RS60645B1 - Postupci za pripremu polinukleotida upotrebom kompozicija multivalentne katjonske soli - Google Patents

Postupci za pripremu polinukleotida upotrebom kompozicija multivalentne katjonske soli

Info

Publication number
RS60645B1
RS60645B1 RS20200935A RSP20200935A RS60645B1 RS 60645 B1 RS60645 B1 RS 60645B1 RS 20200935 A RS20200935 A RS 20200935A RS P20200935 A RSP20200935 A RS P20200935A RS 60645 B1 RS60645 B1 RS 60645B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
polynucleotide
salt
composition
subunits
cases
Prior art date
Application number
RS20200935A
Other languages
English (en)
Inventor
Premchandran H Ramiya
Original Assignee
Geron Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Geron Corp filed Critical Geron Corp
Publication of RS60645B1 publication Critical patent/RS60645B1/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1137—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
    • C12N15/1006—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers
    • C12N15/101—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers by chromatography, e.g. electrophoresis, ion-exchange, reverse phase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates
    • C12P19/28—N-glycosides
    • C12P19/30—Nucleotides
    • C12P19/34—Polynucleotides, e.g. nucleic acids, oligoribonucleotides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/11—Antisense
    • C12N2310/113—Antisense targeting other non-coding nucleic acids, e.g. antagomirs
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
    • C12N2310/314—Phosphoramidates
    • C12N2310/3145—Phosphoramidates with the nitrogen in 3' or 5'-position
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C12N2310/351—Conjugate
    • C12N2310/3515—Lipophilic moiety, e.g. cholesterol
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y207/00—Transferases transferring phosphorus-containing groups (2.7)
    • C12Y207/07—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
    • C12Y207/07049—RNA-directed DNA polymerase (2.7.7.49), i.e. telomerase or reverse-transcriptase

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Treatment Of Liquids With Adsorbents In General (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Description

