WO1996002631A1

WO1996002631A1 - Procede pour produire une carboxyesterase seche stabilisee

Info

Publication number: WO1996002631A1
Application number: PCT/JP1995/001431
Authority: WO
Inventors: Kazutaka Uno; Makoto Egi; Nobuko Egi; Nobuo Ogata
Original assignee: Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd.
Priority date: 1994-07-20
Filing date: 1995-07-19
Publication date: 1996-02-01
Also published as: EP0778344A1; EP0778344A4; EP0778344B1; DE69523163D1; ATE206756T1; US5792636A; DE69523163T2

Description

明細書安定化されたカルボキシエステラーゼ乾燥物の製造法技 ffj 分野

本発明は安定化されたカルボキシエステラーゼ乾燥物の製造法に関する。該酵素乾燥物を飲食品（例えば、パン、醸造調味料、酒類、食肉加工品等）の製造中に添加することにより、好ましい香り（エステル香）を飲食品に付与することができる。

背景技術

従来、酵素の安定化の為に、種々の物質が使用されている。例えば、ザルコシン 'ォキシダーゼの安定化物質として糖類（乳糖、グルコース、サッカロース、デキストリン、ァラビット、ソルビット、マンニット、イノシット、 /5—サイクロデキストリン等）、アミノ酸類、キレート剤（特開昭 55— 34001 号公報）、セラチオペプチダーゼの安定化物質として乳糖、蔗糖、ゼラチン、ァスパラギン酸、グルタミン酸（特開昭 58— 134991号公報）、酵素蛋白の保護物質として、ショ糖、ブドウ糖、グリセリン、ゼラチン、アルブミン、アミノ酸等〔「凍結' 乾燥と保護物質」根井外喜男編東大出版（1972年 3月 20日）〕、エチレングリコール、グリセロール、ソルビトール、イノシトール、グルコース、ショ糖等〔蛋白質核酸酵素 Vol. 30, No. 10, 1115(1985) 〕が知られている。

また、カルボキシエステラーゼ（EC. 3. 1. 1. 1) の研究用試薬として、'液体状の豚肝臓由来のカルボキシエステラーゼ、例えば、 Esterase 〔製品番号 E3128 ： S I GMA社のカタログ（1993)〕、〔製品番号 104698 ： Boehr inger Mannheim社のカタログ（1991)〕が知られている。

ゥサギ肝臓由来のカルボキシエステラーゼ、 Esterase 〔製品番号 E0887 : S IGMA 社のカタログ (1993)〕は凍結乾燥品であるが、安定性が十分ではなく、この凍結乾燥酵素についての分析によれば [ 分析方法は、糖質の化学（下）、 P. 329 、東京化学同人に準じた〕、糖類等の安定化物質が添加されていないことが判る。動物臓器由来のカルボキシエステラーゼは研究用試薬以外にも工業用として使用されているが、液体状で使用されている（W0 93/09681)。

発明の開示

本発明はカルボキシエステラーゼを含有する溶液に糖類を添加した後、乾燥することにより安定化されたカルボキシエステラーゼ乾燥物を製造する方法に関する。

本発明に用いられるカルボキシエステラーゼとしては、特に動物臓器由来、豚、牛、羊、山羊等の動物臓器、例えば肝臓、腎臓、心臓等から採取されたものがあげられる。

これらの動物臓器から安定化されたカルボキシエステラーゼ乾燥物を製造するには、例えば、以下の方法で行う。

動物臓器をミンチした後、蔗糖を含む緩衝液（P H 6〜7 ) を加え破砕した後、遠心分離する。得られた上清液を酸（酢酸等）で P Hを 4. 5〜5. 5に調整した後、遠心分離して沈殿物を得る。この沈澱物を溶媒（アセトン等）にて脱脂後、緩衝液（p H 6〜7 ) に懸濁する。この懸濁液に 7 0 %飽和になるよう硫酸アンモニゥムを添加し、遠心分離する。得られた沈濺物を 3. 2 M硫酸アンモニゥムに懸濁し酵素液とする。ついでこの酵素液を、そのまま若しくは、希釈（水等）、若しくは脱塩によって溶解した後、これに、糖類を加え溶解した後、乾燥する。

