BR112017019627B1 - Método de preparação de polinucleotídeos e composição de sal de cátion multivalente - Google Patents

Método de preparação de polinucleotídeos e composição de sal de cátion multivalente Download PDF

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Abstract

Os aspectos da divulgação incluem métodos para a preparação de um polinucleotídeo. Em algumas modalidades, o método inclui fazer entrar em contato uma primeira composição polinucleotídica que inclui: um polinucleotídeo que possui uma sequência de 7 ou mais subunidades nucleosídicas e em que pelo menos duas das subunidades nucleosídicas são unidas por uma ligação inter-subunidade e tiofosforamidato N3'^P5'; e produtos e reagentes sintéticos não alvo; com um sal de cátion multivalente para precipitar um sal de polinucleotídeo incluindo pelo menos um contraíon de cátions multivalente; e separar o sal de polinucleotídeo da primeira composição polinucleotídica em contato para produzir uma segunda composição polinucleotídica que inclui o sal polinucleotídico. Em certas modalidades, o método inclui ainda a ligação do sal polinucleotídico com um suporte de cromatografia de fase reversa; e eluindo a partir da cromatografia suporta uma terceira composição polinucleotídica que inclui um polinucleotídico. Também são fornecidas composições que incluem um sal do polinucleotídeo que inclui pelo menos um contraíon de cátions multivalentes.

Description

REFERÊNCIA CRUZADA AO PEDIDO RELACIONADO
[0001] Nos termos de 35 U.S.C. §119(e), esse pedido reivindica prioridade da data de deposito do Pedido Provisório de n° de Série U.S. No. 62/151.891 depositado em 23 de abril de 2015, cuja divulgação é incorporada neste documento por referência.
INTRODUÇÃO
[0002] Química de polímeros de ácido nucleico tem desempenhado um papel em muitas tecnologias em desenvolvimento nos campos da farmacêutica, diagnóstico e analítico, e mais particularmente nos subcampos de terapias antisense e antigene, química combinatória, amplificação de sinal de DNA ramificado e diagnósticos de DNA baseados em arranjo e análise. Alguma desta química de polímeros tem sido dirigida para melhorar a força de ligação, especificidade e resistência à nuclease de polímeros de ácido nucleico naturais, tais como o DNA. Ligações de ácido nucleico de peptídeo (PNA), fosforotioato, metilfosfonato e fosforamidato intemucleosídeo são alguns exemplos de químicas de polímeros que foram aplicadas a polinucleotídeos para proporcionar uma ou mais propriedades desejáveis, tais como a resistência a nucleases, a incorporação celular e a solubilidade.
[0003] Fosforamidatos N3'^P5‘ de polinucleotídeo podem formar duplexes estáveis com fitas de DNA e RNA complementares, bem como triplexes estáveis com duplexes de DNA, e são resistentes a nucleases. Tio fosforamidatos N3'^P5‘ de polinucleotídeo têm encontrado utilização como agentes antisense potentes tanto in vitro como in vivo. Os compostos que contém polinucleotídeos que inibem a atividade da telomerase podem ser usados para tratar distúrbios mediados por telomerase, tais como câncer, uma vez que as células de câncer expressam atividade de telomerase e as células somáticas humanas normais não possuem atividade de telomerase a níveis biologicamente relevantes. Como tal, métodos para preparar e isolar tais polinucleotídeos são de interesse.
SUMÁRIO
[0004] Os aspectos da divulgação incluem métodos para a preparação de um polinucleotídeo. Em algumas modalidades, o método inclui o fazer entrar em contato uma primeira composição polinucleotídica que inclui: um polinucleotídeo que possui uma sequência de 7 ou mais subunidades nucleosídicas em que pelo menos duas das subunidades nucleosídicas são unidas por uma ligação inter-subunidade de N3 '^ P5' tiofosforamidato; e produtos e reagentes sintéticos não alvo; com um sal de cátion multivalente para precipitar um primeiro sal de polinucleotídeo incluindo pelo menos um contraíon de cátions multivalente; e separar o sal de polinucleotídico da primeira composição polinucleotídica em contato para produzir uma segunda composição polinucleotídica que inclui o primeiro sal polinucleotídico. Em certas modalidades, o método inclui ainda a ligação do primeiro sal polinucleotídico com um suporte de cromatografia de fase reversa; e eluindo a partir da cromatografia suporta uma terceira composição polinucleotídica que inclui um segundo sal polinucleotídico. Também são fornecidas composições que incluem um sal do polinucleotídeo que inclui pelo menos um contraíon de cátions multivalentes. Em algumas modalidades, o pelo menos um contraíon de cátions multivalentes é selecionado do grupo que consiste em magnésio, zinco, alumínio e cálcio.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
[0005] Aqueles versados na técnica compreenderão que os desenhos, descritos a seguir, são apenas para fins ilustrativos. As figuras não se destinam a limitar o escopo dos presentes ensinamento de maneira alguma.
[0006] A Figura 1 mostra cromatogramas de HPLC de Imetelstat-Mg em soluções de NaCl 1M a uma variedade de pH.
[0007] A Figura 2 representa os resultados de uma análise elementar de Imetelstat Sódio tratado com uma variedade de sais.
[0008] A Figura 3 representa os resultados de uma análise elementar de Imetelstat Sódio tratado com equivalentes crescentes de sal de cloreto de magnésio.
[0009] A Figura 4 representa os resultados de uma análise elementar de Imetelstat TEA tratada com equivalentes crescentes de sal de cloreto de magnésio.
DEFINIÇÕES
[0010] Antes de descrever modalidades exemplares com maior detalhe, as seguintes definições são apresentadas para ilustrar e definir o significado e alcance dos termos utilizados na descrição.
[0011] Os seguintes termos têm os seguintes significados, a menos que indicado de outra forma. Quaisquer termos não definidos têm os seus significados reconhecidos na técnica.
[0012] Tal como utilizado neste documento, os termos polinucleotídeo e oligonucleotídeo são utilizados de forma intercambiável para se referir a um composto que contém uma pluralidade de subunidades da unidade nucleosídica ou resíduos nucleosídicos que estão ligados por ligações de internucleosídeo ou ligações internucleosídicas. Sempre que um polinucleotídeo é representado por uma sequência de letras, tal como "ATGUCCTG", entende-se que os nucleotídeos estão em ordem 5'^ 3' da esquerda para a direita e que "A" indica a desoxiadenosina, "C" designa a desoxicitidina, "G" indica a desoxiguanosina, "T" indica a timidina, e "U" indica a desoxiuridina, a menos que indicado de outra maneira.
[0013] Tal como se utiliza neste documento, "nucleosídeo" inclui os nucleosídeos naturais, incluindo 2'-desóxi e 2'-hidroxil, por exemplo, formas, tal como descrito em Kornberg e Baker, DNA Replication, 2a Ed. (Freeman, São Francisco, 1992). "Análogos", em referência a nucleosídeos incluem nucleosídeos sintéticos tendo frações de base modificadas e/ou frações de açúcar modificadas, por exemplo, descrito em geral por Scheit, Nucleotide Analogs (John Wiley, Nova Iorque, 1980). Tais análogos incluem nucleosídeos sintéticos projetados para potencializar as propriedades de ligação, por exemplo, estabilidade, especificidade, ou similares, tal como divulgado por Uhlmann e Peyman, (Chemical Reviews 90:543-584, 1990). Em algumas modalidades, um análogo de nucleosídeo ou nucleosídeo inclui um grupo 3'-hidroxil ou um grupo 3'-amino.
[0014] Os termos "base" e "nucleobase" são utilizados indiferentemente e definidos neste documento como incluindo (i) DNA convencional e bases de RNA (uracil, timina, adenina, guanina, e citosina) e (ii) bases modificadas ou análogos de base (por exemplo, 5-metil-citosina, 5- bromouracil ou inosina). Um análogo de base é um produto químico cuja estrutura molecular imita aquela de uma base de DNA ou RNA convencional.
[0015] Tal como utilizado neste documento, "pirimidina" significa as pirimidinas que ocorrem em nucleosídeos naturais, incluindo citosina, timina e uracil, e análogos comuns dos mesmos, tais como os que contêm substituintes de oxi, metil, propinil, metóxi, hidroxil, amino, tio, halo e semelhantes. O termo, tal como utilizado neste documento, inclui ainda pirimidinas com grupos de proteção comuns ligados, tais como N4- benzoilcitosina. Outros grupos protetores de pirimidina de interesse incluem, mas não estão limitados a, aqueles grupos protetores que são divulgados por Beaucage e Iyer Tetrahedron 48: 2223-2311 (1992).
[0016] Tal como utilizado neste documento, "purina" significa as purinas que ocorrem em nucleosídeos naturais, incluindo adenina, guanina, e hipoxantina, e análogos comuns respectivos, tais como os que contêm substituintes de óxi, metil, propinil, metóxi, hidroxil, amino, tio, halo e semelhantes. O termo, tal como utilizado neste documento, inclui ainda purinas com grupos de proteção comuns ligados, tais como N2-benzoil guanina, N2-isobutiril guanina, N6-benzoilenolina e semelhantes. Outros grupos de proteção comuns de purina são divulgados por Beaucage e Iyer Tetrahedron 48: 2223-2311 (1992). Tal como utilizado neste documento, o termo "-protegido-" como um componente de um nome químico refere-se a grupos de proteção reconhecidos na técnica para uma fração particular de um composto, por exemplo, hidroxilo protegido "5" em referência a um nucleosídeo que inclui trifenilmetilo (ou seja, tritil), p-anisildifenilmetilo (isto é, monometoxitritilo ou MMT), di-p-anisilfenilmetilo (isto é, dimetóxitritilo ou DMT) e semelhantes; e uma nucleobase protegida em referência a uma nucleobase que inclui um heteroátomo protegido com um grupo tal como uma dimetilaminoformamidina (DMF), benzoílo (Bz), isobutirilo e semelhantes. Os grupos de proteção reconhecidos na técnica incluem os descritos nas seguintes referências: Gait, editor, Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach (IRL Press, Oxford, 1984); Amrnaath e Broom, Chemical Reviews, 77:183-217, 1977; Pon et al., Biotechniques, 6:768-775, 1988; Ohtsuka et al, Nucleic Acids Research, 10:6553-6570, 1982; Eckstein, editor, Oligonucleotides, and Analogues: A Practical Approach (IRL Press, Oxford, 1991), Greene e Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, Segunda edição, (John Wiley & Sons, New York, 1991), Narang, editor, Synthesis and Applications of DNA and RNA (Academic Press, Nova York, 1987), Beaucage e Iyer Tetrahedron 48: 2223-2311 (1992), e similares referências.
[0017] Tal como utilizado neste documento, "polioleucleotídeo N3 '^ P5' tiofosforamidato" significa um oligômero, geralmente linear, de subunidades nucleosídicas ligadas por pelo menos uma ligação N3 '^ P5' tiofosforamidato. Em termos gerais, as subunidades de nucleosídeos compreendem nucleosídeos ou análogos de nucleosídeos, mas também podem compreender porções mais gerais que tenham química compatível, tais como os açúcares não básicos e outras unidades de hidrocarboneto, tais como os descritos nas referências seguintes: Newton et al, Nucleic Acids Research, 21: 1155-1162 (1993); Griffin et al, J. Am. Chem. Soc, 114: 79767982 (1992); Jaschke et al, Tetrahedron Letters, 34: 301-304 (1992); Ma et al., Pedido Internacional PCT/CA92/00423; Zon et al., pedido internacional PCT/US90/06630; Durand et al., Nucleic Acids Research, 18: 6353-6359 (1990); Salunkhe et al., J. Am. Chem. Soc, 114: 8768-8772 (1992); e similares. Em alguns casos, o termo significa um polinucleotídeo em que todas as ligações internucleosídicas são substituídas por ligações N3 '^ P5' tiofosforamidato. Como tal, o termo compreende oligômeros parcialmente, bem como totalmente, "amidados". Em alguns casos, o termo significa um polinucleotídeo onde todas as ligações internucleossídicas são substituídas por ligações N3 '^ P5' tiofosforamidato e em que as subunidades nucleosídicas são os nucleosídeos naturais ou seus análogos. Um sujeito polinucleotídeo N3'^ P5' tiofosforoamidato em que cada ligação é ligação de fosforamidato N3'^ P5' ("totalmente amidado") pode ser encaixado em ou ligado a outros oligonucleotídeos ou polinucleotídeos para formar um oligômero maior, que é "parcialmente amidado." Um sujeito polinucleotídeo N3 '^ P5' tiofosforamidato pode incluir quaisquer grupos terminais 3' e/ou 5' convenientes. Em algumas modalidades, o polinucleotídeo N3 '^ P5' tiofosforamidato inclui um grupo terminal 3 '-hidróxilo ou um grupo 3'-amino terminal.
[0018] Tal como utilizado neste documento, os termos "fosfato" e "grupo fosfato" devem significar que englobam um grupo tiofosfato e um grupo oxofosfato.
[0019] Tal como utilizado neste documento, o termo "grupo amino fosforamidita" refere-se ao grupo amino, -NR4R5, ligado ao átomo de fósforo de um grupo fosforamidita e o termo "nitrogênio de fosforamidita" refere-se ao átomo de nitrogênio do grupo amino da fosforamidita.
[0020] "Alquilo" refere-se a grupos hidrocarbilo alifáticos saturados monovalentes com 1 a 10 átomos de carbono e tais como 1 a 6 átomos de carbono (por exemplo, "um alquilo com 1 a 6 átomos de carbono") ou 1 a 5 (por exemplo, "Um alquilo de 1 a 5 átomos de carbono") ou 1 a 4 (por exemplo, "um alquilo com 1 a 4 átomos de carbono") ou 1 a 3 átomos de carbono (por exemplo, "um alquilo de 1 a 3 átomos de carbono"). Este termo inclui, a título de exemplo, grupos hidrocarbil lineares e ramificados, tais como metil (CH3-), etil (CH3CH2-), n-propil (CH3CH2CH2-), isopropil ((CH3)2CH-), n-butil (CH3CH2CH2CH2-), isobutil ((CH3)2CHCH2-), sec-butil ((CH3)(CH3CH2)CH-), t-butil ((CH3)3C-), n-pentil (CH3CH2CH2CH2CH2-) e neopentil ((CH3)3CCH2-).
[0021] O termo "alquilo substituído" refere-se a um grupo alquilo, tal como definido neste documento, em que um ou mais átomos de carbono na cadeia alquilo foram opcionalmente substituídos por um heteroátomo tal como -O-, -N-, -S-, -S (O)N- (onde n é 0 a 2), - NR- (onde R é hidrogênio ou alquil) e tem de 1 a 5 substituintes selecionados do grupo constituído por alcóxi, alcóxi substituído, cicloalquil, cicloalquil substituído, cicloalquenil, cicloalquenil substituído, acil, acilamino, aciloxi, amino, aminoacil, aminoaciloxi, oxiaminoacil, azido, ciano, halogênio, hidroxil, oxo, tioceto, carboxil, carboxilalquil, tioariloxi, tioheteroariloxi, tioheterociclooxi, tiol, tioalcoxi, tioalcóxisubstituído, aril, ariloxi, heteroaril, heteroariloxi, heterociclil, heterociclooxi, hidroxiamino, alcoxiamino, nitro, -SO-alquilo, -SO-arilo, -SO- heteroarilo, -SO2-alquilo, -SO2-aril, -SO2-heteroaril e - RaRb, em que Ra e Rb podem ser iguais ou diferentes e são escolhidos entre hidrogênio, alquilo, cicloalquilo, alcenilo, cicloalcenilo, alcinilo, arilo, heteroarilo e heterocíclico opcionalmente substituídos. Em alguns casos, um "alquilo substituído" refere-se a um grupo alquilo como definido neste documento tem de 1 a 5 substituintes selecionados do grupo que consiste em alcóxi, cicloalquilo, cicloalcenilo, acil, acilamino, aciloxi, amino, aminoacilo, aminoaciloxi, oxiaminoacil, azido, Ciano, halogéneo, hidroxilo, carboxilo, carboxilalquilo, tiol, tioalcóxi, arilo, arilóxi, heteroarilo, heteroariloxi, heterociclilo, heterocicloxilo, sulfonamido e - RaRb, em que Ra e Rb podem ser iguais ou diferentes e são escolhidos entre hidrogênio, alquilo, cicloalquilo, alcenilo, cicloalcenilo, alcinilo, arilo, heteroarilo e heterocíclico.
[0022] "Alcóxi" refere-se ao grupo -O-alquilo, em que alquilo é como definido neste documento. Alcóxi inclui, a título de exemplo, metóxi, etóxi, n- propóxi, isopropóxi, n-butóxi, t-butóxi, sec-butóxi, n-pentóxi, e semelhantes. O termo "alcóxi" refere-se também aos grupos alquenil-O-, cicloalquilo-O-, cicloalquenilo-O-, e alquinil-O-, onde alquenil, cicloalquilo, cicloalquenil, e alquinil são como definidos neste documento.
[0023] O termo "alcóxi substituído" refere-se aos grupos alquilo-O- substituído, alquenil-O- substituído, cicloalquilo-O- substituído, cicloalquenil- O- substituído e alquinil-O- substituído em que o alquilo substituído, alquenil substituído, cicloalquilo substituído, cicloalquenilo substituído e alquinilo substituído são como neste documento definidos.
[0024] "Acilo" refere-se aos grupos H-C(O) -, alquil-C(O) -, alquilo-C (O)- substituído, alquenil-C(O) -, alquenil-C(O)- substituído, alquinil-C(O)- substituído, alquinil-C(O) -, cicloalquil-C(O) -, cicloalquil-C(O) substituído, cicloalcenil-C(O) - cicloalcenil-C(O), aril-C(O) -, arilo-C(O)- substituído, heteroaril-C(O) -, heteroaril-C(O)- substituído, heterociclil-C(O) e heterociclil- C(O) substituído, em que alquilo, alquilo substituído, alquenilo, alquenilo substituído, alquinilo, alquinilo substituído, cicloalquilo, cicloalquilo substituído, cicloalquenilo, cicloalquenilo substituído, arilo, arilo substituído, heteroarilo, heteroarilo substituído, heterocíclico e heterocíclico substituído são como definidos neste documento. Por exemplo, acil inclui o grupo "acetil" CH3C(O)-
[0025] O termo "amino substituído" refere-se ao grupo -NRR onde cada R é independentemente selecionado a partir do grupo que consiste de hidrogênio, alquilo substituído, cicloalquilo, cicloalquilo substituído, alquenilo, alquenilo substituído, cicloalquenilo, cicloalquenilo substituído, alquinilo, alquinilo substituído, aril, heteroaril e heterociclil, desde que pelo menos um R não seja hidrogênio.
[0026] "Halo" ou "halogênio" refere-se a fluoro, cloro, bromo e iodo.
[0027] "Hidróxi" ou "hidroxilo" refere-se ao grupo -OH.
[0028] "Heteroaril" refere-se a um grupo aromático de 1 a 15 átomos de carbono, tal como de 1 a 10 átomos de carbono e 1 a 10 heteroátomos selecionados a partir do grupo que consiste em oxigénio, nitrogênio e enxofre dentro do anel. Esses grupos heteroaril podem possuir um único anel (tal como piridinil, imidazolil ou furil) ou múltiplos anéis condensados num sistema de anel (por exemplo como em grupos tais como, indolizinil, quinolinil, benzofurano, benzimidazolil ou benzotienil), em que pelo menos um anel no sistema de anéis é aromático, desde que o ponto de ligação seja através de um átomo de um anel aromático. Em certas modalidades, o(s) átomo(s) de nitrogênio e/ou enxofre do anel do grupo heteroaril está opcionalmente oxidado para proporcionar as frações de N-óxido (N^O), sulfinil ou sulfonil. Este termo inclui, a título de exemplo, piridinil, pirrolil, indolil, tiofenil e furanil. Salvo restrição em contrário imposta pela definição para o substituinte aril, estes grupos aril podem opcionalmente ser substituídos com 1 a 5 substituintes, ou de 1 a 3 substituintes, selecionados de entre acilóxi, hidróxi, tiol, acil, alquil, alcóxi, alquenil, alquinil, cicloalquil, cicloalquenil, alquil substituído, alcóxi substituído, alqunil substituído, alquinil substituído, cicloalquil substituído, cicloalquenil substituído, amino, amino substituído, aminoacil, acilamino, alcaril, aril, arilóxi, azido, carboxil, carboxilalquil, ciano, halogênio, nitro, heteroaril, heteroarilóxi, heterociclil, heterocicloóxi, aminoaciloxi, oxiacilamino, tioalcóxi, tioalcóxi, tioarilóxi, tioheteroarilóxi, -SO-alquil, -SO-alquil substituído, -SO-aril, -SO-heteroaril, - SO2-alquil, -SO2-alquil substituído, -SO2-aril e -SO2-heteroaril e trihalometIl. Em tais casos, um grupo heteroaril que está substituído com 1 até 5 substituintes (por exemplo, tal como descrito neste documento) é referido como um "heteroaril substituído".
[0029] "Heterociclo", "heterocíclico", "heterocicloalquilo" e "heterociclilo" refere-se a um grupo saturado ou insaturado possuindo um único anel ou anéis condensados múltiplos, incluindo sistemas de anel espiro com ponte fundida e espiro e tendo de 3 a 20 átomos de anel, incluindo 1 a 10 heteroátomos. Esses átomos de anel são selecionados a partir do grupo que consiste em nitrogênio, enxofre, ou oxigénio, em que, em sistemas de anéis fundidos, um ou mais dos anéis podem ser cicloalquilo, aril, ou heteroaril, desde que o ponto de ligação seja através do anel não-aromático. Em certas modalidades, o(s) átomo(s) de nitrogênio e/ou enxofre do grupo heterocíclico são opcionalmente oxidados para proporcionar as frações de N-óxido, -S(O)-, ou -SO2.
