KR102401252B1 - 다가 양이온 염 조성물을 사용한 폴리뉴클레오티드 제조의 방법 - Google Patents

다가 양이온 염 조성물을 사용한 폴리뉴클레오티드 제조의 방법 Download PDF

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Abstract

본 개시내용의 양태는 폴리뉴클레오티드의 제조를 위한 방법을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 하기를 포함하는 제1 폴리뉴클레오티드 조성물을, 다가 양이온 염과 접촉시켜 적어도 하나의 다가 양이온 반대이온을 포함하는 폴리뉴클레오티드 염을 침전시키는 단계: 7 이상의 뉴클레오시드 하부단위를 포함하는 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 (상기 뉴클레오시드 하부단위 중 적어도 2개는 N3'-P5' 티오포스포르아미데이트 하부단위간 연결에 의하여 결합됨); 및 비표적 합성 생성물 및 시약; 및 상기 접촉된 제1 폴리뉴클레오티드 조성물로부터 상기 폴리뉴클레오티드 염을 분리시켜 상기 폴리뉴클레오티드 염을 포함하는 제2 폴리뉴클레오티드 조성물을 생산하는 단계를 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 방법은 하기 단계를 추가로 포함한다: 폴리뉴클레오티드 염을, 역 상 크로마토그래피 지지체와 접촉시키는 단계; 및 상기 크로마토그래피 지지체로부터 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제3 폴리뉴클레오티드 조성물을 용출시키는 단계. 또한, 적어도 하나의 다가 양이온 반대이온을 포함하는 폴리뉴클레오티드의 염을 포함하는 조성물이 제공된다.

Description

다가 양이온 염 조성물을 사용한 폴리뉴클레오티드 제조의 방법
관련 기술에 대한 상호 참조
35 U.S.C. § 119(e)에 따라서, 본 출원은, 2015년 4월 23일 출원된, 미국 가출원 시리즈 번호 62/151,891에 우선권 주장하고, 이 개시내용은 본원에서 참고로 편입된다.
도입
핵산 중합체 화학은 약제학적, 진단학적 및 분석학적 분야에서 및 보다 특히 안티센스 및 항-유전자 치료, 조합적 화학, 분지형화된 DNA 신호 증폭 및 어레이-기반 DNA 진단 및 분석의 하위분야에서 많은 개발 기술에서 역할을 수행하였다. 상기 중합체 화학의 일부는 DNA와 같은 천연 핵산 중합체의 결합 강도, 특이성 및 뉴클레아제 내성을 개선시켰다. 펩티드 핵산 (PNA), 포스포로티오에이트, 메틸포스포네이트 및 포스포르아미데이트 뉴클레오시드간 연결(linkage)은 뉴클레아제 내성, 세포 취득 및 용해도와 같은 하나 이상의 목적하는 성질을 제공하도록 폴리뉴클레오티드에 적용된 일부 중합체 화학의 예이다.
폴리뉴클레오티드 N3'→P5' 포스포르아미데이트는 상보적 DNA 및 RNA 가닥과 안정한 듀플렉스를 형성할 수 있고 DNA 듀플렉스와 안정한 트리플렉스를 형성할 수 있고, 이는 뉴클레아제에 내성이다. 폴리뉴클레오티드 N3'→P5' 티오포스포르아미데이트는 시험관내 및 생체내 둘다에서 강력한 안티센스 제제로서 사용되었다. 텔로머라아제 활성을 억제하는 화합물을 함유하는 폴리뉴클레오티드는 암과 같은 텔로머라아제-매개된 장애를 치료하기 위해 사용될 수 있는데, 그 이유는 암 세포는 텔로머라아제 활성을 발현하고 정상 인간 체세포는 생물학적 관련 수준에서 텔로머라아제 활성을 소유하고 있지 않기 때문이다. 이와 같이, 상기 폴리뉴클레오티드를 제조하고 단리시키는 방법이 관심 대상이다.
일본 공표특허공보 특표2007-504830호 일본 공표특허공보 특표2003-513887호 국제공개공보 WO 2012/021985 국제공개공보 WO 2008/127305 미국특허공보 US 9,796,747
Sawadogo and Van Dyke, Nucleic Acids Research, 1991, 19(3): 674 Graham and Williams, Journal of Food Science, 1966, 31(3):362-372 Plum et al., Biopolymers, 1990, 30:631-643
요약
개시의 양태는 폴리뉴클레오티드의 제조를 위한 방법을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 하기를 포함하는 제1 폴리뉴클레오티드 조성물을, 다가 양이온 염과 접촉시켜 적어도 하나의 다가 양이온 반대이온을 포함하는 제1 폴리뉴클레오티드 염을 침전시키는 단계: 7 이상의 뉴클레오시드 하부단위를 포함하는 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 (상기 뉴클레오시드 하부단위 중 적어도 2개는 N3'→P5' 티오포스포르아미데이트 하부단위간 연결에 의하여 결합됨); 및 비표적 합성 생성물 및 시약; 및 상기 접촉된 제1 폴리뉴클레오티드 조성물로부터 상기 폴리뉴클레오티드 염을 분리시켜 상기 폴리뉴클레오티드 염을 포함하는 제2 폴리뉴클레오티드 조성물을 생산하는 단계를 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 방법은 하기 단계를 추가로 포함한다: 제1 폴리뉴클레오티드 염을, 역 상 크로마토그래피 지지체와 접촉시키는 단계; 및 상기 크로마토그래피 지지체로부터 제2 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제3 폴리뉴클레오티드 조성물을 용출시키는 단계. 또한, 적어도 하나의 다가 양이온 반대이온을 포함하는 폴리뉴클레오티드의 염을 포함하는 조성물이 제공된다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 다가 양이온 반대이온은 마그네슘, 아연, 알루미늄, 및 칼슘으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
당해 분야의 숙련가는, 하기 기술된 도면이 단지 예증적 목적을 위한 것임을 이해할 것이다. 이러한 도면은 본 교시내용의 기술 영역을 어떠한 방식으로도 제한하고자 하는 것이 아니다.
도 1은 다양한 pH의 1M NaCl 용액에서 이메텔스텟-Mg의 HPLC 크로마토그램을 도시한다.
도 2는 다양한 염으로 처리된 이메텔스텟 나트륨의 원소 분석의 결과를 도시한다.
도 3은 증가하는 등량의 마그네슘 염화물 염으로 처리된 이메텔스텟 소디움의 원소 분석 결과를 도시한다.
도 4는 증가하는 등량의 마그네슘 염화물 염으로 처리된 이메텔스텟 TEA의 원소 분석 결과를 도시한다.
정의
예시적인 구현예를 더 상세히 기술하기 전에, 상세한 설명에서 사용된 용어들의 의미와 범위를 예시하고 한정하기 위해 하기 정의가 제시된다.
하기의 용어는 달리 나타내지 않는 한 하기의 의미를 갖는다. 임의의 정의되지 않는 용어는 이들이 당업계에서 인정된 의미를 갖는다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어들 폴리뉴클레오티드 및 올리고뉴클레오티드는 뉴클레오시드간 결합 또는 뉴클레오시드간의 연결에 의해 결합된 복수의 뉴클레오시드 모이어티 하부단위 또는 뉴클레오시드 잔기를 함유하는 화합물을 지칭하기 위해 상호교환적으로 사용된다. 폴리뉴클레오티드가 일련의 문자, 예를 들어, "ATGUCCTG"로 나타낸 경우, 상기 뉴클레오티드는 달리 주지되지 않는 한, 왼쪽에서 오른쪽으로 5'→3' 순서로 있는 것이고 "A"는 데옥시아데노신을 지칭하고, "C"는 데옥시시티딘을 지칭하고, "G"는 데옥시구아노신을 지칭하고, "T"는 티미딘을 지칭하고 "U"는 데옥시우리딘을 지칭하는 것으로 이해된다.
본원에 사용된 바와 같은 “뉴클레오시드"는 예를 들어, 문헌[참조: Kornberg and Baker, DNA Replication, 2nd Ed. (Freeman, San Francisco, 1992)]에 기재된 바와 같이 2'-데옥시 및 2'-하이드록실 형태를 포함하는 천연 뉴클레오시드를 포함한다. 뉴클레오시드와 관련하여 "유사체"는 예를 들어, 일반적으로 문헌[참조: Scheit, Nucleotide Analogs (John Wiley, New York, 1980)]에 기재된, 변형된 염기 모이어티 및/또는 변형된 슈가 모이어티를 갖는 합성 뉴클레오시드를 포함한다. 상기 유사체는 문헌[참조: Uhlmann and Peyman (Chemical Reviews, 90:543-584, 1990)]에 기재된 바와 같이 결합 성질, 예를 들어, 안정성, 특이성 등을 증진시키도록 설계된 합성 뉴클레오시드를 포함한다. 일부 구현예에서, 뉴클레오시드 또는 뉴클레오시드 유사체는 3’-하이드록실 기 또는 3’-아미노 기를 포함한다.
용어 “염기” 및 “핵염기”는 상호교환적으로 사용되고 (i) 통상적인 DNA 및 RNA 염기 (우라실, 티민, 아데닌, 구아닌 및 시토신), 및 (ii) 변형된 염기 또는 염기 유사체 (예를 들어, 5-메틸-시토신, 5-브로모우라실, 또는 이노신)을 포함하는 것으로 본원에서 정의된다. 염기 유사체는 이의 분자 구조가 통상의 DNA 또는 RNA 염기를 모방하는 화학물질이다.
본원에 사용된 바와 같은 "피리미딘"은 시토신, 티민 및 우라실을 포함하는 천연 뉴클레오시드에 존재하는 피리미딘, 및 이들의 통상의 유사체, 예를 들어, 옥시, 메틸, 프로피닐, 메톡시, 하이드록실, 아미노, 티오, 할로 등 및 치환체를 함유하는 것들을 의미한다. 본원에 사용된 바와 같은 용어는 통상의 보호기가 부착된 피리미딘, 예를 들어, N4-벤조일시토신을 추가로 포함한다. 추가의 관심 피리미딘 보호기는 비제한적으로 하기에 개시된 보호기를 포함한다: Beaucage and Iyer Tetrahedron 48: 2223-2311 (1992).
본원에 사용된 바와 같은 "퓨린"은 아데닌, 구아닌 및 하이포크산틴을 포함하는 천연 뉴클레오시드에 존재하는 퓨린, 및 이들의 통상의 유사체, 예를 들어, 옥시, 메틸, 프로피닐, 메톡시, 하이드록실, 아미노, 티오, 할로 등 및 치환체를 함유하는 것들을 의미한다. 본원에 사용된 바와 같은 용어는 통상의 보호기가 부착된 퓨린, 예를 들어, N2-벤조일구아닌, N2-이소부티릴구아닌, N6-벤조일아데닌 등을 추가로 포함한다. 추가의 통상의 퓨린 보호기는 하기에 개시된다: Beaucage and Iyer Tetrahedron 48: 2223-2311 (1992). 화학명의 한 성분로서 본원에 사용된 바와 같은 용어 "-보호된-"은 화합물의 특정 모이어티에 대하여 당업계에 인지된 보호기를 지칭하고, 예를 들어, 뉴클레오시드와 관련하여 "5'-보호된-하이드록실"은 트리페닐메틸(즉, 트리틸), p-아니실디페닐메틸 (즉, 모노메톡시트리틸 또는 MMT), 디-p-아니실페닐메틸 (즉, 디메톡시트리틸 또는 DMT) 등을 포함하고, 핵염기와 관련된 보호된 핵염기는 디메틸아미노포름아미딘 (DMF), 벤조일 (Bz), 이소부티릴 등과 같은 기로 보호된 헤테로원자를 포함한다. 당업계에서 인지된 보호기는 하기의 문헌에 기재된 것들을 포함한다: Gait, editor, Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach (IRL Press, Oxford, 1984); Amarnath and Broom, Chemical Reviews, 77:183-217, 1977; Pon et al., Biotechniques, 6:768-775, 1988; Ohtsuka et al., Nucleic Acids Research, 10:6553-6570, 1982; Eckstein, editor, Oligonucleotides, and Analogues: A Practical Approach (IRL Press, Oxford, 1991), Greene and Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, Second Edition, (John Wiley & Sons, New York, 1991), Narang, editor, Synthesis and Applications of DNA and RNA (Academic Press, New York, 1987), Beaucage and Iyer Tetrahedron 48: 2223- 2311 (1992), 및 유사 참고문헌.
본원에 사용된 바와 같은 "폴리뉴클레오티드 N3'→P5' 티오포스포르아미데이트"는 적어도 하나의 N3'→P5' 티오포스포르아미데이트 연결에 의해 결합된 통상 선형인 뉴클레오시드 하부단위의 올리고머를 의미한다. 일반적인 용어에서, 상기 뉴클레오시드 하부단위는 뉴클레오시드 또는 뉴클레오시드 유사체를 포함하지만 또한 하기의 문헌에 기재된 바와 같은 비염기성 슈가와 같은 적합한 화학물질을 갖는 보다 일반적인 모이어티 및 다른 탄화수소 모이어티를 포함할 수 있다: Newton et al., Nucleic Acids Research, 21: 1155- 1162 (1993); Griffin et al., J. Am. Chem. Soc., 114: 7976-7982 (1992); Jaschke et al., Tetrahedron Letters, 34: 301-304 (1992); Ma et al., 국제 출원 PCT/CA92/00423; Zon et al., 국제 출원 PCT/US90/06630; Durand et al., Nucleic Acids Research, 18: 6353-6359 (1990); Salunkhe et al., J. Am. Chem. Soc., 114: 8768-8772 (1992); 등. 일부 사례에서, 본 용어는 모든 뉴클레오시드간의 연결이 N3'→P5' 티오포스포르아미데이트 연결에 의해 대체된 폴리뉴클레오티드를 의미한다. 이와 같이, 본 용어는 부분적으로뿐만 아니라 전체적으로 "아미드화된" 올리고머를 포함한다. 일부 경우에, 이러한 용어는 모든 뉴클레오시드간 연결이 N3'→P5' 티오포스포르아미데이트 연결로 대체되고 상기 뉴클레오시드 하부단위가 천연 뉴클레오시드 또는 이의 유사체인 폴리뉴클레오티드를 의미한다. 모든 연결이 N3'→P5' 티오포스포르아미데이트 연결인 본 발명의 폴리뉴클레오티드 N3'→P5' 티오포스포르아미데이트(“완전히 아미드화된”)는 “부분적으로 아미드화된” 보다 큰 올리고머를 형성하기 위해 다른 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드에 포매되거나 부착될 수 있다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드 N3'→P5' 티오포스포르아미데이트는 임의의 적합한 3’ 및/또는 5’ 말단 기를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드 N3'→P5' 티오포스포르아미데이트는 3’-하이드록실 말단 기 또는 3’-아미노 말단 기를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 “포스페이트” 및 “포스페이트 기”는 티오포스페이트 기 및 옥소포스페이트 기를 포괄하는 것으로 의미된다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "포스포르아미다이트 아미노 기”는 포스포르아미다이트 기의 인 원자에 부착된 아미노 기, --NR4R5 을 지칭하고, 용어 "포스포르아미다이트 질소"는 포스포르아미다이트 아미노 기의 질소 원자를 지칭한다.
"알킬"은 1 내지 10개의 탄소 원자 및 예컨대 1 내지 6개의 탄소 원자(예를 들면, "1 내지 6개의 탄소 원자의 알킬"), 또는 1 내지 5(예를 들면, "1 내지 5개의 탄소 원자의 알킬"), 또는 1 내지 4(예를 들면, "1 내지 4개의 탄소 원자의 알킬"), 또는 1 내지 3개의 탄소 원자(예를 들면, "1 내지 3개의 탄소 원자의 알킬")를 갖는 1가 포화된 지방족 하이드로카르빌 기를 지칭한다. 이러한 용어는, 예로서, 하기를 포함한다: 선형 및 분지형 하이드로카르빌 기 예컨대 메틸 (CH3-), 에틸 (CH3CH2-), n-프로필 (CH3CH2CH2-), 이소프로필 ((CH3)2CH-), n-부틸 (CH3CH2CH2CH2-), 이소부틸 ((CH3)2CHCH2-), sec-부틸 ((CH3)(CH3CH2)CH-), t-부틸 ((CH3)3C-), n-펜틸 (CH3CH2CH2CH2CH2-), 및 네오펜틸 ((CH3)3CCH2-).
상기 용어 “치환된 알킬”은 본원에 정의된 바와 같은 알킬 기를 지칭하고, 여기서, 상기 알킬 쇄에서 하나 이상의 탄소 원자는 임의로 -O-, -N-, -S-, -S(O)n- (여기서, n은 0 내지 2이다), -NR- (여기서 R은 수소 또는 알킬이다)과 같은 헤테로원자로 대체되어 있고 알콕시, 치환된 알콕시, 사이클로알킬, 치환된 사이클로알킬, 사이클로알켄일, 치환된 사이클로알켄일, 아실, 아실아미노, 아실옥시, 아미노, 아미노아실, 아미노아실옥시, 옥시아미노아실, 아지도, 시아노, 할로겐, 하이드록실, 옥소, 티오케토, 카르복실, 카르복실알킬, 티오아릴옥시, 티오헤테로아릴옥시, 티오헤테로사이클로옥시, 티올, 티오알콕시, 치환된 티오알콕시, 아릴, 아릴옥시, 헤테로아릴, 헤테로아릴옥시, 헤테로사이클일, 헤테로사이클로옥시, 하이드록시아미노, 알콕시아미노, 니트로, -SO-알킬, -SO-아릴, -SO-헤테로아릴, -SO2-알킬, -SO2-아릴, -SO2-헤테로아릴, 및 -NRaRb 로 이루어진 군으로부터 선택되는 1 내지 5개의 치환체를 갖고, 여기서, Ra 및 Rb 는 동일하거나 상이할 수 있고 수소, 임의로 치환된 알킬, 사이클로알킬, 알켄일, 사이클로알켄일, 알킨일, 아릴, 헤테로아릴 및 헤테로환계으로부터 선택된다. 일부 경우에, “치환된 알킬”은 알콕시, 사이클로알킬, 사이클로알켄일, 아실, 아실아미노, 아실옥시, 아미노, 아미노아실, 아미노아실옥시, 옥시아미노아실, 아지도, 시아노, 할로겐, 하이드록실, 카르복실, 카르복실알킬, 티올, 티오알콕시, 아릴, 아릴옥시, 헤테로아릴, 헤테로아릴옥시, 헤테로사이클일, 헤테로사이클로옥시, 설폰아미도, 및 -NRaRb 로 이루어진 군으로부터 선택되는, 1 내지 5개의 치환체를 갖는 본원에 정의된 바와 같은 알킬 기를 지칭하고, 여기서, Ra 및 Rb 는 동일하거나 상이할 수 있고 수소, 알킬, 사이클로알킬, 알켄일, 사이클로알켄일, 알킨일, 아릴, 헤테로아릴 및 헤테로환계으로부터 선택된다.
“알콕시”는 기 -O-알킬을 지칭하고, 여기서, 알킬은 본원에 정의된 바와 같다. 알콕시는 예를 들어, 메톡시, 에톡시, n-프로폭시, 이소프로폭시, n-부톡시, t-부톡시, 2급-부톡시, n-펜톡시 등을 포함한다. 상기 용어 “알콕시”는 또한 기 알켄일-O-, 사이클로알킬-O-, 사이클로알켄일-O-, 및 알킨일-O-를 지칭하고, 여기서, 알켄일, 사이클로알킬, 사이클로알켄일 및 알킨일은 본원에 정의된 바와 같다.
상기 용어 “치환된 알콕시”는 기 치환된 알킬-O-, 치환된 알켄일-O-, 치환된 사이클로알킬-O-, 치환된 사이클로알켄일-O-, 및 치환된 알킨일-O-를 지칭하고, 여기서, 치환된 알킬, 치환된 알켄일, 치환된 사이클로알킬, 치환된 사이클로알켄일 및 치환된 알킨일은 본원에 정의된 바와 같다.
“아실”은 기 H-C(O)-, 알킬-C(O)-, 치환된 알킬-C(O)-, 알켄일-C(O)-, 치환된 알켄일-C(O)-, 알킨일-C(O)-, 치환된 알킨일-C(O)-, 사이클로알킬-C(O)-, 치환된 사이클로알킬-C(O)-, 사이클로알켄일-C(O)-, 치환된 사이클로알켄일-C(O)-, 아릴-C(O)-, 치환된 아릴-C(O)-, 헤테로아릴-C(O)-, 치환된 헤테로아릴-C(O)-, 헤테로사이클일-C(O)-, 및 치환된 헤테로사이클일-C(O)-를 지칭하고, 여기서, 알킬, 치환된 알킬, 알켄일, 치환된 알켄일, 알킨일, 치환된 알킨일, 사이클로알킬, 치환된 사이클로알킬, 사이클로알켄일, 치환된 사이클로알켄일, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 헤테로환계, 및 치환된 헤테로환계는 본원에 정의된 바와 같다. 예를 들어, 아실은 “아세틸” 기 CH3C(O)-를 포함한다.
용어 “치환된 아미노”는 기 -NRR을 지칭하고, 여기서, 각각의 R은 독립적으로 수소, 알킬, 치환된 알킬, 사이클로알킬, 치환된 사이클로알킬, 알켄일, 치환된 알켄일, 사이클로알켄일, 치환된 사이클로알켄일, 알킨일, 치환된 알킨일, 아릴, 헤테로아릴 및 헤테로사이클일로 이루어진 군으로부터 선택되고, 단, 적어도 하나의 R은 수소가 아니다.
“할로” 또는 “할로겐”은 플루오로, 클로로, 브로모 및 요오도를 지칭한다.
“하이드록시” 또는 “하이드록실”은 기 -OH를 지칭한다.
“헤테로아릴”은 환 내에 산소, 질소, 및 황으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1 내지 15개 탄소 원자, 예를 들어, 1 내지 10개 탄소 원자 및 1 내지 10개 헤테로원자의 방향족 기를 지칭한다. 상기 헤테로아릴 기는 단일 환 (예를 들어, 피리딘일, 이미다졸일 또는 푸릴) 또는 환 시스템에서 다중 축합 환(예를 들어, 인돌리지닐, 퀴놀린일, 벤조푸란, 벤즈이미다졸일 또는 벤조티에닐과 같은 기에서와 같은)을 가질 수 있으며, 여기서, 상기 환 시스템 내에서 적어도 하나의 환은 방향족이며, 단, 부착 지점은 방향족 환의 원자를 통해서이다. 특정 구현예에서, 헤테로아릴 기의 질소 및/또는 황 환 원자(들)은 임의로 산화되어 N-옥사이드 (N→O), 설피닐, 또는 설폰일 모이어티를 제공한다. 상기 용어는, 예로서, 피리딘일, 피롤릴, 인돌일, 티오페닐, 및 푸란일을 포함한다. 헤테로아릴 치환체에 대해 정의에 의해 달리 제한되지 않는 한, 이러한 헤테로아릴 기는 아실옥시, 하이드록시, 티올, 아실, 알킬, 알콕시, 알켄일, 알킨일, 사이클로알킬, 사이클로알켄일, 치환된 알킬, 치환된 알콕시, 치환된 알켄일, 치환된 알킨일, 치환된 사이클로알킬, 치환된 사이클로알켄일, 아미노, 치환된 아미노, 아미노아실, 아실아미노, 알크아릴, 아릴, 아릴옥시, 아지도, 카르복실, 카르복실알킬, 시아노, 할로겐, 니트로, 헤테로아릴, 헤테로아릴옥시, 헤테로사이클일, 헤테로사이클로옥시, 아미노아실옥시, 옥시아실아미노, 티오알콕시, 치환된 티오알콕시, 티오아릴옥시, 티오헤테로아릴옥시, -SO-알킬, -SO-치환된 알킬, -SO-아릴, -SO-헤테로아릴, -SO2-알킬, -SO2-치환된 알킬, -SO2-아릴 및 -SO2-헤테로아릴, 및 트리할로메틸로부터 선택되는, 1 내지 5개 치환체, 또는 1 내지 3개 치환체로 임의로 치환될 수 있다. 이러한, 경우, 1 내지 5개 치환체 (예를 들어, 본원에 기재된 바와 같음)로 치환된 헤테로아릴 기는 “치환된 헤테로아릴”로서 지칭된다.
“헤테로사이클,” “헤테로환계,” “헤테로사이클로알킬,” 및 “헤테로사이클일”은 융합된 가교된 및 스피로 환 시스템을 포함하는 단일 환 또는 다중 축합 환, 및 1 내지 10개 헤테로원자를 포함하는 3 내지 20개 환 원자를 갖는 포화 또는 불포화 기를 지칭한다. 이들 환 원자는 질소, 황 또는 산소로 이루어진 군으로부터 선택되고, 여기서, 융합된 환 시스템에서, 하나 이상의 환은 사이클로알킬, 아릴, 또는 헤테로아릴일 수 있고, 단, 부착 지점은 비-방향족 환을 통해서이다. 특정 구현예에서, 헤테로환계 기의 질소 및/또는 황 원자(들)은 임의로 산화되어 N-옥사이드, -S(O)-, 또는 -SO2- 모이어티를 제공한다.