酵素液に加える糖類としては、マルト一ス、マルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペンタオース、マルトへキサオース、グルコース、シュクロース、トレハロース、ラクト一ス、フルクト一ス、マルトへプタオース、マルチトール、マルトトリイト一ル、マルトテトライトール、イノシトール、ソルビトールおよびラクチトールから選ばれる少なくとも 1種が用いられ、好ましくは、マルト一ス、シュクロース、マルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペン夕ォース、マルトへキサオース、マルトヘプ夕オース、マルチトール、マルトトリイトール、マルトテトライトールおよびラクチトールの少なくとも 1種が用いられ、より好ましくはマルトースまたはマルチトールが用いられる。

糖類の量は酵素溶液に対し、 0. 1〜 3 0 % w/v、好ましくは 0. 1〜 2 0 % w/v である。乾燥は真空凍結乾燥、噴霧乾燥、通風乾燥等で行われ、真空凍結乾燥の場合、真空度 1 3 0 Pa以下、凍結温度— 1 0〜一 3 0 、棚温度 5〜 4 0 で行われる _c 噴霧乾燥の場合、入口温度 1 0 0〜1 5 0 °C、出口温度 5 0〜1 2 0 で行われ、通風乾燥の場合、 4 0〜 8 0でで 1〜 1 0時間行われる。

乾燥時の酵素活性の低下を抑える目的では、真空凍結乾燥など比較的緩和な条件での乾燥が好ましい。また、酵素の乾燥時に、必要に応じて賦形剤を添加することも可能である。この場合、例えば、デキストリンなどが用いられる。

この様にして得られたカルボキシエステラーゼ乾燥物の酵素活性は極めて安定に維持される。

発明を実施するための最良の形態

以下に実施例および参考例を示す。

実施例 1

参考例 7で得たカルボキシエステラーゼ含有溶液（タンパク質濃度 3. 5 mg/mK 活性 1 8 0 U/ml) に、安定化物質としてマルトースを l % (w/v) の濃度で溶解した。この溶液を一 2 0 で 2時間凍結した後、共和式凍結乾燥器 R L— 3 0 N B型にて、棚温 3 0 °C、真空度 1 3. 3 Pa以下で、約 1 8時間乾燥して粉末酵素を得た。

この酵素活性を以下の方法で測定 * 'し、次式 * ²で酵素活性の残存率を求めたところ 8 6 %であった。

*1 酵素活性の測定は、 Methods i n Enzymology 77' 333(1981) に準じて、次のように測定した。 p—二トコフエニルアセテート 1 8. l mgを l mlのァセトニトリルに溶解した後、トリスマレイトバッファー（50m 、 PH7. 0)で 100ml にメスアツプしたものを基質とした。酵素液（得られた粉末酵素を水で溶解して調製したもの） 0. 2 mlに基質 1. 8 mlを加え混合後、 3 0 °Cで 1 0分間反応を行い、アセトン 2 ml加え反応を停止し、 4 0 5 nraで吸光度を測定した。なお、調製した基質は 1 時間以内に使用した。この方法で、 O D 0. 2〜1. 0に酵素量と吸光度の間に直線性が確認された。 p—二トロフヱノ一ルのモル分子吸光度係数 16400/Μ· cmを用い、 1単位は 1分間に前記条件で 1 mo l の基質を分解する量とした。得られた結果は、乾燥前の単位タンパク質当たりの活性を 1 0 0として、乾燥後に残存した活性を比活性の比として表した（次式）。

の Jtffi性 (uni t/ng i

' m (%) = χ ι o o

m a^ (uni t/ng タンパク）対照として、実施例 1において、安定化物質のマルトースを用いない以外は実施例 1と同様にして粉末酵素を得た。この粉末酵素の活性残存率を実施例 1と同様にて算出したところ 1 6 %であった。

