ES2810751T3 - Anticuerpos que se unen específicamente a TL1A - Google Patents

Anticuerpos que se unen específicamente a TL1A Download PDF

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Bridget Cooksey
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Abstract

Un anticuerpo recombinante que se une específicamente al ligando 1A de tipo TNF (TL1A) y comprende una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3 y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 4.

Description

DESCRIPCIÓN
Anticuerpos que se unen específicamente a TL1A
Referencia a un listado de secuencias
La presente solicitud incluye un Listado de secuencias enviado electrónicamente como un archivo de texto llamado TL1A_ST25, creado el 18 de septiembre de 2015 con un tamaño de 89.000 bytes. El listado de secuencias forma parte de la memoria descriptiva de la patente.
Campo de la invención
La presente divulgación se refiere en general al campo de la ingeniería de anticuerpos. De manera más específica, la presente divulgación se refiere a anticuerpos variantes que se unen específicamente a TL1A y que inhiben la interacción entre TL1A y el receptor de muerte 3 (DR3). En algunos aspectos, los anticuerpos también inhiben la interacción entre TL1A y el receptor señuelo 3 (DcR3). Los anticuerpos tienen potencia mejorada en relación con el anticuerpo original del que procedían las variantes.
Antecedentes de la invención
El ligando 1A de tipo TNF (TL1A, sin. miembro 15 de la superfamilia TNF (TNFSF15); TL1 y VEGI) es un miembro de la superfamilia de factores de necrosis tumoral, que es expresado por células presentadoras de antígenos (incluyendo células dendríticas, linfocitos B y macrófagos), linfocitos T CD4+ y CD8+ y células endoteliales. El TL1A puede expresarse en la superficie celular o secretarse como una citocina soluble. El receptor para TL1A, el receptor de muerte 3 (DR3) es expresado por diversas células, incluyendo linfocitos T CD4+ y CD8+, linfocitos NK, linfocitos NKT y linfocitos T reguladores FOXP3+ (Treg) y células linfoides innatas de tipo 2 y tipo 3 (ILC2 e ILC3).
TL1A también puede unirse a un receptor señuelo (DcR3), que es un inhibidor competitivo de DR3. DcR3 también actúa como un receptor señuelo para el ligando Fas (Fas-L) y proteína inducible de tipo linfotoxina que compite con la glucoproteína D por la unión al mediador de entrada del virus del herpes en linfocitos T (LIGHT). Por consiguiente, DcR3 es un regulador importante de varias rutas de transducción de señales.
La ruta de señalización TL1A/DR3 se ha implicado en varios sistemas biológicos, que están asociados con enfermedades humanas. Por ejemplo, se ha mostrado que TL1A desempeña una función en la inmunidad, angiogénesis y homeostasis de los tejidos barrera. También se ha mostrado que la inhibición de la interacción de TL1A con DR3 promueve un beneficio terapéutico en varias afecciones inmunomediadas, tales como encefalomielitis autoinmunitaria experimental (EAE; un modelo de esclerosis múltiple), colitis, colitis ulcerosa, enfermedad de Crohn, enfermedad inflamatoria intestinal, dermatopatía, asma y artritis.
Por consiguiente, los compuestos que inhiben la actividad de TL1A son deseables, p. ej., para sus usos terapéuticos, profilácticos, diagnósticos y pronósticos.
Sumario de la invención
La presente invención se refiere a un anticuerpo recombinante como se define en las reivindicaciones. En el presente documento se describe un anticuerpo recombinante que comprende una CDR1 de región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 15, una CDR2 de región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 28, una CDR3 de región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 17, una CDR1 de región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 29, una CDR2 de región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 19 y una CDR3 de región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 30, siempre que cuando la región variable de cadena pesada comprenda la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1, la región variable de cadena ligera no comprenda la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2.
En algunos aspectos, el anticuerpo comprende una CDR2 de región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 16 y una CDR3 de región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 22. En algunos aspectos, el anticuerpo comprende una CDR2 de región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 21 y una CDR3 de región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 20. En algunos aspectos, el anticuerpo comprende una CDR2 de región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 16, una CDR1 de región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 23 y una CDR3 de región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 22. En algunos aspectos, el anticuerpo comprende una CDR2 de región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 16, una CDR1 de región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 24 y una CDR3 de región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 22. En algunos aspectos, el anticuerpo comprende una CDR2 de región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 16, una CDR1 de región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 25 y una CDR3 de región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 22. En algunos aspectos, el anticuerpo comprende una CDR2 de región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 16, una CDR1 de región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 26 y una CDR3 de región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 22. En algunos aspectos, el anticuerpo comprende una CDR2 de región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 21 y una CDR3 de región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 22. En algunos aspectos, el anticuerpo comprende una CDR2 de región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 21, una CDR1 de región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 24 y una CDR3 de región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 22. En algunos aspectos, el anticuerpo comprende una CDR2 de región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 21, una CDR1 de región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 25 y una CDR3 de región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 22. En algunos aspectos, el anticuerpo comprende una CDR2 de región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 21, una CDR1 de región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 26 y una CDR3 de región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 22. En algunos aspectos, el anticuerpo comprende una CDR2 de región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 21 y una CDR3 de región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 27.
La presente invención es un anticuerpo recombinante que se une específicamente a TL1A que comprende una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3 y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 4.
También se proporciona en el presente documento un anticuerpo recombinante (de la presente invención y los descritos en el presente documento) que comprende una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 3 y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 14, siempre que cuando la región variable de cadena pesada comprenda la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1, la región variable de cadena ligera no comprenda la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2. En algunos aspectos, el anticuerpo comprende una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1 y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 4. En algunos aspectos, el anticuerpo comprende una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3 y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2. En algunos aspectos, el anticuerpo comprende una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1 y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 5. En algunos aspectos, el anticuerpo comprende una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1 y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 6. En algunos aspectos, el anticuerpo comprende una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1 y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 7. En algunos aspectos, el anticuerpo comprende una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1 y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 8. De acuerdo con la invención, el anticuerpo comprende una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3 y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 4. En algunos aspectos, el anticuerpo comprende una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3 y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 6. En algunos aspectos, el anticuerpo comprende una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3 y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 7. En algunos aspectos, el anticuerpo comprende una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3 y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 8. En algunos aspectos, el anticuerpo comprende una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3 y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 10.
El anticuerpo de la presente invención comprende una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 60 y una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 61.
Dichos anticuerpos recombinantes (de la presente invención y los descritos en el presente documento) son preferentemente de longitud completa y son preferentemente monoclonales. Dichos anticuerpos recombinantes se unen a TL1A con afinidad mejorada con respecto a un anticuerpo que tiene una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1 y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2. Dichos anticuerpos recombinantes tienen potencia mejorada con respecto a un anticuerpo que tiene una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1 y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2. La potencia mejorada puede ser de una potencia al menos aproximadamente 10 veces mayor con respecto a un anticuerpo que tiene una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1 y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2. La potencia mejorada puede ser de una potencia al menos aproximadamente 12 veces mayor con respecto a un anticuerpo que tiene una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1 y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2. La potencia mejorada puede ser de una potencia al menos aproximadamente 13 veces mayor con respecto a un anticuerpo que tiene una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1 y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2. La potencia mejorada puede ser de una potencia al menos aproximadamente 15 veces mayor con respecto a un anticuerpo que tiene una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1 y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2. La potencia mejorada puede ser de una potencia al menos aproximadamente 20 veces mayor con respecto a un anticuerpo que tiene una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1 y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2. La potencia mejorada puede ser de una potencia al menos aproximadamente 25 veces mayor con respecto a un anticuerpo que tiene una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1 y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2. La potencia mejorada puede ser de una potencia al menos aproximadamente 27 veces mayor con respecto a un anticuerpo que tiene una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1 y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2. La potencia mejorada puede ser de una potencia al menos aproximadamente 40 veces mayor con respecto a un anticuerpo que tiene una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1 y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2. El factor de aumento de la potencia se puede determinar según un ensayo de potencia de caspasa inducida por TL1A en células TF-1.
Dichos anticuerpos recombinantes pueden comprender una región constante de cadena pesada de IgG1 humana, una región constante de cadena pesada de IgG2 humana o una región constante de cadena pesada de IgG4 humana, o cualquier alotipo de las mismas. La región constante de cadena pesada de IgG1 humana puede comprender la SEQ ID NO: 42 o la SEQ ID NO: 43 (IgG1 AK humana), o la SEQ ID NO: 44 (IgG1 humana con YTE), o la SEQ ID NO: 64 (IgG1 humana con YTE y AK), o la SEQ ID NO: 63 (IgG1 humana con L234A, L235A, G237A) o la SEQ ID NO: 62 (IgG1 humana con L234A, L235A, G237A y AK), o la SEQ ID NO: 65 (IgG1 humana con L235A y G237A) o la SEQ ID NO: 66 (IgG1 humana con L235A, G237A y AK). La región constante de cadena pesada de IgG2 humana puede comprender la SEQ ID NO: 67 o la SEQ ID NO: 70 (IgG2 AK humana), o la SEQ ID NO: 71 (IgG2 humana con A330S, P331s ) o la SEQ ID NO: 68 (IgG2 humana con A330S, P331S y AK). La región constante de IgG4 de cadena pesada de IgG4 humana puede comprender la SEQ ID NO: 45 o la Se Q ID No : 46 (IgG4 humana con S228P y AK), o la SEQ ID NO: 47 (IgG4 humana con S228P e YTE) o la SEQ ID NO: 69 (IgG4 humana con S228P, YTE y AK). Se entenderá que podría usarse una cadena pesada de IgG4 sin la sustitución estabilizadora S228P (p. ej., IgG4 con YTE solo, o IgG4 con YTE y AK, o IgG4 con AK solo).
Los anticuerpos recombinantes (de la presente invención y los descritos en el presente documento) pueden comprender una región constante de cadena ligera lambda humana o un alotipo de la misma. La región constante lambda de cadena ligera humana puede comprender la SEQ ID NO: 48.
Dichos anticuerpos recombinantes se unen a TL1A humano y pueden unirse al TL1A de un primate no humano o al TL1A de un mamífero no humano tal como un ratón, rata, cobaya, gato, perro, conejo o cerdo.
Dichos anticuerpos recombinantes pueden usarse en un método para tratar una enfermedad de las vías respiratorias, un método para tratar una enfermedad gastrointestinal, un método para tratar una dermatopatía o un método para tratar la artritis, o puede usarse en el tratamiento de una enfermedad de las vías respiratorias, una enfermedad gastrointestinal, una dermatopatía o artritis, o puede usarse en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad de las vías respiratorias, una enfermedad gastrointestinal, una dermatopatía o artritis. La enfermedad de las vías respiratorias puede comprender una o más de asma, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), fibrosis pulmonar, sarcoidosis pulmonar, rinitis alérgica o fibrosis quística. La enfermedad gastrointestinal puede comprender una o más de enfermedad inflamatoria intestinal, enfermedad de Crohn, colitis, colitis ulcerosa, esofagitis eosinofílica o síndrome del intestino irritable, o una enfermedad o afección gastrointestinal asociada con fibrosis quística. La artritis puede comprender artritis reumatoide. La dermatopatía puede comprender una o más de dermatitis atópica, eccema y esclerodermia.
Los sujetos humanos, sujetos primates no humanos o sujetos mamíferos no humanos que necesitan dichos tratamientos pueden tratarse con los anticuerpos o una composición que comprende los anticuerpos, por ejemplo, administrando los anticuerpos o la composición de los mismos al sujeto. La administración puede ser parenteral, por ejemplo, subcutánea y/o intravenosa.
Dichos anticuerpos recombinantes pueden usarse en un método para detectar TL1A en la superficie de células mononucleares de sangre periférica (PBMC). Los métodos comprenden poner en contacto un anticuerpo que se une a TL1A como se describe o ilustra en el presente documento con PBMC obtenidas de un sujeto y detectar el anticuerpo unido a TL1A en la superficie de las PBMC. Los métodos pueden comprender además cuantificar el nivel de TL1A en las PBMC. Los métodos pueden comprender además obtener las PBMc del sujeto.
Dichos anticuerpos recombinantes pueden usarse en un método para detectar TL1A en suero sanguíneo. Los métodos comprenden poner en contacto un anticuerpo que se une a TL1A como se describe o ilustra en el presente documento con suero sanguíneo obtenido de un sujeto y detectar el anticuerpo unido a TL1A en el suero. Los métodos pueden comprender además cuantificar el nivel de TL1A en el suero sanguíneo. Los métodos pueden comprender además obtener el suero de sangre obtenida del sujeto. Los métodos pueden comprender además obtener sangre del sujeto.
Se proporcionan polinucleótidos que codifican uno o más de la región variable de cadena pesada y la región variable de cadena ligera de dichos anticuerpos (de la presente invención y los descritos en el presente documento). Los polinucleótidos pueden codificar además una región constante de cadena pesada y/o una región constante de cadena ligera.
En algunos aspectos, un polinucleótido comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una región variable de cadena pesada de anticuerpo que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3, por ejemplo, una secuencia de ácido nucleico que comprende la SEQ ID NO: 51 o la SEQ ID NO: 58. En algunos aspectos, el polinucleótido comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una región variable de cadena ligera de anticuerpo que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2, por ejemplo, una secuencia de ácido nucleico que comprende la SEQ ID NO: 50. En algunos aspectos, el polinucleótido comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una región variable de cadena ligera de anticuerpo que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 4, por ejemplo, una secuencia de ácido nucleico que comprende la SEQ ID NO: 52 o la SEQ ID NO: 59. En algunos aspectos, el polinucleótido comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una región variable de cadena ligera de anticuerpo que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 6, por ejemplo, una secuencia de ácido nucleico que comprende la SEQ ID NO: 54. En algunos aspectos, el polinucleótido comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una región variable de cadena ligera de anticuerpo que comprende la secuencia de aminoácidos de la s Eq ID NO: 7, por ejemplo, una secuencia de ácido nucleico que comprende la SEQ ID NO: 55. En algunos aspectos, el polinucleótido comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una región variable de cadena ligera de anticuerpo que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 8, por ejemplo, una secuencia de ácido nucleico que comprende la SEQ ID NO: 56. En algunos aspectos, el polinucleótido comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una región variable de cadena ligera de anticuerpo que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 10, por ejemplo, una secuencia de ácido nucleico que comprende la SEQ ID NO: 57.
