aulgabe der Erfindung ist es, eine Vorrichtung bereitzustellen, mit der sich das Verfahren in besonders einfacher Weise durchführen läßt.
Gelöst werden diese Aufgaben mittels eines Verfahrens, das die kennzeichnenden Merkmale des Anspruches 1 enthält, sowie mit einer Vorrichtung gemäß Anspruch 7.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren werden Zellen eingesetzt, deren Zellmembran Arachidonsäure als essentiellen Baustein ent- halten und die vor der Prüfung mit [JH] Arachidonsäure markiert worden sind. Die markierten Zellen werden in einem Testansatz in Gegenwart des zu prüfenden Werkstoffes und in einem parallelen werkstofffreien Kontrollansatz mit gleichen Zellzahlen inkubiert. Zu definierten Zeiten wird im zellfreien Überstand der Ansätze die Radioaktivität bestimmt. Aus dem Unterschied zwischen den für den Test und den Kontrollansatz gemessenen Werten kann dann eine Aussage über die Toxizität des geprüften Werkstoffes ab¬ geleitet werden.
Arachidonsäure ist essentieller Bestandteil der Lipidfraktion von Membranen vieler Zellen. Membranschädigungen, z.B. bei Gewe¬ beentzündung, führen zu einer Freisetzung von Arachidonsäure. Diese Tatsache ist bereits seit längerem bekannt. So haben z.B. Stark et al in "Alternative Methods in Toxicology 1" Seiten 179 - 203, 1983 beschrieben, daß Hepatomzellen in Gegenwart von z.B. n-Butanol zuvor eingebaute [*Η] Arachidonsäure freisetzen. Aus Chemical Abstracts 112 (1990): 212040u; Lamont G.S. et al.; Al¬ tern. Methods Toxicol. 1989, 7 (In Vitro Toxicol: New Dir.) 175- 181 und Chemical Abstracts 105 (1986): 19967d; De Leo V.A. et al.; Altern. Methods Toxicol. 1985, 3 (In Vitro Toxicol.), 467-481 sind Verfahren bekannt, bei denen die Membrantoxizität von Deter- genzien gemessen wird. Hierbei werden arachidonsäuremarkierte Zellen in Gegenwart von Detergenzien inkubiert und danach die Freisetzung der Arachidonsäure gemessen.
Überraschend wurde nun festgestellt, daß eine Freisetzung von [-*H]Arachidonsäure nicht nur in Gegenwart der oben zitierten be¬ kannten membrantoxischen Substanzen erfolgt, sondern erfindungs¬ gemäß auch in Gegenwart von festen Werkstoffen meßbar ist, wobei sogar darüber hinaus ein direkter Kontakt zwischen den
Zellen und dem Werkstoff nicht gegeben sein muß. Diese Beobachtung war vor allen Dingen deswegen überraschend, weil z.B. bei dem relativ inerten Kunststoff nur geringe Oberflächen¬ wechselwirkungen mit einem umgebenden zellhaltigen Medium zu erwarten sind und Kunststoffe per se in der Regel nur eine äußerst geringe toxische Wirkung haben. Basierend auf dieser Beobachtung wurde das erfindungsgemäße Verfahren entwickelt, das erstmalig unter besonderer Berücksichtigung der Membrantoxizität mit guter Reproduzierbarkeil eine differenzierte quantitative toxikologische Bewertung auch von nur geringfügig unterschiedlichen Werkstoffen erlaubt.
In dem erfindungsgemäßen Verfahren können menschliche bzw. tie¬ rische sowie einzelne pflanzliche Zellinien und einzellige Organis¬ men eingesetzt werden. Wichtig ist lediglich, daß die eingesetzten Zellen in ihrer Membran als integralen Bestandteil Arachidonsäure enthalten und mit relativ geringem Aufwand mit [3H]Arachidon- säure markiert werden können. Die Auswahl geeigneter Zellen bzw. der Einbau von [-Η] Arachidonsäure in die Zellmembran stellt für den Fachmann keinerlei Problem dar. Denkbar ist, daß z.B. humane Monozyten, die nach gängigen Mehtoden aus humanem Venenblut gewonnen werden können, eingesetzt werden. Denkbar ist auch die Verwendung von Lymphozyten.
Bevorzugt wird in dem Verfahren gemäß Anspruch 2 die promyelo- zytische humane Zellinie U937 eingesetzt. Es handelt sich dabei um eine gängigerweise, in virologischen Experimenten verwendete Zellinie, die z.B. bei der European Collection of Animal Cell Cul- tures (ECACC), Centre for Applied Microbiology & Research, Porion Down, Salisbury Wilts SP4 OJG, U.K. unter der Nummer ECACC:850131440 bezogen werden kann.