[0030] Exemplos de heterociclos e heteroaris incluem, mas não estão limitados a azetidina, pirrol, imidazol, pirazol, piridina, pirazina, pirimidina, piridazina, indolizina, isoindol, indol, di-hidroindol, indazol, purina, quinolizina, isoquinolina, quinolina, ftalazina, naftilpiridina, quinoxalina, quinazolina, cinolina, pteridina, carbazol, carbolina, fenantridina, acridina, fenantrolina, isotiazol, fenazina, isoxazol, fenoxazina, fenotiazina, imidazolidina, imidazolina, piperidina, piperazina, indolina, ftalimida, 1,2,3,4-tetra- hidroisoquinolina, 4,5,6,7-tetra-hidrobenzo[b]tiofeno, tiazol, tiazolidina, tiofeno, benzo[b]tiofeno, morfolinilo, tiomorfolinil (também referido como tiamorfolinil), 1,1-dioxotiomorfolinil, piperidinil, pirrolidina, tetra-hidrofuranil e similares.
[0031] A menos que seja restringida de outra forma pela definição para o substituinte heterocíclico, tais grupos heterocíclicos podem ser opcionalmente substituídos com 1 a 5, ou de 1 a 3 substituintes, selecionados de alcoxi, alcóxisubstituído, cicloalquilo, cicloalquilo substituído, cicloalcenilo, cicloalcenilo substituído, acil, acilamino, aciloxi, amino, amino substituído, aminoacilo, aminoaciloxi, oxiaminoacil, azido, ciano, halogêneo, hidroxilo, oxo, tioqueto, carboxilo, carboxilalquilo, tioariloxi, tioheteroariloxi, tioheterocicloxilo, tiol, tioalcóxi, tioalcóxi substituído, arilo, ariloxi, Heteroarilo, heteroariloxi, heterociclilo, heterocicloxilo, hidroxiamino, alcoxiamino, nitro, - SO-alquilo, -SO-alquilo substituído, -SO-arilo, -SO-heteroarilo, -SO2-alquilo, -SO2- alquilo substituído, -SO2-aril, -SO2-heteroarilo e heterociclo fundido.
[0032] "Nitro" refere-se ao grupo -NO2.
[0033] "Oxo" refere-se ao átomo (= O).
[0034] "Tióis" refere-se ao grupo -SH.
[0035] "Tioxo" ou o termo "tioqueto" refere-se ao átomo (= S).
[0036] Em adição a esta descrição, o termo "substituído", quando utilizado para modificar um grupo especificado ou radical, também pode significar que um ou mais átomos de hidrogênio do grupo especificado ou radicais são, cada um, independentemente um do outro, substituídos com os mesmos ou diferentes grupos substituintes, tal como definido abaixo.
[0037] Além dos grupos divulgados em relação aos termos individuais neste documento, grupos substituintes para substituir um ou mais hidrogênios (quaisquer dois hidrogênios em um único carbono podem ser substituídos por = O, = R70= N-OR70= N2 Ou = S) no grupo ou radical especificado são, a menos que especificado de outra forma, -R60, Halo, = O, -OR70, -SR70, - R80R80, Tri-halometilo, -CN, -OCN, -SCN, -NO, -NO2, =N2, - N3, -SO2R70, -SO2O-M+, -SO2OR70, -OSO2R70, -OSO2O-M+, -OSO2OR70, - P(O)(O-)2(M+)2, -P(O)(OR70)O-M+, -P(O)(OR70)2, -C(O)R70, -C(S)R70, - C(NR70)R70, -C(O)O-M+, -C(O)OR70, -C(S)OR70, -C(O)NR80R80, - C(NR70)NR80R80, -OC(O)R70, -OC(S)R70, -OC(O)O-M+, -OC(O)OR70, - OC(S)OR70, -NR70C(O)R70, -NR70C(S)R70, -NR70CO2" M+, -NR70CO2R70, - NR70C(S)OR70, -NR70C(O)NR80R80, -NR70C(NR70)R70 e - NR70C(NR70)NR80R80, em que R60 é selecionado do grupo que consiste em alquilo, cicloalquilo, heteroalquilo, heterocicloalquilalquilo, cicloalquilalquilo, arilo, arilalquilo, heteroarilo e heteroarilalquilo opcionalmente substituídos, cada R70 é independentemente hidrogênio ou R60; cada R80 é independentemente R70 ou, alternativamente, dois R 80's, tomados em conjunto com o átomo de nitrogênio ao qual estão ligados, formam um heterocicloalquilo de 5, 6 ou 7 membros que pode opcionalmente incluir de 1 a 4 heteroátomos adicionais iguais ou diferentes selecionados do grupo que consiste em O, N e S, dos quais N pode ter -H ou C1-C3 substituição de alquilo; e cada M+ é um contra íon com uma carga líquida única e positiva. Cada M+ pode ser independentemente, por exemplo, um íon alcalino, como K+, Na+, Li+; um íon de amônia, como +N (R60)4; ou um íon alcalino-terroso, como [Ca2+]0.5, [Mg2+]0.5 ou [Ba2+]0,5 ("subscrito 0,5 significa que um dos contraíons para tais íons de terra alcalina divalentes podem ser uma forma ionizada de um composto da invenção e o outro um contraíon tal como cloreto ou dois compostos ionizados divulgados neste documento podem servir como contraíons para estes íons terrosos alcalinos divalente ou um composto duplamente ionizado da invenção pode servir como contraíon para tais íons terrosos alcalinos divalentes). Como exemplos específicos, - R80R80 está deve incluir - H2, H-alquilo, N-pirrolidinilo, N-piperazinilo, 4N-metil- piperazin-1-ilo e N-morfolinilo.
[0038] Além da divulgação neste documento, em certa modalidade, um grupo que é substituído tem 1, 2, 3, ou 4 substituintes, 1, 2 ou 3 substituintes, 1 ou 2 substituintes, ou 1 substituinte.
[0039] Entende-se que em todos os grupos substituídos definidos acima, os polímeros aos quais chegou-se através da definição de substituintes com outros substituintes sozinhos (por exemplo, aril substituído com um grupo aril substituído como um substituinte que é substituído com um grupo aril substituído, que é depois substituído por um grupo aril substituído, etc.) não se destinam a serem incluídos neste documento. Em tais casos, o número máximo de tais substituições é três. Por exemplo, substituições seriais de grupos aril substituídos especificamente contempladas neste documento estão limitadas a aril substituído-(aril substituído)-aril substituído.
[0040] Salvo indicação em contrário, as nomenclaturas de substituintes que não são explicitamente definidos neste documento são obtidas ao nomear a porção terminal da funcionalidade seguida pela funcionalidade adjacente em direção ao ponto de ligação.
[0041] Em relação a quaisquer grupos divulgados neste documento, que contêm um ou mais substituintes, entende-se, é claro, que esses grupos não contêm nenhuma substituição ou padrões de substituição que sejam estericamente impraticáveis e/ou sinteticamente inviáveis. Além disso, os compostos da presente invenção incluem todos os isômeros estereoquímicos resultantes da substituição destes compostos.
[0042] O termo "sal farmaceuticamente aceitável" significa um sal que é aceitável para administração a um paciente, tal como um mamífero (sais com contraíons com segurança aceitável para mamíferos para um dado regime de dosagem). Tais sais podem ser derivados de bases inorgânicas ou orgânicas farmaceuticamente aceitáveis e de ácidos farmaceuticamente aceitáveis inorgânicos ou orgânicos. "Sal farmaceuticamente aceitável" refere-se a sais farmaceuticamente aceitáveis de um composto que são sais derivados de uma variedade de contraíons orgânicos e inorgânicos bem conhecidos na técnica e incluem, a título de exemplo apenas, sódio e semelhantes; e quando a molécula contém uma funcionalidade de base, sais de ácidos orgânicos ou inorgânicos, tais como cloridrato e outros semelhantes. Os sais farmaceuticamente aceitáveis de interesse incluem, mas não estão limitados a sais de alumínio, amônio, arginina, bário, benzatina, cálcio, colinato, etilenodiamina, lisina, lítio, magnésio, meglumina, procaína, potássio, sódio, trometamina, N-metilglucamina, N,N'- dibenziletileno-diamina, cloroprocaína, dietanolamina, etanolamina, piperazina, zinco, diisopropilamina, diisopropiletilamina, trietilamina e trietanolamina.
[0043] O termo "sal" significa um composto formado quando um próton de um ácido é substituído por um cátion, tal como um cátion metálico ou um cátion orgânico e semelhantes. Caso seja aplicável, o sal é um sal farmaceuticamente aceitável, embora isto não seja necessário para os sais de compostos intermediários que não são destinados para administração a um paciente. A título de exemplo, os sais dos compostos da presente invenção incluem aqueles em que o composto está protonado por um ácido inorgânico ou orgânico para formar um cátion, com a base conjugada do ácido inorgânico ou orgânico como o componente aniônico do sal. Os sais de interesse incluem, mas não estão limitados a, sais de alumínio, amônio, arginina, bário, benzatina, cálcio, césio colinato, etilenodiamina, lítio, magnésio, meglumina, procaína, N-metilglucamina, piperazina, potássio, trometamina, zinco, N,N'-dibenziletileno-diamina, cloroprocaína, dietanolamina, etanolamina, piperazina, diisopropilamina, trietilamina, diisopropiletilamina e trietanolamina. Entende-se que para qualquer uma das estruturas de oligonucleotídeos descritas neste documento, que incluem uma cadeia principal com ligações de internucleosídeo, tais oligonucleotídeos também podem incluir quaisquer formas de sais convenientes. Em algumas modalidades, formas ácidas das ligações de internucleosídeo estão representadas para simplificar. Em alguns casos, o sal do composto da invenção é um sal de cátion monovalente. Em certos casos, o sal do composto da invenção é um sal de cátion divalente. Em alguns casos, o sal do composto da invenção é um sal de cátion trivalente.
[0044] "Solvatar" refere-se a um complexo formado pela combinação de moléculas de solventes com moléculas ou íons do soluto. O solvente pode ser um composto orgânico, um composto inorgânico ou uma mistura de ambos. Alguns exemplos de solventes incluem, mas não estão limitados a, metanol, N, N-dimetilformamida, tetrahidrofurano, dimetilsulfóxido e água. Quando o solvente é água, o solvato formado é um hidrato.
[0045] O "estereoisômero" e os "estereoisômeros" referem-se a compostos que têm a mesma conectividade atômica, mas uma disposição atômica diferente no espaço. Os estereoisômeros incluem cis-trans isômeros, isómeros E e Z, enantiômeros e diastereômeros.
[0046] "Tautômero" refere-se a formas alternativas de uma molécula que diferem apenas na ligação eletrônica de átomos e/ou na posição de um próton, tais como tautômeros enol-ceto e imina-enamina, - NH-P (= S) (OH) -O- e - NH-P (= O) (SH) -O-, ou as formas tautoméricas de grupos heteroarilo que contém uma disposição de átomos do anel N = C (H) -NH-, tais como pirazóis, imidazóis, benzimidazóis, triazóis e tetrazóis. Aqueles versados na técnica reconhecerão que outras disposições tautoméricas dos grupos descritos neste documento são possíveis. Por exemplo, entende-se que um polinucleotídeo descrito pela seguinte estrutura:
Figure img0001
também abrange a seguinte estrutura mostrando um possível arranjo tautomérico alternativo de grupos de ligação:
Figure img0002
em que "nps" representa uma ligação de tiofosforamidato (- NH-P (= O) (SH) - O- ou-NH-P (= S) (OH) -O-) conectando o carbono 3 'de um nucleosídeo ao 5'-carbono do nucleosídeo adjacente. Entende-se que todas as formas tautoméricas de um composto da invenção são englobadas por uma estrutura em que um arranjo tautomérico possível dos grupos do composto é descrito, mesmo que não seja especificamente indicado. Qualquer arranjo tautomérico conveniente dos grupos dos compostos da invenção podem ser utilizados na descrição dos compostos.
[0047] Será apreciado que o termo "ou um seu sal ou solvato ou estereoisômero" destina-se a incluir todas as permutações de sais, solvatos e estereoisômeros, tais como um solvato de um sal farmaceuticamente aceitável de um estereoisômero do composto do assunto. Entende-se que o termo "ou um seu sal" destina-se a incluir todas as permutações de sais. Entende-se que o termo "ou um seu sal farmaceuticamente aceitável" pretende incluir todas as permutações de sais. Entende-se que o termo "ou um seu solvato" pretende incluir todas as permutações de solvatos. Entende- se que o termo "ou um seu estereoisômero" destina-se a incluir todas as permutações de estereoisômeros. Entende-se que o termo "ou um tautômero dos mesmos" destina-se a incluir todas as permutações de tautômeros. Assim, por exemplo, segue-se que se pretende incluir um solvato de um sal farmaceuticamente aceitável de um tautômero de um estereoisômero do composto do assunto.
[0048] Tal como utilizado neste documento, o termo "isolado" pretende descrever um composto de interesse que está num ambiente diferente daquele em que o composto ocorre naturalmente. "Isolado" pretende incluir os compostos que estão dentro de amostras que são substancialmente enriquecidos para o composto de interesse e/ou em que o composto de interesse é parcialmente ou substancialmente purificado.
[0049] Tal como utilizado neste documento, o termo "substancialmente purificado" refere-se a um composto que é removido do seu ambiente natural e é pelo menos 60% livre, pelo menos 75% livre, pelo menos 80% livre, pelo menos, 81% livre, pelo menos 82% livre, pelo menos 83% livre, pelo menos 84% livre, pelo menos 85% livre, pelo menos 86% livre, pelo menos 87% livre, pelo menos 88% livre, pelo menos 89% livre, pelo menos 90% livre, pelo menos 91% livre, pelo menos 92% livre, pelo menos 93% livre, pelo menos 94% livre, pelo menos 95% livre, pelo menos 96% livre, pelo menos 97% livre, pelo menos 98% livre, pelo menos 99% livre, ou mais de 99% livre de outros componentes com os quais está naturalmente associado.
[0050] O termo "condições fisiológicas" pretende englobar essas condições compatíveis com células vivas, por exemplo, condições predominantemente aquosas de uma temperatura, pH, salinidade, etc. que são compatíveis com células vivas.
[0051] Onde um intervalo de valores é fornecido, entende-se que cada valor interveniente, ao décimo da unidade do limite inferior, a menos que o contexto dite claramente de outra forma, entre os limites superior e inferior do intervalo e qualquer outro valor estabelecido ou interveniente nesse intervalo estabelecido está englobado na invenção. Os limites superior e inferior desses intervalor menores podem ser independentemente incluídos nos intervalos menores e também são englobados na invenção, sujeitos a qualquer limite especificamente excluído no intervalo estabelecido. Onde o intervalo estabelecido inclui um ou ambos os limites, os intervalos que excluem qualquer um ou ambos os limites incluídos também são incluídos na invenção.
[0052] Deve ser observado que como usado neste documento e na reivindicação anexa, as formas singulares "um", "uma", e "o" incluem referenciais plurais, a menos que o contexto claramente dite de outra forma. É observado, adicionalmente, que as reivindicações podem ser redigidas para excluir qualquer elemento opcional. Como tal, esta declaração destina- se a servir como base antecedente para o uso de tal terminologia exclusiva como "unicamente," "somente" e semelhantes em conexão com a recitação de elementos da reivindicação, ou uso de uma limitação "negativa".
[0053] Outras definições de termos podem aparecer ao longo do relatório descritivo.
DESCRIÇÃO DAS MODALIDADES EXEMPLARES
[0054] Conforme resumido acima, aspectos da divulgação incluem métodos para a preparação de um polinucleotídeo. Em algumas modalidades, o método inclui fazer entrar em contato uma primeira composição polinucleotídica que inclui: um polinucleotídeo que possui uma sequência de 7 ou mais subunidades nucleosídicas em que pelo menos duas das subunidades nucleosídicas são unidas por uma ligação inter-subunidade de N3 '^ P5' tiofosforamidato; e produtos e reagentes sintéticos não alvo; com um sal de cátion multivalente para precipitar um primeiro sal de polinucleotídeo incluindo pelo menos um contraíon de cátions multivalente; e separar o primeiro sal de polinucleotídico da primeira composição polinucleotídica em contato para produzir uma segunda composição polinucleotídica que inclui o primeiro sal polinucleotídico. Em certas modalidades, o método inclui ainda a ligação do sal polinucleotídico com um suporte de cromatografia de fase reversa; e eluindo a partir da cromatografia suporta uma terceira composição polinucleotídica que inclui um polinucleotídico. Em alguns casos, a terceira composição polinucleotídica inclui um segundo sal polinucleotídico. Também são fornecidas composições que incluem um sal do polinucleotídeo que inclui pelo menos um contraíon de cátions multivalentes. Em algumas modalidades, o pelo menos um contraíon de cátions multivalentes é selecionado do grupo que consiste em magnésio, zinco, alumínio e cálcio.
[0055] Antes de serem descritas as várias modalidades, deve entender-se que os ensinamentos desta divulgação não estão limitados às modalidades particulares descritas e, como tal, podem, evidentemente, variar. Também deve ser entendido que a terminologia utilizada neste documento tem a finalidade de descrever modalidades particulares somente, e não pretende ser limitante, uma vez que o escopo dos presentes ensinamentos será limitado somente pelas reivindicações anexas.
[0056] Os títulos de seção utilizados neste documento são apenas para fins organizacionais e não devem ser interpretadas como limitando, de qualquer maneira, o assunto descrito. Enquanto os presentes ensinamentos são descritos em conjunto com várias modalidades, não se pretende que os presentes ensinamentos sejam limitados a tais modalidades. Pelo contrário, os presentes ensinamentos abrangem várias alternativas, modificações e equivalentes, como serão apreciados por aqueles versados na técnica.
[0057] A menos que definido de forma contrária, todos os termos técnicos e científicos usados neste documento têm o mesmo significado que o comumente compreendido por aqueles versados na técnica à qual a invenção se relaciona. Embora quaisquer métodos e materiais semelhantes ou equivalentes aos descritos neste documento possam ser usados na prática ou em testes da presente invenção, os métodos e materiais de interesse são agora descritos. Todas as publicações mencionadas aqui são incorporadas neste documento por referência para divulgar e descrever os métodos e/ou materiais em conexão com os quais as publicações são citadas.
[0058] A menção de qualquer publicação é para a sua divulgação antes da data de depósito e não deve ser interpretada como uma admissão de que as presentes reivindicações não estão no direito de anteceder tal publicação em virtude de invenção prévia. Adicionalmente, as datas de publicação fornecidas podem ser diferentes das datas de publicação reais que podem ser confirmadas de forma independente.
[0059] É reconhecido que determinadas características da invenção, que são, para clareza, descritas no contexto de modalidades separadas, também podem ser fornecidas em combinação em uma única modalidade. Por outro lado, várias características da invenção que são, por concisão, descritas no contexto de uma única modalidade, também podem ser fornecidas separadamente ou em qualquer subcombinação adequada. Todas as combinações das modalidades relacionadas com a invenção são especificamente abrangidas pela presente invenção e são divulgadas neste documento como se cada uma e todas as combinações fosse individualmente e explicitamente descritas, na medida em que tais combinações abarcam assuntos que são, por exemplo, compostos que são compostos estáveis (isto é, compostos que podem ser feitos, isolados, caracterizados e testados para a atividade biológica). Além disso, todos os subcombinações das várias modalidades e dos seus elementos (por exemplo, elementos dos grupos químicos listados nas modalidades que descrevem tais variáveis) também são especificamente abrangidas pela presente invenção e são divulgadas neste documento como se cada tal subcombinação fosse individualmente e explicitamente divulgada neste documento.
[0060] Todas as patentes e publicações, incluindo todas as sequências reveladas dentro dessas patentes e publicações, referidas neste documento são expressamente incorporadas por referência.
[0061] Ao descrever ainda mais a presente invenção, os métodos de preparação de um polinucleotídeo são descritos em primeiro lugar com maior detalhe. Em seguida, são analisadas composições polinucleotídicas de interesse para a prática dos métodos do assunto.
MÉTODOS DE PREPARAÇÃO
[0062] Os aspectos da presente divulgação incluem métodos para a preparação de um polinucleotídeo. Em algumas modalidades, o método inclui fazer entrar em contato uma primeira composição polinucleotídica incluindo um polinucleotídeo (por exemplo, como descrito neste documento) e produtos e agentes de síntese não alvo, com um sal catiônico multivalente para precipitar um sal polinucleotídico incluindo pelo menos um contraíon de cátions multivalentes. A precipitação do sal polinucleotídico utilizando os métodos do assunto prevê a remoção de todos os produtos e agentes de síntese não-alvo solúveis. Em algumas modalidades, o método inclui separar o sal de polinucleotídeo da primeira composição de polinucleotídeo que entrou em contato para produzir uma segunda composição de polinucleotídeo que inclui o sal de polinucleotídeo. Em certas modalidades, a primeira composição polinucleotídica, o sal polinucleotídico e a segunda composição polinucleotídica incluem cada um polinucleotídeo alvo com uma sequência de 7 ou mais subunidades nucleosídicas em que pelo menos duas das subunidades nucleosídicas são unidas por uma ligação inter-subunidade N3 '^ P5' tiofosforamidato (por exemplo, como descrito neste documento).
[0063] A segunda composição polinucleotídica pode ter uma quantidade reduzida de produtos e agentes de síntese não alvo, em comparação com a primeira composição polinucleotídica. Por quantidade reduzida de produtos e agentes de síntese não alvo, entende-se que existe uma redução de 10% ou mais em peso dos produtos e agentes de síntese não alvo na segunda composição de polinucleotídeo em comparação com a primeira composição de polinucleotídeo, tal como um 15 % ou mais por redução de peso, 20% ou mais por redução de peso, 25% ou mais por redução de peso, 30% ou mais por redução de peso, 35% ou mais por redução de peso, 40% ou mais por redução de peso, 45% ou mais por redução de peso, 50% ou mais por redução de peso, 55% ou mais por redução de peso, 60% ou mais por redução de peso, 65% ou mais por redução de peso, 70% ou mais por redução de peso, 75% ou mais por redução de peso, 80% ou mais por redução de peso, 85% ou mais por redução de peso, 90% ou mais por redução de peso ou 95% ou mais por redução de peso. Como tal, os métodos do assunto podem proporcionar a precipitação seletiva do polinucleotídeo alvo sobre produtos e agentes de síntese não-alvo. Em certas modalidades, os métodos em questão proporcionam uma seletividade melhorada da precipitação em comparação com um método de controle de precipitação de polinucleotídeo usando um solvente orgânico, tal como etanol puro ou uma solução de etanol (ver, por exemplo, Crouse J, Amorese D (1987). "Ethanol Precipitation: Ammonium Acetate as an Alternative to Sodium Acetate". Focus 9 (2): 3-5). Por seletividade melhorada da precipitação entende-se que 5% ou mais em peso de produtos e agentes de síntese não alvo são removidos da segunda composição polinucleotídica em comparação com uma composição de controle, tal como 10% ou mais em peso, 15% ou mais em peso, 20%) ou mais em peso, 25% ou mais em peso, 30%> ou mais em peso, 35% ou mais em peso, 40% ou mais em peso, 45% ou mais em peso, 50% ou mais em peso, 55%) ou mais em peso, 60% ou mais em peso, 65% ou mais em peso, 70% ou mais em peso, 75% ou mais em peso, 80% ou mais em peso, 85% ou mais em peso, 90%) ou mais em peso, ou 95% ou mais em peso de produtos de síntese e agentes não alvo são removidos. A quantidade reduzida de produtos e agentes de síntese não alvo, em comparação com a primeira composição polinucleotídica, pode ser determinada utilizando quaisquer métodos convenientes, por exemplo, utilizando métodos HPLC.
