CN107429247A - 使用多价阳离子盐组合物制备多核苷酸的方法 - Google Patents

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Abstract

本公开各方面包括用于制备多核苷酸的方法。在一些实施方案中，所述方法包括使第一多核苷酸组合物与多价阳离子盐接触以使包含至少一个多价阳离子抗衡离子的多核苷酸盐沉淀，所述第一多核苷酸组合物包含：具有7个或更多个核苷亚基的序列的多核苷酸并且所述核苷亚基中的至少两个是通过N3'→P5'硫代氨基磷酸酯亚基间键联接合，及非靶合成产物和试剂；及将所述多核苷酸盐从所述接触的第一多核苷酸组合物中分离以产生包含所述多核苷酸盐的第二多核苷酸组合物。在某些实施方案中，所述方法进一步包括使所述多核苷酸盐与反相色谱载体接触；及从所述色谱载体洗脱出包含所述多核苷酸的第三多核苷酸组合物。还提供了包含所述多核苷酸盐的组合物，所述多核苷酸盐包含至少一个多价阳离子抗衡离子。

Description

使用多价阳离子盐组合物制备多核苷酸的方法
相关申请的交叉引用
遵照35U.S.C.§119(e)，本申请要求2015年4月23日提交的美国临时申请系列号62/151,891的申请日的优先权，其公开内容以引用的方式并入本文中。
引言
核酸聚合物化学在药学、诊断学及分析领域，并且更确切地说，在反义和抗基因疗法、组合化学、分支DNA信号扩增及基于阵列的DNA诊断和分析子领域中的许多正在开发的技术中起到作用。这种聚合物化学中有一些是针对改善如DNA等天然核酸聚合物的结合强度、特异性及核酸酶抗性。肽核酸(PNA)、硫代磷酸酯、甲基膦酸酯及氨基磷酸酯核苷间键联是被应用于多核苷酸以提供一种或多种所希望的特性，如核酸酶抗性、细胞摄取及溶解性的一些聚合物化学的实例。
多核苷酸N3'→P5'氨基磷酸酯可以与互补的DNA和RNA链形成稳定双链体，以及与DNA双链体形成稳定三链体，并且对核酸酶具有抗性。多核苷酸N3'→P5'硫代氨基磷酸酯可以在体内和体外用作有效反义试剂。含有抑制端粒酶活性的化合物的多核苷酸可以用于治疗端粒酶介导的病症，如癌症，因为癌细胞表达端粒酶活性，而正常人类体细胞在生物相关水平上不具有端粒酶活性。因此，制备和分离此类多核苷酸的方法是值得关注的。
概述
本公开各方面包括用于制备多核苷酸的方法。在一些实施方案中，该方法包括使第一多核苷酸组合物与多价阳离子盐接触以使包含至少一个多价阳离子抗衡离子的第一多核苷酸盐沉淀，所述第一多核苷酸组合物包含：具有7个或更多个核苷亚基的序列的多核苷酸，其中所述核苷亚基中的至少两个是通过N3'→P5'硫代氨基磷酸酯亚基间键联接合，及非靶合成产物和试剂；及将该多核苷酸盐从所述接触的第一多核苷酸组合物中分离以产生包含所述第一多核苷酸盐的第二多核苷酸组合物。在某些实施方案中，该方法进一步包括使该第一多核苷酸盐与反相色谱载体接触；及从所述色谱载体洗脱出包含第二多核苷酸盐的第三多聚合物组合物。还提供了包含所述多核苷酸盐的组合物，所述多核苷酸盐包含至少一个多价阳离子抗衡离子。在一些实施方案中，所述至少一个多价阳离子抗衡离子选自由镁、锌、铝及钙组成的组。
附图简述
熟练技术人员应理解，以下描述的图式仅用于说明的目的。这些图式不打算以任何方式限制本教导的范围。
图1显示在各种pH下伊美司他(Imetelstat)-Mg在1M NaCl溶液中的HPLC色谱图。
图2描绘了用各种盐处理的伊美司他钠的元素分析结果。
图3描绘了用当量递增的氯化镁盐处理的伊美司他钠的元素分析结果。
图4描绘了用当量递增的氯化镁盐处理的伊美司他TEA的元素分析结果。
定义
在更详细地描述示例性实施方案之前，陈述以下定义以说明和确定说明书中所使用的术语的含义和范围。
除非另外指示，否则以下术语具有以下含义。任何未定义的术语都具有其领域认可的含义。
如本文所使用，术语多核苷酸和寡核苷酸可互换使用，指的是含有通过核苷间键或核苷间键联连接的多个核苷部分亚基或核苷残基的化合物。在以一系列字母表示多核苷酸，如“ATGUCCTG”时，应了解，除非另外说明，否则核苷酸从左到右遵循5'→3'次序并且“A”表示脱氧腺苷，“C”表示脱氧胞苷，“G”表示脱氧鸟苷，“T”表示胸苷，并且“U”表示脱氧尿苷。
如本文所使用，“核苷”包括天然核苷，包括2'-脱氧和2'-羟基形式，例如Kornberg和Baker,DNA Replication,第2版(Freeman,San Francisco,1992)中所描述。有关核苷的“类似物”包括具有经修饰的碱基部分和/或经修饰的糖部分的合成核苷，例如Scheit,Nucleotide Analogs(John Wiley,New York,1980)中大体上描述的。所述类似物包括被设计用于增强结合特性，例如稳定性、特异性等的合成核苷，如Uhlmann和Peyman(ChemicalReviews,90:543-584,1990)中所公开的。在一些实施方案中，核苷或核苷类似物包括3’-羟基或3’-氨基。
术语“碱基”与“核碱基”可互换使用并且在本文中定义成包括(i)常规DNA和RNA碱基(尿嘧啶、胸腺嘧啶、腺嘌呤、鸟嘌呤及胞嘧啶)，及(ii)修饰的碱基或碱基类似物(例如5-甲基-胞嘧啶、5-溴尿嘧啶或肌苷)。碱基类似物是分子结构模拟常规DNA或RNA碱基的分子结构的化学物质。
如本文所使用，“嘧啶”意指存在于天然核苷中的嘧啶，包括胞嘧啶、胸腺嘧啶及尿嘧啶，及其常见类似物，如含有氧基、甲基、丙炔基、甲氧基、羟基、氨基、硫代、卤代等取代基的那些类似物。如本文所使用的术语另外包括附接有常用保护基的嘧啶，如N4-苯甲酰基胞嘧啶。所关注的其它嘧啶保护基包括但不限于，Beaucage和Iyer Tetrahedron 48:2223-2311(1992)所公开的那些保护基。
如本文所使用，“嘌呤”意指存在于天然核苷中的嘌呤，包括腺嘌呤、鸟嘌呤及次黄嘌呤，及其常见类似物，如含有氧基、甲基、丙炔基、甲氧基、羟基、氨基、硫代、卤代等取代基的那些类似物。如本文所使用的术语另外包括附接有常用保护基的嘌呤，如N2-苯甲酰基鸟嘌呤、N2-异丁酰基鸟嘌呤、N6-苯甲酰基腺嘌呤等。其它常见嘌呤保护基公开于Beaucage和Iyer Tetrahedron 48:2223-2311(1992)中。如本文所使用，作为一个化学名称的一部分的术语“-保护的”是指技术认可的用于化合物特定部分的保护基，例如关于核苷的“5'-保护的羟基”包括三苯基甲基(即，三苯甲基)、对茴香基二苯基甲基(即，单甲氧基三苯甲基或MMT)、二-对茴香基苯基甲基(即，二甲氧基三苯甲基或DMT)等；及关于核碱基的经保护核碱基包括用如二甲基氨基甲酰胺(DMF)、苯甲酰基(Bz)、异丁酰基等基团保护的杂原子。技术认可的保护基包括以下参考文献中描述的那些：Gait编辑,Oligonucleotide Synthesis:APractical Approach(IRL Press,Oxford,1984)；Amarnath和Broom,Chemical Reviews,77:183-217,1977；Pon等人,Biotechniques,6:768-775,1988；Ohtsuka等人,NucleicAcids Research,10:6553-6570,1982；Eckstein编辑,Oligonucleotides,and Analogues:A Practical Approach(IRL Press,Oxford,1991)；Greene和Wuts,Protective Groups inOrganic Synthesis,第二版(John Wiley&Sons,New York,1991)；Narang编辑,Synthesisand Applications of DNA and RNA(Academic Press,New York,1987)；Beaucage和IyerTetrahedron 48:2223-2311(1992)，及类似参考文献。
如本文所使用，“多核苷酸N3'→P5'硫代氨基磷酸酯”意指由至少一个N3'→P5'硫代氨基磷酸酯键联连接的核苷亚基的低聚物，通常呈线性。在一般意义上，这些核苷亚基包含核苷或核苷类似物，而且还可以包含具有相容化学性质的较常见部分，如无碱基糖及其它烃部分，如以下参考文献中所描述：Newton等人,Nucleic Acids Research,21:1155-1162(1993)；Griffin等人,J.Am.Chem.Soc.,114:7976-7982(1992)；Jaschke等人,Tetrahedron Letters,34:301-304(1992)；Ma等人,国际申请PCT/CA92/00423；Zon等人,国际申请PCT/US90/06630；Durand等人,Nucleic Acids Research,18:6353-6359(1990)；Salunkhe等人,J.Am.Chem.Soc.,114:8768-8772(1992)等等。在一些情形中，该术语意指所有核苷间键联都被N3'→P5'硫代氨基磷酸酯键联替代的多核苷酸。因此，该术语理解为部分以及完全地“酰胺化的”低聚物。在一些情形中，该术语意指其中所有核苷间键联都被N3'→P5'硫代氨基磷酸酯键联替代并且其中核苷亚基是天然核苷或其类似物的多核苷酸。每个键联都是N3'→P5'硫代氨基磷酸酯键联(“完全酰胺化”)的主题多核苷酸N3'→P5'硫代氨基磷酸酯可以被包埋入或附接至其它寡核苷酸或多核苷酸以形成“部分酰胺化的”较大低聚物。主题多核苷酸N3'→P5'硫代氨基磷酸酯可以包括任何适宜的3’和/或5’端基。在一些实施方案中，多核苷酸N3'→P5'硫代氨基磷酸酯包括3’-羟基端基或3’-氨基端基。
如本文所使用，术语“磷酸酯”和“磷酸酯基”意图涵盖硫代磷酸酯基和氧代磷酸酯基。
如本文所使用，术语“氨基亚磷酸酯氨基(phosphoramidite amino group)”是指附接至氨基亚磷酸酯基的磷原子的氨基，--NR4R5，并且术语“氨基亚磷酸酯氮”是指氨基亚磷酸酯氨基的氮原子。
“烷基”是指具有1至10个碳原子并且如1至6个碳原子(例如，“具有1至6个碳原子的烷基”)，或1至5个(例如，“具有1至5个碳原子的烷基”)，或1至4个(例如，“具有1至4个碳原子的烷基”)，或1至3个碳原子(例如，“具有1至3个碳原子的烷基”)的一价饱和脂肪族烃基。该术语包括例如，直链或支链烃基，如甲基(CH3-)、乙基(CH3CH2-)、正丙基(CH3CH2CH2-)、异丙基((CH3)2CH-)、正丁基(CH3CH2CH2CH2-)、异丁基((CH3)2CHCH2-)、仲丁基((CH3)(CH3CH2)CH-)、叔丁基((CH3)3C-)、正戊基(CH3CH2CH2CH2CH2-)及新戊基((CH3)3CCH2-)。
术语“被取代的烷基”是指其中烷基链中的一个或多个碳原子任选被杂原子如-O-、-N-、-S-、-S(O)n-(其中n是0至2)、-NR-(其中R是氢或烷基)替代并且具有1至5个取代基的如本文所定义的烷基，所述取代基选自由以下组成的组：烷氧基、被取代的烷氧基、环烷基、被取代的环烷基、环烯基、被取代的环烯基、酰基、酰基氨基、酰氧基、氨基、氨基酰基、氨基酰氧基、氧基氨基酰基、叠氮基、氰基、卤素、羟基、氧代、硫酮基、羧基、羧基烷基、硫代芳氧基、硫代杂芳氧基、硫代杂环氧基、硫醇、硫代烷氧基、被取代的硫代烷氧基、芳基、芳氧基、杂芳基、杂芳氧基、杂环基、杂环氧基、羟基氨基、烷氧基氨基、硝基、-SO-烷基、-SO-芳基、-SO-杂芳基、-SO2-烷基、-SO2-芳基、-SO2-杂芳基及-NRaRb，其中Ra和Rb可以相同或不同并且选自氢、任选取代的烷基、环烷基、烯基、环烯基、炔基、芳基、杂芳基及杂环基。在一些情形中，“被取代的烷基”是指具有1至5个取代基的如本文所定义的烷基，所述取代基选自由以下组成的组：烷氧基、环烷基、环烯基、酰基、酰基氨基、酰氧基、氨基、氨基酰基、氨基酰氧基、氧基氨基酰基、叠氮基、氰基、卤素、羟基、羧基、羧基烷基、硫醇、硫代烷氧基、芳基、芳氧基、杂芳基、杂芳氧基、杂环基、杂环氧基、亚磺酰氨基及-NRaRb，其中Ra和Rb可以相同或不同并且选自氢、烷基、环烷基、烯基、环烯基、炔基、芳基、杂芳基及杂环基。
“烷氧基”是指基团-O-烷基，其中烷基如本文所定义。烷氧基包括例如甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、叔丁氧基、仲丁氧基、正戊氧基等。术语“烷氧基”还指基团烯基-O-、环烷基-O-、环烯基-O-及炔基-O-，其中烯基、环烷基、环烯基及炔基如本文所定义。
术语“被取代的烷氧基”是指基团被取代的烷基-O-、被取代的烯基-O-、被取代的环烷基-O-、被取代的环烯基-O-及被取代的炔基-O-，其中被取代的烷基、被取代的烯基、被取代的环烷基、被取代的环烯基及被取代的炔基如本文所定义。
“酰基”是指基团H-C(O)-、烷基-C(O)-、被取代的烷基-C(O)-、烯基-C(O)-、被取代的烯基-C(O)-、炔基-C(O)-、被取代的炔基-C(O)-、环烷基-C(O)-、被取代的环烷基-C(O)-、环烯基-C(O)-、被取代的环烯基-C(O)-、芳基-C(O)-、被取代的芳基-C(O)-、杂芳基-C(O)-、被取代的杂芳基-C(O)-、杂环基-C(O)-及被取代的杂环基-C(O)-，其中烷基、被取代的烷基、烯基、被取代的烯基、炔基、被取代的炔基、环烷基、被取代的环烷基、环烯基、被取代的环烯基、芳基、被取代的芳基、杂芳基、被取代的杂芳基、杂环基及被取代的杂环基如本文所定义。举例来说，酰基包括“乙酰基”CH3C(O)-
术语“被取代的氨基”是指基团-NRR，其中每个R独立地选自由以下组成的组：氢、烷基、被取代的烷基、环烷基、被取代的环烷基、烯基、被取代的烯基、环烯基、被取代的环烯基、炔基、被取代的炔基、芳基、杂芳基及杂环基，条件是至少一个R不是氢。
“卤代”或“卤素”是指氟代、氯代、溴代及碘代。
“羟基”或“羟基”是指基团-OH。
“杂芳基”是指在环内具有1至15个碳原子(如1至10个碳原子)及1至10个选自由氧、氮及硫组成的组的杂原子的芳香族基团。此类杂芳基可以在环系统中具有单一环(如吡啶基、咪唑基或呋喃基)或多个缩合环(例如，如在吲哚嗪基、喹啉基、苯并呋喃、苯并咪唑基或苯并噻吩基等基团中)，其中在环系统内至少一个环是芳香族环，条件是附接点为芳香族环的原子。在某些实施方案中，杂芳基的氮和/或硫环原子任选被氧化以提供N-氧化物(N→O)、亚磺酰基或磺酰基部分。该术语包括例如吡啶基、吡咯基、吲哚基、噻吩基及呋喃基。除非杂芳基取代基的定义另外限制，否则这些杂芳基可以任选被1至5个取代基，或被1至3个取代基取代，所述取代基选自酰氧基、羟基、硫醇、酰基、烷基、烷氧基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、被取代的烷基、被取代的烷氧基、被取代的烯基、被取代的炔基、被取代的环烷基、被取代的环烯基、氨基、被取代的氨基、氨基酰基、酰基氨基、烷芳基、芳基、芳氧基、叠氮基、羧基、羧基烷基、氰基、卤素、硝基、杂芳基、杂芳氧基、杂环基、杂环氧基、氨基酰氧基、氧基酰基氨基、硫代烷氧基、被取代的硫代烷氧基、硫代芳氧基、硫代杂芳氧基、-SO-烷基、-SO-被取代的烷基、-SO-芳基、-SO-杂芳基、-SO2-烷基、-SO2-被取代的烷基、-SO2-芳基及-SO2-杂芳基，及三卤代甲基。在这些情形中，被1至5个取代基(例如，如本文所描述)取代的杂芳基称为“被取代的杂芳基”。
“杂环”、“杂环的”、“杂环烷基”及“杂环基”是指具有单一环或多个缩合环(包括稠合桥连和螺环系统)并且具有包括1至10个杂原子在内的3至20个环原子的饱和或不饱和基团。这些环原子选自由氮、硫或氧下组成的组，其中在稠合环系统中，一个或多个环可以是环烷基、芳基或杂芳基，条件是附接点是非芳香族环。在某些实施方案中，杂环基的氮和/或硫原子任选被氧化以提供N-氧化物、-S(O)-或-SO2-部分。
杂环和杂芳基的实例包括但不限于，氮杂环丁烷、吡咯、咪唑、吡唑、吡啶、吡嗪、嘧啶、哒嗪、吲嗪、异吲哚、吲哚、二氢吲哚、吲唑、嘌呤、喹嗪、异喹啉、喹啉、酞嗪、萘基吡啶、喹喔啉、喹唑啉、噌啉、蝶啶、咔唑、咔啉、菲啶、吖啶、菲咯啉、异噻唑、吩嗪、异噁唑、吩噁嗪、吩噻嗪、咪唑烷、咪唑啉、哌啶、哌嗪、吲哚啉、邻苯二甲酰亚胺、1,2,3,4-四氢异喹啉、4,5,6,7-四氢苯并[b]噻吩、噻唑、噻唑烷、噻吩、苯并[b]噻吩、吗啉基、硫代吗啉基(又称为噻吗啉基)、1,1-二氧代硫代吗啉基、哌啶基、吡咯烷、四氢呋喃基等。
