JPH02500951A - ヒトサイトメガロウイルスの免疫原性糖ペプチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ヒトサイトメガロウィルスの免疫原性糖ペプチド産業上の利用分野 本発明はヒトサイトメガロウィルス（ＨＣＭＶ）に関し、さらに詳しくは、免疫 応答を惹起し得る、その糖ペプチド成分に関するものである。これらの糖ペプチ ドおよびそれらと反応し得る抗体は診断および治療に有用である。

発明の背景 ヒトサイトメガロウィルスは多くの臨床上の症候群にかかわっている。感染は、 免疫適格性を有する子供や大人では通常、無症状であるが、胎児または幼児では 重篤な先天性疾患の原因となり、また、免疫障害患者においては発病や死をもた らし得る。ＨＣＭＶは、活性な感染症の母親から胎内で母子感染をうけた子供の 精神薄弱の一般的な原因であり、また、免疫を抑制されている移植患者の合併症 を引き起こす主な日和味感染の原因と考えられている。ＨＣＭＶはまた、後天性 免疫不全症候群（ＡＩＤＳ、エイズ）の治療に重要と考えられている。ＨＣＭＶ は、最近、エイズ患者に頻発するカボジ肉腫の原因であることが示唆された。

これらの問題を改善するためにＨＣＭＶの基本的な性質に関する多くの研究がな されている。ＨＣＭＶはヘルペス型のウィルスであって、核酸とタンパク質との 核複合体が、構造的および酵素的機能を有する内部キャプシドタンパク質および 糖ペプチドおよび糖脂質からなる外部のエンベロープ膜に包まれている。最初の ２グループはピリオン（ウィルス粒子）内に隔離されており、無傷の感染性ピリ オンでは免疫系または抗体と反応し得ない。しかも、それらが体液中に存在する ことは、ウィルス生産物は生産されるが、感染性のピリオンは放出されない、静 止期のヘルペス型感染症に移る場合に通常みられることから、活性な感染性の診 断には役立たない。同様に、初期感染は失敗する可能性がある。即ち、宿主細胞 は、ウィルス性生産物を生産し始めるかもしれないが、これらの生産物はピリオ ン内に蓄積されず活性な感染は達成されない。

ＨＣＭＶは以下の方法の１またはそれ以上を用いて診断することができる。１） 間接的な免疫蛍光顕微鏡検査によるピリオン体内のＨＣＭＶの同定または感染し た組織内のＨＣＭＶ抗原の同定、２）感染組織または体液を接種した細胞モルイ ヤー（単層）中のウィルスの検出、３）血清中のＨＣＭＶ特異抗体の同定、また は４）標識した相補性ＤＮＡ断片とのハイブリダイゼーション。今日行われてい るＨＣＭＶ診断法の総説はマヨ・レポート［Ｍａｙｏ　Ｒｅｐｏｒｔ、Ｍａｙ。

Ｃ１１ｎ、Ｐｒａｃ、、６０，６３６（１９８５）］を参照されたい。

最も一般的なＨＣＭＶ診断法は試料をヒトの線維芽細胞中で培養し、典型的な細 胞変性作用を検査する方法である。この方法は、尿、咽喉洗浄液または血液等、 多くの異なった、入手容易な試料を用いる場合に有用である。増殖２〜４週間後 に培養物を封入体や典型的な巨大な融合細胞の存在など、ＨＣＭＶ感染の証拠を 調べることができる。このような方法は診断までに１力月を要するという点で不 便である。

ＥＬＩＳＡまたは直接免疫蛍光法を用い、モノクローナル抗体（Ｍ２Ｓ）コは免 疫蛍光法に用いるために早期および後期ＨＣＭＶ核タンパク質に対するＭｏＡｂ ｓを製造した。ＭｏＡｂｓを蛍光物質で標識し、生検標本または培養細胞中の細 胞内ＨＣＭＶとの結合を観察することができる。この種の診断法は培養法よりは るかに迅速である。結果は１日以内で得られる。

ＨＣＭＶ感染の治療には救急の抗ウイルス治療が有用となるであろう。移植患者 においては免疫抑制薬物治療が潜伏性のＨＣＭＶを変化させて再活性化する可能 性がある。さらに、ＨＣＭＶ症状が似通っているので、拒否反応が隠蔽され得る ことから、移植拒否反応の制御のために、正確かつ迅速に活性なＨＣＭＶ感染を 診断することが必要とされる。

ウィルス抗体を直接ＨＣＭ　Ｖ患者の循環中に注入し、抗体と循環ピリオンとを 結合させ、宿主細胞と結合し得ないようにすることで、感染を直接制限すること ができる。

また、暴露されていない成人、とくに懐妊年令の女性をＨＣＭ　Ｖ感染から保護 するためにワクチンを接種することは有益であろう。

米国特許Ｎｏ、３．９５９．４６６には、ヒト肺線維芽細胞で少なくとも５０回 、好ましくは１２５〜１５０回継代培養した不活化ＨＣＭＶを用いたワクチンが 記載されている。そのようなワクチンはウィルスを体内に蔓延させずにＨＣＭＶ に対する免疫を誘導すると言われている。しかしながら、当該技術分野ではその ような不活化ウィルスワクチンは“死滅”ワクチンと同様、ある低発現率でヴイ ルレント型に変化し得る。このことは、Ｓ　ａｌｋおよびＳ　ａｂｉｎのポリオ ワクチンの場合に十分認められた。

最近、サブユニットワクチンの構築が成功された。そのようなサブユニットワク チンはウィルスの一部のみを含んでおり、活性ウィルスを生産することができな い。別法として、免疫原性遺伝子産物をコードする遺伝物質を非グイルレント性 担体ウィルス、ワタシニア等にスプライシングしてもよい。この組換えウィルス は体内で一時期、再生産されるので死滅ウィルスよりも免疫刺激作用が大きいと いう利点を有する。

ＨＣＭＶの免疫学的研究には、免疫原および活性なＨＣＭＶ感染の標識として、 膜エンベロープ成分、とりわけ、糖ペプチドをも調べなければならないというこ とがますます明瞭になっている。ウィルス製品の出発物質には、所望の膜エンベ ロープ成分に加えて、宿主細胞の細胞片、核タンパク質、牛ヤプシドタンパク質 、および成熟した感染性ピリオンには見出されない前駆体タンパク質などが含ま れる。膜エンベロープ糖ペプチドでさえも、ヒダや窩に残ったり、宿主の免疫に かかわる細胞との相互作用を立体的に阻害されるなどの理由から、それらの内の すべてが免疫系への生理的な到達を果たす訳ではない。

従って、インビトロでよく反応し抗体を惹起する（例えば、その糖ペプチドとの 結合に関して）と共に、免疫系およびそれに対して惹起された抗体に生理的に到 達して相互作用する膜エンベロープ糖ペプチドを得ることが望ましい。ピリオン 表面のそのような糖ペプチドが対応する抗体と反応するとピリオンは宿主に感染 することができな（なる。即ち、それは中和されたことになる。

そのような糖ペプチドおよびそれに対して惹起された抗体は活性なＨＣＭＶ感染 症の診断、そのような感染症の治療、および感染し易い人々における感染予防の ための複合（結合）またはサブユニットワクチンの成分として有用である。

そのような抗体治療、活性なＨＣＭＶ感染の診断またはワクチンが行われる前に 、体液性および細胞性免疫を刺激する組成物を同定のウィルスの糖ペプチドが有 用であることが分かった。例えば、ある種の膜エンベロープ糖ペプチドを含有す る、界面活性剤によるＨＣＭＶ抽出物はモルモットの体液および細胞性免疫を誘 導することができる。ＭｏＡｂｓは、ジスルフィド複合体と関連して、分子量５ ｏ、ｏｏｏ〜５８．０００，９３．０００および１３０．　ＯＯＯの免疫沈降性 糖ペプチドとして得られた。これらの抗体の幾つかは、補体の存在下においての みインビトロでの中和活性を示した。補体の非存在下では１つのＭｏＡｂのみが ＨＣＭＶの８６．　ＯＯＯダルトンのタンパク質と反応し中和した［ラスムラセ ンら（Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ）、Ｐ　ｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、　８１．８７６〜８８０（１９８４）］ 。

１１９７６年キムら［Ｋｉｍ、Ｊ、Ｖｉｏｌ、、２０，６０４〜６１１（１９７ ６）］はＨＣＭＶ中ニサイズ１１．０００から２９０，０００ダルトンの、少な （とも３３個のポリペプチドを発見した。これらの内６個は糖ペプチドであった が、分離法、非還元性界面活性ゲル中での電気泳動ではこれらの糖ペプチドを、 個々の分子を特性化するのに十分な程度に分離することができなかった。１個の ウィルスタンパク質、分子量６６．０００のグリコジル化タンパク質が、最も豊 富なウィルスタンパク質であることが分かった。後に、キムはこの糖ペプチドを 部分精製し、それに対するＭｏＡｂｓを惹起させることに成功した。しかしなが ら、彼が得たＭｏＡｂｓはいずれも極めて高濃度でもＨＣＭＶを中和することが できなかった。９個のＭｏＡｂｓの混合物もまた、ウィルス中和活性を示さなか った［キムら、Ｊ、ＣＩ　ｉｎ、　Ｍ　１ｃｒｏｂｉｏ１．．１８．３３１〜３ ４３．１９８３］。