[0064] Tal como utilizado neste documento, os termos "polinucleotídeo sintético alvo" e "polinucleotídeo alvo" são utilizados de forma intercambiável e referem-se a um polinucleotídeo que possui uma sequência particular desejada de nucleotídeos que é sintetizada num suporte através de qualquer método convencional de síntese de polinucleotídeos em fase sólida gradual (por exemplo, como descrito neste documento), e onde o polinucleotídeo é desprovido de quaisquer grupos protetores que são utilizados apenas para fins de execução da estratégia sintética do polinucleotídeo alvo. Tais grupos protetores podem ser removidos de um polinucleotídeo nas etapas finais da síntese em fase sólida, por exemplo, durante a desproteção final e a clivagem do polinucleotídeo a partir de um suporte para produzir o polinucleotídeo alvo. Tal como utilizado neste documento, o termo "não alvo" refere-se a qualquer componente conveniente, por exemplo, um composto, um polinucleotídeo ou um seu derivado, um agente, etc., ou suas misturas que não seja o produto alvo desejado de uma síntese.
[0065] O polinucleotídeo alvo pode incluir qualquer número conveniente de subunidades nucleosídicas, tais como entre 7 e 500 subunidades nucleosídicas, entre 7 e 100 subunidades nucleosídicas, entre 7 e 75 subunidades nucleosídicas, entre 7 e 50 subunidades nucleosídicas, entre 7 e 40 subunidades nucleosídicas, entre 7 e 30 subunidades nucleosídicas, entre 7 e 20 subunidades nucleosídicas, entre 7 e 15 subunidades nucleosídicas, entre 10 e 15 subunidades nucleosídicas ou entre 13 e 15 subunidades nucleosídicas. Em alguns casos, o polinucleotídeo alvo tem entre 7 e 100 subunidades nucleosídicas, como entre 7 e 50 subunidades nucleosídicas, entre 10 e 50 subunidades nucleosídicas, entre 10 e 40 subunidades nucleosídicas, entre 10 e 30 subunidades nucleosídicas, entre 10 e 25 subunidades nucleosídicas, entre 10 e 20 subunidades nucleosídicas, entre 12 e 18 subunidades nucleosídicas, ou entre 12 e 16 subunidades nucleosídicas. Em certos casos, o polinucleotídeo alvo tem 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 ou 25 subunidades nucleosídicas.
[0066] Tal como utilizado neste documento, o termo "produtos e agentes de síntese não alvo" refere-se coletivamente a uma variedade de componentes não alvo que podem estar presentes num produto sintético em bruto de síntese de polinucleotídeos em fase sólida, incluindo mas não limitado a: produtos de polinucleotídeos não alvo da síntese, tais como polinucleotídeos truncados, fragmentos de polinucleotídeos tampados (ou seja, sequências que foram tampadas após um acoplamento de subunidade falido), polinucleotídeos incluindo deleções (ou seja, falta de um ou mais monômeros ou dímeros de nucleosídeo alvo, por exemplo, como descrito neste documento) e polinucleotídeos derivatizados (por exemplo, sequências polinucleotídicas que sofrem uma reação lateral indesejável durante a síntese ou clivagem); e agentes tais como ligantes clivados, produtos de desproteção, por exemplo, produtos de grupos protetores removidos tais como produtos de grupos protetores de fósforo e produtos de grupo de proteção de base (por exemplo, produtos de grupo de proteção de amina exocíclica), reagentes de clivagem e/ou eliminadores de clivagem e reagentes de síntese residuais, tais como reagentes de monômeros, dímeros, acoplamento, tampamento ou desproteção.
[0067] Em certas modalidades, os métodos proporcionam a precipitação seletiva do polinucleotídeo alvo sobre produtos e agentes de síntese não alvo e que incluem polinucleotídeos que possuem 6 subunidades nucleosídicas ou menos, tais como 5 ou menos, 4 ou menos, 3 ou menos ou 2 subunidades nucleosídicas. Em certos casos, todos os produtos e agentes de síntese não alvo que não são polinucleotídeos permanecem solúveis durante a etapa de precipitação seletiva dos métodos do assunto e podem assim ser facilmente removidos do precipitado de sal polinucleotídico resultante.
[0068] Os métodos em questão podem incluir precipitação e separação do polinucleotídeo alvo a partir de uma preparação sintética em bruto para produzir uma composição polinucleotídica que possui várias propriedades desejáveis, tais como uma quantidade reduzida de produtos e agentes de síntese não alvo (por exemplo, reagentes de síntese, reagentes de clivagem, eliminadores, grupos protetores removidos, produtos laterais de clivagem (ligantes, grupos de cobertura, etc.) e pequenos fragmentos de polinucleotídeos).
[0069] Em algumas modalidades, os métodos do assunto incluem a precipitação do polinucleotídeo a partir de uma preparação sintática em bruto como um sal catiônico multivalente antes da purificação por cromatografia. Em certos casos, os métodos sujeitos são métodos de purificação de um polinucleotídeo alvo. A precipitação da composição de polinucleotídeo em bruto utilizando um sal de cátion multivalente produz um precipitado de sal polinucleotídico incluindo pelo menos um contraíon de cátions multivalente. Em alguns casos, o precipitado de sal polinucleotídico inclui uma mistura de contrações de cátions monovalentes e multivalentes que formam pares de íons com cadeia principal polinucleotídica polianiônica. Tal como utilizado neste documento, os termos "sal de cátion multivalente" e "sal multivalente" quando utilizados em referência a um polinucleotídeo são utilizados de forma intercambiável para se referir a um sal polinucleotídico que inclui pelo menos um contraíon de cátions multivalente que é emparelhado com íons para um grupo de ligação de subunidade aniônica da cadeia principal polinucleotídica. Em alguns casos, o sal catiônico multivalente do polinucleotídeo inclui uma mistura de cátions monovalentes e multivalentes. Em algumas modalidades, o cátion multivalente pode proporcionar a agregação do polinucleotídeo alvo por combinação de íons a grupos de ligação aniônicos inter-subunidades de duas ou mais cadeias principais polinucleotídicas. Em instâncias específicas, um íon de cátion divalente se emparelha com polinucleotídeos para formar um dímero. Em alguns casos, uma maior agregação dos polinucleotídeos pode ser conseguida por interações multivalentes adicionais mediadas por cátions multivalentes adicionais. Como tal, em alguns casos, os métodos sujeitos podem proporcionar agregação seletiva e precipitação de polinucleotídeos alvo sobre produtos e agentes sintéticos não alvo.
[0070] Em algumas modalidades do método, o pelo menos um contraíon de cátion multivalente é divalente. Em modalidades específicas, o pelo menos um contraíon de cátions multivalentes é selecionado do grupo que consiste em magnésio, zinco, e cálcio. Em algumas modalidades, pelo menos um contraíon de cátion multivalente é trivalente. Em certas modalidades, pelo menos um contraíon de cátions multivalentes é alumínio. Em algumas modalidades, o sal de polinucleotídeo inclui ainda um contraíon de cátion monovalente. Em tais casos, o sal de polinucleotídeo é um sal misto, por exemplo, um sal que inclui dois ou mais contraíons de cátions diferentes.
[0071] Todos os métodos convenientes de precipitação de um polinucleotídeo podem encontrar utilização nos métodos do assunto. A etapa de fazer entrar em contato a primeira composição polinucleotídica com um sal de cátion multivalente para precipitar um sal polinucleotídico incluindo pelo menos um contraíon de cátions multivalente pode ser conseguida usando quaisquer métodos convenientes. Podem ser utilizados quaisquer cátions multivalentes convenientes e seus sais (por exemplo, tal como descrito neste documento) na etapa de fazer entrar em contato para produzir o precipitado. Em certos casos, um sal de um polinucleotídeo que inclui pelo menos um contraíon de cátions multivalente é produzido numa fase de solução, por exemplo, através da adição de um sal catiônico multivalente a uma solução que inclui o polinucleotídeo. Uma vez que o sal de cátion multivalente tenha sido adicionado à solução, o precipitado pode então se formar. Em alguns casos, um sal de um polinucleotídeo que inclui pelo menos um contraíon de cátions multivalente pode ser formado num suporte de permuta iônica. Qualquer suporte conveniente de permuta iônica pode ser utilizado na etapa de contato. Em alguns casos, o suporte de permuta iônica é uma forte resina de permuta catiônica. Em algumas modalidades do método, a etapa de contato inclui eluir a primeira composição de polinucleotídeo a partir de um suporte de permuta de cátions que inclui contraíons de cátions multivalentes. Tal como utilizado neste documento, o termo "suporte de permuta catiônica" refere-se a um suporte que é ele próprio aniônico e é capaz de emparelhar íons com um analito catiônico, tal como um cátion multivalente de interesse. Qualquer eluente conveniente pode ser utilizado para a etapa de eluição do suporte de permuta catiônica. Em alguns casos, o precipitado se forma no eulate depois que o sal polinucleotídico foi eluído do suporte de permuta catiônica.
[0072] Os métodos do assunto podem ser realizados em qualquer preparação sintética bruta conveniente de um polinucleotídeo sintético alvo. Em alguns casos, a primeira composição polinucleotídica é uma preparação sintética bruta de um polinucleotídeo sintético alvo. Em certas modalidades, a primeira composição polinucleotídica é uma composição que é o produto da clivagem de um polinucleotídeo alvo a partir de um suporte, pós síntese. Como tal, a primeira composição polinucleotídica pode incluir uma variedade de produtos e agentes sintéticos não alvo. Os métodos em questão proporcionam a precipitação seletiva do sal de polinucleotídeo sobre produtos e agentes de síntese não alvo, que permanecem em solução e assim podem ser facilmente removidos do precipitado resultante.
[0073] Todos os métodos convenientes de síntese (por exemplo, como descrito neste documento) podem ser utilizados para sintetizar o polinucleotídeo alvo. Após a síntese, o polinucleotídeo alvo é clivado do suporte no qual as etapas de síntese são realizadas. Após a clivagem, o polinucleotídeo alvo de comprimento total pode ser purificado para remover reagentes indesejáveis de síntese e clivagem e remover fragmentos de polinucleotídeos não alvo e seus derivados. Os métodos de assunto que incluem a precipitação do sal polinucleotídico incluindo pelo menos um contraíon de cátions multivalente podem ser realizados em qualquer estágio conveniente da preparação de um polinucleotídeo alvo, tal como pós síntese e antes da purificação de cromatografia em fase reversa.
[0074] Tal como utilizado neste documento, os termos "preparação sintética bruta", "composição bruta" e "polinucleotídeo bruto" referem-se a uma composição que inclui os produtos sintéticos da síntese de polinucleotídeos em fase sólida que são recolhidos após síntese via clivagem a partir de um suporte de síntese de fase sólida, onde a composição é não purificada, isto é, não foi realizada purificação por cromatografia na composição. A cromatografia de purificação se refere a qualquer método conveniente que inclui a purificação de absorção de polinucleotídeo alvo a um suporte de cromatografia e subsequente eluição e resolução do polinucleotídeo alvo do polinucleotídeo não alvo. Em alguns casos, a purificação por cromatografia se refere a purificação por cromatografia de fase inversa.
[0075] Em algumas modalidades, o método inclui ainda o fornecimento de uma primeira composição polinucleotídica, em que a composição é produzida por clivagem pós-síntese a partir de um suporte de síntese de fase sólida. Quaisquer etapas adicionais convenientes, tais como etapas de evaporação, diluição ou concentração, também podem ser realizadas na preparação sintética em bruto antes da utilização da composição resultante nos métodos em questão. Em alguns casos, o método inclui ainda a síntese do polinucleotídeo alvo (por exemplo, como descrito neste documento no suporte de síntese em fase sólida). Em certas modalidades, o método inclui ainda a clivagem do polinucleotídeo a partir de um suporte para produzir a primeira composição polinucleotídica.
[0076] Um precipitado sólido que inclui o sal polinucleotídico pode ser separado da primeira composição polinucleotídica que é posta em contato com o sal multivalente (isto é, a primeira composição polinucleotídica contatada) utilizando qualquer método conveniente. Os métodos de separação de interesse incluem, mas não estão limitados a, centrifugação, filtração, decantação e semelhantes.
[0077] Em alguns casos, a separação do precipitado inclui o sal de polinucleotídeo é conseguida por centrifugação, em que a aplicação de uma força centrífuga à primeira composição de polinucleotídeo contatada, por exemplo, numa centrífuga, faz com que o precipitado forme um pélete, por exemplo, na parte inferior do recipiente. A formação de um pellet por centrifugação pode ser referida como centrifugação do precipitado. Em certas modalidades do método, a etapa de separação inclui a centrifugação da primeira composição de polinucleotídeo contatada para centrifugar o precipitado de sal de polinucleotídeo. O líquido sobrenadante pode então ser decantado do tubo sem perturbar o precipitado, ou retirado do recipiente, por exemplo, com uma pipeta de Pasteur. O processo de centrifugação pode ser repetido com uma solução de lavagem.
[0078] Em alguns casos, a separação do precipitado incluindo o sal polinucleotídico é conseguida por filtração. Em algumas modalidades do método, a etapa de separação inclui a filtração do sal polinucleotídico do primeiro polinucleotídeo contatado. Todos os filtros convenientes e meios filtrantes podem ser utilizados nos métodos do assunto. Em certos casos, a separação é conseguida por filtração em profundidade usando um meio de filtro que é selecionado de acordo com o polinucleotídeo alvo.
[0079] Em algumas modalidades, o método inclui fazer entrar em contato uma primeira composição polinucleotídica que inclui: um polinucleotídeo que possui uma sequência de 7 ou mais subunidades nucleosídicas e em que pelo menos duas das subunidades nucleosídicas são unidas por uma ligação inter-subunidade de tiofosforamidato N3'^P5'; e produtos e agentes sintéticos não alvo; com um sal de cátion multivalente para precipitar um primeiro sal de polinucleotídeo incluindo pelo menos um contraíon de cátions multivalente; e separar o primeiro sal de polinucleotídeo da primeira composição polinucleotídica em contato para produzir uma segunda composição polinucleotídica que inclui o sal polinucleotídico.
[0080] Separar o precipitado da primeira composição de polinucleotídeo contatada produz uma segunda composição polinucleotídica que inclui o primeiro sal polinucleotídico. Em alguns casos, a precipitação seletiva do primeiro sal polinucleotídico utilizando o sal catiônico multivalente através dos métodos sujeitos produz uma segunda composição polinucleotídica que inclui uma quantidade reduzida de produtos e agentes sintéticos não alvo.
[0081] Após a precipitação seletiva, os sais polinucleotídicos em questão podem então ser convertidos num sal polinucleotídico solúvel por troca de cátions do pelo menos um contraíon de cátions multivalente para longe do polinucleotídeo e substituição com outro contraíon de cátion de interesse (por exemplo, como descrito neste documento). Como tal, os métodos em questão proporcionam a formação reversível de um primeiro sal de polinucleotídeo incluindo pelo menos um contraíon de cátions multivalentes. Tal como utilizado neste documento, os termos "formação reversível" e "permuta reversível" são utilizados de forma intercambiável e referem-se à preparação de um sal de polinucleotídeo por, por exemplo, precipitação seletiva (por exemplo, como descrito neste documento), onde o sal formado também pode ser subsequentemente dissociado para permutar o pelo menos um sal de cátion multivalente do sal. Em alguns casos, os sais polinucleotídicos que são insolúveis em qualquer solvente podem ser referidos como sais formados irreversivelmente. Em algumas modalidades, o método inclui a troca do pelo menos um contraíon de cátions multivalente para fora do primeiro sal polinucleotídico para produzir um segundo sal polinucleotídico solúvel, onde a permuta inclui dissociar o contraíon de cátions multivalentes e o emparelhamento de íons com um cátion salino solúvel de interesse. Em certos casos, o segundo sal polinucleotídico solúvel é um sal monovalente. Em certos casos, o segundo sal polinucleotídico solúvel é um sal de sódio. Em certos casos, o segundo sal polinucleotídico solúvel é um sal de trietilamônio. Em alguns casos, o primeiro e o segundo polinucleotídeo são distintos um do outro, ou seja, incluem diferentes contrações de cátions. A dissociação dos sais polinucleotídicos em questão e a permuta do pelo menos um contraíon de cátions multivalentes pode ser conseguida utilizando-se quaisquer métodos convenientes. Em certos casos, a dissociação é conseguida usando cromatografia de fase reversa, por exemplo, como descrito neste documento. Em alguns casos, a cromatografia de permuta iônica pode ser utilizada para conseguir a dissociação. Em certas modalidades, a dissociação do primeiro sal polinucleotídico é conseguida por dissolução do sal num solvente, incluindo um contraíon catiônico de interesse.
[0082] Após a separação, podem ser realizadas outras etapas de purificação na segunda composição de polinucleotídeo. Em algumas modalidades, o método inclui ainda: fazer entrar em contato o primeiro sal polinucleotídico com um suporte de cromatografia de fase reversa; e eluir a partir do suporte de cromatografia uma terceira composição polinucleotídica que inclui um polinucleotídico. Em certas modalidades, a terceira composição polinucleotídica inclui um segundo sal polinucleotídico. Qualquer método de cromatografia em fase reversa conveniente pode ser utilizado para purificar o sal polinucleotídico. Os métodos de cromatografia de fase reversa e suportes de interesse incluem, entre outros, puridicação cromatográfica usando cromatografia de fase reversa de par de íon, cromatografia de fase reversa de C18 e aqueles métodos e suportes descritos por Chen et al., Journal of Chromatography A, Volume 1288, 3 de maio de 2013, Páginas 7381; e Zimmermann et al., Journal of Chromatography A, Volume 1354, 8 de agosto de 2014, páginas 43-55. Em algumas modalidades, a segunda composição polinucleotídica é carregada diretamente no suporte de cromatografia de fase reversa. Por carregado diretamente no suporte entende-se que a segunda composição polinucleotídica produzida usando o método em questão é adicionada diretamente, por exemplo, como um precipitado sólido isolado, ao suporte de cromatografia de fase reversa. Em alguns casos, o suporte de cromatografia em fase reversa é uma resina configurada como uma coluna e a composição polinucleotídica é adicionada ao topo do leito de resina. Em certas modalidades, o método inclui ainda a dissolução da segunda composição polinucleotídica em um solvente. Podem ser utilizados quaisquer solventes convenientes, incluindo, mas não limitado a, tampões aquosos, solventes orgânicos miscíveis com água e suas misturas. Nesses casos, uma solução da segunda composição polinucleotídica pode ser posta em contato com o suporte de cromatografia de fase reversa para absorver o polinucleotídeo no suporte antes da eluição.
[0083] Em alguns casos, o contato inclui absorver o polinucleotídeo no suporte de cromatografia de fase reversa e subsequentemente eluir o polinucleotídeo para proporcionar a resolução cromatográfica do polinucleotídeo alvo a partir de um polinucleotídeo não alvo e de agentes sintéticos residuais que estão presentes na composição. O oligonucleotídeo que contém o polinucleotídeo alvo é coletado. Todos os eluentes convenientes podem ser utilizados para eluir o polinucleotídeo do suporte de cromatografia de fase reversa. O eluente pode ser selecionado de acordo com uma variedade de fatores, como a natureza do suporte de cromatografia de fase reversa, o oligonucleotídeo alvo, os sais desejados particulares do polinucleotídeo alvo, etc. Em alguns casos, pelo menos um contraíon de cátions multivalentes do primeiro sal de polinucleotídeo é um íon permutado no suporte de cromatografia de fase reversa com outro contraíon de cátions distinto de interesse incluído no eluente. Em casos assim, quando o polinucleotídeo é eluído a partir do suporte de cromatografia de fase reversa, ele está em uma forma de sal diferente (isto é, um segundo sal polinucleotídico), que, quando foi carregado porque pelo menos um contraíon de cátions multivalentes do polinucleotídeo foi permutado. Em certos casos, a forma de sal do polinucleotídeo que é eluído do suporte na terceira composição polinucleotídica é mais solúvel em água do que o primeiro sal polinucleotídico, incluindo pelo menos um contraíon de cátions multivalentes.
[0084] Em certas modalidades, a terceira composição polinucleotídica inclui um segundo sal polinucleotídico que é um sal farmaceuticamente aceitável do polinucleotídeo. Em certos casos, a terceira composição inclui um segundo sal de polinucleotídeo que é um sal de cátions monovalentes do polinucleotídeo. Em certos casos, a terceira composição inclui um segundo sal polinucleotídico que é um sal de trietilamônio do polinucleotídeo. Em certos casos, a terceira composição inclui um segundo sal polinucleotídico que é um sal de sódio do polinucleotídeo. Entende-se que após o polinucleotídeo ser purificado por cromatografia de fase reversa, qualquer número de etapas adicionais de permuta de contraíons de cátions pode ser realizado no sal polinucleotídico a fim de produzir um sal desejado a partir do polinucleotídeo. Em algumas modalidades, o método inclui ainda a permuta iônica de contraíons de cátions do segundo sal polinucleotídico para produzir um terceiro sal polinucleotídico. Em certas modalidades, o terceiro sal polinucleotídico é um sal farmaceuticamente aceitável do polinucleotídeo. Em certos casos, o terceiro sal polinucleotídico é um sal de cátions monovalentes do polinucleotídeo. Em certos casos, o terceiro sal polinucleotídico é um sal de sódio do polinucleotídeo (por exemplo, como aqui descrito).
