TWI736532B - 使用多價陽離子鹽組合物之聚核苷酸製備方法 - Google Patents

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Abstract

本發明之諸多態樣包括製備聚核苷酸之方法。在一些實施例中，該方法包括使第一聚核苷酸組合物與多價陽離子鹽接觸以使包括至少一個多價陽離子相對離子之聚核苷酸鹽沈澱，該第一聚核苷酸組合物包括：聚核苷酸，其具有7個以上核苷亞單元之序列且該等核苷亞單元中有至少兩個係由N3'→P5'硫代磷醯胺酯亞單元間鍵聯接合；以及非目標合成產物及試劑；及分離該聚核苷酸鹽與該經接觸之第一聚核苷酸組合物，以產生包括該聚核苷酸鹽之第二聚核苷酸組合物。在某些實施例中，該方法進一步包括使該聚核苷酸鹽與逆相層析載體接觸；及自該層析載體溶離包括該聚核苷酸之第三聚核苷酸組合物。亦提供包括該聚核苷酸之鹽的組合物，該聚核苷酸之鹽包括至少一個多價陽離子相對離子。

Description

使用多價陽離子鹽組合物之聚核苷酸製備方法 [相關申請案之交叉引用]
根據35 U.S.C.§ 119(e)，本申請主張2015年4月23日申請之美國臨時申請案第62/151,891號之申請日期的優先權，該案之揭示內容係以引用之方式併入本文中。
核酸聚合物化學在醫藥、診斷及分析領域中且更特定言之在反義及反基因治療劑、組合化學、分支DNA信號擴增以及基於陣列之DNA診斷及分析子領域中的許多開發技術中起作用。此聚合物化學中有一些針對改良諸如DNA之天然核酸聚合物的結合強度、特異性及核酸酶抗性。肽核酸(PNA)、硫代磷酸酯、甲基膦酸酯及磷醯胺酯核苷間鍵聯為已應用於聚核苷酸以提供一或多種理想性質(諸如核酸酶抗性、細胞吸收及溶解度)之一些聚合物化學的實例。
聚核苷酸N3'→P5'磷醯胺酯可與互補DNA及 RNA股鏈形成穩定雙鏈體，以及與DNA雙鏈體形成穩定三鏈體，且對核酸酶具有抗性。聚核苷酸N3'→P5'硫代磷醯胺酯已得以在活體外及活體內用作有效反義劑。含有可抑制端粒酶活性之化合物的聚核苷酸可用於治療端粒酶介導之病症，諸如癌症，此係因為癌細胞表現端粒酶活性，而正常人類體細胞在生物學相關層級上不具有端粒酶活性之故。因而，對製備及分離此種聚核苷酸之方法感興趣。
本發明之諸多態樣包括製備聚核苷酸之方法。在一些實施例中，該方法包括使第一聚核苷酸組合物與多價陽離子鹽接觸以使包括至少一個多價陽離子相對離子之第一聚核苷酸鹽沈澱，該第一聚核苷酸組合物包括：聚核苷酸，其具有7個以上核苷亞單元之序列，其中該等核苷亞單元中有至少兩個係由N3'→P5'硫代磷醯胺酯亞單元間鍵聯接合；以及非目標合成產物及試劑；及分離該聚核苷酸鹽與該經接觸之第一聚核苷酸組合物，以產生包括該第一聚核苷酸鹽之第二聚核苷酸組合物。在某些實施例中，該方法進一步包括使該第一聚核苷酸鹽與逆相層析載體接觸；及自該層析載體溶離包括第二聚核苷酸鹽之第三聚核苷酸組合物。亦提供包括該聚核苷酸之鹽的組合物，該聚核苷酸之鹽包括至少一個多價陽離子相對離子。在一些實施例中，該至少一個多價陽離子相對離子係選自由以下各項組成之群：鎂、鋅、鋁及鈣。
熟習此項技術者應理解，以下所描述之圖式僅用於說明目的。該等圖式不意欲以任何方式限制本發明教示之範疇。
圖1顯示處於不同的pH值下的含伊美司他-Mg之1M NaCl溶液的HPLC層析譜。
圖2描繪對經多種鹽處理之伊美司他鈉之元素分析的結果。
圖3描繪對經增加當量之氯化鎂鹽處理之伊美司他鈉之元素分析的結果。
圖4描繪對經增加當量之氯化鎂鹽處理之伊美司他TEA之元素分析的結果。
定義
在更詳細描述例示性實施例之前，闡述以下定義以說明並定義發明說明中所使用之術語的含義及範疇。
除非另外指示，否則以下術語具有以下含義。任何未定義之術語均具有其技術認可之含義。
如本文中所使用，術語聚核苷酸及寡核苷酸可互換用於指含有由核苷間鍵或核苷間鍵聯連接之複數個核苷部分亞單元或核苷殘基的化合物。除非另外指出，否則每當聚核苷酸由諸如「ATGUCCTG」之字母序列表示時，便應理解該等核苷酸自左向右按照5'→3'順序，且「A」 表示去氧腺苷，「C」表示去氧胞苷，「G」表示去氧鳥苷，「T」表示胸苷，且「U」表示去氧尿苷。
如本文中所使用，「核苷」包括天然核苷，包括2'-去氧及2'-羥基形式，例如，如Kornberg及Baker,DNA Replication，第2版(Freeman,San Francisco,1992)中所描述。「類似物」在提及核苷時包括具有經修飾之鹼基部分及/或經修飾之糖部分的合成核苷，例如Scheit,Nucleotide Analogs(John Wiley,New York,1980)所大體描述。此種類似物包括為了增強結合性質，例如穩定性、特異性或其類似性質而設計的合成核苷，諸如Uhlmann及Peyman(Chemical Reviews,90：543-584,1990)所揭示。在一些實施例中，核苷或核苷類似物包括3'-羥基或3'-胺基。
術語「鹼基」及「核鹼基」可互換使用且在本文中定義為包括(i)習知DNA及RNA鹼基(尿嘧啶、胸腺嘧啶、腺嘌呤、鳥嘌呤及胞嘧啶)及(ii)經修飾之鹼基或鹼基類似物(例如5-甲基-胞嘧啶、5-溴尿嘧啶或肌苷)。鹼基類似物為分子結構模擬習知DNA或RNA鹼基之分子結構的化學物質。
如本文中所使用，「嘧啶」意謂天然核苷中存在之嘧啶，包括胞嘧啶、胸腺嘧啶及尿嘧啶，及其常見類似物，諸如含有氧基、甲基、丙炔基、甲氧基、羥基、胺基、硫基、鹵基及其類似取代基者。如本文中所使用之術語進一步包括連接有常見保護基之嘧啶，諸如N4-苯甲醯 基胞嘧啶。感興趣之其他嘧啶保護基包括但不限於Beaucage及Iyer Tetrahedron 48：2223-2311(1992)所揭示之保護基。
如本文中所使用，「嘌呤」意謂天然核苷中存在之嘌呤，包括腺嘌呤、鳥嘌呤及次黃嘌呤，及其常見類似物，諸如含有氧基、甲基、丙炔基、甲氧基、羥基、胺基、硫基、鹵基及其類似取代基者。如本文中所使用之術語進一步包括連接有常見保護基之嘌呤，諸如N2-苯甲醯基鳥嘌呤、N2-異丁醯基鳥嘌呤、N6-苯甲醯基腺嘌呤及其類似物。其他常見嘌呤保護基由Beaucage及Iyer Tetrahedron 48：2223-2311(1992)揭示。如本文中所使用，術語「-經保護」作為化學名稱之一部分係指標對化合物之特定部分的技術公認之保護基，例如，「5'-經保護之羥基」在提及核苷時包括三苯基甲基(亦即，三苯甲基)、對茴香基二苯基甲基(亦即，單甲氧基三苯甲基或MMT)、二-對茴香基二苯基甲基(亦即，二甲氧基三苯甲基或DMT)及其類似基團；且經保護之核鹼基在提及核鹼基時包括經諸如二甲基胺基甲脒(DMF)、苯甲醯基(Bz)、異丁醯基及其類似基團之基團保護之雜原子。技術公認之保護基包括以下參考文獻中所描述者：Gait編，Oligonucleotide Synthesis：A Practical Approach(IRL Press,Oxford,1984)；Amarnath及Broom,Chemical Reviews,77：183-217,1977；Pon等人，Biotechniques,6：768-775,1988；Ohtsuka等人，Nucleic Acids Research, 10：6553-6570,1982；Eckstein編，Oligonucleotides.and Analogues：A Practical Approach(IRL Press,Oxford,1991)；Greene及Wuts,Protective Groups in Organic Synthesis，第二版，(John Wiley & Sons,New York,1991)；Narang編，Synthesis and Applications of DNA and RNA(Academic Press,New York,1987)；Beaucage及Iyer Tetrahedron 48：2223-2311(1992)；及其類似參考文獻。
如本文中所使用，「聚核苷酸N3'→P5'硫代磷醯胺酯」意謂由至少一個N3'→P5'硫代磷醯胺酯鍵聯連接之核苷亞單元之寡聚物，通常為線性的。一般而言，核苷亞單元包含核苷或核苷類似物，但亦可包含具有相容化學性之更一般部分，諸如無鹼基糖及其他烴部分，諸如以下參考文獻中所描述：Newton等人，Nucleic Acids Research,21：1155-1162(1993)；Griffin等人，J.Am.Chem.Soc.,114：7976-7982(1992)；Jaschke等人，Tetrahedron Letters,34：301-304(1992)；Ma等人，International application PCT/CA92/00423；Zon等人，國際申請案PCT/US90/06630；Durand等人，Nucleic Acids Research,18：6353-6359(1990)；Salunkhe等人，J.Am.Chem.Soc.,114：8768-8772(1992)；及其類似參考文獻。在一些情況下，該術語意謂其中所有核苷間鍵聯均由N3'→P5'硫代磷醯胺酯鍵聯置換之聚核苷酸。因而，該術語涵蓋部分以及完全「醯胺化」之寡聚物。在一些情況下，該術語意謂其中所有核苷間鍵聯均由N3'→P5'硫代磷醯胺酯鍵聯置換且 其中該等核苷亞單元為天然核苷或其類似物之聚核苷酸。標的聚核苷酸N3'→P5'硫代磷醯胺酯，其中每個鍵聯均為N3'→P5'硫代磷醯胺酯鍵聯(「完全醯胺化」)，可包埋於或連接於其他寡核苷酸或聚核苷酸以形成「部分醯胺化」之更大寡聚物。標的聚核苷酸N3'→P5'硫代磷醯胺酯可包括任何適宜之3'及/或5'末端基。在一些實施例中，聚核苷酸N3'→P5'硫代磷醯胺酯包括3'-羥基末端基或3'-胺基末端基。
如本文中所使用，術語「磷酸酯」及「磷酸酯基」意在涵蓋硫代磷酸酯基及側氧基磷酸酯基。
如本文中所使用，術語「亞磷醯胺胺基」係指連接於亞磷醯胺基之磷原子的胺基--NR4R5，且術語「亞磷醯胺氮」係指亞磷醯胺胺基之氮原子。
「烷基」係指具有1至10個碳原子且諸如1至6個碳原子(例如，「1至6個碳原子之烷基」)或1至5個(例如，「1至5個碳原子之烷基」)或1至4個(例如，「1至4個碳原子之烷基」)或1至3個碳原子(例如，「1至3個碳原子之烷基」)之單價飽和脂族烴基。此術語包括例如直鏈及分支鏈烴基，諸如甲基(CH3-)、乙基(CH3CH2-)、正丙基(CH3CH2CH2-)、異丙基((CH3)2CH-)、正丁基(CH3CH2CH2CH2-)、異丁基((CH3)2CHCH2-)、第二丁基((CH3)(CH3CH2)CH-)、第三丁基((CH3)3C-)、正戊基(CH3CH2CH2CH2CH2-)及新戊基((CH3)3CCH2-)。
術語「經取代之烷基」係指如本文中所定義之 烷基，其中烷基鏈中之一或多個碳原子已視情況經諸如-O-、-N-、-S-、-S(O)n-(其中n為0至2)、-NR-(其中R為氫或烷基)之雜原子置換且具有1至5個選自由以下各項組成之群的取代基：烷氧基、經取代之烷氧基、環烷基、經取代之環烷基、環烯基、經取代之環烯基、醯基、醯胺基、醯氧基、胺基、胺基醯基、胺基醯基氧基、氧基胺基醯基、疊氮基、氰基、鹵素、羥基、側氧基、硫酮基、羧基、羧基烷基、硫代芳基氧基、硫代雜芳基氧基、硫代雜環氧基、硫醇、硫代烷氧基、經取代之硫代烷氧基、芳基、芳氧基、雜芳基、雜芳基氧基、雜環基、雜環氧基、羥基胺基、烷氧基胺基、硝基、-SO-烷基、-SO-芳基、-SO-雜芳基、-SO2-烷基、-SO2-芳基、-SO2-雜芳基及-NRaRb，其中Ra及Rb可相同或不同且選自氫、視情況經取代之烷基、環烷基、烯基、環烯基、炔基、芳基、雜芳基及雜環。在一些情況下，「經取代之烷基」係指如本文中所定義之烷基，其具有1至5個選自由以下各項組成之群的取代基：烷氧基、環烷基、環烯基、醯基、醯胺基、醯氧基、胺基、胺基醯基、胺基醯氧基、氧基胺基醯基、疊氮基、氰基、鹵素、羥基、羧基、羧基烷基、硫醇、硫代烷氧基、芳基、芳氧基、雜芳基、雜芳基氧基、雜環基、雜環氧基、磺醯胺基及-NRaRb，其中Ra及Rb可相同或不同且選自氫、烷基、環烷基、烯基、環烯基、炔基、芳基、雜芳基及雜環。
「烷氧基」係指基團-O-烷基，其中烷基如本 文中所定義。烷氧基包括例如甲氧基、乙氧基、正丙氧基、異丙氧基、正丁氧基、第三丁氧基、第二丁氧基、正戊氧基及其類似基團。術語「烷氧基」亦係指基團烯基-O-、環烷基-O-、環烯基-O-及炔基-O-，其中烯基、環烷基、環烯基及炔基如本文中所定義。
術語「經取代之烷氧基」係指基團經取代之烷基-O-、經取代之烯基-O-、經取代之環烷基-O-、經取代之環烯基-O-及經取代之炔基-O-，其中經取代之烷基、經取代之烯基、經取代之環烷基、經取代之環烯基及經取代之炔基如本文中所定義。
「醯基」係指基團H-C(O)-、烷基-C(O)-、經取代之烷基-C(O)-、烯基-C(O)-、經取代之烯基-C(O)-、炔基-C(O)-、經取代之炔基-C(O)-、環烷基-C(O)-、經取代之環烷基-C(O)-、環烯基-C(O)-、經取代之環烯基-C(O)-、芳基-C(O)-、經取代之芳基-C(O)-、雜芳基-C(O)-、經取代之雜芳基-C(O)-、雜環基-C(O)-及經取代之雜環基-C(O)-，其中烷基、經取代之烷基、烯基、經取代之烯基、炔基、經取代之炔基、環烷基、經取代之環烷基、環烯基、經取代之環烯基、芳基、經取代之芳基、雜芳基、經取代之雜芳基、雜環及經取代之雜環如本文中所定義。舉例而言，醯基包括「乙醯基」基團CH3C(O)-。
術語「經取代之胺基」係指基團-NRR，其中各R獨立地選自由以下各項組成之群：氫、烷基、經取代之烷基、環烷基、經取代之環烷基、烯基、經取代之烯 基、環烯基、經取代之環烯基、炔基、經取代之炔基、芳基、雜芳基及雜環基，其限制條件為至少一個R不為氫。
「鹵基」或「鹵素」係指氟基、氯基、溴基及碘基。
「羥基」係指基團-OH。
「雜芳基」係指在環內具有1至15個碳原子，諸如1至10個碳原子及1至10個選自由氧、氮及硫組成之群的雜原子的芳族基。此種雜芳基可在環系統中具有單個環(諸如吡啶基、咪唑基或呋喃基)或多個縮合環(例如呈在基團中之形式，諸如吲哚嗪基、喹啉基、苯并呋喃、苯并咪唑基或苯并噻吩基)，其中該環系統內之至少一個環為芳族，其限制條件為連接點係經由芳族環之原子。在某些實施例中，雜芳基之氮及/或硫環原子視情況經氧化以提供N-氧化物(N→O)、亞磺醯基或磺醯基部分。此術語包括例如吡啶基、吡咯基、吲哚基、噻吩基及呋喃基。除非另外受關於雜芳基取代基之定義約束，否則此種雜芳基可視情況經1至5個取代基或1至3個取代基取代，該(等)取代基係選自醯氧基、羥基、硫醇、醯基、烷基、烷氧基、烯基、炔基、環烷基、環烯基、經取代之烷基、經取代之烷氧基、經取代之烯基、經取代之炔基、經取代之環烷基、經取代之環烯基、胺基、經取代之胺基、胺基醯基、醯基胺基、烷芳基、芳基、芳氧基、疊氮基、羧基、羧基烷基、氰基、鹵素、硝基、雜芳基、雜芳基氧基、雜環基、雜環氧基、胺基醯氧基、氧基醯基胺 基、硫代烷氧基、經取代之硫代烷氧基、硫代芳氧基、硫代雜芳氧基、-SO-烷基、-SO-經取代之烷基、-SO-芳基、-SO-雜芳基、-SO2-烷基、-SO2-經取代之烷基、-SO2-芳基及-SO2-雜芳基，及三鹵代甲基。在此種情況下，經1至5個取代基(例如，如本文中所描述)取代之雜芳基稱為「經取代之雜芳基」。
「雜環」、「雜環狀」、「雜環烷基」及「雜環基」係指具有單個環或多個縮合環，包括稠合橋環及螺環系統且具有3至20個環原子，包括1至10個雜原子的飽和或不飽和基團。此等環原子係選自由以下各項組成之群：氮、硫或氧，其中在稠合環系統中，一或多個環可為環烷基、芳基或雜芳基，其限制條件為連接點係經由非芳族環。在某些實施例中，雜環狀基團之氮及/或硫原子視情況經氧化以提供N-氧化物、-S(O)-或-SO2-部分。
雜環及雜芳基之實例包括但不限於氮雜環丁烷、吡咯、咪唑、吡唑、吡啶、吡嗪、嘧啶、噠嗪、吲哚嗪、異吲哚、吲哚、二氫吲哚、吲唑、嘌呤、喹嗪、異喹啉、喹啉、酞嗪、萘基吡啶、喹喔啉、喹唑啉、噌啉、蝶啶、咔唑、咔啉、菲啶、吖啶、菲咯啉、異噻唑、吩嗪、異噁唑、吩噁嗪、吩噻嗪、咪唑烯、咪唑啉、哌啶、哌嗪、吲哚啉、酞醯亞胺、1,2,3,4-四氫異喹啉、4,5,6,7-四氫苯并[b]噻吩、噻唑、噻唑啶、噻吩、苯并[b]噻吩、嗎啉基、硫代嗎啉基(亦稱為噻嗎啉基)、1,1-二側氧基硫代嗎啉基、哌啶基、吡咯啶、四氫呋喃基及其類似基團。
