TWI607086B - 牙科用植體及其製造方法 - Google Patents

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Description

牙科用植體及其製造方法
本發明是有關牙科用植體(implant)及其製造方法。更具體而言，是有關可形成機能性牙周組織的牙科用植體及其製造方法。
已知有各種治療方式可使因蛀牙或牙周病而喪失的牙齒機能再度復活。例如，已知將金屬或陶瓷等人工材料製作的假牙埋入牙根中的方法。此外，例如，在已完全喪失牙根時，已知在健康的牙齒上架橋以放置假牙之方法。
另外，近年來作為牙科取代醫療的尖端治療法之一，是實施口腔植體治療。口腔植體治療，是指將鈦等植體植入喪失牙齒部位的顎骨中之方式。
不過，天然牙齒的牙根與牙科用植體存在很大的差異。天然牙齒的牙根被牙周組織的一部份之牙根膜被覆，相對的在牙科植體的移植部位，通常沒有牙根膜。
在天然牙齒的周圍，存在可維繫牙根側的牙骨質(cementum)與外側的齒槽骨之纖維狀牙根膜組織。牙骨質具有保護牙根面與使牙根膜附著在牙根面的機能。此外，已知牙根膜具 有的機能，可大別為：1)咬合力的緩衝作用、2)牙齒的移動能(牙科矯正治療等使用的力學)及3)將咬合及矯正等侵害刺激(疼痛刺激等)傳送到中樞神經系統的神經傳達機能等三種。其中，尤其是牙根膜為了緩衝牙齒的咬合力，已知具有相對於牙根長軸方向之垂直方向驅動的纖維，在此牙根膜組織中的纖維驅動，為表現牙根膜機能之不可或缺的必要構成。
然而，在牙科用植體移植時，植體移植部位並不能形成如同存在於天然牙齒周圍之機能性牙周組織。因此，牙科植體的移植部位，將因長時間使用的咬合力，引起支撐彼等之齒槽骨的吸收，而有不耐使用的問題。
因此，在移植牙科用植體之際，長期以來冀盼可能形成與天然牙齒相同的牙周組織之技術。
迄今，為了在移植後的植體周圍形成牙周組織，已有使用來自牙周組織的培養細胞之探討。
<非專利文獻1>
本文獻揭示採自老鼠牙根膜的前驅細胞之培養細胞的利用。揭示將培養細胞與基質膠(matrigel)同時塗布在經SLA處理的植體。此外，本文獻提及將此植體移植到老鼠的牙齒缺損部位時，形成牙周組織。
但是，本文獻中，在植體周圍形成的牙根膜之驅動，是與植體的長軸方向平行，而與天然牙根膜不同。由於牙根膜之移行對於牙齒的咬合力之支撐具有重要意義，因此具有這樣的牙根膜之牙周組織，不能期待具有支撐咬合力的機能。
<非專利文獻2>
本文獻中揭示，將經珐瑯基質蛋白(Emdogain,Enamel Matrix Derivatives,EMD)處理的鈦植體移植到顎骨，同時將自牙根膜採集的PDL細胞注入移植部位的方法。此方法是意圖形成植體周圍的牙周組織，以琺瑯基質(enamel matrix)蛋白作為主成分，且併用藥劑者。而且，本文獻也提及與未混入上皮組織的齒槽骨結合的組織之形成。不過，在已形成的牙周組織中，未確認牙周組織之一的牙骨質結構。同時，也未確認牙周組織中的牙根膜之驅動。
如此迄今，仍無有關可形成機能性牙周組織的牙科用植體的報告。
[先前技術文獻] [非專利文獻]
[非專利文獻1]Lin Y et. al., J Dent Res. 2011 Feb；90(2)：251-6, Epub 2010 Dec 13.
[非專利文獻2]Craig RG et. al., J Oral Implantol. 2006；32(5)：228-36.