[0085] Em certos casos, a primeira composição inclui um sal de cátions monovalentes do polinucleotídeo. Em certos casos, o sal de cátions monovalentes é selecionado dentre o grupo que consiste em sódio, amônio e alquil amônio. Em certos casos, o alquil amônio é selecionado dentre o grupo que consiste em dimetilamônio, metilamônio, etilamônio e trietilamônio. Em certos casos, a primeira composição inclui um sal de amônio do polinucleotídeo. Em certos casos, a primeira composição inclui um sal de alquilamônio do polinucleotídeo. Em certos casos, a primeira composição inclui um sal de trietilamônio do polinucleotídeo. Em certos casos, a primeira composição inclui um sal de sódio do polinucleotídeo. A primeira composição polinucleotídica pode ser posta em contato com um sal catiônico multivalente para precipitar um primeiro sal polinucleotídico incluindo pelo menos um contraíon de cátions multivalentes. Dessa forma, em certas modalidades, a primeira composição polinucleotídica contatada inclui o primeiro sal polinucleotídico, incluindo pelo menos um contraíon de cátions multivalentes.
[0086] Considerados como sendo abrangidos no âmbito desta invenção estão as modalidades de qualquer uma das modalidades do método indicadas anteriormente, em que o polinucleotídeo é conforme descrito neste documento.
Métodos de síntese
[0087] Todos os métodos, estratégias e químicas de síntese de polinucleotídeos convenientes podem ser utilizados para preparar as composições de polinucleotídeos do produto sintético em bruto que encontram uso nos métodos de preparação em questão. As químicas de síntese dos polinucleotídeos e métodos de interesse que podem ser adaptados para utilização nos métodos em questão incluem, mas não estão limitados a, fosforamidita, H-fosfonato, fosfodiéster, fosfotriéster, fosfitotriéster. Os componentes polinucleotídicos dos compostos da invenção podem ser sintetizados por adaptação de protocolos convencionais para o tipo de química selecionado. Os métodos de interesse para a síntese de oligonucleotídeos que possuem produtos químicos de tiofosforamidato N3 '^ P5' incluem, mas não estão limitados aos métodos descritos nos documentos US 5.824.793, McCurdy et al., (1997) Tetrahedron Letters, 38: 207-210; Pongracz & Gryaznov, (1999) Tetrahedron Letters, 49: 7661-7664; US 6.835.826, US 7.494.982, US 7.485.717 e US 5.684.143.
[0088] Em alguns casos, um polinucleotídeo de interesse é sintetizado através de acoplamentos sequenciais a partir do terminal 5' e passando-se para o terminal 3' da sequência polinucleotídica alvo. Em certos casos, um polinucleotídeo de interesse é sintetizado através de acoplamentos sequenciais a partir do terminal 3' e passando-se para o terminal 5' da sequência polinucleotídica alvo. Em algumas modalidades, o polinucleotídeo é sintetizado por acoplamentos sequenciais de fosforamiditas de monômeros para o terminal de crescimento do polinucleotídeo. A subunidade de nucleosídeo de 5'-terminal pode ser ligada a qualquer suporte sólido conveniente através de um grupo de ligação opcional ou grupo 5'-terminal. Uma vez que a primeira subunidade está ligada ao suporte sólido, a subunidade pode ser desprotegida para produzir um grupo livre, imobilizado 3'-terminal. Em seguida, podem ser obtidos acoplamentos de subunidades para a cadeia de oligonucleotídeos de crescimento. Em alguns casos, o método inclui o acoplamento de um grupo de terminal 3' a um monômero de 5'-fosforamidita de nucleotídeo protegido em 3'. Em certas modalidades, o grupo de terminal 3' é um grupo 3'-hidroxil. Em certas modalidades, o grupo de terminal 3' é um grupo 3'-amino.
[0089] Em alguns casos, o método de síntese polinucleotídica inclui as etapas de: (a) desproteção do grupo amino 3' 'protegido de nucleosídeo terminal ligado a um suporte em fase sólida, referida desproteção formando um grupo amino 3' livre; (B) colocar em contato o grupo amino 3' com um monômero de aminonucleosídeo-5'-fosforamidita 3'-protegido, na presença de um catalisador de nucleófilo para formar uma ligação de fosforamidita N3‘^ P5‘; e (c) oxidar a ligação para produzir uma ligação de tiofosforamidato N3‘^ P5‘. Em algumas modalidades, o método inclui (d) repetir as etapas de (a) até (c) até o polinucleotídeo ser sintetizado.
[0090] Em alguns casos, o método inclui o acoplamento de um grupo 3'-terminal ligado a suporte com o dímero de 5'-fosforamidita do dinucleotídeo protegido em 3'. Os métodos de síntese de polinucleotídeos de interesse incluem, mas não estão limitados aos métodos de síntese de fase sólida, incluindo pelo menos um acoplamento de um dímero de dinucleotídeo conforme descrito na Publicação PCT No. WO2015/168310, cujo pedido reivindica o benefício do pedido provisório U.S. com o No. de série 61/987.396. A sequência do polinucleotídeo alvo pode ser sintetizada utilizando uma estratégia retrossintética que inclui acoplamento sequencial de ambas as subunidades de dímero e do monômero para o grupo 3' terminal da cadeia de oligonucleotídeos de crescimento. Em algumas modalidades, o polinucleotídeo é sintetizado pelo uso de um método que inclui ao menos um acoplamento de um dímero de dinucleotídeo ao grupo de terminal 3' livre de uma cadeia de polinucleotídeos de crescimento.
[0091] Em alguns casos, o método de síntese polinucleotídica inclui as etapas de: (a) desproteção do grupo amino 3' protegido de um nucleosídeo terminal ligado a um suporte em fase sólida, referida desproteção formando um grupo amino 3' livre; (b) colocar em contato o grupo amino 3' livre com um fiofosforamidato de amino-dinucleotídeo protegido em 3' ou um dímero de 5'-fosforamidita na presença de um catalisador de nucleófilo para formar uma ligação de fosforamidita N3'^ P5'; e (c) oxidar a ligação para produzir uma ligação de tiofosforamidato N3'^ P5'. Em algumas modalidades, o método inclui (d) repetir as etapas de (a) até (c) até o polinucleotídeo estar sintetizado, em que a etapa (b) é um dímero de amino-dinucleotídeo tiofosforamidato-5'-fosforamidita protegido em 3' ou um pode ser usado um monômero de amino-nucleotídeo-5'-fosforamidita protegida em 3'.
[0092] Quaisquer estratégias convenientes de grupos protetores pode ser utilizada nos métodos em questão para proteger os grupos de base, fosforamidita, fosforamidato, e os grupos 5', 2' e/ou 3' do polinucleotídeo. Os grupos protetores de interesse incluem, mas não estão limitados àqueles grupos protetores descritos por Ohkubo et al., Org. Lett., 2010, 12 (11), pp 2496-2499; e Beaucage e Iyer, Tetrahedron 48: 2223-2311 (1992).
[0093] Tal como aqui utilizado, o termo "grupo protetor de fosfato" refere-se a um grupo protetor que pode ser ligado a uma ligação de inter- subunidades contendo fósforo de um oligonucleotídeo. Quando presente, um grupo protetor de fosfato pode impedir (ou seja, bloquear) reação da ligação contendo fósforo no local em que o grupo protetor de fosfato está ligado. Quaisquer ligações convenientes contendo fósforo de intersubunidade (por exemplo, ligações P(III) e P(V)) podem ser protegidas pelos grupos fosfato sujeito protetores, incluindo, mas não se limitando a fosforamidita, oxofosforamidato, tiofosforamidato, éster de fosfato, éster de tiofosfato, ligações de fosfodiéster e semelhantes. O grupo protetor de fosfato pode ser ligado a um átomo de oxigénio disponível da ligação contendo fósforo de intersubunidade. Quaisquer grupos de proteção convenientes podem ser utilizados como um grupo protetor de fosfato. Em certas modalidades, um grupo protetor de fosfato é metil ou β-cianoetil.
[0094] Em alguns casos, o grupo de terminal 3' da cadeia polinucleotídica em crescimento pode incluir um grupo 3'-hidroxil, um grupo 3' -amino ou uma versão protegida sua. Quaisquer grupos protetores de hidroxil e/ou amino convenientes podem ser utilizados para o grupo determinal 3' durante a síntese dos polinucleotídeos. Em algumas formas de realização, o grupo de terminal 3' é um grupo 3'-amino protegido e o método inclui a desproteção ou remoção do grupo protetor para produzir um grupo 3' de amino livre. Tal como aqui utilizado, o termo "grupo amino livre" significa um grupo amino disponível para reação com o grupo fosforamidita de um monômero ou dímero que chega. Em algumas modalidades, um grupo amino livre é uma amina primária. Após o passo de desproteção (por exemplo, destritilação), o grupo amino pode estar na forma de um sal (por exemplo, o sal de uma base conjugada do ácido utilizado para a destritilação). Este sal pode, opcionalmente, ser neutralizado com uma solução de base tal como trietilamina a 2% em acetonitril ou piridina depois do passo de destritilação.
[0095] Proteção em 3' dos fosforamiditos de subunidades que chegam impede polimerização indesejável da cadeia. Em algumas formas de realização, o grupo de terminal 3' é um grupo 3'-hidroxil protegido e o método inclui a desproteção ou remoção do grupo protetor para produzir um grupo 3'-hidroxil livre. Em algumas modalidades, o grupo de terminal 3' é um grupo 3'-amino protegido e o método inclui a desproteção ou remoção do grupo protetor para produzir um grupo 3'-amino livre. O grupo 3'-amino ou 3'-hidroxil protegido pode ser protegido com um grupo protetor tritil. Em certas formas de realização, o grupo de proteção tritil é trifenilmetil (Tr ou Trt, Ph3C-). Em certas modalidades, o grupo de proteção tritil é 4,4'-dimetoxitritil (DMT). A desproteção do grupo amino ou hidroxil de terminal 3' pode ser conseguida utilizando quaisquer métodos convenientes. Os métodos de interesse incluem, mas não estão limitados aos métodos descritos por Beaucage e Iyer, Tetrahedron 48: 2223-2311 (1992). Em alguns casos, a desproteção do grupo 3' amino protegido de um nucleosídeo terminal inclui destritilação para produzir um grupo de terminal 3' livre, por exemplo, de destritilação catalisada por ácido. Em alguns casos, os fosforamiditos de subunidade de dímero ou monômero incluem um grupo 3 '-hidroxil ou 3' -amino protegido que é o mesmo que o grupo de terminal 3' do nucleosídeo terminal ligado ao suporte sólido.
[0096] Todos os suportes de fase sólida convenientes podem ser utilizados para a síntese de polinucleotídeos de acordo com os métodos em questão. Os suportes sólidos de interesse incluem, mas não estão limitados a micropartículas de vidro de poro controlado (CPG), poliestireno altamente reticulado (por exemplo, NittoPhase HL 400 ou GE Primer 350), copolímeros acrílicos, celulose, nylon, dextrano, látex, poliacroleína, e semelhantes, tais como os descritos nas referências seguintes exemplos: Meth. Enzymol., Seção A, páginas 1-147, vol.44 (Academic Press, Nova York, 1976); Patentes U.S. Nos 4.678.814.; 4.413.070; e 4046; 720; e Pon, Capítulo 19, em Agrawal, editor, Methods in Molecular Biology, Vol.20, (Humana Press, Totowa, NJ, 1993). Outros suportes de interesse incluem esferas de poliestireno; poliestireno enxertado com polietileno glicol (por exemplo, TentaGel ™, Rapp Polymere, Tübingen, Alemanha); e similares. A seleção das características de suporte, como material, porosidade, tamanho, forma e similares, e o tipo de unidade de ligação empregada depende de uma variedade de fatores, como grupos de proteção empregados, comprimento do produto final, quantidade de produto final e similares. Exemplos de frações de ligação são descritos em Pon et al, Biotechniques, 6: 768-775 (1988); Webb, Pat. U.S. No. 4.659.774; Barany et al., Pedido Internacional de Patente PCT/US91/06103; Brown et al., J. Chem. Soc. Commun, 1989: 891893; Damha et al., Nucleic Acids Research, 18: 3813-3821 (1990); Beattie et al., Clinical Chemistry, 39: 719-722 (1993); Maskos e Southern, Nucleic Acids Research, 20: 1679-1684 (1992); e similares.
[0097] Em algumas modalidades, os suportes sólidos que acham uso nos métodos em questão incluem CPG e poliestireno enxertado com polietilenoglicol e possuindo um grupo amino terminal (por exemplo, TentaGel-NH2™, Rapp Polymere, Tübingen, Alemanha). O grupo aminopropilo pode ser utilizado como espaçador entre CPG e a ligação nucleosídica. Em alguns casos, a ligação ao 5'-hidroxil do primeiro nucleosídeo é um grupo succinil que proporciona uma ligação de éster de base lábil que pode ser clivada após a síntese com amônia aquosa.
[0098] Após a desproteção, o nucleosídeo ligado ao suporte é capaz de reagir com uma subunidade de fosforamidita do dímero ou monômero para formar uma ligação internucleosídica. Entende-se que o nucleosídeo ligado ao suporte pode referir-se a um único resíduo ligado a um suporte sólido ou pode referir-se ao resíduo terminal de uma cadeia de oligonucleotídeo que é ligada ao suporte. Quaisquer química de acoplamento, reagentes e métodos convenientes de acoplamento podem ser utilizados nos presentes métodos. Qualquer seleção conveniente em relação das condições de acoplamento, grupos protetores, suportes de fase sólida, grupos de ligação, reagentes de desproteção, reagentes para clivar produtos a partir de suportes de fase sólida, purificação do produto, e semelhantes, podem ser feitas no contexto dos métodos em questão de acordo com a orientação, por exemplo, de Gait, editor, Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach (IRL Press, Oxford, 1984); Amarnath e Broom, Chemical Reviews, Vol. 77, pgs. 183-217 (1977); Pon et al., Biotechniques, Vol. 6, pp. 768-775 (1988); Ohtsuka et al., Nucleic Acids Research, Vol. 10, pp. 65536570 (1982); Eckstein, editor, Oligonucleotides, and Analogues: A Practical Approach (IRL Press, Oxford, 1991), Greene e Wuts "Protective Groups in Organic Synthesis", terceira edição, Wiley, Nova York 1999, Narang, editor, Synthesis and Applications of DNA and RNA (Academic Press, Nova York, 1987), Beaucage e Iyer, Tetrahedron 48: 2223-2311 (1992) e referências afins.
[0099] Em alguns casos, após o acoplamento, os grupos 3'-amino que não reagiram da cadeia em crescimento ligada ao suporte do polinucleotídeo podem ser opcionalmente protegidos com um agente de proteção conveniente antes do próximo passo de desproteção (por exemplo, a etapa de destritilação) para tornar inertes às etapas de ligação subsequentes. Esta etapa de proteção pode melhorar o perfil de HPLC da preparação para tornar mais fácil a purificação e podem também melhorar o rendimento global do produto. Reagentes de nivelamento úteis nos presentes métodos incluem reagentes eletrofílicos tais como anidrido acético e anidrido isobutírico, cloretos de ácido, tais como adamantil cloreto de carbonilo, cloreto de pivaoil, e semelhantes, isotiocianatos, cloroformatos, etc. Também são úteis fosforamiditos em conjunto com um ativador e seguido por oxidação, e sais de H-fosfonato de trietilamônio tais como isopropil-H-fosfonato usados em conjunto com um cloreto de ácido tal como cloreto de pivaoil ou cloreto de carbonil adamantil.
[0100] Em algumas modalidades, o método inclui a oxidação de ligação fosforamidito de um internucleosídeo N3'^ P5'. Tal como aqui utilizados, os termos "oxidar", "oxidação", "oxidante", e assim por diante, em referência a uma ligação internucleosídica contendo fósforo, um processo ou tratamento para converter o átomo de fósforo da ligação de um fósforo (III) forma uma forma de fósforo (V). A oxidação das ligações internucleotídicas pode ser executada em qualquer ponto conveniente na síntese utilizando quaisquer métodos convenientes. Em algumas modalidades, a oxidação é realizada de um modo passo a passo, por exemplo, durante cada ciclo de acoplamento. Em outras modalidades, a oxidação de várias ligações internucleotídicas é efetuada no final da síntese. Em alguns casos, uma ligação de fosforamidito oxidante N3'^ P5' (por exemplo, utilizando um agente oxidante com base de iodo/ água) produz uma ligação oxo- fosforamidato. Em outros casos, uma ligação fosforamidita oxidante N3'^ P5' inclui sulfurização para produzir uma ligação tiofosforamidato N3'^ P5'. A sulfuração pode ser realizada utilizando quaisquer métodos convenientes. Os métodos de extração de sulfato incluem aqueles descritos por Gryazonov et al., em WO2001018015 e US6, 114.519. Os agentes de sulfatação de interesse incluem, mas não estão limitados a, sulfureto elementar, dissulfuretos de tiuram, tais como o dissulfureto de tetraetiltiuram, os dissulfuretos de acil, tais como o sulfato de fenicidrato, o dissulfureto de fenil acetil, os dissulfuretos de fosfinotil, tais como S-Tetra™ e 1,1-dioxo-3H-1,2- benzoditiol-3-ona. Em algumas modalidades, a sulfatação pode ser realizada utilizando-se p dissulfureto de fenil acetil em 2,6-lutidina. Em certas modalidades, sulfurização pode ser realizada utilizando reagente de Beaucage, utilizando métodos como descrito por Iyer et al., J. Organic Chemistry 55:4693-4699, 1990.
[0101] A clivagem do polinucleotídeo do suporte de síntese em fase sólida pode ser atingida usando-se quaisquer métodos e reagentes convenientes, os quais podem ser selecionados dependendo de uma variedade de fatores, tais como a natureza do suporte, a química de ligação e a estratégia do grupo de proteção utilizada durante a síntese. As selecções feitas na síntese e clivagem de um polinucleotídeo alvo podem determinar as identidades dos produtos de síntese não alvo e do agente presentes na primeira composição polinucleotídica.
[0102] Em algumas modalidades, antes da clivagem, os grupos protetores de fósforo do polinucleotídeo são removidos para evitar a formação de adutores indesejáveis potenciais do grupo protetor clivado (por exemplo, o grupo protetor de β-cianoetil) com o polinucleotídeo. Os métodos de interesse que podem ser adaptados para utilização na desproteção e na clivagem de polinucleotídeos incluem aqueles descritos em U.S. 7.199.236. Em algumas modalidades, o polinucleotídeo é clivado do suporte usando uma solução de amônia para remover os grupos de proteção de base (por exemplo, grupos de proteção de amino exocíclicos) e quaisquer grupos protetores de fósforo remanescentes. Podem ser utilizadas quaisquer condições convenientes na reação de clivagem do polinucleotídeo. Em alguns casos, a clivagem é realizada a uma temperatura na faixa de 40-60 ° C. Em alguns casos, a clivagem é realizada durante um longo período de tempo, como um tempo na faixa de 12 a 24 horas. Após a clivagem do polinucleotídeo, o suporte pode então ser removido por filtração e enxaguado. As soluções combinadas do filtrado e do enxaguamento, que agora contêm a preparação sintética bruta do polinucleotídeo, podem ser utilizadas nos métodos de preparação em questão, antes de serem levadas adiante para outras etapas de purificação. Em alguns casos, a purificação de uma solução polinucleotídica inclui a cromatografia líquida de alto rendimento de fase reversa (RP-HPLC), por exemplo, pelo uso de Kromasil C18 a 4555°C. Em alguns casos, as composições polinucleotídicas dos métodos em questão podem passar por qualquer número de etapas de dessalinização e concentração convenientes, por exemplo, utilizando-se um aparelho de Filtração de Fluxo Tangencial (TFF) equipado com membranas de polietersulfona com um tamanho de corte de diâmetro de poro de 1000 Da.
COMPOSIÇÕES POLINUCLEOTÍDICAS
[0103] Os aspectos da presente divulgação incluem composições de sais polinucleotídicos, incluindo contraíons de cátions multivalentes. Em algumas modalidades, a composição inclui: um sal de um polinucleotídeo que inclui pelo menos um contraíon de cátions multivalentes, em que o polinucleotídeo tem uma sequência de 7 ou mais subunidades de nucleosídeos e pelo menos duas das subunidades nucleosídicas são unidas por uma ligação de inter-subunidades de tiofosforamidato N3 '^ P5'. Em certas modalidades, o polinucleotídeo inclui uma sequência de 7 ou mais subunidades de nucleosídeos complementares ao componente de RNA de telomerase humana.
[0104] Contraíons de cátions multivalentes
[0105] Todos os cátions multivalentes convenientes podem encontrar uso como contraíons nos sais polinucleotídicos em questão. Dessa forma, um cátion multivalente pode formar um par de íons com um local aniônico em uma estrutura de polinucleotídeos nas composições polinucleotídicas em questão. Os polinucleotídeos podem incluir subunidades de nucleosídeos ligadas por ligações de inter-subunidades contendo fósforo (por exemplo, ligações P(V)), como fosforamidato, tiofosforamidato, éster de fosfato, ligações de fosfodiéster e afins. Entende-se que as ligações de inter- subunidades do polinucleotídeo podem ser carregadas negativamente (por exemplo, em uma solução aquosa) e emparelhadas em íons com um contraíon catiônico. Essas ligações de inter-subunidades podem ser referidas como grupos aniônicos da estutura polinucleotidica.
[0106] Tal como aqui utilizado, o termo cátion multivalente refere-se a um cátion capaz de formar múltiplos pares de íons, por exemplo, um cátion carregado de múltiplas formas, como um cátion carregado duplamente ou triplamente. Qualquer cátion multivalente conveniente pode encontrar uso nas presentes composições de sais de polinucleotídeos. Em algumas modalidades, um íon de cátion multivamente é se une a dois ou mais grupos aniônicos adjacentes da estrutura polinucleotídica. Em algumas modalidades, um íon de cátion multivalente se une a um grupo aniônico da estrutura polinucleotídica. Em algumas modalidades, o contraíon de cátion multivalente é bivalente. Os contraíons de cátions bivalentes de interesse incluem, sem limitação, magnésio, zinco e cálcio. Em algumas modalidades, o contraíon de cátion multivalente é trivalente. Os contraíons de cátions trivalentes de interesse incluem, sem limitação, alumínio. Em determinadas modalidades da composição, pelo menos um contraíon de cátions multivalentes é selecionado do grupo que consiste em magnésio, zinco, alumínio e cálcio. Em certas modalidades da composição, pelo menos um contraíon de cátions multivalentes é o magnésio. Em certas modalidades da composição, pelo menos um contraíon de cátions multivalentes é zinco. Em certas modalidades da composição, pelo menos um contraíon de cátions multivalentes é alumínio. Em certas modalidades da composição, pelo menos um contraíon de cátions multivalentes é cálcio.
