WO1987003602A1

WO1987003602A1 - Anticytomegaloviral human monoclonal antibody and process for its preparation

Info

Publication number: WO1987003602A1
Application number: PCT/JP1986/000613
Authority: WO
Inventors: Yasuhiko Masuho; Toru Sugano; Yoh-Ichi Matsumoto; Shigeki Fujinaga
Original assignee: Teijin Limited
Priority date: 1985-12-06
Filing date: 1986-12-02
Publication date: 1987-06-18
Also published as: DE3650032D1; DE3650032T2; AU6721887A; EP0248909A1; KR880700823A; ATE110084T1; EP0248909B1; AU590656B2; KR910000736B1; US5043281A; EP0248909A4

Description

明

発明の名称

サイ卜メガロウィルスに対するヒ卜 ♦ モノクロ一ナル抗体とその製造法

技術分野

本発明は、サイ卜メガロウィルス（Cytomegaio-virus, 以 F CM Vと略記する）に対するヒ卜モノクローナル抗体（monoclonal antibody, 以下 M CAと略記する〉とその製造法に関する。その目的とするところは、 GMV感染症の診断，予防及び治療に役立つところの、 ClMVに '特異的なヒ卜 M CAを提供することにある。

½景技術

C iVI Vはヘルべス ♦ ウィルス属に属するウィルスの一つであり、 D A, コアタンパク，力プシッドとェンビロープから成っている。このウィルスが人間に感染しても、多くの場合何の疾病も引き起こさない。しかしながら、免疫能力の低下した新生児では肝炎を起こしたり、臟器移植のために免疫抑制された患者に間質性肺炎を起こし、しばしば致命的な感染症を引き起こす。従って、この感染症の診断，予防及び治療は大きな医療ニーズがある。 Cond I eB (Ameri can J. Hed i c i ne, March 30, 134- 141, 198 参照〉は骨髄移植患者に杭 CM V抗体価の高ぃヒ卜血清グロプリンを投与し、 CM V感染とそれによる間質性肺炎を防ぐことに成功している。高力価のヒ卜血清グロプリンは、血清提供者の抗体価をあらかじめチェ、クし、高力 iffiである血槳のみを収集して分画される。この方法で得られる血清グロプリンの、 CM Vに対する抗体価はランダムに収集されたものの高々 10倍にしか過ぎず、かっこのように高力価血清グロブリンを収集することは非常に困難であり、安定に供給することができない。

Mi I steinと (fillerによつて確立されたハイプリドーマ法によって、高純度の抗体、すなわち M CAが作製できるようになった。 asmussen ら (Proc. Watに Acad. Scに USA, 81,876-880, 1984 参照〉は C M Vをマウスに免疫し、そのマウス脾細胞とマウス ♦ ミエローマ細胞を融合することによって、 V特異的 iVI C Aを産生するハイァリドーマを作製した。彼女ら以外にもいくつかの研究グループが C M Vに対するマウスの IV1 C Aを得ている (例えば、 Goldstein ら， Infection and Immunity, 38 .273-281, 1982; Pe「eiraら， Infection and Immunity, 36_; 924-932,. 1982 参照）。これらの M GAの中にあつて、ウィルスを中和する活性を有する M CAは少ないが、 Rasmussen らの M CAは、約 10〃g で CM Vを中和する能力がある。これは高力価血清グロプリンと比較したとき、極めて高い中和活性であり、このような M CA による C M V感染症の予防あるいは治療が期待される。しかしながら、これらはマウス由来の M C Aであり、人体に投与したとき異物として認識され不都合な副作用を引き起す。そこで、マウス由来でなく、ヒ卜由来の抗 C iVI V ♦ M C Aが望まれる _c