헤테로사이클 및 헤테로아릴의 예는 아제티딘, 피롤, 이미다졸, 피라졸, 피리딘, 피라진, 피리미딘, 피리다진, 인돌리진, 이소인돌, 인돌, 디하이드로인돌, 인다졸, 퓨린, 퀴놀리진, 이소퀴놀린, 퀴놀린, 프탈라진, 나프틸피리딘, 퀴녹살린, 퀴나졸린, 신놀린, 프테리딘, 카바졸, 카볼린, 페난트리딘, 아크리딘, 페난트롤린, 이소티아졸, 페나진, 이속사졸, 페녹사진, 페노티아진, 이미다졸리딘, 이미다졸린, 피페리딘, 피페라진, 인돌린, 프탈이미드, 1,2,3,4-테트라하이드로이소퀴놀린, 4,5,6,7-테트라하이드로벤조[b]티오펜, 티아졸, 티아졸리딘, 티오펜, 벤조[b]티오펜, 모르폴리닐, 티오모르폴리닐 (티아모르폴리닐로도 지칭됨), 1,1-디옥소티오모르폴리닐, 피페리딘일, 피롤리딘, 테트라하이드로푸란일 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
헤테로환계 치환체에 대해 정의에 의해 달리 제한되지 않는 한, 이러한 헤테로환계 기는 알콕시, 치환된 알콕시, 사이클로알킬, 치환된 사이클로알킬, 사이클로알켄일, 치환된 사이클로알켄일, 아실, 아실아미노, 아실옥시, 아미노, 치환된 아미노, 아미노아실, 아미노아실옥시, 옥시아미노아실, 아지도, 시아노, 할로겐, 하이드록실, 옥소, 티오케토, 카르복실, 카르복실알킬, 티오아릴옥시, 티오헤테로아릴옥시, 티오헤테로사이클로옥시, 티올, 티오알콕시, 치환된 티오알콕시, 아릴, 아릴옥시, 헤테로아릴, 헤테로아릴옥시, 헤테로사이클일, 헤테로사이클로옥시, 하이드록시아미노, 알콕시아미노, 니트로, -SO-알킬, -SO-치환된 알킬, -SO-아릴, -SO-헤테로아릴, -SO2-알킬, -SO2-치환된 알킬, -SO2-아릴, -SO2-헤테로아릴, 및 융합 헤테로사이클로부터 선택되는, 1 내지 5개, 또는 1 내지 3개 치환체로 임의로 치환될 수 있다.
“니트로” 는 -NO2 기를 지칭한다.
“옥소”는 원자 (=O)를 지칭한다.
“티올”은 기 -SH를 지칭한다.
“티옥소” 또는 용어 “티오케토”는 원자 (=S)를 지칭한다.
본원의 개시내용에 추가하여, 구체화된 기 또는 라디칼을 변형시키는데 사용되는 경우, 용어 “치환된”은 또한 구체화된 기 또는 라디칼의 하나 이상의 수소 원자가 각각 서로 독립적으로 아래에 정의된 바와 같은 동일하거나 상이한 치환체 기로 대체됨을 의미할 수 있다.
본원에서의 개별 용어에 관하여 개시된 군에 더하여, 명시된 기 또는 라디칼 내 하나 이상 수소 (단일 탄소 상의 임의의 2개 수소는 =O, =NR70, =N-OR70, =N2 또는 =S로 대체될 수 있음)를 치환하기 위한 치환체 기는, 달리 명시되지 않는다면, 하기로 대체될 수 있다: -R60, 할로, =O, -OR70, -SR70, -NR80R80, 트리할로메틸, -CN, -OCN, -SCN, -NO, -NO2, =N2, -N3, -SO2R70, -SO2O- M+, -SO2OR70, -OSO2R70, -OSO2O-M+, -OSO2OR70, -P(O)(O-)2(M+)2, -P(O)(OR70)O- M+, -P(O)(OR70)2, -C(O)R70, -C(S)R70, -C(NR70)R70, -C(O)O- M+, -C(O)OR70, -C(S)OR70, -C(O)NR80R80, -C(NR70)NR80R80, -OC(O)R70, -OC(S)R70, -OC(O)O-M+, -OC(O)OR70, -OC(S)OR70, -NR70C(O)R70, -NR70C(S)R70, -NR70CO2 - M+, -NR70CO2R70, -NR70C(S)OR70, -NR70C(O)NR80R80, -NR70C(NR70)R70
및 -NR70C(NR70)NR80R80 (여기서 R60 은 하기로 이루어진 군으로부터 선택되며: 임의로 치환된 알킬, 사이클로알킬, 헤테로알킬, 헤테로사이클로알킬알킬, 사이클로알킬알킬, 아릴, 아릴알킬, 헤테로아릴 및 헤테로아릴알킬; 각 R70 은 독립적으로 수소 또는 R60 이며; 각 R80 은 독립적으로 R70 이거나, 또는 대안적으로, 2개의 R80 이 이들이 결합된 질소 원자와 함께 취해져서, 5-, 6- 또는 7-원 헤테로사이클로알킬을 형성하고, 이는 임의로, O, N 및 S로 이루어진 군으로부터 선택된 1 내지 4개의 상동하거나 또는 상이한 추가의 헤테로원자를 포함할 수 있으며, 여기서 N은 -H 또는 C1-C3 알킬 치환을 가질 수 있으며; 각 M+ 는 순 단일 양전하를 갖는 반대이온임). 각각의 M+ 는 독립적으로, 예를 들어, 알칼리 이온, 예를 들어 K+, Na+, Li+ ; 암모늄 이온, 예를 들어, +N(R60)4 ; 또는 알칼리 토이온, 예를 들어, [Ca2 +]0.5, [Mg2 +]0.5, 또는 [Ba2 +]0.5 (“아래첨자 0.5는 이러한 2가 알칼리 토이온에 대한 반대이온 중 하나가 본 발명의 화합물의 이온화된 형태일 수 있으며, 나머지는 클로라이드와 같은 반대이온일 수 있거나, 또는 본원에 개시된 2개의 이온화된 화합물은 이러한 2가 알칼리 토이온에 대한 반대이온으로서 기능할 수 있거나, 본 발명의 이중으로 이온화된 화합물은 이러한 2가 알칼리 토이온에 대한 반대이온으로서 기능할 수 있음을 의미한다)일 수 있다. 구체적인 예로서, -NR80R80 은 -NH2, -NH-알킬, N-피롤리디닐, N-피페라지닐, 4N-메틸-피페라진-1-일 및 N-모폴리닐을 포함하는 것으로 의미된다.
본원의 개시내용에 추가하여, 특정 구현예에서, 치환된 기는 1, 2, 3, 또는 4개 치환체, 1, 2, 또는 3개 치환체, 1 또는 2개 치환체, 또는 1개 치환체를 갖는다.
상기 정의된 모든 치환된 기에서, 추가의 치환체를 갖는 치환체를 그 자체에 대해 정의된 중합체 (예를 들어, 치환체로서 치환된 아릴 기를 갖는 치환된 아릴이며 이는 그 자체가 치환된 아릴 기로 치환되며, 치환된 아릴 기 등으로 추가로 치환된다)가 본원에 포함되지 않음을 의미한다. 이러한, 경우, 이러한 치환의 최대수는 3이다. 예를 들어, 본원에서 구체적으로 고려되는 치환된 아릴 기의 일련의 치환은 치환된 아릴-(치환된 아릴)-치환된 아릴로 제한된다.
달리 나타내지 않는 한, 본원에 명백히 정의되지 않은 치환체의 명명법은 기능기에 이어 부착 지점 쪽으로 인접한 기능기의 말단 부분을 명명함에 의해 발생한다.
하나 이상의 치환체를 함유하는 본원에 개시된 기 중 어느 하나로서, 물론, 이러한 기가 입체적으로 비현실적이고/이거나 합성에 의해 비-실현가능한 임의의 치환 또는 치환 패턴을 함유하지 않음을 이해한다. 또한, 본 발명의 화합물은 이들 화합물의 치환으로부터 발생하는 모든 입체화학 이성질체를 포함한다.
용어 “약제학적으로 허용가능한 염”은 환자, 예를 들어, 포유동물에게 투여하는데 허용되는 염 (주어진 투여 용법을 위한 허용가능한 포유동물 안전을 갖는 반대이온을 갖는 염)을 의미한다. 이러한 염은 약제학적으로 허용가능한 무기 또는 유기 염기로부터 그리고 약제학적으로 허용가능한 무기 또는 유기 산으로부터 유도될 수 있다. “약제학적으로 허용가능한 염”은 화합물의 약제학적으로 허용가능한 염을 지칭하고, 상기 염은 당업계에 익히 공지된 다양한 유기 및 무기 반대이온으로부터 유도되고, 예로서 나트륨 등만을 포함하고; 분자가 염기성 기능기를 함유하는 경우, 염산염 등과 같은 유기 또는 무기산의 염을 포함한다. 목적하는 약제학적으로 허용가능한 염은 알루미늄, 암모늄, 아르기닌, 바륨, 벤자틴, 칼슘, 콜리네이트, 에틸렌디아민, 리신, 리튬, 마그네슘, 메글루민, 프로카인, 칼륨, 나트륨, 트로메타민, N-메틸글루카민, N,N′-디벤질에틸렌-디아민, 클로로프로카인, 디에탄올아민, 에탄올아민, 피페라진, 아연, 디이소프로필아민, 트리에틸아민, 디이소프로필에틸아민 및 트리에탄올아민 염을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
용어 “이의 염”은 산의 양성자가 금속 양이온 또는 유기 양이온 등과 같은 양이온에 의해 대체되는 경우 형성되는 화합물을 의미한다. 적용가능한 경우, 염은 약제학적으로 허용가능한 염이지만, 이것은 환자에게 투여하기 위해 의도되지 않은 중간체 화합물의 염에 필요하지 않다. 예로서, 본 발명의 화합물의 염은 무기 또는 유기 산에 의해 양성자화되어, 염의 음이온 성분으로서 무기 또는 유기 산의 짝염기를 갖는 양이온을 형성하는 것들을 포함한다. 목적하는 염은 알루미늄, 암모늄, 아르기닌, 바륨, 벤자틴, 칼슘, 세슘, 콜리네이트, 에틸렌디아민, 리튬, 마그네슘, 메글루민, 프로카인, N-메틸글루카민, 피페라진, 칼륨, 나트륨, 트로메타민, 아연, N,N′-디벤질에틸렌-디아민, 클로로프로카인, 디에탄올아민, 에탄올아민, 피페라진, 디이소프로필아민, 트리에틸아민, 디이소프로필에틸아민 및 트리에탄올아민 염을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 뉴클레오시드간 연결의 골격을 포함하는 본원에 묘사된 폴리뉴클레오티드 구조 중 어느 하나에 대해, 이러한 폴리뉴클레오티드는 또한 임의의 적합한 염 형태를 포함할 수 있음을 이해한다. 일부 구현예에서, 뉴클레오시드간 연결의 산 형태는 단순화를 위해 묘사한다. 일부 예에서, 본 발명의 화합물의 염은 1가 양이온 염이다. 특정 예에서, 본 발명의 화합물의 염은 2가 양이온 염이다. 일부 예에서, 본 발명의 화합물의 염은 3가 양이온 염이다.
“용매화물”은 용매 분자와 용질의 분자 또는 이온의 배합에 의해 형성된 착물을 지칭된다. 용매는 유기 화합물, 무기 화합물, 또는 이 둘다의 혼합물일 수 있다. 용매의 일부 예는, 메탄올, N,N-디메틸포름아미드, 테트라하이드로푸란, 디메틸설폭시드, 및 물을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 용매가 물인 경우, 형성된 용매화물은 수화물이다.
“입체이성질체” 및 “입체이성질체”들은 동일한 원자 연결을 갖지만 공간에 있어서 상이한 원자 배열을 갖는 화합물을 지칭한다. 입체이성질체는 시스-트랜스 이성질체, E 및 Z 이성질체, 거울상이성질체, 및 부분입체이성질체를 포함한다.
“호변이성질체”는 원자의 전자 결합에서 및/또는 양성자의 위치에서만 상이한 분자의 대안적인 형태를 지칭하고, 예를 들어, 에놀-케토 및 이민-엔아민 호변이성질체, -NH-P(=S)(OH)-O- 및 -NH-P(=O)(SH)-O-, 또는 -N=C(H)-NH- 환 원자 배열을 함유하는 헤테로아릴 기의 호변이성질체 형태, 예를 들어, 피라졸, 이미다졸, 벤즈이미다졸, 트리아졸, 및 테트라졸이다. 당업계의 숙련가는 본원에 기재된 다른 호변이성질체 배열이 가능함을 인지할 것이다. 예를 들어, 하기 구조로 기재되는 폴리뉴클레오티드는:
Figure 112017088984458-pct00001

또한 연결 기의 하나의 가능한 대안적인 호변이성질체 배열을 나타내는 하기 구조를 포함함을 이해한다:
Figure 112017088984458-pct00002

여기서, “nps”는 하나의 뉴클레오시드의 3'-탄소를 인접한 뉴클레오시드의 5'-탄소로 연결하는 티오포스포르아미데이트 연결 (―NH―P(=O)(SH)―O― 또는 ― NH― P(=S)(OH)―O―)를 나타낸다. 본 발명의 화합물의 모든 호변이성질체 형태가 구조에 의해 포괄되고, 여기서, 구체적으로 나타내지 않은 경우에도 화합물의 기의 하나의 가능한 호변이성질체 배열이 기재되는 것으로 이해된다. 본 발명의 화합물의 기의 임의의 적합한 호변이성질체 배열은 화합물의 기술에 사용될 수 있다.
용어 “또는 이의 염 또는 용매화물 또는 입체이성질체”는 염, 용매화물 및 입체이성질체, 예를 들어, 본 발명의 화합물의 입체이성질체의 약제학적으로 허용가능한 염의 용매화물의 모든 치환이 포함되는 것으로 의도됨이 인식될 것이다. 용어 “또는 이의 염”은 염의 모든 치환이 포함되는 것으로 의도됨이 이해된다. 용어 “또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염”은 염의 치환이 포함되는 것으로 의도됨이 이해된다. 용어 “또는 이의 용매화물”은 용매화물의 모든 치환이 포함되는 것으로 의도됨이 이해된다. 용어 “또는 이의 입체이성질체”는 입체이성질체의 모든 치환이 포함되는 것으로 의도됨이 이해된다. 용어 “또는 이의 호변이성질체”는 호변이성질체의 모든 치환이 포함되는 것으로 의도됨이 이해된다. 따라서, 예를 들어, 당해 화합물의 입체이성질체의 호변이성질체의 약제학적으로 허용가능한 염의 호변이성질체의 용매화물이 포함되는 것으로 의도된다.
본원에 사용된 바와 같이 용어 “단리된”은 화합물이 천연에서 발생하는 것과는 상이한 환경에서 존재하는 목적하는 화합물을 기술하는 것으로 의미된다. "단리된"은 목적하는 화합물이 실질적으로 농축된 샘플 내에 존재하고/하거나 목적하는 화합물이 부분적으로 또는 실질적으로 정제된 화합물을 포함하는 것으로 의미된다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "실질적으로 정제된"은 그것의 천연 환경으로부터 제거되고 그리고 이것이 천연적으로 관련된 다른 성분로부터 적어도 60% 유리, 적어도 75% 유리, 적어도 80% 유리, 적어도 81% 유리, 적어도 82% 유리, 적어도 83% 유리, 적어도 84% 유리, 적어도 85% 유리, 적어도 86% 유리, 적어도 87% 유리, 적어도 88% 유리, 적어도 89%> 유리, 적어도 90% 유리, 적어도 91% 유리, 적어도 92% 유리, 적어도 93% 유리, 적어도 94% 유리, 적어도 95% 유리, 적어도 96% 유리, 적어도 97% 유리, 적어도 98% 유리, 적어도 99% 유리, 또는 99% 초과 유리하는 화합물을 지칭한다.
용어 “생리적 조건”은 살아 있는 세포와 혼화성인 이들 조건, 예를 들어, 살아있는 세포와 혼화성인 온도, pH, 염분, 등의 우세한 수성 조건을 포함하는 것으로 의미된다.
값의 범위가 제공된 경우, 맥락이 명확히 달리 지시하지 않는 한 하한의 단위의 열번째까지, 그 범위의 상한과 하한 및 그 지칭된 범위에서 임의의 다른 지칭된 또는 개입 값 사이에서, 각 개입 값이 본 발명 내에서 포함되는 것이 이해된다. 이들 더 작은 범위의 상한 및 하한은 더 작은 범위에서 독립적으로 포함될 수 있고 본 발명 내에 또한 포함되고, 상기 지칭된 범위에서 임의의 특이적으로 제외된 한계 처리된다. 상기 진술된 값이 제한치 중 하나 또는 둘다를 포함하는 경우, 이들 포함된 제한의 둘다를 배제하는 범위가 또한 본 발명에 포함된다.
본원 및 첨부된 특허청구범위에 사용된 단수 형태 “a,” “an,” 및 “the”는 문맥이 명백하게 다르게 지시하지 않는 한, 복수의 지시 대상을 포함한다는 것을 주시해야 한다. 청구범위가 임의의 선택적인 성분을 배제하도록 작성될 수 있다는 것이 추가로 주목된다. 이와 같이, 이러한 지칭은 청구항 요소의 지칭 또는 “부정적인” 제한의 사용과 관련하여 “단독으로,” “유일한”으로서 이러한 배타적인 용어의 사용을 위한 선행 기초로서 작용할 것이다.
용어들의 다른 정의가 명세서 전반에 걸쳐 나타날 수 있다.
상기 요약된 바와 같이, 개시의 양태는 폴리뉴클레오티드의 제조를 위한 방법을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 하기를 포함하는 제1 폴리뉴클레오티드 조성물을, 다가 양이온 염과 접촉시켜 적어도 하나의 다가 양이온 반대이온을 포함하는 제1 폴리뉴클레오티드 염을 침전시키는 단계: 7 이상의 뉴클레오시드 하부단위를 포함하는 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 (상기 뉴클레오시드 하부단위 중 적어도 2개는 N3'→P5' 티오포스포르아미데이트 하부단위간 연결에 의하여 결합됨); 및 비표적 합성 생성물 및 시약; 및 상기 접촉된 제1 폴리뉴클레오티드 조성물로부터 상기 폴리뉴클레오티드 염을 분리시켜 상기 폴리뉴클레오티드 염을 포함하는 제2 폴리뉴클레오티드 조성물을 생산하는 단계를 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 방법은 하기 단계를 추가로 포함한다: 폴리뉴클레오티드 염을, 역 상 크로마토그래피 지지체와 접촉시키는 단계; 및 상기 크로마토그래피 지지체로부터 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제3 폴리뉴클레오티드 조성물을 용출시키는 단계. 일부 경우에서, 제3 폴리뉴클레오티드 조성물은 제2 폴리뉴클레오티드 염을 포함한다. 또한, 적어도 하나의 다가 양이온 반대이온을 포함하는 폴리뉴클레오티드의 염을 포함하는 조성물이 제공된다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 다가 양이온 반대이온은 마그네슘, 아연, 알루미늄, 및 칼슘으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
다양한 구현예를 기술하기 전에, 본 발명의 교시내용이 그 기재된 특정 구현예들에 한정되지 않으며, 따라서 당연히 변경될 수 있음을 이해해야 한다. 또한, 본 발명의 범주는 첨부된 특허청구범위에 의해서만 제한되므로, 본원에서 사용된 용어는 특정 구현예만을 기술하기 위한 것이지 본 발명의 범주를 제한하려는 의도가 아니라는 것을 이해해야 한다.
본원에서 사용된 섹션 제목은 구조상의 목적만을 위한 것이며 어떤 식으로든 기술되는 발명의 주제를 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 본 발명의 교시내용이 다양한 구현예들과 관련하여 기술되고 있지만, 본 발명의 교시내용이 그러한 구현예들로 한정하려는 의도는 아니다. 오히려, 본 발명의 교시내용은 당업자에게 자명한 바와 같이 다양한 대안, 변형 및 균등물을 포함한다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용된 전체 기술 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 당해 분야의 숙련가에 의해 통상적으로 이해되는 바와 같이 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기재된 것과 유사하거나 동일한 임의의 방법 및 재료가 또한 본 발명의 실시 또는 시험에 사용될 수 있지만, 목적하는 방법 및 재료가 지금부터 기재된다. 본원에 지칭된 모든 공보는 개시내용을 참조하여 본원에 포함되고 공보가 인용된 것과 관련된 방법 및/또는 재료를 기재한다.
모든 간행물의 인용은 출원일 이전에 그 내용이 공개된 것으로 간주되는 것이며 종래 발명으로 인해 본원의 청구범위가 그러한 간행물보다 더 선행하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 또한, 제공되는 간행물의 날짜는 실제 공개 날짜와 다를 수 있으며 이는 독자적으로 확인될 수 있다.
명백하게 하기 위해 별도의 양태와 관련하여 기재된 본 발명의 특정 특징은 또한 단일 구현예와 조합하여 제공될 수 있는 것으로 이해한다. 반대로, 간결함을 위해 단일 구현예의 맥락에 기재된 본 발명의 다양한 특성은 또한 개별적으로 또는 임의의 적합한 하위-조합으로 제공될 수 있다. 본 발명에 관한 구현예의 모든 조합은 본 발명에 의해 구체적으로 포함되고, 이러한 조합은, 예를 들어, 적합한 화합물 (즉, 생물학적 활성을 위해 제조되고 단리되고 특성확인되고 시험될 수 있는 화합물)인 주요 요지를 포함하는 정도로, 각각의 모든 조합이 개별적으로 그리고 명시적으로 개시된 것처럼 본원에 개시되어 있다. 또한, 다양한 구현예 및 이의 요소의 모든 하위-조합 (예를 들어, 이러한 변수를 기술하는 구현예에 기재된 화학 기의 구현예)은 또한 구체적으로 본 발명에 의해 포함되고 각각의 모든 이러한 하위-조합이 개별적으로 그리고 명시적으로 본원에 개시된 것처럼 본원에 개시되어 있다.
본 명세서에서 지칭된 모든 특허 및 공보는 이러한 특허 및 공보 내에 개시된 모든 서열을 포함하여 참고로 명확히 편입된다.
본 발명을 추가로 기술함에 있어서, 폴리뉴클레오티드를 제조하는 방법이 먼저 보다 상세히 기재된다. 다음으로, 본 방법을 실시하기 위한 대상의 폴리뉴클레오티드 조성물이 검토된다.
제조 방법
본 개시내용의 양태는 폴리뉴클레오티드의 제조를 위한 방법을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 폴리뉴클레오티드 (예컨대, 본원에 기술된 바와 같음) 및 비표적 합성 생성물 및 제제를 포함하는 제1 폴리뉴클레오티드 조성물을, 다가 양이온 염과 접촉시켜 적어도 하나의 다가 양이온 반대이온을 포함하는 폴리뉴클레오티드 염을 침전시키는 단계를 포함한다. 본 방법을 사용하여 폴리뉴클레오티드 염의 침전은 모든 용해성 비표적 합성 생성물 및 제제의 제거를 제공한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 폴리뉴클레오티드 염을, 상기 접촉된 제1 폴리뉴클레오티드 조성물로부터 분리시켜 상기 폴리뉴클레오티드 염을 포함하는 제2 폴리뉴클레오티드 조성물을 생산하는 단계를 포함한다. 특정 구현예에서, 제1 폴리뉴클레오티드 조성물, 폴리뉴클레오티드 염 및 제2 폴리뉴클레오티드 조성물 각각은 7 이상의 뉴클레오시드 하부단위의 서열을 갖는 표적 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 여기서 상기 뉴클레오시드 하부단위 중 적어도 2개는 N3'→P5' 티오포스포르아미데이트 하부단위간 연결 (예컨대, 본원에 기술된 바와 같음)에 의하여 결합된다.
제2 폴리뉴클레오티드 조성물은 제1 폴리뉴클레오티드 조성물과 비교하여 감소된 양의 비표적 합성 생성물 및 제제를 가질 수 있다. 비표적 합성 생성물 및 제제의 감소된 양에 의해서는 제1 폴리뉴클레오티드 조성물에 비교하여 제2 폴리뉴클레오티드 조성물 내 비표적 합성 생성물 및 제제의 10중량% 이상 감소, 예컨대 15중량% 이상 감소, 20중량% 이상 감소, 25중량% 이상 감소, 30중량% 이상 감소, 35중량% 이상 감소, 40중량% 이상 감소, 45중량% 이상 감소, 50중량% 이상 감소, 55중량% 이상 감소, 60중량% 이상 감소, 65중량% 이상 감소, 70중량% 이상 감소, 75중량% 이상 감소, 80중량% 이상 감소, 85중량% 이상 감소, 90중량% 이상 감소, 또는 95중량% 이상 감소가 있다는 것이 의미된다. 이와 같이, 본 방법은 비표적 합성 생성물 및 제제에 대해 표적 폴리뉴클레오티드의 선택적 침전을 제공할 수 있다. 특정 구현예에서, 본 발명의 방법은, 유기 용매, 예컨대 니트(neat) 에탄올 또는 에탄올 용액을 사용한, 폴리뉴클레오티드 침전 방법의 대조군과 비교하여, 침전의 개선된 선택성을 제공한다 (참고: 예컨대, Crouse J, Amorese D (1987). "Ethanol Precipitation: Ammonium Acetate as an Alternative to Sodium Acetate". Focus 9 (2): 3-5). 침전의 개선된 선택성은, 대조군 조성물과 비교하여, 5 중량% 이상의 비표적 합성 생성물 및 제제가 제2 폴리뉴클레오티드 조성물로부터 제거되며, 예컨대 10 중량% 이상, 15 중량% 이상, 20 중량% 이상, 25 중량% 이상, 30 중량% 이상, 35 중량% 이상, 40 중량% 이상, 45 중량% 이상, 50 중량% 이상, 55 중량% 이상, 60 중량% 이상, 65 중량% 이상, 70 중량% 이상, 75 중량% 이상, 80 중량% 이상, 85 중량% 이상, 90 중량% 이상, 또는 95 중량% 이상의 비표적 합성 생성물 및 제제가 제거되었다는 것을 의미한다. 제1 폴리뉴클레오티드 조성물과 비교한, 비표적 합성 생성물 및 제제의 감소된 양이, 예를 들어 임의의 적합한 방법, 예를 들어 HPLC 방법을 사용하여 계측될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어들 "표적 합성 폴리뉴클레오티드" 및 "표적 폴리뉴클레오티드"는 상호교환적으로 사용되고 그리고 (예를 들면, 본 명세서에서 기재된 바와 같은) 임의의 적합한 단계적인 고체 상 폴리뉴클레오티드 합성 방법을 통해 지지체 상에서 합성된 뉴클레오티드의 특정한 요망된 서열을 가지고 그리고 폴리뉴클레오티드가 표적 폴리뉴클레오티드의 합성 전략을 실행할 목적으로 단독으로 이용된 임의의 보호기가 없는 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 이러한 보호기는 고체 상 합성의 최종 단계에서, 예를 들면, 표적 폴리뉴클레오티드를 생성하기 위해 지지체로부터 폴리뉴클레오티드의 최종 탈보호 및 절단 동안에 폴리뉴클레오티드로부터 제거될 수 있다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "비표적"은 합성의 요망된 표적 생성물이 아닌 임의의 적합한 성분, 예를 들면, 화합물, 폴리뉴클레오티드 또는 그것의 유도체, 제제, 등이나 이들의 혼합물을 지칭한다.