Opis
UVOD
[0001] Hemija polimera nukleinskih kiselina igra ulogu u brojnim tehnologijama u ekspanziji u oblasti farmacije, dijagnostike i analitike, i konkretnije, u podoblastima antisens i anti-genskih terapeutika, kombinatornoj hemiji, razgranatoj amplifikaciji DNK signala i DNK dijagnostici i analizi na bazi mikročipova. Jedan deo ove hemije polimera je usmeren na poboljšanje jačine vezivanja, specifičnosti i otpornosti na nukleaze prirodnih polimera nukleinskih kiselina, kao što je DNK. Peptidne nukleinske kiseline (PNK), fosforotioat, metilfosfonat i fosforamidatne veze između nukleozida predstavljaju primere nekih vrsta polimerske hemije koje su primenjene kod polinukleozida kako bi bile obezbeđene jedna ili više poželjnih osobina kao što su otpornost na nukleaze, preuzimanje u ćelije i solubilnost.
[0002] Polinukleotidni N3’→P5’ fosforamidati mogu da obrazuju stabilne duplekse sa komplementarnim lancima DNK i RNK, kao i stabilne triplekse sa DNK dupleksima, i otporni su na nukleaze. Polinukleotidni N3’→P5’ tiofosforamidati našli su primenu kao potentni antisens agensi, kako in vitro, tako i in vivo. Jedinjenja koja sadrže polinukleotide, a koja inhibiraju telomeraznu aktivnost, mogu da se koriste za lečenje telomerazama posredovanih bolesti, kao što je kancer, s obzirom na to da ćelije kancera eksprimiraju telomeraznu aktivnost dok normalne ljudske ćelije nemaju telomeraznu aktivnost u biološki relevantnim nivoima. Imajući to u vidu, od interesa su postupci za pripremu i izolaciju takvih polinukleotida.
[0003] U WO 2005/023994 su opisani modifikovani oligonukleotidi za inhibiciju telomeraza. U publikaciji Sawadogo et al, Nucl. Acids Res., vol.19, no.3, page 674 (1991) opisuje se postupak za prečišćavanje deprotektovanih oligodeoksinukleotida. U WO 2008/127305 se opisuje postupak za izolaciju biomakromolekula uz pomoć niskog pH i dvovalentnih katjona. U WO 2015/168310 su opisane oligonukleotidne kompozicije i postupci kojima se oni prave. U WO 2012/021985 su opisani helatni oligonukleotidni kompleksi dvovalentnih metalnih jona i oligonukleotida.
KRATAK PREGLED PRONALASKA
[0004] Aspekti prema prikazu uključuju postupke za pripremu polinukleotida. U nekim primerima izvođenja, postupak uključuje dovođenje u kontakt prve polinukleotidne kompozicije koja uključuje polinukleotid sa sekvencom od 7 ili više nukleozidnih subjedinica gde su najmanje dve od tih nukleozidnih subjedinica povezane N3’→P5’ tiofosforamidnom vezom između subjedinica; i proizvode i reagense iz sinteze koji nisu ciljni molekuli sinteze; sa multivalentnom katjonskom solju, kako bi se istaložila prva polinukleotidna so koja uključuje najmanje jedan multivalentni kontra jon; i razdvajanje polinukleotidne soli od prve polinukleotidne kompozicije dovedene u kontakt, kako bi bila proizvedena druga polinukleotidna kompozicija koja uključuje prvu polinukleotidnu so. U nekim primerima izvođenja, postupak dalje uključuje dovođenje u kontakt prve polinukleotidne soli sa nosačem za reverzno-faznu hromatografiju; i eluciju sa hromatografskog nosača polinukleotidne kompozicije koja uključuje drugu polinukleotidnu so. Takođe su obezbeđene kompozicije koje uključuju so polinukleotida koja uključuje najmanje jedan multivalentni katjonski kontra jon. U nekim primerima izvođenja, najmanje jedan multivalentni katjonski kontra jon odabran je iz grupe koja se sastoji od magnezijuma, cinka, aluminijuma i kalcijuma.
KRATAK OPIS SLIKA
[0005] Stručnjak u oblasti će razumeti da crteži koji su opisani u daljem tekstu imaju isključivo namenu ilustrovanja. Nije predviđeno da crteži na bilo koji način ograniče obim predmetnih instrukcija.
Slika 1 prikazuje HPLC hromatograme za Imetelstat-Mg u 1M rastvorima NaCl na različitim pH vrednostima.
Slika 2 prikazuje rezultate elementarne analize Imetelstat Natrijuma koji je tretiran nizom različitih soli.
Slika 3 prikazuje rezultate elementarne analize Imetelstat Natrijuma koji je koji je tretiran rastućim ekvivalentima magnezijum hloridne soli.
Slika 4 prikazuje rezultate elementarne analize Imetelstat TEA koja je tretiran rastućim ekvivalentima magnezijum hloridne soli.
DEFINICIJE
[0006] Pre nego što tipični primeri izvođenja budu detaljnije opisani, izložene su sledeće definicije kako bi ilustrovale i definisale značenje i obim izraza koji se koriste u opisu.
[0007] Sledeći izrazi imaju sledeća značenja osim ako je drugačije naznačeno. Bilo koji izraz koji nije definisan ima značenje koje ima i u datoj oblasti.
[0008] Kako se ovde koriste, izrazi polinukleotid i oligonukleotid koriste se naizmenično za označavanje jedinjenja koje sadrži veći broj subjedinica nukleozidne komponente ili nukleozidnih ostataka koji su povezani vezama između nukleozida ili vezivnim grupama između nukleozida. Kad god je nukleotid predstavljen sekvencom slova, kao što je "ATGUCCTG" podrazumeva se da su nukleotidi u 5’→3’ redosledu sa leva na desno i da "A" označava deoksiadenozin, "C" označava deoksicitidin, "G" označava deoksiguanozin, "T" označava timidin i "U" označava deoksiuridin, osim ako je drugačije naznačeno.
[0009] Kako se ovde koristi, "nukleozid" uključuje prirodne nukleozide, uključujući 2’-deoksi i 2’-hidroksilne oblike, npr. kao što su opisani u publikaciji autora Kornberg i Baker, DNA Replication, 2nd Ed. (Freeman, San Francisco, 1992). "Analozi", kada se odnosi na nukleozide, uključuju sintetičke nukleozide koji imaju modifikovane bazne komponente i/ili modifikovane šećerne komponente, npr. uopšteno opisane u publikaciji Scheit, Nucleotide Analogs (John Wiley, New York, 1980). Ovi analozi uključuju sintetičke nukleozide dizajnirane tako da poboljšavaju osobine vezivanja, npr. stabilnost, specifičnost, ili slične, kao što je prikazano u publikaciji autora Uhlmann i Peyman (Chemical Reviews, 90:543-584, 1990). U nekim primerima izvođenja, nukleozid ili nukleozidni analog uključuje 3’-hidroksilnu grupu ili 3’-amino grupu.
[0010] Izrazi "baza" i "nukleobaza" koriste se naizmenično i ovde su definisani tako da uključuju (i) konvencionalne DNK i RNK baze (uracil, timin, adenin, guanin, i citozin), i (ii) modifikovane baze ili bazne analoge (npr., 5-metil-citozin, 5-bromouracil ili inozin). Bazni analog je hemikalija čija molekulska struktura podražava strukturu konvencionalnih DNK ili RNK baza.
[0011] Kako se ovde koristi, "pirimidin" označava pirimidine koji se javljaju u prirodnim nukleozidima, uključujući citozin, timin i uracil, i njihove uobičajene analoge, kao što su oni koji sadrže oksi, metil, propinil, metoksi, hidroksil, amino, tio, halo, i slične supstituente. Ovaj izraz, onako kako se ovde koristi, dodatno uključuje pirimidine sa vezanim uobičajenim protektivnim grupama, kao što je N4-benzoilcitozin. Dodatne protektivne grupe pirimidina od interesa uključuju, ali nisu ograničene na, one protektivne grupe koje su prikazali autori Beaucage and Iyer, Tetrahedron 48: 2223-2311 (1992).
[0012] Kako se ovde koristi, "purin" označava purin koji se javljaju u prirodnim nukleozidima, kao što su adenin, guanin i hipoksantin, i njihove uobičajene analoge, kao što su oni koji sadrže oksi, metil, propinil, metoksi, hidroksil, amino, tio, halo, i slične supstituente. Ovaj izraz, onako kako se ovde koristi, dodatno uključuje purin sa vezanim uobičajenim protektivnim grupama, kao što su N2-benzoilguanin, N2-izobutirilguanin, N6-benzoiladenin, i slične. Dodatne protektivne grupe purina su prikazali autori Beaucage and Iyer, Tetrahedron 48: 2223-2311 (1992). Kako se ovde koristi, izraz "-protektovan-" kao komponenta hemijskog imena odnosi se na protektivne grupe priznate u oblasti, za konkretnu komponentu jedinjenja, npr. "5’-protektovani-hidroksil" kada se odnosi na nukleozid, uključuje trifenilmetil (tj., tritil), p-anisildifenilmetil (tj., monometoksitritil ili MMT), di-panisilfenilmetil (tj., dimetoksitritil ili DMT), i slične grupe; na protektovanu nukleobazu koja uključuje heteroatom protektovan grupama kao što su dimetil-aminoformamidin (DMF), benzoil (Bz), izobutiril, i slične. Protektivne grupe priznate u oblasti, uključuju grupe opisane u sledećim referencama: Gait, editor, Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach (IRL Press, Oxford, 1984); Amarnath and Broom, Chemical Reviews, 77:183-217, 1977; Pon et al., Biotechniques, 6:768-775, 1988; Ohtsuka et al., Nucleic Acids Research, 10:6553-6570, 1982; Eckstein, editor, Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach (IRL Press, Oxford, 1991), Greene and Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, Second Edition, (John Wiley & Sons, New York, 1991), Narang, editor, Synthesis and Applications of DNA and RNA (Academic Press, New York, 1987), Beaucage and Iyer Tetrahedron 48: 2223-2311 (1992), i slične reference.
[0013] Kako se ovde koristi, "polinukleotid N3’→P5’ tiofosforamidat" označava oligomer, obično linearan, nukleozidnih subjedinica vezanih najmanje jednom N3’→P5’ tiofosforamidnom vezom. Uopšteno govoreći, nukleozidne subjedinice sadrže nukleozide ili nukleozidne analoge, ali mogu takođe da sadrže opštije komponente sa kompatibilnim hemijskim osobinama, kao što su nebazni šećeri ili druge ugljovodonične komponente, kao što su one opisane u sledećim referencama: Newton et al., Nucleic Acids Research, 21: 1155-1162 (1993); Griffin et al., J. Am. Chem. Soc., 114: 7976-7982 (1992); Jaschke et al., Tetrahedron Letters, 34: 301-304 (1992); WO 93/06122; WO 91/07092; Durand et al., Nucleic Acids Research, 18: 6353-6359 (1990); Salunkhe et al., J. Am. Chem. Soc., 114: 8768-8772 (1992); i slične. U nekim slučajevima, izraz označava polinukleotid u kome su sve veze između nukleotida zamenjene N3’→P5’ tiofosforamidnim vezama. U tim slučajevima, ovaj izraz obuhvata delimično kao i potpuno "amidovane" oligomere. U nekim slučajevima, izraz označava polinukleotid u kome su sve veze zamenjene N3’→P5’ tiofosforamidnim vezama, i pri čemu su nukleozidne subjedinice prirodni nukleozidi ili njihovi analozi. Predmetni polinukleotid N3’→P5’ tiofosforamidat u kome je svaka veza predstavljena N3’→P5’ tiofosforamidnom vezom ("potpuno amidovan") može da bude ugrađen u, ili vezan za druge oligonukleotide ili polinukleotide kako bi obrazovao veći oligomer koji je "delimično amidovan." Predmetni polinukleotid N3’→P5’ tiofosforamidat može da uključuje bilo koju pogodnu 3’ i/ili 5’ terminalnu grupu. U nekim primerima izvođenja, polinukleotid N3’→P5’ tiofosforamidat uključuje 3’-hidroksil terminalnu grupu ili 3’-amino terminalnu grupu.
[0014] Kako se ovde koriste, predviđeno je da izrazi "fosfat" i "fosfatna grupa" obuhvataju tiofosfatnu grupu i oksofosfatnu grupu.
[0015] Kako se ovde koristi, izraz "fosforamiditna amino grupa" odnosi se na amino grupu, --NR4R5, vezanu za atom fosfora fosforamiditne grupe, a izraz "fosforamiditni azot" odnosi se na atom azota fosforamiditne amino grupe.
[0016] "Alkil" se odnosi na jednovalentnu zasićenu alifatičnu ugljovodoničnu grupu koja ima od 1 do 10 atoma ugljenika i to recimo, 1 do 6 atoma ugljenika (npr., "alkil od 1 do 6 atoma ugljenika "), ili 1 do 5 (npr., "alkil od 1 do 5 atoma ugljenika " ili 1 do 4 (npr., "alkil od 1 do 4 atoma ugljenika " ili 1 do 3 atoma ugljenika (npr., "alkil od 1 do 3 atoma ugljenika "). Ovaj izraz uključuje, na primer, linearne i granate hidrokarbil grupe kao što su metil (CH3-), etil (CH3CH2-), n-propil (CH3CH2CH2-), izopropil ((CH3)2CH-), n-butil (CH3CH2CH2CH2-), izobutil ((CH3)2CHCH2-), sek-butil ((CH3)(CH3CH2)CH-), t-butil ((CH3)3C-), n-pentil (CH3CH2CH2CH2CH2-) i neopentil ((CH3)3CCH2-).
[0017] Izraz "supstituisani alkil" odnosi se na alkil grupu, kako je ovde definisana, pri čemu su jedan ili više atoma ugljenika u alkil lancu izborno zamenjeni hetero atomima kao što su -O-, -N-, -S-, -S(O)n- (gde je n 0 do 2), -NR-(gde je R vodonik ili alkil) i imaju od 1 do 5 supstituenata odabranih iz grupe koja se sastoji od alkoksi, supstituisanog alkoksi, cikloalkila, supstituisanog cikloalkila, cikloalkenila, supstituisanog cikloalkenila, acila, acilamino, aciloksi, amino, aminoacil, aminoaciloksi, oksiaminoacil, azido, cijano, halogena, hidroksil, okso, tioketo, karboksila, karboksilalkila, tioariloksi, tioheteroariloksi, tioheterociklooksi, tiola, tioalkoksi, supstituisanog tioalkoksi, arila, ariloksi, heteroarila, heteroariloksi, heterociklila, heterociklooksi, hidroksiamino, alkoksiamino, nitro, -SO-alkila, -SO-arila, -SO-heteroarila, -SO2-alkila, -SO2-arila, -SO2-heteroarila i -NRaR<b>, pri čemu R<a>i R<b>mogu da budu isti ili različiti i izabrani od vodonika, izborno supstituisanog alkila, cikloalkila, alkenila, cikloalkenila, alkinila, arila, heteroarila i heterocikla. U nekim slučajevima, "supstituisani alkil" se odnosi na alkil grupu, kako je ovde definisana, koja ima od 1 do 5 supstituenata odabranih iz grupe koja se sastoji od alkoksi, cikloalkil, cikloalkenil, acil, acilamino, aciloksi, amino, aminoacil, aminoaciloksi, oksiaminoacil, azido, cijano, halogena, hidroksila, karboksila, karboksilalkila, tiola, tioalkoksi, arila, ariloksi, heteroarila, heteroariloksi, heterociklila, heterociklooksi, sulfonamido i -NRaRb, gde Ra i Rb mogu da budu isti ili različiti i izabrani od vodonika, alkila, cikloalkila, alkenila, cikloalkenila, alkinila, arila, heteroarila i heterociklika.
[0018] "Alkoksi" se odnosi na grupu -O-alkil, pri čemu je alkil onakav kako je ovde definisan. Alkoksi uključuje, na primer, metoksi, etoksi, n-propoksi, izopropoksi, n-butoksi, t-butoksi, sekbutoksi, n-pentoksi, i slično tome. Izraz "alkoksi" takođe se odnosi na grupe alkenil-O-, cikloalkil-O-, cikloalkenil-O- i alkinil-O-, pri čemu su alkenil, cikloalkil, cikloalkenil i alkinil onakvi kako su ovde definisani.
[0019] Izraz "supstituisani alkoksi" odnosi se na grupe supstituisanu alkil-O-, supstituisanu alkenil-O-, supstituisanu cikloalkil-O-, supstituisanu cikloalkenil-O- i supstituisanu alkinil-O- pri čemu su alkil, supstituisani alkenil, supstituisani cikloalkil, supstituisani cikloalkenil i supstituisani alkinil onakvi kako su ovde definisani.
[0020] "Acil" se odnosi na grupe H-C(O)-, alkil-C(O)-, supstituisani alkil-C(O)-, alkenil-C(O)-, supstituisani alkenil-C(O)-, alkinil-C(O)-, supstituisani alkinil-C(O)-, cikloalkil-C(O)-, supstituisani cikloalkil-C(O)-, cikloalkenil-C(O)-, supstituisani cikloalkenil-C(O)-, aril-C(O)-, supstituisani aril-C(O)-, heteroaril-C(O)-, supstituisani heteroaril-C(O)-, heterociklil-C(O)- i supstituisani heterociklil-C(O)-, pri čemu su alkil, supstituisani alkil, alkenil, supstituisani alkenil, alkinil, supstituisani alkinil, cikloalkil, supstituisani cikloalkil, cikloalkenil, supstituisani cikloalkenil, aril, supstituisani aril, heteroaril, supstituisani heteroaril, heterociklik i supstituisani heterociklik onakvi kako su ovde definisani. Na primer, acil uključuje "acetil" grupu CH3C(O)-.
[0021] Izraz "supstituisani amino" odnosi se na grupu -NRR gde je svaki R nezavisno odabran iz grupe koja se sastoji od vodonika, alkila, supstituisanog alkila, cikloalkila, supstituisanog cikloalkila, alkenila, supstituisanog alkenila, cikloalkenila, supstituisanog cikloalkenila, alkinila, supstituisanog alkinila, arila, heteroarila i heterociklila, s tim da najmanje jedan R nije vodonik.
[0022] "Halo" ili "halogen" odnose se na fluoro, hloro, bromo i jodo.
[0023] "Hidroksi" ili "hidroksil" odnose se na grupu –OH.
[0024] "Heteroaril" se odnosi na aromatičnu grupu sa od 1 do 15 atoma ugljenika, recimo od 1 do 10 atoma ugljenika i 1 do 10 heteroatoma odabranih iz grupe koja se sastoji od kiseonika, azota i sumpora u prstenu. Ove heteroaril grupe u sistemu prstena mogu da imaju jedan prsten (kao što su piridinil, imidazolil ili furil) ili više kondenzovanih prstenova (kao na primer u grupama kao što su indolizinil, hinolinil, benzofuran, benzimidazolil ili benzotienil), pri čemu je najmanje jedan prsten u sistemu prstenova aromatičan, pod uslovom da tačku vezivanja predstavlja atom aromatičnog prstena. U nekim primerima izvođenja, atom(i) azota i/ili sumpora u prstenu heteroaril grupe opciono se oksiduju kako bi obezbedili N-oksidne (N→O), sulfinilne ili sulfonilne komponente. Ovaj izraz uključuje, na primer, piridinil, pirolil, indolil, tiofenil i furanil. Osim ako nije na neki drugi način ograničeno definicijom za heterociklični supstituent, ove heteroaril grupe mogu izborno da budu supstituisane sa od 1 do 5 supstituenata, ili od 1 do 3 supstituenta, izabranih od aciloksi, hidroksi, tiol, acil, alkil, alkoksi, alkenil, alkinil, cikloalkil, cikloalkenil, supstituisanog alkila, supstituisanog alkoksi, supstituisanog alkenil, supstituisanog alkinil, supstituisanog cikloalkil, supstituisanog cikloalkenil, amino, supstituisanog amino, aminoacil, acilamino, alkaril, aril, ariloksi, azido, karboksil, karboksilalkil, cijano, halogen, nitro, heteroaril, heteroariloksi, heterociklil, heterociklooksi, aminoaciloksi, oksiacilamino, tioalkoksi, supstituisanog tioalkoksi, tioariloksi, tioheteroariloksi, -SO-alkil, -SO-supstituisanog alkil,-SO-aril, -SO-heteroaril, -SO2-alkil, -SO2-supstituisanog alkil, -SO2-aril i -SO2-heteroaril, i trihalometila. U ovim slučajevima, heteroaril grupa koja je supstituisana sa od 1 do 5 supstituenata (npr., kao što je ovde opisano) označava se kao "supstituisani heteroaril".
[0025] "Heterocikl," "heterociklik," "heterocikloalkil" i "heterociklil" odnose se na zasićenu ili nezasićenu grupu koja ima jedan prsten ili više kondenzovanih prstenova, uključujući fuzionisane premošćene i spiro sisteme prstenova, i koja ima od 3 do 20 atoma u prstenu, uključujući 1 do 10 heteroatoma. Ovi atomi prstena su odabrani iz grupe koja se sastoji od azota, sumpora ili kiseonika, pri čemu, u fuzionisanim sistemima prstenova, jedan ili više prstenova mogu da budu cikloalkil, aril ili heteroaril, pod uslovom da je tačka vezivanja preko nearomatičnog prstena. U nekim primerima izvođenja, atom(i) azota i/ili sumpora heterociklične grupe izborno su oksidovani kako bi obezbedili N-oksidne, -S(O)- ili -SO2-komponente.
[0026] Primeri heterocikla i heteroarila uključuju, ali nisu ograničeni na, azetidin, pirol, imidazol, pirazol, piridin, pirazin, pirimidin, piridazin, indolizin, izoindol, indol, dihidroindol, indazol, purin, hinolizin, izohinolin, hinolin, ftalazin, naftilpiridin, hinoksalin, hinazolin, cinolin, pteridin, karbazol, karbolin, fenantridin, akridin, fenantrolin, izotiazol, fenazin, izoksazol, fenoksazin, fenotiazin, imidazolidin, imidazolin, piperidin, piperazin, indolin, ftalimid, 1,2,3,4-tetrahidroizohinolin, 4,5,6,7-tetrahidrobenzo[b]tiofen, tiazol, tiazolidin, tiofen, benzo[b]tiofen, morfolinil, tiomorfolinil (takođe označen i kao tiamorfolinil), 1,1-dioksotiomorfolinil, piperidinil, pirolidin, tetrahidrofuranil, i slično.
[0027] Osim ako nije na neki drugi način ograničeno definicijom za heterociklični supstituent, ove heterociklične grupe mogu izborno da budu supstituisane sa 1 do 5, ili od 1 do 3 supstituenta, izabranih od alkoksi, supstituisanog alkoksi, cikloalkila, supstituisanog cikloalkila, cikloalkenila, supstituisanog cikloalkenila, acila, acilamino, aciloksi, amino, supstituisanog amino, aminoacila, aminoaciloksi, oksiaminoacila, azido, cijano, halogena, hidroksila, okso, tioketo, karboksila, karboksilalkila, tioariloksi, tioheteroariloksi, tioheterociklooksi, tiola, tioalkoksi, supstituisanog tioalkoksi, arila, ariloksi, heteroarila, heteroariloksi, heterociklila, heterociklooksi, hidroksiamino, alkoksiamino, nitro, -SO-alkila, -SO-supstituisanog alkila, -SO-arila, -SO-heteroarila, -SO2-alkila, -SO2-supstituisanog alkila, -SO2-arila, -SO2-heteroarila ili fuzionisanog heterocikla.
[0028] "Nitro" se odnosi na grupu -NO2.
[0029] "Okso" se odnosi na atom (=O).
[0030] "Tiol" se odnosi na grupu -SH.
[0031] "Tiokso" ili izraz "tioketo" odnose se na atom (=S).
[0032] Osim ovde uključenog prikaza, izraz "supstituisan," kada se koristi da modifikuje neku grupu ili radikal, može takođe da znači i da su jedan ili više atoma vodonika u naznačenoj grupi ili radikalu, svaki, nezavisno jedan od drugog, zamenjeni istom ili različitim supstituentnim grupama, kao što su definisane u tekstu koji sledi.
[0033] Pored grupa koje su ovde prikazane u vezi sa pojedinačnim izrazima, supstituentne grupe za supstituisanje jednog ili više vodonika (bilo koja dva vodonika na jednom ugljeniku mogu da se zamene sa =O, =NR70, =N-OR70, =N2ili =S) u naznačenim grupama ili radikalima su, osim ako nije drugačije naznačeno, -R<60>, halo, =O, -OR<70>, -SR<70>, -NR<80>R<80>, trihalometil, -CN, -OCN, -SCN, -NO, -NO2, =N2, -N3, -SO2R70, -SO2O-M+ , -SO2OR70, -OSO2R70, -OSO2O-M+ , -OSO2OR70, -P(O)(O-)2(M+)2, -P(O)(OR70)O-M+ , -P(O)(OR70)2, -C(O)R70, -C(S)R70, -C(NR70)R70, -C(O)O-M+ , -C(O)OR70, -C(S)OR70, 80R80, -C(NR70)NR80R80, -OC(O)R70, -OC(S)R70,-OC(O)O-M+ , -OC(O)OR70, -OC(S)OR70, -NR70C(O)R70,-C(O)NR-NR70C(S)R70, -NR70CO 70
2-M+ , -NR CO2R70, -NR70C(S)OR70, -NR70C(O)NR80R80, -NR70C(NR70)R70 i -NR70C(NR70)NR80R<80>, pri čemu je R<60>odabran iz grupe koja se sastoji od opciono supstituisanog alkila, cikloalkila, heteroalkila, heterocikloalkilalkila, cikloalkilalkila, arila, arilalkila, heteroarila i heteroarilalkila, svaki R70 je nezavisno vodonik ili R60; svaki R80 je nezavisno R70 ili, alternativno, dva R80 uzeta zajedno sa atomom azota za koji su vezani, obrazuju heterocikloalkil sa 5, 6 ili 7 članova koji izborno može da uključuje od 1 do 4 ista ili različita dodatna heteroatoma odabrana iz grupe koja se sastoji od O, N i S, od čega N može da ima -H ili C1-C3 alkil supstituciju; i svaki M<+>je kontra jon sa jediničnim neto pozitivnim naelektrisanjem. Svaki M+ može nezavisno da bude, na primer, alkalni jon, kao što je K<+>, Na+ , Li<+>; amonijum jon, kao što je N(R<60>)4; ili zemnoalkalni jon, kao što su [Ca2+]0.5, [Mg2+]0.5ili [Ba2+]0.5(subskript 0.5 znači da jedan od kontra jona ovih zemnoalkalnih jona može da bude jonizovani oblik jedinjenja prema pronalasku, a drugi kontra jon kao što je hlorid, ili dva, ovde prikazana jonizovana jedinjenja mogu da služe kao kontra joni za ove dvovalentne zemnoalkalne jone, ili dvostruko jonizovano jedinjenje prema pronalasku može da služi kao kontra jon za ove dvovalentne zemnoalkalne jone). Kao specifični primeri, predviđeno je da -NR<80>R<80>uključuju -NH2, -NH-alkil, N-pirolidinil, N-piperazinil, 4N-metil-piperazin-1-il i N-morfolinil.
[0034] Pored ovde uključenog prikaza, u izvesnom primeru izvođenja, grupa koja je supstituisana ima 1, 2, 3, ili 4 supstituenta, 1, 2, ili 3 supstituenta, 1 ili 2 supstituenta ili 1 supstituent.
[0035] Podrazumeva se da u svim supstituisanim grupama definisanim u prethodnom tekstu, polimeri do kojih se došlo definisanjem supstituenata njihovim dodatnim supstituentima (npr., supstituisani aril koji ima supstituisanu aril grupu kao supstituent, a koja je i sama supstituisana supstituisanom aril grupom, koja je dodatno supstituisana supstituisanom aril grupom, itd.) nisu predviđeni da budu ovde uključeni. U tim slučajevima, maksimalan broj ovakvih supstitucija je tri. Na primer, serijske supstitucije supstituisanih aril grupa koje se ovde specifično razmatraju ograničene su na supstituisani aril-(supstituisani aril)-supstituisani aril.
[0036] Sem ako nije drugačije naznačeno, do nomenklature supstituenata koja ovde nije eksplicitno definisana, dolazi se imenovanjem terminalnog dela funkcionalnosti nakon koga sledi susedna funkcionalnost u smeru ka tački vezivanja.
[0037] Što se tiče bilo koje, ovde prikazane grupe koja sadrži jedan ili više supstituenata, podrazumeva se, naravno, da takve grupe ne sadrže bilo kakvu supstituciju ili supstitucioni obrazac koji je sterno nepraktičan i/ili neostvariv u smislu sinteze. Osim toga, predmetna jedinjenja uključuju sve stereohemijske izomere koji nastaju supstitucijom ovih jedinjenja.
[0038] Izraz "farmaceutski prihvatljiva so" označava so čija je primena kod pacijenta kao što je sisar (soli sa kontra jonima koji imaju prihvatljivu bezbednost za sisare za dati dozni režim), prihvatljiva. Ove soli mogu da se dobijaju od farmaceutski prihvatljivih neorganskih ili organskih baza i od farmaceutski prihvatljivih neorganskih ili organskih kiselina. "Farmaceutski prihvatljiva so" odnosi se na farmaceutski prihvatljive soli nekog jedinjenja, koje se dobijaju od niza različitih organskih i neorganskih kontra jona dobro poznatih u oblasti i uključuju, samo kao primer, natrijum i slične, i, kada molekul sadrži baznu funkcionalnost, soli organskih i neorganskih kiselina, kao što je hlorovodonična, i slične. Farmaceutski prihvatljive soli od interesa uključuju ali nisu ograničene na soli aluminijuma, amonijaka, arginina, barijuma, benzatina, kalcijuma, holina, etilendiamina, lizina, litijuma, magnezijuma, meglumina, prokaina, kalijuma, natrijuma, trometamina, N-metilglukamina, N,N’-dibenziletilen-diamina, hloroprokaina, dietanolamina, etanolamina, piperazina, cinka, diizopropilamina, trietilamina, diizopropiletilamina i trietanolamina.
[0039] Izraz "njihova so” označava jedinjenje koje se obrazuje kada se proton kiseline zameni katjonom kao što je metalni katjon ili organski katjon, ili slično. Kada je to moguće, so predstavlja farmaceutski prihvatljivu so, iako ovo nije neophodno za soli prelaznih jedinjenja koja nisu namenjena za primenu kod pacijenata. Na primer, soli predmetnih jedinjenja uključuju jedan soli kod kojih je jedinjenje protonizovano neorganskom ili organskom kiselinom kako bi se obrazovao katjon, pri čemu konjugovana baza neorganske ili organske kiseline predstavlja anjonsku komponentu soli. Soli od interesa uključuju, ali nisu ograničene na, soli aluminijuma, amonijaka, arginina, barijuma, benzatina, kalcijuma, cezijuma, holina, etilendiamina, litijuma, magnezijuma, meglumina, prokaina, N-metilglukamina, piperazina, kalijuma, natrijuma, trometamina, cinka, N,N’-dibenziletilen-diamina, hloroprokaina, dietanolamina, etanolamina, piperazina, diizopropilamina, trietilamina, diizopropiletilamina i trietanolamina. Podrazumeva se da za bilo koju od ovde opisanih polinukleotidnih struktura koje uključuju kičmu od veza između nukleozida, ovi polinukleotidi mogu takođe da uključuju bilo koje pogodne oblike soli. U nekim primerima izvođenja, radi jednostavnosti su prikazani kiseli oblici internukleozidnih veza. U nekim slučajevima, so predmetnog jedinjenja je so jednovalentnog katjona. U nekim slučajevima, so predmetnog jedinjenja je so dvovalentnog katjona. U nekim slučajevima, so predmetnog jedinjenja je so trovalentnog katjona.
[0040] "Solvat" se odnosi na kompleks koji se obrazuje kombinovanjem molekula rastvarača sa molekulima ili jonima rastvorene supstance. Rastvarač može da bude organsko jedinjenje, neorgansko jedinjenje ili smeša ta dva. Neki primeri rastvarača uključuju, ali nisu ograničeni na, metanol, N,N-dimetilformamid, tetrahidrofuran, dimetilsulfoksid i vodu. Kada je rastvarač voda, obrazovani solvat je hidrat.
[0041] "Stereoizomer" i "stereoizomeri" odnose se na jedinjenja koja imaju isti način vezivanja atoma ali različit raspored atoma u prostoru. Stereoizomeri uključuju cis-trans izomere, E i Z izomere, enantiomere i dijastereoizomere.
[0042] "Tautomer" se odnosi na alternativne oblike molekula koji se razlikuju samo po vezivanju atoma pomoću elektrona i/ili po položaju protona, kao što su enol-keto i imin-enamin tautomeri, -NH-P(=S)(OH)-O- i -NH-P(=O)(SH)-O-, ili tautomerni oblici heteroaril grupa koje sadrže -N=C(H)-NH- raspored atoma u prostoru, kao što su pairazoli, imidazoli, benzimidazoli, triazoli i tetrazoli. Stručnjak u oblasti će prepoznati da su mogući i drugi tautomerni rasporedi ovde opisanih grupa. Na primer, podrazumeva se da polinukleotid opisan sledećom strukturom:
takođe obuhvata sledeću strukturu koja prikazuje jedan mogući alternativni tautomerni raspored vezanih grupa:
pri čemu "nps" predstavlja tiofosforamidatnu vezu (-NH-P(=O)(SH)-O- ili - NH-P(=S)(OH)-O-) koja povezuje 3’-ugljenik jednog nukleozida sa 5’-ugljenikom susednog nukleozida. Podrazumeva se da su svi tautomerni oblici predmetnog jedinjenja obuhvaćeni strukturom kojom je opisan jedan mogući tautomerni raspored grupa u jedinjenju, čak i ako to nije posebno naznačeno. Prilikom opisivanja jedinjenja, može da se koristi bilo koji pogodan tautomerni raspored grupa u predmetnom jedinjenju.
[0043] Biće jasno da je predviđeno da izraz "ili njegova so ili solvat ili stereoizomer’ uključuje sve permutacije soli, solvata i stereoizomera, kao recimo solvat farmaceutski prihvatljive soli stereoizomera predmetnog jedinjenja. Podrazumeva se da je predviđeno da izraz "ili njegova so’ uključuje sve permutacije soli. Podrazumeva se da je predviđeno da izraz "ili njegova farmaceutski prihvatljiva so’ uključuje sve permutacije soli. Podrazumeva se da je predviđeno da izraz "ili njegov solvat” uključuje sve permutacije solvata. Podrazumeva se da je predviđeno da izraz "ili njegov stereoizomer’ uključuje sve permutacije stereoizomera. Podrazumeva se da je predviđeno da izraz "ili njegov tautomer’ uključuje sve permutacije tautomera. Tako, dakle, na primer, sledi da je predviđeno da uključuje solvat farmaceutski prihvatljive soli tautomera stereoizomera predmetnog jedinjenja.