本發明的課題是提供牙科用植體移植後，可在植體的周圍形成機能性牙周組織之植體。
為解決上述問題，經本案發明人等深入探討，結果發現在牙科用植體的表面配置來自齒胚組織或來自牙根組織的細 胞塊，可在植體移植後的植體周圍形成機能性的牙周組織。
亦即，本發明是有關一種牙科用植體，是可形成機 能性牙周組織的牙科用植體，其特徵為：在前述植體表面配置來自齒胚組織或來自牙根膜組織的細胞塊，前述植體移植時，配置前述細胞塊的前述植體表面，是被患者的齒槽骨圍繞之全部或部份表面。
此處，本發明的可形成機能性牙周組織的牙科用植體之一實施形態之特徵為：前述來自齒胚組織的細胞塊為來自齒胚間葉組織或來自齒小囊組織的細胞塊。
此外，本發明的可形成機能性牙周組織的牙科用植體之一實施形態之特徵為：前述細胞塊為來自齒胚組織，前述齒胚組織為選自帽狀期、鐘狀前期及鐘狀後期所成群組中的任何一個發生階段。
此外，可形成本發明的機能性牙周組織的牙科用植體之一實施形態之特徵為：前述植體在植體移植後可矯正。
此外，可形成本發明的機能性牙周組織的牙科用植體之一實施形態之特徵為：前述形成的牙周組織為(i)具有機能性牙骨質及機能性牙根膜以及(ii)具有機能性神經纖維之中的至少一種。
此外，可形成本發明的機能性牙周組織的牙科用植體之一實施形態之特徵為：前述植體在植體的全部或部份表面，又含有表面塗布劑的塗布層，使前述細胞塊配置在前述塗布層的表面上。
此外，可形成本發明的機能性牙周組織的牙科用植 體之一實施形態之特徵為：前述表面塗布劑是選自羥磷灰石(hydroxyapatite)、α-磷酸三鈣、β-磷酸三鈣及膠原蛋白所形成之群組。
此外，可形成本發明的機能性牙周組織的牙科用植體之一實施形態之特徵為：前述植體可促進齒槽骨的再生。
此外，可形成本發明的機能性牙周組織的牙科用植體之一實施形態之特徵為：前述植體可改善齒槽骨的再生能。
然而，將以上所述之本發明的一或數種特徵任意組合者，當然也是本發明的牙科用植體。
此外，本發明的另一形態是有關植體的製造方法，其特徵是：可形成機能性牙周組織的牙科用植體之製造方法，其中包含在前述植體移植時，將來自齒胚組織或來自牙根膜組織的細胞塊配置在被患者的齒槽骨圍繞之植體的全部或部份表面之步驟。
此處，可形成本發明的機能性牙周組織的牙科用植體之製造方法的一實施形態之特徵為：前述來自齒胚組織的細胞塊為來自齒胚間葉組織或來自齒小囊組織的細胞塊。
此外，可形成本發明的機能性牙周組織的牙科用植體之製造方法的一實施形態之特徵為：前述細胞塊來自齒胚組織，前述齒胚組織為選自帽狀期、鐘狀前期及鐘狀後期所成群組中的任何一個發生階段。
此外，可形成本發明的機能性牙周組織的牙科用植體之製造方法的一實施形態之特徵為：在植體移植後可矯正前述植體。
此外，可形成本發明的機能性牙周組織的牙科用植體之製造方法的一實施形態之特徵為：前述形成的牙周組織具有(i)具有機能性牙骨質及機能性牙根膜以及(ii)具有機能性的神經纖維之中的至少一方之特徵。
此外，可形成本發明的機能性牙周組織的牙科用植體之製造方法的一實施形態之特徵為：在配置前述細胞塊的步驟前，又包含在植體的全部或部份表面，在植體移植時被患者之齒槽骨圍繞的表面上，形成表面塗布劑的塗布層的步驟，使前述細胞塊配置在前述塗布層的表面上。
此外，可形成本發明的機能性牙周組織的牙科用植體之製造方法的一實施形態之特徵為：前述表面塗布劑是選自羥磷灰石、α-磷酸三鈣、β-磷酸三鈣及膠原蛋白所成群組。
然而，將以上所述之本發明的一或數種特徵任意的組合者，當然也是本發明的牙科用植體之製造方法。