표적 폴리뉴클레오티드는 임의의 적합한 수의 뉴클레오시드 하부단위, 예컨대 7 내지 500 의 뉴클레오시드 하부단위, 7 내지 100 의 뉴클레오시드 하부단위, 7 내지 75 의 뉴클레오시드 하부단위, 7 내지 50 의 뉴클레오시드 하부단위, 7 내지 40 의 뉴클레오시드 하부단위, 7 내지 30 의 뉴클레오시드 하부단위, 7 내지 20 의 뉴클레오시드 하부단위, 7 내지 15 의 뉴클레오시드 하부단위, 10 내지 15 의 뉴클레오시드 하부단위, 또는 13 내지 15 의 뉴클레오시드 하부단위를 포함할 수 있다. 일부 경우에서, 표적 폴리뉴클레오티드는, 7 내지 100 뉴클레오시드 하부단위, 예컨대 7 내지 50 뉴클레오시드 하부단위, 10 내지 50 뉴클레오시드 하부단위, 10 내지 40 뉴클레오시드 하부단위, 10 내지 30 뉴클레오시드 하부단위, 10 내지 25 뉴클레오시드 하부단위, 10 내지 20 뉴클레오시드 하부단위, 12 내지 18 뉴클레오시드 하부단위, 또는 12 내지 16 뉴클레오시드 하부단위를 갖는다. 특정 경우에서, 표적 폴리뉴클레오티드는 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18,19, 20,21,22, 23,24 또는 25 뉴클레오시드 하부단위를 갖는다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "비표적 합성 생성물 및 제제"는 비제한적으로: 합성의 비표적 폴리뉴클레오티드 생성물, 예컨대 절단된 폴리뉴클레오티드, 캡핑된 폴리뉴클레오티드 단편(즉, 결함이 있는 하부단위 커플링 후 캡핑된 서열), 결실(들)(즉, 예를 들면, 본 명세서에서 기재된 바와 같은 1종 이상의 표적 뉴클레오시드 단량체 또는 이량체를 누락하는 것)을 포함하는 폴리뉴클레오티드 및 유도된 폴리뉴클레오티드(예를 들면, 합성 또는 절단 동안 바람직하지 않은 부반응을 당한 폴리뉴클레오티드 서열); 및 제제 예컨대 절단된 링커, 탈보호의 생성물, 예를 들면, 제거된 보호기 생성물 예컨대 아인산 보호기 생성물 및 염기 보호기 생성물(예를 들면, 고리외 아민 보호기 생성물), 절단 시약 및/또는 절단 포착제 및 잔류 합성 시약, 예컨대 단량체, 이량체, 커플링, 캡핑 또는 탈보호 시약을 포함하는, 고체 상 폴리뉴클레오티드 합성의 조물질 합성 생성물에 존재할 수 있는 다양한 비표적 성분을 집합적으로 지칭한다.
특정 구현예에서, 본 방법은 6 뉴클레오시드 하부단위 또는 그 미만, 예컨대 5 또는 그 미만, 4 또는 그 미만, 3 또는 그 미만 또는 2 뉴클레오시드 하부단위를 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 비표적 합성 생성물 및 제제에 대해 표적 폴리뉴클레오티드의 선택적 침전을 제공한다. 특정 경우에, 폴리뉴클레오티드가 아닌 모든 비표적 합성 생성물 및 제제는 본 방법의 선택적 침전 단계 동안 용해성으로 남아 있고 따라서 수득한 폴리뉴클레오티드 염 침전물로부터 쉽게 제거될 수 있다.
본 방법은 몇 개의 바람직한 특성, 예컨대 비표적 합성 생성물 및 제제(예를 들면, 합성 시약, 절단 시약, 포착제, 제거된 보호기, 절단 부산물(링커, 캡핑 기, 등), 및 작은 폴리뉴클레오티드 단편)의 감소된 양을 가지는 폴리뉴클레오티드 조성물을 생성하기 위해 조물질 합성 제제로부터 표적 폴리뉴클레오티드의 침전 및 분리를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 본 방법은 크로마토그래피 정제 전에 다가 양이온 염으로서 조물질 합성 제제로부터 폴리뉴클레오티드를 침전시키는 것을 포함한다. 특정 경우에서, 본 발명의 방법은 표적 폴리뉴클레오티드의 정제 방법이다. 다가 양이온 염을 사용한, 조 폴리뉴클레오티드 조성물의 침전은 적어도 하나의 다가 양이온 반대이온을 포함하는 폴리뉴클레오티드 염 침전물을 생산한다. 일부 경우에서, 폴리뉴클레오티드 염 침전물은, 다중음이온성 폴리뉴클레오티드 골격과 이온 쌍을 형성하는 1가 및 다가 양이온 반대이온의 혼합물을 포함한다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 폴리뉴클레오티드에 관하여 사용될 때 용어들 "다가 양이온 염" 및 "다가 염"은 폴리뉴클레오티드 골격의 음이온성 하부단위간 연결 기에 쌍으로 된 이온인 적어도 하나의 다가 양이온 반대이온을 포함하는 폴리뉴클레오티드 염을 지칭하기 위해 상호교환적으로 사용된다. 일부 사례에서, 폴리뉴클레오티드의 다가 양이온 염은 1가 및 다가 양이온의 혼합물을 포함한다. 일부 구현예에서, 다가 양이온은, 2이상의 폴리뉴클레오티드 골격의 음이온성 하부단위간 연결 기로의 이온 쌍형성에 의한, 표적 폴리뉴클레오티드의 응집을 제공할 수 있다. 특정 사례에서, 2가 양이온은 두 개의 상이한 폴리뉴클레오티드와 쌍을 이루어 이량체를 형성한다. 일부 경우에서, 폴리뉴클레오티드의 추가적 응집은 추가의 다가 양이온에 의해 매개된 추가의 다가 상호작용에 의해 달성될 수 있다. 이와 같이, 일부 경우에서, 본 방법은 비표적 합성 생성물 및 제제에 대해 표적 폴리뉴클레오티드의 선택적 응집 및 침전을 제공할 수 있다.
상기 방법의 일부 구현예에서, 적어도 하나의 다가 양이온 반대이온은 2가이다. 특정 구현예에서, 적어도 하나의 다가 양이온 반대이온은 마그네슘, 아연, 및 칼슘으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 다가 양이온 반대이온은 3가이다. 특정 구현예에서, 적어도 하나의 다가 양이온 반대이온은 알루미늄이다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드 염은 추가로 1가 양이온 반대이온을 포함한다. 상기 경우에서, 폴리뉴클레오티드 염은 혼합 염, 예컨대, 2 이상의 상이한 양이온 반대이온을 포함하는 염이다.
폴리뉴클레오티드 침전의 임의의 적합한 방법은 본 발명의 방법에서 용도를 발견할 수 있다. 제1 폴리뉴클레오티드 조성물을 다가 양이온 염과 접촉시켜 적어도 하나의 다가 양이온 반대이온을 포함하는 폴리뉴클레오티드 염을 침전시키는 단계는 임의의 적합한 방법을 사용하여 달성될 수 있다. (예를 들면, 본 명세서에서 기재된 바와 같이) 임의의 적합한 다가 양이온 및 그것 염이 침전물을 생성하기 위해 접촉 단계에서 이용될 수 있다. 특정 경우에서, 적어도 하나의 다가 양이온 반대이온을 포함하는 폴리뉴클레오티드의 염은, 용액 단계에서, 예컨대, 폴리뉴클레오티드를 포함하는 용액으로의 다가 양이온 염의 부가를 통하여, 생산된다. 일단 다가 양이온 염이 용액에 첨가되면 침전이 그런 다음 형성될 수 있다. 일부 경우에서, 적어도 하나의 다가 양이온 반대이온을 포함하는 폴리뉴클레오티드의 염은 이온 교환 지지체 상에서 형성될 수 있다. 임의의 적합한 이온 교환 지지체가 접촉 단계에서 이용될 수 있다. 일부 경우에서, 이온 교환 지지체는 강한 양이온교환수지이다. 본 방법의 일부 구현예에서, 접촉 단계는 다가 양이온 반대이온을 포함하는 양이온 교환 지지체로부터 제1 폴리뉴클레오티드 조성물을 용출하는 것을 포함한다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "양이온 교환 지지체"는 자체로 음이온성이고 그리고 대상의 다가 양이온과 같은 양이온성 분석물과 이온쌍을 이룰 수 있는 지지체를 지칭한다. 임의의 적합한 용출액이 양이온 교환 지지체로부터 용출하는 단계에 이용될 수 있다. 일부 사례에서, 침전물은 폴리뉴클레오티드 염이 양이온 교환 지지체로부터 용출되어 진 후 용출물에서 형성된다.
본 방법은 표적 합성 폴리뉴클레오티드의 임의의 적합한 조물질 합성 제제에 대해 수행될 수 있다. 일부 사례에서, 제1 폴리뉴클레오티드 조성물은 표적 합성 폴리뉴클레오티드의 조물질 합성 제제이다. 특정 구현예에서, 제1 폴리뉴클레오티드 조성물은, 합성 후, 지지체 유래의 표적 폴리뉴클레오티드의 절단 생성물인 조성물이다. 이와 같이, 제1 폴리뉴클레오티드 조성물은 다양한 비표적 합성 생성물 및 제제를 포함할 수 있다. 본 방법은 용액에 잔존하고 따라서 수득한 침전물로부터 쉽게 제거될 수 있는, 비표적 합성 생성물 및 제제에 대해 폴리뉴클레오티드 염의 선택적 침전을 제공한다.
표적 폴리뉴클레오티드를 합성하기 위해 (예를 들면, 본 명세서에서 기재된 바와 같이) 합성의 임의의 적합한 방법이 이용될 수 있다. 합성에 이어서, 표적 폴리뉴클레오티드는 단계적인 합성이 수행된 지지체로부터 절단된다. 절단에 이어서, 바람직하지 않은 합성 및 절단 시약을 제거하고 그리고 비표적 폴리뉴클레오티드 단편, 및 그것의 유도체를 제거하기 위해 전장 표적 폴리뉴클레오티드가 정제될 수 있다. 적어도 하나의 다가 양이온 반대이온을 포함하는 폴리뉴클레오티드 염의 침전을 포함하는 본 방법은 합성 후 그리고 역 상 크로마토그래피 정제 전과 같이, 표적 폴리뉴클레오티드의 제조의 임의의 적합한 단계에서 수행될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어들 "조물질 합성 제제", "조물질 조성물" 및 "조물질 폴리뉴클레오티드"는 합성 후 고체 상 합성 지지체로부터 절단을 통해 수집된 고체 상 폴리뉴클레오티드 합성의 합성 생성물을 포함하는 조성물을 지칭하고, 여기서 본 조성물은 비정제되었고, 즉, 크로마토그래피 정제가 조성물에 대해 수행되지 않았다. 크로마토그래피 정제는 크로마토그래피 지지체로의 표적 폴리뉴클레오티드의 흡착 및 비표적 폴리뉴클레오티드로부터의 표적 폴리뉴클레오티드의 후속적 용출 및 분해를 포함하는 임의의 적합한 정제 방법을 지칭한다. 일부 경우에, 크로마토그래피 정제는 역 상 크로마토그래피 정제를 지칭한다.
일부 구현예에서, 본 방법은 추가로 제1 폴리뉴클레오티드 조성물을 제공하는 것을 포함하고, 여기서 본 조성물은 고체 상 합성 지지체로부터 합성후 절단을 통해 생산된다. 본 방법에서 수득한 조성물을 이용하기 전에, 임의의 적합한 추가의 단계 예컨대 증발, 희석, 또는 농축 단계가 또한 조물질 합성 제제에 대해 수행될 수 있다. 일부 사례에서, 본 방법은 추가로 (예를 들면, 본 명세서에서 기재된 바와 같이 고체 상 합성 지지체 상에서) 표적 폴리뉴클레오티드를 합성하는 것을 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 방법은 제1 폴리뉴클레오티드 조성물을 생산하기 위해 지지체로부터 폴리뉴클레오티드를 절단하는 단계를 추가로 포함한다.
폴리뉴클레오티드 염을 포함하는 고형 침전물은 임의의 적합한 방법을 사용하여 다가 염과 접촉된 제1 폴리뉴클레오티드 조성물(즉, 접촉된 제1 폴리뉴클레오티드 조성물)로부터 분리될 수 있다. 대상의 분리 방법은, 비제한적으로, 원심분리, 여과, 디캔팅, 및 기타 동종의 것을 포함한다.
일부 경우에서, 폴리뉴클레오티드 염을 포함하는 침전물의 분리는 원심분리에 의하여 달성되며, 여기서 예컨대, 원심분리기 내 접촉된 제1 폴리뉴클레오티드 조성물로의 원심력의 적용은 예컨대, 용기 최하부에서, 침전물이 펠렛을 형성하도록 한다. 원심분리를 통한 펠렛의 형성은 침전물을 회전시키는 것으로 지칭될 수 있다. 상기 방법의 특정 구현예에서, 분리 단계는 접촉된 제1 폴리뉴클레오티드 조성물을 원심분리하여 폴리뉴클레오티드 염 침전물을 스핀 다운(spin down)하는 것을 포함한다. 상청액 액체는 그런 다음 침전물을 방해하지 않고 튜브로부터 경사 분리될 수 있거나, 예를 들면 파스퇴르 피펫으로 용기로부터 배출될 수 있다. 원심분리 과정은 세정액으로 반복될 수 있다.
일부 경우에서, 폴리뉴클레오티드 염을 포함하는 침전물의 분리는 여과에 의해 달성된다. 본 발명의 일부 구현예에서, 분리 단계는 접촉된 제1 폴리뉴클레오티드로부터 폴리뉴클레오티드 염을 여과하는 것을 포함한다. 임의의 적합한 여과 및 여과 배지는 본 발명의 방법에 사용될 수 있다. 특정 경우에, 분리는 표적 폴리뉴클레오티드에 따라 선택된 여과 배지를 사용하여 심층 여과에 의해 달성된다.
일부 구현예에서, 상기 방법은 하기를 포함한다: 7 이상의 뉴클레오시드 하부단위의 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 (상기 뉴클레오시드 하부단위 중 적어도 2개는 N3'→P5' 티오포스포르아미데이트 하부단위간 연결에 의하여 결합됨); 및 비표적 합성 생성물 및 제제를 포함하는 제1 폴리뉴클레오티드 염 조성물을,
다가 양이온 염과 접촉시켜, 적어도 하나의 다가 양이온 반대이온을 포함하는 제1 폴리뉴클레오티드 염을 침전시키는 단계;
제1 폴리뉴클레오티드 염을, 상기 접촉된 제1 폴리뉴클레오티드 조성물로부터 분리시켜 상기 폴리뉴클레오티드 염을 포함하는 제2 폴리뉴클레오티드 조성물을 생산하는 단계.
상기 접촉된 제1 폴리뉴클레오티드 조성물로부터 침전물을 분리시키는 것은 제1 폴리뉴클레오티드 염을 포함하는 제2 폴리뉴클레오티드 조성물을 생산한다. 일부 경우에서, 본 발명의 방법을 통한 다가 양이온 염을 사용한 제1 폴리뉴클레오티드 염의 선택적 침전은 비표적 합성 생성물 및 제제의 감소된 양을 포함하는 제2 폴리뉴클레오티드 조성물을 생산한다.
선택적 침전 후, 그런 다음 상기 대상체 폴리뉴클레오티드 염은 (예를 들면, 본 명세서에서 기재된 바와 같이) 폴리뉴클레오티드로부터 떨어진 적어도 하나의 다가 양이온 반대이온의 양이온 교환 및 대상의 또 다른 양이온 반대이온으로 대체함에 의해 용해성 폴리뉴클레오티드 염으로 전환될 수 있다. 상기와 같이, 본 발명의 방법은 적어도 하나의 다가 양이온 반대이온을 포함하는 제1 폴리뉴클레오티드 염의 가역적 형성을 제공한다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어들 "가역적 형성" 및 "가역적 교환"은 상호교환적으로 사용되고 그리고, (예를 들면, 본 명세서에서 기재된 바와 같이) 예를 들면 선택적 침전에 의한 폴리뉴클레오티드 염의 제조를 지칭하며, 여기서 형성된 염은 또한 그 뒤에 해리될 수 있어 염으로부터 적어도 하나의 다가 양이온 염을 교환해 버릴 수 있다. 일부 경우에서, 임의의 용매에 불용성인 폴리뉴클레오티드 염은 비가역적으로 형성된 염으로 지칭될 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 방법은, 제1 폴리뉴클레오티드 염으로부터 적어도 하나의 다가 양이온 반대이온을 교환하여 가용성 제2 폴리뉴클레오티드 염을 생산하는 단계를 포함하며, 여기서 상기 교환은 다가 양이온 반대이온의 해리 및 관심 가용성 염 양이온과의 이온 쌍형성을 포함한다. 특정 경우에서, 가용성 제2 폴리뉴클레오티드 염은 1가 염이다. 특정 경우에서, 가용성 제2 폴리뉴클레오티드 염은 나트륨 염이다. 특정 경우에서, 가용성 제2 폴리뉴클레오티드 염은 트리에틸암모늄 염이다. 일부 사례에서, 제1 및 제2 폴리뉴클레오티드는 서로 상이하다, 즉, 상이한 양이온 반대이온을 포함한다. 본 대상 폴리뉴클레오티드 염의 해리 및 적어도 하나의 다가 양이온 반대이온의 교환은 임의의 적합한 방법을 사용하여 달성될 수 있다. 특정 사례에서, 해리는 예를 들면, 본 명세서에서 기재된 바와 같이, 역 상 크로마토그래피를 사용하여 달성된다. 일부 경우에서, 해리를 달성하기 위해 이온 교환 크로마토그래피가 이용될 수 있다. 특정 구현예에서, 제1 폴리뉴클레오티드 염의 해리는 관심 양이온 반대이온을 포함하는 용매 내 염의 용해에 의하여 달성된다.
분리 후, 추가적 정제 단계가 제2 폴리뉴클레오티드 조성물에 대해 수행될 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 하기 단계를 추가로 포함한다: 제1 폴리뉴클레오티드 염을, 역 상 크로마토그래피 지지체와 접촉시키는 단계; 및 상기 크로마토그래피 지지체로부터 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제3 폴리뉴클레오티드 조성물을 용출시키는 단계. 특정 구현예에서, 제3 폴리뉴클레오티드 조성물은 제2 폴리뉴클레오티드 염을 포함한다. 임의의 적합한 역 상 크로마토그래피 방법이 폴리뉴클레오티드 염을 정제하기 위해 이용될 수 있다. 대상의 역 상 크로마토그래피 방법 및 지지체는, 비제한적으로, 이온-쌍 역전된- 상 크로마토그래피, C18 역전된-상 크로마토그래피를 사용한 크로마토그래피 정제를 포함하고 그리고 이들 방법 및 지지체는 문헌 [Chen et al., Journal of Chromatography A, Volume 1288, 3 May 2013, Pages 73-81; and Zimmermann et al., Journal of Chromatography A, Volume 1354, 8 August 2014, Pages 43-55]에 기재된다. 일부 구현예에서, 제2 폴리뉴클레오티드 조성물은 역 상 크로마토그래피 지지체 상에 직접적으로 부하된다. 지지체 상에 직접적으로 부하된다는 것은, 본 발명의 방법을 사용하여 생산된 제2 폴리뉴클레오티드 조성물이 직접적으로, 예컨대 단리 고형 침전물로서, 역 상 크로마토그래피 지지체에 첨가된다는 것을 의미한다. 일부 사례에서, 역 상 크로마토그래피 지지체는 칼럼으로 구성된 수지이고 폴리뉴클레오티드 조성물은 수지 층의 최상부에 첨가된다. 특정 구현예에서, 상기 방법은 용액 내에서 제2 폴리뉴클레오티드 조성물을 용해시키는 단계를 추가로 포함한다. 비제한적으로, 수성 완충액, 물과 혼화성인 유기 용매 및 이들의 혼합물을 포함하는 임의의 적합한 용매가 이용될 수 있다. 그와 같은 경우에, 제2 폴리뉴클레오티드 조성물의 용액이 용출 전에 지지체에 폴리뉴클레오티드를 흡착하기 위해 역 상 크로마토그래피 지지체와 접촉될 수 있다.
일부 경우에서, 접촉은 역 상 크로마토그래피 지지체 상에 폴리뉴클레오티드를 흡착하는 것과 그 뒤에 폴리뉴클레오티드를 용출하는 것을 포함하여 조성물 내에 존재하는 비표적 폴리뉴클레오티드 및 잔류 합성 제제로부터 표적 폴리뉴클레오티드의 크로마토그래피 분해능을 제공한다. 표적 폴리뉴클레오티드를 함유하는 용출액이 수집된다. 임의의 적합한 용출액이 역 상 크로마토그래피 지지체로부터 폴리뉴클레오티드를 용출하기 위해 이용될 수 있다. 용출액은 다양한 인자, 예컨대 역 상 크로마토그래피 지지체의 특성, 표적 올리고뉴클레오티드, 표적 폴리뉴클레오티드의 특정한 요망된 염, 등에 따라 선택될 수 있다. 일부 사례에서, 제1 폴리뉴클레오티드 염의 적어도 하나의 다가 양이온 반대이온은 용출액에 포함된 대상의 또 다른 상이한 양이온 반대이온과 역 상 크로마토그래피 지지체 상에서 교환된 이온이다. 그와 같은 경우에, 폴리뉴클레오티드가 역 상 크로마토그래피 지지체로부터 용출될 때, 이것은 적어도 하나의 다가 양이온 반대이온이 폴리뉴클레오티드로부터 벗어나 교환되어 지기 때문에 이것이 부하될 때의 것과 상이한 염 형태(즉, 제2 폴리뉴클레오티드 염)이다. 특정 경우에서, 제3 폴리뉴클레오티드 조성물 내 지지체로부터 용출된 폴리뉴클레오티드의 염 형태는 적어도 하나의 다가 양이온 반대이온을 포함하는 제1 폴리뉴클레오티드 염보다 더욱 수용성이다.
특정 구현예에서, 제3 폴리뉴클레오티드 조성물은 폴리뉴클레오티드의 약제학적으로 허용가능한 염인 제2 폴리뉴클레오티드 염을 포함한다. 특정 경우에서, 제3 조성물은 폴리뉴클레오티드의 1가 양이온 염인 제2 폴리뉴클레오티드 염을 포함한다. 특정 경우에서, 제3 조성물은 폴리뉴클레오티드의 트리에틸암모늄 염인 제2 폴리뉴클레오티드 염을 포함한다. 특정 경우에서, 제3 조성물은 폴리뉴클레오티드의 나트륨 염인 제2 폴리뉴클레오티드 염을 포함한다. 폴리뉴클레오티드는 역 상 크로마토그래피에 의해 정제된 후, 임의의 수의 추가적인 양이온 반대이온 교환 단계가 폴리뉴클레오티드의 요망된 염 형태를 생성하기 위해 폴리뉴클레오티드 염 상에서 수행될 수 있다는 것이 이해되어 진다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 제3 폴리뉴클레오티드 조성물을 생산하기 위해 제2 폴리뉴클레오티드 염으로부터 양이온 반대이온을 이온 교환하는 단계를 추가로 포함한다. 특정 구현예에서, 제3 폴리뉴클레오티드 염은 폴리뉴클레오티드의 약제학적으로 허용가능한 염이다. 특정 경우에서, 제3 폴리뉴클레오티드 염은 폴리뉴클레오티드의 1가 양이온 염이다. 특정 사례에서, 제3 폴리뉴클레오티드 염은 (예를 들면, 본 명세서에서 기재된 바와 같이) 폴리뉴클레오티드의 나트륨 염이다.