除非杂环基取代基的定义另外限制，否则这些杂环基可以任选被1至5个取代基，或被1至3个取代基取代，所述取代基选自烷氧基、被取代的烷氧基、环烷基、被取代的环烷基、环烯基、被取代的环烯基、酰基、酰基氨基、酰氧基、氨基、被取代的氨基、氨基酰基、氨基酰氧基、氧基氨基酰基、叠氮基、氰基、卤素、羟基、氧代、硫酮基、羧基、羧基烷基、硫代芳氧基、硫代杂芳氧基、硫代杂环氧基、硫醇、硫代烷氧基、被取代的硫代烷氧基、芳基、芳氧基、杂芳基、杂芳氧基、杂环基、杂环氧基、羟基氨基、烷氧基氨基、硝基、-SO-烷基、-SO-被取代的烷基、-SO-芳基、-SO-杂芳基、-SO2-烷基、-SO2-被取代的烷基、-SO2-芳基、-SO2-杂芳基及稠合杂环。
“硝基”是指基团-NO2。
“氧代”是指原子(＝O)。
“硫醇”是指基团-SH。
“硫代”或术语“硫酮基”是指原子(＝S)。
除本文的公开内容外，术语“被取代的”当用于修饰指定基团或自由基时，还可以指该指定基团或自由基的一个或多个氢原子各自彼此独立地被相同或不同的如以下所定义的取代基置换。
除非另外说明，否则除关于本文的个别术语所公开的基团外，用于取代指定基团或取代基中的一个或多个氢(单一碳上的任意两个氢可以被＝O、＝NR70、＝N-OR70、＝N2或＝S置换)的取代基是-R60、卤代、＝O、-OR70、-SR70、-NR80R80、三卤代甲基、-CN、-OCN、-SCN、-NO、-NO2、＝N2、-N3、-SO2R70、-SO2O-M+、-SO2OR70、-OSO2R70、-OSO2O-M+、-OSO2OR70、-P(O)(O-)2(M+)2、-P(O)(OR70)O-M+、-P(O)(OR70)2、-C(O)R70、-C(S)R70、-C(NR70)R70、-C(O)O-M+、-C(O)OR70、-C(S)OR70、-C(O)NR80R80、-C(NR70)NR80R80、-OC(O)R70、-OC(S)R70、-OC(O)O-M+、-OC(O)OR70、-OC(S)OR70、-NR70C(O)R70、-NR70C(S)R70、-NR70CO2 -M+、-NR70CO2R70、-NR70C(S)OR70、-NR70C(O)NR80R80、-NR70C(NR70)R70及-NR70C(NR70)NR80R80，其中R60选自由以下组成的组：任选取代的烷基、环烷基、杂烷基、杂环烷基烷基、环烷基烷基、芳基、芳基烷基、杂芳基及杂芳基烷基，每个R70独立地是氢或R60；每个R80独立地是R70或替代地，两个R80’与其所键结的氮原子连一起形成5元、6元或7元杂环烷基，该杂环烷基可以任选包括1至4个选自由O、N及S组成的组相同或不同的额外杂原子，其中N可以具有-H或C1-C3烷基取代；并且每个M+是带净单一正电荷的抗衡离子。每个M+可以独立地是例如碱金属离子，如K+、Na+、Li+；铵离子，如+N(R60)4；或碱土金属离子，如[Ca2+]0.5、[Mg2+]0.5或[Ba2+]0.5(“下标0.5表示这些二价碱土金属离子的抗衡离子之一可以是本发明化合物的离子化形式并且另一抗衡离子，如氯离子，或两种本文所公开的离子化化合物可以用作这些二价碱土金属离子的抗衡离子，或双离子化的本发明化合物可以用作这些二价碱土金属离子的抗衡离子)。作为具体实例，-NR80R80意图包括-NH2、-NH-烷基、N-吡咯烷基、N-哌嗪基、4N-甲基-哌嗪-1-基及N-吗啉基。
除本文的公开内容外，在某些实施方案中，被取代的基团具有1、2、3或4个取代基，1、2或3个取代基，1或2个取代基，或1个取代基。
应了解，在以上定义的所有被取代基团中，通过具有其它取代基的取代基定义自身所得到的聚合物(例如，具有被取代芳基作为取代基的被取代芳基，其自身经被取代芳基取代，该被取代芳基又经被取代芳基取代等)不打算包括在本文中。在此类情形中，此类取代的最大次数是三次。举例来说，本文中特别涵盖的被取代芳基的一系列取代局限于被取代芳基-(被取代芳基)-被取代芳基。
除非另外指示，否则本文未明确定义的取代基的命名是通过命名官能团的末端部分，随后朝向附接点命名相邻官能团来进行。
对于含有一个或多个取代基的本文所公开的任何基团，应理解，此类基团当然不含在空间上不切实际和/或在合成上不可行的任何取代或取代模式。此外，主题化合物包括由取代这些化合物得到的所有立体化学异构体。
术语“药学上可接受的盐”意指可接受施用给患者，如哺乳动物的盐(对于给定剂量方案，抗衡离子具有可接受的哺乳动物安全性的盐)。此类盐可以衍生自药学上可接受的无机或有机碱以及药学上可接受的无机或有机酸。“药学上可接受的盐”是指一种化合物的药学上可接受的盐，这些盐衍生自本领域众所周知的多种有机和无机抗衡离子并且包括例如钠等；而且当分子含有碱性官能团时，指有机或无机酸的盐，如盐酸盐等。所关注的药学上可接受的盐包括但不限于，铝盐、铵盐、精氨酸盐、钡盐、苄青霉素盐、钙盐、胆碱盐、乙二胺盐、赖氨酸盐、锂盐、镁盐、葡甲胺盐、普鲁卡因盐、钾盐、钠盐、氨丁三醇盐、N-甲基葡糖胺盐、N,N'-二苯甲基乙二胺盐、氯代普鲁卡因盐、二乙醇胺盐、乙醇胺盐、哌嗪盐、锌盐、二异丙胺盐、三乙胺盐、二异丙基乙胺盐及三乙醇胺盐。
术语“其盐”意指当酸的质子被阳离子，如金属阳离子或有机阳离子等置换时所形成的化合物。适用时，该盐是药学上可接受的盐，不过不打算施用给患者的中间化合物的盐无需是药学上可接受的盐。举例来说，本发明化合物的盐包括该化合物被无机或有机酸质子化以形成阳离子且该无机或有机酸的共轭碱作为盐的阴离子组分的盐。所关注的盐包括但不限于，铝盐、铵盐、精氨酸盐、钡盐、苄青霉素盐、钙盐、锶盐、胆碱盐、乙二胺盐、锂盐、镁盐、葡甲胺盐、普鲁卡因盐、N-甲基葡糖胺盐、哌嗪盐、钾盐、钠盐、氨丁三醇盐、锌盐、N,N'-二苯甲基乙二胺盐、氯代普鲁卡因盐、二乙醇胺盐、乙醇胺盐、哌嗪盐、二异丙胺盐、三乙胺盐、二异丙基乙胺盐及三乙醇胺盐。应了解，对于本文所描绘的包括核苷间键联主链的任何多核苷酸结构，这些多核苷酸还可以包括任何适宜的盐形式。在一些实施方案中，为简洁起见，描绘了这些核苷间键联的酸性形式。在一些情形中，主题化合物的盐是一价阳离子盐。在某些情形中，主题化合物的盐是二价阳离子盐。在一些情形中，主题化合物的盐是三价阳离子盐。
“溶剂化物”是指通过将溶剂分子与溶质分子或离子组合而形成复合物。溶剂可以是有机化合物、无机化合物或二者的混合物。溶剂的一些实例包括但不限于，甲醇、N,N-二甲基甲酰胺、四氢呋喃、二甲亚砜及水。当溶剂是水时，所形成的溶剂化物是水合物。
“立体异构体”是指具有相同原子连接但原子空间布置不同的化合物。立体异构体包括顺-反异构体、E和Z异构体、对映异构体及非对映异构体。
“互变异构体”是指仅在原子的电子键结和/或质子位置方面不同的分子的交替形式，如烯醇-酮基和亚胺-烯胺互变异构体、-NH-P(＝S)(OH)-O-与-NH-P(＝O)(SH)-O-，或含有-N＝C(H)-NH-环原子布置的杂芳基的互变异构形式，如吡唑、咪唑、苯并咪唑、三唑及四唑。本领域普通技术人员将认识到，本文所描述的基团其它互变异构布置也是可能的。举例来说，应了解，由以下结构描述的多核苷酸：
也涵盖以下显示出键联基团的一种可能的交替互变异构布置的结构：
其中“nps”表示将一个核苷的3'-碳连接至相邻核苷的5'-碳的硫代氨基磷酸酯键联(—NH—P(＝O)(SH)—O—或—NH—P(＝S)(OH)—O—)。应了解，在描述主题化合物的基团的一种可能的互变异构布置的情况下，即使没有具体指示，该化合物的所有互变异构形式也都涵盖在一种结构内。主题化合物的基团的任何适宜的互变异构布置都可以用于描述这些化合物。
应理解，术语“或其盐或溶剂化物或立体异构体”意图包括盐、溶剂化物及立体异构体的所有组合，如主题化合物的一种立体异构体的药学上可接受的盐的溶剂化物。应了解，术语“或其盐”意图包括所有盐组合。应了解，术语“或其药学上可接受的盐”意图包括所有盐组合。应了解，术语“或其溶剂化物”意图包括所有溶剂化物组合。应了解，术语“或其立体异构体”意图包括所有立体异构体组合。应了解，术语“或其互变异构体”意图包括所有互变异构体组合。因此，例如由此可见，其意图包括主题化合物的一种立体异构体的互变异构体的药学上可接受的盐。
如本文所使用，术语“分离的”意图描述所关注化合物处于与该化合物天然存在的环境不同的环境。“分离的”意图包括化合物是在大体上富集所关注化合物和/或所关注化合物被部分或大体上纯化的样品内。
如本文所使用，术语“大体上纯化”是指将一种化合物从其天然环境中移出并且至少60％不含、至少75％不含、至少80％不含、至少81％不含、至少82％不含、至少83％不含、至少84％不含、至少85％不含、至少86％不含、至少87％不含、至少88％不含、至少89％不含、至少90％不含、至少91％不含、至少92％不含、至少93％不含、至少94％不含、至少95％不含、至少96％不含、至少97％不含、至少98％不含、至少99％不含或超过99％不含天然地与之相连的其它组分。
术语“生理条件”意图涵盖与活细胞相容的条件，例如与活细胞相容的主要含水的温度、pH、盐度等条件。
在提供一个值的范围时，应了解，除非上下文另外清楚地规定，否则在该范围的上限与下限之间的精确至下限单位的十分之一的每个中间值，以及在该所陈述的范围内的任何其它所陈述的值或中间值都涵盖在本发明的范围内。这些较小范围的上限和下限可以独立地包括在较小范围内，并且也涵盖在本发明的范围内，除非明确地排除所陈述的范围内的任何限值。在所陈述的范围包括这些限值中的一个或两个的情况下，排除了所包括的限值中的任一个或两个的范围也包括在本发明中。
须注意的是，除非上下文另外清楚地规定，否则如本文及所附权利要求书中所使用，单数形式“一个(种)(a/an)”和“所述”包括复数形式的参考物。还应注意，权利要求书可以被草拟成排除任何可选要素。因此，这一陈述意图用作结合权利要求要素的陈述使用如“唯一地”、“仅”等排他性术语，或使用“负面”限制的前提基础。
其它术语定义可以出现在本说明书上下文中。
示例性实施方案的描述
如以上所概述，本公开各态样包括用于制备多核苷酸的方法。在一些实施方案中，该方法包括使第一多核苷酸组合物与多价阳离子盐接触以使包含至少一个多价阳离子抗衡离子的第一多核苷酸盐沉淀，该第一多核苷酸组合物包含：具有7个或更多个核苷亚基的序列的多核苷酸，其中这些核苷亚基中的至少两个是通过N3'→P5'硫代氨基磷酸酯亚基间键联接合，及非靶合成产物和试剂；及将该第一多核苷酸盐从接触的第一多核苷酸组合物中分离以产生包含第一多核苷酸盐的第二多核苷酸组合物。在某些实施方案中，该方法进一步包括使该多核苷酸盐与反相色谱载体接触；及从该色谱载体洗脱出包含该多核苷酸的第三多核苷酸组合物。在一些情形中，第三多核苷酸组合物包含第二多核苷酸盐。还提供了包含多核苷酸盐的组合物，该多核苷酸盐包含至少一个多价阳离子抗衡离子。在一些实施方案中，该至少一个多价阳离子抗衡离子选自由以下组成的组：镁、锌、铝及钙。
在描述各种实施方案之前，应了解，本公开的教导不局限于所描述的特定实施方案，并因此当然可以变化。还应了解，本文所使用的术语只是出于描述特定实施方案的目的，并且不打算作限制用，因为本教导的范围只受所附权利要求书限制。
本文使用的章节标题只是出于组织目的，并且不应解释为以任何方式限制所描述的主题内容。尽管结合各种实施方案描述本教导，但本教导不打算局限于这些实施方案。相反，本领域技术人员应理解，本教导涵盖各种替代方案、修改及等效内容。
除非另外定义，否则本文是使用的所有技术和科学术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所了解相同的含义。尽管与本文所描述的方法和材料类似或等效的任何方法和材料也可以用于实践或测试本发明，但现描述所关注的方法和材料。本文提到的所有公布都是以引用的方式并入本文中，以结合所引用的公布来公开和描述所述方法和材料。
任何公布都是引用其在申请日之前的公开内容并且不应解释为承认本权利要求书无权由于在先发明而将此类公布的日期提前。另外，所提供的公布的日期可能不同于实际公布日期，这些可以独立地确认。
应理解，为清楚起见而在独立实施方案的上下文中描述的本发明的某些特征也可以组合于单一实施方案中提供。相反，为简洁起见而在单一实施方案的上下文中描述的本发明的各种特征也可以独立地或以任何适合子组合形式提供。有关本发明的实施方案的所有组合都特别地涵盖在本发明内并且公开于本文中，就如同独立并且明确地公开每一组合以使得此类组合包含主题内容一般，所述主题内容是例如化合物，即稳定化合物(即，可以被制备、分离、表征并测试生物活性的化合物)。此外，各种实施方案及其要素(例如描述此类变量的实施方案中所列化学基团的元素)的所有子组合也特定地包含在本发明中并且公开于本文中，就如同本文独立并且明确地公开每一此类子组合一般。
本文提到的所有专利和公布，包括这些专利和公布中公开的所有序列，都明确地以引用的方式并入。
在进一步描述本发明时，先较详细地描述制备多核苷酸的方法。接下来，将评述用于实践主题方法的所关注多核苷酸组合物。
制备方法
本公开各方面包括用于制备多核苷酸的方法。在一些实施方案中，该方法包括使包含多核苷酸(例如，如本文所描述)及非靶合成产物和试剂的第一多核苷酸组合物与多价阳离子盐接触以使包含至少一个多价阳离子抗衡离子的多核苷酸盐沉淀。使用主题方法沉淀多核苷酸盐去除了所有可溶性非靶合成产物和试剂。在一些实施方案中，该方法包括将多核苷酸盐从接触的第一多核苷酸组合物中分离以产生包含多核苷酸盐的第二多核苷酸组合物。在某些实施方案中，第一多核苷酸组合物、多核苷酸盐及第二多核苷酸组合物各自包括了具有7个或更多个核苷亚基的序列的靶多核苷酸，其中该核苷亚基中的至少两个是通过N3'→P5'硫代氨基磷酸酯亚基间键联(例如，如本文所描述)接合。
相较于第一多核苷酸组合物，第二多核苷酸组合物可以具有较少量的非靶合成产物和试剂。较少量的非靶合成产物和试剂意味着，相较于第一多核苷酸组合物，第二多核苷酸组合物中非靶合成产物和试剂以重量计有10％或更多减少，如以重量计15％或更多减少、以重量计20％或更多减少、25％或更多减少、以重量计30％或更多减少、以重量计35％或更多减少、以重量计40％或更多减少、以重量计45％或更多减少、以重量计50％或更多减少、以重量计55％或更多减少、以重量计60％或更多减少、以重量计65％或更多减少、以重量计70％或更多减少、以重量计75％或更多减少、以重量计80％或更多减少、以重量计85％或更多减少、以重量计90％或更多减少，或者以重量计或95％或更多减少。因此，主题方法可以相对于非靶合成产物和试剂，选择性沉淀靶多核苷酸。在某些实施方案中，相较于使用有机溶剂，如纯甲醇或乙醇溶液沉淀多核苷酸的对照方法(参见例如，Crouse J,Amorese D(1987)."Ethanol Precipitation:Ammonium Acetate as an Alternative to SodiumAcetate".Focus 9(2):3-5)，主题方法提高了沉淀的选择性。提高沉淀的选择性意味着，相较于对照组合物，以重量计5％或更多的非靶合成产物和试剂从第二多核苷酸组合物去除，如以重量计10％或更多、以重量计15％或更多、以重量计20％或更多、以重量计25％或更多、以重量计30％或更多、以重量计35％或更多、以重量计40％或更多、以重量计45％或更多、以重量计50％或更多、以重量计55％或更多、以重量计60％或更多、以重量计65％或更多、以重量计70％或更多、以重量计75％或更多、以重量计80％或更多、以重量计85％或更多、以重量计90％或更多，或者以重量计95％或更多的非靶合成产物和试剂被去除。相较于第一多核苷酸组合物，非靶合成产物和试剂的量的减少可以使用任何适宜方法，例如使用HPLC方法测定。
如本文所使用，术语“靶合成多核苷酸”和“靶多核苷酸”可互换使用并且指具有特定所希望的核苷酸序列的多核苷酸，该多核苷酸是经由任何适宜的逐步固相多核苷酸合成方法(例如，如本文所描述)在载体上合成，并且其中该多核苷酸不含仅用于执行靶多核苷酸合成策略目的的任何保护基。这些保护基可以在固相合成的最终步骤中，例如在最终多核苷酸脱保护基及从载体裂解期间从多核苷酸去除以得到靶多核苷酸。如本文所使用，术语“非靶”是指并非所希望的合成靶产物的任何适宜组分，例如化合物、多核苷酸或其衍生物、试剂等，或其混合物。
