WO1989001523A1 - Process for preparing pyruvic acid by fermentation - Google Patents

Description

明 細 書

発酵法 に よ る ピ ル ビ ン 酸の 製造法

技術分野

本発 明 は 発酵法 に よ る ピ ル ビ ン 酸 の 製造法 に 関 す る 。 5 背景分野

卜 ル ロ プ シ ス 属 徴 生 物 を 用 い て 、 発 酵法 に よ り ビ ル ビ ン 酸が製造で き る こ と は 、 既 に 知 ら れ て い る （ 日 本農 芸化学会誌第 3 2 巻第 5 7 3 ペ ー ジ ， 特開昭 6 2 — 1 4 7 8 9 号公報 ） 。

0 し 力 し な ；^ ら 、 力 >カ> る 従来法 に お い て は ピ ル ビ ン 酸 の 蓄積量、 収率が 低 く 、 工業 的 に 実 用 化す る こ と は で き な い 。 す な わ ち 、 日 本農芸化学会 誌第 3 2 巻第 5 7 3 ぺ ー ジ に よ る と 、 ト ル ロ ブ シ ス ， キ ャ ン デ ィ ダ を 用 い た ビ ル ビ ン 酸の 蓄積 量は 高 々 0. 5 タ と 低 い 。 ま た 、 特開昭5 6 2 — 1 4 7 8 9号公報に よ る と 、 ト ル ロ ブ シ ス · エ ツ チ ェ ル シ ー を 用 い た ピ ル ビ ン 酸の 蓄積量は 高 々 5. 1 9 / Ά と 低 い。 し 力 > も 、 こ の ト ル ロ ブ シ ス · ェ ツ チ エ ル シ ー株 は チ ア ミ ン存在下 で生育 が良 く な る 力 s 、 生 育の た め に チ ア ミ ン を要求す る も の で は な い 。

ひ 発 明 の 開示'

本発 明者 ら は 、 上 記問 題点 を 解 決す る こ と が で き 、 さ ら に 生産性 の 高 い ピ ル ビ ン 酸 の 製 造方法 に つ い て鋭意 研 究 し た 結果、 ト ル ロ ブ シ ス 属 に 属 し 、 生 育の た め に チ ア ミ ン お よ び ピ オ チ ン を 要求 し 、 ピ ル ビ ン 酸生産 能 を 有 す ： る 微生物が著量 の ピ ル ビ ン 酸 を 生成蓄積せ し め る こ と を 見出 し た 。

本発明の 第 1 の 目 的は 、 ピ ル ビ ン 酸 を 収率 · 収量 と も 十分 に生成蓄積せ し め る 方法 を 提供 す る こ と で あ る 。

本発 明 の も う 1 つ の 目 的 は 、 副生物が ほ と ん ど な く 、 ピ ル ビ ン 酸を 生成蓄積せ し め る 方法 を 提供す る こ と で あ る o

本発明 の他の 目 的 は 、 新規 な 変異株 を 用 い た改良方法 を提供す る こ と に あ る 。

本発明 の これ ら の 目 的は 、 以下の 詳細説 明 か ら 明 ら か で あ る 。

こ れ ら の貝 的 は ト ル ロ ブ シ ス 属 に 属 し 、 生育の た め に チ ア ミ ン お よ び ビ ォ チ ン を 要求 し 、 か つ ビ ル ビ ン 酸生産 能 を 有す る 微生物 を 培養 し て 培養液中 に ピ ル ビ ン酸 を生 成蓄積せ し め 、 前記培養液中 よ り ピ ル ビ ン 酸 を採取す る こ と を 特徵 と す る 発酵法 に よ る ピ ル ビ ン酸 の 製造法 に よ り 達成 さ れ る 。

発明 を 実施す る た め の最良の 形態 次 に 本発 明 を 詳細 に 説明す る 。

本発明で 用 い ら れ る 微生物 は ト ル 口 プ シ ス 属 に属 し 、 生育の た め に チ ア ミ ンお よ び ピ オ チ ン を 要求 し 、 力 っ ピ ル ビ ン 酸生産能 を 有す る 微生物で あ れ ば い か な る も ので あ っ て も よ い 。

か か る 性質 を 有 し て い れ ば 、 他の 要求性 、 薬剤耐性、 酵素活性の変化な ど の性質 を 持 つ も の で も 本発 明 の範 囲 に含 ま れ る 。 本発 明 に お い て は 、 上記 チ ア ミ ン お よ び ピ オ チ ン 要求 性 に カ卩 え 、 好 ま し く は 生育 の た め に ア ル ギ ニ ン を 要求す る 変異株 を 用 い る 。 こ こ に い う ア ル ギ ニ ン要求性 と は 、 広義の 意味で あ り 、 不完全欠失型 （ い わ ゆ る L eaky 型） も 含 む も の で あ る 。 さ ら に ア ル ギ ニ ン の 生合成前駆-物質 で 要求性 が満足 さ れ る 場合 も 含 む も の で あ る 。

ま た 、 本 発明 に お い て は 、 上記 チ ア ミ ン お よ び ビ ォ チ ン 要求性 に 加 え 、 好 ま し く は 親株 よ り も 低 い ピ ル べ 一 ト デ カ ル ボ キ シ ラ ー ゼ 活性 （ 以下 P D C 活 性 と 略 す ） を 有 す る 変異株 を 用 い る 。 P D C 活性 レ ベ ル を 低下 さ せ る こ と は 、 ビ ル ビ ン 酸力 s ァ セ ト ア ル デ ヒ ド へ と 代謝 さ れ る の を 少 な く し 、 グ ル コ ー ス 力 > ら ピ ル ビ ン 酸へ の 変換率 を 高 め る の に役 立 ち ''、 そ の た め ピ ル ビ ン 酸 の 蓄積量 が 増カロす る と 推定 さ れ る 。