除非另外受關於雜環狀取代基之定義約束，否則此種雜環狀基團可視情況經1至5個取代基或1至3個取代基取代，該(等)取代基係選自烷氧基、經取代之烷氧基、環烷基、經取代之環烷基、環烯基、經取代之環烯基、醯基、醯基胺基、醯氧基、胺基、經取代之胺基、胺基醯基、胺基醯氧基、氧基胺基醯基、疊氮基、氰基、鹵素、羥基、側氧基、硫酮基、羧基、羧基烷基、硫代芳氧基、硫代雜芳氧基、硫代雜環氧基、硫醇、硫代烷氧基、經取代之硫代烷氧基、芳基、芳氧基、雜芳基、雜芳氧基、雜環基、雜環氧基、羥基胺基、烷氧基胺基、硝基、-SO-烷基、-SO-經取代之烷基、-SO-芳基、-SO-雜芳基、-SO2-烷基、-SO2-經取代之烷基、-SO2-芳基、-SO2-雜芳基及稠合雜環。
「硝基」係指基團-NO2。
「側氧基」係指原子(=O)。
「硫醇」係指基團-SH。
「側硫基」或術語「硫酮基」係指原子(=S)。
除本文中之揭示內容以外，術語「經取代」當用於修飾指定基團時亦可意謂指定基團之一或多個氫原子各自彼此獨立地經相同或不同的如以下所定義的取代基置換。
除非另作說明，否則除關於本文中之個別術語所揭示的基團以外，用於取代指定基團中之一或多個氫(單一碳上之任何兩個氫可經=O、=NR70、=N-OR70、=N2或=S置換) 的取代基為-R60、鹵基、=O、-OR70、-SR70、-NR80R80、三鹵甲基、-CN、-OCN、-SCN、-NO、-NO2、=N2、-N3、-SO2R70、-SO2O-M+、-SO2OR70、-OSO2R70、-OSO2O-M+、-OSO2OR70、-P(O)(O-)2(M+)2、-P(O)(OR70)O-M+、-P(O)(OR70)2、-C(O)R70、-C(S)R70、-C(NR70)R70、-C(O)O-M+、-C(O)OR70、-C(S)OR70、-C(O)NR80R80、-C(NR70)NR80R80、-OC(O)R70、-OC(S)R70、-OC(O)O-M+、-OC(O)OR70、-OC(S)OR70、-NR70C(O)R70、-NR70C(S)R70、-NR70CO2 -M+、-NR70CO2R70、-NR70C(S)OR70、-NR70C(O)NR80R80、-NR70C(NR70)R70及-NR70C(NR70)NR80R80，其中R60係選自由以下各項組成之群：視情況經取代之烷基、環烷基、雜烷基、雜環烷基烷基、環烷基烷基、芳基、芳基烷基、雜芳基及雜芳基烷基；各R70獨立地為氫或R60；各R80獨立地為R70，或替代地，兩個R80與其所鍵結之氮原子一起形成5員、6員或7員雜環烷基，該雜環烷基可視情況包括1至4個選自由O、N及S組成之群的相同或不同的其他雜原子，其中N可具有-H或C1-C3烷基取代；且各M+為具有淨單一正電荷之相對離子。各M+可獨立地為例如鹼金屬離子，諸如K+、Na+、Li+；銨離子，諸如+N(R60)4；或鹼土金屬離子，諸如[Ca2+]0.5、[Mg2+]0.5或[Ba2+]0.5(下標0.5意謂此種二價鹼土金屬離子之相對離子中一個可為本發明化合物之離子化形式且另一個相對離子為諸如氯離子，或兩個經離子化之本文中所揭示之化合物可充當此種二價鹼土離子之相對離子，或經雙離子化之本發明化合物可充當二價鹼土金屬離子之相對離 子)。作為特定實例，-NR80R80意在包括-NH2、-NH-烷基、N-吡咯啶基、N-哌嗪基、4N-甲基-哌嗪-1-基及N-嗎啉基。
除本文中之揭示內容以外，在某一實施例中，經取代之基團具有1、2、3或4個取代基、1、2或3個取代基、1或2個取代基、或1個取代基。
應理解，在以上所定義之所有經取代之基團中，本文中不意欲包括藉由定義自身具有其他取代基之取代基(例如，經取代之芳基具有經取代之芳基作為取代基，該取代基本身由經取代之芳基取代，該經取代之芳基進一步由經取代之芳基取代等等)而得到的聚合物。在此種情況下，此種取代之最大次數為三。舉例而言，對本文中明確涵蓋之經取代芳基之連續取代僅限於經取代之芳基-(經取代之芳基)-經取代之芳基。
除非另外指示，否則本文中未明確定義之取代基之命名係藉由依序命名官能度之末端部分及朝向連接點之相鄰官能度來達成。
關於本文中所揭示之含有一或多個取代基之任何基團，固然應理解此種基團不含在空間上不切實際及/或在合成上不可行之任何取代或取代型式。另外，標的化合物包括由對此等化合物進行取代而產生的所有立體化學異構體。
術語「醫藥學上可接受之鹽」意謂可接受投與諸如哺乳動物之患者的鹽(對於指定劑量方案具有可接受 之哺乳動物安全性的與相對離子之鹽)。此種鹽可來源於醫藥學上可接受之無機或有機鹼及醫藥學上可接受之無機或有機酸。「醫藥學上可接受之鹽」係指化合物之醫藥學上可接受之鹽，該等鹽來源於此項技術中熟知的多種有機及無機相對離子且僅舉例而言，包括鈉及其類似物；且當該分子含有鹼性官能度時包括有機或無機酸之鹽，諸如鹽酸鹽及其類似物。感興趣之醫藥學上可接受之鹽包括但不限於鋁、銨、精胺酸、鋇、本乍生、鈣、膽鹼、乙二胺、離胺酸、鋰、鎂、美洛明、普魯卡因、鉀、鈉、緩血酸胺、N-甲基葡糖胺、N,N'-二苯甲基乙二胺、氯普魯卡因、二乙醇胺、乙醇胺、哌嗪、鋅、二異丙胺、三乙胺、二異丙基乙胺及三乙醇胺鹽。
術語「其鹽」意謂當酸之質子經諸如金屬陽離子或有機陽離子及其類似物之陽離子置換時形成的化合物。在適用時，該鹽為醫藥學上可接受之鹽，但對於不意欲投與患者之中間化合物之鹽，則此不需如此。舉例而言，本發明化合物之鹽包括其中該化合物藉由無機或有機酸進行質子化以形成陽離子、以無機或有機酸之共軛鹼作為該鹽之陰離子組分的彼等鹽。感興趣之鹽包括但不限於鋁、銨、精胺酸、鋇、本乍生、鈣、銫、膽鹼、乙二胺、鋰、鎂、美洛明、普魯卡因、N-甲基葡糖胺、哌嗪、鉀、鈉、緩血酸胺、鋅、N,N'-二苯甲基乙二胺、氯普魯卡因、二乙醇胺、乙醇胺、哌嗪、二異丙胺、三乙胺、二異丙基乙胺及三乙醇胺鹽。應理解，對於本文中所描繪之包 括核苷間鍵聯之主鏈的任何聚核苷酸結構，此種聚核苷酸亦可包括任何適宜之鹽形式。在一些實施例中，出於簡單之目的而描述核苷間鍵聯之酸形式。在一些情況下，標的化合物之鹽為單價陽離子鹽。在某些情況下，標的化合物之鹽為二價陽離子鹽。在一些情況下，標的化合物之鹽為三價陽離子鹽。
「溶劑合物」係指由溶劑分子與溶質分子或離子之組合形成的複合物。溶劑可為有機化合物、無機化合物或兩者之混合物。溶劑之一些實例包括但不限於甲醇、N,N-二甲基甲醯胺、四氫呋喃、二甲亞碸及水。當溶劑為水時，所形成之溶劑合物為水合物。
「立體異構體」係指具有相同的原子連線性但不同的原子空間排列的化合物。立體異構體包括順式-反式異構體、E及Z異構體、對映異構體及非對映異構體。
「互變異構體」係指分子之僅在原子之電子鍵結方面及/或在質子之位置方面不同的替換形式，諸如烯醇-酮及亞胺-烯胺互變異構體、-NH-P(=S)(OH)-O-及-NH-P(=O)(SH)-O-、或含有-N=C(H)-NH-環原子排列之雜芳基的互變異構形式，諸如吡唑、咪唑、苯并咪唑、三唑及四唑。熟習此項技術者應認識到，本文中所描述之基團的其他互變異構排列為可能的。舉例而言，應理解，由以下結構描述之聚核苷酸：
Figure 105112455-A0202-12-0017-1
亦涵蓋顯示鍵聯基團之一種可能替換互變異構排列的以下結構：
Figure 105112455-A0202-12-0017-2
其中「nps」表示連接一個核苷之3'碳與相鄰核苷之5'碳的硫代磷醯胺酯鍵聯(-NH-P(=O)(SH)-O-或-NH-P(=S)(OH)-O-)。應理解，縱使未明確指示，標的化合物之所有互變異構形式亦由描述該化合物之基團的一種可能互變異構排列結構涵蓋。標的化合物之基團的任何適宜之互變異構排列均可用於描述該化合物。
應瞭解，術語「或其鹽或溶劑合物或立體異構 體」意欲包括鹽、溶劑合物及立體異構體之所有排列，諸如標的化合物之立體異構體之醫藥學上可接受之鹽的溶劑合物。應理解，術語「或其鹽」意欲包括鹽之所有排列。應理解，術語「或其醫藥學上可接受之鹽」意欲包括鹽之所有排列。應理解，術語「或其溶劑合物」意欲包括溶劑合物之所有排列。應理解，術語「或其立體異構體」意欲包括立體異構體之所有排列。應理解，術語「或其互變異構體」意欲包括互變異構體之所有排列。因而，舉例而言，由此可見意欲包括標的化合物之立體異構體之互變異構體之醫藥學上可接受之鹽的溶劑合物。
如本文中所使用，術語「經分離」意在描述在不同於該化合物天然存在環境之環境中的感興趣之化合物。「經分離」意在包括實質上富含感興趣之化合物及/或感興趣之化合物部分或實質上經純化之樣品內的化合物。
如本文中所使用，術語「實質上經純化」係指自其天然環境中移出且至少60%不含、至少75%不含、至少80%不含、至少81%不含、至少82%不含、至少83%不含、至少84%不含、至少85%不含、至少86%不含、至少87%不含、至少88%不含、至少89%不含、至少90%不含、至少91%不含、至少92%不含、至少93%不含、至少94%不含、至少95%不含、至少96%不含、至少97%不含、至少98%不含、至少99%不含或超過99%不含其在天然情況下締合之其他組分的化合物。
術語「生理條件」意在涵蓋與活細胞相容之彼等條件，例如，具有與活細胞相容之溫度、pH值、鹽度等之主要呈水性之條件。
在提供值之範圍時，應理解，除非上下文另外清楚指出，否則介於該範圍之上限與下限之間(直至下限單位之十分之一)的各居中值及該所陳述範圍中之任何其他所陳述值或居中值涵蓋在本發明內。根據該所陳述範圍中之任何明確排除之界限，此等較小範圍之上限及下限可獨立地包括在該等較小範圍中，且亦涵蓋在本發明內。在所陳述之範圍包括一個或兩個界限之情況下，排除彼等所包括界限中之任一者或兩者的範圍亦包括在本發明中。
必須指出，除非上下文另外清楚指示，否則如本文中及所附申請專利範圍中所使用，單數形式「一」及「該」包括複數參考物。應進一步注意可起草申請專利範圍以排除任何視情況存在之要素。因而，此陳述意欲充當結合陳述申請專利範圍要素來使用此種排他性術語(諸如「僅僅」、「僅」及其類似術語)或使用「負」限制的前提條件。
術語之其他定義可能出現在本說明書中。
例示性實施例之描述
如以上所概述，本發明之諸多態樣包括製備聚核苷酸之方法。在一些實施例中，該方法包括使第一聚核苷酸組合物與多價陽離子鹽接觸以使包括至少一個多價陽 離子相對離子之第一聚核苷酸鹽沈澱，該第一聚核苷酸組合物包括：聚核苷酸，其具有7個以上核苷亞單元之序列，其中該等核苷亞單元中有至少兩個係由N3'→P5'硫代磷醯胺酯亞單元間鍵聯接合；以及非目標合成產物及試劑；及分離該第一聚核苷酸鹽與該經接觸之第一聚核苷酸組合物，以產生包括該第一聚核苷酸鹽之第二聚核苷酸組合物。在某些實施例中，該方法進一步包括使該聚核苷酸鹽與逆相層析載體接觸；及自該層析載體溶離包括該聚核苷酸之第三聚核苷酸組合物。在一些情況下，第三聚核苷酸組合物包括第二聚核苷酸鹽。亦提供包括該聚核苷酸之鹽的組合物，該聚核苷酸之鹽包括至少一個多價陽離子相對離子。在一些實施例中，該至少一個多價陽離子相對離子係選自由以下各項組成之群：鎂、鋅、鋁及鈣。
在描述各種實施例之前，應理解本發明之教示不侷限於所描述之特定實施例且因而固然可變化。亦應理解，本文中所使用之術語僅出於描述特定實施例之目的，而不意欲具有限制性，此係因為本發明教示之範疇將僅由所附申請專利範圍加以限制。
本文中所使用之章節標題僅出於組織之目的且不應被視為以任何方式限制所描述之標的物。儘管已描述本發明之教示連同各種實施例，但不意欲本發明之教示僅限於此種實施例。相反，如熟習此項技術者應瞭解，本發明之教示涵蓋各種替代方案、修改及等效物。
除非另外定義，否則本文中所使用之所有技術 及科學術語均具有與一般熟習本發明所屬領域者通常所理解的含義相同的含義。儘管與本文中所描述者類似或等效之任何方法及材料亦可用於本發明之實踐或測試中，但現描述感興趣之方法及材料。本文中所提及之所有出版物係以引用之方式併入本文中以結合所引用之出版物來揭示並描述方法及/或材料。
對任何出版物之引用係由於其揭示內容在申請日期之前，且不應被視為承認本申請專利範圍由於先前發明而無權優先於此種出版物。此外，所提供之公開日期可與實際公開日期不同，該等實際公開日期可獨立地證實。
應瞭解，個別實施例之內容中出於清楚性之目的而描述的某些本發明特徵亦可組合提供於單一實施例中。相反，單一實施例之內容中出於簡便之目的而描述的各種本發明特徵亦可個別地或以任何適合之子組合形式提供。關於本發明之所有實施例組合明確由本發明涵蓋且揭示於本文中，如同各個及每個組合個別地且明確地得以揭示，達到此種組合涵蓋例如作為穩定化合物之化合物(亦即，可製造、分離、表徵及測試生物活性的化合物)的標的物的程度。另外，各種實施例及其要素(例如描述此種變數之實施例中所列出的化學基團的要素)之所有子組合亦明確由本發明涵蓋且揭示於本文中，如同各個及每個此種子組合個別地且明確地揭示於本文中。
本文中所提及之所有專利及出版物，包括此種專利及出版物內所揭示之所有序列，明確地以引用之方式 併入。
在進一步描述本發明時，首先詳細描述製備聚核苷酸之方法。接下來，綜述用於實踐標的方法之感興趣之聚核苷酸組合物。
製備方法
本發明之諸多態樣包括製備聚核苷酸之方法。在一些實施例中，該方法包括使第一聚核苷酸組合物與多價陽離子鹽接觸以使包括至少一個多價陽離子相對離子之聚核苷酸鹽沈澱，該第一聚核苷酸組合物包括聚核苷酸(例如，如本文中所描述)以及非目標合成產物及試劑。使用標的方法使聚核苷酸鹽沈澱提供所有可溶性非目標合成產物及試劑之移除。在一些實施例中，該方法包括分離該聚核苷酸鹽與該經接觸之第一聚核苷酸組合物，以產生包括該聚核苷酸鹽之第二聚核苷酸組合物。在某些實施例中，該第一聚核苷酸組合物、該聚核苷酸鹽及該第二聚核苷酸組合物各自包括具有7個以上核苷亞單元之序列的目標聚核苷酸，其中該等核苷亞單元中有至少兩個係由N3'→P5'硫代磷醯胺酯亞單元間鍵聯接合(例如，如本文中所描述)。
該第二聚核苷酸組合物與該第一聚核苷酸組合物相比可具有減少量之非目標合成產物及試劑。減少量之非目標合成產物及試劑意謂與該第一聚核苷酸組合物相比該第二聚核苷酸組合物中所存在之非目標合成產物及試劑 以重量計減少10%以上，諸如以重量計減少15%以上、以重量計減少20%以上、以重量計減少25%以上、以重量計減少30%以上、以重量計減少35%以上、以重量計減少40%以上、以重量計減少45%以上、以重量計減少50%以上、以重量計減少55%以上、以重量計減少60%以上、以重量計減少65%以上、以重量計減少70%以上、以重量計減少75%以上、以重量計減少80%以上、以重量計減少85%以上、以重量計減少90%以上、或以重量計減少95%以上。因而，標的方法可提供目標聚核苷酸相對於非目標合成產物及試劑之選擇性沈澱。在某些實施例中，標的方法提供與使用諸如純乙醇或乙醇溶液之有機溶劑的對照聚核苷酸沈澱方法相比經改良之沈澱選擇性(參見例如Crouse J,Amorese D(1987).「Ethanol Precipitation：Ammonium Acetate as an Alternative to Sodium Acetate」.Focus 9(2)：3-5)。經改良之沈澱選擇性意謂與對照組合物相比，自該第二聚核苷酸組合物中移除以重量計佔5%以上之非目標合成產物及試劑，諸如移除以重量計佔10%以上、以重量計佔15%以上、以重量計佔20%以上、以重量計佔25%以上、以重量計佔30%以上、以重量計佔35%以上、以重量計佔40%以上、以重量計佔45%以上、以重量計佔50%以上、以重量計佔55%以上、以重量計佔60%以上、以重量計佔65%以上、以重量計佔70%以上、以重量計佔75%以上、以重量計佔80%以上、以重量計佔85%以上、以重量計佔90%以上或以重量計佔95%以上之非目標 合成產物及試劑。非目標合成產物及試劑與第一聚核苷酸組合物相比之減少量可使用任何適宜之方法來確定，例如使用HPLC方法。
如本文中所使用，術語「目標合成聚核苷酸」及「目標聚核苷酸」可互換使用且係指具有特定所要核苷酸序列之聚核苷酸，該聚核苷酸係在載體上經由任何適宜之逐步固相聚核苷酸合成法(例如，如本文中所描述)合成，且其中聚核苷酸缺乏僅用於執行目標聚核苷酸合成策略之目的的任何保護基。此種保護基可在固相合成之最終步驟中，例如在最終脫保護及聚核苷酸自載體裂解以產生目標聚核苷酸期間自聚核苷酸移除。如本文中所使用，術語「非目標」係指，任何適宜之組分，例如並非合成之所要目標產物的化合物、聚核苷酸或其衍生物、試劑等或其混合物。