특정 경우에서, 제1 조성물은 폴리뉴클레오티드의 1가 양이온 염을 포함한다. 특정 경우에, 1가 양이온 염은 나트륨, 암모늄 및 알킬 암모늄으로 구성된 군으로부터 선택된다. 특정 사례에서, 알킬 암모늄은 디메틸암모늄, 메틸암모늄, 에틸암모늄 및 트리에틸암모늄으로 구성된 군으로부터 선택된다. 특정 경우에서, 제1 조성물은 폴리뉴클레오티드의 암모늄 염을 포함한다. 특정 경우에서, 제1 조성물은 폴리뉴클레오티드의 알킬 암모늄 염을 포함한다. 특정 경우에서, 제1 조성물은 폴리뉴클레오티드의 트리에틸암모늄 염을 포함한다. 특정 경우에서, 제1 조성물은 폴리뉴클레오티드의 나트륨 염을 포함한다. 제1 폴리뉴클레오티드 조성물은 다가 양이온 염과 접촉하여, 적어도 하나의 다가 양이온 반대이온을 포함하는 제1 폴리뉴클레오티드 염을 침전시킬 수 있다. 상기와 같이, 특정 구현예에서, 상기 접촉된 제1 폴리뉴클레오티드 조성물은 적어도 하나의 다가 양이온 반대이온을 포함하는 제1 폴리뉴클레오티드 염을 포함한다.
폴리뉴클레오티드가 본 명세서에서 기재된 바와 같은 것인 방법 중 임의의 상기-표시된 구현예의 구현예가 본 발명의 범위 내에 포함되는 것으로 간주된다.
합성 방법
본 제조 방법에서 사용이 밝혀진 조물질 합성 생성물 폴리뉴클레오티드 조성물을 제조하기 위해 임의의 적합한 폴리뉴클레오티드 합성 방법, 전략 및 화학물질이 이용될 수 있다. 본원 발명의 방법에 사용하기 위해 채택될 수 있는 목적하는 폴리뉴클레오티드 합성 화학반응 및 방법은 포스포르아미다이트, H-포스포네이트, 포스포디에스테르, 포스포트리에스테르, 포스파이트 트리에스테르를 비제한적으로 포함한다. 본원 발명의 화합물의 폴리뉴클레오티드 성분들은 선택된 화학반응 유형을 위한 임의의 통상적인 프로토콜을 채택함에 의해 합성될 수 있다. N3'→P5' 티오포스포르아미데이트 화학물질을 갖는 올리고뉴클레오티드의 합성을 위한 대상의 방법은, 비제한적으로, U.S. 5,824,793, 문헌 [McCurdy et al., (1997) Tetrahedron Letters, 38:207-210]; 문헌 [Pongracz & Gryaznov, (1999) Tetrahedron Letters, 49:7661-7664]; US 6,835,826, US 7,494,982, US 7,485,717 및 US 5,684,143에 기재된 이들 방법을 포함한다.
일부 경우에서, 관심 폴리뉴클레오티드는 표적 폴리뉴클레오티드 서열의 5’-말단으로부터 개시하여 3'-말단으로 진행하는 연속적 커플링을 통하여 합성된다. 특정 경우에서, 관심 폴리뉴클레오티드는 표적 폴리뉴클레오티드 서열의 3’-말단으로부터 개시하여 5'-말단으로 진행하는 연속적 커플링을 통하여 제조된다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 폴리뉴클레오티드의 성장하는 말단에 단량체 포스포르아미다이트의 순차적인 커플링에 의해 합성된다. 상기 5’-말단 뉴클레오시드 하부단위는 임의의 연결기 또는 5'-말단기를 통해 임의의 적합한 고형 지지체에 부착될 수 있다. 일단 제1 하부단위가 고형 지지체에 부착되면, 상기 하부단위는 유리된 고정화된 3'-말단 기를 생성하기 위해 탈보호될 수 있다. 그런 다음, 성장하는 올리고뉴클레오티드 사슬에 대한 하부단위 커플링이 달성될 수 있다. 일부 경우에, 상기 방법은 지지체 결합된 3'-말단 기를 3'-보호된-뉴클레오티드-5'-포스포르아미다이트 단량체와 커플링시키는 단계를 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 3’-말단 기는 3’-하이드록실 기이다. 특정 구현예에서, 상기 3’-말단 기는 3’-아미노 기이다.
일부 경우에서, 폴리뉴클레오티드 합성 방법은 하기의 단계를 포함한다: (a) 고형상 지지체에 부착된 말단 뉴클레오시드의 보호된 3’ 아미노 기를 탈보호하여 유리된 3’ 아미노 기를 형성하는 단계; (b) 3’ 아미노 기를 친핵성 촉매의 존재하에 3’-보호된 아미노뉴클레오시드-5’-포스포르아미다이트 단량체와 접촉시켜 뉴클레오시드간 N3'→P5’ 포스포르아미다이트 연결을 형성하는 단계; 및 (c) 상기 연결을 산화시켜 N3'→P5’' 티오포스포르아미데이트 연결을 생산하는 단계. 일부 구현예에서, 이 방법은 폴리뉴클레오티드가 합성이 될 때까지 (d) 단계 (a) 내지 (c)를 반복하는 것을 포함한다.
일부 경우에서, 상기 방법은 지지체 결합된 3'-말단 기를 3'-보호된-디뉴클레오티드-5'-포스포르아미다이트 이량체와 커플링시키는 단계를 포함한다. 대상의 폴리뉴클레오티드 합성 방법은, 비제한적으로, 그 출원이 미국 가출원 시리즈 번호 61/987,396의 이점을 주장을 주장하는 PCT 공개 번호 WO2015/168310에 기재된 바와 같은 디뉴클레오티드 이량체의 적어도 하나의 커플링을 포함하는 고체 상 합성의 이들 방법을 포함한다. 표적 폴리뉴클레오티드 서열은 이량체 및 단량체 하부단위 둘 다를 연장하는 올리고뉴클레오티드 쇄의 3' 말단 기로 연속적으로 커플링시킴을 포함하는 레트로합성 전략을 통하여 합성될 수 있다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는, 디뉴클레오티드 이량체의 연장하는 폴리뉴클레오티드 쇄의 유리된 3' 말단 기로의 적어도 하나의 커플링 단계를 포함하는 방법을 사용하여 합성된다.
일부 경우에서, 폴리뉴클레오티드 합성 방법은 하기의 단계를 포함한다: (a) 고형상 지지체에 부착된 말단 뉴클레오시드의 보호된 3’ 아미노 기를 탈보호하여 유리된 3’ 아미노 기를 형성하는 단계; (b) 3’ 아미노 기를 친핵성 촉매의 존재하에 3’-보호된 아미노-디뉴클레오티드 티오포스포르아미데이트 또는 포스포르아미다이트-5'- 포스포르아미다이트 이량체와 접촉시켜 뉴클레오시드간 N3'→P5’ 포스포르아미다이트 연결을 형성하는 단계; 및 (c) 상기 연결을 산화시켜 N3'→P5’' 티오포스포르아미데이트 연결을 생산하는 단계. 일부 구현예에서, 이 방법은 폴리뉴클레오티드가 합성이 될 때까지 (d) 단계 (a) 내지 (c)를 반복하는 것을 포함하며, 여기서 단계 (b)에서는 3'- 보호된 아미노-디뉴클레오티드 티오포스포르아미데이트-5'-포스포르아미다이트 이량체 또는 3'- 보호된 아미노-뉴클레오티드-5'-포스포르아미다이트 단량체가 이용될 수 있다.
임의의 적합한 보호기 전략은 폴리뉴클레오티드의 염기, 포스포르아미다이트, 포스포르아미데이트, 5', 2' 및/또는 3' 기를 보호하기 위한 본원 발명의 방법에 사용될 수 있다. 목적하는 보호기는 하기 문헌에 기재된 보호기들을 포함하지만 이에 제한되지 않는다: Ohkubo et al., Org. Lett., 2010, 12 (11), pp 2496-2499; and Beaucage and Iyer, Tetrahedron 48: 2223-2311 (1992).
본원에 사용된 바와 같은 용어 “포스페이트 보호기”은 올리고뉴클레오티드의 인-함유 하부단위간 연결에 부착될 수 있는 보호기를 지칭한다. 존재하는 경우, 포스페이트 보호기는 포스페이트 보호기가 부착된 인-함유 연결의 반응을 방지(즉, 차단)할 수 있다. 임의의 적합한 인-함유 하부단위간 연결 (예컨대, P(III) 및 P(V) 연결)은 포스포르아미다이트, 옥소포스포르아미데이트, 티오포스포르아미데이트, 포스페이트 에스테르, 티오포스페이트 에스테르, 포스포디에스테르 연결 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는 본원 발명의 포스페이트 보호기에 의해 보호될 수 있다. 상기 포스페이트 보호기는 인-함유 하부단위간 연결의 가용한 산소 원자에 부착될 수 있다. 임의의 적합한 보호기는 포스페이트 보호기으로서 사용될 수 있다. 특정 구현예에서, 포스페이트 보호기는 메틸, 또는 β-시아노에틸이다.
일부 경우에서, 연장하는 폴리뉴클레오티드 쇄의 3’-말단 기는 3’-하이드록실, 3’-아미노 기 또는 이의 보호된 버젼을 포함할 수 있다. 임의의 적합한 하이드록실 및/또는 아미노 보호기는 폴리뉴클레오티드 합성 동안에 3'-말단 기에 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 3’말단 기는 보호된 3’-아미노 기이고 상기 방법은 보호기를 탈보호하거나 제거하여 유리된 3' 아미노 기를 생성시킴을 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이, "유리된 아미노 기"은 입수 단량체 또는 이량체의 포스포르아미다이트 기와 반응시키기 위해 가용한 아미노 기를 의미한다. 일부 구현예에서, 유리된 아미노 기는 1급 아민이다. 탈보호 (예를 들어, 탈트리틸화) 단계 후, 상기 아미노 기는 염 (예를 들어, 탈트리틸화를 위해 사용되는 산의 짝염기 염)의 형태로 존재할 수 있다.
상기 염은 임의로 염기성 용액, 예를 들어, 탈트리틸화 단계 후 아세토니트릴 중 2% 트리에틸아민 또는 피리딘으로 중화될 수 있다.
입수 하부단위 포스포르아미다이트의 3’-보호는 쇄의 목적하지 않은 중합을 방지한다. 일부 구현예에서, 상기 3’-말단 기는 보호된 3’-하이드록실 기이고 상기 방법은 보호기를 탈보호하거나 제거하여 유리된 3'-하이드록실 기를 생성시킴을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 3’-말단 기는 보호된 3'-아미노 기이고 상기 방법은 상기 보호기를 탈보호하거나 제거하여 유리된 3'-아미노 기를 생성시킴을 포함한다. 상기 보호된 3’-아미노 또는 3’-하이드록실 기는 트리틸 보호기으로 보호될 수 있다. 특정 구현예에서, 트리틸 보호기는 트리페닐메틸 (Tr 또는 Trt, Ph3C-)이다. 특정 구현예에서, 트리틸 보호기는 4,4’- 디메톡시트리틸 (DMT)이다. 3'-말단 아미노 또는 하이드록실 기의 탈보호는 임의의 적합한 방법을 사용하여 성취될 수 있다. 목적하는 방법은 하기 문헌에 기재된 방법들을 포함하지만 이에 제한되지 않는다:Beaucage and Iyer, Tetrahedron 48: 2223-2311 (1992). 일부 경우에, 말단 뉴클레오시드의 보호된 3' 아미노 기의 탈보호는 유리된 3' 말단 기를 생성하기 위한 탈트리틸화, 예를 들어, 산-촉매된 탈트리틸화를 포함한다. 일부 경우에서, 상기 이량체 또는 단량체 하부단위 포스포르아미다이트는 고형 지지체에 부착된 말단 뉴클레오시드의 3' 말단 기와 동일한 보호된 3'-하이드록실 또는 3'-아미노 기를 포함한다.
임의의 적합한 고체 상 지지체는 본 방법에 따른 폴리뉴클레오티드의 합성에 사용될 수 있다. 대상의 고형 지지체는, 비제한적으로, 제어된 기공 유리(CPG), 고도로 교차-연결된 폴리스티렌(예를 들면, NittoPhase HL 400 또는 GE 프라이머 350), 아크릴 공중합체, 셀룰로오스, 나일론, 덱스트란, 라텍스, 폴리아크롤레인, 및 기타 동종의 것, 예컨대 하기 예시적인 참조에 개시된 것들로 제작된 극미립자를 포함한다: Meth. Enzymol., Section A, pages 11-147, vol.44 (Academic Press, New York, 1976); 미국 특허 번호 4,678,814; 4,413,070; 및 4,046;720; 및 Pon, Chapter 19, in Agrawal, editor, Methods in Molecular Biology, Vol.20, (Humana Press, Totowa, N.J., 1993). 대상의 추가의 고형 지지체는 폴리스티렌 비드; 폴리에틸렌 글리콜로 그라프팅된 폴리스티렌(예를 들면, 독일 튀빙겐 소재의 랩 폴리머레 사의 TentaGel™); 등을 포함한다. 물질, 공극율, 크기, 형태 등과 같은 지지체 특성 및 사용되는 연결 모이어티 유형의 선택은 사용되는 보호기, 최종 생성물의 길이, 최종 생성물의 양 등과 같은 다양한 인자에 의존한다. 예시적 연결 모이어티는 하기에 개시된다: Pon et al., Biotechniques, 6:768-775 (1988); Webb , 미국 특허 번호 4,659,774; Barany et al., 국제 특허 출원 PCT/US91/06103; Brown et al., J. Chem. Soc. Commun., 1989: 891-893; Damha et al., Nucleic Acids Research, 18: 3813-3821(1990); Beattie et al., Clinical Chemistry, 39: 719-722 (1993); Maskos and Southern, Nucleic Acids Research, 20: 1679-1684 (1992); 등.
일부 구현예에서, 본원 발명의 방법에 사용되는 고형 지지체는 폴리에틸렌 글리콜과 그래프팅되고 말단 아미노 기 (예를 들어, TentaGel-NH2 ™, Rapp Polymere, Tubingen Germany)를 가공하는 CPG 및 폴리스티렌을 포함한다. 상기 아미노프로필 기는 CPG와 뉴클레오시드 연결 간의 스페이서로서 사용될 수 있다. 일부 경우에, 제1 뉴클레오시드의 5'-하이드록실로의 연결은 수성 암모니아를 사용한 합성 후 절단될 수 있는 염기-불안정 에스테르 연결을 제공하는 석신일 기이다.
탈보호 후, 지지체-결합된 뉴클레오시드는 이량체 또는 단량체 하부단위 포스포르아미다이트와 반응하여 뉴클레오시드간 연결을 형성할 수 있다. 지지체-결합된 뉴클레오시드는 고형 지지체에 부착된 단일 잔기를 지칭할 수 있거나 상기 지지체에 부착된 올리고뉴클레오티드 쇄의 말단 잔기를 지칭할 수 있는 것으로 이해된다. 임의의 적합한 커플링 화학반응, 커플링 시약 및 방법은 본원 발명의 방법에 사용될 수 있다. 본원 발명의 방법과 관련하여 커플링 조건, 보호기, 고형상 지지체, 연결 기, 탈보호 시약, 고형상 지지체로부터 생성물을 절단하기 위한 시약, 생성물의 정제 등에 관한 적합한 선택은 하기에 따라 본 발명의 방법 내의 맥락에서 제조될 수 있다: 예를 들어, Gait, editor, Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach (IRL Press, Oxford, 1984); Amarnath and Broom, Chemical Reviews, Vol. 77, pgs. 183-217 (1977); Pon et al., Biotechniques, Vol. 6, pgs. 768-775 (1988); Ohtsuka et al., Nucleic Acids Research, Vol. 10, pgs. 6553-6570 (1982); Eckstein, editor Oligonucleotides, and Analogues: A Practical Approach (IRL Press, Oxford, 1991), Greene and Wuts “Protective Groups in Organic Synthesis”, Third edition, Wiley, New York 1999,
Narang, editor, Synthesis and Applications of DNA and RNA (Academic Press, New York, 1987), Beaucage and Iyer, Tetrahedron 48: 2223-2311 (1992), 및 유사 참고 문헌.
일부 경우에서, 링 후, 폴리뉴클레오티드의 지지체-결합된 연장하는 쇄의 반응되지 않은 3'-아미노 기는 임의로, 다음 탈보호 단계(예를 들어, 탈트리틸화 단계) 전 적합한 캡핑 제제로 캡핑시켜 이들이 후속 커플링 단계에서 불활성이도록 할 수 있다. 상기 캡핑 단계는 제조 단계의 HPLC 프로필을 개선시켜 정제를 보다 용이하게 할 수 있고 또한 생성물의 전체 수율을 개선시킬 수 있다. 본원 발명의 방법에 유용한 캡핑 시약은 아세트산 무수물 및 이소부티르산 무수물, 산 클로라이드, 예를 들어, 아다만틸 카보닐 클로라이드, 피바오일 클로라이드 등, 이소티오시아네이트, 클로로포르메이트 등과 같은 친전자성 시약을 포함한다. 활성제와 결합하고 그 다음 산화된 포스포르아미다이트, 및 산 염화물 예컨대 피바오일 염화물 또는 아다만틸 카보닐 염화물과 결합하여 사용된 H-포스포네이트 염 예컨대 트리에틸암모늄 이소프로필-H-포스포네이트가 또한 유용하다.
일부 구현예에서, 상기 방법은 뉴클레오시드간 N3'→P5' 포스포르아미다이트 연결을 산화시킴을 포함한다. 인-함유 뉴클레오시드간 연결와 관련하여 본원에 사용된 바와 같은 용어 "산화시키다", "산화", “산화시키는” 등은 인(III) 형태 기원 연결의 인 원자를 인(V) 형태로 전환시키기 위한 방법 또는 처리를 의미한다. 뉴클레오티드간 연결의 산화는 임의의 적합한 방법을 사용한 합성에서 임의의 적합한 지점에서 수행될 수 있다. 일부 구현예에서, 산화는 예를 들어, 모든 커플링 사이클 동안에 단계적 방식으로 수행된다. 다른 구현예에서, 다수의 뉴클레오티드간 연결의 산화는 합성 말기에 수행된다. 일부 경우에, N3'→P5' 포스포르아미다이트 연결을 산화시켜(예를 들어, 요오드/물 기반 산화제) 옥소-포스포르아미데이트 연결을 생성한다. 다른 경우에, N3'→P5’ 포스포르아미다이트 연결을 산화시켜 N3'→P5’ 티오포스포르아미데이트 연결을 생성하기 위한 황화를 포함한다. 황화는 임의의 적합한 방법을 사용하여 수행될 수 있다. 관심 황화 방법은 하기에 기술된 것들을 포함한다: Gryazonov et al. WO2001018015 및 US6,114,519. 관심 황화 제제는 원소 황, 티우람 디설파이드, 예를 들어, 테트라에틸 티우람 디설파이드, 아실 디설파이드, 예를 들어, 펜아실디설파이드, 페닐 아세틸 디설파이드, 포스포피노티오일 디설파이드, 예를 들어, S-Tetra™, 및 1,1-디옥소-3H-1,2-벤조디티올-3-온을 비제한적으로 포함한다. 일부 구현예에서, 황화는 2,6-루티딘에서 페닐 아세틸 디설파이드를 사용하여 수행될 수 있다. 특정 구현예에서, 황화는 Beaucage 시약을 수행하여 수행할 수 있고, 하기 문헌에 기재된 방법을 사용한다: Iyer et al., J. Organic Chemistry 55:4693-4699, 1990.
고체 상 합성 지지체로부터 폴리뉴클레오티드의 절단은 다양한 인자, 예컨대 지지체의 특성, 링커 화학물질 및 합성 동안 이용된 보호기 전략에 의존하여 선택될 수 있는 임의의 적합한 방법 및 시약을 사용하여 달성될 수 있다. 표적 폴리뉴클레오티드의 합성 및 절단에서의 선택은 제1 폴리뉴클레오티드 조성물에 존재하는 비표적 합성 생성물 및 제제의 동일성을 결정할 수 있다.
일부 구현예에서, 절단 전에, 폴리뉴클레오티드의 아인산 보호기는 폴리뉴클레오티드를 갖는 절단된 보호기 (예를 들면, β-시아노에틸 보호기)의 임의의 잠재적인 바람직하지 않은 부가물의 형성을 피하기 위해 제거된다. 폴리뉴클레오티드를 탈보호하고 단리하는데 사용하기 위해 적응될 수 있는 대상의 방법은 US 7,199,236에 기재된 것들을 포함한다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 임의의 염기 보호기(예를 들면, 고리외 아미노 보호기) 및 임의의 잔존하는 아인산 보호기를 제거하기 위해 암모니아 용액을 사용하여 지지체로부터 절단된다. 임의의 적합한 조건이 폴리뉴클레오티드 절단 반응에 이용될 수 있다. 일부 경우에서, 절단은 40-60℃의 범위인 온도에서 수행된다. 일부 사례에서, 절단은 12-24시간의 범위로 되는 시간과 같이 장시간에 걸쳐 수행된다. 폴리뉴클레오티드의 절단 후, 지지체는 그런 다음 여과로 제거될 수 있고 그리고 린스될 수 있다. 이제 폴리뉴클레오티드의 조물질 합성 제제를 함유하는 조합된 여액 및 린스 용액이 추가의 정제 단계로 이월되기 전에 본 제조 방법에 이용될 수 있다. 일부 경우에서, 폴리뉴클레오티드 용액의 정제는, 예를 들면, 45-55℃에서 Kromasil C18을 사용하는 예비 역상-고성능 액체 크로마토그래피 (RP-HPLC) RP HPLC를 포함한다. 일부 사례에서, 본 방법의 폴리뉴클레오티드 조성물은, 예를 들면, 1,000 Da의 기공 직경 절단 크기를 갖는 폴리에테르설폰 막이 구비된 접선 유동 여과(TFF) 장치를 사용함에 의해 임의의 수의 적합한 탈염 및 농축 단계가 진행될 수 있다.
폴리뉴클레오티드 조성물
본 개시내용의 양태는 다가 양이온 반대이온을 포함하는 폴리뉴클레오티드 염 조성물을 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물은 하기를 포함한다: 적어도 하나의 다가 양이온 반대이온을 포함하는 폴리뉴클레오티드의 염 (여기서 상기 폴리뉴클레오티드는 7 이상의 뉴클레오시드 하부단위의 서열을 갖고, 그리고 상기 뉴클레오시드 하부단위 중 적어도 2개는 N3'→P5’ 티오포스포르아미데이트 하부단위간 연결에 의하여 결합됨). 특정 구현예에서, 상기 폴리뉴클레오티드는 인간 텔로머라아제의 RNA 성분에 상보적인 7개 이상의 뉴클레오시드 하부단위의 서열을 갖는다.
다가 양이온 반대이온
임의의 적합한 다가 양이온에서 본 폴리뉴클레오티드 염에서의 반대이온으로서의 용도를 발견할 수 있다. 이와 같이, 다가 양이온은 본 폴리뉴클레오티드 조성물에서 폴리뉴클레오티드 골격 상에 음이온성 부위와 이온 쌍을 형성할 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 아인산-함유 하부단위간 연결(예를 들면, P(V) 연결) 예컨대 포스포르아미데이트, 티오포스포르아미데이트, 포스페이트 에스테르, 포스포디에스테르 연결 및 기타 동종의 것에 의해 연결된 뉴클레오시드 하부단위를 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드의 하부단위간 연결은 (예를 들면, 수용액에서) 음으로 하전될 수 있고 그리고 양이온성 반대이온과 이온 쌍으로 될 수 있다고 이해되어 진다. 이러한 하부단위간 연결은 폴리뉴클레오티드 골격의 음이온성 기로 지칭될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 다가 양이온은 다중 이온 쌍, 예를 들면, 여러 배로 하전된 양이온, 예컨대 이중 하전된 또는 삼중 하전된 양이온을 형성할 수 있는 양이온을 지칭한다. 임의의 적합한 다가 양이온이 본 폴리뉴클레오티드 염 조성물에 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 다가 양이온 이온이 폴리뉴클레오티드 골격의 2 이상의 인접 음이온성 기에 쌍을 이룬다. 일부 구현예에서, 다가 양이온 이온이 폴리뉴클레오티드 골격의 일 음이온성 기에 쌍을 이룬다. 일부 구현예에서, 다가 양이온 반대이온은 2가이다. 대상의 2가 양이온 반대이온은, 비제한적으로, 마그네슘, 아연 및 칼슘을 포함한다. 일부 구현예에서, 다가 양이온 반대이온은 3가이다. 관심 3가 양이온 반대이온은, 비제한적으로, 알루미늄을 포함한다. 상기 조성물의 특정 구현예에서, 적어도 하나의 다가 양이온 반대이온은 마그네슘, 아연, 알루미늄, 및 칼슘으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 상기 조성물의 특정 구현예에서, 적어도 하나의 다가 양이온 반대이온은 마그네슘이다. 상기 조성물의 특정 구현예에서, 적어도 하나의 다가 양이온 반대이온은 아연이다. 상기 조성물의 특정 구현예에서, 적어도 하나의 다가 양이온 반대이온은 알루미늄이다. 상기 조성물의 특정 구현예에서, 적어도 하나의 다가 양이온 반대이온은 칼슘이다.