Die markierten Zellen werden in Gegenwart des Werkstoffes und ohne Werkstoff inkubiert. Zu vorgegebenen Zeiten wird die Radio¬ aktivität im zellfreien Überstand der jeweiligen Ansätze gemessen und zueinander in Beziehung gesetzt. Die Messung der Radioakti¬ vität kann in einem herkömmlichen Liquid Scintillation Counter er-
folgen. Bei nichttoxischen Werkstoffen sind die Werte im Test- und im Kontrollansatz etwa gleich. Leichte toxische Wirkung liegt vor, wenn die Radioaktivität im zellfreien Überstand des Testansatzes nicht mehr als doppelt so hoch wie im Kontrollansatz ist. Auf mitt¬ lere bis starke Toxizität läßt sich aus Werten schließen, die mehr als doppelt so hoch sind.
Um vergleichbare Werte zu erhalten, ist es erforderlich, daß die Zellzahlen in dem Test- und dem Kontrollansatz übereinstimmen. Auch dies läßt sich ohne Probleme von einem Fachmann bewerk¬ stelligen.
Ein weiteres Problem kann allerdings darin bestehen, daß Arachi¬ donsäure, wie generell Phospholipide und Fettsäuren aufgrund ihrer chemischen und physikalischen Eigenschaften dazu neigen, sich an Phasengrenzen auszubreiten. Es kann daher nicht ausgeschlossen werden, daß ein Teil der im erfindungsgemäßen Verfahren frei¬ gesetzten Arachidonsäure an der Oberfläche des zu untersuchenden Werkstoffes und auch an der Oberfläche des Gefäßes, in dem der Test durchgeführt wird, adsorbiert. Eine derartige Adsorption von freigesetzter Arachidonsäure könnte im Zweifelsfall zu geringfügig falsch negativen Untersuchungsergebnissen führen. Vor Durchfüh¬ rung einer Testreihe (aber auch selbstverständlich parallel dazu) können daher zusätzliche Kontrollansätze vorgesehen werden, in denen die Adsorption von Arachidonsäure an den Oberflächen des zu untersuchenden Werkstoffes und auch des Untersuchungsgefäßes getrennt oder einzeln ermittelt wird. Ein typischer Kontrollansatz könnte z.B. eine zellfreie arachidonsäurehaltige Lösung enthalten. Über eine zeitabhängige Messung der eventuellen Abnahme des Arachidonsäuregehaltes in der Lösung könnte man dann die Ad¬ sorption an den jeweiligen Oberflächen bestimmen und später bei der Auswertung der eigentlichen Testreihen berücksichtigen. Der¬ artige Kontrollansätze sollten insbesondere dann vorgesehen wer¬ den, wenn neue, in ihren Arachidonsäure-Bindungs- und Freisetzungsverhalten noch unbekannte Werkstoffe untersucht wer¬ den.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann z.B. in Dienstleistungslabo¬ ren durchgeführt werden. Bei entsprechender Ausstattung können alle Schritte des Verfahrens in einem solchen Labor durchgeführt werden. Es ist aber auch möglich, die einzelnen Verfahrensschritte aufzutrennen. So ist es z.B. denkbar, daß mit [3H]Arachidonsäure markierte Zellen in größerem Umfang in einem Spezialbetrieb her¬ gestellt werden und in lagerfähiger Form an z.B. Betriebe abge¬ geben werden, die die weiteren Schritte des Verfahrens direkt bei sich im Hause durchfuhren wollen. Denkbar ist es z.B. auch, daß nur die Inkubation der Test- und Kontrollansätze direkt in z.B. dem kunststoffverarbeitenden Betrieb erfolgt und die Proben zentral an einem anderen Ort ausgewertet werden.
Ausgestaltungen der Erfindung sind in den Unteransprüchen ge¬ schützt.
Nach Anspruch 2 ist vorgesehen, daß die Prüfung mit menschlichen Zellinien erfolgt. Die bei dieser Prüfung gewonnenen Ergebnisse kommen den Verhältnissen beim Menschen am nächsten und erlau¬ ben daher eine gute Voraussage über die Körperverträglichkeit der geprüften Werkstoffmaterialien.
Weitere Ausgestaltungen der Erfindung zielen auf eine Erleichte¬ rung bei der Durchführung des Verfahrens.