目標聚核苷酸可包括任何適宜數目之核苷亞單元，諸如介於7個與500個之間的核苷亞單元、介於7個與100個之間的核苷亞單元、介於7個與75個之間的核苷亞單元、介於7個與50個之間的核苷亞單元、介於7個與40個之間的核苷亞單元、介於7個與30個之間的核苷亞單元、介於7個與20個之間的核苷亞單元、介於7個與15個之間的核苷亞單元、介於10個與15個之間的核苷亞單元或介於13個與15個之間的核苷亞單元。在一些情況下，目標聚核苷酸具有介於7個與100個之間的核苷亞單元、介於7個與50個之間的核苷亞單元、介於10 個與50個之間的核苷亞單元、介於10個與40個之間的核苷亞單元、介於10個與30個之間的核苷亞單元、介於10個與25個之間的核苷亞單元、介於10個與20個之間的核苷亞單元、介於12個與18個之間的核苷亞單元或介於12個與16個之間的核苷亞單元。在某些情況下，目標聚核苷酸具有7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25個核苷亞單元。
如本文中所使用，術語「非目標合成產物及試劑」總體上係指可能存在於固相聚核苷酸合成之粗合成產物中的多種非目標群組分，包括但不限於：該合成之非目標聚核苷酸產物，諸如截短聚核苷酸、已封端之聚核苷酸片段(亦即，在亞單元偶合失敗後封端之序列)、包括缺失之聚核苷酸(亦即，丟失一或多個目標核苷單體或二聚體，例如，如本文中所描述)及衍生化聚核苷酸(例如，在合成或裂解期間進行不合需要之副反應的聚核苷酸序列)；及試劑，諸如裂解連接子、脫保護產物，例如移除之保護基產物，諸如磷保護基產物及鹼保護基產物(例如，環外胺保護基產物)、裂解試劑及/或裂解清除劑及殘餘合成試劑，諸如單體、二聚體、偶合試劑、封端試劑或脫保護試劑。
在某些實施例中，該方法提供目標聚核苷酸相對於非目標合成產物及試劑(包括具有6個以下核苷亞單元、諸如5個以下、4個以下、3個以下或2個核苷亞單元之聚核苷酸)的選擇性沈澱。在某些情況下，所有非目 標合成產物及非聚核苷酸試劑在標的方法之選擇性沈澱步驟期間仍可溶且可能因而容易自所產生之聚核苷酸鹽沈澱物中移除。
標的方法可包括自粗合成製劑中沈澱並分離目標聚核苷酸以產生具有若干理想性質之聚核苷酸組合物，諸如減少量之非目標合成產物及試劑(例如，合成試劑、裂解試劑、清除劑、移除之保護基、裂解副產物(連接子、封端基等)及小聚核苷酸片段)。
在一些實施例中，標的方法包括在層析純化之前使聚核苷酸作為多價陽離子鹽自粗合成製劑中沈澱。在某些情況下，標的方法為純化目標聚核苷酸之方法。使用多價陽離子鹽使粗聚核苷酸組合物沈澱可產生包括至少一個多價陽離子相對離子之聚核苷酸鹽沈澱物。在一些情況下，聚核苷酸鹽沈澱物包括與聚陰離子聚核苷酸主鏈形成離子對之單價及多價陽離子相對離子的混合物。如此處所使用，術語「多價陽離子鹽」及「多價鹽」當關於聚核苷酸使用時可互換用於指包括與聚核苷酸主鏈之陰離子亞單元間鍵聯基團進行離子配對的至少一個多價陽離子相對離子的聚核苷酸鹽。在一些情況下，聚核苷酸之多價陽離子鹽包括單價及多價陽離子之混合物。在一些實施例中，多價陽離子可提供藉由與兩個以上聚核苷酸主鏈之陰離子亞單元間鍵聯基團進行離子配對而達成目標聚核苷酸之聚集。在某些情況下，二價陽離子離子對與兩種不同的聚核苷酸形成二聚體。在一些情況下，聚核苷酸之進一步聚集 可藉由額外多價陽離子介導之額外多價相互作用來達成。因而，在一些情況下，標的方法可提供目標聚核苷酸相對於非目標合成產物及試劑之選擇性聚集及沈澱。
在該方法之一些實施例中，該至少一個多價陽離子相對離子為二價。在某些實施例中，該至少一個多價陽離子相對離子係選自由以下各項組成之群：鎂、鋅及鈣。在一些實施例中，該至少一個多價陽離子相對離子為三價。在某些實施例中，該至少一個多價陽離子相對離子為鋁。在一些實施例中，該聚核苷酸鹽進一步包括單價陽離子相對離子。在此種情況下，聚核苷酸鹽為混合鹽，例如包括兩種以上不同的陽離子相對離子的鹽。
使聚核苷酸沈澱之任何適宜方法均可得以用於標的方法中。使該第一聚核苷酸組合物與多價陽離子鹽接觸以使包括至少一個多價陽離子相對離子之聚核苷酸鹽沈澱的步驟可使用任何適宜方法來達成。任何適宜多價陽離子及其鹽(例如，如本文中所描述)均可用於接觸步驟中以產生沈澱物。在某些情況下，包括至少一個多價陽離子相對離子之聚核苷酸鹽係在液相中，例如，經由向包括該聚核苷酸之溶液中添加多價陽離子鹽而產生。在多價陽離子鹽已添加至溶液中後，隨後可形成沈澱物。在一些情況下，包括至少一個多價陽離子相對離子之聚核苷酸鹽可在離子交換載體上形成。任何適宜之離子交換載體均可用於接觸步驟。在一些情況下，離子交換載體為強陽離子交換樹脂。在該方法之一些實施例中，接觸步驟包括自包括多 價陽離子相對離子之陽離子交換載體溶離第一聚核苷酸組合物。如本文中所使用，術語「陽離子交換載體」係指本身為陰離子且能夠與諸如感興趣之多價陽離子之陽離子分析物進行離子配對的載體。任何適宜溶離劑均可用於自陽離子交換載體溶離之步驟。在一些情況下，在已自陽離子交換載體溶離聚核苷酸鹽之後，溶離物中形成沈澱物。
可對目標合成聚核苷酸之任何適宜粗合成製劑執行標的方法。在一些情況下，第一聚核苷酸組合物為目標合成聚核苷酸之任何合成製劑。在某些實施例中，第一聚核苷酸組合物為作為目標聚核苷酸在合成後自載體裂解之產物的組合物。因而，第一聚核苷酸組合物可包括多種非目標合成產物及試劑。標的方法提供聚核苷酸鹽相對於非目標合成產物及試劑之選擇性沈澱，該等非目標合成產物及試劑仍在溶液中且因而可容易地自所產生之沈澱物中移除。
任何適宜合成方法(例如，如本文中所描述)均可用於合成目標聚核苷酸。合成後，使目標聚核苷酸自在上面進行逐步合成之載體裂解。裂解後，全長目標聚核苷酸可經純化以移除不合需要之合成及裂解試劑且移除非目標聚核苷酸片段及其衍生物。包括使包括至少一個多價陽離子相對離子之聚核苷酸鹽沈澱的標的方法可在製備目標聚核苷酸之任何適宜階段，諸如合成後及逆相層析純化前進行。
如本文中所使用，術語「粗合成製劑」、「粗 組合物」及「粗聚核苷酸」係指包括合成後經由自固相合成載體裂解而收集之固相聚核苷酸合成之合成產物的組合物，其中該組合物未經純化，亦即，未對該組合物進行層析純化。層析純化係指包括將目標聚核苷酸吸附至層析載體且隨後自非目標聚核苷酸溶離並解析目標聚核苷酸的任何適宜純化方法。在一些情況下，層析純化係指逆相層析純化。
在一些實施例中，該方法進一步包括提供第一聚核苷酸組合物，其中該組合物係經由合成後自固相合成載體裂解而產生。亦可在所產生之組合物用於標的方法中之前對粗合成製劑進行任何適宜之額外步驟，諸如蒸發、稀釋或濃縮步驟。在一些情況下，該方法進一步包括合成目標聚核苷酸(例如，如本文中所描述在固相合成載體上)。在某些實施例中，該方法進一步包括自載體裂解聚核苷酸以產生第一聚核苷酸組合物。
可使用任何適宜之方法來分離包括聚核苷酸鹽之固體沈澱物與跟多價鹽接觸之第一聚核苷酸組合物(亦即，經接觸之第一聚核苷酸組合物)。感興趣之分離方法包括但不限於離心、過濾、傾析及其類似方法。
在一些情況下，包括聚核苷酸鹽之沈澱物之分離係藉由離心來達成，其中向經接觸之第一聚核苷酸組合物施加離心力，例如在離心機中，致使沈澱物形成球粒，例如，在容器底部。經由離心形成球粒可稱為使沈澱物下旋。在該方法之某些實施例中，分離步驟包括對經接觸之 第一聚核苷酸組合物進行離心以使聚核苷酸鹽沈澱物下旋。隨後可在不干擾沈澱物的情況下自管中傾析上清液，例如用巴斯德移液管。可用洗滌溶液重複離心過程。
在一些情況下，包括聚核苷酸鹽之沈澱物之分離係藉由過濾來達成。在該方法之一些實施例中，分離步驟包括自經接觸之第一聚核苷酸過濾聚核苷酸鹽。任何適宜之篩檢程式及過濾介質均可用於標的方法中。在某些情況下，分離係藉由使用根據目標聚核苷酸選擇之過濾介質進行深度過濾來達成。
在一些實施例中，該方法包括：使包括以下之第一聚核苷酸組合物：聚核苷酸，其具有7個以上核苷亞單元之序列且該等核苷亞單元中有至少兩個係由N3'→P5'硫代磷醯胺酯亞單元間鍵聯接合；以及非目標合成產物及試劑；與多價陽離子鹽接觸以使包括至少一個多價陽離子相對離子之第一聚核苷酸鹽沈澱；及分離該第一聚核苷酸鹽與該經接觸之第一聚核苷酸組合物，以產生包括該第一聚核苷酸鹽之第二聚核苷酸組合物。
分離該沈澱物與該經接觸之第一聚核苷酸組合物產生包括該第一聚核苷酸鹽之第二聚核苷酸組合物。在一些情況下，使用多價陽離子鹽經由標的方法進行該第一聚核苷酸鹽之選擇性沈澱產生包括減少量之非目標合成產物及試劑的第二聚核苷酸組合物。
在選擇性沈澱之後，隨後可藉由自聚核苷酸中陽離子交換出至少一個多價陽離子相對離子且用感興趣之另一陽離子相對離子(例如，如本文中所描述)進行置換而將標的聚核苷酸鹽轉化成可溶性聚核苷酸鹽。因而，標的方法提供包括至少一個多價陽離子相對離子之第一聚核苷酸鹽的可逆形成。如本文中所使用，術語「可逆形成」及「可逆交換」可互換使用且係指藉由例如選擇性沈澱(例如，如本文中所描述)來製備聚核苷酸鹽，其中所形成之鹽亦可隨後解離以便自鹽中交換出至少一個多價陽離子鹽。在一些情況下，不溶於任何溶劑中之聚核苷酸鹽可稱為不可逆形成之鹽。在一些實施例中，該方法包括自第一聚核苷酸鹽中交換出至少一個多價陽離子相對離子以產生可溶性第二聚核苷酸鹽，其中該交換包括使多價陽離子相對離子解離且與感興趣之可溶性鹽陽離子進行離子配對。在某些情況下，可溶性第二聚核苷酸鹽為單價鹽。在某些情況下，可溶性第二聚核苷酸鹽為鈉鹽。在某些情況下，可溶性第二聚核苷酸鹽為三乙基銨鹽。在一些情況下，第一聚核苷酸與第二聚核苷酸彼此不同，亦即，包括不同的陽離子相對離子。標的聚核苷酸鹽之解離及至少一個多價陽離子相對離子之交換可使用任何適宜之方法來達成。在某些情況下，解離係使用逆相層析來達成，例如，如本文中所描述。在一些情況下，可利用離子交換層析來達成解離。在某些實施例中，第一聚核苷酸鹽之解離係藉由將該鹽溶解於包括感興趣之陽離子相對離子的溶劑中來達成。
在分離之後，可對第二聚核苷酸組合物進行進一步純化步驟。在一些實施例中，該方法進一步包括：使該第一聚核苷酸鹽與逆相層析載體接觸；及自該層析載體溶離包括該聚核苷酸之第三聚核苷酸組合物。在某些實施例中，該第三聚核苷酸組合物包括第二聚核苷酸鹽。任何適宜之逆相層析法均可用於純化該聚核苷酸鹽。感興趣之逆相層析法及載體包括但不限於使用離子對逆相層析之層析純化、C18逆相層析以及以下文獻所描述之彼等方法及載體：Chen等人，Journal of Chromatography A，第1288卷，2013年5月3日，第73-81頁；及Zimmermann等人，Journal of Chromatography A，第1354卷，2014年8月8日，第43-55頁。在一些實施例中，該第二聚核苷酸組合物係直接負載至該逆相層析載體上。直接負載於載體上意謂使用標的方法產生之第二聚核苷酸組合物係例如作為經分離之固體沈澱物直接添加至逆相層析載體。在一些情況下，逆相層析載體為配置為管柱之樹脂且聚核苷酸組合物係添加至樹脂層之頂部。在某些實施例中，該方法進一步包括將第二聚核苷酸組合物溶解於溶劑中。任何適宜之溶劑均可利用，包括但不限於水性緩衝液、可與水混溶之有機溶劑及其混合物。在此種情況下，可使第二聚核苷酸組合物之溶液與逆相層析載體接觸以便使聚核苷酸吸附至載體，隨後溶離。
在一些情況下，該接觸包括使聚核苷酸吸附至逆相層析載體且隨後溶離聚核苷酸以提供目標聚核苷酸與 組合物中所存在之非目標聚核苷酸及殘餘合成試劑的層析解析。收集含有目標聚核苷酸之溶離物。可利用任何適宜之溶離劑自逆相層析載體溶離聚核苷酸。溶離劑可根據多種因素加以選擇，諸如逆相層析載體之性質、目標寡核苷酸、目標聚核苷酸之特定所要鹽等等。在一些情況下，第一聚核苷酸鹽之至少一個多價陽離子相對離子在逆相層析載體上與溶離劑中所包括的另一不同的感興趣之陽離子相對離子進行離子交換。在此種情況下，當自逆相層析載體溶離聚核苷酸時，其呈與其負載時不同的鹽形式(亦即，第二聚核苷酸鹽)，此係因為自聚核苷酸中交換出至少一個多價陽離子相對離子。在某些情況下，該第三聚核苷酸組合物中自載體溶離之聚核苷酸之鹽形式與包括至少一個多價陽離子相對離子之第一聚核苷酸鹽相比更具水溶性。
在某些實施例中，該第三聚核苷酸組合物包括第二聚核苷酸鹽，該第二聚核苷酸鹽為該聚核苷酸之醫藥學上可接受之鹽。在某些情況下，該第三組合物包括第二聚核苷酸鹽，該第二聚核苷酸鹽為該聚核苷酸之單價陽離子鹽。在某些情況下，該第三組合物包括第二聚核苷酸鹽，該第二聚核苷酸鹽為該聚核苷酸之三乙基銨鹽。在某些情況下，該第三組合物包括第二聚核苷酸鈉鹽，該第二聚核苷酸鈉鹽為該聚核苷酸之鈉鹽。應理解，在藉由逆相層析法純化聚核苷酸之後，可對聚核苷酸鹽進行任何數目之進一步陽離子相對離子交換步驟以產生聚核苷酸之所要鹽形式。在一些實施例中，該方法進一步包括自第二聚核 苷酸鹽中離子交換陽離子相對離子以產生第三聚核苷酸鹽。在某些實施例中，該第三聚核苷酸鹽為該聚核苷酸之醫藥學上可接受之鹽。在某些情況下，該第三聚核苷酸鹽為該聚核苷酸之單價陽離子鹽。在某些情況下，該第三聚核苷酸鹽為該聚核苷酸之鈉鹽(例如，如本文中所描述)。
在某些情況下，該第一組合物包括該聚核苷酸之單價陽離子鹽。在某些情況下，該單價陽離子鹽係選自由以下各項組成之群：鈉、銨及烷基銨。在某些情況下，該烷基銨係選自由以下各項組成之群：二甲基銨、甲基銨、乙基銨及三乙基銨。在某些情況下，該第一組合物包括該聚核苷酸之銨鹽。在某些情況下，該第一組合物包括該聚核苷酸之烷基銨鹽。在某些情況下，該第一組合物包括該聚核苷酸之三乙基銨鹽。在某些情況下，該第一組合物包括該聚核苷酸之鈉鹽。該第一聚核苷酸組合物可與多價陽離子鹽接觸以使包括至少一個多價陽離子相對離子之第一聚核苷酸鹽沈澱。因而，在某些實施例中，經接觸之第一聚核苷酸組合物包括有包括至少一個多價陽離子相對離子之第一聚核苷酸鹽。
該方法之以上指示之實施例中之任一者的實施例被視為涵蓋在本發明之範疇內，其中聚核苷酸如本文中所描述。
合成方法
任何適宜之聚核苷酸合成方法、策略及化學反 應均可用於製備得以用於標的製備方法中之粗合成產物聚核苷酸組合物。可經改適以用於標的方法中之感興趣之聚核苷酸合成化學反應及方法包括但不限於亞磷醯胺、H-膦酸酯、磷酸二酯、磷酸三酯、亞磷酸三酯。本發明化合物之聚核苷酸組分可藉由對用於所選化學反應類型之任何習知方案進行改適來合成。用於合成具有N3'→P5'硫代磷醯胺酯化學部分之寡核苷酸的感興趣之方法包括但不限於以下文獻中所描述之彼等方法：U.S.5,824,793；McCurdy等人，(1997)Tetrahedron Letters,38：207-210；Pongracz & Gryaznov,(1999)Tetrahedron Letters,49：7661-7664；US 6,835,826；US 7,494,982；US 7,485,717；及US 5,684,143。
在一些情況下，感興趣之聚核苷酸係經由連續偶合自目標聚核苷酸序列之5'-末端開始且進行至3'-末端來合成。在某些情況下，感興趣之聚核苷酸係經由連續偶合自目標聚核苷酸序列之3'-末端開始且進行至5'-末端來合成。在一些實施例中，聚核苷酸係藉由單體亞磷醯胺與聚核苷酸生長末端之連續偶合來合成。5'-末端核苷亞單元可經由視情況存在之連接基團或5'-末端基而連接於任何適宜之固體載體。在第一亞單元連接於該固體載體後，該亞單元可脫除保護基以產生經固定之游離3'-末端基。隨後，可達成亞單元與生長寡核苷酸鏈偶合。在一些情況下，該方法包括使載體結合之3'-末端基與3'-經保護之核苷酸-5'-亞磷醯胺單體偶合。在某些實施例中，3'-末端基 為3'-羥基。在某些實施例中，3'-末端基為3'-胺基。
在一些情況下，該聚核苷酸合成方法包括以下步驟：(a)對與固相載體連接之末端核苷之經保護之3'-胺基進行脫保護，該脫保護形成游離3'-胺基；(b)在親核性催化劑存在下使該游離3'-胺基與3'-經保護之胺基核苷-5'-亞磷醯胺單體接觸，以形成核苷間N3'→P5'亞磷醯胺鍵聯；及(c)使該鍵聯氧化以產生N3'→P5'硫代磷醯胺酯鍵聯。在一些實施例中，該方法包括(d)重複步驟(a)至(c)，直至合成該聚核苷酸。
在一些情況下，該方法包括使載體結合之3'-末端基與3'-經保護之二核苷酸-5'-亞磷醯胺二聚體偶合。感興趣之聚核苷酸合成法包括但不限於如PCT公開案第WO2015/168310號中所描述之包括二核苷酸二聚體之至少一次偶合的彼等固相合成方法，該申請案主張美國臨時申請案第61/987,396號之權益。目標聚核苷酸序列可經由包括二聚體及單體亞單元兩者與生長寡核苷酸鏈之3'末端基連續偶合的逆合成策略來合成。在一些實施例中，聚核苷酸係使用包括二核苷酸二聚體與生長聚核苷酸鏈之游離3'末端基之至少一次偶合的方法來合成。