一般にヒ卜由来の M C Aはマウス ♦ ミエ口一マ細胞，ヒ卜 ♦ ミエ LJ一マ細胞あるいは他のリンパ系樹立細胞とヒ卜 ♦ リンパ球とを細胞融合して得られるハイプリド一マから産生される。あるいはヒ卜 ♦ リンパ球を E Bウイルスによって変異させたリンパ芽球細胞からも産生される： 1980年から現在まで、多くのヒ卜 M C A作製の試み • -がなされてきた.が、いずれの方法もそれぞれ固有の問題- をかかえているつマウス ♦ ミエローとヒ卜 ♦ リンパ球との細胞融合で得られたハイアリドーマの M C A産生は不安定であるし、ヒ卜 ♦ ミエ口一マ細胞とヒ卜 ♦ リンパ球との細胞融合は極めて効率が悪い。また E Bウィルスによつ τ得られるリンパ芽球細胞の M C Α産生は量が少なく、かつ不安定である- その上、 Ez Bウィルスは腫瘍を引き起こす能力を有し〔おり、安全性上大きな問題がある。このように j C A産生細胞を樹立する技術において大きな障害があるが、さらにもう Ί つ、特定抗原に特異的なヒ卜 Aを得るためには大きな障害がある。それは十分に免疫されたヒ卜 ♦ リンパ球を得るという課題である。一般に £常人のリンパ球は C M Vによって感作されていることが多いが、その免疫度合いは極めて低い c 従って、正常人のリンパ球からハイプリドーマあるいはリンパ芽球細胞を樹立しても、抗 CMV * MCAを産生する細胞を得られる見込みはほとんどない。

CM Vに対するヒ卜 MG Aについては Ίつだけ産生細胞株が得られたとの報告がある（ J. Immunol. _; 133,

2^02-2205, 198 参照〉。これによると、正常人リンパ球を E Bウィルスで変異させて、 MC A產生細胞株が得られている- しかしながら、記載されている内容は一葉の螢光抗体写真のみであり、！VICAを安定に産生している細胞株が樹立できたのか否か明白ではない。さらに前述したように、 E B'ウィルス由来の発癌性も問題があり、人体に投与することは大きな危険を伴う。また、この方法によつて得られた M C Aは、 C iVI Vに結合するとしても C M Vを中和する能力を全く有していないことが明らかにされている。

以上の如く、目的とする特異性を有するヒ卜 iVIC Aを効率よく収得する上で最も大きな問題は、ヒ卜 ♦ リンパ球を特定の抗原で十分免疫することが困難であるということである- マウスの場合には、生体にとって有害な抗原であっても投与し得るし、さらに都合のよい投与スケジュールで免疫することができるが、人間の場合にはこれができない。 CMVは病原体であり、ワクチンが出来ていない現在、人間に CM Vを故意に投与し、免疫することは倫理上許されない。ヒ卜 MCAを作製する上で、次に問題となる点は、ヒ卜 M C Aを安定に産生する細胞を樹立する方法である。ハイプリドーマ法も E B V法も一長一短があることは前にも述べた通りである。

発明の開示

本発明者らは、抗 C!M V * ヒ卜 M CAを取得することを目的として鋭意研究を行った結果、 in V ro でマイ卜—ジェン存在下に、 C V又は C M V由来の蛋白若しくは糖蛋白で感作したヒ卜 ♦ リンパ球と、マウス ♦ ミエローマ細胞とを融合させる方法によって、抗 CM V ♦ ヒ卜 |V1 C Aを産生するハイァリドーマを得ることができた , ：そして、このハイ 7·リドーマ及ひ / 乂-はそれに由来する細胞株を培養し、培養上清から抗 C VI V ヒ卜 IV1 CAを採取することができた。

本発明のヒ卜 iVl C Aは、 C M V及び/又は C M V感染細胞に反応する抗体である。本発明の抗 CM V ♦ ヒ卜 M 〇 \ので好ましいのは Ϊ gG1型のものであり、これはまた 2つの種顇に分けられる。一方の種類の M C Aは、分子鼂約 64, 000の CM V抗原蛋白 . または分子量約 64, 000 の抗原蛋白を主成分と _する複数の C;Vl V抗原蛋白を認識する。他の種類の iVl (〕 \は、分子譽約 130.000 と約 55,000の CM V抗原蛋白を認識する。そして、後者は、 C M Vを中和する能力を有し、ァメリカンタイプ力ルチヤ― コレクション（ A T C C に寄託番号 HB9215 として寄記されているハイアりドーマじ 41 、又はそれと同様な抗原蛋白を認識するハイプリドーマによって産生される。

図面の簡単な説明 - .