[0044] Kako se ovde koristi, predviđeno je da izraz "izolovan" opisuje jedinjenje od interesa koje se nalazi u sredini drugačijoj od sredine u kojoj se to jedinjenje prirodno javlja. Predviđeno je da " izolovan" uključuje jedinjenja koja se nalaze u uzorcima koji su u osnovi obogaćeni jedinjenjem od interesa i/ili u kojima je jedinjenje od interesa delimično ili u najvećoj meri prečišćeno.
[0045] Kako se ovde koristi, izraz "u najvećoj meri" odnosi se na jedinjenje koje je uklonjeno iz svoje prirodne sredine i najmanje 60% je slobodno od, najmanje 75% je slobodno od, najmanje 80% je slobodno od, najmanje 81% je slobodno od, najmanje 82% je slobodno od, najmanje 83% je slobodno od, najmanje 84% je slobodno od, najmanje 85% je slobodno od, najmanje 86% je slobodno od, najmanje 87% je slobodno od, najmanje 88% je slobodno od, najmanje 89% je slobodno od, najmanje 90% je slobodno od, najmanje 91% je slobodno od, najmanje 92% je slobodno od, najmanje 93% je slobodno od, najmanje 94% je slobodno od, najmanje 95% je slobodno od, najmanje 96% je slobodno od, najmanje 97% je slobodno od, najmanje 98% je slobodno od, najmanje 99% je slobodno od, ili više od 99% je slobodno od drugih komponenti sa kojima je prirodno u vezi.
[0046] Predviđeno je da izraz "fiziološki uslovi" obuhvata uslove kompatibilne sa živim ćelijama, npr., predominantno uslove u vodi, sa temperaturom, pH vrednostima, salinitetom, itd. koji su kompatibilni sa živim ćelijama.
[0047] Kada je obezbeđen opseg vrednosti, podrazumeva se da je svaka vrednost koja je umetnuta, sve do desetine jedinice donje granične vrednosti, osim ako kontekst jasno ne nalaže drugačije, između gornje i donje granične vrednosti tog opsega, kao i bilo koja druga navedena ili umetnuta vrednost u tom navedenom opsegu, obuhvaćena pronalaskom. Gornje i donje granične vrednosti ovih manjih opsega mogu nezavisno da budu uključene u manje opsege, i takođe su obuhvaćene pronalaskom i na njih se odnosi bilo koja specifično isključena granična vrednost u navedenom opsegu. Kada navedeni opseg uključuje jednu ili obe granične vrednosti, u pronalazak su uključeni i opsezi iz kojih su isključene jedan ili obe ove uključene granične vrednosti.
[0048] Potrebno je napomenuti da, kako se koriste ovde i u priloženim patentnim zahtevima, oblici jednine uključuju reference na množinu, izuzev ako kontekst jasno ne nalaže drugačije. Dalje se napominje da patentni zahtevi mogu da budu sastavljeni tako da isključuju bilo koji opcioni element. U tom smislu, namena ove izjave je da služi kao prethodni osnov za upotrebu terminologije ekskluziviteta kao što je "jedino", "samo" i slično, u vezi sa nabrajanjem elemenata patentnih zahteva, ili za upotrebu "negativnog" ograničenja.
[0049] Kroz celu specifikaciju mogu da se jave i druge definicije izraza.
OPIS TIPIČNIH PRIMERA IZVOĐENJA
[0050] Prema prethodno datom sažetom pregledu, aspekti prema prikazu uključuju postupke za pripremu polinukleotida. U nekim primerima izvođenja, postupak uključuje dovođenje u kontakt prve polinukleotidne kompozicije koja uključuje polinukleotid koji ima sekvencu od 7 ili više nukleozidnih subjedinica, pri čemu su najmanje dve od nukleozidnih subjedinica povezane N3’→P5’ tiofosforamidnom vezom između subjedinica; i proizvoda sinteze koji nisu ciljni proizvodi, i reagenasa; sa solju multivalentnog katjona kako bi se istaložila prva polinukleotidna so koja uključuje najmanje jedan multivalentan katjonski kontra jon; i odvajanja prve polinukleotidne soli od prve polinukleotidne kompozicije sa kojom je dovedena u kontakt, kako bi se proizvela druga polinukleotidna kompozicija koja uključuje prvu polinukleotidnu so. U nekim primerima izvođenja, postupak dodatno uključuje dovođenje u kontakt polinukleotidne soli sa nosačem za reverzno-faznu hromatografiju; i eluciju sa hromatografskog nosača treće polinukleotidne kompozicije koja uključuje polinukleotid. U nekim slučajevima, treća polinukleotidna kompozicija uključuje drugu polinukleotidnu so. Ovde su takođe obezbeđene kompozicije koje uključuju so polinukleotida koja uključuje najmanje jedan multivalentan katjonski kontra jon. U nekim primerima izvođenja, najmanje jedan multivalentan katjonski kontra jon je odabran iz grupe koja se sastoji od magnezijuma, cinka, aluminijuma i kalcijuma.
[0051] Pre nego što budu opisani različiti primeri izvođenja, potrebno je razumeti da instrukcije prema ovom prikazu nisu ograničena na konkretne opisane primere izvođenja, i kao takva mogu, naravno, da variraju. Takođe je potrebno razumeti da terminologija koja se ovde koristi služi samo za opisivanje konkretnih primera izvođenja, i nije predviđeno da bude ograničavajuća, pošto će obim predmetnih instrukcija biti ograničen samo priloženim patentnim zahtevima.
[0052] Naslovi odeljaka koji su ovde korišćeni imaju samo svrhu organizovanja i ne treba ih na bilo koji način tumačiti kao ograničavanje opisane predmetne materije. Iako su predmetne instrukcije opisana u kombinaciji sa različitim primerima izvođenja, nije predviđeno da predmetne instrukcije budu ograničena na te primere izvođenja. Naprotiv, predmetne instrukcije obuhvataju različite alternative, modifikacije i ekvivalente, što će stručnjacima u oblasti biti jasno.
[0053] Osim ako nije drugačije definisano, svi tehnički i naučni izrazi koji se ovde koriste imaju isto ono značenje koje podrazumeva stručnjak u oblasti kojoj ovaj pronalazak pripada. Premda u praksi ili prilikom testiranja predmetnog pronalaska, sada su opisani postupci i materijali od interesa.
[0054] Citiranje bilo koje publikacije se odnosi na njegovu dostupnost javnosti pre datuma podnošenja predmetne patentne prijave i ne bi ga trebalo tumačiti kao priznanje da predmetni patentni zahtevi nemaju pravo na antidatiranje ovih publikacija putem prava prethodnog pronalaska. Osim toga, obezbeđeni datumi objavljivanja mogu da se razlikuju od stvarnih datuma objavljivanja, što je moguće nezavisno potvrditi.
[0055] Jasno je da određena svojstva pronalaska, koja su, da bi bila jasna, opisana u kontekstu posebnih primera izvođenja, mogu takođe da budu obezbeđena u vidu kombinacije u jednom primeru izvođenja. Obrnuto, različita svojstva pronalaska, koja su, da bi bila kratka, opisana u kontekstu jednog primera izvođenja, mogu takođe da budu obezbeđena posebno ili u vidu bilo koje pogodne podkombinacije. Sve kombinacije primera izvođenja koje se odnose na pronalazak specifično su obuhvaćene predmetnim pronalaskom i prikazana su ovde na isti način kao i da je svaka pojedinačna kombinacija individualno i eksplicitno prikazana, do te mere da ove kombinacije obuhvataju teme kao, na primer, jedinjenja koja predstavljaju stabilna jedinjenja (tj., jedinjenja koja je moguće napraviti, izolovati, okarakterisati i testirati u pogledu biološke aktivnosti). Osim toga, sve podkombinacije različitih primera izvođenja i njihovi elementi (npr., elementi hemijskih grupa navedeni u primerima izvođenja koji opisuju ove promenljive) takođe su specifično obuhvaćene predmetnim pronalaskom i prikazani su ovde isto kao i da je svaka pojedinačna podkombinacija individualno i eksplicitno ovde prikazana.
[0056] U daljem opisivanju predmetnog pronalaska, najpre su detaljnije opisani postupci za pripremu polinukleotida. Sledeće, dat je pregled polinukleotidnih kompozicija od interesa za praktičnu primenu predmetnih postupaka.
POSTUPCI PRIPREME
[0057] Aspekti predmetnog prikaza uključuju postupke za pripremu polinukleotida. U nekim primerima izvođenja, postupak uključuje dovođenje u kontakt prve polinukleotidne kompozicije koja uključuje polinukleotid (npr., kao što je ovde opisan) i proizvode sinteze i agense koji nisu cilj te sinteze, sa solju multivalentnog katjona, kako bi se istaložila polinukleotidna so koja uključuje najmanje jedan multivalentan katjonski kontra jon. Taloženje polinukleotidne soli upotrebom predmetnih postupaka obezbeđuje uklanjanje svih solubilnih proizvoda sinteze i agenasa koji nisu ciljevi sinteze. U nekim primerima izvođenja, postupak uključuje odvajanje polinukleotidne soli od prve polinukleotidne kompozicije koja se dovodi u kontakt, kako bi bila proizvedena druga polinukleotidna kompozicija koja uključuje polinukleotidnu so. U nekim primerima izvođenja, i prva polinukleotidna kompozicija i polinukleotidna so, kao i druga polinukleotidna kompozicija, uključuju ciljni polinukleotid koji ima sekvencu od 7 ili više nukleozidnih subjedinica, pri čemu su najmanje dve od nukleozidnih subjedinica povezane N3’→P5’ tiofosforamidnom vezom između subjedinica (npr., kao što je ovde opisano).
[0058] Druga polinukleotidna kompozicija može da ima smanjenu količinu proizvoda sinteze i agenasa koji nisu ciljni proizvodi, u poređenju sa prvom polinukleotidnom kompozicijom. Pod smanjenom količinom proizvoda sinteze i agenasa koji nisu ciljni proizvodi misli se na to da postoji smanjenje od 10% ili više, po težini, proizvoda sinteze i agenasa koji nisu ciljni proizvodi u drugoj polinukleotidnoj kompoziciji u poređenju sa prvom polinukleotidnom kompozicijom, kao što je smanjenje od 15% ili više, po težini, smanjenje od 20% ili više, po težini, smanjenje od 25% ili više, po težini, smanjenje od 30% ili više, po težini, smanjenje od 35% ili više, po težini, smanjenje od 40% ili više, po težini, smanjenje od 45% ili više, po težini, smanjenje od 50% ili više, po težini, smanjenje od 55% ili više, po težini, smanjenje od 60% ili više, po težini, smanjenje od 65% ili više, po težini, smanjenje od 70% ili više, po težini, smanjenje od 75% ili više, po težini, smanjenje od 80% ili više, po težini, smanjenje od 85% ili više, po težini, smanjenje od 90% ili više, po težini ili smanjenje od 95% ili više , po težini. Imajući to u vidu, predmetni postupci mogu da omoguće selektivno taloženje ciljnog polinukleotida u odnosu na proizvode sinteze i agens koji nisu ciljni proizvodi. U nekim primerima izvođenja, predmetni postupci omogućavaju selektivnost taloženja u poređenju sa kontrolnim postupkom taloženja polinukleotida pomoću organskog rastvarača, kao što je čist etanol ili rastvor etanola (videti npr., Crouse J, Amorese D (1987). "Ethanol Precipitation: Ammonium Acetate as an Alternative to Sodium Acetate". Focus 9 (2): 3-5). Pod poboljšanom selektivnošću taloženja misli se na to da se 5% ili više, po težini, proizvoda sinteze i agenasa koji nisu ciljni proizvodi, uklanja iz druge polinukleotidne kompozicije u poređenju sa kontrolnom kompozicijom, recimo uklanja se 10% ili više, po težini, 15% ili više, po težini, 20% ili više, po težini, 25% ili više, po težini, 30% ili više, po težini, 35% ili više, po težini, 40% ili više, po težini, 45% ili više, po težini, 50% ili više, po težini, 55% ili više, po težini, 60% ili više, po težini, 65% ili više, po težini, 70% ili više, po težini, 75% ili više, po težini, 80% ili više, po težini, 85% ili više, po težini, 90% ili više, po težini, ili 95% ili više, po težini proizvoda sinteze i agenasa koji nisu ciljni proizvodi. Smanjenje količine proizvoda sinteze i agenasa koji nisu ciljni proizvodi, u poređenju sa prvom polinukleotidnom kompozicijom može da se odredi bilo kojim pogodnim postupcima, na primer upotrebom HPLC postupaka.
[0059] Kako se ovde koriste, izrazi "ciljni sintetički polinukleotid" i "ciljni polinukleotid" koriste se naizmenično i odnose se na polinukleotid koji ima konkretnu željenu sekvencu nukleotida koja je sintetisana na nosaču bilo kojim pogodnim konvencionalnim postupkom postepene sinteze polinukleotida na čvrstoj fazi (npr., kao što je ovde opisano), i polinukleotid je lišen bilo koje protektivne grupe koja se koristi jedino u svrhe izvođenja strategije za sintezu ciljnog polinukleotida. Ove protektivne grupe mogu da budu uklonjene sa polinukleotida u finalnim koracima sinteze na čvrstoj fazi, npr., tokom finalne deprotekcije i odvajanja polinukleotida sa nosača, kako bi bio proizveden ciljni polinukleotid. Kako se ovde koristi, izraz "koji nije ciljni" odnosi se na bilo koju pogodnu komponentu, npr., jedinjenje, polinukleotid ili njihov derivat, agens, itd., ili njihove smeše koji nisu željeni ciljni proizvod sinteze.
[0060] Ciljni polinukleotid može da uključuje bilo koji pogodan broj nukleozidnih subjedinica, recimo između 7 i 500 nukleozidnih subjedinica, recimo između 7 i 500 nukleozidnih subjedinica, između 7 i 100 nukleozidnih subjedinica, između 7 i 75 nukleozidnih subjedinica, između 7 i 50 nukleozidnih subjedinica, između 7 i 40 nukleozidnih subjedinica, između 7 i 30 nukleozidnih subjedinica, između 7 i 20 nukleozidnih subjedinica, između 7 i 15 nukleozidnih subjedinica, između 10 i 15 nukleozidnih subjedinica ili između 13 i 15 nukleozidnih subjedinica. U nekim slučajevima, ciljni polinukleotid ima između 7 i 100 nukleozidnih subjedinica, recimo između 7 i 50 nukleozidnih subjedinica, između 10 i 50 nukleozidnih subjedinica, između 10 i 40 nukleozidnih subjedinica, između 10 i 30 nukleozidnih subjedinica, između 10 i 25 nukleozidnih subjedinica, između 10 i 20 nukleozidnih subjedinica, između 12 i 18 nukleozidnih subjedinica ili između 12 i 16 nukleozidnih subjedinica. U nekim slučajevima, ciljni polinukleotid ima 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18,19, 20, 21, 22, 23, 24 ili 25 nukleozidnih subjedinica.
[0061] Kako se ovde koristi, izraz "proizvodi sinteze i agensi koji nisu cilj sinteze" odnosi se grupno na niz različitih komponenti koje nisu ciljne komponente, a mogu da budu prisutne u sirovom proizvodu sinteze polinukleotida na čvrstoj fazi, uključujući, ali ne i ograničeno na: polinukleotidne proizvode sinteze koji nisu ciljni proizvodi, kao što su skraćeni polinukleotidi, terminalno modifikovani polinukleotidni fragmenti (tj., sekvence koje su terminalno modifikovane nakon neuspešnog kuplovanja subjedinice), polinukleotidi koji uključuju deleciju(e) (tj., kojima nedostaje jedan ili više ciljnih nukleozidnih monomera ili dimera, npr., kao što je ovde opisano) i derivatizovani polinukleotidi (npr., polinukleotidne sekvence koje podležu neželjenoj bočnoj reakciji tokom sinteze ili odvajanja); i agensi kao što su odvojeni linkeri, proizvodi deprotekcije, npr., proizvodi uklonjene protektivne grupe kao što su fosforni proizvodi protektivnih grupa i bazni proizvodi protektivnih grupa (npr., egzociklični aminski proizvodi protektivnih grupa), reagensi za odvajanje i/ili hvatanje odvojenih grupa i rezidualni reagensi iz sinteze, kao što su monomeri, dimeri, reagensi za kuplovanje, terminalne modifikacije i doprotekciju.
[0062] U nekim primerima izvođenja, postupci omogućavaju selektivno taloženje ciljnih polinukleotida i agenasa u odnosu na proizvode sinteze koji nisu ciljni proizvodi, a koji uključuju polinukleotide koji imaju 6 nukleozidnih subjedinica ili manje, recimo 5 ili manje, 4 ili manje, 3 ili manje ili 2 nukleozidne subjedinice. U nekim slučajevima, svi proizvodi sinteze i agensi koji nisu ciljni polinukleotidi, ostaju solubilni tokom koraka selektivnog taloženja predmetnih postupaka i može na taj način lako da se ukloni iz dobijenog precipitata polinukleotidne soli.
[0063] Predmetni postupci mogu da uključuju taloženje i odvajanje ciljnih polinukleotida iz sirove sintetičke preparacije kako bi bila proizvedena polinukleotidna kompozicija koja ima nekoliko poželjnih svojstava, kao što je smanjena količina proizvoda i agenasa i sinteze koji nisu cilj sinteze (npr., reagensi za sintezu, reagensi za odvajanje, hvatanje odvojenih grupa, uklonjene protektivne grupe, bočni proizvodi degradacije (linkeri, grupe za terminalnu modifikaciju, itd.), i mali polinukleotidni fragmenti).
[0064] U nekim primerima izvođenja, predmetni postupci uključuju taloženje polinukleotida iz sirove sintetičke preparacije u vidu soli sa multivalentnim katjonom, pre hromatografskog prečišćavanja. U nekim slučajevima, predmetni postupci su postupci prečišćavanja ciljnog polinukleotida. Taloženje sirove polinukleotidne kompozicije pomoću soli sa multivalentnim katjonom proizvodi precipitat polinukleotidne soli koji uključuje najmanje jedan multivalentan katjonski kontra jon. U nekim slučajevima, prepcipitat polinukleotidne soli uključuje smešu jednovalentnih i multivalentnih katjonskih kontra jona koji obrazuju jonske parove sa polianjonskom polinukleotidnom kičmom. Kako se ovde koriste, izrazi "so sa multivalentnim katjonom" i "multivalentna so", kada se odnose na polinukleotid, koriste se naizmenično da označe polinukleotidnu so koja uključuje najmanje jedan multivalentan katjonski kontra jon koji je sparen sa anjonskom grupom za međusobno vezivanje subjedinica polinukleotidne kičme. U nekim slučajevima, polinukleotidna so sa multivalentnim katjonom uključuje smešu jednovalentnih i multivalentnih katjona. U nekim primerima izvođenja, multivalentni katjon može da omogući agregaciju ciljnog polinukleotida putem jonskog sparivanja sa anjonskim grupama za međusobno vezivanje subjedinica dve ili više polinukleotidnih kičmi. U nekim slučajevima, dvovalentan katjonski jon sparuje se sa dva različita polinukleotida kako bi obrazovao dimer. U nekim slučajevima dalja agregacija polinukleotida može da se postigne dodatnim multivalentnim interakcijama koje su posredovane dodatnim multivalentnim katjonima. U tom smislu, u nekim slučajevima, predmetni postupci mogu da omoguće selektivnu agregaciju i taloženje ciljnih polinukleotida u odnosu na proizvode sinteze i agense koji nisu ciljevi sinteze.
[0065] U nekim primerima izvođenja postupka, najmanje jedan multivalentan katjonski kontra jon je dvovalentan. U nekim primerima izvođenja, najmanje jedan multivalentan katjonski kontra jon je odabran iz grupe koja se sastoji od magnezijuma, cinka i kalcijuma. U nekim primerima izvođenja, najmanje jedan multivalentan katjonski kontra jon je trovalentan. U nekim primerima izvođenja, najmanje jedan multivalentan katjonski kontra jon je aluminijum. U nekim primerima izvođenja, polinukleotidna so dodatno uključuje jednovalentni katjonski kontra jon. U takvim slučajevima, polinukleotidna so je mešana so, npr., so koja uključuje dva ili više različitih katjonskih kontra jona.
[0066] Bilo koji pogodni koraci taloženja polinukleotida mogu da nađu svoju primenu u predmetnim postupcima. Korak u kome se u kontakt dovode prva polinukleotidna kompozicija sa multivalentnom katjonskom solju, kako bi bila istaložena polinukleotidna so koja uključuje najmanje jedan multivalentni pozitivan kontra jon, može da se postigne upotrebom bilo kojih pogodnih postupaka. Bilo koji pogodni multivalentni katjoni i njihove soli (npr., kao što su ovde opisane) mogu da se upotrebljavaju u koraku dovođenja u kontakt, kako bi bio proizveden precipitat. U nekim slučajevima, so polinukleotida koja uključuje najmanje jedan multivalentni pozitivan kontra jon proizvodi se u rastvorenoj fazi, npr., putem dodavanja multivalentne katjonske soli u rastvor koji uključuje polinukleotid. Kada se multivalentna katjonska so doda u rastvor, tada može da se obrazuje precipitat. U nekim slučajevima, so polinukleotida koja uključuje najmanje jedan multivalentni pozitivan kontra jon može da se obrazuje na izmenjivačkom nosaču. U koraku dovođenja u kontakt mogu da se koriste bilo koji pogodni jonoizmenjivački nosači. U nekim slučajevima, jonoizmenjivački nosač je jaka katjonska izmenjivačka smola. U nekim primerima izvođenja postupka, korak dovođenja u kontakt uključuje eluciju prve polinukleotidne kompozicije sa katjonskog izmenjivačkog nosača, koja uključuje te multivalentne katjonske kontra jone. Kako se ovde koristi, izraz " katjonski izmenjivački nosač" odnosi se na nosač koji je sam anjonski i koji može da sparuje jone sa katjonskim analitom, kao što je multivalentni katjon od interesa. Za korak elucije sa katjonskog izmenjivačkog nosača može da se koristi bilo koje pogodno sredstvo za eluciju. U nekim slučajevima, precipitat se obrazuje u eluatu nakon što je polinukleotidna so eluirana sa katjonskog izmenjivačkog nosača.
[0067] Predmetni postupci mogu da se izvode na bilo kojoj pogodnoj sirovoj sintetičkoj preparacija ciljnog sintetičkog polinukleotida. U nekim slučajevima, prva polinukleotidna kompozicija je sirova sintetička preparacija ciljnog sintetičkog polinukleotida. U nekim primerima izvođenja, prva polinukleotidna kompozicija je kompozicija koja predstavlja proizvod odvajanja ciljnog polinukleotida od nosača, nakon sinteze. U tom smislu, prva polinukleotidna kompozicija može da uključuje niz različitih proizvoda i agenasa sinteze koji nisu cilj sinteze. Predmetni postupci omogućavaju selektivno taloženje polinukleotidne soli u odnosu na proizvode i agense koji nisu cilj sinteze, a koji zaostaju u rastvoru te se lako mogu ukloniti iz dobijenog precipitata.
[0068] Bilo koji pogodni postupci sinteze (npr., kao što su ovde opisani) mogu da budu upotrebljeni kako bi se sintetisao ciljni polinukleotid. Nakon sinteze, ciljni polinukleotid se odvaja od nosača na kome je izvedena postepena sinteza. Nakon odvajanja, ciljni polinukleotid kompletne dužine može da se prečisti kako bi se uklonili neželjeni reagensi iz sinteze i odvajanja i da bi se uklonili polinukleotidni fragmenti koji nisu cilj sinteze i njihovi derivati. Predmetni postupci koji uključuju taloženje polinukleotidne soli koja uključuje najmanje jedan multivalentan pozitivan kontra jon može da se izvede u bilo kom pogodnom stadijumu preparacije ciljnog polinukleotida, recimo, nakon sinteze i pre prečišćavanja reverzno-faznom hromatografijom.
[0069] Kako se ovde koriste, izrazi "sirova sintetička preparacija", "sirova kompozicija" i "sirovi polinukleotid" odnose se na kompoziciju koja uključuje sintetičke proizvode iz sinteze polinukleotida na čvrstoj fazi koji se sakupljaju nakon sinteze putem odvajanja od nosača za sintezu na čvrstoj fazi, pri čemu kompozicija nije prečišćena, tj., na kompoziciji nije izvedeno hromatografsko prečišćavanje. Hromatografsko prečišćavanje se odnosi na bilo koji pogodan postupak prečišćavanja koji uključuje apsorpciju ciljnog polinukleotida na hromatografski nosač i naknadnu eluciju i razdvajanje ciljnog polinukleotida od polinukleotida koji nisu cilj sinteze. U nekim slučajevima, hromatografsko prečišćavanje se odnosi na reverzno-fazno hromatografsko prečišćavanje.
[0070] U nekim primerima izvođenja, postupak dodatno uključuje obezbeđivanje prve polinukleotidne kompozicije, gde se kompozicija proizvodi putem odvajanja od nosača za sintezu na čvrstoj fazi, nakon sinteze. Bilo koji dodatni koraci kao što su koraci uparavanja, razblaživanja ili koncentrovanja, takođe mogu da se izvedu na sirovoj sintetičkoj preparaciji pre nego što se dobijena kompozicija iskoristi u predmetnim postupcima. U nekim slučajevima, postupak dodatno uključuje sintetisanje ciljnog polinukleotida (npr., kao što je ovde opisano, na nosaču za sintezu na čvrstoj fazi). U nekim primerima izvođenja, postupak dodatno uključuje odvajanje polinukleotida sa nosača kako bi bila proizvedena prva polinukleotidna kompozicija.
[0071] Čvrsti precipitat koji uključuje polinukleotidnu so može da se odvoji od prve polinukleotidne kompozicije koja je dovedena u kontakt sa multivalentnom solju (tj., prve polinukleotidne kompozicije, dovedene u kontakt) upotrebom bilo kog pogodnog postupka. Postupci odvajanja od interesa uključuju ali nisu ograničeni na, centrifugiranje, filtraciju, dekantovanje i slične postupke.
[0072] U nekim slučajevima, razdvajanje precipitata koji uključuje polinukleotidnu so, postiže se centrifugiranjem pri kome primena centrifugalne sile na prvu polinukleotidnu kompoziciju dovedenu u kontakt, npr., u centrifugi, dovodi do toga da precipitat obrazuje pelet, npr., na dnu posude. Obrazovanje peleta putem centrifugiranja može da se označava kao obaranje precipitata. U nekim primerima izvođenja postupka, korak razdvajanja uključuje centrifugiranje prve polinukleotidne kompozicije dovedene u kontakt, kako bi se oborio precipitat polinukleotidne soli. Tečnost iz supernatanta može zatim da se dekantuje iz epruvete, a da se pritom precipitat ne poremeti, ili da se izvuče iz posude, npr., pomoću Pasterove pipete. Postupak centrifugiranja može da se ponovi sa rastvorom za ispiranje.
[0073] U nekim slučajevima, razdvajanje precipitata koji uključuje polinukleotidnu so, postiže se filtracijom. U nekim primerima izvođenja postupka, korak razdvajanja uključuje filtraciju polinukleotidne soli od prvog polinukleotida dovedenog u kontakt. Bilo koji pogodni filteri i medijumi za filtraciju mogu da se koriste u predmetnim postupcima. U izvesnim slučajevima, razdvajanje se postiže dubinskom filtracijom pomoću filterskog medijuma koji se bira u skladu sa ciljnim polinukleotidom.
[0074] U nekim primerima izvođenja, postupak uključuje: dovođenje u kontakt prve polinukleotidne kompozicije koja uključuje polinukleotid koji ima sekvencu od 7 ili više nukleozidnih subjedinica i najmanje dve od nukleozidnih subjedinica povezane su N3’→P5’ tiofosforamidatnom vezom između subjedinica; i sintetičkih proizvoda i agenasa za sintezu koji nisu ciljevi sinteze; sa multivalentnom katjonskom solju, kako bi se istaložila prva polinukleotidna so koja sadrži najmanje jedan multivalentan katjonski kontra jon; i odvajanje prve polinukleotidne soli so iz prve polinukleotidne kompozicije dovedene u kontakt, kako bi se dobila druga polinukleotidna kompozicija koja uključuje polinukleotidnu so.
[0075] Odvajanje precipitata iz prve polinukleotidne kompozicije dovedene u kontakt, daje drugu polinukleotidnu kompoziciju koja uključuje prvu polinukleotidnu so. U nekim slučajevima, selektivna precipitacija prve polinukleotidne soli upotrebom multivalentne katjonske soli putem predmetnih postupaka daje drugu polinukleotidnu kompoziciju koja uključuje smanjenu količinu proizvoda i agenasa sinteze koji nisu cilj sinteze.
[0076] Nakon selektivne precipitacije, predmetne polinukleotidne soli mogu zatim da se prevedu u solubilnu polinukleotidnu so putem izmene katjona najmanje jednog multivalentnog katjonskog kontra jona sa polinukleotida i njegovom zamenom drugim katjonskim kontra jonom od interesa (npr., kao što je ovde opisano). U tom smislu, predmetni postupci omogućavaju reverzibilno obrazovanje prve polinukleotidne soli koja uključuje najmanje jedan multivalentni katjonski kontra jon. Kako se ovde koriste, izrazi "reverzibilno obrazovanje" i "reverzibilna izmena" koriste se naizmenično i odnose se na pripremu polinukleotidne soli putem, npr., selektivne precipitacije (npr., kao što je ovde opisano), pri čemu obrazovana so može takođe naknadno da disocira kako bi odvajanjem izgubila najmanje jednu multivalentnu katjonsku so iz soli. U nekim slučajevima, polinukleotidne soli koje su nesolubilne u bilo kom rastvaraču mogu da se označavaju kao ireverzibilno obrazovane soli. U nekim primerima izvođenja, postupak uključuje izmenu najmanje jednog multivalentnog katjonskog kontra jona njegovim odvajanjem od prve polinukleotidne soli kako bi se dobila solubilna druga polinukleotidna so, pri čemu izmena uključuje disocijaciju multivalentnog katjonskog kontra jona i jonsko sparivanje sa katjonom od interesa solubilne soli. U nekim slučajevima, solubilna druga polinukleotidna so je jednovalentna so. U nekim slučajevima, solubilna druga polinukleotidna so je natrijumova so. U nekim slučajevima, solubilna druga polinukleotidna so je trietilamonijum so. U nekim slučajevima, prvi i drugi polinukleotid su međusobno različiti, tj., uključuju različite katjonske kontra jone. Disocijacija predmetnih polinukleotidnih soli i izmena najmanje jednog multivalentnog katjonskog kontra jona može da se postigne upotrebom bilo kojih pogodnih postupaka. U nekim slučajevima, disocijacija se postiže upotrebom reverzno-fazne hromatografije, npr., kao što je ovde opisano. U nekim slučajevima, jonoizmenjivačka hromatografija može da se koristi kako bi se postigla disocijacija. U nekim primerima izvođenja, disocijacija prve polinukleotidne soli postiže se rastvaranjem soli u rastvaraču koji uključuje katjonski kontra jon od interesa.
[0077] Posle razdvajanja, na drugoj polinukleotidnoj kompoziciji mogu da se izvedu dodatni koraci prečišćavanja. U nekim primerima izvođenja, postupak dodatno uključuje: dovođenje u kontakt prve polinukleotidne soli sa nosačem za reverzno-faznu hromatografiju; i elucija sa hromatografskog nosača treće polinukleotidne kompozicije koja uključuje polinukleotid. U nekim primerima izvođenja, treća polinukleotidna kompozicija uključuje drugu polinukleotidnu so. Bilo koji pogodni postupci reverzno-fazne hromatografije mogu da se koriste za prečišćavanje polinukleotidne soli. Postupci i nosači za reverzno-faznu hromatografiju od interesa uključuju, ali nisu ograničeni na, hromatografsko prečišćavanje upotrebom reverzno-fazne hromatografije jonskog para, C18 reverzno-faznu hromatografiju i one postupke i nosače koje su opisali autori Chen et al., Journal of Chromatography A, Volume 1288, 3 May 2013, Pages 73-81; i Zimmermann et al., Journal of Chromatography A, Volume 1354, 8 August 2014, Pages 43-55. U nekim primerima izvođenja, druga polinukleotidna kompozicija nanosi se direktno na nosač za reverzno-faznu hromatografiju. Pod direktnim nanošenjem na nosač misli se na to da se druga polinukleotidna kompozicija koja se dobija upotrebom predmetnog postupka, dodaje direktno, npr., u vidu izolovanog čvrstog precipitata, u nosač za reverzno-faznu hromatografiju. U nekim slučajevima, nosač za reverznofaznu hromatografiju je smola oblikovana u vidu kolone i polinukleotidna kompozicija se dodaje na vrh sloja smole. U nekim primerima izvođenja, postupak dodatno uključuje rastvaranje druge polinukleotidne kompozicije u rastvaraču. Moguće je koristiti bilo koje pogodne rastvarače, uključujući, ali ne ograničeno na, vodene pufere, organske rastvarače koji se mešaju sa vodom, kao i njihove smeše. U ovim slučajevima, rastvor druge polinukleotidne kompozicije može da se dovede u kontakt sa nosačem za reverzno-faznu hromatografiju kako bi se polinukleotid apsorbovao na nosač pre elucije.
