UA125284C2 - Рекомбінантне антитіло, яке специфічно зв'язується з tl1a - Google Patents
Рекомбінантне антитіло, яке специфічно зв'язується з tl1a Download PDFInfo
- Publication number
- UA125284C2 UA125284C2 UAA201804192A UAA201804192A UA125284C2 UA 125284 C2 UA125284 C2 UA 125284C2 UA A201804192 A UAA201804192 A UA A201804192A UA A201804192 A UAA201804192 A UA A201804192A UA 125284 C2 UA125284 C2 UA 125284C2
- Authority
- UA
- Ukraine
- Prior art keywords
- rgo
- acid sequence
- antibody
- amino acid
- variable region
- Prior art date
Links
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims abstract description 73
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims abstract description 73
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims abstract description 73
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 51
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 199
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 93
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 claims description 92
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 79
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 75
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 claims description 72
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 64
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 48
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims description 31
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 28
- 208000006673 asthma Diseases 0.000 claims description 27
- 206010009887 colitis Diseases 0.000 claims description 20
- 229940092253 ovalbumin Drugs 0.000 claims description 15
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims description 15
- 108010058846 Ovalbumin Proteins 0.000 claims description 14
- 101000777271 Mus musculus Calcineurin B homologous protein 3 Proteins 0.000 claims description 13
- 241000700199 Cavia porcellus Species 0.000 claims description 11
- 102000011727 Caspases Human genes 0.000 claims description 10
- 108010076667 Caspases Proteins 0.000 claims description 10
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 210000003979 eosinophil Anatomy 0.000 claims description 10
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 claims description 9
- 208000022559 Inflammatory bowel disease Diseases 0.000 claims description 8
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 claims description 8
- 210000001072 colon Anatomy 0.000 claims description 8
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 claims description 8
- 241000282553 Macaca Species 0.000 claims description 6
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 claims description 6
- 210000002345 respiratory system Anatomy 0.000 claims description 5
- 208000031481 Pathologic Constriction Diseases 0.000 claims description 2
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 2
- 240000001829 Catharanthus roseus Species 0.000 claims 4
- 235000002568 Capsicum frutescens Nutrition 0.000 claims 2
- 244000005894 Albizia lebbeck Species 0.000 claims 1
- 241000272525 Anas platyrhynchos Species 0.000 claims 1
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 claims 1
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 claims 1
- 241001327708 Coriaria sarmentosa Species 0.000 claims 1
- 235000005459 Digitaria exilis Nutrition 0.000 claims 1
- 235000002917 Fraxinus ornus Nutrition 0.000 claims 1
- 244000182067 Fraxinus ornus Species 0.000 claims 1
- 240000005546 Piper methysticum Species 0.000 claims 1
- 235000016787 Piper methysticum Nutrition 0.000 claims 1
- 244000046146 Pueraria lobata Species 0.000 claims 1
- 235000010575 Pueraria lobata Nutrition 0.000 claims 1
- 235000011449 Rosa Nutrition 0.000 claims 1
- 241001415849 Strigiformes Species 0.000 claims 1
- 241001424341 Tara spinosa Species 0.000 claims 1
- 241001622399 Thala Species 0.000 claims 1
- CCAZWUJBLXKBAY-ULZPOIKGSA-N Tutin Chemical compound C([C@]12[C@@H]3O[C@@H]3[C@@]3(O)[C@H]4C(=O)O[C@@H]([C@H]([C@]32C)O)[C@H]4C(=C)C)O1 CCAZWUJBLXKBAY-ULZPOIKGSA-N 0.000 claims 1
- 101100020289 Xenopus laevis koza gene Proteins 0.000 claims 1
- 239000004110 Zinc silicate Substances 0.000 claims 1
- 239000004071 soot Substances 0.000 claims 1
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 abstract description 2
- 102100024587 Tumor necrosis factor ligand superfamily member 15 Human genes 0.000 abstract 2
- 108090000138 Tumor necrosis factor ligand superfamily member 15 Proteins 0.000 abstract 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 abstract 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 73
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 67
- 101100460719 Mus musculus Noto gene Proteins 0.000 description 54
- 101100187345 Xenopus laevis noto gene Proteins 0.000 description 54
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 34
- 241001130469 Tila Species 0.000 description 30
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 30
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 28
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 24
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 23
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 23
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 22
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 21
- 238000012933 kinetic analysis Methods 0.000 description 20
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 17
- 201000003883 Cystic fibrosis Diseases 0.000 description 16
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 16
- 206010003246 arthritis Diseases 0.000 description 14
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 12
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 11
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 11
- 208000005069 pulmonary fibrosis Diseases 0.000 description 11
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 11
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 11
- 230000004044 response Effects 0.000 description 11
- 208000017520 skin disease Diseases 0.000 description 11
- 208000018522 Gastrointestinal disease Diseases 0.000 description 10
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 10
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 10
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 10
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 10
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 10
- 208000006545 Chronic Obstructive Pulmonary Disease Diseases 0.000 description 9
- 206010012438 Dermatitis atopic Diseases 0.000 description 9
- 206010064212 Eosinophilic oesophagitis Diseases 0.000 description 9
- 206010016654 Fibrosis Diseases 0.000 description 9
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 9
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 9
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 9
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 9
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 9
- 201000008937 atopic dermatitis Diseases 0.000 description 9
- 208000010643 digestive system disease Diseases 0.000 description 9
- 201000000708 eosinophilic esophagitis Diseases 0.000 description 9
- 230000004761 fibrosis Effects 0.000 description 9
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 9
- 208000018685 gastrointestinal system disease Diseases 0.000 description 9
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 9
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 9
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 9
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 9
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 9
- 241000700198 Cavia Species 0.000 description 8
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 8
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 8
- NTYJJOPFIAHURM-UHFFFAOYSA-N Histamine Chemical compound NCCC1=CN=CN1 NTYJJOPFIAHURM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 8
- 241000894007 species Species 0.000 description 8
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 8
- 206010009900 Colitis ulcerative Diseases 0.000 description 7
- 208000011231 Crohn disease Diseases 0.000 description 7
- 241000009328 Perro Species 0.000 description 7
- 201000006704 Ulcerative Colitis Diseases 0.000 description 7
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 7
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 7
- 208000023504 respiratory system disease Diseases 0.000 description 7
- 206010039073 rheumatoid arthritis Diseases 0.000 description 7
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 7
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 7
- 239000010936 titanium Substances 0.000 description 7
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 7
- 206010039085 Rhinitis allergic Diseases 0.000 description 6
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 6
- 201000010105 allergic rhinitis Diseases 0.000 description 6
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 6
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 6
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 6
- 208000002551 irritable bowel syndrome Diseases 0.000 description 6
- 201000003651 pulmonary sarcoidosis Diseases 0.000 description 6
- 108700015048 receptor decoy activity proteins Proteins 0.000 description 6
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 6
- 229910019567 Re Re Inorganic materials 0.000 description 5
- 239000000443 aerosol Substances 0.000 description 5
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 5
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 5
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 5
- 230000000112 colonic effect Effects 0.000 description 5
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 5
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 5
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 5
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 5
- 229940126601 medicinal product Drugs 0.000 description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 5
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 5
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 5
- 108010047041 Complementarity Determining Regions Proteins 0.000 description 4
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 4
- WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N Haematoxylin Chemical compound C12=CC(O)=C(O)C=C2CC2(O)C1C1=CC=C(O)C(O)=C1OC2 WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 4
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 4
- 208000018569 Respiratory Tract disease Diseases 0.000 description 4
- 206010039710 Scleroderma Diseases 0.000 description 4
- 208000025865 Ulcer Diseases 0.000 description 4
- 208000026935 allergic disease Diseases 0.000 description 4
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 4
- 208000010668 atopic eczema Diseases 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 4
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 4
- 238000011067 equilibration Methods 0.000 description 4
- 229960001340 histamine Drugs 0.000 description 4
- 206010020718 hyperplasia Diseases 0.000 description 4
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 4
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 4
- 239000005022 packaging material Substances 0.000 description 4
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 4
- 229920003229 poly(methyl methacrylate) Polymers 0.000 description 4
- 239000004926 polymethyl methacrylate Substances 0.000 description 4
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 4
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 4
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 3
- WFDIJRYMOXRFFG-UHFFFAOYSA-N Acetic anhydride Chemical compound CC(=O)OC(C)=O WFDIJRYMOXRFFG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 208000000884 Airway Obstruction Diseases 0.000 description 3
- 102000019034 Chemokines Human genes 0.000 description 3
- 108010012236 Chemokines Proteins 0.000 description 3
- 101150060303 SOK2 gene Proteins 0.000 description 3
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 3
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 3
- 102100040247 Tumor necrosis factor Human genes 0.000 description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 3
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 3
- 238000013211 curve analysis Methods 0.000 description 3
- YPHMISFOHDHNIV-FSZOTQKASA-N cycloheximide Chemical compound C1[C@@H](C)C[C@H](C)C(=O)[C@@H]1[C@H](O)CC1CC(=O)NC(=O)C1 YPHMISFOHDHNIV-FSZOTQKASA-N 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 3
- 210000002175 goblet cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 3
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 3
- 238000003367 kinetic assay Methods 0.000 description 3
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 3
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 3
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 3
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 3
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 3
- 238000006722 reduction reaction Methods 0.000 description 3
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 3
- 239000000779 smoke Substances 0.000 description 3
- -1 sulfenyl halides Chemical class 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 231100000397 ulcer Toxicity 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- NHJVRSWLHSJWIN-UHFFFAOYSA-N 2,4,6-trinitrobenzenesulfonic acid Chemical compound OS(=O)(=O)C1=C([N+]([O-])=O)C=C([N+]([O-])=O)C=C1[N+]([O-])=O NHJVRSWLHSJWIN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001103870 Adia Species 0.000 description 2
- 208000036065 Airway Remodeling Diseases 0.000 description 2
- 241000486679 Antitype Species 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 108010006654 Bleomycin Proteins 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 101710155857 C-C motif chemokine 2 Proteins 0.000 description 2
- 101100492787 Caenorhabditis elegans mai-1 gene Proteins 0.000 description 2
- 102000000018 Chemokine CCL2 Human genes 0.000 description 2
- 102000009058 Death Domain Receptors Human genes 0.000 description 2
- 108010049207 Death Domain Receptors Proteins 0.000 description 2
- QSJXEFYPDANLFS-UHFFFAOYSA-N Diacetyl Chemical compound CC(=O)C(C)=O QSJXEFYPDANLFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010012735 Diarrhoea Diseases 0.000 description 2
- 206010014950 Eosinophilia Diseases 0.000 description 2
- 208000009386 Experimental Arthritis Diseases 0.000 description 2
- 206010017943 Gastrointestinal conditions Diseases 0.000 description 2
- 102000004269 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 description 2
- 108010017080 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 101000939500 Homo sapiens UBX domain-containing protein 11 Proteins 0.000 description 2
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 2
- 108010002616 Interleukin-5 Proteins 0.000 description 2
- 102000000743 Interleukin-5 Human genes 0.000 description 2
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 2
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 2
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 2
- 241001115903 Raphus cucullatus Species 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- 241000555745 Sciuridae Species 0.000 description 2
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 2
- 102100029645 UBX domain-containing protein 11 Human genes 0.000 description 2
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- 230000010933 acylation Effects 0.000 description 2
- 238000005917 acylation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000036428 airway hyperreactivity Effects 0.000 description 2
- 230000029936 alkylation Effects 0.000 description 2
- 238000005804 alkylation reaction Methods 0.000 description 2
- 239000013566 allergen Substances 0.000 description 2
- 229940037003 alum Drugs 0.000 description 2
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- 230000009830 antibody antigen interaction Effects 0.000 description 2
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 2
- 210000004436 artificial bacterial chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 2
- 229960001561 bleomycin Drugs 0.000 description 2
- OYVAGSVQBOHSSS-UAPAGMARSA-O bleomycin A2 Chemical compound N([C@H](C(=O)N[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)NCCC=1SC=C(N=1)C=1SC=C(N=1)C(=O)NCCC[S+](C)C)[C@@H](O[C@H]1[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1)O[C@@H]1[C@H]([C@@H](OC(N)=O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)C=1N=CNC=1)C(=O)C1=NC([C@H](CC(N)=O)NC[C@H](N)C(N)=O)=NC(N)=C1C OYVAGSVQBOHSSS-UAPAGMARSA-O 0.000 description 2
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 2
- 210000004271 bone marrow stromal cell Anatomy 0.000 description 2
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 2
- 230000021235 carbamoylation Effects 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- XLJMAIOERFSOGZ-UHFFFAOYSA-M cyanate Chemical compound [O-]C#N XLJMAIOERFSOGZ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 230000016396 cytokine production Effects 0.000 description 2
- 229940127089 cytotoxic agent Drugs 0.000 description 2
- 239000003651 drinking water Substances 0.000 description 2
- 235000020188 drinking water Nutrition 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 2
- YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N eosin Chemical compound [Na+].OC(=O)C1=CC=CC=C1C1=C2C=C(Br)C(=O)C(Br)=C2OC2=C(Br)C(O)=C(Br)C=C21 YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000005081 epithelial layer Anatomy 0.000 description 2
- 210000003238 esophagus Anatomy 0.000 description 2
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 2
- 230000002496 gastric effect Effects 0.000 description 2
- LEQAOMBKQFMDFZ-UHFFFAOYSA-N glyoxal Chemical compound O=CC=O LEQAOMBKQFMDFZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 2
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 2
- 230000009610 hypersensitivity Effects 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 2
- 230000004941 influx Effects 0.000 description 2
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 2
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 2
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 2
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 2
- JDNTWHVOXJZDSN-UHFFFAOYSA-N iodoacetic acid Chemical compound OC(=O)CI JDNTWHVOXJZDSN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 2
- 230000004199 lung function Effects 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 2
- 238000002414 normal-phase solid-phase extraction Methods 0.000 description 2
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 2
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 2
- OJUGVDODNPJEEC-UHFFFAOYSA-N phenylglyoxal Chemical compound O=CC(=O)C1=CC=CC=C1 OJUGVDODNPJEEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 2
- 102000035025 signaling receptors Human genes 0.000 description 2
- 108091005475 signaling receptors Proteins 0.000 description 2
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 2
- 238000002198 surface plasmon resonance spectroscopy Methods 0.000 description 2
- 235000013616 tea Nutrition 0.000 description 2
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 description 2
- 230000009278 visceral effect Effects 0.000 description 2
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 2
- KMOUUZVZFBCRAM-OLQVQODUSA-N (3as,7ar)-3a,4,7,7a-tetrahydro-2-benzofuran-1,3-dione Chemical compound C1C=CC[C@@H]2C(=O)OC(=O)[C@@H]21 KMOUUZVZFBCRAM-OLQVQODUSA-N 0.000 description 1
- OVOJUAKDTOOXRF-UHFFFAOYSA-N 2,4-dinitrobenzenesulfonic acid Chemical compound OS(=O)(=O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1[N+]([O-])=O OVOJUAKDTOOXRF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000003923 2,5-pyrrolediones Chemical class 0.000 description 1
- KFDPCYZHENQOBV-UHFFFAOYSA-N 2-(bromomethyl)-4-nitrophenol Chemical compound OC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1CBr KFDPCYZHENQOBV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FALRKNHUBBKYCC-UHFFFAOYSA-N 2-(chloromethyl)pyridine-3-carbonitrile Chemical compound ClCC1=NC=CC=C1C#N FALRKNHUBBKYCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BSCMKVMJAHJNJW-UHFFFAOYSA-L 3-[2-carboxyethyl(dichloro)stannyl]propanoic acid Chemical compound OC(=O)CC[Sn](Cl)(Cl)CCC(O)=O BSCMKVMJAHJNJW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- FBTSQILOGYXGMD-LURJTMIESA-N 3-nitro-L-tyrosine Chemical class OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C([N+]([O-])=O)=C1 FBTSQILOGYXGMD-LURJTMIESA-N 0.000 description 1
- 206010003598 Atelectasis Diseases 0.000 description 1
- 208000032116 Autoimmune Experimental Encephalomyelitis Diseases 0.000 description 1
- 208000034309 Bacterial disease carrier Diseases 0.000 description 1
- 208000035143 Bacterial infection Diseases 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 101100148933 Caenorhabditis elegans sdhb-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100256965 Caenorhabditis elegans sip-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100500421 Chlamydomonas reinhardtii DHC1 gene Proteins 0.000 description 1
- 208000017667 Chronic Disease Diseases 0.000 description 1
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 1
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 1
- 102000018832 Cytochromes Human genes 0.000 description 1
- 108010052832 Cytochromes Proteins 0.000 description 1
- 201000004624 Dermatitis Diseases 0.000 description 1
- 101100291267 Drosophila melanogaster Miga gene Proteins 0.000 description 1
- 101100536354 Drosophila melanogaster tant gene Proteins 0.000 description 1
- 239000012591 Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline Substances 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 208000027004 Eosinophilic disease Diseases 0.000 description 1
- 241000283086 Equidae Species 0.000 description 1
- 206010015150 Erythema Diseases 0.000 description 1
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 1
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 1
- 101710171457 Glycoprotein O Proteins 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 101000984746 Homo sapiens BRCA1-associated protein Proteins 0.000 description 1
- 101000942008 Homo sapiens Colorectal mutant cancer protein Proteins 0.000 description 1
- 101001033249 Homo sapiens Interleukin-1 beta Proteins 0.000 description 1
- 101000600766 Homo sapiens Podoplanin Proteins 0.000 description 1
- 101000800488 Homo sapiens T-cell leukemia homeobox protein 1 Proteins 0.000 description 1
- 102100039065 Interleukin-1 beta Human genes 0.000 description 1
- 102000013691 Interleukin-17 Human genes 0.000 description 1
- 108050003558 Interleukin-17 Proteins 0.000 description 1
- 108090000978 Interleukin-4 Proteins 0.000 description 1
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 description 1
- 102000004889 Interleukin-6 Human genes 0.000 description 1
- 208000029523 Interstitial Lung disease Diseases 0.000 description 1
- 206010023799 Large intestinal ulcer Diseases 0.000 description 1
- 108010047357 Luminescent Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000006830 Luminescent Proteins Human genes 0.000 description 1
- 208000019693 Lung disease Diseases 0.000 description 1
- 208000032376 Lung infection Diseases 0.000 description 1
- 241000282567 Macaca fascicularis Species 0.000 description 1
- 102000009571 Macrophage Inflammatory Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010009474 Macrophage Inflammatory Proteins Proteins 0.000 description 1
- PEEHTFAAVSWFBL-UHFFFAOYSA-N Maleimide Chemical compound O=C1NC(=O)C=C1 PEEHTFAAVSWFBL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 101100009348 Mus musculus Depp1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100286247 Mus musculus Id1 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000282339 Mustela Species 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 150000007930 O-acyl isoureas Chemical class 0.000 description 1
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 1
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 1
- 101100491259 Oryza sativa subsp. japonica AP2-2 gene Proteins 0.000 description 1
- 101000825640 Oryza sativa subsp. japonica Shikimate kinase 3, chloroplastic Proteins 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 101710132772 Peroxidase 1 Proteins 0.000 description 1
- 206010036790 Productive cough Diseases 0.000 description 1
- 208000007123 Pulmonary Atelectasis Diseases 0.000 description 1
- 101100009350 Rattus norvegicus Depp gene Proteins 0.000 description 1
- 208000002200 Respiratory Hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- 101100385396 Schizosaccharomyces pombe (strain 972 / ATCC 24843) cka1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101710193490 Serine/threonine protein kinase OSK3 Proteins 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- 108700023707 TUG1 Proteins 0.000 description 1
- NYTOUQBROMCLBJ-UHFFFAOYSA-N Tetranitromethane Chemical compound [O-][N+](=O)C([N+]([O-])=O)([N+]([O-])=O)[N+]([O-])=O NYTOUQBROMCLBJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RTAQQCXQSZGOHL-UHFFFAOYSA-N Titanium Chemical compound [Ti] RTAQQCXQSZGOHL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- 102220589714 YjeF N-terminal domain-containing protein 3_T24Y_mutation Human genes 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 208000024716 acute asthma Diseases 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 230000008371 airway function Effects 0.000 description 1
- 230000010085 airway hyperresponsiveness Effects 0.000 description 1
- 208000037883 airway inflammation Diseases 0.000 description 1
- 150000001299 aldehydes Chemical class 0.000 description 1
- 230000009435 amidation Effects 0.000 description 1
- 238000007112 amidation reaction Methods 0.000 description 1
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000033115 angiogenesis Effects 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000005775 apoptotic pathway Effects 0.000 description 1
- 125000000637 arginyl group Chemical group N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)* 0.000 description 1
- 210000001106 artificial yeast chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 210000003567 ascitic fluid Anatomy 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 239000012131 assay buffer Substances 0.000 description 1
- 208000027697 autoimmune lymphoproliferative syndrome due to CTLA4 haploinsuffiency Diseases 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 208000022362 bacterial infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 1
- SRSXLGNVWSONIS-UHFFFAOYSA-N benzenesulfonic acid Chemical compound OS(=O)(=O)C1=CC=CC=C1 SRSXLGNVWSONIS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002146 bilateral effect Effects 0.000 description 1
- 239000013060 biological fluid Substances 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 150000001718 carbodiimides Chemical class 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000000423 cell based assay Methods 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 125000003636 chemical group Chemical group 0.000 description 1
- AWGTVRDHKJQFAX-UHFFFAOYSA-M chloro(phenyl)mercury Chemical compound Cl[Hg]C1=CC=CC=C1 AWGTVRDHKJQFAX-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 208000023819 chronic asthma Diseases 0.000 description 1
- 235000019504 cigarettes Nutrition 0.000 description 1
- 238000012761 co-transfection Methods 0.000 description 1
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 1
- 230000008951 colonic inflammation Effects 0.000 description 1
- 230000004600 colonic motility Effects 0.000 description 1
- 230000009137 competitive binding Effects 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 239000007859 condensation product Substances 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 229920003045 dextran sodium sulfate Polymers 0.000 description 1
- FFYPMLJYZAEMQB-UHFFFAOYSA-N diethyl pyrocarbonate Chemical compound CCOC(=O)OC(=O)OCC FFYPMLJYZAEMQB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 150000002019 disulfides Chemical class 0.000 description 1
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 1
- 239000000428 dust Substances 0.000 description 1
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 1
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002327 eosinophilic effect Effects 0.000 description 1
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 1
- 231100000321 erythema Toxicity 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 208000012997 experimental autoimmune encephalomyelitis Diseases 0.000 description 1
- 239000004744 fabric Substances 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 238000011832 ferret model Methods 0.000 description 1
- 102000034287 fluorescent proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091006047 fluorescent proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 229940015043 glyoxal Drugs 0.000 description 1
- ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N guanidine group Chemical group NC(=N)N ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011554 guinea pig model Methods 0.000 description 1
- 230000012447 hatching Effects 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-ZSJDYOACSA-N heavy water Substances [2H]O[2H] XLYOFNOQVPJJNP-ZSJDYOACSA-N 0.000 description 1
- 125000000623 heterocyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 210000003630 histaminocyte Anatomy 0.000 description 1
- 125000000487 histidyl group Chemical group [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C([H])=N1 0.000 description 1
- 102000050209 human BRAP Human genes 0.000 description 1
- 102000050077 human MCC Human genes 0.000 description 1
- 102000044958 human TLX1 Human genes 0.000 description 1
- 125000002883 imidazolyl group Chemical group 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 125000001041 indolyl group Chemical group 0.000 description 1
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 description 1
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 description 1
- 210000004964 innate lymphoid cell Anatomy 0.000 description 1
- 208000020082 intraepithelial neoplasia Diseases 0.000 description 1
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 1
- PGLTVOMIXTUURA-UHFFFAOYSA-N iodoacetamide Chemical compound NC(=O)CI PGLTVOMIXTUURA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000001503 joint Anatomy 0.000 description 1
- 210000002510 keratinocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 description 1
- 210000002429 large intestine Anatomy 0.000 description 1
- 208000010729 leg swelling Diseases 0.000 description 1
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- FPYJFEHAWHCUMM-UHFFFAOYSA-N maleic anhydride Chemical compound O=C1OC(=O)C=C1 FPYJFEHAWHCUMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 238000001693 membrane extraction with a sorbent interface Methods 0.000 description 1
- 150000002730 mercury Chemical class 0.000 description 1
- 150000002731 mercury compounds Chemical class 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- SJFKGZZCMREBQH-UHFFFAOYSA-N methyl ethanimidate Chemical compound COC(C)=N SJFKGZZCMREBQH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091028838 miR-2 stem-loop Proteins 0.000 description 1
- 230000007659 motor function Effects 0.000 description 1
- 210000004400 mucous membrane Anatomy 0.000 description 1
- 201000006417 multiple sclerosis Diseases 0.000 description 1
- 238000007837 multiplex assay Methods 0.000 description 1
- 238000002663 nebulization Methods 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 230000010807 negative regulation of binding Effects 0.000 description 1
- 210000000440 neutrophil Anatomy 0.000 description 1
- 238000006396 nitration reaction Methods 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 230000008092 positive effect Effects 0.000 description 1
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 1
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 1
- 239000012562 protein A resin Substances 0.000 description 1
- 230000006337 proteolytic cleavage Effects 0.000 description 1
- 208000002815 pulmonary hypertension Diseases 0.000 description 1
- 239000002096 quantum dot Substances 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 238000001525 receptor binding assay Methods 0.000 description 1
- 238000005932 reductive alkylation reaction Methods 0.000 description 1
- 210000003289 regulatory T cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000007634 remodeling Methods 0.000 description 1
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 1
- 102220075283 rs200435907 Human genes 0.000 description 1
- 102200114051 rs372699811 Human genes 0.000 description 1
- 102200094314 rs74315399 Human genes 0.000 description 1
- 235000002020 sage Nutrition 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 1
- 210000003802 sputum Anatomy 0.000 description 1
- 208000024794 sputum Diseases 0.000 description 1
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 229940014800 succinic anhydride Drugs 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 230000008719 thickening Effects 0.000 description 1
- 230000030968 tissue homeostasis Effects 0.000 description 1
- 229910052719 titanium Inorganic materials 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 1
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 1
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 125000000430 tryptophan group Chemical group [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C2=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C12 0.000 description 1
- 125000001493 tyrosinyl group Chemical group [H]OC1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 230000036269 ulceration Effects 0.000 description 1
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 1
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
- 230000004584 weight gain Effects 0.000 description 1
- 235000019786 weight gain Nutrition 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
- C07K16/241—Tumor Necrosis Factors
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
- A61P11/06—Antiasthmatics
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2875—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the NGF/TNF superfamily, e.g. CD70, CD95L, CD153, CD154
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
- C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
- C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
- C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
- C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Pulmonology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Transplantation (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Винахід стосується рекомбінантного антитіла, яке специфічно зв’язується з TL1A, виділеного полінуклеотиду, трансформованої клітини, способу детекції TL1A in vitro, а також фармацевтичної композиції, яка містить таке рекомбінантне антитіло.
Description
Винахід стосується рекомбінантного антитіла, яке специфічно зв'язується з ТІ1А, виділеного полінуклеотиду, трансформованої клітини, способу детекції ТІТА / мйт, а також фармацевтичної композиції, яка містить таке рекомбінантне антитіло.
ПЕРЕХРЕСНЕ ПОСИЛАННЯ НА СПОРІДНЕННІ ЗАЯВКИ
Ця заявка заявляє пріоритет за попередньою заявкою США Мо 62/220442, поданої 18 вересня 2015 року, зміст якої включено в цей документ за допомогою посилання в повному обсязі та для будь-яких цілей.
ПЕРЕЛІК ПОСЛІДОВНОСТЕЙ
Ця заявка включає перелік послідовностей, який надається електронним способом у вигляді текстового файлу ТІ/ТА 5725, створеного 18 вересня 2015 року, розміром 89000 байт. Перелік послідовностей включений в цей документ за допомогою посилання.
ГАЛУЗЬ ТЕХНІКИ
Це розкриття відноситься в цілому до області конструювання антитіл. Більш конкретно, це розкриття відноситься до варіантів антитіл, які специфічно зв'язуються з ТІЛА і які інгібують взаємодію між ТІ1А та рецептором смерті З (ОКЗ). У деяких аспектах антитіла також інгібують взаємодію між ТІ1А і рецептором-приманкою З (ОсСКЗ). Антитіла мають поліпшену активність у порівнянні з вихідним антитілом, з якого були отримані варіанти.
РІВЕНЬ ТЕХНІКИ
Різні публікації, включаючи патенти, опубліковані заявки, номери доступу, технічні статті та наукові статті наводяться в описі. Кожна з цих цитованих публікацій включена в якості посилання в повному обсязі і для будь-яких цілей в цьому документі.
ФНП-подібний ліганд ТА (ТІ ТА, син. 15 член суперсімейства ФНП (ТМЕЗЕ15); ТІ1 ії МЕСІ) є членом надсімейства фактора некрозу пухлин, який експресується антиген-презентуючими клітинами (включаючи дендритні клітини, В-клітини та макрофаги), СО4-- ії СОв Т-клітинами і ендотеліальними клітинами. ТІ1А може бути експресований на поверхні клітини або секретований як розчинний цитокин. Рецептор для ТІтТА, рецептор смерті З (ОКЗ) експресується різними клітинами, включаючи СО4-- ії СО8-- Т-клітини, МК-клітини, МКТ-клітини і
ЕОХРЗ-- регуляторні Т-клітини (Тгед) і вроджені лімфоїдні клітини 2 типу та З типу (ІП С2 і С3).
ТІЛА також може зв'язувати рецептор-приманку (ОсСК3), який є конкурентним інгібітором рез. ОсКкЗ також діє як рецептор-приманка для РЕаз-ліганда (Раз5-І) і лімфотоксин-подібного індуцибельного білка, який конкурує з глікопротеїном О за зв'язування медіатора проникнення вірусу герпесу на Т-клітинах (ГІСНТ- лімфотоксин-подібний індуцибельний білок). Відповідно,
Зо рез є важливим регулятором декількох шляхів сигналінгу.
Шлях сигналінгу ТГІЛА/ОКЗ був залучений у кілька біологічних систем, які пов'язані із захворюваннями людини. Наприклад, було показано, що ТІ 1А грає роль в імунітеті, ангіогенезі та гомеостазі бар'єрних тканин. Було показано, що інгібування взаємодії ТІЛА з ОКЗ сприяє терапевтичному ефекту в декількох імуноопосередкованих патологічних станах, таких як експериментальний аутоїмунний енцефаломієліт (ЕАЕ, модель розсіяного склерозу), коліт, виразковий коліт, хвороба Крона, запальне захворювання кишечника, захворювання шкіри, астма і артрит.
Відповідно, сполуки, які інгібують активність ТІ1А, придатні, наприклад, для їх терапевтичного, профілактичного, діагностичного та прогностичного застосування.
СТИСЛИЙ ОПИС СУТІ ВИНАХОДУ
У цьому описі запропоновано рекомбінантне антитіло, яке містить СОКІ1 варіабельної ділянки важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність 5ЕО ОО МО: 15, СОК2 варіабельної ділянки важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність 5ХЕО ІЮ МО: 28,
СОКЗ варіабельної ділянки важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність ФЕО ІЮ
МО: 17, СОКІ1 варіабельної ділянки легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність
ЗБО ІЮ МО: 29, СОМК2 варіабельної ділянки легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 19, ії СОКЗ варіабельної ділянки легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність зЗЕО ІЮ МО: 30, за умови, що якщо варіабельна ділянка важкого ланцюга містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО: 1, варіабельна ділянка легкого ланцюга не містить амінокислотну послідовність зХЕО ІЮО МО: 2.
У деяких аспектах антитіло містить СОК2 варіабельної ділянки важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність зЕО ІЮ МО: 16, і СОКЗ варіабельної ділянки легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність зЕО ІЮО МО: 22. У деяких аспектах антитіло містить СОК2 варіабельної ділянки важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 21, і
СОКЗ варіабельної ділянки легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ
МО: 20. У деяких аспектах антитіло містить СОМК2 варіабельної ділянки важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність 5ЕО І МО: 16, СОМК1 варіабельної ділянки легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність 5ХЕО ІЮО МО: 23, і СОКЗ варіабельної ділянки легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність зЕО ІЮ МО: 22. У деяких аспектах бо антитіло містить СОМК2 варіабельної ділянки важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 16, СОКІ варіабельної ділянки легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність зЕО ІЮ МО: 24, ії СОКЗ варіабельної ділянки легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність зЕО ІО МО: 22. У деяких аспектах антитіло містить СОК2 варіабельної ділянки важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність 5ХЕО ІЮ МО: 16,
СОКІ варіабельної ділянки легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ
МО: 25, і СОКЗ варіабельної ділянки легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність
ЗБО ІО МО: 22. У деяких аспектах антитіло містить СОМК2 варіабельної ділянки важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 16, СОКІ1 варіабельної ділянки легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 26, і СОКЗ варіабельної ділянки легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність 5600 ІЮ МО: 22. У деяких аспектах антитіло містить СОК2 варіабельної ділянки важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність зЕО ІЮ МО: 21, і СОКЗ варіабельної ділянки легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність зЕО ІО МО: 22. У деяких аспектах антитіло містить СОК2 варіабельної ділянки важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність 5ХЕО ІЮ МО: 21,
СОКІ варіабельної ділянки легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ
МО: 24, і СОРКЗ варіабельної ділянки легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність
ЗБО ІО МО: 22. У деяких аспектах антитіло містить СОМК2 варіабельної ділянки важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 21, СОКІ1 варіабельної ділянки легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО: 25, і СОКЗ варіабельної ділянки легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність 5Е00 ІО МО: 22. У деяких аспектах антитіло містить СОК2 варіабельної ділянки важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 21, СОКІ1 варіабельної ділянки легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 26, і СОКЗ варіабельної ділянки легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність ЕЕ ІЮ МО: 22. У деяких аспектах антитіло містить СОК2 варіабельної ділянки важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність
ЗБЕО ІЮ МО: 21, і СОКЗ варіабельної ділянки легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 27.
Також у цьому описі запропоновано рекомбінантне антитіло, яке містить варіабельну ділянку важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність 560 ІЮ МО: 1 або 5ЕО ІЮО МО: 3, Її
Зо варіабельну ділянку легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 14, за умови, що, якщо варіабельна ділянка важкого ланцюга містить амінокислотну послідовність
ЗЕО ІЮ МО: 1, варіабельна ділянка легкого ланцюга не містить амінокислотну послідовність
ЗЕО ІЮО МО: 2. У деяких аспектах антитіло містить варіабельну ділянку важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО: 1, і варіабельну ділянку легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО: 4. У деяких аспектах антитіло містить варіабельну ділянку важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність зЕО ІЮО МО: 3, і варіабельну ділянку легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність «ЕО ІЮ МО: 2. У деяких аспектах антитіло містить варіабельну ділянку важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність зЗЕО ІЮ МО: 1, і варіабельну ділянку легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮО МО: 5. У деяких аспектах антитіло містить варіабельну ділянку важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність «ЕО ІЮ МО: 1, і варіабельну ділянку легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІО МО: 6. У деяких аспектах антитіло містить варіабельну ділянку важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність зЗЕО ІЮ МО: 1, і варіабельну ділянку легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО: 7. У деяких аспектах антитіло містить варіабельну ділянку важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО: 1, і варіабельну ділянку легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність зЕО ІЮ МО: 8. У деяких аспектах антитіло містить варіабельну ділянку важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ
МО: 3, і варіабельну ділянку легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ
МО: 4. У деяких аспектах антитіло містить варіабельну ділянку важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність зЗЕО ІЮ МО: 3, і варіабельну ділянку легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 6. У деяких аспектах антитіло містить варіабельну ділянку важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність «ЕО ІЮО МО: 3, і варіабельну ділянку легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮО МО: 7. У деяких аспектах антитіло містить варіабельну ділянку важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність зЗЕО ІЮ МО: 3, і варіабельну ділянку легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність 5Е0О ІЮ МО: 8. У деяких аспектах антитіло містить варіабельну ділянку важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО: 3, і варіабельну ділянку легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 10.
У деяких аспектах антитіло містить важкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність
ЗБЕО ІЮ МО: 60. У деяких аспектах антитіло містить легкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮО МО: 61. У деяких аспектах антитіло містить важкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО: 60, і легкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 61.
Такі рекомбінантні антитіла переважно є повнорозмірними і переважно є моноклональними.
Такі рекомбінантні антитіла зв'язуються з ТІ1А з підвищеною афінністю щодо антитіла, що має варіабельну ділянку важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність зЕО ІЮО МО: 1, і варіабельну ділянку легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 2.
Такі рекомбінантні антитіла мають підвищену активність у порівнянні з антитілом, які мають варіабельну ділянку важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність зЕО ІЮО МО: 1, і варіабельну ділянку легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 2.
Підвищена активність може бути щонайменше приблизно в 10 разів вища за активність антитіла, яке має варіабельну ділянку важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність
ЗЕО ІЮ МО: 1, і варіабельну ділянку легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність
ЗЕО ІЮ МО: 2. Підвищена активність може бути щонайменше приблизно в 12 разів вища за активність антитіла, яке має варіабельну ділянку важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність зЗЕО ІЮ МО: 1, і варіабельну ділянку легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність 5ЕСО ІЮО МО: 2. Підвищена активність може бути щонайменше приблизно в 13 разів вища за активність антитіла, яке має варіабельну ділянку важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність зЗЕО ІЮ МО: 1, і варіабельну ділянку легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО: 2. Підвищена активність може бути щонайменше приблизно в 15 разів вища за активність антитіла, яке має варіабельну ділянку важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО: 1, і варіабельну ділянку легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮО МО: 2. Підвищена активність може бути щонайменше приблизно в 20 разів вища за активність антитіла, яке має варіабельну ділянку важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність «ЕО ІЮ МО: 1, і варіабельну ділянку легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 2. Підвищена активність може бути щонайменше приблизно в 25 разів вища за активність антитіла, яке має
Зо варіабельну ділянку важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО: 1, і варіабельну ділянку легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 2.
Підвищена активність може бути щонайменше приблизно в 27 разів вища за активність антитіла, яке має варіабельну ділянку важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність
ЗЕО ІЮ МО: 1, і варіабельну ділянку легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність
ЗЕО ІЮ МО: 2. Підвищена активність може бути щонайменше приблизно в 40 разів вища за активність антитіла, яке має варіабельну ділянку важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність зЗЕО ІЮ МО: 1, і варіабельну ділянку легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність зЕО ІЮ МО: 2. Кратність підвищення активності можна визначати відповідно до аналізу ТІ 1А-індукованої каспазної активності в клітинах ТЕ-1.
Такі рекомбінантні антитіла можуть містити константну ділянку важкого ланцюга Ідс1 людини, константну ділянку важкого ланцюга ІдбС2 людини або константну ділянку важкого ланцюга Ідс4 людини або будь-які їх аллотипи. Константна ділянка важкого ланцюга Ідс1 людини може містити 5ЕО ІЮ МО: 42, або 5ЕО ІЮ МО: 43 (АК ІдДС1 людини), або 5ЕО ІЮ МО: 44 (901 людини з УТЕ), або ЗЕО ІЮ МО: 64 (1901 людини з УТЕ і АК), або 5ЗЕО ІЮО МО: 63 (901 людини з /234А, 1 235А, 5237А), або 5ЕО ІЮ МО: 62 (1901 людини з І 234А, І 235А, 5237А і АК), або 5ЗЕО ІЮ МО: 65 (І9ДС1 людини з І 235А і 5237А), або ЗЕО ІЮ МО: 66 (901 людини з І 235А, 5237А і АК). Константна ділянка важкого ланцюга Іде2 людини може містити ЗЕО ІЮ МО: 67, або 5ЕО ІО МО: 70 (АК ІдсС2 людини), або 5ЕО ІЮ МО: 71 (902 людини з АЗ305, РЗ3315), або
ЗЕО ІЮ МО: 68 (9052 людини з АЗ305, РЗ315 і АК). Константна ділянка Ідо4 важкого ланцюга
Ід54 людини може містити 5ЕО ІЮ МО: 45 або 5ЕО ІО МО: 46 (19054 людини з 5228Р і АК), або
ЗЕО І МО: 47 (19054 людини з 5228Р і УТЕ), або 5ЕО ІЮ МО: 69 (9054 людини з 5228Р, ТЕ і
АК). Зрозуміло, що важкий ланцюг Ід054 можна використовувати без стабілізуючої заміни 5228Р (наприклад, Ідс4 тільки з МТЕ або Ідса4 з МУТЕ і АК або Ідса4 тільки з АК).