靶多核苷酸可以包括任何适宜数量的核苷亚基，如介于7个与500个之间的核苷亚基、介于7个与100个之间的核苷亚基、介于7个与75个之间的核苷亚基、介于7个与50个之间的核苷亚基、介于7个与40个之间的核苷亚基、介于7个与30个之间的核苷亚基、介于7个与20个之间的核苷亚基、介于7个与15个之间的核苷亚基、介于10个与15个之间的核苷亚基，或者介于或13个与15个之间的核苷亚基。在一些情形中，靶多核苷酸具有介于7个与100个之间的核苷亚基，如介于7个与50个之间的核苷亚基、介于10个与50个之间的核苷亚基、介于10个与40个之间的核苷亚基、介于10个与30个之间的核苷亚基、介于10个与25个之间的核苷亚基、介于10个与20个之间的核苷亚基、介于12个与18个之间的核苷亚基，或者介于12个与16个之间的核苷亚基。在某些情形中，靶多核苷酸具有7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个核苷亚基。
如本文所使用，术语“非靶合成产物和试剂”总体上指可能存在于固相多核苷酸合成的粗合成产物中的多种非靶组分，包括但不限于：该合成的非靶多核苷酸产物，如截短的多核苷酸、加帽的多核苷酸片段(即，在失败的亚基偶联之后加帽的序列)、包括缺失的多核苷酸(即，缺失一个或多个靶核苷单体或二聚体，例如本文所描述)及衍生化的多核苷酸(例如，在合成或裂解期间经历不希望的副反应的多核苷酸序列)；以及如裂解的接头、脱保护基的产物，例如去除的保护基产物，如磷保护基产物和碱基保护基产物(例如环外胺保护基产物)、裂解试剂和/或裂解清除剂和残留合成试剂，如单体、二聚体、偶联剂、加帽封端试剂或脱保护基试剂等试剂。
在某些实施方案中，相对于包括了具有6个或更少，如5个或更少、4个或更少、3个或更少核苷亚基，或者2个核苷亚基的多核苷酸的非靶合成产物和试剂，这些方法选择性沉淀靶多核苷酸。在某些情形中，不是多核苷酸的所有非靶合成产物和试剂在主题方法的选择性沉淀步骤期间都保持可溶性，并因此能够容易地从所得多核苷酸盐沉淀物去除。
主题方法可以包括靶多核苷酸从粗合成制剂沉淀及分离，以得到具有若干所希望的特性，如非靶合成产物和试剂(例如合成试剂、裂解试剂、清除剂、去除的保护基、裂解副产物(接头、加帽封端基团等)及小多核苷酸片段)的多核苷酸组合物。
在一些实施方案中，主题方法包括在色谱法纯化之前，使多核苷酸以多价阳离子盐形式从粗合成制剂沉淀。在某些情形中，主题方法是靶多核苷酸沉淀方法。使用多价阳离子盐使粗多核苷酸组合物沉淀，得到包含至少一个多价阳离子抗衡离子的多核苷酸盐沉淀物。在一些情形中，该多核苷酸盐沉淀物包括一价与多价阳离子抗衡离子的混合物，该混合物与聚阴离子多核苷酸主链形成离子对。如此处所使用，术语“多价阳离子盐”和“多价盐”当用于多核苷酸时可互换使用，指的是包括至少一个多价阳离子抗衡离子的多核苷酸盐，该抗衡离子与多核苷酸主链的阴离子亚基间键联基团形成离子对。在一些情形中，多核苷酸的多价阳离子盐包括一价与多价阳离子的混合物。在一些实施方案中，该多价阳离子可以通过与两个或更多个多核苷酸主链的阴离子亚基间键联基团形成离子对来使靶多核苷酸聚集。在某些情形中，二价阳离子与两个不同的多核苷酸形成离子对，由此形成二聚体。在一些情形中，由额外多价阳离子介导的额外多价相互作用可以是烯胺多核苷酸的进一步聚集。因此，在一些情形中，主题方法可以相对于非靶合成产物和试剂，选择性聚集和沉淀靶多核苷酸。
在该方法的一些实施方案中，该至少一个多价阳离子抗衡离子是二价的。在某些实施方案中，该至少一个多价阳离子抗衡离子选自由镁、锌及钙组成的组。在一些实施方案中，该至少一个多价阳离子抗衡离子是三价的。在某些实施方案中，该至少一个多价阳离子抗衡离子是铝。在一些实施方案中，多核苷酸盐进一步包括一价阳离子抗衡离子。在此类情形中，该多核苷酸盐是一种混合盐，例如包括两个或更多个不同阳离子抗衡离子的盐。
使多核苷酸沉淀的任何适宜方法都可以用于主题方法中。使第一多核苷酸组合物与多价阳离子盐接触以使包含至少一个多价阳离子抗衡离子的多核苷酸盐沉淀的步骤可以使用任何适宜的方法实现。任何适宜的多价阳离子及其盐(例如，如本文所描述)都可以用于该接触步骤中以产生沉淀物。在某些情形中，在溶液相中，例如经由将多价阳离子盐添加至包括该多核苷酸的溶液中来产生包括至少一个多价阳离子抗衡离子的多核苷酸盐。在将该多价阳离子盐添加至该溶液中之后，即可以形成沉淀物。在一些情形中，包括至少一个多价阳离子抗衡离子的多核苷酸盐可以在阴离子交换载体上形成。任何适宜的离子交换载体都可以用于接触步骤中。在一些情形中，该离子交换载体是强阳离子交换树脂。在该方法的一些实施方案中，接触步骤包括从阳离子交换载体洗脱出包括多价阳离子抗衡离子的第一多核苷酸组合物。如本文所使用，术语“阳离子交换载体”是指本身呈阴离子并且能够与阳离子分析物，如所关注的多价阳离子形成离子对的载体。任何适宜的洗脱液都可以用于从阳离子交换载体洗脱的步骤中。在一些情形中，在从阳离子交换载体洗脱出多核苷酸盐之后，在洗脱液中形成沉淀物。
主题方法可以对靶合成多核苷酸的任何适宜的粗合成制剂执行。在一些情形中，第一多核苷酸组合物是靶合成多核苷酸的粗合成制剂。在某些实施方案中，第一多核苷酸组合物是作为合成后从载体裂解的靶多核苷酸裂解产物的组合物。因此，第一多核苷酸组合物可以包括多种非靶合成产物和试剂。主题方法相对于非靶合成产物和试剂，选择性沉淀多核苷酸盐，这些非靶合成产物和试剂保留在溶液中并因此易于从所得沉淀物去除。
任何适宜的合成方法(例如，如本文所描述)都可以用于合成靶多核苷酸。在合成之后，靶多核苷酸从载体中裂解，是在该载体上执行逐步合成。在裂解后，可以对全长靶多核苷酸进行纯化以去除不希望的合成和裂解试剂并且去除非靶多核苷酸片段，及其衍生物。可以在制备靶多核苷酸的任何适宜阶段执行包括了沉淀包含至少一个多价阳离子抗衡离子的多核苷酸盐的主题方法，如在合成后且在反相色谱法纯化之前执行。
如本文所使用，术语“粗合成制剂”、“粗组合物”及“粗多核苷酸”是指包括了固相多核苷酸合成的合成产物的组合物，这些合成产物是在合成后经由从固相合成载体裂解进行收集，其中该组合物未纯化，即尚未对该组合物执行色谱法纯化。色谱法纯化是指任何适宜的纯化方法，该方法包括将靶多核苷酸吸收到色谱载体上，随后从非靶多核苷酸洗脱和解析出该靶多核苷酸。在一些情形中，色谱法纯化是指反相色谱法纯化。
在一些实施方案中，该方法进一步包括提供第一多核苷酸组合物，其中该组合物是经由合成后从固相合成载体裂解而得到。在将所得组合物用于主题方法中之前，还可以对粗合成制剂执行任何适宜的额外步骤，如蒸发、稀释或浓缩步骤。在一些情形中，该方法进一步包括合成靶多核苷酸(例如，如本文关于固相合成载体所描述)。在某些实施方案中，该方法进一步包括从载体裂解多核苷酸以得到第一多核苷酸组合物。
包含多核苷酸盐的固体沉淀物可以使用任何适宜方法从与多价盐接触的第一多核苷酸组合物(即，接触的第一多核苷酸组合物)中分离。所关注的分离方法包括但不限于，离心、过滤、倾析等。
在一些情形中，包括多核苷酸盐的沉淀物的分离是通过离心实现，在此情况下，在例如离心管中对接触的第一多核苷酸组合物施加离心力，使沉淀物在例如容器底部形成团粒。经由离心形成团粒可以称为使沉淀物旋降。在该方法的某些实施方案中，分离步骤包括使接触的第一多核苷酸组合物离心以使多核苷酸盐沉淀物旋降。接着，可以在不扰乱沉淀物情况下从管中倾析出上清液，或者可以用例如Pasteur移液管从容器中抽取上清液。离心过程可以在洗涤溶液存在下重复进行。
在一些情形中，包括多核苷酸盐的沉淀物的分离是通过过滤实现的。在该方法的一些实施方案中，分离步骤包括过滤出接触的第一多核苷酸中的多核苷酸盐。任何适宜的过滤器和过滤介质都可以用于主题方法中。在某些情形中，分离是通过使用根据靶多核苷酸选择的过滤介质进行深度过滤来实现。
在一些实施方案中，该方法包括：使包含以下的第一多核苷酸组合物：具有7个或更多个核苷亚基的序列的多核苷酸并且这些核苷亚基中的至少两个通过N3'→P5'硫代氨基磷酸酯亚基间键联接合；及非靶合成产物和试剂；
与多价阳离子盐接触以使包含至少一个多价阳离子抗衡离子的第一多核苷酸盐沉淀；及
将该第一多核苷酸盐从接触的第一多核苷酸组合物中分离以得到包含多核苷酸盐的第二多核苷酸组合物。
将沉淀物从接触的第一多核苷酸组合物中分离，得到包含第一多核苷酸盐的第二多核苷酸组合物。在一些情形中，经由主题方法，使用多价阳离子盐选择性沉淀第一多核苷酸盐得到了包括较少量非靶合成产物和试剂的第二多核苷酸组合物。
在选择性沉淀之后，接着可以通过阳离子交换出多核苷酸盐中至少一个多价阳离子抗衡离子并用所关注的另一阳离子抗衡离子(例如，如本文所描述)替代，来将主题多核苷酸盐转化成可溶性多核苷酸盐。因此，主题方法可逆地形成包含至少一个多价阳离子抗衡离子的第一多核苷酸盐。如本文所使用，术语“可逆形成”和“可逆交换”可互换使用并且是指通过例如选择性沉淀(例如，如本文所描述)来制备多核苷酸盐，在此情况下，所形成的盐随后还可以解离以从该盐交换出至少一种多价阳离子盐。在一些情形中，不可溶于任何溶剂中的多核苷酸盐可以称为不可逆形成的盐。在一些实施方案中，该方法包括从第一多核苷酸盐交换出该至少一个多价阳离子抗衡离子以得到可溶性第二多核苷酸盐，其中该交换包括解离该多价阳离子抗衡离子及与所关注的可溶性盐阳离子形成离子对。在某些情形中，可溶性第二多核苷酸盐是一价盐。在某些情形中，该可溶性第二多核苷酸盐是钠盐。在某些情形中，该可溶性第二多核苷酸盐是三乙铵盐。在一些情形中，该第一和第二多核苷酸彼此不同，即包括不同的阳离子抗衡离子。主题多核苷酸盐的解离及该至少一个多价阳离子抗衡离子的交换可以使用任何适宜方法实现。在某些情形中，解离是使用如本文所描述的反相色谱法实现。在一些情形中，可以利用离子交换色谱法实现解离。在某些实施方案中，第一多核苷酸盐的解离是通过将该盐溶解于包括所关注的阳离子抗衡离子的溶剂中来实现。
分离之后，可以对第二多核苷酸组合物执行进一步纯化步骤。在一些实施方案中，该方法进一步包括：使第一多核苷酸盐与反相色谱载体接触；及从该色谱载体洗脱出包含该多核苷酸的第三多核苷酸组合物。在某些实施方案中，该第三多核苷酸组合物包含第二多核苷酸盐。可以利用任何适宜的反相色谱法来纯化多核苷酸盐。所关注的反相色谱法和载体包括但不限于，使用离子对反相色谱法进行的色谱纯化、C18反相色谱法，以及Chen等人,Journal of Chromatography A,第1288卷,2013年5月3日,第73-81页；及Zimmermann等人,Journal of Chromatography A,第1354卷,2014年8月8日,第43-55页所描述的方法和载体。在一些实施方案中，第二多核苷酸组合物被直接装载至反相色谱载体上。直接装载至载体上意指，使用主题方法制造的第二多核苷酸组合物是例如以分离的固体沉淀物形式直接添加至反相色谱载体上。在一些情形中，该反相色谱载体是配置成柱形式的树脂，并且多核苷酸组合物被添加至树脂床的顶部。在某些实施方案中，该方法进一步包括将第二多核苷酸组合物溶解于溶剂中。任何适宜的溶剂都可以使用，包括但不限于，水性缓冲液、可与水混溶的有机溶剂及其混合物。在此类情形中，在洗脱前，可以使第二多核苷酸组合物的溶液与反相色谱载体接触以将多核苷酸吸收至载体上。
在一些情形中，接触包括将多核苷酸吸收至反相色谱载体上，随后洗脱该多核苷酸以色谱方式将靶多核苷酸从非靶多核苷酸和存在于组合物中的残留合成试剂解析出来。含有靶多核苷酸的洗脱液被收集起来。可以利用任何适宜的洗脱液从反相色谱载体洗脱出多核苷酸。洗脱液可以根据多种因素选择，如反相色谱载体的性质、靶寡核苷酸、具体所希望的靶多核苷酸盐等。在一些情形中，第一多核苷酸盐的至少一个多价阳离子抗衡离子在反相色谱载体上与洗脱液中所包含的另一不同的所关注阳离子抗衡离子发生离子交换。在此类情形中，当从反相色谱载体洗脱多核苷酸时，由于该至少一个多价阳离子抗衡离子从多核苷酸交换出来，故该多核苷酸呈与其装载时不同的盐形式(即，第二多核苷酸盐)。在某些情形中，第三多核苷酸组合物中从载体洗脱的多核苷酸的盐形式的水溶性高于包括至少一个多价阳离子抗衡离子的第一多核苷酸盐。
在某些实施方案中，该第三多核苷酸组合物包含为药学上可接受的多核苷酸盐的第二多核苷酸盐。在某些情形中，该第三组合物包含第二多核苷酸盐，即该多核苷酸的一价阳离子盐。在某些情形中，该第三组合物包含第二多核苷酸盐，该盐是多核苷酸的三乙铵盐。在某些情形中，该第三组合物包含第二多核苷酸盐，该盐是多核苷酸的钠盐。应了解，在利用反相色谱法纯化多核苷酸之后，可以对该多核苷酸盐执行多个进一步阳离子抗衡离子交换步骤，以得到所希望的多核苷酸盐形式。在一些实施方案中，该方法进一步包括从第二多核苷酸盐离子交换阳离子抗衡离子，以得到第三多核苷酸盐。在某些实施方案中，该第三多核苷酸盐是多核苷酸的药学上可接受的盐。在某些情形中，该第三多核苷酸盐是多核苷酸的一价阳离子盐。在某些情形中，该第三多核苷酸盐是多核苷酸的钠盐(例如，如本文所描述)。
在某些情形中，第一组合物包含多核苷酸的一价阳离子盐。在某些情形中，该一价阳离子盐选自由钠、铵及烷基铵组成的组。在某些情形中，烷基铵选自由以下组成的组：二甲基铵、甲基铵、乙基铵及三乙基铵。在某些情形中，该第一组合物包含多核苷酸的铵盐。在某些情形中，该第一组合物包含多核苷酸的烷基铵盐。在某些情形中，该第一组合物包含多核苷酸的三乙铵盐。在某些情况下，该第一组合物包含多核苷酸的钠盐。第一多核苷酸组合物可以与多价阳离子盐接触以使包含至少一个多价阳离子抗衡离子的第一多核苷酸盐沉淀。因此，在某些实施方案中，接触的第一多核苷酸组合物包含了含有至少一个多价阳离子抗衡离子的第一多核苷酸盐。
以上指示的所述方法的实施方案中的任一个的实施方案被认为包含在本发明的范围内，其中多核苷酸是如本文所描述。
合成方法
可以利用任何适宜的多核苷酸合成方法、策略及化学试剂来制备粗合成产物多核苷酸组合物，这些多核苷酸组合物可用于主题制备方法中。可以用于主题方法中的多核苷酸合成化学试剂及相关方法包括但不限于，氨基亚磷酸酯、H-膦酸酯、磷酸二酯、磷酸三酯、亚磷酸三酯。本发明化合物的多核苷酸组分可以采用适于所选化学试剂类型的任何适宜的方案合成。用于合成具有N3'→P5'硫代氨基磷酸酯化学的寡核苷酸的相关方法包括但不限于，U.S.5,824,793；McCurdy等人,(1997)Tetrahedron Letters,38:207-210；Pongracz&Gryaznov,(1999)Tetrahedron Letters,49:7661-7664；US 6,835,826、US 7,494,982、US7,485,717及US 5,684,143中所描述的方法。
在一些情形中，从靶多核苷酸序列的5’-末端开始并且直到3’-末端，经由依次偶联来合成所关注的多核苷酸。在某些情形中，从靶多核苷酸序列的3’-末端开始并且直到5’-末端，经由依次偶联来合成所关注的多核苷酸。在一些实施方案中，通过将单体氨基亚磷酸酯依次偶联至多核苷酸的生长的末端来合成多核苷酸。5’-末端核苷亚基可以经由可选接头或5’-末端基团附接至任何适宜的固体载体。在第一亚基附接至固体载体后，就可以使该亚基脱保护基以得到游离的固定化3’-末端基团。接着，可以将亚基偶联至生长的寡核苷酸链。在一些情形中，该方法包括将载体结合的3’-末端基团与3’-保护的核苷酸-5'-氨基亚磷酸酯单体偶联。在某些实施方案中，该3’-末端基团是3’-羟基。在某些实施方案中，该3’-末端基团是3’-氨基。
在一些情形中，多核苷酸合成方法包括以下步骤：(a)使附接至固相载体的末端核苷的受保护的3'-氨基脱保护，该脱保护形成游离的3'-氨基；(b)使该游离的3'-氨基与3'-保护的氨基-核苷-5'-氨基亚磷酸酯单体在亲核催化剂存在下接触以形成核苷间N3'→P5'氨基亚磷酸酯键联；及(c)氧化该键联以得到N3'→P5'硫代氨基磷酸酯键联。在一些实施方案中，该方法包括(d)重复步骤(a)至(c)，直至合成该多核苷酸。
在一些情形中，该方法包括将载体结合的3’-末端基团与3’-保护的二核苷酸-5'-氨基亚磷酸酯二聚体偶联。所关注的多核苷酸合成方法包括但不限于，PCT公布号WO2015/168310中所描述的包括至少一个二核苷酸二聚体偶联的固相合成方法，该申请要求美国临时申请系列号61/987,396的权益。靶多核苷酸序列可以经由逆合成策略合成，该逆合成策略包括将二聚体和单体亚基依次偶联至生长的寡核苷酸链的3’末端基团。在一些实施方案中，使用了包括将二核苷酸二聚体至少一次偶联至生长的多核苷酸链的3’末端基团的方法来合成多核苷酸。