En algunos aspectos, el polinucleótido comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una región variable de cadena pesada de anticuerpo que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1, por ejemplo, una secuencia de ácido nucleico que comprende la SEQ ID NO: 49. En algunos aspectos, el polinucleótido comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una región variable de cadena ligera de anticuerpo que comprende la secuencia de aminoácidos de la s Eq ID NO: 4, por ejemplo, una secuencia de ácido nucleico que comprende la SEQ ID NO: 52. En algunos aspectos, el polinucleótido comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una región variable de cadena ligera de anticuerpo que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 5, por ejemplo, una secuencia de ácido nucleico que comprende la SEQ ID NO: 53. En algunos aspectos, el polinucleótido comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una región variable de cadena ligera de anticuerpo que comprende la secuencia de aminoácidos de la s Eq ID NO: 6, por ejemplo, una secuencia de ácido nucleico que comprende la SEQ ID NO: 54. En algunos aspectos, el polinucleótido comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una región variable de cadena ligera de anticuerpo que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 7, por ejemplo, una secuencia de ácido nucleico que comprende la SEQ ID NO: 55. En algunos aspectos, el polinucleótido comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una región variable de cadena ligera de anticuerpo que comprende la secuencia de aminoácidos de la s Eq ID NO: 8, por ejemplo, una secuencia de ácido nucleico que comprende la SEQ ID NO: 56.
Se proporcionan vectores que comprenden uno o más de dichos polinucleótidos. Se proporcionan células transformadas con uno o más de dichos polinucleótidos o dichos vectores. Las células transformadas pueden ser de mamíferos y, preferentemente, son células hospedadoras de expresión de mamíferos tales como células CHO, células NS0 o células HEK293.
Breve descripción de los dibujos
La figura 1 muestra las posiciones e identidades de cada una de las sustituciones de aminoácidos individuales realizadas en las regiones CDR1 o CDR2 o en restos de aminoácidos seleccionados adyacentes a CDR2 de la cadena pesada variable del anticuerpo parental (320-179). Las regiones en recuadros representan las CDR según el sistema de numeración AbM.
La figura 2 muestra las posiciones y las identidades de cada una de las sustituciones de aminoácidos individuales realizadas en las regiones CDR1 o CDR3 de la cadena ligera variable del anticuerpo original (320-179). Las regiones en recuadros representan las CDR según el sistema de numeración AbM.
La figura 3 muestra una alineación de cadenas pesadas de anticuerpos anti-TL1A variantes.
La figura 4 muestra una alineación de cadenas ligeras de anticuerpos de unión anti-TL1A variantes.
La figura 5 muestra una comparación de la fase de disociación de TL1A de anticuerpos anti-TL1A variantes, según lo medido mediante RPS.
La figura 6 muestra los resultados de ensayos de potencia de caspasa de células TF-1 con anticuerpos de TL1A variantes.
La figura 7 muestra los resultados de los ensayos de potencia de la caspasa de células TF-1 usando diversos anticuerpos de TL1A en comparación con el anticuerpo original, 320-179.
La figura 8 muestra que el anticuerpo 320-587 tiene una potencia de TL1A superior en un ensayo de potencia de caspasa de células TF-1, en comparación con otros anticuerpos anti-TL1A publicados en varios experimentos diferentes.
La figura 9 muestra diversos anticuerpos anti-TL1A que inhiben la unión de TL1A a DR3, en comparación con un control de isotipo según lo medido en formato de ELISA.
La figura 10 muestra que el anticuerpo original, 320-179, no inhibe la unión de TL1A a DcR3 mientras que los anticuerpos anti-TL1A variantes inhiben la interacción TL1A-DcR3.
La figura 11 muestra que el anticuerpo 320-587 reacciona de manera cruzada y se une a TL1A de diferentes especies; el anticuerpo unido a TL1A de todas las especies probadas.
La figura 12 muestra los resultados de la administración del anticuerpo 320-587 en un modelo de colitis inducida por TNBS de rata, lo que demuestra que el anticuerpo alivia significativamente síntomas de colitis
La figura 13 muestra que el anticuerpo 320-587 detecta TL1A humano secretado de PBMC humanas estimuladas con complejos inmunitarios, en una prueba de ELISA.
La figura 14 muestra que el anticuerpo 320-587 detecta una población de PBMC humanas que expresan la membrana TL1A en su superficie, en una prueba de citometría de flujo.
La figura 15 muestra que las ratas que tenían asma aguda inducida por OVA tratada con el anticuerpo 320-587 habían reducido significativamente los eosinófilos en el líquido de lavado broncoalveolar (BALF).
Las figuras 16A a 16D muestran que el tratamiento de cobayas que tenían asma aguda inducida por OVA tratada con el anticuerpo 320-587 tuvo mejoras en (fig. 16A) eosinófilos BALF, (fig. 16B) macrófagos BALF, (fig. 16C) hiperreactividad de las vías respiratorias después de reacción asmática temprana y (fig. 16D) magnitud de la reacción asmática temprana.
Las figuras 17A a 17E muestran que el tratamiento de ratas que tenían asma crónica inducida por OVA tratada con el anticuerpo 320-587 tuvo mejoras en (fig. 17A) eosinófilos BALF, (fig. 17B) macrófagos BALF, (fig. 17C) IL-13 BALF, (fig. 17D) hiperplasia de células caliciformes según se evaluó mediante reactividad de PAS y (fig. 17E) engrosamiento de la mucosa según se evaluó a partir de secciones teñidas con hematoxilina y eosina.
La figura 18 muestra la dosis de ovoalbúmina necesaria para duplicar la obstrucción de las vías respiratorias. La figura 19 muestra que el tratamiento de ratas que tenían colitis inducida por TNBS tratada con el anticuerpo 320-587 tuvo mejoras en la fibrosis del área de la úlcera.
Las figuras 20A a 20E muestran una comparación de ratas que tenían colitis inducida por TNBS con colitis inducida por DNBS, tratadas con el anticuerpo 320-587 y los efectos a los 7 y 14 días, en (fig. 20A) relación de peso/longitud del colon, (fig. 20B) fibrosis de colon, (fig. 20C) infiltrado de colon y (fig. 20D) daño de colon. La fig. 20E muestra secciones representativas del área de la úlcera a los 7 y 14 días.
Las figuras 21A a 21C muestran que el tratamiento de ratas que tienen tratamiento de colitis inducida por DSS con el anticuerpo 320-587 tuvieron mejoras en (fig. 21A) cambio de peso durante la administración de d Ss , (fig. 21B) puntuación clínica durante la administración de DSS y (fig. 21C) relación de peso/longitud del colon.
La figura 22 muestra cambios en citocinas intraperitoneales inducidas por TL1A en respuesta al tratamiento con 320-587.
Descripción detallada de la invención
A lo largo de la memoria descriptiva y las reivindicaciones se usan diversos términos relacionados con aspectos de la divulgación. Dichos términos deben tener su significado habitual en la técnica, a menos que se indique otra cosa. Otros términos definidos de manera específica deben interpretarse de un modo coherente con la definición proporcionada en el presente documento.
Los términos "sujeto" y "paciente" se usan indistintamente e incluyen cualquier animal. Se prefieren los mamíferos, incluyendo mamíferos de compañía (p. ej., gato, perro) y granja (p. ej., cerdo, caballo, vaca), así como roedores, incluyendo ratones, conejos y ratas, cobayas y otros roedores. Se prefieren más primates no humanos, tales como monos cinomolgos, y se prefieren en gran medida seres humanos.
Una molécula tal como un anticuerpo se ha "aislado" si se ha alterado y/o eliminado de su ambiente natural por la mano de un ser humano.
Como se usan en el presente documento, las formas en singular "un", "uno/a" y "el/la" incluyen referentes plurales a menos que se indique expresamente otra cosa.
La "especificidad" en el contexto de las interacciones anticuerpo-antígeno no es necesariamente una designación absoluta, pero puede constituir un término relativo que significa el grado de selectividad de un anticuerpo para una célula positiva para antígeno en comparación con una célula negativa para antígeno. La especificidad de un anticuerpo para una célula positiva para antígeno está mediada por las regiones variables del anticuerpo y habitualmente por las regiones determinantes de complementariedad (CDR) del anticuerpo. Una construcción puede tener especificidad de aproximadamente 100 a aproximadamente 1000 veces para células positivas para antígeno en comparación con células negativas para antígeno.
Como se usa en el presente documento, el término "recombinante" incluye la expresión de genes preparados mediante ingeniería genética o de otro modo mediante manipulación de laboratorio.
La divulgación proporciona anticuerpos anti-TL1A variantes que comprenden una región variable de cadena pesada y/o ligera alterada de manera recombinante del anticuerpo 320-179, uniéndose dichos anticuerpos variantes de manera específica a TL1A. Estos anticuerpos variantes 320-179 inhiben la capacidad de TL1A para interactuar con DR3 y, en algunos aspectos, también con DcR3 y, además, inhibir la señalización inducida por la interacción de TL1A con DR3. Estos anticuerpos tienen potencia mejorada en relación con el anticuerpo 320-179. Estos anticuerpos tienen afinidad mejorada por TL1A en relación con el anticuerpo 320-179.
La potencia mejorada puede ser de una potencia al menos aproximadamente 10 veces mayor con respecto a un anticuerpo que tiene una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1 y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2. La potencia mejorada puede ser de una potencia al menos aproximadamente 12 veces mayor con respecto a un anticuerpo que tiene una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1 y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2. La potencia mejorada puede ser de una potencia al menos aproximadamente 13 veces mayor con respecto a un anticuerpo que tiene una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1 y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2. La potencia mejorada puede ser de una potencia al menos aproximadamente 15 veces mayor con respecto a un anticuerpo que tiene una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1 y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2. La potencia mejorada puede ser de una potencia al menos aproximadamente 20 veces mayor con respecto a un anticuerpo que tiene una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1 y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2. La potencia mejorada puede ser de una potencia al menos aproximadamente 25 veces mayor con respecto a un anticuerpo que tiene una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1 y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2. La potencia mejorada puede ser de una potencia al menos aproximadamente 27 veces mayor con respecto a un anticuerpo que tiene una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1 y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2. La potencia mejorada puede ser de una potencia al menos aproximadamente 40 veces mayor con respecto a un anticuerpo que tiene una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1 y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2. Se puede determinar el factor de mejora de la potencia, por ejemplo, midiendo la liberación de caspasa en la apoptosis inducida por TL1A en un ensayo de células TF-1.
Los anticuerpos variantes 320-179 (de la presente invención y los descritos en el presente documento) se expresan de manera recombinante y se unen de manera específica a TL1A. El anticuerpo original, 320-179, comprende una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1 y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2. En algunos aspectos, un anticuerpo variante 320-179 comprende una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 3 y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 14, siempre que cuando la región variable de cadena pesada comprenda la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1, la región variable de cadena ligera no comprenda la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2. El anticuerpo variante 320-179 es capaz de inhibir la interacción de TL1A con DR3. El anticuerpo variante 320-179 tiene potencia mejorada con respecto al anticuerpo 320-179 y/o tiene afinidad mejorada por TL1A con respecto al anticuerpo 320-179.
En algunos aspectos, la región variable de cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1 y la región variable de cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 4. En algunos aspectos, la región variable de cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3 y la región variable de cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2. En algunos aspectos, la región variable de cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1 y la región variable de cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 5. En algunos aspectos, la región variable de cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1 y la región variable de cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 6. En algunos aspectos, la región variable de cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1 y la región variable de cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 7. En algunos aspectos, la región variable de cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1 y la región variable de cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 8. De acuerdo con la invención, la región variable de cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3 y la región variable de cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 4. En algunos aspectos, la región variable de cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3 y la región variable de cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 6. En algunos aspectos, la región variable de cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3 y la región variable de cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:
7. En algunos aspectos, la región variable de cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID
NO: 3 y la región variable de cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 8. En algunos aspectos, la región variable de cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3 y la región variable de cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 10.
Como se ha descrito anteriormente, el anticuerpo variante 320-179 de la presente invención comprende una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3 y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 4 y se une específicamente a TL1A. En algunos aspectos, la región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 3 se une a una región constante de cadena pesada de IgG1 (AK) humana (p. ej., SEQ ID NO: 43) de modo que la cadena pesada comprende la SEQ ID NO: 60.
En algunos aspectos, la región variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 4 se une a una región constante de cadena ligera humana lambda (p. ej., SEQ ID NO: 48) de modo que la cadena ligera comprende la SEQ ID NO: 61. El anticuerpo variante 320-179 es capaz de inhibir la interacción de TL1A con DR3. El anticuerpo variante tiene potencia mejorada con respecto al anticuerpo 320-179 y/o tiene afinidad mejorada por TL1A con respecto al anticuerpo 320­
179.
En algunos aspectos, los anticuerpos variantes 320-179 (de la presente invención y los descritos en el presente documento) se expresan de forma recombinante y se unen de manera específica a t L1A, y comprenden una CDR1 de región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 15, una CDR2 de región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 28 y una CDR3 de región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 17. Los anticuerpos pueden comprender una CDR1 de región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 29, una CDR2 de región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 19 y una CDR3 de región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 30. En aspectos en los que la región variable de cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1, la región variable de cadena ligera preferentemente no comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2. Estos anticuerpos variantes 320-179 son capaces de inhibir la interacción de TL1A con DR3. Estos anticuerpos variantes 320-179 tienen potencia mejorada con respecto al anticuerpo 320-179 y/o tienen afinidad mejorada por TL1A con respecto al anticuerpo 320-179.
región varia región varia región varia
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ble de
cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 22.
En algunos aspectos, los anticuerpos se unen específicamente a TL1A y comprenden una CDR1 de región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 15, una CDR2 de región variable
de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 16, una CDR3 de región variable
de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 17, una CDR1 de región variable
de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 23, una CDR2 de región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 19 y una CDR3 de región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 22.
En algunos aspectos, los anticuerpos se unen específicamente a TL1A y comprenden una CDR1 de región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 15, una CDR2 de región variable
de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 16, una CDR3 de región variable
de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 17, una CDR1 de región variable
de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 24, una CDR2 de región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 19 y una CDR3 de región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 22.
En algunos aspectos, los anticuerpos se unen específicamente a TL1A y comprenden una CDR1 de región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 15, una CDR2 de región variable
de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 16, una CDR3 de región variable
de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 17, una CDR1 de región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 25, una CDR2 de región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 19 y una CDR3 de región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 22.