[0107] Entende-se que o número de contraíons de cátions que estão presentes no sal de polinucleotídeo depende de uma variedade de fatores, como o comprimento da estrutura polianiônica, a valência dos cátions nos sais, o pH da solução, a agregação dos polinucleotídeos da composição, etc. As composições em questão podem incluir pelo menos um contraíon de cátions multivalentes à estrutura dos polinucleotídeos polianiônicos nas composições polinucleotídicas em questão, como 2 ou mais, 3 ou mais, 4 ou mais, 5 ou mais, 6 ou mais, 7 ou mais, 8 ou Mais 9 ou mais, 10 ou mais, 15 ou mais, 20 ou mais, 30 ou mais, 40 ou mais, 50 ou mais, 100 ou mais ou mesmo mais contraíons de cátions multivalentes. Em certas modalidades, um polinucleotídeo com n subunidades nucleosídicas pode incluir entre 1 e (n-1)/2 (se n for um número inteiro ímpar) do(s) contraíon(s) bivalente(s) ou entre 1 e (n-2)/2 (se n for um númerointeiro ) do(s) contraíon(s) de cátion(s) bivalente(s). Em alguns casos, um sal polinucleotídico que inclui pelo menos um cátion multivamente pode incluir ainda uma variedade de outros contraíons de cátions, que podem ser monovalentes, bivalentes ou trivalentes. Em certos casos, n está na gama de 7 a 50, tal como de 7 a 40, 10 a 40, 10 a 30, 10 a 25, 10 a 20 ou na gama de 12 a 15 subunidades nucleosídicas.
[0108] Em algumas modalidades da composição, o sal de polinucleotídeo pode incluir 3% molar ou mais do contraíon de cátions multivalentes em relação a uma estrutura polianiônica do polinucleotídeo (isto é, em relação a uma inclusão máxima teórica de contraíons de cátions ao longo da estrutura polianiônica), como 4% molar ou mais, 5% molar ou mais, 6% molar ou mais, 7% molar ou mais, 8% molar ou mais, 9% molar ou mais, 10% molar ou mais, 11% molar ou mais, 12% molar ou mais, 13% molar ou mais, 14% molar ou mais, 15% molar ou mais, 16% molar ou mais, 17% molar ou mais, 18% molar ou mais, 19% molar ou mais, 20 % Molar ou mais, 25% molar ou mais, 30% molar ou mais, 35% molar ou mais, 40% molar ou mais, 45% molar ou mais, 50% molar ou mais, 55% molar ou mais, 60% molar ou mais ou ainda mais do contraíon de cátions multivalentes em relação a uma estrutura polianiônica do polinucleotídeo. Em algumas modalidades das composições em questão, o polinucleotídeo pode incluir 10% molar ou mais do contraíon de cátions multivalentes em relação a uma estrutura polianiônica do polinucleotídeo. Por exemplo, um sal de polinucleotídeo que inclui uma estrutura plianiônica de 10 ligações de subunidades inter-nucleósidas e inclui um emparelhamento de íons de contraíons de cátions divalentes com duas das ligações é descrito como incluindo 20% molar do contraíon de cátions divalentes. Se o contraíon de cátions bivalentes se juntar a apenas uma das ligações em vez de duas, o sal polinucleotídico é descrito como incluindo 10% molar do contraíon de cátions bivalentes. Desse modo, o valor % molar refere-se a um nível de ocupação da estrutura dos polinucleotídeos polianiônicos por parte dos contraíons de cátions multivalentes que encontra-se presentes no sal polinucleotídico. Por exemplo, um cátion de Mg2+ em um sal polinucleotídico de 13-meros com 12 ligações da subunidades internucleosídicas gera 16,7% molar de ocupação da estrutura. Entende-se que, em algumas modalidades, o sal polinucleotídico pode incluir locais adicionais de emparelhamento de íons nos terminais do polinucleotídeo (por exemplo, um grupo 5'-tiofosfato) e, se presentes, esses locais devem ser incluídos no valor de % molar do composto.
[0109] Em algumas modalidades da composição, o sal polinucleotídico inclui 90% molar ou menos do contraíon de cátions multivalentes em relação a uma estrutura polianiônica do polinucleotídeo, como 70% molar ou menos, 65% molar ou menos, 60% molar ou menos, 50% molar ou menos ou até menos do contraíon de cátions multivalentes.
[0110] Em certas modalidades da composição, o sal polinucleotídico inclui de 3 a 90% molar do contraíon de cátions multivalentes em relação a uma estrutura polianiônica do polinucleotídeo, como de 3 a 65% molar (por exemplo, de 6 a 50% molar, 10 a 50% molar ou 10 a 40% molar), 3 a 50% molar, 3 a 40% molar, 3 a 30% molar, 3 a 20% molar ou 3 a 15% molar do contraíon de cátions multivalentes em relação a uma estrutura polianiônica do polinucleotídeo.
[0111] Em certos casos da composição, o sal polinucleotídico inclui 3 a 60% molar de um contra-ião de catião divalente em relação a um esqueleto polianiônico do polinucleotídeo, tal como 3 a 50% molar (por exemplo, 5 a 50% molar) 3 a 40% molar, 3 a 30% molar, 3 a 20% molar, 3 a 15% molar, tal como 3-12% molar de um contraíon de cátions bivalentes.
[0112] Em certos casos da composição, o sal polinucleotídico inclui de 3 a 60% molar de um contraíon de cátions de magnésio em relação a uma estrutura polianiônica do polinucleotídeo, como magnésio, 5-50% molar, 540% molar, 10 -40% molar ou 20-40% molar de um contraíon de cátions de magnésio.
[0113] Em certos casos da composição, o sal polinucleotídico inclui de 10 a 70% molar de um contraíon de cátions trivalentes em relação a uma estrutura polianiónica do polinucleotídeo, tal como de 10 a 60% molar, 20 a 60% molar, 20 a 50 % molar ou 30 a 50% molar de um contraíon de cátions trivalentes. Em algumas modalidades da composição, o sal polinucleotídico inclui 0,5% ou mais em peso do contraíon de cátions multivalentes (por exemplo, magnésio), tal como 0,6% ou mais, 0,7% ou mais, 0,8% ou mais, 0,9% ou mais, 1,1% ou mais, 1,2% ou mais, 1,3% ou mais, 1,4% ou mais, 1,5% ou mais, 1,6% ou mais, 1,7% ou mais, 1,8% ou mais, 1,9% ou mais, 2,0% ou mais, 2,1% ou mais, 2,2% ou mais, 2,3% ou mais, 2,4% ou mais, 2,5% ou mais, 2,6% ou mais, 2,7% ou mais, 2,8% ou mais, 2,9% ou mais, 3,0% ou mais em peso do contraíon de cátions multivalentes.
[0114] O sal polinucleotídico é um sal misturado que inclui uma mistura de contraíons de cátions multivalentes e monovalentes. Em certas modalidades da composição, o sal polinucleotídico inclui uma proporção de contraíons de cátions multivalentes por contraíon de cátions monovalentes de pelo menos 0,05 ou mais por molaridade, tal como 0,10 ou mais, 0,15 ou mais, 0,20 ou mais, 0,25 ou mais, 0,30 ou mais, 0,35 ou mais, 0,40 ou mais, 0,45 ou mais, 0,50 ou mais, 0,55 ou mais, 0,60 ou mais, 0,65 ou mais, 0,70 ou mais por molaridade ou até mais de contraíons de cátions multivalentes por contraíons de cátions monovalentes.
[0115] Em alguns casos, o sal polinucleotídico inclui uma proporção de contraíons multivalentes por contraíons de cátions monovalentes de 1:12 por molaridade. Em alguns casos, o sal polinucleotídico inclui uma proporção de contraíons de cátions multivalentes por monovalentes de 1: 11 por molaridade. Em alguns casos, o sal polinucleotídico inclui uma proporção de contraíons de cátions multivalentes por monovalentes de 1: 10 por molaridade. Em alguns casos, o sal polinucleotídico inclui uma proporção de contraíons multivalentes por contraíons de cátions monovalentes de 1:9 por molaridade. Em alguns casos, o sal polinucleotídico inclui uma proporção de contraíons de cátions multivalentes por monovalentes de 1:8 por molaridade. Em alguns casos, o sal polinucleotídico inclui uma proporção de contraíons multivalentes por contraíons de cátions monovalentes de 1:7 por molaridade. Em alguns casos, o sal polinucleotídico inclui uma proporção de contraíons multivalentes por contraíons de cátions monovalentes de 1:6 por molaridade. Em alguns casos, o sal polinucleotídico inclui uma proporção de contraíons multivalentes por contraíons de cátions monovalentes de 1:5 por molaridade. Em alguns casos, o sal polinucleotídico inclui uma proporção de contraíons multivalentes por contraíons de cátions monovalentes de 1:4 por molaridade. Em alguns casos, o sal polinucleotídico inclui uma proporção de contraíons multivalentes por contraíons de cátions monovalentes de 2:9 por molaridade. Em alguns casos, o sal polinucleotídico inclui uma proporção de contraíons multivalentes por contraíons de cátions monovalentes de 3:7 por molaridade. Em alguns casos, o sal polinucleotídico inclui uma proporção de contraíons multivalentes por contraíons de cátions monovalentes de 4:5 por molaridade. Em alguns casos, o sal polinucleotídico inclui uma proporção de contraíons multivalentes por contraíons de cátions monovalentes de 5:3 por molaridade.
[0116] Em certos casos do sal polinucleotídico misturado, o contraíon de cátions multivalentes é o magnésio e o contraíon de cátions monovalentes é o sódio. Em certos casos do sal polinucleotídico misturado, o contraíon de cátions multivalentes é o magnésio e o contraíon de cátions monovalentes é o amônio. Em certos casos do sal polinucleotídico misturado, o contraíon de cátions multivalentes é o magnésio e o contraíon de cátions monovalentes é o trietilamônio. Em certos casos do sal polinucleotídico misturado, o contraíon de cátions multivalentes é o alumínio. Em certos casos do sal polinucleotídico misturado, o contraíon de cátions multivalentes é o zinco. Em certos casos do sal polinucleotídico misturado, o contraíon de cátions multivalentes é o cálcio. Em certos casos do sal polinucleotídico misturado, o contraíon de cátions monovalentes é o sódio. Em certos casos do sal polinucleotídico misturado, o contraíon de cátions monovalentes é o amônio. Em certos casos do sal polinucleotídico misturado, o contraíon de cátions monovalentes é o trietilamônio. Em certas modalidades, o sal polinucleotídico inclui um contraíon de cátions multivalentes. Em certas modalidades, o sal polinucleotídico inclui 2 contraíons de cátions multivalentes. Em certas modalidades, o sal polinucleotídico inclui 3 contraíons de cátions multivalentes. Em certas modalidades, o sal polinucleotídico inclui 4 contraíons de cátions multivalentes. Em certas modalidades, o sal polinucleotídico inclui 5 contraíons de cátions multivalentes. Em certas modalidades, o sal polinucleotídico inclui 6 contraíons de cátions multivalentes. Em certas modalidades, o sal polinucleotídico inclui 7 contraíons de cátions multivalentes. Em certas modalidades, o sal polinucleotídico inclui 8 contraíons de cátions multivalentes. Em certas modalidades, o sal polinucleotídico inclui 9 contraíons de cátions multivalentes. Em certas modalidades, o sal polinucleotídico inclui 10 contraíons de cátions multivalentes.
[0117] Além de um polinucleotídeo alvo, uma variedade de produtos de síntese de polinucleotídeos não alvo podem ser produzidos durante a síntese de polinucleotídeos. Produtos de menor importância que podem estar presentes nas preparações de polinucleotídeos incluem, mas não estão limitados aos produtos de eliminação (por exemplo, produtos que não têm um ou mais resíduos de nucleosídeo), produtos que incluem um ou mais grupos protetores, produtos terminados (por exemplo, produtos que incluem uma cadeia de polinucleotídeo coberto), os produtos que não possuem um ou mais nucleobases, produtos que incluem ligações fosforamidito parcialmente oxidados e produtos que incluem ligações parcialmente sulfuradas.
[0118] Os métodos em questão proporcionam composições que incluem uma pureza melhorada do polinucleotídeo alvo da composição. Em algumas modalidades, a composição inclui 20% ou mais em peso do polinucleotídeo alvo, tal como 25% ou mais, 30% ou mais, 35% ou mais, 40% ou mais, 45% ou mais, 50% ou mais, 60% ou mais, 70% ou mais, 80% ou mais, 90% ou mais ou mesmo 95% ou mais em peso do polinucleotídeo alvo. Em certas modalidades, a composição inclui 50% ou mais em peso do polinucleotídeo alvo. Em certas modalidades, a composição inclui 55% ou mais em peso do polinucleotídeo alvo. Em certas modalidades, a composição inclui 60% ou mais em peso do polinucleotídeo alvo. Em certas modalidades, a composição inclui 65% ou mais em peso do polinucleotídeo alvo. Em certas modalidades, a composição inclui 70% ou mais em peso do polinucleotídeo alvo. Em certas modalidades, a composição inclui 75% ou mais em peso do polinucleotídeo alvo. Em certas modalidades, a composição inclui 80% ou mais em peso do polinucleotídeo alvo. Em certas modalidades, a composição inclui 85% ou mais em peso do polinucleotídeo alvo. Em certas modalidades, a composição inclui 90% ou mais em peso do polinucleotídeo alvo. Em certas modalidades, a composição inclui 95% ou mais em peso do polinucleotídeo alvo.
[0119] Os métodos em questão proporcionam composições incluindo uma quantidade reduzida de produtos e agentes de síntese não alvo. Por quantidade reduzida, entende-se que a quantidade em peso dos produtos e agentes de síntese não alvo na composição é reduzida em relação a um método de controle. Em algumas modalidades, as composições em questão incluem produtos e a gentes de síntese não alvo em uma quantidade de 50% ou menos dos polinucleotídeos nãoalvo totais na composição, por exemplo: 40% ou menos, 30% ou menos, 25% ou menos, 20%> ou menos, 15%> ou menos, 10%> ou menos ou mesmo 5% ou menos dos produtos e agentes de síntese não alvo.
[0120] Qualquer uma dentre uma grande variedade de composições polinucleotídicas pode ser preparada usando os métodos aqui descritos. Uma variedade de classes e tipos de polinucleotídeos são de interesse para a preparação utilizando os presentes métodos (por exemplo, tal como aqui descrito). Os polinucleotídeos adequados para a preparação de acordo com os métodos em questão incluem, mas não estão limitados a, polinucleotídeos antisense, polinucleotídeos de RNA, polinucleotídeos de siRNA, polinucleotídeos de RNAi, aptâmeros de DNA, micro RNA e afins.
[0121] Em algumas modalidades, o polinucleotídeo é descrito pela Fórmula (I):
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Fórmula (I) onde: cada B é, independentemente, purina, purina protegida, pirimidina ou uma dina protegida ou um análogo seu; cada X é, independentemente, oxigênio ou enxofre; cada R3 é, independentemente, hidrogênio, fluoro, hidroxil, um alcoxi, um alcoxi substituído ou um grupo hidroxil protegido; R6 é amino, hidroxil, amino protegido, hidróxi protegido, -O-T-Z ou - NH-T- cada T é independentemente um ligante opcional; cada Z é, independentemente H, um lipídio, um transportador, um oligonucleotídeo, um polímero, um polipeptídeo, um marcador detectável ou uma etiqueta; e n é um número inteiro de 1 a 1000. Entende-se que os oligonucleotídeos de Fórmula (I) podem existir na forma de sal. Como tal, as ligações de internucleosídeos da Fórmula (I) pode estar numa forma de sal que inclui qualquer contraíon conveniente. Essas formas destinam-se a ser incluídas no âmbito da presente divulgação. Entende-se que podem ser possíveis outras disposições tautoméricas das ligações internucleósidas do polinucleotídeo descrito na Fórmula (I). Essas formas destinam-se a ser incluídas no âmbito da presente divulgação.
[0122] Em algumas modalidades da fórmula (I), cada R3 é hidrogênio. Em algumas modalidades da Fórmula (I), cada R3 é flúor. Em algumas modalidades da Fórmula (I), cada R3 é hidroxil. Em algumas modalidades da Fórmula (I), R6 representa um amino. Em certas modalidades da Fórmula (I), R6 é hidroxil. Em algumas modalidades da Fórmula (I), o símbolo Z representa H. De acordo com algumas modalidades da Fórmula (I), Z é um lípido (por exemplo, tal como aqui descrito). Em certos casos, o lipídio é um ácido graxo (por exemplo, tal como aqui descrito). Em algumas modalidades da Fórmula (I), Z é um transportador. Em algumas modalidades da Fórmula (I), Z é um oligonucleotídeo. Em algumas modalidades da Fórmula (I), Z é um polímero. Em certos casos, o polímero é um PEG. Em algumas modalidades da Fórmula (I), Z é um polipeptídeo. Em algumas modalidades da Fórmula (I), Z é uma etiqueta detectável. Em algumas modalidades da Fórmula (I), Z é uma etiqueta. Em algumas modalidades da Fórmula (I), T está ausente. Em algumas modalidades, cada B é selecionado independentemente a partir de A, C, G, T e U.
[0123] Em certas modalidades da Fórmula (I), n é um número inteiro entre 7 e 500, como entre 7 e 100, entre 7 e 75, entre 7 e 50, entre 7 e 40, entre 7 e 30, entre 7 e 20, entre 7 e 15, entre 10 e 15 ou entre 13 e 15. Em certas modalidades, n é um número inteiro de entre 7 e 100, tal como entre 7 e 50, entre 10 e 50, entre 10 e 40, entre 10 e 30, entre 10 e 25, entre 10 e 20, entre 12 e 18 ou entre 12 e 16. Em certas modalidades, n é 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 ou 25.
[0124] Polinucleotídeos complementares ao componente de RNA da telomerase
[0125] Os aspectos da divulgação incluem compostos e composições que incluem polinucleotídeos complementares ao componente de RNA da telomerasa humana e métodos para a sua preparação. Os compostos podem inibir a actividade da telomerase em células com uma potência elevada e têm características de captação celular.
[0126] Em certos casos, o polinucleotídeo inclui uma sequência de 7 ou mais subunidades de nucleosídeos complementares ao componente de RNA da telomerase humana, como 8 ou mais, 9 ou mais, 10 ou mais, 11 ou mais, 12 ou mais, 13 ou mais, 14 ou mais, 15 ou mais, 20 ou mais, 30 ou mais, 50 ou mais subunidades de nucleosídeos complementares ao componente de RNA da telomerase humana.
[0127] Em algumas modalidades, o polinucleotídeo inclui entre 3 e 50 subunidades contíguas nucleosídeos complementares ao componente de RNA de telomerase humana, tal como entre 5 e 40, entre 7 e 40, entre 10 e 40, entre 10 e 30, entre 10 e 25, entre 10 e 20, ou entre 12 e 15 subunidades de nucleosídeos. Em certas modalidades, o polinucleotídeo inclui uma sequência de 7 ou mais subunidades de nucleosídeos complementares ao componente de RNA da telomerase humana, como 10 ou mais, 11 ou mais, 12 ou mais, 13 ou mais, 14 ou mais, 15 ou mais, 20 ou mais, 30 ou mais, 50 ou mais subunidades de nucleosídeos contíguos ao componente de RNA da telomerase humana.
[0128] Em algumas modalidades, o polinucleotídeo é um composto descrito pela fórmula: O-(x-L)n em que O representa o oligonucleotídeo, incluindo uma sequência de subunidades de nucleosídeos complementares ao componente de RNA de telomerase humana, x é um grupo ligante opcional, L representa o radical lipídico e n é um número inteiro de 1-5. Em alguns casos, n é 5. Em alguns casos, n é 4. Em alguns casos, n é 3. Em alguns casos, n é 2. Em alguns casos, n é 1. A concepção dos compostos, portanto, requer a seleção de duas entidades, O e L, e a determinação da ligação estrutural (s) entre essas entidades, as quais podem envolver o grupo ligante opcional x.
[0129] Em algumas modalidades, o composto polinucleotídico pode ser descrito pela fórmula: O-(x-L)n em que O representa o polinucleotídeo, incluindo uma sequência de subunidades de nucleosídeos complementares ao componente de RNA de telomerase humana, x é um grupo ligante opcional, L representa o radical lipídico e n é 1, tal como um polinucleotídeo da Fórmula (I), ou um seu sal destes, em que na Fórmula (I), Z é o radical lipídico, T é o ligante opcional (por exemplo, conforme descreve-se aqui) e os grupos B correspondem à sequência das subunidades de nucleosídeos complementares ao componente de RNA de telomerase humana.
[0130] O componente polinucleotídico O pode ser considerado como o componente "efetor" do composto em que é este componente que faz a inibição da enzima telomerase por ligação ao componente de RNA da telomerase. Assim, a sequência de O é selecionada de tal forma que inclua uma região complementar à sequência do RNA da telomerase, que é mostrada na SEQ ID NO:1. A região que é complementar ao componente de RNA da telomerase pode, em teoria, ser direcionada a qualquer porção do RNA da telomerase, mas regiões particulares do RNA da telomerase são os alvos preferidos para os polinucleotídeos inibitórios. Uma região de alvo preferida é a região que mede os nucleotídeos 30-67 da SEQ ID NO: 1, que inclui a "região modelo", uma região de 11 nucleotídeos da sequência 5'- CUAACCCUAAC-3' (SEQ ID NO: 21) que abrange o nucleotídeo 46-56 da SEQ ID NO: 1. As funções de região modelo para especificar a sequência de telomérica repete que a telomerase adiciona às extremidades do cromossoma e é essencial para a atividade da enzima telomerase (ver Chen et al., Cell 100:503-514, 2000; Kim et al., Proc. Natl. Acad. Sci., EUA 98(14):7982-7987, 2001). Os compostos de interesse que contêm uma porção polinucleotídica que inclui uma sequência complementar à toda ou parte da região do modelo são, portanto, de interesse. Outra região alvo de interesse é a região que abrange os nucleotídeos 137-179 da hTR (ver Pruzan et al., Nucl. Acids Research, 30:559-588, 2002). Dentro desta região, a sequência que abrange 141-153 é um alvo preferencial. A publicação PCT WO 98/28442 descreve o uso de polinucleotídeos de pelo menos 7 polinucleotídeos de comprimento para inibir a telomerase, onde os oligonucleotídeos são projetados para serem complementares às partes acessíveis da sequência de hTR fora da região modelo, incluindo os nucleotídeos 137-196, 290-319, e 350-380 da hTR.