従って、保護的な体液性応答を引き起こし得る、これらＨＣＭＶ糖ペプチドを提 供することが必要である。そのような糖ペプチドに対する直接のＭｏＡｂｓへの 要求も存在する。

発明の簡単な記述 本発明は、実質上、純粋な免疫原性糖ペプチド、好ましくはＨＣＭＶから導かれ た糖ペプチドである物質に関するものである。これらの糖ペプチドは無傷のＨＣ ＭＶピリオンの膜エンベロープにのみフィト結合を介して結合している。この糖 ペプチドは免疫系および抗体に生理学的に到達可能であって、ヒトにおいて体液 性および細胞性免疫の両方を刺激することができる。

本発明は、第１の実施態様として、ＧＬＰ−Ａと命名した分子量約９３，０００ ダルトンの糖ペプチドに関する。ＧＬＰ−ＡはＨＣＭＶとは反応するが単純庖疹 、アデノウィルス、エプスタイン−パールウィルス、または水痘ウィルスとは反 応せず、ＨＣＭｖを中和し得る（好ましくは補体の存在下）、モノクローナル抗 体と反応することができる抗原決定基を含有する。

本発明は、第２の実施態様として、ＧＬＰ−Ｂと命名した、分子量約５０．　Ｏ ＯＯから５２．　ＯＯＯダルトンの他の糖ペプチドに関するものである。ＧＬＰ −ＢはＨＣＭ　Ｖ　、単純庖疹およびアデノウィルスと反応し、補体非存在下で ＨＣＭＶを中和することができるモノクローナル抗体と反応し得る抗原決定基を 含有している。

本発明の糖ペプチドを得るためには、まず、臨床からの一次単離物から得たＨＣ ＭＶまたはトウネ（Ｔ、　ｏｗｎｅ）およびトレド（Ｔｏｌｅｄｏ）のようにし て得た樹立株をヒト細胞（最も便利なのは皮膚線維芽細胞の一次培養物である） で増殖させる。上清を任意の通常の濃縮法、好ましくは分別遠心の後、ショ糖密 度勾配遠心することによって濃縮することで、上清液の細胞蓄積物から無傷のピ リオンを得る。ピリオンから膜エンベロープを取り、ジスルフィド結合している 糖ペプチド複合体を、陰イオン交換樹脂を用いる高速液体クロマトグラフィーで さらに精製する。糖ペプチド複合体の免疫沈澱、次いで、ジスルフィド結合の還 元、アルキル化、およびゲル濾過ＨＰＬＣによって実質上、純粋な本発明の糖ペ プチドが得られた。

従って、本明細書中、「実質上、純粋な」という語句は、糖ペプチド複合体また は糖ペプチドがＨＣＭＶの、膜エンベロープ上での他の膜成分との天然の関係か ら抽出されていること、およびＨＣＭＶ内部の核またはキャプシド成分から抽出 されていることを意味する。

本発明の操作に従えば、そのいずれもが中和性ＭｏＡｂｓの生産に有用であり、 また、活性なＨＣＭＶ感染の治療に有用である、様々な程度のグリコジル化を伴 ったポリペプチドまたはポリペプチド複合体の製造および精製法を容易に得るこ とができる。

本発明の糖ペプチドは、モノクローナル抗体製造のための、周知のＫｏｈｌｅｒ −Ｍｉｌｓｔｅｉｎ法の第１段階でのマウスの免疫化に用いることができる。よ り好都合なことには、ＨＣＭＶピリオン全体を含有する組成物をもそのように用 いることができる。このように、本発明はＧＬＰ−ＡおよびＧＬＰ−Ｂ上に存在 する抗原決定基と結合するＭｏＡｂｓをも提供するものである。本発明の好まし いＭｏＡｂｓはＨＣＭＶを中和することができ、無傷のピリオンの診断試験の基 礎を提供し得るものである。

従って、本発明は以下の工程により、産生されるモノクローナル抗体に関するも のである。

（ａ）マウスをＨＣＭＶピリオンで免疫シ；（ｂ）該マウスの肺細胞を骨髄腫細 胞系統と融合させてハイブリドーマを得； （ｃ）該ハイブリドーマからＨＣＭＶと反応し得るが、単純庖疹ウィルス、アデ ノウィルス、エプスタイン−バールウィルスまたはバリセラウィルスとは反応し ないモノクローナル抗体であって、ＨＣＭＶを中和し得るモノクローナルを産生 ずることができるハイブリドーマを選択し；さらに、 （ｄ）該ハイブリドーマをクローン増殖させる。

本発明はまた、以下の工程で製造されたモノクローナル抗体に関するものである 。

（ａ）マウスをＨＣＭＶピリオンで免疫し；（ｂ）該マウスの肺細胞を骨髄腫細 胞と融合してハイブリドーマを（ｃ）該ハイブリドーマからＨＣＭ　Ｖ　、単純 庖疹およびアデノウィルスと反応し得るモノクローナル抗体であって、補体の非 存在下でＨＣＭＶを中和し得るモノクローナル抗体を産生ずることができるハイ ブリドーマを選択し；さらに、 （ｄ）該ハイブリドーマをクローン増殖させる。

イオン交換ＨＰＬＣにより分画した。糖ペプチドおよび糖ペプチド複合体を含有 する保持ピーク２−４のモノクローナル抗体との反応性を調べた。第１図（Ａ） ：非還元［３Ｈ］グルコサミン−標識トウネ株ＨＣＭＶ抽出物のイオン交換ＨＰ ＬＣにおける放射活性像を示す。

第１図（Ｂ）：ピーク１−４の糖ペプチドを非還元下に電気泳動によって検査し た結果を示す。第１図（Ｃ）：ビーク２−４の糖ペプチドをモノクローナル抗体 ’Ｃ２［（Ｃ）におけるレーン２−４３、次いで、′Ｅ　、１０　［（Ｃ）にお けるレーン°２−’４］で免疫沈澱させた結果を示す。

沈澱を還元せずに免疫沈澱させた。第１図（Ｄ）：ピーク１−４の糖ペプチドを 還元したのち、電気泳動で検査した結果を示す。第１図（Ｅ）：ビーク２−４の 糖ペプチドをモノクローナル抗体’Ｃ２［（Ｅ）におけるレーン２−４］、次い で、’Ｅ１０［（Ｅ）におけるレーン°２−゛４］で免疫沈澱させた結果を示す 。沈澱を還元したのち、電気泳動にかけて調べた。すべての場合におけるレーン 番号は試料を得たイオン交換処理でのピーク番号である。各図の右側の番号は１ ０−３倍で示した分子量である。すべての場合に、糖ペプチドの検出は蛍光写真 法（フルオログラフィー）で行った。

募λ１１　ＨＰＬＣとイムノアフィニティー法を組み合わせて精製したＧＬＰ− ＡおよびＧＬＰ＝Ｂをモノクローナル抗体で免疫沈澱させ、それらの免疫原性の 保持を示した。レーン１はモノクローナル抗体’Ｃ２で免疫沈澱した糖ペプチド ＧＬＰ−Ａを表す。レーン２はモノクローナル抗体’ＥＩＯで免疫沈澱した糖ペ プチドＧＬＰ実施例１ ウィルスの増殖および糖ペプチドの精製Ａ、原料および方法 １、ウィルスの増殖、放射性標識、および精製ダルベツコの改良イーグル培地（ ＤＭＥＭ）＋１０％ウシ胎仔血清中で培養したヒト線維芽細胞の一次培養物をト ウネ株ＨＣＭＶで感染の多重度（Ｍｏｌ）１−５で多重感染させた。感染後１− ２日目（こ、以後の精製における標識として［３Ｈ］グルコサミン（５ｕＣｉ／ ｘ（！、２２Ｃｉ／ｍＭ、アマ−ジャム、アーリントンノ＼イツ、イリノイス） または［３ＳＳコメチオニン（５ｕＣｉ／ｉｆｆ、　１０９　Ｃｉ／＋ｎＭ、デ ュポン／ＮＥＮ、ボストン、マサチューセ・ソツ）を加えた。