在一些情形中，多核苷酸合成方法包括以下步骤：(a)使附接至固相载体的末端核苷的受保护的3'-氨基脱保护，该脱保护形成游离的3'-氨基；(b)使该游离的3'-氨基与3'-保护的氨基-二核苷酸-硫代氨基磷酸酯或氨基亚磷酸酯-5'-氨基亚磷酸酯二聚体在亲核催化剂存在下接触以形成核苷间N3'→P5'氨基亚磷酸酯键联；及(c)氧化该键联以得到N3'→P5'硫代氨基磷酸酯键联。在一些实施方案中，该方法包括(d)重复步骤(a)至(c)，直至合成多核苷酸，其中在步骤(b)中，可以利用3'-保护的氨基-二核苷酸硫代氨基磷酸酯-5'-氨基亚磷酸酯二聚体或3'-保护的氨基-核苷酸-5'-氨基亚磷酸酯单体。
任何适宜的保护基策略都可以用于主题方法中以保护多核苷酸的碱基、氨基亚磷酸酯、氨基磷酸酯、5’、2’和/或3’基团。所关注的保护基包括但不限于，Ohkubo等人,Org.Lett.,2010,12(11),第2496-2499页；及Beaucage和Iyer,Tetrahedron 48:2223-2311(1992)所描述的那些保护基。
如本文所使用，术语“磷酸酯保护基”是指可以附接至寡核苷酸的含磷亚基间键联的保护基。当存在时，磷酸酯保护基可以防止(即，阻断)在附接该磷酸酯保护基的位置处含磷键联的反应。主题磷酸酯保护基可以保护任何适宜的含磷亚基间键联(例如，P(III)和P(V)键联)，包括但不限于，氨基亚磷酸酯、氧代氨基磷酸酯、硫代氨基磷酸酯、磷酸酯、硫代磷酸酯、磷酸二酯键联等。磷酸酯保护基可以附接至含磷亚基间键联的可用氧原子。任何适宜的保护基都可以用作磷酸酯保护基。在某些实施方案中，磷酸酯保护基是甲基或或β-氰基乙基。
在一些情形中，生长的多核苷酸链的3’-末端基团可以包括3’-羟基、3’-氨基或其受保护形式。任何适宜的羟基和/或氨基保护基都可以在多核苷酸合成期间用于3’-末端基团。在一些实施方案中，3’末端基团是受保护的3’-氨基并且该方法包括脱保护基或去除该保护基以得到游离的3’氨基。如本文所使用，术语“游离氨基”意指可用于与输入的单体或二聚体的氨基亚磷酸酯基反应的氨基。在一些实施方案中，游离氨基是伯胺。在脱保护基(例如脱三苯甲基)步骤之后，氨基可以呈盐形式(例如，用于脱三苯甲基的酸的共轭碱的盐)。在脱三苯甲基步骤之后，该盐可以任选用碱性溶液，如2％三乙胺或吡啶的乙腈溶液中和。
输入亚基氨基亚磷酸酯的3’-保护防止该链发生不希望的聚合反应。在一些实施方案中，3’-末端基团是受保护的3’-羟基并且该方法包括脱保护基或去除该保护基以得到游离的3’-羟基。在一些实施方案中，3’-末端基团是受保护的3’-氨基并且该方法包括脱保护基或去除该保护基以得到游离的3’-氨基。受保护的3’-氨基或3’-羟基可以用三苯甲基保护基保护。在某些实施方案中，三苯甲基保护基是三苯基甲基(Tr或Trt、Ph3C-)。在某些实施方案中，三苯甲基保护基是4,4’-二甲氧基三苯甲基(DMT)。3’-末端氨基或羟基可以使用任何适宜的方法脱保护基。相关方法包括但不限于，Beaucage和Iyer,Tetrahedron 48:2223-2311(1992)所描述的方法。在一些情形中，末端核苷的受保护3'氨基脱保护基包括脱三苯甲基以得到游离的3’末端基团，例如酸催化的脱三苯甲基。在一些情形中，二聚体或单体亚基氨基亚磷酸酯包括与附接至固体载体的末端核苷的3’-末端基团相同的受保护3’-羟基或3’-氨基。
可以使用任何适宜的固相载体，根据主题方法合成多核苷酸。相关固体载体包括但不限于，由可控孔径玻璃(CPG)制成的微粒、高度交联的聚苯乙烯(例如，NittoPhase HL400或GE Primer 350)、丙烯酸共聚物、纤维素、尼龙、葡聚糖、乳胶、聚丙烯醛等，如以下示例性参考文献中所公开的那些：Meth.Enzymol.,第A部分,第11-147页,第44卷(AcademicPress,New York,1976)；美国专利号4,678,814、4,413,070及4,046；720；以及Pon,第19章,Agrawal编辑,Methods in Molecular Biology,第20卷(Humana Press,Totowa,N.J.,1993)。其它相关载体包括聚苯乙烯珠粒；接枝有聚乙二醇的聚苯乙烯(例如，TentaGelTM,Rapp Polymere,Tubingen Germany)等。载体特征，如材料、孔隙率、大小、形状等，以及所用连接部分的类型的选择取决于多种因素，如所采用的保护基、终产物的长度、终产物的量等。示例性连接部分公开于Pon等人,Biotechniques,6:768-775(1988)；Webb,美国专利号4,659,774；Barany等人,国际专利申请PCT/US91/06103；Brown等人,J.Chem.Soc.Commun.,1989:891-893；Damha等人,Nucleic Acids Research,18:3813-3821(1990)；Beattie等人,Clinical Chemistry,39:719-722(1993)；Maskos和Southern,Nucleic Acids Research,20:1679-1684(1992)等中。
在一些实施方案中，可用于主题方法中的固体载体包括CPG以及接枝有聚乙二醇并具有末端氨基的聚苯乙烯(例如，TentaGel-NH2 TM,Rapp Polymere,Tubingen Germany)。氨基丙基可以在CPG与核苷键联之间用作间隔基。在一些情形中，与第一核苷的5'-羟基的键联是琥珀酰基，由此提供了在合成后能够用氨水溶液裂解的碱不稳定性酯键联。
在脱保护之后，载体结合的核苷能够与二聚体或单体亚基氨基亚磷酸酯反应形成核苷间键联。应了解，载体结合的核苷可以指附接至固体载体的单一残基，或者可以指寡核苷酸链中附接至载体的末端残基。任何适宜的偶联化学、偶联试剂及方法都可以用于主题方法中。在主题方法的情况下，可以根据例如Gait编辑,Oligonucleotide Synthesis:APractical Approach(IRL Press,Oxford,1984)；Amarnath和Broom,Chemical Reviews,第77卷,第183-217页(1977)；Pon等人,Biotechniques,第6卷,第768-775页(1988)；Ohtsuka等人,Nucleic Acids Research,第10卷,第6553-6570页(1982)；Eckstein编辑,Oligonucleotides,and Analogues:A Practical Approach(IRL Press,Oxford,1991)；Greene和Wuts“Protective Groups in Organic Synthesis”,第三版,Wiley,New York1999；Narang编辑,Synthesis and Applications of DNA and RNA(Academic Press,NewYork,1987)；Beaucage和Iyer,Tetrahedron 48:2223-2311(1992)等参考文献的指导，针对偶联条件、保护基、固相载体、接头、脱保护基试剂、从固相载体裂解产物的试剂、产物纯化法等作出任何适宜选择。
在一些情形中，在偶联之后，载体结合的生长的多核苷酸链的未反应的3'-氨基可以在下一脱保护基步骤(例如脱三苯甲基步骤)之前任选用适宜的加帽封端试剂加帽以使其对后续偶联步骤呈惰性。这一加帽步骤可以改善该制剂的HPLC型态以使纯化更容易，并且还可以提高产物的总体产率。可用于主题方法中的封端试剂包括亲电子试剂，如乙酸酐和异丁酸酐；酰氯，如金刚烷基羰基氯、特戊酰氯等；异硫氰酸酯；氯代甲酸酯等。也可使用氨基亚磷酸酯与活化剂且随后氧化的组合，以及H-膦酸盐如异丙基-H-膦酸酯三乙铵与酰氯如特戊酰氯或金刚烷基羰基氯的组合。
在一些实施方案中，所述方法包括氧化核苷间N3'→P5'氨基亚磷酸酯键联。如本文所使用，涉及含磷核苷间键联的术语“氧化(oxidize/oxidation/oxidizing)”意指用于将该键联的磷原子从磷(III)形式转化成磷(V)形式的方法或处理。核苷酸间键联的氧化可以在合成中的任何适宜时间点，使用任何适宜的方法进行。在一些实施方案中，氧化是在例如每一偶联循环期间逐步进行的。在其它实施方案中，在合成结束时氧化多个核苷酸间键联。在一些情形中，氧化N3'→P5'氨基亚磷酸酯键联(例如，使用碘/水基氧化剂)产生氧代氨基磷酸酯键联。在其它情形中，氧化N3'→P5'氨基亚磷酸酯键联包括硫化产生N3'→P5'硫代氨基磷酸酯键联。硫化可以使用任何适宜的方法进行。相关硫化方法包括Gryazonov等人,WO2001018015及US6,114,519中所描述的方法。相关硫化剂包括但不限于，元素硫；二硫化秋兰姆(thiuram disulfide)，如二硫化三乙基秋兰姆；酰基二硫化物，如苯酰基二硫化物、苯基乙酰基二硫化物、硫膦基，如S-TetraTM，及1,1-二氧代-3H-1,2-苯并硫醇-3-酮。在一些实施方案中，硫化可以使用苯基乙酰基二硫化物于2,6-二甲基吡啶中进行。在某些实施方案中，硫化可以使用Beaucage试剂，使用Iyer等人,J.Organic Chemistry 55:4693-4699,1990所描述的方法进行。
可以使用任何适宜的方法和试剂将多核苷酸从固相合成载体裂解，所述方法和试剂可以取决于多种因素选择，如载体的性质、接头化学及在合成期间使用的保护基策略。在合成中作出的选择及靶多核苷酸的裂解可以决定第一多核苷酸组合物中存在的非靶合成产物和试剂的身份。
在一些实施方案中，在裂解之前，去除多核苷酸的磷保护基以避免裂解的保护基(例如，β-氰基乙基保护基)与多核苷酸形成任何可能不合需要的加合物。可用于多核苷酸脱保护和裂解的相关方法包括US7,199,236中所描述的方法。在一些实施方案中，使用氨溶液将多核苷酸从载体裂解以去除任何碱基保护基(例如，环外氨基保护基)及任何残留的磷保护基。任何适宜的条件都可以用于多核苷酸裂解反应中。在一些情形中，裂解是在40-60℃范围内的温度下进行。在一些情形中，裂解进行较长时间段，如在12-24小时范围内的时间。在多核苷酸裂解后，接着可以通过过滤去除载体并冲洗。可以在进行进一步纯化步骤之前，将现含有粗多核苷酸合成制剂的合并的滤液和冲洗溶液用于主题制备方法中。在一些情形中，多核苷酸溶液的纯化包括例如使用Kromasil C18在45-55℃下进行的制备型反相高效液相色谱法(RP-HPLC)RP HPLC。在一些情形中，主题方法的多核苷酸组合物可以经历例如通过使用配备有孔径截止大小是1,000Da的聚醚砜膜的切向流过滤(TFF)装置进行的多个适宜的脱盐和浓缩步骤。
多核苷酸组合物
本公开各方面包括了含多价阳离子抗衡离子的多核苷酸盐组合物。在一些实施方案中，该组合物包括：包含至少一个多价阳离子抗衡离子的多核苷酸盐，其中多核苷酸具有7个或更多个核苷亚基的序列且这些核苷亚基中的至少两个是通过N3'→P5'硫代氨基磷酸酯亚基间键联接合。在某些实施方案中，该多核苷酸具有与人类端粒酶的RNA组分互补的7个或更多个核苷亚基的序列。
多价阳离子抗衡离子
任何适宜的多价阳离子可以在主题多核苷酸盐中用作抗衡离子。因此，多价阳离子可以与主题多核苷酸组合物中多核苷酸主链上的阴离子位点形成离子对。多核苷酸可以包括由含磷亚基间键联(例如，P(V)键联)，如氨基磷酸酯、磷酸酯、磷酸二酯键联等连接的核苷亚基。应了解，多核苷酸的亚基间键联可以带负电荷(例如，在水溶液中)并与阳离子抗衡离子形成离子对。这些亚基间键联可以视为多核苷酸主链的阴离子基团。
如本文所使用，术语多价阳离子是指能够形成多个离子对的阳离子，例如，带多个电荷的阳离子，如带两个电荷或带三个电荷的阳离子。任何适宜的多价阳离子都可以用于主题多核苷酸盐组合物中。在一些实施方案中，多价阳离子多核苷酸主链的两个或更多个相邻阴离子基团形成离子对。在一些实施方案中，多价阳离子与多核苷酸主链的一个阴离子基团形成离子对。在一些实施方案中，多价阳离子抗衡离子是二价的。相关二价阳离子抗衡离子包括但不限于，镁、锌及钙。在一些实施方案中，多价阳离子抗衡离子是三价的。相关三价阳离子抗衡离子包括但不限于，铝。在所述组合物的某些实施方案中，所述至少一个多价阳离子抗衡离子选自由以下组成的组：镁、锌、铝及钙。在所述组合物的某些实施方案中，所述至少一个多价阳离子抗衡离子是镁。在所述组合物的某些实施方案中，所述至少一个多价阳离子抗衡离子是锌。在所述组合物的某些实施方案中，所述至少一个多价阳离子抗衡离子是铝。在所述组合物的某些实施方案中，所述至少一个多价阳离子抗衡离子是钙。
应了解，多核苷酸盐中存在的阳离子抗衡离子的数量取决于多种因素，如聚阴离子主链的长度、盐中阳离子的价态、溶液的pH、组合物中多核苷酸的聚集情况等。主题组合物可以包括至少一个针对主题多核苷酸组合物中的聚阴离子多核苷酸主链的多价阳离子抗衡离子，如2个或更多个、3个或更多个、4个或更多个、5个或更多个、6个或更多个、7个或更多个、8个或更多个、9个或更多个、10个或更多个、15个或更多个、20个或更多个、30个或更多个、40个或更多个、50个或更多个、100个或更多个，或甚至更多个多价阳离子抗衡离子。在某些实施方案中，具有n个核苷亚基的多核苷酸可以包括在1个与(n-1)/2个(如果n是奇数整数)之间的二价阳离子抗衡离子或在1个与(n-2)/2个(如果n是偶数整数)之间的二价阳离子抗衡离子。在一些情形中，包括至少一个多价阳离子的多核苷酸盐可以进一步包括多个其它阳离子抗衡离子，这些抗衡离子可以是一价、二价或三价的。在某些情形中，n的范围是7至50，如7至40、10至40、10至30、10至25、10至20，或范围是12至15个核苷亚基。
在所述组合物的一些实施方案中，相对于多核苷酸的聚阴离子主链(即，相对于沿聚阴离子主链的理论最大阳离子抗衡离子纳入量)，多核苷酸盐可以包括3mol％或更多的多价阳离子抗衡离子，如相对于多核苷酸的聚阴离子主链，4mol％或更多、5mol％或更多、6mol％或更多、7mol％或更多、8mol％或更多、9mol％或更多、10mol％或更多、11mol％或更多、12mol％或更多、13mol％或更多、14mol％或更多、15mol％或更多、16mol％或更多、17mol％或更多、18mol％或更多、19mol％或更多、20mol％或更多、25mol％或更多、30mol％或更多、35mol％或更多、40mol％或更多、45mol％或更多、50mol％或更多、55mol％或更多、60mol％或更多，或者甚至更多的多价阳离子抗衡离子。在主题组合物的一些实施方案中，相对于多核苷酸的聚阴离子主链，多核苷酸可以包括10mol％或更多的多价阳离子抗衡离子。举例来说，包括了含10个核苷间亚基键联的聚阴离子主链并且包括与两个键联形成离子对的一个二价阳离子抗衡离子的多核苷酸盐被描述为包括20mol％的二价阳离子抗衡离子。如果一个二价阳离子抗衡离子只与一个键联而非两个形成离子对，那么该多核苷酸盐被描述为包括10mol％的二价阳离子抗衡离子。因此，mol％值是指聚阴离子多核苷酸主链被多核苷酸盐中存在的多价阳离子抗衡离子占据的水平。举例来说，具有12个核苷间亚基键联的13聚体多核苷酸盐中的一个Mg2+阳离子占据16.7mol％的主链。应了解，在一些实施方案中，多核苷酸盐可以在多核苷酸的末端(例如，5’-硫代磷酸酯基)处包括额外的离子配对位点，并且如果存在额外离子配对位点，则这些位点应当计入该化合物的mol％值内。
在所述组合物的一些实施方案中，相对于多核苷酸的聚阴离子主链，多核苷酸盐包括90mol％或更少的多价阳离子抗衡离子，如70mol％或更少、65mol％或更少、60mol％或更少、50mol％或更少，或者甚至更少的多价阳离子抗衡离子。
在所述组合物的某些实施方案中，相对于多核苷酸的聚阴离子主链，多核苷酸盐包括3至90mol％的多价阳离子抗衡离子，如相对于多核苷酸的聚阴离子主链，3至65mol％(例如，6至50mol％、10至50mol％或10至40mol％)、3至50mol％、3至40mol％、3至30mol％、3至20mol％，或3至15mol％的多价阳离子抗衡离子。
在所述组合物的某些情形中，相对于多核苷酸的聚阴离子主链，多核苷酸盐包括3至60mol％的二价阳离子抗衡离子，如3至50mol％(例如，5至50mol％)、3至40mol％、3至30mol％、3至20mol％、3至15mol％，如3-12mol％的二价阳离子抗衡离子。