[0131] A região de O que é direcionada para a sequência hTR é, em alguns casos, exatamente complementar à sequência hTR correspondente. Embora incompatibilidades possam ser toleradas em determinados casos, espera-se que elas diminuam a especificidade e atividade do conjugado de polinucleotídeo resultante. Em algumas modalidades, a sequência da bases do polinucleotídeo O é assim selecionada para incluir uma sequência de pelo menos 5 nucleotídeos exatamente complementares ao RNA telomerase, e a inibição aumentada da telomerase pode ser obtida se comprimentos crescentes da sequência complementar forem empregados, tais como pelo menos 6, pelo menos 7, pelo mens 8, pelo menos 10, pelo menos 12, pelo menos 13 ou pelo menos 15 nucleotídeos exatamente complementares ao RNA da telomerase. Em outras modalidades, a sequência do oligonucleotídeo inclui uma sequência de pelo menos 7 a 20, de pelo menos 8 a 20, de pelo menos 10 a 20 ou de pelo menos 10 a 15 nucleotídeos exatamente complementares à sequência de RNA da telomerase. A atividade inibitória ótima da telomerase pode ser obtida quando o comprimento total do polinucleotídeo O é selecionado para ser complementar à sequência de RNA da telomerase. No entanto, não é necessário que o comprimento total do componente polinucleotídeo é exatamente complementar à sequência alvo, e a sequência do polinucleotídeo pode incluir regiões que não são complementares à sequência alvo. Tais regiões podem ser adicionadas, por exemplo, para conferir outras propriedades ao composto, tal como sequências que facilitam a purificação. Se o componente polinucleotídeo O deve incluir as regiões que não são complementares à sequência alvo, tais regiões podem ser posicionadas em ou em ambos os terminais 5' ou 3'. Nos casos em que a região de complementaridade exata para a região-alvo for o modelo, a inibição da telomerase eficaz pode ser alcançada com uma região curta (5-8 nucleotídeos) de complementaridade exata para a qual uma sequência semelhante de telomerase (rico em G) é unida à extremidade 5'.
[0132] Exemplos de sequências que são complementares ao RNA de telomerase humana e que pode ser incluída como parte do componente polinucleotídeo O, ou o qual pode ser usado como componente de todo o polinucleotídeo O incluem o seguinte: sequências complementares de hTR (regiões da sequência polinucleotídica da SEQ ID NO:1, da Publicação U.S. 2012329858); GGGUUGCGGA GGGUGGGCCU GGGAGGGGUG GUGGCCAUUU UUUGUCUAAC CCUAACUGAG AAGGGCGUAG GCGCCGUGCU UUUGCUCCCC GCGCGCUGUU UUUCUCGCUG ACUUUCAGCG GGC GG A A A AG CCUCGGCCUG CCGCCUUCCA CCGUUCAUUC UAGAGCAAAC AAAAAAUGUC AGCUGCUGGC CCGUUCGCCC CUCCCGGGGA CCUGCGGCGG GUCGCCUGCC CAGCCCCCGA ACCCCGCCUG GAGGCCGCGG UCGGCCCGGG GCUUCUCCGG AGGCACCCAC UGCCACCGCG AAGAGUUGGG CUCUGUCAGC CGCGGGUCUC UCGGGGGCGA GGGCGAGGUU CAGGCCUUUC AGGCCGCAGG A AG AGG A AC G GAGCGAGUCC CCGCGCGCGG CGCGAUUCCC UGAGCUGUGG GACGUGCACC CAGGACUCGG CUCACACAUG C (SEQ ID NO: 1) GC TC T AGA ATGA AC GGTGGA AGGC GGC AGG 137-166 (SEQ ID NO: 2) GTGGAAGGCGGCAGG 137-151 (SEQ ID NO: 6) GGA AGGC GGC AGG 137-149 (SEQ ID NO: 7) GTGGAAGGCGGCA 139-151 (SEQ ID NO: 8) GTGGAAGGCGG 141-151 (SEQ ID NO: 9) CGGTGGAAGGCGG 141-153 (SEQ ID NO: 10) ACGGTGGAAGGCG 142-154 (SEQ ID NO: 11) AACGGTGGAAGGCGGC 143-155 (SEQ ID NO: 12) ATGAACGGTGGAAGGCGG 144-158 (SEQ ID NO: 13) ACATTTTTTGTTTGCTCTAG 160-179 (SEQ ID NO: 14) TAGGGTTAGACAA 42-54 (SEQ ID NO: 3) GTTAGGGTTAG 46-56 (SEQ ID NO: 4) GTTAGGGTTAGAC 44-56 (SEQ ID NO: 15) GTTAGGGTTAGACAA 42-56 (SEQ ID NO: 16) GGGTTAGAC 44-52 (SEQ ID NO: 19) CAGTTAGGG 50-58 (SEQ ID NO: 20) CCCTTCTCAGTT 54-65 (SEQ ID NO: 17) CGCCCTTCTCAG 56-67 (SEQ ID NO: 18)
[0133] Em algumas modalidades, o polinucleotídeo inclui uma sequência selecionada dentre o grupo que consiste em: GTTAGGGTTAG (SEQ ID NO:4); TAGGGTTAGACAA (SEQ ID NO:3); e CAGTTAGGGTTAG (SEQ ID NO:5).
[0134] A escolha do tipo de ligação inter-nucleosídica utilizada na síntese do componente O pode ser feita a partir de qualquer das substâncias químicas de polinucleotídeos disponíveis, incluindo, sem limitação, fosfodiéster, fosfotriéster, metilfosfonato, fosforamidato P3'^N5‘, fosforamidato N3'^P5', tiofosforamidato N3'^P5' e ligações de fosforotioato. Em algumas modalidades, o componente polinucleotídico O tem pelo menos uma ligação de tiofosforamidato N3'^P5'. Em determinadas modalidades, as subunidades do nucleosídeo complementares ao componente de RNA da telomerase humana são todas unidas pelas ligações entre subunidades de tiofosforamidato N3'^ P5'. Em certos casos, a ligação de inter-subunidades de tiofosforamidato N3'^ P5' tem a seguinte estrutura: 3 '— NH— P(S)(OR)— O— 5 ' em que R é hidrogénio ou um sal seu. Entende-se que para qualquer um dos componentes oligonucleotídicos O aqui descritos, que inclui uma ligação de inter-subunidades, tais componentes polinucleotídicos O também podem incluir qualquer forma de sal conveniente da ligação. Desse modo, a ligação de inter-subunidades podem estar numa forma de sal que inclui qualquer contraíon conveniente.
[0135] Em algumas modalidades, pelo menos duas das subunidades de nucleosídeos são unidas por uma ligação de subunidades de tiofosforamidato N3'^P5‘ e as outras ligações de inter-subunidadessão selecionadas, cada, independentemente, a partir do oxo-fosforamidato N3'^P5‘ e ligações de inter-subunidades de tiofosforamidato N3'^P5'. Em algumas modalidades, as subunidades nucleosídicas são unidas por ligações inter-subunidades, cada uma independentemente selecionada a partir de ligações de oxo-fosforamidato N3'^P5' e ligações de inter- subunidades de tiofosforamidato N3'^P5'. Em algumas modalidades, as subunidades nucleosídicas são unidas por ligações de inter-subunidades, cada uma independentemente selecionada a partir de ligações de oxo- fosforamidato N3'^P5' e de ligações de inter-subunidades de tiofosforamidato N3'^P5'; contanto que pelo menos duas das subunidades nucleosídicas sejam unidas por uma ligação de inter-subunidades de tiofosforamidato N3'^P5'. Em algumas modalidades, as subunidades de nucleosídeos são unidas por ligações de inter-subunidades de tiofosforamidato N3'^P5'.
[0136] Em algumas modalidades, o componente polinucleotídico O tem a sequência TAGGGTTAGACAA (SEQ ID NO: 3), e as subunidades nucleosídicas são unidas por ligações entre subunidades compreendendo pelo menos uma ligação de tiofosforamidato N3 '^ P5'. Em algumas modalidades, o componente polinucleotídico O tem a sequência TAGGGTTAGACAA (SEQ ID NO: 3), e as subunidades nucleosídicas são unidas por ligações entre subunidades compreendendo pelo menos uma ligação de tiofosforamidato N3 '^ P5'. Em algumas modalidades, o componente polinucleotídico O tem a sequência TAGGGTTAGACAA (SEQ ID NO: 3), e as subunidades nucleosídicas são unidas por ligações entre subunidades compreendendo pelo menos uma ligação de tiofosforamidato N3'^ P5'. Em algumas modalidades, o componente polinucleotídico O tem a sequência TAGGGTTAGACAA (SEQ ID NO: 3), e as subunidades nucleosídicas são unidas por ligações entre subunidades compreendendo pelo menos quatro ligações de tiofosforamidato N3 '^ P5'. Em algumas modalidades, o componente polinucleotídico O tem a sequência TAGGGTTAGACAA (SEQ ID NO: 3), e as subunidades nucleosídicas são unidas por ligações entre subunidades compreendendo pelo menos cinco ligações de tiofosforamidato N3 '^ P5'. Em algumas modalidades, o componente polinucleotídico O tem a sequência TAGGGTTAGACAA (SEQ ID NO: 3), e as subunidades nucleosídicas são unidas por ligações entre subunidades compreendendo pelo menos seis ligações de tiofosforamidato N3 '^ P5'. Em algumas modalidades, o componente polinucleotídico O tem a sequência TAGGGTTAGACAA (SEQ ID NO: 3), e as subunidades nucleosídicas são unidas por ligações entre subunidades compreendendo pelo menos sete ligações de tiofosforamidato N3 '^ P5'. Em algumas modalidades, o componente polinucleotídico O tem a sequência TAGGGTTAGACAA (SEQ ID NO: 3), e as subunidades nucleosídicas são unidas por ligações entre subunidades compreendendo pelo menos oito ligações de tiofosforamidato N3'^P5'. Em algumas modalidades, o componente polinucleotídico O tem a sequência TAGGGTTAGACAA (SEQ ID NO: 3), e as subunidades nucleosídicas são unidas por ligações entre subunidades compreendendo pelo menos nove ligações de tiofosforamidato N3'^P5'. Em algumas modalidades, o componente polinucleotídico O tem a sequência TAGGGTTAGACAA (SEQ ID NO: 3), e as subunidades nucleosídicas são unidas por ligações entre subunidades compreendendo pelo menos dez ligações de tiofosforamidato N3'^P5'. Em algumas modalidades, o componente polinucleotídico O tem a sequência TAGGGTTAGACAA (SEQ ID NO: 3), e as subunidades nucleosídicas são unidas por ligações entre subunidades compreendendo pelo menos onze ligações de tiofosforamidato N3'^P5'. Em algumas modalidades, o componente polinucleotídico O tem a sequência TAGGGTTAGACAA (SEQ ID NO: 3), e as subunidades nucleosídicas são unidas por ligações entre subunidades cada uma independentemente selecionada a partir de ligações entre subunidades de oxo-fosforamidato N3’ ^ P5’ e tiofosforamidato N3'^P5'. Em algumas modalidades, o componente polinucleotídico O tem a sequência TAGGGTTAGACAA (SEQ ID NO: 3), e as subunidades nucleosídicas são unidas por ligações entre subunidades cada uma independentemente selecionada a partir de ligações entre subunidades de oxo-fosforamidato N3’ ^P5’ e tiofosforamidato N3'^ P5'; desde que pelo menos duas das subunidades nucleosídicas sejam unidas por uma ligação entre subunidades de tiofosforamidato N3'^P5'. Em algumas modalidades, o componente polinucleotídico O tem a sequência TAGGGTTAGACAA (SEQ ID NO: 3), e as subunidades nucleosídicas são todas unidas por ligações entre subunidades de tiofosforamidato N3'^P5'.
[0137] Em todas as modalidades anteriores e seguintes, ligações entre subunidades de tiofosforamidato N3'^P5', em particular, são — NH— P(=O)(SH)— O— ou um tautômero ou um sal do mesmo; e ligações entre subunidades de oxo-fosforamidato N3’ ^P5’, em particular, são — NH— P(=O)(OH)— O— ou um tautômero ou sal do mesmo. Mais em particular, em todas as modalidades descritas neste documento e a seguir, ligações entre subunidades de tiofosforamidato de N3'^P5', em particular, são — NH— P(=O)(SH)— O— ou um tautômero ou sal de sódio do mesmo; e ligações entre subunidades de oxo-fosforamidato N3'^P5', em particular, são — NH— P(=O)(OH)— O— ou um tautômero ou sal de sódio do mesmo.
[0138] Em uma das modalidades, a invenção refere-se a qualquer uma das estruturas específicas descritas neste documento, em que, opcionalmente, uma ou mais, em particular uma, ligações entre subunidades de tiofosforamidato N3'^P5' são substituídas por ligações entre subunidades de oxo-fosforamidato N3'^P5'. Em uma das modalidades, a invenção refere- se a qualquer uma das estruturas específicas descritas neste documento, em que uma ou mais, em particular uma, ligações entre subunidades de tiofosforamidato N3'^P5‘ são substituídas por ligações entre subunidades de oxo-fosforamidato N3'^P5'.
[0139] Em alguns casos, os compostos em questão são mais eficazes em produzir inibição de telomerase em células do que nucleotídeos correspondentes que não são conjugados à componentes lipídicos. Acredita- se que o componente lipídico L funcione para aumentar a absorção celular do composto, particularmente, no sentido de facilitar a passagem através da membrana celular. Embora o mecanismo pelo qual isto ocorre ainda não foi totalmente elucidado, uma possibilidade é que o componente lipídico pode facilitar a ligação do composto para a membrana celular, quer como uma única molécula, ou uma sua forma agregada (micelar), com subsequente internalização. No entanto, a compreensão do mecanismo exato não é necessária para os compostos em questão a serem utilizados.
[0140] O componente lipídico pode ser qualquer lipídio ou derivado de lipídio que proporciona absorção celular melhorada ao polinucleotídeo não modificado. Lipídios de interesse incluem, mas não estão limitados a, hidrocarbonetos, gorduras (por exemplo, glicerídeos, ácidos graxos e derivados de ácido graxo, tais como amidas graxos) e esteróis. Quando o componente de lípidos é um hidrocarboneto, o componente L pode ser um hidrocarboneto cíclico substituído ou não substituído ou uma cadeia linear alifática ou hidrocarboneto ramificado, que pode ser saturado ou insaturado. Exemplos incluem hidrocarbonetos não ramificados de cadeia linear que estão completamente saturados ou poli-insaturados. O comprimento da cadeia de hidrocarboneto pode variar de C2-C30, mas a inibição da telomerase ótima pode ser obtida com cadeias de carbono que são C8-C22. Exemplos de hidrocarbonetos saturados (alcanos) estão listados abaixo: Nome sistemático/Cadeia de carbono Tetradecano C14H30 Pentadecano C15H32 Hexadecano C16H34 Heptadecano C17H36 Octadecano C18H38 Nonadecano C19H40 Eicosano C20H42
[0141] Formas mono- e poli-insaturadas (alcenos e polienos, tais como alcadienos e alcatrienos) de hidrocarbonetos também podem ser selecionados, com compostos possuindo uma a três ligações duplas sendo de interesse, embora o composto tendo mais ligações duplas pode ser usado. Alquinos (contendo uma ou mais ligações triplas) e alqueninos (ligação tripla(s) e ligação(s) dupla) também podem ser utilizados.
[0142] As formas substituídas de hidrocarbonetos podem ser utilizadas nos compostos em questão, com grupos substituintes que são inertes in vivo e in vitro sendo de interesse. Em alguns casos, o substituinte é flúor. Exemplos de estruturas genéricas de hidrocarbonetos polifluorados incluem: CF3(CF2)n— (CH2)m- onde m é pelo menos 1, em alguns casos pelo menos 2, e n é 1 a 30, tal como fluorotridecano: CF3(CF2)9(CH2)3; e CH3(CH2)a(CF2)b(CH2)c- onde a, b e c são independentemente 1-30.
[0143] Outros componentes lipídicos adequados de interesse incluem, mas não estão limitados a, ácidos graxos simples e derivados de ácidos graxos, glicerídeos e lipídios mais complexos tais como esteróis, por exemplo, colesterol. Ácidos graxos e seus derivados podem ser totalmente saturados ou mono- ou poli-insaturados. O comprimento da cadeia de carbono pode variar de C2-C30, mas a inibição da telomerase ótima pode ser obtida com cadeias de carbono que são C8-C22. Exemplos de ácidos graxos saturados estão listados abaixo: Nome sistemático/Nome trivial /Cadeia de carbono Mirístico tetradecanoico 14:0 Palmítico hexadecanoico 16:0 Esteárico octadecanoico 18:0 Araquidico eicosanoico 20:0
[0144] As formas mono e poli-insaturadas de ácidos graxos podem também ser utilizadas, com compostos tendo de uma a três ligações duplas sendo de interesse, contudo, os compostos com mais ligações duplas também podem ser usados. Exemplos de ácidos graxos mono e poli- insaturados de interesse que podem ser usados incluem: Nome sistemático/Nome trivial/Cadeia de carbono Cis-9-hexadecanoico palmitoleico 16:1 (n-7) Cis-6-octadecanoico petroselínico 18:1 (n-12) Cis-9-octadecanoico oleico 18:1 (n-9) 9,12-octadecadienoico linoleico 18: 2 (n-6) 6,9,12-octadecatrienoico gama-linoleico 18:3 (n-6) 9,12,15-octadecatrienoico alfa-linoleico 18:3 (n-3) 5,8,11,14-eicosatetraenoico araquidônico 20:4 (n-6)
[0145] Os ácidos graxos com uma ou mais ligações na cadeia de carbono, bem como os ácidos graxos ramificados, também podem ser usados nos compostos da invenção. Formas substituídas de ácidos graxos podem ser utilizadas nos compostos da invenção. Assim como acontece com os grupos de hidrocarbonetos, grupos substituintes que são inertes in vivo e in vitro são de interesse, tais como o flúor. Estruturas genéricas exemplificativas de derivados polifluorinados de ácidos graxos adequados para uso na invenção são: CF3(CF2)n— (CH2)mCO— onde m é pelo menos 1, preferencialmente, pelo menos 2, e n é 1 a 30, e CH3(CH2)a(CF2)b(CH2)cCO— onde a, b e c são independentemente 1-30.
[0146] Em alguns casos, entre um e cinco componentes L (n é 1, 2, 3, 4 ou 5) estão ligados covalentemente ao componente O, através de um ligante opcionalmente. Em alguns casos, são utilizados um ou dois componentes L (n=1 ou 2). Quando mais de um componente L é ligado ao componente O, cada componente L é selecionado independentemente.
[0147] Será apreciado que os compostos da invenção, descrita como tendo um hidrocarboneto especificado como a porção L e os compostos descritos como tendo um ácido graxo especificado (com o mesmo número de átomos de carbono como o hidrocarboneto especificado) estão intimamente relacionados e diferem em estrutura apenas quanto à natureza da ligação que une a porção L ao oligonucleotídeo, que por sua vez é um resultado do procedimento de síntese usado para produzir o composto. Por exemplo, e como descrito em mais detalhes abaixo, quando os compostos são sintetizados possuindo a porção L conjugada ao terminal 3'-amino de um polinucleotídeo (tendo ligações internucleosídicas de fosforamidato ou tiofosforamidatos), a utilização da forma de aldeído de um ácido graxo (um aldeído graxo) como materiais de partida resulta na formação de uma ligação amina entre a cadeia lipídica e o polinucleotídeo, de tal modo que o grupo lipídico apareça como um hidrocarboneto. Em contraste, a utilização do ácido carboxílico, anidrido de ácido ou as formas de cloreto de ácido do mesmo ácido graxo resulta na formação de uma ligação de amido, de modo tal que o grupo de lipídio apareça na forma de um derivado de ácido graxo, especificamente no caso de um amido graxo (conforme observado na seção de definições acima, por questão de simplificação, o termo "ácido graxo", quando descreve o grupo conjugado L, é usado de forma ampla, de modo a incluir derivados de ácido graxo, incluindo amidos graxos). Isso é ilustrado nos esquemas a seguir, que representam o terminal 3'-amino de um polinucleotídeo de fosforamidato unido a um componente de lipídio C14. No esquema A, L é o ácido tetradecanoico (mirístico), em que a ligação entre os grupos L e O é um amido. No esquema B, L é tetradecano e a ligação entre os grupos L e O é um amino. Esquema A
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[0148] A ligação entre os componentes O e L pode ser uma ligação direta, ou pode se dar por meio de uma porção de ligante opcional, por exemplo: x ou o ligante opcional T de Fórmula (I). O grupo ligante pode servir para facilitar a síntese química dos compostos. Sendo usado ou não um grupo ligante para mediar a conjugação dos componentes de O e L, há vários sítios no componente do polinucleotídeo O a que o(s) componente(s) de L podem ser convenientemente conjugados. Os pontos de ligação adequados incluem os terminais 5' e 3', um ou mais anéis de açúcar, espinha dorsal de internucleosídeos e as nucleobases do polinucleotídeo. Em alguns casos, a porção L está ligada ao terminal 3 ou 5' do polinucleotídeo.