７５００ｘ９で２０分間低速遠心して培地から細胞および細月包片を除去した。

この上清を４８．２００Ｘ９で１時間遠心してウィルスを集めた。ウィルスのベ レットをトリス−ＮａＣＱ”　・ｙファー（５０１１１Ｍトリスヒドロキシメチ ルアミノメタン−ＨＣｌ！、ｐＨ７，４および１５０ｍＭ　ＮａＣのに再懸濁し 、同じ）く・ノファーで調製した２０−６０％ショ糖勾配上に重層した。沈降速 度法を１３１．３００ｘｓｒで１時間実施した。グラディエンド採取を行い２８ Ｏｒ＋ｍでの吸光度測定によってモニターした。ショ糖濃度４３％にバンドを形 成した光学密度の主要ピークを採取した。これらの画分をトリス−ＮａＣＱバッ ファーで希釈し、１３１．３００Ｘ９で２時間遠心してウィルスを収集した。精 製した全ウィルス沈澱を“精製Ｔｏｖｎｅ　Ｐｒｅｐ”と命名した。

２、界面活性剤およびクロロホルム　メタノール抽出精製ウィルス１Ｏ−１５ｘ ９を、１．０％Ｎｏｎ１ｄｅｔ　Ｐ　−４Ｑ　（Ｎ　Ｐ−４０、ポリオキシエチ レン−ｐ−ｔ−オクチルフェノール）を含有するトリス−ＮａＣＱバッファー（ ５０ｍＭ　）リス−ＨＣＱ、ｐＨ７，５，１０ｍＭＮａＣｌ２および２＋ｎＭ　 ＰＭＳＦ）３　５ＭＱに懸濁してウィルスの界面活性剤抽出物を調製した。界面 活性剤−ウィルス懸濁物を室温で１時間撹拌し、１時間高速遠心して、抽出タン パク質を不溶性タンパク質から分離した。ある場合は、界面活性剤による抽出の 前に精製ウィルスをクロロホルム−メタノール（２：　１　、ｖ／ｖ）で抽出し 、脂質を除去した。トリス−ＮａＣ１２バッファー中のウィルス懸濁液ｌ容量に 対し、２０容量のクロロホルム−メタノールを用い、撹拌しながら室温で２０分 間抽出したのち、遠心し、層分離させ、脱脂質層を集めた。

３、イオン交換ＨＰＬＣによるＨＣＭＶのジスルフィド結合した糖ペプチド複合 体の単離 ジスルフィド結合した糖ペプチド複合体を陰イオン交換高速液体クロマトグラフ ィーによって単離した。分離はポンプ、グラディエンドフォーマ−（勾配形成装 置）およびＵＶ検出器を備えたＶ　ａｒｉａｎＭｏｄｅｌ　Ｖｉｓｔａ　５５０ ０／４０２　ＨＰＬＣシステムで行った。

陰イオン交換クロマトグラフィーは、非還元界面活性剤抽出物０゜５舷を直接Ａ ｑｕａｐｏｒｅ　ＡＸ　−３００陰イオン交換カラム（Ｂ　ｒｏｗｎｌｅｅ　Ｌ ａｂｓ　Ｉ　ｎｃＢ　サンタクララ、カリフォルニア）に適用して行った。カラ ムを２．５＋ａＭ　ＮａＣｌ２および０．１％ＮＰ−４０を含有する２０ＩＩＩ ＭトリスーＨＣＱバッファー（ｐＨ７，８）で１５分間洗浄した。結合した糖ペ プチドを４０分間、最初に用いたものと同じバッファー中２．５ｍＭから１．０ ｍＭのＮａＣＱ線状グラディエンドで溶離した。流速はＩ　Ｈ（１／分であった 。収集した画分の放射活性をモニタ免疫沈澱のために、プロティンＡ−セファロ ースＣＬ−４Ｂビーズ（Ｓ　ｉｇｍａ　−Ａ　１ｄｒｉｃｈ、セントルイス、ミ ゾリー）をヤギ抗マウスＩｇｃ（ＨおよびＬ）と−緒にインキュベートして準備 し、りん酸緩衝化食塩水（ＰＢＳ）で使用前に洗浄した。全抽出物またはイオン 交換ＨＰＬＣによって得た糖ペプチドまたは糖ペプチド複合体をモノクローナル 抗体ｌ−４８−４１Ｃ２，２−２９−９８７または２２−１５−９Ｅ１０（製は 下記）ノイずれかと、０．１％Ｎｐ−４０含有ＰＢＳ中、一定速度で撹拌しなが ら１．５時間インキュベートした。

幾つかの例ではＮＰ−４０の代わりに０．１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ ）を用いた。次いで、調製したプロティンＡ−セファロースＣＬ−４Ｂビーズを 抗原−抗体溶液に入れ、さらに１．５時間、定速撹拌下で反応させた。０．１％ ＮＰ−４０含有ＰＢＳで３回、ビーズを洗浄した。最終の洗浄の後、ビーズと結 合したタンパク質を５ＤＳ−ＰＡＧＥのために可溶化した。

５、モノマーの調製 尿素（８Ｍ）の存在下、ジチオスレイトール（ＤＴＴ、　Ｕｎｉｔｅｄ　５ｔａ ｔｅｓ　Ｂ　１ｏｃｈｅａ＋１ｃａｌｓ、クリーブランド、オハイオ）を終濃度 １０ｍＭとなる様に加え、単離したＨＣＭＶのジスルフィド結合した糖ペプチド 複合体を還元した。一定速度で撹拌しながら室温で２−２４時間反応させた。還 元したスルフヒドリル基のアルキル化はヨウドア１％ＳＤＳ含有試料を上記のＶ ａｒｉａｎシステムを用いるゲル濾過ＨＰＬＣに委ねた。ゲル濾過は、ＴＳＫ３ ００ＳＷと４００ＳＷゲル濾過カラム（トウヨウソーダ、東京、日本）を直列に 連結し、０゜１％ＳＤＳを含有している５０＋Ｍりん酸ナトリウム、ｐＨ７，０ ゜でイソクラティックに溶離して行った。流速は０　、３１０１分であった。２ ７５ｎｍの吸収をモニターし、収集した画分の放射性活性もモニターした。

５ＤＳ−ＰＡＧＥは、レムリ（Ｌａｅｍｎ＋１ｉ）の方法に従い、５−１５％ポ リポリリルアミドスラブゲルグラディエント法で行った。４％ＳＤＳの存在下、 試料を３分間沸騰させて可溶化した。室温まで冷却した後、試料に尿素およびベ ーターメルカプトエタノール（ＢＭＥ）を加え、５％ＢＭＥおよび２Ｍ尿素を含 有する試料を調製した。

Ｅｎｌｉｇｈｔｉｎｇ（Ｄｕｐｏｎｔ／ＮＥＮ、ボストン、マサチューセッツ） を用い、フルオログラフィーによってトリチウムを検出した。

ＨＣＭＶはモノクローナル抗体と反応するジスルフィド結合した糖ペプチドを含 有することが知られている。これらの、または他の、ＨＣＭＶのジスルフィド結 合した糖ペプチドの分離にイオン交換ＨＰＬＣを用い得るか否かを調べることは 興味深いことである。非還元［３Ｈ］グルコサミンで標識したＨＣＭＶの界面活 性剤抽出物をイオン交換ＨＰＬＣで分離すると、放射活性な、１本の非保持ピー クと３本の保持ピークが検出された（第１図Ａ）。非保持ピークは、クロロホル ム−メタノール（２＋　１　、ｖ／ｖ）で抽出されタンパク質を固定する条件で はポリアクリルアミドゲルに固定されない物質を含有していた（第１図Ｂおよび Ｄル−ン１）。また、この物質は［３５ｓ］メチオニンでは標識されなかった（ データは示さず）。これらの結果に基いて、このピークには糖脂質が含有されて いると結論した。この糖脂質に関してはモノクローナル抗体との反応性を試験し ながった。

非保持ピークは殆んどまたは全く糖ペプチドを含有していないが、３本の保持ピ ークはジスルフィド結合した糖ペプチドを含有していた（第１図、ＢおよびＤ） 。このことは、各保持ピークから得た物質を、ジスルフィド結合を還元し、また は還元せずに電気泳動に付すことによって判明した。ピーク２を還元せずに電気 泳動で検査すると、見掛けの分子量が９３．０００の１本のバンドを豊富に含有 していることがわかった。しかしながら、ジスルフィド結合の還元後では、見掛 けの分子量が５０−５２，０００および９３，０００の少なくとも２個の糖ペプ チドが検出された（第１図ＢおよびＤ、レーン２）。このように、ピーク２は分 子量９３，０００の糖ペプチド複合体と、見掛は上、同じ分子量を有する糖ペプ チドとを含有するようである。ピーク３および４もジスルフィド結合した糖ペプ チド複合体を含有する。ピーク３から得た物質を還元せずに電気泳動にかけると ２本の主要なバンドが検出された。１本のバンドは分離（分解）ゲルの頂上に認 められ、第２の主要バンドは分子量１３０−１ｇｏ、ｏｏｏを含んでいた。この 物質を還元すると、３種の糖ペプチドが検出された（第１図ＢおよびＣ、レーン ３）。最も豊富な種類は分子量９３，０００であるが、他のより少ない２種のも のは分子量５０．０００および１３０．０００であった。ピーク４を還元せずに 電気泳動にかけて分析した結果、このピークで最も豊富な物質は分子量が２００ ，０００以上であって、分離ゲルの頂上にじみを形成していた（第１図、ＢＳ　 レーン４）。しかしながら、このピークにはピーク３に含まれる物質と同様の分 子量の物質が存在していた。