また、前記実施例および対照の粉末酵素を 3 7 °C、相対湿度 6 5 %で保存し、 3 0曰後、 6 0日後、 9 0日後の活性残存率を凍結乾燥（F D ) 直後の値と一緒に第 1表に示す。

実施例 2〜 1 7および参考例 1〜 5

実施例 1において、安定化物質としてマルトースの代わりに第 1表に示す安定化物質を用いる以外は実施例 1と同様にして粉末酵素を得た。

その粉末酵素の F D直後、 3 0日後、 6 0曰後、 9 0日後の活性残存率を実施例 1と同様に算出した。その結果を第 1表に示す。

第表例活性残存率（¾)

安定化物貧

例 FD直後 30 Β後 90曰後

1 マノレトース 8 6 8 2 ft fi Ό 8 2

. 2 ンュクロース 9 3 7 R ひ Ό 7 1

3 グノレコース 9 8 7 7 6 4 6 1 実 4 トレメ、ロース 9 3 8 1 3 9 4 8

5 ラクトース g 4 A 9 C A 0 £>

6 フルクトース 9 9 7 A 7 Π 6 5

7 マルトトリオース 9 0 Ο ν Q 7 9

8 マルトテトラオース 9 2 7 Q 7 0 7 8

9 マルトペンタオース 9 0 7 7 7 5 7 4

10 マル卜へキサオース 9 4 8 2 7 7 7 4

11 マノレ卜へプタオース 9 3 8 2 7 5 7 ¾ m 12 マノレチトール ζ 9 8 8 9 8 2 8 2

13 マルトトリイトール 8 3 8 8 8 2 7 9

14 マノレトテトライトーノレ 9 2 8 4 8 2 7 8

15 ラクチトール 8 5 8 3 7 5 7 2

16 ソルビトール 6 6 5 4 5 2 4 6

17 イノシトール 9 7 7 2 5 8 4 7 参 1 セロビオース 9 4 5 8 2 8 3 5

2 キシロース 9 7 1 9 2 1 考 3 マンニトール 6 5 5 2 2 7 2 4

4 キシリトール 4 L 3 2 1 8 1 5 例 5 エリスリトール 2 1 9 4 3

対照無添加 1 6 3 0 0

表から明らかな如く、実施例の粉末酵素の長期保存後の安定性は、対照のものに比べてはもちろんのこと参考例のものに比べても非常に優れていることが判る _c 実施例 1 8

実施例 1においてマルトースの代わりにマルチトールの濃度（％ w/v)を 0. 0 2、 0. 1、 1、 5、 1 0、 2 0、 3 0および 4 0と代える以外は実施例 1と同様にして粉末酵素を得た。この粉末酵素の活性残存率を実施例 1と同様に算出した結果を第 2表に示す。第表マルチトーノ U«S (% /v) (%) ^の雌'

0.02 18 〇

0. 1 98 〇

1 98 Ο

5 100 〇

1 0 92 Ο

20 100 〇

30 95 厶

40 95 X

* «t <i 〇；良圩な軽い粉末

Δ;^>しっとりした^末

X；粘性のあるペースト状

表から明らかな如く、マルチトールの濃度としては、 0. 1〜3 0 % w/v、好ましくは 0. 1〜 2 0 % w/vであることが判る。

実施例 1 9

参考例 7で得たカルボキンエステラーゼ含有溶液（タンパク質濃度 3. 5 mg/ml 、活性 1 8 0 U/ml) に、安定化物質としてマルチトールを 1 % w/vの濃度で溶解した。この溶液を噴霧乾燥機（東京理化機器社製の噴霧乾燥機 SD— 1 ) を用い、入口温度 1 0 5°C、出口温度 7 0°Cにて噴霧乾燥した。得られた粉末酵素の活性残存率を実施例 1と同様に算出したところ 7 1 %であった。