So ist nach Anspruch 3 vorgesehen, daß die bei der Prüfung einge¬ setzten, mit [3H]Arachidonsäure markierten Zellen in lyophiliserler oder kryokonservierter Form bereitgestellt werden. Z.B. lyophili- sierte Zellen lassen sich unter entsprechenden Bedingungen auch über längere Zeiträume lagern. Es reicht, zu Beginn der Prüfung die lyophilisierten Zellen in z.B. Zellkulturmedium oder destillier¬ tem Wasser aufzunehmen und in die Test- und Kontrollansätze zu pipettieren. Die Prüfung kann dann gegebenenfalls nach einer kur¬ zen Vorkultivierung zur Reaktivierung der lyophilisierten Zellen unmittelbar beginnen.
Noch einfacher gestaltet sich die Durchführung der Prüfung, wenn, wie in Anspruch 4 vorgesehen, die Zellkulluren bereits in den Re¬ aktionsgefäßen immobilisiert sind. Zur Durchführung der Prüfung reicht es hier aus, die z.B. Nährlösung in die Reaktionsgefäße zu pipettieren und dann den zu prüfenden Werkstoff zuzusetzen. Ein weiterer Vorteil besteht darin, daß bei entsprechender Ausrüstung der Reaktionsgefäße die Immobilisierung der Zellen über den ge¬ samten Prüfungsverlauf erhalten bleiben kann. Die zur Auswertung erforderlichen zellfreien Überstände können dann (ohne Zentrifu- gation) direkt aus den Reaktionsgefäßen entnommen werden.
Wie oben gesagt, ist es für eine korrekte Durchführung der Prüfung erforderlich, daß die ausgewertete Probe aus dem zellfreien Über¬ stand stammt, also keine Zellen mehr enthält. Um gleiche Be¬ dingungen zwischen Test- und Kontrollansatz herzustellen, wird allerdings auch anzustreben sein, daß die zu messende Probe des Teslansatzes auch keine Anteile des zu prüfenden Werkstoffes mehr enthält. Je nachdem, wie die Werkstoffprobe geartet ist, Plättchen, Pulver etc., kann es unter Umständen erforderlich sein, daß auch hier ein ZentrifugationsschriU zur Abtrennung durchgeführt werden muß. In diesem Zusammenhang sieht Anspruch 5 in vorteilhafter Weise vor, daß der zu prüfende Werkstoff in einem separaten flüs¬ sigkeitsdurchlässigen Gefäß oder einem geeigneten Rahmen in den Testansatz eingesetzt wird. Auf diese Weise ist eine besonders ein¬ fache Separierung von Werkstoff und z.B. Zellkulturmedium mög¬ lich.
Eine letzte Ausgestaltung des Verfahrens sieht schließlich vor, daß der Test bei unterschiedlichen Temperaturen durchgeführt wird. Aus den bei unterschiedlichen Temperaturen gewonnenen Prü¬ fungsergebnissen lassen sich Aussagen über die Art der Toxizität des Werkstoffes herleiten. Stellt sich z.B. heraus, daß z.B. bei Re¬ aktionstemperaturen von 4° C und 37° C identische Werte gemes¬ sen werden, dann kann man darauf schließen, daß die toxische Wirkung des Werkstoffes enzymunabhängig ist. Zeigt sich dagegen eine Steigerung der Toxizität bei 37° C, so kann die Ursache hier¬ für eine Enzymaktivierung sein.
Weitere Unteransprüche betreffen eine Vorrichtung zur Durch¬ führung des erfindungsgemäßen Verfahrens. Diese Vorrichtung weist mindestens ein Reaktionsgefäß auf, das eine immobilisierte Zellkultur definierter Zellzahl enthält. Es versteht sich, daß es sich auch hierbei um Zellen handelt, in die zuvor [^H]Arachidonsäure eingebaut worden ist. Nach Füllung des Reaktionsge laßes mit Zell¬ kulturmedium ist die Vorrichtung sofort einsatzbereit.
Um die Lagerfähigkeit derartiger Vorrichtungen zu erhöhen, kann gemäß Anspruch 8 vorgesehen sein, daß die Zellen lyophilisiert oder kryokonserviert sind.
Gemäß Anspruch 9 ist vorgesehen, daß ein in das Reaktionsgefäß einsetzbarer flüssigkeitsdurchlässiger Behälter oder Rahmen zur Aufnahme des zu prüfenden Werkstoffes vorgesehen ist. Die Vor¬ teile wurden bereits weiter oben diskutiert.
Eine letzte Ausgestaltung sieht schließlich vor, daß mehrere Reakti¬ onsgefäße in einem Träger zusammengefaßt sind. Es kann sich z.B. um eine übliche Mikrotit erplatte handeln.