第 Ί図は、本発明の抗 CM V ♦ ヒ卜 M CAの、 CM V に対する中和活性を示す図である。第 2図は、本発明の抗 CM V.♦ ヒ卜 IM G Aの免疫沈降分析の結果を示す図でめる。

発明を実施するための最良の形態

本発明において用いられるヒ卜 ♦ リンパ球は脾臓，リンパ節，末梢血，骨髄，扁桃，アデノイド等の中に含まれている。本発明の目的のためには、いかなるソースのリンパ球でも用いることができるが、. 望ましくは脾臓，骨髄又は扁桃である。

マウスのミエローマ細胞としては、 8—ァザグァニン耐性株を用いるのが有利であり、公知のものとしては、

BALB/Cマウスの P3x 65Ag8株， P3-WS1/1- 株， P3x 63/\gU1株, SP2./0Ag14 株， P3x 63Ag8.6.5.3 株， MPC11- 45.6.1G1.7株， SP- 1株等がある。

本発明においては、ヒ卜のリンパ球とマウスのミエ口 —マ細胞とを融合させるに先立って、ヒ卜のリンパ球を in V roでマイ卜 —ジ 1ン存在に抗原感作する。ヒ卜の場合、正常人では CM Vに対する抗体を産生し得る能力のあるリンパ球は存在しても、その数が極めて少ないそのため目的とするハイプリドーマが得ら.れる可能性が極端に低い。これに対して本発明の i n v roでヒ卜 ♦ リンパ球を感作する方法を採ったときには、その抗原に特異的な抗体を産生するリンパ球が選択的に分化、増殖し、その結果、効率よく目的の M C Α産生ハイプリドーマを得ることができる。

本発明の実施例においては、感作抗原として C Vの A D 169 株が用いられているが、他の実験用 CM V株あるいは臨床分離 C iVl V株でも感作できる。さらに〇 M V そのものなく、その構成蛋白若しくは構成糖蛋白を闬いてちよい。

7ィ卜一ジ 1ンとじては、 -リンパ垛の分化及び増殖を促進させるものならば何でもよいが、例えば、ポークウイードマイ卜ジ1ン（ PWM ) , B細胞増殖因子（B eel I growth factors, Bじ GF) , ァロ亍イン A , フィ卜へム - グルチニン（ P H A ) ，コン力ナバリン Aがある _σ 好ましいのは 2 〜 '200 Q / /^の PWMあるいは 100 分の Ί 容から 3分の Ί 容の BCGFである。

感作の法条件は特に限定されるものではないが、抗 ( 0 V , 又は〇 iVl V由来の蛋白若しくは糖蛋白）の濃度は 'し " g , i 〜 Ί ng ,' ηέ _f Ρ W： Iは 2〜 200 , ϊά, Β C (3 Fは 100 分の 1 容から 3分の Ί 容，リンパ球 (抗体産生細胞）の濃度は Ί、Χ 10⁵ 〜 1 x 10⁷ 個./ /^が適当であり、培養温度は 35〜4(TCで培養時間は 4〜10日、好ましくは 6〜8曰である。培養液は人，牛，馬等の血清を含むものなら何でもよいが、特に胎児牛血清（ F C S ) を含む培養液（例えば R PM I 1640) が好ましい。