在一些情況下，該聚核苷酸合成方法包括以下步驟：(a)對與固相載體連接之末端核苷之經保護之3'-胺基進行脫保護，該脫保護形成游離3'-胺基；(b)在親核性催化劑存在下使該游離3'-胺基與3'-經保護之胺基二核苷酸硫代磷醯胺酯或亞磷醯胺-5'-亞磷醯胺二聚體接觸，以 形成核苷間N3'→P5'亞磷醯胺鍵聯；及(c)使該鍵聯氧化以產生N3'→P5'硫代磷醯胺酯鍵聯。在一些實施例中，該方法包括(d)重複步驟(a)至(c)直至合成該聚核苷酸，其中在步驟(b)中可利用3'-經保護之胺基二核苷酸硫代磷醯胺酯-5'-亞磷醯胺二聚體或3'-經保護之胺基核苷酸-5'-亞磷醯胺單體。
任何適宜之保護基策略均可用於標的方法中以保護聚核苷酸之鹼基、亞磷醯胺、磷醯胺酯、5'、2'及/或3'基團。感興趣之保護基包括但不限於以下文獻所描述之彼等保護基：Ohkubo等人，Org.Lett.,2010,12(11),pp 2496-2499；以及Beaucage及Iyer,Tetrahedron 48：2223-2311(1992)。
如本文中所使用，術語「磷酸酯保護基」係指可連接於寡核苷酸之含磷亞單元間鍵聯的保護基。當存在時，磷酸酯保護基可防止(亦即，阻斷)含磷鍵聯在連接磷酸酯保護基之位置上的反應。任何適宜之含磷亞單元間鍵聯(例如P(III)及P(V)鍵聯)均可藉由標的磷酸酯保護基加以保護，包括但不限於亞磷醯胺、側氧基磷醯胺酯、硫代磷醯胺酯、磷酸酯、硫代磷酸酯、磷酸二酯鍵聯及其類似物。磷酸酯保護基可連接於含磷亞單元間鍵聯之可利用氧原子。任何適宜之保護基均可用作磷酸酯保護基。在某些實施例中，磷酸酯保護基為甲基或β-氰基乙基。
在一些情況下，生長聚核苷酸鏈之3'-末端基可包括3'-羥基、3'-胺基或其經保護之型式。在聚核苷酸 合成期間，3'-末端基上可利用任何適宜之羥基及/或胺基保護基。在一些實施例中，3'末端基為經保護之3'-胺基且該方法包括脫保護或移除保護基以產生游離3'胺基。如本文中所使用，術語「游離胺基」意謂可用於與輸入單體或二聚體之亞磷醯胺基反應的胺基。在一些實施例中，游離胺基為一級胺。在脫保護(例如，脫三苯甲基)步驟之後，胺基可呈鹽(例如，用於脫三苯甲基之酸的共軛鹼鹽)形式。此鹽可在脫三苯甲基步驟之後視情況用諸如2%三乙胺或吡啶/乙腈之鹼性溶液中和。
3'-經保護之輸入亞單元亞磷醯胺防止該鏈之不合需要之聚合。在一些實施例中，3'-末端基為經保護之3'-羥基且該方法包括脫保護或移除保護基以產生游離3'-羥基。在一些實施例中，3'-末端基為經保護之3'-胺基且該方法包括脫保護或移除保護基以產生游離3'-胺基。經保護之3'-胺基或3'-羥基可用三苯甲基保護基加以保護。在某些實施例中，三苯甲基保護基為三苯基甲基(Tr或Trt，Ph3C-)。在某些實施例中，三苯甲基保護基為4,4'-二甲氧基三苯甲基(DMT)。3'-末端胺基或羥基之脫保護可使用任何適宜之方法來達成。感興趣之方法包括但不限於Beaucage及Iyer,Tetrahedron 48：2223-2311(1992)所揭示之彼等方法。在一些情況下，末端核苷之經保護3'胺基之脫保護包括脫三苯甲基以產生游離3'末端基，例如酸催化之脫三苯甲基。在一些情況下，二聚體或單體亞單元亞磷醯胺包括與連接於固體載體之末端核苷之3'-末端基相同 的經保護之3'-羥基或3'-胺基。
任何適宜之固相載體均可用於根據標的方法合成聚核苷酸。感興趣之固體載體包括但不限於由控制孔隙玻璃(CPG)製造之微粒、高度交聯聚苯乙烯(例如NittoPhase HL 400或GE Primer 350)、丙烯酸系共聚物、纖維素、耐綸、葡聚糖、乳膠、聚丙烯醛及其類似物，諸如以下例示性參考文獻中所揭示者：Meth.Enzymol.,A部分，第11-147頁，第44卷(Academic Press,New York,1976)；美國專利第4,678,814號、第4,413,070號及第4,046；720號；以及Pon，第19章，Agrawal編，Methods in Molecular Biology，第20卷，(Humana Press,Totowa,N.J.,1993)。感興趣之其他載體包括聚苯乙烯珠粒；接枝有聚乙二醇之聚苯乙烯(例如TentaGelTM，Rapp Polymere，Tubingen Germany)；及其類似物。載體特徵(諸如材料、孔隙度、尺寸、形狀及其類似特徵)之選擇及所用連接部分之類型視多種因素而定，諸如所用保護基、最終產物之長度、最終產物之品質及其類似因素。例示性連接部分揭示於以下文獻中：Pon等人，Biotechniques,6：768-775(1988)；Webb，美國專利第4,659,774號；Barany等人，國際專利申請案PCT/US91/06103；Brown等人，J.Chem.Soc.Commun.,1989：891-893；Damha等人，Nucleic Acids Research,18：3813-3821(1990)；Beattie等人，Clinical Chemistry,39：719-722(1993)；Maskos及Southern,Nucleic Acids Research,20：1679-1684(1992)；及其類似 文獻。
在一些實施例中，得以用於標的方法中之固體載體包括CPG及接枝有聚乙二醇且具有末端胺基之聚苯乙烯(例如TentaGel-NH2 TM，Rapp Polymere，Tubingen Germany)。胺基丙基可用作介於CPG與核苷鍵聯之間的間隔基。在一些情況下，與第一核苷之5'-羥基的鍵聯為琥珀醯基，其可提供在用氨水合成之後可能裂解之鹼不穩定性酯鍵聯。
在脫保護後，載體結合之核苷能夠與二聚體或單體亞單元亞磷醯胺反應以形成核苷間鍵聯。應理解，載體結合之核苷可能係指與固體載體連接之單一殘基，或可能係指與載體連接之寡核苷酸鏈末端殘基。任何適宜之偶合化學反應、偶合試劑及方法均可用於標的方法中。在標的方法之情況下，關於偶合條件、保護基、固相載體、連接基團、脫保護試劑、用於自固相載體裂解產物之試劑、產物之純化及其類似物的任何適宜選擇均可根據例如以下參考文獻之指導來進行：Gait編，Oligonucleotide Synthesis：A Practical Approach(IRL Press,Oxford,1984)；Amarnath及Broom,Chemical Reviews，第77卷，pgs.183-217(1977)；Pon等人，Biotechniques，第6卷，pgs.768-775(1988)；Ohtsuka等人，Nucleic Acids Research，第10卷，pgs.6553-6570(1982)；Eckstein編，Oligonucleotides.and Analogues：A Practical Approach(IRL Press,Oxford,1991)；Greene及Wuts,「Protective Groups in Organic Synthesis」，第三版，Wiley,New York 1999；Narang編，Synthesis and Applications of DNA and RNA(Academic Press,New York,1987)；Beaucage及Iyer,Tetrahedron 48：2223-2311(1992)；及其類似參考文獻。
在一些情況下，在偶合之後，載體結合之生長聚核苷酸鏈中未反應之3'-胺基可視情況以適宜之封端劑進行封端，隨後進行下一脫保護步驟(例如，脫三苯甲基步驟)以致使其對後續偶合步驟呈惰性。此封端步驟可改良製劑之HPLC輪廓以使純化更容易進行，且亦可改良產物之總體產率。適用於標的方法之封端試劑包括親電子試劑，諸如乙酸酐及異丁酸酐；醯氯，諸如金剛烷基羰基氯、新戊醯氯及其類似物；異硫氰酸酯、氯甲酸酯等等。亦適用者為亞磷醯胺連同活化劑及隨後氧化，及H-膦酸鹽，諸如連同諸如新戊醯氯或金剛烷基羰基氯之醯氯一起使用的異丙基-H-膦酸三乙基銨。
在一些實施例中，該方法包括使核苷間N3'→P5'亞磷醯胺鍵聯氧化。如本文中所使用，術語「氧化」及其類似術語在提及含磷核苷間鍵聯時意謂用於將該鍵聯之磷原子自磷(III)形式轉化至磷(V)形式的過程或處理。可在使用任何適宜方法之合成中在任何適宜之點進行核苷酸間鍵聯之氧化。在一些實施例中，以逐步方式，例如在每個偶合循環期間進行氧化。在其他實施例中，在合成結束時進行多個核苷酸間鍵聯之氧化。在一些情況下，使N3'→P5'亞磷醯胺鍵聯氧化(例如，使用基於碘/水之氧 化劑)產生側氧基磷醯胺酯鍵聯。在其他情況下，使N3'→P5'亞磷醯胺鍵聯氧化包括硫化以產生N3'→P5'硫代磷醯胺酯鍵聯。硫化可使用任何適宜之方法來進行。感興趣之硫化方法包括Gryazonov等人於WO2001018015及US6,114,519中所描述之彼等方法。感興趣之硫化劑包括但不限於元素硫、甲硫碳醯胺二硫化物(諸如四乙基甲硫碳醯胺二硫化物)、醯基二硫化物(諸如苯乙醯基二硫化物、苯基乙醯基二硫化物)、硫膦基二硫化物(諸如S-TetraTM)及1,1-二側氧基-3H-1,2-苯并二硫醇-3-酮。在一些實施例中，硫化可使用含苯基乙醯基二硫化物之2,6-二甲基吡啶來進行。在某些實施例中，硫化可使用Beaucage試劑，使用Iyer等人，J.Organic Chemistry 55：4693-4699,1990所描述之方法來進行。
聚核苷酸自固相合成載體裂解可使用任何適宜之方法及試劑來達成，該等方法及試劑可視多種因素加以選擇，諸如載體之性質、連接子化學性質及合成期間所利用之保護基策略。在目標聚核苷酸之合成及裂解中所作出之選擇可決定第一聚核苷酸組合物中所存在之非目標合成產物及試劑的可鑑別性。
在一些實施例中，在裂解之前，移除聚核苷酸之含磷保護基以避免經裂解之保護基(例如β-氰基乙基保護基)與聚核苷酸之形成任何可能不合需要之加合物。可經改適以用於對聚核苷酸進行脫保護及裂解之感興趣之方法包括US7,199,236中所描述者。在一些實施例中，使用 氨溶液使聚核苷酸自載體裂解以移除任何鹼保護基(例如環外胺基保護基)及任何其餘含磷保護基。任何適宜之條件均可用於聚核苷酸裂解反應中。在一些情況下，在40℃至60℃範圍內之溫度下進行裂解。在一些情況下，在較長時間段內進行裂解，諸如12至24小時範圍內之時間。聚核苷酸裂解後，隨後可藉由過濾及沖洗來移除載體。所合併之濾液及沖洗液現含有粗合成聚核苷酸製劑，可用於標的製備方法中，隨後進入進一步純化步驟。在一些情況下，聚核苷酸溶液之純化包括製備型逆相高效液相層析(RP-HPLC)RP HPLC，例如在45℃至55℃下使用Kromasil C18。在一些情況下，標的方法之聚核苷酸組合物可進行任何數目之適宜脫鹽及濃縮步驟，例如，藉由使用配備有孔隙直徑截止尺寸為1,000Da之聚醚碸膜的切向流過濾(TFF)裝置。
聚核苷酸組合物
本發明之諸多態樣包括有包括多價陽離子相對離子之聚核苷酸鹽組合物。在一些實施例中，該組合物包括：包括至少一個多價陽離子相對離子之聚核苷酸鹽，其中該聚核苷酸具有7個以上核苷亞單元之序列且該等核苷亞單元中有至少兩個係由N3'→P5'硫代磷醯胺酯亞單元間鍵聯接合。在某些實施例中，該聚核苷酸具有7個以上與人類端粒酶之RNA組分互補的核苷亞單元的序列。
多價陽離子相對離子
任何適宜之多價陽離子均可用作標的聚核苷酸鹽中之相對離子。因而，多價陽離子可與標的聚核苷酸組合物中之聚核苷酸主鏈上的陰離子部位形成離子對。聚核苷酸可包括由含磷亞單元間鍵聯(例如P(V)鍵聯)，諸如磷醯胺酯、硫代磷醯胺酯、磷酸酯、磷酸二酯鍵聯及其類似物連接之核苷亞單元。應理解，聚核苷酸之亞單元間鍵聯可帶負電(例如在水溶液中)且與陽離子相對離子進行離子配對。此種亞單元間鍵聯可稱為聚核苷酸主鏈之陰離子團。
如本文中所使用，術語多價陽離子係指能夠形成多個離子對的陽離子，例如帶多電荷之陽離子，諸如帶雙電荷或帶三電荷之陽離子。任何適宜之多價陽離子均可用於標的聚核苷酸鹽組合物中。在一些實施例中，多價陽離子與聚核苷酸主鏈之兩個以上相鄰陰離子團進行離子配對。在一些實施例中，多價陽離子與聚核苷酸主鏈之一個陰離子團進行離子配對。在一些實施例中，多價陽離子相對離子為二價。感興趣之二價陽離子相對離子包括但不限於鎂、鋅及鈣。在一些實施例中，多價陽離子相對離子為三價。感興趣之三價陽離子相對離子包括但不限於鋁。在組合物之某些實施例中，該至少一個多價陽離子相對離子係選自由以下各項組成之群：鎂、鋅、鋁及鈣。在該組合物之某些實施例中，該至少一個多價陽離子相對離子為鎂。在該組合物之某些實施例中，該至少一個多價陽離子 相對離子為鋅。在該組合物之某些實施例中，該至少一個多價陽離子相對離子為鋁。在該組合物之某些實施例中，該至少一個多價陽離子相對離子為鈣。
應理解，聚核苷酸鹽中所存在之陽離子相對離子數目視多種因素而定，諸如聚陰離子主鏈之長度、該等鹽中之陽離子之原子價、溶液之pH值、組合物中之聚核苷酸之聚集等等。標的組合物可包括針對標的聚核苷酸組合物中之聚陰離子聚核苷酸主鏈的至少一個多價陽離子相對離子，諸如2個以上、3個以上、4個以上、5個以上、6個以上、7個以上、8個以上、9個以上、10個以上、15個以上、20個以上、30個以上、40個以上、50個以上、100個以上，或甚至更多個多價陽離子相對離子。在某些實施例中，具有n個核苷亞單元之聚核苷酸可包括介於1個與(n-1)/2個(若n為奇整數)之間的二價陽離子相對離子或介於1與(n-2)/2個(若n為偶整數)之間的二價陽離子相對離子。在一些情況下，包括至少一個多價陽離子之聚核苷酸鹽可進一步包括多種其他陽離子相對離子，該等陽離子相對離子可為單價、二價或三價。在某些情況下，n介於7至50之範圍內，諸如7至40、10至40、10至30、10至25、10至20，或介於12至15個核苷亞單元之範圍內。
在該組合物之一些實施例中，該聚核苷酸鹽可包括相對於該聚核苷酸之聚陰離子主鏈(亦即，相對於陽離子相對離子沿聚陰離子主鏈之理論最大包括量)佔3莫 耳%以上之多價陽離子相對離子，諸如相對於該聚核苷酸之聚陰離子主鏈佔4莫耳%以上、5莫耳%以上、6莫耳%以上、7莫耳%以上、8莫耳%以上、9莫耳%以上、10莫耳%以上、11莫耳%以上、12莫耳%以上、13莫耳%以上、14莫耳%以上、15莫耳%以上、16莫耳%以上、17莫耳%以上、18莫耳%以上、19莫耳%以上、20莫耳%以上、25莫耳%以上、30莫耳%以上、35莫耳%以上、40莫耳%以上、45莫耳%以上、50莫耳%以上、55莫耳%以上、60莫耳%以上，或甚至更多之多價陽離子相對離子。在標的組合物之一些實施例中，該聚核苷酸可包括相對於該聚核苷酸之聚陰離子主鏈佔10莫耳%以上之多價陽離子相對離子。舉例而言，包括具有10個核苷間亞單元鍵聯之聚陰離子主鏈且包括與該等鍵聯中之兩個進行離子配對之一個二價陽離子相對離子的聚核苷酸鹽描述為包括20莫耳%之二價陽離子相對離子。若一個二價陽離子相對離子僅與該等鍵聯之一而非其中兩者進行離子配對，則該聚核苷酸鹽描述為包括10莫耳%之二價陽離子相對離子。因而，莫耳%值係指由聚核苷酸鹽中所存在之多價陽離子相對離子佔據聚陰離子聚核苷酸主鏈之水準。舉例而言，一個Mg2+陽離子在具有12個核苷間亞單元鍵聯之13-聚體聚核苷酸鹽中佔據主鏈之16.7莫耳%。應理解，在一些實施例中，聚核苷酸鹽可在聚核苷酸末端(例如5'-硫代磷酸酯基)上包括額外離子配對位點，且若存在則此種位點應包括該莫耳%值之化合物。
在該組合物之一些實施例中，聚核苷酸鹽包括相對於該聚核苷酸之聚陰離子主鏈佔90莫耳%以下之多價陽離子相對離子，諸如70莫耳%以下、65莫耳%以下、60莫耳%以下、50莫耳%以下或甚至更少之多價陽離子相對離子。
在該組合物之某些實施例中，聚核苷酸鹽包括相對於該聚核苷酸之聚陰離子主鏈為3莫耳%至90莫耳%之多價陽離子相對離子，諸如相對於該聚核苷酸之聚陰離子主鏈為3莫耳%至65莫耳%(例如，6莫耳%至50莫耳%、10莫耳%至50莫耳%或10莫耳%至40莫耳%)、3莫耳%至50莫耳%、3莫耳%至40莫耳%、3莫耳%至30莫耳%、3莫耳%至20莫耳%或3莫耳%至15莫耳%之多價陽離子相對離子。
在該組合物之某些情況下，聚核苷酸鹽包括相對於該聚核苷酸之聚陰離子主鏈為3莫耳%至60莫耳%之二價陽離子相對離子，諸如3莫耳%至50莫耳%(例如，5莫耳%至50莫耳%)、3莫耳%至40莫耳%、3莫耳%至30莫耳%、3莫耳%至20莫耳%、3莫耳%至15莫耳%，諸如3莫耳%至12莫耳%之二價陽離子相對離子。
在該組合物之某些情況下，聚核苷酸鹽包括相對於該聚核苷酸之聚陰離子主鏈為3莫耳%至60莫耳%之鎂陽離子相對離子，諸如鎂、5莫耳%至50莫耳%、5莫耳%至40莫耳%、10莫耳%至40莫耳%或20莫耳%至40莫耳%之鎂陽離子相對離子。