[0149] Se o componente L deve ser ligado ao terminal 3', a ligação pode ser diretamente ao substituinte 3', que no caso dos polinucleotídeos de fosforamidato e tiofosforamidato preferenciais é o grupo 3'-amino, e em outros casos, tais como polinucleotídeos de fosfodiéster convencionais, é um grupo 3-hidróxi. Em alternativa, a porção de L pode estar ligada por meio de um grupo de fosfato ligado a 3', em que um hidrocarboneto de hexadecano está ligado ao fosfato 3' de um polinucleotídeo de tiofosforamidato por meio de um ligante O-alquil. Se a porção de L tiver de ser ligada ao terminal 5', ela pode ser ligada por meio de um grupo fosfato ligado a 5'. A ligação a uma base na porção de O pode se dar através de qualquer átomo adequado, por exemplo, ao grupo amino N2 de uma guanosina. Onde n> 1, de tal modo que uma pluralidade de porções lipídicas deve ser ligada ao componente de O, os componentes de L selecionados individualmente podem ser ligados a qualquer sítio(s) adequado(s). Por exemplo, um grupo de L pode estar ligado a cada terminal, vários grupos de L podem estar ligados às bases ou dois ou mais grupos de L podem estar ligados a um terminal.
[0150] O componente de ligação opcional x pode ser usado para unir os componentes O e L dos compostos. Entende-se que o ligante opcional (por exemplo, x ou T de Fórmula (I)) pode estar ligado ao polinucleotídeo (por exemplo, O) através de um grupo fosfato terminal, por exemplo, um grupo fosfato ligado a 3' ou ligado a 5'. Se um agente de ligação for usado, ele é incorporado aos procedimentos de síntese conforme descritos aqui. Exemplos de grupos ligantes adequados incluem amino glicerol e ligantes do tipo O-alquil glicerol que podem ser representados, respectivamente, pelas estruturas genéricas
Figure img0005
em que R' é H, OH, NH2 Ou SH; Y é O, S ou NR; R é H, uma alquila ou uma alquila substituída; e n e m são independentemente inteiros entre 1- 18. Exemplos de ligantes adequados de interesse são o ligante de aminoglicerol em que R' é OH, Y é O e m e n são cada um 1:
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o ligante de bis-aminoglicerol, em que R' é OH, Y é NH e m e n são cada 1:
Figure img0007
e o ligante de O-alquil glicerol em que R é H:
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[0151] Exemplos de polinucleotídeos modificados com podem ser preparados de acordo com os métodos em questão os compostos descritos na Figura 1 (por exemplo, Figuras Pedido dos EUA US20120329858 a Gryaznov et al. "Modified oligonucleotides for teiomerase inhibition", cuja descrição é incorporada neste documento por referência na sua totalidade.
[0152] Em certas modalidades, a composição inclui um composto descrito pela estrutura:
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ou um seu sal, em que "nps" representa uma ligação de tiofosforamidato (por exemplo, — NH— P(=O)(SH)— O— ou um seu tautômero, ou um seu sal), ligando o carbono 3' de um nucleosídeo ao carbono 5' do nucleosídeo adjacente. Entende-se que o composto descrito na fórmula acima pode existir em uma forma de sal. Tais formas, na medida em que possam existir, destinam-se a ser incluídas no âmbito da presente divulgação. Em certas modalidades, a composição inclui um sal farmaceuticamente aceitável do composto. Em certos casos, a composição inclui um sal de sódio do composto. Em certas modalidades, a composição inclui um sal de cátion divalente do composto, como sal de magnésio do composto. Em certas modalidades, a composição inclui um sal de cátion trivalente do composto, como um sal de alumínio do composto.
[0153] Em certas modalidades, a composição inclui um composto descrito pela estrutura:
Figure img0010
onde cada Mx é independentemente hidrogênio ou qualquer contraíon conveniente de um sal, cada x é independentemente 1, 2 ou 3 e n é um número inteiro de 5 a 13. Em alguns casos, n é 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 ou 13. Em certos casos, cada x é independentemente 1, 2 ou 3 e n é um número inteiro de 5 a 12. Em certos casos, n é 13. Em certos casos, cada x é 1. Em certos casos, cada X é, independentemente, 1 ou 2. Em certos casos, cada x é, independentemente, 1 ou 3. Em certos casos, cada Mx+é independentemente um contraíon catiônico. Em certos casos, cada Mx+ é independentemente um contraíon catiônico, cada x é independentemente 1, 2 ou 3 e n é um número inteiro de 5 a 12. Em certos casos, cada Mx+ é independentemente hidrogênio ou qualquer contraíon catiônico conveniente, cada x é independentemente 1, 2 ou 3 e n é um número inteiro de 5 a 12. Em certos casos, Mx+ é hidrogênio. Em algumas modalidades,(Mx+)n é (Mg2+)(M+)11. Em algumas modalidades, (Mx+)n é (Mg2+)2(M+)9. Em algumas modalidades, In some embodiments, (Mx+)n é (Mg2+)2(M+)9. Em algumas modalidades, (Mx+)3 é (Mg2+)3(M+)7. Em algumas modalidades, (Mx+)n é (Mg2+)4(M+)5. Em algumas modalidades, (Mx+)n é (Mg2+)5(M+)3. Em algumas modalidades, (Mx+)n é (Mg2+)6(M+). Em algumas modalidades, (Mx+)n é (Mg2+)(M+)12, onde o contraíon Mg2+ pode formar um par de íon adicional para a espinha dorsal aniônica de outro oligonucleotídeo. Em algumas modalidades, (Mx+)n é (Mg2+)2(M+)11, onde o contraíon Mg2+ pode formar dois de pares de íons adicionais na espinha(s) dorsal(is) aniônica de um ou dois outros oligonucleotídeos. Em certos casos, o contraíon M+ do sal de magnésio misturado é sódio. Em certos casos, o contraíon M+ do sal de magnésio misturado é amônio. Em certos casos, o contraíon M+ do sal de magnésio misturado é o trietilamônio.
[0154] Em certas modalidades, a composição inclui um composto descrito pela estrutura a seguir e pode incluir quaisquer contraíons catiônicos convenientes de um sal:
Figure img0011
[0155] Em certas modalidades, a composição inclui um composto descrito pela estrutura:
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[0156] Polinucleotídeos modificados por lipídios
[0157] Uma variedade de aproximações sintéticas pode ser utilizada para conjugar uma porção lipídica L ao polinucleotídeo, dependendo da natureza da ligação selecionada, incluindo as abordagens descritas em Mishra et al., (1995) Biochemica et Biophysica Acta, 1264:229-237, Shea et al., (1990) Nucleic Acids Res. 18:3777-3783, and Rump et al., (1998) Bioconj. Chem. 9:341-349. A síntese de compostos em que a fração lipídica é conjugada no terminal 5' ou 3' do polinucleotídeo pode ser alcançada através da utilização de grupos funcionais adequados no terminal adequado, em alguns casos, um grupo amino ou um grupo hidroxila, o qual pode ser feito reagir com ácidos carboxílicos, cloretos de ácido, anidridos e ésteres ativos. Os grupos tiol podem também ser utilizados como grupos funcionais (ver Kupihar et al., (2001) Bioorganic and Medicinal Chemistry 9:1241-1247). Ambos os modificadores de amino e tiol de diferentes comprimentos de cadeia são comercialmente disponíveis para a síntese de polinucleotídeos. Os polinucleotídeos possuindo ligações de tiofosforamidato N3'^P5' contêm grupos 3'-amino (em vez de 3'-hidróxi encontrados na maioria dos processos químicos polinucleotídicos convencionais) e, portanto, estes polinucleotídeos proporcionam uma oportunidade única para a conjugação de grupos lipídicos na extremidade 3' do polinucleotídeo.
[0158] Várias abordagens podem ser utilizadas para ligar grupos lipídicos aos terminais de polinucleotídeos com a química de tiofosforamidato de N3'^P5' (por exemplo, um ligante de propanediol de palmitoilamido-1-O- (4,4'-dimetoxitritil)-2-O-succinil). Para a ligação ao terminal 3', os compostos conjugados podem ser sintetizados pela reação do grupo de 3'-amino livre do polinucleotídeo ligado ao suporte sólido totalmente protegido com o anidrido de ácido correspondente, seguido pela desproteção com amônia e purificação. Alternativamente, o acoplamento de ácidos carboxílicos de lípidos ao grupo 3'-amino livre do polinucleotídeo ligado ao suporte usando agentes de acoplamento tais como carbodiimidas, HBTU (N,N,N',N'- tetrametil-O-(1H-benzotriazol-1-il)hexafluorofosfato de urônio) ou o iodeto de 2-cloro-1-metilpiridínio podem ser utilizados para conjugar os grupos lipídicos. Esses dois métodos formam uma ligação amida entre o lípido e o polinucleotídeo. Os lípidos podem também ser ligados à cadeia de polinucleotídeo utilizando um derivado de fosforamidito do lípido acoplado aos polinucleotídeos durante o alongamento da cadeia. Essa abordagem produz uma ligação de fosforamidato (por exemplo, tiofosforamidato) conectando o lípido e o polinucleotídeo (exemplificado pelos compostos propil-palmitoil e 2-hidroxi-propil-palmitoil). Ainda outra abordagem envolve a reação do grupo de 3-amina livre do polinucleotídeo ligado ao suporte totalmente protegido com um aldeído de lípidos adequados, seguida pela redução com cianoborohidreto de sódio, que produz uma ligação amina.
[0159] Para a ligação ao terminal 5', o polinucleotídeo pode ser sintetizado usando um suporte sólido contendo lipídios modificado, seguido de síntese do polinucleotídeo na direção 5' a 3' como descrito em Pongracz & Gryaznov (1999). Um exemplo do suporte modificado é fornecido abaixo. No caso em que n=14, o ácido graxo é ácido palmítico: reação de 3-amino- 1, 2-propanodiol com cloreto de palmitoil, seguido por succinilação e dimetoxitritilação forneceu o intermediário utilizado para o acoplamento ao suporte sólido. Em alguns casos, R pode ser alquilamina de cadeia longa controlada pelo vidro de poro. Em certos casos, R é um suporte sólido polimérico.
Figure img0013
TILIDADES
[0160] Os métodos e composições da invenção, por exemplo, como descritos acima, encontram utilidade em uma variedade de aplicações. As aplicações de interesse incluem, mas não estão limitadas a: aplicações terapêuticas, aplicações de diagnóstico, aplicações de pesquisa e aplicações de triagem, como analisado com mais detalhes abaixo.
[0161] Os compostos da presente invenção encontram utilidade em uma variedade de aplicações terapêuticas. Em algumas modalidades, os métodos de produção de um polinucleotídeo são aplicados para preparar polinucleotídeos que proporcionam um benefício terapêutico. Os tipos de doenças que podem ser tratadas utilizando as composições da presente invenção são ilimitados. Por exemplo, as composições podem ser utilizadas para o tratamento de inúmeras doenças genéticas. Em algumas modalidades, os presentes métodos e composições têm aplicações antisense. Em algumas modalidades, os presentes métodos e composições têm aplicações de antígeno. Em certas modalidades, os presentes métodos e composições têm aplicações para a inibição da telomerase, como aquelas descritas na Patente U.S. 6.835.826 e na Publicação U.S. 20120329858, cujas divulgações são incorporadas neste documento por referência na sua totalidade.
[0162] A presente divulgação proporciona compostos que podem inibir de forma específica e potente a atividade da telomerase e que podem, portanto, ser usados para inibir a proliferação de células positivas para telomerase, tais como células tumorais. Uma ampla variedade de células cancerosas foram mostradas como sendo positivas para a telomerase, incluindo células de câncer de pele, tecido conjuntivo, adiposo, mama, pulmão, estômago, pâncreas, ovários, colo do útero, útero, rins, bexiga, cólon, próstata, sistema nervoso central (SNC), retina e tumores hematológicos (tais como mieloma, leucemia e linfoma). Os cânceres de interesse incluem, mas não estão limitados a, mielofibrose, trombocitemia, síndrome mielodisplásica e leucemia mielogênica.
[0163] Os presentes compostos podem ser usados para tratar malignidades hematológicas e distúrbios proliferativos, incluindo, mas não se limitando a, trombocitemia essencial (ET), policitemia vera (PV), leucemia mielogênica crônica (CML), mielofibrose (MF), leucemia neutrofílica crônica, leucemia eossinofílica crônica e leucemia mielogênica aguda (AML). Os compostos da presente invenção podem ser utilizados para tratar síndromes mielodisplásicas, que incluem doença como anemia refratária, anemia refratária com excesso de blastos, citopenia refratária com displasia multilinhagens, citopenia refratária com displasia de linhagem única e leucemia mielomonocítica crônica (LMMC). Os compostos da presente invenção podem ser utilizados para tratar doenças hematológicas, tais como as descritas no pedido de patente PCT No. PCT/US 13/070437, depositado em 15 de novembro de 2013, cuja divulgação é incorporada neste documento por referência na sua totalidade.
[0164] Por conseguinte, os compostos proporcionados neste documento são de grande utilidade no tratamento de uma vasta variedade de doenças malignas. Em alguns casos, os compostos da presente invenção podem ser eficazes em proporcionar tratamentos que discriminam entre as células malignas e normais a um grau elevado, evitando muitos dos efeitos colaterais deletérios presentes na maioria dos regimes de quimioterapêuticos atuais que se baseiam em agentes que matam as células em divisão de forma indiscriminada. Ademais, em alguns casos, os compostos modificados de lipídios da invenção são mais potentes do que os oligonucleotídeos não conjugados equivalentes, o que significa que eles podem ser administrados em doses mais baixas, proporcionando uma maior segurança e reduções significativas no custo do tratamento. Os inibidores de telomerase podem ser empregados em conjunto com outras abordagens de tratamento de câncer, incluindo a remoção cirúrgica dos tumores primários, agentes quimioterapêuticos e tratamento de radiação. Assim, a invenção refere-se a compostos e composições aqui proporcionados para utilização como medicamento. A invenção também diz respeito a compostos e composições proporcionados neste documento para utilização no tratamento ou prevenção de qualquer uma das neoplasias mencionadas anteriormente neste documento.
[0165] Os compostos e métodos da presente invenção encontram utilidade em uma variedade de aplicações para diagnóstico, incluindo, mas não se limitando ao desenvolvimento de diagnósticos clínicos, por exemplo: diagnósticos in vitro ou agentes de processamento de imagens de tumor in vivo. Tais aplicações são úteis para diagnosticar ou confirmar o diagnóstico da condição de uma doença ou a suscetibilidade a essas. Os métodos também são úteis para monitorar a progressão da doença e/ou resposta ao tratamento em doentes que tenham sido diagnosticados anteriormente com a doença.
EXEMPLOS
[0166] Exemplo 1: Resumo
[0167] Esses exemplos descrevem experiências para preparar várias formas divalentes ou trivalentes de Imetelstat, tais como Ca, Ba, Mg, Al, Fe, Cu e Zn a partir da forma de sal de sódio de Imetelstat. Nesses experimentos, foram avaliadas melhorias na pureza utilizando métodos de preparação envolvendo a formação e isolamento de sais dos cátions bi-dentados ou tri- dentados que podem se ligar a um, dois ou três grupos fosfato de Imetelstat. A solubilidade e osmolalidade das formas de sal resultantes também foram estudadas.
[0168] A preparação de sais de Cálcio de Imetelstat, Bário de Imetelstat, Magnésio de Imetelstat, Alumínio de Imetelstat, Imetelstat deFe (II ou III) e Imetelstat Cúprico foi investigada usando CaCl2, MgCl2, BaCl2, CuCl2, ZnCl2, AlCl3, FeCl2 e FeCl3.
[0169] Foram estudados três métodos para troca de sal: uso de uma resina forte de troca catiônica (FINEX MFG 210), precipitação e dissolução simples. Quando a solução de Sódio de Imetelstat foi passada através de uma resina trocada com CaCl2, BaCl2 ou MgCl2, as soluções de elução continham pós finos, indicando que os contraíons de sódio foram trocados com êxito na espinha dorsal de Imetelstat e substituídos por contraíons de cálcio, bario ou magnésio. Para os outros cinco reagentes (CuCl2, ZnCl2, AlCl3, FeCl2, FeCl3) que foram equilibrados com a resina de troca catiônica, a parte superior da resina na coluna tornou-se agregada quando a solução de Imetelstat foi passada, indicando também que os contraíons de sódio foram trocados com êxito na espinha dorsal de Imetelstat.
[0170] Os métodos de precipitação e dissolução também foram testados utilizando um excesso de reagentes salinos. Quando um grande excesso de reagente de sal (por exemplo, 900 equivalentes) foi tratado com Sódio de Imetelstat, formou-se um precipitado. Os precipitados foram isolados por filtração. Testes subsequentes indicam que sete a cinquenta equivalentes de reagentes de sal inorgânicos foram necessários para converter todo o Imetelstat em um precipitado.
[0171] Cinco equivalentes dos três sais inorgânicos (Mg, Ba ou Ca) foram tratados com forma de sal de IMEtelstat TEA (trietilamônio) ou com a forma de sal Imetelstat Na. Foi confirmado que a precipitação não ocorreu e as soluções foram dessalinizadas e liofilizadas. A análise de pó liofilizado por Flame AA (Absorção Atômica) mostrou que alguns dos contraíons de sódio de Imetelstat foram trocados.
[0172] Realizou-se uma experiência adicional com MgCl2 usando um a nove equivalentes de cátion de magnésio para a forma de Imetelstat. Os contraíons de sódio foram parcialmente trocados em contraíons de Mg com a maior troca ocorrendo a nove equivalentes de MgCl2, com as composições resultantes apresentando 1,2% em peso de Na e 1,1% em peso de Mg.
[0173] Exemplo 2: Materiais e Equipamentos
[0174] Os reagentes inorgânicos, solventes orgânicos e outros materiais utilizados para o estudo estão listados na Tabela 1. Sódio de Imetelstat (CAS n° 1007380-31-5) do Lote n° de G163/LG-13002 fornecido por Geron foi utilizado para o estudo. Amônio de Imetelstat é uma composição bruta derivada da clivagem de Imetelstat a partir de um suporte de síntese de fase sólida usando amônia e etanol (por exemplo, como descrito por Gryaznov et al., em US 20120329858) e foi obtido a partir do estoque do fabricante. Imetelstat TEA (forma de trietilamônio) é uma composição derivada de um eluato de coluna de purificação HPLC em que é utilizada uma fase móvel de acetato de trietilamônio (TEAA) (por exemplo, como descrito por Gryaznov et al., em US 20120329858) e foi obtida a partir do estoque do fabricante obtido de vários estudos de desenvolvimento de processos. A ultrafiltração foi realizada utilizando uma Célula de Ultrafiltração Agitada (Amicon 8400, Millipore) com membranas PES 1KD. A liofilização foi realizada utilizando um Concentrador de Velocidade de Vácuo (ScanSpeed 40, LaboGene).
[0175] Exemplo 3: Procedimento
[0176] Troca por Coluna de Resina de Troca de Íons Uma coluna de resina de troca catiônica forte, FINEX MFG 210, foi preparada tendo um volume de coluna de 200 mL (4,6 cm x 12 cm) e a resina foi lavada com 1M NaOH e água. A coluna foi então equilibrada com uma solução 1M de cada sal de interesse. No total, foram preparadas oito soluções de sal 1M e utilizadas (CaCl2, MgCl2, BaCl2, CuCl2, ZnCl2, AlCl2, FeCl2, e FeCl3) nestes experimentos. Foi adicionada à coluna uma solução de 50 mL de sódio de Imetelstat a 100 mg/mL.
[0177] No caso de colunas equilibradas de CuCl2, ZnCl2, AlCl2, FeCl2 e FeCl3, a agregação de Imetelstat na resina foi observada na parte superior da coluna quando sódio de Imetelstat foi carregado na coluna.
[0178] As três colunas equilibradas com CaCl2, MgCl2 e BaCl2, as soluções de sal não resultaram em qualquer agregação de Imetelstat na coluna e Imetelstat foi recuperado do eluente de coluna, que foram observados como soluções turvas. Os sais finos foram recuperados desses eluatos por centrifugação (4000 rpm, 20 min). Após a centrifugação, confirmou-se que o sobrenadante não continha qualquer Imetelstat por análise de HPLC. Isso indica que a precipitação e a separação de sais de cálcio, magnésio e bário de Imetelstat foram obtidas com sucesso.
[0179] Por Precipitação
[0180] A cristalização ou precipitação de formas divalentes ou trivalentes de Imetelstat foi investigada usando um grande excesso de sais inorgânicos de interesse (900 equivalentes, base de peso). Soluções salinas de 1M de CaCl2, MgCl2, BaCl2, CuCl2, ZnCl2, AlCl2, FeCl2, e FeCl3 foram preparadas.. Foram misturados três tipos de solução de Imetelstat: solução de Imetelstat bruta (sal de amônio), Imetelstat purificado (forma de sal de trietilamônio (TEA)) e sódio de Imetelstat (forma de sal de Na) com cada solução salina.
[0181] Todas as soluções misturadas apresentaram precipitados de Imetelstat, que foram isolados facilmente por filtração com um papel de filtro Advantec 2. Esse resultado indica que a precipitação e separação de sais multivalentes de Imetelstat foi alcançada com sucesso.
[0182] As solubilidades dos precipitados isolados sob as condições de grande excesso de regente de sal foram inicialmente investigadas utilizando os seguintes solventes: água, acetonitrila, MeOH, EtOH, IPA (álcool isopropílico), 0,1M NaOH, HCl a 0,1 M, 1M NaCl e NMP.
[0183] Para os sais precipitados em um grande excesso de reagente salino, os sais de cálcio, bário e magnésio de Imetelstat eram solúveis em uma solução de NaOH a 0,1 M e 1 M de NaCl (ver Tabela 2). Os estudos de solubilidade do precipitado de Imetelstat obtidos a partir de um grande excesso de reagente de sal de magnésio foram conduzidos em soluções de NaCl a 1M em diferentes concentrações (2mg/mL a 6 mg/mL) e sob diferentes condições de pH (pH 8, 9, 10, 11, 12) e analisados por HPLC (ver cromatogramas da Figura 1). Verificou-se que o precipitado de Imetelstat era solúvel a 6 mg/mL e pH 11 a pH 12. O composto também mostrou estabilidade até pH 12 sem precipitados (Figura 1).
[0184] Por Dissolução
[0185] 30 a 50 equivalentes de reagente salino
[0186] O número de equivalentes de reagentes de sal de interesse que poderia atingir uma precipitação completa de Imetelstat foi investigado pela adição passo a passo do reagente salino de interesse. A formação completa do precipitado foi observada no intervalo de 7 a 50 equivalentes de reagente de sal adicionado para os oito sais listados na Tabela 3. À medida que mais equivalentes de reagentes salinos foram adicionados, observou-se uma tendência para a formação de gel com precipitação para todos os sais.