En algunos aspectos, los anticuerpos se unen específicamente a TL1A y comprenden una CDR1 de región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 15, una CDR2 de región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 21, una CDR3 de región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 17, una CDR1 de región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 18, una CDR2 de región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 19 y una CDR3 de región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 20.
En algunos aspectos, los anticuerpos se unen específicamente a TL1A y comprenden una CDR1 de región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 15, una CDR2 de región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 16, una CDR3 de región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 17, una CDR1 de región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 26, una CDR2 de región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 19 y una CDR3 de región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 22.
De acuerdo con la invención, el anticuerpo se une específicamente a TL1A y comprende una CDR1 de región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 15, una CDR2 de región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 21, una CDR3 de región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 17, una CDR1 de región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 18, una CDR2 de región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 19 y una CDR3 de región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 22.
En algunos aspectos, los anticuerpos se unen específicamente a TL1A y comprenden una CDR1 de región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 15, una CDR2 de región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 21, una CDR3 de región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 17, una CDR1 de región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 24, una CDR2 de región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 19 y una CDR3 de región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 22.
En algunos aspectos, los anticuerpos se unen específicamente a TL1A y comprenden una CDR1 de región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 15, una CDR2 de región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 21, una CDR3 de región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 17, una CDR1 de región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 25, una CDR2 de región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 19 y una CDR3 de región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 22.
En algunos aspectos, los anticuerpos se unen específicamente a TL1A y comprenden una CDR1 de región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 15, una CDR2 de región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 21, una CDR3 de región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 17, una CDR1 de región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 26, una CDR2 de región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 19 y una CDR3 de región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 22.
En algunos aspectos, los anticuerpos se unen específicamente a TL1A y comprenden una CDR1 de región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 15, una CDR2 de región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 21, una CDR3 de región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 17, una CDR1 de región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 18, una CDR2 de región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 19 y una CDR3 de región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 27.
También se describen anticuerpos que se unen específicamente a TL1A y comprenden una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1 y una región variable de cadena ligera, siempre que la región variable de cadena ligera no comprenda la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2. En algunos aspectos, los anticuerpos se unen específicamente a TL1A y comprenden una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3 y una región variable de cadena ligera o una cadena ligera. La región variable de cadena ligera puede comprender además una región constante lambda.
En algunos aspectos, los anticuerpos se unen específicamente a TL1A y comprenden una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2 y una región variable de cadena pesada, siempre que la región variable de cadena pesada no comprenda la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1. En algunos aspectos, los anticuerpos se unen específicamente a TL1A y comprenden una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 4 y una región variable de cadena pesada. En algunos aspectos, los anticuerpos se unen específicamente a TL1A y comprenden una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 5 y una región variable de cadena pesada. En algunos aspectos, los anticuerpos se unen específicamente a TL1A y comprenden una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 6 y una región variable de cadena pesada. En algunos aspectos, los anticuerpos se unen específicamente a TL1A y comprenden una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 7 y una región variable de cadena pesada. En algunos aspectos, los anticuerpos se unen específicamente a TL1A y comprenden una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 8 y una región variable de cadena pesada. En algunos aspectos, los anticuerpos se unen específicamente a TL1A y comprenden una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 9 y una región variable de cadena pesada. En algunos aspectos, los anticuerpos se unen específicamente a TL1A y comprenden una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 10 y una región variable de cadena pesada. En algunos aspectos, los anticuerpos se unen específicamente a TL1A y comprenden una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 11 y una región variable de cadena pesada. En algunos aspectos, los anticuerpos se unen específicamente a TL1A y comprenden una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 12 y una región variable de cadena pesada. En algunos aspectos, los anticuerpos se unen específicamente a TL1A y comprenden una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 13 y una región variable de cadena pesada. En algunos aspectos, los anticuerpos se unen específicamente a TL1A y comprenden una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 14 y una región variable de cadena pesada, siempre que cuando la región variable de cadena ligera comprenda la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2, la región variable de cadena pesada no comprenda la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1. La región variable de cadena pesada puede comprender además una región constante de cadena pesada, incluyendo cualquier secuencia de aminoácidos de región constante de cadena pesada de IgG1, IgG2 o IgG4 descrita o ilustrada en el presente documento.
Los anticuerpos variantes 320-179 se unen específicamente a TL1A. Los anticuerpos se unen a TL1A humano y pueden unirse a uno o más de TL1A de mono cinomolgo, TL1A de ratón, TL1A de rata, TL1A de cobaya, TL1A de gato, TL1A de perro, TL1A de cerdo o TL1A de conejo. En algunos aspectos, los anticuerpos pueden unirse a TL1A de múltiples especies diferentes, por ejemplo, si el epítopo es compartido. En algunos aspectos, el TL1A humano comprende la secuencia de aminoácidos de las SeQ ID NO: 31, SeQ ID NO: 32 o SEQ ID NO: 33. En algunos aspectos, el TL1A de mono cinomolgo comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 34. En algunos aspectos, el TL1A de ratón comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 35. En algunos aspectos, el TL1A de rata comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 36. En algunos aspectos, el TL1A de cobaya comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 37. En algunos aspectos, el TL1A de gato comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 38. En algunos aspectos, el TL1A de cerdo comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 39. En algunos aspectos, el TL1A de conejo comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 40. En algunos aspectos, el TL1A de perro comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 41.
Los anticuerpos variantes 320-179 (de la presente invención y los descritos en el presente documento) tienen una afinidad de unión por un epítopo en TL1A que incluye una constante de disociación en equilibrio (Kd), que puede medirse según un ensayo de exclusión cinética, tal como un ensayo KINEXA® (Sapidyne Instruments Inc., Boise, ID). La Kd para la unión a TL1A determinada a partir de un ensayo de exclusión cinética es preferentemente menor de aproximadamente 1000 pM. En algunos aspectos, la Kd para la unión a TL1A determinada a partir de un ensayo de exclusión cinética es menor de aproximadamente 500 pM, o menor de aproximadamente 400 pM, o menor de aproximadamente 300 pM o menor de aproximadamente 200 pM. En algunos aspectos preferidos, la Kd para la unión a TL1A determinada a partir de un ensayo de exclusión cinética es menor de aproximadamente 100 pM.
La Kd para la unión a TL1A determinada a partir de un ensayo de exclusión cinética puede ser de aproximadamente 10 pM a aproximadamente 100 pM. La Kd para la unión a TL1A determinada a partir de un ensayo de exclusión cinética puede ser de aproximadamente 25 pM a aproximadamente 75 pM. La Kd para la unión a TL1A determinada a partir de un ensayo de exclusión cinética puede ser de aproximadamente 30 pM a aproximadamente 60 pM. La Kd para la unión a TL1A determinada a partir de un ensayo de exclusión cinética puede ser de aproximadamente 30 pM a aproximadamente 50 pM. La Kd para la unión a TL1A determinada a partir de un ensayo de exclusión cinética puede ser de aproximadamente 35 pM a aproximadamente 50 pM. La Kd para la unión a TL1A determinada a partir de un ensayo de exclusión cinética puede ser de aproximadamente 36 pM a aproximadamente 46 pM. La Kd para la unión a TL1A determinada a partir de un ensayo de exclusión cinética puede ser de aproximadamente 38 pM a aproximadamente 44 pM. La Kd para la unión a TL1A determinada a partir de un ensayo de exclusión cinética puede ser de aproximadamente 39 pM a aproximadamente 43 pM. La Kd para la unión a TL1A determinada a partir de un ensayo de exclusión cinética puede ser de aproximadamente 40 pM a aproximadamente 45 pM. La Kd para la unión a TL1A determinada a partir de un ensayo de exclusión cinética puede ser de aproximadamente 35 pM a aproximadamente 42 pM. La Kd para la unión a TL1A determinada a partir de un ensayo de exclusión cinética puede ser de aproximadamente 40 pM. La Kd para la unión a TL1A determinada a partir de un ensayo de exclusión cinética puede ser de aproximadamente 41 pM. La Kd para la unión a TL1A determinada a partir de un ensayo de exclusión cinética puede ser de aproximadamente 42 pM. El ensayo de exclusión cinética puede usar la molécula de anticuerpo o la molécula de TL1A como el compañero de unión constante y la otra molécula como el valorante.
Los anticuerpos anti-TL1A variantes 320-179 (de la presente invención y los descritos en el presente documento) son preferentemente capaces de unirse a células positivas para TL1A. El anticuerpo puede unirse a una célula positiva para TL1A con un valor de CE50 de menos de aproximadamente 100 nM. El anticuerpo puede unirse a una célula positiva para TL1A con un valor de CE50 de menos de aproximadamente 75 nM. El anticuerpo puede unirse a una célula positiva para TL1A con un valor de CE50 de menos de aproximadamente 50 nM. El anticuerpo puede unirse a una célula positiva para TL1A con un valor de CE50 de menos de aproximadamente 30 nM. El anticuerpo puede unirse a una célula positiva para TL1A con un valor de CE50 de menos de aproximadamente 25 nM. El anticuerpo puede unirse a una célula positiva para TL1A con un valor de CE50 de menos de aproximadamente 20 nM. El anticuerpo puede unirse a una célula positiva para TL1A con un valor de CE50 de menos de aproximadamente 18 nM. El anticuerpo puede unirse a una célula positiva para TL1A con un valor de CE50 de menos de aproximadamente 15 nM. El anticuerpo puede unirse a una célula positiva para TL1A con un valor de CE50 de menos de aproximadamente 13 nM. El anticuerpo puede unirse a una célula positiva para TL1A con un valor de CE50 de menos de aproximadamente 10 nM.
Los anticuerpos variantes 320-179 (de la presente invención y los descritos en el presente documento) son preferentemente monoclonales y son más preferentemente anticuerpos de longitud completa que comprenden dos cadenas pesadas y dos cadenas ligeras. En algunos aspectos, los anticuerpos comprenden derivados o fragmentos o partes de anticuerpos que conservan la especificidad de unión a antígeno, y también preferentemente conservan la mayor parte o la totalidad de la afinidad, de la molécula de anticuerpo parental 320-179 (p. ej., para TL1A). Por ejemplo, los derivados pueden comprender al menos una región variable (bien una región variable de cadena pesada o de cadena ligera). Otros ejemplos de derivados y fragmentos de anticuerpos adecuados incluyen, sin limitación, anticuerpos con especificidad poliepitópica, anticuerpos biespecíficos, anticuerpos multiespecíficos, diacuerpos, moléculas monocatenarias, así como moléculas FAb, F(ab')2, Fd, Fabc y Fv, anticuerpos monocatenarios (Sc), anticuerpos Fv monocatenarios (scFv), cadenas ligeras de anticuerpos individuales, cadenas pesadas de anticuerpos individuales, fusiones entre cadenas de anticuerpos y otras moléculas, monómeros o dímeros de cadena pesada, monómeros o dímeros de cadena ligera, dímeros que consisten en una cadena pesada y una ligera y otros multímeros. Los anticuerpos Fv monocatenarios pueden ser multivalentes. Todos los isotipos de anticuerpos pueden usarse para producir derivados de anticuerpos, fragmentos y partes. Pueden producirse derivados, fragmentos y/o partes de anticuerpos de manera recombinante y ser expresados por cualquier tipo celular, procariota o eucariota.
En un anticuerpo de longitud completa, cada cadena pesada está compuesta por una región variable de cadena pesada (abreviada en el presente documento como HCVR o VH) y una región constante de cadena pesada. La región constante de cadena pesada está compuesta por tres dominios, CH1, CH2 y CH3. Cada cadena ligera está compuesta por una región variable de cadena ligera (abreviada en el presente documento como LCVR o VL) y una región constante de cadena ligera. La región constante de cadena ligera comprende un dominio, CL. Las regiones VH y VL pueden subdividirse adicionalmente en regiones de hipervariabilidad, denominadas regiones determinantes de complementariedad (CDR), intercaladas con regiones que están más conservadas, denominadas regiones marco conservadas (FR). Cada VH y VL está compuesta por tres CDR y cuatro FR, dispuestas desde el extremo amino hasta el extremo carboxilo en el siguiente orden: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Normalmente, es menos probable que las propiedades de unión a antígeno de un anticuerpo sean alteradas por cambios en las secuencias de FR que por cambios en las secuencias de CDR. Las moléculas de inmunoglobulina pueden ser de cualquier tipo (p. ej., IgG, IgE, IgM, IgD, IgA e IgY), clase (p. ej., IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2) o subclase.
Los anticuerpos variantes 320-179 (de la presente invención y los descritos en el presente documento) son completamente humanos. Son anticuerpos completamente humanos aquellos en los que la molécula completa es humana o de otro modo de origen humano o incluye una secuencia de aminoácidos idéntica a una forma humana del anticuerpo. Los anticuerpos completamente humanos incluyen los obtenidos de una biblioteca de genes V humanos, por ejemplo, donde los genes humanos que codifican regiones variables de anticuerpos se expresan de manera recombinante. Pueden expresarse anticuerpos completamente humanos en otros organismos (p. ej., ratones y tecnología xenomouse) o células de otros organismos transformados con genes que codifican anticuerpos humanos. No obstante, los anticuerpos completamente humanos pueden incluir restos de aminoácidos no codificados por secuencias humanas, p. ej., mutaciones introducidas por mutaciones aleatorias o dirigidas.
En algunos aspectos, los anticuerpos variantes 320-179 pueden comprender estructuras proteicas no procedentes de inmunoglobulina. Por ejemplo, se puede hacer referencia a (Ku y Schutz, 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 6552­ 6556) que describe un citocromo b562 de proteína de haz de cuatro hélices que tiene dos bucles aleatorizados para crear CDR, que se han seleccionado para unión a antígeno.
Los anticuerpos variantes 320-179 (de la presente invención y los descritos en el presente documento) pueden comprender modificaciones o restos postraduccionales, lo que puede influir en la actividad o estabilidad del anticuerpo. Estas modificaciones o restos incluyen, pero sin limitación, restos metilados, acetilados, glucosilados, sulfatados, fosforilados, carboxilados y amidados y otros restos que son bien conocidos en la técnica. Los restos incluyen cualquier grupo químico o combinaciones de grupos que se encuentran habitualmente en moléculas de inmunoglobulina en la naturaleza o que se añaden de otro modo a anticuerpos mediante sistemas de expresión recombinantes, incluyendo sistemas de expresión procariotas y eucariotas.