かくして得られた CiM Vで感作したヒ卜の抗体產生細 ' 胞とマウスのミ丄ローマ細胞とは、次いで公知の方法に ' 従って細胞融合せしめられる。例えば、リンパ球とミエローマ細胞を 10： Ί 〜 Ί : 100 、好ましくは 1 ： Ί 〜 Ί 10の比率で混合し、適当な細胞融合溶液、例えば約 35% ポリエチレングリコール（分子量 1,000 〜6,000 程度〉および約 7.5 %ジメチルスルホキシドを含む R P M I 1640を加えて、室温〜 37°Cで Ί 〜数分間攪拌し、その後 10% F CS加 R P [ 1640で徐々に希釈し、洗浄の後、' H A T ( ヒポキサンザン一アミノプ亍リン一チミジン）選択培養液にて細胞濃度が Ί 〜 5 X 105 個 /^となるように調整する。これを 0.2 ^ずつ、例えば％穴プレー卜に分注し、 5 % 002を含む空気中で35〜38。0で 3〜 4週間培養する。 H A T培養液中ではハイプリドーマのみが生存し、 8— ァザグァニン耐性のミ丄ローマ細胞及びミ 1口マ同十の融合細胞は生存し得ない（未融合の抗体產生細胞は数曰で死滅する）。

培養後、培養液中の抗体価をチェックし、目的とする杭体を產生しているハイブリドーマのみを選択し単離する（クローニング〉。培養液中の抗体価のチェックは、ラジ τίィムノアツセィ法（ R I A ) , 酵素抗体法（ E L I S A , 螢光抗体法などの、抗原への抗体の結合そのものを検出する方法と、ウィルスの生物活性を阻害する抗体の活性をみる方法等で行なうことができる。クローニングによって選択された、本発明の抗 CM V ♦ ヒ卜 M

C Aを産生するマウス一ヒ卜ハイプリドーマは、凍結して保存することができる。かかるハイプリドーマのセルライン（細胞株）及び/又はそれに由来する細胞株を適当な方法で大量に培養すると、培養上清から本発明の目的とするヒ卜 M GAを得ることができる。また、このハイブリドーマを動物に移植して腫瘍化し、その腹水や血清からヒ卜 M CAを得ることもできる。

以上の如-くして得られた抗 CM V ♦ ヒ卜 M CAは、次のような特性を有する。本発明で得られた抗 CMV ♦ ヒ卜 M CAは、多くの実験用 CM V株及び臨床分離株に共通に反応する。しかし、他のヘルぺス群ウィルスである単純へルぺスウィルス， E Bウィルス，水痘帯状疱疹ゥィルスには反応しない。また CM V感染細胞には反応するが、非感染細胞には反応しない。従ってこれらの M C Aは CM Vに特異的であるといえる。このように CM V に特異的であることが明瞭に示されたヒ卜 M CAは、本発明において初めて得られたものである。

CM Vは多くの抗原物質によって構成されている。そこで、本発明のヒ卜 M CAがどのような構成成分に対して反応するのか検討した結果、第 1群の M CAは分子量約 64,000の蛋白（糖蛋白を含む、以下同じ〉、ないしは約 64， 000を主成分とする複数の抗原蛋白に反応することがわかった。これらの M C Aは、ウィルスを中和する能力を有していない。一 5、第 2群の M CAは分子量約 130,000 の蛋白と分子量約 55, 000の蛋白に反応し、この群の M C Aの中には強いウイルス中和活性を有している M C Aがあることがわかった = これらの特性から考えて、 CM V感染の診断には、第 Ί群と第 2群の M CAが使用し得るが、 CM V感染の予防及び治療には第 2群の M C Aが適している。

本発明においては抗原物質を特に限定するものでなく、 C M V特異的ヒ卜 M C Aはすべて本発明の範囲に含まれる。しかし、予防及び治療という目的から考えたとき、 !VI CAにウィルス中和（不活化）活性があるという点は極めて重要な特性である。

以下、実施例により本発明を詳述する。

実施例 Ί

(1) CM V抗原の作製

単層に増殖した H E L細胞に、 A D169 株感染細胞を 7 ： Ί の割合で混ぜ、 5日間 C02インキュベータ一中で培養した。こうして得られた感染細胞を、 0.1 % E D T Aを含むリン酸緩衝生理食塩水ではがし、集めた。次いで、 45秒間超音波破砕し、 3000rpm で 20分間遠心した上清を得た。これを 60 %と 20 %の重層ショ糖溶液の上に乗せ、 10,000x g で Ί 時間遠心した。 60%層と 20%層の間にウィルスは集まるので、これを採取し、再度超音波処理によってよく分散させた。これを 1,28g/c ³ の CsG 溶液の上にのせて、 100,000 X g で 42時間遠心した。その結果、密度勾配が形成された CsG 溶液の 1.29g/cm³ 濃度のところに GM Vが集まったので、これを採取し、 in vitro感作用抗原として用いた。