在所述组合物的某些情形中，相对于多核苷酸的聚阴离子主链，多核苷酸盐包括3至60mol％的镁阳离子抗衡离子，如镁，5-50mol％、5-40mol％、10-40mol％或20-40mol％的镁阳离子抗衡离子。
在所述组合物的某些情形中，相对于多核苷酸的聚阴离子主链，多核苷酸盐包括10至70mol％的三价阳离子抗衡离子，如10至60mol％、20至60mol％、20至50mol％，或30至50mol％的三价阳离子抗衡离子。在所述组合物的一些实施方案中，多核苷酸盐包括以重量计0.5％或更多的多价阳离子抗衡离子(例如，镁)，如以重量计0.6％或更多、0.7％或更多、0.8％或更多、0.9％或更多、1.1％或更多、1.2％或更多、1.3％或更多、1.4％或更多、1.5％或更多、1.6％或更多、1.7％或更多、1.8％或更多、1.9％或更多、2.0％或更多、2.1％或更多、2.2％或更多、2.3％或更多、2.4％或更多、2.5％或更多、2.6％或更多、2.7％或更多、2.8％或更多、2.9％或更多、3.0％或更多的多价阳离子抗衡离子。
多核苷酸盐是包括多价与一价阳离子抗衡离子的混合物的混合盐。在所述组合物的某些实施方案中，多核苷酸盐包括以摩尔浓度计至少0.05或更高的多价阳离子抗衡离子比一价阳离子抗衡离子比率，如以摩尔浓度计是0.10或更高、0.15或更高、0.20或更高、0.25或更高、0.30或更高、0.35或更高、0.40或更高、0.45或更高、0.50或更高、0.55或更高、0.60或更高、0.65或更高、0.70或更高，或者甚至更高的多价阳离子抗衡离子比一价阳离子抗衡离子比率。
在一些情形中，多核苷酸盐包括以摩尔浓度计1:12的多价比一价阳离子抗衡离子比率。在一些情形中，多核苷酸盐包括以摩尔浓度计1:11的多价比一价阳离子抗衡离子比率。在一些情形中，多核苷酸盐包括以摩尔浓度计1:10的多价比一价阳离子抗衡离子比率。在一些情形中，多核苷酸盐包括以摩尔浓度计1:9的多价比一价阳离子抗衡离子比率。在一些情形中，多核苷酸盐包括以摩尔浓度计1:8的多价比一价阳离子抗衡离子比率。在一些情形中，多核苷酸盐包括以摩尔浓度计1:7的多价比一价阳离子抗衡离子比率。在一些情形中，多核苷酸盐包括以摩尔浓度计1:6的多价比一价阳离子抗衡离子比率。在一些情形中，多核苷酸盐包括以摩尔浓度计1:5的多价比一价阳离子抗衡离子比率。在一些情形中，多核苷酸盐包以摩尔浓度计1:4的多价比一价阳离子抗衡离子比率。在一些情形中，多核苷酸盐包括以摩尔浓度计2:9的多价比一价阳离子抗衡离子比率。在一些情形中，多核苷酸盐包括以摩尔浓度计3:7的多价比一价阳离子抗衡离子比率。在一些情形中，多核苷酸盐包括以摩尔浓度计4:5的多价比一价阳离子抗衡离子比率。在一些情形中，多核苷酸盐包括以摩尔浓度计5:3的多价比一价阳离子抗衡离子比率。
在所述混合多核苷酸盐的某些情形中，多价阳离子抗衡离子是镁并且一价阳离子抗衡离子是钠。在所述混合多核苷酸盐的某些情形中，多价阳离子抗衡离子是镁并且一价阳离子抗衡离子是铵。在所述混合多核苷酸盐的某些情形中，多价阳离子抗衡离子是镁并且一价阳离子抗衡离子是三乙铵。在所述混合多核苷酸盐的某些情形中，多价阳离子抗衡离子是铝。在所述混合多核苷酸盐的某些情形中，多价阳离子抗衡离子是锌。在所述混合多核苷酸盐的某些情形中，多价阳离子抗衡离子是钙。在所述混合多核苷酸盐的某些情形中，一价阳离子抗衡离子是钠。在所述混合多核苷酸盐的某些情形中，一价阳离子抗衡离子是铵。在所述混合多核苷酸盐的某些情形中，一价阳离子抗衡离子是三乙铵。在某些实施方案中，多核苷酸盐包括1个多价阳离子抗衡离子。在某些实施方案中，多核苷酸盐包括2个多价阳离子抗衡离子。在某些实施方案中，多核苷酸盐包括3个多价阳离子抗衡离子。在某些实施方案中，多核苷酸盐包括4个多价阳离子抗衡离子。在某些实施方案中，多核苷酸盐包括5个多价阳离子抗衡离子。在某些实施方案中，多核苷酸盐包括6个多价阳离子抗衡离子。在某些实施方案中，多核苷酸盐包括7个多价阳离子抗衡离子。在某些实施方案中，多核苷酸盐包括8个多价阳离子抗衡离子。在某些实施方案中，多核苷酸盐包括9个多价阳离子抗衡离子。在某些实施方案中，多核苷酸盐包括10个多价阳离子抗衡离子。
除靶多核苷酸外，在多核苷酸合成期间，还可以产生多种非靶多核苷酸合成产物。多核苷酸制剂中可能存在的微量产物包括但不限于，缺失产物(例如，缺乏一个或多个核苷残基的产物)、包括一个或多个保护基的产物、封端产物(例如，包括加帽的多核苷酸链的产物)、缺乏一个或多个核碱基的产物、包括部分氧化的氨基亚磷酸酯键联的产物以及包括部分硫化的键联的产物。
主题方法提供了这样一类组合物，在该组合物中包括纯度提高的靶多核苷酸。在一些实施方案中，该组合物包括以重量计20％或更多的靶多核苷酸，如以重量计25％或更多、30％或更多、35％或更多、40％或更多、45％或更多、50％或更多、60％或更多、70％或更多、80％或更多、90％或更多，或者甚至95％或更多的靶多核苷酸。在某些实施方案中，该组合物包括以重量计50％或更多的靶多核苷酸。在某些实施方案中，该组合物包括以重量计55％或更多的靶多核苷酸。在某些实施方案中，该组合物包括以重量计60％或更多的靶多核苷酸。在某些实施方案中，该组合物包括以重量计65％或更多的靶多核苷酸。在某些实施方案中，该组合物包括以重量计70％或更多的靶多核苷酸。在某些实施方案中，该组合物包括以重量计75％或更多的靶多核苷酸。在某些实施方案中，该组合物包括以重量计80％或更多的靶多核苷酸。在某些实施方案中，该组合物包括以重量计85％或更多的靶多核苷酸。在某些实施方案中，该组合物包括以重量计90％或更多的靶多核苷酸。在某些实施方案中，该组合物包括以重量计95％或更多的靶多核苷酸。
主题方法提供了包括减少量的非靶合成产物和试剂的组合物。减少量意指在组合物中非靶合成产物和试剂的量以重量计相对于对照方法减少。在一些实施方案中，主题组合物在该组合物中包括50％或更少总非靶多核苷酸的量的非靶合成产物和试剂，如40％或更少、30％或更少、25％或更少、20％或更少、15％或更少、10％或更少，或者甚至5％或更少的非靶合成产物和试剂。
多种多核苷酸组合物中的任一种都可以使用本文所描述的方法制备。值得关注的是，多种类别和类型的多核苷酸都是使用主题方法(例如，如本文所描述)制备。适于根据主题方法制备的多核苷酸包含但不限于，反义多核苷酸、RNA多核苷酸、siRNA多核苷酸、RNAi多核苷酸、DNA适体、微RNA等。
在一些实施方案中，该多核苷酸以式(I)描述：
其中：
每个B独立地是嘌呤、受保护的嘌呤、嘧啶或受保护的嘧啶，或其类似物；
每个X独立地是氧或硫；
每个R3独立地是氢、氟、羟基、烷氧基、被取代的烷氧基或受保护的羟基；
R6是氨基、羟基、受保护的氨基、受保护的羟基、-O-T-Z或-NH-T-Z；
每个T独立地是可选接头；
每个Z独立地是H、脂质、载体、寡核苷酸、聚合物、多肽、可检测标记，或标签；并且
n是1至1000的整数。应了解，式(I)的寡核苷酸可以呈盐形式存在。因此，式(I)的核苷间键联可以呈包括任何适宜的抗衡离子的盐形式。此类形式意图包括在本公开的范围内。应了解，式(I)中所描述的多核苷酸的核苷间键联的其它互变异构布置也是可能的。此类形式意图包括在本公开的范围内。
在式(I)的一些实施方案中，每个R3是氢。在式(I)的一些实施方案中，每个R3是氟。在式(I)的一些实施方案中，每个R3是羟基。在式(I)的一些实施方案中，R6是氨基。在式(I)的某些实施方案中，R6是羟基。在式(I)的一些实施方案中，Z是H。在式(I)的一些实施方案中，Z是脂质(例如，如本文所描述)。在某些情形中，该脂质是脂肪酸(例如，如本文所描述)。在式(I)的一些实施方案中，Z是载体。在式(I)的一些实施方案中，Z是寡核苷酸。在式(I)的一些实施方案中，Z是聚合物。在某些情形中，该聚合物是PEG。在式(I)的一些实施方案中，Z是多肽。在式(I)的一些实施方案中，Z是可检测标记。在式(I)的一些实施方案中，Z是标签。在式(I)的一些实施方案中，T不存在。在一些实施方案中，每个B独立地选自A、C、G、T及U。
在式(I)的某些实施方案中，n是介于7与500之间，如介于7与100之间、介于7与75之间、介于7与50之间、介于7与40之间、介于7与30之间、介于7与20之间、介于7与15之间、介于10与15之间，或介于13与15之间的整数。在某些实施方案中，n是介于7与100之间，如介于7与50之间、介于10与50之间、介于10与40之间、介于10与30之间、介于10与25之间、介于10与20之间、介于12与18之间，或介于12与16之间的整数。在某些实施方案中，n是7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25。
与端粒酶RNA组分互补的多核苷酸
本公开各方面包括了含与端粒酶的RNA组分互补的多核苷酸的化合物和组合物，及其制备方法。所述化合物可以在高效力下抑制端粒酶活性并且具有细胞摄取特征。
在某些情形中，该多核苷酸包含7个或更多个与人端粒酶的RNA组分互补的核苷亚基，如8个或更多个、9个或更多个、10个或更多个、11个或更多个、12个或更多个、13个或更多个、14个或更多个、15个或更多个、20个或更多个、30个或更多个、50个或更多个与人端粒酶的RNA组分互补的核苷亚基的序列。
在一些实施方案中，该多核苷酸包含介于3个与50个之间的与人端粒酶的RNA组分互补的连续核苷亚基，如介于5个与40个之间、介于7个与40个之间、10个与40个之间、介于10个与30个之间、介于10个与25个之间、介于10个与20个之间，或介于12个与15个之间的核苷亚基。在某些实施方案中，该多核苷酸包含7个或更多个与人端粒酶的RNA组分互补的连续核苷亚基，如10个或更多个、11个或更多个、12个或更多个、13个或更多个、14个或更多个、15个或更多个、20个或更多个、30个或更多个、50个或更多个与人端粒酶的RNA组分互补的连续核苷亚基的序列。
在一些实施方案中，该多核苷酸是下式所描述的化合物：
O-(x-L)n
其中O表示包括与人端粒酶的RNA组分互补的核苷亚基的序列的多核苷酸，x是可选接头，L表示脂质部分并且n是1至5的整数。在一些情形中，n是5。在一些情形中，n是4。在一些情形中，n是3。在一些情形中，n是2。在一些情形中，n是1。因此，所述化合物的设计需要选择两个实体，即O和L，并且确定这些实体之间可能涉及可选接头x的结构键联。
在一些实施方案中，该多核苷酸化合物可以由下式描述：
O-(x-L)n
其中O表示包括与人端粒酶的RNA组分互补的核苷亚基的序列的多核苷酸，x是可选接头，L表示脂质部分并且n是1，如式(I)的多核苷酸或其盐，其中在式(I)中，Z是脂质部分，T是可选接头(例如，如本文所描述)并且B基团对应于与人端粒酶的RNA组分互补的核苷亚基的序列。
多核苷酸组分O可以视为化合物的“效应子”组分，因为这一组分通过结合至端粒酶的RNA组分实现对端粒酶的抑制。因此，选择的O序列应使其包括与端粒酶RNA序列互补的区域，如SEQ ID NO:1中所示。与端粒酶RNA组分互补的区域在理论上可以靶向端粒酶RNA任何部分，但对于抑制性多核苷酸，端粒酶RNA的特定区域是优选的靶。一个优选的靶区是跨SEQ ID NO:1的核苷酸30-67的区域，该区域包括“模板区”，这是一个具有序列5'-CUAACCCUAAC-3'(SEQ ID NO:21)并且跨SEQ ID NO:1的核苷酸46-56的包含11个核苷酸的区域。该模板区用于指明端粒酶添加至染色体末端并且对端粒酶活性至关重要的端粒重复序列(参见Chen等人,Cell 100:503-514,2000；Kim等人,Proc.Natl.Acad.Sci.,USA 98(14):7982-7987,2001)。因此，含有的多核苷酸部分包括与全部或一部分模板区互补的序列的相关化合物是值得关注的。另一值得关注的靶区是跨hTR的核苷酸137-179的区域(参见Pruzan等人,Nucl.Acids Research,30:559-588,2002)。在此区域内，跨141-153的序列是优选的靶。PCT公布WO 98/28442使用至少7个核苷酸长度的多核苷酸抑制端粒酶，其中这些多核苷酸被设计成与在模板区外的hTR序列的可接近部分，包括hTR的核苷酸137-196、290-319及350-380互补。
在一些情形中，靶向hTR序列的O区与相应hTR序列完全互补。尽管在某些情形中可能容许错配，但预期这些错配会降低所得多核苷酸缀合物的特异性和活性。在一些实施方案中，由此选择的多核苷酸O的碱基序列包括与端粒酶RNA完全互补的至少5个核苷酸的序列，并且如果采用长度增加的互补序列，如至少6个、至少7个、至少8个、至少10个、至少12个、至少13个或至少15个与端粒酶RNA完全互补的核苷酸，则可以增强端粒酶的抑制。在其它实施方案中，多核苷酸序列包括由至少7至20个、至少8至20个、至少10至20个或至少10至15个核苷酸构成的与端粒酶RNA序列完全互补的序列。当所选多核苷酸O的全长与端粒酶RNA互补时，可以获得最佳的端粒酶抑制活性。然而，多核苷酸组分的全长不必与靶序列完全互补，并且多核苷酸序列可以包括与靶序列不互补的区域。可以添加这些序列以例如赋予化合物其它特性，如有助于纯化的序列。如果多核苷酸组分O包括与靶序列不互补的区域，则这些区域可以位于5′或3′末端中的一个或两个处。在将具有完全互补性的区域靶向模板区的情况下，利用在5′端接合类端粒酶(富含G)序列的具有完全互补性的较短区域(5-8个核苷酸)可以有效抑制端粒酶。
与人端粒酶RNA互补并且可以包括作为多核苷酸组分O的一部分，或可以用作整个多核苷酸组分O的示例性序列包括以下：
hTR互补序列(美国公布2012329858中具有多核苷酸序列SEQ ID NO：1的区域)；
GGGUUGCGGA GGGUGGGCCU GGGAGGGGUG GUGGCCAUUU UUUGUCUAAC CCUAACUGAGAAGGGCGUAG GCGCCGUGCU UUUGCUCCCC GCGCGCUGUU UUUCUCGCUG ACUUUCAGCG GGCGGAAAAGCCUCGGCCUG CCGCCUUCCA CCGUUCAUUC UAGAGCAAAC AAAAAAUGUC AGCUGCUGGC CCGUUCGCCCCUCCCGGGGA CCUGCGGCGG GUCGCCUGCC CAGCCCCCGA ACCCCGCCUG GAGGCCGCGG UCGGCCCGGGGCUUCUCCGG AGGCACCCAC UGCCACCGCG AAGAGUUGGG CUCUGUCAGC CGCGGGUCUC UCGGGGGCGAGGGCGAGGUU CAGGCCUUUC AGGCCGCAGG AAGAGGAACG GAGCGAGUCC CCGCGCGCGG CGCGAUUCCCUGAGCUGUGG GACGUGCACC CAGGACUCGG CUCACACAUGC(SEQ ID NO：1)
GCTCTAGAATGAACGGTGGAAGGCGGCAGG 137-166(SEQ ID NO：2)
GTGGAAGGCGGCAGG 137-151(SEQ ID NO：6)
GGAAGGCGGCAGG 137-149(SEQ ID NO：7)
GTGGAAGGCGGCA 139-151(SEQ ID NO：8)
GTGGAAGGCGG 141-151(SEQ ID NO：9)
CGGTGGAAGGCGG 141-153(SEQ ID NO：10)
ACGGTGGAAGGCG 142-154(SEQ ID NO：11)
AACGGTGGAAGGCGGC 143-155(SEQ ID NO：12)
ATGAACGGTGGAAGGCGG 144-158(SEQ ID NO：13)
ACATTTTTTGTTTGCTCTAG 160-179(SEQ ID NO：14)
TAGGGTTAGACAA 42-54(SEQ ID NO：3)
GTTAGGGTTAG 46-56(SEQ ID NO：4)
GTTAGGGTTAGAC 44-56(SEQ ID NO：15)
GTTAGGGTTAGACAA 42-56(SEQ ID NO：16)
GGGTTAGAC 44-52(SEQ ID NO：19)
CAGTTAGGG 50-58(SEQ ID NO：20)