さ ら に 、 本発 明 に お い て は 、 上記 チ ア ミ ン お よ び ピ オ チ ン 要求性 に カ卩 え 、 好 ま し く は 生 育 の た め に イ ソ 口 ィ シ ン お よ び バ リ ン を 要求す る 変異株 を 用 い る 。 こ こ に い う イ ソ ロ イ シ ン要求 性お よ び バ リ ン 要求性 と は 、 広義 の 意 味で あ り 、 不.完全欠失型 （ い わ ゆ る L eaky 型） も 含 む も の で あ る 。 さ ら に イ ソ ロ イ シ ン お よ びノ、' リ ン の各生合成 前駆物質 で 要'求性 が満 足 さ れ る 場合 も 含 む も の で あ る 。

ま た 、 本発 明 に お い て は 、 上記 チ ア ミ ン お よ び ビ ォ チ ン 要求性 に 加 え 、 好 ま し く は ァ ミ ノ ォ キ シ 酢酸 に 対 し て 耐性 を 有す る 変異株 を 用 い る 。

こ れ ら の性質、 す な わ ち 要求 性、 酵素活性変化 、 耐 性 は 、 い ずれ も ビ ル ビ ン 酸生産性 に有効 に 働 く 。 そ れ故、 こ れ ら の 性質 の い く ら か ま た は 全部 を有す る 微生物 が好 ま し く 用 い ら れ る 。

本発 明 で用 い ら れ る 微生物 の代表的 な も の と し て は 、 次 の も の が挙げ ら れ る 。

(a) ト ル ロ プ シ ス ， グ ラ ブ ラ ー タ （ Torulopsis glabra ta ) T R — 2 0 2 6

( F E R M B P - 1 4 25 )

こ の T R— 2 0 2 6 株は 生育の た め に チ ア ミ ン お よ び ピ オ チ ン 、 ニ コ チ ン 酸、 ピ リ ド キ シ ン を 要求す る 微 生物 で あ り 、 日本 の発酵研究所 に I F O 0 0 0 5 と し て 寄託 し て あ っ た も の を 、 日 本の工業技術院微生物 工業技術研究所 （ 以下微ェ研 と 略す ） に 1 9 8 7 年

7 月 3 1 日 に 寄 託 し た 。

(b) ト ル ロ ブ シ ス · グ ラ ブ ラ ー タ

A T C C 3 2 9 3 6

こ の A T C C 3 2 9 3 6 珠は 、 生育の た め に チ ア ミ ン 、 ピ オ チ ン 、 ビ リ ド キ シ ン お よ び ニ コ チ ン 酸 を 要 求す る 微生物で あ り 、 既 に 、 米国 の ァ メ リ カ ン * タ イ プ . カ ル チ ヤ 一 · セ ン タ 一 （ A T C C ) に寄託 さ れて い る o

Cc) ト レ ロ プ · シ ス · メ タ ノ ロ べ ッ セ ン ス （ Torulopsis

methano I ovescetis ) T — 2 0 4 4

( F E R M B P - 1 428 )

こ の T R— 2 0 4 4 徕 は 、 生育の た め に チ ア ミ ン ぉ よ び ピ オ チ ン を す る で あ 、 国 の

C に A T C C 2 6 1 7 6 と し て 寄託 し て あ っ た も の を 、 日 本の 微ェ研 に 1 9 8 7 年 8 月 1 日 に 寄 託 し た 。

(ά) ト ル ロ ブ シ ス ， グ ラ ブ ラ ー タ X — 1 5

( F E R M B P - 1 4 2 3 )

こ の X — 1 5 株 は 、 生 育 の た め に チ ア ミ ン 、 ビ ォ チ ン 、 ニ コ チ ン 酸 、 ピ リ ド キ シ ン お よ び ア ル ギ ニ ン を 要 求 す る 微生物 で あ り 、 日 本 の 微ェ研 に 1 9 8 7 年 4 月 4 日 に 寄 託 し た 。

(e) ト ル ロ ブ シ ス · グ ラ ブ ラ ー タ A C H 3 3

( F E R M B P - 1 4 2 4 )

こ の A C I 3 3 株は 、 生育 の た め に チ ア ミ ン 、 ピ オ チ ン 、 ニ コ チ ン 酸お よ び ピ リ ド キ シ ン を 要求 し ； ^ つ P D C 活 性 が親株 よ り 低下 し た 微生物 で あ り 、 日 本 の 微 ェ研 に 1 9 8 7 年 4 月 4 日 に 寄 託 し た 。

(ΐ) ト ル ロ ブ シ ス · グ ラ ブ ラ 一 タ X — 6 8

( F E R M B P - 1 4 2 6 )

こ の X — 6 8 株 は 、 生育の た め に チ ア ミ ン 、 ビ ォ チ ン 、 ニ コ チ ン 酸、 ピ リ ド キ シ ン 、 イ ソ ロ イ シ ン お よ び バ リ ン を 要求 す る 微生物で あ り 、 日 本 の微ェ研 に 1 9 8 7 年 7 月 3 1 日 に 寄 託 し た 。

(g) ト ル ロ ブ シ ス ， グ ラ ブ ラ ー タ A 0 A — 8

( F E R M B P - 1 4 2 7 )