Im folgenden soll anhand von mehreren Beispielen die Durchfüh¬ rung des Verfahrens erläutert werden. Weiterhin wird in einer Ab¬ bildung eine besonders bevorzugte Ausführung der erfindungs¬ gemäßen Vorrichtung dargestellt.
Beispiele 1: Herstellung von [-ΗlArachidonsäure-markierten Zel¬ len.
10 ml einer Suspension von U937-Zellen mit einer Zelldichte von 2 - 3 x 10^ Zellen/ml in 18 ml RPMI 1640-Medium werden in eine 260 ml Polystyrenzellkulturflasche eingesät. Nach Zugabe von 2 ml fetalem Kälberserum wird für zwei Tage im Begasungsbrutschrank (5 % C09, 95 % Luft) bei 37° C inkubiert. Danach ist etwa eine Zellkonzentration von 10° Zellen/ml verfügbar.
Die Zellen werden dann in sterilen 15 ml-Polystyren-Zentri- ugenröhrchen bei 200 g und 4° C fünf Minuten zenlrifugiert, zweimal unter gleichen Bedingungen mit je 5 ml serumfreiem RPMI gewaschen und in serumfreiem RPMI resuspendiert. Die auf 10" Zellen/ml eingestellte Zellsuspension wird dann in einer neuen 260 ml Zellkullurflasche eine Stunde bei 37° C inkubiert. Danach werden pro 27 ml Zellsuspension 3 ml fetales Kälberserum und 30 μl einer 100 μCi/ml enthaltenden [3H]Arachidonsäurelösung zuge¬ geben. Zum Einbau der [3H] Arachidonsäure in die Zellmembran werden die Zellen dann weitere 24 Stunden bei 37° C inkubiert. Nach Beendigung der Inkubation werden die Zellen, wie oben be¬ schrieben, zenlrifugiert und zweimal mit serumfreiem, auf 4° C temperiertem RPMI gewaschen. Das mit [3H] Arachidonsäure mar¬ kierte Zellsediment wird schließlich bei 4° C in 40 ml serumfreiem RPMI in einem sterilen Polystyrengefäß resuspendiert.
Beispiel 2: Prüfung von Reaktionsgefäßen auf ihre membran¬ toxische Wirkung.
Getestet wurden 10 ml Reaktionsgefäße aus Polystyren und Poly¬ propylen. In die Reaktionsgefäße wurden jeweils 1 ml der gemäß Beispiel 1 hergestellten markierten Zellsuspension gegeben. An¬ schließend erfolgte eine Inkubation in serumfreiem RPMI für eine Stunde bei 4° C und anschließend 24 Stunden bei 37° C. Nach Ende der Inkubation bei 4° C wurde eine Charge Röhrchen fünf Minuten bei 4° C und 200 g zentrifugiert. Je 0,5 ml des Über¬ standes sowie 4,5 ml Szintillator wurden in ein Szintilla- tionsmeßgefäß gegeben und vermischt. Danach erfolgte die Mes¬ sung im Szintillationszähler. Die dabei ermittelte Radioaktivität wurde auf Impulse pro Minute und 0,5 ml (cpm/0,5ml) umge¬ rechnet.
Entsprechend wurde nach einer Stunde Inkubationszeit bei 37° C eine weitere Probe genommen und ausgewertet. Die Ergebnisse der beiden Probennahmen sind in den Tabellen la und lb wieder¬ gegeben.
Tabelle la
[3H]Arachidonsäure-Freisetzung nach einstündiger Inkubation von U937-Zellen bei 4° C in Polypropylen(PP)- und Polystyren(PS)-Ge- fäßen
Versuch Material Einzelwerle Mittelwerte MTF Nr. cpm/0,5 ml cpm/0,5 ml PP/PS
Polystyren 217,0
270,7 219,6
271,2
1,82
Polypropylen 401,7
417,3 399, 1
378,2
Polystyren 155,6
136,8 140,4
128,8
1,67
Polypropylen 196,6
206,6 234,0
298,8
Polystyren 270,2
267,3 277,8
295,9
1,66
Polypropylen 482,5
457,1 460,0
440,4
Tabelle lb
[JH]Arachidonsäure-Freisetzung nach einstündiger Inkubation von U937-Zellen bei 37° C in Polypropylen(PP)- und Polysiyren(PS)- Gefäßen
Versuch Material Einzelwerte Mittelwerte MTF Nr. cpm/0,5 ml cpm/0,5 ml PP/PS
Polystyren 382,1
349,0 353,8
330,2
1,65
Polypropylen 590,2
583,7 562,7
514,2
Polystyren 239,7
250,6 249,2
260,3
1,67
Polypropylen 328,1
263,0 282,4
256,2
Polystyren 228,1
440,8 417,5
429,6
1,36
Polypropylen 414,1
635,8 542,7
578,1
Die Abkürzung MTF bedeutet Membrantoxizitätsfaktor. Der Mem- brantoxizilätsfaktor ist der Quotient aus der in den unterschiedli¬ chen Reaktionsgefäßen gemessenen Radioaktivität. Seine Größe de¬ finiert im vorliegenden Fall den Grad der Kunststofftoxizität. Man erkennt hier, daß Reaktionsgefäße aus Polypropylen bei 4° C und auch bei 37° C eine deutlich höhere [3H]Arachidonsäure-Freiset- zung bei den in ihnen kultivierten Zellen bewirken. Dies läßt den Schluß zu, daß Polypropylen im Vergleich zu Polystyren deutlich toxischer ist, wobei die toxische Wirkung von Polypropylen ver¬ mutlich enzymunabhängig ist.