CCCTTCTCAGTT 54-65(SEQ ID NO：17)
CGCCCTTCTCAG 56-67(SEQ ID NO：18)
在一些实施方案中，多核苷酸包含选自由以下组成的组的序列：GTTAGGGTTAG(SEQID NO：4)；TAGGGTTAGACAA(SEQ ID NO：3)；及CAGTTAGGGTTAG(SEQ ID NO：5)。
用于合成O组分的核苷间键联的类型的选择可以由任何可用的多核苷酸化学物质作出，包括但不限于，磷酸二酯、磷酸三酯、甲基膦酸酯、P3′→N5′氨基磷酸酯、N3′→P5′氨基磷酸酯、N3′→P5′硫代氨基磷酸酯及硫代磷酸酯键联。在一些实施方案中，多核苷酸组分O具有至少一个N3′→P5′硫代氨基磷酸酯键联。在某些实施方案中，与人端粒酶的RNA组分互补的核苷亚基都通过N3′→P5′硫代氨基磷酸酯亚基间键联接合。在某些情形中，N3′→P5′硫代氨基磷酸酯亚基间键联具有以下结构：
3'—NH—P(S)(OR)—O—5’
其中R是氢，或其盐。应了解，对于本文所描述的包括此类亚基间键联的多核苷酸组分O，这些多核苷酸组分O还可以包括该键联的任何适宜的盐形式。因此，该亚基间键联可以呈包括任何适宜的抗衡离子的盐形式。
在一些实施方案中，至少两个核苷亚基是通过N3'→P5'硫代氨基磷酸酯亚基间键联接合，并且其它亚基间键联各自独立地选自N3'→P5'氧代氨基磷酸酯和N3'→P5'硫代氨基磷酸酯亚基间键联。在一些实施方案中，核苷亚基是通过亚基间键联接合，这些亚基间键联各自独立地选自N3'→P5'氧代氨基磷酸酯和N3'→P5'硫代氨基磷酸酯亚基间键联。在一些实施方案中，核苷亚基是通过亚基间键联接合，这些亚基间键联各自独立地选自N3'→P5'氧代氨基磷酸酯和N3'→P5'硫代氨基磷酸酯亚基间键联；条件是，至少两个核苷亚基是通过N3'→P5'硫代氨基磷酸酯亚基间键联接合。在一些实施方案中，核苷亚基都是通过N3'→P5'硫代氨基磷酸酯亚基间键联接合。
在一些实施方案中，多核苷酸组分O具有序列TAGGGTTAGACAA(SEQ ID NO:3)，并且核苷亚基是通过包含至少一个N3'→P5'硫代氨基磷酸酯键联的亚基间键联接合。在一些实施方案中，多核苷酸组分O具有序列TAGGGTTAGACAA(SEQ ID NO:3)，并且核苷亚基是通过包含至少两个N3'→P5'硫代氨基磷酸酯键联的亚基间键联接合。在一些实施方案中，多核苷酸组分O具有序列TAGGGTTAGACAA(SEQ ID NO:3)，并且核苷亚基是通过包含至少三个N3'→P5'硫代氨基磷酸酯键联的亚基间键联接合。在一些实施方案中，多核苷酸组分O具有序列TAGGGTTAGACAA(SEQ ID NO:3)，并且核苷亚基是通过包含至少四个N3'→P5'硫代氨基磷酸酯键联的亚基间键联接合。在一些实施方案中，多核苷酸组分O具有序列TAGGGTTAGACAA(SEQ ID NO:3)，并且核苷亚基是通过包含至少五个N3'→P5'硫代氨基磷酸酯键联的亚基间键联接合。在一些实施方案中，多核苷酸组分O具有序列TAGGGTTAGACAA(SEQ ID NO:3)，并且核苷亚基是通过包含至少六个N3'→P5'硫代氨基磷酸酯键联的亚基间键联接合。在一些实施方案中，多核苷酸组分O具有序列TAGGGTTAGACAA(SEQ ID NO:3)，并且核苷亚基是通过包含至少七个N3'→P5'硫代氨基磷酸酯键联的亚基间键联接合。在一些实施方案中，多核苷酸组分O具有序列TAGGGTTAGACAA(SEQ ID NO:3)，并且核苷亚基是通过包含至少八个N3'→P5'硫代氨基磷酸酯键联的亚基间键联接合。在一些实施方案中，多核苷酸组分O具有序列TAGGGTTAGACAA(SEQ ID NO:3)，并且核苷亚基是通过包含至少九个N3'→P5'硫代氨基磷酸酯键联的亚基间键联接合。在一些实施方案中，多核苷酸组分O具有序列TAGGGTTAGACAA(SEQ ID NO:3)，并且核苷亚基是通过包含至少十个N3'→P5'硫代氨基磷酸酯键联的亚基间键联接合。在一些实施方案中，多核苷酸组分O具有序列TAGGGTTAGACAA(SEQ ID NO:3)，并且核苷亚基是通过包含至少十一个N3'→P5'硫代氨基磷酸酯键联的亚基间键联接合。在一些实施方案中，多核苷酸组分O具有序列TAGGGTTAGACAA(SEQ ID NO:3)，并且核苷亚基是通过亚基间键联接合，这些亚基间键联各自独立地选自N3'→P5'氧代氨基磷酸酯和N3'→P5'硫代氨基磷酸酯亚基间键联。在一些实施方案中，多核苷酸组分O具有序列TAGGGTTAGACAA(SEQ ID NO:3)，并且核苷亚基是通过亚基间键联接合，这些亚基间键联各自独立地选自N3'→P5'氧代氨基磷酸酯和N3'→P5'硫代氨基磷酸酯亚基间键联；条件是，至少两个核苷亚基是通过N3'→P5'硫代氨基磷酸酯亚基间键联接合。在一些实施方案中，多核苷酸组分O具有序列TAGGGTTAGACAA(SEQ ID NO:3)，并且核苷亚基都是通过N3'→P5'硫代氨基磷酸酯亚基间键联接合。
在上文和下文的所有实施方案中，N3'→P5'硫代氨基磷酸酯亚基间键联尤其是是—NH—P(＝O)(SH)—O—或其互变异构体，或其盐；并且N3'→P5'氧代氨基磷酸酯亚基间键联尤其是—NH—P(＝O)(OH)—O—或其互变异构体，或其盐。更确切地说，在上文和下文的所有实施方案中，N3'→P5'硫代氨基磷酸酯亚基间键联尤其是—NH—P(＝O)(SH)—O—或其互变异构体，或其钠盐；并且N3'→P5'氧代氨基磷酸酯亚基间键联尤其是—NH—P(＝O)(OH)—O—或其互变异构体，或其钠盐。
在这些实施方案之一中，本发明涉及本文所描述的特定结构中的任一种，其中任选一个或多个，特别是一个N3'→P5'硫代氨基磷酸酯亚基间键联被N3'→P5'氧代氨基磷酸酯亚基间键联替代。在这些实施方案之一中，本发明涉及本文所描述的特定结构中的任一种，其中一个或多个，特别是一个N3'→P5'硫代氨基磷酸酯亚基间键联被N3'→P5'氧代氨基磷酸酯亚基间键联替代。
在一些情形中，主题化合物比未缀合至脂质组分的相应多核苷酸有效地在细胞中产生端粒酶抑制作用。相信脂质组分L用于增进该化合物的细胞摄取，特别是促进通过细胞膜。尽管导致此发生的机制尚未完全阐明，但一种可能性是，该脂质组分可以促进化合物以单一分子或聚集体(胶束)形式结合至细胞膜，随后进行内化。不过，无需了解待用主题化合物的精确机制。
脂质组分可以是相较于未修饰多核苷酸提供增强的细胞摄取的任何脂质或脂质衍生物。相关脂质包括但不限于，烃类、脂肪(例如，甘油酯、脂肪酸及脂肪酸衍生物，如脂肪酰胺)及固醇。在脂质组分是烃的情况下，L组分可以是被取代或未被取代的环状烃，或者直链或支链脂肪烃，该烃可以是饱和或不饱和的。实例包括完全饱和或多不饱和直链非支链烃。烃链的长度可以在C2-C30间变化，但用C8-C22碳链可以获得最佳的端粒酶抑制。相关饱和烃(烷烃)的实例列于下：
系统名/碳链
十四烷C14H30
十五烷C15H32
十六烷C16H34
十七烷C17H36
十八烷C18H38
十九烷C19H40
二十烷C20H42
也可以选择单不饱和及多不饱和形式(烯烃和聚烯，如二烯烃和三烯烃)的烃，其中具有一个至三个双键的化合物是值得关注的，不过也可以采用具有更多双键的化合物。还可以利用炔烃(含有一个或多个三键)及烯炔(三键和双键)。
在主题化合物中可以使用烃之经取代形式，其中在体内和体外呈惰性的取代基是值得关注的。在一些情形中，取代基是氟。多氟代烃的示例性一般结构包括：CF3(CF2)n—(CH2)m-，其中m是至少1，在一些情形中是至少2，并且n是1至30，如氟代十三烷：CF3(CF2)9(CH2)3；及CH3(CH2)a(CF2)b(CH2)c-，其中a、b及c独立地是1-30。
其它适合的相关脂质组分包括但不限于，简单脂肪酸和脂肪酸衍生物、甘油酯及更复杂的脂质，如固醇，例如胆固醇。相关脂肪酸及其衍生物可以是完全饱和或者单不饱和或多不饱和的。烃链的长度可以在C2-C30间变化，但用C8-C22碳链可以获得最佳端粒酶抑制。相关饱和脂肪酸的实例列于下：
系统名/惯用名/碳链
十四烷酸肉豆蔻酸14:0
十六烷酸棕榈酸16:0
十八烷酸硬脂酸18:0
二十烷酸花生酸20:0
也可以采用单不饱和及多不饱和形式的脂肪酸，其中具有一个至三个双键的化合物是值得关注的，不过也可以采用具有更多双键的化合物。可以采用的相关常见单不饱和及多不饱和脂肪酸的实例包括：
系统名/惯用名/碳链
顺-9-十六烷酸棕榈烯酸16:1(n-7)
顺-6-十八烷酸岩芹酸18:1(n-12)
顺-9-十八烷酸油酸18:1(n-9)
9,12-十八碳二烯酸亚油酸18:2(n-6)
6,9,12-十八碳三烯酸γ-亚麻酸18:3(n-6)
9,12,15-十八碳三烯酸α-亚麻酸18:3(n-3)
5,8,11,14-二十碳四烯酸花生四烯酸20:4(n-6)
在碳链中具有一个或多个三键的脂肪酸，以及支化脂肪酸也可以用于主题化合物中。被取代形式的脂肪酸可以用于主题化合物中。与烃基相同，在体内和体外呈惰性的取代基是值得关注的，如氟。适用于本发明中的脂肪酸的多氟代衍生物的示例性一般结构是：CF3(CF2)n—(CH2)mCO—，其中m是至少1，优选是至少2，并且n是1至30，及CH3(CH2)a(CF2)b(CH2)cCO—，其中a、b及c独立地是1-30。
在一些情形中，介于一个与五个之间的L组分(n是1、2、3、4或5)经由任选地接头共价连接至O组分。在一些情形中，利用了一个或两个L组分(n＝1或2)。在将超过一个L组分连接至O组分的情况下，每个L组分是独立地选择的。
应理解，描述为具有指定烃作为L部分的本发明化合物与描述为具有指定脂肪酸(碳原子数量与该指定烃相同)的化合物密切相关并且结构差异仅在于将L部分接合至多核苷酸的键的性质，而这又是用于制造该化合物的合成程序的结果。举例来说，并且如以下更详细地描述，当合成具有L部分缀合至多核苷酸(具有氨基磷酸酯或硫代氨基磷酸酯核苷间键联)的3'-氨基末端的化合物时，使用呈醛形式的脂肪酸(脂肪醛)作为起始物质使得在脂质链与多核苷酸之间形成胺键联，由此使脂质基团呈烃形式。相比之下，使用该脂肪酸的羧酸、酸酐或酰氯形式使得形成酰胺键联，由此使脂质基团呈脂肪酸衍生物形式，特别是在此情形中，呈脂肪酰胺形式(如以上定义部分中所述，为简洁起见，当描述缀合的L基团时，术语“脂肪酸”在本文中以广义使用，包括脂肪酸衍生物，包括脂肪酰胺在内)。这在以下示意图中示出，这些示意图描绘了接合至C14脂质组分的氨基磷酸酯多核苷酸的3'-氨基末端。在示意图A中，L是十四烷酸(肉豆蔻酸)，其中L基团与O基团之间的连接是酰胺。在示意图B中，L是十四烷，并且L基团与O基团之间的连接是胺。
示意图A
示意图B
在O组分与L组分之间的键联可以是直接键，或者可以经由可选接头部分，例如x或式(I)的可选接头T。该接头可以用于促进化合物的化学合成。无论是否使用接头基团介导O组分与L组分的缀合，多核苷酸组分O上都存在适宜缀合L组分的多个位点。适合的键联点包括多核苷酸的5'和3'末端、一个或多个糖环、核苷间主链及核碱基。在一些情形中，L部分附接至多核苷酸的3'或5'末端。
如果打算将L组分附接至3'末端，则可以直接附接至3'取代基，在优选的氨基磷酸酯和硫代氨基磷酸酯多核苷酸情况下，该取代基是3'-氨基，而在其它情形中，如对于常规磷酸二酯多核苷酸，该取代基是3-羟基。或者，L部分可以经由3'-连接的磷酸酯基连接，其中十六烷烃通过O-烷基接头连接至硫代氨基磷酸酯多核苷酸的3'磷酸酯。如果将L部分连接至5'末端，则它可以通过5'-连接的磷酸酯基附接。与O部分上的碱基的附接可以通过任何适合的原子进行，例如附接至鸟苷的N2氨基。当n>1使得多个脂质部分将附接至O组分时，个别地选择的L组分可以在任何适宜的位点附接。举例来说，一个L基团可以附接至每个末端，各种L基团可以附接至碱基，或者两个或更多个L基团可以在一个末端附接。
可以使用可选接头组分x接合化合物的O组分与L组分。应了解，该可选接头(例如，x，或式(I)的T)可以通过末端磷酸酯基，例如3’-连接或5’-连接的磷酸酯基附接至多核苷酸(例如，O)。如果打算采用接头，则将其并入本文所描述的合成程序中。适合接头的实例包括氨基甘油及O-烷基甘油型接头，这些接头分别可以由以下一般结构描绘：
其中R'是H、OH、NH2或SH；Y是O、S或NR；R是H、烷基或被取代的烷基；并且n和m各自独立地是介于1-18之间的整数。适合的相关接头的实例包括其中R'是OH，Y是O并且m和n各自是1的氨基甘油接头：
其中R'是OH，Y是NH并且m和n各自是1的双氨基甘油接头：
及其中R是H的O-烷基甘油接头：
可以根据主题方法制备的示例性脂质修饰多核苷酸包含颁予Gryaznov等人的美国申请US20120329858“Modified oligonucleotides for telomerase inhibition”的图1A中所描述的化合物，该案的公开内容以引用的方式整体并入本文中。
在某些实施方案中，所述组合物包括由以下结构描述的化合物：
或其盐，其中“nps”表示硫代氨基磷酸酯键联(例如，—NH—P(＝O)(SH)—O—或其互变异构体，或其盐)，用于将一个核苷的3'-碳连接至相邻核苷的5'-碳。应了解，上式所描述的化合物可以呈盐形式存在。预期化合物可能存在的这些形式都包括在本公开的范围内。在某些实施方案中，所述组合物包括该化合物的药学上可接受的盐。在某些情形中，所述组合物包括该化合物的钠盐。在某些实施方案中，所述组合物包括该化合物的二价阳离子盐，如该化合物的镁盐。在某些实施方案中，所述组合物包括该化合物的三价阳离子盐，如该化合物的铝盐。
在某些实施方案中，所述组合物包括由以下结构描述的化合物：
其中每个Mx+独立地是氢或盐的任何适宜的抗衡离子，每个x独立地是1、2或3并且n是5至13的整数。在一些情形中，n是5、6、7、8、9、10、11、12或13。在某些情形中，每个x独立地是1、2或3并且n是5至12的整数。在某些情形中，n是13。在某些情形中，每个x是1。在某些情形中，每个x独立地是1或2。在某些情形中，每个x独立地是1或3。在某些情形中，每个Mx+独立地是阳离子性抗衡离子。在某些情形中，每个Mx+独立地是阳离子性抗衡离子，每个x独立地是1、2或3并且n是5至12的整数。在某些情形中，每个Mx+独立地是氢或任何适宜的阳离子性抗衡离子，每个x独立地是1、2或3并且n是5至12的整数。在某些情形中，Mx+是氢。在一些实施方案中，(Mx+)n是(Mg2+)(M+)11。在一些实施方案中，(Mx+)n是(Mg2+)2(M+)9。在一些实施方案中，(Mx+)n是(Mg2+)2(M+)9。在一些实施方案中，(Mx+)3是(Mg2+)3(M+)7。在一些实施方案中，(Mx +)n是(Mg2+)4(M+)5。在一些实施方案中，(Mx+)n是(Mg2+)5(M+)3。在一些实施方案中，(Mx+)n是(Mg2+)6(M+)。在一些实施方案中，(Mx+)n是(Mg2+)(M+)12，其中Mg2+抗衡离子可以与另一寡核苷酸的阴离子性主链形成额外离子对。在一些实施方案中，(Mx+)n是(Mg2+)2(M+)11，其中Mg2+抗衡离子可以与一个或两个寡核苷酸的阴离子性主链形成两个额外的离子对。在某些情形中，混合镁盐的M+抗衡离子是钠。在某些情形中，混合镁盐的M+抗衡离子是铵。在某些情形中，混合镁盐的M+抗衡离子是三乙铵。
在某些实施方案中，所述组合物包括由以下结构描述的化合物并且可以包括盐的任何适宜的阳离子性抗衡离子：
在某些实施方案中，所述组合物包括由以下结构描述的化合物：
脂质修饰的多核苷酸
取决于所选键联的性质，可以使用多种合成方法将脂质部分L缀合至多核苷酸，包括Mishra等人,(1995)Biochemica et Biophysica Acta,1264:229-237；Shea等人,(1990)Nucleic Acids Res.18:3777-3783；及Rump等人,(1998)Bioconj.Chem.9:341-349中所描述的方法。在多核苷酸的5'或3'末端缀合脂质部分的化合物的合成可以通过在适当末端使用能够与羧酸、酰氯、酸酐及活性酯反应的适合官能团，在一些情形中使用氨基或羟基来实现。硫醇基也可以用作官能团(参见Kupihar等人,(2001)Bioorganic and MedicinalChemistry 9:1241-1247)。用于多核苷酸合成的具有不同链长的氨基-和硫醇基-修饰剂是可商购的。具有N3'→P5'硫代氨基磷酸酯键联的多核苷酸含有3'-氨基(不是最常见的多核苷酸化学物质中所见的3'-羟基)，并因此，这些多核苷酸对于将脂质基团缀合至多核苷酸的3'-端提供了唯一机会。