[0078] U nekim slučajevima, dovođenje u kontakt uključuje apsorpciju polinukleotida na nosač za reverzno-faznu hromatografiju i naknadnu eluciju polinukleotida čime se obezbeđuje hromatografsko razdvajanje ciljnog polinukleotida od polinukleotida i zaostalih agenasa iz sinteze, koji nisu cilj sinteze, a prisutni su u kompoziciji. Eluat koji sadrži ciljni polinukleotid se sakuplja. Bilo koja pogodna sredstva za eluciju mogu da se koriste kako bi se polinukleotid eluirao sa nosača za reverzno-faznu hromatografiju. Sredstvo za eluciju može da se odabere u skladu sa različitim faktorima, kao što su priroda nosača za reverzno-faznu hromatografiju, ciljni oligonukleotid, konkretne željene soli ciljnog polinukleotida, itd. U nekim slučajevima, najmanje jedan multivalentan katjonski kontra jon prve polinukleotidne soli izmenjuje se na nosaču za reverznofaznu hromatografiju sa drugim različitim katjonskim kontra jonom od interesa koji je uključen u sredstvo za eluciju. U tim slučajevima, kada se polinukleotid eluira sa nosača za reverzno-faznu hromatografiju, on je u obliku druge soli (tj., druge polinukleotidne soli) nego u trenutku kad je bio nanešen, jer je najmanje jedan multivalentan katjonski kontra jon odvojen izmenom sa polinukleotida. U nekim slučajevima, oblik soli polinukleotida koji se eluira sa nosača u trećoj polinukleotidnoj kompoziciji, više je solubilan u vodi od prve polinukleotidne soli koja uključuje najmanje jedan multivalentni katjonski kontra jon.
[0079] U nekim primerima izvođenja, treća polinukleotidna kompozicija uključuje drugu polinukleotidnu so koja predstavlja farmaceutski prihvatljivu so polinukleotida. U nekim slučajevima, treća kompozicija uključuje drugu polinukleotidnu so koja predstavlja jednovalentnu katjonsku so polinukleotida. U izvesnim slučajevima, treća kompozicija uključuje drugu polinukleotidnu so koja predstavlja trietilamonijum so polinukleotida. U izvesnim slučajevima, treća kompozicija uključuje drugu polinukleotidnu so koja predstavlja natrijumovu so polinukleotida. Podrazumeva se da, nakon što se polinukleotid prečisti putem reverzno-fazne hromatografije, bilo koji broj dodatnih koraka izmene katjonskog kontra jona može da se izvede na polinukleotidnoj soli tako da se proizvede željeni oblik soli polinukleotida. U nekim primerima izvođenja, postupak dodatno uključuje jonsku izmenu katjonskih kontra jona iz druge polinukleotidne soli, kako bi se dobila treća polinukleotidna so. U nekim primerima izvođenja, treća polinukleotidna so je farmaceutski prihvatljiva so polinukleotida. U nekim slučajevima, treća polinukleotidna so je jednovalentna katjonska so polinukleotida. U izvesnim slučajevima, treća polinukleotidna so je natrijumova so polinukleotida (npr., kao što je ovde opisano).
[0080] U nekim slučajevima, prva kompozicija uključuje jednovalentnu katjonsku so polinukleotida. U nekim slučajevima, jednovalentna katjonska so je odabrana iz grupe koja se sastoji od natrijuma, amonijuma i alkil amonijuma. U nekim slučajevima, alkil amonijum je odabran iz grupe koja se sastoji od dimetilamonijuma, metilamonijuma, etilamonijuma i trietilamonijuma. U izvesnim slučajevima, prva kompozicija uključuje amonijumovu so polinukleotida. U izvesnim slučajevima, prva kompozicija uključuje alkil amonijumovu so polinukleotida. U izvesnim slučajevima, prva kompozicija uključuje trietilamonijumovu so polinukleotida. U izvesnim slučajevima, prva kompozicija uključuje natrijumovu so polinukleotida. Prva polinukleotidna kompozicija može da se dovede u kontakt sa multivalentnom katjonskom solju, kako bi bila istaložena prva polinukleotidna so koja uključuje najmanje jedan multivalentni katjonski kontra jon. U tom smislu, u izvesnim primerima izvođenja, prva polinukleotidna kompozicija dovedena u kontakt uključuje prvu polinukleotidnu so koja uključuje najmanje jedan multivalentan katjonski kontra jon.
[0081] Smatra se da su sva izvođenja bilo kog od primera izvođenja postupka, koji su navedeni u prethodnom tekstu, uključena u obim ovog pronalaska, pri čemu je polinukleotid onakav kako je ovde opisan.
Sintetički postupci
[0082] Bilo koji pogodni postupci, strategije i hemije za sintezu polinukleotida koji nalaze primenu u predmetnim postupcima za pripremu, mogu da se koriste za pripremu sirovog sintetičkog proizvoda polinukleotidne kompozicije. Hemije i postupci od interesa za sintezu polinukleotida, koji mogu da se prilagode za upotrebu u predmetnim postupcima uključuju, ali nisu ograničeni na, fosforamidit, H-fosfonat, fosfodiestar, fosfotriestar, fosfit triestar. Polinukleotidne komponente jedinjenja prema pronalasku mogu da se sintetišu prilagođavanjem bilo kojih konvencionalnih protokola za odabrani tip hemije. Postupci od interesa za sintezu oligonukleotida koji imaju N3’→P5’ tiofosforamidatne hemije, uključuju, ali nisu ograničeni na, one postupke koji su opisani u publikacijama SAD 5,824,793, McCurdy et al., (1997) Tetrahedron Letters, 38:207-210; Pongracz & Gryaznov, (1999) Tetrahedron Letters, 49:7661-7664; US 6,835,826, US 7,494,982, US 7,485,717 i US 5,684,143.
[0083] U nekim slučajevima, polinukleotid od interesa se sintetiše putem sekvencijalnih kuplovanja koja počinju od 5’-terminusa i nastavljaju do 3’-terminusa ciljne polinukleotidne sekvence. U nekim slučajevima, polinukleotid od interesa se sintetiše putem sekvencijalnih kuplovanja koja počinju od 3’-terminusa i nastavljaju do 5’-terminusa ciljne polinukleotidne sekvence. U nekim primerima izvođenja, polinukleotid se sintetiše sekvencijalnim kuplovanjima monomera fosforamidita sa narastajućim terminusom polinukleotida. 5’-terminalna nukleozidna subjedinica može da bude vezana za bilo koji čvrsti nosač preko opcione vezujuće grupe ili 5’-terminalne grupe. Kada se prva subjedinica veže za čvrsti nosač, subjedinica može da se deprotektuje kako bi dala deprotektovanu, imobilisanu 3’-terminalnu grupu. Tada mogu da se postignu kuplovanja subjedinica sa narastajućim oligonukleotidnim lancem. U nekim slučajevima, postupak uključuje kuplovanje 3’-terminalne grupe vezane za nosač sa 3’-protektovanim-nukleotid-5’-fosforamiditnim monomerom. U nekim primerima izvođenja, 3’-terminalna grupa je 3’-hidroksilna grupa. U nekim primerima izvođenja, 3’-terminalna grupa je 3’-amino grupa.
[0084] U nekim slučajevima, postupak sinteze polinukleotida uključuje korake: (a) deprotektovanja protektovane 3’-amino grupe terminalnog nukleozida vezanog za nosač čvrste faze, gde se deprotektovanjem obrazuje slobodna 3’-amino grupa; (b) dovođenje u kontakt slobodne 3’-amino grupe sa 3’-protektovanim amino-nukleozid-5’-fosforamiditnim monomerom u prisustvu nukleofilnog katalizatora, kako bi se obrazovala N3’→P5’ fosforamiditna veza između nukleozida; i (c) oksidovanja veze kako bi se dobila N3’→P5’ tiofosforamidatna veza. U nekim primerima izvođenja, postupak uključuje (d) ponavljanje koraka (a) do (c) sve dok se sinteza polinukleotida ne okonča.
[0085] U nekim slučajevima, postupak uključuje kuplovanje 3’-terminalne grupe koja je vezana za nosač, sa 3’-protektovanim-dinukleotid-5’-fosforamidatnim dimerom. Postupci sinteze polinukleotida od interesa uključuju, ali nisu ograničeni na, one postupke sinteze na čvrstoj fazi koji uključuju najmanje jedno kuplovanje dinukleotidnog dimera kao što je opisano u PCT Publikaciji br. WO2015/168310 koja zahteva prednost od privremene SAD patentne prijave sa serijskim br.
61/987,396. Ciljna polinukleotidna sekvenca može da se sintetiše putem retrosintetičke strategije koja uključuje sekvencijalna kuplovanja i dimernih i monomernih subjedinica sa 3’terminalnom grupom narastajućeg oligonukleotidnog lanca. U nekim primerima izvođenja, polinukleotid se sintetiše upotrebom postupka koji uključuje najmanje jedno kuplovanje dinukleotidnog dimera sa slobodnom 3’ terminalnom grupom narastajućeg oligonukleotidnog lanca.
[0086] U nekim slučajevima, postupak sinteze polinukleotida uključuje korake: (a) deprotektovanja protektovane 3’-amino grupe terminalnog nukleozida vezanog za nosač čvrste faze, gde se deprotektovanjem obrazuje slobodna 3’-amino grupa; (b) dovođenja u kontakt slobodne 3’-amino grupe sa 3’-protektovanim amino-dinukleotid-tiofosforamidatnim ili fosforamidit-5’-fosforamiditnim dimerom u prisustvu nukleofilnog katalizatora, kako bi se obrazovala N3’→P5’ fosforamiditna veza između nukleozida; i (c) oksidovanja veze kako bi se dobila N3’→P5’ tiofosforamidatna veza. U nekim primerima izvođenja, postupak uključuje (d) ponavljanje koraka (a) do (c) sve dok se sinteza polinukleotida ne okonča, pri čemu u koraku (b) mogu da se koriste 3’-protektovani amino-dinukleotid tiofosforamidat-5’-fosforamiditni dimer ili 3’-protektovani aminonukleotid-5’-fosforamiditni monomer.
[0087] U predmetnim postupcima može da se koristi bilo koja pogodna strategija za protekciju grupa, kako bi se protektovale bazne, fosforamiditne, fosforamidatne, 5’, 2’ i/ili 3’grupe polinukleotida. Protektivne grupe od interesa uključuju, ali nisu ograničene na, protektivne grupe koje su opisali autori Ohkubo et al., Org. Lett., 2010, 12 (11), pp 2496-2499; i Beaucage i Iyer, Tetrahedron 48: 2223-2311 (1992).
[0088] Kako se ovde koristi, izraz "fosfatna protektivna grupa" odnosi se na protektivnu grupu koja može da bude vezana za vezu između subjedinica oligonukleotida. Kada je prisutna, fosfatna protektivna grupa može da spreči (tj., blokira) reakciju veze koja sadrži fosfor na mestu gde je fosfatna protektivna grupa vezana. Bilo koje pogodne veze između subjedinica, koje sadrže fosfor (npr., P(III) i P(V) veze) mogu da budu protektovane fosfatnim protektivnim grupama, uključujući, ali ne i ograničeno na, fosforamiditne, oksofosforamidatne, tiofosforamidatne, fosfatne estarske, tiofosfatne estarske, fosfodiestarske veze, i slične veze. Fosfatna protektivna grupa može da bude vezana za dostupni atom kiseonika u vezi između subjedinica koja sadrži fosfor. Bilo koje pogodne protektivne grupe mogu da se koriste kao fosfatna protektivna grupa. U nekim primerima izvođenja, fosfatna protektivna grupa je metil ili β-cijanoetil.
[0089] U nekim slučajevima, 3’-terminalna grupa narastajućeg polinukleotidnog lanca može da uključuje 3’-hidroksilnu, 3’-amino grupu ili njihove protektovane verzije. Bilo koje pogodne hidroksil i/ili amino protektivne grupe mogu da se koriste na 3’-terminalnoj grupi tokom sinteze polinukleotida. U nekim primerima izvođenja, 3’-terminalna grupa je protektovana 3’-amino grupa i postupak uključuje deprotekciju ili uklanjanje protektivne grupe kako bi se dobila slobodna 3’-amino grupa. Kako se ovde koristi, izraz "slobodna amino grupa" označava amino grupu koja je dostupna za reagovanje sa fosforamiditnom grupom pridolazećeg monomera ili dimera. U nekim primerima izvođenja, slobodna amino grupa je primarni amin. Nakon koraka deprotekcije (npr., detritilacije), amino grupa može da bude u obliku soli (npr., soli konjugovane baze kiseline koja se koristi za detritilaciju). Ova so može nakon koraka detritilacije opciono da se neutrališe pomoću baznog rastvora kao što je 2% trietilamin ili piridin u acetonitrilu.
[0090] 3’-protekcija pridolazeće subjedinica fosforamidita sprečava neželjenu polimerizaciju lanca. U nekim primerima izvođenja, 3’-terminalna grupa je protektovana 3’-hidroksilna grupa i postupak uključuje deprotektovanje ili uklanjanje protektivne grupe da bi se dobila slobodna 3’-hidroksilna grupa. U nekim primerima izvođenja, 3’-terminalna grupa je protektovana 3’-amino grupa i postupak uključuje deprotekciju ili uklanjanje protektivne grupe kako bi bila proizvedena slobodna 3’-amino grupa. Protektovana 3’-amino ili 3’-hidroksilna grupa mogu da budu protektovane tritilnom protektivnom grupom. U nekim primerima izvođenja, tritilna protektivna grupa je trifenilmetil (Tr ili Trt, Ph3C-). U nekim primerima izvođenja, tritilna protektivna grupa je 4,4’-dimetoksitritil (DMT). Deprotekcija 3’-terminalne amino ili hidroksilne grupe može da se postigne upotrebom bilo kojih pogodnih postupaka. Postupci od interesa uključuju, ali nisu ograničeni na, one postupke koje su opisali autori Beaucage i Iyer, Tetrahedron 48: 2223-2311 (1992). U nekim slučajevima, deprotekcija protektovane 3’ amino grupe terminalnog nukleozida uključuje detritilaciju kojom se proizvodi slobodna 3’-terminalna grupa, npr., detritilaciju katalizovanu kiselinom. U nekim slučajevima, dimerna ili monomerna subjedinica fosforamidita uključuje protektovanu 3’-hidroksilnu ili 3’-amino grupu koja je ista kao i 3’-terminalna grupa terminalnog nukleozida koji je vezan za čvrsti nosač.
[0091] Bilo koji pogodni nosači čvrste faze mogu da se koriste za sintezu polinukleotida prema predmetnim postupcima. Čvrsti nosači od interesa uključuju, ali nisu ograničeni na, mikročestice napravljene od stakla sa kontrolisanom veličinom pora (CPG), intenzivno unakrsno povezanog polistirena (npr., NittoPhase HL 400 ili GE Primer 350), akrilnih kopolimera, celuloze, najlona, dekstrana, lateksa, poliakroleina, i sličnih materijala, kao što su oni prikazani u sledećim primerima referenci: Meth. Enzymol., Section A, pages 11-147, vol.44 (Academic Press, New York, 1976); SAD patenti br. 4,678,814; 4,413,070; i 4,046;720; i Pon, Chapter 19, in Agrawal, editor, Methods in Molecular Biology, Vol.20, (Humana Press, Totowa, N.J., 1993). Dodatni nosači od interesa uključuju polistirenske kuglice; polistiren sa dodatim polietilen glikolom (npr., TentaGel™, Rapp Polymere, Tubingen Nemačka); i slično. Odabir karakteristika nosača, kao što su materijal, poroznost, veličina, oblik i slično, i vrsta povezujuće komponente koja se koristi, zavise od niza različitih faktora, kao što su protektivne grupe koje se koriste, dužina finalnog proizvoda, kvantitet finalnog proizvoda i slično. Primeri vezujućih komponenti su prikazani u Pon et al., Biotechniques, 6:768-775 (1988); internet, SAD pat. br. 4,659,774; Barany et al., Međunarodna patentna prijava PCT/US91/06103; Brown et al., J. Chem. Soc. Commun., 1989: 891-893; Damha et al., Nucleic Acids Research, 18: 3813-3821(1990); Beattie et al., Clinical Chemistry, 39: 719-722 (1993); Maskos and Southern, Nucleic Acids Research, 20: 1679-1684 (1992); i slično.
[0092] U nekim primerima izvođenja, čvrsti nosači koji nalaze primenu u predmetnim postupcima uključuju CPG i polistiren sa dodatim polietilen glikolom i poseduju terminalnu amino grupu (npr., TentaGel-NH2™, Rapp Polymere, Tubingen Nemačka). Aminopropil grupa može da se koristi kao spejser između CPG i nukleozidne veze. U nekim slučajevima, veza sa 5’-hidroksilom prvog nukleozida je sukcinil grupa koja obezbeđuje estarsku vezu osetljivu na baze koja nakon sinteze može da se prekine pomoću vodenog rastvora amonijaka.
[0093] Nakon deprotekcije, nukleozid vezan za podlogu može da reaguje sa dimernom ili monomernom subjedinicom fosforamidita, kako bi se obrazovala veza između nukleozida. Podrazumeva se da nukleozid vezan za podlogu može da se odnosi na jedan ostatak vezan za čvrstu podlogu ili može da se odnosi na terminalni ostatak oligonukleotidnog lanca koji je vezan za podlogu. U predmetnim postupcima mogu da se koriste bilo koja pogodna hemija kuplovanja, reagensi za kuplovanje i postupci. Kad su u pitanju uslovi kuplovanja, protektivne grupe, podloge za čvrstu fazu, vezujuće grupe, reagensi za deprotekciju, reagensi za odvajanje proizvoda sa podloga čvrste faze, prečišćavanje proizvoda, i slično, moguće je napraviti bilo koji izbor u kontekstu predmetnih postupaka, oslanjajući se na smernice date u publikacijama, npr. Gait, editor, Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach (IRL Press, Oxford, 1984); Amarnath and Broom, Chemical Reviews, Vol. 77, pgs. 183-217 (1977); Pon et al., Biotechniques, Vol. 6, pgs. 768-775 (1988); Ohtsuka et al., Nucleic Acids Research, Vol. 10, pgs. 6553-6570 (1982); Eckstein, editor Oligonucleotides. and Analogues: A Practical Approach (IRL Press, Oxford, 1991), Greene and Wuts "Protective Groups in Organic Synthesis", Third edition, Wiley, New York 1999, Narang, editor, Synthesis and Applications of DNA and RNA (Academic Press, New York, 1987), Beaucage and Iyer, Tetrahedron 48: 2223-2311 (1992), i sličnim referencama.
[0094] U nekim slučajevima, nakon kuplovanje, neizreagovane 3’-amino grupe narastajućeg lanca polinukleotida vezanog za nosač, mogu da budu terminalno modifikovane pogodnim sredstvom za terminalnu modifikaciju pre sledećeg koraka deprotekcije (npr., koraka detritilacije) kako bi postale inertne u sledećim koracima kuplovanja. Ovaj korak terminalne modifikacije može da poboljša HPLC profil preparacije kako bi se olakšalo prečišćavanje, a takođe može i da poboljša ukupan prinos proizvoda. Reagensi za terminalnu modifikaciju korisni u predmetnim postupcima uključuju elektrofilne reagense kao što su anhidridi sirćetne i izobuterne kiseline, kiseli hloridi kao adamantil karbonil hlorid, pivaoil hlorid, i slični, izotiocijanati, hloroformati, itd. Korisni su takođe i fosforamiditi u kombinaciji sa aktivatorom i praćeni oksidacijom, i H-fosfonatne soli kao što je trietilamonijum izopropil-H-fosfonat kada se koristi u kombinaciji sa kiselim hloridom kao što je pivaoil hlorid ili adamantil karbonil hlorid.
[0095] U nekim primerima izvođenja, postupak uključuje oksidovanje N3’→P5’ fosforamiditne veze između nukleozida. Kako se ovde koriste, izrazi "oksidovati," "oksidacija," "oksidovanje" i slični izrazi, kada se odnose na veze između nukleozida koje sadrže fosfor, označavaju postupak ili obradu za prevođenje atoma fosfora u vezi, iz oblika fosfora (III) u oblik fosfora (V). Oksidacija veza između nukleotida može da se izvede u bilo kom pogodnom trenutku tokom sinteze, upotrebom bilo kojih pogodnih postupaka. U nekim primerima izvođenja, oskidacija se izvodi postepeno, npr., tokom svakog ciklusa kuplovanje. U drugim primerima izvođenja, oksidacija više veza između nukleotida se izvodi na kraju sinteze. U nekim slučajevima, oksidovanje N3’→P5’ fosforamiditne veze (npr., upotrebom oksidujućeg sredstva na bazi joda/vode) daje oksofosforamidatnu vezu. u drugim slučajevima, oksidovanje N3’→P5’ fosforamiditne veze uključuje sulfataciju kojom se dobija N3’→P5’ tiofosforamidatna veza. Sulfatacija može da se izvede upotrebom bilo kojih pogodnih postupaka. Postupci sulfatacije od interesa uključuju postupke koje su opisali Gryazonov et al. u WO2001018015 i US 6,114,519. Sredstva za sulfataciju od interesa uključuju, ali nisu ograničena na, elementarni sumpor, tiuram disulfide kao što je tetraetil tiuram disulfid, acil disulfide kao što su fenacildisulfid, fenil acetil disulfide, fosfinotioil disulfide kao što je S-Tetra™ i 1,1-diokso-3H-1,2-benzoditiol-3-on. U nekim primerima izvođenja, sulfatacija može da se izvede upotrebom fenil acetil disulfida u 2,6-lutidinu. U nekim primerima izvođenja, sulfatacija može da se izvede upotrebom Beaucage reagensa, upotrebom postupaka kao što su postupci koji su opisani u Iyer et al., J. Organic Chemistry 55:4693-4699, 1990.
[0096] Odvajanje polinukleotida sa nosača za sintezu na čvrstoj fazi može da se postigne upotrebom bilo kojih pogodnih postupaka i reagenasa, koji mogu da se odaberu u zavisnosti od različitih faktora, kao što je priroda nosača, linkerska hemija i vrsta strategije za upotrebu protektivne grupe, koji se koriste tokom sinteze. Izbori napravljeni za potrebe sinteze i odvajanja ciljnog polinukleotida mogu da odrede identitet proizvoda i agenasa iz sinteze, koji nisu cilj sinteze, a koji su prisutni u prvoj polinukleotidnoj kompoziciji.
[0097] U nekim primerima izvođenja, pre odvajanja, fosforne protektivne grupe polinukleotida se uklanjaju kako bi se izbeglo obrazovanje bilo kojih potencijalnih neželjenih adukata odvojene protektivne grupe (npr., β-cijanoetil protektivne grupe) sa polinukleotida. Postupci od interesa koji mogu da se prilagode za upotrebu u deprotekciji i odvajanju polinukleotida uključuju postupke opisane u US 7,199,236. U nekim primerima izvođenja, polinukleotid se odvaja sa nosača upotrebom rastvora amonijaka kako bi se uklonile bilo koje bazne protektivne grupe (npr., egzociklične amino protektivne grupe) i bilo koje preostale fosforne protektivne grupe. U reakciji odvajanja polinukleotida mogu da se koriste bilo koji pogodni uslovi. U nekim slučajevima, odvajanje se izvodi na temperaturi u opsegu od 40-60°C. U nekim slučajevima, odvajanje se izvodi tokom dužeg vremenskog perioda, kao što je period u opsegu od 12-24 sati. Nakon odvajanja polinukleotida, nosač zatim može da se ukloni filtracijom i ispiranjem. Kombinovani rastvori dobijeni filtracijom i ispiranjem, koji sada sadrže sirov sintetičku preparaciju polinukleotida, mogu da se koriste u predmetnim postupcima pripreme, pre nego što se prenesu u daljnje korake prečišćavanja. U nekim slučajevima, prečišćavanje rastvora polinukleotida uključuje preparativnu reverzno-faznu tečnu hromatografiju visokog učinka (RP-HPLC) RP HPLC, npr., upotrebom Kromasil C18 na 45-55°C. U nekim slučajevima, kompozicije polinukleotida prema predmetnim postupcima mogu da budu izložene nekolicini pogodnih koraka isoljavanja i koncentrovanja, npr., pomoću aparature za filtraciju tangencijalnog toka (TFF) opremljene polietarsulfonskim membranama sa veličinom prečnika pora koja obezbeđuje granicu od 1,000 Da.
POLINUKLEOTIDNE KOMPOZICIJE
[0098] Aspekti predmetnog prikaza uključuju kompozicije polinukleotidnih soli koje uključuju multivalentne katjonske kontra jone. U nekim primerima izvođenja, kompozicija uključuje: so polinukleotida koja uključuje najmanje jedan multivalentni katjonski kontra jon, pri čemu polinukleotid ima sekvencu od 7 ili više nukleozidnih subjedinica i najmanje dve od nukleozidnih subjedinica su povezane N3’→P5’ tiofosforamidnom vezom između subjedinica. U nekim primerima izvođenja, polinukleotid ima sekvencu od 7 ili više nukleozidnih subjedinica komplementarnih sa RNK komponentom humane telomeraze.
Multivalentni katjonski kontra joni
[0099] Bilo koji multivalentni katjoni mogu da se primene kao kontra joni u predmetnim polinukleotidnim solima. U tom smislu, multivalentan katjon može da obrazuje jonski par sa anjonskim mestom na polinukleotidnoj kičmi u predmetnoj polinukleotidnoj kompoziciji. Polinukleotidi mogu da uključuju nukleozidne subjedinice međusobno povezane vezama koje sadrže fosfor (npr., P (V) vezama) kao što su fosforamidatne, tiofosforamidatne, fosfatne estarske, fosfodiestarske veze, i slično. Podrazumeva se da veze između subjedinica polinukleotida mogu da budu negativno naelektrisane (npr., u vodenom rastvoru) i sparene sa katjonskim kontra jonom. Ovakve veze između subjedinica mogu da se označavaju kao anjonske grupe polinukleotidne kičme.
[0100] Kako se ovde koristi, izraz multivalentni katjon odnosi se na katjon koji može da obrazuje više različitih jonskih parova, npr., višestruko naelektrisani katjon, kao što je dvostruko ili trostruko naelektrisani katjon. Bilo koji pogodni multivalentni katjoni mogu da nađu primenu u predmetnim kompozicijama polinukleotidne soli. U nekim primerima izvođenja, multivalentni katjonski jon se sparuje sa dve ili više susednih anjonskih grupa polinukleotidne kičme. U nekim primerima izvođenja, multivalentni katjonski jon se sparuje sa jednom anjonskom grupom polinukleotidne kičme. U nekim primerima izvođenja, multivalentan pozitivan kontra jon je dvovalentan. Dvovalentni katjonski kontra joni od interesa uključuju, ali nisu ograničeni na, magnezijum, cink i kalcijum. U nekim primerima izvođenja, multivalentan pozitivan kontra jon je trovalentan. Trovalentni katjonski kontra joni od interesa uključuju, ali nisu ograničeni na, aluminijum. U nekim primerima izvođenja kompozicije, najmanje jedan multivalentni katjonski kontra jon je odabran iz grupe koja se sastoji od magnezijuma, cinka, aluminijuma i kalcijuma. U nekim primerima izvođenja kompozicije, najmanje jedan multivalentni katjonski kontra jon is magnezijum. U nekim primerima izvođenja kompozicije, najmanje jedan multivalentni katjonski kontra jon je cink. U nekim primerima izvođenja kompozicije, najmanje jedan multivalentni katjonski kontra jon je aluminijum. U nekim primerima izvođenja kompozicije, najmanje jedan multivalentni katjonski kontra jon je kalcijum.
[0101] Smatra se da broj katjonskih kontra jona koji su prisutni u polinukleotidnoj soli zavisi od niza različitih faktora, kao što su dužina polianjonske kičme, valenca katjona u solima, pH vrednost rastvora, agregacija polinukleotida u kompoziciji, itd. Predmetne kompozicije mogu da uključuju najmanje jedan multivalentni katjonski kontra jon na polianjonsku polinukleotidnu kičmu u predmetnim polinukleotidnim kompozicijama, recimo 2 ili više, 3 ili više, 4 ili više, 5 ili više, 6 ili više, 7 ili više, 8 ili više, 9 ili više, 10 ili više, 15 ili više, 20 ili više, 30 ili više, 40 ili više, 50 ili više, 100 ili više, ili čak i više multivalentnih katjonskih kontra jona. U nekim primerima izvođenja, polinukleotid koji ima n nukleozidnih subjedinica može da uključuje između 1 i (n-1)/2 (ako je n neparan ceo broj) dvovalentnih katjonskih kontra jon(a) ili između 1 i (n-2)/2 (ako je n is paran ceo broj) dvovalentnih katjonskih kontra jon(a). U nekim slučajevima, polinukleotidna so koja uključuje najmanje jedan multivalentni katjon, može dodatno da uključuje niz drugih katjonskih kontra jona, koji mogu da budu jednovalentni, dvovalentni ili trovalentni. U nekim slučajevima, n je u opsegu od 7 do 50, recimo 7 do 40, 10 do 40, 10 do 30, 10 do 25, 10 do 20, ili u opsegu od 12 do 15 nukleozidnih subjedinica.
[0102] U nekim primerima izvođenja kompozicije, polinukleotidna so može da uključuje 3 molska % ili više multivalentnog katjonskog kontra jona u odnosu na polianjonsku kičmu polinukleotida (tj., u odnosu na teorijski maksimum za uključivanje katjonskih kontra jona duž polianjonske kičme), kao što je 4 molska % ili više, 5 molskih % ili više, 6 molskih % ili više, 7 molskih % ili više, 8 molskih % ili više, 9 molskih % ili više, 10 molskih % ili više, 11 molskih % ili više, 12 molskih % ili više, 13 molskih % ili više, 14 molskih % ili više, 15 molskih % ili više, 16 molskih % ili više, 17 molskih % ili više, 18 molskih % ili više, 19 molskih % ili više, 20 molskih % ili više, 25 molskih % ili više, 30 molskih % ili više, 35 molskih % ili više, 40 molskih % ili više, 45 molskih % ili više, 50 molskih % ili više, 55 molskih % ili više, 60 molskih % ili više, ili još više, multivalentnog katjonskog kontra jona u odnosu na polianjonsku kičmu polinukleotida. U nekim primerima izvođenja predmetne kompozicije, polinukleotid može da uključuje 10 molskih % ili više multivalentnog katjonskog kontra jona u odnosu na polianjonsku kičmu polinukleotida. Na primer, polinukleotidna so koja uključuje polianjonsku kičmu od 10 veza između nukleozidnih subjedinica i koja uključuje jedan dvovalentni katjonski kontra jon koji se sparuje sa dve od tih veza, opisuje se tako kao da uključuje 20 molskih % dvovalentnog katjonskog kontra jona. Ako se jedan dvovalentni katjonski kontra jon sparuje sa samo jednom od veza umesto dve, polinukleotidna so se opisuje tako kao da uključuje 10 molskih % dvovalentnog katjonskog kontra jona. U tom smislu, vrednost molskih % odnosi se na nivo zauzetosti polianjonske polinukleotidne kičme multivalentnim katjonskim kontra jonima koji su prisutni u polinukleotidnoj soli. Na primer, jedan Mg2+ katjon u 13-mernoj polinukleotidnoj soli koja ima 12 veza između nukleozidnih subjedinica daje zauzetost od 16.7 molskih % zauzetosti kičme. Smatra se da u nekim primerima izvođenja polinukleotidna so može da uključuje dodatna mesta sparivanja jona na krajevima polinukleotida (npr., 5’-tiofosfatna grupa), i, ukoliko su prisutna, takva mesta treba da budu uključena u vrednost molskih % jedinjenja.
[0103] U nekim primerima izvođenja kompozicije, polinukleotidna so uključuje 90 molskih % ili manje multivalentnog katjonskog kontra jona u odnosu na polianjonsku kičmu polinukleotida, recimo 70 molskih % ili manje, 65 molskih % ili manje, 60 molskih % ili manje, 50 molskih % ili manje, ili još manje multivalentnog katjonskog kontra jona.
[0104] U nekim primerima izvođenja kompozicije, polinukleotidna so uključuje 3 do 90 molskih % multivalentnog katjonskog kontra jona u odnosu na polianjonsku kičmu polinukleotida, recimo 3 do 65 molskih % (npr., 6 do 50 molskih %, 10 do 50 molskih % ili 10 do 40 molskih %), 3 do 50 molskih %, 3 do 40 molskih %, 3 do 30 molskih %, 3 do 20 molskih % ili 3 do 15 molskih % multivalentnog katjonskog kontra jona u odnosu na polianjonsku kičmu polinukleotida.
[0105] U nekim slučajevima kompozicije, polinukleotidna so uključuje 3 do 60 molskih % multivalentnog katjonskog kontra jona u odnosu na polianjonsku kičmu polinukleotida, recimo 3 do 50 molskih % (npr., 5 do 50 molskih %), 3 do 40 molskih %, 3 do 30 molskih %, 3 do 20 molskih %, 3 do 15 molskih %, kao recimo 3-12 molskih % dvovalentnog katjonskog kontra jona.