Beispiel 3: Prüfung einer Gefäßprothese auf ihre mebrantoxische Wirkung.
Ein Stück einer Gefäßprothese aus Polyester (Oberfläche ca. 3 mm^) wurde in einem Polystyrenröhrchen, das mit 1 ml einer mit [3H]Arachidonsäure markierten Zellsuspension (Beispiel 1) be¬ schickt ist, eine Stunde bei 4° C und eine weitere Stunde bei 37° C inkubiert. Jeweils am Ende der einstündigen Inkubationen bei 4° C und bei 37° C wurde die [ H]Arachidonsäure-Freiselzung im Zell- kulturüberstand bestimmt und mit der Freisetzung in den Kon¬ trollansätzen (Zellen ohne Zusatz des Testmaterials) verglichen. Die Ergebnisse werden in den Tabellen 2a und 2b wiedergegeben.
Tabelle 2a
[ H]Arachidonsäure-Freisetzung nach einstündiger Inkubation von , U937-Zellen in Polystyrenröhrchen (PS) mit und ohne Testpräparat (Gefäßprothese, GP) bei 4° C
Versuch Material Einzelwerle Mittelwerte MTF Nr. cpm/0,5 ml cpm/0,5 ml PP/PS
Polystyren 180,0
171,3 165,6
145,8
0,99
Gefäßprothese 176,0
156,7 165,5
163,9
Polystyren 173,0
142,7 165,5
204,0
1,02
Gefäßprothese 183,1
170,3 169,4
154,8
Polystyren 243,2
223,7 223,9
204,9
0,71
Gefaßprothese 152,0
177,2 158,7
147,0
Tabelle 2b
•2
[-ΗjArachidonsäure-Freisetzung nach einstündiger Inkubation von U937-Zellen in Polystyrenröhrchen (PS) mit und ohne Testpräparat (Gefäßprothese, GP) bei 37° C
Versuch Material Einzelwerte Mittelwerte MTF Nr. cpm/0,5 ml cpm/0,5 ml PP/PS
Polystyren 248,0
246,6 247,3
457,3
1,10
Gefäßprothese 242,1
299,2 273,0
270,6
Polystyren 260,2
257,0 269,0
289,8
1,04
Gefäßprothese 275,9
280,3 278,8
280,2
Polystyren 319,3
305,3 316,7
325,4
0,84
Gefäßprothese 245,0
261,9 265,1
288,4
Aus den Tabellen ergibt sich, daß der das Gefäßprothesematerial enthaltende Testansatz keine erhöhte [3H]Arachidonsäure-Freiset- zung im Vergleich zu dem als Kontrollansatz dienenden Polystyren¬ röhrchen zeigt. Man kann daraus folgern, daß das geprüfte Gefäß- ■ prothesenmaterial in Bezug auf seine Membrantoxizität unbe¬ denklich ist.