此外，本發明的另一形態是有關植體之移植方法，其特徵是：對牙齒缺損的哺乳動物之植體的移植方法，其中包含將上述植體移植到前述牙齒缺損部位之步驟。
此外，本發明的對牙齒缺損的哺乳動物之植體之移植方法的一實施形態之特徵為：前述動物為非人類哺乳動物。
藉由本發明的牙科用植體，可在植體移植後，於植體周圍形成機能性牙周組織。
然而，藉由本發明的牙科用植體，不僅可在植體移植後在植體周圍形成機能性牙周組織，也可促進植體移植部位周 邊齒槽骨之再生。此外，藉由本發明的牙科用植體，可改善植體移植部位周邊齒槽骨之再生能。
第1圖A(上段)表示摘取自胎齡18天的C57/BL/6老鼠的齒胚、來自成年老鼠的天然牙齒之影像。第1圖B(下段)表示自胎齡18天的C57/BL/6老鼠的齒胚分離的齒小囊組織、從來自成年老鼠的天然牙齒分離之牙根膜組織的影像。
第2圖表示對於牙根膜去除模型(model)移植齒小囊組織之際，在移植後第21天的牙周組織之HE染色像。HE染色像，是將顎骨的冠狀斷切片染色之影像，是自切齒方向朝後頭部方向見到的影像。第2圖A表示未移植齒小囊組織的對照區之HE染色像，第2圖B表示已移植齒小囊組織區域的HE染色像。然而，圖中的小星號(＊)表示關節僵硬(ankylosis)形成部位，D表示象牙質，AB表示齒槽骨，C表示牙骨質，PDL表示牙根膜。
第3圖是本發明的一實施形態，表示在具有羥磷灰石(也稱為HA)塗布層植體的該塗布層上，已貼附齒小囊組織的植體(齒小囊賦與HA植體)之移植模型的概略圖。第3圖A表示天然齒列，第3圖B表示第一臼齒的拔牙及牙肉治療，第3圖C表示移植窩的製作，第3圖D表示齒小囊賦與HA植體的移植。
第4圖是本發明的一實施形態，表示已捲附齒小囊組織的HA植體(齒小囊賦與HA植體)之實體像(左中圖)，及該等的GFP螢光像(右中圖表示自側面攝影的影像，右圖表示自底面攝影的影像)。此外，表示在具有捲附齒小囊組織前的羥磷灰石塗布層的植體 (HA植體)之實體像(左圖)。第4圖B表示HA植體及齒小囊組織賦與HA植體移植後當下(左圖)與移植後第21天的CT影像(左中圖、右中圖、右圖)。箭形記號表示牙根膜腔的形成。
第5圖表示本發明的一實施形態之齒小囊賦與HA植體移植後之牙周組織(下段)、天然牙齒的牙周組織(上段)，以及HA植體移植後的周圍組織(中段)之HE染色像。imp表示植體。
第6圖是本發明的一實施形態，表示將賦與來自GFP老鼠的齒小囊組織之HA植體移植到口腔內，移植後第21天的植體周圍之實體像、GFP螢光像及實體像與GFP螢光像重合之圖(上段的影像表示自舌側的側面攝影的影像、下段的影像表示自上顎側(上方)攝影的影像)。箭形記號表示植體。
第7圖表示本發明的一實施形態之齒小囊賦與HA植體移植之際形成的牙根膜之偶氮卞紅染色(azan stain)像(右圖)，及天然牙根膜之偶氮卞紅染色像(左圖)。
第8圖表示將本發明的一實施形態之齒小囊賦與HA植體移植之際形成的牙周組織(下段)，及天然牙齒之牙周組織(上段)，利用掃描型電子顯微鏡攝影的影像。
第9圖表示將本發明的一實施形態之齒小囊賦與HA植體移植之際形成的牙周組織，利用穿透型電子顯微鏡攝影的影像。
第10圖表示本發明的一實施形態之齒小囊賦與HA植體移植之際形成的牙周組織中，利用X線微分析儀解析鈦(Ti)、鈣(Ca)及磷(P)的元素分布之影像(第10圖中的上段影像)。第10圖中下段的影像表示對應於已解析各元素分布的影像(上移影像)之實體像的影像。
第11圖表示本發明的一實施形態之齒小囊賦與HA植體移植之際形成的牙周組織中，利用X線微分析儀解析鈦(Ti)、鈣(Ca)及磷(P)的元素分布之影像，及將該三元素的分布影像重合的影像。