在該組合物之某些情況下，聚核苷酸鹽包括相對於該聚核苷酸之聚陰離子主鏈為10莫耳%至70莫耳%之三價陽離子相對離子，諸如10莫耳%至60莫耳%、20莫耳%至60莫耳%、20莫耳%至50莫耳%或30莫耳%至50莫耳%之三價陽離子相對離子。在該組合物之一些實施例中，聚核苷酸鹽包括以重量計佔0.5%以上之多價陽離子相對離子(例如鎂)，諸如以重量計佔0.6%以上、0.7%以上、0.8%以上、0.9%以上、1.1%以上、1.2%以上、1.3%以上、1.4%以上、1.5%以上、1.6%以上、1.7%以上、1.8%以上、1.9%以上、2.0%以上、2.1%以上、2.2%以上、2.3%以上、2.4%以上、2.5%以上、2.6%以上、2.7%以上、2.8%以上、2.9%以上、3.0%以上之多價陽離子相對離子。
聚核苷酸鹽為包括多價及單價陽離子相對離子之混合物的混合鹽。在該組合物之某些實施例中，聚核苷酸鹽包括以莫耳濃度計為至少0.05以上之多價陽離子相對離子：單價陽離子相對離子比，諸如以莫耳濃度計0.10以上、0.15以上、0.20以上、0.25以上、0.30以上、0.35以上、0.40以上、0.45以上、0.50以上、0.55以上、0.60以上、0.65以上、0.70以上、或甚至更大之多價陽離子相對離子：單價陽離子相對離子。
在一些情況下，聚核苷酸鹽包括以莫耳濃度計為1：12之多價：單價陽離子相對離子比。在一些情況下，聚核苷酸鹽包括以莫耳濃度計為1：11之多價：單價陽離子 相對離子比。在一些情況下，聚核苷酸鹽包括以莫耳濃度計為1：10之多價：單價陽離子相對離子比。在一些情況下，聚核苷酸鹽包括以莫耳濃度計為1：9之多價：單價陽離子相對離子比。在一些情況下，聚核苷酸鹽包括以莫耳濃度計為1：8之多價：單價陽離子相對離子比。在一些情況下，聚核苷酸鹽包括以莫耳濃度計為1：7之多價：單價陽離子相對離子比。在一些情況下，聚核苷酸鹽包括以莫耳濃度計為1：6之多價：單價陽離子相對離子比。在一些情況下，聚核苷酸鹽包括以莫耳濃度計為1：5之多價：單價陽離子相對離子比。在一些情況下，聚核苷酸鹽包括以莫耳濃度計為1：4之多價：單價陽離子相對離子比。在一些情況下，聚核苷酸鹽包括以莫耳濃度計為2：9之多價：單價陽離子相對離子比。在一些情況下，聚核苷酸鹽包括以莫耳濃度計為3：7之多價：單價陽離子相對離子比。在一些情況下，聚核苷酸鹽包括以莫耳濃度計為4：5之多價：單價陽離子相對離子比。在一些情況下，聚核苷酸鹽包括以莫耳濃度計為5：3之多價：單價陽離子相對離子比。
在混合聚核苷酸鹽之某些情況下，多價陽離子相對離子為鎂且單價陽離子相對離子為鈉。在混合聚核苷酸鹽之某些情況下，多價陽離子相對離子為鎂且單價陽離子相對離子為銨。在混合聚核苷酸鹽之某些情況下，多價陽離子相對離子為鎂且單價陽離子相對離子為三乙基銨。在混合聚核苷酸鹽之某些情況下，多價陽離子相對離子為鋁。在混合聚核苷酸鹽之某些情況下，多價陽離子相對離 子為鋅。在混合聚核苷酸鹽之某些情況下，多價陽離子相對離子為鈣。在混合聚核苷酸鹽之某些情況下，單價陽離子相對離子為鈉。在混合聚核苷酸鹽之某些情況下，單價陽離子相對離子為銨。在混合聚核苷酸鹽之某些情況下，單價陽離子相對離子為三乙基銨。在某些實施例中，聚核苷酸鹽包括一個多價陽離子相對離子。在某些實施例中，聚核苷酸鹽包括2個多價陽離子相對離子。在某些實施例中，聚核苷酸鹽包括3個多價陽離子相對離子。在某些實施例中，聚核苷酸鹽包括4個多價陽離子相對離子。在某些實施例中，聚核苷酸鹽包括5個多價陽離子相對離子。在某些實施例中，聚核苷酸鹽包括6個多價陽離子相對離子。在某些實施例中，聚核苷酸鹽包括7個多價陽離子相對離子。在某些實施例中，聚核苷酸鹽包括8個多價陽離子相對離子。在某些實施例中，聚核苷酸鹽包括9個多價陽離子相對離子。在某些實施例中，聚核苷酸鹽包括10個多價陽離子相對離子。
除目標聚核苷酸以外，在聚核苷酸合成期間可產生多種非目標聚核苷酸合成產物。聚核苷酸製劑中可能存在之微量產物包括但不限於缺失產物(例如，缺乏一或多個核苷殘基之產物)、包括一或多個保護基之產物、封端產物(例如，包括封端聚核苷酸鏈之產物)、缺乏一或多個核鹼基之產物、包括部分氧化之亞磷醯胺鍵聯的產物及包括部分硫化之鍵聯的產物。
標的方法提供包括組合物中之目標聚核苷酸純 度有所改良之組合物。在一些實施例中，該組合物包括以重量計佔20%以上之目標聚核苷酸，諸如以重量計佔25%以上、30%以上、35%以上、40%以上、45%以上、50%以上、60%以上、70%以上、80%以上、90%以上、或甚至95%以上之目標聚核苷酸。在某些實施例中，該組合物包括以重量計佔50%以上之目標聚核苷酸。在某些實施例中，該組合物包括以重量計佔55%以上之目標聚核苷酸。在某些實施例中，該組合物包括以重量計佔60%以上之目標聚核苷酸。在某些實施例中，該組合物包括以重量計佔65%以上之目標聚核苷酸。在某些實施例中，該組合物包括以重量計佔70%以上之目標聚核苷酸。在某些實施例中，該組合物包括以重量計佔75%以上之目標聚核苷酸。在某些實施例中，該組合物包括以重量計佔80%以上之目標聚核苷酸。在某些實施例中，該組合物包括以重量計佔85%以上之目標聚核苷酸。在某些實施例中，該組合物包括以重量計佔90%以上之目標聚核苷酸。在某些實施例中，該組合物包括以重量計佔95%以上之目標聚核苷酸。
標題方法提供包括減少量之非目標合成產物及試劑的組合物。減少量意謂該組合物中非目標合成產物及試劑以重量計之量相對於對照方法有所減少。在一些實施例中，標的組合物以佔該組合物中之總非目標聚核苷酸50%以下的量包括非目標合成產物及試劑，諸如40%以下、30%以下、25%以下、20%以下、15%以下、10%以下或甚至5%以下之非目標合成產物及試劑。
可使用本文中所描述之方法來製備多種聚核苷酸組合物中之任一種。對使用標的方法(例如，如本文中所描述)製備多種類別及類型之聚核苷酸感興趣。適合於根據標的方法進行製備之聚核苷酸包括但不限於反義聚核苷酸、RNA聚核苷酸、siRNA聚核苷酸、RNAi聚核苷酸、DNA適體、迷你RNA及其類似物。
在一些實施例中，該聚核苷酸由式(I)描述：
Figure 105112455-A0202-12-0052-3
其中：各B獨立地為嘌呤、經保護之嘌呤、嘧啶或經保護之嘧啶或其類似物；各X獨立地為氧或硫；各R3獨立地為氫、氟、羥基、烷氧基、經取代之烷氧基或經保護之羥基；R6為胺基、羥基、經保護之胺基、經保護之羥基、-O-T-Z或-NH-T-Z；各T獨立地為視情況存在之連接子；各Z獨立地為H、脂質、載體、寡核苷酸、聚合物、 多肽、可偵測標記或標簽；且n為1至1000之整數。應理解，式(I)之寡核苷酸可以鹽形式存在。因而，式(I)之核苷間鍵聯可呈包括任何適宜相對離子之鹽形式。此種形式意欲包括在本發明之範疇內。應理解，式(I)中所描述之聚核苷酸的核苷間鍵聯之其他互變異構排列為可能的。此種形式意欲包括在本發明之範疇內。
在式(I)之一些實施例中，各R3為氫。在式(I)之一些實施例中，各R3為氟。在式(I)之一些實施例中，各R3為羥基。在式(I)之一些實施例中，R6為胺基。在式(I)之某些實施例中，R6為羥基。在式(I)之一些實施例中，Z為H。在式(I)之一些實施例中，Z為脂質(例如，如本文中所描述)。在某些情況下，該脂質為脂肪酸(例如，如本文中所描述)。在式(I)之一些實施例中，Z為載體。在式(I)之一些實施例中，Z為寡核苷酸。在式(I)之一些實施例中，Z為聚合物。在某些情況下，該聚合物為PEG。在式(I)之一些實施例中，Z為多肽。在式(I)之一些實施例中，Z為可偵測之標記。在式(I)之一些實施例中，Z為標籤。在式(I)之一些實施例中，T不存在。在一些實施例中，各B獨立地選自A、C、G、T及U。
在式(I)之某些實施例中，n為介於7與500之間，諸如介於7與100之間、介於7與75之間、介於7與50之間、介於7與40之間、介於7與30之間、介於7與20之間、介於7與15之間、介於10與15之間或介 於13與15之間的整數。在某些實施例中，n為介於7與100之間，諸如介於7與50之間、介於10與50之間、介於10與40之間、介於10與30之間、介於10與25之間、介於10與20之間、介於12與18之間或介於12與16之間的整數。在某些實施例中，n為7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25。
與端粒酶之RNA組分互補的聚核苷酸
本發明之諸多態樣包括有包括與人類端粒酶之RNA組分互補的聚核苷酸的化合物及組合物以及用於製備其之方法。該等化合物可在細胞中以高效力抑制端粒酶活性且具有細胞吸收特徵。
在某些情況下，該聚核苷酸包括具有7個以上與人類端粒酶之RNA組分互補的核苷亞單元，諸如具有8個以上、9個以上、10個以上、11個以上、12個以上、13個以上、14個以上、15個以上、20個以上、30個以上、50個以上與人類端粒酶之RNA組分互補的核苷亞單元的序列。
在一些實施例中，聚核苷酸包括介於3個與50個之間的與人類端粒酶之RNA組分互補的連續核苷亞單元，諸如介於5個與40個之間、介於7個與40個之間、介於10個與40個之間、介於10個與30個之間、介於10個與25個之間、介於10個與20個之間或介於12個 與15個之間的核苷亞單元。在某些實施例中，該聚核苷酸包括具有7個以上與人類端粒酶之RNA組分互補的連續核苷亞單元，諸如10個以上、11個以上、12個以上、13個以上、14個以上、15個以上、20個以上、30個以上、50個以上與人類端粒酶之RNA組分互補的連續核苷亞單元的序列。
在一些實施例中，該聚核苷酸為由下式描述之化合物：O-(x-L)n
其中O表示包括具有與人類端粒酶之RNA組分互補的核苷亞單元的序列的聚核苷酸，x為視情況存在之連接子基團，L表示脂質部分且n為1至5之整數。在一些情況下，n為5。在一些情況下，n為4。在一些情況下，n為3。在一些情況下，n為2。在一些情況下，n為1。因此，該等化合物之設計需要選擇兩個實體，即O及L，且確定介於此等實體之間的結構鍵聯，其可包括視情況存在之連接子基團x。
在一些實施例中，該聚核苷酸化合物可由下式來描述：O-(x-L)n
其中O表示包括具有與人類端粒酶之RNA組分互補的核苷亞單元的序列的聚核苷酸，x為視情況存在之連接子基團，L表示脂質部分且n為1，諸如式(I)之聚核苷酸 或其鹽，其中在式(I)中，Z為脂質部分，T為視情況存在之連接子(例如，如本文中所描述)且B基團對應於具有與人類端粒酶之RNA組分互補的核苷亞單元的序列。
聚核苷酸組分O可被視為該化合物之「效應子」組分，因為此組分藉由結合端粒酶之RNA組分來實現對端粒酶之抑制。因而，選擇O之序列，使得其包括與端粒酶RNA之序列互補的區域，其示於SEQ ID NO：1中。與端粒酶RNA組分互補之區域理論上可靶向端粒酶RNA之任何部分，但端粒酶RNA之特定區域為抑制性聚核苷酸之較佳標靶。一個較佳標靶區為跨越SEQ ID NO：1之核苷酸30至67的區域，其包括「範本區」，即跨越SEQ ID NO：1之核苷酸46至56的序列5'-CUAACCCUAAC-3'(SEQ ID NO：21)的11個核苷酸區域。範本區之功能在於指定端粒酶添加至染色體末端之調聚重複單元之序列，且對端粒酶之活性為必需的(參見Chen等人，Cell 100：503-514,2000；Kim等人，Proc.Natl.Acad.Sci.,USA 98(14)：7982-7987,2001)。因而對含有包括與範本區之整體或一部分互補之序列的聚核苷酸部分的感興趣之化合物感興趣。感興趣之另一標靶區為跨越hTR之核苷酸137至179的區域(參見Pruzan等人，Nucl.Acids Research,30：559-588,2002)。在此區域內，跨越141至153之序列為較佳標靶。PCT公開案WO 98/28442描述至少7個核苷酸長之聚核苷酸用於抑制端粒酶之用途，其中該等聚核苷酸經設計以便與範本區外之hTR序列之可及 部分(包括hTR之核苷酸137-196、290-319及350-380)互補。
O中靶向hTR序列之區域在一些情況下與相應hTR序列精確互補。儘管在某些情況下可容忍錯配，但預計其會降低所得聚核苷酸結合物之特異性及活性。在一些實施例中，聚核苷酸O之鹼基序列因而經選擇以包括具有至少5個與端粒酶RNA精確互補之核苷酸的序列，且若採用增加互補序列之長度，諸如至少6個、至少7個、至少8個、至少10個、至少12個、至少13個或至少15個與端粒酶RNA精確互補之核苷酸，則可獲得增強之端粒酶抑制。在其他實施例中，該聚核苷酸之序列包括具有至少7至20個、至少8至20個、至少10至20個或至少10至15個與端粒酶RNA序列精確互補之核苷酸的序列。當選擇聚核苷酸O之全長與端粒酶RNA互補時可獲得最佳端粒酶抑制活性。然而，聚核苷酸組分之全長未必與標靶序列精確互補，且聚核苷酸序列可能包括不與該標靶序列互補之區域。可添加此種區域，例如，以賦予化合物其他性質，諸如有助於純化之序列。若聚核苷酸組分O將包括不與標靶序列互補之區域，則此種區域可位於5'或3'末端之一或兩者上。在精確互補性區域靶向範本區之情況下，可用在5'端上與端粒酶樣(富含G)序列接合之短(5至8個核苷酸)精確互補性區域來達成有效端粒酶抑制。
與人類端粒酶RNA互補且可作為聚核苷酸組分O之一部分而得以包括在內或可用作整個聚核苷酸組分 O之例示性序列包括以下：hTR互補序列(美國公開案2012329858之聚核苷酸序列SEQ ID NO：1之區域)；
Figure 105112455-A0202-12-0058-5
Figure 105112455-A0202-12-0058-6
(SEQ ID NO：1)
GCTCTAGAATGAACGGTGGAAGGCGGCAGG 137-166(SEQ ID NO：2)
GTGGAAGGCGGCAGG 137-151(SEQ ID NO：6)
GGAAGGCGGCAGG 137-149(SEQ ID NO：7)
GTGGAAGGCGGCA 139-151(SEQ ID NO：8)
GTGGAAGGCGG 141-151(SEQ ID NO：9)
CGGTGGAAGGCGG 141-153(SEQ ID NO：10)
ACGGTGGAAGGCG 142-154(SEQ ID NO：11)
AACGGTGGAAGGCGGC 143-155(SEQ ID NO：12)
ATGAACGGTGGAAGGCGG 144-158(SEQ ID NO：13)
ACATTTTTTGTTTGCTCTAG 160-179(SEQ ID NO：14)
TAGGGTTAGACAA 42-54(SEQ ID NO：3)
GTTAGGGTTAG 46-56(SEQ ID NO：4)
GTTAGGGTTAGAC 44-56(SEQ ID NO：15)
GTTAGGGTTAGACAA 42-56(SEQ ID NO：16)
GGGTTAGAC 44-52(SEQ ID NO：19)
CAGTTAGGG 50-58(SEQ ID NO：20)
CCCTTCTCAGTT 54-65(SEQ ID NO：17)
CGCCCTTCTCAG 56-67(SEQ ID NO：18)
在一些實施例中，該聚核苷酸包括選自由以下各項組成之群的序列：GTTAGGGTTAG(SEQ ID NO：4)；TAGGGTTAGACAA(SEQ ID NO：3)；及CAGTTAGGGTTAG(SEQ ID NO：5)。
合成O組分時所使用之核苷間鍵聯之類型的選擇可由任何可利用之聚核苷酸化學物質組成，包括但不限於磷酸二酯、磷酸三酯、甲基膦酸酯、P3'→N5'磷醯胺酯、N3'→P5'磷醯胺酯、N3'→P5'硫代磷醯胺酯及硫代磷酸酯鍵聯。在一些實施例中，聚核苷酸組分O具有至少一個N3'→P5'硫代磷醯胺酯鍵聯。在某些實施例中，與人類端粒酶之RNA組分互補的核苷亞單元均由N3'→P5'硫代磷醯胺酯亞單元間鍵聯接合。在某些情況下，N3'→P5'硫代磷醯胺酯亞單元間鍵聯具有以下結構：3'-NH-P(S)(OR)-O-5'
其中R為氫，或其鹽。應理解，對於本文中所描述之包括此種亞單元間鍵聯之任何聚核苷酸組分O，此種聚核苷酸組分O亦可包括該鍵聯之任何適宜鹽形式。因而，亞單元間鍵聯可呈包括任何適宜相對離子之鹽形式。