このことは、ピーク３がピーク４にティリングしていることから、大いにあり得 ることである。最後に、ジスルフィド結合の還元後、ピーク４を電気泳動にかけ て検査すると、低分子量の糖ペプチドが検出された（第１図、Ｄ、レーン４）。

最も豊富な種のうち、１つは見掛けの分子量が５０−５２，０００であるが、他 の種の見掛けの分子量は９０−’１３０．０００であった。しながら、還元後で も、ピーク４の分離ゲルの頂上にじみを形成する物質が幾らか存在していた。

本発明の第２の実施例に記載のごとくにしてモノクローナル抗体を調製した。イ オン交換で得た、３本の保持ピークから得た物質を、ＭｏＡｂｓ　２−２９　９ ８７（’Ｂ７）、１−４８−４　ＩＣ２（’Ｃ２）および２−１５−９Ｅ１０　 （’ＥＩＯ）との反応性について試験した。免疫沈澱には、各ピークから同一の 放射活性量を用いた。′Ｂ′７および’Ｃ２はピーク３に認められるジスルフィ ド結合した糖ペプチド複合体と最も強く結合し、このピークはピーク２の１９倍 の放射活性、ピーク４と比較すると６倍の放射活性を沈澱させることが測定され た。これらの複合体を還元すると、それはピーク３に検出されるすべての糖ペプ チドを含有していると思われた（第１図、ＣおよびＥ、レーン３）。これらの糖 ペプチドの内、最も豊富に存在する糖ペプチドは分子量９３，０００のものであ った。

’Ｂ７および°Ｃ２と異なり、’ＥＩＯはピーク４と最も強く結合し、このピー クはピーク２の５−６倍、ピーク３の１１−１２倍の放射活性を沈澱させた。’ ＥＩＯはピーク４に見出される糖ペプチド複合体と最も強く反応したが、それは また、ピーク２に見出され、ジスルフィド結合の還元で分子量５０−５２，００ ０の糖ペプチドを与える分子量９３，０００の糖ペプチドとも反応した（第１図 、ＣおよびＤル−ン２および４）。さらに、ピーク４がら免疫沈澱した糖ペプチ ド複合体は、該複合体をジスルフィド結合の還元後に試験したとき、最も多量に 存在する種である分子量５０−５２．０００の糖ペプチドをも含有していた。し ながら、ピーク４がら得た糖ペプチド複合体中では分子ｊ１５０−５２．０００ の糖ペプチドが最も豊富な種であるが、ジスルフィド結合の還元後にはさらに多 （の他の糖ペプチドが存在していた。実際、’ＥＩＯで免疫沈澱される複合体は ビーク４中に検出される糖ペプチドの大部分または全部を含有すると思われた。

ピーク２−４に検出された糖ペプチドの大多数は°Ｂ７および°Ｃ２、または° ＥＩＯと反応した。しながら、ピーク２に検出された分子量９３，０００の糖ペ プチドは、著しい量で存在するにもがかわらず、どの抗体とも反応しないメ思ゎ れた。このことは、該糖ペプチドがピーク３および４に検出された分子量９３． ０００の糖ペプチドとは異なっていることを示唆するものである。この可能性を さらに試験するために、ビーク２由来の物質を１５倍過剰量の抗体を用い、まず °Ｃ２、次いで、’Ｂ７で免疫沈澱させた。放射活性が沈澱しなくなるまで、プ ロティンＡ−セファロースピーズを数回加えた。これらの沈澱によって得た上清 を同様の工程で°ＥＩＯを用いて免疫沈澱させた。最終の免疫沈澱の後、上清に 残存する物質を電気泳動で調べた。この操作を行った時点で検出された糖ペプチ ドは分子１９３，０００の糖ペプチドのみであった。

３、モノクローナル抗体と反応性の糖ペプチド３本のイオン交換ビークから得た どの物質も非還元条件下、任意の１個の抗体で免疫沈澱させると、常に数本のバ ンドが検出された。

還元すると、これらの種々の複合体は多数の低分子量の糖ペプチドを与えた。こ のことから、免疫沈澱前に還元すると免疫沈澱する様々な糖ペプチドの相対量の 値が影響を受けるか否かを調べた。個々の糖ペプチドに対する抗体の反応性を調 べるために、各イオン交換ピークから得た物質を８Ｍ尿素と０．１％ＮＰ−４０ との存在下でＤＴＴによって還元した。１夜反応させた後、ヨウドアセトアミド を加えて糖ペプチドをアルキル化した。対照実験は、様々なジスルフィド結合し た糖ペプチド全てを含有する全抽出物を同じ条件下で還元し、さらにＢＭＥで還 元することなく電気泳動して調べた。これが終わると、糖ペプチドの大部分が分 子量５０−５２，０００および９０−９２．０００のバンド内に見出された。こ のことは、ＤＴＴで行う還元が有効であったことを示唆するものである。放射活 性に基き、ピーク２およびピーク４から得た等量の還元された、または還元され ていない物質を”ＥＩＯで免疫沈澱させ、他方、ピーク３から得た還元された、 または還元されていない物質を”Ｃ２で免疫沈澱させた。還元した物質を免疫沈 澱させた場合、沈澱する放射活性は非還元物質から沈澱する量と比較して２−３ 倍の減少があった。これは、両方の抗体に関して起こった。しかしながら、免疫 沈澱する糖ペプチドの数には変化がなかった。また、濃度計走査により、免疫沈 澱した糖ペプチドの相対量は、免疫沈澱前に還元することで影響されないという ことが示された。これらの結果は様々なジスルフィド結合した複合体に見い出さ れる糖ペプチドが免疫学的に関連していることを示唆するものである。

４、個々の免疫原性ＨＣＭＶ糖ペプチドの一層の精製イオン交換ＨＰＬＣにより 、本発明者らは免疫原性糖ペプチド複合体を精製することができたが、個々の糖 ペプチドの精製はできなかった。しかも、モノクローナル抗体が幾つかの糖ペプ チドと反応することは明らかである。イオン交換ＨＰＬＣまたはイムノアフフィ ニティー法のいずれか単独では個々の糖ペプチドを得ることは不可能であった。

従って、個々の免疫原性ＨＣＭＶ糖ペプチドを得るために、イオン交換ＨＰＬＣ ，イムノアフィニティー精製およびゲル濾過ＨＰＬＣによる分離を合併した精製 法を開発した。最も豊富に存在する免疫原性糖ペプチド、ＧＬＰ−ＡおよびＧＬ Ｐ−Ｂを単離するために、まず、ジスルフィド結合した糖ペプチド複合体をイオ ン交換ＨＰＬＣで分離した。次いで、ピーク２およびピーク４に見出されるＧＬ Ｐ−Ｂ含有糖ペプチド複合体をモノクローナル抗体゛ＥＩＯを用いてイムノアフ ィニティー精製し、ピーク３のＧＬＰ−Ａ含有糖ペプチドをモノクローナル抗体 °ｃ２を用いて精製した。

次いで、これらの方法で精製した糖ペプチド複合体をＤＴＴで還元し、ヨウドア セトアミドを用いてアルキル化し、個々の糖ペプチドを得た。ピーク２から、ど のモノクローナル抗体とも非反応性の分子量９３．０００の糖ペプチド得るため に、ピーク２を°ｃ２および’ＥＩＯの両者で免疫沈澱させた後の上清をも還元 し、アルキル化した。このようにして製造した個々の糖ペプチドをゲル濾過ＨＰ ＬＣにかけた。このような方法で得た糖ペプチドを５ＤＳ−ＰＡＧＥにかけて調 べると、個々の糖ペプチドが見い出された。

”ＥＩＯで認識された糖ペプチドをＧＬＰ−Ｂ、’Ｃ２で認識された糖ペプチド をＧＬＰ−Ａと命名した。さらに、モノクローナル抗体“ＥＩＯおよびＣ２で認 識され、この方法で精製された主要な糖ペプチドをこれらの抗体でさらに免疫沈 澱させると、糖ペプチドはそれらの免疫原性を精製の最終段階まで維持している ことが示唆された（第２図）。