Beispiel 4: Oberflächenabhängige Arachidonsäure-Freisetzung
Grundsätzlich wurde zur Absicherung der erfindungsgemäßen Meßmethode auch noch untersucht, ob eine Abhängigkeit von [ HJArachidonsäure-Freisetzung zu der Oberfläche des untersuch¬ ten Werkstoffes besteht. Prüfgegenstand waren Reaktionsgefäße aus Polypropylen. Die Prüfkörperoberfläche betrug 15,30 und 60 mm . Die Reaktionsgefäße wurden in Polystyrenröhrchen mit 1 ml
[-ΗlArachidonsäuremarkiertenn U937-Zellen in Kontakt gebracht und anschließend eine Stunde bei 4° C und eine weitere Stunde bei 37° C inkubiert. Polystyrenröhrchen ohne Prüfkörper lieferten die Basiswerte der [3H] Arachidonsäure-Freisetzung. Nach Ablauf der Inkubationszeit und Entfernung der Prüfkörper wurden die Röhr¬ chen 5 Minuten bei 4° C und 200 g zentrifugiert. Von den Über¬ ständen wurden jeweils 0,5 ml entnommen, mit 4,5 ml Szintilator vermischt und die [3H]Arachidonsäure-Aktivität im Szintilations- zähler gemessen. Es ergaben sich folgende Ergebnisse:
Der Prüfkörper mit der 15 mm2 großen Oberfläche setzte 247 cpm/ml [3H]-Arachidonsäure frei. Bei dem 30 mm2 großen Prüf¬ körper waren es bereits 802 cpm/ml und bei dem 60 mm2 großen Prüfkörper betrug der Wert 3789, womit der Bezug zwischen Te¬ stergebnis und Prüfkörperoberfläche dokumentiert ist.
Die hier beschriebenen Beispiele zeigen nur einen kleinen Aus¬ schnitt, in dem das erfindungsgemäße Verfahren umgesetzt werden kann. Es ist selbstverständlich auch möglich und in manchen Fällen sogar geboten, weitere Proben im Verlaufe einer längeren Inkuba¬ tion zu nehmen. Es besieht nämlich auch die Möglichkeit, daß die toxische Wirkung des zu prüfenden Werkstoffes nachläßt und die
Zellen die zuvor freigesetzte [JH]Arachidonsäure wieder einbauen. Eine solche reversible Schädigung der Zellen würde sich durch eine während der Inkubation zunächst ansteigende und dann wieder ab- nehmende [ H] Arachidonsäure-Freisetzung feststellen lassen. Auch dies könnte von Interesse bei der Beurteilung der Verträglichkeit des Werkstoffes sein.
Aus dem Vorhergesagten ergibt sich, daß mit dem erfindungsgemä¬ ßen Verfahren, wie z.B. in den Beispielen dargelegt, unabhängig von den jeweils spezifisch gewählten Reaktionsbedingungen ein zu¬ verlässiger Vergleich zwischen mehreren Werkstoffmaterialien möglich ist. Es handelt sich stets um eine relative Prüfung, bei dem gegen eine als Leerwert definierte Kontrolle gemessen wird. Es muß dabei sichergestellt sein, daß in die zusammengehörigen Kon¬ troll- und Teslansätze gleiche Zellen mit gleicher Aktivität (und in gleicher Zellzahl) gegeben werden und daß die Inkubation unter gleichen Reaktionsbedingungen erfolgt.
Untersuchungen haben ergeben, daß Polystyren keine bzw. eine zu vernachlässigende toxische Wirkung hat. Es bietet sich daher an, bei Prüfung unterschiedlicher Reaktionsgefäße ein Polystyrengefäß als Kontrolle einzusetzen. Sollen dem Ansatz zugesetzte Werkstoffe geprüft werden, dann bietet es sich an, Polystyrenreaktionsgefäße einzusetzen.
Eine weitere, möglicherweise interessante Anwendung des erfin¬ dungsgemäßen Verfahrens besteht darin, einzelne Chargen von Werkstoffen auf Inhomogenitäten zu prüfen. Es hat sich nämlich bei Vorversuchen herausgestellt, daß z.B. Kunststoffartikel einer Charge verborgene Inhomogenitäten aulweisen, die für die Bio- kompatibilitäl möglicherweise eine Rolle spielen. Dies kann darauf zurückzuführen sein, daß sich die bei der Kunststoffherstellung ein¬ gesetzten Beischlagmaterialien unterschiedlich verteilen und dann in den aus dem Kunststoff hergestellten Artikeln mit unterschiedlichen Konzentrationen auftreten. Insofern könnte das erfindungsgemkäße
Verfahren also auch dazu beitragen, Inhomogenitäten innerhalb ei¬ ner Charge von z.B. Kunststoffartikeln zu bestimmen und gegebe¬ nenfalls eine Standardisierung zu ermöglichen.
< Abschließend soll auf die Abbildung eingegangen werden, die einen besonders bevorzugten Träger 10 von Reaklionsgefäßen 11a und 11b zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens zeigt. Die Reaklionsgefäße 11a und 11b enthalten jeweils eine Suspension von mit [3H]Arachidonsäure-markierten U937-Zellen 12 in Nährlö¬ sung (z.B. RPMI) 13. Zur Abdeckung der Reaktionsgefäße 11a, 11b ist ein Deckel 14 vorgesehen.