在一些實施例中，該等核苷亞單元中有至少兩個係由N3'→P5'硫代磷醯胺酯亞單元間鍵聯接合，且其他亞單元間鍵聯各自獨立地選自N3'→P5'側氧基磷醯胺酯及N3'→P5'硫代磷醯胺酯亞單元間鍵聯。在一些實施例中，該等核苷亞單元係由各自獨立地選自N3'→P5'側氧基磷醯 胺酯及N3'→P5'硫代磷醯胺酯亞單元間鍵聯之亞單元間鍵聯接合。在一些實施例中，該等核苷亞單元係由各自獨立地選自N3'→P5'側氧基磷醯胺酯及N3'→P5'硫代磷醯胺酯亞單元間鍵聯之亞單元間鍵聯接合，其限制條件為該等核苷亞單元中有至少兩個係由N3'→P5'硫代磷醯胺酯亞單元間鍵聯接合。在一些實施例中，該等核苷亞單元均由N3'→P5'硫代磷醯胺酯亞單元間鍵聯接合。
在一些實施例中，聚核苷酸組分O具有序列TAGGGTTAGACAA(SEQ ID NO：3)，且核苷亞單元係由包含至少一個N3'→P5'硫代磷醯胺酯鍵聯之亞單元間鍵聯接合。在一些實施例中，聚核苷酸組分O具有序列TAGGGTTAGACAA(SEQ ID NO：3)，且核苷亞單元係由包含至少兩個N3'→P5'硫代磷醯胺酯鍵聯之亞單元間鍵聯接合。在一些實施例中，聚核苷酸組分O具有序列TAGGGTTAGACAA(SEQ ID NO：3)，且核苷亞單元係由包含至少三個N3'→P5'硫代磷醯胺酯鍵聯之亞單元間鍵聯接合。在一些實施例中，聚核苷酸組分O具有序列TAGGGTTAGACAA(SEQ ID NO：3)，且核苷亞單元係由包含至少四個N3'→P5'硫代磷醯胺酯鍵聯之亞單元間鍵聯接合。在一些實施例中，聚核苷酸組分O具有序列TAGGGTTAGACAA(SEQ ID NO：3)，且核苷亞單元係由包含至少五個N3'→P5'硫代磷醯胺酯鍵聯之亞單元間鍵聯接合。在一些實施例中，聚核苷酸組分O具有序列TAGGGTTAGACAA(SEQ ID NO：3)，且核苷亞單元係由包 含至少六個N3'→P5'硫代磷醯胺酯鍵聯之亞單元間鍵聯接合。在一些實施例中，聚核苷酸組分O具有序列TAGGGTTAGACAA(SEQ ID NO：3)，且核苷亞單元係由包含至少七個N3'→P5'硫代磷醯胺酯鍵聯之亞單元間鍵聯接合。在一些實施例中，聚核苷酸組分O具有序列TAGGGTTAGACAA(SEQ ID NO：3)，且核苷亞單元係由包含至少八個N3'→P5'硫代磷醯胺酯鍵聯之亞單元間鍵聯接合。在一些實施例中，聚核苷酸組分O具有序列TAGGGTTAGACAA(SEQ ID NO：3)，且核苷亞單元係由包含至少九個N3'→P5'硫代磷醯胺酯鍵聯之亞單元間鍵聯接合。在一些實施例中，聚核苷酸組分O具有序列TAGGGTTAGACAA(SEQ ID NO：3)，且核苷亞單元係由包含至少十個N3'→P5'硫代磷醯胺酯鍵聯之亞單元間鍵聯接合。在一些實施例中，聚核苷酸組分O具有序列TAGGGTTAGACAA(SEQ ID NO：3)，且核苷亞單元係由包含至少十一個N3'→P5'硫代磷醯胺酯鍵聯之亞單元間鍵聯接合。在一些實施例中，聚核苷酸組分O具有序列TAGGGTTAGACAA(SEQ ID NO：3)，且核苷亞單元係由各自獨立地選自N3'→P5'側氧基磷醯胺酯及N3'→P5'硫代磷醯胺酯亞單元間鍵聯之亞單元間鍵聯接合。在一些實施例中，聚核苷酸組分O具有序列TAGGGTTAGACAA(SEQ ID NO：3)，且核苷亞單元係由各自獨立地選自N3'→P5'側氧基磷醯胺酯及N3'→P5'硫代磷醯胺酯亞單元間鍵聯之亞單元間鍵聯接合；其限制條件為該等核苷亞單元中有至少 兩個係由N3'→P5'硫代磷醯胺酯亞單元間鍵聯接合。在一些實施例中，聚核苷酸組分O具有序列TAGGGTTAGACAA(SEQ ID NO：3)，且核苷亞單元均由N3'→P5'硫代磷醯胺酯亞單元間鍵聯接合。
在上文及下文之所有實施例中，N3'→P5'硫代磷醯胺酯亞單元間鍵聯特定言之為-NH-P(=O)(SH)-O-或其互變異構體或其鹽；且N3'→P5'側氧基磷醯胺酯亞單元間鍵聯特定言之為-NH-P(=O)(OH)-O-或其互變異構體或其鹽。更特定言之，在上文及下文之所有實施例中，N3'→P5'硫代磷醯胺酯亞單元間鍵聯特定言之為-NH-P(=O)(SH)-O-或其互變異構體或其鈉鹽；且N3'→P5'側氧基磷醯胺酯亞單元間鍵聯特定言之為-NH-P(=O)(OH)-O-或其互變異構體或其鈉鹽。
在一個實施例中，本發明係關於本文中所描述之特定結構中之任一種，其中一或多個，特定言之一個N3'→P5'硫代磷醯胺酯亞單元間鍵聯視情況由N3'→P5'側氧基磷醯胺酯亞單元間鍵聯置換。在一個實施例中，本發明係關於本文中所描述之特定結構中之任一種，其中一或多個，特定言之一個N3'→P5'硫代磷醯胺酯亞單元間鍵聯由N3'→P5'側氧基磷醯胺酯亞單元間鍵聯置換。
在一些情況下，標的化合物在於細胞中產生端粒酶抑制方面比未與脂質組分結合之相應聚核苷酸更有效。據信脂質組分L之功能在於增強化合物之細胞吸收，特定言之有助於通過細胞膜。儘管尚未充分闡明發生此現 象之機制，但一種可能性為脂質組分可促進該化合物作為單一分子或聚集物(膠束)形式與細胞膜結合，隨後內在化。然而，利用標的化合物不需要理解確切機制。
脂質組分可為與未經修飾之聚核苷酸相比提供增強之細胞吸收的任何脂質或脂質衍生物。感興趣之脂質包括但不限於烴、脂肪(例如甘油酯、脂肪酸及脂肪酸衍生物，諸如脂肪醯胺)及固醇。在脂質組分為烴之情況下，L組分可為經取代或未經取代之環狀烴或者脂族直鏈或分支鏈烴，其可為飽和或不飽和的。實例包括完全飽和或多不飽和之直鏈無分支鏈烴。烴鏈之長度可自C2-C30變化，但在C8-C22碳鏈之情況下可獲得最佳端粒酶抑制。以下列出感興趣之飽和烴(烷烴)的實例：系統名/碳鏈
十四烷/C14H30
十五烷/C15H32
十六烷/C16H34
十七烷/C17H36
十八烷/C18H38
十九烷/C19H40
二十烷/C20H42。
亦可選擇烴之單不飽和及多不飽和形式(烯烴及多烯，諸如二烯烴及三烯烴)，其中對具有一至三個雙鍵之化合物感興趣，但可採用具有更多個雙鍵之化合物。亦可利用炔烴(含有一或多個三鍵)及烯炔(三鍵及雙鍵)。
烴之經取代形式可用於標的化合物中，其中對在活體內及活體外呈惰性之取代基感興趣。在一些情況下，取代基為氟。多氟化烴之例示性通用結構包括：CF3(CF2)n-(CH2)m-，其中m為至少1、在一些情況下至少2，且n為1至30，諸如氟十三烷：CF3(CF2)9(CH2)3；及CH3(CH2)a(CF2)b(CH2)c-，其中a、b及c獨立地為1至30。
感興趣之其他適合脂質組分包括但不限於簡單脂肪酸及脂肪酸衍生物、甘油酯及較複雜脂質，諸如固醇，例如膽固醇。感興趣之脂肪酸及其衍生物可為完全飽和或者單不飽和或多不飽和的。碳鏈之長度可自C2-C30變化，但在C8-C22碳鏈之情況下可獲得最佳端粒酶抑制。以下列出感興趣之飽和脂肪酸的實例：系統名/慣用名/碳鏈
十四酸/肉豆蔻酸/14：0
十六酸/棕櫚酸/16：0
十八酸/硬脂酸/18：0
二十酸/花生酸/20：0
亦可採用脂肪酸之單不飽和及多不飽和形式，其中對具有一至三個雙鍵之化合物感興趣，但亦可採用具有更多個雙鍵之化合物。可採用之感興趣之常見單不飽和及多不飽和脂肪酸之實例包括：系統名/慣用名/碳鏈
順-9-十六酸/棕櫚油酸16：1(n-7)
順-6-十八酸/岩芹酸/18：1(n-12)
順-9-十八酸/油酸/18：1(n-9)
9,12-十八碳二烯酸/亞麻油酸/18：2(n-6)
6,9,12-十八碳三烯酸/γ-亞麻油酸/18：3(n-6)
9,12,15-十八碳三烯酸/α-亞麻油酸/18：3(n-3)
5,8,11,14-二十碳四烯酸/花生四烯酸/20：4(n-6)
碳鏈中具有一或多個三鍵之脂肪酸以及分支鏈脂肪酸亦可用於標的化合物中。脂肪酸之經取代形式可用於標的化合物中。如同烴基，對在活體內及活體外呈惰性之取代基感興趣，諸如氟。適用於本發明之脂肪酸多氟化衍生物之例示性通用結構為：CF3(CF2)n-(CH2)mCO-，其中m為至少1，較佳至少2，且n為1至30；及CH3(CH2)a(CF2)b(CH2)cCO-，其中a、b及c獨立地為1至30。
在一些情況下，介於一個與五個之間的L組分(n為1、2、3、4或5)經由視情況存在之連接子與O組分共價連接。在一些情況下，利用一個或兩個L組分(n=1或2)。在多於一個L組分與O組分連接時，獨立地選擇各L組分。
應瞭解，描述為具有指定烴作為L部分之本發明化合物及描述為具有指定脂肪酸之化合物(與指定烴具有相同數目之碳原子)密切相關且在結構上僅在接合L部分與聚核苷酸之鍵的性質上不同，此又為用於產生該化合物之合成程式之結果。舉例而言且如以下更詳細描述，當 合成具有結合於聚核苷酸之3'-胺基末端之L部分(具有磷醯胺酯或硫代磷醯胺酯核苷間鍵聯)的化合物時，使用脂肪酸之醛形式(脂肪醛)作為起始物質導致在脂質鏈與聚核苷酸之間形成胺鍵聯，使得脂質基團表現為烴。相反，使用同一脂肪酸之羧酸、酸酐或醯氯形式導致形成醯胺鍵聯，使得脂質基團表現為脂肪酸衍生物，特定言之在此情況下為脂肪醯胺(如以上定義部分中所指出，為了簡單起見，術語「脂肪酸」當描述結合之L基團時在本文中以廣義使用以包括脂肪酸衍生物，包括脂肪醯胺)。此說明於以下示意圖中，該等示意圖描繪接合於C14脂質組分之磷醯胺酯聚核苷酸之3'-胺基末端。在示意圖A中，L為十四酸(肉豆蔻酸)，其中L與O基團之間的連接為醯胺。在示意圖B中，L為十四烷，且L與O基團之間的連接為胺。
Figure 105112455-A0202-12-0066-8
Figure 105112455-A0202-12-0066-9
O與L組分之間的鍵聯可為直接聯接，或可經由視情況存在之連接子部分，例如式(I)之x或視情況存在之連接子T。連接子基團可用於促進化合物之化學合成。 無論是否使用連接子基團來介導O與L組分之結合，聚核苷酸組分O上均存在L組分適宜與其結合之多個位點。適合之鍵聯點包括聚核苷酸之5'及3'末端、一或多個糖環、核苷間主鏈及核鹼基。在一些情況下，L部分連接於聚核苷酸之3'或5'末端。
若L組分將連接於3'末端，則可直接連接於3'取代基，該取代基在較佳磷醯胺酯及硫代磷醯胺酯聚核苷酸之情況下為3'-胺基且在諸如習知磷酸二酯聚核苷酸之其他情況下為3-羥基。或者，L部分可經由3'-連接之磷酸酯基連接，其中十六烷烴經由O-烷基連接子連接於硫代磷醯胺酯聚核苷酸之3'磷酸酯。若L部分將連接於5'末端，則可經由5'-連接之磷酸酯基連接。與O部分上之鹼基之連接可經由任何適合之原子，例如連接於鳥苷酸之N2胺基。在n>1使得複數個脂質部分將連接於O組分時，個別選擇之L組分可連接在任何適宜位點上。舉例而言，一個L基團可連接於各末端，不同的L基團可連接於鹼基，或兩個以上L基團可連接於一個末端。
視情況存在之連接子組分x可用於接合化合物之O及L組分。應理解，視情況存在之連接子(例如，式(I)之x或T)可經由末端磷酸酯基，例如3'-連接或5'-連接之磷酸酯基連接於聚核苷酸(例如O)。若將使用連接子，則如本文中所描述將其併入合成程式中。適合連接子基團之實例包括胺基甘油及O-烷基甘油型連接子，其分別可由以下通用結構來描繪：
Figure 105112455-A0202-12-0068-10
其中R'為H、OH、NH2或SH；Y為O、S或NR；R為H、烷基或經取代之烷基；且n及m各自獨立地為介於1至18之間的整數。
感興趣之適合連接子之實例為胺基甘油連接子，其中R'為OH，Y為O，且m及n各自為1：
Figure 105112455-A0202-12-0068-11
雙胺基甘油連接子，其中R'為OH，Y為NH，且m及n各自為1：
Figure 105112455-A0202-12-0068-12
及O-烷基甘油連接子，其中R為H：
Figure 105112455-A0202-12-0068-13
可根據標的方法製備之例示性脂質經修飾之聚核苷酸包括頒予Gryaznov等人之美國申請案US20120329858「Modified oligonucleotides for telomerase inhibition」之圖1(例如圖1A至1DD)中所描述的彼等化合物，該案之揭示內容係以全文引用之方式併入本文中。
在某些實施例中，該組合物包括由以下結構所描述之化合物：
Figure 105112455-A0202-12-0069-14
或其鹽，其中「nps」表示連接一個核苷之3'-碳與相鄰核苷之5'-碳的硫代磷醯胺酯鍵聯(例如，-NH-P(=O)(SH)-O-或其互變異構體或其鹽)。應理解，以上式中所描述之化合物可呈鹽形式存在。此種形式只要其可存在便意欲包括在本發明之範疇內。在某些實施例中，該組合物包括該化合物之醫藥學上可接受之鹽。在某些情況下，該組合物包括該化合物之鈉鹽。在某些實施例中，該組合物包括該化合物之二價陽離子鹽，諸如該化合物之鎂鹽。在某些實施例中，該組合物包括該化合物之三價陽離子鹽，諸如該化合物之鋁鹽。
在某些實施例中，該組合物包括由以下結構所描述之化合物：
Figure 105112455-A0202-12-0070-15
其中各Mx+獨立地為氫或鹽之任何適宜相對離子，各x獨立地為1、2或3，且n為5至13之整數。在一些情況下，n為5、6、7、8、9、10、11、12或13。在某些情況下，各x獨立地為1、2或3，且n為5至12之整數。在某些情況下，n為13。在某些情況下，各x為1。在某些情況下，各x獨立地為1或2。在某些情況下，各x獨立地為1或3。在某些情況下，各Mx+獨立地為陽離子相對離子。在某些情況下，各Mx+獨立地為陽離子相對離子， 各x獨立地為1、2或3，且n為5至12之整數。在某些情況下，各Mx+獨立地為氫或任何適宜陽離子相對離子，各x獨立地為1、2或3，且n為5至12之整數。在某些情況下，Mx+為氫。在一些實施例中，(Mx+)n為(Mg2+)(M+)11。在一些實施例中，(Mx+)n為(Mg2+)2(M+)9。在一些實施例中，(Mx+)n為(Mg2+)2(M+)9。在一些實施例中，(Mx+)3為(Mg2+)3(M+)7。在一些實施例中，(Mx+)n為(Mg2+)4(M+)5。在一些實施例中，(Mx+)n為(Mg2+)5(M+)3。在一些實施例中，(Mx+)n為(Mg2+)6(M+)。在一些實施例中，(Mx+)n為(Mg2+)(M+)12，其中Mg2+相對離子可與另一寡核苷酸之陰離子主鏈形成額外離子對。在一些實施例中，(Mx+)n為(Mg2+)2(M+)11，其中Mg2+相對離子可與一個或兩個其他寡核苷酸之陰離子主鏈形成兩個額外離子對。在某些情況下，混合鎂鹽之M+相對離子為鈉。在某些情況下，混合鎂鹽之M+相對離子為銨。在某些情況下，混合鎂鹽之M+相對離子為三乙基銨。
在某些實施例中，該組合物包括由以下結構描述之化合物且可包括鹽之任何適宜陽離子相對離子：
Figure 105112455-A0202-12-0072-16
在某些實施例中，該組合物包括由以下結構所描述之化合物：
Figure 105112455-A0202-12-0073-17
脂質經修飾之聚核苷酸
多種合成方法可用於使脂質部分L與聚核苷酸結合，視所選鍵聯之性質而定，包括以下文獻中所描述之方法：Mishra等人，(1995)Biochemica et Biophysica Acta,1264：229-237；Shea等人，(1990)Nucleic Acids Res.18：3777-3783；及Rump等人，(1998)Bioconj.Chem. 9：341-349。脂質部分結合於聚核苷酸之5'或3'末端的化合物之合成可藉由在適當末端上使用可與羧酸、醯氯、酸酐及活性酯反應之適合官能基(在一些情況下為胺基或羥基)來達成。硫醇基亦可用作官能基(參見Kupihar等人，(2001)Bioorganic and Medicinal Chemistry 9：1241-1247)。不同鏈長度之胺基及硫醇修飾因子係購自市面以用於聚核苷酸合成。具有N3'→P5'硫代磷醯胺酯鍵聯之聚核苷酸含有3'-胺基(而非大部分習知聚核苷酸化學物質中所發現之3'-羥基)，且因此，此等聚核苷酸提供使脂質基團與聚核苷酸之3'-端接合結合的唯一機會。
各種方法可用於將脂質基團連接於具有N3'→P5'硫代磷醯胺酯化學性質之聚核苷酸的末端(例如，棕櫚醯基醯胺基-1-O-(4,4'-二甲氧基三苯甲基)-2-O-琥珀醯基丙二醇連接子)。為了連接於3'末端，可藉由使完全經保護之固體載體結合之聚核苷酸的游離3'-胺基與相應酸酐反應，隨後用氨脫保護並純化來合成結合之化合物。或者，使用諸如碳化二亞胺、HBTU(六氟磷酸N,N,N',N'-四甲基-O-(1H-苯并三唑-1-基)脲鎓)或碘化2-氯-1-甲基吡啶鎓之偶合劑使脂質之羧酸與載體結合之聚核苷酸的游離3'-胺基偶合可用於結合脂質基團。此兩種方法在脂質與聚核苷酸之間形成醯胺鍵。亦可使用在鏈伸長期間與聚核苷酸偶合之脂質的亞磷醯胺衍生物將脂質連接於聚核苷酸鏈。此方法產生連接脂質及聚核苷酸之磷醯胺酯(例如硫代磷醯胺酯)鍵聯(例如丙基-棕櫚醯及2-羥基-丙基-棕櫚醯 化合物)。另一方法包括使完全經保護之載體結合之聚核苷酸的游離3'-胺基與適合之脂質醛反應，隨後用氰基硼氫化鈉還原，由此產生胺鍵聯。