実施例２ 精製Ｔｏｗｎｅ　Ｐｒｅｐを抗原として用いてモノクローナル抗体を調製した。

成体Ｂ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｃマウスを、完全フロインドアジュバント中に乳化し た抗原の腹腔内投与によって免疫し、続いて食塩水懸濁の免疫原を３週間間隔で ３回投与してブースター免疫した。最後のブースターの３日後にマウスを犠牲に し、ポリエチレングリコールを用いてその肺臓細胞をＳ　Ｐ　２１０−Ａｇｌ　 ４骨髄腫細胞（アメリカン・ティッシュ−・カルチャー・コレクション）と４： １の割合で融合させた。２４時間後に融合細胞を、１０％０％ウシ胎清、５０μ ｇ／πｇガラマイシン、１３．６μ９／舷ヒボキサンチン、０．４μＭアミノプ テリン、および７．６μｇ／ｘ（ｌチミジンを追加したヘペス緩衝のダルベッフ 改良イーグル培地（Ｄ　Ｍ　Ｅ　Ｍ）を入れた９６ウエルに分配した。この培地 で２週間経過させた後、アミノプテリンを除（上記成分を追加した新鮮な培地に 移した。細胞融合の３−４時間後に、これら培養物の上清を、ＥＬＴＳＡ検定に よｊ）ＨＣＭＶ　ＮＰ−４０抽出物に特異的な抗体について検定した。マウス胸 腺細胞をフィーダー（供給）細胞として用いる限界希釈によって陽性培養物の細 胞のクローニングを行った。顕微鏡で個々のウェルを単一のコロニーについてス クリーニングし、上記のようにしてＨＣＭＶ　ＮＰ−４Ｑ抽出物に対する抗体を 検定した。抗体産生クローンをＢ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｃマウス中での腹水液調製 用に増殖させた。

２、中和検定 ヒドロキシルアパタイトＨＰＬＣで精製したモノクローナル抗体を、２％ウシ胎 児血清（ＦＢＳ）を追加したＤＭＥＭで希釈した。感染に先立って、６００プラ 一ク形成単位（ｐｆｕ）のトウネ株および３００ｐｆｕのトレド株ＣＭＶを、全 量ＤＭＥＭ　０．４３１（中のモノクローナル抗体に加えた。この調製物の半分 にモルモット補体［ペルーフリーズ・バイオロジカルズ（Ｐｅｌ−Ｆｒｅｅｚｅ 　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、　Ｒｏｇｅｒｓ、　Ａｒｋａｎｓａｓ）］を最終濃 度２．０％で加え、残りの半分には同一量のＤＭＥＭを加えた。ウィルスの中和 は３７°Ｃで６０分間行った。ＨＣＭＶ−モノクローナル抗体の混合物を６ウエ ルプレート［コスタ−（Ｃｏｓｔａｒ、　Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、　Ｍａｓｓａｃ ｈｕｓｓｅｔｔｓ）］中の全面層の皮膚線維芽細胞に加え、ウィルスが吸着する ようさらに６０分間インキュベートした。

このウィルス混合物をアスピレータ−処理し、各ウェルに、２％ＦＣ８１ガラマ イシン、ペニシリンＧおよび０．５％アガロース［シー・プラーク（Ｓｅａ　Ｐ ｌａｑｕｅ）、ＦＭＣ社（ＦＭＣＣｏ、、　Ｒｏｃｋｌａｎｄ、　Ｍａｒｙｌａ ｎｄ）］を追加したＤＭＥＭ　５１ｆ２を加えた。８日目に、単層を７０％エタ ノール中の１０％ホルマリンで固定し、メチレン・ブルーで染色し、そしてプラ ーク数を数えた。ウィルスの中和は次の式：によって評価し、プラーク数の５０ ％減少に必要なタンパク質濃度として報告した。

３、モノクローナル抗体の精製 ジャレツツーサリナスら［Ｈ，Ｊｕａｒｅｚ−３ａｌｉｎａｓ　ｅｔ　ａｌ、、 　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、　Ｍａｙ／Ｊｕｎｅ　１９８４］（この文献は 参考のために挙げたものである）に従って、腹水からのモノクローナル抗体を高 速ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーによって精製した。

４、免疫蛍光法 アデノウィルス、ＨＳＶ、ＶＺＶ、および野生型ＨＣＭＶを臨床単離体から得た 。免疫蛍光法用に、ガラス製スライド上の感染および未感染の皮膚線維芽細胞培 養物を冷アセトン：メタノール（ｖ／ｖ。

１：１）中で固定した。固定した培養物を正常ブタ血清でプレイン￥ユベートし 、りん酸緩衝の食塩水（ＰＢＳ）で洗浄した。次の工程は全て０．１％ＮＰ−４ Ｑを含むＰＢＳを用いて行った。ＨＰＬＣ精製した腹水モノクローナル抗体、ま たは組織培養液と供に培養物を３０分間インキニベー１、ＰＢＳ　ＮＰ−４０バ ツフアーで洗浄した。次いで、培養物をフルオレセインイソチオシア＊−ト（Ｆ ＩＴＣ）標識したヤギ抗マウスＩｇＧ［カペル（Ｃａｐｐｅｌ、　Ｍａｌｖｅｒ ｎ、　Ｐｅｎｎ５ｙｌｖａｎｉａ）］と供にインキュベートした。最後の洗浄を 行った後、スライドをツァイス（Ｚｅｉｓｓ）相蛍光顕微鏡で調べた。

ヤギ抗マウスＩｇＧ（ＨおよびＬ）と供にインキュベートすることによって、免 疫沈澱法用にプロティンＡセファロースＣＬ−４Ｂビーズ［シグマ−アルドリッ チ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、　Ｓｔ、Ｌｏｕｉｓ、　Ｍｉｓｓｏｕｒｉ） コを調製し、使用前にりん酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で洗浄した。全抽出物または イオン交換ＨＰＬＣによって得られた糖ペプチドおよび糖ペプチド複合体を、０ ．１％ＮＰ−４０を含むＰＢＳ中、一定の混合を行いながら１．５時間、モノク ローナル抗体’Ｃ２、’Ｂ７、または°ＥＩＯのいずれかとともにインキュベー トした。一部のケースでは０．１％ＮＰ−４０の代わりに０．１％ＳＤＳを用い た。次いで、調製したプロティンＡセファロースＣＬ−４Ｂビーズを抗原抗体溶 液に加え、一定の混合を行いながらさらに１．５時間反応させた。このビーズを ０．１％ＮＰ−４０含有のＰＢＳで３回洗浄した。

この最後の洗浄の後、ビーズに結合したタンパク質を５ＤＳ−ＰＡＧＥ用に可溶 化した。

Ｂ、結果 １、グループＡおよびＢのＭｏＡｂによって認識される糖ペプチド糖ペプチドの バンドと反応するモノクローナル抗体が得られた。

ることかできる。ＭｏＡｂ　２　２９　９Ｂ７（’Ｂ７）およびｌ−４８−４Ｉ Ｃ２（’Ｃ２）はグループＡの代表であり、ＭｏＡｂ２　１５−９Ｅ１０（’Ｅ ＩＯ）はグループＢ１７）代表であツタ。ＨＣＭＶＩ；！ジスルフィド結合した 糖ペプチド複合体を含有していたので、モノクローナル抗体を用いて還元および 未還元の両方の粗製の界面活性剤抽出物を免疫沈澱させ、糖ペプチドが抗体によ って認識されたが故に糖ペプチドが沈澱したものか、または、抗体によって認識 される他の糖ペプチドにいずれかの糖ペプチドがジスルフィド結合によって結合 したが故にこの糖ペプチドが沈澱したものかを調べた。従って、トウネ株ＨＣＭ ＶのＮＰ−４０抽出物の一部をＤＴＴで還元し、利用可能な全てのスルフヒドリ ル結合をヨウドアセトアミドでアルキル化して再高分子化を防止した。この方法 で還元した抽出物を電気泳動で試験して還元されていることを確認した。３種の 抗体すべてを用い、材料および方法の項に記載したようにして還元および未還元 抽出物の両方を免疫沈澱させた。ＭｏＡｂ’Ｂ７および’Ｃ２は、分子量が約９ ３，０００の幅広のバンドを形成した１種の豊富な糖ペプチドを免疫沈澱させた 。さらに、分子量が１３０．０００，５２．０００および５０．０００である比 較的量の少ない３種の糖ペプチドが存在した。沈澱した糖ペプチドの数および分 子量は免疫沈澱前の還元によっては影響を受けなかった。はとんどの糖ペプチド の相対的な量も影響を受けなかったが、しがし、還元後に′ｃ２によって免疫沈 澱した分子Ｊ１５０，０００−５２．０００の糖ペプチドの量には若干の差異が 存在した。

’ＥＩＯ免疫沈澱の試験により、免疫沈澱した糖ペプチドのパターンは’Ｂ７お よび”Ｃ２で得られたものと比較すると非常に違ったものであることがわかった 。’ＥＩＯを用いたときには、ある豊富な糖ペプチドが分子量約５０，０００− ５２．０００で検出された。これら糖ペプチドの両者はゲル中に幅広のバンドを 形成した。

しかし、分子量が９０−９３．０００，１１６，０００．　および１３ｏ、　ｏ 　ｏ　ｏの少な（とも４種の比較的量の少ない糖ペプチド、並びに分子量が２０ ０，０００以上であってゲルの頂上にじみを形成した若干の物質も存在した。し かし、’Ｂ７および°Ｃ２と同様、９ＥＩＯによって沈澱した栢対量および糖タ ンパク質のパターンは沈澱前の還元によっては影響を受けなかった。