また E L I SA用の抗原は次のように調製された - A D 169 を感染させた H E L細胞を G0₂インキュベータ一中で培養し、細胞変性がすべての細胞に観察されるようになつ.た時点で、感染細胞を集めた - この感染細胞を 3 分問超音波処理し、 3000rpm で 20分間遠心し'、その上清を得た。これを E L I S A用抗原として用いた。

(2) CM Vによるりンパ球感作

ヒ卜の睥贜リンパ球を培養液 A ( R P I 1640+ 20% 眙 ¾牛血清 + 20mM H E P E S + 2 グルタミン + Ί

a ビルビン酸十 0.02mg_/ ^/ /^セリン十 80 g ノ i ザンマイシン〉に浮遊させた _π 細胞濃度は 12 Χ 10⁵ 個/ であった。この細胞浮遊液を Ί っ、培養プレー卜（ 24 穴）の 15穴に入れた。それらを 3穴ずつ 5群に分け、第 Ί 群は無添加、第 2群には CiVl V抗原 12ngタンパク Ζ 、第 3群には B C (3 F 0.1 i , 第 5群には同量の C VI Vと B C G F、第 5群には C VI Vと 20 g Z の P W Mを添加した。この培養プレー卜を 37C, 5 % C0₂含有空気で 6日間培養した。マウス ♦ ミエ口—マ細胞 P 3 X 63Ag 8 U Ί株（ P 3 U Ί と略記する）との細胞融合

前もって P 3 U 1 を培養液 B ( R PM I 1640+ 10%胎児牛血清 + 2mMグルタミン + 80jc g i ゲンタマイシン）中で培養しておいた。使用時の細胞濃度は 6 X 10⁵ 個ノであった。上記（2) の感作リンパ球（ 3穴を一緒にした） 5群と P 3 U 1 を、それぞれ別々に無血清 R PM I 1640で 2回洗浄した。各群 3穴のリンパ球と 5 X 10^ 個の P 3 U Ί とを試験管の中で一緒にした。 1500rpm で 5 分間遠心し、上清を捨てた。細胞ペレツ卜を、試験管をたたくことによって；よく分散させた - これに 0.5 のポリエチレングリコ-—ル液（ R P M 1 5.75 +ポリエチレングリコール 1000 3.5 +ジメチルスルホキサイド 0.75/^ ) ( P E G液と略記する）を加えて、細胞をゆるやかに浮遊させた - 1 分後に 0.5 R PiVI I 1640 を加え、さらに 1 分後に 1 R P M I 、さらに 2分後に 4 /^の 4.\了'培養液（ ^ 1 1640+ 20%胎児牛血清 + 80^g / i ゲンタマインシン + IV1ヒポキサンチン + 0.4 ^ Mアミノプテリン + 1.6 . Mチミジン）、さらに 2分後にはの HA T培養液を加えた。最後に、 HA T培養液で細胞浮遊液とした。これを培養プレー卜 ( 96穴〉 Ί枚に蒔いて、 37 . 5 % C0₂含有空気中で培養した。 Ί 週間毎に半量の培養液を斩しい H T培養液 ( HA Tから Aを除去したもの）で交換していきハイブリドーマを得た。

(4) ヒ卜 IgG と抗 CM V抗体の測定

• E L I S Aによって測定した。ヒ卜 IgG を測定するためにャギ抗ヒ卜 IgG 抗体 mi ) を、あるいは抗 5 CM V抗体を測定するために CM V ( A D 169 株〉 2 .U Q タンパク.//^を 50 ^ /'穴ずつそれぞれファルコン ♦ ミクロテス卜 ΠΙの 96穴プレ一卜に固定した _c このプレ一卜にハイアリドーマ培養上清 60 ^を加えて、室温で Ί 時間放置した。 1 %牛血清アルブミン（ B S A ) を含