こ の A 0 A— 8 株 は 、 生育 の た め に チ ア ミ ン 、 ピ オ チ ン 、. 二 コ チ ン酸お よ び ピ リ ド キ シ ン を 要求 し 力 っ ァ ミ ノ ォ キ シ 酢酸に 対す る 耐性 を 有す る 微生物で あ り 、 日 本の微ェ研 に 1 9 8 7 年 8 月 1 日 に 寄 託 し た 。 F E R M B P 番号 は 日 本の微ェ研の 受託番号 で あ り こ の番号の付与 さ れ た微生物 は何人 も 利 用可能で あ る 。

こ れ ら の ビ ル ビ ン 酸生産株（d) 〜（g) は例 え ば 、 ト ル 口 プ シ ス · グ ラ ブ ラ 一 タ T R — 2 0 2 6 を 親株 と し た 変異株 と し て 誘導 で き る 。

変異株の 誘導 は、 通常の 変異処理法 に よ っ て比較的容 易 に 行 う こ と 力 s で き る 。 す な わ ち 、 生育 に ア ル ギ ニ ン を 要求す る 変異株 を 得 る に は 、 親株 を 紫外線照射す る か 、 あ る い は変異誘発剤 （例 え ば N — メ チ ル ー — 二 ト 口 一 Ν — 二 ト ロ ソ グ ァ 二 ジ ン 、 ェ テ ル メ タ ン ス リレ ホ ン 酸 な ど ) で処理 し た 後、 ア ル ギ ニ ン の存在す る 培地 で は生育す る が、 存在 し な い培地 で は 生育で き な い 菌株 を 取得すれ ば よ い。

ま た 、 親株 よ り も 低い P D C 活性 を 有 す る 変異株 を得 る に は 、 前記 と 同 様の 変異処理 を 行 っ た 後、 酢酸 を 含 む 培地 で親株に比べ有意 に生育の 良好 な菌体 を 取得すれ ば よ い。

さ ら に 、 生育に イ ソ ロ イ シ ン お よ び バ リ ン を 要求す る 変異株 を 得 る に は 、 前記 と 同様の 変異処理を 行 っ た 後、 ィ ソ ロ イ シ ン と バ リ ン 力； と も に存在す る 培地 で は 生育す る 力；、 そ の ど ち ら 力 > の少 な く と も 一方が存在 し な い培地 で は 生育で き な い 菌株 を取得す れ ば よ い。 ま た 、 ア ミ ノ ォ キ ジ 酢酸 に 耐性 を 有す る 変異株 を 得 る に は 、 前記 と 同 様の 変異処理 を 行 っ た 後、 親株 が十分 に 生 育で き な い よ う な 量 の ァ ミ ノ ォ キ シ 酢酸 を 含 む 培地で 親株 に 比べ て 有意 に生育良好 な 菌株 を 取得す れ ば よ い 。

P D C 活性 は 、 超音波処理、 フ レ ン チ プ レ ス を 用 い る 高圧法 、 そ の 他の 方法 に よ り 、 細胞 を 破壊 し 、 遠 心分離 し た 上 清 粗酵素 液 を 用 い 、 ピ ル ビ ン 酸 を 基質 に 、 チ ア ミ ン ピ ロ リ ン 酸 を 補酵素 と し て 反応 し 、 生成 し た ァ セ ト ァ ル デ ヒ ド を 2 , 4 — ジ ニ ト ロ フ エ ニ ル ヒ ド ラ ジ ン と 反応 さ せ 、 高速 液体 ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー に よ り 反 応 し た ァ セ ト ア ル デ ヒ ド の 2 , 4 ー ジ ニ ト ロ フ エ ニ ル ヒ ド ラ ゾ ン を 定量分析す る 方法 に よ り 測定 さ れ る 。

P D C の 活 性 が親株 よ り も 低 い 菌株 と し て は 、 親株 を 基準 と し て そ の 7 0 % 以下 、 好 ま し く は 6 0 % 以下 に P D C 活性 が低下 し た も の が望 ま し く 用 い ら れ る 。

た と え 、 親株 を 基準 と し て そ の 7 0 % 以下 に P D C の 活性 が 低下 し て い な く と も 、 そ の菌 株の 誘導 さ れ た も と と な る 野生株 を 基 準 と し て そ の 7 0 % 以下 に P D C 活性 が 低下 し て い れ ば 、 同様 な 効果 が達成 さ れ る も の で あ る の で 、 そ の よ う な 菌株 を 用 い る こ と は 本発明 で 使用 さ れ る 好 ま し い 変異株の 範囲 内 に包含 さ れ る 。 こ こ で P D C 活性 は 、 親株の P D C 活性 を 1 0 0 % と し て 表わ し た 場 合 の 相対活性で示 す も の と す る 。 ：，

ま た 、 ア ミ ノ ォ キ シ 酢酸 に 対す る 耐性 を 有す る 変異株 と は 、 そ の 親株 よ り 強い 耐性 を 有す る 菌株 の こ と で あ り - 好ま し く は 親珠の 2 4 時間後の 相 対生育度が 4 0 以下 に な る よ う な ァ ミ ノ ォ キ シ 酢酸濃度 を含 む培地 で培養 し た 場合 の相 対生育度が 5 0 以上 を 示す よ う な も の を い う 。 こ こ で 生育度は 、 培養液 の 6 6 0 n m に お け る 吸光 度 を 測定 し 、 各菌株の ァ ミ ノ ォ キ シ 酢酸 を 添加 し て い な い培養液の 吸光度を 1 0 0 と し て 表わ し た場合 の相対 吸光度で示す も の と す る 。 ·