参考例 6

実施例 1 9において、安定化物質のマルチトールを用いない以外は実施例 1 9 と同様にして粉末酵素を得た。この粉末酵素の活性残存率を実施例 1 と同様に算出したところ 2 0 %であった。実施例 2 0〜 2 3

参考例 8〜1 1で得た、豚腎臓、牛肝臓、牛腎臓または牛心臓由来の各カルボキシエステラーゼ含有溶液に安定化物質としてマルト一スを 1 % w/vの濃度で溶解した。この溶液を— 2 0 で 2時間凍結した後、共和式凍結乾燥器 RL— 3 0 NB型にて棚温 3 0°C. 真空度 13. 3 Pa以下で、約 1 8時間乾燥して粉末酵素を得た。得られた粉末酵素の活性残存率を実施例 1と同様に算出した結果を第 3表に示す。

第 3 表実施例酵素の由来

20 啄 m 92

21 牛肝職 9 l

22 牛賢 m 89

23 牛心 m 90

参考例 7

豚肝臓 1 kgを肉挽器でミンチした後、 0. 2 5蔗糖を含む 0. 0 2 Mリン酸緩衝液 ( H6. 5 ) 3 0 0 0mlを加え破砕後、遠心分離（ 1 00 0 0 x g、 3 0分間）した。上清液を 2 N酢酸で PH5. 3に調整し、 4°Cで 1 0時間放置した後、再び遠心分離（ 1 0 0 0 0 X g、 3 0分間）して沈殿物を得た。沈澱物に冷ァセトン (一 2 0°C) 1 0 0 0 mlを添加して攪拌後、吸引濂過（東洋濾紙 No. 2使用）した。このアセトンによる脱脂操作を同様に 3回繰り返した後、得た残渣を 2 0°C の真空乾燥機中で乾燥し、残留アセトンを除去した。この濂過残渣に 0. 0 5Mリン酸緩衝液（PH6. 7 ) 1 0 0 0 mlを添加し、 4 °Cで 1 0時間攪拌した後、遠心分離（1 0 0 0 0 x g、 3 0分間）し上清液を得た。これに硫酸アンモニゥムを

5 0 %飽和になるよう添加した後、 4°Cで 5時間放置した。この液を遠心分離 (1 0 0 0 0 x g, 3 0分間）し、沈濺物を除いた後、 7 0%飽和になるように硫酸アンモニゥムを添加混合し、 4°C、 5時間放置した。この液を遠心分離

(l O O O O X g, 3 0分間）して得た沈澱物を 3. 2 Mの硫酸アンモニゥムで全量 1 0 0mlとし、豚肝臓由来の酵素液とした。

参考例 8〜1 1

参考例 7において豚肝臓の代わりに、豚腎臓、牛肝臓、牛肾臓または、牛心臟を用いる以外は参考例 7と同様にして、動物臓器由来の酵素液を得た。

本発明により、安定化されたカルボキシエステラーゼ乾燥物が提供される。産業上の利用可能性

本発明により安定化されたカルボキシエステラーゼ乾燥物が提供される。該酵素乾燥物を飲食品（例えば、パン、醸造調味料、酒類、食肉加工品等）の製造中に添加することにより、好ましい香り（エステル香）を飲食品に付与することができる。

Claims

請求の範囲

1. カルボキシエステラーゼを含有する溶液に糖類を添加した後、乾燥することを特徴とする安定化されたカルボキンエステラーゼ乾燥物の製造法。

2. 糖類がマルトース、マルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペン夕オース、マルトへキサオース、グルコース、シュクロース、トレハロース、ラクトース、マルトへプタオース、マルチトール、マルトテトライトール、イノシトール、ソルビトールおよびラクチトールから選ばれる少なくとも 1種である請求の範囲 1記載の製造法。

3. 糖類がマルトースまたはマルチトールである請求の範囲 1記載の製造法。