폴리뉴클레오티드 염에 존재하는 양이온 반대이온의 수는 다양한 인자, 예컨대 다중음이온성 골격의 길이, 염 내 양이온의 원자가, 용액의 pH, 조성물 내 폴리뉴클레오티드의 응집, 등에 의존적이다고 이해되어 진다. 본 조성물은 하기를 포함할 수 있다: 본 폴리뉴클레오티드 조성물 내 다중음이온성 폴리뉴클레오티드 골격으로의 적어도 하나의 다가 양이온 반대이온, 예컨대 2 이상, 3 이상, 4 이상, 5 이상, 6 이상, 7 이상, 8 이상, 9 이상, 10 이상, 15 이상, 20 이상, 30 이상, 40 이상, 50 이상, 100 이상, 또는 그 초과의 다가 양이온 반대이온. 특정 구현예에서, n 뉴클레오시드 하부단위를 갖는 폴리뉴클레오티드는 1 내지 (n-1)/2 (n이 홀수의 정수인 경우) 2가 양이온 반대이온(들) 또는 1 내지 (n-2)/2 (n이 짝수의 정수인 경우) 2가 양이온 반대이온(들)을 포함할 수 있다. 일부 경우에서, 적어도 하나 다가 양이온을 포함하는 폴리뉴클레오티드 염은 1가, 2가 또는 3가일 수 있는, 다양한 기타 양이온 반대이온을 추가로 포함할 수 있다. 특정 경우에서, n은 7 내지 50, 예컨대 7 내지 40, 10 내지 40, 10 내지 30, 10 내지 25, 10 내지 20, 또는 12 내지 15 범위의 뉴클레오시드 하부단위이다.
상기 조성물의 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드 염은, 폴리뉴클레오티드의 다중음이온성 골격과 비교한 (즉, 다중음이온성 골격에 따른 양이온 반대이온의 이론적 최대 포함과 비교한), 3 mol% 이상의 다가 양이온 반대이온, 예컨대 4 mol% 이상, 5 mol% 이상, 6 mol% 이상, 7 mol% 이상, 8 mol% 이상, 9 mol% 이상, 10 mol% 이상, 11 mol% 이상, 12 mol% 이상, 13 mol% 이상, 14 mol% 이상, 15 mol% 이상, 16 mol% 이상, 17 mol% 이상, 18 mol% 이상, 19 mol% 이상, 20 mol% 이상, 25 mol% 이상, 30 mol% 이상, 35 mol% 이상, 40 mol% 이상, 45 mol% 이상, 50 mol% 이상, 55 mol% 이상, 60 mol% 이상, 또는 그 이상의, 폴리뉴클레오티드의 다중음이온성 골격과 비교한, 다가 양이온 반대이온을 포함할 수 있다. 본 조성물의 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 폴리뉴클레오티드의 다중음이온성 골격과 비교하여, 10% mol% 이상의 다가 양이온 반대이온을 포함할 수 있다. 예를 들어, 10 뉴클레오시드간 하부단위 연결의 다중음이온성 골격을 포함하고, 그리고 상기 연결 중 2개와 이온 쌍형성하는 하나의 2가 양이온 반대이온을 포함하는 폴리뉴클레오티드 염은 20 mol%의 2가 양이온 반대이온을 포함하는 것으로 기술된다. 만일 하나의 2가 양이온 반대이온 이온이 두 개 대신에 단 하나의 연결에 대해 쌍을 이루면, 폴리뉴클레오티드 염은 10 mol%의 2가 양이온 반대이온을 포함하는 것으로 기재된다. 이와 같이, mol% 값은 폴리뉴클레오티드 염에 존재하는 다가 양이온 반대이온에 의해 다중음이온성 폴리뉴클레오티드 골격의 점유의 수준을 지칭한다. 예를 들면, 12 뉴클레오시드간 하부단위 연결을 갖는 13-mer 폴리뉴클레오티드 염에서 하나의 Mg2 + 양이온은 골격 중 16.7 mol% 점유를 제공한다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드 염은 폴리뉴클레오티드의 말단(예를 들면, 5'-티오포스페이트 기)에 추가의 이온쌍 부위를 포함할 수 있고, 그리고 존재한다면, 이러한 부위는 화합물의 mol% 값에 포함되어야 한다는 것이 이해되어 진다.
상기 조성물의 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드 염은, 폴리뉴클레오티드의 다중음이온성 골격과 비교하여, 90 mol% 이하의 다가 양이온 반대이온, 예컨대 70 mol% 이하, 65 mol% 이하, 60 mol% 이하, 50 mol% 이하, 또는 그 미만의 다가 양이온 반대이온을 포함한다.
상기 조성물의 특정 구현예에서, 폴리뉴클레오티드 염은 하기를 포함한다: 폴리뉴클레오티드의 다중음이온성 골격과 비교하여, 3 내지 90 mol%의 다가 양이온 반대이온, 예컨대, 폴리뉴클레오티드의 다중음이온성 골격과 비교하여, 3 내지 65 mol% (예컨대, 6 내지 50 mol%, 10 내지 50 mol% 또는 10 내지 40 mol%), 3 내지 50 mol%, 3 내지 40 mol%, 3 내지 30 mol%, 3 내지 20 mol% 또는 3 내지 15 mol%의 다가 양이온 반대이온.
상기 조성물의 특정 경우에서, 폴리뉴클레오티드 염은 하기를 포함한다: 폴리뉴클레오티드의 다중음이온성 골격과 비교하여, 3 내지 60 mol%의 2가 양이온 반대이온, 예컨대 3 내지 50 mol% (예컨대, 5 내지 50 mol%), 3 내지 40 mol%, 3 내지 30 mol%, 3 내지 20 mol%, 3 내지 15 mol%, 예컨대 3-12 mol%의 2가 양이온 반대이온,
상기 조성물의 특정 경우에서, 폴리뉴클레오티드 염은 하기를 포함한다: 폴리뉴클레오티드의 다중음이온성 골격과 비교하여, 3 내지 60 mol%의 마그네슘 양이온 반대이온, 예컨대 마그네슘, 5-50 mol%, 5-40 mol%, 10-40 mol% 또는 20-40 mol%의 마그네슘 양이온 반대이온.
상기 조성물의 특정 경우에서, 폴리뉴클레오티드 염은 하기를 포함한다: 폴리뉴클레오티드의 다중음이온성 골격과 비교하여, 10 내지 70 mol%의 3가 양이온 반대이온, 예컨대 10 내지 60 mol%, 20 내지 60 mol%, 20 내지 50 mol% 또는 30 내지 50 mol%의 3가 양이온 반대이온. 조성물의 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드 염은 0.5 중량% 이상의 다가 양이온 반대이온(예를 들면, 마그네슘), 예컨대 0.6 중량% 이상, 0.7 중량% 이상, 0.8 중량% 이상, 0.9 중량% 이상, 1.1 중량% 이상, 1.2 중량% 이상, 1.3 중량% 이상, 1.4 중량% 이상, 1.5 중량% 이상, 1.6 중량% 이상, 1.7 중량% 이상, 1.8 중량% 이상, 1.9 중량% 이상, 2.0 중량% 이상, 2.1 중량% 이상, 2.2 중량% 이상, 2.3 중량% 이상 2.4 중량% 이상, 2.5 중량% 이상, 2.6 중량% 이상, 2.7 중량% 이상, 2.8 중량% 이상, 2.9 중량% 이상, 3.0 중량% 이상의 다가 양이온 반대이온을 포함한다.
폴리뉴클레오티드 염은 다가 및 1가 양이온 반대이온의 혼합물을 포함하는 혼합 염이다. 조성물의 특정 구현예에서, 폴리뉴클레오티드 염은 몰농도로 적어도 0.05 이상의 다가 양이온 반대이온 대 1가 양이온 반대이온의 비, 예컨대 몰농도로 0.10 이상, 0.15 이상, 0.20 이상, 0.25 이상, 0.30 이상, 0.35 이상, 0.40 이상, 0.45 이상, 0.50 이상, 0.55 이상, 0.60 이상, 0.65 이상, 0.70 이상, 또는 더욱이 그 이상의 다가 양이온 반대이온 대 1가 양이온 반대이온의 비를 포함한다.
일부 경우에서, 폴리뉴클레오티드 염은 몰농도로 1:12의 다가 양이온 반대이온 대 1가 양이온 반대이온 비를 포함한다. 일부 경우에서, 폴리뉴클레오티드 염은 몰농도로 오전 1:11의 다가 양이온 반대이온 대 1가 양이온 반대이온 비를 포함한다.
일부 경우에서, 폴리뉴클레오티드 염은 몰농도로 1:10의 다가 양이온 반대이온 대 1가 양이온 반대이온 비를 포함한다. 일부 경우에서, 폴리뉴클레오티드 염은 몰농도로 1:9의 다가 양이온 반대이온 대 1가 양이온 반대이온 비를 포함한다. 일부 경우에서, 폴리뉴클레오티드 염은 몰농도로 1:8의 다가 양이온 반대이온 대 1가 양이온 반대이온 비를 포함한다. 일부 경우에서, 폴리뉴클레오티드 염은 몰농도로 1:7의 다가 양이온 반대이온 대 1가 양이온 반대이온 비를 포함한다. 일부 경우에서, 폴리뉴클레오티드 염은 몰농도로 1:6의 다가 양이온 반대이온 대 1가 양이온 반대이온 비를 포함한다. 일부 경우에서, 폴리뉴클레오티드 염은 몰농도로 1:5의 다가 양이온 반대이온 대 1가 양이온 반대이온 비를 포함한다. 일부 경우에서, 폴리뉴클레오티드 염은 몰농도로 1:4의 다가 양이온 반대이온 대 1가 양이온 반대이온 비를 포함한다. 일부 경우에서, 폴리뉴클레오티드 염은 몰농도로 2:9의 다가 양이온 반대이온 대 1가 양이온 반대이온 비를 포함한다. 일부 경우에서, 폴리뉴클레오티드 염은 몰농도로 3:7의 다가 양이온 반대이온 대 1가 양이온 반대이온 비를 포함한다. 일부 경우에서, 폴리뉴클레오티드 염은 몰농도로 4:5의 다가 양이온 반대이온 대 1가 양이온 반대이온 비를 포함한다. 일부 경우에서, 폴리뉴클레오티드 염은 몰농도로 5:3의 다가 양이온 반대이온 대 1가 양이온 반대이온 비를 포함한다.
혼합 폴리뉴클레오티드 염의 특정 경우에서, 다가 양이온 반대이온은 마그네슘이고, 1가 양이온 반대이온은 나트륨이다. 혼합 폴리뉴클레오티드 염의 특정 경우에서, 다가 양이온 반대이온은 마그네슘이고, 1가 양이온 반대이온은 암모늄이다. 혼합 폴리뉴클레오티드 염의 특정 경우에서, 다가 양이온 반대이온은 마그네슘이고, 1가 양이온 반대이온은 트리에틸암모늄이다. 혼합 폴리뉴클레오티드 염의 특정 경우에서, 다가 양이온 반대이온은 알루미늄이다. 혼합 폴리뉴클레오티드 염의 특정 경우에서, 다가 양이온 반대이온은 아연이다. 혼합 폴리뉴클레오티드 염의 특정 경우에서, 다가 양이온 반대이온은 칼슘이다.
혼합 폴리뉴클레오티드 염의 특정 경우에서, 1가 양이온 반대이온은 나트륨이다. 혼합 폴리뉴클레오티드 염의 특정 경우에서, 1가 양이온 반대이온은 암모늄이다. 혼합 폴리뉴클레오티드 염의 특정 경우에서, 1가 양이온 반대이온은 트리에틸암모늄이다. 특정 구현예에서, 폴리뉴클레오티드 염은 1개 다가 양이온 반대이온을 포함한다. 특정 구현예에서, 폴리뉴클레오티드 염은 2 다가 양이온 반대이온을 포함한다. 특정 구현예에서, 폴리뉴클레오티드 염은 3 다가 양이온 반대이온을 포함한다. 특정 구현예에서, 폴리뉴클레오티드 염은 4 다가 양이온 반대이온을 포함한다. 특정 구현예에서, 폴리뉴클레오티드 염은 5 다가 양이온 반대이온을 포함한다. 특정 구현예에서, 폴리뉴클레오티드 염은 6 다가 양이온 반대이온을 포함한다. 특정 구현예에서, 폴리뉴클레오티드 염은 7 다가 양이온 반대이온을 포함한다. 특정 구현예에서, 폴리뉴클레오티드 염은 8 다가 양이온 반대이온을 포함한다. 특정 구현예에서, 폴리뉴클레오티드 염은 9 다가 양이온 반대이온을 포함한다. 특정 구현예에서, 폴리뉴클레오티드 염은 10 다가 양이온 반대이온을 포함한다.
표적 폴리뉴클레오티드에 추가로, 다양한 비표적 폴리뉴클레오티드 합성 생성물은 폴리뉴클레오티드 합성 동안에 제조될 수 있다. 폴리뉴클레오티드 제제에 존재할 수 있는 소수 생성물은 결실 생성물(예를 들어, 하나 이상의 뉴클레오시드 잔기가 없는 생성물), 하나 이상의 보호기를 포함하는 생성물, 말단화된 생성물 (예를 들어, 캡핑된 폴리뉴클레오티드 쇄를 포함하는 생성물), 하나 이상의 핵염기가 없는 생성물, 부분적으로 산화된 포스포르아미다이트 연결을 포함하는 생성물 및 부분적으로 황화된 연결을 포함하는 생성물을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 방법은 조성물 내 개선된 순도의 표적 폴리뉴클레오티드를 포함하는 조성물을 제공한다. 일부 구현예에서, 상기 조성물은 20 중량% 이상의 표적 폴리뉴클레오티드, 예컨대 25 중량% 이상, 30 중량% 이상, 35 중량% 이상, 40 중량% 이상, 45 중량% 이상, 50 중량% 이상, 60 중량% 이상, 70 중량% 이상, 80 중량% 이상, 90 중량% 이상, 또는 심지어 95 중량% 이상의 표적 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 조성물은 50 중량% 이상의 표적 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 조성물은 55 중량%) 이상의 표적 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 조성물은 60 중량% 이상의 표적 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 조성물은 65 중량% 이상의 표적 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 조성물은 70 중량% 이상의 표적 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 조성물은 75 중량%) 이상의 표적 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 조성물은 80 중량% 이상의 표적 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 조성물은 85 중량% 이상의 표적 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 조성물은 90 중량% 이상의 표적 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 조성물은 95 중량%) 이상의 표적 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
본원 발명의 방법은 감소된 양의 하나 이상의 비- 표적 합성 생성물 및 제제를 포함하는 조성물을 제공한다. 감소된 양은 본 조성물 내 비표적 합성 생성물 및 제제의 중량으로의 양이 대조 방법에 비하여 감소되었다는 것으로 의미된다. 일부 구현예에서, 본 조성물은 하기를 포함한다: 조성물 내 총 비 표적 폴리뉴클레오티드의 50% 이하의 양으로 비표적 합성 생성물 및 제제, 예컨대 상기 비표적 합성 생성물 및 제제의 40% 이하, 30% 이하, 25% 이하, 20% 이하, 15% 이하, 10% 이하 또는 심지어 5% 이하.
임의의 광범위한 폴리뉴클레오티드 조성물은 본원에 기재된 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 다양한 부류 및 유형의 폴리뉴클레오티드는 본원 발명의 방법을 사용하여 제조하기 위한(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같음) 관심 대상이다. 본원 발명의 방법에 따른 제조를 위해 적합한 폴리뉴클레오티드는 안티-센스 폴리뉴클레오티드, RNA 폴리뉴클레오티드, siRNA 폴리뉴클레오티드, RNAi 폴리뉴클레오티드, DNA 압타머, 마이크로 RNA 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
일부 구현예에서, 상기 폴리뉴클레오티드는 화학식 (I)로 나타낸다:
Figure 112017088984458-pct00003
화학식 (I)
여기서:
각각의 B는 독립적으로 퓨린, 보호된 퓨린, 피리미딘 또는 보호된 피리미딘, 또는 이의 유사체이고;
각각의 X는 독립적으로 산소 또는 황이고;
각각의 R3 은 독립적으로 수소, 플루오로, 하이드록실, 알콕시, 치환된 알콕시 또는 보호된 하이드록실이고;
R6 은 아미노, 하이드록실, 보호된 아미노, 보호된 하이드록시, -O-T-Z 또는 -NH-T-Z이고;
각각의 T는 독립적으로 임의의 링커이고;
각각의 Z는 독립적으로 H, 지질, 담체, 올리고뉴클레오티드, 중합체, 폴리펩티드. 검출가능한 표지 또는 태그이고; 그리고
n은 1 내지 1000의 정수이다. 식 (I)의 올리고뉴클레오티드는 염 형태로 존재할 수 있다는 것이 이해되어 진다. 이와 같이, 화학식 (I)의 뉴클레오시드간 연결은 임의의 적합한 반대이온을 포함하는 염 형태로 존재할 수 있다. 상기 형태는 본 개시내용 내에 포함되는 것으로 의도된다. 식 (I)로 기재된 폴리뉴클레오티드의 뉴클레오시드간 연결의 다른 호변이성질체성 배열이 가능할 수 있다는 것이 이해되어 진다. 상기 형태는 본 개시내용 내에 포함되는 것으로 의도된다.
화학식 (I)의 일부 구현예에서, 각각의 R3 는 수소이다. 화학식 (I)의 일부 구현예에서, 각각의 R3 는 플루오로이다. 화학식 (I)의 일부 구현예에서, 각각의 R3 는 하이드록실이다. 화학식 (I)의 일부 구현예에서, R6 은 아미노이다. 화학식 (I)의 특정 구현예에서, R6 은 하이드록실이다. 화학식 (I)의 일부 구현예에서, Z는 H이다. 화학식 (I)의 일부 구현예에서, Z는 지질(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같이)이다. 특정 경우에, 상기 지질은 지방산(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같이)이다. 화학식 (I)의 일부 구현예에서, Z는 담체이다. 화학식 (I)의 일부 구현예에서, Z는 올리고뉴클레오티드가다. 화학식 (I)의 일부 구현예에서, Z는 중합체이다. 특정 경우에, 상기 중합체는 PEG이다. 화학식 (I)의 일부 구현예에서, Z는 폴리펩티드가다. 화학식 (I)의 일부 구현예에서, Z는 검출가능한 표지이다. 화학식 (I)의 일부 구현예에서, Z는 태그이다. 화학식 (I)의 일부 구현예에서, T는 부재이다. 일부 구현예에서, 각각의 B는 A, C, G, T 및 U로부터 독립적으로 선택된다.
화학식 (I)의 특정 구현예에서, n은 7 내지 500, 예를 들어, 7 내지 100, 7 내지 75, 7 내지 50, 7 내지 40, 7 내지 30, 7 내지 20, 7 내지 15, 10 내지 15 또는 13 내지 15의 정수이다. 특정 구현예에서, n은 7 내지 100, 예를 들어, 7 내지 50, 10 내지 50, 10 내지 40, 10 내지 30, 10 내지 25, 10 내지 20, 12 내지 18 또는 12 내지 16의 정수이다. 특정 구현예에서, n은 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 25이다.
텔로머라아제의 RNA 성분에 상보적인 폴리뉴클레오티드
본원의 개시 내용의 한 양태는 인간 텔로머라아제의 RNA 성분에 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는 화합물 및 조성물 및 이를 제조하기 위한 방법을 포함한다. 상기 화합물은 높은 효능으로 세포에서 텔로머라아제 활성을 억제할 수 있고 세포 흡수 특성을 갖는다.
특정 경우에, 상기 폴리뉴클레오티드는 인간 텔로머라아제의 RNA 성분에 상보적인 7개 이상의 하부단위, 예를 들어, 인간 텔로머라아제의 RNA 성분에 상보적인 8 이상, 9 이상, 10 이상, 11 이상, 12 이상, 13 이상, 14 이상, 15 이상, 20 이상, 30 이상, 50 이상의 뉴클레오시드 하부단위의 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 폴리뉴클레오티드는 인간 텔로머라아제의 RNA 성분에 상보적인 3 내지 50개 인접 뉴클레오시드 하부단위, 예를 들어, 5 내지 40개, 7 내지 40개, 10 내지 40개, 10 내지 30개, 10 내지 25개, 10 내지 20개 또는 12 내지 15개의 뉴클레오시드 하부단위를 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 폴리뉴클레오티드는 인간 텔로머라아제의 RNA 성분에 상보적인 7개 이상의 하부단위, 예를 들어, 인간 텔로머라아제의 RNA 성분에 상보적인 10 이상, 11 이상, 12 이상, 13 이상, 14 이상, 15 이상, 20 이상, 30 이상, 50 이상의 인접 뉴클레오시드 하부단위의 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 화학식으로 나타낸 화합물이다:
O-(x-L)n
여기서, O는 인간 텔로머라아제의 RNA 성분에 상보적인 뉴클레오시드 하부단위의 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 나타내고, x는 임의의 링커 기가고, L은 지질 모이어티를 나타내고 n은 1 내지 5의 정수이다. 일부 경우에서, n은 5이다. 일부 경우에서, n은 4이다. 일부 경우에서, n은 3이다. 일부 경우에서, n은 2이다. 일부 경우에서, n은 1이다. 따라서, 화합물의 설계는 2개의 실체의 선택, O 및 L, 및 임의의 링커 기 x를 포함할 수 있는 이들 실체 간의 구조적 연결(들)의 결정을 필요로 한다.
일부 구현예에서, 상기 폴리뉴클레오티드 화합물은 하기 화학식으로 나타낼 수 있다:
O-(x-L)n
여기서, O는 인간 텔로머라아제의 RNA 성분에 상보적인 뉴클레오시드 하부단위의 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 (x는 임의의 링커 기가고, L은 지질 모이어티를 나타내고 n은 1이다), 예를 들어, 화학식 (I)의 폴리뉴클레오티드 또는 이의 염이고, 여기서, 화학식 (I)에서, Z는 지질 모이어티이고, T는 임의의 링커(예컨대, 본원에 기술된 바와 같음)이고 B 기는 인간 텔로머라아제의 RNA 성분에 상보적인 뉴클레오시드 하부단위의 서열에 상응한다.
상기 폴리뉴클레오티드 성분 O는 이것이 텔로머라아제의 RNA 성분에 결합함에 의해 텔로머라아제 효소의 억제를 수행하는 성분이라는 점에서 화합물의 "이펙터" 성분으로서 간주될 수 있다. 따라서, O의 서열은 이것이 서열번호 1에 나타낸 텔로머라아제 RNA의 서열에 상보적인 영역을 포함하도록 선택된다. 텔로머라아제 RNA 성분에 상보적인 영역은 텔로머라아제 RNA의 임의의 부분에 이론상 표적화될 수 있지만, 텔로머라아제 RNA의 특정한 영역은 저해 폴리뉴클레오티드의 바람직한 표적이다. 하나의 바람직한 표적 영역은 서열번호 1의 뉴클레오티드 30 내지 67에 걸쳐있는 영역이고, 이는 "주형 영역", 서열 5′-CUAACCCUAAC-3′의 11개 뉴클레오티드 영역 (서열번호: 21)를 포함하고, 이는 서열번호: 1의 뉴클레오티드 46 내지 56에 걸쳐있다. 상기 주형 영역은 텔로머라아제가 염색체 말단에 부가하고 텔로머라아제 효소의 활성에 필수적인 텔로머성 반복체의 서열을 특정하는 기능을 한다(문헌참조: Chen et al., Cell 100:503-514, 2000; Kim et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 98(14):7982-7987, 2001). 따라서, 주형 영역의 전부 또는 일부에 상보적인 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 모이어티를 함유하는 관심 화합물이 특히 관심 대상이다. 또 다른 관심 표적 영역은 hTR의 뉴클레오티드 137-179에 걸쳐있는 영역이다(문헌참조: Pruzan et al., Nucl. Acids Research, 30:559-588, 2002). 상기 영역 내에서, 141-153에 걸쳐있는 서열이 바람직한 표적이다. PCT 공보 WO 98/28442은 텔로머라아제를 억제하기 위해 길이에 있어 적어도 7개의 뉴클레오티드의 폴리뉴클레오티드의 용도를 기재하고 있고, 여기서, 폴리뉴클레오티드는 hTR의 뉴클레오티드 137-196, 290-319, 및 350-380을 포함하는 주형 영역의 외부의 hTR 서열의 근접가능한 부분에 상보적이도록 설계된다.
hTR 서열에 표적화된 O의 영역은 일부 경우에서 상응하는 hTR 서열에 정확하게 상보적이다. 미스매치가 특정 경우에 관용성일 수 있고 이들은 수득한 폴리뉴클레오티드 콘주게이트체의 특이성 및 활성을 감소시키는 것으로 예상된다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드 O의 염기 서열은 따라서 텔로머라아제 RNA에 정확하게 상보적인 적어도 5개의 뉴클레오티드 서열을 포함하도록 선택되고 증진된 텔로머라아제 억제는 상보적 서열의 증가하는 길이가 사용되는 경우, 예를 들어, 텔로머라아제 RNA에 정확하게 상보적인 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 10, 적어도 12, 적어도 13 또는 적어도 15개 뉴클레오티드가 사용되는 경우 수득될 수 있다. 다른 구현예에서, 폴리뉴클레오티드의 서열은 텔로머라아제 RNA 서열에 정확하게 상보적인 적어도 7 내지 20, 적어도 8 내지 20, 적어도 10 내지 20 또는 적어도 10 내지 15개 뉴클레오티드의 서열을 포함한다. 임의의 텔로머라아제 억제 활성은 폴리뉴클레오티드 O의 전장이 텔로머라아제 RNA에 상보적이도록 선택되는 경우 수득될 수 있다. 그러나, 폴리뉴클레오티드 성분의 전장이 표적 서열에 정확하게 상보적일 필요는 없고 폴리뉴클레오티드 서열은 표적 서열에 상보적이지 않은 영역을 포함할 수 있다. 상기 영역은 예를 들어, 화합물 상에 다른 성질을 부여하기 위해 예를 들어, 정제를 촉진시키는 서열이 첨가될 수 있다. 폴리뉴클레오티드 성분 O가 표적 서열에 상보적이지 않은 영역을 포함해야만 하는 경우, 상기 영역은 5' 또는 3' 말단 중 하나 또는 둘다에 위치할 수 있다. 정확한 상보성 영역이 주형 영역으로 표적화된 경우에, 효과적인 텔로머라아제 억제는 텔로머라아제형(G-풍부) 서열이 5' 말단에 연결되는 정확한 상보성의 짧은 (5 내지 8개 뉴클레오티드) 영역과 함께 성취될 수 있다.