本発明 で用 い ら れ る ピ ル ビ ン 酸生産用 の 培地 は発 酵に 通常使用 さ れ る .炭素源、 窒素源、 .無機塩類、 ビ タ ミ ン 類 な ど を ほ ど よ く 含有す る も の で あ れ ば よ い が、 炭 素源 と し て は 、 グ ル コ ー ス な ど の糖質、 有機酸、 エ タ ノ ー ル 、 メ タ ノ ー ル な ど の 使用 酵母菌が利 用 し得 る も の が使用 さ れ る 。 窆素源 と し て は 硫安 、 硝 安、 塩安、 .尿素、 ぺ プ ト ン 、 肉 エ キ ス 、 味液、 そ の他の 有機お よ び 無機窒素化合 物が 使用 さ れ る 力 s、 望ま し く は ア ミ ノ 酸 を バ ラ ン ス よ く - 含 む 有機窒素化合物が よ ό 。 無機塩類 と し て は リ ン 酸 力 リ ウ ム 、 硫酸 マ グ ネ シ ウ ム 、 鉄 、 マ ン ガ ン 、 そ の他 の無 機塩類が用 い ら れ 、 さ ら に チ ア ミ ン 、 ピ オ チ ン な ど の要 求 ビ タ ミ ン 、 あ る い は 必要 に応 じ て 他 の ビ タ ミ ン 、 ま た は こ れ ら を 含有す る 酵母 エ キ ス 、 コ ー ン ス チ 一 プ リ カ 一 そ の他 の天 然物 を 添カ卩 し た 培地 を 使用 すれ ば よ い。

塔養中 は ピ ル ビ ン 酸の 生成蓄積 に と も な い 、 ρ Η の 低 下が起 こ る の で 炭酸 カ ル シ ウ ム 、 苛性 ソ ー ダ、 苛性 カ リ ア ン モ ニ ア な ど の ア ル 力 リ で ρ Η 3 〜 7 に調節す る こ と が ピ ル ビ ン 酸生産に は 有効 で あ る 。 培 養中 の温度 は 2 2 ° (： 〜 3 2 で が適当 で あ る 。 培養終 了後、 系 内 に 蓄積 し た ビ ル ビ ン 酸 は 常法 に よ り 単離採取す る こ と が で き る 。 例 え ば 、 酸性 ヱ一 テ ル 抽出 フ エ ニ ル ヒ ド ラ ゾ ン化 し て 沈 澱単離す る 方法 な ど も 採用

5' す る こ と が で き る 。

実施例 1

第 6 表 に 示す 発酵培地 （ A ) を 1 ^ の マ イ ヤ ー フ ラ ス コ に 4 0 W づ っ分 注 し 、 滅 菌後 、 別滅菌 し た 炭酸 カ ル シ ゥ ム 4 % を 添 加 し 、 ト ル ロ ブ シ ス · グ ラ ブ ラ 一 タ T R — ひ 2 0 2 6 ( ニ コ チ ン 酸 、 ピ リ ド キ シ ン 、 チ ア ミ ン 、 ピ オ チ ン 要求 ） 及 び ト ル ロ ブ シ ス ，. グ ラ ブ ラ 一 タ A T C C 3 2 9 3 6 ( ニ コ チ ン 酸、 ピ リ ド キ シ ン 、 チ ア ミ ン 、 ピ オ チ ン 要求'） を 各 々 一 白 金耳植菌 し た 後、 3 0 °C で 6 0 時 間各 々 培養 し た 。 培養後 、 ピ ル ビ ン 酸 を 高速 液体 ク ロ マ ト グ ラ フ ィ 一 に て定 量 し た 。 結果 を 第 7 表 に示 す。 ま た - 副生物 は 液体 ク 口 マ ト グ ラ フ ィ 一 で は 検 出 さ れ な か っ た こ の各 々 の 培養液 1 を 除菌後、 上 澄液 に 塩酸 を 加 え P H 2. 0 と し 、 1 ^ の ヱ チ ル エ ー テ ル で抽 出 し 、 次い で苛 性 ソ ー ダ で ρ H を 6. 0 に 中 和 し た 後 、 4 0 °C で 減圧濃縮 し 1 0 程度 と し た 。 こ の 濃縮液 に エ タ ノ ー ル を 滴下 さ せ 、 ピ ル ビ ン 酸 ソ ー ダ と し て 、 前者は 2 7. 3 ダ （ 純度 9 7 % ) 、 後 者 は 2 0. 1 （ 純度 9 7. 3 % ) を 得 た 。

実施例 2

実施例 1 に お い て 使用 し た 培地 中 の グ ル コ ー ス を 5 %, に 減 ら し た 以外 は 同様 に し て 、 ト ル ロ ブ シ ス · メ タ ノ ロ べ ッ セ ン ス T R — 2 0 4 4 ( チ ア ミ ン 、 ビ ォ チ ン要求 ：) を 一 白金耳植菌 し た後 、 実施例 1 と 同様の方法で培養 し た 。 6 0 時間後、 培養液中 の ビ ル ビ ン 酸 を 高速液体 ク ロ マ ト グ ラ フ ィ 一 で定量 し た 。 結杲 を 第 7 表 に示す。