Los ejemplos de modificaciones de las cadenas laterales contempladas por la divulgación incluyen modificaciones de grupos amino tales como por alquilación reductora mediante reacción con un aldehído seguido de reducción con NaBH4; amidación con metilacetimidato; acilación con anhídrido acético; carbamoilación de grupos amino con cianato; trinitrobencilación de grupos amino con ácido 2,4,6-trinitrobencenosulfónico (TNBS); acilación de grupos amino con anhídrido succínico y anhídrido tetrahidroftálico; y piridoxilación de lisina con piridoxal-5-fosfato seguido de reducción con NaBH4.
El grupo de guanidina de restos de arginina puede modificarse mediante la formación de productos de condensación heterocíclicos con reactivos tales como 2,3-butanodiona, fenilglioxal y glioxal. El grupo carboxilo puede modificarse mediante la activación de carbodiimida a través de la formación de O-acilisourea seguido de derivación posterior, por ejemplo, a una amida correspondiente. Los grupos sulfhidrilo pueden modificarse mediante métodos tales como carboximetilación con ácido yodoacético o yodoacetamida; oxidación de ácido perfórmico a ácido cisteico; formación de disulfuros mixtos con otros compuestos de tiol; reacción con maleimida, anhídrido maleico u otra maleimida sustituida; formación de derivados mercuriales usando 4-cloromercuribenzoato, ácido 4-cloromercurifenilsulfónico, cloruro de fenilmercurio, 2-cloromercuri-4-nitrofenol y otros mercuriales; carbamoilación con cianato a pH alcalino. Los restos de triptófano pueden modificarse mediante, por ejemplo, oxidación con N-bromosuccinimida o alquilación del anillo de indol con bromuro de 2-hidroxi-5-nitrobencilo o haluros de sulfenilo. Los restos de tirosina, por otro lado, pueden alterarse mediante nitración con tetranitrometano para formar un derivado de 3-nitrotirosina. Se puede realizar modificación del anillo de imidazol de un resto de histidina mediante alquilación con derivados de ácido yodoacético o N-carbetoxilación con dietilpirocarbonato.
Los anticuerpos variantes 320-179 (de la presente invención y los descritos en el presente documento) pueden incluir modificaciones que modulan la semivida en suero y la biodistribución, incluyendo, sin limitación, modificaciones que modulan la interacción del anticuerpo con el receptor de Fc neonatal (FcRn), un receptor con una función clave en la protección de la IgG del catabolismo y el mantenimiento de alta concentración de anticuerpo en suero. Pueden producirse modificaciones moduladoras de la semivida en suero en la región Fc de IgG1, IgG2 o IgG4, incluyendo la sustitución triple de M252Y/S254T/T256E (las sustituciones "YTE", con numeración según el sistema de numeración EU (Edelman, G.M. et al. (1969) Proc. Natl. Acad. USA 63, 78-85)), como se describe en la patente de los Estados Unidos n.° 7.083.784. Pueden producirse otras sustituciones en las posiciones 250 y 428, véase, p. ej., patente de los Estados Unidos n.° 7.217.797, así como en las posiciones 307, 380 y 434, véase, p. ej., publicación de PCT n.° WO 00/042072. Se describen ejemplos de sustituciones de aminoácidos de dominio constante que modulan la unión con receptores de Fc y la función posterior mediada por estos receptores, incluyendo unión a FcRn y semivida en suero, en las publicaciones de los Estados Unidos n.° 2009/0142340, 2009/0068175 y 2009/0092599. Los anticuerpos de cualquier clase pueden tener la lisina C-terminal de cadena pesada omitida o eliminada para reducir la heterogeneidad (AK). La sustitución de S228P (numeración EU) en la IgG4 humana puede estabilizar el intercambio de la rama de Fab de anticuerpos in vivo (Labrin et al. (2009) Nature Biotechnology 27: 8; 767-773) y esta sustitución puede estar presente al mismo tiempo que las modificaciones YTE y/o AK.
Los anticuerpos variantes 320-179 comprenden dominios constantes humanos. Los dominios constantes de cadena pesada son preferentemente dominios constantes de IgG1, IgG2 o IgG4 humanos. Los dominios constantes de cadena ligera son preferentemente dominios constantes lambda humanos. Un dominio lambda humano adecuado comprende la SEQ ID NO: 48.
Las regiones constantes de IgG1 de cadena pesada humana que pueden usarse con los anticuerpos variantes 320­ 179 pueden seleccionarse entre IgG1 humana (SEQ ID NO: 42), IgG1 humana (AK) (SEQ ID NO: 43), IgG1 humana 252Y/254T/256E (SEQ ID NO: 44), IgG1 humana 252Y/254T/256E (AK) (SEQ ID NO: 64), IgG1 humana L234A/L235A/G237A (SEQ ID NO: 63), IgG1 humana L234A/L235A/G237A (AK) (SEQ ID NO: 62), IgG1 humana L235A/G237A (SEQ ID NO: 65) e IgG1 humana L235A/G237A (AK) (SEQ ID NO: 66). Las regiones constantes de IgG2 de cadena pesada humana que se pueden usar con los anticuerpos variantes 320-179 se pueden seleccionar entre IgG2 humana con o sin AK (SEQ iD NO: 67 y SEQ ID NO: 70) e IgG2 humana A330S/P331S con o sin (AK) (SEQ ID NO: 71 y SEQ ID NO: 68). Las regiones constantes de IgG4 de cadena pesada humana que pueden usarse con los anticuerpos variantes 320-179 pueden seleccionarse entre IgG4 humana S228P (SEQ ID NO: 45), IgG4 humana S228P (AK) (SEQ ID NO: 46), IgG4 humana 228P/252Y/254T/256E (SEQ ID NO: 47) e IgG4 humana 228P/252Y/254T/256E (AK) (SEQ ID NO: 69).
Los anticuerpos variantes 320-179 pueden estar marcados, unidos o conjugados con cualquier resto químico o de biomolécula. Los anticuerpos marcados pueden encontrar uso en aplicaciones terapéuticas, de diagnóstico o de investigación básica. Dichos marcadores/conjugados pueden ser detectables, tales como fluorocromos, sondas electroquimioluminiscentes, puntos cuánticos, radiomarcadores, enzimas, proteínas fluorescentes, proteínas luminiscentes y biotina. Los marcadores/conjugados pueden ser agentes quimioterapéuticos, toxinas, isótopos y otros agentes usados para tratar afecciones tales como la destrucción de células cancerosas. Los agentes quimioterapéuticos pueden ser cualquiera que sea adecuado para el fin para el que se usa el anticuerpo.
Los anticuerpos pueden derivatizarse mediante grupos protectores/bloqueadores conocidos para evitar la escisión proteolítica o mejorar la actividad o la estabilidad.
En la divulgación se presentan secuencias polinucleotídicas que codifican anticuerpos (de la presente invención y los descritos en el presente documento) y sus subdominios (p. ej., FR y CDR). Los polinucleótidos incluyen, pero sin limitación, ARN, ADN, ADNc, híbridos de ARN y ADN y cadenas mono, bi o tricatenarias de ARN, ADN o híbridos de los mismos. Los polinucleótidos pueden comprender una secuencia de ácido nucleico que codifica la región variable de cadena pesada y/o la región variable de cadena ligera de un anticuerpo variante 320-179 como se describe o ilustra en el presente documento. También se encuentran dentro del alcance de la divulgación complementos de las secuencias polinucleotídicas.
Un polinucleótido puede comprender una secuencia de ácido nucleico que codifica una región variable de cadena pesada de anticuerpo que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3. Un polinucleótido que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3 puede comprender la secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID NO: 51.
Un polinucleótido puede comprender una secuencia de ácido nucleico que codifica una región variable de cadena pesada de anticuerpo que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1. Un polinucleótido que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1 puede comprender la secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID NO: 49.
Un polinucleótido puede comprender una secuencia de ácido nucleico que codifica una región variable de cadena ligera de anticuerpo que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2. Un polinucleótido que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2 puede comprender la secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID NO: 50.
Un polinucleótido puede comprender una secuencia de ácido nucleico que codifica una región variable de cadena ligera de anticuerpo que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 4. Un polinucleótido que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 4 puede comprender la secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID NO: 52.
Un polinucleótido puede comprender una secuencia de ácido nucleico que codifica una región variable de cadena ligera de anticuerpo que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 5. Un polinucleótido que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 5 puede comprender la secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID NO: 53.
Un polinucleótido puede comprender una secuencia de ácido nucleico que codifica una región variable de cadena ligera de anticuerpo que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 6. Un polinucleótido que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 6 puede comprender la secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID NO: 54.
Un polinucleótido puede comprender una secuencia de ácido nucleico que codifica una región variable de cadena ligera de anticuerpo que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 7. Un polinucleótido que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 7 puede comprender la secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID NO: 55.
Un polinucleótido puede comprender una secuencia de ácido nucleico que codifica una región variable de cadena ligera de anticuerpo que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 8. Un polinucleótido que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 8 puede comprender la secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID NO: 56.
Un polinucleótido puede comprender una secuencia de ácido nucleico que codifica una región variable de cadena ligera de anticuerpo que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 10. Un polinucleótido que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 10 puede comprender la secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID NO: 57.
En algunos aspectos, un polinucleótido comprende una primera secuencia de ácido nucleico que codifica una región variable de cadena pesada de anticuerpo y una segunda secuencia de ácido nucleico que codifica una región variable de cadena ligera de anticuerpo. Una primera secuencia de ácido nucleico puede codificar una región variable de cadena pesada de anticuerpo que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3 y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2. Un polinucleótido que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3 puede comprender la secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID NO: 51 y un polinucleótido que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2 puede comprender la secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID NO: 50.
Una primera secuencia de ácido nucleico puede codificar una región variable de cadena pesada de anticuerpo que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3 y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 4. Un polinucleótido que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3 puede comprender la secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID NO: 51 y un polinucleótido que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 4 puede comprender la secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID NO: 52.
Una primera secuencia de ácido nucleico puede codificar una región variable de cadena pesada de anticuerpo que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3 y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 6. Un polinucleótido que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3 puede comprender la secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID NO: 51 y un polinucleótido que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 6 puede comprender la secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID NO: 54.
Una primera secuencia de ácido nucleico puede codificar una región variable de cadena pesada de anticuerpo que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3 y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 7. Un polinucleótido que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3 puede comprender la secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID NO: 51 y un polinucleótido que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 7 puede comprender la secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID NO: 55.
Una primera secuencia de ácido nucleico puede codificar una región variable de cadena pesada de anticuerpo que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3 y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 8. Un polinucleótido que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3 puede comprender la secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID NO: 51 y un polinucleótido que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 8 puede comprender la secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID NO: 56.
Una primera secuencia de ácido nucleico puede codificar una región variable de cadena pesada de anticuerpo que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3 y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 10. Un polinucleótido que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3 puede comprender la secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID NO: 51 y un polinucleótido que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 10 puede comprender la secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID NO: 57.
Una primera secuencia de ácido nucleico puede codificar una región variable de cadena pesada de anticuerpo que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1 y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 4. Un polinucleótido que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1 puede comprender la secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID NO: 49 y un polinucleótido que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 4 puede comprender la secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID NO: 52.
Una primera secuencia de ácido nucleico puede codificar una región variable de cadena pesada de anticuerpo que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1 y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 5. Un polinucleótido que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1 puede comprender la secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID NO: 49 y un polinucleótido que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 5 puede comprender la secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID NO: 53.
Una primera secuencia de ácido nucleico puede codificar una región variable de cadena pesada de anticuerpo que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1 y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 6. Un polinucleótido que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1 puede comprender la secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID NO: 49 y un polinucleótido que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 6 puede comprender la secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID NO: 54.
Una primera secuencia de ácido nucleico puede codificar una región variable de cadena pesada de anticuerpo que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1 y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 7. Un polinucleótido que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1 puede comprender la secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID NO: 49 y un polinucleótido que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 7 puede comprender la secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID NO: 55.
Una primera secuencia de ácido nucleico puede codificar una región variable de cadena pesada de anticuerpo que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1 y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 8. Un polinucleótido que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1 puede comprender la secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID NO: 49 y un polinucleótido que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 8 puede comprender la secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID NO: 56.
En algunos aspectos, un polinucleótido comprende una primera secuencia de ácido nucleico que codifica una región variable de cadena pesada de anticuerpo y una segunda secuencia de ácido nucleico que codifica una región constante de cadena pesada. En aspectos preferentes, un polinucleótido comprende una primera secuencia de ácido nucleico que codifica una región variable de cadena pesada de anticuerpo que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3 y una segunda secuencia de ácido nucleico que codifica una región constante de cadena pesada de IgG1 (AK) de la SEQ ID NO: 43, por ejemplo, un polinucleótido que comprende la secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID NO: 58.
En algunos aspectos, un polinucleótido comprende una primera secuencia de ácido nucleico que codifica una región variable de cadena ligera de anticuerpo y una segunda secuencia de ácido nucleico que codifica una región constante de cadena ligera. En aspectos preferentes, un polinucleótido comprende una primera secuencia de ácido nucleico que codifica una región variable de cadena ligera de anticuerpo que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 4 y una segunda secuencia de ácido nucleico que codifica una región constante de cadena ligera lambda de la SEQ ID NO: 48, por ejemplo, un polinucleótido que comprende la secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID NO: 59.
Cualquiera de los polinucleótidos descritos o ilustrados en el presente documento puede estar comprendido dentro de un vector. Por tanto, se proporcionan vectores que comprenden polinucleótidos como parte de la divulgación. Los vectores pueden ser vectores de expresión. Se proporcionan por tanto vectores de expresión recombinante que contienen una secuencia que codifica un polipéptido de interés. El vector de expresión puede contener una o más secuencias adicionales, tales como, pero sin limitación, secuencias reguladoras, un marcador de selección, un marcador de purificación o una señal de poliadenilación. Dichos elementos reguladores pueden incluir un promotor de la transcripción, potenciadores, sitios de unión ribosómica de ARNm o secuencias que controlan la terminación de la transcripción y la traducción.
Los vectores de expresión, especialmente vectores de expresión de mamíferos, pueden incluir uno o más elementos no transcritos, tales como un origen de replicación, un promotor adecuado y potenciador ligado al gen para expresar, otras secuencias no transcritas flanqueantes 5' o 3', secuencias no traducidas 5' o 3' (tales como sitios de unión a ribosomas necesarios), un sitio de poliadenilación, sitios donantes y aceptores de corte y empalme o secuencias de terminación de la transcripción. También puede incorporarse un origen de replicación que confiere la capacidad de replicar en un hospedador específico.