關於與5'末端之連接，可使用經修飾之含脂質固體載體合成聚核苷酸，隨後如Pongracz & Gryaznov(1999)中所描述在5'至3'方向上合成聚核苷酸。以下提供經修飾載體之實例。在n=14之情況下，脂肪酸為棕櫚酸：使3-胺基-1,2-丙二醇與棕櫚醯氯反應，隨後進行二甲氧基三苯甲基化及琥珀醯基化，得到用於與固體載體偶合之中間物。在一些情況下，R可為長鏈烷基胺控制之孔隙玻璃。在某些情況下，R為聚合固體載體。
Figure 105112455-A0202-12-0075-18
效用
本發明之方法及組合物，例如，如以上所描述，得以用於多種應用。感興趣之應用包括但不限於：治療應用、診斷應用、研究應用及篩選應用，如以下更詳細綜述。
標的化合物得以用於多種治療應用。在一些實施例中，應用產生聚核苷酸之方法來製備提供治療效益之聚核苷酸。可使用本發明組合物治療之疾病類型為無限 的。舉例而言，該等組合物可用於治療多種遺傳性疾病。在一些實施例中，標的方法及組合物具有反義應用。在一些實施例中，標的方法及組合物具有反基因應用。在某些實施例中，標的方法及組合物具有端粒酶抑制應用，諸如美國專利6,835,826及美國公開案20120329858中所描述之彼等應用，各案之揭示內容係以全文引用之方式併入本文中。
本發明提供可特異性且有效地抑制端粒酶活性並且因此可用於抑制諸如腫瘤細胞之端粒酶陽性細胞之增殖的化合物。已證明多種癌細胞為端粒酶陽性，包括來自於皮膚癌、結締組織腫瘤、脂肪腫瘤、乳房腫瘤、肺腫瘤、胃腫瘤、胰臟腫瘤、卵巢腫瘤、子宮頸腫瘤、子宮腫瘤、腎臟腫瘤、膀胱腫瘤、結腸腫瘤、前列腺腫瘤、中樞神經系統(CNS)腫瘤、視網膜腫瘤及血液學腫瘤(諸如骨髓瘤、白血病及淋巴瘤)之細胞。感興趣之癌症包括但不限於骨髓纖維化、血小板增多症、骨髓發育不良症候群及粒細胞性白血病。
標的化合物可用於治療血液學惡性病及脊髓增生性病症，包括但不限於本態性血小板增多症(ET)、真性紅血球增多症(PV)、慢性骨髓性白血病(CML)、骨髓纖維化(MF)、慢性中性粒細胞性白血病、慢性嗜酸細胞性白血病及急性骨髓性白血病(AML)。標的化合物可用於治療脊髓發育不良症候群，其包括諸如難治性貧血、難治性貧血伴隨過多母細胞、難治性血細胞減少症伴隨多譜系發育不 良、難治性血細胞減少症伴隨單譜系發育不良及慢性單核細胞性白血病(CMML)之疾病。標的化合物可用於治療血液學疾病，諸如2013年11月15日申請之PCT專利申請案第PCT/US13/070437號中所描述者，該案之揭示內容係以全文引用之方式併入本文中。
因此，本文中所提供之化合物廣泛適用於治療多種惡性病。在一些情況下，標的化合物可有效提供能高度區分惡性與正常細胞，從而避免依賴於無差別殺死分裂細胞之藥劑的大部分當前化學治療方案的許多不利副作用的治療。此外，在一些情況下，標的脂質修飾化合物比等效未結合寡核苷酸更有效，此意謂其可以較低劑量投與，從而提高安全性且顯著降低治療成本。端粒酶抑制劑可連同其他癌症治療方法一起使用，包括手術移除原發性腫瘤、化學治療劑及輻射治療。因此，本發明係關於本文中所提供之化合物及組合物，其係用作藥物。本發明亦係關於本文中所提供之化合物及組合物，其係用於治療或預防上文所提及之惡性病中的任一種。
標的化合物及方法得以用於多種診斷應用，包括但不限於臨床診斷劑，例如活體外診斷劑或活體內腫瘤成像劑之開發。此種應用適用於疾病病狀或對其敏感性之診斷或證實診斷。該等方法亦適用於在先前已診斷患有該疾病之患者中監測疾病進展及/或對治療之反應。
實例
實例1：概述
此等實例描述用於由伊美司他之鈉鹽形式製備伊美司他之各種二價或三價形式，諸如Ca、Ba、Mg、Al、Fe、Cu及Zn的實驗。在此等實驗中，對使用包括形成及分離可結合伊美司他之一個、兩個或三個磷酸酯基的雙齒或三齒陽離子之鹽的製備方法對純度之改良進行評估。亦研究所產生之鹽形式的溶解度及滲透壓度。
使用CaCl2、MgCl2、BaCl2、CuCl2、ZnCl2、AlCl3、FeCl2及FeCl3來研究伊美司他鈣、伊美司他鋇、伊美司他鎂、伊美司他鋁、伊美司他Fe(II或III)及伊美司他銅鹽。
研究三種用於鹽交換之方法：使用強陽離子交換樹脂(FINEX MFG 210)、沈澱及簡單溶解。當伊美司他鈉溶液通過與CaCl2、BaCl2或MgCl2交換之樹脂時，溶離溶液含有精細粉末，表明成功地自伊美司他主鏈中交換出鈉相對離子且置換為鈣、鋇或鎂相對離子。對於用陽離子交換樹脂平衡之其他五種試劑(CuCl2、ZnCl2、AlCl3、FeCl2、FeCl3)，當伊美司他溶液通過時管柱中之樹脂的上部發生聚集，亦表明成功地自伊美司他主鏈中交換出鈉相對離子。
亦使用過量鹽試劑來測試沈澱及溶解法。當用伊美司他鈉處理大量過量之鹽試劑(例如900當量)時，形成沈澱物。藉由過濾來分離沈澱物。隨後之測試指示，七至五十當量無機鹽試劑對將所有伊美司他轉化至沈澱物為 必需的。
用伊美司他TEA(三乙基銨)鹽形式或伊美司他Na鹽形式各自處理五當量之三種無機鹽(Mg、Ba或Ca)。據證實不發生沈澱，且對溶液進行脫鹽並凍乾。藉由火焰AA(原子吸收)分析凍乾粉末顯示伊美司他之鈉相對離子中有一些被交換。
使用相對於伊美司他形式為一至九當量之鎂陽離子以MgCl2進行額外實驗。鈉相對離子部分交換成Mg相對離子，最高交換發生在九當量MgCl2下，所產生之組合物顯示1.2重量%之Na及1.1重量%之Mg。
實例2：材料及設備
研究所使用之無機試劑、有機溶劑及其他材料列於表1中。使用由Geron提供之批次號G163/L-G-13002之伊美司他鈉(CAS號1007380-31-5)進行研究。伊美司他銨為來源於使用氨及乙醇使伊美司他自固相合成載體裂解之粗組合物(例如，如Gryaznov等人於US 20120329858中所描述)且獲自製造商儲備。伊美司他TEA(三乙基銨形式)為來源於HPLC純化管柱溶離液之組合物，其中使用含有乙酸三乙基銨(TEAA)之流動相(例如，如Gryaznov等人於US 20120329858中所描述)且獲自由不同的製程開發研究獲得之製造商儲備。使用具有1KD PES膜之攪拌式超濾池(Amicon 8400，Millipore)進行超濾。使用Speed Vacuum Concentrator(ScanSpeed 40，LaboGene)進行凍乾。
實例3：程式
藉由離子交換樹脂管柱進行交換
製備具有200mL之管柱體積(4.6cm×12cm)的強陽離子交換樹脂管柱FINEX MFG 210，且用1M NaOH及水洗滌樹脂。隨後用感興趣之各鹽的1M溶液使管柱平衡。總體而言，此等實驗中製備並使用八種1M鹽溶液(CaCl2、MgCl2、BaCl2、CuCl2、ZnCl2、AlCl2、FeCl2及FeCl3)。向管柱添加50mL 100mg/mL伊美司他鈉溶液。
在經CuCl2、ZnCl2、AlCl2、FeCl2及FeCl3平衡之管柱的情況下，當伊美司他鈉負載至管柱上時，在管柱上部觀察到伊美司他聚集於樹脂上。
用CaCl2、MgCl2及BaCl2使三個管柱平衡，鹽溶液未在管柱上造成任何伊美司他聚集，且自管柱溶離液中回收伊美司他，該管柱溶離液據觀察為混濁溶液。藉由離心(4000rpm，20min)自此等溶離液中回收精細粉末。在離心之後，藉由HPLC分析證實上清液不含任何伊美司他。此指示成功地達成伊美司他之鈣、鎂及鋇鹽的沈澱及分離。
藉由沈澱
使用大量過量之感興趣之無機鹽(900當量，以 重量計)研究伊美司他之二價或三價形式的結晶或沈澱。製備CaCl2、MgCl2、BaCl2、CuCl2、ZnCl2、AlCl2、FeCl2及FeCl3之1M鹽溶液。將三種類型伊美司他溶液：粗伊美司他溶液(銨鹽)、經純化之伊美司他(三乙基銨(TEA)鹽形式)及伊美司他鈉(Na鹽形式)與各鹽溶液混合。
所有混合溶液均顯示伊美司他沈澱物，利用Advantec 2濾紙藉由過濾容易地進行分離。此結果指示成功地達成伊美司他之多價鹽的沈澱及分離。
使用以下溶劑初步研究在鹽試劑大量過量之條件下分離的沈澱物的溶解度：水、乙腈、MeOH、EtOH、IPA(異丙醇)、0.1M NaOH、0.1M HCl、1M NaCl及NMP。
對於在大量過量之鹽試劑中沈澱之鹽，伊美司他之鈣、鋇及鎂鹽可溶於0.1M NaOH及1M NaCl溶液中。(參見表2)。在1M NaCl溶液中在不同的濃度(2mg/mL至6mg/mL)下且在不同的pH值條件(pH 8、9、10、11、12)下進行對獲自大量過量鎂鹽試劑之伊美司他沈澱物的溶解度研究，且藉由HPLC加以分析(參見圖1之層析譜)。觀察到伊美司他沈澱物在6mg/mL及pH 11至pH 12下為可溶的。該化合物亦顯示穩定性直至pH 12而無任何沈澱物(圖1)。
藉由溶解
30至50當量鹽試劑
藉由逐步添加感興趣之鹽試劑來研究感興趣之鹽試劑可達成伊美司他完全沈澱之當量數。對於表3中所列出之八種鹽，在7至50當量之所添加之鹽試劑的範圍內觀察到完全形成沈澱物。在添加更多當量之鹽試劑時，對於所有鹽均觀察到傾向於發生凝膠形成伴隨沈澱。
使用三種類型伊美司他溶液：粗伊美司他銨(粗物質形式)、伊美司他三乙基銨(經純化之TEA鹽形式)及伊美司他鈉(Na鹽形式)，與各鹽溶液混合。伊美司他銨鹽作為NH4OH溶液或水溶液使用。伊美司他銨及伊美司他TEA溶液分別需要約50當量或30當量Mg鹽試劑來達成完全沈澱。
在pH 8至pH 12之各種pH值條件下研究由伊美司他TEA溶液及伊美司他銨溶液形成之沈澱物的溶解度。混合溶液處在室溫下6小時之後，藉由260nm下之UV吸收率分析伊美司他-Mg沈澱物之溶解度。獲自伊美司他銨及伊美司他TEA之沈澱物兩者顯示類似趨勢，因為在高pH值下更多伊美司他鹽溶解於1M NaCl溶液中(參見表3)。
此結果表明，當控制感興趣之鹽試劑相對於伊美司他之當量數時，可藉由任何適宜方法達成伊美司他鹽完全沈澱，以產生可成功地再溶解之沈澱物。
5當量鹽試劑
將伊美司他鈉溶液(100mg，於1mL水中)與5 當量之八種鹽試劑混合且使用攪拌式超濾池及1KD膜藉由超濾對各溶液進行脫鹽。隨後凍乾經超濾之溶液。藉由火焰AA(原子吸收光譜)分析所得粉末中Na及感興趣之各金屬相對離子的含量。如圖2及圖3中所示，對於Zn、Al及Mg，最高金屬相對離子含量為1.1重量%，其中Na含量分別為2.6%、1.7%及2.6%。
6至9當量鹽試劑
向伊美司他鈉溶液中添加6至9當量鎂鹽試劑，且後續超濾及凍乾提供完全可溶於水中之固體產物。對鈉及鎂含量進行分析(參見圖3中之結果)。向伊美司他鈉溶液中添加九當量MgCl2產生Na及Mg相對離子含量以重量計分別為1.1%及1.2%的組合物。
1至10當量鹽試劑
為了研究伊美司他TEA鹽中與伊美司他鈉鹽相比之Mg與TEA相對離子交換，設計並進行另一組實驗。將含一至十當量MgCl2之水溶液與伊美司他TEA鹽溶液(純度>90%，藉由HPLC)混合。在超濾及凍乾之後進行Mg相對離子含量之分析。結果示於圖4中。添加多達10當量MgCl2試劑產生具有1.6重量%Mg之組合物。
實例4：結論
達成伊美司他二價及三價鹽形式之製備，包括 鈣、鎂、鋅、鋁、鋇、鐵(II)、鐵(III)及銅鹽。當使用控制過量之所選無機鹽試劑(參見表2及表3)來使聚核苷酸沈澱時，形成沈澱物，隨後可再溶解，且相對於使用HPLC分析快即溶離雜質顯示經改良之純度。
使用鎂鹽試劑在交換步驟之後產生伊美司他之可溶性固體沈澱物。產生沈澱物，相對於1.1重量%鈉相對離子，其達成1.2重量%鎂相對離子。
使用二價或三價鹽使伊美司他沈澱可移除保留在溶液中之非目標合成產物及試劑。移除粗伊美司他溶液中所存在之此種雜質為伊美司他之後續層析純化步驟提供若干優勢，諸如減少管柱負載、改良解析、減少層析純化步驟數目及改良層析管柱之壽命、降低純化成本及更快純化。
Figure 105112455-A0202-12-0084-19
Figure 105112455-A0202-12-0085-20
Figure 105112455-A0202-12-0086-21
儘管有所附申請專利範圍，但本文中所闡述之揭示內容亦由以下條款定義：
1.一種製備聚核苷酸之方法，該方法包括：使包含以下各項之第一聚核苷酸組合物：聚核苷酸，其具有7個以上核苷亞單元之序列且該等核苷亞單元中有至少兩個係由N3'→P5'硫代磷醯胺酯亞單元間鍵聯接合；及非目標合成產物及試劑；與多價陽離子鹽接觸以使包含至少一個多價陽離子相對離子之第一聚核苷酸鹽沈澱；及分離該第一聚核苷酸鹽與該經接觸之第一聚核苷酸組合物，以產生包含該第一聚核苷酸鹽之第二聚核苷酸組合物。
2.如條款1之方法，其進一步包含：使該第一聚核苷酸鹽與逆相層析載體接觸；及自該層析載體溶離包含第二聚核苷酸鹽之第三聚核苷酸組合物。
3.如條款1至2中任一條之方法，其中該聚核苷酸包 含有包含13個以上與人類端粒酶之RNA組分互補的核苷亞單元的序列。
4.如條款1至3中任一條之方法，其中該聚核苷酸包含介於10個與50個之間的與人類端粒酶之RNA組分互補的連續核苷亞單元。
5.如條款3至4中任一條之方法，其中該等與人類端粒酶之RNA組分互補的核苷亞單元均由N3'→P5'硫代磷醯胺酯亞單元間鍵聯接合。
6.如條款1至5中任一條之方法，其中該聚核苷酸包含選自由以下各項組成之群的序列：GTTAGGGTTAG(SEQ ID NO：4)、TAGGGTTAGACAA(SEQ ID NO：3)及CAGTTAGGGTTAG(SEQ ID NO：5)。
7.如條款1至6中任一條之方法，其中該聚核苷酸係經由視情況存在之連接子與脂質部分結合。
8.如條款2至7中任一條之方法，其中該第二聚核苷酸鹽具有以下結構：
Figure 105112455-A0202-12-0088-22
其中各Mx+獨立地為氫或陽離子相對離子，各x獨立地為1、2或3，且n為5至13之整數。
9.如條款2至8中任一條之方法，其中該第二聚核苷酸鹽為該聚核苷酸之醫藥學上可接受之鹽。
10.如條款2至9中任一條之方法，其中該第二聚核苷酸鹽為該聚核苷酸之單價陽離子鹽。
11.如條款2至10中任一條之方法，其中該第二聚核苷酸鹽為該聚核苷酸之鈉鹽。
12.如條款1至5中任一條之方法，其進一步包括使 該聚核苷酸自載體裂解以產生該第一聚核苷酸組合物。
13.如條款1至12中任一條之方法，其中該第一組合物包含該聚核苷酸之單價陽離子鹽。
14.如條款1至13中任一條之方法，其中該接觸步驟包括自陽離子交換載體溶離該第一聚核苷酸組合物。
15.如條款1至14中任一條之方法，其中該分離步驟包括對該經接觸之第一聚核苷酸組合物進行離心以使該聚核苷酸鹽沈澱物下旋。
16.如條款1至15中任一條之方法，其中該分離步驟包括自該經接觸之第一聚核苷酸過濾該聚核苷酸鹽。
17.如條款2之方法，其中該第二聚核苷酸組合物係直接負載至該逆相層析載體上。
18.如條款1至17中任一條之方法，其進一步包括將該第二聚核苷酸組合物溶解於溶劑中。
19.如條款1至18中任一條之方法，其中該至少一個多價陽離子相對離子為二價。
20.如條款19之方法，其中該至少一個多價陽離子相對離子係選自由以下各項組成之群：鎂、鋅及鈣。
21.如條款1至18中任一條之方法，其中該至少一個多價陽離子相對離子為三價。
22.如條款21之方法，其中該至少一個多價陽離子相對離子為鋁。
23.如條款1至22中任一條之方法，其中該聚核苷酸鹽進一步包含單價陽離子相對離子。
24.一種組合物，其包含：聚核苷酸之鹽，其包含至少一個多價陽離子相對離子；其中該聚核苷酸具有7個以上與人類端粒酶之RNA組分互補的核苷亞單元的序列，且該等核苷亞單元中有至少兩個係由N3'→P5'硫代磷醯胺酯亞單元間鍵聯接合。
25.如條款24之組合物，其中該至少一個多價陽離子相對離子為二價。
26.如條款25之組合物，其中該至少一個多價陽離子相對離子係選自由以下各項組成之群：鎂、鋅及鈣。
27.如條款24至26中任一條之組合物，其中該至少一個多價陽離子相對離子為鎂。
28.如條款24之組合物，其中該至少一個多價陽離子相對離子為三價。
29.如條款28之組合物，其中該至少一個多價陽離子相對離子為鋁。
30.如條款24至29中任一條之組合物，其中該聚核苷酸包含相對於該聚核苷酸之聚陰離子主鏈佔3莫耳%以上之該多價陽離子相對離子。
31.如條款24至29中任一條之組合物，其中該聚核苷酸包含相對於該聚核苷酸佔1.0重量%以上之該多價陽離子相對離子。