実施例 3

( L — ア ル ギ ニ ン 要求性変異株の 取得 ）

ト ル ロ プ シ ス ， グ ラ ブ ラ ー タ T R — 2 0 2 6 ( ニ コ チ ン酸、 チ ア ミ ン 、 ビ リ ド キ シ ン 、 ビ ォ チ ン要求） の 菌体 を 常法に よ り ェ チ ル メ タ ン ス ル ホ ン 酸に よ り 変異処理 （ 以下 E M S 処理 と 称す る ） （ l w / v % 、 3 0 °C で 3 時 間 ） し た の ち 、 栄養寒天培地 （ G P 寒天培地 < ブ ド ウ 糖 2. 0 % 、 酵母 エ キ ス 0. 2 % 、 硫酸 マ グ ネ シ ウ ム 0. 0 5 % ポ リ ペ プ ト ン 5. 0 ¾ 、 リ ン 酸二水素 カ リ ウ ム 0. 1 % 、 寒 天 2 > 、 大五 栄養化学株式会社製 〕 に接種 し 、 3 0 で で 2 日 間培養 し 、 Bacto Yeast Carbon Base ( D I F C 0 ( 株） 製、 以下 、 Y C B 培地 と 略す.） に 、 硫安 5 9 / & を加 え た 寒天培地 （ A ) と Y C B 培地に 硫安 5 3 / L — ア ル ギ ニ ン 1 0 0 Ζ を 加 え た 寒天培地 （ Β ) に 各 々 レ プ リ カ し た 。 次 に 3 0 °C で 3 日 間培養 し 、 実施例 4 の方法 に よ っ て 寒天培地 （ B ) で 生育 し 、 寒天培地 （ A ) で 生育 し な い コ ロ ニ 一 を 釣菌分離 し 、 L 一 ア ル ギ ニ ン 要求性変異株 ト ル ロ ブ シ ス · グ ラ ブ ラ 一 タ X — 1 5 を 取得 し た 。

実施例 4

( ア ル ギ ニ ン 要求性 の 検定） 5 下記第 1 表に 示す 各菌株 を 、 G P 寒天斜 面培地 で 2 4 時間培養 し そ の菌体 を ご く 微量 か き と り 、 L 一 ア ル ギ ニ ン 無添 加 、 お よ び L — ア ル ギ ニ ン 0. 0 1 % 添 力 B し た 硫安 5 Z を 含む Y C B 寒天 平板培地 に う す く 塗布 し 、 3

5 0 °C に て 4 日 間 培養 し そ の生育 の 有無 を 観察 し た 。 L — ア ル ギ ニ ン 無添加寒天平板培養 で生育で き ず 、 L 一 ア ル ギ ニ ン 添加寒天 平板培地 で 生育す る も の を L — ア ル ギ ニ ン 要求性変異株 と し た 。

結果 は 第 1 表 に 示 す と お り で .あ り 、 L 一 ア ル ギ ニ ン 要 Q> 求性株 ト ル ロ ブ シ ス · グ ラ ブ ラ ー タ X — 1 5 は 、 親株 の ト ル ロ ブ シ ス · グ ラ ブ ラ 一 タ T R — 2 0 2 6 と の 比 較 よ り 明 ら 力 > に 、 L — ア ル ギ ニ ン 要求 性 を獲 得 し て い る 。

第 1 · 表

(注） + ：生育あり - ：生育なし

:ひ

実施例 5

( ピ ル ビ ン 酸の生産 ）

第 6 表 に ^す発 酵培地 （ A ) を 1 の マ イ ヤ 一 フ ラ ス コ に 4 0 づ っ分 注 し 、 滅菌後 、 別滅菌 し た 炭酸 カ ル シ 5 ゥ ム 4 % を 添加 し 、 ア ル ギ ニ ン 要求 性変 異 株 ト ル ロ プ シ ス · グ ラ ブ ラ 一 タ X— 1 5 を 接種 し 、 3 0 °C で 6 0 時間 培養 し た 。 た だ し 、 発酵培地 に L 一 ア ル ギ ニ ン 0. 0 1 % を 添加 し て 培養 し た。 培養液中 に 生成 し た ピ ル ビ ン 酸 を 高 速液体 ク ロ マ ト グ ラ フ ィ 一 に て定 量 し た 。

結果 を 第 7 表 に示す。

ト ル ロ ブ シ ス · グ ラ ブ ラ ー タ X _ 1 5 を 用 い た 方法 は 蓄積濃度、 ビ ル ビ ン 酸生成 収率 と も い ずれ も 親株 よ り 顕 著 に 向上 し て い る 。

実施例 6

（ P D C 活性低下株の 取得）

ト ル ロ ブ シ ス · グ ラ ブ ラ 一 タ T R — 2 0 2 6 ( ニ コ チ ン 酸 、 チ ア ミ ン 、 ピ リ ド キ シ ン 、 ビ ォ チ ン 要求） の 菌体 を 常法 に よ り E M S 処理 （ 1 w / V ¾ 、 3 0 。C で 3 時間 ) し た の ち 、 栄養寒天培地 （ G P 寒天培地、 大 五栄養化 学株式会社製） に 接種 し 、 . 3 0 °C で 2 日 間 培養 し 、 第 6 ノ表 に示す成分 か ら な る 基本寒天培地 （ A ) と 、 酢酸 ナ ト リ ウ ム 3 水和物 を 5 ダ を 含 む基本寒 天培地 （ B ) に 各 々 レ プ リ カ し た 。 次 に 3 0 で で 3 日 間培養 し た 本寒天 培地 （ B ) で の生育が基本寒天培地 （ A ) で の生育 よ り 有意 に よ い コ ロ ニ ー を 釣菌 し た 。 次 に第 6 表 に 示す成分 か ら な る 発酵培地 （ B ) 3 ； ^ を 1 8 の試験管に 分注 し 、 滅菌後各 々 の コ ロ ニ ー を 植菌 し 、 ピ ル ビ ン 酸発酵 を 行 い ビ ル ビ ン 酸の 蓄積量、 対糖収率 を 調べ収率 の 向上 し た 抹 ト ル ロ ブ シ ス · グ ラ ブ ラ ー タ A C I 3 3 を得 た 。 実施例 7 ( D C 活性 の 測定）