可以使用各种方法将脂质基团通过N3'→P5'硫代氨基磷酸酯化学(例如，棕榈酰胺基-1-O-(4,4’-二甲氧基三苯甲基)-2-O-琥珀酰基丙二醇接头)附接至多核苷酸的末端。对于附接至3'末端，可以通过使完全保护的固体载体结合的多核苷酸的游离3'-氨基与相应酸酐反应，随后在氨存在下脱保护并纯化来合成缀合的化合物。或者，使用偶联剂，如碳化二亚胺、HBTU(N,N,N',N'-四甲基-O-(1H-苯并三唑-l-基)脲鎓六氟磷酸盐)或2-氯-1-甲基碘化吡啶将脂质的羧酸偶联至载体结合的多核苷酸的游离3'-氨基，可以用来缀合脂质基团。这两种方法在脂质与多核苷酸之间形成酰胺键。还可以在链延长期间，使用偶联至多核苷酸的脂质的氨基亚磷酸酯衍生物将脂质附接至多核苷酸链。此方法得到了连接脂质与多核苷酸(例如，丙基-棕榈酰基和2-羟基-丙基-棕榈酰基化合物)的氨基磷酸酯(例如硫代氨基磷酸酯)键联。又另一方法涉及使完全保护的载体结合的多核苷酸的游离3'-氨基与适合的脂质醛反应，随后用氰基硼氢化钠还原，得到胺键联。
对于附接至5'末端，可以使用改性的含脂质固体载体，随后如Pongracz&Gryaznov(1999)中所描述，沿5’至3’方向合成多核苷酸，由此合成多核苷酸。改性的载体的实例提供于下。在n＝14的情形中，脂肪酸是棕榈酸；3-氨基-1,2-丙二醇与棕榈酰氯反应，随后二甲氧基三苯甲基化和琥珀酰基化，得到用于偶联至固体载体的中间物。在一些情形中，R可以是长链烷基胺可控孔径玻璃。在某些情形中，R是聚合物固体载体。
效用
本发明的方法和组合物，例如，如上文所描述，可用于多种应用中。相关应用包括但不限于，治疗应用、诊断应用、研究应用及筛选应用，如下文更详细地评述。
主题化合物可用于多种治疗应用中。在一些实施方案中，制造多核苷酸的方法被用于制备提供治疗益处的多核苷酸。使用本发明组合物可治疗的疾病类型是无限制的。举例来说，这些组合物可以用于治疗多种遗传疾病。在一些实施方案中，主题方法和组合物具有反义应用。在一些实施方案中，主题方法和组合物具有抗基因应用。在某些实施方案中，主题方法和组合物具有端粒酶抑制应用，如美国专利6,835,826和美国公布20120329858中所描述的应用，其公开内容以引用的方式整体并入本文中。
本公开提供了可以特异性并且有效地抑制端粒酶活性，并因此可以用于抑制端粒酶阳性细胞，如肿瘤细胞的增殖的化合物。经显示，许多的癌细胞呈端粒酶阳性，包括来自皮肤癌、结缔组织癌、脂肪组织癌、乳腺癌、肺癌、胃癌、胰腺癌、卵巢癌、子宫颈癌、子宫癌、肾癌、膀胱癌、结肠癌、前列腺癌、中枢神经系统(CNS)癌症、视网膜癌及血液肿瘤(如骨髓瘤、白血病及淋巴瘤)的细胞。相关癌症包括但不限于，骨髓纤维化、血小板增多症、骨髓增生异常综合征(myelodysplasic syndrome)及骨髓性白血病。
主题化合物可以用于治疗血液恶性疾病及骨髓增生性病症，包括但不限于，特发性血小板增多症(ET)、真性红细胞增多症(PV)慢性骨髓性白血病(CML)、骨髓纤维化(MF)、慢性中性粒细胞白血病、慢性嗜酸性粒细胞白血病及急性骨髓性白血病(AML)。主题化合物可以用于治疗骨髓增生异常综合征，包括如难治性贫血、难治性贫血伴原始细胞增多、难治性血细胞减少伴多系发育异常、难治性血细胞减少伴单系发育异常，及慢性骨髓单核细胞性白血病(CMML)等疾病。主题化合物以用于治疗血液疾病，如2013年11月15日提交的PCT专利申请PCT/US13/070437中所描述的疾病，该申请的公开内容以引用的方式整体并入本文中。
因此，本文提供的化合物可广泛用于治疗众多恶性疾病。在一些情形中，主题化合物可以有效提供在很大程度上区分恶性细胞与正常细胞的治疗，由此避免了当前利用依赖无差别地杀灭分裂细胞的药剂的大部分化疗方案所存在的许多有害副作用。此外，在一些情形中，主题脂质修饰的化合物比等效的未缀合寡核苷酸有效，这意味着，这些化合物可以用较低剂量施用，提供增强的安全性及明显降低的治疗成本。可以将端粒酶抑制剂与其它癌症治疗方法结合使用，包括手术去除原发肿瘤、化学治疗剂及放射治疗。因此，本发明涉及用作药物的本文所提供的化合物和组合物。本发明还涉及用于治疗或预防前文提到的任一种恶性疾病的本文所提供的化合物和组合物。
主题化合物和方法可用于多种诊断应用中，包括但不限于，开发临床诊断剂，例如体外诊断剂或体内肿瘤显影剂。这些应用可用于诊断或确诊疾病病状，或其易感性。所述方法还可用于监测先前已诊断患有疾病的患者的疾病进展和/或对治疗的反应。
实施例
实施例1：概述
这些实施例描述了由伊美司他的钠盐形式制备伊美司他的各种二价或三价形式，如Ca、Ba、Mg、Al、Fe、Cu及Zn的实验。在这些实验中，评价了使用制备方法提高纯度的情况，这些制备方法涉及能够与伊美司他的一个、两个或三个磷酸酯基结合的二配位基或三配位基阳离子的盐的形成和分离。还研究了所得盐形式的溶解性和渗透压。
使用CaCl2、MgCl2、BaCl2、CuCl2、ZnCl2、AlCl3、FeCl2及FeCl3研究伊美司他钙、伊美司他钡、伊美司他镁、伊美司他铝、伊美司他铁(II或III)及伊美司他铜盐的制备。
研究了三种盐交换方法：使用强阳离子交换树脂(FINEX MFG 210)、沉淀及简单溶解。当使伊美司他钠溶液通过树脂，与CaCl2、BaCl2或MgCl2发生交换时，洗出液含有细粉，表明钠抗衡离子成功地从伊美司他主链交换出来并且被钙、钡或镁抗衡离子替代。对于与阳离子交换树脂平衡的其它五种试剂(CuCl2、ZnCl2、AlCl3、FeCl2、FeCl3)，当伊美司他溶液通过时，色谱柱中树脂的顶部变得聚集，表明钠抗衡离子成功地从伊美司他主链交换出来。
另外，使用过量的盐试剂测试沉淀和溶解。当用伊美司他钠处理大量过量的盐试剂(例如900当量)时，形成沉淀。通过过滤分离沉淀。随后的测试表明，将所有伊美司他转化成沉淀需要七至五十当量的无机盐试剂。
用伊美司他TEA(三乙铵)盐形式或伊美司他Na盐形式分别测试五当量的所述三种无机盐(Mg、Ba或Ca)。确定未发生沉淀，并且将溶液脱盐并冷冻干燥。通过Flame AA(原子吸收)分析冷冻干燥的粉末显示，伊美司他的一些钠抗衡离子被交换。
用MgCl2，使用相对于伊美司他形式一至九当量的镁阳离子进行额外实验。钠抗衡离子部分交换成Mg抗衡离子，其中最大交换出现在九当量的MgCl2，由此得到的组合物显示以重量计1.2％的Na和以重量计1.1％的Mg。
实施例2：材料和设备
用于本研究的无机试剂、有机溶剂及其它材料列于表1中。使用由Geron提供的批号是G163/L-G-13002的伊美司他钠(目录号1007380-31-5)进行研究。伊美司他铵是使用氨和乙醇从固相合成载体裂解伊美司他得到的粗组合物(例如，如Gryaznov等人于US20120329858中所描述)，并且是从制造商的储备物获得。伊美司他TEA(三乙铵形式)是从使用含乙酸三乙铵(TEAA)的流动相的HPLC纯化柱洗出液得到的组合物(例如，如Gryaznov等人于US20120329858中所描述)并且是由从各种工艺开发研究得到的制造商储备物获得。超滤是使用带有1KD PES膜的搅拌式超滤器(Stirred Ultrafiltration Cell)(Amicon8400,Millipore)进行。冻干是使用快速真空浓缩器(Speed Vacuum Concentrator)(ScanSpeed 40,LaboGene)进行。
实施例3：程序
通过离子交换树脂柱交换
准备一个柱体积是200mL(4.6cm×12cm)的强阳离子交换树脂柱FINEX MFG 210，并且用1M NaOH和水洗涤树脂。接着，该柱用1M的各相关盐溶液平衡。总的说来，在这些实验中制备并使用八种1M盐溶液(CaCl2、MgCl2、BaCl2、CuCl2、ZnCl2、AlCl3、FeCl2及FeCl3)。向柱中添加50mL的100mg/mL伊美司他钠溶液。
在CuCl2、ZnCl2、AlCl3、FeCl2及FeCl3平衡的柱的情况下，当将伊美司他钠装载至柱上时，在柱顶部中观察到伊美司他聚集在树脂上。
用CaCl2、MgCl2及BaCl2盐溶液平衡的三个柱不会在柱上引起任何伊美司他聚集并且从柱洗出液中回收到伊美司他，其看起来呈混浊溶液形式。通过离心(4000rpm，20min)，从这些洗出液回收到细粉。在离心后，通过HPLC分析确定上清液不含任何伊美司他。这表明成功地实现伊美司他钙、镁及钡盐的沉淀和分离。
通过沉淀
使用大量过量的相关无机盐(900当量，以重量计)研究伊美司他的二价或三价形式的结晶或沉淀。制备1M CaCl2、MgCl2、BaCl2、CuCl2、ZnCl2、AlCl3、FeCl2及FeCl3盐溶液。将以下三种类型的伊美司他溶液与各盐溶液混合：粗伊美司他溶液(铵盐)、纯化的伊美司他(三乙铵(TEA)盐形式)及伊美司他钠(Na盐形式)。
所有混合溶液都显示伊美司他的沉淀物，通过用Advantec 2滤纸过滤容易地分离出这些沉淀物。此结果表明，成功地实现多价伊美司他盐的沉淀和分离。
最初，使用以下溶剂研究在盐试剂大量过量条件下分离的沉淀物的溶解性：水、乙腈、MeOH、EtOH、IPA(异丙醇)、0.1M NaOH、0.1M HCl、1M NaCl及NMP。
对于在大量过量的盐试剂中沉淀的盐，伊美司他的钙盐、钡盐及镁盐可溶于0.1MNaOH和1M NaCl溶液中(参见表2)。从大量过量的镁盐试剂获得的伊美司他沉淀物的溶解性研究是在不同浓度(2mg/mL至6mg/mL)的1M NaCl溶液中并且在不同pH值条件(pH 8、9、10、11、12)下进行，并通过HPLC分析(参看图1的色谱图)。据观察，伊美司他沉淀物在6mg/mL及pH 11至pH 12下可溶。该化合物还在高达pH 12下显示稳定性，无任何沉淀物(图1)。
通过溶解
30至50当量的盐试剂
通过逐步添加相关盐试剂来研究可以完全沉淀伊美司他的相关盐试剂的当量数。对于表3中所列的八种盐，在7至50当量所添加的盐试剂的范围内观察到沉淀物的完全形成。当添加更多当量的盐试剂时，对于所有盐观察到形成凝胶并伴随沉淀的倾向。
使用以下三种类型的伊美司他溶液：粗伊美司他铵(粗品形式)、伊美司他三乙铵(纯化的TEA盐形式)及伊美司他钠(Na盐形式)，将其与各盐溶液混合。使用的伊美司他铵盐呈NH4OH溶液或水溶液形式。伊美司他铵和伊美司他TEA溶液分别需要约50当量或30当量的镁盐试剂，来实现完全沉淀。
在从pH 8至pH 12的各种pH值条件下，研究由伊美司他TEA溶液和伊美司他铵溶液形成的沉淀物的溶解性。在使混合溶液在RT下保持6小时之后，利用在260nm下的UV吸光度来分析伊美司他-Mg沉淀物的溶解性。由伊美司他铵和由伊美司他TEA获得的沉淀物显示类似的倾向，即在高pH值下，较多的伊美司他盐溶解于1M NaCl溶液中(参见表3)。
此结果表明，当相对于伊美司他的相关盐试剂的当量数受到控制时，可以通过任何适宜的方法实现伊美司他盐的完全沉淀，以得到沉淀物，该沉淀物可以成功地再溶解。
5当量盐试剂
将伊美司他钠溶液(100mg于1mL水中)与5当量的八种盐试剂混合，并且使用搅拌式超滤器和1KD膜，通过超滤使各溶液脱盐。接着，将超滤的溶液冻干。通过Flame AA(原子吸收光谱法分析所得粉末的Na和各相关金属抗衡离子的含量。如图2和3中所示，对于Zn、Al及Mg，最高金属抗衡离子含量是以重量计1.1％，其中Na含量分别是2.6％、1.7％及2.6％。
6至9当量盐试剂
向伊美司他钠溶液中添加6至9当量的镁盐试剂，随后超滤并冻干，得到固体产物，该产物可完全溶解于水中。对钠和镁含量进行分析(参见图3中的结果)。向伊美司他钠溶液中添加九当量的MgCl2，得到Na和Mg抗衡离子含量以重量计分别是1.1％和1.2％的组合物。
1至10当量的盐试剂
为了研究相较于伊美司他钠盐，Mg与伊美司他TEA盐中TEA抗衡离子的交换情况，设计并执行另一组实验。将一至十当量的MgCl2水溶液与伊美司他TEA盐溶液(HPLC测定纯度>90％)混合。在超滤和冻干后，分析Mg抗衡离子含量。结果显示于图4中。添加多达10当量的MgCl2试剂得到以重量计具有1.6％Mg的组合物。
实施例4：结论
制备伊美司他的二价和三价盐形式，包括钙盐、镁盐、锌盐、铝盐、钡盐、铁(II)盐、铁盐(III)及铜盐。当使用控制过量的所选无机盐试剂(参见表2和3)使多核苷酸沉淀时，形成沉淀物，这些沉淀物随后可以再溶解，并且相对于使用HPLC分析快速洗脱的杂质，显示出提高的纯度。
使用镁盐试剂在交换步骤之后得到可溶性伊美司他固体沉淀物。得到的沉淀物具有相对于以重量计1.1％的钠抗衡离子，以重量计1.2％的镁抗衡离子。
使用二价或三价盐沉淀伊美司他用于去除保留在溶液中的非靶合成产物和试剂。去除粗伊美司他溶液中存在的此类杂质为随后伊美司他的色谱纯化步骤提供了若干益处，如减小柱装载量、提高解析度、减少色谱纯化步骤的数量和提高色谱柱的寿命、降低纯化成本以及加快纯化。
表1.无机盐、有机溶剂及其它材料
表2
(O：是，X：否，“-”意思是未进行)
*在乙腈、MeOH、EtOH、IPA、水、NMP、1M HCl、1M NaCl、1M NaOH中测试
**在乙腈、MeOH、EtOH、IPA、水、NMP、1M HCl、1M NaCl中测试
表3
尽管附有权利要求书，但本文陈述的公开内容也由以下各条款定义：
1.一种制备多核苷酸的方法，所述方法包括：
使包含以下的第一多核苷酸组合物：
具有7个或更多个核苷亚基的序列的多核苷酸并且所述核苷亚基中至少两个是通过N3'→P5'硫代氨基磷酸酯亚基间键联接合；及
非靶合成产物和试剂；
与多价阳离子盐接触以使包含至少一个多价阳离子抗衡离子的第一多核苷酸盐沉淀；及
将所述第一多核苷酸盐从所述接触的第一多核苷酸组合物中分离以得到包含所述第一多核苷酸盐的第二多核苷酸组合物。
2.如第1条所述的方法，进一步包括使所述第一多核苷酸盐与反相色谱载体接触；及从所述色谱载体洗脱出包含第二多核苷酸盐的第三多核苷酸组合物。
3.如第1条至第2条中任一条所述的方法，其中所述多核苷酸包含含有13个或更多个与人端粒酶的RNA组分互补的核苷亚基的序列。
4.如第1条至第3条中任一条所述的方法，其中所述多核苷酸包含介于10个与50个之间的与人端粒酶的RNA组分互补的连续核苷亚基。
5.如第3条至第4条中任一条所述的方法，其中与所述人端粒酶的RNA组分互补的所述核苷亚基全都是通过N3'→P5'硫代氨基磷酸酯亚基间键联接合。
6.如第1条至第5条中任一条所述的方法，其中所述多核苷酸包含由以下组成的组的序列：GTTAGGGTTAG(SEQ ID NO:4)、TAGGGTTAGACAA(SEQ ID NO:3)及CAGTTAGGGTTAG(SEQID NO:5)。
7.如第1条至第6条中任一条所述的方法，其中所述多核苷酸是经由可选接头缀合至脂质部分。
8.如第2条至第7条中任一条所述的方法，其中所述第二多核苷酸盐具有结构：
其中每个Mx+独立地是氢或阳离子性抗衡离子，每个x独立地是1、2或3并且n是5至13的整数。
9.如第2条至第8条中任一条所述的方法，其中所述第二多核苷酸盐是所述多核苷酸的药学上可接受的盐。
10.如第2条至第9条中任一条所述的方法，其中所述第二多核苷酸盐是所述多核苷酸的一价阳离子盐。
11.如第2条至第10条中任一条所述的方法，其中所述第二多核苷酸盐是所述多核苷酸的钠盐。
12.如第1条至第5条中任一条所述的方法，进一步包括将所述多核苷酸从载体中裂解以得到所述第一多核苷酸组合物。
13.如第1条至第12条中任一条所述的方法，其中所述第一组合物包含所述多核苷酸的一价阳离子盐。
14.如第1条至第13条中任一条所述的方法，其中所述接触步骤包括从阳离子交换载体洗脱出所述第一多核苷酸组合物。
15.如第1条至第14条中任一条所述的方法，其中所述分离步骤包括对所述接触的第一多核苷酸组合物离心以使所述多核苷酸盐沉淀物旋降。
16.如第1条至第15条中任一条所述的方法，其中所述分离步骤包括过滤来自所述接触的第一多核苷酸的所述多核苷酸盐。
17.如第2条所述的方法，其中将所述第二多核苷酸组合物直接装载至所述反相色谱载体上。
18.如第1条至第17条中任一条所述的方法，进一步包括将所述第二多核苷酸组合物溶解于溶剂中。