′Ｅ１０によるＨＣＭＶ株トゥネおよびトレドの中和は補体の追加を必要としな かったが、一方、同濃度（１０ｕ９／ｚ（ｌ以下）のＢ７は２％モルモット補体 の追加に依存していたく第１表）。しかし、さらに高い濃度（３０ｕ９／ｘＱ以 上）では、９Ｂ７は補体の非存在下でウィルスを中和することができた。２％モ ルモット補体の存在下で、′Ｃ２はトレドを中和したが（第１表）、補体の非存 在下ではこの株ヲ中和するのにさらに濃度の抗体を必要とした。さらに、この抗 体は２００　ｕ９／村以下の抗体濃度ではトウネ株に対して中和活性を全く示さ なかった。

第１表ＨＣＭＶの実験室株トウネおよびトレドのインビトロでの中和５０％ＰＦ ｔＪ減少のためのμｇ／岐 ＨＣＭＶ株：　トウネ＊　トウネ　トレド＊　トレド９Ｅ１０　４　８　４　１ ０ ４１Ｇ２　＞２００　＞２００　２　１００９Ｂ７　２　３６　２　４８ ＊抗体は加えずにウィルスおよび補体を接種したときの対照培養物中のＰＦＵの 平均数は、トレドが６００、トウネが３００であった。

また、ＨＣＭＶの実験室株および野生型株、並びに単純庖疹ウィルス（ＨＳＶ） 、水痘ウィルス（ＶＺｖ）、エプスタイン−バールウィルス（ＥＢＶ）およびア デノウィルスで感染させた皮膚線維芽細胞に対するＭｏＡｂの反応性をも試験し た。ＭｏＡｂ’Ｂ７および“Ｃ２の両者はＨＣＭＶ感染細胞に対して特異的であ り、実験室株と野生型株の両方と反応したが、Ｈ３ＶＳＶＺＶＳＥＢＶあるいは アデノウィルス感染細胞とは反応しないことがわかった（第２表）。一方、Ｍｏ Ａｂ’Ｅ１０はＨＣＭ　Ｖ感染の細胞と反応し、ＨＳＶおよびアデノウィルス感 染の細胞と反応したが、ＶＺｖ感染の細胞とは反応しなかった。３種抗体のすべ ては対照の皮膚線維芽細胞とは反応しなかった。

第２表感染細胞に対するモノクローナル抗体の反応性免疫蛍光＊ 抗体　クラス　トウネ　ＡＤ１６９　Ａｔ！　Ｂ　ＣＤ　ＨＳＶ　７デノウイル Ｉ　ＶＺｔｌ　ＥＢＶ　ＳＦ対照 ９Ｅ１０　１ｇＧ３　＋＋　＋　＋　＋　ＮＤ　ＮＤ　＋　＋↓＠−ＮＤ−４Ｉ Ｃ２［ｇＧ２１）＋＋　＋＋　＋＋＋＋＋＋　十＋　−−−−９Ｂ７　１ｇＱｌ 　＋＋　＋＋　＋＋＋＋＋＋　十＋　−−−−−＊　アセトン−メタノール固定 したＣＭＶ−、ＨＳＶ−、アデノウィルス−１およびＶＺＵ−感染のヒト皮膚線 維芽細胞（Ｓ　Ｆ）の細胞質免疫蛍光を、材料および方法の項で説明したように して行った。

ＩＩ　Ａ−ＤはＨＣＭＶの臨床単離体である。

ｅ　モノクローナル抗体９Ｅ１０はＨｅｐ２細胞中で増殖させたアデノウィルス とも反応した。未感染のＨｅｐ２細胞は陰性であった。

ＮＤ実施していないことを示す。

３、単離した糖ペプチドおよび糖ペプチド複合体とＭｏＡｂ　’　Ｅ　１０、’ Ｂ７、および’ｃ２の反応性 ＭｏＡｂにより免疫沈澱した糖ペプチドは免疫沈澱前の還元によっては影響を受 けなかった。従って、ジスルフィド結合による複合体′およびそうでないものに 関連して糖ペプチドの関係を調べるのが望ましかった。等量のピーク２−４から の放射活性を集め、連続的に’Ｃ２および°Ｂ７、次いで°ＥＩＯで免疫沈澱さ せた。ピーク２−４からの分画を４１０２で免疫沈澱させると、この抗体がピー ク３由来の物質と最も強く反応することがわかり、ピーク２に比ベピーク３から １９倍の放射活性を沈澱させ、ピーク４と比べると６倍の放射活性を沈澱させる ことがわかった（第１図参照）。

’Ｃ２または’Ｂ７で免疫沈澱させた後、イオン交換の分画をモノクローナル抗 体’Ｅ１０で免疫沈澱させた。このモノクローナル抗体による免疫沈澱によって 、この抗体がピーク４と最も強く反応し、ピーク２に比べるとこのピークから５ −６倍の放射活性を沈澱させ、ピーク３に比べると１１−１２倍の放射活性を沈 澱させることがわかった。ジスルフィド結合を還元することなくピーク２由来の °ＥＩＯ免疫沈澱物を電気泳動で試験すると、分子量９３．０００のバンドが検 出され、さらに、比較的量の少ない分子量１４０゜０００および１８０，０００ の２つのバンドが検出された。このパターンは、ビーク２由来の物質を還元する ことなく電気泳動によって試験したときに観察されるパターンと極めて類似して いた。ピーク２の°ＥＩＯ免疫沈澱物を還元した後に電気泳動によって試験した ときには、分子量５０−５２．０００の糖タンパク質が検出され、さらに、極め て少量の分子量９０．０００の糖ペプチドが検出された。しかし、分子１ｔ９３ ．　ＯＯＯの糖ペプチドは検出されなかった。

ピーク３からの免疫沈澱物は極めてわずかの放射活性しが含んでいなかった。未 還元のこの物質は高分子量のバンド中にあり、この放射活性の大部分は還元後に 分子量５０．０００の糖ペプチドで検出された。しかし、ごく少量の分子量９３ ．０００の糖ペプチドもピーク３からの免疫沈澱物中に検出された。

ピーク２−４中で検出された糖ペプチドの大部分が’Ｂ７、’Ｃ２、または°Ｅ ＩＯのいずれかと反応したということは興味あることであった。しかし、ピーク ２で検出された分子量９３，０００の糖ペプチドは、この糖ペプチドが相当な量 で存在していたにもがかわらず、どの抗体とも反応しないようであった。このこ とは、この糖ペプチドがピーク３で検出された分子ｆｉ９３．ｏｏｏの糖ペプチ ドとは異なっていることを示唆した。この可能性をさらに調べるため、ピーク２ 由来の物質を始めに°Ｃ２で、次いで”Ｂ７で（約１５倍過剰の抗体を用いて） 免疫沈澱させた。放射活性がもはや沈澱しなくなるまで、プロティンＡセファロ ースビーズを数回加えた。

この沈澱の後に得られた上清を同じ方法により°ＥＩＯで免疫沈澱物中動によっ て試験した。この操作を行ったときには、分子量９３゜ＯＯＯの糖ペプチドが唯 一検出される糖ペプチドであった。これら試験の結果を以下の第３表にまとめる 。

Ｍ３　表ＭｏＡｂによって免疫沈澱した糖ペプチド複合体および糖ペプチドイオ ン交換ＨＰＬＣ免疫沈澱した　還元後に免疫沈澱のピーク＊　糖ペプチド複合体 　した糖ペプチド（ＭｏＡｂ反応性）　（分子量、Ｋｄ）　（分子量、Ｋｄ）２ （９Ｅ１０）　９３　５０−５２ 先（９Ｅ１０）　４５０　５０−５２．９０１１１６．１３０、〉２００ ３（４１Ｃ２，９Ｂ７）　１３０、および＞１３０　５０−５２．９３．１３０ λ（なし）　ジスルフィド結合した　どのＭｏＡｂによっても複合体中の結合し ていな　免疫沈澱しなかったい９３Ｋｄの糖ペプチド　９３Ｋｄの糖ペプチド＊ 第１図。