第 6 表 に 示す 基本培地 を 5 0 0 W の 坂 口 フ ラ ス コ に 1 0 0 づ っ分注 し 、 1 1 5 °C で 1 5 分間 滅菌 し 、 培 地 に 試験菌株 ト ル ロ ブ シ ス · グ ラ ブ ラ ー タ T R — 2 0 2 6 お 5 よ び ト ル ロ ブ シ ス · グ ラ ブ ラ ー タ A C I 3 3 を 各 々 接種 し 、 3 0 °C で 3 0 時 間 振 と う 培養 し た 。 培養液 力 ら 菌体 を 分 離 し 、 p H 7. 2 の 0. 2 M カ リ ウ ム一 リ ン酸緩衝 液で 2 回 洗浄 し 、 上記緩衝液 1 に 懸濁 し 、 超音波処 理 （ 2 0 分 間 ） し 、 遠 心分離 し て 不溶分 を 除 き 、 得 ら れ た 上 Iひ 清 を 酵素液 と し た 。

次 に 、 第 2 表 に 示す 酵素反応 液 を 調整 し 、 3 0 °C で 2 0 分間 酵 素反応 を 行 い 、 2 塩酸 に 溶 か し た 0. 5 m M の 2 , 4 ー ジ ニ ト ロ フ エ ニ ル ヒ ド ラ ジ ン を 1 カ卩 え 、 反 応 を 停止 し 、 生成 ア ル デ ヒ ド を ヒ ド ラ ゾ ン 化す る た め 1 5 5 分 間 静置 し 、 メ タ ノ ー ル を 2 加 え ヒ ド ラ ゾ ン 化合物 を 溶解 し 、 高速液体 ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー に て ァ セ ト ァ ル デ ヒ ド の 2 ， 4 — ジ ニ ト ロ フ エ ニ ル ヒ ド ラ ゾ ン を 定量分析 し た 。

な お 、 対照液 と し て は ビ ル ビ ン 酸 を 除 い た 反応液 を 用 0； い た 。

5： 成 分 容 量

0.18 Mビルビン酸ナト リゥム水溶液 0. I ml 1 V / u ノ Γ^ί^·¾? U. U Ο ml

0· 05 Μクヱン酸緩衝液 （ ρ Η 6.0 ) 1. ύ 5 nl 酵 素 液 0, 1 ml

結 果は 第 3 表 に示す ご と く 、 ト ル ロ プ シ ス · グ ラ ブ ラ — タ A C I 3 3 株の P D C 活性は 親株 の約 1 Z 2 に低下 し て い る 。

3S: 珠 PDC相対活性 トノレロプシス ·

株 グラブラータ I 00

TR- 2026

トルロプシス ·

子 抹 グラフラータ 52

AC I 33 実施例 8

第 6 表 に示す 成分か ら な る 発酵培地 （ B ) を 1 の マ ィ ャ 一 フ ラ ス コ に 4 0 » づ っ分注 し 、 1 1 5 °Cで 1 5 分 閭滅菌 し た 。 次 に 、 別滅菌 し た 炭酸 カ ル シ ウ ム 4 % を.添 加 し 、 ト ル ロ ブ シ ス · グ ラ ブ ラ 一 タ A C 1 3 3 を 一白 金 耳接種 し 、 3 0 で で 7 0 時間回 転振 と う 培養 し た 。 培養 液中 に生成 し た ビ ル ビ ン 酸 を 高速液体 ク ロ マ ト グ ラ フ ィ 一 に て定量 し た 。 結果 を 第 7 表 に 示す。 実施例 9 ( — ィ ソ ロ イ シ ン お よ び — パ リ ン 二

株 の取得 ）

ト ル ロ プ シ ス · グ ラ ブ ラ ー タ T R — 2 0 2 6 ( ニ コ チ ン 酸、 チ ア ミ ン 、 ピ リ ド キ シ ン 、 ピ オ チ ン 要求） の菌体 を 常法 に よ り E M S処理 （ 1 wノ V ¾ 、 3 0 °C で 3 時 間 ) し た の ち 、 栄養寒天培地 （ G P寒天培地、 大五栄養化 学株式会社 製） に 接種 し 、 3 0 °C で 2 日 間培養 し 、 Bacto Yeast Carbon Base ( D I F C O ( 株） 製、 以下 、 Y C B 培地 と 略す ） に、 硫 安 5 ノ を 加 え た寒 培地 （ ェ ) と Y C B 培地 に 硫安 5 ί Ζ 、 L — イ ソ ロ イ シ ン と L — バ リ ン を 各 々 1 0 0 wノ を カ卩 え た 寒天培 地 （ E ) に 各 々 レ プ リ カ し た 。 次 に 3 0 で 3 日 間 培養 し 、 寒 天 培 地 （ E ) で生育 し 、 寒天培地 （ I ) で生育しないコ ロニーを釣菌分 離 し た 。 次に 、 寒天培地 （ 1 ) か ら し一イソロイシンまたは Lーパ リ ンを各々除いた各培地で生育するコ ロニーを除いて、 L一イソ口 ィ シ ン お よ び L ー バ リ ン二 重要求性変異株 卜 ル ロ プ シ ス • グ ラ ブ ラ 一 タ X — 6 8 を 取得 し た 。