19.如第1条至第18条中任一条所述的方法，其中所述至少一个多价阳离子抗衡离子是二价的。
20.如第19条所述的方法，其中所述至少一个多价阳离子抗衡离子选自由镁、锌及钙组成的组。
21.如第1条至第18条中任一条所述的方法，其中所述至少一个多价阳离子抗衡离子是三价的。
22.如第21条所述的方法，其中所述至少一个多价阳离子抗衡离子是铝。
23.如第1条至第22条中任一条所述的方法，其中所述多核苷酸盐进一步包含一价阳离子抗衡离子。
24.一种组合物，包含：含有至少一个多价阳离子抗衡离子的多核苷酸的盐；其中所述多核苷酸具有7个或更多个与所述人端粒酶的RNA组分互补的核苷亚基的序列并且所述核苷亚基中的至少两个是通过N3'→P5'硫代氨基磷酸酯亚基间键联接合。
25.如第24条所述的组合物，其中所述至少一个多价阳离子抗衡离子是二价的。
26.如第25条所述的组合物，其中所述至少一个多价阳离子抗衡离子选自由镁、锌及钙组成的组。
27.如第24条至第26条中任一条所述的组合物，其中所述至少一个多价阳离子抗衡离子是镁。
28.如第24条所述的组合物，其中所述至少一个多价阳离子抗衡离子是三价的。
29.如第28条所述的组合物，其中所述至少一个多价阳离子抗衡离子是铝。
30.如第24条至第29条中任一条所述的组合物，其中相对于所述多核苷酸的聚阴离子主链，所述多核苷酸包含3mol％或更多的所述多价阳离子抗衡离子。
31.如第24条至第29条中任一条所述的组合物，其中相对于所述多核苷酸，所述多核苷酸包含以重量计1.0％或更多的所述多价阳离子抗衡离子。
32.如第24条至第31条中任一条所述的组合物，其中所述组合物是沉淀物。
33.如第24条至第32条中任一条所述的组合物，其中所述多核苷酸包含含有13个或更多个与所述人端粒酶的RNA组分互补的核苷亚基的序列。
34.如第24条至第33条中任一条所述的组合物，其中所述多核苷酸包含介于10个与50个之间的与所述人端粒酶的RNA组分互补的连续核苷亚基。
35.如第24条至第34条中任一条所述的组合物，其中与所述人端粒酶的RNA组分互补的所述核苷亚基全都是通过N3'→P5'硫代氨基磷酸酯亚基间键联接合。
36.如第24条至第35条中任一条所述的组合物，其中所述多核苷酸包含选自由以下组成的组的序列：GTTAGGGTTAG(SEQ ID NO:4)、TAGGGTTAGACAA(SEQ ID NO:3)及CAGTTAGGGTTAG(SEQ ID NO:5)。
37.如第24条至第36条中任一条所述的组合物，其中所述多核苷酸是经由可选接头缀合至脂质部分。
38.如第24条至第37条中任一条所述的组合物，其中所述多核苷酸具有结构：
其中每个Mx+独立地是阳离子性抗衡离子，每个x是1、2或3并且n是5至12。
尽管为了理解清楚的目的已经借助于说明和实施例较详细地描述上述发明，但根据本发明的教导，对本领域普通技术人员显而易见的是，在不背离所附权利要求书的精神或范围的情况下，可以对本发明进行某些改变和修改。
因此，前述仅仅说明本发明的原理。应理解，本领域技术人员将能够设想各种安排，虽然这些安排未在本文中明确描述或显示，但能体现本发明的原理并且包括在本发明的精神和范围内。另外，本文所引用的所有实施例和条件性语言主要旨在帮助读者了解本发明的原理以及本发明人所提供的概念以促进技术发展，并且应解释为不局限于这些具体陈述的实施例和条件。此外，本文中关于陈述本发明的原理、方面及实施方案以及其具体实施例的所有表述都意图涵盖其结构和功能等效物。另外，预期这些等效物包括当前已知的等效物以及将来会开发的等效物，即，所开发的执行相同功能的任何要素，不管结构如何。因此，本发明的范围不打算局限于本文所显示和描述的实施方案。实际上，本发明的范围和精神是由所附实施方案体现。以上指示的实施方案的所有可能组合都被认为包含在本发明的范围内。
序列表
<110> 美国杰龙生物医药公司
P·H·拉米亚
<120> 使用多价阳离子盐组合物制备多核苷酸的方法
<130> 186/002
<150> US 62/151,891
<151> 2015-04-23
<160> 23
<170> 用于Windows的FastSEQ 4.0版
<210> 1
<211> 451
<212> RNA
<213>人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 1
ggguugcgga gggugggccu gggaggggug guggccauuu uuugucuaac ccuaacugag 60
aagggcguag gcgccgugcu uuugcucccc gcgcgcuguu uuucucgcug acuuucagcg 120
ggcggaaaag ccucggccug ccgccuucca ccguucauuc uagagcaaac aaaaaauguc 180
agcugcuggc ccguucgccc cucccgggga ccugcggcgg gucgccugcc cagcccccga 240
accccgccug gaggccgcgg ucggcccggg gcuucuccgg aggcacccac ugccaccgcg 300
aagaguuggg cucugucagc cgcgggucuc ucgggggcga gggcgagguu caggccuuuc 360
aggccgcagg aagaggaacg gagcgagucc ccgcgcgcgg cgcgauuccc ugagcugugg 420
gacgugcacc caggacucgg cucacacaug c 451
<210> 2
<211> 30
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 2
gctctagaat gaacggtgga aggcggcagg 30
<210> 3
<211> 13
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 3
tagggttaga caa 13
<210> 4
<211> 11
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 4
gttagggtta g 11
<210> 5
<211> 13
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 5
cagttagggt tag 13
<210> 6
<211> 15
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 6
gtggaaggcg gcagg 15
<210> 7
<211> 13
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 7
ggaaggcggc agg 13
<210> 8
<211> 13
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 8
gtggaaggcg gca 13
<210> 9
<211> 11
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 9
gtggaaggcg g 11
<210> 10
<211> 13
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 10
cggtggaagg cgg 13
<210> 11
<211> 13
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 11
acggtggaag gcg 13
<210> 12
<211> 16
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 12
aacggtggaa ggcggc 16
<210> 13
<211> 18
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 13
atgaacggtg gaaggcgg 18
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 14
acattttttg tttgctctag 20
<210> 15
<211> 13
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 15
tagggttaga caa 13
<210> 16
<211> 11
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 16
gttagggtta g 11
<210> 17
<211> 13
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 17
gttagggtta gac 13
<210> 18
<211> 15
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 18
gttagggtta gacaa 15
<210> 19
<211> 12
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 19
cccttctcag tt 12
<210> 20
<211> 12
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 20
cgcccttctc ag 12
<210> 21
<211> 9
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 21
gggttagac 9
<210> 22
<211> 9
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 22
cagttaggg 9
<210> 23
<211> 11
<212> RNA
<213>人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 23
cuaacccuaa c 11

Claims (38)

1.一种制备多核苷酸的方法，所述方法包括：
使包含以下的第一多核苷酸组合物：
具有7个或更多个核苷亚基的序列的多核苷酸并且所述核苷亚基中至少两个是通过N3'→P5'硫代氨基磷酸酯亚基间键联接合；及
非靶合成产物和试剂；
与多价阳离子盐接触以使包含至少一个多价阳离子抗衡离子的第一多核苷酸盐沉淀；及
将所述第一多核苷酸盐从所述接触的第一多核苷酸组合物中分离以得到包含所述第一多核苷酸盐的第二多核苷酸组合物。
2.如权利要求1所述的方法，进一步包括
使所述第一多核苷酸盐与反相色谱载体接触；及
从所述色谱载体洗脱出包含第二多核苷酸盐的第三多核苷酸组合物。
3.如权利要求1至2中任一项所述的方法，其中所述多核苷酸包含含有13个或更多个与人端粒酶的RNA组分互补的核苷亚基的序列。
4.如权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述多核苷酸包含介于10个与50个之间的与人端粒酶的RNA组分互补的连续核苷亚基。
5.如权利要求3至4中任一项所述的方法，其中与所述人端粒酶的RNA组分互补的所述核苷亚基全都是通过N3'→P5'硫代氨基磷酸酯亚基间键联接合。
6.如权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述多核苷酸包含由以下组成的组的序列：GTTAGGGTTAG(SEQ ID NO:4)、TAGGGTTAGACAA(SEQ ID NO:3)及CAGTTAGGGTTAG(SEQ IDNO:5)。
7.如权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述多核苷酸是经由可选接头缀合至脂质部分。
8.如权利要求2至7中任一项所述的方法，其中所述第二多核苷酸盐具有结构：
其中每个Mx+独立地是氢或阳离子性抗衡离子，每个x独立地是1、2或3并且n是5至13的整数。
9.如权利要求2至8中任一项所述的方法，其中所述第二多核苷酸盐是所述多核苷酸的药学上可接受的盐。
10.如权利要求2至9中任一项所述的方法，其中所述第二多核苷酸盐是所述多核苷酸的一价阳离子盐。
11.如权利要求2至10中任一项所述的方法，其中所述第二多核苷酸盐是所述多核苷酸的钠盐。
12.如权利要求1至5中任一项所述的方法，进一步包括将所述多核苷酸从载体中裂解以得到所述第一多核苷酸组合物。
13.如权利要求1至12中任一项所述的方法，其中所述第一组合物包含所述多核苷酸的一价阳离子盐。
14.如权利要求1至13中任一项所述的方法，其中所述接触步骤包括从阳离子交换载体洗脱出所述第一多核苷酸组合物。
15.如权利要求1至14中任一项所述的方法，其中所述分离步骤包括对所述接触的第一多核苷酸组合物离心以使所述多核苷酸盐沉淀物旋降。
16.如权利要求1至15中任一项所述的方法，其中所述分离步骤包括过滤来自所述接触的第一多核苷酸的所述多核苷酸盐。
17.如权利要求2所述的方法，其中将所述第二多核苷酸组合物直接装载至所述反相色谱载体上。
18.如权利要求1至17中任一项所述的方法，进一步包括将所述第二多核苷酸组合物溶解于溶剂中。
19.如权利要求1至18中任一项所述的方法，其中所述至少一个多价阳离子抗衡离子是二价的。
20.如权利要求19所述的方法，其中所述至少一个多价阳离子抗衡离子选自由镁、锌及钙组成的组。
21.如权利要求1至18中任一项所述的方法，其中所述至少一个多价阳离子抗衡离子是三价的。
22.如权利要求21所述的方法，其中所述至少一个多价阳离子抗衡离子是铝。
23.如权利要求1至22中任一项所述的方法，其中所述多核苷酸盐进一步包含一价阳离子抗衡离子。
24.一种组合物，包含：
含有至少一个多价阳离子抗衡离子的多核苷酸的盐；
其中所述多核苷酸具有7个或更多个与所述人端粒酶的RNA组分互补的核苷亚基的序列并且所述核苷亚基中的至少两个是通过N3'→P5'硫代氨基磷酸酯亚基间键联接合。
25.如权利要求24所述的组合物，其中所述至少一个多价阳离子抗衡离子是二价的。
26.如权利要求25所述的组合物，其中所述至少一个多价阳离子抗衡离子选自由镁、锌及钙组成的组。
27.如权利要求24至26中任一项所述的组合物，其中所述至少一个多价阳离子抗衡离子是镁。
28.如权利要求24所述的组合物，其中所述至少一个多价阳离子抗衡离子是三价的。
29.如权利要求28所述的组合物，其中所述至少一个多价阳离子抗衡离子是铝。
30.如权利要求24至29中任一项所述的组合物，其中相对于所述多核苷酸的聚阴离子主链，所述多核苷酸包含3mol％或更多的所述多价阳离子抗衡离子。
31.如权利要求24至29中任一项所述的组合物，其中相对于所述多核苷酸，所述多核苷酸包含以重量计1.0％或更多的所述多价阳离子抗衡离子。
32.如权利要求24至31中任一项所述的组合物，其中所述组合物是沉淀物。
33.如权利要求24至32中任一项所述的组合物，其中所述多核苷酸包含含有13个或更多个与所述人端粒酶的RNA组分互补的核苷亚基的序列。
34.如权利要求24至33中任一项所述的组合物，其中所述多核苷酸包含介于10个与50个之间的与所述人端粒酶的RNA组分互补的连续核苷亚基。
35.如权利要求24至34中任一项所述的组合物，其中与所述人端粒酶的RNA组分互补的所述核苷亚基全都是通过N3'→P5'硫代氨基磷酸酯亚基间键联接合。
36.如权利要求24至35任一项所述的组合物，其中所述多核苷酸包含选自由以下组成的组的序列：GTTAGGGTTAG(SEQ ID NO:4)、TAGGGTTAGACAA(SEQ ID NO:3)及CAGTTAGGGTTAG(SEQ ID NO:5)。
37.如权利要求24至36中任一项所述的组合物，其中所述多核苷酸是经由可选接头缀合至脂质部分。
38.如权利要求24至37中任一项所述的组合物，其中所述多核苷酸具有结构：
其中每个Mx+独立地是阳离子性抗衡离子，每个x是1、2或3并且n是5至12。
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