[0106] U nekim slučajevima kompozicije, polinukleotidna so uključuje 3 do 60 molskih % katjonskog kontra jona magenzijuma u odnosu na polianjonsku kičmu polinukleotida, recimo magnezijuma, 5-50 molskih %, 5-40 molskih %, 10-40 molskih % ili 20-40 molskih % katjonskog kontra jona magenzijuma.
[0107] U nekim slučajevima kompozicije, polinukleotidna so uključuje 10 do 70 molskih % trovalentnog katjonskog kontra jona u odnosu na polianjonsku kičmu polinukleotida, recimo 10 do 60 molskih %, 20 do 60 molskih %, 20 do 50 molskih % ili 30 do 50 molskih % trovalentnog katjonskog kontra jona. U nekim primerima izvođenja kompozicije, polinukleotidna so uključuje 0.5 % ili više , po težini multivalentnog katjonskog kontra jona (npr., magnezijuma), recimo 0.6 % ili više, 0.7 % ili više, 0.8 % ili više, 0.9 % ili više, 1.1 % ili više, 1.2 % ili više, 1.3 % ili više, 1.4 % ili više, 1.5 % ili više, 1.6 % ili više, 1.7 % ili više, 1.8 % ili više, 1.9 % ili više, 2.0 % ili više, 2.1 % ili više, 2.2 % ili više, 2.3 % ili više 2.4 % ili više, 2.5 % ili više, 2.6 % ili više, 2.7 % ili više, 2.8 % ili više, 2.9 % ili više, 3.0 % ili više , po težini multivalentnog katjonskog kontra jona.
[0108] Polinukleotidna so je mešana so koja uključuje smešu multivalentnih i jednovalentnih katjonskih kontra jona. U nekim primerima izvođenja kompozicije, polinukleotidna so uključuje odnos multivalentnog katjonskog kontra jona prema jednovalentnom katjonskom kontra jonu od najmanje 0.05 ili više po molarnosti, recimo 0.10 ili više, 0.15 ili više, 0.20 ili više, 0.25 ili više, 0.30 ili više, 0.35 ili više, 0.40 ili više, 0.45 ili više, 0.50 ili više, 0.55 ili više, 0.60 ili više, 0.65 ili više, 0.70 ili više po molarnosti, ili još više multivalentnog katjonskog kontra jona prema jednovalentnom katjonskom kontra jonu.
[0109] U nekim slučajevima, polinukleotidna so uključuje odnos multivalentnog prema jednovalentnom katjonskom kontra jonu od 1:12 po molarnosti. U nekim slučajevima, polinukleotidna so uključuje odnos multivalentnog prema jednovalentnom katjonskom kontra jonu od 1:11 po molarnosti. U nekim slučajevima, polinukleotidna so uključuje odnos multivalentnog prema jednovalentnom katjonskom kontra jonu od 1:10 po molarnosti. U nekim slučajevima, polinukleotidna so uključuje odnos multivalentnog prema jednovalentnom katjonskom kontra jonu od 1:9 po molarnosti. U nekim slučajevima, polinukleotidna so uključuje odnos multivalentnog prema jednovalentnom katjonskom kontra jonu od 1:8 po molarnosti. U nekim slučajevima, polinukleotidna so uključuje odnos multivalentnog prema jednovalentnom katjonskom kontra jonu od 1:7 po molarnosti. U nekim slučajevima, polinukleotidna so uključuje odnos multivalentnog prema jednovalentnom katjonskom kontra jonu od 1:6 po molarnosti. U nekim slučajevima, polinukleotidna so uključuje odnos multivalentnog prema jednovalentnom katjonskom kontra jonu od 1:5 po molarnosti. U nekim slučajevima, polinukleotidna so uključuje odnos multivalentnog prema jednovalentnom katjonskom kontra jonu od 1:4 po molarnosti. U nekim slučajevima, polinukleotidna so uključuje odnos multivalentnog prema jednovalentnom katjonskom kontra jonu od 2:9 po molarnosti. U nekim slučajevima, polinukleotidna so uključuje odnos multivalentnog prema jednovalentnom katjonskom kontra jonu od 3:7 po molarnosti. U nekim slučajevima, polinukleotidna so uključuje odnos multivalentnog prema jednovalentnom katjonskom kontra jonu od 4:5 po molarnosti. U nekim slučajevima, polinukleotidna so uključuje odnos multivalentnog prema jednovalentnom katjonskom kontra jonu od 5:3 po molarnosti.
[0110] U nekim slučajevima mešane polinukleotidne soli, multivalentan katjonski kontra jon je magnezijum, a jednovalentan katjonski kontra jon je natrijum. U nekim slučajevima mešane polinukleotidne soli, multivalentan katjonski kontra jon je magnezijum, a jednovalentan katjonski kontra jon je amonijum. U nekim slučajevima mešane polinukleotidne soli, multivalentan katjonski kontra jon je magnezijum, a jednovalentan katjonski kontra jon je trietilamonijum. U nekim slučajevima mešane polinukleotidne soli, multivalentan katjonski kontra jon je aluminijum. U nekim slučajevima mešane polinukleotidne soli, multivalentan katjonski kontra jon je cink. U nekim slučajevima mešane polinukleotidne soli, multivalentan katjonski kontra jon je kalcijum. U nekim slučajevima mešane polinukleotidne soli, jednovalentan katjonski kontra jon je natrijum. U nekim slučajevima mešane polinukleotidne soli, jednovalentan katjonski kontra jon je amonijum. U nekim slučajevima mešane polinukleotidne soli, jednovalentan katjonski kontra jon je trietilamonijum. U nekim primerima izvođenja, polinukleotidna so uključuje jedan multivalentan katjonski kontra jon. U nekim primerima izvođenja, polinukleotidna so uključuje 2 multivalentna katjonska kontra jona. U nekim primerima izvođenja, polinukleotidna so uključuje 3 multivalentna katjonska kontra jona.. U nekim primerima izvođenja, polinukleotidna so uključuje 4 multivalentna katjonska kontra jona. U nekim primerima izvođenja, polinukleotidna so uključuje 5 multivalentnih katjonskih kontra jona. U nekim primerima izvođenja, polinukleotidna so uključuje 6 multivalentnih katjonskih kontra jona. U nekim primerima izvođenja, polinukleotidna so uključuje 7 multivalentnih katjonskih kontra jona. U nekim primerima izvođenja, polinukleotidna so uključuje 8 multivalentnih katjonskih kontra jona. U nekim primerima izvođenja, polinukleotidna so uključuje 9 multivalentnih katjonskih kontra jona. U nekim primerima izvođenja, polinukleotidna so uključuje 10 multivalentnih katjonskih kontra jona.
[0111] Osim ciljnog polinukleotida, niz različitih polinukleotidnih proizvoda sinteze koji nisu cilj sinteze, mogu da se dobiju tokom sinteze polinukleotida. Minorni proizvodi koji mogu da budu prisutni u preparacijama polinukleotida uključuju, ali nisu ograničeni na, proizvode delecije (npr., proizvode kojim nedostaje jedan ili više nukleozidnih ostataka), proizvodi koji uključuju jednu ili više protektivnih grupa, terminalno modifikovani proizvodi (npr., proizvodi koji uključuju terminalno modifikovan polinukleotidni lanac), proizvodi kojima nedostaje jedna ili više nukleobaza, proizvodi koji uključuju delimično oksidovane fosforamiditne veze i proizvodi koji uključuju delimično sulfatisane veze.
[0112] Predmetni postupci omogućavaju kompozicije koje uključuju poboljšanu čistoću ciljnog polinukleotida u kompoziciji. U nekim primerima izvođenja, kompozicija uključuje 20% ili više, po težini ciljnog polinukleotida, recimo 25% ili više, 30% ili više, 35% ili više, 40% ili više, 45% ili više, 50% ili više, 60% ili više, 70% ili više, 80% ili više, 90% ili više, ili čak 95% ili više, po težini ciljnog polinukleotida. U nekim primerima izvođenja, kompozicija uključuje 50% ili više, po težini ciljnog polinukleotida. U nekim primerima izvođenja, kompozicija uključuje 55% ili više , po težini ciljnog polinukleotida. U nekim primerima izvođenja, kompozicija uključuje 60% ili više, po težini ciljnog polinukleotida. U nekim primerima izvođenja, kompozicija uključuje 65% ili više, po težini ciljnog polinukleotida. U nekim primerima izvođenja, kompozicija uključuje 70% ili više, po težini, ciljnog polinukleotida. U nekim primerima izvođenja, kompozicija uključuje 75% ili više, po težini ciljnog polinukleotida. U nekim primerima izvođenja, kompozicija uključuje 80% ili više, po težini ciljnog polinukleotida. U nekim primerima izvođenja, kompozicija uključuje 85% ili više, po težini ciljnog polinukleotida. U nekim primerima izvođenja, kompozicija uključuje 90% ili više, po težini ciljnog polinukleotida. U nekim primerima izvođenja, kompozicija uključuje 95% ili više, po težini ciljnog polinukleotida.
[0113] Predmetni postupci omogućavaju kompozicije koje uključuju smanjenu količinu proizvoda i agensa iz sinteze koji nisu cilj sinteze. Pod smanjenom količinom se podrazumeva da je količina po težini, proizvoda i agenasa iz sinteze, koji nisu cilj sinteze, smanjena u kompoziciji u odnosu na kontrolni postupak. U nekim primerima izvođenja, predmetne kompozicije uključuju proizvode i agense iz sinteze, koji nisu cilj sinteze, u količini od 50% ili manje polinukleotida koji nisu ciljni, u kompoziciji, recimo 40% ili manje, 30% ili manje, 25% ili manje, 20% ili manje, 15% ili manje, 10% ili manje ili čak 5% ili manje proizvoda i agenasa iz sinteze, koji nisu cilj sinteze.
[0114] Bilo koja od širokog niza polinukleotidnih kompozicija može da se pripremi upotrebom postupaka kao što su ovde opisani. Niz različitih klasa i tipova polinukleotida su od interesa za pripremu upotrebom predmetnih postupaka (npr., kao što je ovde opisano). Polinukleotidi pogodni za pripremu u skladu sa predmetnim postupcima uključuju, ali nisu ograničeni na, antisens polinukleotide, RNK polinukleotide, siRNK polinukleotide, RNKi polinukleotide, DNK aptamere, mikro RNK i slične molekule.
[0115] U nekim primerima izvođenja, polinukleotid je opisan Formulom (I):
pri čemu:
svako B je nezavisno purin, protektovani purin, pirimidin ili protektovani pirimidin, ili njihov analog;
svako X je nezavisno kiseonik ili sumpor;
svako R3 je nezavisno vodonik, fluoro, hidroksil, alkoksi, supstituisani alkoksi ili protektovani hidroksil;
R6 je amino, hidroksil, protektovani amino, protektovani hidroksi, -O-T-Z ili -NH-T-Z; svako T je nezavisno opcioni linker;
svako Z je nezavisno H, lipid, nosač, oligonukleotid, polimer, polipeptid, marker koji može da se detektuje ili grupa za obeležavanje; i
n je ceo broj od 7 do 1000. Podrazumeva se da oligonukleotidi Formule (I), mogu da postoje u obliku soli. U tom smislu, veze između nukleozida u Formuli (I) mogu da budu u takvom obliku da uključuju bilo koji pogodan kontra jon. Predviđeno je da ovi oblici budu uključeni u obim predmetnog prikaza. Podrazumeva se da su mogući i drugi tautomerni aranžmani veza između nukleozida u polinukleotidu koji je opisan Formulom (I). Predviđeno je da ovi oblici budu uključeni u obim predmetnog prikaza.
[0116] U nekim primerima izvođenja Formule (I), svaki R<3>je vodonik. U nekim primerima izvođenja Formule (I), svaki R<3>je fluoro. U nekim primerima izvođenja Formule (I), svaki R<3>je hidroksil. U nekim primerima izvođenja Formule (I), R<6>je amino. U nekim primerima izvođenja Formule (I), R6 je hidroksil. U nekim primerima izvođenja Formule (I), Z je H. U nekim primerima izvođenja Formule (I), Z je lipid (npr., kao što je ovde opisano). U izvesnim slučajevima, lipid je masna kiselina (npr., kao što je ovde opisano). U nekim primerima izvođenja Formule (I), Z je nosač. U nekim primerima izvođenja Formule (I), Z je oligonukleotid. U nekim primerima izvođenja Formule (I), Z polimer. U izvesnim slučajevima, polimer je PEG. U nekim primerima izvođenja Formule (I), Z je polipeptid. U nekim primerima izvođenja Formule (I), Z je marker koji može da se detektuje. U nekim primerima izvođenja Formule (I), Z je grupa za obeležavanje. U nekim primerima izvođenja Formule (I), T je odsutan. U nekim primerima izvođenja, svako B je nezavisno izabrano od A, C, G, T i U.
[0117] U nekim primerima izvođenja Formule (I), n je ceo broj između 7 i 500, recimo između 7 i 100, između 7 i 75, između 7 i 50, između 7 i 40, između 7 i 30, između 7 i 20, između 7 i 15, između 10 i 15 ili između 13 i 15. U nekim primerima izvođenja, n je ceo broj između 7 i 100, recimo između 7 i 50, između 10 i 50, između 10 i 40, između 10 i 30, između 10 i 25, između 10 i 20, između 12 i 18 ili između 12 i 16. U nekim primerima izvođenja, n je 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18,19, 20, 21, 22, 23, 24 ili 25.
Polinukleotidi komplementarni RNK komponenti telomeraze
[0118] Aspekti prema prikazu uključuju jedinjenja i kompozicije koje uključuju polinukleotide komplementarne RNK komponenti humane telomeraze, i postupke za pripremanje polinukleotida te komponente. Jedinjenja mogu sa visokom potencijom da inhibiraju telomeraznu aktivnost u ćelijama i imaju karakteristike ćelijskog preuzimanja.
[0119] U nekim slučajevima, polinukleotid uključuje sekvencu od 7 ili više nukleozidnih subjedinica komplementarnih sa RNK komponentom humane telomeraze, recimo 8 ili više, 9 ili više, 10 ili više, 11 ili više, 12 ili više, 13 ili više, 14 ili više, 15 ili više, 20 ili više, 30 ili više, 50 ili više nukleozidnih subjedinica komplementarnih sa RNK komponentom humane telomeraze.
[0120] U nekim primerima izvođenja, polinukleotid uključuje između 10 i 50 nukleozidnih subjedinica u neprekinutom nizu, koje su komplementarne sa RNK komponentom humane telomeraze, recimo između 5 i 40, između 7 i 40, 10 i 40, između 10 i 30, između 10 i 25, između 10 i 20, ili između 12 i 15 nukleozidnih subjedinica. U nekim primerima izvođenja, polinukleotid uključuje sekvencu od 7 ili više nukleozidnih subjedinica u neprekinutom nizu, koje su komplementarne sa RNK komponentom humane telomeraze, recimo 10 ili više, 11 ili više, 12 ili više, 13 ili više, 14 ili više, 15 ili više, 20 ili više, 30 ili više, 50 ili više nukleozidnih subjedinica u neprekinutom nizu, koje su komplementarne sa RNK komponentom humane telomeraze.
[0121] U nekim primerima izvođenja, polinukleotid je jedinjenje opisano formulom:
O-(x-L)n
gde O predstavlja polinukleotid koji uključuje sekvencu nukleozidnih subjedinica koje su komplementarne sa RNK komponentom humane telomeraze, x je opciona linkerska grupa, L predstavlja lipidnu komponentu i n je ceo broj od 1-5. U nekim slučajevima, n je 5. U nekim slučajevima, n je 4. U nekim slučajevima, n je 3. U nekim slučajevima, n je 2. U nekim slučajevima, n je 1. Dizajn jedinjenja zahteva, dakle, odabir dva entiteta, O i L, i određivanje strukturne veze(a) između ovih entiteta, što može da uključuje opcionu linkersku grupu x.
[0122] U nekim primerima izvođenja, polinukleotidno jedinjenje može da bude opisano formulom:
O-(x-L)n
gde O predstavlja polinukleotid koji uključuje sekvencu nukleozidnih subjedinica koje su komplementarne sa RNK komponentom humane telomeraze, x je opciona linkerska grupa, L predstavlja lipidnu komponentu i n je 1, kao što je polinukleotid Formule (I), ili njegova so, pri čemu u Formuli (I), Z je lipidna komponenta, T je opcioni linker (npr., kao što je ovde opisano) i grupe B odgovaraju sekvenci nukleozidnih subjedinica koje su komplementarne sa RNK komponentom humane telomeraze.
[0123] Polinukleotidna komponenta O može da se posmatra kao "efektorska" komponenta jedinjenja u tom smislu što predstavlja komponentu koja efektivno ostvaruje inhibiciju enzima telomeraze, tako što se vezuje za enzim putem vezivanja za RNK komponentu telomeraze. Dakle, sekvenca za O bira se tako da uključuje region koji je komplementaran sa sekvencom telomerazne RNK, koja je prikazana u sekvenci SEQ ID NO:1. Region koji je komplementaran sa RNK komponentom telomeraza može teoretski da se ciljano usmeri ka bilo kom delu telomerazne RNK, ali su određeni konkretni regioni RNK poželjni ciljni regioni za inhibitorne polinukleotide. Jedan poželjan ciljni region je region koji se proteže od nukleotida 30-67 sekvence SEQ ID NO:1, koji uključuje "templejt region", region od 11 nukleotida sekvence 5’-CUAACCCUAAC-3’ (SEQ ID NO:21) koji se proteže od nukleotida 46-56 sekvence SEQ ID NO: 1. Templejt region funkcioniše tako što određuje sekvencu telomernih ponovaka koje telomeraza dodaje na krajeve hromozoma, i od suštinskog je značaja za aktivnost enzima telomeraze (videti Chen et al., Cell 100:503-514, 2000; Kim et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 98(14):7982-7987, 2001). Dakle, od interesa su jedinjenja od interesa koja sadrže polinukleotidnu komponentu koja uključuje sekvencu komplementarnu sa celim templejt regionom ili njegovim delom. Drugi ciljni region od interesa je region koji obuhvata nukleotide 137-179 hTR sekvence (videti Pruzan et al., Nucl. Acids Research, 30:559-588, 2002). U ovom regionu, poželjna ciljna sekvenca je sekvenca koja obuhvata nukleotide 141-153. PCT objava WO 98/28442 opisuje upotrebu polinukleotida dužine od najmanje 7 nukleotida za inhibiciju telomeraze, gde su polinukleotidi tako dizajnirani da budu komplementarni dostupnim delovima hTR sekvence izvan templejt regiona, uključujući nukleotide 137-196, 290-319 i 350-380 hTR sekvence.
[0124] Region komponente O koji se ciljano usmerava na hTR sekvencu, u nekim slučajevima je potpuno komplementaran sa odgovarajućom hTR sekvencom. I dok u nekim slučajevima pogrešno sparivanje može da se toleriše, očekuje se da ono smanjuje specifičnost i aktivnost dobijenog polinukleotidnog konjugata. U nekim primerima izvođenja, sekvenca baza u polinukleotidu O bira se tako da uključuje sekvencu od najmanje 5 nukleotida koji su potpuno komplementarni sa telomeraznom RNK, i poboljšana inhibicija telomeraze može da se postigne ukoliko se koriste sve duže komplementarne sekvence, recimo najmanje 6, najmanje 7, najmanje 8, najmanje 10, najmanje 12, najmanje 13 ili najmanje 15 nukleotida koji su potpuno komplementarni sa telomeraznom RNK. U drugim primerima izvođenja, sekvenca polinukleotida uključuje sekvencu od najmanje 7 do 20, od najmanje 8 do 20, od najmanje 10 do 20 ili od najmanje 10 do 15 nukleotida koji su koji su potpuno komplementarni sa sekvencom telomerazne RNK. Optimalna inhibitorna aktivnost telomeraze može da se postigne kada se puna dužina polinukleotida O odabere tako da bude komplementarna sa telomeraznom RNK. Međutim, nije neophodno da puna dužina polinukleotidne komponente bude potpuno komplementarna sa ciljnom sekvencom, tako da polinukleotidna sekvenca može da uključuju regione koji nisu komplementarni sa ciljnom sekvencom. Ovakvi regioni mogu da se dodaju, na primer, kako bi jedinjenju obezbedili druga svojstva, kao što su sekvence koje olakšavaju prečišćavanje. Ukoliko je potrebno da polinukleotidna komponenta O uključuju regione koji nisu komplementarni sa ciljnom sekvencom, takvi regioni mogu da budu smešteni na jednom ili oba 5’ ili 3’ terminusa. U situacijama kada se region potpune komplementarnosti ciljno usmerava ka templejt regionu, efikasna inhibicija telomeraze može da se postigne pomoću kratkog (5-8 nukleotida) regiona potpune komplementarnosti sa kojim je sekvenca slična telomerazi (G-bogata) povezana na 5’ kraju.
[0125] Primeri sekvenci koje su komplementarne sa humanom telomeraznom RNK i koje mogu da budu uključene kao deo polinukleotidne komponente O, ili koje mogu da se koriste kao cela polinukleotidna komponenta O, uključuju sledeće:
hTR komplementarne sekvence (regioni polinukleotidne sekvence SEQ ID NO:1 iz SAD Objave patenta 2012329858);
GCTCTAGAATGAACGGTGGAAGGCGGCAGG 137-166 (SEQ ID NO: 2)
GTGGAAGGCGGCAGG 137-151 (SEQ ID NO: 6)
GGAAGGCGGCAGG 137-149 (SEQ ID NO: 7)
GTGGAAGGCGGCA 139-151 (SEQ ID NO: 8)
GTGGAAGGCGG 141-151 (SEQ ID NO: 9)
CGGTGGAAGGCGG 141-153 (SEQ ID NO: 10)
ACGGTGGAAGGCG 142-154 (SEQ ID NO: 11)
AACGGTGGAAGGCGGC 143-155 (SEQ ID NO: 12)
ATGAACGGTGGAAGGCGG 144-158 (SEQ ID NO: 13)
ACATTTTTTGTTTGCTCTAG 160-179 (SEQ ID NO: 14)
TAGGGTTAGACAA 42-54 (SEQ ID NO: 3)
GTTAGGGTTAG 46-56 (SEQ ID NO: 4)
GTTAGGGTTAGAC 44-56 (SEQ ID NO: 15)
GTTAGGGTTAGACAA 42-56 (SEQ ID NO: 16)
GGGTTAGAC 44-52 (SEQ ID NO: 19)
CAGTTAGGG 50-58 (SEQ ID NO: 20)
CCCTTCTCAGTT 54-65 (SEQ ID NO: 17)
CGCCCTTCTCAG 56-67 (SEQ ID NO: 18)
[0126] U nekim primerima izvođenja, polinukleotid uključuje sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od: GTTAG-GGTTAG (SEQ ID NO:4); TAGGGTTAGACAA (SEQ ID NO:3); i CAGTTAGGGTTAG (SEQ ID NO:5).
[0127] Tip veze između nukleozida koji se koristi u sintezi O komponente može da se izabere od bilo koje dostupne polinukleotidne hemije, uključujući, ali ne ograničeno na, fosfodiestarske, fosfotriestarske, metilfosfonatne, P3’→N5’ fosforamidatne, N3’→P5’ fosforamidatne, N3’→P5’ tiofosforamidatne i fosforotioatne veze. U nekim primerima izvođenja, polinukleotidna komponenta O ima najmanje jednu N3’→P5’ tiofosforamidatnu vezu. U nekim primerima izvođenja, nukleozidne subjedinice komplementarne sa RNK komponentom humane telomeraze sve su međusobno povezane N3’→P5’ tiofosforamidatnim vezama između subjedinica. U nekim slučajevima, N3’→P5’ tiofosforamidatna veza između subjedinica ima sledeću strukturu:
3’--NH--P(S)(OR)--O--5’
gde je R vodonik ili so. Podrazumeva se da za bilo koje ovde opisane polinukleotidne komponente O koje uključuju takvu vezu između subjedinica, te polinukleotidne komponente O mogu takođe da uključuju bilo koje pogodne oblike soli ovih veza. U tom smislu, veza između subjedinica može da bude u obliku soli koja uključuje bilo koji pogodan kontra jon.
[0128] U nekim primerima izvođenja, najmanje dve nukleozidne subjedinice su povezane N3’→P5’ tiofosforamidatnom vezom između subjedinica, a druge veze između subjedinica su sve nezavisno izabrane od N3’→P5’ okso-fosforamidatnih i N3’→P5’ tiofosforamidatnih veza između subjedinica. U nekim primerima izvođenja, nukleozidne subjedinice su povezane vezama između subjedinica, gde je svaka veza nezavisno izabrana od N3’→P5’ okso-fosforamidatnih i N3’→P5’ tio-fosforamidatnih veza između subjedinica. U nekim primerima izvođenja, nukleozidne subjedinice povezane su vezama između subjedinica od kojih je svaka nezavisno izabrana od N3’→P5’ okso-fosforamidatnih i N3’→P5’ tiofosforamidatnih veza između subjedinica; pod uslovom da su najmanje dve od nukleozidnih subjedinica povezane pomoću N3’→P5’ tiofosforamidatne veze između subjedinica. U nekim primerima izvođenja, nukleozidne subjedinice su sve povezane N3’→P5’ tiofosforamidatnim vezama između subjedinica.
[0129] U nekim primerima izvođenja, polinukleotidna komponenta O ima sekvencu TAGGGTTAGACAA (SEQ ID NO:3), a nukleozidne subjedinice su povezane vezama između subjedinica koje sadrže najmanje jednu N3’→P5’ tiofosforamidatnu vezu. U nekim primerima izvođenja, polinukleotidna komponenta O ima sekvencu TAGGGTTAGACAA (SEQ ID NO:3), a nukleozidne subjedinice su povezane vezama između subjedinica koje sadrže najmanje dve N3’→P5’ tiofosforamidatne veze. U nekim primerima izvođenja, polinukleotidna komponenta O ima sekvencu TAGGGTTAGACAA (SEQ ID NO:3), a nukleozidne subjedinice su povezane vezama između subjedinica koje sadrže najmanje tri N3’→P5’ tiofosforamidatne veze. U nekim primerima izvođenja, polinukleotidna komponenta O ima sekvencu TAGGGTTAGACAA (SEQ ID NO:3), a nukleozidne subjedinice su povezane vezama između subjedinica koje sadrže najmanje četiri N3’→P5’ tiofosforamidatne veze. U nekim primerima izvođenja, polinukleotidna komponenta O ima sekvencu TAGGGTTAGACAA (SEQ ID NO:3), a nukleozidne subjedinice su povezane vezama između subjedinica koje sadrže najmanje pet N3’→P5’ tiofosforamidatnih veza. U nekim primerima izvođenja, polinukleotidna komponenta O ima sekvencu TAGGGTTAGACAA (SEQ ID NO:3), a nukleozidne subjedinice su povezane vezama između subjedinica koje sadrže najmanje šest N3’→P5’ tiofosforamidatnih veza. U nekim primerima izvođenja, polinukleotidna komponenta O ima sekvencu TAGGGTTAGACAA (SEQ ID NO:3), a nukleozidne subjedinice su povezane vezama između subjedinica koje sadrže najmanje sedam N3’→P5’ tiofosforamidatnih veza. U nekim primerima izvođenja, polinukleotidna komponenta O ima sekvencu TAGGGTTAGACAA (SEQ ID NO:3), a nukleozidne subjedinice su povezane vezama između subjedinica koje sadrže najmanje osam N3’→P5’ tiofosforamidatnih veza. U nekim primerima izvođenja, polinukleotidna komponenta O ima sekvencu TAGGGTTAGACAA (SEQ ID NO:3), a nukleozidne subjedinice su povezane vezama između subjedinica koje sadrže najmanje devet N3’→P5’ tiofosforamidatnih veza. U nekim primerima izvođenja, polinukleotidna komponenta O ima sekvencu TAGGGTTAGACAA (SEQ ID NO:3), a nukleozidne subjedinice su povezane vezama između subjedinica koje sadrže najmanje deset N3’→P5’ tiofosforamidatnih veza. U nekim primerima izvođenja, polinukleotidna komponenta O ima sekvencu TAGGGTTAGACAA (SEQ ID NO:3), a nukleozidne subjedinice su povezane vezama između subjedinica koje sadrže najmanje jedanaest N3’→P5’ tiofosforamidatnih veza. U nekim primerima izvođenja, polinukleotidna komponenta O ima sekvencu TAGGGTTAGACAA (SEQ ID NO:3), a nukleozidne subjedinice su povezane vezama između subjedinica od kojih je svaka nezavisno izabrana od N3’ →P5’ oksofosforamidatnih i N3’→P5’ tiofosforamidnih veza između subjedinica. U nekim primerima izvođenja, polinukleotidna komponenta O ima sekvencu TAGGGTTAGACAA (SEQ ID NO:3), a nukleozidne subjedinice su povezane vezama između subjedinica od kojih je svaka nezavisno izabrana od N3’ →P5’ okso-fosforamidatnih i N3’→P5’ tiofosforamidnih veza između subjedinica; pod uslovom da su najmanje dve nukleozidne subjedinice povezane N3’→P5’ tiofosforamidatnim vezama između subjedinica. U nekim primerima izvođenja, polinukleotidna komponenta O ima sekvencu TAGGGTTAGACAA (SEQ ID NO:3), i sve nukleozidne subjedinice su povezane N3’→P5’ tiofosforamidnim vezama između subjedinica.
[0130] U svim primerima izvođenja prethodno ili nadalje izloženim u tekstu N3’→P5’ tiofosforamidatne veze između subjedinica naročito su -NH-P(=O)(SH)-O- ili njen tautomer, ili njena so; i N3’ →P5’ okso-fosforamidatne veze između subjedinica naročito su -NH-P(=O)(OH)-O- ili njen tautomer, ili njena so. Još konkretnije, u svim primerima izvođenja prethodno ili nadalje izloženim u tekstu, N3’→P5’ tiofosforamidatne veze između subjedinica naročito su -NH-P(=O)(SH)-O- ili njen tautomer, ili njena so natrijuma; i N3’→P5’ okso-fosforamidatne veze između subjedinica naročito su -NH-P(=O)(OH)-O- ili njen tautomer, ili njena so natrijuma.
[0131] U jednom od primera izvođenja, pronalazak se odnosi na bilo koju od ovde opisanih specifičnih struktura, pri čemu je izborno jedna ili više, naročito jedna, N3’→P5’ tiofosforamidatna veza između subjedinica zamenjena N3’→P5’ okso-fosforamidatnom vezom između subjedinica. U jednom od primera izvođenja, pronalazak se odnosi na bilo koju od ovde opisanih specifičnih struktura, pri čemu je jedna ili više, naročito jedna, N3’→P5’ tiofosforamidatna veza između subjedinica zamenjena N3’→P5’ okso-fosforamidatnom vezom između subjedinica.
[0132] U nekim slučajevima, predmetna jedinjenja su efikasnija u postizanju inhibicije telomeraze u ćelijama nego odgovarajući polinukleotidi koji nisu konjugovani sa lipidnim komponentama. Veruje se da lipidna komponenta L funkcioniše tako što poboljšava preuzimanje jedinjenja u ćelije, naročito putem olakšavanja prolaska kroz ćelijsku membranu. Iako mehanizam po kome se ovo dešava nije u potpunosti razjašnjen, jedna mogućnost je da lipidna komponenta možda olakšava vezivanje jedinjenja za ćelijsku membranu bilo u vidu pojedinačnog molekula, bilo u obliku agregata (micelarnog), sa naknadnom internalizacijom. Međutim, poznavanje preciznog mehanizma nije neophodno da bi predmetna jedinjenja mogla da se koriste.
[0133] Lipidna komponenta može da bude bilo koji lipid ili derivat lipida koji obezbeđuje poboljšano preuzimanje u ćelije u poređenju sa nemodifikovanim polinukleotidom. Lipidi od interesa uključuju, ali nisu ograničeni na, ugljovodonike, masti (npr., gliceride, masne kiseline i derivate masnih kiselina, kao što su masni amidi) i sterole. Kada je lipidna komponenta ugljovodonik, L komponenta može da bude supstituisani ili nesupstituisani ciklični ugljovodonik ili alifatični linearni lanac ili granati ugljovodonik, koji može da bude zasićen. Primeri uključuju negranate ugljovodonike linearnog lanca koji su potpuno zasićeni ili polinezasićeni. Dužina ugljovodoničnog lanca može da varira od C2-C30, ali optimalna inhibicija telomeraze može da se postigne pomoću ugljovodonika sa lancima dužine C8-C22. Primeri zasićenih ugljovodonika (alkana) od interesa navedeni su u spisku koji sledi:
Sistematsko ime / Ugljenični lanac
[0134]
Tetradekan C14H30
Pentadekan C15H32
Heksadekan C16H34
Heptadekan C17H36
Oktadekan C18H38
Nonadekan C19H40
Eikozan C20H42
[0135] Takođe mogu da se izaberu i mononezasićeni i polinezasićeni oblici (alkeni i polieni, kao što su alkadieni i alkatrieni) ugljovodonika, pri čemu su od interesa jedinjenja koja imaju jednu do tri dvostruke veze, iako mogu da se koriste i jedinjenja koja imaju više dvostrukih veza. Alkini (koji sadrže jednu ili više trostrukih veza) i alkenini (trostruka veza(e) i dvostruka veza(e)) takođe mogu da se koriste.
[0136] Supstituisani oblici ugljovodonika mogu da se koriste u predmetnim jedinjenjima, pri čemu su od interesa supstituentne grupe koje su in vivo i in vitro inertne. U nekim slučajevima, supstituent je fluor. Primeri generičkih struktura polifluorisanih ugljovodonika uključuju: CF3(CF2)n-(CH2)mgde je m najmanje 1, u nekim slučajevima najmanje 2, i n je 1 do 30, kao što je fluorotridekan: CF3(CF2)9(CH2)3; i CH3(CH2)a(CF2)b(CH2)c- gde su a, b i c nezavisno 1-30.
[0137] Druge pogodne lipidne komponente od interesa uključuju, ali nisu ograničene na, jednostavne masne kiseline i derivate masnih kiselina, gliceride, kompleksnije lipide kao što su steroli, na primer holesterol. Masne kiseline i njihovi derivati od interesa mogu da budu potpuno zasićeni ili mononezasićeni ili polinezasićeni. Dužina ugljeničnog lanca može da varira od C2-C30, ali se optimalna inhibicija telomeraza postiže pomoću ugljeničnih lanaca dužine C8-C22. Primeri zasićenih masnih kiselina od interesa navedeni su u tekstu koji sledi:
Sistematsko ime / Trivijalno ime / Ugljenični lanac
[0138]
Tetradekanska miristinska 14:0
Heksadekanska palmitinska 16:0
Oktadekanska stearinska 18:0
Eikozanska arahidna 20:0
[0139] Mononezasićeni i polinezasićeni oblici masnih kiselina mogu takođe da se koriste, pri čemu su od interesa jedinjenja koja imaju jednu do tri dvostruke veze, premda i jedinjenja koja imaju više dvostrukih veza mogu takođe da se koriste. Primeri uobičajenih mononezasićenih i polinezasićenih masnih kiselina od interesa, koje mogu da se koriste, uključuju:
Sistematsko ime / Trivijalno ime / Ugljenični lanac
[0140]
Cis-9-heksadekanska palmitoleinska 16:1(n-7)
Cis-6-oktadekanska petroselinska 18:1 (n-12)
Cis-9-oktadekanska oleinska 18:1 (n-9)
9,12-oktadekadienska linoleinska 18:2 (n-6)
6,9,12-oktadekatrienska gama-linoleinska 18:3 (n-6)
9,12,15- oktadekatrienska alfa- linoleinska 18:3 (n-3)
5,8,11,14-eikozatetraenska arahidonska 20:4 (n-6)
[0141] Masne kiseline sa jednom ili više trostrukih veza u ugljeničnom lancu, kao i granate masne kiseline, takođe mogu da se koriste u predmetnim jedinjenjima. U predmetnim jedinjenjima mogu da se koriste supstituisani oblici masnih kiselina. Kao i kod ugljovodoničnih grupa, od interesa su supstituentne grupe koje su in vivo i in vitro inertne, kao što je fluor. Primeri generičkih struktura polifluorinisanih derivata masnih kiselina koji su pogodni za uporedbu u pronalasku su: CF3(CF2)n-(CH2)mCO- gde je m najmanje 1, poželjno najmanje 2, a n je 1 do 30, i CH3(CH2)a(CF2)b(CH2)cCO-gde su a, b i c nezavisno 1-30.
[0142] U nekim slučajevima, za O komponentu je kovalentno vezano između jedne i pet L komponenti (n je 1, 2, 3, 4 ili 5), preko opcionog linkera. U nekim slučajevima, koriste se jedna ili dve L komponente (n=1 ili 2). Kada je za O komponentu je vezano više od jedne L komponente, svaka L komponenta je nezavisno odabrana.
[0143] Uvideće se da su jedinjenja prema pronalasku za koja je opisano da imaju specifični ugljovodonik kao L komponentu i jedinjenja za koja je opisano da imaju specifičnu masnu kiselinu (sa istim brojem atoma ugljenika kao i specifični ugljovodonik) vrlo slična i da im se strukture razlikuju samo po prirodi veze kojom se L komponenta vezuje za polinukleotid, što je, sa svoje strane rezultat postupka sinteze koji je korišćen da se jedinjenje dobije. Na primer, i kao što je detaljnije opisano u tekstu koji sledi, kada se jedinjenja sintetišu tako da imaju L komponentu konjugovanu sa 3’-amino terminusom polinukleotida (koji ima fosforamidatne ili tiofosforamidatne veze između nukleozida), upotreba aldehidnog oblika masne kiseline (masnog aldehida) kao polaznog materijala, dovodi do obrazovanja aminske veze između lipidnog lanca i polinukleotida, tako da lipidna grupa izgleda kao ugljovodonik. Nasuprot tome, upotreba karboksilne kiseline, anhidrida kiseline ili oblika kiselih hlorida iste masne kiseline, dovodi do obrazovanja amidne veze, tako da lipidna grupa izgleda kao derivat masne kiseline, u ovom primeru, specifično kao masni amid (kao što je prethodno u tekstu pomenuto u odeljku sa definicijama, zarad jednostavnosti, izraz "masna kiselina" kada se opisuje konjugovana L grupa, ovde se široko koristi tako da uključuje derivate masnih kiselina, uključujući masne amide). Ovo je ilustrovano u sledećim šematskim prikazima u kojima se vidi 3’-amino terminus fosforamidatnog polinukleotida, povezan sa C14 lipidnom komponentom. U šematskom prikazu A, L is tetradekanska kiselina (miristinska kiselina), u kojoj je veza između L i O grupe amid. U šematskom prikazu B, L je tetradekan, a veza između L i O grupe je amin.
[0144] Vezivanje komponenti O i L može da bude direktno vezivanje ili može da se ostvari putem opcione linkerske komponente, npr., x ili opcionog linkera T iz Formule (I). Linkerska grupa može da služi da se olakša hemijska sinteza jedinjenja. Bez obzira na to da li se ili ne linkerska grupa koristi za posredovanje pri konjugaciji O i L komponenti, na polinukleotidnoj komponenti O postoji više mesta sa kojima L komponenta(e) može pogodno da se konjuguje. Pogodne tačke vezivanja uključuju 5’ i 3’ terminuse, jedan ili više prstenova šećera, internukleozidnu kičmu i nukleobaze polinukleotida. U nekim slučajevima, komponenta L je vezana za 3’ ili 5’ terminus polinukleotida.
[0145] Ako je potrebno da L komponenta bude vezana za 3’ terminus, veza može da se ostvaruje direktno preko 3’ supstituenta, koji je u slučaju poželjnih fosforamidatnih i tiofosforamidatnih polinukleotida predstavljen 3’-amino grupom, a u drugim slučajevima, kao što su konvencionalni fosfodiestarski polinukleotidi, 3-hidroksi grupom. Alternativno, L komponenta može da bude vezana preko 3’-povezane fosfatne grupe, u kojoj je heksadekanski ugljovodonik vezan sa 3’ fosfatom tiofosforamidatnog polinukleotida preko O-alkil linkera. Ako je potrebno da L komponenta bude vezana za 5’ terminus, ona može da bude vezana preko 5’-povezane fosfatne grupe. Vezivanje za bazu na O komponenti može da se ostvari preko bilo kog pogodnog atoma, na primer za N2amino grupu guanozina. Kada je n>1 tako da je potrebno da se veći broj lipidnih komponenti veže za O komponentu, individualno odabrane L komponente mogu da se vežu za bilo koje pogodno mesto(a). Na primer, jedna L grupa može da bude vezana za svaki terminus, različite L grupe mogu da budu vezane za bazu, ili de ili više L grupa mogu da budu vezane za jedan terminus.
[0146] Opciona linkerska komponenta x može da se koristi da bi povezale O i L komponente jedinjenja. Smatra se da opcioni linker (npr., x, ili T iz Formule (I)) može da bude vezan za polinukleotid (npr., O) preko terminalne fosfatne grupe, npr., 3’-vezane ili 5’- vezane fosfatne grupe. Ako je potrebno da se koristi linker, on je inkorporiran u postupke sinteze kao što je ovde opisano. Primeri pogodnih linkerskih grupa uključuju amino glicerol i linkere tipa O-alkil glicerol koji redom mogu da budu predstavljeni generičkim strukturama:
gde R’ predstavlja H, OH, NH2ili SH; Y predstavlja O, S ili NR; R predstavlja H, alkil ili supstituisani alkil; i n i m su nezavisno celi brojevi između 1-18. Primeri pogodnih linkera od interesa su aminoglicerol linker u kome R’ predstavlja OH, Y predstavlja O, a i m i n su 1:
bis-aminoglicerol linker, u kome R’ predstavlja OH, Y predstavlja NH, a i m i n su 1:
i O-alkil glicerol linker u kome R predstavlja H:
[0147] Primeri lipidima modifikovanih polinukleotida koji mogu da se pripreme u skladu sa predmetnim postupcima uključuju jedinjenja opisana na Slici 1 (npr., Slike 1A-1DD) u SAD Patentnoj prijavi US20120329858 u ime Gryaznov et al. "Modified oligonucleotides for telomerase inhibition", čiji je prikaz ovde inkorporiran u svojoj celovitosti putem reference.
[0148] U nekim primerima izvođenja, kompozicija uključuje jedinjenje opisano strukturom:
ili njegovu so, gde "nps" predstavlja tiofosforamidnu vezu (npr., -NH-P(=O)(SH)-O- ili njen tautomer, ili so), koja povezuje 3’-ugljenik jednog nukleozida sa 5’-ugljenikom susednog nukleozida. Podrazumeva se da jedinjenje opisano u prethodnoj formuli može da postoji u obliku soli. Predviđeno je da ovakvi oblici, ukoliko mogu da postoje, budu uključeni u obim predmetnog prikaza. U nekim primerima izvođenja, kompozicija uključuje farmaceutski prihvatljivu so jedinjenja. U nekim slučajevima, kompozicija uključuje natrijumovu so jedinjenja. U nekim primerima izvođenja, kompozicija uključuje dvovalentnu katjonsku so jedinjenja, kao što je magezijumova so jedinjenja. U nekim primerima izvođenja, kompozicija uključuje trovalentnu katjonsku so jedinjenja, kao što je aluminijumova so jedinjenja.
[0149] U nekim primerima izvođenja, kompozicija uključuje jedinjenje opisano sledećom strukturom:
gde je svako M nezavisno vodonik ili bilo koji pogodan kontra jon soli, svako x je nezavisno 1, 2 ili 3 i n je ceo broj od 5 do 13. U nekim slučajevima, n je 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 ili 13. U nekim slučajevima, svako x je nezavisno 1, 2 ili 3 i n je ceo broj od 5 do 12. U nekim slučajevima, n je 13. U nekim slučajevima, svako x je 1. U nekim slučajevima, svako x je nezavisno 1 ili 2. U nekim slučajevima, svako x je nezavisno 1 ili 3. U nekim slučajevima, svako M<x+>je nezavisno katjonski kontra jon. U nekim slučajevima, svako M<x+>je nezavisno katjonski kontra jon, svako x je nezavisno 1, 2 ili 3 i n je ceo broj od 5 do 12. U nekim slučajevima, svako M<x+>je vodonik. U nekim slučajevima, svako M<x+>je nezavisno vodonik ili bilo koji pogodan katjonski kontra jon, svako x je nezavisno 1, 2 ili 3 i n je ceo broj od 5 do 12. U nekim slučajevima, svako M<x+>je vodonik. U nekim primerima izvođenja, (M<x+>)n je (Mg<2+>)(M<+>)11. U nekim primerima izvođenja, (Mx+)nje (Mg2+)2(M+)9. U nekim primerima izvođenja, (Mx+)
nje (Mg2 )2(M+)9. U nekim primerima izvođenja, (Mx+)3je (Mg2+)3(M+)7. U nekim primerima izvođenja, (Mx+)
nje (Mg2+)4(M )5. U nekim primerima izvođenja, (M<x+>)nje (Mg2+)5(M+)3. U nekim primerima izvođenja, (Mx+)nje (Mg2+)6(M+). U nekim primerima izvođenja, (M<x+>)n je (Mg<2+>)(M<+>)12, pri čemu Mg2+ kontra jon može da obrazuje dodatni jonski par sa anjonskom kičmom drugog oligonukleotida. U nekim primerima izvođenja, (M<x+>)nje (Mg2+)2(M+)11, pri čemu Mg2+ kontra joni mogu da obrazuju dva dodatna jonska para sa anjonskom kičmom(ama) jednog ili dva druga oligonukleotida. U nekim slučajevima, M<+>kontra jon mešane magnezijumove soli je natrijum. U nekim slučajevima, M<+>kontra jon mešane magnezijumove soli je amonijum. U nekim slučajevima, M<+>kontra jon mešane magnezijumove soli je trietilamonijum.
[0150] U nekim primerima izvođenja, kompozicija uključuje jedinjenje opisano sledećom strukturom i može da uključuje bilo koje pogodne katjonske kontra jone soli:
Ċ
[0151] U nekim primerima izvođenja, kompozicija uključuje jedinjenje opisano strukturom:
Polinukleotidi modifikovani lipidima
[0152] Niz različitih sintetičkih pristupa može da se koristi kako bi se lipidna komponenta L konjugovala sa polinukleotidom, u zavisnosti od prirode odabrane veze, uključujući pristupe opisane u publikacijama Mishra et al., (1995) Biochemica et Biophysica Acta, 1264:229-237, Shea et al., (1990) Nucleic Acids Res. 18:3777-3783 i Rump et al., (1998) Bioconj. Chem. 9:341-349. Sinteza jedinjenja u kojima je lipidna komponenta konjugovana na 5’ ili 3’ terminusu polinukleotida može da se postigne kroz upotrebu pogodnih funkcionalnih grupa na odgovarajućem terminusu, u nekim slučajevima amino grupe ili hidroksilne grupe, koje mogu da reaguju sa karboksilnim kiselinama, hloridima, anhidridima i aktivnim estrima. Tiolne grupe takođe mogu da se koriste kao funkcionalne grupe (videti Kupihar et al., (2001) Bioorganic and Medicinal Chemistry 9:1241-1247). Za sintezu polinukleotida su komercijalno dostupni kako modifikatori amino, tako i tiolnih grupa sa različitim dužinama lanca. Polinukleotidi koji imaju N3’→P5’ tiofosforamidatne veze sadrže 3’-amino grupe (pre nego 3’-hidroksi grupe koje se javljaju kod većine konvencionalnih hemija polinukleotida), i otuda ovi polinukleotidi obezbeđuju jedinstvenu priliku za konjugaciju lipidnih grupa sa 3’-krajem polinukleotida.
[0153] Različiti pristupi mogu da se primene kako bi se lipidne grupe vezale za terminuse polinukleotida sa N3’→P5’ tiofosforamidatnom hemijom (npr., palmitoilamido-1-O-(4,4’-dimetoksitritil)-2-O-sukcinil propandiolski linker). U cilju vezivanja za 3’ terminus, može da se sintetiše konjugovano jedinjenja, tako što se 3’-amino grupa potpuno protektovanog polinukleotida vezanog za nosač izloži reakciji sa odgovarajućim anhidridom kiseline, nakon čega sledi deprotekcija amonijakom i prečišćavanje. Alternativno, kuplovanje karboksilne kiseline lipida sa slobodnom 3’-amino grupom polinukleotida vezanog za nosač, pomoću sredstava za kuplovanje kao što su karbodiimidi, HBTU (N,N,N’,N’-tetrametil-O-(1H-benzotriazol-1-il)uronijum heksafluorofosfat) ili 2-hloro-1-metilpiridinijum jodid, može da se koristi za konjugaciju lipidnih grupa. Ova dva postupka obrazuju amidnu vezu između lipida i polinukleotida. Lipidi takođe mogu da budu vezani za polinukleotidni lanac upotrebom fosforamiditnog derivata lipida kuplovanog sa polinukleotidima tokom elongacije lanca. Ovaj pristup daje fosforamidatnu (npr., tiofosforamidatnu) vezu koja povezuje lipid i polinukleotid (primer su propil-palmitoil i 2-hidroksi-propil-palmitoil jedinjenja). Još jedan drugačiji pristup uključuje reakciju slobodne 3’-amino grupe potpuno protektovanog polinukleotida vezanog za nosač sa pogodnim aldehidom lipida, za kojom sledi redukcija pomoću natrijum cijanoborohidrida, koja proizvodi aminsku vezu.
[0154] U cilju vezivanja za 5’ terminus, polinukleotid može da se sintetiše upotrebom modifikovanog čvrstog nosača koji sadrži lipid, nakon čega sledi sinteza polinukleotida u smeru 5’ ka 3’, kao što je opisano kod autora Pongracz & Gryaznov (1999). Primer modifikovanog nosača je obezbeđen u tekstu koji sledi. U slučaju kada je n=14, masna kiselina je palmitinska kiselina: reakcija 3-amino-1, 2-propandiola sa palmitoil hloridom praćena je dimetoksitritilacijom i sukcinilacijom obezbedile su intermedijer koji se koristi za kuplovanje sa čvrstim nosačem. U nekim slučajevima, R može da bude staklena pora kontrolisana alkil aminom dugog lanca. U nekim slučajevima, R je polimerni čvrsti nosač.
UPOTREBA
[0155] Postupci i kompozicije prema pronalasku, npr., kao što su opisani prethodno u tekstu, igraju ulogu u nizu različitih primena. Primene od interesa uključuju, ali nisu ograničene na: terapeutske primene, dijagnostičke primene, istraživačke primene i primene u skriningu, što je sa više detalja dato u pregledu koji sledi.
[0156] Predmetna jedinjenja nalaze primenu u nizu različitih terapeutskih aplikacija. U nekim primerima izvođenja, postupci za proizvodnju polinukleotida primenjuju se kako bi bili pripremljeni polinukleotidi koji obezbeđuju terapeutsku korist. Tipovi bolesti koje mogu da se leče upotrebom kompozicija prema predmetnom pronalasku su bezgranični. Na primer, kompozicije mogu da se koriste za lečenje niza genetskih bolesti. U nekim primerima izvođenja, predmetni postupci i kompozicije imaju antisens primene. U nekim primerima izvođenja, predmetni postupci i kompozicije imaju antigene primene. U nekim primerima izvođenja, predmetni postupci i kompozicije imaju primene u inhibiciji telomeraze, kao što su primene prikazane u SAD patentu 6,835,826, i SAD objavi patent 20120329858.
[0157] Predmetni prikaz obezbeđuje jedinjenja koja mogu specifično i potentno da inhibiraju telomeraznu aktivnost i koja stoga mogu da se koriste da inhibiraju proliferaciju ćelija pozitivnih za telomerazu, kao što su tumorske ćelije. Za veoma veliki niz različitih ćelija kancera pokazano je da su pozitivne za telomerazu, uključujući ćelija iz kancera kože, vezivnog tkiva, masnog tkiva, tumora dojke, pluća, želuca, pankreasa, jajnika, grlića materice, bubrega, bešike, kolona, prostate, centralnog nervnog sistema(CNS), retine i krvi (kao što su mijelom, leukemija i limfom). Kanceri od interesa uključuju, ali nisu ograničeni na, mijelofibrozu, trombocitemiju, mijelodisplastični sindrom i mijelogenu leukemiju.
[0158] Predmetna jedinjenja mogu da se koriste za lečenje hematoloških maligniteta i mijeloproliferativnih poremećaja, uključujući, ali ne i ograničeno na, esencijalnu trombocitemiju (ET), policitemiju vera (PV), hroničnu mijelogenu leukemiju (CML), mijelofibrozu (MF), hroničnu neutrofilnu leukemiju, hroničnu eozinofilnu leukemiju i akutnu mijelogenu leukemiju (AML). Predmetna jedinjenja mogu da se koriste za lečenje mijelodisplastičnih sindroma, koji uključuju bolesti kao što je refraktorna anemija, refraktorna anemija sa viškom blast ćelija, refraktorna citopenija sa displazijom više ćelijskih linija, refraktorna citopenija sa displazijom jedne ćelijske linije i hronična mijelomonocitna leukemija (CMML). Predmetna jedinjenja mogu da se koriste za lečenje hematoloških bolesti, kao što su bolesti opisane u WO 2014/088785.
[0159] U skladu sa tim, ovde obezbeđena jedinjenja široko su korisna u lečenju niza maligniteta. U nekim slučajevima, predmetna jedinjenja mogu efikasno da obezbede lečenje koje u velikoj meri pravi razliku između malignih i normalnih ćelija, čime se izbegavaju brojni štetni sporedni efekti koji su prisutni kod većine trenutno zastupljenih hemioterapijskih režima koji se oslanjaju na agense koji bez razlike ubijaju sve ćelije koje se dele. Osim toga u nekim slučajevima, predmetna jedinjenja modifikovana lipidima su potentnija nego ekvivalentni nekonjugovani oligonukleotidi, što znači da mogu da se primenjuju u nižim dozama, obezbeđujući poboljšanu bezbednost i značajna sniženja cene lečenja. Inhibitori telomeraze mogu da se koriste u kombinaciji sa drugim pristupima lečenju kancera, uključujući hirurško uklanjanje primarnih tumora, hemioterapijske agense i lečenje zračenjem. Otuda se pronalazak odnosi na ovde obezbeđena jedinjenja i kompozicije, za upotrebu kao medikamenata. Pronalazak se takođe odnosi na ovde obezbeđena jedinjenja i kompozicije za upotrebu u lečenju i prevenciji bilo kojih maligniteta koji su pomenuti prethodno u tekstu.
[0160] Predmetna jedinjenja i postupci nalaze primenu u nizu dijagnostičkih aplikacija, uključujući, ali ne ograničeno na, razvoj kliničke dijagnostike, npr., in vitro dijagnostike ili sredstava za in vivo vizuelizaciju tumora. Ove primene su korisne prilikom postavljanja ili potvrđivanja dijagnoze stanja bolesti ili predispozicije za nju. Postupci su takođe korisni za praćenje progresije bolesti i/ili odgovora na lečenje kod pacijenata kod kojih je bolest prethodno dijagnostifikovana.
PRIMERI
Primer 1: Sažetak
[0161] Ovi primeri opisuju eksperimente koji za cilj imaju pripremu različitih dvovalentnih ili trovalentnih oblika Imetelstat inhibitora, kao što su Ca, Ba, Mg, Al, Fe, Cu i Zn, od oblika natrijumove soli Imetelstat inhibitora. U ovim eksperimentima, ocenjivano je poboljšanja stepena čistoće upotrebom postupaka pripreme koji uključuju obrazovanje i izolaciju soli bidentatnih ili tridentatnih katjona koji mogu da se vežu sa jednom, dve ili tri fosfatne grupe Imetelstat inhibitora. Takođe je ispitivana solubilnost i osmolalnost dobijenih oblika soli.
[0162] Priprema soli Imetelstat kalcijuma, Imetelstat barijuma, Imetelstat magnezijuma, Imetelstat aluminijuma, Fe (II ili III) Imetelstata i Imetelstat bakra ispitivana je upotrebom CaCl3, MgCl3, BaCl3, CuCl3, ZnCl3, AlCl3, FeCl3i FeCl3.
[0163] Ispitivana su tri postupka za izmenu soli: upotreba jake smole za izmenu katjona (FINEX MFG 210), precipitacija i jednostavno rastvaranje. Kada je rastvor Imetelstat natrijuma propušten kroz smolu izmenjenu sa CaCl3, BaCl3ili MgCl3, rastvori eluata su sadržali fini prah, ukazujući na to da se kontra joni natrijuma uspešno odvojeni sa kičme Imetelstata i zamenjeni kontra jonima kalcijuma, barijuma ili magnezijuma. U slučaju drugih pet reagenasa (CuCl3, ZnCl3, AlCl3, FeCl3, FeCl3) koji su ekvilibrisani sa smolom za izmenu katjona, prilikom propuštanja rastvora Imetelstata, došlo je do agregacije gornjeg dela smole u koloni, što je takođe ukazalo na to da su kontra joni natrijuma uspešno odvojeni sa kičme Imetelstata i zamenjeni.
[0164] Postupci taloženja i rastvaranja su takođe testirani upotrebom reagenasa soli u višku. Kada je reagens soli u velikom višku (npr. 900 ekvivalenata) tretiran Imetelstat natrijumom, obrazovao se precipitat. Precipitati su izolovani filtracijom. Naknadni testovi ukazuju da je sedam do pedeset ekvivalenata reagensa bilo neophodno da se sav Imetelstat prevede u precipitat.
[0165] Pet ekvivalenata svake od tri neorganske soli (Mg, Ba ili Ca) tretirano je ili oblikom soli Imetelstat TEA (trietilamonijum) ili oblikom soli Imetelstat Na. Potvrđeno je da ne dolazi do taloženja i rastvori su isoljeni i osušeni zamrzavanjem. Analiza osušenog i zamrznutog praha pomoću instrumenta Flame AA (atomska apsorpcija) pokazala je da je izmenjen deo kontra jona natrijuma sa Imetelstata.
[0166] Izveden je i dodatni eksperiment sa MgCl3u kome je korišćeno jedan do devet ekvivalenata magnezijumskog katjona prema obliku Imetelstata. Kontra joni natrijuma delimično su izmenjeni sa Mg kontra jonima pri čemu je do izmene u najvećem obimu dolazilo sa devet ekvivalenata MgCl3, pri čemu su dobijene kompozicije pokazivale 1.2 % po težini Na i 1.1% po težini Mg.
Primer 2: Materijali i oprema
[0167] Neorganski reagensi, organski rastvarači i drugi materijali koji su korišćeni u studiji navedeni su u Tabeli 1. U studiji je korišćen Imetelstat Natrijum (CAS #1007380-31-5), lot broj G163/L-G-13002, koga je obezbedila kompanija Geron. Imetelstat amonijum je sirova kompozicija dobijena odvajanjem Imetelstat inhibitora od nosača za sintezu na čvrstoj fazi upotrebom amonijaka i etanola (npr., kao što je opisano u publikaciji Gryaznov et al. in US 20120329858) i dobijena je iz zaliha proizvođača. Imetelstat TEA (trietilamonijum oblik) je kompozicija dobijena iz eluata HPLC prečišćavanja na koloni gde se koristila mobilna faza sa trietilamonijum acetatom (TEAA) (npr., kao što su opisali Gryaznov et al. u US 20120329858) i dobijen je iz zaliha proizvođača koje su nastale u različitim studijama sa ciljem razvoja procesa. Ultrafiltracija je izvedena pomoću instrumenta Stirred Ultrafiltration Cell (Amicon 8400, Millipore) sa 1KD PES membranama. Liofilizacija je sprovedena upotrebom Speed Vacuum koncentratora (ScanSpeed 40, LaboGene).
Primer 3: Postupak
Izmena pomoću kolone sa jonoizmenjivačkom smolom
[0168] Kolona sa jakom smolom za izmenu katjona, FINEX MFG 210, pripremljena je sa zapreminom od 200 mL (4.6 cm x 12 cm) i smola je isprana pomoću 1M NaOH i vode. Kolona je zatim ekvilibrisana sa 1M rastvorom svake soli od interesa. U ovim eksperimentima ukupno je pripremljeno i korišćeno osam 1M rastvora (CaCl3, MgCl3, BaCl3, CuCl3, ZnCl3, AlCl3, FeCl3i FeCl3).50 mL rastvora Imetelstat natrijuma pri 100 mg/mL dodato je u kolonu.
[0169] U slučaju kolona ekvilibrisanih pomoću CuCl3, ZnCl3, AlCl3, FeCl3i FeCl3, kada je Imetelstat natrijum nanošen na kolonu, uočavana je agregacija Imetelstata na smoli u gornjem kraju kolone.
[0170] U tri kolone ekvilibrisane pomoću CaCl3, MgCl3i BaCl3, rastvori soli nisu doveli do bilo kakve agregacije Imetelstata na koloni i Imetelstat je izdvojen iz eluata sa kolone, što se uočavalo u vidu zamućenih rastvora. Iz ovih eluata su centrifugiranjem (4000 rpm, 20 min) izdvojeni fini prahovi. Nakon centrifugiranja je HPLC analizom potvrđeno da supernatant nije sadržao Imetelstat. Ovo pokazuje da je taloženje i razdvajanje kalcijumovih, magnezijumovih i barijumovih soli Imetelstata uspešno postignuto.
Taloženjem
[0171] Kristalizacija ili taloženje dvovalentnih ili trovalentnih oblika Imetelstata ispitivano je upotrebom neorganskih soli od interesa u velikom višku (900 ekvivalenata težine baze).
Pripremljeni su 1M rastvori soli CaCl3, MgCl3, BaCl3, CuCl3, ZnCl3, AlCl3, FeCl3i FeCl3. Sa svakim rastvorom soli pomešana su tri tipa rastvora Imetelstata: sirovi rastvor Imetelstata (amonijum so), prečišćeni Imetelstat (oblik trietilamonijum (TEA) soli) i Imetelstat natrijum (oblik Na soli).
[0172] Svi mešani rastvori su pokazali precipitate Imetelstata koji su lako izolovani filtracijom pomoću Advantec 2 filter papira. Ovaj rezultat pokazuje da je taloženje i razdvajanje multivalentnih soli Imetelstata uspešno postignuto.
[0173] Solubilnosti precipitata izolovanih u uslovima velikog viška reagensa soli inicijalno su ispitivane upotrebom sledećih rastvarača: voda, acetonitril, MeOH, EtOH, IPA (izopropil alkohol), 0.1 M NaOH, 0.1 M HCl, 1M NaCl i NMP.
[0174] Za soli koje su istaložile pri velikom višku rastvora soli, Imetelstat soli kalcijuma, barijuma i magnezijuma bile su solubilne u rastvorima 0.1 M NaOH i 1 M NaCl. (videti Tabelu 2). Studije solubilnosti precipitata Imetelstata koji je dobijen iz velikog viška reagensa magnezijumove soli, sprovedene su u 1M NaCl rastvorima različitih koncentracija (2 mg/mL do 6 mg/mL) i u uslovima različitih pH vrednosti (pH 8, 9, 10, 11, 12) i analizirane pomoću HPLC (videti hromatograme sa Slike 1). Uočeno je da je precipitat Imetelstata solubilan pri 6 mg/mL i pH 11 do pH 12. Jedinjenje je takođe pokazalo stabilnost na vrednostima pH do 12, bez ikakvih precipitata (Slika 1).
Rastvaranjem
30 do 50 ekvivalenata reagensa soli
[0175] Broj ekvivalenata reagenasa soli od interesa kojima je bilo moguće postići potpuno taloženje Imetelstata, ispitivan je dodavanjem reagensa soli korak po korak. Potpuno obrazovanje precipitata uočeno je pri opsegu od 7 do 50 ekvivalenata dodatog reagensa soli za osam soli navedenih u Tabeli 3. Pri dodavanju većeg broja ekvivalenata reagenasa soli, za sve soli je uočen trend ka obrazovanju gela uz taloženje.
[0176] Korišćena su tri tipa rastvora Imetelstata: sirovi Imetelstat amonijum (sirovi oblik), Imetelstat trietilamonijum (prečišćen oblik TEA soli) i Imetelstat natrijum (oblik Na soli), koji su pomešani sa svakim rastvorom soli. Imetelstat amonijumska so je korišćena ili u vidu rastvora NH4OH ili rastvora u vodi. Za rastvore Imetelstat amonijuma i Imetelstat TEA bilo je neophodno približno 50 ekvivalenata ili 30 ekvivalenata reagensa Mg soli, redom, kako bi se postiglo potpuno taloženje.
[0177] Solubilnost precipitata obrazovanih od Imetelstat TEA rastvora i Imetelstat amonijumskog rastvora ispitivana je u uslovima različitih pH vrednosti od pH 8 do pH 12. Nakon što su mešani rastvori stajali 6 sati na RT, solubilnost Imetelstat-Mg precipitata je analizirana pomoću UV apsorbancije na 260 nm. Oba precipitata, dobijena od Imetelstat amonijuma i Imetelstat TEA pokazala su sličan trend u tom smislu što se Imetelstat so rastvara u 1M rastvoru NaCl pri visokim pH vrednostima (videti Tabelu 3).
[0178] Ovaj rezultat ukazuje na to da kada se broj ekvivalenata reagensa soli od interesa u odnosu na Imetelstat kontroliše, potpuno taloženje Imetelstat soli može da se postigne pomoću bilo kog pogodnog postupka kako bi se dobio precipitat koji može uspešno da se ponovo rastvori.
5 ekvivalenata reagensa soli
[0179] Rastvor Imetelstat Natrijuma (100 mg u 1mL vode) pomešan je sa 5 ekvivalenata osam reagenasa soli i svaki rastvor je isoljen putem ultrafiltracije koristeći ćeliju za ultrafiltraciju sa mešanjem i 1KD membrane. Ultrafiltrirani rastvor je zatim liofiliziran. Sadržaj Na i svakog metalnog kontra jona od interesa u dobijenom prahu je analiziran instrumentom Flame AA (atomska apsorpciona spektroskopija). Kao što je prikazano na Slici 2 i 3, najviši sadržaj metalnog kontra jona iznosio je 1.1% , po težini za Zn, Al i Mg, sa sadržajima Na od 2.6%, 1.7% i 2.6%, redom.
6 do 9 ekvivalenata reagensa soli
[0180] 6 do 9 ekvivalenata reagensa magnezijumove soli je dodato u rastvor Imetelstat Natrijuma i naknadna ultrafiltracija i liofilizacija su obezbedile proizvod u čvrstom obliku koji je bio potpuno solubilan u vodi. Izvedena je analiza sadržaja natrijuma i magnezijuma (videti rezultate na Slici 3). Dodavanje deve ekvivalenata MgCl3u rastvor Imetelstat Natrijuma, daje kompoziciju u kojoj sadržaj Na i Mg kontra jona iznosi 1.1% i 1.2% , po težini, redom.
1 do 10 ekvivalenata reagensa soli
[0181] Kako bi se ispitala izmena Mg jona TEA kontra jonima u Imetelstat TEA soli u poređenju sa Imetelstat natrijumovom solju, dizajnirana je i izvedena druga grupa eksperimenata. Jedan do deset ekvivalenata MgCl3u vodenim rastvorima pomešano je sa rastvorom Imetelstat TEA soli (čistoća > 90%, određena pomoću HPLC). Analiza sadržaja Mg kontra jona izvedena je nakon ultrafiltracije i liofilizacije. Rezultati su prikazani na Slici 4. Dodavanje najviše do 10 ekvivalenata MgCl3reagensa dalo je kompoziciju sa 1.6 % Mg , po težini.
Primer 4: Zaključak
[0182] Priprema Imetelstata u obliku dvovalentnih i trovalentnih soli je postignuta, uključujući soli kalcijuma, magnezijuma, cinka, aluminijuma, barijuma, gvožđa (II), gvožđa (III) i bakra. Kada su korišćeni izabrani reagensi neorganskih soli u kontrolisanom višku (videti Tabele 2i 3) kako bi se polinukleotid istaložio, obrazovali su se precipitati koji su zatim mogli da se ponovo rastvore, i koji su pokazali poboljšanu čistoću kada su u pitanju nečistoće koje se brzo eluiraju upotrebom HPLC analize.
[0183] Upotreba reagensa magnezijumove soli dala je, nakon koraka izmene, solubilan čvrsti precipitat Imetelstata. Dobijeni su precipitati kod kojih je postignuta količina od 1.2 % po težini kontra jona magnezijuma u odnosu na 1.1 % po težini kontra jona natrijuma.
[0184] Taloženje Imetelstat inhibitora upotrebom dvovalentnih ili trovalentnih soli omogućava uklanjanje proizvoda i reagenasa iz sinteze koji nisu cilj sinteze, a koji zaostaju u rastvoru. Uklanjanje ovih nečistoća prisutnih u sirovim Imetelstat rastvorima, obezbeđuje nekoliko prednosti za naknadne korake hromatografskog prečišćavanja Imetelstata, kao što je smanjeno nanošenje na kolonu, poboljšano razdvajanje, smanjen broj koraka hromatografskog prečišćavanja i poboljšana dužina trajanja hromatografskih kolona, sniženi troškovi prečišćavanje i brža prečišćavanja.
Tabela 1. neorganske soli, organski rastvarači i drugi materijali
Tabela 3