実施例 1 0

( ィ ソ ロ イ シ ン 、 バ リ ン要求性 の 検定）

下記第 4表 に示す 各菌株 を 、 G P 寒天斜面培地で 2 4 時間 培養 し そ の 菌体 を ご く 微量か き と り 、 L 一 イ ソ ロ イ シ ン と L 一 ノ、' リ ン を添加 し な い Y C B寒 天培地 お よ び L — イ ソ ロ イ シ ン の み 0. 0 1 % 、 L — ノ、' リ ン の み 0. 0 1 % , L — イ ソ ロ イ シ ン と L — ノ、' リ ン を 各 々 0. 0 1 % を 含 む Y C B 寒天培地 に う す く 塗布 し 、 3 0 °C で 4 日 間 培養 し そ の 生育 の 有無 を 観察 し た 。 ① L — イ ソ ロ イ シ ン お よ び L ー ノ リ ン無添加、 ② L — イ ソ ロ イ シ ン の み添加、 お よ び ③ L 一バ リ ン の み添加の寒天平板培地で生育で き ず、 ④ L — ィ ソ 口 ィ シ ン と L 一 バ リ ン 同時添加寒天平板培地で 生育 す る も の を L — イ ソ 口 ィ シ ン お よ び バ リ ン 二重要求 5 性変異株 と し た 。

結-果は 第 4 表に示す と お り で あ り 、 L ー ィ ソ ロ イ シ ン Z バ リ ン二重要求性株 ト ル ロ ブ シ ス · グ ラ ブ ラ ー タ X — 6 8 は 、 親株の ト ル ロ ブ シ ス · グ ラ ブ ラ 一 タ T R— 2 0 2 6 と の比較よ り 明 ら ^ に 、 L 一 イ ソ ロ イ シ ン と L — バ Iひ リ ン の二重要求性 を獲得 し てい る 。

4

20 (注） +：生育あり ―：生育なし

11 e ： イ ソロイシン Va 1 ： バリ ン 実施例 1 1

( ビ ル ビ ン 酸の生産）

第 6 表 に示す発酵培地 （ A ) を 1 の マ イ ヤ 一 フ ラ ス

25 コ に 4 0 づ っ分注 し 、 滅菌後、 別滅菌 し た炭酸カ ル シ 、 · 一 R — 2 0 2 6 お よ び ィ ソ ロ イ シ ン 、 バ リ ン 二重要求性変 異株 ト ル ロ ブ シ ス · グ ラ ブ ラ 一 タ X — 6 8 を 各 々 接 種 し 3 0 °C で 6 0 時 間 培養 し た 。 た だ し 、 変異株 は 発酵培地: に L 一 イ ソ ロ イ シ ン と L — バ リ ン 各 々 0. 0 1 を 添加 し て 培養 し た 。 培養液 中 に 生成 し た ピ ル ビ ン 酸 を 高速液体 ク ロ マ ト グ ラ フ ィ 一 に て 定量 し た 。

結果 を 第 7 表 に示す 。

ト ル ロ ブ シ ス · グ ラ ブ ラ ー タ X — 6 8 を 用 い た 方法 は- 蓄積 濃度、 ピ ル ビ ン 酸生成収率 と も い ず れ も 親株 よ り 顕 著 に 向 上 し て い る 。

実施例 1 2

( ァ ミ ノ ォ キ シ 酢 酸耐性株 の 取得）

ト ル ロ プ シ ス · グ ラ ブ ラ ー タ T R — 2 0 2 6 ( ニ コ チ ン 酸 、 チ ア ミ ン 、 ピ リ ド キ シ ン 、 ピ オ チ ン 要求 ） の菌体 を 常法 に よ り 、 E M S 処理 （ l w z v 3 0 °C で 3 時 間 〉 し た の ち 、 8 m M の ァ ミ ノ 才 キ シ 酢 酸 を 加 え た 第 6 表 に 示 す 基 本 寒 天 培 地 （ A ) に 接種 し 、 3 0 °C で 5 日 間培養 し 、 生育 し て き た 大 き な コ ロ ニ ー を 釣菌 し た 。

次 に第 6 表 に示 す 発酵培地 （ A ) を 、 1 8 の 試験管に 分 注 し 、 滅菌後 、 各 々 の コ ロ ニ ー を 植菌 し 、 .ピ ル ビ ン 酸発酵 を 行 い 、 ピ ル ビ ン 酸 の 蓄積量 、 対糖収率 を 調 べ、 有意 に収 率 の 向上 し た 株 ト ル ロ ブ シ ス · グ ラ ブ ラ ー タ A O A — 8 を 得 た 。

実施例 1 3

Q ( ァ ミ ノ ォ キ シ酢 酸の 耐性度 の 検定）

親株 ト ル ロ ブ シ ス · グ ラ ブ ラ 一 タ T R — 2 0 2 6 及 び ト ル ロ ブ シ ス · グ ラ ブ ラ ー タ A O A — 8 を 、 ア ミ ノ ォ キ シ 酢酸を 各 々 0 m M、 2. 5 m M―、 5 m M、 8 m M含 む 第