２５ｃｍ”の垂直組織培養フラスコ中、１０Ｘ　１０”の新鮮な末梢血液単球（ ＭＮＣ）をＩＸｌ　０＠ＭＮＣ／訳Ｑの密度とし、１０％ＰＨ８中のＲＰＭ１１ ６４０培地に懸濁した１０．０μ９の熱−不活化したＨＣＭＶ抗原（精製Ｔｏｗ ｎｅ　Ｐｒｅｐ；　５６℃／１時間）で刺激することによって、ＨＣＭＶ特異的 なＴ細胞芽球を調製した。５％ＣＯ２大気中に３７℃で６日問おいた後、９６ウ エルのＵ底の組織培養プレート中、フィーダー細胞としてのＸ−線照射オートロ ガスＭＮＣ１熱−不活化ＨＣＭｖ抗原（１μ９／ｊＩの、および１０−２０％Ｔ ＣＧＦ［バイオテスト（Ｂｉｏｔｅｓｔ、　Ｆｒａｎｋｆｕｒｔ、　Ｇｅｒｍａ ｎｙ）］の存在下、０，３細胞／ウエルでの限界希釈によってＨＣＭＶ特異的芽 球をクローニングした。以後、３−４日毎に細胞に新鮮なＴＣＧＦ含有培地を補 給した。週に一度、ＨＣＭＶ抗原およびオートロガスＸ−線照射フィーダー細胞 を培地に加えた。２１日口の経過の後、増殖細胞をさらに増殖させるため２４ウ エルのプレートに移し、次いで、大量調製のため２５ＣＩ”の組織培養フラスコ 中にもう一度蒔いた。増殖クローンの一部を第２の限界希釈によってサブクロー ニングし、クローニングを確実なものにした。４種のＨＣＭＶ七ロポシロポジテ ィブ供与体統（ライン）を発生させ、１００以上の別々のヘルパー−Ｔ（Ｔｈ） 細胞クローンを得た。

２、ＨＣＭＶ−Ｔｈクローンの特徴付は以下のようにして、全てのＴｈクローン を、表現型、増殖応答、ＩＬ−２産生、および細胞毒活性について調べた。

Ａ０表現型分析 モノクローナル抗体０ＫＴ３（全Ｔ細胞）、○ＫＴ４（ヘルパー／誘導Ｔ細胞） 、および０ＫＴ８（細胞毒／サプレッサーＴ細胞）［オルソ０フアーマシニーテ イカルズ社（Ｏｒｔｈｏ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ　Ｉｎｃ、。

Ｒａｒｉｔａｎ、　Ｎｅｗ　Ｊｅｒｓｅｙ）］を用い、間接免疫蛍光検定法を用 いて、ＯＫＴ表現型決定因子の発現についてＴｈクローンを分析した。蛍光は、 ツァイスの蛍光蛍光を用いる蛍光顕微鏡法、またはＥＰＩＣ３５４１［コールタ −社（Ｃｏｕｌｔｅｒ　Ｃｏｒｐ、、　Ｈｉａｌｅａｈ、　Ｆｌｏｒｉｄａ）］ を用いるフロー・サイトメトリー法のいずれかで検出した。全てのＴｈクローン は、０ＫＴ３＋　０ＫＴ４＋　０ＫＴ８−の表現型を示した。

Ｂ、リンパ球の増殖 Ｔ細胞クローンを組織培養培地中、ＴＣＧＦの非存在下で一装置き、次いでＨＣ ＭＶ抗原または関連のヘルペスウィルス抗原、Ｈ３Ｖのどちろかで７２時間再刺 激して、ＨＣ！ＶＩ　Ｖに対する増殖応答の特異性を調べた。Ｈ３Ｖに対する応 答は組織培養培地のバンクグラウンド対照のものに類似していた。即ち、全ての ＴｈクローンはＨＣＭＶ特異的であった。

Ｃ，インターロイキン−２（Ｉ　Ｌ−２）の産生ＴｈクローンをＨＣＭＶ抗原で 刺激し、２４時間でその上清を集め、ネズミＣＴＬＬ−２０（Ｉ　Ｌ−２依存性 ）ネズミセルラインを用いてＩＬ−２活性を検定した。全てのＴｈクローンは、 ＣＴＬＬ−２０の生存および増殖で示されるＩＬ−２の産生を示した。

Ｄ、細胞毒活性 全てのＴｈクローンを、ＮＫ標的セルライン、Ｋ５６２、オートロガスな未感染 並びにＨＣＭＶ−およびＨ３Ｖ−感染のヒト皮膚線維芽細胞（標的細胞として） に対する細胞毒活性について試験した。ＮＫまたはウィルス特異的な細胞毒活性 は、どのＴｈクローンについても観察されなかった。

細胞免疫の初期の重要な工程は、ヘルパー−Ｔ　（Ｔ　ｈ）細胞と呼ばれる白血 球（ＷＢＣ）の一群による外来抗原の認識である。抗原の最初の免疫原反応はＴ ｈ細胞によるその認識に依存している。認識の後、増殖し、いくつかのタイプの ＷＢＣの増殖を引き起こすＩＬ−２などのリンフ才力イン類を産生ずるように、 このＴｈ細胞が刺激される。ＨＰＬＣのビーク２（ｒ２ＵＲＪ）、３（ｒ３ＵＲ Ｊ）、および４（ｒ４ＵＲＪ）由来の精製した未還元の糖ペプチド複合体による 、あるＨＣＭＶ特異的Ｔｈ細胞クローン（ＷＲＣ＃　３）の相対的な増殖を第４ 表に示す。

第４表Ｔｈ細胞クローンＷＲ（、：３の増殖刺激物質　導入された３Ｈ−チミジ ン （ｃｐｍ） ＷＲＣ：３　（対照）９５±３６ ＷＲＣ＃３　＋ＷＲＣＭＮＣＩＲ”＊　（対照）１４３±１０ｉＲｃ＃３　＋　 ＷＲＣＭＮＣ””　＋　Ｈ３Ｖ　（ｌμｇ／ウェル”）　３３６土９２ＷＲＣ： ３　＋　ＹＲＣＭＮＣ！１１”　＋　）ラネＣＭＶ　（０，５μ９／ウエル）　 ５５，０８０±１．２１０ＷＲＣ＃３　＋　ＷＲＣＭＮＣ！Ｒ”　＋　）リドｙ Ｘ−１００１ｆＳの）’７ネＣＭＶ　（０，ｓμｙ、／ウニｌ）　９，３１１± ２，８６６ＷＲＣ＃３　＋　貰ＲＣＭＮＣ”Ｒ＋　２ｔｉＲ（０，ｌｚｇ／ウェ ル）　１．１９４±７９２ＷＲＣ，”３　＋　ＷＲＣＭＮＣｒＲＲ＋　３ＵＲ（ ０，１μ９／つｘｌ）　１９，７０６±５，２５２ＷＲＣ＃３　＋　％ＲＣＭＮ Ｃ１″”　＋　４ＵＲ（０，１Ｈｇ／つＩル）　２５，３８７±３８９＊供与体 ＷＲＣ由来の照射Ｍ　Ｎ　Ｃ０重要なことは、吸着細胞の表面に存在する抗原が 、引き全抗原に対して特異的に指向している単核リンパ球のクローン性増殖を誘 導するということである。刺激がおさまった後、生き残った増殖クローンは身体 中に記憶細胞として残り、同一の抗原が与えられたときにもう一度迅速に増殖す るための用意をする。この−次記憶細胞がＴｈ細胞である。

ＧＬＰ−ＡおよびＧＬＰ−Ｂ糖ペプチドは、第５表に示したように、七ロポジテ ィブ供与体由来の記憶ＷＢＣを刺激するが、七ロネガティブ供与体由来のそれは 刺激しない。これらの結果は、これら糖ペプチド複合体がＨＣＭ　Ｖの重要な免 疫学的成分であることを示した。

刺激物質　ＴＬ　ＪＤ　ＷＲＣＫＭ （ＣＭＶ−）　（ＣＭＶ＋）　（ＣＭＶ＋）　（ＣＭＶ＋）培地　６４５±１４ ５°　２３１±６７　３１２±１０６　１．１８９±６３５（”−”対照） ｓｔａｐｈフｙ−万古菌液　１２８．０７３±２６．８５６　ＮＤ＊　２６７、 １６７±２２．３５６　１８２，１９０±２２．７４７（全ての供与体に 対する”＋”対利 トウネＡｇ　４４２±９４　１０９．２６２±７．１６４　５４．０６８±１０ ．１５７　３１．２２４±６．９８１２ＵＲ９８３±６９　２３．９２２±１． ７１４　：（、５９２±４２　１１．８５２±２，４２３３ＵＲ９０２±４５　 ９，２７７±２．８３１　２．９７５±１．７９２　３９．Ｏ＆ｇ±４２７４Ｕ Ｒ１，１４４±４６６　１９．７１１１１±２．８８９　１．８６５±２３０　 １３．０８７±１．２６８＊未屓１淀。

＋−フィコール−ハイバーク（Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ）密度勾配での供 与体のヘパリン処理混合物から単離した単核細胞（ＭＮＣ）を、ゲーツら［Ｒ， Ｃ，Ｇｅｈｒｚ　ｅｔ　ａｌ、　。

Ｊ、　Ｉｎｆｅｃｔ、　Ｄｉｓｌ、　１４３．３９１　（１９８１）コの方法に より、リンパ球の増殖について検定した。

実施例４ グループＡからのモノクローナル抗体を用いるヒトサイトメガロウィルスの診断 検定 Ａ、材料および方法 グループＡの糖ペプチドの別の抗原決定基に対して指向性である２種類のモノク ローナル抗体を、この酵素結合した免疫吸着検定に用いる。−次、即ち捕捉モノ クローナル抗体Ｉを固相に吸着させる。