Los vectores pueden usarse para transformar cualquiera de una amplia gama de células hospedadoras bien conocidas por los expertos en la materia y preferentemente células hospedadoras capaces de expresar anticuerpos. Los vectores incluyen, sin limitación, plásmidos, fagémidos, cósmidos, bácmidos, cromosomas artificiales de bacterias (BAC), cromosomas artificiales de levadura (YAC) y baculovirus, así como otros vectores bacterianos, eucariotas, de levadura y víricos. Las células hospedadoras adecuadas incluyen, sin limitación, células CHO, células NS0, células HEK293 o cualquier línea celular estable eucariota conocida o producida, y también incluyen bacterias, levadura y células de insectos.
Los anticuerpos también pueden ser producidos por células de hibridoma; siendo los métodos para producir hibridomas bien conocidos y establecidos en la técnica.
La divulgación también proporciona composiciones que comprenden los anticuerpos variantes 320-179 (de la presente invención y los descritos en el presente documento). Las composiciones pueden comprender cualquiera de los anticuerpos descritos y/o ilustrados en el presente documento y un vehículo aceptable tal como un vehículo farmacéuticamente aceptable. Los vehículos adecuados incluyen cualquier medio que no interfiera con la actividad biológica del anticuerpo y preferentemente no sea tóxico para un hospedador al que se administra. Las composiciones pueden formularse para su administración a un sujeto en cualquier forma farmacéutica adecuada.
Los anticuerpos variantes 320-179 (de la presente invención y los descritos en el presente documento) pueden usarse para tratar una enfermedad de las vías respiratorias, una enfermedad gastrointestinal, artritis o una dermatopatía en un sujeto. Por tanto, la divulgación presenta métodos de tratamiento. En general, los métodos comprenden administrar un anticuerpo variante 320-179, o composición del mismo, a un sujeto que necesite tratamiento para una enfermedad de las vías respiratorias, enfermedad gastrointestinal, artritis o una dermatopatía, de modo que se trate la enfermedad de las vías respiratorias, enfermedad gastrointestinal, artritis o dermatopatía. El anticuerpo variante 320-179 puede comprender cualquier anticuerpo descrito o ilustrado en el presente documento. La administración puede comprender la administración subcutánea del anticuerpo. La administración puede comprender la administración intravenosa del anticuerpo. El sujeto es preferentemente un ser humano. El sujeto puede ser un primate no humano tal como un mono cinomolgo o puede ser un mamífero tal como un ratón, rata, cobaya, gato, cerdo, conejo o perro.
En aspectos en los que se va a tratar una enfermedad de las vías respiratorias, los métodos comprenden administrar un anticuerpo variante 320-179, o composición del mismo, a un sujeto que necesite tratamiento para una enfermedad de las vías respiratorias. La enfermedad de las vías respiratorias puede comprender una o más de asma, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), fibrosis pulmonar, sarcoidosis pulmonar, rinitis alérgica o fibrosis quística. Por tanto, por ejemplo, en algunos aspectos, los métodos comprenden administrar un anticuerpo variante 320-179, o composición del mismo, a un sujeto que necesite tratamiento para asma, de modo que se trate el asma en el sujeto. En algunos aspectos, los métodos comprenden administrar un anticuerpo variante 320-179, o composición del mismo, a un sujeto que necesite tratamiento para EPOC, de modo que se trate la EPOC en el sujeto. En algunos aspectos, los métodos comprenden administrar un anticuerpo variante 320-179, o composición del mismo, a un sujeto que necesite tratamiento para fibrosis pulmonar, de modo que se trate la fibrosis pulmonar en el sujeto. En algunos aspectos, los métodos comprenden administrar un anticuerpo variante 320-179, o composición del mismo, a un sujeto que necesite tratamiento para sarcoidosis pulmonar, de modo que se trate la sarcoidosis pulmonar en el sujeto. En algunos aspectos, los métodos comprenden administrar un anticuerpo variante 320-179, o composición del mismo, a un sujeto que necesite tratamiento para rinitis alérgica, de modo que se trate la rinitis alérgica en el sujeto. En algunos aspectos, los métodos comprenden administrar un anticuerpo variante 320-179, o composición del mismo, a un sujeto que necesite tratamiento para fibrosis quística, de modo que se trate la fibrosis quística en el sujeto.
En aspectos en los que se va a tratar una enfermedad gastrointestinal, los métodos comprenden administrar un anticuerpo variante 320-179, o composición del mismo, a un sujeto que necesite tratamiento para una enfermedad gastrointestinal. La enfermedad gastrointestinal puede comprender una o más de enfermedad inflamatoria intestinal (EII), enfermedad de Crohn, colitis, colitis ulcerosa, síndrome del intestino irritable (SII), esofagitis eosinofílica o una enfermedad o afección gastrointestinal asociada con la fibrosis quística. Por tanto, por ejemplo, en algunos aspectos, los métodos comprenden administrar un anticuerpo variante 320-179, o composición del mismo, a un sujeto que necesite tratamiento para EII, de modo que se trate la EII en el sujeto. En algunos aspectos, los métodos comprenden administrar un anticuerpo variante 320-179, o composición del mismo, a un sujeto que necesite tratamiento para enfermedad de Crohn, de modo que se trate la enfermedad de Crohn en el sujeto. En algunos aspectos, los métodos comprenden administrar un anticuerpo variante 320-179, o composición del mismo, a un sujeto que necesite tratamiento para colitis, de modo que se trate la colitis en el sujeto. En algunos aspectos, los métodos comprenden administrar un anticuerpo variante 320-179, o composición del mismo, a un sujeto que necesite tratamiento para colitis ulcerosa, de modo que se trate la colitis ulcerosa en el sujeto. En algunos aspectos, los métodos comprenden administrar un anticuerpo variante 320-179, o composición del mismo, a un sujeto que necesite tratamiento para SII, de modo que se trate el SII en el sujeto. En algunos aspectos, los métodos comprenden administrar un anticuerpo variante 320-179, o composición del mismo, a un sujeto que necesite tratamiento para esofagitis eosinofílica, de modo que se trate la esofagitis eosinofílica en el sujeto. En algunos aspectos, los métodos comprenden administrar un anticuerpo variante 320-179, o composición del mismo, a un sujeto que necesite tratamiento para una enfermedad o afección gastrointestinal asociada con fibrosis quística, de modo que se trate la enfermedad o afección gastrointestinal asociada con fibrosis quística en el sujeto.
En aspectos en los que se va a tratar la artritis, los métodos comprenden administrar un anticuerpo variante 320-179, o composición del mismo, a un sujeto que necesite tratamiento para artritis. La artritis puede comprender artritis reumatoide. Por tanto, por ejemplo, en algunos aspectos, los métodos comprenden administrar un anticuerpo variante 320-179, o composición del mismo, a un sujeto que necesite tratamiento para artritis reumatoide, de modo que se trate la artritis reumatoide en el sujeto.
En aspectos en los que se va a tratar una dermatopatía, los métodos comprenden administrar un anticuerpo variante 320-179, o composición del mismo, a un sujeto que necesite tratamiento para una dermatopatía. La dermatopatía puede comprender una o más de dermatitis atópica, eccema o esclerodermia. Por tanto, por ejemplo, en algunos aspectos, los métodos comprenden administrar un anticuerpo variante 320-179, o composición del mismo, a un sujeto que necesite tratamiento para dermatitis atópica, de modo que se trate la dermatitis atópica en el sujeto. En algunos aspectos, los métodos comprenden administrar un anticuerpo variante 320-179, o composición del mismo, a un sujeto que necesite tratamiento para eccema, de modo que se trate el eccema en el sujeto. En algunos aspectos, los métodos comprenden administrar un anticuerpo variante 320-179, o composición del mismo, a un sujeto que necesite tratamiento para esclerodermia, de modo que se trate la esclerodermia en el sujeto.
Los anticuerpos variantes 320-179 descritos o ilustrados en el presente documento pueden usarse en la preparación de un medicamento para su uso en el tratamiento de una enfermedad de las vías respiratorias. Los anticuerpos variantes 320-179 descritos o ilustrados en el presente documento pueden usarse en la preparación de un medicamento para su uso en el tratamiento de una enfermedad gastrointestinal. Los anticuerpos variantes 320- 179 descritos o ilustrados en el presente documento pueden usarse en la preparación de un medicamento para su uso en el tratamiento de la artritis. Los anticuerpos variantes 320-179 descritos o ilustrados en el presente documento pueden usarse en la preparación de un medicamento para su uso en el tratamiento de una dermatopatía. Los anticuerpos variantes 320-179 descritos o ilustrados en el presente documento pueden usarse en la preparación de un medicamento para su uso en el tratamiento de una cualquiera de asma, EPOC, fibrosis pulmonar, sarcoidosis pulmonar, rinitis alérgica, fibrosis quística, enfermedad inflamatoria intestinal, enfermedad de Crohn, colitis, colitis ulcerosa, síndrome del intestino irritable, esofagitis eosinofílica, una enfermedad o afección gastrointestinal asociada con la fibrosis quística, artritis, artritis reumatoide, dermatitis atópica, eccema o esclerodermia.
Los anticuerpos variantes 320-179 descritos o ilustrados en el presente documento pueden usarse en el tratamiento de una enfermedad de las vías respiratorias. Los anticuerpos variantes 320-179 descritos o ilustrados en el presente documento pueden usarse en el tratamiento de una enfermedad gastrointestinal. Los anticuerpos variantes 320-179 descritos o ilustrados en el presente documento pueden usarse en el tratamiento del asma. Los anticuerpos variantes 320-179 descritos o ilustrados en el presente documento pueden usarse en el tratamiento de una dermatopatía. Los anticuerpos variantes 320-179 descritos o ilustrados en el presente documento pueden usarse en el tratamiento de la EPOC. Los anticuerpos variantes 320-179 descritos o ilustrados en el presente documento pueden usarse en el tratamiento de la fibrosis pulmonar. Los anticuerpos variantes 320-179 descritos o ilustrados en el presente documento pueden usarse en el tratamiento de la sarcoidosis pulmonar. Los anticuerpos variantes 320-179 descritos o ilustrados en el presente documento pueden usarse en el tratamiento de la rinitis alérgica. Los anticuerpos variantes 320-179 descritos o ilustrados en el presente documento pueden usarse en el tratamiento de la fibrosis crítica. Los anticuerpos variantes 320-179 descritos o ilustrados en el presente documento pueden usarse en el tratamiento de la enfermedad inflamatoria intestinal. Los anticuerpos variantes 320- 179 descritos o ilustrados en el presente documento pueden usarse en el tratamiento de la enfermedad de Crohn. Los anticuerpos variantes 320-179 descritos o ilustrados en el presente documento pueden usarse en el tratamiento de la colitis. Los anticuerpos variantes 320-179 descritos o ilustrados en el presente documento pueden usarse en el tratamiento de la colitis ulcerosa. Los anticuerpos variantes 320-179 descritos o ilustrados en el presente documento pueden usarse en el tratamiento de la esofagitis eosinofílica. Los anticuerpos variantes 320-179 descritos o ilustrados en el presente documento pueden usarse en el tratamiento de una enfermedad o afección gastrointestinal asociada con la fibrosis quística. Los anticuerpos variantes 320-179 descritos o ilustrados en el presente documento pueden usarse en el tratamiento del síndrome del intestino irritable. Los anticuerpos variantes 320-179 descritos o ilustrados en el presente documento pueden usarse en el tratamiento de la artritis reumatoide. Los anticuerpos variantes 320-179 descritos o ilustrados en el presente documento pueden usarse en el tratamiento de la dermatitis atópica. Los anticuerpos variantes 320-179 descritos o ilustrados en el presente documento pueden usarse en el tratamiento del eccema. Los anticuerpos variantes 320-179 descritos o ilustrados en el presente documento pueden usarse en el tratamiento de la esclerodermia.
También se proporciona un método in vitro para detectar TL1A en una muestra tisular aislada de un sujeto, que comprende poner en contacto el anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones 1-19 con una muestra tisular aislada de un sujeto para formar un complejo de anticuerpo-TL1A y detectar el complejo en la muestra tisular.
Se puede usar un anticuerpo variante 320-179 para detectar células positivas para TL1A, por ejemplo, en una muestra tisular obtenida de un sujeto. Los anticuerpos se pueden usar para detectar células mononucleares de sangre periférica (PBMC) positivas para TL1A, por ejemplo, PBMC obtenidas de un sujeto. Los anticuerpos se pueden usar para detectar TL1A en el suero sanguíneo. Dichos métodos pueden llevarse a cabo in vivo, ex vivo, in vitro o in situ. En general, los métodos comprenden poner en contacto cualquiera de los anticuerpos variantes 320-179 descritos o ilustrados en el presente documento con un tejido o células, p. ej., PBMC, aislados de un sujeto para formar un complejo de anticuerpo-TL1A y detectar el complejo en el tejido o en las células. El anticuerpo puede estar marcado con un marcador detectable. El anticuerpo puede detectarse con un anticuerpo secundario que está marcado con un marcador detectable. El tejido puede comprender o puede ser un líquido biológico tal como sangre o suero sanguíneo. El tejido puede comprender o puede ser tejido de las vías respiratorias, tal como tejido pulmonar, esputo, líquido de lavado broncoalveolar, tejido gastrointestinal o líquido de lavado gastrointestinal. El tejido puede comprender o puede ser piel o tejido dérmico. El tejido puede comprender o puede ser tejido de cualquier articulación del cuerpo. El método puede comprender además aislar el tejido del sujeto. Dichos métodos pueden ser cuantitativos, por ejemplo, cuantificando el nivel de TL1A en el tejido, cuantificando el nivel de células positivas para TL1A o cuantificando el nivel de TL1A en células, o cuantificando el nivel de TL1A en el suero.
La divulgación también presenta kits que comprenden cualquiera de los anticuerpos variantes 320-179 descritos e ilustrados en el presente documento. Los equipos pueden usarse para suministrar anticuerpos y otros agentes para su uso en métodos de diagnóstico, investigación básica o terapéuticos, entre otros. En algunos aspectos, los kits comprenden uno cualquiera o más de los anticuerpos variantes 320-179 descritos o ilustrados en el presente documento e instrucciones para usar el o los anticuerpos en un método para tratar una enfermedad de las vías respiratorias, en un método para tratar una enfermedad gastrointestinal o en un método para tratar la artritis.