Рекомбінантні антитіла можуть містити константну ділянку легкого ланцюга лямбда людини або її аллотип. Константна ділянка легкого ланцюга лямбда людини може містити 5ЕО ІЮ МО: 48.
Такі рекомбінантні антитіла зв'язуються з ТІ/1А людини і можуть зв'язуватися з ТІЛА приматів, відмінних від людини, або ТІЛА ссавця, відмінного від людини, такого як миша, щур, морська свинка, кішка, собака, кролик або свиня.
Такі рекомбінантні антитіла можуть бути використані в способі лікування захворювання дихальних шляхів, способі лікування захворювання шлунково-кишкового тракту, способі лікування захворювання шкіри або способі лікування артриту, або можуть бути використані для лікування захворювання дихальних шляхів, захворювання шлунково-кишкового тракту, захворювання шкіри, або артриту, або можуть бути використані для виготовлення лікарського засобу для лікування захворювань дихальних шляхів, захворювання шлунково-кишкового тракту, захворювання шкіри або артриту. Захворювання дихальних шляхів може включати одне або більше з: астми, хронічного обструктивного захворювання легенів (ХОЗЛ), легеневого фіброзу, саркоїдозу легенів, алергічного риніту або кістозного фіброзу. Захворювання шлунково-кишкового тракту може включати одне або більше з: запального захворюванню кишечника, хвороби Крона, коліт, виразкового коліту, еозинофільного езофагіту або синдрому подразненого кишечника або захворювання, або патологічного стану шлунково-кишкового тракту, пов'язаного з кістозним фіброзом. Артрит може включати ревматоїдний артрит.
Захворювання шкіри може включати одне або більше з: атопічного дерматиту, екземи та склеродермії.
Людей, приматів, відмінних від людини, або ссавців, відмінних від людини, які потребують таких методів лікування, можна лікувати за допомогою антитіл або композиції, що містить антитіла, наприклад, шляхом введення антитіл або їх композиції суб'єкту. Введення може бути парентеральним, наприклад, підшкірним та/або внутрішньовенним.
Такі рекомбінантні антитіла можуть бути використані в способі виявлення ТІЛА на поверхні мононуклеарних клітин периферичної крові (МКПК). Способи включають приведення в контакт антитіла, яке зв'язується з ТІ1А, як описано або наведено у цьому документі в якості прикладу, з МКПК, отриманими від суб'єкта, і виявленням антитіла, зв'язаного з ТІ 1А, на поверхні МКПК.
Способи можуть додатково включати кількісне визначення рівня ТІЛА на МКПК. Способи можуть додатково включати отримання МКПК від суб'єкта.
Такі рекомбінантні антитіла можуть бути використані в способі виявлення ТА в сироватці крові. Способи включають приведення в контакт антитіла, яке зв'язується з ТІ1А, як описано або наведено у цьому документі в якості прикладу, з сироваткою крові, отриманої від суб'єкта, і виявленням антитіла, зв'язаного з ТІ/1ТА, в сироватці. Способи можуть додатково включати
Зо кількісне визначення рівня ТІЛА в сироватці крові. Способи можуть додатково включати отримання сироватки з крові, отриманої від суб'єкта. Способи можуть додатково включати отримання крові від суб'єкта.
Запропоновані полінуклеотиди, що кодують одну або більше варіабельних ділянок важкого ланцюга і варіабельних ділянок легкого ланцюга таких антитіл. Полінуклеотиди можуть
З5 додатково кодувати константну ділянку важкого ланцюга та/або константну ділянку легкого ланцюга.
У деяких аспектах полінуклеотид містить послідовність нуклеїнової кислоти, яка кодує варіабельну ділянку важкого ланцюга антитіла, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ
МО: 3, наприклад, послідовність нуклеїнової кислоти, яка містить 5ЕО ІЮ МО: 51 або 5ЕО ІЮ МО: 58. У деяких аспектах полінуклеотид містить послідовність нуклеїнової кислоти, яка кодує варіабельну ділянку легкого ланцюга антитіла, що містить амінокислотну послідовність ФЕО ІЮ
МО: 2, наприклад, послідовність нуклеїнової кислоти, яка містить 5ЕО ІО МО: 50. У деяких аспектах полінуклеотид містить послідовність нуклеїнової кислоти, яка кодує варіабельну ділянку легкого ланцюга антитіла, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 4, наприклад, послідовність нуклеїнової кислоти, яка містить ЗЕО ІЮ МО: 52 або 5ЕО ІЮО МО: 59. У деяких аспектах полінуклеотид містить послідовність нуклеїнової кислоти, яка кодує варіабельну ділянку легкого ланцюга антитіла, що містить амінокислотну послідовність ФЕО ІЮ
МО: 6, наприклад, послідовність нуклеїнової кислоти, яка містить 5ЕО ІО МО: 54. У деяких аспектах полінуклеотид містить послідовність нуклеїнової кислоти, яка кодує варіабельну ділянку легкого ланцюга антитіла, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 7, наприклад, послідовність нуклеїнової кислоти, яка містить ЗХЕО ІЮ МО: 55. У деяких аспектах полінуклеотид містить послідовність нуклеїнової кислоти, яка кодує варіабельну ділянку легкого ланцюга антитіла, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮО МО: 8, наприклад, послідовність нуклеїнової кислоти, яка містить зЕО ІЮО МО: 56. У деяких аспектах полінуклеотид містить послідовність нуклеїнової кислоти, яка кодує варіабельну ділянку легкого ланцюга антитіла, що містить амінокислотну послідовність ЗЕ ІЮ МО: 10, наприклад, послідовність нуклеїнової кислоти, яка містить ЗЕО ІЮО МО: 57.
У деяких аспектах полінуклеотид містить послідовність нуклеїнової кислоти, яка кодує варіабельну ділянку важкого ланцюга антитіла, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ 60 МО: 1, наприклад, послідовність нуклеїнової кислоти, яка містить 5ЕО ІО МО: 49. У деяких аспектах полінуклеотид містить послідовність нуклеїнової кислоти, яка кодує варіабельну ділянку легкого ланцюга антитіла, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 4, наприклад, послідовність нуклеїнової кислоти, яка містить ЗХЕО ІЮ МО: 52. У деяких аспектах полінуклеотид містить послідовність нуклеїнової кислоти, яка кодує варіабельну ділянку легкого ланцюга антитіла, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮО МО: 5, наприклад, послідовність нуклеїнової кислоти, яка містить зЕО ІОЮО МО: 53. У деяких аспектах полінуклеотид містить послідовність нуклеїнової кислоти, яка кодує варіабельну ділянку легкого ланцюга антитіла, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІО МО: 6, наприклад, послідовність нуклеїнової кислоти, яка містить ЗЕО ІО МО: 54. У деяких аспектах полінуклеотид містить послідовність нуклеїнової кислоти, яка кодує варіабельну ділянку легкого ланцюга антитіла, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІО МО: 7, наприклад, послідовність нуклеїнової кислоти, яка містить БЕО ІЮ МО: 55. У деяких аспектах полінуклеотид містить послідовність нуклеїнової кислоти, яка кодує варіабельну ділянку легкого ланцюга антитіла, що містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮО МО: 8, наприклад, послідовність нуклеїнової кислоти, яка містить БЕО ІЮ МО: 56.
Запропоновані вектори, що містять один або більше таких полінуклеотидів. Запропоновані клітини, трансформовані одним або більше такими полінуклеотидами або такими векторами.
Трансформовані клітини можуть належати ссавцям, і переважно є клітинами-хазяями експресії ссавців, такими як клітини СНО, клітини М5О або клітини НЕК293.
СТИСЛИЙ ОПИС ГРАФІЧНИХ МАТЕРІАЛІВ
На Фіг. 1 зображено положення та ідентичності кожної з одиночних амінокислотних замін, зроблених у ділянках СОКІ або СОК2, або до вибраних амінокислотних залишків, суміжних з
СОК2 варіабельної ділянки важкого ланцюга вихідного антитіла (320-179). Заключені в рамки ділянки являють собою СОК згідно з системою нумерації АБМ.
На Фіг. 2 зображено положення та ідентичності кожної з окремих амінокислотних замін, зроблених у ділянках СОМК1 або СОКЗ варіабельної ділянки легкого ланцюга вихідного антитіла (320-179). Заключені в рамки ділянки являють собою СОЕК згідно з системою нумерації АБМ.
На Фіг. 3 зображено вирівнювання важких ланцюгів варіантів антитіла проти ТІ1А.
На Фіг. 4 зображено вирівнювання легких ланцюгів варіантів анти-ТІ1А-зв'язуючого
Зо антитіла.
На Фіг. 5 зображено порівняння фази дисоціації ТІТА варіантів антитіл проти ТІЛА, виміряних за допомогою ЗРК (поверхневий плазмонний резонанс).
На Фіг. 6 зображено результати аналізу активності каспаз клітин ТЕ-1 з варіантами антитіл проти ТІЛА.
На Фіг. 7 зображено результати аналізів активності каспаз клітин ТЕ-1 з використанням різних антитіл проти ТІЛА в порівнянні з вихідним антитілом, 320-179.
На Фіг. 8 зображено, що антитіло 320-587 має найвищу активність ТІ 1А в аналізі активності каспаз ТЕ-1 в порівнянні з іншими відомими антитілами проти ТІТА в декількох різних експериментах.
На Фіг. 9 зображено різні антитіла проти ТІЛА, які інгібують зв'язування ТІ/ТА з ОКЗ в порівнянні з ізотипічним контролем, як виміряно в форматі ІФА.
На Фіг. 10 зображено, що вихідне антитіло 320-179 не пригнічує зв'язування ТІ1А з ОсКЗ, тоді як варіанти антитіл проти ТІ1А інгібують взаємодію ТІ ТА-ОсА3.
На фіг. 11 зображено, що антитіло 320-587 перехресно реагує та зв'язується з ТІ1А різних видів; зазначене антитіло зв'язується з ТІ 1А всіх випробовуваних видів.
На Фіг. 12 зображено результати введення антитіла 320-587 в ТМВ5-індукованій моделі коліту (ТМВ5 - тринітробензолсульфонова кислота) щурів, яка демонструє, що антитіло значно полегшує симптоми коліту.
На Фіг. 13 зображено, що антитіло 320-587 виявляє ТІ/ТА людини, що виділяється з людських МКПК, стимульованих імунними комплексами, в ІФА.
На Фіг. 14 зображено, що антитіло 320-587 виявляє популяцію людських МКПК, які експресують мембранні ТІ 1А на їх поверхні, в аналізі методом проточної цитометрії.
На Фіг. 15 зображено, що у щурів, які мають гостру ОМА-індуковану астму (ОМА-овальбумін), які отримували лікування антитілом 320-587, значно знижувався рівень еозинофілів у рідині бронхоальвеолярного лаважу (РБАЛ).
На фіг. 16А-160 зображено, що у морських свинок з гострою ОМА-індукованою астмою, яку лікували за допомогою антитіла 320-587, були поліпшення відносно еозинофілів у РБАЛ (Фіг. 16А), макрофагів у РБАЛ (Фіг. 168), гіперреактивності верхніх дихальних шляхів після ранньої астматичної реакції (Фіг. 16С), та вираженості ранньої астматичної реакції (Фіг. 160).
На Фіг. 17А-17Е зображено, що у щурів з хронічною ОМА-індукованою астмою, яку лікували за допомогою антитіла 320-587, були поліпшення відносно еозинофілів у РБАЛ (Фіг. 17А), макрофагів у РБАЛ (Фіг. 17В), ІЛ-13 у РБАЛ (Фіг. 17С), гіперплазії келихоподібних клітин, яка оцінюється за допомогою ШИК-реакції (Фіг. 170), та потовщенню слизової оболонки, яке оцінюється на зрізах, забарвлених НЕ (гематоксилін і еозин) (Фіг. 17Е).
На Фіг. 18 зображено дозу овальбуміну, необхідна для подвоєння обструкції дихальних шляхів.
На Фіг. 19 зображено, що у щурів з ТМВ5-індукованим колітом, який лікували за допомогою антитіла 320-587, був позитивний вплив на фіброз в області виразок.
На Фіг. 20А-20Е зображено порівняння щурів з ТМВ5-індукованим колітом з ОМВ5- індукованим колітом (ОМВ5 -динітробензолсульфонова кислота), яких лікували за допомогою антитіла 320-587, і прояви ефекту на 7 і 14 добу на (Фіг. 20А) відношення маса/довжина товстої кишки, (Фіг. 208) фіброз товстої кишки, (Фіг. 202) інфільтрат товстої кишки і (Фіг. 200) пошкодження товстої кишки. На Фіг. 20Е показані репрезентативні зрізи області виразок на 7 і 14 добу.
На Фіг. 21А-21С зображено, що у щурів з Ю55б-індукованим колітом, який лікували за допомогою антитіла 320-587, були поліпшення відносно зміни маси під час введення О55 (Фіг. 21А), клінічних показників під час введення 055 (Фіг. 218), і відношення маса/довжина товстої кишки (Фіг. 213).
На Фіг. 22 зображено зміни рівня ТІ ТА-індукованих внутрішньоочеревинних цитокінів у відповідь на лікування 320-587.
ДЕТАЛЬНИЙ ОПИС СУТІ ВИНАХОДУ
Різні терміни, які відносяться до аспектів розкриття, використовуються в описі та формулі винаходу. Такі терміни повинні мати своє звичайне значення в цій області техніки, якщо не вказано інше. Інші конкретно визначені терміни повинні тлумачитися згідно з визначенням, представленим у цьому документі.
У деяких випадках терміни "суб'єкт" і "пацієнт" використовуються в цьому документі як взаємозамінні і включають будь-яку тварину. Кращими є ссавці, в тому числі компаньйони (наприклад, кішка, собака) і сільськогосподарські види ссавців (наприклад, свині, коні, корови), а
Зо також гризуни, включаючи мишей, кроликів і щурів, морських свинок та інших гризунів. Примати, відмінні від людини, такі як яванські макаки, більш бажані, і люди найбільш бажані.
Молекула, така як антитіло, була «виділена», якщо вона була змінена та/або видалена з її природного середовища рукою людини.
Як використовується в цьому документі, форми однини включають форми множини, якщо прямо не зазначено інше. «Специфічність» в контексті взаємодій антитіло-антиген необов'язково є абсолютним визначенням, але може являти собою відносний термін, що означає ступінь селективності антитіла до антиген-позитивної клітини в порівнянні 3 антиген-негативною клітиною.
Специфічність антитіла для антиген-позитивної клітини опосередковується варіабельними ділянками антитіла і зазвичай ділянками, які визначають компліментарність, (СОК) антитіла.
Конструкція може мати від 100 до 1000-кратної специфічності для антиген-позитивних клітин в порівнянні з антиген-негативними клітинами.
Використаний в цьому документі термін «рекомбінантний» включає експресію генів, отриманих за допомогою генної інженерії або іншим способом шляхом лабораторних маніпуляцій.
У розкритті представлені варіанти антитіл проти ТІ/1ТА, що містять рекомбінантно змінену варіабельну ділянку важкого та/або легкого ланцюга антитіла 320-179, таким чином, що варіанти антитіл специфічно зв'язуються з ТІ 1А. Ці варіанти антитіл 320-179 інгібують здатність
ТІЛА взаємодіяти з ОКЗ і, у деяких аспектах, також з Ос і, крім того, інгібують сигналінг, викликаний взаємодією ТІ1А з ОКЗ. Ці антитіла мають підвищену ефективність у порівнянні з антитілом 320-179. Ці антитіла мають підвищену афінність до ТІ1А у порівнянні з антитілом 320-179.
Підвищена активність може бути щонайменше приблизно в 10 разів вища за активність антитіла, яке має варіабельну ділянку важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність
ЗЕО ІЮ МО: 1, і варіабельну ділянку легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність
ЗЕО ІЮ МО: 2. Підвищена активність може бути щонайменше приблизно в 12 разів вища за активність антитіла, яке має варіабельну ділянку важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність зЗЕО ІЮ МО: 1, і варіабельну ділянку легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮО МО: 2. Підвищена активність може бути щонайменше приблизно в 13 бо разів вища за активність антитіла, яке має варіабельну ділянку важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність зЗЕО ІЮ МО: 1, і варіабельну ділянку легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮО МО: 2. Підвищена активність може бути щонайменше приблизно в 15 разів вища за активність антитіла, яке має варіабельну ділянку важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО: 1, і варіабельну ділянку легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО: 2. Підвищена активність може бути щонайменше приблизно в 20 разів вища за активність антитіла, яке має варіабельну ділянку важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність «ЕО ІЮ МО: 1, і варіабельну ділянку легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність 5Е0О ІЮ МО: 2. Підвищена активність може бути щонайменше приблизно в 25 разів вища за активність антитіла, яке має варіабельну ділянку важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність зЕО ІЮО МО: 1, і варіабельну ділянку легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 2.
Підвищена активність може бути щонайменше приблизно в 27 разів вища за активність антитіла, яке має варіабельну ділянку важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність
ЗЕО ІЮ МО: 1, і варіабельну ділянку легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність
ЗЕО ІЮ МО: 2. Підвищена активність може бути щонайменше приблизно в 40 разів вища за активність антитіла, яке має варіабельну ділянку важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність зЗЕО ІЮ МО: 1, і варіабельну ділянку легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність ЗЕ ІЮ МО: 2. Кратність підвищення активності можна визначити, наприклад, шляхом вимірювання вивільнення каспази в ТІ 1А-індукованому апоптозі в аналізі клітин ТЕ-1.
Варіанти антитіла 320-179 рекомбінантно експресуються і специфічно зв'язуються з ТІ1А.
Вихідне антитіло 320-179 містить варіабельну ділянку важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність зЗЕО ІЮ МО: 1, і варіабельну ділянку легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність зЗЕО ІО МО: 2. У деяких аспектах варіант антитіла 320-179 містить варіабельну ділянку важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність 560 ІЮ МО: 1, або 5ЕО ІЮ МО: 3, і варіабельну ділянку легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 14, за умови, що, якщо варіабельна ділянка важкого ланцюга містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 1, варіабельна ділянка легкого ланцюга не містить амінокислотну послідовність 5ЕС ІЮО МО: 2. Варіант антитіла 320-179 здатний пригнічувати взаємодію ТІТ1А з ОКЗ. Варіант антитіла 320-179 має підвищену активність у порівнянні з
Зо антитілом 320-179 та/або має підвищену афінність до ТІ ТА у порівнянні з антитілом 320-179.
У деяких аспектах варіабельна ділянка важкого ланцюга містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮО МО: 1, і варіабельна ділянка легкого ланцюга містить амінокислотну послідовність 560 ІЮО МО: 4. У деяких аспектах варіабельна ділянка важкого ланцюга містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 3, і варіабельна ділянка легкого ланцюга містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО: 2. У деяких аспектах варіабельна ділянка важкого ланцюга містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮО МО: 1, і варіабельна ділянка легкого ланцюга містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 5. У деяких аспектах варіабельна ділянка важкого ланцюга містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО: 1, і варіабельна ділянка легкого ланцюга містить амінокислотну послідовність зЗЕО ІЮ МО: 6. У деяких аспектах варіабельна ділянка важкого ланцюга містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮО МО: 1, і варіабельна ділянка легкого ланцюга містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 7. У деяких аспектах варіабельна ділянка важкого ланцюга містить амінокислотну послідовність зЗЕО
ІО МО: 1, і варіабельна ділянка легкого ланцюга містить амінокислотну послідовність зЗЕО ІЮ
МО: 8. У деяких найбільш переважних аспектах варіабельна ділянка важкого ланцюга містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 3, і варіабельна ділянка легкого ланцюга містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО: 4. У деяких аспектах варіабельна ділянка важкого ланцюга містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮО МО: 3, і варіабельна ділянка легкого ланцюга містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 6. У деяких аспектах варіабельна ділянка важкого ланцюга містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО: 3, і варіабельна ділянка легкого ланцюга містить амінокислотну послідовність зЗЕО ІЮ МО: 7. У деяких аспектах варіабельна ділянка важкого ланцюга містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮО МО: 3, і варіабельна ділянка легкого ланцюга містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 8. У деяких аспектах варіабельна ділянка важкого ланцюга містить амінокислотну послідовність зЗЕО
ІО МО: 3, і варіабельна ділянка легкого ланцюга містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ
МО: 10.
У найбільш переважних аспектах варіант антитіла 320-179 містить варіабельну ділянку важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність зЗЕО ІЮ МО: 3, і варіабельну ділянку легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність ЗЕ ІЮО МО: 4, і специфічно зв'язується з ТІ/1А. У деяких аспектах варіабельна ділянка важкого ланцюга 5ЕО ІЮО МО: З бо приєднана до константної ділянки важкого ланцюга Ідс1 (АК) людини (наприклад, 5ЕО ІЮ МО:
43), так, що важкий ланцюг містить ЗЕО ІЮО МО: 60. У деяких аспектах варіабельна ділянка легкого ланцюга 5ЕО ІЮ МО: 4 приєднана до константної ділянки легкого ланцюга лямбда людини (наприклад, 5ЕО ІЮ МО: 48), так, що легкий ланцюг містить БЕО ІЮ МО: 61. Варіант антитіла 320-179 здатний пригнічувати взаємодію ТІ1А з ОКЗ. Варіант антитіла має підвищену активність у порівнянні з антитілом 320-179 та/або має підвищену афінність до ТІЛА у порівнянні з антитілом 320-179.
У деяких аспектах варіанти антитіл 320-179 рекомбінантно експресуються і специфічно зв'язуються з ТІЛА і містять СОКІ! варіабельної ділянки важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність 5ХЕО ІЮ МО: 15, СОМК2 варіабельної ділянки важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО: 28, і СОКЗ варіабельної ділянки важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність ЗЕ ІЮ МО: 17. Антитіла можуть містити варіабельну ділянку легкого ланцюга СОКІ, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ
МО: 29, СОК2 варіабельної ділянки легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність
ЗБЕО ІЮ МО: 19, ії СОКЗ варіабельної ділянки легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 30. У аспектах, в яких варіабельна ділянка важкого ланцюга містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 1, варіабельна ділянка легкого ланцюга переважно не містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 2. Ці варіанти антитіл 320-179 здатні інгібувати взаємодія ТІ1ТА з ОКЗ. Ці варіанти антитіл 320-179 мають підвищену активність у порівнянні з антитілом 320-179 та/або мають підвищену афінність до ТІ 1А у порівнянні з антитілом 320-179.
У деяких аспектах антитіла специфічно зв'язуються з ТІ1А і містять СОКІ варіабельної ділянки важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність 5ЕО ОО МО: 15, СОК2 варіабельної ділянки важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність зХЕО ІЮ МО: 16,
СОКЗ варіабельної ділянки важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ
МО: 17, СОКІ1 варіабельної ділянки легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність
ЗБО ІЮ МО: 18, СОМК2 варіабельної ділянки легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 19, і СОКЗ варіабельної ділянки легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 22.
У деяких аспектах антитіла специфічно зв'язуються з ТІ1А і містять СОКІ1 варіабельної ділянки важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність 5ЕО ОО МО: 15, СОК2 варіабельної ділянки важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність 5ХЕО ІЮ МО: 16,
СОКЗ варіабельної ділянки важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність 5Е0 ІЮ
МО: 17, СОКІ1 варіабельної ділянки легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність
ЗБО ІЮ МО: 23, СОМК2 варіабельної ділянки легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 19, ії СОКЗ варіабельної ділянки легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 22.
У деяких аспектах антитіла специфічно зв'язуються з ТІ1А і містять СОКІ1 варіабельної ділянки важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність 5ЕО ОО МО: 15, СОК2 варіабельної ділянки важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність 5ХЕО ІЮ МО: 16,
СОКЗ варіабельної ділянки важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ
МО: 17, СОКІ1 варіабельної ділянки легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність
ЗЕБЕО Ір МО: 24, СОМК2 варіабельної ділянки легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 19, і СОКЗ варіабельної ділянки легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 22.
У деяких аспектах антитіла специфічно зв'язуються з ТІ1А і містять СОКІ варіабельної ділянки важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність 5ЕО ОО МО: 15, СОК2 варіабельної ділянки важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність 5ХЕО ІЮ МО: 16,
СОКЗ варіабельної ділянки важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність ЖЕО ІЮ
МО: 17, СОКІ1 варіабельної ділянки легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність
ЗБО ІЮ МО: 25, СОМК2 варіабельної ділянки легкого ланцюга, що містить амінокислотну
БО послідовність ЗЕО ІЮ МО: 19, ії СОКЗ варіабельної ділянки легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 22.
У деяких аспектах антитіла специфічно зв'язуються з ТІ1А і містять СОКІ1 варіабельної ділянки важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮО МО: 15, СОВ2 варіабельної ділянки важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність 5ХЕО ІЮ МО: 21,
СОКЗ варіабельної ділянки важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ
МО: 17, СОКІ1 варіабельної ділянки легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність
ЗБО ІЮ МО: 18, СОМК2 варіабельної ділянки легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 19, і СОКЗ варіабельної ділянки легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність зЗЕО ІЮ МО: 20.
У деяких аспектах антитіла специфічно зв'язуються з ТІТА і містять СОКІ1 варіабельної ділянки важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність 5ЕО ОО МО: 15, СОК2 варіабельної ділянки важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність 5ХЕО ІЮ МО: 16,
СОКЗ варіабельної ділянки важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ
МО: 17, СОКІ1 варіабельної ділянки легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність
ЗБО ІЮ МО: 26, СОМК2 варіабельної ділянки легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 19, ії СОКЗ варіабельної ділянки легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 22.
У деяких аспектах антитіла специфічно зв'язуються з ТІ1А і містять СОКІ1 варіабельної ділянки важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 15, СОК2 варіабельної ділянки важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність 5ХЕО ІЮ МО: 21,
СОКЗ варіабельної ділянки важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ
МО: 17, СОКІ1 варіабельної ділянки легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність
ЗБО ІЮ МО: 18, СОМК2 варіабельної ділянки легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 19, і СОКЗ варіабельної ділянки легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 22.
У деяких аспектах антитіла специфічно зв'язуються з ТІТА і містять СОКІ1 варіабельної ділянки важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність 5ЕО ОО МО: 15, СОК2 варіабельної ділянки важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність 5ХЕО ІЮ МО: 21,
СОКЗ варіабельної ділянки важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ
МО: 17, СОКІ1 варіабельної ділянки легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність
ЗБО ІЮ МО: 24, СОМК2 варіабельної ділянки легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 19, і СОКЗ варіабельної ділянки легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 22.
У деяких аспектах антитіла специфічно зв'язуються з ТІ1А і містять СОКІ варіабельної ділянки важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО 10 МО: 15, СОК2 варіабельної ділянки важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність 5ХЕО ІЮ МО: 21,
СОКЗ варіабельної ділянки важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ
МО: 17, СОКІ1 варіабельної ділянки легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність
Зо ЗБО ІЮ МО: 25, СОМК2 варіабельної ділянки легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 19, і СОКЗ варіабельної ділянки легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність зЗЕО ІЮ МО: 22.
У деяких аспектах антитіла специфічно зв'язуються з ТІ1А і містять СОКІ1 варіабельної ділянки важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність 5ЕО ОО МО: 15, СОК2 варіабельної ділянки важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮО МО: 21,
СОКЗ варіабельної ділянки важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ
МО: 17, СОКІ1 варіабельної ділянки легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність
ЗБО ІЮ МО: 26, СОМК2 варіабельної ділянки легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 19, і СОКЗ варіабельної ділянки легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 22.
У деяких аспектах антитіла специфічно зв'язуються з ТІ1А і містять СОКІ1 варіабельної ділянки важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність 5ЕО ОО МО: 15, СОК2 варіабельної ділянки важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність 5ХЕО ІЮ МО: 21,
СОКЗ варіабельної ділянки важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ
МО: 17, СОКІ1 варіабельної ділянки легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність
ЗБО ІЮ МО: 18, СОМК2 варіабельної ділянки легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 19, і СОКЗ варіабельної ділянки легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 27.
У деяких аспектах антитіла специфічно зв'язуються з ТІЛА і містять варіабельну ділянку важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність зЗЕО ІЮ МО: 1, і варіабельну ділянку легкого ланцюга, за умови, що варіабельна ділянка легкого ланцюга не містить амінокислотну послідовність БЕО ІО МО: 2. У деяких аспектах антитіла специфічно зв'язуються з ТІ 1А і містять варіабельну ділянку важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність зЕО ІЮО МО: 3, і варіабельну ділянку легкого ланцюга або легкий ланцюг. Варіабельна ділянка легкого ланцюга може додатково містити константну ділянку лямбда.
У деяких аспектах антитіла специфічно зв'язуються з ТІЛА і містять варіабельну ділянку легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 2, і варіабельну ділянку важкого ланцюга, за умови, що варіабельна ділянка важкого ланцюга не містить амінокислотну послідовність БЕО ІО МО: 1. У деяких аспектах антитіла специфічно зв'язуються з ТІ 1А і містять бо варіабельну ділянку легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність зЕО ІЮ МО: 4, Її варіабельну ділянку важкого ланцюга. У деяких аспектах антитіла специфічно зв'язуються з
ТІЛА ії містять варіабельну ділянку легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність
ЗЕО ІО МО: 5, і варіабельну ділянку важкого ланцюга. У деяких аспектах антитіла специфічно зв'язуються з ТІ1А їі містять варіабельну ділянку легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮО МО: 6, і варіабельну ділянку важкого ланцюга. У деяких аспектах антитіла специфічно зв'язуються з ТІ1ТА і містять варіабельну ділянку легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 7, і варіабельну ділянку важкого ланцюга. У деяких аспектах антитіла специфічно зв'язуються з ТІ 1А і містять варіабельну ділянку легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність ХЕО ІО МО: 8, і варіабельну ділянку важкого ланцюга. У деяких аспектах антитіла специфічно зв'язуються з ТІЛА і містять варіабельну ділянку легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮО МО: 9, і варіабельну ділянку важкого ланцюга. У деяких аспектах антитіла специфічно зв'язуються з ТІ1А і містять варіабельну ділянку легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність ФЕО ІЮ МО: 10, і варіабельну ділянку важкого ланцюга. У деяких аспектах антитіла специфічно зв'язуються з ТІЛА і містять варіабельну ділянку легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 11, і варіабельну ділянку важкого ланцюга. У деяких аспектах антитіла специфічно зв'язуються з
ТІЛА ії містять варіабельну ділянку легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність
ЗЕО ІЮ МО: 12, і варіабельну ділянку важкого ланцюга. У деяких аспектах антитіла специфічно зв'язуються з ТІ1А їі містять варіабельну ділянку легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО: 13, і варіабельну ділянку важкого ланцюга. У деяких аспектах антитіла специфічно зв'язуються з ТІ1А і містять варіабельну ділянку легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 14, і варіабельну ділянку важкого ланцюга, за умови, що якщо варіабельна ділянка легкого ланцюга містить амінокислотну послідовність ЗЕО
ІО МО: 2, варіабельна ділянка важкого ланцюга не містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ
МО: 1. Варіабельна ділянка важкого ланцюга може додатково містити константну ділянку важкого ланцюга, включаючи будь-яку амінокислотну послідовність константної ділянки важкого ланцюга Ідсес1, Ідс2 або Ідо4, описану або проілюстровану в цьому документі.
Варіанти антитіл 320-179 специфічно зв'язуються з ТІ1А. Антитіла зв'язуються з ТІЛА людини і можуть зв'язуватися з однією або більше з: ТІ 1А яванського макака, ТІ/1А миші, ТІ ТА щура, ТІ/1А морської свинки, ТІЛА кішки, ТІ1А собаки, ТІ1А свині або ТІ1А кролика. У деяких аспектах антитіла можуть зв'язуватися з ТІ1А кількох різних видів, наприклад, якщо епітоп є загальним. У деяких аспектах ТІ1А людини містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮО МО: 31, 5ЕО ІО МО: 32, або 5ЕБЕО ІЮО МО: 33. У деяких аспектах ТІ/1А яванського макака містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІО МО: 34. У деяких аспектах ТІТА миші містить амінокислотну послідовність 5ЕБЕО ІО МО: 35. У деяких аспектах ТІЛА щура містить амінокислотну послідовність БЕО ІЮ МО: 36. У деяких аспектах ТІ1А морської свинки містить амінокислотну послідовність 5ЕО 10 МО: 37. У деяких аспектах ТІЛА кішки містить амінокислотну послідовність 5ЕБЕО ІО МО: 38. У деяких аспектах ТІЛА свині містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІО МО: 39. У деяких аспектах ТІЛА кролика містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮО МО: 40. У деяких аспектах ТІТА собаки містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 41.
Варіанти антитіл 320-179 мають афінність зв'язування для епітопа на ТІ1А, яка включає рівноважну константу дисоціації (Ко), яка може бути виміряна за допомогою ексклюзійного кінетичного аналізу, такого як аналіз КІМЕХА? (Заріаупе Іпзігитепів Іпс., Бойсе, Айдахо). Ко для зв'язування ТІ1А, яка визначена за допомогою ексклюзійного кінетичного аналізу, переважно становить менше, ніж близько 1000 пМ. У деяких аспектах Ко для зв'язування ТІЛА, яка визначена за допомогою аналізу кінетичного виключення, становить менше, ніж близько 500
ПМ, або менше, ніж близько 400 пМ, або менше, ніж близько 300 пМ, або менше, ніж близько 200 пМ. У деяких переважних аспектах Ко для зв'язування ТІ 1А, яка визначена за допомогою екслюзійного кінетичного аналізу, становить менше, ніж близько 100 пМ.
Ко для зв'язування ТІ1ТА, яка визначена за допомогою екслюзійного кінетичного аналізу, може становити від близько 10 пМ до близько 100 пМ. Ко для зв'язування ТІ 14А, яка визначена за допомогою екслюзійного кінетичного аналізу, може становити від близько 25 пМ до близько 75 пМ. Ко для зв'язування ТІ 1А, яка визначена за допомогою екслюзійного кінетичного аналізу, може становити від близько 30 пМ до близько 60 пМ. Ко для зв'язування ТІ 14А, яка визначена за допомогою екслюзійного кінетичного аналізу, може становити від близько 30 пМ до близько 50
ПМ. Ко для зв'язування ТІ1ТА, яка визначена за допомогою екслюзійного кінетичного аналізу, може становити від близько 35 пМ до близько 50 пМ. Ко для зв'язування ТІ 14А, яка визначена за допомогою екслюзійного кінетичного аналізу, може становити від близько 36 пМ до близько 46 60 ПМ. Ко для зв'язування ТІ1ТА, яка визначена за допомогою екслюзійного кінетичного аналізу,
може становити від близько 38 пМ до близько 44 пМ. Ко для зв'язування ТІ 14А, яка визначена за допомогою екслюзійного кінетичного аналізу, може становити від близько 39 пМ до близько 43
ПМ. Ко для зв'язування ТІ1ТА, яка визначена за допомогою екслюзійного кінетичного аналізу, може становити від близько 40 пМ до близько 45 пМ. Ко для зв'язування ТІ 14А, яка визначена за допомогою екслюзійного кінетичного аналізу, може становити від близько 35 пМ до близько 42
ПМ. Ко для зв'язування ТІ1А, яка визначена за допомогою екслюзійного кінетичного аналізу, може становити близько 40 пМ. Ко для зв'язування ТІТА, яка визначена за допомогою екслюзійного кінетичного аналізу, може становити близько 41 пМ. Ко для зв'язування ТІ1А, яка визначена за допомогою екслюзійного кінетичного аналізу, може становити близько 42 пМ.
Екслюзійний кінетичний аналіз може використовувати молекулу антитіла або молекулу ТІЛА в якості константного партнера по зв'язуванню, а іншу молекулу в якості титранту.
Варіанти антитіл проти ТІЛА 320-179 переважно здатні зв'язуватися з ТІ ТА-позитивними клітинами. Антитіло може зв'язуватися з ТІ 1ТА-позитивною клітиною із значенням ЕКзо менше, ніж близько 100 нМ. Антитіло може зв'язуватися з ТІ ТА-позитивною клітиною із значенням ЕК:о менше, ніж близько 75 нМ. Антитіло може зв'язуватися з ТІТА-позитивною клітиною із значенням ЕКхо менше, ніж близько 50 нМ. Антитіло може зв'язуватися з ТІ1ТА-позитивною клітиною із значенням ЕКоо менше, ніж близько 30 нМ. Антитіло може зв'язуватися з ТІ1А- позитивною клітиною із значенням ЕКзо менше, ніж близько 25 нМ. Антитіло може зв'язуватися з
ТІТА-позитивною клітиною із значенням ЕК5о менше, ніж близько 20 нМ. Антитіло може зв'язуватися з ТІ ТА-позитивною клітиною із значенням ЕКзо менше, ніж близько 18 нМ. Антитіло може зв'язуватися з ТІ 1А-позитивною клітиною із значенням ЕКхо менше, ніж близько 15 нМ.
Антитіло може зв'язуватися з ТІ ТА-позитивною клітиною із значенням ЕКхо менше, ніж близько 13 нМ. Антитіло може зв'язуватися з ТІ 1ТА-позитивною клітиною із значенням ЕКзо менше, ніж близько 10 нМ.
Варіанти антитіла 320-179 переважно є моноклональними і більш переважно являють собою повнорозмірні антитіла, що містять два важких ланцюги і два легких ланцюги. У деяких аспектах антитіла містять похідні або фрагменти, або частини антитіл, які зберігають антигензв'язуючу специфічність, а також переважно зберігають у більшій мірі або всю афінність молекули вихідного антитіла 320-179 (наприклад, для ТІ1А). Наприклад, похідні можуть містити
Зо щонайменше одну варіабельну ділянку (варіабельна ділянка важкого ланцюга або легкого ланцюга). Інші приклади придатних похідних і фрагментів антитіл включають, без обмеження, антитіла з поліепітопною специфічністю, біспецифічні антитіла, мультиспецифічні антитіла, діатіла, одноланцюгові молекули, а також молекули ЕАбБ, Е (АБ')», Ра, Рабс і Ем, одноланцюгові (5с) антитіла, одноланцюгові Ем-антитіла (5сЕм), окремі легкі ланцюги антитіл, окремі важкі ланцюги антитіл, злиття між ланцюгами антитіл і іншими молекулами, мономери або димери важкого ланцюга, мономери або димери легкого ланцюга, димери, що складаються з одного важкого та одного легкого ланцюгів, і інших мультимерів. Одноланцюгові Ем-антитіла можуть бути мультивалентними. Всі ізотипи антитіл можуть бути використані для отримання похідних, фрагментів і частин антитіл. Похідні, фрагменти та/або частини антитіла можуть бути рекомбінантно продуковані та експресовані будь-яким типом клітин, прокаріотами або еукаріотами.
У повнорозмірному антитілі кожний важкий ланцюг складається з варіабельної ділянки важкого ланцюга (скорочено позначається в цьому документі як НСМА або МН) і константної ділянки важкого ланцюга. Константна ділянка важкого ланцюга складається з трьох доменів:
СНІ, СН2 ї СНІЗ. Кожний легкий ланцюг складається з варіабельної ділянки легкого ланцюга (скорочено позначеної як ЇСМК або МІ) і константної ділянки легкого ланцюга. Константна ділянка легкого ланцюга складається з одного домену, СІ. Ділянки МН і МІ. можна далі поділити на ділянки гіперваріабельності, які називаються ділянками, що визначають компліментарність (СОК), які чергуються з більш консервативними ділянками, що називаються каркасними ділянками (ЕК). Кожна МН і МІ. складається з трьох СОК і чотирьох ЕК, розташованих від М- кінця до С-кінця в такому порядку: ЕК!, СОКІ, ЕК2, СОК2, ЕКЗ, СОКЗ, ЕК4. Як правило, антигензв'язуючі властивості антитіла з меншою ймовірністю можуть порушуватися змінами в послідовності ЕК, а не змінами послідовностей СОК. Молекули імуноглобуліну можуть бути будь-якого типу (наприклад, Ідс, ІДЕ, ІМ, дО, ІдА їі Іду), класу (наприклад, Ідс1, Ідс2, Іде,
Ід4, ІДА1 і ІдАг) або підкласу.