10 有するハンクス塩類緩衝液（ H B S S— B〉で 3回洗浄

' - の後、ャギ抗ヒ'卜 igG 抗体一アル'力りフォスファターゼ

000倍希釈液）を 60 ^加えて、室温で 1 時間反応させた - さらに H B S S— Bで 3回洗浄したのち、 P—二卜口フエニルノォスフェートを 1 Mジエタノールァミン is + Ί iVl gO の ρΗ9,δ 溶液に 0.6mg /^の割合で溶かした溶液 100 を如えた。 30分から 60分後に 405nm の吸光 ¾を測定し、檫準】G 液あるいは標準 CiM V陽性血清との比較から、その値を算出した。

全群とも％穴ァレート Ί 枚に細胞を蒔き、 96穴中の、

20 ハイプリドーマが成育してきた穴の数（肉眼で判定〉、さらにそのうちヒ卜 IgG を產生しているハイブリドーマをもつ穴の数、そして抗 C M V抗体を産生している穴の数を第 Ί 表に示した。 C iVl Vと B C Θ卜を加えたときに最も多くの抗〇 'VI V抗体產生ハイプリドーマが成育した in v i tro 全ハイプリ igG 抗 CMV

ドーマ

感作 (肉眼判定〉産生

1 無添加 18 12 0

2 C IV！ V 20 27 1

3 B CG F 81 93 6

4 CM V + 84 96 32 B CG F

5 C !Vl V十 55 29 3 P WM 実施例 2

ヒ卜脾臓リンパ球を、実施例 Ί の（2) の如く CM Vあるいはで感作し、実施例 Ί の（3) の如く P 3 U Ί と細胞融合を行なつた。得られたハイプリドーマのうら CiM Vに対する M CAを産生しているハイプリドーマを以 Fの如くクローニングした。

(1) ハイァリドーマのクローニング

クローニングは限定希釈法を用いた。抗 CM V抗体陽性の穴より細皑を取り出し、細胞数を数え培養液 Bを用い Ί個. /穴あるいは 10個 /穴で細胞を蒔いた。 2週間後に細胞が十分増殖したので、その上清に抗 CiVI V ♦ C Aがあるか否かを E L I SAによって測定し、抗 CMV ♦ M CA産生ハイプリドーマを選別した。

こうして、ハイプリドーマ C 1 , C 3 , C 4 , C 7 , C 23反び G 41が樹立された。これらのハイプリドーマは安定に IgG 型の抗 CM V ♦ ヒ卜 M C Aを産生し続けている。ハイプリドーマ C41 は、アメリカンタイプカルチヤ — コレクション（ A T C C ) に 1986年 9月 2 9 日に寄記され、寄記番号は HB92I5である。

(2) 抗 CM V ♦ ヒ卜 M CAの調製

得られたハイプリドーマの 1つ CM1を無血清培地 I T ビ S ( R P I 1640 2容 +ダルべッコ—M E M Ί 容 + F 12 Ί 容十インシュリン 8.5 g / + 卜ランスフェリン 2 9 / +エタノールァミン 20 M +セレナイ卜 2.5 X 10-3 M ) 中で培養した。その培養上清を限外濾過 ( アミコン P30) で濃縮し、 0.02Mリン酸ナトリウム ( p H 7. δ >に対して透析した - 同緩衝液で平衡化した D Ε カラム（フアルマシア社製〉にかけ、未吸着分画にヒ卜 M CAを回収した :：ドデシル硫酸ナ卜リゥ厶 ♦ ポリァクリノレアミ卜'電気泳（sod i um dodecy I su I fate-poly- acrylainide gel electrophoresis, SOS-PAGE) で分析した結果、 H鎖と L鎖からなる精製 M C A標品であることが確認された。