Weiterhin ist ein Einsatz 15 vorgesehen, der zwei separate mit Flüssigkeitsdurchlässen 16 versehene und in die Reaktionsgefäße 11a, 11b einsetzbare Behälter 17a und 17b aufweist. In die Behälter kann nun wunschweise der zu prüfende Werkstoff eingegeben wer¬ den. Im gezeigten Falle handelt es sich dabei um mehrere Plättchen 18 z.B. eines Kunststoffes, die in dem Behälter 17a angeordnet sind. In dem Reaktionsgefäß 11a wird also der Testansatz inkubiert, während in dem Reaktionsgefäß 11b, dessen Behälter 17b leer bleibt, die Kontrolle inkubiert wird. Die Flüssigkeitsdurchlässe 16 können so dimensioniert sein, daß sie keine Zellen durchlassen. In diesem Fall mißt man selektiv die toxische Wirkung der Substan¬ zen, die vom dem zu untersuchenden Werkstoff an ein umgebendes Medium abgegeben werden. Werden die Flüssigkeilsdurchlässe größer (zelldurchlässig) ausgebildet, so mißt man gegebenenfalls noch zusätzlich die toxische Wirkung, die auf einen direkten Ober- flächenkontakt der Zellen mit dem Werkstoff zurückzuführen ist.
Zur Probenentnahme genügt es, den Deckel 14 von dem Träger 10 abzunehmen, danach den Einsatz 15 zu entfernen und die ge¬ wünschte Menge Nährlösung 13 aus den Reaklionsgefäßen 11a, 11b zu entnehmen. Es versieht sich, daß die Reaktionsgefäße 11a und 11b und auch der Einsatz 15 aus möglichst neutralem Malerial her¬ gestellt werden. Es hat sich in diesem Zusammenhang gezeigt, daß Polystyren die beste Zellverträglichkeit aufweist und deswegen als Trägermaterial besonders gut geeignet ist.
Claims
1. Verfahren zur toxikologischen Prüfung von Werkstoffen, insbesondere Kunststoffen, bei dem Zellen unter definierten Reaktionsbedingungen zusammen mil dem zu prüfenden Werkstoff in Flüssigkeitsansätzen inkubiert werden und an¬ hand der Reaktion der Zellen auf den Grad der Toxizität des Werkstoffes zurückgeschlossen wird, dadurch gekenn¬ zeichnet, daß Zellen eingesetzt werden, deren Zellmem¬ branen Arachidonsäure als essentiellen Baustein enthalten
•2 und in deren Membranen zuvor [*Η]Arachidonsäure einge¬ baut worden ist, die markierten Zellen in einem Testansalz in Gegenwart des zu prüfenden Werkstoffes und in einem werk¬ stofffreien Kontrollansatz inkubiert werden, wobei Testansalz und Kontrollansatz auf gleiche Zellzahlen eingestellt sind, zu definierten Zeilen im zellfreien Überstand der Ansätze die Radioaktivität bestimmt wird, und aus dem Unterschied zwi¬ schen den für den Test und den Kontrollansaz gemessenen Werten eine Aussage über die Toxizität des geprüften Mate¬ rials abgeleitet wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß Zellen auf Basis menschlicher Zellinien, insbesondere der promyelozytischen humanen Zellinie U937 eingesetzt wer¬ den.
3. Verfahren nach den Ansprüchen 1 oder 2, dadurch gekenn¬ zeichnet, daß die Zellen vor oder nach Markierung mit [JH]Arachidonsäure lyophilisiert oder kryokonserviert wer¬ den.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch ge¬ kennzeichnet, daß die Zellen in den eingesetzten Reaktions¬ gefäßen immobilisiert werden.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch ge¬ kennzeichnet, daß das zu prüfende Material in einem sepa¬ raten, llüssigkeitsdurchlässigen Gefäß oder in einen Rahmen eingespannt in den Testansatz eingebracht wird.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch ge¬ kennzeichnet, daß die Prüfung bei unterschiedlichen Tempe¬ raturen durchgeführt wird.
7. Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens nach den An¬ sprüchen 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens ein Reaktionsgefäß (11a, 11b) vorgesehen ist, das eine defi¬ nierte Zahl von mit [3H]Arachidonsäure markierten Zellen in immobilisierter Form enthält.