Варіанти антитіл 320-179 є повністю людськими. Повністю людські антитіла є ті, в яких вся молекула є людською або має людське походження, або містить амінокислотну послідовність, ідентичну людській формі антитіла. Повністю людські антитіла включають антитіла, отримані з бібліотеки М-генів людини, наприклад, де рекомбінантно експресуються людські гени, що бо кодують варіабельні ділянки антитіл. Повністю людські антитіла можуть експресуватися в інших організмах (наприклад, мишах і технології ХепоМоизе) або клітинах інших організмів, трансформованих генами, що кодують людські антитіла. Повністю людські антитіла можуть, тим не менш, містити амінокислотні залишки, які не кодуються людськими послідовностями, наприклад, мутації, введені за допомогою випадкових або сайт-спрямованих мутацій.
У деяких аспектах варіанти антитіл 320-179 можуть містити білкові каркаси, що походять не з імуноглобуліну. Наприклад, можна зробити посилання на (Ки 5 5спці7, 1995, Ргос. Маї!. Асад.
Зсі. ОБА 92: 6552-6556), який описує білок у вигляді чотирьохспірального пучка цитохрому 65562, що має дві петлі, які розташовані у випадковому порядку для створення СОК, які були вибрані для зв'язування антигена.
Варіанти антитіл 320-179 можуть містити посттрансляційні модифікації або фрагменти, які можуть впливати на активність або стабільність антитіл. Ці модифікації або фрагменти включають, без обмеження, метильовані, ацетильовані, глікозильовані, сульфатовані, фосфорильовані, карбоксильовані та амідовані фрагменти та інші фрагменти, які добре відомі в цій області техніки. Фрагменти включають будь-яку хімічну групу або комбінації груп, які зазвичай зустрічаються в молекулах імуноглобуліну в природі або іншим способом доданих до антитіл за допомогою рекомбінантних систем експресії включаючи прокариотичні та еукаріотичні системи експресії.
Приклади модифікацій бічного ланцюга, що розглядаються в описі, включають модифікації аміногруп, таких як відновлювальне алкілування реакцією з альдегідом з подальшим відновленням за допомогою Мавнх-; амідування метилацетимідатом; ацилювання ангідридом оцтової кислоти; карбамоїлювання аміногруп ціанатом; тринітробензилювання аміногруп 2, 4, 6- тринітробензолсульфокислотою (ТМВ5); ацилювання аміногруп з янтарним ангідридом і тетрагідрофталевим ангідридом; та піридоксилування лізину піридоксаль-о-фосфатом, з подальшим відновленням за допомогою МавВна.
Гуанідинова група залишків аргініну може бути модифікована шляхом утворення продуктів гетероцикличної конденсації з реагентами, такими як 2,3-бутандіон, фенілгліоксаль і гліоксаль.
Карбоксильна група може бути модифікована шляхом активації карбодиїмідів за допомогою утворення О-ацилізосечовини з утворенням похідного, наприклад, відповідного аміду.
Сульфідрильні групи можуть бути модифіковані методами, такими як карбоксиметилювання з йодоцтовою кислотою або йодоацетамідом; окислення первинної кислоти до цистиїнової кислоти; утворення змішаних дисульфідів з іншими тіоловмісними сполуками; реакція з малеїмідом, малеїновим ангідридом або іншим заміщеним малеїімідом; утворення ртутних похідних з використанням 4-хлорртутьбензоата, 4-хлорртутьфенілсульфонової кислоти, хлориду фенилртуті, 2-хлорртуть-4-нітрофенолу та інших сполук ртуті; карбамоїлювання з ціанатом при лужному рН. Триптофанові залишки можуть бути модифіковані, наприклад, шляхом окислення М-бромсукцинімідом або алкилювання індольного кільця з 2-гідрокси-5- нітробензилбромідом або сульфенілгалогенідами. З іншого боку, залишки тирозину можуть бути змінені шляхом нітрування тетранітрометаном з утворенням похідного З-нітротирозину.
Модифікацію імідазольного кільця гістидинового залишку можна здійснити шляхом алкілування похідними йодоцтової кислоти або М-карбетоксилювання з діетилпірокарбонатом.
Варіанти антитіл 320-179 можуть включати модифікації, які модулюють час напіввиведення і біорозподіл в сироватці крові, включаючи, але не обмежуючись, модифікації, які модулюють взаємодію антитіла з неонатальним Ес-рецептором (ЕсКп), рецептором, який грає ключову роль в захисті дО від катаболізму і підтримці високої концентрації антитіл в сироватці. Модифікації, які модулюють час напівжиття в сироватці крові, можуть відбуватися в Ес-ділянці Ідс1, 92 або
ІЧ954, включаючи потрійну заміну М252у/52541/1256Е (заміни «УТЕ» з нумерацією згідно з системою нумерації ЄС (Едеїтап, .М., еї а. (1969) Ргос. Ма!й!. Асад. О5А 63, 78-85)), як описано в патенті США Мо 7083784. Інші заміни можуть відбуватися в положеннях 250 і 428, див., наприклад, патент США. Мо 7217797, а також у положеннях 307, 380 і 434, див., наприклад, публікацію РСТ Мо УМО 00/042072. Приклади амінокислотних замін константної ділянки, які модулюють зв'язування з Ес-рецепторами і подальшою функцією, опосередкованою цими рецепторами, включаючи зв'язування ЕБсоКп і час навпівжиття в сироватці крові, описані в публікації США МоМо 2009/0142340, 2009/0068175, і 2009/0092599. Антитіла будь-якого класу можуть мати С-кінцевий лізин важкого ланцюга, опущений або видалений для зменшення гетерогенності (АК). Заміна 5228Р (нумерація ЄС) в Їд04 людини може стабілізувати обмін Рар- фрагментами антитіла іп мімо (І абгіп еї аї. (2009) Маїште Віотесппоіоду 27: 8; 767-773), і ця заміна може бути присутньою одночасно з модифікаціями УТЕ та/або АК.
Варіанти антитіл 320-179 містять константні домени людини. Константні домени важкого ланцюга переважно являють собою константні домени Ідс1, Ідс2 або Ідс4 людини. Константні домени легкого ланцюга переважно являють собою константні домени лямбда людини.
Придатний домен лямбда людини містить ЗЕО ІЮ МО: 48.
Константні ділянки важкого ланцюга 901 людини, які можуть використовуватися з варіантами антитіл 320-179, можуть бути вибрані з (91 людини (ЗЕО ІЮ МО: 42), ЇД01 людини (АК) (ЗЕБЕО І МО: 43), Ідб1 людини 252Уу/2541/256Е (5БО ОО МО: 44), 951 людини 252У/2541/256Е (АК) (ЗЕО ІЮ МО: 64), ІД01 людини І 234А/ 235А/5237А (ЗЕО ІЮ МО: 63), ІдО1 людини І 234А/Л 235А5237А (АК) (ЗЕО ІО МО: 62), ІДС1 людини І 235А/5237А (ЗЕО ІЮ МО: 65), і 901 людини І 235А/5237А (АК) (5ЗЕО ІЮ МО: 66). Константні ділянки важкого ланцюга Ідсг2г людини, які можуть бути використані з варіантами антитіл 320-179, можуть бути вибрані з ЇІдс2 людини з або без АК (ЗЕО ІО МО: 67 і ЗЕО ІО МО: 70) і І(39052 людини АЗ305/РЗ3315 з або без (АК) (ЗЕО ІО МО: 71 ї 5БЕО ІОЮО МО: 68). Константні ділянки важкого ланцюга Ід4 людини, які можуть бути використані з варіантами антитіл 320-179, можуть бути вибрані з ІдД54 людини 5228Р (ЗЕБЕО ІЮ МО: 45), Ід054 людини 5228Р (ДК) (5ЕБЕО ІЮ МО: 46), 9054 людини 228Р/252У/2541/256Е (5ЕО ІО МО: 47) і (904 людини 228Р/252У/2541/256Е (АК) (ЗЕО ІЮ МО: 69).
Варіанти антитіл 320-179 можуть бути помічені, зв'язані або кон'юговані з будь-якими хімічними або біомолекулярними фрагментами. Мічені антитіла можуть знайти застосування в терапевтичних, діагностичних або фундаментальних дослідженнях. Такі мітки/кон'югати можуть детектуватися, наприклад, флуорохроми, електрохемілюмінесцентні зонди, квантові точки, радіоактивні мітки, ферменти, флуоресцентні білки, люмінесцентні білки і біотин.
Мітки/кон'югати можуть бути хіміотерапевтичними агентами, токсинами, ізотопами та іншими агентами, які використовуються для лікування таких патологічних станів, наприклад, знищення ракових клітин. Хіміотерапевтичні агенти можуть бути будь-якими, які придатні для цілей, для яких використовується антитіло.
Антитіла можуть бути дериватизовані відомими захисними/блокуючими групами, щоб запобігти протеолітичному розщепленню або підвищенню активності чи стабільності.
Полінуклеотидні послідовності, які кодують антитіла та їх субдомени (наприклад, ЕК і СОК), представлені в описі. Полінуклеотиди включають, але не обмежуються ними, РНК, ДНК, «ДНК, гібриди РНК ії ДНК і одно-, дво- або трьохланцюгові ланцюги РНК, ДНК або їх гібридів.
Зо Полінуклеотиди можуть містити послідовність нуклеїнової кислоти, що кодує варіабельну ділянку важкого ланцюга, та/або варіабельну ділянку легкого ланцюга варіанта антитіла 320- 179, як описано чи наведено у цьому документі в якості прикладу. Комплементарні ланцюги полінуклеотидних послідовностей також входять в обсяг розкриття.
Полінуклеотид може містити послідовність нуклеїнової кислоти, яка кодує варіабельну ділянку важкого ланцюга антитіла, що містить амінокислотну послідовність ЗЕ ІО МО: 3.
Полінуклеотид, що кодує амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮО МО: 3, може містити послідовність нуклеїнової кислоти ЗЕО ІЮ МО: 51.
Полінуклеотид може містити послідовність нуклеїнової кислоти, яка кодує варіабельну ділянку важкого ланцюга антитіла, що містить амінокислотну послідовність ЗЕ ІЮО МО: 1.
Полінуклеотид, що кодує амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮО МО: 1, може містити послідовність нуклеїнової кислоти ЗЕО ІЮ МО: 49.
Полінуклеотид може містити послідовність нуклеїнової кислоти, яка кодує варіабельну ділянку легкого ланцюга антитіла, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 2.
Полінуклеотид, що кодує амінокислотну послідовність ЗЕО ІО МО: 2, може містити послідовність нуклеїнової кислоти ЗЕО ІЮ МО: 50.
Полінуклеотид може містити послідовність нуклеїнової кислоти, яка кодує варіабельну ділянку легкого ланцюга антитіла, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 4.
Полінуклеотид, що кодує амінокислотну послідовність хЕО ІЮ МО: 4, може містити послідовність нуклеїнової кислоти ЗЕО ІЮ МО: 52.
Полінуклеотид може містити послідовність нуклеїнової кислоти, яка кодує варіабельну ділянку легкого ланцюга антитіла, що містить амінокислотну послідовність ЗЕ ІО МО: 5.
Полінуклеотид, що кодує амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮО МО: 5, може містити послідовність нуклеїнової кислоти ЗЕО ІЮ МО: 53.
Полінуклеотид може містити послідовність нуклеїнової кислоти, яка кодує варіабельну ділянку легкого ланцюга антитіла, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО І МО: 6.
Полінуклеотид, що кодує амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮО МО: 6, може містити послідовність нуклеїнової кислоти ЗЕО ІЮ МО: 54.
Полінуклеотид може містити послідовність нуклеїнової кислоти, яка кодує варіабельну ділянку легкого ланцюга антитіла, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 7.
Полінуклеотид, що кодує амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮО МО: 7, може містити послідовність нуклеїнової кислоти ЗЕО ІЮ МО: 55.
Полінуклеотид може містити послідовність нуклеїнової кислоти, яка кодує варіабельну ділянку легкого ланцюга антитіла, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 8.
Полінуклеотид, що кодує амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮО МО: 8, може містити послідовність нуклеїнової кислоти ЗЕО ІЮ МО: 56.
Полінуклеотид може містити послідовність нуклеїнової кислоти, яка кодує варіабельну ділянку легкого ланцюга антитіла, що містить амінокислотну послідовність ЗЕ ІЮ МО: 10.
Полінуклеотид, що кодує амінокислотну послідовність ЗЕО 10 МО: 10, може містити послідовність нуклеїнової кислоти 5ЕО ІЮ МО: 57.
У деяких аспектах полінуклеотид містить першу послідовність нуклеїнової кислоти, яка кодує варіабельну ділянку важкого ланцюга антитіла, і другу послідовність нуклеїнової кислоти, яка кодує варіабельну ділянку легкого ланцюга антитіла. Перша послідовність нуклеїнової кислоти може кодувати варіабельну ділянку важкого ланцюга антитіла, що містить амінокислотну послідовність зЗЕО ІЮ МО: 3, і варіабельну ділянку легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність зЕО ІЮО МО: 2. Полінуклеотид, що кодує амінокислотну послідовність БЕО ІЮ МО:
З, може містити послідовність нуклеїнової кислоти 5ЕО ІЮ МО: 51, і полінуклеотид, що кодує амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 2, може містити послідовність нуклеїнової кислоти
ЗЕО І МО: 50.
Перша послідовність нуклеїнової кислоти може кодувати варіабельну ділянку важкого ланцюга антитіла, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 3, і варіабельну ділянку легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО: 4. Полінуклеотид, що кодує амінокислотну послідовність ЗЕ ІЮ МО: З, може містити послідовність нуклеїнової кислоти ЗЕО ІЮО МО: 51, і полінуклеотид, що кодує амінокислотну послідовність зЕО ІЮО МО: 4, може містити послідовність нуклеїнової кислоти 5ЕО ІЮО МО: 52.
Перша послідовність нуклеїнової кислоти може кодувати варіабельну ділянку важкого ланцюга антитіла, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 3, і варіабельну ділянку легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО: 6. Полінуклеотид, що кодує амінокислотну послідовність ЗЕ ІЮ МО: З, може містити послідовність нуклеїнової
Ко) кислоти ЗЕО ІЮО МО: 51, і полінуклеотид, що кодує амінокислотну послідовність «ЕЕ ІЮО МО: 6, може містити послідовність нуклеїнової кислоти ЗЕО ІЮО МО: 54.
Перша послідовність нуклеїнової кислоти може кодувати варіабельну ділянку важкого ланцюга антитіла, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 3, і варіабельну ділянку легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО: 7. Полінуклеотид, що кодує амінокислотну послідовність ЗЕ ІЮ МО: З, може містити послідовність нуклеїнової кислоти ЗЕО ІЮО МО: 51, і полінуклеотид, що кодує амінокислотну послідовність зЕО ІЮО МО: 7, може містити послідовність нуклеїнової кислоти 5ЕО ІЮ МО: 55.
Перша послідовність нуклеїнової кислоти може кодувати варіабельну ділянку важкого ланцюга антитіла, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 3, і варіабельну ділянку легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮО МО: 8. Полінуклеотид, що кодує амінокислотну послідовність ЗЕ ІЮ МО: З, може містити послідовність нуклеїнової кислоти ЗЕО ІЮО МО: 51, і полінуклеотид, що кодує амінокислотну послідовність зЕО ІЮО МО: 8, може містити послідовність нуклеїнової кислоти БЕ ІЮ МО: 56.
Перша послідовність нуклеїнової кислоти може кодувати варіабельну ділянку важкого ланцюга антитіла, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 3, і варіабельну ділянку легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність 560 ІЮ МО: 10. Полінуклеотид, що кодує амінокислотну послідовність ЗЕ ІЮ МО: З, може містити послідовність нуклеїнової кислоти ЗЕО ІЮО МО: 51, і полінуклеотид, що кодує амінокислотну послідовність зЗЕО ІЮ МО: 10, може містити послідовність нуклеїнової кислоти ЗЕО ІЮ МО: 57.
Перша послідовність нуклеїнової кислоти може кодувати варіабельну ділянку важкого ланцюга антитіла, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 1, і варіабельну ділянку легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮО МО: 4. Полінуклеотид, що кодує амінокислотну послідовність ЗЕ ІЮ МО: 1, може містити послідовність нуклеїнової кислоти ЗЕО ІЮО МО: 49, і полінуклеотид, що кодує амінокислотну послідовність зЕО ІЮО МО: 4, може містити послідовність нуклеїнової кислоти ЗЕО ІЮ МО: 52.
Перша послідовність нуклеїнової кислоти може кодувати варіабельну ділянку важкого ланцюга антитіла, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 1, і варіабельну ділянку легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 5. Полінуклеотид, що кодує амінокислотну послідовність ЗЕ ІЮ МО: 1, може містити послідовність нуклеїнової кислоти ЗЕО ІЮО МО: 49, і полінуклеотид, що кодує амінокислотну послідовність «ЕЕ ІЮО МО: 5, може містити послідовність нуклеїнової кислоти ЗЕО ІЮ МО: 53.
Перша послідовність нуклеїнової кислоти може кодувати варіабельну ділянку важкого ланцюга антитіла, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 1, і варіабельну ділянку легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮО МО: 6. Полінуклеотид, що кодує амінокислотну послідовність ЗЕ ІЮ МО: 1, може містити послідовність нуклеїнової кислоти ЗЕО ІЮО МО: 49, і полінуклеотид, що кодує амінокислотну послідовність «ЕЕ ІЮО МО: 6, може містити послідовність нуклеїнової кислоти ЗЕО ІЮ МО: 54.
Перша послідовність нуклеїнової кислоти може кодувати варіабельну ділянку важкого ланцюга антитіла, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 1, і варіабельну ділянку легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 7. Полінуклеотид, що кодує амінокислотну послідовність ЗЕО ІО МО: 1, може містити послідовність нуклеїнової кислоти ЗЕО ІЮО МО: 49, і полінуклеотид, що кодує амінокислотну послідовність зЕО ІЮО МО: 7, може містити послідовність нуклеїнової кислоти ЗЕО ІЮ МО: 55.
Перша послідовність нуклеїнової кислоти може кодувати варіабельну ділянку важкого ланцюга антитіла, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 1, і варіабельну ділянку легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 8. Полінуклеотид, що кодує амінокислотну послідовність ЗЕО ІО МО: 1, може містити послідовність нуклеїнової кислоти ЗЕО ІЮО МО: 49, і полінуклеотид, що кодує амінокислотну послідовність зЕО ІЮО МО: 8, може містити послідовність нуклеїнової кислоти 5ЕО ІЮ МО: 56.
У деяких аспектах полінуклеотид містить першу послідовність нуклеїнової кислоти, яка кодує варіабельну ділянку важкого ланцюга антитіла, і другу послідовність нуклеїнової кислоти, яка кодує константну ділянку важкого ланцюга. У переважних аспектах полінуклеотид містить першу послідовність нуклеїнової кислоти, яка кодує варіабельну ділянку важкого ланцюга антитіла, що містить амінокислотну послідовність зЕО ІЮО МО: 3, і другу послідовність нуклеїнової кислоти, яка кодує константну ділянку важкого ланцюга Ідсі (АК) 5ЕО І МО: 43, наприклад, полінуклеотид, що містить послідовність нуклеїнової кислоти ЗЕО ІЮ МО: 58.
У деяких аспектах полінуклеотид містить першу послідовність нуклеїнової кислоти, яка кодує варіабельну ділянку легкого ланцюга антитіла, і другу послідовність нуклеїнової кислоти, яка
Зо кодує константну ділянку легкого ланцюга. У переважних аспектах полінуклеотид містить першу послідовність нуклеїнової кислоти, яка кодує варіабельну ділянку легкого ланцюга антитіла, що містить амінокислотну послідовність зЕО ІЮО МО: 4, і другу послідовність нуклеїнової кислоти, яка кодує константну ділянку легкого ланцюга лямбда ЗЕО ІЮ МО: 48, наприклад, полінуклеотид, що містить послідовність нуклеїнової кислоти ЗЕО ІЮ МО: 59.
Будь-який з полінуклеотидів, описаних або проілюстрованих прикладами в цьому документі, може бути поміщений у вектор. Таким чином, вектори, що містять полінуклеотиди, представлені як частина розкриття. Вектори можуть бути векторами експресії. Таким чином, запропоновані рекомбінантні вектори експресії, які містять послідовність, яка кодує поліпептид, що являє інтерес. Вектор експресії може містити одну або більше додаткових послідовностей, таких як, без обмеження, регуляторні послідовності, селективний маркер, мітку очищення або сигнал поліаденілювання. Такі регуляторні елементи можуть містити транскрипційний промотор, енхансери, мРНК-сайти зв'язування рибосоми або послідовності, які контролюють припинення транскрипції та трансляції.
Вектори експресії, особливо вектори експресії для ссавців, можуть містити один або більше нетранскрибованих елементів, таких як точка початку реплікації, придатний промотор і енхансер, зв'язаний з геном, що експресується, інші 5'- або 3'і-фланкуючі нетранскрибовані послідовності, 5'- або З "- нетрансльовані послідовності (такі як необхідні сайти зв'язування рибосом), сайт поліаденілювання, ділянку донора і акцептора сплайсингу, або послідовності термінації транскрипції. Також може бути включена точка початку реплікації, яка дає можливість реплікувати в конкретному хазяїні.
Вектори можуть бути використані для трансформації будь-якого з широкого набору клітин- хазяїв, добре відомих фахівцям в цій області техніки, і переважно клітин-хазяїв, здатних експресувати антитіла. Вектори включають, без обмеження, плазміди, фагеміди, косміди, бакміди, бактеріальні штучні хромосоми (ВАС), дріжджові штучні хромосоми (УАС) і бакуловірус, а також інші бактеріальні, еукаріотичні, дріжджові та вірусні вектори. Придатні клітини-хазяї включають без обмеження клітини СНО, клітини М50, клітини НЕК293 або будь- яку відому, або продукуються еукаріотичну клітинну лінію, а також включають бактерії, дріжджі і клітини комах.
Антитіла також можуть бути отримані клітинами гібридоми; способи отримання гібридом, 60 добре відомі і розроблені в цій області техніки.
У розкритті також представлені композиції, що містять варіанти антитіл 320-179. Композиції можуть містити будь-яке з антитіл, описане та/або проілюстроване в цьому документі прикладами, і прийнятний носій, такий як фармацевтично прийнятний носій. Придатні носії включають будь-які середовища, які не впливають на біологічну активність антитіла і переважно не токсичні для хазяїна, якому він вводиться. Композиції можуть бути складені для введення суб'єкту в будь-якій придатній лікарській формі.
Варіанти антитіл 320-179 можуть бути використані для лікування захворювань дихальних шляхів, захворювання шлунково-кишкового тракту, артриту або захворювання шкіри у суб'єкта.
Таким чином, розкриття включає методи лікування. Загалом, способи включають введення варіанта антитіла 320-179 або його композиції суб'єкту, який потребує лікування захворювання дихальних шляхів, захворювання шлунково-кишкового тракту, артриту або захворювання шкіри, так що захворювання респіраторних шляхів, захворювання шлунково-кишкового тракту, артрит або захворювання шкіри лікується. Варіант антитіла 320-179 може містити будь-яке антитіло, описане або наведене в цьому документі в якості прикладу. Введення може включати підшкірне введення антитіла. Введення може включати внутрішньовенне введення антитіла. Суб'єкт переважно являє собою людину. Суб'єкт може бути приматом, відмінним від людини, таким як яванський макак, або може бути ссавцем, таким як миша, щур, морська свинка, кішка, свиня, кролик або собака.
У тих аспектах, при яких необхідно лікувати захворювання дихальних шляхів, способи включають введення варіанта антитіла 320-179 або його композиції суб'єкту, який потребує лікування захворювання дихальних шляхів. Захворювання дихальних шляхів може включати одне або більше з: астми, хронічного обструктивного захворювання легенів (ХОЗЛ), легеневого фіброзу, саркоїдозу легенів, алергічного риніту або кістозного фіброзу. Так, наприклад, у деяких аспектах способи включають введення варіанта антитіла 320-179 або його композиції суб'єкту, який потребує лікування астми, таким чином, що астма лікується у суб'єкта. У деяких аспектах способи включають введення варіанта антитіла 320-179 або його композиції суб'єкту, який потребує лікування ХОЗЛ, таким чином, що ХОЗЛ лікується у суб'єкта. У деяких аспектах способи включають введення варіанта антитіла 320-179 або його композиції суб'єкту, який потребує лікування легеневого фіброзу, таким чином, що легеневий фіброз лікується у суб'єкта.
У деяких аспектах способи включають введення варіанта антитіла 320-179 або його композиції суб'єкту, який потребує лікування саркоїдозу легенів, таким чином, що саркоїдоз легенів лікується у суб'єкта. У деяких аспектах способи включають введення варіанта антитіла 320-179 або його композиції суб'єкту, який потребує лікування алергічного риніту, таким чином, що алергічний риніт лікується у суб'єкта. У деяких аспектах способи включають введення варіанта антитіла 320-179 або його композиції суб'єкту, який потребує лікування кістозного фіброзу, таким чином, що кістозний фіброз лікується у суб'єкта.
У тих аспектах, при яких необхідно лікувати захворювання шлунково-кишкового тракту, способи включають введення варіанта антитіла 320-179 або його композиції суб'єкту, який потребує лікування захворювання шлунково-кишкового тракту. Захворювання шлунково- кишкового тракту може включати одне або більше з наступного списку: запальне захворювання кишечника (ІВО), хвороба Крона, коліт, виразковий коліт, синдром подразненого кишечника (ІВ5), еозинофільний езофагіт, або захворювання або патологічний стан шлунково-кишкового тракту, пов'язаний з кістозним фіброзом. Так, наприклад, у деяких аспектах способи включають введення варіанта антитіла 320-179 або його композиції суб'єкту, який потребує лікування ІВО, таким чином, що ІВО лікується у суб'єкта. У деяких аспектах способи включають введення варіанта антитіла 320-179 або його композиції суб'єкту, який потребує лікування хвороби Крона, таким чином, що хвороба Крона лікується у суб'єкта. У деяких аспектах способи включають введення варіанта антитіла 320-179 або його композиції суб'єкту, який потребує лікування коліту, таким чином, що коліт лікується у суб'єкта. У деяких аспектах способи включають введення варіанта антитіла 320-179 або його композиції суб'єкту, який потребує лікування виразкового коліту, таким чином, що виразковий коліт лікується у суб'єкта. У деяких аспектах способи включають введення варіанта антитіла 320-179 або його композиції суб'єкту, який потребує лікування ІВ5, таким чином, що ІВЗ лікується у суб'єкта. У деяких аспектах способи включають введення варіанта антитіла 320-179 або його композиції суб'єкту, який потребує лікування еозинофільного езофагіту, таким чином, що еозинофільний езофагіт лікується у суб'єкта. У деяких аспектах способи включають введення варіанта антитіла 320-179 або його композиції суб'єкту, який потребує лікування захворювання або патологічного стану шлунково- кишкового тракту, пов'язаного з кістозним фіброзом, таким чином, що захворювання або патологічний стан шлунково-кишкового тракту, пов'язаний з кістозним фіброзом, лікується у 60 суб'єкта.
У тих аспектах, при яких необхідно лікувати артрит, способи включають введення варіанта антитіла 320-179 або його композиції суб'єкту, який потребує лікування артриту. Артрит може включати ревматоїдний артрит. Так, наприклад, у деяких аспектах способи включають введення варіанта антитіла 320-179 або його композиції суб'єкту, який потребує лікування ревматоїдного артриту, таким чином, що ревматоїдний артрит лікується у суб'єкта.
У тих аспектах, при яких необхідно лікувати захворювання шкіри, способи включають введення варіанта антитіла 320-179 або його композиції суб'єкту, який потребує лікування захворювання шкіри. Захворювання шкіри може включати одне або більше з атопічного дерматиту, екземи або склеродермії. Так, наприклад, у деяких аспектах способи включають введення варіанта антитіла 320-179 або його композиції суб'єкту, який потребує лікування атопічного дерматиту, таким чином, що атопічний дерматит лікується у суб'єкта. У деяких аспектах способи включають введення варіанта антитіла 320-179 або його композиції суб'єкту, який потребує лікування ІВ5, таким чином, що ІВ5 лікується у суб'єкта. У деяких аспектах способи включають введення варіанта антитіла 320-179 або його композиції суб'єкту, який потребує лікування ІВ5, таким чином, що ІВЗ лікується у суб'єкта.
Варіанти антитіл 320-179, описані або наведені в якості прикладу в цьому документі, можуть бути використані при отриманні лікарського засобу для використання при лікуванні захворювання респіраторних шляхів. Варіанти антитіл 320-179, описані або наведені в якості прикладу в цьому документі, можуть бути використані при отриманні лікарського засобу для використання при лікуванні захворювання шлунково-кишкового тракту. Варіанти антитіл 320- 179, описані або наведені в якості прикладу в цьому документі, можуть бути використані при отриманні лікарського засобу для використання при лікуванні артриту. Варіанти антитіл 320-179, описані або наведені в якості прикладу в цьому документі, можуть бути використані при отриманні лікарського засобу для використання при лікуванні захворювання шкіри. Варіанти антитіл 320-179, описані або наведені в якості прикладу в цьому документі, можуть бути використані при отриманні лікарського засобу для застосування при лікуванні будь-якого захворювання 3: астми, ХОЗЛ, легеневого фіброзу, саркоїдозу легенів, алергічного риніту, кістозного фіброзу, запального захворювання кишечника, хвороби Крона, коліту, виразкового коліту, синдрому подразненого кишечника, еозинофільного езофагіту, захворювання або
Зо патологічного стану шлунково-кишкового тракту, пов'язаного з кістозним фіброзом, артриту, ревматоїдного артриту, атопічного дерматиту, екземи або склеродермії.
Варіанти антитіл 320-179, описані або наведені в якості прикладу в цьому документі, можуть бути використані для лікування захворювання дихальних шляхів. Варіанти антитіл. 320-179, описані або наведені в якості прикладу в цьому документі, можуть бути використані для лікування захворювання шлунково-кишкового тракту. Варіанти антитіл 320-179, описані або наведені в якості прикладу в цьому документі, можуть бути використані для лікування астми.
Варіанти антитіл 320-179, описані або наведені в якості прикладу в цьому документі, можуть бути використані для лікування захворювання шкіри. Варіанти антитіл 320-179, описані або наведені в якості прикладу в цьому документі, можуть бути використані для лікування ХОЗЛ.
Варіанти антитіл 320-179, описані або наведені в якості прикладу в цьому документі, можуть бути використані для лікування легеневого фіброзу. Варіанти антитіл 320-179, описані або наведені в якості прикладу в цьому документі, можуть бути використані для лікування саркоїдозу легенів. Варіанти антитіл 320-179, описані або наведені в якості прикладу в цьому документі, можуть бути використані для лікування алергічного риніту. Варіанти антитіл 320-179, описані або наведені в якості прикладу в цьому документі, можуть бути використані для лікування кістозного фіброзу. Варіанти антитіл 320-179, описані або наведені в якості прикладу в цьому документі, можуть бути використані для лікування запального захворювання кишечника. Варіанти антитіл 320-179, описані або наведені в якості прикладу в цьому документі, можуть бути використані для лікування хвороби Крона. Варіанти антитіл 320-179, описані або наведені в якості прикладу в цьому документі, можуть бути використані для лікування коліту.
Варіанти антитіл 320-179, описані або наведені в якості прикладу в цьому документі, можуть бути використані для лікування виразкового коліту. Варіанти антитіл 320-179, описані або наведені в якості прикладу в цьому документі, можуть бути використані для лікування еозинофільного езофагіту. Варіанти антитіл 320-179, описані або наведені в якості прикладу в цьому документі, можуть бути використані для лікування захворювання або патологічного стану шлунково-кишкового тракту, пов'язаного з кістозним фіброзом. Варіанти антитіл 320-179, описані або наведені в якості прикладу в цьому документі, можуть бути використані для лікування синдрому подразненого кишечника. Варіанти антитіл 320-179, описані або наведені в якості прикладу в цьому документі, можуть бути використані для лікування ревматоїдного бо артриту. Варіанти антитіл 320-179, описані або наведені в якості прикладу в цьому документі,
можуть бути використані для лікування атопічного дерматиту. Варіанти антитіл 320-179, описані або наведені в якості прикладу в цьому документі, можуть бути використані для лікування екземи. Варіанти антитіл 320-179, описані або наведені в якості прикладу в цьому документі, можуть бути використані для лікування склеродермії.
Також запропонований спосіб іп міго для виявлення ТА в зразку тканини, виділеному від суб'єкта, що включає приведення в контакт антитіла за допомогою одного з пп. 1-19 зі зразком тканини, виділеним від суб'єкта, з утворенням комплексу антитіло-ТІ ТА, і виявлення комплексу в зразку тканини.
Варіант антитіла 320-179 можна використовувати для виявлення ТІ1А-позитивних клітин, наприклад, у зразку тканини, отриманому від суб'єкта. Антитіла можуть використовуватися для виявлення ТІТА-позитивних мононуклеарних клітин периферичної крові (МКПК), наприклад,
МКПК, отриманих від суб'єкта. Антитіла можуть використовуватися для виявлення ТІЛА в сироватці крові. Такі способи можуть бути здійснені іп мімо, ех мімо, іп міо або іп 5йи. Загалом, способи включають приведення в контакт будь-якого з варіантів антитіл 320-179, описаних або проілюстрованих в цьому документі, з тканиною або клітинами, наприклад, МКПК, виділеними від суб'єкта, з утворенням комплексу антитіло-Т/ ТА і виявлення комплексу в тканині або на клітинах. Антитіло може бути помічене міткою, що виявляється. Антитіло може бути виявлено вторинним антитілом, яке помічене міткою, що виявляється. Тканина може містити або може бути біологічною рідиною, такий як кров або сироватка крові. Тканина може містити або може бути тканинами дихального тракту, таким як тканину легкого, мокрота, рідина бронхоальвеолярного лаважу, шлунково-кишкова тканина або шлунково-кишкова промивна рідина. Тканина може містити або може бути шкірою або тканиною шкіри. Тканина може містити або може бути тканиною будь-якого суглоба в організмі. Спосіб може додатково включати виділення тканини від суб'єкта. Такі методи можуть бути кількісними, наприклад, кількісне визначення рівня ТІЛА в тканини, кількісне визначення рівня ТІ1А-позитивних клітин або кількісне визначення рівня ТІ ТА на клітинах або кількісне визначення рівня ТІ 1А в сироватці.
У розкритті також запропоновані набори, що містять будь-який з варіантів антитіл 320-179, описаних і наведених в якості прикладів у цьому документі. Набори можуть використовуватися для забезпечення антитіл і інших агентів для застосування в діагностиці, фундаментальних дослідженнях або терапевтичних методах, серед іншого. У деяких аспектах набори містять будь-яке одне чи більше з варіантів антитіл 320-179, описаних або наведених в якості прикладу в цьому документі, та інструкції для використання одного або більше антитіл у способі лікування захворювання дихальних шляхів, у способі лікування захворювання шлунково-кишкового тракту, або в способі лікування артриту.
Наступні приклади наведені для більш докладного опису розкриття. Вони призначені для ілюстрації, а не для обмеження розкриття.
Приклад 1
Матеріали та методи
Положення амінокислот в цих прикладах нумеруються згідно з системою нумерації Кабаї.
СОК визначають відповідно до методу АБМ системи визначення СОК в цьому документі. 1.1.Генерація варіантів пучків. Амінокислотні послідовності варіабельної ділянки важкого та легкого ланцюгів антитіла 320-179 (5БО ІО МО: 1 і 2 відповідно) використовували в якості матриць для розробки зазначених варіантів. 320-179 був раніше описаний в публікації США Мо 2014/0255302 (МН являє собою ЗЕО ІЮО МО: 186, а Мі являє собою 5ЕО ІО МО: 199 в цій публікації) як 320-179 (також описано як С320-179). Це антитіло мало сприятливі біофізичні властивості, було потужним інгібітором ТІТА і мало низький прогнозований профіль імуногенності.
Варіанти антитіл 320-179 були зроблені шляхом заміни однієї з групи з дев'яти типових амінокислот - А, 5, О, 0, Н, К, І, МУ, М - по одній в кожному амінокислотному положенні СОК (як визначено за допомогою номенклатури АБМ) в СОКІ1 легкого ланцюга (СОК-1І1), СОКЗ легкого ланцюга (СОК-І3), СОКІ важкого ланцюга (СОК-НІ) і СОМК2 важкого ланцюга (СОК-Нг).
Варіанти антитіл, що включають А, 5, 0, 0, Н, К, І, МУ, У, також були зроблені в положеннях 59 і 60 у варіабельній ділянці важкого ланцюга і в положенні 79 у варіабельній ділянці легкого ланцюга. Повний список всіх згенерованих однозаміщених варіантів антитіл показаний на Фіг. 1 (варіабельна ділянка важкого ланцюга) і 2 (варіабельна ділянка легкого ланцюга), відповідно. 1.2.Конструювання векторів, що експресують антитіла. Варіанти варіабельних ділянок були отримані шляхом зворотної транскрипції амінокислотних послідовностей в послідовності ДНК, які згодом були синтезовані де помо шляхом збірки синтетичних олігонуклеотидів. Варіанти Мн субклонували у вектор експресії ссавців, що містить константну ділянку людини для отримання бо повнорозмірних важких ланцюгів антитіл (Сні важкого ланцюга Ід51 людини, шарнірна ділянка,
домени Сна2 і Сн3) (наприклад, ОпіРгої Мо. РО1857). Аналогічно, варіанти Мі субклонували у вектор експресії ссавців, що містить константну ділянку легкого ланцюга лямбда людини для отримання лямбда-ланцюгів повнорозмірних антитіл (Зму/із5Ргої Мо. РОСОО5.1). У деяких випадках повнорозмірний важкий ланцюг і, окремо, легкий ланцюг, були зворотньо трансльовані в послідовності ДНК і згодом синтезовані де помо шляхом збірки синтетичних олігонуклеотидів. 1.3. Експресія варіантів антитіл. Антитіла були отримані шляхом спільної трансфекції важких і легких ланцюгів антитіл в клітини ЕХРІ2932 (І е ТесппоІодіеє5, Карлобад, Каліфорнія). За добу до трансфекції було визначено кількість клітин, необхідних для експерименту. Для кожної 20 мл трансфекції було потрібно 3,6х107 клітин у 20 мл середовища ЕХРІ2932 Ехргеззіоп Медішт. У день до трансфекції клітини висівали з щільністю 0,9х105 життєздатних клітин/мл і інкубували протягом ночі при 37 "С у зволоженій атмосфері з 8 95 СО» в повітрі на орбітальному шейкері, що обертається зі швидкістю 200 об/хв. У день трансфекції кількість клітин і їх життєздатність визначали з використанням автоматизованого лічильника клітин. Використовували культури з більш ніж 98 95 життєздатними клітинами. Для кожної 20 мл трансфекції комплекси ліпід-ДНК отримували шляхом розведення 10 мкг ДНК важкого ланцюга і 10 мкг ДНК легкого ланцюга в середовищі ОРТІ-МЕМ? | Кедисеа бегит Меаїцт (Іе Тесппоіодіеє5, Карлобад, Каліфорнія) (Мо 31985 -062) до загального об'єму 1,0 мл. 54 мкл ЕХРІРЕСТАМІМЕ? 293 Веадепі (І їє
Тесппоїодіе5, Карлобад, Каліфорнія) розбавляли в середовищі ОРТІ-МЕМФ | до загального об'єму 1,0 мл. Обидва флакони обережно перемішували і інкубували протягом 5 хвилин при кімнатній температурі. Після інкубації розбавлену ДНК змішували з розведеним
ЕХРІРГЕСТАМІМЕ? 293 Кеадепі і реакційною сумішшю ДНК-ЕХРІРЕСТАМІМЕ? 293 Реадепі і інкубували ще 20 хвилин при кімнатній температурі щоб утворити комплекси ДНК-
ЕХРІБГЕСТАМІМЕ? 293 Кеаодепі. Після інкубації в кожну 50 мл біореакторну трубку (ТРР Тесппо
Ріазіїс Ргодисі5 АС) додавали 2 мл комплексу ДНК-ЕХРІРЕЕСТАМІМЕ? 293 Кеадепі. У негативну контрольну пробірку замість комплексу ДНК-ЕХРІЕЕСТАМІМЕ? 293 Кеадепі додавали 2 мл середовища ОРТІ-МЕМУ | (Ше Тесппоїодіе5, Карлсобад, Каліфорнія). Клітини інкубували в інкубаторі при температурі 37 "С зі зволоженою атмосферою 8 95 СО» в повітрі на орбітальному шейкері, що обертається зі швидкістю 200 об/хв. Приблизно через 16-18 годин після трансфекції у кожний біореактор додавали 100 мкл ЕХРІРЕСТАМІМЕ? 293 Тгапвгтесіюп Еппапсег
Зо 1 ї 1,0 мл ЕХРІРЕСТАМІМЕ? 293 Тгапвгесіп Еппапсег 2. Антитіла збирали приблизно через 72 години після трансфекції. 1.4.Очищення варіантів антитіл. Кожен варіант антитіл експресували в клітинах ЕХРІ2939 в 20 мл клітинної культури. Культури центрифугували в 50 мл пробірках фірми РаЇсоп при 3000х9 протягом 20 хвилин і супернатант фільтрували з використанням 0,22 мкм фільтра (Согпіпо).