5 6 表 に示す基本培地 に 、 同量接種 し て 、 3 0 で 2 4 時 閭 培養 し 、 菌体の生育度 を 測定 し た 。

結果 は第 5 表 に示 す よ う に 、 ト ル π プ シ ス · グ ラ ブ ラ — タ A O A — 8 は 、 親株 に 比 し 、 高濃度の ア ミ ノ ォ キ ジ 酢酸を 含 む 培地 で生育が阻 害 さ れず 、 ァ ミ ノ ォ キ シ 酢酸 の 耐性株 と な っ て い る 。

篛 5 差

5

0 実施例 1 4

( ピ ル ビ ン 酸の 発酵生産）

第 6 表 に示す 発酵培地 （ A ) を 、 1 の マ イ ヤ 一 フ ラ ス コ に 4 0 づ っ分注 し 、 滅菌後、 別滅菌 し た 炭酸カ ル シ ゥ ム 4 % を 添加 し 、 親株 ト ル ロ プ シ ス · グ ラ ブ ラ 一 タ5 T R - 2 0 2 6 及 び ァ ミ ノ ォ キ シ 酢酸耐性株 ト ル ロ プ シ · ー — 一

3 0 °C で 6 0 時間 培養 し た 。 培養 後、 ピ ル ビ ン 酸 を 高速 液 体 ク ロ マ ト グ ラ フ ィ 一 に て 定 量 し た 。 結果 を 第 7 表 に 示 す 。 ： ト ル ロ ブ シ ス · グ ラ ブ ラ ー タ A 0 A — 8 を 用 い た 方 法 は 、 蓄積濃度 、 ピ ル ビ ン 酸生成 収率 と も に 、 親株 よ り 顕 著 に 向 上 し て い た 。 第 6 表 基本寒天培地 発 酵 培 地

Πι 77

(A) (Β) . (A) (Β) ク' フレ コ 一 ス 1 0 g 1 09 1 0 9 1 00 ? 1 0 0 硫 安 5 9 5 9 5 9 1 9 1 9

'酢酸ナトリ ウム 3水和物 0 5 9 0 0 5 9 KH₂ P0₄ 1 9 1 1 9 1 9 1

MgS0₄ · 7H₂0 0.5 9 0.5 9 0.5 0.5 9 0.5 9 酵 母 エ キ ス 0.1 9 0.5 9 0.1 9 ペ プ ト ン 3 0 9 3 0 ピリ ドキシ ン ·塩酸塩 400 //^ 400 ζ ニ コ チ ン 酸 2 2 チ ア ミ ン · 塩酸塩 5 μ 9 5 μ 9 ピ オ チ ン 5 μ 9 5 μ 9 寒 天 2 0 9 2 0 g

=·|. 且

α ST 虽 1 £ p H 5. 5 に調整 ビルビン酸蓄積量

実繊 菌 珠 対消費糖収率

9 / (¾) ト jレロプシス ·

1 グラブラ一タ 49.5 49.5 T - 2026

ト jレロプシス ·

1 クラフラータ 44.0 44.9 ATCC 32936

ト jレロプシス ·

2 メタノロべッセンス 20.5 410 TR- 2044 ト jレロ プシス ·

5 クラブラータ 55.8 58.0

X- 15

ト _；レロプシス ·

8 ク ラブラータ 56.8 57.9

AC H 33

トルロプシス ·

1 1 グラブラータ 53.0 55.0

X-68 トリレロプシス ·

1 クラフラータ 55.5 57.1

AOA-8

産 業上 の 利 用 可 能性

ピ ル ビ ン 酸は 生 体代謝の 重 要な 中 間 体で あ り 、 各種 医 • 農薬 な ど の有効 な 合成原料で あ る の み な ら ず 酵 素法 に よ る L一 ト リ プ ト フ ァ ン 、 L— シ ス テ ィ ン 、 L 一チ ロ シ 5 ン な ど の ァ ミ ノ 酸合 成 の 主要原料 で あ る 。 よ っ て 安 価 に 製造 し 得れ ば 、 種 々 の合成 原料 と し て 有用 で あ る 。

L0

15

,0

25

Claims

請求の範囲

(1) ト ル ロ ブ シ ス （ Torulopsis ) 属 に羼 し 、 生育 の た め に チ ア ミ ン お よ び ピ オ チ ン を 要求 し 、 カ っ ピ ル ビ ン酸 生産能 を有す る 微生物 を培 養 し て 培養液中 に ビ ル ビ ン 酸 を 生成蓄積せ し め 、 前記培養液 中 よ り ピ ル ビ ン 酸 を 採取す る こ と を 特徵 と す る 発酵法に よ る ピ ル ビ ン 酸の 製造法。

(2) 微生物 が生育の た め に ア ル ギ ニ ン を 要求す る こ と を 特徵 と す る 特許請求の 範囲第 1 項記載 の発酵法に よ る ビ ル ビ ン 酸の 製造法。

(3) 微生物 が親株 よ り も 低い ピ ル べ 一 ト デ カ ル ボ キ シ ラ ー ゼ活性 を 有す る こ と を 特徵 と す る 特許請求 の 範囲 第

1 項 記載の発酵法 に よ る ピ ル ビ ン 酸の 製造法。-

C4) 微生 物 が生育の た め に イ ソ ロ イ シ ン お よ び バ リ ン を 要求す る こ と を 特徵 と す る 特許請求の範囲第 1 項記載 の発酵法 に よ る ビ ル ビ ン 酸の 製造法。

(5) 微生物が ア ミ ノ ォ キ シ 酢酸 に対 し て 耐性 を 有す る こ と を特徵 と す る 特許請求の 範囲第 1 項 記載の発酵法に よ る ビ ル ビ ン 酸の 製造法。

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