Claims (28)

  1. Patentni zahtevi 1. Postupak za pripremu polinukleotida, pri čemu postupak sadrži: a) dovođenje u kontakt prve polinukleotidne kompozicije sa multivalentnom katjonskom solju kako bi se istaložila prva polinukleotidna so; b) razdvajanje prve polinukleotidne soli od prve polinukleotidne kompozicije dovedene u kontakt, kako bi se dobila druga polinukleotidna kompozicija koja sadrži prvu polinukleotidnu so; gde prva polinukleotidna kompozicija sadrži: (i) polinukleotid koji ima sekvencu od 7 ili više nukleozidnih subjedinica i najmanje dve od nukleozidnih subjedinica su povezane N3’→P5’ tiofosforamidatnom vezom između subjedinica; i (ii) solubilne proizvode i reagense sinteze koji nisu cilj sinteze c) dovođenje u kontakt druge polinukleotidne kompozicije iz koraka (b) sa nosačem za reverzno-faznu hromatografiju; i d) eluciju sa nosača za reverzno-faznu hromatografiju treće polinukleotidne kompozicije koja sadrži drugu solubilnu polinukleotidnu so.
  2. 2. Postupak prema patentnom zahtevu 1, naznačen time što su sve nukleozidne subjedinice povezane vezama između subjedinica, nezavisno izabranim od N3’→-P5’ tiofosforamidatne veze između subjedinica i N3’→-P5’ fosforamidatne veze između subjedinica.
  3. 3. Postupak prema patentnom zahtevu 1 ili 2, naznačen time što je polinukleotid opisan Formulom (I):
    pri čemu: svako B je nezavisno purin, protektovani purin, pirimidin ili protektovani pirimidin, ili njihov analog; svako X je nezavisno kiseonik ili sumpor; svako R3 je nezavisno vodonik, fluoro, hidroksil, alkoksi, supstituisani alkoksi ili protektovani hidroksil; R6 je amino, hidroksil, protektovani amino, protektovani hidroksi, -O-T-Z ili -NH-T-Z; svako T je nezavisno opcioni linker; svako Z je nezavisno H, lipid, nosač, oligonukleotid, polimer, polipeptid, marker koji može da se detektuje ili grupa za obeležavanje; i n je ceo broj od 7 do 100.
  4. 4. Postupak prema bilo kom od patentnih zahteva 1-3, naznačen time što: polinukleotid sadrži sekvencu koja sadrži 13 ili više nukleozidnih subjedinica koje su komplementarne sa RNK komponentom humane telomeraze, ili polinukleotid sadrži između 10 i 50 nukleozidnih subjedinica u neprekinutom nizu koje su komplementarne sa RNK komponentom humane telomeraze.
  5. 5. Postupak prema bilo kom od patentnih zahteva 1-4, naznačen time što su sve nukleozidne subjedinice povezane N3’→P5’ tiofosforamidatnom vezom između subjedinica.
  6. 6. Postupak prema bilo kom od patentnih zahteva 1-5, naznačen time što polinukleotid sadrži sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od: GTTAGGGTTAG (SEQ ID NO:4), TAGGGTTAGACAA (SEQ ID NO:3) i CAGTTAGGGTTAG (SEQ ID NO:5).
  7. 7. Postupak prema bilo kom od patentnih zahteva 1-6, naznačen time što je polinukleotid konjugovan sa lipidnom komponentom preko opcionog linkera.
  8. 8. Postupak prema bilo kom od patentnih zahteva 1-7, naznačen time što druga polinukleotidna so ima strukturu:
    pri čemu je svako M<x+>nezavisno vodonik ili katjonski kontra jon, svako x je nezavisno 1, 2 ili 3 i n je ceo broj od 5 do 13.
  9. 9. Postupak prema bilo kom od patentnih zahteva 1-8, naznačen time što nakon koraka elucije d) druga polinukleotidna so predstavlja farmaceutski prihvatljivu so polinukleotida.
  10. 10. Postupak prema bilo kom od patentnih zahteva 1-9, naznačen time što nakon koraka elucije d), druga polinukleotidna so predstavlja monovalentnu katjonsku so polinukleotida, poželjno natrijumovu so polinukleotida.
  11. 11. Postupak prema bilo kom od patentnih zahteva 1-10, koji dodatno sadrži, pre koraka dovođenja u kontakt a), odvajanje polinukleotida sa nosača čvrste faze, kako bi se dobila prva polinukleotidna kompozicija u vidu sirove sintetičke preparacije polinukleotida.
  12. 12. Postupak prema bilo kom od patentnih zahteva 1-11, naznačen time što pre koraka dovođenja u kontakt a) prva polinukleotidna kompozicija sadrži monovalentnu katjonsku so polinukleotida.
  13. 13. Postupak prema bilo kom od patentnih zahteva 1-12, naznačen time što korak dovođenja u kontakt a) sadrži nanošenje i eluciju prve polinukleotidne kompozicije sa katjonskog izmenjivačkog nosača.
  14. 14. Postupak prema bilo kom od patentnih zahteva 1-13, naznačen time što korak razdvajanja b) sadrži centrifugiranje prve polinukleotidne kompozicije dovedene u kontakt, kako bi se oborio precipitat prve polinukleotidne soli, ili filtraciju prve polinukleotidne soli iz prve polinukleotidne kompozicije dovedene u kontakt.
  15. 15. Postupak prema bilo kom od patentnih zahteva 1-13, naznačen time što se druga polinukleotidna kompozicija iz koraka b) nanosi direktno na nosač za reverzno-faznu hromatografiju.
  16. 16. Postupak prema bilo kom od patentnih zahteva 1-15, koji dodatno sadrži, pre koraka dovođenja u kontakt c), rastvaranje druge polinukleotidne kompozicije u rastvaraču.
  17. 17. Postupak prema bilo kom od patentnih zahteva 1-16, naznačen time što: najmanje jedan multivalentni katjonski kontra jon je dvovalentan, poželjno odabran iz grupe koja se sastoji od magnezijuma, cinka i kalcijuma; ili najmanje jedan multivalentni katjonski kontra jon je trovalentan, poželjno aluminijum.
  18. 18. Postupak prema bilo kom od patentnih zahteva 1-17, naznačen time što prva polinukleotidna so dodatno sadrži monovalentni katjonski kontra jon.
  19. 19. Kompozicija koja sadrži: precipitat soli polinukleotida, koji sadrži najmanje jedan multivalentni katjonski kontra jon; pri čemu polinukleotid ima sekvencu od 7 ili više nukleozidnih subjedinica komplementarnih sa RNK komponentom humane telomeraze i najmanje dve od nukleozidnih subjedinica su povezane N3’→P5’ tiofosforamidnom vezom između subjedinica.
  20. 20. Kompozicija prema patentnom zahtevu 19, naznačena time što: najmanje jedan multivalentni katjonski kontra jon je dvovalentan, poželjno odabran iz grupe koja se sastoji od magnezijuma, cinka i kalcijuma, poželjnije magnezijum; ili najmanje jedan multivalentni katjonski kontra jon je trovalentan, poželjno aluminijum.
  21. 21. Kompozicija prema bilo kom od patentnih zahteva 19-20, naznačena time što polinukleotidna so sadrži 3 molska % ili više multivalentnog katjonskog kontra jona ili sadrži 1.0 %, po težini, ili više, multivalentnog katjonskog kontra jona.
  22. 22. Kompozicija prema bilo kom od patentnih zahteva 19-21, naznačena time što kompozicija predstavlja precipitat.
  23. 23. Kompozicija prema bilo kom od patentnih zahteva 19-22, naznačena time što je polinukleotid opisan Formulom (I):
    pri čemu: svako B je nezavisno purin, protektovani purin, pirimidin ili protektovani pirimidin, ili njihov analog; svako X je nezavisno kiseonik ili sumpor; svako R3 je nezavisno vodonik, fluoro, hidroksil, alkoksi, supstituisani alkoksi ili protektovani hidroksil; R6 je amino, hidroksil, protektovani amino, protektovani hidroksi, -O-T-Z ili -NH-T-Z; svako T je nezavisno opcioni linker; svako Z je nezavisno H, lipid, nosač, oligonukleotid, polimer, polipeptid, marker koji može da se detektuje ili grupa za obeležavanje; i n je ceo broj od 7 do 100.
  24. 24. Kompozicija prema bilo kom od patentnih zahteva 19-23, naznačena time što: polinukleotid sadrži sekvencu koja sadrži 13 ili više nukleozidnih subjedinica koje su komplementarne sa RNK komponentom humane telomeraze, ili polinukleotid sadrži između 10 i 50 nukleozidnih subjedinica u neprekinutom nizu koje su komplementarne sa RNK komponentom humane telomeraze.
  25. 25. Kompozicija prema bilo kom od patentnih zahteva 19-24, naznačena time što su sve nukleozidne subjedinice povezane N3’→P5’ tiofosforamidnom vezom između subjedinica.
  26. 26. Kompozicija prema bilo kom od patentnih zahteva 19-25, naznačena time što polinukleotid sadrži sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od: GTTAGGGTTAG (SEQ ID NO:4), TAGGGTTAGACAA (SEQ ID NO:3) i CAGTTAGGGTTAG (SEQ ID NO:5).
  27. 27. Kompozicija prema bilo kom od patentnih zahteva 19-26, naznačena time što je 5’ ili 3’ terminus polinukleotida konjugovan sa lipidnom komponentom preko opcionog linkera.
  28. 28. Kompozicija prema bilo kom od patentnih zahteva 19-27, naznačena time što polinukleotid ima strukturu: Ċ
    pri čemu je svako M<x+>nezavisno katjonski kontra jon, svako x je 1, 2 ili 3 i n je 5 do 12.
RS20200935A 2015-04-23 2016-04-21 Postupci za pripremu polinukleotida upotrebom kompozicija multivalentne katjonske soli RS60645B1 (sr)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201562151891P 2015-04-23 2015-04-23
PCT/US2016/028657 WO2016172346A1 (en) 2015-04-23 2016-04-21 Methods of polynucleotide preparation using multivalent cation salt compositions
EP16720636.6A EP3286203B1 (en) 2015-04-23 2016-04-21 Methods of polynucleotide preparation using multivalent cation salt compositions