Супернатанти очищали з використанням робота сіїзхоп АБРЕС Х274. Якщо коротко, картриджі
ЗРЕ (твердофазна екстракція) (Адіїепі, 12131014), заповнені 1,2 мл смоли з протеїном А
МАВ5ОЕГ ЕСТ ЗОВЕ? (СЕ Неайнсаге Віо-Зсіепсе5 АВ, Уппсала, Швеція), були попередньо врівноважені З об'ємами колонки 1Х РВ5. 18 мл супернатанту пропускали через колонки, а потім промивали 4 мл 1Х РВ5. Кожну колонку попередньо елюювали 0,9 мл 0,1 М лимонної кислоти, при рН 2,9. Очищені антитіла елюювали 2 мл 0,1 М лимонної кислоти, при рН 2,9.
Антитіла знесолювали у РВ5 ббогепзепз (59,5 мМ КНеРоОх, 7,3 мМ МагНРО».2Н2О, 145,4 мМ Масі (рН -- 5.8)) з використанням колонок РО-10 (СЕ Неайнсаге). 1.5.Експресія антитіла та зв'язування антигена, як визначено за допомогою 5РК (поверхневий плазмонний резонанс). Використовуючи сенсорні чіпи СМ5 (СЕ Неайсаге)
Протеїн А (Ріегсе) був з'єднаний з поверхнею чипа з використанням набору для амінного сполучення (ЗЕ Неакнййсаге). Протеїн А був з'єднаний з проточною кюветой 1 і 2 (або альтернативно З і 4) з використанням ВІАСОКЕ? 1200. Супернатанти з клітин ЕХРІ-2939, що містять антитіло або альтернативно очищені антитіла (як описано в 1.4), пропускали через поверхню проточної кювети 2, тоді як буфер (НВ5-ЕР) пропускали через проточну кювету 1.
Кількість супернатанту або очищеного білка (а також концентрація), що вводиться під час стадії захоплення, варіювалася між прогонами і зазначено в заголовках таблиць 3-11. У кінці введення супернатанту або очищеного антитіла вимірювали зміну в одиницях відповіді. Це значення було зазначено як рівень захоплення в таблицях 3-11. Щоб визначити, чи є ТІ/ТА пов'язаним з антитілом, Т/ТА потім пропускали через проточні кювети 1 і2, а одиниці відповіді вимірювали до кінця введення ТІЛА (фаза асоціації). Це значення позначається як рівень зв'язування ТІЛА (раннього) в таблицях 3-11. Одиниці відповіді вимірювали до закінчення фази дисоціації. Це значення помічене як рівень зв'язування ТІТА (пізнього) в таблицях 3-11 і є мірою кількості антитіла, яке було втрачено з поверхні чипа в результаті дисоціації комплексу ТІ 1А-антитіла.
Сенсограми були двічі стандартизовані (проточна кювета 2 віднімається з проточної кювети 1 і бо контрольного буфера). Оскільки для скринінгу була велика кількість варіантів антитіл, їх перевіряли в різних прогонах (таблиці 3-11). У кожному випадку (крім прогону 3) для порівняння було включено вихідне антитіло 320-179. Нижче наводиться короткий опис умов, які використовуються в кожному прогоні:
Таблиця 1
Рівень Рівень
Су- Приб-лизний Конц. зв'язування | зв'язування
Про- | пер- Білок рівень зразка ТІЛА ТІЛА Примітки гін Ж | на- захоп-лення ТІЛА (раннього) (пізнього) тант (ЕФ) (мкг/мл) | на момент на момент часу часу
Антитіло, розведене до 2 1 х 400 10 59 590 мкг/мл, варіабельний час захоплення
Супернатант, розведений в 2 х 1000 10 44 220 рухому буфері, варіабельний час захоплення
Антитіло, розведене до 2 2 х 400 10 44 590 мкг/мл, варіабельний час захоплення
Супернатант, з |х варіабельна| 10 59 5ОО рухомому бу фере захоплення 60 с
Антитіло, 4 х БОЮ Б 44 220 розведене до 2 мкг/мл в рухомому буфері
Супернатант, х 100 5 44 220 розведений в рухомому буфері,
Антитіло, розведене до 2 х варіабельна 5 44 170 рухомому буфері і захоплене протягом 45 с
Антитіло, « розведене до 7 х 400 5 44 220 приблизно 2 мкг/мл
Антитіло, розведене до 2 х 400 5 44 590 мкг/мл, варіабельний час захоплення
Антитіло, розведене до 2 х 400 5 44 590 мкг/мл, варіабельний час захоплення " Цей прогін був виконаний на Віасоге? АТО0
Зв'язування антитіла проти ТІЛА з різними видами ТІТА також визначали з використанням
ЗРЕ. Антитіло проти ТІ1ТА захоплювали на поверхні Протеїну А. ТІ1А від людини, щури, миші, кролика, морської свинки, свині, собаки, кішки або яванського макака, пропускали по поверхні, і вимірювали одиниці відповіді. 1.6.Отримання ТІТА. Т/1А людини отримували в системі експресії для ссавця ЕХРІ2932, використовуючи конструкцію експресії ДНК, що кодує позаклітинний домен (ЕСО) ТІ1А людини з М-кінцевим НІЗ і міткою РІГ АС. Інші види форм ТІЛА були створені на основі переліку послідовностей із загальнодоступних баз даних. Вони наведені нижче:
Таблиця 2
Посилання на загальнодоступну ,
ЗЕО ІЮ МО: 125 з
Яванський макак Публікації США Мо 34 2014/0255302
Супернатант культури, який містить білок ТІ1А, що секретується, збирали центрифугуванням при 2000х9 протягом 10 хвилин для видалення клітин. Білок ТІТА очищали із супернатанту з використанням колонки НР НІЗТКЕАР? (СЕ Неайсаге). Елюйований білок піддавали буферного обміну в РВ5 з використанням колонки НІГОАО? 16/60 Зирегдех 200 для препаративного ступеня чистоти (СЕ НеайпВсаге) і фракції -«- 70 кДа, розділяли гель-фільтрацією на колонці НІГОАОЄ 26/60 5ИОРЕВОЕХ? для препаративного ступеня чистоти 200 (СЕ
Неайнсаге). 1.7.Аналіз активності клітинної лінії ТЕ-1. Щоб визначити, які антитіла проти ТІЛА функціонально нейтралізують біологічну активність ТІ1А, антитіла тестували на їх здатність нейтралізувати апоптоз, індукований ТІЛА, у лінії клітин ТЕ-1. Клітинну лінію еритролейкозу людини ТЕ-1 (АТСС: СКІ -2003) підтримували в культурі в стандартних умовах. Клітини ТЕ-1 (7,5х107/лунку) інкубували в непрозорих 96-лункових планшетах (Сгеіпег) з 100 нг/мл людського
ТІЛА ї 10 мкг/мл циклогексаміду для індукування апоптозу. Антитіла, які тестувалися, у концентрації 10 мкг/мл (66,7 нМ) або менше додавали до планшетів і інкубували протягом 4-5 годин. Потім індукцію апоптозу оцінювали з використанням набору Нотодепеоив Сазразез Кії (Коспе) відповідно до інструкцій виробника.
Дані були нормовані за рівнем експресії у відсотках від максимального апоптозу (рівні апоптозу, що досягаються ТІ ТА людини плюс циклогексимід у відсутності антитіла проти ТІ 1А).
Зо 1.8.Селективність до рецепторів у найбільш активних антитіл. ТІ ТА зв'язується як з його родинним сигнальним рецептором ОКЗ, так і з рецептором-приманкою ОсСКЗ, який також служить рецептором-приманкою для членів сімейства ФНП Разв-ї і ГІСНТ. Антитіла оцінювали на їх здатність пригнічувати зв'язування ТІЛА з його рецепторами в конкурентному ІФА. Химеру риз/гс (280 Зувіетв5) або химеру ОсКЗ/Ес (КО бЗузіетв5) наносили на 96-лунковий планшет (Махізогр, Мипс) в концентрації 2 мкг/мл. Серійно розведені тестові антитіла попередньо інкубували з 1 мкг/мл біотинільованого в одному сайті ТІ/ТА людини протягом 30 хвилин, потім додавали до лунок, покритих ЮОКЗ/Рс або ЮОстЗ/Ес. Зв'язаний ТІТА був виявлений з використанням стрептавідин-пероксидази хрону 1: 2000 (ВО РПагтіпдеп). Дані були нормовані за рівнем експресії у відсотках від максимального зв'язування ТІ/ТА з рецептором при відсутності антитіла проти ТІ1А. 1.9.Екслюзійний кінетичний аналіз. Цим аналізом вимірюють вільну концентрацію одного з партнерів по зв'язуванню без порушення рівноваги. Розчини можуть бути приготовлені в автономному режимі з використанням немодифікованих білків у розчині, а значення вимірювання афінності можна прочитати через кілька діб після змішування, щоб забезпечити досягнення рівноваги. В екслюзійному кінетичному аналізі один інтерактант (званий постійним зв'язуючим партнером, або СВР) утримується в постійній концентрації, а інший (званий титрантом) розбавляється послідовно. Екслюзійні кінетичні аналізи можуть бути використані для визначення константи дисоціації (Ко) ії афінності взаємодії антитіло-антиген. У типовому екслюзійному кінетичному аналізі титрант іммобілізували на гранули (наприклад, гранули сефарози або ПММА (поліметилметакрилат)) і використовували для захоплення вільного СВР в розчині. Потім вторинний мічений зонд використовується для кількісної оцінки кількості захопленого СВР. Екслюзійний кінетичний аналіз описаний в Оагійпо, КК еї аї. (2004) АБ5АХМ апа
Огид ОемеІортенпі Тесппої. 2(6):647-57.
Компоненти об'єднували і дозволяли їм досягти рівноваги. Потім для кількісної оцінки вільної фракції СВР використовували екслюзійний кінетичний аналіз. Криві рівноваги з декількома концентраціями СВР аналізували з використанням методу аналізу п-кривої в програмному забезпеченні КіпЕхА? Рго (версія 4.1.11, Зарідупе) для отримання надійних значень Ко. Взаємодію 320-587 для ТІТА людини досліджували з використанням двох напрямків: (1) СВР являє собою 320-587, титрант являє собою ТІ14А, (2) СВР являє собою ТІЛА, титрант являє собою 320-587.
Приклад 2
Результати експерименту 2.1.Вибір ТІ/1А-зв'язуючих варіантів з еквівалентної або поліпшеною швидкістю дисоціації у порівнянні з С320-179. Варіанти антитіл 320-179 були сконструйовані і експресовані, як описано вище. Супернатанти ЕХРІ2939 (їШе Тесппоодіе5 Согр.) кожного варіанта оцінювали за допомогою ВІАСОКЕЗ? (СЕ Неайвсаге) і отримані дані порівнювали з даними вихідного антитіла 320-179. В окремому експерименті антитіла очищали з використанням хроматографії на протеїні А (див. 1.4), і в експериментах ВІАСОКЕ? (СЕ Неаїїсаге) використовували очищені антитіла. У таблицях 3-11 показаний рівень експресії кожного варіанта, а також їх зв'язування з
ТІЛА в ранній і пізній момент часу. У більш пізніх серіях (табл. 10 і 11) тестували варіанти антитіл, що містять більше однієї амінокислотної заміни.
Таблиця З
Експеримент 5РЕ - Прогін 1 - Антитіла проти ТІ 1А, що зв'язуються з ТІ 1А. " - вказує на антитіла, які були вибрані для аналізу активності.
Рівень | Рівень | Рівень днтитіло Заміна в МН Заміна в МІ. захоплення З зування ТІТАЇзв язування ТІЛА щодо 320-179 | щодо 320-179 (раннього) (пізнього)
Таблиця 4
Експеримент 5РЕ - Прогін 2 - Антитіла проти ТІ 1А, що зв'язуються з ТІ 1А. " - вказує на антитіла, які були вибрані для аналізу активності.
Рівень й Рівень . . ' Рівень й ' Рівень
Заміна в МН| Замінав вень | зв'язува- зв'язува- Рівень / зв'язува- зв'язува- . захоп- |ння ТІЛА захопле- | ння ТІЛА
Антитіло | щодо 320- | МІ щодо лення | (ранньо- ння ТІЛА ННЯ (ранньо- ння ТІЛА 179 320-179 го) (пізнього) го) (пізнього) 320-192 |Відсутня |Т24А | 960 | 238 | 218 | - | - | - / (320-193 |Відсутня |Т245 | 990 | 249 | 227 | 409 | л103 | 9
Таблиця 4
Експеримент 5РЕ - Прогін 2 - Антитіла проти ТІ 1А, що зв'язуються з ТІ 1А. " - вказує на антитіла, які були вибрані для аналізу активності.
Рівень . Рівень . . ' Рівень . ' Рівень
Заміна в МН| Замінав вень | зв'язува- зв'язува- Рівень / зв'язува- зв'язува- . захоп- |ння ТІЛА захопле- | ння ТІ/Т1А
Антитіло | щодо 320- | МІ щодо лення | (ранньо- ння ТІЛА ННЯ (ранньо- ння ТІЛА 179 320-179 го) (пізнього) го) (пізнього) 320-195 |Відсутня 71240 | 992 | 249 | 227 | - | - | - 320-196 |Відсутня /Т24Н | 995 | 250 | 228 | - | - | - 320-198" |Відсутня /Т24Ї | 1023 | 262 | 21 | - | - (ї - 320-200 |Відсутня /Т24У | 1027 | 251 | 231 | | її 320-201" |Відсутня /525А | 990 | 274 | 252 | 3939 | 7 | 57 320-202" |Відсутня 5250 | 1034 | 234 | 214 | - | - (ї - 320-204 |Відсутня /525Н | 1003 | 193 | 155 | - | - | - 320-206 |Відсутня 525. | 1000 | 257 | 235 | - | - | - 320-207" |Відсутня /525МУ | 1022 | 268 | 243 | - | - | - 320-208 |Відсутня /525М | 1034 | 222 | 199 | - | - | - 320-209" |Відсутня /52бА | 1007 | 222 | 200 | - | - | - 320-210 |Відсутня 5260 | 1033 | 225 | 202 | - | - | - 320-211" |Відсутня 5260 | 1025 | 206 | 164 | 392 | 80 1 64 320-212 |Відсутня /526Н | 1013 | 226 | 205 | - | - | - 320-214 |Відсутня 526 | 1038 | 221 | 196 | - | - | - 320-215 |Відсутня 526 | 1021 | 220 | 199 | - | - | - 320-216 |Відсутня /526М | 1010 | 171 | 147 | - | - її - 320-217 |Відсутня /527А | 1076 | 258 | 235 | - | - | - 320-218 |Відсутня 5270 | 1081 | 239 | 218 | 412 | 92 | 80 320-219" |Відсутня 5270 | 1061 | 243 | 220 | - | - ( - 320-220 |Відсутня /527Н | 1049 | 253 | 230 | - | - | - 320-221 |Відсутня /527/К | 1063 | 225 | 207 | 413 | 99 1 898 320-222 |Відсутня 5271 | 1037 | 156 | 96 | - | - | - 320-223 |Відсутня /527М | 1061 | 143 | 66 | - | - | - 320-224 |Відсутня /527М | 1055 | 198 | 155 | - | - / - 320-225 |Відсутня /5г7аА | 1066 | 267 | 243 | - | - | - 320-226" |Відсутня /527ай | 1035 | 250 | 228 | - | - | - 320-227 |Відсутня /527аб | 1022 | 242 | 218 | - | - (| - 320-228 |Відсутня /527ан | 1072 | 259 | 235 | - | - | - 320-229" |Відсутня /527ак | 1057 | 268 | 251 | - | - (| - 320-230 |Відсутня /5г/7а!ї | 1087 | 245 | 223 | - | - | - 320-231 |Відсутня /527ам/ | 1078 | 271 | 243 | - | - | - 320-232 |Відсутня /52/7ау | 1051 | 261 | 235 | - | - | - 320-234 |Відсутня 02705 | 1089 | 262 | 239 | - | - | - 320-235 |Відсутня 027ЬО | 1110 | 256 | 236 | - | - | - 320-236 |Відсутня (Оо7ЬН | 1085 | 254 | 232 | 45 | 5 | 6 320-237 |Відсутня О27оК | 1073 | 240 | 221 | з398 | 10 | в 320-238 |Відсутня барі. | 1106 | 221 | 191 | - | - її - 320-239 |Відсутня О27оМУ | 1079 | 212 | 163 | - | - її - (320-240 |Відсутня |О27ьМ | 1089 | 230 | 196 | - | - | -
Таблиця 4
Експеримент 5РЕ - Прогін 2 - Антитіла проти ТІ 1А, що зв'язуються з ТІ 1А. " - вказує на антитіла, які були вибрані для аналізу активності.
Рівень й Рівень . . ' Рівень й ' Рівень
Заміна в МН| Замінав вень | зв'язува- зв'язува- Рівень / зв'язува- зв'язува- . захоп- | ння ТІЛА захопле- | ння ТІЛА
Антитіло | щодо 320- | МІ щодо ння ТІЛА ння ТІЛА лення | (ранньо- |, . ння (ранньо- |, . 179 320-179 го) (пізнього) го) (пізнього) 320-241" |Відсутня |2/сА | 1092 | 179 | 122 | - | - | - 320-242 |Відсутня |27с5 | 1076 | 124 | 49 | - | - | - 320-243 |Відсутня |27с0) | 1065 | 7 | 26 | - | - | - 320-244" |Відсутня |27с0 | 1083 | 21 | 20 | - | - | - 320-245" |Відсутня |27сН | 1084 | 59 | 26 | - | - | - 320-246 |Відсутня |2/сК | 1089 | 32 | 23 | - | - | - 320-247 |Відсутня |2/сі | 1078 | 205 | 162 | - | - | - 320-248 |Відсутня |27сМ/ | 1110 | 96 | з30 | - | - | - 320-249 |Відсутня (г/см | 1096 | 77 | 28 | - | - | - 320-250 |Відсутня |Сс28А | 1104 | 180 | 115 | - | - | - / (320-251 |Відсутня |с285 | 1085 | 134 | 50 | - | - | -
Таблиця 5
Експеримент 5РЕ - Прогін З - Антитіла проти ТІ ТА, що зв'язуються з ТІ 1А. " - вказує на антитіла, які були вибрані для аналізу активності.
Замінав ун Замінав у. Рівень Рівень зв'язування зу я Ті
Антитіло щодо 320-179 |щодо 320-179 захоплення | ТІ/1А (раннього) (пізнього) 320-252. |Відсутня 0280 | 996 | 20 | 9 320-253 |Відсутня 0280 | 1073 | 6 | 6 320-254 |Відсутня 0288, | 702! 17777117 | 77778 2 320-255 |Відсутня |028К./ | 842 | 77724 | 778 2 320-258 |Відсутня |028Ж4 | 823. | Щщ(-:: 9 | 6 320-261 |Відсутня |Аг2ОО | 956.7 | 2-86 | щ-ЗХБ29 ( 320-265 |Відсутня |АгОМ/ | 71057. | 168. | -:( 69 Ф Кж« 320-270. |Відсутня 0300: | 51 | 9 | 5
Таблиця 5
Експеримент 5РЕ - Прогін З - Антитіла проти ТІ ТА, що зв'язуються з ТІ 1А. " - вказує на антитіла, які були вибрані для аналізу активності.
Замінав ун | Замінаву. Рівень Рівень зв'язування взувая ті
Антитіло щодо 320-179 |щодо 320-179 захоплення | ТІ/1А (раннього) (пізнього) 320-281 |Відсутня (ЗК | 7321 1777717112г2 |в 320-287 |Відсутня 0320: | 339. | 0 г Ф | 2 320-293 |Відсутня |УЗЗА | 421 | 104. | (86 Ф 320-301 |Відсутня |НЗЯМ | 456 | -: 108 | (96 320-302" |Відсутня |НА | 423. | юю 99... | ...ЮЮ744щ (320-311 |Відсутня 0895 2 | 0 / 0 | 0
Таблиця 6
Експеримент 5РЕ - Прогін 4 - Антитіла проти ТІ 1А, що зв'язуються з ТІ 1А. " - вказує на антитіла, які були вибрані для аналізу активності.
Рівень Рівень Рівень
Антитіло Заміна в МН Заміна в МІ. захоплення зв'язування ТІ1А зв'язування ТІЛА щодо 320-179| щодо 320-179 (раннього) (пізнього)
Таблиця 6
Експеримент 5РЕ - Прогін 4 - Антитіла проти ТІ 1А, що зв'язуються з ТІ 1А. " - вказує на антитіла, які були вибрані для аналізу активності.
Рівень Рівень Рівень
Антитіло Заміна в МН Заміна в МІ. захоплення зв'язування ТІ1А зв'язування ТІЛА щодо 320-179| щодо 320-179 (раннього) (пізнього) 320-317 |Відсутня |089У -ЙЮЙЮюЮИ/00/л071105701717171717186111711111111831 320-329 |Відсутня |М9ІК 1777/6009 320-330 Відсутня |У. 77/17777160077771717171111397771771111 419 320-332 |Відсутня |0Я2гА777777771711111531 17177171 66117111111111144 320-338 |Відсутня |092М/7777771711110548 17777791 320-343 |Відсутня 0930 2 в 545 7771217 177777111901 320-356 |Відсутня |Т94М/ 1777/4867 17777109 17777771 861 320-360 |Відсутня 1950 77705547 86177115 320-362 |Відсутня П95НО77777711111152211711718111191
Таблиця 6
Експеримент 5РЕ - Прогін 4 - Антитіла проти ТІ 1А, що зв'язуються з ТІ 1А. " - вказує на антитіла, які були вибрані для аналізу активності.
Рівень Рівень Рівень
Антитіло Заміна в МН Заміна в МІ. захоплення зв'язування ТІ1А зв'язування ТІЛА щодо 320-179| щодо 320-179 (раннього) (пізнього) 320-369 Відсутня |595аї/////17111503 7 177777178981711111111601С 320-370 Відсутня |595аМ/ 17770570 17777 66771777111111117390
Таблиця 7
Експеримент 5РЕ - Прогін 5 - Антитіла проти ТІ 1А, що зв'язуються з ТІ1А.
Рівень Рівень Рівень
Антитіпо Заміна в МН Заміна в МІ. захоплення зв'язування зв'язування щодо 320-179 | щодо 320-179 ТІЛА (раннього)| ТІТА (пізнього) 320-372 |Відсутня ЩА | 106 | 1 | 0 2 Ф (« 320-373 |Відсутня (АБО | 77/99. | Юля 320-374 |Відсутня (АБО | 77/98. | 710 320-376 |Відсутня (АЗК | 77/98. |з 1 320-382 |Відсутняї (11970 -:( | 106. | 0 2 | 0 320-384 |Відсутня (| 97Н.7/ 77798113 | 2 320-386 |Відсутня (ПЯЛМ | 104 | 7/1 | 770 320-402 |М27. 00 |Відсутня.//// | 98.2 | (11 |Ї7711ло1
Таблиця 7
Експеримент 5РЕ - Прогін 5 - Антитіла проти ТІ 1А, що зв'язуються з ТІ1А.
Рівень Рівень Рівень
Антитіпо Заміна в МН Заміна в МІ. захоплення зв'язування зв'язування щодо 320-179 | щодо 320-179 ТІЛА (раннього)| ТІТА (пізнього) 320-405 |Т285 |Відсутня.// | (79 2 щ | 10 | 9 320-406 |т280 |Відсутняя./// | 82 | 8 | 7 320-410 |Т2Ві 0000 |Відсутня.//// | 86. | 11 | ло 320-411 |Т28Му 00 |Відсутня.//// | 82 | 10 | 9 320-442 |Т28М |Відсутня./// | 89.7 | (ЛО | 9 320-413 |Р2ОА |Відсутня./// | 89 | 2 -:( 25. |.4.4СС8С1С 320-416 |Р290 00 |Відсутня./// | 81 77779178 2 320-417 |Р2ОН 0 |Відсутня./// | 85... | 9 | 8 320-418 |Р2ОК 00 |Відсутня./// | 85. ЮЩ| 10 | 9 320-419 |Р2ОЯ 00 |Відсутня./// | 83 | 11 | 9 2 320-421 |Р28У 0 |Відсутня./// | 81777978 2 320-422 |ТЗ0ОА |Відсутня./// | 80 | 2-10 | 779 2 2 щ « 320-423 |Т305 |Відсутня./// | 86 2 | 10 | ло 320-424 |Т300 |Відсутня./// | 86 | 11 | ло 320-425 |Т300 |Відсутня./// | 89.7 | 14 | 120 320-426 |ТЗОН 000 |Відсутня.//// | 84 | 10 | 7/9 2 320-429 |ТЗОМУ 0 |Відсутня./// | 902 | 2-72 320-430 |Т30М |Відсутня./// | 85. | 6 | 6 (320-431 |531А 000 |Відсутняя./// | 85 6ЮЩ | 6 | 6
Таблиця 8
Експеримент 5РЕ - Прогін 6 - Антитіла проти ТІ ТА, що зв'язуються з ТІ 1А. " - вказує на антитіла, які були вибрані для аналізу активності. . аміна в аміна в одо зв'язування зв'язування
Антитіло | додо 320-179 320-1 тв захоплення (раннього) | ТІЛА (пізнього) 320-433 |5310 |Відсутня.///// | 412 | -:(( 90 2 юЮЩщ | 83 2 320-441 |У3З2О 0 |Відсутня.//// | 388. | 2 -:( 80177767
Таблиця 8
Експеримент 5РЕ - Прогін 6 - Антитіла проти ТІ ТА, що зв'язуються з ТІ 1А. " - вказує на антитіла, які були вибрані для аналізу активності. . аміна в аміна в одо зв'язування зв'язування
Антитіло | додо 320-179 320-1 тв захоплення (раннього) | ТІЛА (пізнього) 320-446 |0ОЗЗА 0 |Відсутня.//// | 469 | - 718 7778 2 що 320-448 0330 |Відсутня.7///// | 482 | її | 6 320-451 033 000 |Відсутня.////// | 497. | 719 2 щЩ | 8 320-457 |1340 (Відсутня | 55 2 Щ | 6 | 4 320-464" |М355 0 |Відсутня///// | 600 | 771930. 1240 320-466 |М35О |Відсутня.//// | 3660 | 2 щ-:( 93 2 щЩщ | 86 ( 320-469 |МЗ3БІ 00 (Відсутня | 315 | (695 2 щЩ | 6 (« 320-473 |Відсутня |М91О0 | 453. | (69 2 ЮДЩщ | 552 320-475 |Відсутня (МЯБМ/777 | 72 11117818 320-483 |М/БОА |Відсутня.ї///// | 492 | 4 | 6 320-484 |М/5О5 0 |Відсутня.д//// | 555 | З | 6 320-490 |М/БОУ |Відсутня.///// | 3939. | 2 -:( 714... |. 8 2 2щ-
Таблиця 9
Експеримент 5РЕ - Прогін 7 - Антитіла проти ТІ 1А, що зв'язуються з ТІ 1А. " - вказує на антитіла, які були вибрані для аналізу активності.
Рівень Рівень Рівень днтитіло Заміна в УН Заміна в МІ. захоплення зв'язування ТІЛАврв'язування ТІЛА щодо 320-179 | щодо 320-179 (раннього) (пізнього) 320-492 11510 |Відсутня.//// 439 | (89 7777782 2 2щЩ- 320-499 |М525 |Відсутня.//// 485 | -:( 890 2 ющ Є 82 2 щ 320-600 |М52О 00 |Відсутня.д///////77 472 | 695 2 щ | 53 о 320-БО3 |МБ2М/ 00 |Відсутня.д//// 7484 | 47177716 320-606 |РБгає |Відсутня.д///// 444 | 97. 1777717789 2 820-611 |РБгаї |Відсутня.д///// 581 | 7 10617777 9824 320-613 |РБгау |Відсутня.д///// 585. | -:(( 99 2 ющ ВЯеЗ 90 г Ф 320-614 |МБЗА |Відсутня.д///// 516 | 96 77777788 24 320-616 |М53О 0 |Відсутня.д//// 461 | 79277777 86 2 320-531 фОББА 00 |Відсутня.д//////7 331 | 66б771717711111111611 320-533 |0550 |Відсутня.//// 441 | 93 77777786 4
Зо
Таблиця 9
Експеримент 5РЕ - Прогін 7 - Антитіла проти ТІ 1А, що зв'язуються з ТІ 1А. " - вказує на антитіла, які були вибрані для аналізу активності.
Рівень Рівень Рівень днтитіло Заміна в УН Заміна в МІ. захоплення зв'язування ТІЛАврв'язування ТІЛА щодо 320-179 | щодо 320-179 (раннього) (пізнього) 320-542 |М5бО 0 |Відсутня./////// 839 | 97 юЮющ | 86 Ф 320-544 |МБбК |Відсутня./// 6907 | 12077777 112 320-548 |Т57А |Відсутня.//////7 335 | -:( 74 | 68 щі 820-554 |Т5/И. |Відсутня.//// 506 | - 66177775 820-556 |Т57У |Відсутня.//// | 634 | 7100/7777 902 320-557 |О5ВА |Відсутня./////7 378 | 26 г юЩ | 6 Фо 320-559 |0580 |Відсутня.д///// 535 | (9 | 5 320-560 (0580 |Відсутня.д//// 907. | (866 (| 9 320-661 |О5ВН 0000 |Відсутня.д/// 539.7 | 2-14 9 (| 6 320-567 |У595 |Відсутня./// | 5907 | -:( 96 7 щ| 86 Ф «( 320-572 |АБОЗ |Відсутня.д//////77 459 | -: 98 2 щЩщ | 90 гФ / 320-576 |АБОК |Відсутня./////77 479 | -:( 90 7 7 |/83 4 320-577 ЦІ51А |Відсутня./////77 479 | 98 2 ЮщЩщ | 90 гФ /
Таблиця 10
Експеримент 5РЕ - Прогін 8 - Антитіла проти ТІ ТА, що зв'язуються з ТІ 1А. " - вказує на антитіла, які були вибрані для аналізу активності.
Антитіло щодо 320-179 | щодо 320-179 захоплення | ТІ1А (раннього) ТІЛА (пізнього 320-179. |Відсутня Відсутня | 402 | 98 | 86 320-584" Відсутня 1315,М91М/ | 399. | 103 | 98
Таблиця 11
Експеримент 5РЕ - Прогін 9 - Антитіла проти ТІ ТА, що зв'язуються з ТІ 1А. " - вказує на антитіла, які були вибрані для аналізу активності.
Рівень | Рівень | Рівень днтитіло Заміна в МН |Заміна в МІ. щодо захоплення З язування ТІЛА| зв язування ТІЛА щодо 320-179 320-179 (раннього) (пізнього) 320-179 Відсутня |Відсутня.ї | 402 | 708. | .-Х 98
Антитіла, які мали рівні захоплення, подібні або кращі, ніж у 320-179, а також значення рівня зв'язування ТІТА (раннього) і рівня зв'язування ТІ А (пізнього), які були в подібному діапазоні, були взяті для аналізу активності. Ці варіанти позначені штрихуванням в таблицях 3-11.
Порівняння швидкості дисоціації, яка вимірюється за допомогою 5РК для декількох антитіл, показано на Фіг. 5. Деякі з антитіл дисоціювали з меншою швидкістю, ніж вихідне антитіло 320- 179. 2.2Антитіла проти ТІ1А з поліпшеною активністю в клітинному аналізі. Для визначення того, чи корелює поліпшена швидкість дисоціації з посиленою активністю очищеного антитіла,
варіанти досліджували в аналізі ТІ 1А-індукованої активності каспаз в клітинах ТЕ-1. Ефективні антитіла діють шляхом зв'язування з ТІЛА і інгібують активацію Т/1А рецептора ОКЗ. Цей рецептор запускає шлях апоптозу, в якому каспази активуються і можуть бути виявлені з використанням комерційних реагентів. У кожному експерименті варіант антитіла порівнювали з 320-179 за кратністю поліпшення активності. Результати наведені в таблиці 12.
Таблиця 12
Аналіз ТІ 1А-індукованої каспазної активності в клітинах ТЕ-1: Інгібування антитілами проти ТІЛА щодо 320-179 320-179 (мкг/мл) (мкг/мл) поліпшення 320-489 Відсутняя (| 79К 777777 | 00 | 0040 | 0 25 ЧРе 820-213 Відсутня |526К | 0070 | 0030 | 0 25 ю"«з"(І 820-244 Відсутня (М 27с0 | 55030 | 0010 | 0 2 «(// 820-245 Відсутня (М 2г7сН | 0540 | 0010 | 0 2 з(
Таблиця 12
Аналіз ТІ 1А-індукованої каспазної активності в клітинах ТЕ-1: Інгібування антитілами проти ТІЛА щодо 320-179 320-179 (мкг/мл) (мкг/мл) поліпшення 820-611 М5бУ 0 ф|М91м,сезК | 0005 | 0040 | 8 ях Для кількох антитіл з кратністю поліпшення, що перевищує 10-кратне підвищення активності, проводили до п-7 аналізів.
Результати відповідали даним, наведеним у цій таблиці. На Фіг. 7 показані п - 4 повторів кількох антитіл з поліпшеною активністю в порівнянні з 320-179.
Як показано в таблиці 12 і на Фіг. 6, деякі з тестованих антитіл з однією заміною мають найвищу активність в порівнянні з 320-179. З усіх тестованих варіантів антитіла з однією заміною два мали більш ніж 10-кратне підвищення активності в порівнянні з 320-179. Цими варіантами були 320-331 (який містив заміну М91МУ/ у варіабельній ділянці легкого ланцюга) і 320-547 (який містив заміну М5бМ у варіабельній ділянці важкого ланцюга) (Фіг. 6). Цей результат є несподіваним, оскільки, як правило, СОКЗ МН антитіла переважно бере участь у зв'язуванні антитіл, тоді як, навпаки, заміна М5б6У чинить істотний вплив на зв'язування в СОК2
МН антитіла. Коли були зроблені варіанти з М91М/ з Мі або окремо М5бУ в МН з іншими замінами, які покращували активність, були отримані високоактивні антитіла. Коли заміна 91 в МІ була об'єднана з заміною М5бУ в МН в одному антитілі, 320-587, кратність збільшення активності в порівнянні з 320-179 становила 40. На Фіг. 7 показані чотири різних повторних експерименти, що демонструють збільшення активності чотирьох антитіл 320-587, 320-591, 320- 592 ії 320-601 у порівнянні з 320-179. Послідовності цих антитіл з підвищеною активністю у порівнянні з 320-179 показані на Фіг. З (варіабельна ділянка важкого ланцюга) і на Фіг. 4 (варіабельна ділянка легкого ланцюга).
Проведено порівняння активності 320-587 у порівнянні з іншими раніше описаними антитілами проти ТІТА. Ці раніше описані антитіла включають антитіло 1681М, описане в патенті США Мо 8642741 (МН являє собою 5ЕО ІЮО МО: 18; Мі являє собою 5ЕО ІЮО МО: 26), антитіло МН5Л/І1 з публікації США Мо 2014/0308271 (МН являє собою 5ЕО ІЮО МО: 24; МІ. являє собою 5ЕО ІЮ МО: 17), гуманізоване 184, як описано в патенті США Мо 8263743 (МН являє собою ЗЕО ІЮ МО: 74; МІ являє собою ЗЕО ІЮ МО: 75) і 320-168 (також зване С320-168), як описано в публікації США Мо 2014/0255302А1 (УН являє собою ЗЕО ІЮ МО: 181; МІ. являє собою
ЗЕО ІЮ МО: 194). На Фіг. 8 показано, що 320.587 має найвищу ефективність в аналізі на основі клітин у порівнянні з цими раніше описаними антитілами, що робить його найбільш ефективним антитілом проти ТІ1А. 2.3.Аналіз конкурентного зв'язування з рецепторами ОКЗ і ОсКЗ. Антитіла, які проявляли
Зо підвищену активність у порівнянні з 320-179, піддавали скринінгу на їх здатність пригнічувати зв'язування ТІ/ТА з його сигнальним рецептором ОКЗ або рецептором-приманкою ОсК3. Всі тестовані антитіла проти ТІ 1А показали інгібування зв'язування ТІ/ТА з ОКЗ у порівнянні з ізотипічним контролем (Фіг. 9). Це підтверджує, що антитіла інгібують активність ТІ1А, блокуючи взаємодію ТІ 1А-ОНАЗ.
У попередніх експериментах, описаних у публікації США Мо 2014/0255302А1 (приклад 4), антитіло 320-179 (320-179) тестували в аналізі конкурентного зв'язування з рецепторами і показали, що воно селективно інгібує зв'язування ТІ1А з ЮОКЗ, але не з ОскКЗ (фіг. 10). В експериментах, представлених у цьому документі на Фіг. 10, знову показано, що 320-179 не інгібує взаємодію ТІ 1А-ЮОсК3. Це контрастує з протестованими поліпшеними антитілами проти
ТІЛА. Антитіла з поліпшеною активністю в аналізі клітин ТЕ-1 (як описано в розділі 2.2), включаючи антитіло 320-587, закономірно інгібували взаємодію ТІ 1А-ОсСВЗ.
Таким чином, вихідне антитіло 320-179 здатне інгібувати взаємодію ТІ/1А-ОКЗ, але не взаємодію ТІ 1А-ОсКЗ. Декілька антитіл з підвищеною ефективністю, таких як 320-267 (МН являє собою 5ЕО ІЮ МО: 1, МІ являє собою 5ЕО ІЮО МО: 11), 320-277 (МН являє собою ЗЕО ІО МО: 1,
МІ. являє собою ЗЕО ІЮО МО: 12), 320-278 (МН являє собою 5ЕО ІЮО МО 1, МІ являє собою 5ЕО
ІО МО: 13) ї 320-591 (МН являє собою ЗЕО ІЮ МО: 3, МІ являє собою 5ЕО ІЮО МО: 9) інгібує взаємодію ТІ Та-ОКЗ, але не взаємодіє ТІ ТА-ОСКЗ. Декілька антитіл з підвищеною активністю, таких як 320-331, 320-547, 320-583, 320-584, 320-585, 320-586, 320-587 і варіанти цих антитіл, здатні пригнічувати взаємодію як ТІ Т1А-ОКЗ, так і ТГТЛА-Оев3. 2.4.Видова перехресна реактивність 320-587 була перевірена на їх здатність зв'язуватися з рекомбінантно продукованим ТІЛА від різних видів. Антитіло зв'язувало ТІЛА усіх видів, які тестували (Фіг. 11). Зв'язування 320-587 з Т/1А людини, щури, морської свинки, собаки, кішки, яванського макака мало низьку швидкість дисоціації, що вказувало на високу афінну взаємодію.