8. Vorrichtung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellen lyophilisiert oder kryokonserviert sind.
9. Vorrichtung insbesondere nach einem der Ansprüche 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet, daß ein separater in das Reak¬ tionsgefäß (11a, 11b) einsetzbarer, flüssigkeitsdurchlässiger Behälter (17a, 17b) zur Aufnahme des zu prüfenden Mate¬ rials vorgesehen ist.
10. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 7 bis 9, dadurch ge¬ kennzeichnet, daß mehrere Reaktionsgefäße (11a, 11b) in einem Träger (10) zusammengefaßt sind.
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| EP95932678A EP0779980A1 (de) | 1994-09-10 | 1995-09-07 | Verfahren zur toxikologischen prüfung von werkstoffen, insbesondere kunststoffen, und vorrichtung zur durchführung des verfahrens |
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE19751581A1 (de) * | 1997-11-20 | 1999-08-26 | Bechert | Verfahren zur Prüfung von Materialien hinsichtlich ihrer potentiellen antimikrobiellen Wirksamkeit und der Adhäsion auf ihrer Oberfläche |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE19825909C1 (de) * | 1998-06-10 | 1999-11-25 | Graffinity Pharm Design Gmbh | Reaktorträger mit mehreren Mikroprobenaufnahmekammern |
| DE19856229C1 (de) * | 1998-12-04 | 2000-08-31 | Deutsches Krebsforsch | Verfahren zur Bestimmung von biologischen Langzeitwirkungen von Stoffen und Kit zur Durchführung des Verfahrens |
| DE10312505B4 (de) * | 2003-03-15 | 2007-07-19 | Pauli, Wilfried, Dr. | Kultivierungssysteme zur Gewinnung von Langzeit-Reinkulturen wasserlebender Kleinorganismen |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4246339A (en) * | 1978-11-01 | 1981-01-20 | Millipore Corporation | Test device |
| EP0590485A1 (de) * | 1992-09-28 | 1994-04-06 | Becton, Dickinson and Company | Zellkultureinsatz |
-
1994
- 1994-09-10 DE DE19944432326 patent/DE4432326C2/de not_active Expired - Fee Related
-
1995
- 1995-09-07 EP EP95932678A patent/EP0779980A1/de not_active Withdrawn
- 1995-09-07 WO PCT/EP1995/003508 patent/WO1996007904A1/de not_active Application Discontinuation
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4246339A (en) * | 1978-11-01 | 1981-01-20 | Millipore Corporation | Test device |
| EP0590485A1 (de) * | 1992-09-28 | 1994-04-06 | Becton, Dickinson and Company | Zellkultureinsatz |
Non-Patent Citations (6)
| Title |
|---|
| ALTERN. METHODS TOXICOL., vol. 3(In Vitro Toxicol.), pages 467 - 481 * |
| ALTERN. METHODS TOXICOL., vol. 7(In Vitro Toxicol: New Dir.), pages 175 - 181 * |
| CHEMICAL ABSTRACTS, vol. 105, no. 3, 21 July 1986, Columbus, Ohio, US; abstract no. 19967, V. A. DE LEO ET AL.: "Surfactant-induced primary irritancy: an in-vitro model" page 233; column 2; * |
| CHEMICAL ABSTRACTS, vol. 112, no. 23, 4 June 1990, Columbus, Ohio, US; abstract no. 212040, G. S. LAMONT ET AL.: "Developing an alternative to the Draize skin test: comparison of human skin cell responses to irritants in vitro" page 177; column 1; * |
| CHEMICAL ABSTRACTS, vol. 121, no. 15, 10 October 1994, Columbus, Ohio, US; abstract no. 172371, M. G. SHIVJI ET AL.: "Cutaneous toxicity of surfactants in normal human keratinocytes assessed by cytotoxicity, arachidonic acid release, and regulation of interleukin-1-alpha mRNA" page 337; column 2; * |
| TOXICOL. METHODS, vol. 4, no. 3, pages 193 - 203 * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE19751581A1 (de) * | 1997-11-20 | 1999-08-26 | Bechert | Verfahren zur Prüfung von Materialien hinsichtlich ihrer potentiellen antimikrobiellen Wirksamkeit und der Adhäsion auf ihrer Oberfläche |
| DE19751581C2 (de) * | 1997-11-20 | 2002-05-08 | Thorsten Bechert | Verfahren und Vorrichtung zur Prüfung von Materialien hinsichtlich ihrer potentiellen antimikrobiellen Wirksamkeit und der Adhäsion auf ihrer Oberfläche |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE4432326C2 (de) | 1997-07-17 |
| EP0779980A1 (de) | 1997-06-25 |
| DE4432326A1 (de) | 1996-03-14 |
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