Los siguientes ejemplos se proporcionan para describir la divulgación con mayor detalle. Su objetivo es ilustrar, no limitar, la divulgación. La referencia a variantes 320-179 distintas de 320-587 se incluye con fines de referencia.
Ejemplo 1
Materiales y métodos
Las posiciones de aminoácidos en estos ejemplos están numeradas según el sistema de numeración de Kabat. Las CDR se definen según el método AbM del sistema de definición de CDR a lo largo del presente documento.
1.1. Generación de paquetes variantes. Las secuencias de aminoácidos de región variable de cadena pesada y ligera del anticuerpo 320-179 (SEQ ID NO: 1 y 2 respectivamente) se usaron como moldes para el diseño de variantes puntuales. 320-179 se ha descrito previamente en la publicación de los Estados Unidos n.° 2014/0255302 (VH es SEQ ID NO: 186 y VL es SEQ ID NO: 199 en esa publicación) como 320-179 (también descrito como C320-179). Este anticuerpo tenía propiedades biofísicas favorables, era un inhibidor potente de TL1A y tenía un perfil de inmunogenicidad predicho bajo.
Se prepararon variantes de anticuerpos de 320-179 sustituyendo uno de un grupo de nueve aminoácidos representativos - A, S, Q, D, H, K, L, W, Y - uno cada vez en una de cada posición de aminoácido de CDR (como se define por la nomenclatura AbM) en la CDR1 de cadena ligera (CDR-L1), la CDR3 de cadena ligera (CDR-L3), la CDR1 de cadena pesada (CDR-H1 ) y la CDR2 de cadena pesada (CDR-H2). También se realizaron variantes de anticuerpos, que incorporan A, S, Q, D, H, K, L, W, Y, en la posición 59 y 60 en la cadena pesada variable y en la posición 79 en la cadena ligera variable. Se muestra una lista completa de todas las variantes de anticuerpos con sustituciones individuales generadas en las figuras 1 (cadena pesada variable) y 2 (cadena ligera variable), respectivamente.
1.2. Construcción de vectores que expresan anticuerpos. Se generaron variantes de región variable mediante retrotraducción de secuencias de aminoácidos en secuencias de ADN que posteriormente se sintetizaron de novo mediante ensamblaje de oligonucleótidos sintéticos. Se subclonaron variantes de Vh en un vector de expresión de mamífero que contiene una región constante humana para producir cadenas pesadas de anticuerpos de longitud completa (dominios Ch1, bisagra, Ch2 y Ch3 de cadena pesada de IgG1 humana) (p. ej., UniProt n.° P01857). De manera análoga, se subclonaron variantes de Vl en un vector de expresión de mamífero que contenía una región constante de cadena ligera lambda humana para producir cadenas lambda de anticuerpos de longitud completa (SwissProt n.° P0CG05.1). En algunos casos, la cadena pesada y, por separado, la cadena ligera de longitud completa, se tradujo de vuelta a secuencias de ADN y posteriormente se sintetizó de novo mediante ensamblaje de oligonucleótidos sintéticos.
1.3. Expresión de variantes de anticuerpos. Se produjeron anticuerpos co-transfectando cadenas pesadas y ligeras de anticuerpos en células EXPI293® (Life Technologies, Carlsbad, CA). El día antes de la transfección, se determinó el número de células necesarias para el experimento. Para cada transfección de 20 ml, fueron necesarias 3,6 x 107 células en 20 ml de medio de expresión EXPI293®. El día anterior a la transfección, las células se sembraron a una densidad de 0,9 x 106 células viables/ml y se incubaron durante una noche a 37 °C en una atmósfera humidificada de CO2 al 8 % en aire en un agitador orbital que gira a 200 rpm. El día de la transfección, el número y la viabilidad de las células se determinaron utilizando un contador celular automático. Solo se utilizaron cultivos con >98 % de células viables. Para cada transfección de 20 ml, se prepararon complejos de lípido-ADN diluyendo 10 mg de ADN de cadena pesada y 10 mg de ADN de cadena ligera en medio de suero reducido OPTI-MEM® (Life Technologies, Carlsbad, CA) I (cat. n.° 31985-062) a un volumen total de 1,0 ml. Se diluyeron 54 ml de reactivo EXPIFECTAMINE® 293 (Life Technologies, Carlsbad, CA) en medio OPTI-MEM® I hasta un volumen total de 1,0 ml. Ambos viales se mezclaron suavemente y se incubaron durante 5 minutos a temperatura ambiente. Después de la incubación, el ADN diluido se mezcló con el reactivo EXPIFECTAMINE® 293 diluido y la mezcla de reactivos DNA-EXPIFECTAMINE® 293 y se incubó durante 20 minutos más a temperatura ambiente para permitir la formación de complejos de reactivos DNA-EXPIFECTAMINE® 293. Después de la incubación, se añadieron 2 ml de complejo de reactivos DNA-EXPIFECTAMINE® 293 a cada tubo de biorreactor de 50 ml (TPP Techno Plastic Products AG). Al tubo de control negativo, se añadieron 2 ml de medio OPTI-MEM® (Life Technologies, Carlsbad, CA) I en lugar del complejo reactivo DNA-EXPIFECTAMINE® 293. Las células se incubaron en una incubadora a 37 °C con una atmósfera humidificada de CO2 al 8 % en aire en un agitador orbital que rota a 200 rpm. Aproximadamente 16-18 horas después de la transfección, se añadieron 100 ml de potenciador de la transfección EXPIFECTAMINE® 293 1 y 1,0 ml de potenciador de la transfección EXPIFECTAMINE® 293 2 a cada biorreactor. Los anticuerpos se recogieron aproximadamente a las 72 horas después de la transfección.
1.4. Purificación de variantes de anticuerpos. Cada variante de anticuerpo se expresó en células EXPI293® en 20 ml de cultivo celular. Los cultivos se centrifugaron en tubos falcon de 50 ml a 3000 x g durante 20 minutos y los sobrenadantes se filtraron usando un filtro de 0,22 mm (Corning). Los sobrenadantes se purificaron usando un robot Gilson ASPEC GX274. En resumen, se equilibraron previamente cartuchos SPE (Agilent, 12131014) empaquetados con 1,2 ml de resina de proteína A MABSELECT s Ur E® (GE Healthcare BioSciences AB Uppsala, Suecia) con 3 volúmenes de columna de PBS 1X. Se pasaron 18 ml de sobrenadante sobre las columnas seguido de un lavado de PBS 1X de 4 ml. Cada columna se eluyó previamente con 0,9 ml de ácido cítrico 0,1 M, pH 2,9. Los anticuerpos purificados se eluyeron con 2 ml de ácido cítrico 0,1 M, pH 2,9. Los anticuerpos se desalaron en PBS S0rensens (KH2PO459,5 mM, Na2HPO4.2H2O 7,3 mM, NaCl 145,4 mM (pH ~ 5,8)) utilizando columnas PD-10 (GE Healthcare).
1.5. Expresión de anticuerpos y unión a antígeno según lo determinado mediante RPS. Usando una microplaca sensora CM5 (GE Healthcare), se acopló proteína A (Pierce) a la superficie de la microplaca usando un kit de acoplamiento de amina (GE Healthcare). La proteína A se acopló en la celda de flujo 1 y 2 (o, como alternativa, 3 y 4) usando un BIACORE® T200. Se pasaron sobrenadantes de células EXPI-293® que contenían anticuerpos o anticuerpos purificados de manera alternativa (según lo descrito en 1.4) sobre la superficie de la celda de flujo 2, mientras que se pasó tampón (HBS-EP) sobre la celda de flujo 1. La cantidad de sobrenadante o proteína purificada (así como la concentración) inyectada durante la etapa de captura varió entre ejecuciones y se especifica en el encabezado de las tablas 3-11. Al final de la inyección del sobrenadante o anticuerpo purificado se midió el cambio en las unidades de respuesta. Este valor se indicó como nivel de captura en las tablas 3-11. Para determinar si el anticuerpo se unió a TL1A, se pasó después el TL1A sobre las celdas de flujo 1 y 2 y se midieron las unidades de respuesta antes del final de la inyección de TL1A (la fase de asociación). Este valor está marcado como nivel de unión a TL1A (temprano) en las tablas 3-11. Las unidades de respuesta se midieron antes del final de la fase de disociación. Este valor está marcado como nivel de unión a TL1A (tardío) en las tablas 3-11 y es una medida de la cantidad de anticuerpo que se ha perdido de la superficie de la microplaca como resultado de la disociación del complejo de TL1A - anticuerpo. Los sensorgramas tuvieron doble referencia (la celda de flujo 2 se resta de la celda de flujo 1 y un blanco de tampón). Ya que había una gran cantidad de variantes de anticuerpos para cribar, estas se cribaron en diferentes ciclos (tablas 3-11). En cada caso (excepto el ciclo 3) el anticuerpo original, 320-179, se incluyó en el ciclo, con fines de comparación. A continuación se muestra un sumario de las condiciones utilizadas en cada ciclo:
Tabla 1.
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continuación
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La unión de anti-TL1A a TL1A de diferentes especies también se determinó usando RPS. El anticuerpo anti-TL1A se capturó en la superficie de una proteína A. Se hizo fluir TL1A de ser humano, rata, ratón, conejo, cobaya, cerdo, perro, gato o mono cinomolgo sobre la superficie y se midieron las unidades de respuesta.
1.6. Producción de TL1A. Se produjo TL1A humano en el sistema de expresión EXPI293® de mamíferos, usando una construcción de expresión de ADN que codificaba el dominio extracelular (DEC) de TL1A humano con un marcador de HIS y FLAG ubicado en el extremo N. Se generaron otras formas de especies de TL1A en función del listado de secuencias en bases de datos listadas públicamente. Estas se resumen a continuación:
Tabla 2.
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El sobrenadante de cultivo que contenía la proteína TL1A secretada se recogió mediante centrifugación a 2000 x g durante 10 minutos para eliminar las células. La proteína TL1A se purificó del sobrenadante usando una columna HISTRAP® HP (GE Healthcare).
Se intercambió el tampón de la proteína eluida a PBS usando una columna de uso en preparación HILOAD® 16/60 Superdex 200 (GE Healthcare) y la fracción de ~70 kDa se separó por filtración en gel en una columna de uso en preparación HILOAD® 26/60 SUPERDEX® 200 (GE Healthcare).
1.7. Ensayo de potencia de línea celular TF-1. Para determinar qué anticuerpos anti-TL1A neutralizan funcionalmente la actividad biológica de TL1A, se evaluó la capacidad de los anticuerpos para neutralizar la apoptosis inducida por TL1A en una línea celular TF-1. La línea celular eritroleucémica humana TF-1 (ATCC: CRL-2003) se mantuvo en cultivo en condiciones convencionales. Se incubaron células TF-1 (7,5 x 104/pocillo) en placas de 96 pocillos de laterales negros (Greiner) con TL1A humano 100 ng/ml y cicloheximida 10 mg/ml para inducir apoptosis. Se añadieron anticuerpos de prueba a una concentración de 10 mg/ml (66,7 nM) o menos a las placas y se incubaron durante 4 a 5 horas. Después se evaluó la inducción de apoptosis utilizando el kit de caspasas homogéneas (Roche) según las instrucciones del fabricante.
Los datos se normalizaron mediante expresión como un porcentaje de apoptosis máxima (niveles de apoptosis logrados por TL1A humano más cicloheximida en ausencia de anticuerpo anti-TL1A).
1.8. Selectividad del receptor de anticuerpos candidatos. TL1A se une tanto a su receptor de señalización afín, DR3, como a un receptor señuelo, DcR3, que también actúa como receptor señuelo para los miembros de la familia de TNF Fas-L y LIGHT. Se evaluó la capacidad de los anticuerpos para inhibir la unión de TL1A a sus receptores en un ELISA de competición. Se aplicó quimera DR3/Fc (R&D Systems) o quimera DcR3/Fc (R&D Systems) sobre una placa de 96 pocillos (Maxisorp, Nunc) a una concentración de 2 mg/ml. Se preincubaron anticuerpos de prueba diluidos en serie con TL1A humano biotinilado de un solo sitio 1 mg/ml durante 30 minutos y después se añadieron a los pocillos recubiertos con DR3/Fc o DcR3/Fc. Se detectó TL1A unido usando estreptavidina-peroxidasa de rábano picante 1:2000 (BD Pharmingen). Los datos se normalizaron mediante expresión como un porcentaje de unión máxima de TL1A al receptor en ausencia de anticuerpo anti-TL1A.
1.9. Ensayo de exclusión cinética. Este ensayo mide la concentración libre de uno de los compañeros de unión sin alterar el equilibrio. Se pueden preparar soluciones fuera de línea, usando proteínas no modificadas en solución, y las mediciones de afinidad se pueden leer días después de la mezcla para asegurar que se haya alcanzado el equilibrio. En un ensayo de exclusión cinética, un interactuante (denominado compañero de unión constante o CBP) se mantiene a una concentración constante, mientras que el otro (denominado valorante) se diluye en serie. Se pueden usar ensayos de exclusión cinética para determinar la constante de disociación (Kd) y la afinidad de una interacción de anticuerpo-antígeno. En un ensayo de exclusión cinética típico, el valorante se inmoviliza en perlas (p. ej., perlas de Sepharose o PMMA) y se usa para capturar el CBP libre en solución. Después se usa una sonda secundaria marcada para cuantificar la cantidad de CBP capturado. El ensayo de exclusión cinética se revisa en Darling, RK et al. (2004) ASSAY and Drug Development Technol. 2 (6): 647-57.
Los componentes se combinaron y se permitió que alcanzaran el equilibrio. El ensayo de exclusión cinética se usó después para medir la fracción libre del CBP. Las curvas en equilibrio con múltiples concentraciones de CBP se analizaron utilizando la herramienta de análisis de curvas n dentro del software KinExA® Pro (versión 4.1.11, Sapidyne) para obtener determinaciones robustas de Kd. La interacción de 320-587 para TL1A humano se examinó utilizando dos orientaciones: (1) CBP es 320-587, el valorante es TL1A y (2) CBP es Tl 1A, el valorante es 320-587. Ejemplo 2
Resultados experimentales
2.1. Selección de variantes de unión a TL1A con una tasa de inactivación equivalente o mejorada en relación con C320-179. Se construyeron variantes del antibiótico 320-179 y se expresaron como se ha descrito anteriormente. Los sobrenadantes EXPI293® (Life Technologies Corp.) de cada variante se evaluaron mediante BIACORE® (GE Healthcare) y los datos obtenidos se compararon con los del anticuerpo original 320-179. En algunos experimentos, los anticuerpos se purificaron usando cromatografía de proteína A (véase 1.4) y los anticuerpos purificados se usaron en experimentos de BIACORE® (GE Healthcare). Las tablas 3-11 muestran el nivel de expresión de cada variante, junto con su unión a TL1A en un punto temporal temprano y tardío. En ciclos posteriores (tablas 10 y 11) se probaron variantes de anticuerpos que contenían más de una sustitución de aminoácidos.