実施例 3

(1) 抗 CM V ♦ ヒ卜 M C Aの感染細胞に対する反応性 CM Vの A D169 株あるいは H i 株を感染させた H E L細胞及び感染させていない細胞に、抗 CM V ♦ ヒ卜 M CAである CM ， C 3 , C 4 , C 7 , C23-, C41を反応させた。さらにフル才レツセンイソチ才シァネィ卜 (f luorescein i sothi ocyanate, FITC) 標識抗ヒ卜 IgG 抗体を反応させ、螢光顕微鏡下で観察した。その結果、いずれの M C.Aも非感染細胞には反応せず、感染細胞のみに反応した。また C Ί , C 3 , C 4 , C 7は A D 169 あるいは H i — 1感染細胞の細胞質内 GMV抗原に反応して、細胞膜上の CM V抗原には反応しなかった。他方、 C 23と CM1は.細胞質内抗原と細胞膜上抗原の両方に反応した。

(2) 抗 CM V ♦ M C Aの可溶化ウィルス抗原に対する反応性

抗 C M V ♦ M C Aのヘルぺス属ウィルスに対する結合性を調べるため、 H S V— Ί型 2株， H S V— 2型 2株， V Z V 2株， CM V 6株， E B V Ί株を各々感染させた H E L細胞及び非感染 H E L細胞から、実施例 Ί の（1) の如く可溶化抗原を調製し、実施例 Ί の（4) の如く E L I S Aを実施した。その結果を第 2表に示した。

抗 C !Vl V ♦ !M C A ( ， C 2 , C 3 , C 7， C 23, C 1 ) はすべて CM Vにのみ結合し、他のへルぺス属ゥィルス，宿主細胞には結合しなかった。また C41を除く抗 C iVl V ♦ iVl C Aは C ΙΜ V 6株すべてに結合した。なお、 H 1は単純へルぺスウィルス（ HS V ) に対するヒ G Aである。

第 2 表

i直は、 405nmの吸収を示。

不 ² 0.1未満ある。

実施例 4

抗 C iVl V ♦ ヒ卜 iVl C Aのウィルス中和活性

ヒ卜 M C A溶液 200 H , 200 C H 50 ^の新鮮モルモッ卜血清を 5倍希釈した溶液 100 ^及び CM V ( A D 169 株） 737 pfu(plaque-forming units) を含む溶液 100 〃 ^を混合し、 37。Cで Ί 時間インキュべ一卜した。この混合液 100 ^を 6穴プレー卜に培養した H E L細胞にかけ、 37。Cで Ί 時間インキュべ一卜したのち、 0.5 % ( W/ V .) ァガロース及び 5 % ( VZ V ) F C Sを含む M E M培地を加えて、 G0₂インキュベーター内で 1 1 日間培養した。この単層細胞を 10%ホルマリン水溶液で固定し、 0.3 %メチレンプル一水溶液によって染色したのち、 CM V感染によるプラーク ( Pfu)を計測した _c 中和活性は次のように表した。 .'

^MC を入れない) MC を入れた)

1«対象の pfii ときの fu X 10ひ（¾)

MC を入れない対象の pfu ) 結果を第 Ί 図に示した。 C23は 0.75 g ノ f で、は 0.18 α ζ で 50%中和を示した。しかしながら

G 3 , C 4， C 7は全く中和活性を示さなかった。また Hi- 1株を用いたときも、〇23は3.3 Q で 100 %中和， C41は 0.95 g/ で 100 %中和を示したのに対し、 G 3 は 17.7 g/' で 35%の中和しか示さなかった。

また、実施例 3— (2) に掲げた A D 169 株以外の CM V株 5株について中和活性を調べたところ、 C 23は 10 il^ / ^で 95%以上の中和を全株について示した。一方 C 41は実施例 3— (2) の第 2表に示した E L I S Aのデ —タと同様に、 10 g ¾3では1^0.12 株と Y A N— 3株については、各々 20%, 64%のやや弱い中和活性を示し、他の株については 80%以上の中和活性を示した。