第12圖表示在植體移植後形成的牙根膜組織中的神經纖維解析使用之植體移植模型中，切齒、臼齒與植體的位置關係之模式圖。
第13圖A表示在本發明的一實施形態之齒小囊賦與HA植體、天然牙齒、HA植體上施加矯正力的試驗中，將矯正前及矯正後的影像重合之圖像。第13圖B表示施加矯正力之際的天然牙齒、移植後的HA植體及移植後的齒小囊賦與HA植體的移動距離之圖形。
第14圖表示在本發明的一實施形態之齒小囊賦與HA植體、天然牙齒、HA植體上施加矯正力之後，第6天的壓迫側之骨吸收標記(marker)(CSF-1)及牽引側的骨形成標記(Ocn)之表現，以原位雜交(in situ hybridization)進行解析的切片影像。圖中，箭形記號表示CSF-1的表現部位，箭頭表示Ocn的表現部位。
第15圖表示在本發明的一實施形態之齒小囊賦與HA植體、天然牙齒及HA植體的周圍之牙根膜區域中，觀察末梢神經標記的神經絲(Neuro Filament)之表現時之影像(相位差像、螢光像及相位差像與螢光像的重合影像)。
第16圖表示對於本發明的一實施形態之齒小囊賦與HA植體、天然牙齒及HA植體的周圍之牙根膜，以矯正力施加侵害刺激，2小時後藉由原位雜交(in situ hybridization)對在三叉神經脊 髓路核表現的c-Fos蛋白質進行解析的切片影像。圖中，箭形記號表示c-Fos蛋白質之表現部位，T表示三叉神經脊髓路核。
第17圖上段表示三壁性骨缺損模型的製作步驟之模式圖。此外，第17圖下段表示三壁性骨缺損模型的實體照片、三元結構的微CT影像(三元CT影像)及微CT影像(冠狀斷及水平斷)，第17圖C表示植體的移植。
第18圖表示對於三壁性骨缺損模型的本發明的一實施形態之齒小囊賦與HA植體(下段)或HA植體(中段)移植之際，移植日(第0天)以及自移植日後第14天、第28天及第50天的三壁性骨缺損模型的齒槽骨之三元CT影像。此外，第18圖上段表示未對於三壁性骨缺損模型移植植體等之際的三壁性骨缺損模型的齒槽骨之三元CT影像。圖中的箭形符號表示齒槽骨已再生至原來的高度。
第19圖表示對於三壁性骨缺損模型的本發明之一實施形態的齒小囊賦與HA植體移植之際，移植日(第0天)以及自移植日的第14天、第28天及第50天的齒槽骨之微CT影像(上段：箭狀斷、中段：水平斷、下段：冠狀斷)。圖中的箭頭表示牙根膜腔樣的間隙。
第20圖表示對於三壁性骨缺損模型的本發明之一實施形態的齒小囊賦與HA植體或HA植體移植之際，移植日後第50天的齒槽骨之再生量的比例圖。此外，表示以未移植植體的三壁性骨缺損模型中的齒槽骨之再生量的比例。圖形中100%表示齒槽骨缺損前的狀態之齒槽骨的量。
第21圖表示對於三壁性骨缺損模型的本發明之一實施形態 的齒小囊賦與HA植體(下段)或HA植體(中段)移植之際，移植日(第0天)及第50天的齒槽骨之箭狀斷的截斷面影像。此外，表示將HA植體移植至齒槽骨側面未缺損的一般齒槽骨(上段)之際，移植日(第0天)及第50天的齒槽骨之箭狀斷的截斷面影像作為對照。
第22圖表示對於三壁性骨缺損模型的本發明之一實施形態的齒小囊賦與HA植體或HA植體移植之際，移植日後第50天中，植體埋入齒槽骨內之量的圖形。此外，表示將HA植體移植至齒槽骨側面未缺損的一般齒槽骨之際，移植日後第50天植體埋入齒槽骨之量的圖形。
與本發明相關的牙科用植體，是可形成機能性牙周組織的牙科用植體，其特徵是：使來自齒胚組織或來自牙根膜組織的細胞塊配置在植體的表面，配置細胞塊的植體之表面，是在植體移植時被患者的齒槽骨圍繞之全部或部份的表面。