Tabla 3. Experimento de RPS - Ciclo 1 - Anticuerpos anti-TL1A que se unen a TL1A. * indica anticuerpos que se l i n r n r l r n n i .
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Tabla 4. Experimento de RPS - Ciclo 2 - Anticuerpos anti-TL1A que se unen a TL1A. * indica anticuerpos que se l i n r n r l r n ^ n i .
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(continuación)
Figure imgf000022_0001
(continuación)
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Tabla 5. Experimento de RPS - Ciclo 3 - Anticuerpos anti-TL1A que se unen a TL1A. * indica anticuerpos que se l i n r n r l r n ni .
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continuación
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continuación
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Tabla 6. Experimento de RPS - Ciclo 4 - Anticuerpos anti-TL1A que se unen a TL1A. * indica anticuerpos que se l i n r n r l r n ni .
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continuación
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continuación
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T l 7. Ex rim n RP - i l - Ani r ni-TL1A n n TL1A.
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continuación
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continuación
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Tabla 8. Experimento de RPS - Ciclo 6 - Anticuerpos anti-TL1A que se unen a TL1A. * indica anticuerpos que se l i n r n r l r n ni .
Figure imgf000029_0002
continuación
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continuación
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Tabla 9. Experimento de RPS - Ciclo 7 - Anticuerpos anti-TL1A que se unen a TL1A. * indica anticuerpos que se l i n r n r l r n ni .
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continuación
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continuación
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continuación
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Tabla 10. Experimento de RPS - Ciclo 8 - Anticuerpos anti-TL1A que se unen a TL1A. * indica anticuerpos que se l i n r n r l r n ni .
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Tabla 11. Experimento de RPS - Ciclo 9 - Anticuerpos anti-TL1A que se unen a TL1A. * indica anticuerpos que se l i n r n r l r n ni .
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continuación
Figure imgf000035_0001
Los anticuerpos que tenían niveles de captura similares o mejores que 320-179, así como valores de nivel de unión a TL1A (temprano) y nivel de unión a TL1A (tardío) que estaban en un rango similar se llevaron a ensayos de potencia. Estas variantes se indican por sombreado en las tablas 3-11. En la figura 5 se muestra una comparación de la velocidad de disociación medida mediante RPS para varios de los anticuerpos. Varios de los anticuerpos se disociaron a una velocidad más lenta que la del anticuerpo original 320-179.
2.2 Anticuerpos anti-TL1A con potencia mejorada en el ensayo basado en células. Para evaluar si la velocidad de disociación mejorada se correlacionaba con un anticuerpo purificado de potencia mejorada, las variantes se procesaron en el ensayo de actividad caspasa inducida por TL1a en células TF-1. Los anticuerpos potentes actúan uniéndose a TL1A e inhibiendo la activación de TL1A del receptor DR3. Este receptor desencadena una ruta de apoptosis en la que las caspasas se activan y pueden detectarse utilizando reactivos comerciales. En cada experimento, la variante de anticuerpo se comparó con 320-179 con respecto al factor de mejora de la potencia. Los resultados se muestran en la tabla 12.
T l 12. En n i in i r TL1A n l l TF-1: Inhi i n r ni r ni-TL1A.
Figure imgf000035_0002
(continuación)
Figure imgf000036_0001
(continuación)
Figure imgf000037_0001
Como se ha demostrado en la tabla 12 y en la figura 6, varios de los anticuerpos de sustitución única probados tenían potencia superior en comparación con 320-179. De todas las variantes de anticuerpos de sustitución única probadas, dos tuvieron mejora de la potencia mayor de 10 veces en comparación con 320-179. Estas variantes fueron 320-331 (que contenía una sustitución Y91W en la cadena ligera variable) y 320-547 (que contenía una sustitución N56Y en la cadena pesada variable) (figura 6). Este resultado es inesperado, ya que normalmente la CDR3 del VH del anticuerpo está predominantemente implicada en la unión del anticuerpo, mientras que, por el contrario, la sustitución N56Y que se identificó tiene una influencia sustancial en las uniones de CDR2 del VH del anticuerpo. Cuando se realizaron variantes incorporando Y91W del VL o, por separado, N56Y en el VH con otras sustituciones que mejoraron la potencia, se obtuvieron anticuerpos muy potentes. Cuando la sustitución Y91W de VL se combinó con la sustitución N56Y de VH en un anticuerpo, 320-587, el factor de mejora de la potencia en comparación con 320-179 fue de 40. La figura 7 muestra cuatro experimentos repetidos diferentes que demuestran el aumento de potencia de cuatro anticuerpos 320-587, 320-591, 320-592 y 320-601 en comparación con 320-179. Las secuencias de estos anticuerpos con potencia mejorada en comparación con 320-179 se muestran en la figura 3 (cadena pesada variable) y la figura 4 (cadena ligera variable).
Se realizó una comparación de la potencia de 320-587 en comparación con otros anticuerpos anti-TL1A descritos anteriormente. Estos anticuerpos descritos previamente incluyen el anticuerpo 1681N descrito en la patente de los Estados Unidos n.° 8.642.741 (VH es la SEQ ID NO: 18; VL es la SEQ ID NO. 26), el anticuerpo VH5/VL1 de la publicación de los Estados Unidos n.° 2014/0308271 (VH es la SEQ ID NO: 24; VL es la SEQ ID NO: 17), 1B4 humanizado como se describe en la patente de los Estados Unidos n.° 8.263.743 (VH es la SEQ ID NO: 74; VL es la SEQ ID NO: 75) y 320-168 (también denominado C320-168) como se describe en la publicación de los Estados Unidos n.° 2014/0255302A1 (VH es la SEQ ID NO: 181; VL es la SEQ ID NO: 194). La figura 8 muestra que 320.587 tiene potencia superior en el ensayo basado en células en comparación con estos anticuerpos descritos anteriormente, convirtiéndolo en el anticuerpo anti-TL1A más potente descrito.
2.3. Ensayos de competencia del receptor DR3 y DcR3. Los anticuerpos que mostraron mayor potencia en comparación con 320-179 se exploraron para determinar su capacidad para inhibir la unión de TL1A a su receptor de señalización afín, DR3, o un receptor señuelo, DcR3. Todos los anticuerpos anti-TL1A probados mostraron inhibición de la unión de TL1A a DR3, en comparación con un control de isotipo (figura 9). Esto confirma que los anticuerpos inhiben la actividad de TL1A al bloquear la interacción TL1A-DR3.
En experimentos previos descritos en la publicación de los Estados Unidos n.° 2014/0255302A1 (ejemplo 4), el anticuerpo 320-179 (320-179) se probó en un ensayo de competencia del receptor y se mostró que inhibe selectivamente la unión de TL1A a DR3 pero no a DcR3 (figura 10). En los experimentos presentados en el presente documento en la figura 10, se muestra nuevamente que 320-179 no inhibe la interacción TL1A-DcR3. Esto contrasta con los anticuerpos anti-TL1A mejorados probados. Los anticuerpos con potencia mejorada en el ensayo de células TF-1 (como se describe en la sección 2.2), incluyendo el anticuerpo 320-587, inhibieron uniformemente la interacción TL1A-DcR3.
En resumen, el anticuerpo parental 320-179 fue capaz de inhibir la interacción TL1A-DR3 pero no la interacción TL1A-DcR3. Varios anticuerpos con potencia mejorada, tales como 320-267 (VH es la SEQ ID No: 1; VL es la SEQ ID No: 11), 320-277 (VH es la SEQ ID NO: 1, VL es la SEQ ID NO 12), 320-278 (VH es la SEQ ID NO 1; VL es la SEQ ID NO 13) y 320-591 (VH es la SEQ ID NO: 3, VL es la SEQ ID NO 9) inhibieron la interacción TL1a-DR3 pero no la interacción TL1A-DcR3. Varios anticuerpos con potencia mejorada, tales como 320-331, 320-547, 320-583, 320-584, 320-585, 320-586, 320-587 y variantes de estos anticuerpos, son capaces de inhibir las interacciones TL1A-DR3 y TL1A-DcR3.
2.4. La reactividad cruzada entre especies de 320-587 se probó para determinar su capacidad para unirse a TL1A producido de manera recombinante de diferentes especies. El anticuerpo unido a TL1A de todas las especies probadas (figura 11). La unión de 320-587 a TL1A humano, de rata, de cobaya, de perro, de gato y de mono cinomolgo tenía una velocidad de disociación lenta, lo que indica una interacción de alta afinidad. El anticuerpo se unió a TL1A de ratón y conejo y tenía una velocidad de disociación rápida.
2.5. Modelos de eficacia preclínica para probar anticuerpos anti-TL1A en los siguientes modelos animales de enfermedad:
Asma: asma inducida por alérgenos - el roedor (ratón, rata o cobaya) se sensibiliza mediante inyección intradérmica de ovoalbúmina (OVA), especialmente OVA procedente de huevos de gallina, más alumbre y después se expone al menos 2 semanas después mediante aerosol de OVA nebulizado, lo que provoca síntomas de tipo asmático, incluyendo hiperreactividad de las vías respiratorias, afluencia de eosinófilos y aumento de la producción de citocinas (p. ej., Hylkema et al., 2002, Clin. Exp. Immunol. 129: 390-96). Dicho modelo podría modificarse mediante exposición repetida para presentar un perfil de enfermedad más crónico con aumento de la remodelación de las vías respiratorias e inducción de fibrosis (p. ej., Bos et al., 2007, Eur. Respir. J. 30: 653-661). También se pueden usar alérgenos alternativos, tales como ácaros del polvo doméstico (p. ej., Lambert et al., 1998, Am. J. Respir. Crit. Care Med. 157: 1991-9). Como alternativa, un primate no humano (p. ej., macaco cinomolgo) puede sensibilizarse y exponerse con un antígeno ambiental tal como Ascaris suum, lo que conduce a hiperreactividad de las vías respiratorias, afluencia de eosinófilos y aumento de la producción de citocinas (p. ej., Wegner et al., 1991, J. Allergy Clin. Immunol. 87: 835-41).
EPOC: Inflamación de las vías respiratorias inducida por inhalación de humo - el roedor (ratón, rata o cobaya) se expondrá a humo de cigarrillo 3-7 veces por semana durante al menos 4 semanas provocando una enfermedad pulmonar similar a la EPOC, caracterizada por la acumulación pulmonar de neutrófilos, aumento de la producción de citocinas inflamatorias, fibrosis pulmonar e hipertensión pulmonar (p. ej., Davis et al. (2012) PLoS One 7: e33304). Se puede inducir una forma más grave de enfermedad al incluir una infección bacteriana o vírica repetida en los pulmones durante la exposición al humo (p. ej., Li et al. (2012) Biol. Pharm. Bull. 35: 1752-60). Los roedores con EPOC inducida por humo se tratarán con anticuerpos anti-TL1A y se explorarán para determinar la eficacia del tratamiento.
Fibrosis pulmonar: Fibrosis pulmonar inducida por bleomicina - el roedor (ratón, rata o cobaya) se tratará con bleomicina mediante instilación intratraqueal/intranasal o inyección intravenosa una o dos veces por semana durante al menos 3 semanas. Este tratamiento induce fibrosis pulmonar significativa y estable (p. ej., Pinart et al. (2009) Resp. Physiol. Neurobiol. 166: 41-46). Los roedores con fibrosis pulmonar inducida por bleomicina se tratarán con anticuerpos anti-TL1A y se explorarán para determinar la eficacia del tratamiento.
Fibrosis quística: Modelo de hurón con supresión de CFTR - los hurones homocigotos para supresión génica, o mutaciones conocidas relacionadas con la enfermedad, de CFTR (gen causante de la fibrosis quística) desarrollan espontáneamente una enfermedad similar a la fibrosis quística caracterizada por la obstrucción de las vías respiratorias por moco, atelectasia, neumonía intersticial e infecciones pulmonares repetidas con colonización bacteriana pulmonar progresiva (p. ej., Sun et al. (2014) Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 50: 502-12). Los hurones CFTR- 1 - se tratarán con anticuerpos anti-TLla y se explorarán para determinar la eficacia del tratamiento.
Síndrome del intestino irritable: Hipersensibilidad visceral inducida por estrés - se inducirá estrés en ratas mediante separación neonatal-materna (p. ej., Coutinho et al. (2002) Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 282: G307-16) o inmovilización de adultos (p. ej., Shen et al. (2010) J. Neurogastroenterol. Motil. 16: 281-90). Se espera que esto produzca alteración de la motilidad colónica e hipersensibilidad visceral similar a la observada en pacientes con Sil. Las ratas estresadas se tratarán con anticuerpos anti-TL1A y se explorarán para determinar la eficacia del tratamiento.
Artritis reumatoide: Artritis inducida por colágeno - el roedor (ratón, rata o cobaya) se inmunizará y se estimulará con colágeno en adyuvante. Los animales desarrollan inflamación y eritema bilaterales del pie, infiltrado inflamatorio en el área articular y daño articular (p. ej., Bendele et al. (1999) Toxicol. Pathol. 27: 134-42). Los roedores con artritis inducida por colágeno se tratarán con anticuerpos anti-TL1A y se explorarán para determinar la eficacia del tratamiento.
Esofagitis eosinofílica: Esofagitis eosinofílica inducida por Aspergillus fumigatus intranasal. Ratones expuestos a instilación intranasal repetida de A. fumigatis desarrollan eosinofilia esofágica notable, displasia e hiperplasia epitelial y gránulos de eosinófilos libres (p. ej., Mishra et al. (2001) J. Clin. Invest. 107: 83-90). De manera análoga, la exposición repetida en aerosol a la ovoalbúmina durante un periodo de dos semanas en cobayas sensibilizadas provoca eosinofilia esofágica con infiltración tanto de eosinófilos como de mastocitos en la capa epitelial (p. ej., Liu et al. (2015) Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 308: G482-488). Los ratones o cobayas con esofagitis eosinofílica se tratarán con anticuerpos anti-TL1A y se explorarán para determinar la eficacia del tratamiento.