実施例 5

抗 CM V ♦ ヒ卜 M C Aの免疫沈降分析

ヒ卜 iVI C Aが反応するウィルス粒子の構成成分が、何であるか決めるために、免疫沈降分析を行なった。 H E L細胞に CM V ( A D 169 株〉を感染させて、 35S—メチォニンでァイソ卜 -プ標識を行なった。標識した細胞を、 0. OHV! 〖ris♦ ト 0.15IV1 aG2+-1 %デ才キシコール酸-ナ卜リウ厶 + Ί % Tritonx 100 + 0.1 %ドデシル硫酸卜リウ厶（ S D S ) 十 ^フエニルメチルスルノォニルノル 7f ライド（ pH 7.4) (溶解液）によって溶解した。これに抗 CM V ♦ ヒ卜 M CAを加えて、抗原 ♦ 抗体複合物を形成させておき、さらにプロテイン A— セファ — ス 4 Bによって複合体を吸着精製した。これを、 0. I2b ;Vl iris♦ H« + 1 %S D S + 3 % 2—メル力アトエタノール十 15%グリセリン（ PH 8.2) で 3分間 100 ^処理し、その上清を S D S—ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけた。泳動後ゲルを乾燥させ、 X線フィルムに一 70ででさらした。

その結果を第 2図に示した。 C Ί は約 64, 000と約 50, 000に、 C 2は約 64, 000と約 46, 000に、 C 4と C 7は約 64，000に、 023と〇41は約130,000 と約 55, 000の分子量をもつウィルス抗原に反応することが判った。

実施例 6

抗 C V ♦ M Q Aのァイソタイプの同定

ヒ卜 ! VI C Aのアイソタイプの同定は以下の如く行なつた。 H鎖の同定は、ヒ卜 IgG2, IgG3, に対するゥサギ抗血清を用いた免疫拡散法（ τίクタロニー法〉を用い、 L鎖の同定は、 A D169 感染細胞を抗原プレー卜とし、 2次抗体にア力リフォスファタ一ゼ標識したャギ抗ヒ卜 K鎖ないしは鎖を用いた E L I SAを行なつにつ

結果を第 3表に示した =

ύ 表

産業上の利用可能性

本発明の抗 CM V ♦ ヒ卜 M CAは、 CM V感染の診断薬とし、また CM V感染症の予防及び治療薬として利用でさる。

Claims

1 . サイ卜メガロウィルスに対するヒ卜 ♦ モノクロ一ナル抗体。

2. ヒ卜 ♦ モノクローナル抗体が IgG 1型である請求の範囲第 Ί 項記載のヒ卜 ♦ モノクローナル抗体。

求

3. 分子量約 64,000サイ卜メガロウィルス抗原蛋白，または分子量約 64: 000の抗原蛋の白を主成分とする複数のサィ卜メガロウィルス抗原蛋白を認識する請求の範囲第 Ί 項記載のヒ卜 · モノクローナル抗体。

4. 分子量約 130_:000 と約 55， 000のけィ卜メガロウィルス抗原蛋白を認識する請求の範囲第 Ί 項記載のヒ卜 ♦ モノクローナル抗体。 b , サイ卜メガロウィルスを中和する能力を有する請求の範囲第 4項記載のヒ卜 ♦ 七ノクローナル抗体。

6. ァメりカンタイアカルチャーコレクション ( A T C C ) に寄記番号 HB9215として寄記されているハィ 7リ卜一マ C 41, 又はそれと同様な抗原蛋白を認識するハイアりド -マによって産生される請求の範囲第 4項記載のヒ卜 ♦ 七ノクローナル抗体。

7. in V roでマイ卜一ジェンの存在下に、サイ卜メガロウィルスはサイ卜メガロウィルス由来の蛋白若しくは糖蛋白で感作したヒ卜 ♦ リンパ球と、マウス ♦ ミエ口一マ細胞とを細胞融合させ、得られたハイプリドーマの中からサイ卜メガロウィルスに対するヒ卜 ♦ モノクロ一ナル抗体を產生するハイプリドーマを選別し、次いで該ハイプリドーマ及び. Z又はそれに由来する細胞株を培養し、その培養上清からヒ卜 ♦ モノクローナル抗体を採取することからなる、サイ卜メガロウィルスに対するヒ卜 ♦ モノクロ一ナル抗体の製造法。

8 . A T G Cに寄記番号 9215として寄記されているハィプリドーマ C 4 'し又はそれと同様な抗原蛋白を認識するハイプリドーマつ