인간 텔로머라아제 RNA에 상보적이고 폴리뉴클레오티드 성분 O의 일부로서 포함될 수 있거나, 전체 폴리뉴클레오티드 성분 O로서 사용될 수 있는 예시적 서열은 다음을 포함한다:
hTR 상보적 서열(미국 공보 2012329858의, 폴리뉴클레오티드 서열 번호: 1의 영역);
Figure 112017088984458-pct00004
Figure 112017088984458-pct00005
GACGUGCACC CAGGACUCGG CUCACACAUG C (서열 번호: 1)
GCTCTAGAATGAACGGTGGAAGGCGGCAGG 137-166 (서열번호 2) GTGGAAGGCGGCAGG 137-151 (서열 번호: 6)
GGAAGGCGGCAGG 137-149 (서열번호 7)
GTGGAAGGCGGCA 139-151 (서열번호 8)
TGGAAGGCGG 141-151 (서열 번호: 9)
CGGTGGAAGGCGG 141-153 (서열번호 10)
ACGGTGGAAGGCG 142-154 (서열번호 11)
AACGGTGGAAGGCGGC 143-155 (서열번호 12)
ATGAACGGTGGAAGGCGG 144-158 (서열번호 13)
ATTTTTTGTTTGCTCTAG 160-179 (서열 번호: 14)
TAGGGTTAGACAA 42-54 (서열번호 3)
GTTAGGGTTAG 46-56 (서열번호 4)
GTTAGGGTTAGAC 44-56 (서열번호 15)
GTTAGGGTTAGACAA 42-56 (서열번호 16)
GGGTTAGAC 44-52 (서열 번호: 19)
CAGTTAGGG 50-58 (서열 번호: 20)
CCCTTCTCAGTT 54-65 (서열번호 17)
CGCCCTTCTCAG 56-67 (서열번호 18)
일부 구현예에서, 상기 폴리뉴클레오티드는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함한다: GTTAGGGTTAG (서열번호 4); TAGGGTTAGACAA (서열번호 3); 및 CAGTTAGGGTTAG (서열번호 5).
O 성분의 합성에 사용되는 뉴클레오시드간 연결은 포스포디에스테르, 포스포트리에스테르, 메틸포스포네이트, P3′→N5′ 포스포르아미데이트, N3′→P5′ 포스포르아미데이트, N3′→P5′ 티오포스포르아미데이트 및 포스포로티오에이트 연결을 포함하지만 이에 제한되지 않는, 가용한 폴리뉴클레오티드 화학물질의 어느 하나로부터 선택될 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 폴리뉴클레오티드 성분 O는 적어도 하나의 N3′→P5′ 티오포스포르아미데이트 연결을 갖는다. 특정 구현예에서, 인간 텔로머라아제의 RNA 성분에 상보적인 뉴클레오시드 하부단위 모두는 또한 N3′→P5′ 티오포스포르아미데이트 하부단위간 연결에 의해 결합된다. 특정 경우에, N3′→P5′ 티오포스포르아미데이트 하부단위간 연결은 하기의 구조를 갖는다:
3'―NH―P(S)(OR)―O―5 ’
여기서, R은 수소 또는 이의 염이다. 상기 하부단위간 연결을 포함하는, 본원에 기재된 임의의 폴리뉴클레오티드 성분 O 중 어느 하나에 대해, 상기 폴리뉴클레오티드 성분 O는 또한 임의의 적합한 염 형태의 연결을 포함할 수 있는 것으로 이해된다. 이와 같이, 하부단위간 연결은 임의의 적합한 반대이온을 포함하는 염 형태로 존재할 수 있다.
일부 구현예에서, 뉴클레오시드 하부단위 중 적어도 2개는 N3′→P5′ 티오포스포르아미데이트 하부단위간 연결에 의하여 결합되고, 그리고 기타 하부단위간 연결은 각각 독립적으로 N3′→P5′ 옥소-포스포르아미데이트 및 N3′→P5′ 티오포스포르아미데이트 하부단위간 연결로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 뉴클레오시드 하부단위는 각각 독립적으로 N3’→P5’ 옥소-포스포르아미데이트 및 N3'→P5' 티오포스포르아미데이트 하부단위간 연결로부터 선택된 하부단위간 연결에 의하여 결합된다. 일부 구현예에서, 뉴클레오시드 하부단위는 각각 독립적으로 N3’→P5’ 옥소-포스포르아미데이트 및 N3'→P5' 티오포스포르아미데이트 하부단위간 연결로부터 선택된 하부단위간 연결에 의하여 결합되며, 단, 상기 뉴클레오시드 하부단위 중 적어도 2개는 N3'→P5' 티오포스포르아미데이트 하부단위간 연결에 의하여 결합된다. 일부 구현예에서, 뉴클레오시드 하부단위 모두는 또한 N3′→P5′ 티오포스포르아미데이트 하부단위간 연결에 의해 결합된다.
일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드 성분 O는 서열 TAGGGTTAGACAA (서열 번호:3)을 가지며, 그리고 뉴클레오시드 하부단위는 적어도 1개의 N3'→P5' 티오포스포르아미데이트 연결을 포함하는 하부단위간 연결에 의하여 결합된다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드 성분 O는 서열 TAGGGTTAGACAA (서열 번호:3)을 가지며, 그리고 뉴클레오시드 하부단위는 적어도 2개의 N3'→P5' 티오포스포르아미데이트 연결을 포함하는 하부단위간 연결에 의하여 결합된다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드 성분 O는 서열 TAGGGTTAGACAA (서열 번호:3)을 가지며, 그리고 뉴클레오시드 하부단위는 적어도 3개의 N3'→P5' 티오포스포르아미데이트 연결을 포함하는 하부단위간 연결에 의하여 결합된다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드 성분 O는 서열 TAGGGTTAGACAA (서열 번호:3)을 가지며, 그리고 뉴클레오시드 하부단위는 적어도 4개의 N3'→P5' 티오포스포르아미데이트 연결을 포함하는 하부단위간 연결에 의하여 결합된다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드 성분 O는 서열 TAGGGTTAGACAA (서열 번호:3)을 가지며, 그리고 뉴클레오시드 하부단위는 적어도 5개의 N3'→P5' 티오포스포르아미데이트 연결을 포함하는 하부단위간 연결에 의하여 결합된다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드 성분 O는 서열 TAGGGTTAGACAA (서열 번호:3)을 가지며, 그리고 뉴클레오시드 하부단위는 적어도 6개의 N3'→P5' 티오포스포르아미데이트 연결을 포함하는 하부단위간 연결에 의하여 결합된다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드 성분 O는 서열 TAGGGTTAGACAA (서열 번호:3)을 가지며, 그리고 뉴클레오시드 하부단위는 적어도 7개의 N3'→P5' 티오포스포르아미데이트 연결을 포함하는 하부단위간 연결에 의하여 결합된다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드 성분 O는 서열 TAGGGTTAGACAA (서열 번호:3)을 가지며, 그리고 뉴클레오시드 하부단위는 적어도 8개의 N3'→P5' 티오포스포르아미데이트 연결을 포함하는 하부단위간 연결에 의하여 결합된다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드 성분 O는 서열 TAGGGTTAGACAA (서열 번호:3)을 가지며, 그리고 뉴클레오시드 하부단위는 적어도 9개의 N3'→P5' 티오포스포르아미데이트 연결을 포함하는 하부단위간 연결에 의하여 결합된다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드 성분 O는 서열 TAGGGTTAGACAA (서열 번호:3)을 가지며, 그리고 뉴클레오시드 하부단위는 적어도 10개의 N3'→P5' 티오포스포르아미데이트 연결을 포함하는 하부단위간 연결에 의하여 결합된다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드 성분 O는 서열 TAGGGTTAGACAA (서열 번호:3)을 가지며, 그리고 뉴클레오시드 하부단위는 적어도 11개의 N3'→P5' 티오포스포르아미데이트 연결을 포함하는 하부단위간 연결에 의하여 결합된다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드 성분 O는 서열 TAGGGTTAGACAA (서열 번호:3)을 가지며, 그리고 뉴클레오시드 하부단위는 각각 독립적으로 N3’-P5’ 옥소-포스포르아미데이트 및 N3'-P5' 티오포스포르아미데이트 하부단위간 연결로부터 선택된 하부단위간 연결에 의하여 결합된다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드 성분 O는 서열 TAGGGTTAGACAA (서열 번호:3)을 가지며, 뉴클레오시드 하부단위는 각각 독립적으로 N3’→P5’ 옥소-포스포르아미데이트 및 N3'→P5' 티오포스포르아미데이트 하부단위간 연결로부터 선택된 하부단위간 연결에 의하여 결합되며, 단, 상기 뉴클레오시드 하부단위 중 적어도 2개는 N3'→P5' 티오포스포르아미데이트 하부단위간 연결에 의하여 결합된다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드 성분 O는 서열 TAGGGTTAGACAA (서열번호:3)를 가지고, 뉴클레오시드 하부단위는 모두 N3'→P5' 티오포스포르아미데이트 하부단위간 연결에 의해 결합된다.
이상 및 이하의 모든 구현예에서, N3'→P5’ 티오포스포르아미데이트 하부단위간 연결은 특히, ―NH―P(=0)(SH)―O― 또는 이의 호변이성질체, 또는 이의 염이며, N3'→P5’ 옥소-포스포르아미데이트 하부단위간 연결은 특히, ―NH― P(=O)(OH)―O― 또는 이의 호변이성질체, 또는 이의 염이다. 더욱 특히, 이상 및 이하의 모든 구현예에서, N3'→P5’ 티오포스포르아미데이트 하부단위간 연결은 특히, ―NH―P(=O)(SH)―O― 또는 이의 호변이성질체, 또는 이의 나트륨 염이며, N3'→P5’ 옥소-포스포르아미데이트 하부단위간 연결은 특히, ―NH― P(=O)(OH)―O― 또는 이의 호변이성질체, 또는 이의 나트륨 염이다.
하나의 구현예에서, 본 발명은 본 명세서에서 기재된 임의의 하나의 특정한 구조에 관한 것이고 여기서 임의로, 1종 이상의, 특히 하나의, N3'→P5’ 티오포스포르아미데이트 하부단위간 연결은 N3'→P5’ 옥소- 포스포르아미데이트 하부단위간 연결로 대체된다. 하나의 구현예에서, 본 발명은 본 명세서에서 기재된 임의의 하나의 특정한 구조에 관한 것이고 여기서 1종 이상의, 특히 하나의, N3'→P5’ 티오포스포르아미데이트 하부단위간 연결은 N3'→P5’ 옥소- 포스포르아미데이트 하부단위간 연결로 대체된다.
일부 경우에서, 본 화합물은 지질 성분에 콘주게이트되지 않은 상응하는 폴리뉴클레오티드 보다 세포에서 텔로머라아제 억제를 나타내는데 보다 효과적이다. 상기 지질 성분 L은 특히 세포 막을 통한 전달을 촉진시키는데 있어서 화합물의 세포 흡수를 증진시키는 기능을 하는 것으로 사료된다. 이것이 발생하도록 하는 메커니즘은 완전히 이해되지 않고 있지만 한가지 가능성은 지질 성분이 후속적 내재화와 함께 단일 분자 또는 응집체(마이셀) 형태로서 세포막으로의 화합물의 결합을 촉진시킬 수 있다는 것이다. 그러나, 정확한 기전의 이해는 사용될 본 화합물에 대해 요구되지 않는다.
상기 지질 성분은 비변형된 폴리뉴클레오티드와 비교하여 증진된 세포 흡수를 제공하는 임의의 지질 또는 지질 유도체일 수 있다. 바람직한 지질은, 탄화수소, 지방(예를 들어, 글리세라이드, 지방산 및 지방 아미드와 같은 지방산 유도체) 및 스테롤을 비제한적으로 포함한다. 지질 성분이 탄화수소인 경우, L 성분은 포화되거나 불포화될 수 있는 치환되거나 비치환된 사이클릭 탄화수소 또는 지방족 직쇄 또는 분지형 탄화수소일 수 있다. 예시는 완전히 포화되거나 다중불포화된 직쇄의 비분지형 탄화수소를 포함한다. 탄화수소 쇄의 길이는 C2-C30로부터 다양할 수 있지만, 임의의 텔로머라아제 억제는 C8-C22인 탄소 쇄와 함께 수득될 수 있다. 관심 포화된 탄화수소(알칸)의 예시는 하기에 열거되어 있다:
시스템 명칭 / 탄소쇄
테트라데칸 C14H30
펜타데칸 C15H32
헥사데칸 C16H34
헵타데칸 C17H36
옥타데칸 C18H38
노나데칸 C19H40
에이코산 C20H42
탄화수소의 단일- 및 다중-불포화된 형태 (알켄 및 폴리엔, 예를 들어, 알카디엔 및 알카트리엔)이 또한 선택될 수 있고 1 내지 3개의 이중 결합을 갖는 화합물이 관심 대상이지만, 보다 많은 이중 결합을 갖는 화합물이 사용될 수 있다. 알킨 (하나 이상의 삼중 결합을 함유하는) 및 알케닌 (삼중 결합(들) 및 이중 결합(들))이 또한 사용될수 있다.
치환된 형태의 탄화수소는 본 화합물에 사용될 수 있고 치환체 기는 생체내 및 시험관내에서 불활성인 것이 관심 대상이다. 일부 경우에서, 치환체는 불소이다. 다중불소화된 탄화수소의 예시적인 일반 구조는 다음을 포함한다: CF3(CF2)n―(CH2)m-, 여기서 m은 적어도 1이며, 일부 경우에서 적어도 2이며, 그리고 n은 1 내지 30, 예컨대 플루오로트리데칸이며: CF3(CF2)9(CH2)3; 및 CH3(CH2)a(CF2)b(CH2)c- 여기서 a, b 및 c 는 독립적으로 1 내지 30이다.
다른 적합한 관심 지질 성분은 단순 지방산 및 지방산 유도체, 글리세라이드 및 스테롤과 같은 보다 복합지질, 예를 들어, 콜레스테롤을 비제제한적으로 포함한다. 관심 지방산 및 이들의 유도체는 완전히 포화되거나 단일 또는 다중 불포화될 수 있다. 탄소쇄의 길이는 C2-C30으로 다양할 수 있지만, 최적의 텔로머라아제 억제는 C8-C22인 탄소쇄와 함께 수득될 수 있다. 관심 포화된 지방산의 예시는 하기에 열거되어 있다:
시스템 명칭 / 통칭명 / 탄소쇄
테트라데카노익 미리스틱 14:0
헥사데카노익 팔미틱 16:0
옥타데카노익 스테아릭 18:0
에이코사노익 아라키딕 20:0
단일- 및 다중-불포화된 형태의 지방산이 또한 사용될 수 있고 1개 내지 3개의 이중 결합을 갖는 화합물이 관심 대상이지만, 보다 많은 이중 결합을 갖는 화합물이 또한 사용될 수 있다. 사용될 수 있는 통상의 관심 단일- 및 다중-불포화된 지방산의 예는 다음을 포함한다:
시스템 명칭 / 통칭명 / 탄소쇄
시스-9-헥사데카노익 팔미톨레익 16:1(n-7)
시스-6-옥타데카노익 페트로셀리닉 18:1 (n-12)
시스-9-옥타데카노익 올레익 18:1 (n-9)
9,12-옥타데카디에노익 리놀레익 18:2 (n-6)
6,9,12-옥타데카트리에노익 감마-리놀레익 18:3 (n-6)
9,12,15-옥타데카트리에노익 알파-리놀레익 18:3 (n-3)
5,8,11,14-에이코사테트라에노익 아라키도닉 20:4 (n-6)
탄소쇄에서 하나 이상의 삼중 결합을 갖는 지방산, 및 분지형 지방산은 또한 본 화합물에 사용될 수 있다. 치환된 형태의 지방산은 본 화합물에 사용될 수 있다. 탄화수소 기와 함께 생체내 또는 시험관내 불활성인 치환체 기, 예컨대 불소가 관심 대상이다. 본 발명에 사용하기 위해 적합한 지방산의 다중불소화된 유도체의 예시적 일반 구조는 다음과 같다: CF3(CF2)n―(CH2)mCO― (여기서 m은 적어도 1, 바람직하게는 적어도 2이며, 그리고 n은 1 내지 30임, 및 CH3(CH2)a(CF2)b(CH2)cCO― (여기서 a, b 및 c 는 독립적으로 1 내지 30임).
일부 경우에, 1 내지 5개의 L 성분 (n은 1, 2, 3, 4 또는 5임)은 임의로 링커를 통해 O 성분으로 공유적으로 연결된다. 일부 경우에서, 1 또는 2개의 L 성분들이 사용된다 (n=1 또는 2). 하나 이상의 L 성분이 O 성분으로 연결되는 경우, 각각의 L 성분은 독립적으로 선택된다.
L 모이어티로서 명시된 탄화수소를 갖는 것으로 기재된 본 발명의 화합물 및 지방산을 갖는 것으로서 기재된 화합물(특정 탄화수소와 동일한 수의 탄소 원자를 갖는)은 밀접하게 관련되고 L 모이어티를 폴리뉴클레오티드에 연결하는 결합의 특성에서만 구조에서 상이한 (이는 이어서 화합물을 제조하기 위해 사용되는 합성 과정의 결과이다) 것으로 인지된다. 예를 들어, 및 하기에 보다 상세하게 기재된 바와 같이, 폴리뉴클레오티드 (포스포르아미데이트 또는 티오포스포르아미데이트 뉴클레오시드간 연결)의 3’-아미노 말단으로 콘주게이트된 L 모이어티를 갖는 화합물이 합성되는 경우, 개시 물질로서 알데하이드 형태의 지방산(지방 알데하이드)의 사용은 지질쇄와 폴리뉴클레오티드 간의 아민 연결을 형성시켜 지질 기는 탄화수소로서 나타난다. 대조적으로, 카르복실산, 산 무수물 또는 산 클로라이드 형태의 동일한 지방산의 용도는 아미드 연결을 형성시켜 지질 기가 지방산 유도체를 형성시켜 지질 기가 지방산 유도체, 특히 이 경우에 지방 아미드(단순화하기 위해 상기 정의 섹션에서 주지된 바와 같이 용어 “지방산”은 콘주게이트된 L 기를 지칭하는 경우를 기재하는 경우 용어 “지방산”은 지방 아미드를 포함하는 지방산 유도체를 포함하도록 본원에서 광범위하게 사용된다)로 나타나도록 한다. 이것은 C14 지질 성분에 연결된 포스포르아미데이트 폴리뉴클레오티드의 3’-아미노 말단을 도시하는 하기의 반응식에서 설명된다. 반응식 A에서, L은 테트라데카노산(미리스트산)이고, 여기서, L과 O 기간의 연결은 아미드이다. 반응식 B에서, L은 테트라데칸이고 L과 O 기 간의 연결은 아민이다.
도식 A
Figure 112017088984458-pct00006
도식 B
Figure 112017088984458-pct00007
O와 L 성분들 간의 연결은 직접 연결일 수 있거나 임의의 링커 모이어티, 예를 들어, 화학식 (I)의 x 또는 임의의 링커 T를 통한 것일 수 있다. 상기 링커 기는 화합물의 화학적 합성을 촉진시키는 작용을 할 수 있다. 링커 기가 O와 L 성분들의 콘주게이션을 매개하기 위해 사용되는지의 여부는 L 성분(들)이 간편하게 콘주게이트될 수 있는 폴리뉴클레오티드 성분 O 상의 다중 부위가 있는지에 의존한다. 적합한 연결 지점은 폴리뉴클레오티드의 5’ 및 3’ 말단, 하나 이상의 당 환, 뉴클레오시드간 골격 및 핵염기를 포함한다. 일부 경우에, L 모이어티는 폴리뉴클레오티드의 3’ 또는 5’ 말단에 부착된다.
L' 성분이 3’ 말단으로 부착되어야 하는 경우, 부착점은 3’ 치환체에 직접적인 것일 수 있고 바람직한 포스포르아미데이트 및 티오포스포르아미데이트 폴리뉴클레오티드의 경우에 3’-아미노 기이고 통상적인 포스포디에스테르 폴리뉴클레오티드와 같은 다른 경우에 3-하이드록시 기이다. 대안적으로, L 모이어티는 3’-연결된 포스페이트 기를 통해 연결될 수 있고, 여기서, 헥사데칸 탄화수소는 O-알킬 링커를 통해 티오포스포르아미데이트 폴리뉴클레오티드의 3’ 포스페이트에 연결된다. L 모이어티가 5’ 말단에 연결되어야만 하는 경우, 5’-연결된 포스페이트 기를 통해 부착될 수 있다. O 모이어티 상에 염기로의 부착은 임의의 적합한 원자, 예를 들어, 구아노신의 N2 아미노 기로 부착될 수 있다. n>1이어서, 다수의 지질 모이어티가 O 성분으로 부착되어야만 하는 경우, 개별적으로 선택된 L 성분은 임의의 적합한 부위(들)에서 부착될 수 있다. 예를 들어, 하나의 L 기는 각각의 말단으로 부착될 수 있고, 다양한 L 기는 염기로 부착될 수 있거나 2개 이상의 L 기는 하나의 말단에 부착될 수 있다.
임의의 링커 성분 x는 화합물의 O와 L 성분을 결합하기 위해 사용될 수 있다. 임의의 링커(예를 들면, 식 (I) 중 x, 또는 T)는 말단 포스페이트 기, 예를 들면, 3'-연결된 또는 5'-연결된 포스페이트 기를 통해 폴리뉴클레오티드(예를 들면, O)에 부착될 수 있다는 것이 이해되어 진다. 링커가 사용되어야만 하는 경우, 본원에 기재된 바와 같이 합성 과정으로 혼입된다. 적합한 링커 기의 예는 일반 구조에 의해 각각 도시될 수 있는 아미노 글리세롤 및 O-알킬 글리세롤형 링커를 포함한다:
Figure 112017088984458-pct00008
여기서, R′ 는 H, OH, NH2 또는 SH이며; Y는 O, S 또는 NR이며; R은 H, 알킬 또는 치환된 알킬이며; 그리고 n 및 m은 각각 독립적으로 1 내지 18의 정수이다.
관심 적합한 링커의 예시는 아미노글리세롤 링커이다 (여기서, R′는 OH이며, Y는 O이며, 그리고 m 및 n은 각각 1임):
Figure 112017088984458-pct00009
비스-아미노글리세롤 링커(여기서, R′는 OH이며, Y는 NH이며, 그리고 m 및 n은 각각 1임):
Figure 112017088984458-pct00010
그리고 O-알킬 글리세롤 링커이다 (여기서, R은 H임):
Figure 112017088984458-pct00011
본원 발명의 방법에 따라 제조될 수 있는 예시적인 지질-변형된 폴리뉴클레오티드는 하기 문헌의 도 1 (예컨대 도 1a-1dd), 예를 들어 하기에 기재된 화합물을 포함한다: 미국 출원 US20120329858 내지 Gryaznov et al. “Modified oligonucleotides for telomerase inhibition” (이의 개시 내용은 이들의 전문이 본원에 참조로서 포함됨).
특정 구현예에서, 상기 조성물은 하기의 구조로 나타낸 화합물을 포함한다:
Figure 112017088984458-pct00012
또는 이의 염, 여기서 “nps”는 하기를 나타낸다: 티오포스포르아미데이트 연결 (예컨대,―NH― P(=O)(SH)―O― 또는 이의 호변이성질체, 또는 이의 염)을 나타내고, 이는 하나의 뉴클레오시드의 3’-탄소를 인접한 뉴클레오시드의 5’-탄소에 연결한다. 상기 화학식에서 기술된 화합물이 염 형태로 존재할 수 있다는 것이 이해된다. 이들이 존재할 수 있는 한 상기 형태는 본원의 개시 내용의 범위 내에 포함되는 것으로 의도된다. 특정 구현예에서, 상기 조성물은 화합물의 약제학적으로 허용되는 염을 포함한다. 특정 경우에, 상기 조성물은 화합물의 나트륨 염을 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 조성물은 화합물의 마그네슘 염과 같은 화합물의 2가 양이온 염을 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 조성물은 화합물의 알루미늄 염과 같은 화합물의 3가 양이온 염을 포함한다.