Антитіло зв'язувало ТІ1А миші і кролика і мало високу швидкістю дисоціації. 2.5.Доклінічні моделі ефективності для тестування антитіл проти ТІЛА на наступних тваринних моделях захворювання:
Астма: алерген-індукована астма - гризуна (миша, щур або морська свинка) сенсибілізували внутрішньошкірною ін'єкцією овальбуміну (ОМА), особливо ОМА, отриманого з курячих яєць, з додаванням галунів, а потім стимулювали щонайменше через 2 тижні шляхом обприскування розпорошеним ОМА, викликаючи симптоми астми, включаючи гіперреактивність дихальних шляхів, приплив еозинофілів і збільшення виробництва цитокінів (наприклад, НуїЇКета еї аї., 2002, Сііп. Ехр. Іттипої. 129:390-96). Така модель може бути змінена шляхом повторної стимуляції, щоб забезпечити профіль більш хронічної хвороби зі збільшенням ремоделюваннюс дихальних шляхів і індукції фіброзу (наприклад, Во5 єї аї., 2007, Еиг. Везріг. У. 30:653-661).
Альтернативні алергени, такі як пиловий кліщ, також можуть бути використані (наприклад,
І атьен еї а!., 1998, Ат. 9. Везріг. Стії. Саге Мед. 157:1991-9). Альтернативно, примат, відмінний від людини, (наприклад, яванський макак) може бути сенсибілізований та стимульований екзогенним антигеном, таким як Авсагі5 зишт, що призводить до гіперреактивності дихальних шляхів, притоку еозинофілів і збільшення продукування цитокінів (наприклад, Ууедпег еї аї., 1991, У. АІегду Сіїп. Іттипої .87:835-41).
ХОЗЛ: Запалення дихальних шляхів, викликаних димом - гризун (миша, щур або морська свинка) буде піддаватися впливу сигаретного диму 3-7 разів на тиждень протягом як мінімум 4 тижнів, що призведе до легеневого захворювання, подібного ХОЗЛ, яке характеризується скупченням у легенях нейтрофілів, збільшенням продукції запальних цитокінів, фіброзом легенів і легеневою гіпертензією (наприклад, Оаміз5 еї аї. (2012) Рі о5 Опе 7:е33304). Більш важка форма захворювання може бути викликана внесенням повторної бактеріальної або вірусної інфекції в легені під час впливу диму (наприклад, Гі еї аїЇ. (2012) Віої. Рпагпт. Виї. 35:1752-60). Гризуни з ХОЗЛ, індукованим димом, будуть отримувати лікування антитілами проти ТІ1А і перевірені на ефективність лікування.
Легеневий фіброз: Блеоміцин-індукований легеневий фіброз - гризун (миша, щур або морська свинка) буде отримувати лікування блеоміцином або шляхом інтратрахеальної/інтраназальної інстиляції, або шляхом внутрішньовенної ін'єкції один або два рази на тиждень протягом щонайменше З тижнів. Ця методика індукує значний і стабільний легеневий фіброз (наприклад, Ріпагі еї аї. (2009) Кезр. Ріузіої!., Меигобіої. 166:41-46). Гризуни з блеоміцин-індукованим легеневим фіброзом отримуватимуть лікування антитілами проти ТІ1А Її будуть перевірені на ефективність лікування.
Кістозний фіброз: Тхоряча модель з нокаутом СЕТЕ (трансмембранний регулятор кістозного фіброзу) - у тхорів, гомозиготних за нокаутним геном, або з відомими мутаціями, пов'язаними з хворобою, СЕТК (ген, який є причиною кістозного фіброзу) спонтанно розвивається захворювання подібне кістозному фіброзу, що характеризується обструкцією слизових оболонок дихальних шляхів, ателектазом, інтерстиціальною пневмонією і повторними легеневими інфекціями з прогресуючою бактеріальною колонізацією легких (наприклад, 5ип еї аї. (2014) Ат.
У. Везріг. Сеї! Мої. Віої. 50:502-12). СЕТА- тхори отримуватимуть лікування антитілами проти бо ТІ1а і будуть перевірені на ефективність лікування.
Синдром подразненого кишечника: Стрес-індукована вісцеральна гіперчутливість. Стрес будуть індукувати у щурів шляхом розлучення новонародженого з матір'ю (наприклад, Сошіпно еї аї. (2002) Ат. 9). РНузіо!ї. Савігоіпієві. І імег РНузіої. 282: 1307-16) або обмеження рухових функцій дорослих (наприклад, Зпеп еї аїЇ. (2010) 7. МеипгодавзігоепіегоЇ. Моїй. 16:281-90).
Очікується, що це призведе до зміненої перистальтики товстої кишки та вісцеральної гіперчутливості, подібної до тієї, яка спостерігається у пацієнтів з ІВ5. Щури, яких піддавали стресу, будуть отримувати лікування антитілами проти ТІ ТА і будуть перевірені на ефективність лікування.
Ревматоїдний артрит: Колаген-індукований артрит - гризун (миша, щур або морська свинка) буде імунізований і стимульований колагеном в ад'юванті. У тварин розвивається двосторонній набряк ніг і еритема, запальний інфільтрат в області суглобів і пошкодження суглобів (наприклад, Вепаеїе еї аї. (1999) Тохісої. РаїйоїЇ. 27:134-42). Гризуни з колаген-індукованим артритом отримуватимуть лікування антитілами проти ТІ ТА і будуть перевірені на ефективність лікування.
Еозинофільний езофагіт: Інтраназальний еозинофільний езофагіт, індукований АзрегойиШв5
Титідаїш5. У мишей, які зазнали повторної інтраназальної інстиляції А. Титідаїйв5, розвивається виражена еозинофілія стравоходу, епітеліальна дисплазія і гіперплазія і вільні еозинофільні гранули (наприклад, Міга еї аї. (2001) 9. Сііп. Іпмеві. 107:83-90). Аналогічним чином повторний вплив аерозолю з овальбуміном протягом двох тижнів у сенсибілізованих морських свинок викликає еозинофілію стравоходу з інфільтрацією як еозинофілів, так і огрядних клітин в епітеліальному шарі (наприклад, ім єї аі. (2015) Ат. У. РНузіо!Ї. Савігоіпіеві. І імег РНувзіо!. 308:2482-488). Мишей або морських свинок з еозинофільним езофагітом будуть лікувати антитілами проти ТІ ТА і перевіряти на ефективність лікування. 2.6.Використання антитіл проти Т/Т1А при виявленні зразків, що містять ТІЛА, антитіла згідно розкриттю можуть бути використані для виявлення ТІ/ТА у зразках людини. 320-587 використовували для виявлення ТІТА людини, що секретується з людських МКПК, стимульованих імунними комплексами (Фіг. 13) у форматі ІФА. 320-587 також використовували для виявлення популяції людських МКПК, які експресують мембранний ТІЛА на їх поверхні в експериментах по проточній цитометрії (Фіг. 14).
Зо 2.1.Визначення афінності зв'язування антитіла проти ТІ/ТА з ТІ/Т1А людини за допомогою екслюзійного кінетичного аналізу. Час досягнення рівноваги з 320-587 як СВР: Спочатку вимірювали швидкість Коп для взаємодії 320-587/ТІ1А. Якщо коротко, розчин отримували шляхом змішування 320-587 і ТІ 1А, а аліквоти видаляли в різні моменти часу протягом З годин.
Вільний 320-587 був захоплений шляхом пропускання розчину через колонку, заповнену гранулами сефарози, покритими 20 мкг/мл ТІ/ТА. Захоплений 320-587 був виявлений з використанням АїЇеха Рійог? 647-кон'юЮгованого антитіла проти імуноглобуліну людини (0,5 мкг/мл). Цей аналіз повторювали двічі, отримуючи швидкості Коп 8,35х105 ме" і 7,45х105 ме" із середньою швидкістю Коп 7,90х107 ме". Потім швидкість Коп використовували для оцінки часу, необхідного для досягнення рівноваги при різних концентраціях 320-587, використовуючи інструмент для отримання теоретичної кривої зв'язування, представлений на веб-сайті Зарідупе (мили. Зарідупе.сот).
Визначення КО з використанням 320-587 як СВР. СВР, 320-587, розводили в аналітичному буфері (ОРВ5 (фосфатно-сольовий буфер Дюльбекко), доповненому 1 мг/мл В5А (бичачий сироватковий альбумін)) до кінцевих концентрацій 15, 50 ії 150 пМ. Титрант Т/1А людини розбавляли в аналітичному буфері для створення серії концентрацій 0,1, 0,3, 1, З, 10, 30, 100, 300 1000 ї 3000 пМ. Використовуючи час досягнення рівноваги, який був визначений вище, кривим, які містили або 50, або 150 пМ 320-587, дозволили прийти до рівноваги в інкубаторі при 25 "С протягом 2 діб. Кривим, які містили 15 пМ 320-587, дозволили прийти до рівноваги в інкубаторі при 25 "С протягом З діб. Після періоду врівноваження вільну фракцію 320-587 у кожній реакції кількісно визначали, як описано вище. Значення Ко визначали з використанням аналізу п-кривої кривих рівноваги, що генеруються з 15, 50 і 150 пм 320-587.
Час досягнення рівноваги з ТІЛА як СВР: Час досягнення рівноваги в цій орієнтації оцінювали з використанням Коп для взаємодії 320-587/Т1І14А, визначеного як описано вище в 2.8.
У цьому форматі вільну фракцію ТІЛА захоплювали шляхом пропускання розчину через колонку, заповненою гранулами ПММА, покритими 30 мкг/мл 320-587. Захоплений ТІ1А був виявлений з використанням антитіла проти бх-піз Ругідні 650 (0,75 мкг/мл). Цей аналіз повторювали двічі, отримуючи швидкості Коп 6,11х105 мо" і 5,74х105 мс! із середньою швидкістю Коп 5,93х105 ме".
Визначення Ко з використанням ТІ ТА як СВР. СВР, людський ТІ14А, розводили в буфері для бо аналізу до кінцевих концентрацій 30, 100 ї 300 пМ. Титрант 320-587 людини розбавляли в аналітичному буфері для створення серії концентрацій 0.05, 0,15, 0,5, 1,5, 5, 15, 50, 150, 500 1500 ї 5000 пМ.
Використовуючи час досягнення рівноваги, який був визначений вище, всім кривим дозволили прийти до рівноваги в інкубаторі при 25 "С протягом 3 діб. Після періоду врівноваження вільну фракцію ТІ1А у кожній реакції кількісно визначали, як описано вище.
Значення Ко визначали з використанням аналізу п-кривої кривих рівноваги, що генеруються з 30, 100 ї 300 пМ ТІ А.
Задовільну відповідність спостерігали для двох методів КіпЕХА, а також відносно низьким 95 похибки. Значення Ко для взаємодії ТІ1А з 320-587, яке визначається з використанням 320-587 як СВР, становило 40,9728,33 пМ (таблиця 13), тоді як Ко, отриманий з використанням ТІЛА як
СВР, становила 41,52:513,5 пМ (таблиця 14).
Таблиця 13
Афінність: Гранули сефарози, вкриті ТІ/ТА; 320-587 як СВР береднє/////77777771111111111Ї11111111111400971 ЇЇ
ЗО(стандартневідхилення)ї | -:( 8933 ЇЇ, (з КВ(коефіцієнтвараційї ОЇ 77777777711712011111111 ЇЇ
Таблиця 14
Афінність: Гранули ПММА, вкриті 320-587; ТІ1А як СВР.
Середнє Я41Б2С/ 11111111
ЗО(стандартневідхилення)ї | 1357/1771 (з КВ(коефіцієнтвараціїї ЇЇ 77777777771179311111111111111111111111 3.0.Доклінічні моделі ефективності для тестування антитіл проти ТІ Та. 3.0.1.Астма.
Гостра овальбумин-індукована астма у щурів. Сірих щурів сенсибілізували ОМА за допомогою і/п ін'єкції на 0 добу, а потім стимулювали аерозолем ОМА щодоби на 35-42 доби.
Щурів лікували антитілом 320-587 або носієм за допомогою в/в ін'єкції на 14, 21, 281і 35 добу.
Рідину бронхоальвеолярного лаважу (РБАЛ) оцінювали на загальні та диференційовані клітини на 43 добу. Було виявлено, що лікування значно знижує кількість еозинофілів у РБАЛ (фіг. 15).
Хронічна овальбумин-індукована астма у щурів. Щурів сенсибілізували з використанням
ОМА з додаванням галунів за допомогою і/п ін'єкції на 0 ї 7 добу, а потім стимулювали аерозолем з ОМА два рази на тиждень протягом З тижнів, починаючи з 14 доби і до 31 доби, і 5 діб поспіль з 37 по 42 добу. Тварин лікували антитілом 320-587 або носієм за допомогою в/в ін'єкцій на 24, 29, 34 і 39 добу. РБАЛ оцінювали на загальні та диференційовані клітини і панель цитокінів на 43 добу. Зрізи легенів фарбували гематоксиліном і еозином (Н 8. Е) і Шифф-йодною кислотою (ШИК) і оцінювали за рядом патологій. Лікування 320-587 значно зменшувало еозинофіли та макрофаги РБАЛ (Фіг. 17А і 178), ІЛ-4 ї ІЛ-13 РБАЛ (Фіг. 17С), гіперплазію
Зо келихоподібних клітин (Фіг. 170) і товщину бронхіального епітеліального шару (Фіг. 17Е), у порівнянні з носієм.
Гостра овальбумін-індукована астма у морських свинок. Самці морських свинок Юипкіп
Напієеу були сенсибілізовані овальбуміном, після чого їм була зроблена операція по установці балонного катетера для вимірювання функції легенів і ранніх, і пізніх астматичних реакцій. На 16, 20, 24 і 28 добу тварини отримували і/п ін'єкції з антитілом 320-587 або носієм. Стимуляція аерозолем з овальбуміном (0,05-0,1 95) проводили через 30 хвилин після останнього лікування.
Реактивність дихальних шляхів (АНК) до гістаміну вимірювали за 24 години до стимуляції, через 6 годин після стимуляції (відразу після ранньої астматичної реакції) і через 24 години після стимуляції (відразу після пізньої астматичної реакції). Природу і тривалість ранніх і пізних астматичних реакцій також реєстрували шляхом онлайн-реєстрації функції легень протягом усього 24-годинного періоду. Тварин умертвляли через 25 годин після стимуляції і відбирали рідину бронхоальвеолярного лаважу. РБАЛ оцінювали на загальні та диференційовані клітини.
Лікування за допомогою 320-587 значно зменшувало кількість як еозинофілів, так і макрофагів у
РБАЛ (Фіг. 16А і 168), а також поліпшення АНК після ранньої астматичної реакції (Фіг. 16) і загальної величини ранньої астматичної реакції (Фіг. 1603), у порівнянні з носієм.
Хронічна овальбумін-індукована астма у морських свинок. Самці морських свинок Юипкіп
Напшеу були сенсибілізовані овальбуміном, а через 4 тижні після цього стимулювали овальбуміном щотижня протягом 12 тижнів. Стимуляцію овальбуміном (0,05-0,5 95) проводили шляхом інгаляції аерозольного розчину до тих пір, поки не визначили обструкцію дихальних шляхів. Тварини отримували лікування антитілом 320-587 або носієм за допомогою і/п ін'єкцій кожні 5 діб, починаючи з 8 тижня стимуляції овальбуміном. Функцію дихальних шляхів за допомогою реактивності дихальних шляхів до гістаміну вимірювали до первинної стимуляції, за 24 години до кінцевої стимуляції, і через 6 годин після кінцевої стимуляції. Незважаючи на те, що ніякого ефекту на АНК, викликаного стимуляцією гістаміном, не спостерігали, антитіло 320- 587 значно зменшувало алергічну реакцію виклину ОМА, так як для індукування обструкції дихальних шляхів були необхідні поступово зростаючі дози ОМА (Фіг. 18).
Вважається, що відмінності у терапевтичному ефекті антитіл, що спостерігається в моделях гострої та хронічної астми у морських свинок, є наслідком самої моделі. Вважається, що в хронічній моделі ступінь АНК зменшується з часом і, відповідно, стає менш чутливою до лікування. У цій області гостра модель зазвичай використовується для спостереження складних ефектів реактивності дихальних шляхів, а хронічна модель зазвичай використовується для спостереження складних ефектів ремоделювання дихальних шляхів. Оцінки ремоделювання тривають. Проте було неочікувано спостерігати антитіла, які мають вплив на реакцію на алерген, хоча на цій стадії антитіло практично не впливало на абсолютний АНК (відповідь на гістамін), це значно зменшило пряму алергічну відповідь на антиген.
Зо 3.0.2.Ззапальне захворювання кишечника
ТМВ5-індукований коліт у щурів: Щури отримували одноразову дозу тринітробензолсульфонової кислоти в етанолі шляхом внутрішньоректальної інстиляції.
Контрольні тварини отримували еквівалентний об'єм етанолу. Протягом 7 діб у тварин розвинувся осередковий коліт, що характеризується виразкою товстої кишки із запальним інфільтратом і різним ступенем фіброзу (наприклад, УМіг» єї аї. (2007) Маї. Ргоїос. 2:541-546).
Введення 320-587 значно зменшило множинні симптоми захворювання, включаючи товщину товстої кишки (Фіг. 12А), кількість і тяжкість спайок (Фіг. 128), а також кількість і тяжкість стриктур (Фіг. 12С), що призвело до значно більш легкого перебігу захворювання, ніж у тварин, які отримували або носій, або зв'язане з ізотипічним подібним нерелевантним антитілом (Фіг. 1203. Зменшений фіброз товстої кишки (Фіг. 19) також спостерігали у тварин, які отримували лікування 320.587.
Порівняння хвороби через 7 і 14 діб при ОМВ5-індукованому коліті у щурів. Коліт індукували, як описано вище, використовуючи динітробензолсульфонову кислоту (ОМВ5) замість ТМВ5, а щури, які використовуються в експериментах ОМВ5, були щурами лінії Умієтаг. Тварин лікували антитілом 320-587 або носієм за допомогою в/в ін'єкцій на 1 і 8 добу. Групи оцінювали по коліту на 7 і 14 добу після введення ОМВ5 і тяжкості захворювання між двома точками часу. Лікування антитілом 320-587 мало обмежений ефект на 7 добу, але на 14 добу тварини, які одержували лікування антитілом 320-587, показали значне поліпшення в масі та довжині товстої кишки (Фіг. 20А), фіброзі (Фіг. 208), запальному інфільтраті (Фіг. 202) і пошкодженні товстої кишки (Фіг. 200). Репрезентативні зрізи виразки ободової кишки (Фіг. 20Е) демонструють ступінь відновлення пошкоджень і зменшення фіброзу через 14 діб. На 7 і 14 добу тварини, які одержували носій, мали великий запальний інфільтрат і фіброз зі значною втратою кишкової архітектури. Навпаки, тварини, які одержували лікування 320-587, показали значний запальний інфільтрат, фіброз і втрату кишкової архітектури на 7 добу, але ці ефекти в значній мірі змінювалися впродовж 14 діб.
Відмінності, які спостерігаються в терапевтичних ефектах антитіл, які спостерігаються в моделях ТМВ5 і ОМВ5, як вважають, виникли через використання різних ліній щурів (Зргадие-
Бамжмеу для ТМВ5 проти Умізїаг для ОМВ5). У кожній лінії щурів є відмінності в їх відповідях на імунізацію, так що вважається, що кінетика їх реакції в цих моделях різна. Крім того, ТМВ5 і бо РМВ5 відрізняються структурно і, як вважають, викликають зміни в перебігу захворювання.
Хронічний (21-добовий) О55-індукований коліт у щурів. Щурам давали декстран сульфату натрію (055) у концентрації 5 95 маса/об'єм у питній воді протягом 7 діб, потім 2 95 маса/об'єм у питній воді протягом ще 14 діб. У тварин розвинулася діарея, дифузне запалення товстої кишки, гіперплазія келихоподібних клітин і пошкодження епітелію крипт, і виразки (наприклад,
Вапанауа єї аї. (2014) Когеап У). Рпузіо!. Рнаптасої. 18:279-88). Щурів лікували антитілом 320- 587 або носієм шляхом внутрішньовенної ін'єкції на 5, 12 і 19 добу. Тварин зважували і оцінювали на клінічні прояви хвороби (діарея і прихована кров) щодня, а масу та довжину товстої кишки оцінювали на 21 добу. Лікування антитілом 320-587 істотно змінило Ю55- індуковане уповільнення приросту ваги (Фіг. 21А), поліпшило клінічні симптоми захворювання (Фіг. 218) і поліпшило масу і довжину товстої кишки (Фіг. 213).
Індукція внутрішньоочеревинних цитокінів за допомогою рекомбінантного ТІ/ТА людини.
Внутрішньочеревна ін'єкція рекомбінантного мишачого ТІ1А може індукувати продукування запальних цитокінів, таких як ІЛ-5. У цьому дослідженні миші отримували разову дозу або антитіла 320-587, або носія, а через годину отримували 40 мкг/миша рекомбінантного ТІЛА людини (ПТ 1А). Через шість годин після введення гпТІ1А отримували перитонеальний лаваж і оцінювали перитонеальну рідину на вміст цитокінів і хемокінів за допомогою мультиплексного аналізу. Лікування антитілом 320-587 значно зменшувало перитонеальні концентрації цитокінів
Г-КСФ (гранулоцитарний колонієстимулюючий фактор), ІЛ-1Б, ІЛ-5, ІЛ-6, ІЛ-17 та хемокінів ІР-10,
КС (хемокіни кератиноцитів), МСР-1 (моноцитарний хемоаттрактантний білок-1), МІР-Та, МІР- 1р, МІР-2 (МІР - запальний білок макрофагів) (Фіг. 22).
Розкриття винаходу не обмежується варіантами здійснення, описаними і проілюстрованими прикладами вище, але допускає зміни і модифікації в межах об'єму доданої формули винаходу.
ПЕРЕЛІК ПОСЛІДОВНОСТЕЙ
«1105 Тема РНагітасешіїсаі5 Дибігавйа РЕ; ха «120». АНТИТІЛА, ЯКІ СПЕЦИФІЧНО ЗВ'ЯЗУЮТЬСЯ З ТІЛА «130» 185704-3019 «1605 71 «17/05 Ратепіп версії 35 «21051 «2115 119 «9125 Білок «2135. Ното заріенпь «00» 1 сіп Уаі ОЇп теп маї Сів ет СІу Аа ОЇш Ма! Гу суб Рго СІМ Аа 1 5 10 15 5ег Уаї Гуз Уа бег Суз Ту5 Аа 5ет Оу Тут Пс Ріе ТАг бе Туг зо
Авр Ме Ап Тгр Ма! Ате Сп Ага Рго біуУ Сп ОМ Теи и Ттр Мей до 45
Оу Тер ец Ав Рго Авп 5ег ОМ Ап Тит Сіу Туг Аа Сп Гу5 Ре 50: 55 60 біІп Оу Ага Маї Тиг Мет Тиг Аа Азр Аге бег ТАг 5ег Тег Авіа Туг 65 70 75 8о
Ме оц Гец бегзегієий Аге зег ОЇ Ар Тіг Ага Уві Туг Туг Суб 85 90 95
Аа Аге СІ Маї Рго Сі ТНг Аа Аа Ріе Си Туг Тгтр Оу Спо Су 100 105 по
ТАгІеи Маї Тиг Уа! бегбег 115 ді
«2115 111 «2172» Білок «213». Ното заріеп5 «400» 2 сп 5егУа! Гей ТНг Сп Рго Рго бег Уа! 5ег Оу Аа Рго СОІУ Сп 1 5 10 15
АгЕ Ма! Тег Пе зег Су Тиг Зег Зег 5ег5ег А5р Пе Су Аа Су зо
Іеч СІу Ма! Ні Тгтр Туг Сп. Сп ей Рго ЗУ ТНг Аа Рго Гуз Те
Геч Пе біг Оу Тук Туг Ап. Ага Ріо бег су Маї Рго Ар. Аге Ре
БО
Зег Су бег (ув 5ег Су Тиг бег діа бег Те Тиг Пе Тит су Гей
65 70 75 во
Ген Рго біш Ахр бій бу Ар Туг Туг Суб Сп бег Туг Ар ОХ Тг 85 90 95
Гей ЗегАїЇв ей Рне СІУ СУ Оу Тег Туз Гец ТНг Ма! Ге Су 100 105 по «2105 3 «2115. 119 «2125 Білок «2135. Ното 5аріепь «ДО З сбІп Ма спец Ма! сій бег су Аа Си Ма! Гу Туз Ргб Су Діа 1 5 10 15 бег УаїЇ уз Уаі бег Сув Гуз Аа бег Оу Туг Тьг Ре Твг бег Туг
Ар Пе. Абп Ігр Маї Аге біп Аіа Рго су бІп су Те ОІч Тр Меї
Су Тер Гей Авп Рго Авп 5ег ОХ Туг ТНг Оу Туг Аа СЇп Ту Ре бо
ОІп Оу Ате Уаї Тит Меє ТАг Аа Авр Агро бег Тиг бек Ти Аа Тут 65. 70 75 80
Ме оц Гец 5ег5ег еп Аге Зег сі Ар Тпг Аа Ма! Туг Тут Сув 85 90 95
Аа Аге ОМ Маї Рго ОЇ и Тиг Аа Аа Рбе ОЇи Туг Тгр Оу Сіп ОХ 100 105 110
ТигІец МаЇ ТигУаїЇ бегбетг 115
«2105 4 «2115 11 «2175 Білок «213» Ното заріепе5 «А0О» 4
Сп 5ег Уа! Ген Таг бі Рго Рго 5ег Маї зег ОЇуУ Аа Рго Сіу Сп 1 5 10 15
Ате Маї ТАг Пе Зег Суб Ти 5егЗег бег5ег Авр Ме Оу Аа Су зо
Геш су Маї Ні Тгр Туг ОЇп бій ги Ріо бу ТА Аа Рго ув Теи
Гец Пес Су Туг Туг Ап: Аге Рго 5ег су Ма! Рго-Авр.Аге Ре 5.8) 5ег Оу зет Гу 5ег Су Тпгоег Аа 5ег Ге ТНг Пе Тпг Оу тей 65 70 75 80
Геш Рго си Ар Б Оу Авр Тут Тук Су біп 5ег Тер Авр Оу ТИг 85 90 95
Гей 5ег Аа Геш Рпе су су су Тпг Гуз Гей Тег Ма їец бу 100 105 110 «21055 «211» 111 «212». Білок «2135 Ното заріепе «400» 5
СбіпбегУа! ей Тиг біп Рго Рго 5ег Уаі 5ег бу Аа Рго сіу сіп 1 5 10 15
Аге УаЇ Тиг Пе бет Суз Тиг бег 5ег 5ег ет Ар Ме Сіу Аа Аа
Їеи Оу Маї Ніб Тр Ту" Ол сп Гей Ро Оу ТА Ага Рго 1у5 Ге
Гец Пе Оу Туг Туг Авп-Ате Ріо 5ег у Маї Рго Авр Аге Рре бо бег Су бет Гуз бег Су Тит бег Аа бет Ге и Тиг Пе Ти г оїу ей 65 70 75 80
Гец Рго ОЇ ц Ар Си Су Ар Туг Туг Су Сп 5ег Тгр.Аб5р сім ТАг 85 90 95
Іепй 5ег Аа Іеи Рне Су ОХ Оу Тнг уз Те ТНг ма Ге су 100 105 по «2105 6 «2115 ЦІ «212» Білок «2135. Ното 5аріє п5
«4002 6 сп 5егУаіЇ Гей Тк 9Ги Рго Рго 5ег Уаї 5ег С1у Аа Рго су сп 1 5 10 15
Ате Маї ТАг Пе Зег Суб Ти 5егЗег бег5ег Авр Ме Оу Аа Су
БІВ)
Зег ау Маї Ні Тгр.Туг сп. Оп Гец Ро СІу Твг Аа Рго уз Тем
НІ) 45
Гепй Пе си бу Тук Туг Абп Аге Ро бег Оу Уаї Рго Абр Аге Ре бо 5ег Оу 5ег Гу бег Оу Тиг5ег Аа ет Гец Тнг Пе Тит сІу Тец 65 7 75 80
Ге Рго бІш Ар бін Оу Авр Туг Туг Су бій бег Тгр Ар Оу ТЬБг 85 90 95
Іеч 5ег Аа Ге Ре су су Оу Тиг Туз Те Тег Ма! Те Оу 100 105 110 «2105 7 «211» 111 «2125 Білок «213» Ното заріепе5 «400» 7
ОЇп 5ег Уа Гей Тіт Сп Рго Рго зег Уа! 5ег Су Аа Рго сіІу Оп 1 5 10 15
Агре УаЇ Тиг Пе ет. Суз Тиг ет 5ет 5егбег Ар Пе СХ Аа Су сп су Ма! Ні Тгр ТугбІп сп Ге Рго 5ІХ Тиг Аа Рго ГухТей
Іеи Пе біш су Туг ТугАвп Аге Рго 5ег су Маї Рго Авр Аге Ре бег Су бег Цу5 бег СОІУ Та бег Аа 5ег Ге и Таг Пе Тиг Оу ем 65 Мо, 75 80
Гей РгоСбіц Азр Сі Су Авр Туг Туг Су іп бет Тгр.Абр Оу ТНг 85 90 95
Гей 5ег Аа Гец Ре бу су СОІУ Тиг Гу Гец Тег Ма Те Су 100 105 по «2105». 8 «2115 111 «212» Білок «213» Ното зарієпе «40025 8 сп 5ег Ма! Теи Ти Оп Рго Рго 5ег Маї 5ег-СІу Аа Рго су Оп 1 5 10 15
Аге УаїЇ Тиг Ме зег Су Тиг зег5ег 5егбег Ар Ме ОЇуУ Аа Су
Ге Оу МаїЇ Гец Тгр Тус Сп. СТп Геи Ріо Оу ТА Аа Рго Туз Гец до 45
Гец Пе а Оу Туг Туг Авп-Ате Ріо 5ег у Маї Рго Авр Аге Ре бо 5Зег Оіу Зег Гу Зег Оу Пигбег Аа бегТец Тит Пе Тис оїЇу ей 65 70 75 80
Іем Рго ОЇц Ар бі Оу Ар Туг Туг Су Оп 5ег Тгр Ар Оу ТЕГ 85 90 95
Іей 5ег Аа Іеи Рне су СХ СОІУ Тнг уз Ге Тег Ма Те Оу 100 105 110
«2105 95 «2115 11 «2175 Білок «213» Ното заріепе5 «400» 9
Сп 5Зег Уа! Ген Таг Сп Рго Рго 5ег Уа Хег Оу Аа Рго соїу біІп 1 5 10 15
Ате Маї ТАг Пе Зег Суб Ти 5егЗег бег5ег Авр Ме Оу Аа Су
Геш су Маї Гец Тер Туг біт Оп би Ріо Су Тиг Ага Рго Тув Те
Гец Пес Су Туг Туг Ап: Аге Рго 5ег су Ма! Рго-Авр.Аге Ре бо 5ег Оу зет Гу зег Оу Тигоег Аа 5ег Те ТНг Пе Тг Оу ей 65 70 75 80
Геш Рго си Ар БІ Оу Ар Туг Тук Су біп 5ег Туг Ар Оу ТАг 85 90 95
Гей 5ег Аа Гец Ре бу су СОІУ Тиг Гу Гец Тег Ма Те Су 100 105 110 «2105 10 «211» 111 «212». Білок «2135 Ното заріепе «40025 10 біпбегУа! Гей Тиг біп Рго Рго зег Узі 5ег СОІУ Аа Рго СОІУ Оп 1 5 10 15
Агре УаЇ Тиг Пе бет Суз Тиг бег 5ег 5ег5ет Ар Ме Сіу Аа Сіу
Їеи Оу Маї Ніб Тр Туг ста сп Тем Рго Су ТАт Аа Рго Ту Те
Гец Пе Оу Туг Туг Авп-Ате Ріо 5ег у Маї Рго Авр Аге Рре бо бег Су бег Цу5 бег ОЇу Тиг Зег Аа 5ег Ге и Тиг Пе Тіг Оу Ге 65 7 75 80
Гец Рго ОЇ ц Ар Си С1у Ар Туг Туг Суб Сп Зег Рпе А5р.ОЇу Тег 85 90 95
Іей 5ег Аа Гей Ре су СХ Су Тнг ув Те Тег Маї їец Су 100 105 по «2105 11 «2115 ЦІ «212» Білок «2135. Ното 5аріє п5
БА сп 5егУаіЇ Гей Тк 9Ги Рго Рго 5ег Уаї 5ег С1у Аа Рго су сп 1 5 10 15
Ате Маї ТАг Пе Зег Суб Ти 5егЗег бег5ег Ар Ме Оу Аа Аа