32.如條款24至31中任一條之組合物，其中該組合物為沈澱物。
33.如條款24至32中任一條之組合物，其中該聚核 苷酸包含有包含13個以上與人類端粒酶之RNA組分互補的核苷亞單元的序列。
34.如條款24至33中任一條之組合物，其中該聚核苷酸包含介於10個與50個之間的與人類端粒酶之RNA組分互補的連續核苷亞單元。
35.如條款24至34中任一條之組合物，其中該等與人類端粒酶之RNA組分互補的核苷亞單元均由N3'→P5'硫代磷醯胺酯亞單元間鍵聯接合。
36.如條款24至35中任一條之組合物，其中該聚核苷酸包含選自由以下各項組成之群的序列：GTTAGGGTTAG(SEQ ID NO：4)、TAGGGTTAGACAA(SEQ ID NO：3)及CAGTTAGGGTTAG(SEQ ID NO：5)。
37.如條款24至36中任一條之組合物，其中該聚核苷酸係經由視情況存在之連接子與脂質部分結合。
38.如條款24至37中任一條之組合物，其中該聚核苷酸具有以下結構：
Figure 105112455-A0202-12-0092-23
其中各Mx+獨立地為陽離子相對離子，各x為1、2或3，且n為5至12之整數。
儘管已出於清楚理解之目的藉由說明及實例之方式相當詳細地描述上述發明，但熟習此項技術者應顯而易知根據本發明之教示，可在不背離所附申請專利範圍之精神及範疇的情況下對其進行某些變化及修改。
因此，前述內容僅說明本發明之原理。應瞭解，熟習此項技術者將能夠設計儘管本文中未明確描述或 顯示但可體現本發明之原理且包括在其精神及範疇內的各種安排。此外，本文中所敘述之所有實例及條件措辭主要意欲輔助讀者理解本發明之原理及由諸位發明人貢獻之用於增進此項技術之原理，並且應被視為但不限於此種明確敘述之實例及條件。此外，本文中敘述本發明之原理、態樣及實施例以及其特定實例的所有陳述均意欲涵蓋其結構及功能等效物。另外，意欲此種等效物包括當前已知的等效物及未來開發的等效物，亦即，所開發的執行相同功能的任何要素，不考慮結構。因此，本發明之範疇不意欲受限於本文中所顯示及描述之實施例。相反，本發明之範疇及精神由所附實施例體現。以上所指示之實施例的所有可能組合均被視為涵蓋在本發明之範疇內。
<110> 美商傑龍公司(Geron Corporation)
<120> 使用多價陽離子鹽組合物之聚核苷酸製備方法
<140> TW105112455
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<150> US 62/151891
<151> 2015-04-23
<160> 21
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 451
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 1
Figure 105112455-A0305-02-0097-6
<210> 2
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 2
Figure 105112455-A0305-02-0097-8
<210> 3
<211> 13
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 3
Figure 105112455-A0305-02-0098-10
<210> 4
<211> 11
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 4
Figure 105112455-A0305-02-0098-13
<210> 5
<211> 13
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 5
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<210> 6
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 6
Figure 105112455-A0305-02-0098-17
<210> 7
<211> 13
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 7
Figure 105112455-A0305-02-0098-18
<210> 8
<211> 13
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 8
Figure 105112455-A0305-02-0099-19
<210> 9
<211> 11
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 9
Figure 105112455-A0305-02-0099-21
<210> 10
<211> 13
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 10
Figure 105112455-A0305-02-0099-23
<210> 11
<211> 13
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 11
Figure 105112455-A0305-02-0099-26
<210> 12
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 12
Figure 105112455-A0305-02-0099-27
<210> 13
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 13
Figure 105112455-A0305-02-0100-29
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 14
Figure 105112455-A0305-02-0100-30
<210> 15
<211> 13
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 15
Figure 105112455-A0305-02-0100-32
<210> 16
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 16
Figure 105112455-A0305-02-0100-33
<210> 17
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 17
Figure 105112455-A0305-02-0101-34
<210> 18
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 18
Figure 105112455-A0305-02-0101-37
<210> 19
<211> 9
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 19
Figure 105112455-A0305-02-0101-38
<210> 20
<211> 9
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 20
Figure 105112455-A0305-02-0101-39
<210> 21
<211> 11
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 21
Figure 105112455-A0305-02-0101-40

Claims (42)

  1. 一種製備聚核苷酸之方法，該方法包括：a)使第一聚核苷酸組合物與多價陽離子鹽接觸以使包含至少一個多價陽離子相對離子之第一聚核苷酸鹽沈澱；及b)分離該第一聚核苷酸鹽與該經接觸之第一聚核苷酸組合物，以產生包含該第一聚核苷酸鹽之第二聚核苷酸組合物；其中該第一聚核苷酸組合物包括：i)聚核苷酸，其具有7個以上核苷亞單元之序列且該等核苷亞單元中有至少兩個係由N3'→P5'硫代磷醯胺酯亞單元間鍵聯接合；及ii)可溶性非目標合成產物及試劑；c)使包括來自步驟b)的該第一聚核苷酸鹽之該第二聚核苷酸組合物與逆相層析載體接觸；及d)自該逆相層析載體溶離包含第二聚核苷酸鹽之第三聚核苷酸組合物。
  2. 如申請專利範圍第1項之方法，其中，該核苷亞單元均由各獨立選自N3'→P5'硫代磷醯胺酯亞單元間鍵聯與N3'→P5'磷醯胺酯亞單元間鍵聯的亞單元間鍵聯接合。
  3. 如申請專利範圍第1項或第2項之方法，其中該聚核苷酸由式(I)描述：
    Figure 105112455-A0305-02-0103-2
     其中：各B獨立地為嘌呤、經保護之嘌呤、嘧啶或經保護之嘧啶或其類似物；各X獨立地為氧或硫；各R3獨立地為氫、氟、羥基、烷氧基、經取代之烷氧基或經保護之羥基；R6為胺基、羥基、經保護之胺基、經保護之羥基、-O-T-Z或-NH-T-Z；各T獨立地為視情況存在之連接子；各Z獨立地為H、脂質、載體、寡核苷酸、聚合物、多肽、可偵測標記或標簽；且n為7至100之整數。
  4. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該聚核苷酸包含有包含13個以上與人類端粒酶之RNA組分互補的核苷亞單元的序列。
  5. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該聚核苷酸包含介於10個與50個之間的與人類端粒酶之RNA組分 互補的連續核苷亞單元。
  6. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該等核苷亞單元均由N3'→P5'硫代磷醯胺酯亞單元間鍵聯接合。
  7. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該聚核苷酸包含選自由以下各項組成之群的序列：GTTAGGGTTAG(SEQ ID NO：4)、TAGGGTTAGACAA(SEQ ID NO：3)及CAGTTAGGGTTAG(SEQ ID NO：5)。
  8. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該聚核苷酸係與脂質部分結合。
  9. 如申請專利範圍第8項之方法，其中，該聚核苷酸係經由連接子與該脂質部分結合。
  10. 如申請專利範圍第2項之方法，其中該第二聚核苷酸鹽具有以下結構：
    Figure 105112455-A0305-02-0105-3
     其中各Mx+獨立地為氫或陽離子相對離子，各x獨立地為1、2或3，且n為5至13之整數。
  11. 如申請專利範圍第2項之方法，其中在該溶離步驟d)之後，該第二聚核苷酸鹽為該聚核苷酸之醫藥學上可接受之鹽。
  12. 如申請專利範圍第2項之方法，其中在該溶離步驟d)之後，該第二聚核苷酸鹽為該聚核苷酸之單價陽離子鹽。
  13. 如申請專利範圍第2項之方法，其中在該溶離步 驟d)之後，該第二聚核苷酸鹽為該聚核苷酸之鈉鹽。
  14. 如申請專利範圍第1項之方法，其進一步包括在該接觸步驟a)之前，使該聚核苷酸自固相合成載體裂解以產生該第一聚核苷酸組合物作為該聚核苷酸的粗合成製劑。
  15. 如申請專利範圍第1項之方法，其中在該接觸步驟a)之前，該第一聚核苷酸組合物包含該聚核苷酸之單價陽離子鹽。
  16. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該接觸步驟a)包括自陽離子交換載體負載及溶離該第一聚核苷酸組合物。
  17. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該分離步驟b)包括對該經接觸之第一聚核苷酸組合物進行離心以使該第一聚核苷酸鹽沈澱物下旋。
  18. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該分離步驟b)包括自該經接觸之第一聚核苷酸組合物過濾該第一聚核苷酸鹽。
  19. 如申請專利範圍第2項之方法，其中步驟b)之該第二聚核苷酸組合物係直接負載至該逆相層析載體上。
  20. 如申請專利範圍第2項之方法，其進一步包括在接觸步驟c)之前，將該第二聚核苷酸組合物溶解於溶劑中。
  21. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該至少一個多價陽離子相對離子為二價。
  22. 如申請專利範圍第21項之方法，其中該至少一個多價陽離子相對離子係選自由以下各項組成之群：鎂、鋅及鈣。
  23. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該至少一個多價陽離子相對離子為三價。
  24. 如申請專利範圍第23項之方法，其中該至少一個多價陽離子相對離子為鋁。
  25. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該第一聚核苷酸鹽進一步包含單價陽離子相對離子。
  26. 一種組合物，其包含：聚核苷酸之鹽沈澱物，其包含至少一個多價陽離子相對離子；其中該聚核苷酸具有7個以上的核苷亞單元的序列，且該等核苷亞單元中有至少兩個係由N3'→P5'硫代磷醯胺酯亞單元間鍵聯接合。
  27. 如申請專利範圍第26項之組合物，其中該至少一個多價陽離子相對離子為二價。
  28. 如申請專利範圍第27項之組合物，其中該至少一個多價陽離子相對離子係選自由以下各項組成之群：鎂、鋅及鈣。
  29. 如申請專利範圍第26項至第28項中任一項之組合物，其中該至少一個多價陽離子相對離子為鎂。
  30. 如申請專利範圍第26項之組合物，其中該至少一個多價陽離子相對離子為三價。
  31. 如申請專利範圍第30項之組合物，其中該至少一個多價陽離子相對離子為鋁。
  32. 如申請專利範圍第26項之組合物，其中該聚核苷酸鹽包含3莫耳%以上之該多價陽離子相對離子。
  33. 如申請專利範圍第26項之組合物，其中該聚核苷酸鹽包含1.0重量%以上之該多價陽離子相對離子。
  34. 如申請專利範圍第26項之組合物，其中該組合物為沈澱物。
  35. 如申請專利範圍第26項之組合物，其中該聚核苷酸由式(I)描述：
    Figure 105112455-A0305-02-0108-4
     其中：各B獨立地為嘌呤、經保護之嘌呤、嘧啶或經保護之嘧啶或其類似物；各X獨立地為氧或硫；各R3獨立地為氫、氟、羥基、烷氧基、經取代之烷氧基或經保護之羥基；R6為胺基、羥基、經保護之胺基、經保護之羥基、-O- T-Z或-NH-T-Z；各T獨立地為視情況存在之連接子；各Z獨立地為H、脂質、載體、寡核苷酸、聚合物、多肽、可偵測標記或標簽；且n為7至100之整數。
  36. 如申請專利範圍第26項之組合物，其中該聚核苷酸包含有包含13個以上與人類端粒酶之RNA組分互補的核苷亞單元的序列。
  37. 如申請專利範圍第26項之組合物，其中該聚核苷酸包含介於10個與50個之間的與人類端粒酶之RNA組分互補的連續核苷亞單元。
  38. 如申請專利範圍第26項之組合物，其中該等核苷亞單元均由N3'→P5'硫代磷醯胺酯亞單元間鍵聯接合。
  39. 如申請專利範圍第26項之組合物，其中該聚核苷酸包含選自由以下各項組成之群的序列：GTTAGGGTTAG(SEQ ID NO：4)、TAGGGTTAGACAA(SEQ ID NO：3)及CAGTTAGGGTTAG(SEQ ID NO：5)。
  40. 如申請專利範圍第26項之組合物，其中該聚核苷酸之5’或3’末端係與脂質部分結合。
  41. 如申請專利範圍第40項之組合物，其中該聚核苷酸之5’或3’末端係經由連接子與該脂質部分結合。
  42. 如申請專利範圍第26項之組合物，其中該聚核苷酸具有以下結構：
    Figure 105112455-A0305-02-0110-5
     其中各Mx+獨立地為陽離子相對離子，各x為1、2或3，且n為5至12之整數。
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