특정 구현예에서, 상기 조성물은 하기의 구조로 나타낸 화합물을 포함한다:
Figure 112017088984458-pct00013
여기서, 각각의 Mx + 는 독립적으로 수소 또는 임의의 적합한 염의 반대이온이고, 각각의 x는 독립적으로 1, 2 또는 3이고 n은 5 내지 13의 정수이다. 일부 경우에서, 각각의 n은 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 또는 13이다. 특정 사례에서, 각 x는 독립적으로 1, 2 또는 3이고 n은 5 내지 12의 정수이다. 특정 경우에서, n은 13이다. 특정 경우에, 각각의 x는 1이다. 특정 경우에, 각각의 x는 독립적으로 1 또는 2이다. 특정 경우에, 각각의 x는 독립적으로 1 또는 3이다. 특정 경우에서, 각 Mx + 는 독립적으로 양이온성 반대이온이다. 특정 경우에서, 각각의 Mx + 는 독립적으로 염의 양이온성 반대이온이고, 각각의 x는 독립적으로 1, 2 또는 3이고 n은 5 내지 12의 정수이다. 특정 경우에서, 각각의 Mx + 는 독립적으로 수소 또는 임의의 적합한 양이온성 반대이온이고, 각각의 x는 독립적으로 1, 2 또는 3이고 n은 5 내지 12의 정수이다. 특정 경우에, Mx + 는 수소이다. 일부 구현예에서, (Mx +)n 는 (Mg2+)(M+)11 이다. 일부 구현예에서, (Mx +)n 는 (Mg2 +)2(M+)9 이다. 일부 구현예에서, (Mx+)n 은 (Mg2 +)2(M+)9 이다. 일부 구현예에서, (Mx +)n 는 (Mg2 +)3(M+)7 이다. 일부 구현예에서, (Mx +)n 는 (Mg2 +)4(M+)5 이다. 일부 구현예에서, (Mx +)n 는 (Mg2 +)5(M+)3 이다. 일부 구현예에서, (Mx +)n 는 (Mg2 +)6(M+) 이다. 일부 구현예에서, (Mx +)n 은 (Mg2+)(M+)12 이고, 여기서 Mg2 + 반대이온은 또 다른 올리고뉴클레오티드의 음이온성 골격에 추가의 이온 쌍을 형성할 수 있다. 일부 구현예에서, (Mx +)n 은 (Mg2 +)2(M+)11 이고, 여기서 Mg2 + 반대이온은 1 또는 2개의 기타 올리고뉴클레오티드(들)의 음이온성 골격(들)에 2종의 추가의 이온 쌍을 형성할 수 있다. 특정 경우에서, 혼합된 마그네슘 염의 M+ 반대이온은 나트륨이다. 특정 경우에서, 혼합된 마그네슘 염의 M+ 반대이온은 암모늄이다. 특정 경우에서, 혼합된 마그네슘 염의 M+ 반대이온은 트리에틸암모늄이다.
특정 구현예에서, 상기 조성물은 하기의 구조로 나타낸 화합물을 포함하고 염의 임의의 적합한 양이온성 반대이온을 포함할 수 있다:
Figure 112017088984458-pct00014
특정 구현예에서, 상기 조성물은 하기의 구조로 나타낸 화합물을 포함한다:
Figure 112017088984458-pct00015
지질 변형된 폴리뉴클레오티드
다양한 합성 방법을 사용하여 하기 문헌에 기재된 방법을 포함하는, 선택된 연결의 특성에 의존하여 지질 모이어티 L을 폴리뉴클레오티드에 콘주게이트시킬 수 있다: Mishra et al., (1995) Biochemica et Biophysica Acta, 1264:229- 237, Shea et al., (1990) Nucleic Acids Res. 18:3777-3783, and Rump et al., (1998) Bioconj. Chem. 9:341-349. 지질 모이어티가 폴리뉴클레오티드의 5' 또는 3' 말단에 콘주게이트된 화합물의 합성은 적당한 말단에서 카르복실산, 산 클로라이드, 무수물 및 활성 에스테르와 반응할 수 있는 적합한 기능성 기, 일부 경우에 아미노 기 또는 하이드록실 기를 통해 성취될 수 있다. 티올 기가 또한 작용기로 사용될 수 있다(문헌 [Kupihar et al., (2001) Bioorganic and Medicinal Chemistry 9:1241-1247] 참고). 상이한 쇄 길이의 아미노- 및 티올-변형제 둘다는 폴리뉴클레오티드 합성을 위해 상업적으로 가용하다. N3′→P5′ 티오포스포르아미데이트 연결을 갖는 폴리뉴클레오티드는 3'-아미노 기 (가장 통상적인 폴리뉴클레오티드 화학반응에서 발견되는 3'-하이드록시와 비교하여 상대적으로)을 함유하고 따라서 이들 폴리뉴클레오티드는 지질 기를 폴리뉴클레오티드의 3'-말단에 콘주게이트시키기 위해 유일한 기회를 제공한다.
N3'→P5' 티오포스포르아미데이트 화학물질(예를 들면, 팔미토일아미도-1-O-(4,4'-디메톡시트리틸)-2-O-석시닐 프로판디올 링커)을 갖는 폴리뉴클레오티드의 말단에 지질 기를 부착하기 위해 다양한 접근법이 사용될 수 있다. 3' 말단으로의 부착을 위해, 상기 콘주게이트된 화합물은 완전히 보호된 고형 지지체 결합된 폴리뉴클레오티드의 유리된 3'-아미노 기를 상응하는 산 무수물과 반응시킴에 이어서 암모니아로 탈보호하고 정제하여 합성될 수 있다. 대안적으로, 카보디이미드, HBTU (N,N,N ’,N’-테트라메틸-O-(1H-벤조트리아졸-1-일)우로늄 헥사플루오로포스페이트) 또는 2-클로로-1-메틸피리디늄 요오드와 같은 커플링 시약을 사용하여 지지체 결합된 폴리뉴클레오티드의 유리된 3'-아미노 기로의 지질의 카르복실산의 커플링을 사용하여 지질 기를 콘주게이트시킬 수 있다. 이들 2개의 방법은 지질과 폴리뉴클레오티드 간의 아미드 결합을 형성한다. 지질은 또한 쇄 연장 동안에 폴리뉴클레오티드로 커플링된 지질의 포스포르아미다이트 유도체를 사용하여 폴리뉴클레오티드 쇄에 부착될 수 있다. 이러한 접근은 포스포르아미데이트(예컨대, 티오포스포르아미데이트) 연결을 수득하고, 상기 연결(프로필-팔미토일 및 2-하이드록시-프로필-팔미토일 화합물에 의해 예시된)는 지질과 폴리뉴클레오티드를 연결한다. 여전히 또 다른 방법은 완전히 보호된 지지체 결합된 폴리뉴클레오티드의 유리된 3'-아미노 기를 적합한 지질 알데하이드과 반응시킴에 이어서 아민 연결을 생성하는 나트륨 시아노보로하이드라이드로 환원시킴을 포함한다.
5' 말단으로의 부착을 위해, 폴리뉴클레오티드는 변형된 지질-함유 고형 지지체를 사용한 합성에 이어서 문헌(참조: Pongracz & Gryaznov (1999))에 기재된 바와 같이 5'에서 3' 방향으로 폴리뉴클레오티드를 합성할 수 있다. 변형된 지지체의 예는 하기에 제공된다. 상기 경우에서, n은 14이며, 지방산은 팔미트산이며: 3-아미노-1,2-프로판디올과 팔미토일 클로라이드의 반응에 이어서 디메톡시트리틸화 및 석신일화로 고형 지지체로의 커플링을 위해 사용되는 중간체를 수득하였다. 일부 경우에서, R은 장쇄 알킬 아민 조절된 공극 유리일 수 있다. 특정 사례에서, R은 중합체 고형 지지체이다.
Figure 112017088984458-pct00016
용도
본 발명의 방법 및 조성물은 예를 들어, 상기된 바와 같이 다양한 적용에 사용된다. 관심 적용은 비제한적으로 하기를 포함한다: 하기에 보다 상세하게 검토된 바와 같은 치료학적 적용, 진단학적 적용, 연구 적용, 및 스크리닝 적용.
본원 발명의 화합물은 다양한 치료학적 적용에 사용된다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드를 제조하는 방법은 치료학적 이득을 위해 제공하는 폴리뉴클레오티드를 제조하기 위해 적용된다. 본 발명의 조성물을 사용하여 치료될 수 있는 질환의 유형은 제한이 없다. 예를 들어, 상기 조성물은 다수의 유전학적 질환의 치료를 위해 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 본원 발명의 방법 및 조성물은 안티센스 적용을 갖는다. 일부 구현예에서, 상기 본원 발명의 방법 및 조성물은 항 유전자 적용을 갖는다. 특정 구현예에서, 본 방법 및 조성물은 텔로머라아제 저해 적용, 예컨대 미국 특허 6,835,826, 및 미국 공보 20120329858에 기재된 것들을 가지고, 그것의 개시내용은 그 전체가 참고로 본 명세서에 편입된다.
본 개시내용은 텔로머라아제 활성을 특이적으로 및 강력하게 억제할 수 있고 따라서 종양 세포와 같은 텔로머라아제 양성 세포의 증식을 억제하기 위해 사용될 수 있는 화합물을 제공한다. 매우 광범위한 암 세포는 텔로머라아제-양성인 것으로 나타났고, 이는 피부, 연결 조직, 지방 세포, 유방, 폐, 위, 췌장, 난소, 자궁경부, 자궁, 신장, 방광, 결장, 전립선, 중추 신경계(CNS), 망막 및 혈액학적 종양(예를 들어, 골수종, 백혈병 및 림프종) 암 기원의 세포를 포함한다. 목적하는 암은 골수섬유증, 혈소판증, 골수이형성 증후군 및 골수성 백혈병을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
본원 발명의 화합물을 사용하여 혈액 악성종양 및 골수증식성 장애를 치료할 수 있고, 이는 본태성 혈소판증가증(ET), 진성적혈구증가증 (PV) 만성 골수성 백혈병 (CML), 골수섬유증 (MF), 만성 호중구 백혈병, 만성 호산성 백혈병 및 급성 골수성 백혈병 (AML)을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 본원 발명의 화합물을 사용하여 골수이형성 증후군을 치료할 수 있고, 이는 난치성 빈혈, 과도한 블라스트를 갖는 난치성 빈혈, 다계열형성이상 난치성혈구감소증, 단일계열형성이상 난치성혈구감소증, 및 만성 골수단구성 백혈병 (CMML)과 같은 질환을 포함한다. 대상 화합물은 혈액 질환, 예컨대 2013년 11월 15일 출원된 PCT 특허 출원 번호 PCT/US13/070437에 기재된 것들을 치료하기 위해 사용될 수 있고, 그것의 개시내용은 그 전체가 참고로 본 명세서에 편입된다.
따라서, 본원에 제공된 화합물은 광범위의 악성종양을 치료하는데 널리 유용하다. 일부 경우에서, 본 화합물은 악성과 정상 세포를 고도로 구분하여, 분할 세포를 구분되게 사멸시키는 제제에 의존하여 대부분의 현재 화학치료 레지멘에서 존재하는 많은 해로운 부작용을 회피하는 치료를 제공하는데 효과적일 수 있다. 더욱이, 일부 경우에서, 본 지질 변형된 화합물은 균등한 비콘주게이트된 올리고뉴클레오티드 보다 강하고 이는 이들이 보다낮은 용량으로 투여되어 증진된 안정성을 제공하고 치료 비용을 상당히 감소시킬 수 있음을 의미한다. 텔로머라아제 억제제는 원발성 종양의 수술적 제거, 화학치료학적 제제 및 방사선 치료를 포함하는 다른 암 치료 방법과 연계하여 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 약제로서 사용하기 위한 본원에 제공된 화합물 및 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 또한 이전에 지칭된 악성종양 중 어느 하나를 치료하거나 예방하는데 사용하기 위해 본원에 제공된 화합물 및 조성물에 관한 것이다.
본원 발명의 화합물 및 방법은 임상적 진단, 예를 들어, 시험관내 진단 또는 생체내 종양 이미지화제의 개발을 포함하지만 이에 제한되지 않는 다양한 진단학적 적용에 사용된다. 상기 적용은 질환 조건, 이에 대한 민감성을 진단하거나 진단을 확인하는데 유용하다. 상기 방법은 또한 이전에 상기 질환으로 진단된 환자에서 질환 진행 및/또는 치료 반응을 모니터링하기 위해 유용하다.
실시예
실시예 1: 요약
이들 실시예는 이메텔스텟의 나트륨 염 형태로부터 Ca, Ba, Mg, Al, Fe, Cu, 및 Zn와 같은 다양한 2가 또는 3가 형태의 이메텔스텟을 제조하는 실험을 기술한다. 이들 실험에서, 이메텔스텟의 1, 2 또는 3 포스페이트 기와 결합할 수 있는 비-덴테이트 또는 트리-덴테이트 양이온의 염의 형성 및 단리를 포함하는 제조 방법을 사용하여 순도에서의 개선이 평가되었다. 얻어진 염 형태의 용해도 및 오스몰농도가 또한 연구되었다.
이메텔스텟 칼슘, 이메텔스텟 바륨, 이메텔스텟 마그네슘, 이메텔스텟 알루미늄, Fe (II 또는 III) 이메텔스텟, 및 제이구리 이메텔스텟 염의 제조가 CaCl2, MgCl2, BaCl2, CuCl2, ZnCl2, A1Cl3, FeCl2, 및 FeCl3를 사용하여 조사되었다. 염 교환에 대한 세 가지 방법이 연구되었다: 강한 양이온-교환 수지(FINEX MFG 210), 침전, 및 단순 용해의 사용. 이메텔스텟 나트륨 용액이 CaCl2, BaCl2 또는 MgCl2 와 교환된 수지를 통과할 때, 용출 용액은 미세 분말을 함유하여, 나트륨 반대이온이 이메텔스텟 골격으로부터 성공적으로 교환되었고 그리고 칼슘, 바륨 또는 마그네슘 반대이온으로 대체되었다는 것을 나타낸다. 양이온교환수지로 평형화된 다른 5종 시약(CuCl2, ZnCl2, AICI3, FeCl2, FeCl3)에 대해, 칼럼 내 수지의 최상부 일부는 이메텔스텟 용액이 통과될 때 응집되어, 나트륨 반대이온이 이메텔스텟 골격으로부터 성공적으로 교환되었다는 것을 또한 나타낸다.
침전 및 용해 방법이 또한 과잉의 염 시약을 사용하여 시험되었다. 큰 과잉의 염 시약(예를 들면 900 당량)이 이메텔스텟 나트륨으로 처리될 때, 침전물이 형성된다. 침전물을 여과로 단리했다. 후속의 시험은 7 내지 50 당량의 무기 염 시약이 모든 이메텔스텟을 침전으로 전화하기 위해 필요하였다는 것을 나타낸다.
5 당량의 3종 무기 염(Mg, Ba 또는 Ca)이 이메텔스텟 TEA(트리에틸암모늄) 염 형태 또는 이메텔스텟 Na 염 형태 중 어느 하나로 각각 처리된다. 침전이 일어나지 않았고 그리고 용액은 탈염되고 냉동-건조되었다는 것이 확인되었다. 화염 AA(Atomic Absorption; 원자 흡수)에 의한 냉동건조된 분말의 분석은 이메텔스텟의 일부 나트륨 반대이온이 교환되었다는 것을 나타냈다.
추가의 실험은 1 대 9 당량의 마그네슘 양이온 대 이메텔스텟 형태를 사용하여 MgCl2 로 수행되었다. 나트륨 반대이온은 9 당량의 MgCl2 에서 발생하는 최고 교환으로 Mg 반대이온에 부분적으로 교환되어, 수득한 조성물은 1.2 중량%의 Na 및 1.1 중량%의 Mg을 나타냈다.
실시예 2: 물질 및 장치
연구에 사용된 무기 시약, 유기 용매, 및 다른 물질은 표 1에 열거된다. 지론 사에 의해 제공된 G163/L- G-13002의 로트 #의 이메텔스텟 나트륨(CAS #1007380-31-5)이 본 연구에 사용되었다. 이메텔스텟 암모늄은 (예를 들면, Gryaznov 등의 US 20120329858에서 기재된 바와 같이) 암모니아 및 에탄올을 사용하여 고체 상 합성 지지체로부터 이메텔스텟의 절단으로부터 유도된 조물질 조성물이고 제조자의 저장품으로부터 수득되었다. 이메텔스텟 TEA(트리에틸암모늄 형태)는 트리에틸암모늄 아세테이트(TEAA) 함유 이동상이 (예를 들면, Gryaznov 등의 US 20120329858에서 기재된 바와 같이) 사용된 HPLC 정제 칼럼 용출물로부터 유도된 조성물이고 그리고 다양한 공정 전개 연구로부터 수득된 제조자의 저장품으로부터 수득되었다. 한외여과는 1KD PES 막을 갖는 교반된 한외여과 셀(Amicon 8400, 밀리포어 사)을 사용하여 수행되었다. 동결건조는 속도 진공 농축기(ScanSpeed 40, 라보진 사)를 사용하여 수행되었다.
실시예 3: 절차
이온교환 수지 칼럼에 의한 교환
200mL(4.6cm x 12cm)의 칼럼 용적을 갖는 강한 양이온교환수지의 칼럼인, FINEX MFG 210이 제작되었고 그리고 수지는 1M NaOH 및 물로 세정되었다. 칼럼은 그런 다음 1M 용액의 각 대상의 염으로 평형화되었다. 이러한 실험에서, 총 8종의 1M 염 용액 (CaCl2, MgCl2, BaCl2, CuCl2, ZnCl2, A1Cl2, FeCl2, 및 FeCl3)이 제조 및 사용되었다. 100mg/mL에서의 이메텔스텟 나트륨 50mL 용액이 칼럼에 첨가되었다.
CuCl2, ZnCl2, A1Cl2, FeCl2, 및 FeCl3 평형화된 칼럼의 경우에, 수지 상에 이메텔스텟의 응집은 이메텔스텟 나트륨이 칼럼 상으로 부하될 때 칼럼의 최상부 일부에서 관측되었다.
CaCl2, MgCl2 및 BaCl2 로 평형화된 세 개의 칼럼은 염 용액이 칼럼 상에 어떠한 이메텔스텟 응집도 초래하지 않았고 이메텔스텟이 칼럼 용출물로부터 회수되어 흐린 용액으로 관측되었다. 미세 분말은 원심분리(4000rpm, 20분)에 의해 이들 용출물로부터 회수되었다. 원심분리 후, 상청액은 HPLC 분석에 의해 어떠한 이메텔스텟도 함유하지 않았다는 것이 확인되었다. 이것은 이메텔스텟의 칼슘, 마그네슘 및 바륨 염의 침전 및 분리가 성공적으로 달성되었다는 것을 나타낸다.
침전에 의하여
이메텔스텟의 2가 또는 3가 형태의 결정화 또는 침전이 대상의 큰 과잉의 무기 염(900 당량, 중량 기준)을 사용하여 조사되었다. 1M 염 용액 (CaCl2, MgCl2, BaCl2, CuCl2, ZnCl2, A1Cl2, FeCl2, 및 FeCl3)이 제조되었다. 이메텔스텟 용액의 세 가지 유형: 조물질 이메텔스텟 용액(암모늄 염), 정제된 이메텔스텟(트리에틸암모늄(TEA) 염 형태), 및 이메텔스텟 나트륨(Na 염 형태)이 각 염 용액과 혼합되었다.
모든 혼합된 용액은 이메텔스텟의 침전물을 나타냈으며, 어드밴텍(Advantec) 2 여과지로 여과에 의해 쉽게 단리되었다. 이것은 이메텔스텟의 다가 염의 침전 및 분리가 성공적으로 달성되었다는 것을 나타낸다.
대량의 과잉의 염 시약의 조건 하에서 단리된 침전물의 용해도는 하기 용매: 물, 아세토니트릴, MeOH, EtOH, IPA(이소프로필 알코올), 0.1M NaOH, 0.1M HC1, 1M NaCl, 및 NMP를 사용하여 초기에 조사되었다.
큰 과잉의 염 시약에 침전된 염에 대해, 이메텔스텟의 칼슘, 바륨, 및 마그네슘 염은 0.1M NaOH 및 1M NaCl 용액에서 용해성이었다(표 2 참고). 큰 과잉의 마그네슘 염 시약으로부터 수득된 이메텔스텟 침전물의 용해도 연구는 상이한 농도(2mg/mL 내지 6 mg/mL)에서 그리고 상이한 pH 조건(pH 8, 9, 10, 11, 12)하에서 1M NaCl 용액에서 수행되었고 HPLC에 의해 분석되었다(도 1의 크로마토그램 참고). 이메텔스텟 침전물은 6mg/mL 및 pH 11 내지 pH 12에서 용해성인 것으로 관측되었다. 화합물은 또한 어떠한 침전도 없이 최대 pH 12까지 안정성을 나타냈다(도 1).
용해에 의하여
30 내지 50 당량 염 시약
이메텔스텟의 완전한 침전을 달성할 수 있는 대상의 염 시약의 당량 수는 대상의 염 시약을 단계적으로 첨가함에 의해 조사되었다. 침전물의 완전한 형성은 표 3에 열거된 8개 염에 대해 첨가된 염 시약의 7 내지 50 당량의 범위에서 관측되었다. 보다 많은 당량의 염 시약이 첨가됨에 따라, 모든 염에 대해 침전과 함께 겔 형성에 대한 추세가 관측되었다.
세 가지 유형의 이메텔스텟 용액이 사용되었다: 조물질 이메텔스텟 암모늄(조물질 형태), 이메텔스텟 트리에틸암모늄(정제된 TEA 염 형태), 및 이메텔스텟 나트륨(Na 염 형태)이 각 염 용액과 혼합되었다. 이메텔스텟 암모늄 염은 NH4OH 용액이나 물에서의 용액으로 사용되었다. 이메텔스텟 암모늄 및 이메텔스텟 TEA 용액은 완전한 침전을 달성하기 위해 각각 대략 50 당량 또는 30 당량의 Mg 염 시약을 필요했다.
이메텔스텟 TEA 용액 및 이메텔스텟 암모늄 용액으로부터 형성된 침전물의 용해도는 pH 8 내지 pH 12의 다양한 pH 조건 하에서 조사되었다. 혼합된 용액을 실온에서 6시간 동안 정치한 후, 이메텔스텟-Mg 침전물의 용해도가 260nm에서 UV 흡광도에 의해 분석되었다. 이메텔스텟 암모늄 및 이메텔스텟 TEA로부터 수득된 양자의 침전물은 높은 pH에서 1M NaCl 용액에 보다 많은 이메텔스텟 염이 용해되는 유사한 추세를 나타냈다(표 3 참조).
이 결과는 이메텔스텟에 대한 대상의 염 시약의 당량 수가 제어될 때, 이메텔스텟 염의 완전한 침전이 임의의 적합한 방법에 의해 달성될 수 있어 성공적으로 재용해될 수 있는 침전물을 생성한다는 것을 시사한다.
5 당량 염 시약
이메텔스텟 나트륨 용액(1mL의 물 내 100mg)이 5 당량의 8개 염 시약과 혼합되고 그리고 각 용액은 교반된 한외여과 셀 및 1KD 막을 사용하여 한외여과에 의해 탈염되었다. 한외여과된 용액은 그런 다음 동결건조되었다. 수득한 분말은 화염 AA(원자 흡수 분광법에 의해 대상의 Na 및 각 금속 반대이온의 함량에 대해 분석되었다. 도 2 및 3에 도시된 바와 같이, 최고 금속 반대이온 함량은 Zn, Al, 및 Mg에 대해 1.1중량%로, 각각 2.6%, 1.7%, 및 2.6%의 Na 함량을 가졌다.
6 내지 9 당량 염 시약
이메텔스텟 나트륨 용액에 6 내지 9 당량의 마그네슘 염 시약의 첨가가 이루어지고 후속의 한외여과 및 동결건조가 물에 완전히 용해성인 고형 생성물을 제공했다. 나트륨 및 마그네슘 함량의 분석이 수행되었다(도 3에서의 결과 참고). 이메텔스텟 나트륨 용액에 9 당량의 MgCl2의 첨가는 Na 및 Mg 반대이온 함량이 각각 1.1중량% 및 1.2중량%인 조성물을 생성한다.
1 내지 10 당량 염 시약
이메텔스텟 나트륨 염에 비교될 때 이메텔스텟 TEA 염 내 TEA 반대이온으로 Mg의 교환을 조사하기 위해, 또 다른 세트의 실험이 설계되고 수행되었다. 수용액 내 1 내지 10 당량의 MgCl2 가 이메텔스텟 TEA 염 용액(HPLC에 의한 순도 > 90%)과 혼합되었다. Mg 반대이온 함량의 분석은 한외여과 및 동결건조 후에 수행되었다. 결과는 도 4에 도시되었다. 최대 10 당량의 MgCl2 시약의 첨가는 1.6중량%의 Mg을 갖는 조성물을 생산했다.
실시예 4: 결론
칼슘, 마그네슘, 아연, 알루미늄, 바륨, 철(II), 철 (III) 및 구리 염을 포함하는 이메텔스텟의 2가 및 3가 염 형태의 제조가 달성되었다. 제어된 과잉의 선택된 무기 염 시약이 폴리뉴클레오티드를 침전시키기 위해 사용될 때(표 2 및 3 참고), 그 뒤에 재용해될 수 있었고 그리고 HPLC 분석을 사용한 빠른 용출 불순물에 관해 개선된 순도를 나타내는 침전물이 형성되었다.
마그네슘 염 시약의 사용은 교환 단계 후 이메텔스텟의 용해성 고형 침전물을 생산했다. 1.1 중량%의 나트륨 반대이온에 비해 1.2 중량%의 마그네슘 반대이온을 달성한 침전물이 생산되었다.