БІВ)
ІГеи Су Маї Ні5 Тгр Туг СІп.біп Ген Ро Су ТАг Аа Рго Іу5 Геи
НІ) 45
Гепй Пе си бу Тук Туг Абп Аге Ро бег Оу Уаї Рго Абр Аге Ре бо 5ег Оу 5ег Гу бег Оу Тиг5ег Аа ет Гец Тиг Пе Тег Оу Гей 65 7 75 80
Ге Рго Сбіц Ар бін бу Авр Туг Туг Сув Оп бег Туг Авр. Су ТВг 85 90 95
Іеч 5ег Аа Ге Рре су су Оу Тиг Туз Тео Тег Уа Гец су 100 105 по «210512 «211» 111 «2125 Білок «213» Ното заріепе5 «4005 12
ОЇп 5ег Уа Гей Тіт Сп Рго Рго зег Уа! 5ег Су Аа Рго сіІу Оп 1 5 10 15
Агре УаЇ Тиг Пе бет Суз Тиг бег 5ег 5ег5ет Ар Ме Сіу Аа Сіу б5ег БіІу Маї, Ні Тгр-Туг Оп бій Ге Ріо бу ТАг Ага Рго Гу Гей
Іеи Пе бі су Туг Туг Абп. АгеРго бег су Маї Рго Ар. Аге РНе бег Су бег Цу5 бег СОІУ Та бег Аа 5ег Ге и Таг Пе Тиг Оу ем 65 7 75 80 цей Рго-СІш Абр.СІш Су Ар Тут Туг Суб Сп Зег Туг Азр.ОІХ Тв г 85 90 95
Гей 5ег Аа Гец Ре бу су СОІУ Тиг Гу Гец Тег Ма Те Су 100 105 ло «2105 13 «2115 111 «212» Білок «213» Ното зарієпе «40025 13 сп 5ег Ма! Теи Ти Оп Рго Рго 5ег Маї 5ег-СІу Аа Рго су Оп 1 5 10 15
Аге УаїЇ Тиг Ше зег Су Тиг Зегбегег бет Ар. Пе СОІУ Аа су;
СіІп СІу Маї Ні Тгр Туг бІп. біп. Гей Рго Су Тиг АГа Рго Туз ей до 45
Гец Пе а СОІУ Тук Туг Авп Аге Рго бег су Маї Рго Ар Аг Ре бо 5Зег Оіу Зег Гу Зег Оу Пигбег Аа бегТец Тит Пе Тис оїЇу ей 65 70 75 80
Гей РгоаЇш Ар БІШ-ОЇуУ Авр Туг Туг Суб біІп.5ег Туг А5р. ОМ Тег 85 90 95
Іей 5ег Аа Іеи Рне су СХ СОІУ Тнг уз Ге Тег Ма Те Оу 100 105 110
«210» 14 -2115 111 «2175 Білок «213» Ното заріепе5 «220» «2212 Хаа «222» (32).432) «2235» сабод «220» «2215 Хаа «2225 133)..(33) «223» | або 5, або 0 «9205 «221» Хаа «227» (36). 36) «223» Набої1ї «220» «221» Хаа «227» (193)..193) «2235 М або Е, або
«АОО» 14
Сп 5ег Уа! Геи Тиг Сп Рго Рго 5ег Маї 5ег Оу Аа Рго Су бій 1 5 10 15
Аге Маї Тіг Пе зег Су Тит 5ег 5ег 5ег5ег Ар Пе Оу Лів Хаа
Хаа су Ма! Хаа Тгр Туг біп Сп Те Рго біІу Тит Аа Рго Гу Те
Геч Пе біг Оу Тук Туг Ап. Ага Ріо бег су Маї Рго Ар. Аге Ре 216) бБегОоїу 5ег Гу вет бу Тг5етг Аа зегТеи ТНг Пе ТНг оЇуУ Сеи 65 70 75 80
Гей Рго см Азр.С1и Оу Ар Туг Туг Сух біп 5ег.Хаа Ар Су ТНг 85 90 95 бо
Геи 5ег Аа їец Рпе Су СбІу Су ТНг СузТеи Твг Уа Гец Оу 100 105 10 «210» 15 «211» 10 «212» Білок «213». Ното заріеп5 «400» 15
Оу ТусТвг Рее Тиг бег Туг Ар Пе Авп 1 5 10 «210» 16 «211» 10 «212». Білок «213»: Ното заріепе «400516
Тер Тец Аза Ріо Депп 5ег Оу Аби Ти ої у
1 5 10 «2105 17 -2115 10 «212» Білок «213» Ното зарієп5 «4005 17
См Ма! Рго ОЇи Тпг Аа Аа Ре Сім Туг 1 5 10 «2105. 18 «211» 14 «217» Білок «213». Ното зарієп5 «400». 18
Тег 5ег 5егбег 5ег Ар Пе бі Аа СОІУ Теш сім Маї Ні 1 5 10
-2115 7 «2175 Білок «213» Ното заріепе5 «4005 15
Оу Туг Туг Авп Аге Рго 5ег 1 5 «210» 20 «211510 «2125 Білок «2135. Ното 5аріепь «400» 20
Оп. 5ег Туг Ар Оу ТигІец бег Аа Те 1 5 10 «210521 «2115 10 -2125 Білок
«213» Ното:заріепе «ОО» 21
Тер Гец Авп Ріо Авп 5ег ОЇУ Туг Тк Бу 1 5 10 «2105 22 -2115 10 «212» Білок «213» Ното зарієпе «00» 22 сп 5ег Тр. Авр сіу ТАгІеи бег Аа Гей 1 5 10 «2105. 23 «211» 14 «212» Білок «213». Ното 5арієепе «4005. 23
Твгезег5зегзет зег Аєр Це су Аа Аа ец Су Маї Ні 1 5 10 «210» 24 «2115 145 «2125 Білок «213» Ното заріепе5 «400» 24
Твг5ег5ег бег 5егА5р. Пе СОІУ Аа ОІуУ 5ег Оу Маї Ні 1 5 10 «210» 25 «2115 14 «212» Білок «213». Ното зарієп5 «000» 25
Тиг 5етг 5ег бег 5ег Ар Пе Су Аа ОЇ Сп су Ма! Ні 1 5 10
«210» 26 «2115 14 «212» Білок «213». Ното зарієп5 «8005 26
Твг бег бег бег 5ег Ар Пе Сі Аа ОЇ Геи су Ма ей 1 5 10 «2105 27 «211» 10 «212» Білок «2135 Ното 5аріє п5 «400» 27
Чіп .5ег Ре Авр Оу ТНг Гец 5ег Ага Те 1 5 10 «2105 28
«2125» Білок «2135 Ното заріе п5 «220» «221» Хаа -2225 (8Х..(8) «223» Мабої «400» 28
Ттріецй Ап. Ріо А5п бЗег СІХ Хаа Тпг Оу 1 5 10 «2105 29 «2115 14 «212» Білок «213». Ното зарієп5 «20» «2215 Хаа «2292 (10)..010)
«223» бабод «221» Хаа «922» 111)..(11) «223» Ї або 55, або 0 «2205 «221» Хаа «922» (14).(14) «923» Набої «40025 79
Тіт 5ег 5ег зегзег Ар Пе Су Аа Хаа Хаз Су Маї Хаа 1 5 10 «2105 30 «2115 10 «212»: Білок «2135 Ното 5аріє п5 «2705
«221» Хаа «227» (3).(3) «223» ХУ або М, або г «400» 30
ОІп.5ег Хааз Ар. ОІу Тпгец бег Да тей 1 5 10 «2105 81 «211» 180 «212». Білок «2135 Ното заріепе «400» 31 ем Гуз Сіу біІп Ом Ріе:Аїа Рго 5ег Ні Сп Сп Маї Туг Аа Ро 1 5 10 15
Гец Аге Ав Ар Су Ар Гу Рго Аге Ла Ні Теч Тнг Маї Маї Агв,
ій Те Рго ТНг іп Ні Реве Гує Асп сій Ре. Рго Аіаїеи Нів Ттр
СІ Ні СІ Ш Іен оіу Тен Ага Рпе Тит ух АєтАте МеєАвп Тук ТАг бо
ДА5п Гуз Рне Тец Гец Пе Рго ОЇ и 5ег су Ар. Туг Рре Пе Тут бег 65 70 75 80
ОЇп Ма! ТНг Ре Аге Су Ме Тиг5ег СІ Су зег Си Пе Агв Ой 85 90 95
Аа СІу Аге Рго:Авп. у» Рго Авр 5ет Пе Тит Уа! маї Пе ТАг ув 100 105 по
Уа! Тит. Авр 5ег Тує Рго Сім Рго Тит Оп Геи ги Мекстіу Тг Гу 115 120 125
Зег аг Су СІн Уа! су бег А5п Тгр Ре са Рго Це Туг їви Су
130 135 140
Аа Меї РНе бегТеп сп си Сіу Ар Туз Тец Меї Ма! Азп Ма! бег 145 150 155 160
Ар Ме бегІеи Уа Ар Тук ТНг Ту Ои Ар у Тег Ре Рпе бЇу 165 10 175
Аа Рпе Гей Те 180 «210532 «211» 180 «212» Білок «213» Ното зарієпе «00» 32
Гец Гуз Оу бІп ОЇ Раеє Аа Рго бек Ніє Сів СІп Уаі Туг Аа Ро 1 5 10 15
Геч Аге АІа Ар су Абр (у5 Рго Аге Аа Ні5 Іеи Тит Маї Ма! Аге
Сбіп"ТНг Рго Тнг сп Ні Рпе (ув Ахп Сп Рре Рго Аа Те Нів Тгр до 45
СІ Ні СІ Ш Іен оіу Тен Ага Рпе Тит ух АєтАте МеєАвп Тук ТАг бо деп ух Рпе Іеи Ге Ме Рго Си 5ег Су Авр Туг Рпе Пе Тут 5ег 65 70 75 80
Сп Ма! Тег Рпе Аа бу Ме Тиг зег Оу Су 5ег ОЇм Пе. Аге Сп 85 90 95
Аа СІу Аге Рго:Авп. у» Рго Авр 5ет Пе Тит Уа! маї Пе ТАг ув 100 105 110
Уа! Таг Ар 5ег Туг Рго Си Рго Тпг бІп Гей ей Метаїу ТНг Гу 115 120 125 бек Уа! Су Сію Маг ау 5егАєп Ттр.Рпе сіл Рго Ме Туг Гец су 130 135 140
Аа Меї РНе бегТеп сп си Сіу Ар Туз Тец Меї Ма! Азп Ма! бег 145 150 155 160
Ар Ме зегІеци Ма! Ар. Туг Тег у Ом Азр у» Те Ре. Рпе су 165 172 175
АДіа Рне Геи Гей 180 «2105 33 «911» 210 «212» Білок «2135 Ното 5аріє п5
«400»: 33
Авр Туг Гуз А5р Ар Авр Авр Ту Оу 5ег Нів: Ні. Ні Ні Ні Ніб 1 5 10 15
Нів Ні Сіу бег Оу 5ег Гей Маї Рго Аге Оу бег Оу 5ег Гей ув сІуУ біп-оЇи Ре Аа Ро 5ег Ні5 С1п Оп Ма! Туг Аа Рго Тец Аг
НІ) 45
Аа Ар Оу Ар Гух Рго Агв Аа Ніз Ге Тпг Ма! Уаї Аге Сп Тег бо
Рго Тиг СбІп Ні Рбе Туз Ап. б п Рпе Рго Аа Гец Ні Тгр'"СЇи.Нівб 65 7 75 80 сішец Оу ей Аа Ріе Тпг Гуз Авп Аге Ме Азп Туг Тит Авп Ту 85 90 95
Рпе Гец Гец Пе Рго Ом бег су Ар. Туг Рпе Пе Туг бег Оп Маї 100 105 по
Тег Рне Аге Оу Меї Тиг 5ег СТИ Сух 5ег Ом Пе. Аге Сп Аа Су 115 120 125
Аге Рго Авп ув Рго Авр.5ег Пе Тк Ма! Ма! Пе Тиг Гуз Ма! Тит 130 135 140 дер заг Туг Рго си Рго Піг бій Ген Те Мет Оу Тпг Гу 5ег Маї 145 150 155 160
Су ОЇи Ма! су бег Азп Тгтр Ре Сп Рго Пе Туг ем су Аа Меї 1655 170 175
Ріе бегІГеш біп сім сі Авр Гуз Іеи Ме Ма! Авп Ма! ет Абр Пе 180 185 190
5егІеми Маї Ар. Туг Тиг Туз Си Авр. ух. ТАг Ре РКе сіу Аа Рне 195 200 205
Гец Ге 210 «2105 за -2115 180 «212» Білок «213» Масаса ТахсісцІагіє «400» 34
Гемч Гуз су Сп си Ре: Ага Рго бег Нів Оп. Сп Маї Туг Аа Ріо 1 5 10 15
ГецАге Аа Ар СОІУ Ар Гу Рго Аг Аіа Ніз Тем ТНг Маї Ма! Аге
Оп. Тв Рго Тпг оп Ні Гей Гу5 Ап Сбіп Рпе Рго Аа Ге Ні Тгр
Нв) 45 сш Ніх сш Тец су Тен АГа Рпе Тег Туз Авп Ате Мет Азп Туг ТАг бо
Авп ух Рпе Ге Тен Пе Рго Ти бег 1у Ар Туг Рпе Ма! Туг5ег 65 70 75 80 біп Ма! Тег Рпе Ага біу МеєТНг зег бі Су 5ет СІи Пе Ага Оп 85 90 95
Аа сіу Аге РгоАвп ух Рго Ар Зег Пе Тпг Ма! Уа! Пе Тис Гуз 100 105 110
Уа! Тиг А5р бетг Туг Рго Сім Рго Тиг Оп Ге Те Мессі Тиг Гу 115 120 125 бег Уа! Сув Є Ма! су бег Ап Ттр. Ріе СІп Рго Пе Тугіец Су 130 135 140
Аа Меї Ріє 5егей біп СІ Су Ар Ту Теми Меї Уа! Авгі МаїЇ 5ег 145 150 155 160
Авр Ме бег Тец Маї Ар. Туг ТАг Цу5 и АбрТух Таг Ре Ре су 165 17 175
Аа Рпе Ген Ге 180 «2105 35 «211» 180 «212» Білок «2135 Ми тихси 5 «400» 35
Гец Аге Аа Пе Тиг ОЇ Обід Аге 5ег Сі Рго бег Ро сп сп Маї 1 5 10 15
Туг5ет Рго Рго Аге Су Гу Рго Аге Аа Ні Іги Тит Пе Ту Лув
Сп ТАг Рго Аа Рго Ні5 Гец Гуз Ап ОіІп.Гец Зег АІа Тец Ні Ттр
Сни Ні Азрїєци Оу Меє Аа Ре Тс Гуз Азп СОІУ Мет ух Туг Пе бо
Авп Гуз бег Те Маї Пе Рго Сїш бегОЇу Авр Туг Ре Пе Туг5ег 65 7 75 80 оп Пе Тиг Ре Аге Су Тис Тег бек Маї Суб Оу Ар Пе бег Агро 85 90 95
Оу Аге Аге Рго Авпо ух Рго Ар зег Пе Тбг Меї Ма! Пе Твг Гу 100 105 110
Уаї Аа Ар. 5ег Туг Рго Сім Рго Аа АгрТецч ги Тег Су бег Гу 115 120 125
5ег Маї Суз Он Пе 5ег Авп.Азп Тр Рпе бій 5ег Теми Туг Гей сіу 130 135 140
Аа Тих Рне бетгТеи ОЇ сю Су Ар. Аге ей МесМаї Ап Уа! бег 145 150 155 160
Авр Ме бег Тец Маї Ар. Туг ТАг Цу5 и АбрТух Таг Ре Ре су 165 17 175
Аа Ре еп Гец 180 «210536 «2115. 180 «212» Білок «213»: Кациз5 погуерісци5 «4005 36
РпеРго Так Уа! Тк си сін Аге бет Аа Рго.бег Аа Сп Рго Маї 1 5 10 15
ТугТне Рго бег Аге Авр Туз Рго- Туз Аа Ні Геу Тнг Пе Ме Аге
Сп ТАг Рго Ма! Рго Ні5 Гец Гуз Азп си еп Аа АІа Тец Ні5 Ттр до 45
Он Ап Ап Те су Мет Аа Ре Тпг Гу Ап Аге МесАєхп Туг ТАг
Ге.0)
Азп Гуз Ріє ей Ма! Пе Рго- Сім бег Сім Ар Туг Ре Ме Тугбег 65. 70 75 80 сп Пе Те Рве Аге Су Ти Ти г бег Сім Суб СІу Азр Ме бег Аге 85 90 95 уаГгАге Аге Рго ув ув Рго Азр 5ег Пе Тиг Маї Уа! Пе Тит Гу
100 105 по
Уаї АІа А5р.5ег Туг Рго См Рго Аа Ні Ге їеи Тиг Оу ТАг Су 115 120 125 5ег Уа! Суб Ом Ме бег ет Авп Тгр.Ріе СІп Рго Ме Тугіги бу 130 135 140
Аа Мес Ріе 5етг Геш'сІй си Оу Ар Ага Теи Ме Ма! Асп Уа! 5ег 145 150 155 160
Аер Пе бег ІвиМаї Ар. Туг Тит Туз С1и Ар Ту Тит Рбе Рне Оу 165 10 175
Аа Ріє Геш Пе 180 «2105 37 -2115 179
«212» Білок -2135 Сауїа рогсеПи5 «005 37
Пе Азп- Сім Сп. Аге; Ре Оу Рго бег Туг Оп Аге Маї Туг Тиг Рго 1 5 10 15
Гец Аге Авр Авр Аге Ар ух Рго Аге Аа Ні Гей Тіг МаїМаї Аге
Оп Твг Ро Тис ов Ні Гей Гу Ап Оп Ре Рго Аа Ге Нів Тгр
Сни Ніх біпец сїу ецч Аа Ре ТАг Гу Ап Аге Ме Азп Туг ТА г бо
Азп Гуз Ріє ей Ма! Це Рго- сін Тпг Оу Ар Туг Рне Маї Тугбег 65 7 75 80
Оп Пе ТА Ре Ате біу Тпг Тпгбег Он Суб Су Пе бет Рго Оу 85 90 95
Агев ОІп.оІп Авп о Губ Рго Аєр 5ег Пе Рпе Маї Ма! Пе Тиг Ту Ма 100 105 по
Тиг А5р Зег Туг Рго бій Ргобег Сп Ге ем Ти со Тс Гуз ет 115 120 125
Уа Су ОЇ Пе зЗегб5ег Ап Тр Ре СбІп Ріо їец Тугіви Су Ага 130 135 140
МесРне бегІеиц бій Січ СІу Ар Гуз Іги Меї Уа Азп ма! бег Ар 145 150 155 1650
ПебетгІец Уа! Ар Туг Тиг Гу СІ Ар у5 Тнг Рре Рпе Сіу Аа 165 10 175
Рне Іеи Гей
«2105 38 -21ї5 180 «212 Білок «2135 геїї5 сагив. «4005 38
Рго- Гуз СІу Аге бу. Рпе су Рго 5ег Ні Сп. Аге Аа Тут Тг5ег 1 5 10 15
Рго Су Аа Су сіу Ар ув Рго Аге: Аа Ніє Геи ТБг Маї Ма! Аге
Оп Твг Рго Тпг сп Рго Тец ух Ап біІп Ре Рго Аа Гец Ні Ітр о(ш-Нів си Гец Оу ен Ага Рпе Пе І уз-Авп о Аге Меї Авп Туг ТАг 50
Авп Гуз РпеТей Ма! Пе Рго сім 5ег ау Авр. Туг Рпе Маї Тугбет 65 7 75 80
Сбіп Ма! Тег РНе Аге бу Тит Тиг зег ОЇи Сух О1У ОЇю Пе Аге сп 85 90 95
Оіу бег Атгв Ів Авп ух Рго Ар 5ег Пе Пе МУаї Уаї Пе Тег Гуз 100 105 по ма! Тк Ар 5егТує Рго о Рго Тг ЗІп ГепТей Мету ТНг Гу 115 120 125 5Зег Уа! Су Сім Ма! бу 5ег Азп Тгтр.РПе Сп Рго-Пе ТугІец сіу 130 135 140
Аіа МеєРне бегІеи біІп Сім Су Авр Іув ем Ме Ма! Азп Ма! бег 145 150 155 160
Ар Пе бег Геи МаГАвр Туг ТАг Ту ОЇ Ар Ту Тв Рее Ре Оу 165 17 175
Аа Рпе Ген Ге 180 «2105 39 -2115 180 «212» Білок «2135 5и5 5сгота «400» 39
Рго Гуз бу сп си Тец сім Рго 5ег Ні5 СІп Аге Ма! Туг Аа Рго 1 5 10 15
Рго.Сс1Іу Аа о1у Аге Азр Гу РееАге Аа Ні Тец Те Маї Ма! Аге
Оп. ТАг зег ТНг би Рго їГец Гу Азп Оп РБе Рго Аа Генч Ні» Тгр
Нв) 45 сш Ніх сш Тец су Тен АГа Рпе Тег Туз Авп Ате Мет Азп Туг ТАг бо
Абп ух Рпе Ге Маї Пе Рго Со бег бу Ар Туг Рпе Ме Туг 5ег 65 70 75 80 біІп'"Ма| Таг Рпе Аге бу Тит Тигбег ОЇи Суб Оу Оу Ме зег оп 85 90 95
СІш Аге Аг ей Абп Гу Ро Авро5ет Пе Пе Ма! Уа! Це ТНг у 100 105 110
Уа! Тиг А5р бетг Туг Рго Сім Рго Тиг Оп Ге Те Мессі Тиг Гу 115 120 125 5ег Уа! Суз Сім Пе су бег.Ахп Тгр Рбе сп Рго Ме Туг Тем Оу 130 135 140
Аа Мех Ре Зег Гей Ні5 СЇи Су Ар Гу5 Ге Мет Узі Азп Ма! бег 145 150 155 160
Авр Ме бег Тец Маї Ар. Туг ТАг Цу5 и АбрТух Таг Ре Ре су 165 170 175
Аа Рпе Ген Ге 180 «2105 40 «211» 179 «212» Білок «213» Огусіоїавив сипісц й «400» 40
Гец Гуз су Аге си Рпе су Рго5ег ОІй бІп'Аге Аа Туг Ме Рго 1 5 10 15
Ге Аге АІз Ар. Су Абп Гуз Рго Аге Аа Ні Те Тг Аа Ма! Ту
Ов Твг Рго Тіг біпоРго Гец Ага Абп Ніє Рпе Рго. Аа Тез Ні Тр до 45
Си Ні СОЇ Те Оу ви Аа Ре Трг Туз Авп. Ате Мет Авп ТугТНг бо
Авп ух Рпе Геци Маї Пе Рго Сію 5ег бу Ар Туг Рпе МаїЇ Тук ег 65 7 75 80
Зп Ма! Тие Ре. Аге Оу Твг Тигбег ОТи Сух ОЇ Ма! Пе Авп Сп 85 90 95
АгеЕ Аг Аге Оп ТА Ту Рго Ар 5ет Пе Маї Ма! Ма! Пе ТАг. Гу 100 105 110
Уа! ТНг Ар. АзпТуг Рго бі Рго Ага СІп Гец Те ТО Су Тог Ту 115 120 125
5ег Уаі-Сувз- сш Мекоїу Авп Ттр.Рібе Сп Рго Це ТугІец Оу Ага 130 135 10
Ме Рне бегТец ОЇ Сі Оу Ар Гу Теги Ме Ма! Азп Ма! бег Ар 145 150 155 160
Уа бег Гец УаїЇ Ахр Туг ТпгГу5 Ом Азр Гу5 Тиг о Рпе Рпе Су Аа 165 17 175
Рре Ігипеи «210» 41 «2115. 180 «212» Білок «2135 Сапів Татліайв «4005 41
Рто Гуз Су бій о и Рпе Су Ні 5ег Ніб Оп Аге Ага Туг Аа 5ег 1 5 10 15
Рго Аге Ага О1у СОІУ Авр Ту5 Рг Аге Аа Ніб Тен Тпг Маї Уаї Ате
Сп 5ег Рго ТНг біп Рго Ге бід 5егіей РНе Рго АІатеи Ні Тгр
ОЇ Ні ом Ге бу Теи Ага Рне-ТНк Гу Ап Аге Мек Ап Туг Тег
Ге.0)
Азп Гуз Ріє ей Ма! Пе Рго- Сім бег Сім Ар Туг Ре Ма! Тугбег 65. 7 75 80
Зп Ма Тие Рпе Аге Су Тиг Тиг его Сух Оу Он Аа Ага Оп 85 90 95
Су Зег Аг Те Авп у Рго Ар 5ег Пе Пе МаїЇ Ма! Пе Тнг Гу
100 105 110
Уаї Тиг А5р.5ег Тут Рго біш Рго Тиг специ ей Мекоїу ТНг ув 115 120 125 5ег Уа! Сує Сім Уаі Су зег Ап Тгр. Ре біІп Рго Пе Тугі еп. су 130 135 140
Аа Меє РНе 5ет Гей сп сої Оу: Ар Туз Їеи Меї Ма! Азп Ма! бег 145 150 155 160
А5р Пе бег ГгиМаї Ар. Тут Тиг ув о Ар ух Тк Рвбе Ріє су 165 170 175
Аа Рне Гец ей 180 «2105 45 -2115 330
«212» Білок «2135 Ното 5аріеп5 «4005 42
Аа бег ТАг Гу Су Ргобег Ма)! Ре Ргоїеиц Аа Рго бХег5егІ ув 1 5 10 15 бег ТВгбег СОІУ Оу Тег Аа АЇз Гей Оу Суб Гец Ма! Гу Ар Туг
Рне Рго ОЇ Рго УаїЇ Тит Маї бег Тгр. Ап 5ег Су Аа Гей ТА бег
Су Маї Ніх Тпг Ре Рго Аа Маї Геи біп 5егзегОоЇу Іеци Тугбег бо
Гей 5егЗег Уа! Ма Тиг Маї Рго бег 5ег зег І еи С1у Тнт ап Тег 65 7 75 80
Туг Пе Су Ахп Уві Аєп Ні Гу5 Рго Зет Доп. Те Гуз Уа! Авр ув 85 90 95
Гув Маг сїц Рго ув 5ег Сув Ар. Гуз Ти Ні Тиг Су Р о Рго Суб 100 105 по
Рго- Аа Ро Січ Гец Те Оу бу Рго бег Уаї Ре їГеи Ре Рго Рго: 115 120 125
Гуз Рго (у Ар Те Геци Ме Пе 5егАгеТАг Рго би МаЇ ТНг Су 130 135 140
Уа! Ма! Ма! Аєр Ма! бег Ніз ОЇш Ар Рго Зм Маї ух Ре Ап Ттр 145 150 155 160
Туг Ма! Ар су Маї См Маї Ніз Ап Аа Гу Тит Гу Рго. Аге ОЇ Ч 165 170 175 и сіп ТугАвп 5ег Тиг Туг Аге Маї Уа Зег Ма! Геш Тит а! Ге
180 185 190
Ні Оп Авр Тер Ге Абп Оу (у5 бі Туг бу Су Гуз МаїЇ Зег Ав 195 200 205
Гуз АІа ец Рго Аа Рго Ме Си Гух ТНт Це 5ег Туз Аа (ух Оу 210 215 220
Оп. Рго Аге Си Рго ОГа Ма! Туг Тег Ге Рго Рго зег Аге Ар ОЇ 225 230 235 240
Геч Так Гуз Авп. сп Ма! 5ег бе ТпгСуєтТеи МаїЇ Гу СТУ Рпе Туг 245 250 255
Рго 5ег Ар. Пе Аа Уаі СТИ Тгр-ОЇ и Зег Ап Оу Сп. Рго ОЇ и Ап 260 265 270
Авп Туг Гу ТАг Тог Рго Рго Ма! Тец Ар 5ег А5р Оу 5ег Рпе Ре 275 280 285
Іеи Туг5ег Гуз Геи Тиг Ма! Ар Гу 5ег Аге Ттр біп сп бу Ап 290 295 з
Чаї Рпе 5ег Сув 5ег Ма! Мей Ні: Аа Те Ні Авп Ні Тут ТНг 305 310 315 320 біп'ух бегіги бегігєгци 5ег Ро Оу Гу 325 330 «2105 43 «2115. 329 «217» Білок «213». Ното зарієп5 «ДО». 43
Аа 5ег ТНг Гуз ОЇу Рго беї Ма! Ріе РгоїТей Аа Рго бег5ег Гуз 1 5 10 15
5ег Пт 5ег біу Оу ТАг Аа Аа Ге су Су Тецй Маї Гу Ар. Туг 20: 25 з0
Рне Рго си Рго Маї Тит Ма! 5ег Тгр Авп:5ег.ОЇу Да Те ТНі 5ет
Оу Уа! Ні5 Тиг Рпе Рго АГа"а!Ї Гец Сп 5ег бег Оу Геч Тут бег 60
Гецбегзег Ма! Ма! Тит Маї Рго бег ЗегзегІец СіІу Тиг Сп ТВг 65 70 75 80
Туг ШПе-Сув Азп.УаЇ Ап. Ні 1у5 Рго зег Ап Тит Гуз Уа! Ар Гув 85 90 95
Гу5 Маї сін Рго Ту5.5ег Су Аєр Гу Пт Ні Тиг Суз Рюю Рго Суб 100 105 110
Рго Аа Рю сш Те Іец бу Оу Рго-бег Уаі Ріе Теи Ріе Рго Рго
115 120 125 ув Рго Гу Ар Тиг Теи Мех Пе бег Аге Тиг Рго сЇш Ма! ТигСує 130 135 140
Ууаї Ма! Уа Ар. Уа! бег Ні СОЇ Ар Рго Ой Ма! Гуз РНе- Ап Тгр 145 150 155 160
Туг УаЇ Азр СІу Ма! сін Маї Ніх Авп Аа Гу Тит Гу Рго Аге Ой 165 17 175
Сі Сп Туг Азп бег Тнг Туг Аге Ма! Ма! бег Ма! Теи Тнг Ма! Те 180 185 190
Ні сп. Ар ТгрТец Ахп СІ1уУ Гу бін Туг Гу Су Гу Ма! 5ег Ап 195 200 205
Гуз Аа Гей Рго Аа Рго Ме: Си Гу Тит Пе 5ег Гу Аа Гуз Су 210 215 220 сп Рго Аге ОЇ Рго Сп Маї Тут ТАг Ген Рго Рго 5ег Аге Авр оч 225 230 235 240
Гей Тпг ув. Азп сп Уа 5ег Ге Тіг Суб Ге Уа! Гу 01 Ре Туг 245 250 255
Рго 5ег Ар Пе Аа Маі си Тгр.ОЇи Зег Абп су сп. Рго Ом Авп 260 265 270
Абп Туг Гуз Тбг Таг Рго Рго а! Гей Азр бег Ар Оу 5ег Рпе Ре 275 280 285
Гец Туг5ег Гуз Тео Тиг Ма! Ар Сух бег Аге Тгр ап біп Оу Аби 2930 295 з00
Уаї Рне 5ег Су 5ег Ма! Мей Ні СІ Аїа Ге и Ні Авп Ні Туг ТВг 305 310 315 320
СІп Гуз зегІец 5Зегівц 5ег Ро Су «210» 44 «211» 330 «2125 Білок «213» Ното заріепе5 «400» 44
Аа бег ТНг Ту СІУ Рго 5ег Маї Рре РгоТец Аа Рго зегбег Гу 1 5 10 15 5ег Тіг 5ег СІу Сіу ТАг АІаАа Геи СІу Суз Те и Маї Гуз Ар Туг
Ре Рго сш. Рго Уа! Тіт Ма! бег Тгр Ап бег Су Аа ем Тиг бетг
Су Ма! Ні5 Тег Рре Рго Аа Маї Гей Сп 5ег 5ег Оу Тен Тугбег бо
Геи бег5ег Уа Маї Тиг Уа! Рго 5ег Зег ет Те Оу ТНг Сп ТНг 65 7 75 80
Туг Пе Сух Аза Маї Авп Ні 1у5.Рго Зег Аби Піг Гу ма! Абр Гу 85 90 95
Гуз Ма! сій Рго ув бег Суз Абр-Гух ТНг Ні Тит Сує Ріо Рго Сувз 100 105 110
Рго Аа Ріо ОЇи Гей Те бу Оу Рго-5ег Ма) Ре Теи Рпе Рго Рго 115 120 125
Гуз Рго (у Ар Тг Ге Туг Це Тег Аге ОЇ и Рго ОЇ маї Тиг Су 130 135 140
Уа Уа! Уа! Азр Ма 5ег Ніз ОЇи Ар Рго ОЇ Ма! Гу Ре Азп Тгр 145 150 155 160
Туг ХаІ "Ар БІ; Маг ої Маї Ні Азп Аа Гуз ТАг ух Рго Аге бІШ 165 170 175
ОІш біп Туг Азп 5ег Тпг Туг Аге Маї Ма Хек Ма! (сп Тиг Уа! Тец 180 185 190
Ні: сСіп Абр Тгр Те Абпо Оу Гуз бі Туг Гу Су Ту5 МаїЇ бет Ап 195 200 205
Гуз АІа ец Рго Аа Рго Ме Си Гух ТНт Це 5ег Туз Аа (ух Оу 210 215 220
Оп. Рго Аге Си Рго Оп Уаї ТуєТигеш Рго Рго бег Аге Ар: ОЇ 225 230 235 240
Гей Тиг ув Азп Сп Уаї 5ег Гец Таг Суб Тен Ма! Гуз Су. Ріе Туг 245 250 255
Рго зег Ар Пе А!в Уа! ОЇ Тгр. Оу бег Ахп ОЇ сп Рюю Си Ап 260 265 270
Авп Туг Гуз Тпг Твг Рго Рго Уа Теи Ар 5ег Ар бу 5ег Рпе Ре 275 280 285
Гец Туг бег Туз Гец Тиг Ма! Авр Гуз бег Аге Тгр бій Сп Сіу Авп 290 295 з
Уа Рбе баг Сує ет Чаї Меї Ніх Сім АІаїей Ніх Авп Ні Туг ТАтг 305 310 315 320 біп'ух бегіги бегігєгци 5ег Ро Оу Гу 325 330 «210545 «2115 327 «212» Білок -2135. Ноїто 5заріенпь
«АОО» 45
Аа бег Тіг цу Бу Рго 5ег Уа! Ріе Рго Гей Аа Рго Су бег Аге 1 5 10 15 5ег Тпг 5ег См 5ег ТНг Аа Аа Гец Оу Су Ге и Маї Гу Ар Туг
Рнпе Рго Сн Рго Уа! Тиг Уа! бег Тгр А5п 5ег бу Аа Ге Тпг бег су Маї. Ні Тпг Рпе-Рго Авіа Ма Геш сп 5ег 5ег Оу Гец Туг5ег
БО
Гей бегзег Ма! Маї Тит Уаї Рго 5ег Зег зегТец СІу Ти г Су5 ТНг 65 70 75 во
ТугТНг Су Авп Ма! Ар Ні Гу Рго зег Ап ТЕг (ух Ма! Ар Ту 85 90 95
Аге Ма! січ 5ег Гу Туг Оу Рго Рго Суб. Рго Рго Суб Рго Аа Рго 100 105 по біш Рне Гей бу су Рго.5ег Ма! Рне Тец Ріе Рго Рго Гу Рго Гух 115 120 125
Авр ТигГеци МекіІе бег Ага ТНг Рго бі Маї Тнг Суз УаїЇ Ма! Маї 130 135 140
Ар МаїЇ бег СІп си Ар Рго ОЇ Ма! сп. Ре Авп Тгр. Туг МаїЇ Ар 145 150 155 160
Оу Ма! сі ма! Ніє Ази Аа Гу ТНг Гуз Рго Аге См СІ Сп Ре 165 1 175
Авп бег Тпг Туг Аго УаїЇ Маї бег Ма Те ци Тк Маї Ге Ніє біп Авр 180 185 190
Тер ге Азп бу Гу Со Туг у Су Ту Ма! 5ег-Авп Ту Оу Тей 195 200 205
Рго 5ег бег Пе Ом Гуз ТАг Пе Зег Ту5 Аа Гу5 Оу Сп Рго Аге 21а 215 220
Сн Рго бій Уа! Туг Тиг Тени Рго Рго 5ег сп Сім Си Меє Тег ув 225 230 235 Рв)
Авп Сп Уа! бегТец Тнг Суз Те Маї Гу с1у РЕе Туг Ргозег Ар 245 250 255
Пе Ага Маї Си Тгр ОЇи 5ет Абп- Оу Оп. Рго бі и Ап Ап Туг Гу 260 265 270
Тс ТагоРго Рго ма! Тен Ар бет Ар. Сіу беї Ре РНе Геи ТугЗег 275 280 285
Аге Тед ТНг Уві Аєр Ту 5ег Аге Гр ОЇп Он Су Ази Уаї Ре 5ег 290 295 Зо
Суєбег Уа! Меї Ні СІн Аа Те Ніє Ап Ні Туг Тег біп ув ет 305 з10 315 320
Гей 5ег Іги 5егіеи Су Гуз 325 «210». 46 -9115 326 «2125 Білок «213»: Ното заріепе «400» 46
Аа б5ег ТНг ух СІ Рго 5ег Ма! Рре РгоТец Аа Рго Суб зетг Аге 1 5 10 15 5ег ТНг бег би 5ег Тиг Аа Аа Геи СОІУ Су Геи Маї Гу5 Ар. Туг зо
Рпе Рго си Рго Уаї Тиг Уа! бег Тгр Ахп 5ег ОХ Ліа Гец ТАт бег до 45
Оу Ма Ні Тих Ріє Рго Аа. Маї Геи СІп.5ег бег Су ей Тугбег 50: 55 60
Іеи 5егзег Ма! Ма! ТНг Ма! Рго5ег зет 5егец Су Тит Гу Тг 65 70 75 8о
Туг ТВгсух Азп Уа! Ар Ні (ув Ро 5ег Абп ТНг Гуз Уа Авр Гу 85 90 95
Ате Ма! СІи 5ег Ту Туг СУ Рго Рго Су Рго-Рго Суб Рго Аа Рго 100 105 по си Рпе Гец сіу Оу Рго бег Ма! Рне Геш Ріє Рго Рго Гу Рго Ту 115 120 125
Ар ТигІец Меї Пе 5ег Аге Тіт Рго Сім Ма! Тег Суз Уа! Ма! Маї 130 135 150
Авр Уаї зег бІп си Ар. Рго іш Уа! Оп Рре Ап Тгр Туг Ма! Ар 145 150 155 160 сіу агоїи Маг Ніє Ап Аа Гух ТНг Ту Рго Аг Он с сп Ре 165 17 175 деп заг Тг Туг Ате Чаї Ма! бек Уа! Тем Тег Уа! Теи Ні ОТп Дер 180 185 190
Тер Гей Азп Су Гу ОЇ Туг Гу Суз Гу Маї Зег Ап Гуз Су Тей 195 200 205
Рго бег бег Іе Си (Гу ТАг Ме ет Іу5 Аа Гуз Оу біп Рго Атге 210 215 290 оц Рго біп Уаї Тує Тк Гец Рго Рго 5ег Сп СТ СТи Меє Тиг Гу 225 230 235 240
Аепо оп Уа! 5ег Гей Тиг Суб ТГеци Маї Гу су пе Туг Рго бегАв5р 245 250 255
Пе Аа Уа! Сію Тгр-ОЇибег Ап. ОІу Оп Рго и Ап Ав Туг Гуз 260 265 270
Твг Те Рго Рго Уаї Ге Ар 5ег Ар. Су 5ег Рпе РНе Ге Туг бег 275 280 285
Агр ей Тіг Ма! Ар Гуз 5ег Аге Тр Сп Сі Оу Ап Маї Ре бег 290 295 з
Сув 5ег Ма! Ме Ніх Си Ага Те Ніє Авп Ні Ту Ти Оп Гуз бег 305 310 315 320 ей 5егієеи Зег ей Оу
«2105 47 «2115 827 «212» Білок «213» Ното зарієпе «00» 47
Аа 5ег Таг Гу СІУ Рго 5ег Уа! Рпе РгоТец Аа Рго Су зег Аге 1 5 10 15 5ег Тпг 5ег См 5ег ТНг Аа Аа Геи С1у Су Тец Маї Гу Ар. Туг
Рнпе Рго см Рго Уа! Тиг Уа! бег Тгр Ап 5ег Бім Аа Те Тнг бег су Маї Ні Тиг Рре Рго Аа Уа Іеи Сп 5ег5ег су їеи Туг5ег 50
Ген 5ег5ег Уа! Маї ТНг Уа! Рго 5ег Зет 5ет Гец ОЇу ТНг Гу ТАг 65 7 75 80
Туг Таг Су Авп Уаїі Ар Ні Гу5 Ро 5ег Ап ТНг Ту Ма! Ар Ту 85 90 95
Агв Уа! ОЇ и 5ег Гу Туг ІМ Рго Рго Суз Рго Рго Су Рго Аа. Рго 100 105 по аЇи Рпе Гем біу Су Рго зег Ма! Рпе Теи Рре Рго Рго Ту Рго Гу 115 120 125
Авр ТигГец Туг Пе ТНг Аг бій Рго Си Ма!-Тиг Суз Маї Уа! Ма! 130 135 140
Азр Маї 5ег бІп Си Азр. Рго Си Ма! ОГа Ре Авп Тгр Туг Маї Азр 145 150 155 160
Оіу Уа са Маї Ніз Азп. Аа Гу ТАг Ту Рго Аге ОО 10 Оп Рве 165 1 175
Авпобег ТНг Туг Ате Ма! Уа зек УаїЇ Гец Тк Ма Пец Ні сп Аер 180 185 190
Тгр Геш Авп. Оу Гуз ОЇи Туг Гу5 Суб Суб Маї Зег Ап Туз Оу ви 195 200 205
Рго5егзег Пе Си ух ТАг Це зег (ух Ага Гуз Ох Оп Рго Аг 210 215 220 сш Рго біІп Маї Туг Тиг Гей Рго Рго 5ег сп оЇй ОЇ Меї ТП Ту 225 230 235 240
Ап сп Уа! бек Тец Ти Суб Тец Ма! Гу Су Ре Туг Рго 5ег Ар 245 250 255
Пе АІамМаї Січ Тгтр бішм 5ег.Авп Оу Сп Рго сп Ап Авп Туг Гу
260 265 270
Тиг Тиг Рго Рго Ма! Іеи Ар Зег Ар Су 5ег Ре Ре 1Теч Тугбег 275 280 285
Аге ей Тіг Уа! Азр Гуз 5ет Аге Тгр бІп сім Сіу Авп Уаі Ре 5ег 290 295 00
Сує 5ег Уа! Меї Ні Їм Аа Гец Ніх Азп Ніз Туг Тит. Оп Гу бег з05 310 315 320
Геч 5егІеи 5егІви су Ту 325 «210». 48 «211» 105 «217» Білок «213». Ното 5арієепе «4005 48
СіІй Рго Гу Аа Аа: Рго 5ет Ма! Тпг ей Рре Рго Ргобег зег сій 1 5 10 15 біштТец сп Ага Ап Ту» Ага Тигіец Маї Су Гец Ше бег А5р Ре
Туг Рго Сбіу Аа Уа! ТНг Ма! Ага Тгтр Туз Аа Ар бег бег Рго Маї
Гуз Аа су МУаї си Те Те ТАг Рго бег ув СІ по бег Ап Ази Гу 50: 55 60
Туг АІз АІа Зег зег ТугІец 5егТец ТНг Рго Сн Сп Тгр Гу зег 65 70 75 8о
Ніх Аге:бег Туг ет Су Сп Ма! Тит Ніз ОЇ 0 Оу бег Тиг Уагаїм 85 90 95
Гу5 Тв Маї діа Рго Тг си Су бег 100 105 -2105 495 «2115 357 «2125 ДНК «2135. Ното 5аріепь «400» 49 саветвсавсіввівсавістеввЕсеває вівааваавс сіввеЕвссісавіраавсіс бо
Іссівсааре сисівБага сассисассавнаваца їсаасієввсесвасаввсс 120 сосввасааєе вес рарів гасееваїфве сіраассстіа асавіввіаа сасарестає 150 всасараарс їссавревсав арісассате ассесараїс віїссассав сасарсстає 240 аїсвавєсіва всарссіває аїсігаєвасасееосрівкаєцасівівсравраваавірд 300 ссівавасев ссЕссціра єтасівввес савераассстввісассеї сісстса 357 «2105 50 -2115 333
«2125 ДНК «2135 Ното 5аріеп5 «дО» 50 сававєсеірс їгасасавос їссаїссвір (сігесеЕссс сівєвссаває авграссаїс бо авсірсаєса єсавсавсав свасаїсьса Бссрессісе всвірсасів ріаїсавсавє 120 сівссівеса ссвссоссаа всірсіраїс варвестасіасаассевсс савсввсвів 1980 "сссвассевЕ Каєсевсав саававсенсассавсявсса вссірасааєсассввссів 240 сівсссваве асраєвесва стаєтасівссававстасе асвисасосі равсвосстя 300
ПСЕВСсеЕває всассаарсі Бассвісста Бе зз3 «2105 51 «211» 357 «2125. ДНК «213»: Ното заріепе «400» 51 саврівсавсіввівЕсавіссевсеЕссвав вірваавааас ссеБЕсессіс свівааврвів БО їсстрсааве ссарсе вста сассисасс Ісстасраса їСсаасіревї Бавесавнсс 120 сосвЕссаве Босівравів раїсеесіре сіваасссса асіссеесіа сассевсіає 180