2.6. El uso de anticuerpos TL1A en la detección de muestras que contienen anticuerpos de TL1A de la divulgación se puede usar para detectar TL1A en muestras humanas. Se utilizó 320-587 para detectar TL1A humano secretado de PBMC humanas estimuladas con complejos inmunitarios (figura 13) en formato ELISA. También se utilizó 320-587 para detectar una población de PBMC humanas que expresan TL1A de membrana en su superficie en experimentos de citometría de flujo (figura 14).
2.7. Mediciones de afinidad de la unión del anticuerpo anti-TL1A a TL1A humano mediante ensayo de exclusión cinética. Tiempo para alcanzar el equilibrio con 320-587 como CBP: En primer lugar, se midió la tasa de Kon para la interacción 320-587/TL1A. En resumen, se preparó una solución mezclando 320-587 y TL1A, y se extrajeron alícuotas en diversos puntos temporales durante 3 horas. Se capturó 320-587 libre haciendo pasar la solución sobre una columna empaquetada con perlas de Sepharose recubiertas con 20 mg/ml de TL1A. Se detectó 320-587 capturado con un anticuerpo anti-humano conjugado con Alexa Fluor® 647 (0,5 mg/ml). Este ensayo se repitió dos veces produciendo tasas de Kon de 8,35 x 105 Ms_1 y 7,45 x 105 Ms_1, con un promedio de tasa de Kon de 7,90 x 105 Ms_1. La tasa de Kon se usó después para estimar la cantidad de tiempo necesaria para alcanzar el equilibrio a diversas concentraciones de 320-587 usando la herramienta de curva de unión teórica proporcionada en el sitio web de Sapidyne (www.Sapidyne.com).
Determinación de KD con 320-587 como CBP. El CBP, 320-587, se diluyó en tampón de ensayo (DPBS complementado con 1 mg/ml de BSA) a concentraciones finales de 15, 50 y 150 pM. El valorante, TL1A humano se diluyó en tampón de ensayo para crear una serie de concentraciones de 0,1, 0,3, 1, 3, 10, 30, 100, 300, 1000 y 3000 pM. Usando el tiempo para alcanzar el equilibrio determinado anteriormente, se permitió que las curvas que contenían 320-58750 o 150 pM se equilibraran en una incubadora a 25 °C durante 2 días. Se permitió que las curvas que contenían 320-587 15 pM se equilibraran en una incubadora a 25 °C durante 3 días. Después del periodo de equilibrio, la fracción libre de 320-587 en cada reacción se cuantificó como se ha descrito anteriormente. Los valores de Kd se determinaron usando análisis de curva n de curvas de equilibrio generadas con 320-587 15, 50 y 150 pM. Tiempo para alcanzar el equilibrio con TL1A como CBP: El tiempo para alcanzar el equilibrio en esta orientación se estimó usando la Kon para la interacción 320-587/TL1A, determinada como se describe en 2.8 anterior. En este formato, la fracción libre de TL1A se capturó pasando la solución sobre una columna empaquetada con perlas de PMMA recubiertas con 30 mg/ml de 320-587. El TL1A capturado se detectó con un anticuerpo anti 6x-his DyLight 650 (0,75 mg/ml). Este ensayo se repitió dos veces produciendo tasas de Kon de 6,11 x 105 Ms_1 y 5,74 x 105 Ms-1, con un promedio de tasa de Kon de 5,93 x 105 Ms_1.
Determinación de Kd con TL1A como CBP: El CBP, TL1A humano, se diluyó en tampón de ensayo a concentraciones finales de 30, 100 y 300 pM. El valorante, 320-587, se diluyó en tampón de ensayo para crear una serie de concentraciones de 0,05, 0,15, 0,5, 1,5, 5, 15, 50, 150, 500, 1500 y 5000 pM.
Usando el tiempo para alcanzar el equilibrio determinado anteriormente, se permitió que todas las curvas se equilibraran en una incubadora a 25 °C durante 3 días. Después del periodo de equilibrio, la fracción libre de TL1A en cada reacción se cuantificó como se ha descrito anteriormente. Los valores de Kd se determinaron usando análisis de curva n de curvas de equilibrio generadas con TL1A 30, 100 y 300 pM.
Se observó un buen acuerdo entre los dos métodos KinExA, así como un porcentaje de error relativamente bajo. El valor de Kd para la interacción de TL1A con 320-587 se determinó usando 320-587 ya que el CBP fue 40,97 ± 8,33 pM (tabla 13), mientras que la Kd obtenida usando TL1A como el CBP fue 41,52 ± 13,5 pM (tabla 14).
Tabla 13. Afinidad: Perlas de Se harose recubiertas con TL1A 320-587 como el CBP.
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Tabla 14. Afinidad: Perlas de PMMA recubiertas con 320-587 TL1A como el CBP.
Figure imgf000039_0002
3.0. Modelos preclínicos de eficacia para probar anticuerpos anti-TLla.
3.0. 1. Asma.
Asma aguda inducida por ovoalbúmina en ratas. Se sensibilizaron ratas Brown-Norway con OVA mediante inyección i.p. el día 0 y después se expusieron diariamente con aerosol de OVA los días 35-42. Las ratas se trataron con el anticuerpo 320-587 o vehículo mediante inyección i.v. los días 14, 21, 28 y 35. El líquido de lavado broncoalveolar (BALF) se evaluó para las células totales y diferenciales el día 43. Se encontró que el tratamiento reduce significativamente los eosinófilos BALF (figura 15).
Asma crónica inducida por ovoalbúmina en ratas. Las ratas se sensibilizaron con OVA más alumbre mediante inyección i.p. los días 0 y 7, y después se expusieron con aerosol de OVA dos veces por semana durante 3 semanas a partir del día 14 hasta el día 31, y en 5 días consecutivos desde los días 37 a 42. Los animales se trataron con el anticuerpo 320-587 o vehículo mediante i.v. los días 24, 29, 34 y 39. El BALF se evaluó para determinar células totales y diferenciales y un panel de citocinas el día 43. Las secciones pulmonares se tiñeron con hematoxilina y eosina (H y E) y Schiff de ácido peryódico (PAS), y se evaluaron para determinar una serie de patologías. El tratamiento con 320­ 587 disminuyó significativamente los eosinófilos y macrófagos en BALF (figuras 17A y 17B), IL-4 e IL-13 en BALF (figura 17C), hiperplasia de células caliciformes (figura 17D) y el grosor de la capa epitelial bronquial (figura 17E), en comparación con el vehículo.
Asma aguda inducida por ovoalbúmina en cobayas. Se sensibilizaron cobayas macho Dunkin Hartley a ovoalbúmina y a continuación se sometieron a cirugía para instalar un catéter de globo para medir la función pulmonar y las reacciones asmáticas tempranas y tardías. Los días 16, 20, 24 y 28, los animales se trataron i.p. con anticuerpo 320­ 587 o vehículo. Se realizó exposición con aerosol de ovoalbúmina (0,05-0,1 %) 30 minutos después del último tratamiento. La sensibilidad de las vías respiratorias (SVR) a la histamina se midió 24 h antes de la exposición, 6 h después de la exposición (inmediatamente después de la reacción asmática temprana) y 24 h después de la exposición (inmediatamente después de la reacción asmática tardía). La naturaleza y el tamaño de las reacciones asmáticas tempranas y tardías también se registraron mediante el registro en línea de la función pulmonar durante todo el periodo de 24 h. Los animales se sacrificaron 25 h después de la exposición y se realizó lavado broncoalveolar. El BALF se evaluó para determinar las células totales y diferenciales. El tratamiento con 320-587 disminuyó significativamente tanto los eosinófilos como los macrófagos en BALF (figura 16A y 16B), además de mejorar la s Vr después de la reacción asmática temprana (figura 16C) y la magnitud general de la reacción asmática temprana (figura 16D), en comparación con vehículo.
Asma crónica inducida por ovoalbúmina en cobayas. Se sensibilizaron cobayas macho Dunkin Hartley a la ovoalbúmina y 4 semanas después se expusieron con ovoalbúmina semanalmente durante 12 semanas. Se realizó exposición a ovoalbúmina (0,05-0,5 %) mediante inhalación de solución en aerosol hasta que se observó obstrucción de las vías respiratorias. Los animales se trataron con anticuerpo 320-587 o vehículo i.p. cada 5 días a partir de la semana 8 de exposiciones a ovoalbúmina. La función de las vías respiratorias, por medio de la sensibilidad de las vías respiratorias a histamina, se midió antes de la exposición inicial, 24 horas antes de la exposición final y 6 horas después de la exposición final. Aunque no se observó ningún efecto sobre la SVR inducida por exposición a histamina, el anticuerpo 320-587 disminuyó significativamente la respuesta alérgica a OVA, ya que eran necesarias dosis progresivamente crecientes de OVA para inducir la obstrucción de las vías respiratorias (figura 18).
Se cree que las diferencias en el efecto terapéutico de los anticuerpos observadas en los modelos de asma aguda y crónica en cobayas son una función del modelo en sí. Se cree que, en el modelo crónico, el grado de SVR disminuye a lo largo del tiempo y, por consiguiente, se vuelve menos sensible al tratamiento. En la técnica, el modelo agudo se usa en general para observar los efectos compuestos en la sensibilidad de las vías respiratorias y el modelo crónico se usa en general para observar los efectos compuestos en la remodelación de las vías respiratorias. Están en curso evaluaciones de remodelación. No obstante, fue sorprendente observar que los anticuerpos influyen en la respuesta al alérgeno, aunque el anticuerpo no influyó sustancialmente en la SVR absoluta (respuesta a la histamina) en esta etapa, disminuyó significativamente la respuesta alérgica directa al antígeno.
3.0.2. Enfermedad inflamatoria intestinal
Colitis inducida por TNBS en ratas: Las ratas se trataron con una dosis única de ácido tri-nitrobencenosulfónico en etanol mediante dosis de instilación intrarrectal. Los animales de control recibieron un volumen equivalente de etanol solamente. Durante un periodo de 7 días, los animales desarrollaron colitis focal caracterizada por ulceración del colon con infiltrado inflamatorio y diversos grados de fibrosis (p. ej., Wirtz et al. (2007) Nat. Protoc. 2: 541-546). La administración de 320-587 redujo significativamente múltiples indicadores de enfermedad, incluyendo el grosor del colon (figura 12A), el número y la gravedad de las adherencias (figura 12B) y el número y la gravedad de las estenosis (figura 12C) lo que conduce a una enfermedad significativamente más leve que los animales tratados con vehículo o un anticuerpo irrelevante con isotipo coincidente (figura 12D). También se observó disminución de la fibrosis de colon (figura 19) en animales tratados con 320.587.
Comparación de la enfermedad después de 7 y 14 días en colitis inducida por DNBS en ratas. Se indujo colitis como se ha descrito anteriormente usando ácido dinitrobencenosulfónico (DNBS) en lugar de TNBS y las ratas usadas en los experimentos de DNBS fueron ratas Wistar. Los animales se trataron con el anticuerpo 320-587 o vehículo i.v. los días 1 y 8. Los grupos se evaluaron para determinar la colitis 7 y 14 días después de DNBS y la gravedad de la

Claims (13)

REIVINDICACIONES
1. Un anticuerpo recombinante que se une específicamente al ligando 1A de tipo TNF (TL1A) y comprende una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3 y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 4.
2. El anticuerpo recombinante según la reivindicación 1, en donde el anticuerpo comprende una región constante de cadena pesada de IgG1 humana, opcionalmente en donde la región constante de cadena pesada de IgG1 humana comprende la SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 65 o SEQ ID NO: 66.
3. El anticuerpo recombinante según la reivindicación 1, en donde el anticuerpo comprende una región constante de cadena pesada de IgG4 humana, opcionalmente en donde la región constante de IgG4 de cadena pesada humana comprende la SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47 o SEQ ID NO: 69.
4. El anticuerpo recombinante según la reivindicación 1, en donde el anticuerpo comprende una región constante de IgG2 de cadena pesada humana, opcionalmente en donde la región constante de IgG2 de cadena pesada humana comprende la SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70 o SEQ ID NO: 71.
5. El anticuerpo recombinante según la reivindicación 1, en donde el anticuerpo comprende una región constante lambda de cadena ligera humana.
6. El anticuerpo recombinante según la reivindicación 5, en donde el anticuerpo recombinante comprende una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 61.
7. El anticuerpo recombinante según la reivindicación 2 o 6, en donde el anticuerpo recombinante comprende una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 60.
8. Una composición, que comprende el anticuerpo recombinante según una cualquiera de las reivindicaciones 1-7 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
9. El anticuerpo recombinante según una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, para su uso en el tratamiento de una enfermedad de las vías respiratorias, asma, EPOC, sarcoidosis pulmonar, rinitis alérgica, fibrosis pulmonar, fibrosis quística, una enfermedad gastrointestinal, enfermedad inflamatoria intestinal, colitis, colitis ulcerosa, esofagitis eosinofílica, una enfermedad gastrointestinal asociada con la fibrosis quística, síndrome del intestino irritable, enfermedad de Crohn, artritis, artritis reumatoide, una dermatopatía, dermatitis atópica, eccema o esclerodermia.
10. El anticuerpo recombinante según una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, para su uso en el tratamiento del asma.
11. Un método in vitro para detectar TL1A (i) en la superficie de células mononucleares de sangre periférica (PBMC), que comprende poner en contacto el anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones 1-7 con PBMC aisladas de un sujeto, detectar el anticuerpo unido a TL1A en la superficie de las PBMC y, opcionalmente, cuantificar el nivel de TL1A en las PBMC, (ii) en suero sanguíneo, que comprende poner en contacto el anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones 1-7 con suero sanguíneo obtenido de un sujeto, detectar el anticuerpo unido a TL1A en el suero y, opcionalmente, cuantificar el nivel de TL1A en el suero sanguíneo o (iii) en una muestra tisular aislada de un sujeto, que comprende poner en contacto el anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones 1-7 con tejido aislado de un sujeto para formar un complejo de anticuerpo-TL1A y detectar el complejo en el tejido.
12. Una célula transformada que expresa el anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones 1-7.
13. Un polinucleótido que tiene una secuencia de ácido nucleico que codifica un anticuerpo según la reivindicación 1, que comprende una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3 y una segunda secuencia de ácido nucleico que codifica una región variable de cadena ligera de anticuerpo que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 4.
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