[0187] Foram utilizados três tipos de solução de Imetelstat: amônio de Imetelstat bruto (forma bruta), trietilamônio de Imetelstat (forma de sal TEA purificada) e sódio de Imetelstat (forma de sal de Na) foram misturados com cada solução salina. O sal de amônio de Imetelstat foi usado como uma solução de NH4OH ou uma solução em água. As soluções de amônio de Imetelstat e Imetelstat TEA exigiram aproximadamente 50 equivalentes ou 30 equivalentes de reagente de sal de Mg, respectivamente, para obter a precipitação completa.
[0188] A solubilidade dos precipitados formados a partir da solução de Imetelstat TEA e da solução de amônio de Imetelstat foi investigada sob várias condições de pH, de pH 8 a pH 12. Depois de deixar as soluções misturadas durante 6 horas à TA, a solubilidade dos precipitados de Mg de Imetelstat foram analisados por absorvência de UV a 260 nm. Ambos os precipitados obtidos do amônio de Imetelstat e do Imetelstat TEA mostraram uma tendência semelhante em que mais sal de Imetelstat dissolvido em solução de NaCl a 1M a pH elevado (ver Tabela 3).
[0189] Esse resultado sugere que quando o número de equivalentes de reagente salino de interesse em relação ao Imetelstat é controlado, a precipitação completa do sal de Imetelstat pode ser conseguida por qualquer método conveniente para produzir um precipitado que possa ser resolvido com sucesso.
[0190] 5 equivalentes de reagente salino
[0191] A solução de Sódio de Imetelstat (100 mg em 1mL de água) foi misturada com 5 equivalentes de oito reagentes salinos e cada solução foi dessalinizada por ultrafiltração usando uma Célula de Ultrafiltração Agitada e uma membrana de 1KD. A solução ultrafiltrada foi então liofilizada. O pó resultante foi analisado quanto ao teor de Na e a cada contraíon metálico de interesse por Flame AA (espectroscopia de absorção atômica). Conforme mostrado nas Figuras 2 e 3, o maior teor de contraíon metálico foi de 1,1% em peso para Zn, Al e Mg, com conteúdo de Na de 2,6%, 1,7% e 2,6%, respectivamente.
[0192] 6 a 9 equivalentes de reagente salino
[0193] Foi feita a adição de 6 a 9 equivalentes de reagente de sal de magnésio à solução de Sódio de Imetelstat e a posterior ultrafiltração e liofilização proporcionou o produto sólido que era completamente solúvel em água. A análise do teor de sódio e magnésio foi realizada (ver resultados na Figura 3). Adição de nove equivalentes de MgCl2 para a solução de Sódio de Imetelstat produz uma composição em que o teor de contraíon de Na e Mg é de 1,1% e 1,2% em peso, respectivamente.
[0194] 1 a 10 equivalentes de reagente de sal
[0195] Para investigar a troca de Mg com contraíons de TEA no sal de Imetelstat TEA em comparação com o sal de sódio de Imetelstat, foi projetado e realizado outro conjunto de experimentos. Um a dez equivalentes de MgCl2 em soluções aquosas foram misturadas com solução de sal de Imetelstat TEA (pureza> 90% por UPLC). Uma análise do teor de contraíons de Mg foi realizada após ultrafiltração e liofilização. Os resultados são mostrados na Figura 4. A adição de até 10 equivalentes de reagente de MgCl2 produziu uma composição com 1,6% de Mg em peso.
[0196] Exemplo 4: Conclusão
[0197] A preparação de formas de sal divalentes e trivalentes de Imetelstat foi conseguida incluindo cálcio, magnésio, zinco, alumínio, bário, ferro(II), ferro(III) e sais de cobre. Quando se utilizou um excesso controlado de reagentes de sais inorgânicos selecionados (ver Tabela 2 e 3) para precipitar o polinucleotídeo, foram formados precipitados que poderiam subsequentemente ser redissolvidos e que mostram uma pureza melhorada em relação às impurezas de eluição rápida usando análise de HPLC.
[0198] A utilização de um reagente de sal de magnésio produziu um precipitado sólido solúvel de Imetelstat após a etapa de troca. Foram produzidos precipitados que obtiveram 1,2% em peso de contraíon de magnésio relativamente a 1,1% em peso de contraíon de sódio.
[0199] A precipitação de Imetelstat utilizando sais divalentes ou trivalentes proporciona a remoção de produtos e reagentes sintéticos não alvos que permanecem na solução. A remoção de tais impurezas presentes em soluções de Imetelstat bruto proporciona várias vantagens para subsequentes etapas de purificação de cromatografia de Imetelstat, tais como carga de coluna reduzida, resolução melhorada, número reduzido de etapas de purificação de cromatografia e vida útil melhorada das colunas de cromatografia, custos de purificação reduzidos e purificações mais rápidas. Tabela 1. Sais Inorgânicos, Solventes Orgânicos e Outros Materiais
Figure img0014
Tabela 2
Figure img0015
Figure img0016
* Testado em Acetonitrila, MeOH, EtOH, IPA, Água, NMP, 1M HCl, 1M NaCl, 1M NaOH ** Testado em Acetonitrila, MeOH, EtOH, IPA, água, NMP, 1M HCl, 1M NaCl Tabela 3
Figure img0017
[0200] Sem prejuízo das reivindicações anexas, a descrição apresentada neste documento também é definida pelas seguintes reivindicações:
[0201] 1. Um método de preparação de um polinucleotídeo, compreendendo o método: contatar uma primeira composição polinucleotídica compreendendo: um polinucleotídeo possuindo uma sequência de 7 ou mais subunidades nucleosídicas e pelo menos duas das subunidades nucleosídicas são unidas por uma ligação entre subunidades de tiofosforamidato N3'^P5'; e produtos e reagentes sintéticos não direcionados; com um sal catiônico multivalente para precipitar um primeiro sal polinucleotídico compreendendo pelo menos um contraíon de cátion multivalente; e separar o primeiro sal polinucleotídico da primeira composição polinucleotídica contatada para produzir uma segunda composição polinucleotídica compreendendo o primeiro sal polinucleotídico.
[0202] 2. O método da reivindicação 1, compreendendo ainda: entrar em contato com o primeiro sal polinucleotídico com suporte de cromatografia de fase reversa; e eluir a partir do suporte de cromatografia uma terceira composição polinucleotídica compreendendo um segundo sal polinucleotídico.
[0203] 3. O método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1-2, em que o polinucleotídeo compreende uma sequência que compreende 13 ou mais subunidades nucleosídicas complementares ao componente de RNA da telomerase humana.
[0204] 4. O método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1-3, em que o polinucleotídeo compreende entre 10 e 50 subunidades de nucleosídeo contíguas complementares ao componente de RNA da telomerase humana.
[0205] 5. O método de qualquer uma das reivindicações 3-4, em que as subunidades de nucleosídeos complementares ao componente de RNA da telomerase humana são todas unidas por ligações de entre subunidades de tiofosforamidato N3'^P5‘.
[0206] 6. O método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1-5 em que o polinucleotídeo compreende uma sequência selecionada dentre o grupo que consiste em: GTTAGGGTTAG (SEQ ID NO:4), TAGGGTTAGACAA (SEQ ID NO:3) e CAGTTAGGGTTAG (SEQ ID NO:5).
[0207] 7. O método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1-6, em que o polinucleotídeo é conjugado com uma unidade lipídica através de um ligante opcional.
[0208] 8. O método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 2-7, em que o segundo sal polinucleotídico tem a estrutura:
Figure img0018
onde cada Mx é independentemente hidrogênio ou um contraíon catiônico, cada x é independentemente 1, 2 ou 3 e n é um número inteiro de 5 a 13.
[0209] 9. O método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 2-8, em que o segundo sal polinucleotídico é um sal farmaceuticamente aceitável do polinucleotídeo.
[0210] 10. O método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 2-9, em que o segundo sal de polinucleotídeo é um sal de cátion monovalente do polinucleotídeo.
[0211] 11. O método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 2-10, em que o segundo sal polinucleotídico é um sal de sódio do polinucleotídeo.
[0212] 12. O método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1-5, compreendendo ainda a divisão do polinucleotídeo a partir de um suporte para produzir a primeira composição polinucleotídica.
[0213] 13. O método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1-12, em que a primeira composição compreende um sal de cátion monovalente do polinucleotídeo.
[0214] 14. O método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1-13, em que a etapa de contato compreende eluir a primeira composição de polinucleotídeo a partir de um suporte de troca de cátions.
[0215] 15. O método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1-14, em que a etapa de separação compreende a centrifugação da primeira composição de polinucleotídeo contatada para centrifugar o precipitado de sal de polinucleotídeo.
[0216] 16. O método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-15, em que a etapa de separação compreende a filtração do sal polinucleotídico do primeiro polinucleotídeo contatado.
[0217] 17. O método da reivindicação 2, em que a segunda composição polinucleotídica é carregada diretamente no suporte de cromatografia em fase reversa.
[0218] 18. O método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1-17, compreendendo ainda a dissolução da segunda composição de polinucleotídeo em um solvente.
[0219] 19. O método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1-18, em que o pelo menos um contraíon de cátions multivalente é divalente.
[0220] 20. O método da reivindicação 19, em que o pelo menos um contraíon de cátions multivalente é selecionado do grupo que consiste em magnésio, zinco e cálcio.
[0221] 21. O método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1-18, em que o pelo menos um contraíon de cátion multivalente é trivalente.
[0222] 22. O método da reivindicação 21, em que o pelo menos um contraíon de cátions multivalente é alumínio.
[0223] 23. O método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1-22, em que o sal de polinucleotídeo compreende ainda um contraíon de cátion monovalente.
[0224] 24. Uma composição compreendendo: um sal de um polinucleotídeo compreendendo pelo menos um contraíon de cátions multivalente; em que o polinucleotídeo tem uma sequência de 7 ou mais subunidades de nucleosídeo complementares ao componente de RNA da telomerase humana e pelo menos duas das subunidades nucleosídicas são unidas por uma ligação entre subunidades de tiofosforamidato N3'^P5'.
[0225] 25. A composição de acordo com a reivindicação 24, em que o pelo menos um contraíon de cátion multivalente é divalente.
[0226] 26. A composição de acordo com a reivindicação 25, em que o pelo menos um contraíon de cátion multivalente é selecionado do grupo que consiste em magnésio, zinco e cálcio.
[0227] 27. A composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 24-26, em que o pelo menos um contraíon de cátion multivalente é o magnésio.
[0228] 28. A composição de acordo com a reivindicação 24, em que o pelo menos um contraíon de cátion multivalente é trivalente.
[0229] 29. A composição de acordo com a reivindicação 28, em que o pelo menos um contraíon de cátion multivalente é alumínio.
[0230] 30. A composição de acordo com qualquer uma das reivindicações de 24-29, em que o polinucleotídeo compreende 3% em moles ou mais do contraíon do cátion multivalente em relação a uma espinha dorsal polianiônica do polinucleotídeo.
[0231] 31. A composição de acordo com qualquer uma das reivindicações de 24-29, em que o polinucleotídeo compreende 1,0% em peso ou mais do contraíon de cátion multivalente em relação ao polinucleotídeo.
[0232] 32. A composição de acordo com qualquer uma das reivindicações de 24-31, em que a composição é um precipitado.
[0233] 33. A composição de acordo com qualquer uma das reivindicações de 24-32, em que o polinucleotídeo compreende uma sequência que compreende 13 ou mais subunidades nucleosídicas complementares ao componente de RNA da telomerase humana.
[0234] 34. A composição de acordo com qualquer uma das reivindicações de 24-33, em que o polinucleotídeo compreende entre 10 e 50 subunidades de nucleosídeo contíguas complementares ao componente de RNA da telomerase humana.
[0235] 35. O método de qualquer uma das reivindicações 24-34, em que as subunidades de nucleosídeos complementares ao componente de RNA da telomerase humana são todas unidas por ligações de entre subunidades de tiofosforamidato N3'^P5'.
[0236] 36. O método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 24-35 em que o polinucleotídeo compreende uma sequência selecionada dentre o grupo que consiste em: GTTAGGGTTAG (SEQ ID NO:4), TAGGGTTAGACAA (SEQ ID NO:3) e CAGTTAGGGTTAG (SEQ ID NO:5).
[0237] 37. A composição de acordo com qualquer uma das reivindicações de 24-36, em que o polinucleotídeo é conjugado com uma fração lipídica através de um ligante opcional.
[0238] 38. A composição de acordo com qualquer uma das reivindicações de 24-37, em que o polinucleotídeo tem a estrutura:
Figure img0019
em que cada Mx é independentemente um contraíon catiônico, cada x é 1, 2 ou 3 e n é 5 a 12.
[0239] Embora a invenção anterior tenha sido descrita com algum detalhe por meio de ilustração e exemplo para fins de clareza de entendimento, será prontamente aparente para os versados na técnica à luz dos ensinamentos da presente invenção que certas alterações e modificações podem ser feitas sem se afastar do espírito ou âmbito das reivindicações anexas.
[0240] Nesse sentido, o exposto anteriormente ilustra meramente os princípios da invenção. Será percebido que os versados na técnica serão capazes de planejar vários arranjos que, embora não explicitamente descritos ou mostrados neste documento, incorporam os princípios da invenção e estão incluídos dentro de seu espírito e escopo. Além disso, todos os exemplos e a linguagem condicional relatados aqui destinam-se, principalmente, a auxiliar o leitor na compreensão dos princípios da invenção e dos conceitos contribuídos pelos inventores para promover a técnica, e devem ser interpretados como sendo sem limitação a tais exemplos e condições especificamente relatados. Além disso, todas as declarações neste documento que relatam princípios, aspectos e modalidades da invenção, bem como seus exemplos específicos, se destinam a abranger equivalentes estruturais e funcionais dos mesmos. Além disso, pretende-se que tais equivalentes incluam os equivalentes conhecidos atualmente e os equivalentes desenvolvidos no futuro, isto é, quaisquer elementos desenvolvidos que realizam a mesma função, independentemente da estrutura. O escopo da presente invenção, portanto, não se destina a estar limitado às modalidades exemplares mostradas e descritas neste documento. Pelo contrário, o escopo e o espírito da presente invenção estão incorporados pelas reivindicações anexas. Todas as possíveis combinações das modalidades indicadas acima são consideradas como abrangidas no âmbito desta invenção.

Claims (29)

1. Método de preparação de um polinucleotídeo caracterizado por compreender: a) colocar uma primeira composição polinucleotídica em contato com um sal catiônico multivalente para precipitar um primeiro sal polinucleotídico compreendendo pelo menos um contraíon de cátion multivalente; e b) separar o primeiro sal polinucleotídico da primeira composição polinucleotídica contatada para produzir uma segunda composição polinucleotídica compreendendo o primeiro sal polinucleotídico; em que a primeira composição polinucleotídica compreende: i) um polinucleotídeo possuindo uma sequência de 7 ou mais subunidades nucleosídicas e pelo menos duas das subunidades nucleosídicas são unidas por uma ligação entre subunidades de tiofosforamidato N3'^P5‘; e ii) produtos e reagentes sintéticos não-alvo solúveis; c) colocar a segunda composição polinucleotídica compreendendo o primeiro sal polinucleotídico da etapa b) em contato com um suporte de cromatografia em fase reversa; e d) eluir a partir do suporte de cromatografia em fase reversa uma terceira composição polinucleotídica compreendendo um segundo sal polinucleotídico.
2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as subunidades de nucleosídeos são todas unidas por ligações entre subunidades, cada uma independentemente selecionada a partir de ligação entre subunidades de tiofosforamidato N3'^P5' e ligação entre subunidades de fosforamidato N3'^P5'.
3. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo é descrito pela Fórmula (I):
Figure img0020
em que: cada B é, independentemente, uma purina, uma purina protegida, uma pirimidina ou uma pirimidina protegida ou um análogo do mesmo; cada X é, independentemente, oxigênio ou enxofre; cada R3 é, independentemente, hidrogênio, flúor, hidroxil, um alcoxi, um alcoxi substituído ou um grupo hidroxil protegido; R6 é amino, hidroxil, um amino protegido, um hidróxi protegido, -O-T-Z ou -NH-T-Z; cada T é independentemente um ligante opcional; cada Z é, independentemente H, um lipídio, um transportador, um oligonucleotídeo, um polímero, um polipeptídeo, um marcador detectável ou uma etiqueta; e n é um número inteiro de 7 a 100.
4. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que: o polinucleotídeo compreende uma sequência que compreende 13 ou mais subunidades nucleosídicas complementares ao componente de RNA da telomerase humana; ou o polinucleotídeo compreende entre 10 e 50 subunidades de nucleosídeo contíguas complementares ao componente de RNA da telomerase humana.
5. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que as subunidades de nucleosídeos são todas unidas por ligações entre subunidades de tiofosforamidato N3'^P5'.
6. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo compreende uma sequência selecionada dentre o grupo que consiste em: GTTAGGGTTAG (SEQ ID NO:4), TAGGGTTAGACAA (SEQ ID NO:3) e CAGTTAGGGTTAG (SEQ ID NO:5).
7. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo é conjugado com uma unidade lipídica através de um ligante opcional.
8. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que o segundo sal polinucleotídico tem a estrutura:
Figure img0021
onde cada Mx+ é independentemente hidrogênio ou um contraíon catiônico, cada x é independentemente 1, 2 ou 3 e n é um número inteiro de 5 a 13.
9. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que, após a etapa d) de eluição, o segundo sal polinucleotídico é um sal farmaceuticamente aceitável do polinucleotídeo.
10. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que, após a etapa d) de eluição, o segundo sal de polinucleotídeo é um sal de cátion monovalente do polinucleotídeo.
11. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que, após a etapa d) de eluição, o segundo sal polinucleotídico é um sal de sódio do polinucleotídeo.
12. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado por compreender ainda, antes da etapa a) de contato, a clivagem do polinucleotídeo a partir de um suporte de síntese de fase sólida, para produzir a primeira composição polinucleotídica como uma preparação sintética bruta do polinucleotídeo.
13. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo fato de que, antes da etapa a) de contato, a primeira composição polinucleotídica compreende um sal de cátion monovalente do polinucleotídeo.
14. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizado pelo fato de que a etapa a) de contato compreende carregar e eluir a primeira composição de polinucleotídeo a partir de um suporte de troca de cátions.
15. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizado pelo fato de que a etapa b) de separação compreende a centrifugação da primeira composição de polinucleotídeo contatada para centrifugar o primeiro precipitado de sal de nucleotídeo.
16. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, caracterizado pelo fato de que a etapa b) de separação compreende a filtração do primeiro sal polinucleotídico da primeira composição polinucleotídea contatada.
17. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 16, caracterizado pelo fato de que a segunda composição polinucleotídica da etapa b) é carregada diretamente no suporte de cromatografia em fase reversa.
18. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 17, caracterizado por compreender ainda, antes da etapa c) de contato, a dissolução da segunda composição de polinucleotídeo em um solvente.
19. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 18, caracterizado pelo fato de que: o pelo menos um contraíon de cátions multivalente é divalente, preferencialmente selecionado do grupo que consiste em magnésio, zinco e cálcio; ou o pelo menos um contraíon de cátion multivalente é trivalente; preferencialmente alumínio.
20. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 19, caracterizado pelo fato de que o primeiro sal de polinucleotídeo compreende ainda um contraíon de cátion monovalente.
21. Composição caracterizada por compreender: um precipitado de sal de um polinucleotídeo compreendendo pelo menos um contraíon de cátions multivalente; em que o polinucleotídeo tem uma sequência de 7 ou mais subunidades de nucleosídeo e pelo menos duas das subunidades nucleosídicas são unidas por uma ligação entre subunidades de tiofosforamidato N3'^P5‘, em que o polinucleotídeo é descrito pela Fórmula (I):
Figure img0022
em que: cada B é, independentemente, uma purina, uma purina protegida, uma pirimidina ou uma pirimidina protegida ou um análogo do mesmo; cada X é, independentemente, oxigênio ou enxofre; cada R3 é, independentemente, hidrogênio, flúor, hidroxil, um alcoxi, um alcoxi substituído ou um grupo hidroxil protegido; R6 é amino, hidroxil, um amino protegido, um hidróxi protegido, -O-T-Z ou -NH-T-Z; cada T é independentemente um ligante opcional; cada Z é, independentemente H, um lipídio, um transportador, um oligonucleotídeo, um polímero, um polipeptídeo, um marcador detectável ou uma etiqueta; e n é um número inteiro de 7 a 100, e e, que: o pelo menos um contraíon de cátion multivalente é divalente, preferencialmente selecionado do grupo consistindo em magnésio, zinco e cálcio; ou o pelo menos um contraíon de cátion multivalente é trivalente, preferencialmente selecionado de alumínio.
22. Composição, de acordo com a reivindicação 21, caracterizada pelo fato de que o sal de um polinucleotídeo compreende 3% em moles ou mais do contraíon do cátion multivalente.
23. Composição, de acordo com a reivindicação 21, caracterizada pelo fato de que o sal de um polinucleotídeo compreende 1,0% em peso ou mais do contraíon de cátion multivalente.
24. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 21 a 23, caracterizada pelo fato de que a composição é um precipitado.
25. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 21 a 24, caracterizada pelo fato de que: o polinucleotídeo compreende uma sequência que compreende 13 ou mais subunidades nucleosídicas complementares ao componente de RNA da telomerase humana; ou o polinucleotídeo compreende entre 10 e 50 subunidades de nucleosídeo contíguas complementares ao componente de RNA da telomerase humana.
26. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 21 a 25, caracterizada pelo fato de que as subunidades de nucleosídeos são todas unidas por ligações entre subunidades de tiofosforamidato N3'^P5'.
27. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 21 a 26, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo compreende uma sequência selecionada dentre o grupo que consiste em: GTTAGGGTTAG (SEQ ID NO:4), TAGGGTTAGACAA (SEQ ID NO:3) e CAGTTAGGGTTAG (SEQ ID NO:5).
28. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 21 a 27, caracterizada pelo fato de que uma extremidade 5’ ou 3’ do polinucleotídeo é conjugado com uma fração lipídica através de um ligante opcional.
29. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 21 a 28, caracterizada pelo fato de que o polinucleotídeo tem a estrutura:
Figure img0023
em que cada Mx+ é independentemente um contraíon catiônico, cada x é 1, 2 ou 3 e n é 5 a 12.
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