Бсссавааві Іссавреесає ввівассаїе ассессраса рріссассіс сассросіас 740 аїєраєсівї ссавссівар віссваввасассесосвіріасіайесевс савввавній /-З00 сесвавассе сірссіїсва ртасіреевс савевсассс іввірассвї ріссавс 37 «2105 52 «2115. 333 «2125 ДНК «2135. Ното 5аріепь «д0О0х 52 саваєсвівсівасасарвсс тссаїссвів (сівесвссс сіввссаває авівассаїс 60 авсівсасса єсарсавсає свасаїсвва вссеессіве Есвівсасів ріаїсарсав 120
СіЕссіреса ссессссосаа ксівсіваїсрареестастасаассввсссавсевсвів 180 сесвассері Чавсеесав сааварсвесассавсесса росірасааїсассввсств 240 сірсссвавєо асварвесва сіассасірссаравсіввв асррсасссі вавсвсосів 300
ПсреСсврвав рсассаарсі вассвісста вві 333 «2105 53 «211» 333 «2125 ДНК «213» Ното заріепе5 «4005 53 сававсвівсівасасарсс Ессайссвір ІСТеЕвсесссствессавав авірассаїс бо авсівсасса єсарсавсає свасаїсева вссесісіре есвівсасів віаїсарсав 120 сівссіввса освсссосаа Есіесіваїсвавеесіастасаассеьвоссавсевевів 180 "сссвассевЕ Каєсевсав саававсенсассавсявсса вссірасааєсассввссів 240 стесссвавєв асвавеесва стасіасівссававсівве асерсасосівавсессся /-З00
НСЕвЕсСевав есассаарсі вассвісста Вр 333 «2105 54
2115 333 -2125 ДНК «2135 Ното заріе п5 «4005 54 саваєсвівсівасасарвсс тссаїссвів (сівесвссс сіввссаває авівассаїс 60 авсівсасса єсавсавсає сгасаїсева вссевсався всвівсасів Біаїсавсав 120 сівссіврса ссесссссаа есівсісаїсвавеесіастасаассввсссарсевсвів 180 сесрассерві НПавсеесає саарарсеесассавсесса гссірасаай сассевсств 240 сібсссваєр асвавевсва сіасіасірс сававсівевасевсасосі вавсесосір 300
Певесврає всассаавсі рассвісста ве 333 «2105 55 «2115. 333 «2122: ДНК «2135 Ното 5аріє п5 «4005 55 сававрсрівсїврасасавсс їссаїссеїв ІстіеРСсессс сірвссавав автрассаїс бо авсівсасса всавсавсає сеасаїсева вссеЕссаве всвівсасів Еіаїсавсає 120 сівссівеса ссвссоссаа всірсіраїс варвестасіасаассевсс савсввсвів 1980 "сссвассевЕ Каєсевсав саававсенсассавсявсса вссірасааєсассввссів 240 сівоссваве асгарвесва стастасірссаравсідвв асевсасосі лавсвсосів /з00
Нсресеває всассаавсі вассвісста вві 333 «2105. 56 -2115» 333 «2125 ДНК «213»: Ното заріепе «4005 56 сававсвівсівасасарсс Ессайссвір ІСТеЕвсесссствессавав авірассаїс бо авсірсасса рсавсавсає свасаїсьва рссеБссісе воБІвсівіс сіаїсавсав (120 сівссіврса ссвсссосаа всі всіраїсвареестасьасаассевсс савсевсвїв 180 сосрассввії Павсересав сааваксевсассавсесса росівасаає сассрессів 240 сівсссваєв асвавресва стасіасівс сакавсівев асевсассст вавсесосів 300
ТсеВсСерає всассаарсі вассвісста ве 333 «2105 57 «211» 333 «2125 ДАК «213». Ното заріеп5 «4005 57 саварсеїрс (васасарсс тссаїссевів сТеЕвсессс стввссавав арівассагс бо авсівсасса єсавсавсає свасаїсева вссеессіве есрівсасів віаєсавсає 120
СіЕссіреса ссессссосаа ксівсіваїсрареестастасаассввсссавсевсвів 180 сесрассерві НПавсеесає саарарсеесассавсесса гссірасаай сассевсств 240 сівсссраєв асвареесва стасіасірссававснів асерсасссі равсвсеств 300
НсееСсеЕрар рсассаарсії вассвісста вер 333
«210» 58 «211» 1344 «2125 ДНК «213» Ното заріепе5 «4005 58 саввівєсавсіввівсаріс свесессвав віваававас ссевсессгс сріваавнїв бо
Хосівсааве ссавсееста сассЦсасс іссітасваса їсаасірсері ваввсарвсос 120 "сссвессаве вСсіввавте вагевесівеЕ сіраасссса асіссввсіа сассевсіас 180 вессавааві їссавресав врівассаїте ассвосваса вріссассіс сассвсстає 240 аггБавсірї ссаврссівар віссраввасассвссвівсасіайнесессавнваввїв 00 сссварассв сірссисва втасігеерс сарвесасссірвівассвї віссавсвос 360 їссассааве рсоссарсеГ еНсссссів всссссавсі ссаавіссас сарсерсвва 420 ассрссесістрвесіросії врісаасвасіасиссссе арсосвівсассвісавсівв 480 аасіссврсе оссірассіссресрівсасасснссссв ссрієсівса рієсарсввс 540 стеЕтасісссіравсісссі єрісассетв сосіссіста вссівресасссарасстає 600 асівсаасе Теаассасаа всссіссаас ассааве(ре асазадзаресвЕвавсосаар 660
Лссівєсваса арасісаса с сіріосіссс Ірссссесос ссвавсівсі серРсевасся 750
ЇссБіЕнНсСствИсссасс саарсссаав васасссіра траїсіссав расссссовав 780
Бівасствсе ТЕрІСвВієра свівісссас езевасссіваврвіваавії саасіввтає 8540 відвасерсе грраррірса саасессаар ассаавссса єрраврааса віасаасісс 900 асстассвев ІСсвіріссБі еЕсівассвіс сібсассаве асісесіваа серсаавває 960 тасаавівсса арріріссаа сааввсссїв сосессососа їСсраваавассаїсіссаає 1020 вссаавеессарссісвсва рссссаврів тасасасірс осссНссав вбасравсів 1080 ассаараасс аррвірісссї вассірісія рЕрааревсі їстассссіс свасаїсвсс 1140 вінгавівев аріссаасее ссарсссвав аасааціаса авгассасасстссосвісств 1200 васіссвасе всісснон Ісіртасісс аавсівассе їерасаавіссаввіввсає 1260 саавесаась ГР Нсіссів сіссріваїр сасрарессос їесасаасса сіасассосар 1390 аарісссіва єссірісссс сеес 1344 «2105. 59 «21 8 «2122 ДНК «213» Ното зарієпе «005 59 сававєсеірс їгасасавос їссаїссвір (сігесеЕссс сівєвссаває авграссаїс 60 авсірсаєса єсавсавсав свасаїсьса Бссрессісе всвірсасів ріаїсавсавє 120 сіБссіврса ссесссссаа есівсівас вавеестасітасаассввсссарсерсвів 180 сесгассері Нарсессар саававсерсассарсесса вссісасааі сассвессїв 240 «сівсссваве асвавеесва сіасіасісссававсівве асевсасссі вавсесссів 300
МсвесеБав есассаавсі вассвісста ввісавсоса арвссесісссавсвівасс З60 сіенссссссСаавсавсва граасіяєсар ессаасааре ссасссірві вівссіваїс 420 авсвасисї асссігевеЕсСсвівассвїе восієвааре ссратавсав сссівіваав 480 вССЕЕСвІТрЕ ааассассас ссоссіссаае сарарсааса асааагасессессавсавс 540 тассірісссівассссова всарірсаас ісссассеві сстасавсів ссаврісаса 600 сасвареєса всассрівва ааавассеїв всссосассе арієсарс 48 «2105 60 «2115 448 «212» Білок «213». Ното зарієп5 «4005. 60
Сп Ма! спец Маї Ой 5ег СІ Аа Си Ма! Гуз Ту Рго ЇХ Аа 1 5 10 15 5ег Ма Гу Ма! бег Су Ту Аа бег ОХ Туг Тит Ре Тиг 5ег Туг
Авр- Пе-деп Тр Маї Ате сіл Аа Рго Оу сп Оу Тео Тер Меє
Оу Тгтр Ге Ап Рго Авп 5ег ОЇ Туг Тит Оу Тут Аа сп Гуз Рае
БО бІп Оу Аге Ма! Тит Мех ТНг Аа Азр Аге зег ТагЗег Тіт Авіа Туг 65 70 75 8о
Мекоцец бег5ег Ге Агебег Сн Авр Тнг Аа Ма! Тут Туг Суб 85 90 95
Аа Аге Сн МаїЇ Рго си ТАг Аа Аа Рне Си Туг Тгр ОІУ ОЇ п Оу 100 105 по
ТЬгіви Маї Тиг Уа бзег5ег Аа 5ег ТНг Туз ОЇу Рго зег Ма! Ре 115 120 125
Рго ей Аа Рго бег Зег Гу бег Тит Хег СОІУ Су ТНг Аа Аа ей 130 135 140
Оу Суз Тем Маї Туз Авр. Туг Рре Рго Си Рго Ма! ТНг Ма! Зег Ттр 145 150 155 160
Авп бег СОІУ АІатеи Тиг 5ет бІх Маї Ні Те Рпе Рго Аа Уа! І ец 165 17 175
Сп 5егзег ОЇу Геп Туг ЗегТеци бегзег Ма! Ма! ТНг УаЇ Рго 5ег 180 185 190 б5ег 5ег ги Оу Тпг Сп Тпг Туг Пе Суб Ап Маї Азп Ні Су Рго 195 200 205 5ег Ап Тиг Гуз Ма! Азр ух Гуз Ма! Сім Рго Ту бет Су Ар Ту 210 215 220
ТТН Ніз Так Сух Рго Рго Су Рго Аа Рго бі ГецтТец сіу Су Рго 225 230 235 240 5Зег Уа Рпе Те Рпе Рго Рго Ту Рго Гуз Азр. Ти Теи Ме е 5ег
245 250 255
Аге ТНг Рго си Маї Тпг Сух Уа! Маї Уаї Авр Маї бЗег Ні См Авр 260 265 270
Рго си Маї Гу Ре: Авп Тер Туг Уа! Азр.ОІуУ Маї Сім Ма! Ні Аби 275 280 285
Аа Гуз Тиг Гуз Рго Аге Си Со Сп Гук Ап бег ТНг Туг Аге Маї 2930 295 з00
Уа! бег Ма! Геи Тпг Ма! Геи Ні сп Ар ТгрІец.Авп Оу Ту5 іш 305 310 315 320
Туг Гу Су (у Уаі 5ет Ахп ух Авіа Те Рго Ага Рго Пе Си Гу 325 330 335
Тег Пе 5ег ух Аа Гуз Оу. Оп Рго Аге бій Рго оп Маї Тує Тит 340 345 350
Геш Рго Рго 5ег Аге Абр СІ Тец ТАг Гу Ап Сп Ма! ЗегТец ТЕГ 355 360 365
Суз Гей Ма! Гуз Су Ре Тук Рго бег Ар Пе Аа Уа! Сім Тгр ОЇ 370 375 380 б5егАвп. Оу Оп Рго Си Ап Азп о Туг Гу ТТН ТАг Рго Рго Уа! Тем 385 з9а0 395 дой
Ар зег Ар бу 5ег Рпе Рбе Іги Туг зег уз Тен Тпг Ма А5р Ту 405 д10 415 5егАге Тгр Зп сп Оу Ап Ма! Рпе 5ег Сух ет Ма! Меє Ні СЇи 420 425 430
Аа Гецш-Нів Ап Ні Туг Тиг Сіл Туз бегіІец бегІеи Зег Рго Оу 435 до 445
«2105 51 «2115 216 «2172» Білок «213». Ното заріеп5 «400» 61
Сп 5ег Уа! Гей ТНг Сп Рго Рго бег Уа! 5ег Оу Аа Рго СОІУ Сп 1 5 10 15
АгЕ Ма! Тег Пе зег Су Тиг Зег Зег 5ег5ег А5р Пе Су Аа Су зо
Іеч СІу Ма! Ні Тгтр Туг Сп. Сп ей Рго ЗУ ТНг Аа Рго Гуз Те
Геч Пе біг Оу Тук Туг Ап. Ага Ріо бег су Маї Рго Ар. Аге Ре
БО
Зег Су бег (ув 5ег Су Тиг бег діа бег Те Тиг Пе Тит су Гей
65 7 75 во
Ген Рго біш Абр біш бу Авр Туг Туг Сув Сп бег Тгр Ар ОХ ТЕГ 85 90 95
Гей ЗегАїЇв ей РНе СІу бу Оу Ти Гуз Теми Ту Ма Ге Су Оп 100 105 по
Рго ух Аа Аа Рто 5ег Ма! Тиг Те РнеРго Рго 5ег бег си Ой 115 120 125
Геш СІп. Аа Авп ув. Аа Тит Гец Ма! Суб Сем Пе бег Ар Ре Туг 130 135 140
Рго. су Аа Ма! Тпг Маї АІа Тгр. Гуз. Аа Абр зег 5ег Рго Ма! Ту 145 150 155 160
Аа ОЇуУ Уа ОЇи Таг ТНг Твг Рго 5ег Гуз: Оп бег. Ап Ап Гу Туг 165 170 175
Аа АІа бек 5ег ТугГец 5ег Ге ТигРго ОЇ біІп Тер Гує5ег Ні 180 185 130
Ате 5ег Тугбег Суб Сп. Уа! Тне Ніз Сім Су бег Тит Ма! сі Гу 195 200 205
Тег Уа Аа Рго Тиг си Сух зег 210 215 «2105 62 «211» 329 «217» Білок «213». Ното зарієп5 «400562
Аа 5ег ТНг Гуз ОЇу Рго беї Ма! Ріе РгоїТей Аа Рго бег5ег Гуз 1 5 10 15
5ег Пт 5ег біу Оу ТАг Аа Аа Ге су Су Тецй Маї Гу Ар. Туг 20: 25 з0
Рне Рго си Рго Маї Тит Ма! 5ег Тгр Авп:5ег.ОЇу Да Те ТНі 5ет
Оу Уа! Ні5 Тиг Рпе Рго АГа"а!Ї Гец Сп 5ег бег Оу Геч Тут бег 60
Гецбегзег Ма! Ма! Тит Маї Рго бег ЗегзегІец СіІу Тиг Сп ТВг 65 70 75 8о0
Туг ШПе-Сув Азп. Уа! Ап. Ні 1у5 Рго зег Ап Тіт Туз Уа! Аєр у 85 90 95
Гу5 Маї сін Рго Ту5.5ег Су Аєр Гу Пт Ні Тиг Суз Рюю Рго Суб 100 105 110
Рго Аа Рю Си Ліа Аа Су Аа Рго бег Ма! Рне Те и Ріе Рго Рго
115 120 125 ув Рго Гу Ар Тиг Теи Мех Пе бег Аге Тиг Рго сЇш Ма! ТигСує 130 135 140
Ууаї Ма! Уа Ар. Уа! бег Ні сЇш Ар Рго бін Ма! Гу5 Ре Ап Тгр 145 150 155 160
Туг УаЇ Азр СІу Ма! сін Маї Ніх Авп Аа Гу Тит Гу Рго Аге Ой 165 17 175 сіш ап Тук Азп.5ег Тит Туг Атге Ма! Ма! бег Ма! Геи Те Маї Геи 180 185 190
Ні сп. Ар ТгрТец Авп Оу Гу бін Туг Гу5 Су Гу Ма!Ї зег А5п 195 200 205
Гуз Аа Гей Рго Аа Рго Ме Січ Гу ТНг Пе бегух Аа (ув ОЇу 210 215 220 сп Рго Аге ОЇ Рго СіІп Ма! Тут Тиг Ген Рго Ргобег Аге С1й ОЇи 225 230 235 240
Меєтигіух Ап ОІп Ма! бегієц Тит Су Теи Уа (ух Оу Рне Туг 245 250 255
Рго 5ег Ар Пе Аа Маі си Тгр.ОЇи ЗегАвп. Оу сп Ро см Ап 260 265 270
Авп Туг Гуз Тег ТНг РгосРго Уаі ей Азр бегАвр ОМ 5ег Рне Ре 275 280 285
Гец Туг5ег Гуз Тео Тиг Ма! Ар Гу бег Ате Ттр Сп Оп. Оу Аби 290 295 300
Уаї Рне 5ег Су 5ег Ма! Мей Ні Сн АГатеи Ні Авп Ні Туг ТВг 305 з10 315 320 бій Гу зегіви 5егівеци 5ег Ро Оу «210» 63 «211» 330 «2125 Білок «213» Ното заріепе «дО 63
Аа бег ТНг Ту СІУ Рго 5ег Маї Рре РгоТец Аа Рго зегбег Гу 1 5 10 15 5ег Тіг5ег Су Сіу ТАг Аа Аа Геи СІу Суз Те и МУаі Гуз Абр Туг
Ре Рго сш. Рго Уа! Тіт Ма! бег Тгр Ап бег Су Аа ем Тиг бетг
Су Ма! Ні5 Тег Рре Рго Аа Маї Гей Сп 5ег 5ег Оу Тен Тугбег
Геи бег5ег Уа Маї Тиг Уа! Рго 5ег Зег ет Те Оу ТНг Сп ТНг 65 70 75 80
Туг Пе Сух Аза Маї Авп Ні 1у5.Рго Зег Аби Піг Гу ма! Абр Гу 85 90 95
Гуз Ма! сій Рго ув бег Суз Абр-Гух ТНг Ні Тит Сує Ріо Рго Сувз 100 105 110
Рго Аа Ріо си Ага Аа бу Ада Рго 5ег Ма! Рпе Геи Рпе Рго Рго 115 120 125
Гуз Рго (у Ар Те Геци Ме Пе 5егАгеТАг Рго Ім Маї Тиг Су 130 135 140
Уа Уа! Уа! Азр Ма 5ег Ніз ОЇи Ар Рго ОЇ Ма! Гу Ре Азп Тгр 145 150 155 160
Туг ХаІ "Ар БІ; Маг ої Маї Ні Азп Аа Гуз ТАг ух Рго Аге бІШ 165 10 175
ОІш біп Туг Азп 5ег Тпг Туг Аге Маї Ма Хек Ма! (сп Тиг Уа! Тец 180 185 190
Ні: сСіп Абр Тгр Те Абпо Оу Гуз бі Туг Гу Су Ту5 МаїЇ бет Ап 195 200 205
Гуз АІа ец Рго Аа Рго Ме Сіц Гух Тит Пе 5ег Туз Аа Гу Су 210 215 220
Оп. Рго Атге Си Рго Оп Маї ТуєТАг Гей Рго Рго 5ег Агв Сім ОЇ 225 230 235 240
Меєтиг Гуз Авп СбІп Уаї бег Те Тиг Сувлеи Маї Гу Сіу Рпе Туг 245 250 255
Рго зег Ар Пе А!в Уа! ОЇ Тгр. Оу бег Ахп ОЇ сп Рюю Си Ап 260 265 270
Ап Туг Гу Тег ТвгоРго Рго Уа! Теи Ар 5ег Ар су 5ег Рапе Ре 275 280 285
Гец Туг бег Туз Гец Тиг Ма! Авр Гуз бег Аге Тгр бій Сп Сіу Авп 290 295 з
Уа Рбе баг Сує бег Чаї Ме Ніх Сім Аїа Тем Нів АвпО Ні Туг Тиг 305 310 315 320 біп'ух бегіги бегігєгци 5ег Ро Оу Гу 325 330 «2105 64 «211» 329 «212» Білок -2135. Ноїто 5заріенпь
«АОО» А
Аа 5ег ТНг Гуз бу Рго бег Уа! Рпе Рго Тем Аа Рго 5ег 5ег Ту 1 5 10 15 5ег Тпг зег Оу С1у ТНг Ав Аа Гей О1у Суб Тец Уа! Гуз Абр Туг
Рнпе Рго Сн Рго Уа! Тиг Уа! бег Тгр Ап 5ег бу Аа Ге Тпг бег оіу Маї, Ніє Тиг Ре Рго Ага Уа! Гец Ой 5ет 5ег ОЇу Тец Тугбег
БО
Гецбегзег Ма! Ма! Тит Маї Рго бег ЗегзегІец СіІу Тиг Сп ТВг 65 70 75 во
Туг Пе Сув Азп Маї Азп Ні Ту5 Рго 5ег Аєп ТПг Гуз Ма! Ар Ту 85 90 95
Гуз Ма! сію Рго Гу бе Сув Авр.Гу5 Те Ні Твг Су Ро РгоСув 100 105 по
Рто Аа Рто СІ Гей Тец су су Рго 5ег Уа! Рпе Те Рне Рго Рго 115 120 125
Гу Рго Гуз Ар. ТгТец Туг Пе Та гАге ОЇ и Рго ОЇ Ма! ТНг Су 130 135 140
Ууаї Ма! Уа Ар. Уа! бег Ні СОЇ Ар Рго Ой Ма! Гуз РНе- Ап Тгр 145 150 155 160
Туг УаЇ Азр СІу Ма! сін Маї Ніх Авп Аа Гу Тит Гу Рго Аге Ой 165 17 175 соц ОЇп ТугАвп бег ТАг Туг Аге Маї Ма 5ег Ма! Те Тиг Уаї Ге 180 185 1950
Ніз Сп Ар ТтрГец Абп Оу Гуз Си Туг Гуз Суз Ту Уаї 5ег Ав 195 200 205
Гуз Аа Геци Рго Ага Рго Пе Сім Гу5 То Пе 5ег ух Аа Гу Су 21а 215 220
Сп Рго Ате См Рго Сп Ма! Туг Тит Тец Рго Рго бег Аге Дер Си 225 230 235 240
Ге Тиг Ту Аза бій Маї 5ег Те Тиг Суб Гей Маї Туз О1у Рее Туг 245 250 255
Рго 5ег Ар Пе Аа Маі си Тгр.ОЇи ЗегАвп. Оу сп Ро см Ап 260 265 270
Азп Туг Гуз Те Тг Рго Рго Уа! Гец Ар бег Ар Су 5етг Ре Ре 275 280 285
Їеи Тук5ег Гу5 Те ТНг Ма! Авр І ув бег Аге Ттр Оп біп Оу Авп 290 295 зо
Уа! Рре: бег Су. бег Ма! Мех Ні СІс АДіа Те и Ніє: Ап Ні ТуУг ТА г 305 310 315 320
Оп Гуз 5ег Іги 5ет Іги 5ег Ріо Су 325 «2105. 65 -2115 330 «2125 Білок «213»: Ното заріепе «А0О» 65
Аа бег ТНг Ту СІУ Рго 5ег Маї Рре Рго Тец-АїЇа Ро 5ег 5ег (ув 1 5 10 15 5ет ТНг 5ег су Оу ТАг Аа АІз Тецп Оу Су Тец Ма! Гу Ар Туг
Рпе Рго си Рго Уаї Тиг Узі бег Тгр Авп бег Оу Аа Ге цу ТНг бег до 45
Оу Ма Ні Тих Ріє Рго Аа. Маї Геи СІп.5ег бег Су ей Тугбег 50: 55 60 ем 5ег5ег Ма! Маі Тнг Маї Рго зегзег 5егТеу біу ТАг Оп ТАг 65 70 75 8о
Туг Пе Сух Аза Маї Авп Ні 1у5.Рго Зег Аби Піг Гу ма! Абр Гу 85 90 95
Гуз Ма! СІ Рго (ув 5ег Сув Авр Ту Тнг Ні Тнг Сув Рго Рго- Суб 100 105 по
Рго Аа Ро со Тес Аа СОІУ Аа Рго 5егМаї Рне Ігу РНе Рго Рго 115 120 125
Гуз Рго Ту5Авр Тгеч Ме Пе зегАте Тег Рго Си Ма! ТАг Су 130 135 150
Уа! МаЇ МаЇ Ар Маї 5ег Ні ОЇЧ Ар Рго Он Маї Гу5 Рпе Азп Тгр 145 150 155 160
Туг Ма! Аєр Оу Ма! ОЇ Маї Ні Аєп Аа Гу Тиг Туз Рго Аге ОЇ 165 17 175 о сп Туг Ахп:бЗег ТВг Туг Аге МУаї Ма! ет МаЇ Геи Тит Маї Гей 180 185 190
Ні: сСіп Абр Тгр Те Абпо Оу Гуз бі Туг Гу Су Ту5 МаїЇ бет Ап 195 200 205
Гуз АІа Гец Рго Аа Рго Пе Си у5.Тг Пе бег у5 Аа Гу5 Оу 210 215 290
Оп Рго Аге Сім Рго сп Уа! Туг Тпг Тем Рго. Рго зег Аге Азр. ОЇ 225 280 2235 240
Гец Тиг Іув.Авп Сп Маі Зегеи Тиг СузТеш ма! Гу Су Рпе. Туг 245 250 255
Рго 5ег Ар Пе Аа Ма ОЇи Тгр.ОІш 5ег. Ап су Сп Рго-ОЇи Ап 260 265 270
Ап Туг Ту5 Те Тег Рго Рго Уа! Гей Ар. бег Ар. Оу 5ег Ре Рре 275 280 285
Гей Тугбег ух Гей Тит Маї Ар Гу бег Аге Ттр. Оп спо Оу Ап 290 295 з
Уа! Рне бек Су 5еї Мазі Мей Ні СІш Аа їеи Ніє-Авп Ні Тут ТАг 305 з10 315 320
Оп Гуз бегІги 5ег Іецбет Ро. Су Гу
325 30 «2105 66 «21 329 «212 Білок «213» Ното зарієпе «005 66
Аа бег ТАг Гу Су Ргобег Ма)! Ре Ргоїеиц Аа Рго бХег5егІ ув 1 5 10 15 5ег Тпг зег Оу С1у ТНг Ав Аа Гей О1у Суб Тец Уа! Гуз Абр Туг
Рнпе Рго СЇн Рго Уа! Тиг Уа! бег Тгр Ап 5ег Бім Аа їец Тит 5ег су Маї Ні Тиг Рре Рго Аа Уа Іеи Сп 5ег5ег су їеи Туг5ег 50
Ген 5ег5ег Уа! Маї ТНг Уа! Рго 5ег 5ег5ет Ге Оу ТНг Сп Тег 65 7 75 80
Туг Пе Сув Азп.УаїЇ Ап Ні 1у5 Рго 5ег Ап Тк Гуз Ма! Авр Гу 85 90 95
Гув Маг сїц Рго ув 5ег Сув Ар. Гуз Ти Ні Тиг Су Рго Рго Суб 100 105 по
Рго Аа Ріс аІш Тец Аа су Ава Рго 5ег Уа! Рпе Іец Рпе Рго Рго 115 120 125
Гу Рго Гуз Ар. Тпгец МеєПе 5ег АгеТЕг Рго би маї Тиг Суб 130 135 140
Уа! Ма! Ма! Аєр Ма! бег Ніз ОЇш Ар Рго Зм Маї ух Ре Ап Ттр 145 150 155 160
Туг Ма! Ар сі Ма! СІЮ Маї Ніх Азп. Аа Тує Тег ув. Рго-Аге СІи 165 1/0 175 іш ап Туг Авп 5ег Тит Туг Аге Маї Ма! Зег Уа! Теу Таг Уа! Гей 1850 185 150
Нів ОЇп Авр Тгр Геч Азп'аїу Гу бій Тут Гуз Су Гуз МаЇ 5ег Абп 195 200 205
Гуз Аа Теми Рго Аа Рго Ме Си Гуз Те Пе зег ув Аа ув Оу 210 215 220 сп Рго Агр О1и Рго біІп Маї Туг ТпгІеи Рго Ргобеї Аге: Ар. ОЇ ий 225 230 235 240
Геч Так Гуз Авп. сп Ма! 5ег бе ТпгСуєтТеи МаїЇ Гу СТУ Рпе Туг 245 25 255
Рго 5ег Ар Пе Аа Ма! си Тгр.СЇи 5ег Авп Оу Сп Рго ОЇ и Авп
260 265 270
Ап Туг Гуз Тиг Тнг Рго Рго Уаї Геч Ар бег Ар бу 5ег Рпе Ре 275 280 285
Гей Туг5ег ух Геи Тіг Ма Ар Гуз бег Аге Тгр бІп Оп Оу Авбп 290 295 з
Чаї Рпе 5ег Сув 5ег Ма! Мей Ні: Аа Те Ні Авп Ні Тут ТНг з05 310 315 320
Оп ув бет Ів и. бег Ів и 5ег Ріо Оу 325 «2105. 67 «2115 326 «212» Білок «213». Ното 5арієепе -4005 67
Аа бег ТНг Гу5 СІу Рго зег Ма! Рне. РгоТец Аа Рго Су бег АгЕ 1 5 10 15 5егТисб5ег бі ц зег Тпг Аа Аа Теи Оу Су Геци Маї Ту5 Ар. Туг
Рне Рго си Рго Маї Тит Ма! 5ег Тгр Авп:5ег.ОЇу Да Те ТНі 5ет
Оу Маі Ні Те Ре Рго Ага Уа! Гей Сп бег бег Су Ген Туг 5ег 50: 55 60
Іеи 5егзег Ма! Ма! ТНг Ма! Рго 5ег зег Аєп РНе Оу Тиг СТп Тег 65 70 75 во
Туг Тиг Сух Азп Ма! Ар Ні цу Рго бег Азп ТНг Гуз Уа! Ар Гу 85 90 95
Тег Ма! біш Аге (ув Су Сує Ма! сію Суб Ріо Рго Су Рго Аа Рію 100 105 110
Рго Уаі! АІа Сіу Рго Зег Ма! Рне Теци Ре Рго Рго Гу Рго Гуз Ар 115 120 125
ТНе беи Мей Пе зег Ага ТАг Рго бі Маї Ти Сух Уа! Уа! Маї Ар 130 135 140
Уаї бег Ні СІи Азр Рго Си Ма! Са Рпе Ахп Тер Туг Уа! Ар. Оу 145 150 155 160
Уа! сім Маї Ніз'Азп Ага Гу5 Те Гуз Рго Аг ОЇ 0 10 Оп Ре Ап 165 17 175 5ег Пк Рпе.Аге Уа! Ма! бег Уа! Гец ТАг Ма! Ма! Ні5 СсІп.Авр Тр 180 185 1930
ГепАвп Оу Гуз сін Туг Гу Суб Гуз Ма! бет Авп Гу Оу Тец Ро
195 200 205
Аа Рго Ме Са ув ТАг Пебег Су. ТНг Гу5 Оу Оп Рго Аге ОЇШ 210 215 220
Рго Сп Ма! ТуУг Тпг ей Рго Рго 5ег Аге Сім сої Ме ТНг Гу5 Ап 225 230 235 240 сп Ма! 5ег Те Тиг Су Тец Ма! Гуз: су Ре Тук Рго 5ег Ар. Ме 245 250 255
Аа Уа! си Тер си бег Ап су Оп Рго-СТи Авп Авп Туг Гу ТИ 260 265 270
ТВеРго Рго МеєГец А5р.5ег Абр біу 5ег Рпе Ре Геи Туг 5ег Ту 275 280 285
Гец-ТНг Маї Ар Гуз зег Ага Тгр сп. Спо Оу Ап Ма! Рре 5ег Суб 290 295 з
5ег Ма! Ме Ніє сі Аа Гец Ні Авп Ні Тут Тиг Ой Гуз бег Ге 305 310 315 320 5егІецбег Рго су ув 325 «2105 68 «211» 325 «212». Білок «2135 Ното заріепе «4005 68
Аа 5ег Таг Гу СІ Ргобег Уа! Рпе Рго1ец Аа Рго Суб бег Ате 1 5 10 15 бег ТНг 5ег Сн бег ТАг Аа Аа Іеи Су Су Гец Ма! Гу5 Авр Туг
РпеРго си Рто Уаї Трг Уаї 5ег Тр. Авп б5егї бу Аа Тец Тет 5ет
Сіу Маг Ні Тиг Рбе Рго: Ага а Тен Сбіп бегзег Оу еи Тугбег бо
Геи бег5ег Уа! МаїЇ Тиг Уаї Рго 5ег 5ет Азп Рне бу Тит сп ТАг 65 70 75 80
Туг Тнг Су Ахп Маї Авр-Нів Гу Рго 5ег Азп ТЕг Гу Уаї А5р Ту 85 90 95
Тиг Уа! СІч Аге Гу Су Су Ма! си Су Рго Рго Сув Рго Аа Рго 100 105 по
Рго Маї Аа СІуУ Рго бег Ма! РпеТеи Ре Рго Рго Гу Рго Ту Авр 115 120 125
ТигТеєи Мей Пе 5ег Аге ТнНг Рго Сі Уаї Тиг Су Ма! Ма Ма! Авр
130 135 140
Уаї бег Ні Си Ар Рго СТИ Ма! СТа Рне Ап Тгр Туг Ма! Ар. Су 145 150 155 160
Уа! сш Уа! Ніх Ахп Аа Гу5 Тиг (ух Рго Аге ОЇ и Сі Сп Ріе Авп 165 10 175 5ег Пік Рре Атге Уа МУаі бег Уа! Геи Тиг Уа! Ма! Ні5 Сп Ар Тгр 180 185 130
Гец Авп су Гу СТИ Туг Гуз Суб Гу Маї бет Ап Ту Оу Те Ро 195 200 205 5ег 5ег Пе Си І у5 Тпг Пе 5ег Гу5 Тис Гу СІ біп Рго Аг ОЇи 210 215 220
Рго біІп Ма! Туг ПігТец.Рго Рго 5ег Аге ОЇш Сію Меє ТПг. Гу Ап 225 230 235 240 сп Ма! 5ег Гей Пі Су Гец Ма! Гуз Оу Рпе Туї Рго 5ег Ар е 245 250 255
АЇа Уа! сш Тгер.СЇ и бег Ап су ап. Рго 91 Ази Асп Туг Ту ТАг 260 265 270
ТЕг Рго-Рго Ме Ге Авр 5ег Азр Су Зег Рпе Ріє Геч Туг 5ег Гу 275 280 285
Г еп Тпг Уа! Ар Туз 5ег Аге Тр Спо бІп су Абп Уа! Рпе бег Су 290 295 зО0 5ег Ма! Ме Ні5 ОІш Аа еп Ні Авп Ні Тує Таг Сп Гуз бегіец з05 310 315 320 5егіеи 5ег Рго сім 325
«2105. 59 «211» 326 «2172» Білок «213». Ното заріеп5 «400» 69
Аа бег Тіг цу Бу Рго 5ег Уа! Ріе Рго Гей Аа Рго Су бег Аге 1 5 10 15 бег Тиг 5ег Ом 5ег Тпг Аа Аа Гец. Оу Суз Тец Маї (ух Ар. Туг
Рне Рго Сім Рго Уа! Тіг Маї бет Тгр.Азп 5ег Оу Ліз Те и Тиг 5ег оіу Маї, Ніє Тиг Ре Рго Ага Уа! Гец Ой 5ет 5ег ОЇу Тец Тугбег 50
Іеи 5ег5ег Уа! Уаї Тиг Ма! Рго бек 5ег5егіеи С1У ТНг Гуз ТАг
65 70 75 во
Туг Тиг Суз Аєп Маї Ар Ні Цу5 Ріо 5ег Абп ТНг Туз Маг Ар Гуз 85 90 95
Аге Ма! ОЇи 5ег Гув Тут СОІУ Рго-Рго Су Рго РгоСув Рго Аіа Рго 100 105 10 сш Рпе Те Су су Рго 5ег Ма! Рпе Те Ре Рго Рго Ту Рго Ту 115 120 125 д5рТпгГеш Туг Те Тит Аге бЇч Рго си Ма! Тит Су Ма! Ма! Маї 130 135 140
Ар УаїЇ Зег сп СІ Азр.Рго- бій Ма! Сбіп Рпе Ап Тер Туг МаїЇ А5р 145 150 155 160
Оу Магоїи Маї Ніє Ап Аа Гуз ТАг Ту5 Рго Аге. ОЇ ОЇи Оп Ре 165 170 175
Азп5ег ТАг Туг Ате МаїЇ Ма! бег Уа) Ге Ти Ма Тем Ніє. сп: Авр 180 185 190
Тер Гец Авп бу Гув Ош Туг Ту Сує Гуз Уа) ет Ап Туз Оу Те 195 200 205
Рго 5егЗег Пе Сіц Гуз ТНг Ме Зег у5 Аа Гу5 Су Сп РгоАге 210 215 220
Си Рго Оп Уа! Туг ТигІец. Рго Рго 5ег біІп Си Си Меї Тиг Ту 225 230 235 240
Ап Оп Уа! ЗетТец ТАг Су Те и Ма! Суб Су Ре Туг Рго 5ег Авр 245 250 255
Пе АГа Ма Сію Тгр Ой бег Аєп Су Сп, Рго би Абп Авп Туг Гуз 260 265 270
ТБ Тве Рго Рго Уа Тец Ар бег Ар Су Зег Ре РНе Ге Туг 5ег 275 280 285
АгеТец Тпг Уа Азр.Тух зег Ага Тгр ОІп- Оу Оу Азп Маї Ре 5ег 290 295 300
Сує бег Уа! Мей Ні Си Ага Гец-Нів Авп Ніє Туг Тит ОЇп Гу зег 305 310 315 320
Ге 5егівибегіви су 325 «2105 70 «211» 325 «212». Білок «213»: Ното заріепе «А0О» 70
Аа 5ег Тиг Гуз су Ргобег Ма! Рре.Рго Гец Ага Рго Суб 5ег Ав
1 5 10 15 бег Тиг5ег Си бег Тиг Аа Аа Геи Су Суз Те Маї Туз Азр Туг зо
Ріе Рго см Рго Уаї Тнг Уа! Зег Тгр.Азп 5ег ОМ Ліза Ге ТКгЗег до 45
Оу Ма Ні Тих Ріє Рго Аа. Маї Геи СІп.5ег бег Су ей Тугбег 60
Іец беї бег Уа! Маї Тиг Ма Рго бег 5ег Азп Ре Су Тиг бій. Тег 55 7 75 80
Туг Тнг Су Ахп Маї Ар Ні Гу5 Ро. бег Ап ТЕг Гуз Ма! Ар Гу 85 90 95
ТНг Маї біс Аге Ту5 Су Су МаЇ СТИ Су Ро Рго Сує Рго Аа Рго 100 105 110
Рго Маї Аа су Рго 5ег Ма! Ре Геи Ре Рго Рго Ту Рго 1у5 Ар 115 120 125
Тис Геи Мей Пе 5ег Аге Тиг Рго Сію Уа! Тип Су Уа! УаЇ Маї Ар 130 135 140
Уа бег Ні ОЇм Азр. Рго-бІу Маї Сп Рне Авп Тгр.Туг Маї Ар СІу 145 150 155 160
Уа! сш Уа! Ніх Ахп Аа Гу5 Тиг (ух Рго Аге ОЇ и Сі Сп Ріе Авп 165 175 175 5ег Пік Рре Атге Уа МУаі бег Уа! Геи Тиг Уа! Ма! Ні5 Сп Ар Тгр 180 185 190
Гей Авп ОіІу Гує ОЇи Туг Гу СуєтТуз Ма! бек Ап Туз СОІУ Тец Рг 195 200 205
Аа Рго Ме ОЇ Цуз ТНг Пе 5ег Гу ТНг ух Су бі п РгоАге Са 210 215 220
Рго- сп Уаї Туг Тиг Тем Рго Рго 5ет Аге С1и ОЇю Мей ТАг Гуз Ап 225 230 235 240
Сп Уа! бегІеци Тиг Су теп Маї Гуз Су Рпе Туг Рго бет. Авр Ме 245 250 255
Аа Уві Тгр ОЇ и бег Абп Оу Сп Рго ЗІ Авп Авп Туг Ту ТА 250 265 270
ТЕг Рго-Рго Ме Ге Авр 5ег Азр Су Зег Рпе Ріє Геч Туг 5ег Гу 275 280 285
Гей Тиг Ма! Абр Ту бег Аге Тгр Оп іп СОІУ Азп Маї Рне бег Су 290 295 300
5ег Уаі Мет Ні сію. Аа ве Ні Асп Ні Туг Тиг Оп Гу бет Гей 305 310 315 320 бегІецбег Рго бу 325 «210571 «2115 326 «212» Білок «213» Ното зарієпе «4005
Аа 5ег Тиг Гуз су Рго б5ег а! Рпе Рго Тем Аа Ріо Сув бег.Ате 1 5 10 15 бег Тиг 5ег Ом 5ег Тпг Аа Аа Гец. Оу Суз Тец Маї (ух Ар. Туг
Рне Рго Сни Рго Маї Тиг Уа! 5ет Тгр Ахп 5ег Оу АІа Гец ТНгЗег су Ма! Ні Ти Рпе: Рго Аіа Уа! Геи бій 5еї 5ег Оу Теми Туг5ег бо
Гец 5ег 5ег Ма! Уа! Тит Ма! Рго бег 5ет Ап Рпе Су Тиг сп ГА 65 7 75 80
Туг Таг Су Авп Уаїі Ар Ні Гу5 Ро 5ег Ап ТНг Ту Ма! Ар Ту 85 90 95
Тіг Уа! сі Аге Гу Су Су Ма! СІ Су Рго Рго Суб Рго Аа Ріо 100 105 110
Рго Ма! АІа СІ Рго 5ег Уа! Рне Геш Рне Рго Рго Гу Рго Туз Ар 115 120 125
ТАгІеи Ме Пе бет Агро Таг Рго Сім Ма! Тиг Суз Маї Ма! Маї Ар 130 135 140
Уаї ет Ні5 ОЇ. Ар Рго Сп а! сп Ріє Авп Тгр. Туг Уа! Азр Оу 1845 150 155 160
Уа! Сіш Маї Ні Азп Ага Гу ТНг Ту Рго Аге Оу Ом біп Рпе Ап 1655 170 175 бег Тк Ре Аге Уаї Ма бет Уа! Гей Тлг МаЇ МаїЇ Ніє СТ Ар. Тгр 1850 185 150
Гей Азп Оу Гу о Тук Гу Суб Гу Уа! бег Ап Суб су Те Рго 195 200 205 5Зегзег Пе Си Гу ТАг Пе Зег Гу5 Таг Гу5 Оу Сп Рго Аге:ОЇШ 210 215 220
Рго сп Ма! Туг Тпг Гец Рго Рго 5ег Аге ОЇш Сі МеєтТнг Гує Авп 225 230 235 240
Оій Маї бег Гец ТНг Су Ге Ма! Ту СУ Ре Тук Рго 5ег Ар Те 245 250 255
АІа УагОоїЇи Тгр ОЇ и бегАвп Бу Сп Рго сш Авп Авп Туг Гу5 Тг 260 265 270
Тиг Рго Рго Ме Гец Ар Зег А5р:ОЇу бег Ре Ріе Геи Туг бег Губ 275 280 285
Гецш Те Уа Авр Ту зег Ага. Тер Сп біп Оу Ап Маї Рве Зег Су 290 295 300 5ег Маі Мет Ні Сім Аа Ів и Ні Азп Ні Туг Тит сп Гу5 бегіеи 305 з10 315 320 5егІец бег Рго сх Гув 325
Claims (2)
1. Рекомбінантне антитіло, яке специфічно зв'язується з ТІ1А і містить варіабельну область важкого ланцюга СОКІ1, що містить амінокислотну послідовність 560 ІЮ МО:15, варіабельну область важкого ланцюга СОМК2, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО:21, варіабельну область важкого ланцюга СОКЗ, що містить амінокислотну послідовність 5Е0 ІЮ МО:17, варіабельну область легкого ланцюга СОКІ, що містить амінокислотну послідовність ЗБЕО ІЮ МО:18, варіабельну область легкого ланцюга СОМК2, що містить амінокислотну послідовність 5ЕО І МО:19, і варіабельну область легкого ланцюга СОКЗ, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО:22.