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS60645B1 true RS60645B1 (sr) 2020-09-30

Family

ID=55911083

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20200935A RS60645B1 (sr) 2015-04-23 2016-04-21 Postupci za pripremu polinukleotida upotrebom kompozicija multivalentne katjonske soli

Country Status (36)

Country Link
US (2) US10745687B2 (sr)
EP (1) EP3286203B1 (sr)
JP (4) JP2018513127A (sr)
KR (1) KR102401252B1 (sr)
CN (2) CN113564168B (sr)
AU (2) AU2016250576C1 (sr)
BR (1) BR112017019627B1 (sr)
CA (1) CA2978191C (sr)
CL (1) CL2017002314A1 (sr)
CO (1) CO2017009217A2 (sr)
CY (1) CY1123197T1 (sr)
DK (1) DK3286203T3 (sr)
EA (1) EA035885B1 (sr)
ES (1) ES2798270T3 (sr)
HR (1) HRP20201218T1 (sr)
HU (1) HUE051148T2 (sr)
IL (1) IL254222A0 (sr)
LT (1) LT3286203T (sr)
MA (2) MA42569B1 (sr)
MD (1) MD3286203T2 (sr)
ME (1) ME03811B (sr)
MX (1) MX383293B (sr)
MY (1) MY187804A (sr)
PE (2) PE20171785A1 (sr)
PH (1) PH12017501927B1 (sr)
PT (1) PT3286203T (sr)
RS (1) RS60645B1 (sr)
SA (1) SA517390103B1 (sr)
SG (2) SG10201909816PA (sr)
SI (1) SI3286203T1 (sr)
SM (1) SMT202000389T1 (sr)
TN (1) TN2017000411A1 (sr)
TW (1) TWI736532B (sr)
UA (1) UA124521C2 (sr)
WO (1) WO2016172346A1 (sr)
ZA (1) ZA201706041B (sr)

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102401252B1 (ko) 2015-04-23 2022-05-24 제론 코포레이션 다가 양이온 염 조성물을 사용한 폴리뉴클레오티드 제조의 방법
EP3555289A1 (en) 2016-12-13 2019-10-23 ModernaTX, Inc. Rna affinity purification
JP7048617B2 (ja) 2016-12-19 2022-04-05 ヴェンタナ メディカル システムズ， インク． ペプチド核酸コンジュゲート
MA49914A (fr) * 2017-08-18 2021-04-21 Modernatx Inc Procédés analytiques par hplc
EP3684933A4 (en) * 2017-09-22 2021-06-23 The Regents of the University of Colorado, A Body Corporate THIOMORPHOLINO-OLIGONUCLEOTIDES, FOR TREATMENT OF MUSCULAR DYSTROPHY
EP3727470B1 (en) * 2017-12-18 2024-11-20 Ventana Medical Systems, Inc. Peptide nucleic acid conjugates

Family Cites Families (35)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4046720A (en) 1974-01-17 1977-09-06 California Institute Of Technology Crosslinked, porous, polyacrylate beads
US4678814A (en) 1981-03-30 1987-07-07 California Institute Of Technology Polyacrolein microspheres
US4413070A (en) 1981-03-30 1983-11-01 California Institute Of Technology Polyacrolein microspheres
US5185444A (en) 1985-03-15 1993-02-09 Anti-Gene Deveopment Group Uncharged morpolino-based polymers having phosphorous containing chiral intersubunit linkages
US4659774A (en) 1985-11-01 1987-04-21 American Hoechst Corporation Support for solid-phase oligonucleotide synthesis
EP0801082B1 (en) 1990-08-31 2003-04-09 Regents Of The University Of Minnesota Method for making graft resins for solid-phase peptide synthesis
US5281701A (en) 1991-07-12 1994-01-25 Applied Biosystems, Inc. Process and compounds for RNA synthesis
US5476925A (en) 1993-02-01 1995-12-19 Northwestern University Oligodeoxyribonucleotides including 3'-aminonucleoside-phosphoramidate linkages and terminal 3'-amino groups
US5599922A (en) 1994-03-18 1997-02-04 Lynx Therapeutics, Inc. Oligonucleotide N3'-P5' phosphoramidates: hybridization and nuclease resistance properties
JP3482209B2 (ja) 1994-03-18 2003-12-22 ジェロン・コーポレーション オリゴヌクレオチドｎ３’→ｐ５’ホスホルアミデート：合成および化合物；ハイブリダイゼーションおよびヌクレアーゼ耐性特性
US5726297A (en) 1994-03-18 1998-03-10 Lynx Therapeutics, Inc. Oligodeoxyribonucleotide N3' P5' phosphoramidates
US5859233A (en) 1996-02-21 1999-01-12 Lynx Therapeutics, Inc. Synthons for synthesis of oligonucleotide N3-P5 phosphoramidates
US5684143A (en) 1996-02-21 1997-11-04 Lynx Therapeutics, Inc. Oligo-2'-fluoronucleotide N3'->P5' phosphoramidates
JP2001507229A (ja) 1996-12-20 2001-06-05 ジェロン コーポレイション テロメラーゼのｒｎａ成分を検出および阻害するための方法
US5998604A (en) 1997-09-15 1999-12-07 The Perkin-Elmer Corporation Polynucleotide purification method
US6114519A (en) 1997-10-15 2000-09-05 Isis Pharmaceuticals, Inc. Synthesis of sulfurized oligonucleotides
US6465628B1 (en) 1999-02-04 2002-10-15 Isis Pharmaceuticals, Inc. Process for the synthesis of oligomeric compounds
DK1210357T3 (da) 1999-09-10 2008-07-21 Geron Corp Oligonukleotid-N3' -P5' -thiophosphoramidater: syntese og anvendelse deraf
JP2002060341A (ja) 2000-08-21 2002-02-26 Terumo Corp 止血剤
WO2002077184A2 (en) 2001-03-23 2002-10-03 Geron Corporation Oligonucleotide conjugates
US7563618B2 (en) 2001-03-23 2009-07-21 Geron Corporation Oligonucleotide conjugates
US20120329858A1 (en) 2010-08-04 2012-12-27 Geron Corporation Modified oligonucleotides for telomerase inhibition
KR101298493B1 (ko) 2003-09-09 2013-08-21 제론 코포레이션 텔로머라제 억제를 위한 변형 올리고뉴클레오티드
EP1783216A1 (en) 2004-05-28 2007-05-09 Sankyo Company, Limited Telomerase-inhibitory ena oligonucleotide
ME02933B (me) 2004-07-02 2018-04-20 Geron Corp Sinteza zaštićenih 3'-amino nukleozionih monomera
EP2458011B1 (en) * 2005-10-03 2013-07-24 Life Technologies Corporation Compositions, methods, and kits for amplifying nucleic acids
CA2666607C (en) * 2006-11-01 2015-02-10 Biogen Idec Ma Inc. Method of isolating biomacromolecules using low ph and divalent cations
SG187165A1 (en) * 2010-08-20 2013-02-28 Replicor Inc Oligonucleotide chelate complexes
US9106103B2 (en) 2011-09-23 2015-08-11 Eaton Corporation Unintteruptible power supply systems and methods employing on-demand energy storage
US9006630B2 (en) 2012-01-13 2015-04-14 Altasens, Inc. Quality of optically black reference pixels in CMOS iSoCs
AR091065A1 (es) 2012-05-18 2014-12-30 Replicor Inc Una formulacion farmaceutica que comprende un quelato de oligonucleotidos antiviral para el tratamiento de una infeccion antiviral
EP2861757B1 (en) * 2012-06-14 2019-11-06 Life Technologies Corporation Novel compositions, methods and kits for polymerase chain reaction (pcr)
HRP20240624T1 (hr) * 2012-12-07 2024-08-02 Geron Corporation Inhibitor telomeraze imetelstat za liječenje mijeloproliferativnih poremećaja i mijeloproliferativne neoplazme
JOP20200257A1 (ar) * 2014-05-01 2017-06-16 Geron Corp تركيبات أوليجو نوكليوتيد وطرق لتحضيرها
KR102401252B1 (ko) 2015-04-23 2022-05-24 제론 코포레이션 다가 양이온 염 조성물을 사용한 폴리뉴클레오티드 제조의 방법

Also Published As

Publication number Publication date
AU2021202803A1 (en) 2021-06-03
JP2018513127A (ja) 2018-05-24
CN107429247B (zh) 2021-08-13
BR112017019627A2 (pt) 2018-05-15
EP3286203B1 (en) 2020-05-06
MX383293B (es) 2025-03-13
NZ735042A (en) 2021-11-26
TW201706284A (zh) 2017-02-16
AU2016250576B2 (en) 2021-02-04
WO2016172346A1 (en) 2016-10-27
ZA201706041B (en) 2020-11-25
SI3286203T1 (sl) 2020-10-30
CA2978191A1 (en) 2016-10-27
TWI736532B (zh) 2021-08-21
LT3286203T (lt) 2020-07-27
PH12017501927A1 (en) 2018-03-05
ES2798270T3 (es) 2020-12-10
CY1123197T1 (el) 2021-10-29
MX2017011642A (es) 2017-11-02
SMT202000389T1 (it) 2020-09-10
JP2022168017A (ja) 2022-11-04
AU2016250576A1 (en) 2017-09-21
JP2021152079A (ja) 2021-09-30
AU2016250576C1 (en) 2021-05-06
CN113564168B (zh) 2024-10-25
CL2017002314A1 (es) 2018-05-04
MY187804A (en) 2021-10-26
UA124521C2 (uk) 2021-10-05
HK1251234A1 (en) 2019-01-25
PE20221275A1 (es) 2022-09-01
CA2978191C (en) 2022-10-04
CN113564168A (zh) 2021-10-29
HRP20201218T1 (hr) 2020-12-11
MD3286203T2 (ro) 2020-08-31
PH12017501927B1 (en) 2022-09-02
KR102401252B1 (ko) 2022-05-24
CN107429247A (zh) 2017-12-01
JP2025061848A (ja) 2025-04-11
TN2017000411A1 (en) 2019-01-16
IL254222A0 (en) 2017-10-31
US20200339975A1 (en) 2020-10-29
HUE051148T2 (hu) 2021-03-01
SA517390103B1 (ar) 2021-07-14
MA42569B1 (fr) 2020-08-31
EA035885B1 (ru) 2020-08-27
US11441144B2 (en) 2022-09-13
PT3286203T (pt) 2020-07-08
SG11201707893RA (en) 2017-11-29
DK3286203T3 (da) 2020-06-02
EP3286203A1 (en) 2018-02-28
PE20171785A1 (es) 2017-12-27
SG10201909816PA (en) 2019-11-28
BR112017019627B1 (pt) 2022-11-29
MA42157A (fr) 2018-02-28
ME03811B (me) 2021-04-20
KR20170138399A (ko) 2017-12-15
EA201791753A1 (ru) 2018-04-30
CO2017009217A2 (es) 2018-02-20
US20160312227A1 (en) 2016-10-27
US10745687B2 (en) 2020-08-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11441144B2 (en) Methods of polynucleotide preparation using multivalent cation salt compositions
CN106459134B (zh) 寡核苷酸组合物及其制备方法
HK1251234B (en) Methods of polynucleotide preparation using multivalent cation salt compositions
HK1242377A1 (en) Methods of polynucleotide preparation using multivalent cation salt compositions
HK40102389A (zh) 寡核苷酸组合物及其制备方法
NZ735042B2 (en) Methods of polynucleotide preparation using multivalent cation salt compositions
OA18769A (en) Methods of polynucleotide preparation using multivalent cation salt compositions.