2가 또는 3가 염을 사용한 이메텔스텟의 침전은 용액에 남아있는 비표적 합성 생성물 및 시약의 제거를 제공한다. 조물질 이메텔스텟 용액에 존재하는 이러한 불순물의 제거는 이메텔스텟의 후속의 크로마토그래피 정제 단계에서 몇 가지의 이점, 예컨대 감소된 칼럼 부하, 개선된 분해능, 크로마토그래피 정제 단계의 감소된 수 및 크로마토그래피 칼럼의 개선된 수명, 감소된 정제 비용 및 더 빠른 정제를 제공한다.
무기 염 , 유기 용매, 및 기타 재료
재료 분자 화학식 (분자량) 등급 또는 순도
염화칼슘 2수화물 CaCl2-2H2O (MW 147.01) ≥99 %
염화마그네슘 1수화물 MgCl2-H2O
(MW 203.30)		 ≥99 %
염화바륨, 2수화물 BaCl2-2H2O (MW 244.26) ≥99 %
염화구리(II) 2수화물 CUCl2-2H2O (MW 170.48) ≥99 %
염화아연 ZnCl2
(MW 136.30)		 ≥98 %
염화알루미늄 6수화물 A1Cl3-6H2O (MW 241.43) ≥95 %
염화철(II) 4수화물 FeCl2-4H2O
(MW 198.81)		 ≥98 %
염화철(III) 6수화물 FeCl3-6H2O
(MW 270.30)		 ≥98 %
염화나트륨 NaCl
(MW 58.4)		 USP 등급
(O: 유, X: 무, 수행되지 않음)
방법 시험된 이메텔스텟 수행된 시험 CaCl2 MgCl2 BaCl2 CuCl2 ZnCl2 A1Cl3 FeCl2 FeCl3
이온 교환 수지 나트륨 (Na 형태, l00mg /mL) 칼럼 통과 O O O X X X X X
칼럼 후 용액 내 침전 O O O - - - - -
침전물의 여과 X X X - - - - -
침전물의 가용성* X X X - - - - -
침전(Precipitat)-이온
(900 당량)		 나트륨 (Na 형태, l00mg /mL) 침전물 (여과가능) O O O O O O O O
침전물의 가용성** X X X X X X X X
1M NaOH 내 침전물의 가용성 O O O X X X X X
TEA
(35 mg /mL)		 침전물 (여과가능) O O O O O O O O
침전물의 가용성** X X X X X X X X
1M NaOH 내 침전물의 가용성 O O X X X X X X
조 생성물 (NH4OH 내) 침전물 (여과가능) O O O O O O O O
침전물의 가용성** X X X - - - - -
* 아세토니트릴, MeOH, EtOH, IP A, 물, NMP, 1M HCL, 1M NaCl, 1M NaOH 내 시험됨
* 아세토니트릴, MeOH, EtOH, IP A, 물, NMP, 1M HCL, 1M NaCl 내 시험됨
Figure 112021046604614-pct00025
첨부된 청구항에도 불구하고, 본 명세서에 기재된 개시내용은 또한 하기 조항에 의해 규정된다:
삭제
1. 하기를 포함하는, 폴리뉴클레오티드를 제조하는 방법:
하기를 포함하는 제1 폴리뉴클레오티드 조성물을:
7 이상의 뉴클레오시드 하부단위의 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 (상기 뉴클레오시드 하부단위 중 적어도 2개는 N3'→P5' 티오포스포르아미데이트 하부단위간 연결에 의하여 결합됨); 및
및 비표적 합성 생성물 및 시약;
다가 양이온 염과 접촉시켜, 적어도 하나의 다가 양이온 반대이온을 포함하는 제1 폴리뉴클레오티드 염을 침전시키는 단계; 및
제1 폴리뉴클레오티드 염을, 상기 접촉된 제1 폴리뉴클레오티드 조성물로부터 분리시켜 상기 제1 폴리뉴클레오티드 염을 포함하는 제2 폴리뉴클레오티드 조성물을 생산하는 단계.
2. 조항 1에 있어서, 상기 방법은 하기 단계를 추가로 포함하는, 방법: 제1 폴리뉴클레오티드 염을, 역 상 크로마토그래피 지지체와 접촉시키는 단계; 및 상기 크로마토그래피 지지체로부터 제2 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제3 폴리뉴클레오티드 조성물을 용출시키는 단계.
3. 조항 1 또는 2에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드가 인간 텔로머라아제의 RNA 성분에 상보적인 13개 이상의 뉴클레오시드 하부단위를 포함하는 서열을 포함하는, 방법.
4. 조항 1 내지 3 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드가 인간 텔로머라아제의 RNA 성분에 상보적인 10개 내지 50개 인접 뉴클레오시드 하부단위를 포함하는, 방법.
5. 조항 3 또는 4에 있어서, 인간 텔로머라아제의 RNA 성분에 상보적인 상기 뉴클레오시드 하부단위가 모두 N3′→P5′ 티오포스포르아미데이트 하부단위간 연결에 의해 결합된, 방법.
6. 조항 1 내지 5 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드가 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 포함하는, 방법: GTTAGGGTTAG (서열번호 4), TAGGGTTAGACAA (서열번호 3) 및 CAGTTAGGGTTAG (서열번호 5).
7. 조항 1 내지 6 중 어느 한 항에 있어서, 여기서 상기 폴리뉴클레오티드는 임의의 링커를 통해 지질 모이어티에 콘주게이트되는 방법.
8. 조항 2 내지 7 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 폴리뉴클레오티드 염은 하기 구조를 갖는, 방법:
Figure 112017088984458-pct00017
상기 식 중, 각각의 Mx + 는 독립적으로 수소 또는 양이온성 반대이온이고, 각각의 x는 독립적으로 1, 2 또는 3이고, 그리고 n은 5 내지 13의 정수이다.
9. 조항 2 내지 8 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 폴리뉴클레오티드 염은 폴리뉴클레오티드의 약제학적으로 허용가능한 염인, 방법.
10. 조항 2 내지 9 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 폴리뉴클레오티드 염은 폴리뉴클레오티드의 1가 양이온 염인, 방법.
11. 조항 2 내지 10 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 폴리뉴클레오티드 염은 폴리뉴클레오티드의 나트륨 염인, 방법.
12. 조항 1 내지 5 중 어느 한 항에 있어서, 제1 폴리뉴클레오티드 조성물을 생산하기 위해 지지체로부터 폴리뉴클레오티드를 절단하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
13. 조항 1 내지 12 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 조성물은 폴리뉴클레오티드의 1가 양이온 염을 포함하는, 방법.
14. 조항 1 내지 13 중 어느 한 항에 있어서, 상기 접촉 단계는 양이온 교환 지지체로부터 제1 폴리뉴클레오티드 조성물을 용출하는 것을 포함하는 방법.
15. 조항 1 내지 14 중 어느 한 항에 있어서, 상기 분리 단계는 상기 접촉된 제1 폴리뉴클레오티드 조성물을 원심분리하여 폴리뉴클레오티드 염 침전물을 스핀 다운(spin down)하는 것을 포함하는, 방법.
16. 조항 1 내지 15 중 어느 한 항에 있어서, 상기 분리 단계는 접촉된 제1 폴리뉴클레오티드로부터 폴리뉴클레오티드 염을 여과하는 것을 포함하는 방법.
17. 조항 2에 있어서, 상기 제2 폴리뉴클레오티드 조성물은 역 상 크로마토그래피 지지체 상에 직접적으로 부하되는, 방법.
18. 조항 1 내지 17 중 어느 한 항에 있어서, 용액에서 상기 제2 폴리뉴클레오티드 조성물을 용해시키는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
19. 조항 1 내지 18 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 다가 양이온 반대이온은 2가인, 방법.
20. 조항 19에 있어서, 상기 적어도 하나의 다가 양이온 반대이온은 마그네슘, 아연, 및 칼슘으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
21. 조항 1 내지 18 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 다가 양이온 반대이온은 3가인, 방법.
22. 조항 21에 있어서, 상기 적어도 하나의 다가 양이온 반대이온은 알루미늄인, 방법.
23. 조항 1 내지 22 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드 염이 1가 양이온 반대이온을 추가로 포함하는, 방법.
24. 적어도 하나의 다가 양이온 반대이온을 포함하는 폴리뉴클레오티드의 염을 포함하고, 상기 폴리뉴클레오티드는 인간 텔로머라아제의 RNA 성분에 상보적인 7 이상의 뉴클레오시드 하부단위의 서열을 갖고, 그리고 뉴클레오시드 하부단위의 적어도 2개는 N3′→P5′ 티오포스포르아미데이트 하부단위간 연결에 의해 결합되는, 조성물.
25. 조항 24에 있어서, 상기 적어도 하나의 다가 양이온 반대이온은 2가인 조성물.
26. 조항 25에 있어서, 상기 적어도 하나의 다가 양이온 반대이온은 마그네슘, 아연, 및 칼슘으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
27. 조항 24 내지 26 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 다가 양이온 반대이온은 마그네슘인, 조성물.
28. 조항 24에 있어서, 상기 적어도 하나의 다가 양이온 반대이온은 3가인 조성물.
29. 조항 28에 있어서, 상기 적어도 하나의 다가 양이온 반대이온은 알루미늄인 조성물.
30. 조항 24 내지 29 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 상기 폴리뉴클레오티드의 다중음이온성 골격과 비교하여, 3 mol% 이상의 다가 양이온 반대이온을 포함하는, 조성물.
31. 조항 24 내지 29 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 상기 폴리뉴클레오티드와 비교하여, 1.0 중량% 이상의 다가 양이온 반대이온을 포함하는, 조성물.
32. 조항 24 내지 31 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 침전물인, 조성물.
33. 조항 24 또는 32에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드가 인간 텔로머라아제의 RNA 성분에 상보적인 13개 이상의 뉴클레오시드 하부단위를 포함하는 서열을 포함하는, 조성물.
34. 조항 24 내지 33 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드가 인간 텔로머라아제의 RNA 성분에 상보적인 10개 내지 50개 인접 뉴클레오시드 하부단위를 포함하는, 조성물.
35. 조항 24 또는 34에 있어서, 인간 텔로머라아제의 RNA 성분에 상보적인 상기 뉴클레오시드 하부단위가 모두 N3′→P5′ 티오포스포르아미데이트 하부단위간 연결에 의해 결합된, 조성물.
36. 조항 24 내지 35 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드가 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 포함하는, 조성물: GTTAGGGTTAG (서열번호 4), TAGGGTTAGACAA (서열번호 3) 및 CAGTTAGGGTTAG (서열번호 5).
37. 조항 24 내지 36 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 임의의 링커를 통해 지질 모이어티에 콘주게이트되는, 조성물.
38. 조항 24 내지 37 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드가 하기 구조를 갖는, 조성물:
Figure 112017088984458-pct00018
상기 식 중, 각각의 Mx + 는 독립적으로 양이온성 반대이온이고, 각각의 x는 1이다. 2 또는 3이며, 그리고 n은 5 내지 12이다.
전술한 발명이 이해의 명확성의 목적을 위하여 예시 및 예의 방식으로 일부 상세히 기재되어 있어도, 특정 변화 및 변형이 첨부된 청구범위의 취지 또는 범위에서 이탈 없이 만들어질 수 있는 본 발명의 교시의 점에서 당해 분야의 숙련가에 용이하게 명백하다.
따라서, 상기는 본 발명의 원리를 단지 예시한다. 본원에서 명백하게 기재되지 않거나 또는 보이지 않아도, 본 발명의 원리를 구현하고 그 취지 및 범위내에 포함되는 다양한 배열을 당해 분야의 숙련가가 고안할 수 있을 것임이 인정될 것이다. 더욱이, 본원에서 인용된 모든 예 및 조건적 언어는 본 발명의 원리 및 선행기술의 추가에 발명자들에 의해 기여된 개념의 이해에서 독자를 돕도록 주로 의도되고, 상기 특이적으로 인용된 예 및 조건에 제한 없이 그대로 해석된다. 또한, 본 발명의 원리, 양태, 및 구현예 뿐만 아니라 이들의 특이적 예를 본원에서 인용한 모든 서술은 이들의 모든 구조적 및 기능적 등가물을 포함하도록 의도된다. 추가적으로, 상기 등가물이 구조와 무관하게 현재 공지된 등가물 및 미래에 개발된 등가물, 즉, 동일한 기능을 수행하는 개발된 임의의 요소 모두를 포함하는 것이 의도된다. 따라서, 본 발명의 범위는 본 명세서에 도시되고 기재된 구현예로 제한되도록 의도되지 않는다. 오히려, 본 발명의 범위 및 사상은 첨부된 구현예에 의해 구현된다. 상기 지적된 구현예의 모든 가능한 조합은 본원 발명의 범위 내에 포괄되는 것으로 고려된다.
<110> Geron Corporation Ramiya, Premchandran H. <120> Methods of Polynucleotide Preparation Using Multivalent Cation Salt Compositions <130> 186/002 <150> US 62/151,891 <151> 2015-04-23 <160> 23 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 451 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 1 ggguugcgga gggugggccu gggaggggug guggccauuu uuugucuaac ccuaacugag 60 aagggcguag gcgccgugcu uuugcucccc gcgcgcuguu uuucucgcug acuuucagcg 120 ggcggaaaag ccucggccug ccgccuucca ccguucauuc uagagcaaac aaaaaauguc 180 agcugcuggc ccguucgccc cucccgggga ccugcggcgg gucgccugcc cagcccccga 240 accccgccug gaggccgcgg ucggcccggg gcuucuccgg aggcacccac ugccaccgcg 300 aagaguuggg cucugucagc cgcgggucuc ucgggggcga gggcgagguu caggccuuuc 360 aggccgcagg aagaggaacg gagcgagucc ccgcgcgcgg cgcgauuccc ugagcugugg 420 gacgugcacc caggacucgg cucacacaug c 451 <210> 2 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 2 gctctagaat gaacggtgga aggcggcagg 30 <210> 3 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 3 tagggttaga caa 13 <210> 4 <211> 11 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 4 gttagggtta g 11 <210> 5 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 5 cagttagggt tag 13 <210> 6 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 6 gtggaaggcg gcagg 15 <210> 7 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 7 ggaaggcggc agg 13 <210> 8 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 8 gtggaaggcg gca 13 <210> 9 <211> 11 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 9 gtggaaggcg g 11 <210> 10 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 10 cggtggaagg cgg 13 <210> 11 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 11 acggtggaag gcg 13 <210> 12 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 12 aacggtggaa ggcggc 16 <210> 13 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 13 atgaacggtg gaaggcgg 18 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 14 acattttttg tttgctctag 20 <210> 15 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 15 tagggttaga caa 13 <210> 16 <211> 11 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 16 gttagggtta g 11 <210> 17 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 17 gttagggtta gac 13 <210> 18 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 18 gttagggtta gacaa 15 <210> 19 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 19 cccttctcag tt 12 <210> 20 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 20 cgcccttctc ag 12 <210> 21 <211> 9 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 21 gggttagac 9 <210> 22 <211> 9 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 22 cagttaggg 9 <210> 23 <211> 11 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 23 cuaacccuaa c 11

Claims (41)

  1. 폴리뉴클레오티드를 제조하는 방법으로서,
    a) 제1 폴리뉴클레오티드 조성물을 다가 양이온 염과 접촉시켜 적어도 하나의 다가 양이온 반대이온을 포함하는 제1 폴리뉴클레오티드 염을 침전시키는 단계; 및
    b) 제1 폴리뉴클레오티드 염을, 접촉된 제1 폴리뉴클레오티드 조성물로부터 분리시켜 제1 폴리뉴클레오티드 염을 포함하는 제2 폴리뉴클레오티드 조성물을 생산하는 단계를 포함하며,
    제1 폴리뉴클레오티드 조성물은
    (i) 7개 이상의 뉴클레오시드 하부단위의 서열을 가진 폴리뉴클레오티드로서, 뉴클레오시드 하부단위 중 적어도 2개가 N3' → P5' 티오포스포르아미데이트 하부단위간 연결에 의해 결합된, 폴리뉴클레오티드; 및
    (ii) 수용성 비표적 합성 생성물 및 시약
    을 포함하는, 방법.
  2. 제1 항에 있어서,
    c) 단계 (b)의 제1 폴리뉴클레오티드 염을 포함하는 제2 폴리뉴클레오티드 조성물을 역 상 크로마토그래피 지지체에 접촉시키는 단계; 및
    d) 역 상 크로마토그래피 지지체로부터 제2 폴리뉴클레오티드 염을 포함하는 제3 폴리뉴클레오티드 조성물을 용출시키는 단계
    를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제1 항에 있어서, 폴리뉴클레오티드는 화학식 (I)로 나타난 것을 특징으로 하는 방법:
    Figure 112021140429029-pct00026

    상기 식에서:
    각각의 B는 독립적으로 퓨린, 보호된 퓨린, 피리미딘 또는 보호된 피리미딘, 또는 이의 유사체이고;
    각각의 X는 독립적으로 산소 또는 황이고;
    각각의 R3은 독립적으로 수소, 플루오로, 하이드록실, 알콕시, 치환된 알콕시 또는 보호된 하이드록실이고;
    R6은 아미노, 하이드록실, 보호된 아미노, 보호된 하이드록시, -O-T-Z 또는 -NH-T-Z이고;
    각각의 T는 독립적으로 임의의 링커이고;
    각각의 Z는 독립적으로 H, 지질, 담체, 올리고뉴클레오티드, 중합체, 폴리펩티드. 검출가능한 표지 또는 태그이고;
    n은 7 내지 100의 정수이다.
  4. 제1 항에 있어서, 폴리뉴클레오티드는 인간 텔로머라제의 RNA 성분에 상보적인 13개 이상의 뉴클레오시드 하부단위를 포함하는 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제1 항에 있어서, 폴리뉴클레오티드는 인간 텔로머라제의 RNA 성분에 상보적인 10 내지 50개의 인접한 뉴클레오시드 하부단위를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제4 항에 있어서, 인간 텔로머라제의 RNA 성분에 상보적인 뉴클레오시드 하부단위는 모두 N3' → P5' 티오포스포르아미데이트 하부단위간 연결에 의해 결합되는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제5 항에 있어서, 인간 텔로머라제의 RNA 성분에 상보적인 뉴클레오시드 하부단위는 모두 N3' → P5' 티오포스포르아미데이트 하부단위간 연결에 의해 결합되는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제1 항에 있어서, 폴리뉴클레오티드는 GTTAGGGTTAG (서열번호 4), TAGGGTTAGACAA (서열번호 3) 및 CAGTTAGGGTTAG (서열번호 5)로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제1 항에 있어서, 폴리뉴클레오티드는 임의의 링커를 통해 지질 모이어티에 콘주게이트되는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제2 항에 있어서, 제2 폴리뉴클레오티드 염은 하기 구조를 갖는 것을 특징으로 하는 방법:
    Figure 112021140429029-pct00027

    상기 식에서 각각의 Mx+ 는 독립적으로 수소 또는 양이온성 반대이온이고, 각각의 x는 독립적으로 1, 2 또는 3이고, n은 5 내지 13의 정수이다.
  11. 제2 항 내지 제10 항 중 어느 한 항에 있어서, 용출 단계 d) 이후 제2 폴리뉴클레오티드 염은 폴리뉴클레오티드의 약제학적으로 허용가능한 염인 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제2 항 내지 제10 항 중 어느 한 항에 있어서, 용출 단계 d) 이후 제2 폴리뉴클레오티드 염은 폴리뉴클레오티드의 1가 양이온 염인 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제2 항 내지 제10 항 중 어느 한 항에 있어서, 용출 단계 d) 이후 제2 폴리뉴클레오티드 염은 폴리뉴클레오티드의 나트륨 염인 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제1 항 내지 제7 항 중 어느 한 항에 있어서, 접촉 단계 a) 전에, 폴리뉴클레오티드의 조물질 합성 제제로서 제1 폴리뉴클레오티드 조성물을 생산하기 위해 고체 상 합성 지지체로부터 폴리뉴클레오티드를 절단하는 것을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제1 항 내지 제10 항 중 어느 한 항에 있어서, 접촉 단계 a) 전에, 제1 폴리뉴클레오티드 조성물은 폴리뉴클레오티드의 1가 양이온 염을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제1 항 내지 제10 항 중 어느 한 항에 있어서, 접촉 단계 a)는 양이온 교환 지지체로부터 제1 폴리뉴클레오티드 조성물을 부하하고 용출하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 제1 항 내지 제10 항 중 어느 한 항에 있어서, 분리 단계 b)는 접촉된 제1 폴리뉴클레오티드 조성물을 원심분리하여 제1 폴리뉴클레오티드 염 침전물을 스핀 다운(spin down)하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 제1 항 내지 제10 항 중 어느 한 항에 있어서, 분리 단계 b)는 접촉된 제1 폴리뉴클레오티드 조성물로부터 제1 폴리뉴클레오티드 염을 여과하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 제2 항에 있어서, 단계 b)의 제2 폴리뉴클레오티드 조성물은 역 상 크로마토그래피 지지체 상에 직접적으로 부하되는 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 제2 항 내지 제10 항 중 어느 한 항에 있어서, 접촉 단계 c) 전에, 용매에서 제2 폴리뉴클레오티드 조성물을 용해시키는 것을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  21. 제1 항 내지 제10 항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 다가 양이온 반대이온은 2가인 것을 특징으로 하는 방법.
  22. 제21 항에 있어서, 적어도 하나의 다가 양이온 반대이온은 마그네슘, 아연, 및 칼슘으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  23. 제1 항 내지 제10 항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 다가 양이온 반대이온은 3가인 것을 특징으로 하는 방법.
  24. 제23 항에 있어서, 적어도 하나의 다가 양이온 반대이온은 알루미늄인 것을 특징으로 하는 방법.
  25. 제1 항 내지 제10 항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 폴리뉴클레오티드 염은 1가 양이온 반대이온을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  26. 조성물로서,
    적어도 하나의 다가 양이온 반대이온을 포함하는 폴리뉴클레오티드의 염 침전물을 포함하며,
    폴리뉴클레오티드는 인간 텔로머라제의 RNA 성분에 상보적인 7개 이상의 뉴클레오시드 하부단위의 서열을 갖고, 뉴클레오시드 하부단위의 적어도 2개는 N3' → P5' 티오포스포르아미데이트 하부단위간 연결에 의해 결합되는, 조성물.
  27. 제26 항에있어서, 적어도 하나의 다가 양이온 반대이온은 2가인 것을 특징으로 하는 조성물.
  28. 제27 항에 있어서, 적어도 하나의 다가 양이온 반대이온은 마그네슘, 아연, 및 칼슘으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  29. 제28 항에 있어서, 적어도 하나의 다가 양이온 반대이온은 마그네슘인 것을 특징으로 하는 조성물.
  30. 제26 항에 있어서, 적어도 하나의 다가 양이온 반대이온은 3가인 것을 특징으로 하는 조성물.
  31. 제30 항에 있어서, 적어도 하나의 다가 양이온 반대이온은 알루미늄인 것을 특징으로 하는 조성물.
  32. 제26 항 내지 제31 항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리뉴클레오티드 염은 3 mol% 이상의 다가 양이온 반대이온을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  33. 제26 항 내지 제31 항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리뉴클레오티드 염은 1.0 중량% 이상의 다가 양이온 반대이온을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  34. 제26 항 내지 제31 항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물은 침전물인 것을 특징으로 하는 조성물.
  35. 제26 항 내지 제31 항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리뉴클레오티드는 화학식 (I)로 나타난 것을 특징으로 하는 조성물:
    Figure 112021140429029-pct00028

    상기 식에서
    각각의 B는 독립적으로 퓨린, 보호된 퓨린, 피리미딘 또는 보호된 피리미딘, 또는 이의 유사체이고;
    각각의 X는 독립적으로 산소 또는 황이고;
    각각의 R3은 독립적으로 수소, 플루오로, 하이드록실, 알콕시, 치환된 알콕시 또는 보호된 하이드록실이고;
    R6은 아미노, 하이드록실, 보호된 아미노, 보호된 하이드록시, -O-T-Z 또는 -NH-T-Z이고;
    각각의 T는 독립적으로 임의의 링커이고;
    각각의 Z는 독립적으로 H, 지질, 담체, 올리고뉴클레오티드, 중합체, 폴리펩티드. 검출가능한 표지 또는 태그이고;
    n은 7 내지 100의 정수이다.
  36. 제26 항 내지 제31 항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리뉴클레오티드는 인간 텔로머라아제의 RNA 성분에 상보적인 13개 이상의 뉴클레오시드 하부단위를 포함하는 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  37. 제26 항 내지 제31 항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리뉴클레오티드는 인간 텔로머라아제의 RNA 성분에 상보적인 10개 내지 50개의 인접한 뉴클레오시드 하부단위를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  38. 제26 항 내지 제31 항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 텔로머라아제의 RNA 성분에 상보적인 뉴클레오시드 하부단위는 모두 N3' → P5' 티오포스포르아미데이트 하부단위간 연결에 의해 결합된 것을 특징으로 하는 조성물.
  39. 제26 항 내지 제31 항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리뉴클레오티드는 GTTAGGGTTAG (서열번호 4), TAGGGTTAGACAA (서열번호 3) 및 CAGTTAGGGTTAG (서열번호 5)로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  40. 제26 항 내지 제31 항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리뉴클레오티드의 5' 또는 3' 말단은 임의의 링커를 통해 지질 모이어티에 콘주게이트되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  41. 제26 항 내지 제31 항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리뉴클레오티드는 하기 구조를 갖는 것을 특징으로 하는 조성물:
    Figure 112021140429029-pct00029

    상기 식에서 각각의 Mx+는 독립적으로 양이온성 반대이온이고, 각각의 x는 1, 2 또는 3이고, n은 5 내지 12이다.
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