第２のモノクローナル抗体■を、結果の読み出しを与えるいずれかの表示システ ムにコンジュゲートさせる。ＨＣＭＶの存在下では、陽性の読み出し結果が得ら れるであろう。

捕捉抗体■、例えば°Ｃ２を、ダイナチック［Ｄｙｎａｔｅｃｈ、　Ａｌｅｘａ ｎｄｒｉａ、　Ｖｉｒｇｉｎｉａコのリモバストリップ・システム（Ｒｅｍｏｖ ａｓｔｒｉｐ　ｓｙｓｔｅｍ）のイムロンＩ　（Ｉｍｍｕｌｏｎ　ｌ）ポリスチ レンマイクロウェルに吸着させた。炭酸塩−炭酸水素塩バッファ−ｐＨ９，５を 用い、ウェルを０゜０５％−ツイーン２０含有のりん酸緩衝食塩水ｐＨ７，４（ ＰＢＳ−ツイーン）で洗浄した。

精製ＣＭＶウィルスおよびウィルス感染あるいは未感染の皮膚線維芽細胞溶菌液 （１％ＮＰ−４Ｑ含有のＰＢＳで得られた）をマイクロウェルに加え、３７℃で １時間インキュベートした。次いで、このウェルをＰＢＳ−ツイーンで洗浄した 。

ビオチン処理したモノクローナル抗体■、例えば’Ｂ７を加え、この試料を３７ ℃で１時間インキュベートした。次いで、ウェルをＰＳＢ−ツイーンで洗浄した 。

ペルオキシダーゼにコンジュゲートしたストレプトアビジン［キルケガード・ア ンド・ぺり−・ラボラトリーズ社αｉｒｋｅｇａａｒｄ　＆　Ｐｅｒｒｙ　Ｌａ ｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ｉｎｃ、　）コを加え、試料をさらに３７℃で１時間 インキュベートした。次いで、ウェルをＰＢＳ−ツイーンおよび蒸留水で洗浄し た。

リン酸−クエン酸バッファーｐＨ５，０中の基質オルソ−フェニレンジアミンを 、添加した過酸化水素とともに用いた。室温で１５分間インキュベートした後、 ５Ｎ硫酸で反応を止めた。ダイナチックのマイクロウェル・プレート・リーダー により４９０ｎｍでの生成物の吸収を読み取った。

第５表に示したように、ＨＣＭＶのトウネ株との反応は全タンパク質７．８ｎ９ 以上で直線状であったが、皮膚線維芽細胞対照との測定可能な反応は存在しなか った。患者の試料を直接検定したが、全ウィルスタンパク質を測定することはで きなかった。第６表に典型的な患者の検定を示す。細胞培養物診断によって確認 したＨＣＭＶ陽性試料はバックグラウンド値を越えて強く反応することがわかっ た。

Ｂ、結果 試　料　全タンパク質　吸　収 ＨＣＭＶ抗原　（ｎ？）　（４９０ｒ＋ｍ）トウネ株　０　０．００２ ０、５　０．０５１ １　０、０６０ ２　０、０８ｇ ３、９　０．０８５ ７、８　０．１１０ １５・６　０．１４６ ３１、３　０．２１１ ６２、５　０．２８ｇ １２５　０、４３０ ２５０　０、７３２ ５００　１、３７９ 患者試料　吸　収 細胞溶菌液　（４９０ｎｍ） ＨＣＭＶ感染の皮膚線維芽細胞　１．９６７（１／１６希釈） 未感染の皮膚線維芽細胞　０．１１７ Ｈ３ＩＩ感染の皮膚線維芽細胞　０．１ｏｔＨ３Ｖ−２感染の皮膚線維芽細胞　 ０．１２９患者試料は、熟練した臨床ウィルス学実験室職員による古典的な細胞 変性効果パターン認識によって同定した。

炙−寒 我々は、ＨＣＭＶが少なくとも２種類の膜エンベロープ糖タンパク質複合体を含 有しており、この複合体が糖ペプチドＧＬＰ−ＡおよびＧＬＰ−Ｂを含んでおり 、ウィルス粒子の表面に配列しており、折り畳まれてもいないし小高中に埋没し てもいないし、また身体環境の巨大成分、例えば抗体およびＴｈ細胞の抗原認識 部位との反応を立体的に阻害されてもいないことを発見した。これらの糖ペプチ ドは体液性および細胞性免疫応答を強く誘導し、ＨＣＭＶ感染からの回復におい て重要な役割を示している。さらに、これら糖ペプチドに対するＭｏＡｂは生ウ ィルスを中和する。

本発明は、μ９量の実質的に純粋な糖ペプチドの単離方法を提供するものである 。ＧＬＰ−ＡおよびＧＬＰ−Ｂ並びにこれらから導かれるＭｏＡｂは、ＨＣＭＶ の診断、感染患者の治療、および未感染の人の予防に有用であると考えられる。

ＧＬＰ−Ａに対して生成させた抗体の例としては、ＭｏＡｂｌ−４８−４１Ｃ２ および２−２９−９８７が挙げられる。これら抗体は活性ＨＣＭＶウィルスの診 断に特に有用である。当業者なら本発明の教示に従って容易にＧＬＰ−Ａを調製 し、これを上記モノクローナル抗体の同定に用いることができる。

また、ＧＬＰ−Ｂと反応する抗体としてＭｏＡｂ　２−１５−９Ｅ１０が挙げら れ、これは補体の添加なしでＨＣＭＶを中和することができる。当業者なら本発 明の教示に従ってＧＬＰ−Ｂを調製するのは容易であり、特徴を同じくする他の モノクローナル抗体の同定に用いることができる。このような抗体はＨＣＭＶの 治療に有用であり、ヘルペス型の他のウィルスとの交叉反応性の程度はこの用途 に別の利点を与える。

一９Ｂ７＝ＩｖＩ−１０１１７；Ｈｂ　２−１５−９Ｅ１０＝ＩＶＩ−１０１１ ８；Ｈｂ　ｌ−４８−４１Ｃ２＝ＩＶＩ−１０１１９゜これら寄託されているハ イブリドーマの培養物は、本出願に基づく特許が認められたときに一般に入手可 能となるであろう。寄託物の入手が可能であることは、合衆国政府が認めた特許 ９権利を狭めてその対象発明を実施するライセンスを与えるものではないことを 理解すべきである。

本明細書には、ある種の代表的な態様が説明のために記載されているが、本発明 の思想および範囲から逸脱することなくその修飾が可能であることは当業者には 明らかであろう。

本研究を進めるにあたり援助と激励を頂いたチルドレンズ・ホスピタル［Ｃｈｉ ｌｄｒｅｎ’ｓ　Ｈｏ５ｐｉｔａｌ、　Ｓｔ、Ｐａｕｌ、　Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ ］に対し謝意を表する。

く 〇 国際調査報告 −１−一−＾帥−−１−一・　ＰＣ？／υＳ　８７１０３０４１

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. １．（ａ）マウスをＨＣＭＶピリオンで免疫し；（ｂ）該マウスの脾細胞を骨髄 腫細胞系統と融合させてハイプリドーマを得； （ｃ）該ハイブリドーマから、ＨＣＭＶと反応し得るが、単純庖疹ウイルス、ア デノウイルス、エプスタイン−バールウイルスまたはバリセラウイルスとは反応 しないモノクローナル抗体であって、ＨＣＭＶを中和し得るモノクローナル抗体 を産生することができるハイプリドーマを選択し；そして、 （ｄ）該ハイブリドーマをクローン増殖させる；ことを特徴とする方法によって 製造されるモノクローナル抗体。
2. ２．９３ｋＤのＨＣＭＶエンベロープ関連の糖ペプチドを免疫沈澱させる請求項 １記載のモノクローナル抗体。
3. ３．ハイプリドーマＩＶＩ−１０１１７が産生する請求項１記載のモノクローナ ル抗体。
4. ４．ハイプリドーマＩＶＩ−１０１１９が産生する請求項１記載のモノクローナ ル抗体。
5. ５．（ａ）マウスをＨＣＭＶピリオンで免疫し；（ｂ）該マウスの脾細胞を骨髄 腫細胞系統と融合させてハイブリドーマを得； （ｃ）該ハイプリドーマから、ＨＣＭＶ、単純庖疹およびアデノウイルスと反応 し得るモノクローナル抗体であって、補体の非存在下でＨＣＭＶを中和し得るモ ノクローナル抗体を産生することができるハイブリドーマを選択し；そして、 （ｄ）該ハイプリドーマをクローン増殖させる；ことを特徴とする方法によって 製造されるモノクローナル抗体。
6. ６．５０−５２ｋＤのＨＣＭＶエンベロープ関連の糖タンパク質を免疫沈澱させ る請求項１記載のモノクローナル抗体。
7. ７．ハイブリドーマＩＶＩ−１０１１８が産生する請求項５記載のモノクローナ ル抗体。