2. Рекомбінантне антитіло за п. 1, яке містить варіабельну область важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність ЖЕО ІЮ МО:3, і варіабельну область легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність 560 ІЮ МО:4.
З. Рекомбінантне антитіло за п. 1 або 2, де антитіло містить константну область важкого ланцюга Ідс1 людини.
4. Рекомбінантне антитіло за п. 3, де константна область важкого ланцюга Ідс1 людини містить ЗЕО І МО:42, 5ЕО І МО:43, 5ЕО ІЮ МО:44, 5ЕО 10 МО:62, 5ЕО ІЮ МО:63, 5ЕО ІЮО МО:64, 5ЕО ІО МО:65 або 5ЕО ІЮ МО:66.
5. Рекомбінантне антитіло за п. 1 або 2, де антитіло містить константну область важкого ланцюга Ід0б4 людини, де константна область важкого ланцюга Ід54 людини містить ЗЕО ІЮ МО:45, БЕО ІО МО:46, 5ЕО ІЮО МО:47 або 5ЕО ІЮ МО:69.
6. Рекомбінантне антитіло за п. 1 або 2, де антитіло містить константну область важкого ланцюга ЇдбС2 людини, де константна область важкого ланцюга їд52 людини містить ЗЕО ІЮ МО:67, 5БЕО ІО МО:68, 5ЕО ІЮ МО:70 або 5ЕО ІЮ МО:71.
7. Рекомбінантне антитіло за будь-яким із пп. 1-6, де антитіло містить константну область легкого ланцюга лямба людини.
8. Рекомбінантне антитіло за п. 7, де рекомбінантне антитіло містить легкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність зЕО ІЮ МО:61. Ко) 9. Рекомбінантне антитіло за п. З або 8, де рекомбінантне антитіло містить важкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО:60.
10. Композиція, яка містить рекомбінантне антитіло за будь-яким із пп. 1-9 і фармацевтично прийнятний носій.
11. Рекомбінантне антитіло за будь-яким із пп. 1-9 для застосування в лікуванні астми.
12. Рекомбінантне антитіло за будь-яким із пп. 1-9 для застосування в лікуванні запального захворювання кишечнику або коліту.
13. Спосіб детекції ТІ/1ТА іп міго (ї на поверхні мононуклеарних клітин периферичної крові (РВМС), який включає приведення антитіла за будь-яким із пп. 1-9 в контакт з РВМС, які виділені у індивіда, і детекцію антитіла, зв'язаного з ТІ/1А на поверхні РВМС, (ії) в сироватці крові, який включає приведення антитіла за будь-яким із пп. 1-9 в контакт з сироваткою крові, взятої в індивіда, і детекцію антитіла, зв'язаного з ТІ1А в сироватці, або (ії) в зразку тканини, який виділений у індивіда, який включає приведення антитіла за будь-яким із пп. 1-9 в контакт зі зразком тканини, який виділений у індивіда, з утворенням комплексу антитіло-ТІ14А, і детекцію комплексу в тканині.
14. Трансформована клітина, яка експресує антитіло за будь-яким із пп. 1-9.
15. Виділений полінуклеотид, що має послідовність нуклеїнової кислоти, яка кодує варіабельну область важкого ланцюга антитіла, що містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮО МО:3, і послідовність нуклеїнової кислоти, яка кодує варіабельну область легкого ланцюга антитіла, що містить амінокислотну послідовність зЗЕО ІЮ МО:4.
Ср СО І МУБУЦОИАЕУКАВСАВУКУВСКАЕКУТЕТВІМНУВОСАРСОСС КЕ ЕМО М КОКОС иТМтА тлуа Е І МКУ і ВААААВАДАА ПА ВК ЗВОиВеМешеО аишшщовишиВ коро Оороров вав З Осо Оног пррозНнІнННю НКЕККТКТЕК КК ККАККІ, МЕНА Ки КК ХУ КАХ Ж х ХХ У КК х ср ТЕТАТМЕ АВТ ВОКОГАУХУПАВВУВЕТААЕКУКСОСТЬУТУ ВЕ Іво ТІ МО:
чнг.1 сові Сов еВУБРОРЕВУЗСАРООВУГІВСТЕВЕВТМ АСЦИТ ватТАВЕ ІВ в УуМВеБНУРІОВЕВОоЕКВоТВ АТ і ХАКААААКВАКАВ вОосОосовОопивВа зовосодоросого ЗАВІТ Зоо а МКК ИКНННИЕ КОСА КЕКЕК ЗАВ НЯ їх її ку ср ТЕО БЕВОвеОХ УК атом і5ББО ІВ ЩО: М ВАААЛАОА І: МОМ сеООю Но ЗВУ ВН Кк БК КА КІ КО я КН Фіг. 2 У УК еКУ
182 20 5 49 5 со них НО НО М АН ПА п В о о ОО и и п ВО 179УН ОУОІУОЗСАБУКЕРОАВУКУВСКАЗСХТЕТВУРІМНУВОАРООЗСЬКИМСКИМРМОМТОХАОКРОСВУТ 2Б7УН 0... ті ихуча ау тах иа сичаттіїхуєигчіуіїчя іч учити ЗИ оососдгухуюхчнахчничаза чувати туєтухувиухвчхумехчка жа ни жхнтч ую ху ючи хни З2ЗВМЕ у. узлчазлчачачуяяютічаяа ча вач уча лати уча тю ва і юти чу ютч єтчаятя ЗОТУН у... нилалачантіччиучухяууханичяача иа хучута нич чия ЗУБ 3... суа уча уч юча чі чула учи хіх дну хіх ах а нич нат тіки БАТУН дупу юкхч уча науч кача ла нал ут ял чула чі качиних есі юю єю» БВЗУН сус. хха учили налу ткух и улица 5ВАМН у.о ачухичла а віч кати ач тя юну ха ючи хіт тучких ЗВБУМИ 00... анал ії ації ьхучиа юю кача а нти ач ат тт ють ВЗВБУН 0. ак няч а нах ючи ах ня хю ючи вх єн вчити яхт, ЗВУМН усу усу а тя ізчаачювтчухті чі іаляучтиуччніхучичяхиучінаЖеичччниїьхня 53 0000. учукнча жила вача качана за єв чна лука чхули єна ча ху ккччхча БВ 00... чули тяїатихуіучалалтанаутхивтча их ючч чі Муч віях БЯЗУН узяв юта лю хжуюх віча ча ютчхютєт чт ха нт чити Жул хін чу чиях сх нн ан ан нт А в на а а жа А А а А а А А А а А і а а а А а а ЗОНИ ЗОБУ сузсачхаалча тва чали кю а ух тація ватяну Мі чали. ОУН 0.0. зучазаччніхуауаичана тал члиталиіухуєи чати чания уч Же вух л нич то во 50 та 110 ши и А и р а п ав о а ОА а ПРДА Я 179У9 МТАРВОТЗТАХМЕНІЗОВЕРТАУУХСАВЕУРЕТАВЕЕХНСОсСТЬУТУВО ЗВО І МО: 257 сусла ілчучиттуличхуєчуча унії чхиулитч хи що хр МО: 2ТМН .у..сх чутні хла ча ач аличі уча чи хуюачяних БО ІВ МО:ї 27ЯУН 0. уачанихитучхучича чілі ул аличі ютчану їхня ЖЕО їв оМОо:ї ЗОН о... захнича ніччю учили учкюічч нях ЗЕО Ір МОо:ї ЗЗЕУН ду... юні уа вача хличттіччутчаяніхчнитяя БО ІЮБ МО:3 БАТУН духу гчахла тая узі туі іа титана ад юю во Ір МО: З БВЗУН ус... ултиачинчаничулиухачнучлнчччиччхиєуучияхнияя КО то Мщо:3 БВЯУН .......схухичча тала чних ююічвиттухіачатіучяччяяи, ЗБО ХВ о МО:Ї ЗЯБУН суд зузла нта ача юку чл а юю тал рити КО Ір МО:ї БВБУН .0..,пу апа чия я я юю уч кчуту ючи та кою яа 5ЕО 10 оМОо:1 БВУН о у... нічна чані чан чхкатуюіччкичяхнчяхя ко І МО:З БЗЕУН о у. у,.уктічялтілніхча туту уча тча уча ючих КО ІЮ БО: З БОМ .сууаанчітні ча улалкача ла лулал иа няучч учи ЖЕО ІроМОо:З ЗЗЗУН 0... худ нина нач иа уча тя кв тліє тчухютих жах чити» ям зво хо МО: З БЗАМН о ду. суоталаччніхчуюаучютіікаіті іі ічата ніч ничучих ко хо Мо:3 БОБУН усу. налахичууал тва ії ул іа та чанах вкО Ів МО:3 бОЇМН о у.уу.чазихчачальула іх іичаа утіх хуєитлала чл нях КО ІВ МО:3
Фіг. З
19 го зо 40 зо 50 п по а по в и ОО НА ОО В ВО 179уУ2. ОБУШТОВРЕУЗОАРСООВУТІЗСТВВВВрІОАСЬСУНИХООСРОТАРКІІЕОУУМАРБСУРОВЕВ жо и в в ОО в КО І ФІРУВ уггі ліухаччиачаччачачихіча яву тхала лічені расржнинн нн на а і а п А і в ОН ЗО сс... Мала ча ююкта ач хіх увів ЗІ сазана тіутучалаутіті зт чна іч ичучукхт я итачухчхх БЕТУЮ у.уучлтааа чула ла аллаля тич уча ухчухітя ті тучкчя нт тяятяя 583УВ 0. чані ча чу ВМ ііі ча нати тачка ЗВАМИ (сучас чухінттчі ач Вуза чати чухахч юні тах тнняха ча ОБУ о... іхухналііу іх схіахазчутчуєтча нят 5ВбМШ 0... тіучла ничих алитт тич ачіяянияити БЕТМЕ о... ічухчуталлітуіххіуллтніича кла ниучтутчали ява ах сеха: и а а і а и п А БОЖУ ..уугтаханазуттадаал антитіла М уталахал начала ватні ВАЄ 0... яті ілі хана Вуз. ах уютачч тачка БОМ султана юіхіччяичибу чілі вича хучаняя ния хи лин и в а а п ОО ОО Я ОЗ о о сососхкзаилазалахчиала чатах кттініучхула зичу нняяяяи 70 во зо 1200 115 НАчИ НА НН ПА и по и о р З а и 17957. СТЗАЗБТІТОСИРЕРЕСОУХСОЗУРСТЬВАБЕСССТКОТУТЄ вЖО їр о мо:2 ЗЕМ о с.сххлалнизхтууха кажи ттттітутанили талих ко хр оМо:11 27МЬ 0... .ххухічі ючих хліуі іти хліві що їр що:12 ЛВ ссср чанах учи чахчях вкО Ір МО:13 ЗОМ 0.0, ниічихіалн я тлинххя во тр Мо: 9 ск а в о а ПА В А яко Ір МОо:4 ЗМ сс. вазіаа ла чаталаа та ана залчічаліктая вкО їв о МО:2 ЗАМ услуг іч ючи чо Ір МО:5 екв вовни ОО ко їромо: Є ЗВВМЬ о... чиїх чані чо 10 ОщОо:7 5ВБУВ у. туттутукаатітяуча Тихі хухіхачия ко І0 МО:8 п о и ИН Я во їр що:4 БОІМЕ с. нич чхати яко Ір Ммо:9 суд: ин в и А во їв МО:5 БВЗУВ 114... Му ихата нічия «ко їв МО: 6 ВЗ ості Щ ау тхчтчтивкаая вЖО ІВ ЩМО:7 ВЗ 0... вала я М... «ко Ір МО:8 ОМ супутніх чака ча Юутіа ал італ нини. ко Іо МО:10
Фіг. 4 юю г о с кудлнкхнихи . ЛІТ тт я : М, пут іюжкіюксю» З ЕВІ Б - ПХТ ром тк. ПУ УТТТ оту усттнне 320 НИ «39 "З лшжкиц и похо то жк хи в дк 320-175 -2й Час (с)
Фіг. 5
Аналіз активності каспази клітин Тр-1 т29- дон -н 23.25 ий 20 зв Р : З . п З за я нари за й . Б се 50-28 Я, Е -- 320-307 т 60 в ій кю, зве 220-175 8 К, Ж за й де : Щ й а ше Й фони жи ий ; -3о 1 -й -й й гу ї Антитіло (мкг/мл) Аналіз активності каспази клітин ТЕ-1 420 ! --е 380-351 зб -- 380-547 Ї Женя зн 5205179 -Е Е і, сення Ж Її іо з 650 Х ги в, | 71 з ! ло 384 /
г. Х к: я й п ЗАКАИК Як ДИ й Е маша ткюючхчжют юку -8 «й. -й 0 2 Антитіло (мкг) Аналізактивності каспази клітин ТЕ-1 420 г в ск бно т--ей-- 320-555 во лі - 390-584 Б Ї -- 320-585 що ж Ж руде сф дає ій з20-885 Е ! | й -- 350-587 Ж 30 Я Ї -е 320-179 ро оо ; 4 сій і І В З і 8 Пе Й рих лює кути кіт ку -30 ! сення -6 -й -й 0 Кй Антитіло (мкг/мл)
Фіг. 6
1294 - в 185 Н і ек ник ЗИ ее айо-віт я 220-537 не и ак ро їй Ши --- З Н гом зай зх90-82ї - се й зап-аах ж вач Е І св А зт з і -козапв Е | Не 7 че зшп-а83 ЕЗ т А «фе зІа-ней Е Я У ве. Е Ка "й В й й К яке зга шо 85 що СЕ -кео запи Е 557 т /Х и их -- 53.17 К р.й / й р -к- 330-175 Ж Н КК щих в то 45 й що 5 ? я в ; Ї ; - и м п з я - ї з -й - -Е - - а -Е -8 «3 -х -3 ГУ Антитіло факг/ми) Антитіло (мкг мА) 126 те - -єр зЗцв-5В Н Ру -кее УХВ-ЕВ; -к- 38305551 ч р їх -- зба М Н щ 7? У Й ен зз0-вв? к . Кк -йе зто-вд ЕЗ їй - ее запа Е і: З т ке УДЕ-Вої р Я 4в- тей Ж Хе се ВІ. 17О хо М ї й Й - не Жип.178 УЖ зв. й ь : я що Е жу ЕН ї-- Й я а Х с ІНН св ДИ Ноя й це р хх Б: Ед Ж Н ЕН і Ї Н ї кн а п -5 -й - - 4 2 -5 -А -ї -2 - 2 Антитіло (мкм) Антитіла (мкглат
Фіг. У
-- 4188М - й --- УНЕАЛІ х Во о - 330-587 Е ї й в Ж 40 А ї 5 Ї г. я п 2-6 Ти Ї5 Ж і ХХ й в -й. -Е 0 ? Антитіло (мкг/мл) шо ни ВЕ авяення втобівняннтя по 0.077 и си СУНЗА оо В00000ннн 0 125 А Яе -йа- Гуманізоване 184 дику -ке 330-168 «х 80 ДЕ: - 320-557 с й га ї ж І: Ж 50 р. го А ї, ї ну ЛА й "А -6 -й -й а 2 Антитіло (мкг/мл) Антитіло ШИ ! ІКоо мкг/мл вет підвищення в порівнянні з 1 с АННИ С ЗНМ ПО зе 00000000000000606030000001583 БА ва
Фіг. 8
Конкуренція за зв'язування ТІ 1А: ОКЗ 100 п -е- 320-331 У --- 320-547 -- К --- 390-179 в Ж -к- ІзотиИп до 5о -- пЗ00п-25 5 їй а -3 -2 - г Антитіло Пов (мкг/мл) Конкуренція за зв'язування ТІ1А: ЯЗ 196 и ня и - й Я Й - 320-957 - я Б т -- 320-577 5 де / З -- 390-278 й 5О и и 9 | ; -к- 320-307 1, й -- 329-331
Б . «- 320-179 34 же 300-285 «В -2 «і й Антитіло Пов(мкг/мл Конкуренція за зв'язування ТІ1А:ОКЗ оо -- 320-585 Я 7 кн ш й ий -й- 320-585 що сажа ш Бо я дея | -- 3000-25 5 Зк --- 390-586 ін з 24 ї ! --- 320-587 ! і ! - «З -й - о Антитіло-Пое (мкг/мл)
Фіг. 9
Конкуренція за зв'язування ТІ1А: ОК той -а- 3200-31 -е- 3970-5477 - --- 330-179 і тв |зОТИп мо Б Е -- 5300-25 о х - 0 -й -3 о і Антитіло Пов (мкг/мл) Конкуренція за зв'язування ТІ 1А: ОВЗ -а- 320-557 тво Що -- ЗО ї- -«- 320-278 г г -- 320.307 о. Ж во -- 320-331 У " -й- 320-178 я у, я -ке БОЗ00-К5 ; у же К: я свй он ну, нм. - -3 - й 1 Антитіло Пов (мкг/мл) Конкуренція за зв'язування ПЛ1А:ОКЗ 180 -- 320-583 вивститі 390-584 ко а і п М -5 я й де: -к- 350-585 я 56 у - 3000-25 ї ;-Ш й - 390-585 5 яв Ж, 2 і Й, -к- 320-587 Ж зв і 320-179 7 й ик -- 5201 864 Женя ре я та |зотип 4 В 1 2 Антитіло Пов (мкг/мл
Фіг. 10
ОП ненні 1А Щура 700 я Ше я ! со , пиши пінпнккаоіотнкнковвовюн , 0 ЛлІЛА кішки - її за ооо нн оепевоево юю вв соня «о П.1А морської свинки о. в, ІЙ ча пнненнвноюннетеюнннньнит І. 1А собаки 8 І осреюя ооесосоваватая і і ТІЛА людини "й еф , НО Кеннет 1А миші в / Що М І ее тІ 1А яванекого макака що 1005 са ї ! жо у чо і | Шо пон сон ТІ1А кролика о о
З. що 00 00 Часіс)
Фіг. 11
А Товщина товстої кишки скчкінкннт І радо І т Вдорові (тільки етансбл) 4 ке: Я Контроль-носій Е Ж | вх бої І в. 5 мг/кг івотипічного контролю оз зе й З мг/кг 320-587 з Ех Я в 2 Фе Кк о й 4-4 ах Ж й А 8 Спайки
2.5 В 5 І ред Ї - Вдорові (тільки етанол) Б й вещешх у ШИ я Контроль-носій 5 ЕЕ я | вх. 001 | « Б Ммг/кгізотипічного контролю кож - - а 5 мг/кг 320-587 в а п Во в вже ж а ЖЕ
- 8.5 о й р. Го. см вки 0000005 С Стриктурь а Й ж РР - Ї вк | | 7 Вдорові (тільки етанол) З Ї пе 1 Я Контроль-носій к ; Зх й 5; 3 ВОМ Фе : ; їх шо я З Мг/кгізотипічного контролю а 5 Мг/кг320-587 ж й г вжкА в і о бь ;петежежеюя й -жй до У ж вААКВА ко п І- хін а се КРУ о дна цін дані орні іні дні яна І Захворювання товстої кишки В, т 7 У Я . .. 5 7 Вдорові (тільки етанол) В І ре.0001 І о Контроль-носій в Я й шо 48 ва Го 1 «о Б.міг/кг івотипічного контролю ге КЗ БЖ А Б'мг/кг 320-587 КЕ У уч в ей і Б в зях в Фіг. 12
Б. вх ан 5 5 УХИЛОДУХ.
з і пол ї я не зи що - К Ше 15 ня 8 ний, НЕ: | нини, В чо як ні с я я доваюх Ок с. у Ж « не ши я мк ок са оо У вія же Ж вами ! ОХ нев . о що о о 2 -? ї о гоой с гас У с КУ св) з) 5 о з гей о мо Я З ; Ку Е в і к Б ке а Ку я о КУ
Фіг. 13 п тт Голи пот лі 33 Івотипічний контроль | 320-587 о | шин ЗИ - Н Шоу тА ян Е ! - ще ТК о д ! У Ом, отр
КО. Н 5 А ий и ох и ко Ос о ие | КЕ МИ ой БО АН М ! Ср шо ВО «ВЕ В; шо 5 5-0 ШЕ Н й ну
Фіг. 14
Еозинофіли РЕАЛ 2592 й ; а КЕ Контроль-носій ш- що - со 299 в - а й 350-557 «чх й Ка БЕ | Ве - 189 М е нн х за й ще 109 о Ж жк ке з їх с ко 50 й а ту х в: «ж вхо.в0ой5 (Манна-Уїтні)
Фіг. 15 фіг. 16А Фіг. 1865 хз ще я ї тя ші т 2 Контроль-насій 5 і с Кантралесносій Е Н БУ з ї х Коза т ко Зшха? Ав х , ко пливу Фі 2 шої ге
У. і пан КД ння, г Ж Н ге к хо КУ Е на нн « Еш ШИ шва ши нич З Н - а х і їх й х ЗА шов а ко т Н що ' Шщ є ж « црдннннннкннтттнтнннт тет тні аа "дев Манна-утні З руввв іМоннахуїтні)
Фіг. 166 фіг. 160 в . й шо змив 8 че а ; го ВЕ і Я! З Конгролюснкля КЕ і г чо е В 4 й Й о жо дашвві Б а Ж Комтуєльсяосій жо з хх і уд-яи?. 555 ЯК я Шен вон ов З Я ж і хх
: з. до | з БО пре х що зн Ж БУ зд х 5 | с ях жд п. ження БУ ! що плжпллжіукккьккнкяк шох У х пої 4 ка да, росла х Я З х хх вах шї Н ВЗ ОД дня х. нн ЗИ Кк й 5 дея ахіМмМанна-уїтнії
Фіг. 17А Фіг. 178 таб у пло 30 Б Не ЩО б Контроль-носій Я КЖентроль-носій Ф й А жо Зр0-587 ше а Зуб-887 В ово в ЗЕМ о, зва
Б.Я --е Ко й В ж спню М дурня с к Б ге ж парове ї3 шо лаб а їх ох т б о | В -Мвавав. я, г жжжж в. бе анна за знав о о жо 5 3 ш Н І. це ї Кк 3 М нки хви КЗ х у ї АКА АЛАНА зве вк ови -Уїтні: х се Не в«взвецМаннауїтні) «в» (Манна-Уїтні)
Фіг. 176 Фіг. 170 18 з 9 Контроль-носій гм в й 2 Контроль-носій Бо х ко Ми-ЕВї о --- і Оз чо й З З 23 ов а ах й -- сн я т
Ж м. -- о е Ж я НОбОПЕЄ ах со Кк т: я пня фонннчечнннннння Од: оо А сов пнптнннннникх що д Всі З АвфААЬАХ «а кава оо 55 ГІ е от, ііиинлідадачячнтннниттннтня х «вах (Манна -Уїтні) Уе«в ах (Манна-Уїтні)
Фіг. 17Е о 8 о 1 Ки ЕЗШЯ в «є Контроль-носій б З як Ко УгО-Бя р: вах зі ко Й ч-г Зоо А оо пустою о С сво їх Га пптетттетттнноінх к о : 2 ОХ опонент юниттетечосі одно нвтоінединечнтічотенн ях пло 23 (Манна-Уїтні)
Доза овальбуміну, необхідна для посилення обструкції дихальних шляхів на 10095 2000 уж Щ «ке Контроль-носій ЕЕ зн 320-587
5. 1800 дя Е їз жо т00о -2 Фк в ; . в) : т щоб ; її сх їй ж ж шо ше ше о МИ в ; б Е й 5 8 18 172 Тиждень жа хжр001 у порівнянні з носієм
Фіг. 18 ж.
е
2.0 ососсео А в.
5 1.5 5 В
2 1.0 ЗО Шин шк ко Ж жк ко нини 5 о
0.5
0. р «1.0 А (Манна-ітні) ща Контроль-носій а з2ага-5в7
Фіг. 19
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US201562220442P | 2015-09-18 | 2015-09-18 | |
| PCT/US2016/052040 WO2017049024A1 (en) | 2015-09-18 | 2016-09-16 | Antibodies that specifically bind to tl1a |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| UA125284C2 true UA125284C2 (uk) | 2022-02-16 |
Family
ID=57043002
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| UAA201804192A UA125284C2 (uk) | 2015-09-18 | 2016-09-16 | Рекомбінантне антитіло, яке специфічно зв'язується з tl1a |
Country Status (33)
| Country | Link |
|---|---|
| US (3) | US10138296B2 (uk) |
| EP (2) | EP3350223B1 (uk) |
| JP (2) | JP7013366B2 (uk) |
| KR (1) | KR101998535B1 (uk) |
| CN (1) | CN108137693B (uk) |
| AR (1) | AR106055A1 (uk) |
| AU (2) | AU2016323460B2 (uk) |
| BR (2) | BR122021002400A8 (uk) |
| CA (1) | CA2997015A1 (uk) |
| CL (1) | CL2018000711A1 (uk) |
| CO (1) | CO2018003736A2 (uk) |
| CY (1) | CY1123499T1 (uk) |
| DK (1) | DK3350223T3 (uk) |
| EA (1) | EA201890756A1 (uk) |
| ES (1) | ES2810751T3 (uk) |
| HK (2) | HK1251002A1 (uk) |
| HR (1) | HRP20201323T1 (uk) |
| HU (1) | HUE051496T2 (uk) |
| IL (1) | IL257761B2 (uk) |
| LT (1) | LT3350223T (uk) |
| MA (2) | MA42825B1 (uk) |
| MD (1) | MD3350223T2 (uk) |
| MX (1) | MX2018003185A (uk) |
| PE (1) | PE20181080A1 (uk) |
| PH (1) | PH12018500580A1 (uk) |
| PL (1) | PL3350223T3 (uk) |
| PT (1) | PT3350223T (uk) |
| RS (1) | RS60703B1 (uk) |
| SI (1) | SI3350223T1 (uk) |
| TW (1) | TWI703158B (uk) |
| UA (1) | UA125284C2 (uk) |
| WO (1) | WO2017049024A1 (uk) |
| ZA (1) | ZA201801427B (uk) |
Families Citing this family (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2010062960A2 (en) | 2008-11-26 | 2010-06-03 | Cedars-Sinai Medical Center | METHODS OF DETERMINING RESPONSIVENESS TO ANTI-TNFα THERAPY IN INFLAMMATORY BOWEL DISEASE |
| WO2013044298A1 (en) | 2011-09-30 | 2013-04-04 | Cephalon Australia Pty Ltd | Antibodies against tl1a and uses thereof |
| KR20230109779A (ko) | 2013-03-27 | 2023-07-20 | 세다르스-신나이 메디칼 센터 | Tl1a 기능 및 관련된 신호전달 경로의 저해에 의한섬유증 및 염증의 완화 및 반전 |
| US10316083B2 (en) | 2013-07-19 | 2019-06-11 | Cedars-Sinai Medical Center | Signature of TL1A (TNFSF15) signaling pathway |
| TWI703158B (zh) * | 2015-09-18 | 2020-09-01 | 美商希佛隆公司 | 特異性結合tl1a之抗體 |
| EP4338672A2 (en) * | 2015-12-04 | 2024-03-20 | University Of Iowa Research Foundation | System for screening delirium patients for the presence of encephalopathy |
| KR102464372B1 (ko) | 2016-03-17 | 2022-11-04 | 세다르스-신나이 메디칼 센터 | Rnaset2를 통한 염증성 장 질환의 진단 방법 |
| CN118240830A (zh) | 2016-10-26 | 2024-06-25 | 西达-赛奈医疗中心 | 中和抗tl1a单克隆抗体 |
| CA3098374A1 (en) | 2018-04-25 | 2019-10-31 | Prometheus Biosciences, Inc. | Optimized anti-tl1a antibodies |
| BR112022007720A2 (pt) | 2019-10-24 | 2022-08-23 | Prometheus Biosciences Inc | Anticorpos humanizados para ligante 1a tnf-like (tl1a) e seus usos |
| WO2024026395A1 (en) | 2022-07-27 | 2024-02-01 | Cephalon Llc | Anti-tl1a antibodies for the treatment of ulcerative colitis and crohn's disease |
| WO2024026386A1 (en) | 2022-07-27 | 2024-02-01 | Cephalon Llc | Anti-tl1a antibody formulations |
Family Cites Families (32)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7820798B2 (en) | 1994-11-07 | 2010-10-26 | Human Genome Sciences, Inc. | Tumor necrosis factor-gamma |
| US7597886B2 (en) | 1994-11-07 | 2009-10-06 | Human Genome Sciences, Inc. | Tumor necrosis factor-gamma |
| PL220113B1 (pl) | 1999-01-15 | 2015-08-31 | Genentech Inc | Wariant macierzystego polipeptydu zawierającego region Fc, polipeptyd zawierający wariant regionu Fc o zmienionym powinowactwie wiązania receptora Fc gamma (FcγR), polipeptyd zawierający wariant regionu Fc o zmienionym powinowactwie wiązania noworodkowego receptora Fc (FcRn), kompozycja, wyizolowany kwas nukleinowy, wektor, komórka gospodarza, sposób otrzymywania wariantu polipeptydu, zastosowanie wariantu polipeptydu i sposób otrzymywania wariantu regionu Fc |
| US6548062B2 (en) * | 2000-02-29 | 2003-04-15 | Cephalon, Inc. | Method of treating cancer with anti-neurotrophin agents |
| ES2727425T3 (es) | 2000-12-12 | 2019-10-16 | Medimmune Llc | Moléculas con semividas prolongadas, composiciones y usos de las mismas |
| US7317091B2 (en) | 2002-03-01 | 2008-01-08 | Xencor, Inc. | Optimized Fc variants |
| US20040132101A1 (en) | 2002-09-27 | 2004-07-08 | Xencor | Optimized Fc variants and methods for their generation |
| US7217797B2 (en) | 2002-10-15 | 2007-05-15 | Pdl Biopharma, Inc. | Alteration of FcRn binding affinities or serum half-lives of antibodies by mutagenesis |
| US20080233119A2 (en) | 2003-08-20 | 2008-09-25 | University Of Miami | Compositions and methods for treating inflammatory lung disease |
| JP2007530588A (ja) | 2004-03-23 | 2007-11-01 | バイオジェン・アイデック・エムエイ・インコーポレイテッド | レセプターカップリング剤およびその治療用途 |
| GB0521621D0 (en) * | 2005-10-24 | 2005-11-30 | Domantis Ltd | Tumor necrosis factor receptor 1 antagonists for treating respiratory diseases |
| WO2006127900A2 (en) | 2005-05-25 | 2006-11-30 | Biogen Idec Ma Inc. | Tl1a in the treatment of disease |
| AU2006284922B2 (en) | 2005-08-30 | 2012-01-19 | University Of Miami | Immunomodulating tumor necrosis factor receptor 25 (TNFR25) agonists, antagonists and immunotoxins |
| US20090269345A1 (en) | 2005-12-23 | 2009-10-29 | Rong Fan | CLN248 Antibody Compositions and Methods of Use |
| US9068003B2 (en) | 2007-01-10 | 2015-06-30 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Dept. Of Health And Human Services | Antibodies that bind to TL1A and methods of treating inflammatory or autoimmune disease comprising administering such antibodies |
| US20110217310A1 (en) | 2007-01-10 | 2011-09-08 | Siegel Richard M | Blockade of tl1a-dr3 interactions to ameliorate t cell mediated disease pathology |
| WO2008106451A2 (en) | 2007-02-26 | 2008-09-04 | Cedars-Sinai Medical Center | Methods of using single nucleotide polymorphisms in the tl1a gene to predict or diagnose inflammatory bowel disease |
| JP5745854B2 (ja) | 2007-11-13 | 2015-07-08 | テバ バイオファーマシューティカルズ ユーエスエー インコーポレーティッド | Ｔｌ１ａに対するヒト化抗体 |
| WO2010118210A1 (en) | 2009-04-08 | 2010-10-14 | Cedars-Sinai Medical Center | Methods of predicting complication and surgery in crohn's disease |
| US20130195884A1 (en) | 2009-12-31 | 2013-08-01 | Deutsches Krebsforschungszentrum | Novel modulators of trail signalling |
| JO3375B1 (ar) | 2010-11-08 | 2019-03-13 | Regeneron Pharma | أجسام مضادة بشرية للجين a1 الشبيه بعامل النخر الورمي (tl1a) |
| WO2013044298A1 (en) | 2011-09-30 | 2013-04-04 | Cephalon Australia Pty Ltd | Antibodies against tl1a and uses thereof |
| AU2013371957B2 (en) | 2013-01-02 | 2018-10-25 | Ichnos Sciences SA | Antibodies that bind to TL1A and their uses |
| KR20230109779A (ko) | 2013-03-27 | 2023-07-20 | 세다르스-신나이 메디칼 센터 | Tl1a 기능 및 관련된 신호전달 경로의 저해에 의한섬유증 및 염증의 완화 및 반전 |
| MX2015013901A (es) * | 2013-04-05 | 2015-12-11 | Genentech Inc | Anticuerpos anti-il-4 y anticuerpos biespecificos y sus usos. |
| US20160096885A1 (en) | 2013-05-17 | 2016-04-07 | Cedars-Sinal Medical Center | Distinct effects of ifn-gamma and il-17 on tl1a modulated inflammation and fibrosis |
| US10316083B2 (en) | 2013-07-19 | 2019-06-11 | Cedars-Sinai Medical Center | Signature of TL1A (TNFSF15) signaling pathway |
| EP3041580A4 (en) | 2013-09-06 | 2017-05-03 | Cedars-Sinai Medical Center | Systems, devices and methods for anti-tl1a therapy |
| MY182271A (en) | 2013-11-13 | 2021-01-18 | Pfizer | Tumor necrosis factor-like ligand 1a specific antibodies and compositions and uses thereof |
| JP2018512167A (ja) | 2015-04-15 | 2018-05-17 | バイオサーチ テクノロジーズ インコーポレイテッド | ダブルクエンチャープローブ |
| TWI703158B (zh) | 2015-09-18 | 2020-09-01 | 美商希佛隆公司 | 特異性結合tl1a之抗體 |
| CR20180365A (es) | 2015-12-16 | 2018-09-28 | Amgen Inc | PROTEÍNAS DE UNIÓN AL ANTÍGENO BISPECÍFICO DE ANTI-TL1A/ANTI-TNF-a Y SUS USOS |
-
2016
- 2016-09-14 TW TW105130075A patent/TWI703158B/zh active
- 2016-09-16 DK DK16774750.0T patent/DK3350223T3/da active
- 2016-09-16 RS RS20200983A patent/RS60703B1/sr unknown
- 2016-09-16 EA EA201890756A patent/EA201890756A1/ru unknown
- 2016-09-16 WO PCT/US2016/052040 patent/WO2017049024A1/en active Application Filing
- 2016-09-16 AU AU2016323460A patent/AU2016323460B2/en active Active
- 2016-09-16 JP JP2018512167A patent/JP7013366B2/ja active Active
- 2016-09-16 BR BR122021002400A patent/BR122021002400A8/pt unknown
- 2016-09-16 MX MX2018003185A patent/MX2018003185A/es unknown
- 2016-09-16 PT PT167747500T patent/PT3350223T/pt unknown
- 2016-09-16 BR BR112018005407A patent/BR112018005407A8/pt active Search and Examination
- 2016-09-16 UA UAA201804192A patent/UA125284C2/uk unknown
- 2016-09-16 ES ES16774750T patent/ES2810751T3/es active Active
- 2016-09-16 IL IL257761A patent/IL257761B2/en unknown
- 2016-09-16 MA MA42825A patent/MA42825B1/fr unknown
- 2016-09-16 MD MDE20180714T patent/MD3350223T2/ro unknown
- 2016-09-16 KR KR1020187007337A patent/KR101998535B1/ko active IP Right Grant
- 2016-09-16 CN CN201680053598.8A patent/CN108137693B/zh active Active
- 2016-09-16 CA CA2997015A patent/CA2997015A1/en active Pending
- 2016-09-16 SI SI201630885T patent/SI3350223T1/sl unknown
- 2016-09-16 LT LTEP16774750.0T patent/LT3350223T/lt unknown
- 2016-09-16 US US15/267,213 patent/US10138296B2/en active Active
- 2016-09-16 AR ARP160102834A patent/AR106055A1/es unknown
- 2016-09-16 HU HUE16774750A patent/HUE051496T2/hu unknown
- 2016-09-16 EP EP16774750.0A patent/EP3350223B1/en active Active
- 2016-09-16 PL PL16774750T patent/PL3350223T3/pl unknown
- 2016-09-16 MA MA052643A patent/MA52643A/fr unknown
- 2016-09-16 EP EP20151834.7A patent/EP3693393A1/en active Pending
- 2016-09-16 PE PE2018000398A patent/PE20181080A1/es unknown
-
2018
- 2018-02-28 ZA ZA2018/01427A patent/ZA201801427B/en unknown
- 2018-03-16 CL CL2018000711A patent/CL2018000711A1/es unknown
- 2018-03-16 PH PH12018500580A patent/PH12018500580A1/en unknown
- 2018-04-09 CO CONC2018/0003736A patent/CO2018003736A2/es unknown
- 2018-08-15 HK HK18110481.5A patent/HK1251002A1/zh unknown
- 2018-10-18 US US16/164,509 patent/US11220549B2/en active Active
- 2018-11-30 HK HK18115365.5A patent/HK1256300A1/zh unknown
-
2020
- 2020-08-17 CY CY20201100767T patent/CY1123499T1/el unknown
- 2020-08-25 HR HRP20201323TT patent/HRP20201323T1/hr unknown
-
2021
- 2021-11-30 US US17/538,530 patent/US20220185902A1/en active Pending
-
2022
- 2022-01-17 JP JP2022005039A patent/JP7341259B2/ja active Active
-
2023
- 2023-06-01 AU AU2023203440A patent/AU2023203440A1/en active Pending
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| UA125284C2 (uk) | Рекомбінантне антитіло, яке специфічно зв'язується з tl1a | |
| RU2760334C2 (ru) | Моноклональные антитела к альфа-синуклеину для предотвращения агрегации тау-белка | |
| ES2791333T3 (es) | Anticuerpos anti-MIF para su uso en el tratamiento de enfermedades inflamatorias | |
| CN103890009B (zh) | 白细胞介素‑31单克隆抗体 | |
| US10604562B2 (en) | Anti-transthyretin humanized antibody | |
| US11186630B2 (en) | Anti-transthyretin human antibody | |
| CN106432484A (zh) | 人类免疫缺陷病毒中和抗体及其使用方法 | |
| CN106459215A (zh) | 治疗自身免疫疾病的结合fcrn的抗体 | |
| CN104262483A (zh) | 用于生成抗体混合物的方法 | |
| EA011302B1 (ru) | Антитела, которые связывают рецептор интерлейкина-4 | |
| TWI665214B (zh) | 特異性針對ｉｌ－２１之結合分子及其用途 | |
| CN109311992A (zh) | 用于治疗t细胞介导疾病的新型抗cd6抗体 | |
| TW201321408A (zh) | 作為診斷標記之oxMIF | |
| BR112019013953A2 (pt) | Anticorpo anti-a-syn e uso do mesmo | |
| EP3992205A1 (en) | Sars coronavirus-2 spike protein binding compounds | |
| JP6286757B2 (ja) | 抗ヒトｃｄ６９抗体、及びその医薬用途 | |
| US10981977B2 (en) | Anti-HERV-K envelope protein antibodies and methods for detecting HERV-K envelope protein in patients with sporadic amyotrophic lateral sclerosis | |
| WO2017214609A1 (en) | Uses of il-41 | |
| US20220259298A1 (en) | Neutralizing Antibody for Tooth Regeneration Treatment Targeting USAG-1 Molecule | |
| CN101415438A (zh) | Toll样受体3拮抗剂、方法和用途 | |
| WO2022060900A1 (en) | Shark-derived binding molecules for sars-cov-2 coronavirus and uses thereof | |
| WO2022207652A1 (en) | Methods of treatment using protein binders to irhom2 epitopes | |
| EA042971B1 (ru) | Антитела, которые специфически связываются с tl1a | |
| Hoban | Chimeric IgM immunoglobulin specific to the measles nucleoprotein: a positive control in measles diagnostic tests and proficiency panels |