「植體」，是指一般對人類或動物以醫療為目的而使用的埋入生體內之器具。本說明書中，「植體」尤其是指取代掉牙而埋入顎骨中的牙科用人工牙齒。
本發明中使用的植體之材料，只要是對生體無害、具有生體親和性、可耐咬合的高強度材料即可，可使用過去以來即使用作為植體的材料。植體的材料，可列舉：例如金屬製、金屬合金製、塑膠材料製、陶瓷製、複合材料、骨替代材料等。
本發明中可使用作為植體的金屬及金屬合金，可列舉：例如鈦、鋼鐵、鐵、合金鋼、鐵合金、鈦合金、CoCr合金、銀、銅、鈣、鎂、鋅等。
本發明中可使用作為植體的塑膠材料，可列舉：例如聚乙烯、聚丙烯、聚四氟乙烯、對苯二甲酸乙二酯、聚醯胺類、聚胺酯類、聚矽氧烷類、聚矽氧烷彈性體類、聚醚醚酮類、聚碸類、多糖類及聚乳酸類等聚合物。
可使用作為本發明中的植體之陶瓷材料，可列舉：例如氧化鋁、氧化鋯、氧化鈦、氧化矽等氧化物或氮化物，例如，如羥磷灰石的磷酸鈣、玻璃及玻璃陶瓷，並宜為可在生理的條件下溶解或分解的玻璃及玻璃陶瓷等。
本發明的植體中使用的材料，就生體適合性或力學的適合性而言，是以使用鈦或鈦合金更佳。此外，骨替代材料，可列舉：例如自家牙齒、可自同種個體獲得的牙齒，或可自異種個體獲得的牙齒等。
本發明中使用的植體之形狀或大小，可配合移植者的牙齒缺損部位，由該業者適宜設計。
此外，本發明的一實施形態中的牙科用植體，可在其表面上形成表面塗布劑的塗布層。
本說明書中的「表面塗布劑」，是指使細胞塊接著在植體之際形成立腳點使用者。在植體表面形成的表面塗布劑之塗布層，可提高細胞塊對植體的接著。
本發明中使用的表面塗布劑，可列舉：例如羥磷灰石、α-TCP(磷酸三鈣)、β-TCP或膠原蛋白等凝膠材料。
尤其羥磷灰石具有促進骨格形成的生物活性，可促進植體移植後的植體周圍形成牙骨質，或促進植體對骨的著生。就此而言，羥磷灰石宜使用作為表面塗布劑。
又，本發明的植體之材料，可使用例如具有與羥磷灰石等表面塗布劑相同效果的材料作為植體之材料。此時，植體整體具有與表面塗布劑的塗布層相同之層，可在植體表面上直接配置來自齒胚組織或來自牙根膜組織的細胞塊。或者，可將與植體材料不同的表面塗布劑塗布在植體表面上，再將細胞塊配置在其表面上。
表面塗布劑是植體的全部或部份的表面，可在植體移植時以被覆在被患者的齒槽骨圍繞的表面上之方式進行塗布。此外，表面塗布劑的塗布層，是以介在植體與配置在植體之細胞塊之間之方式形成。
植體移植時被患者的齒槽骨圍繞的表面上，是指植體的表面上，在移植植體後被埋入患者的牙齒缺損部位內的部份。此部份將來可與患者的牙周組織連結。
表面塗布劑的塗布方法，可應用該業者已知的方法進行。例如，在將羥磷灰石塗布在植體之際，可應用蒸鍍、電漿熔射法等進行。表面塗布劑的層厚度或表面塗布劑的塗布範圍，該業者可視塗布對象的植體或移植者的缺損部位而適宜設計。本發明的一實施形態中，例如可使塗布層之厚度為1μm至2μm。
此外，除了如上述的使表面塗布劑在植體表面形成塗布層之外，也可使用市售已塗布羥磷灰石等表面塗布劑之植體。
「牙周組織」，是指以牙齒為主而在外層形成的牙骨質、牙根膜、齒槽骨及由牙肉構成的組織。因本發明之植體移植而形成的牙周組織，特別是牙骨質、牙根膜及齒槽骨。在本發明的植體移植後形成的牙骨質及牙根膜，可藉由與患部的齒槽骨或 牙肉連結而形成牙周組織。
牙骨質、牙根膜及齒槽骨，可以藉由組織染色而容易鑑定形態。染色方法，可使用例如通常的蘇木精-伊紅染色(HE，hematoxylin-eosin staining)。在進行組織染色時，該業者例如經過以4%三聚甲醛(paraformadehyde：PFA)將試樣品固定、以10%乙烯二胺四醋酸(ETDA)脫灰、石蠟包埋、然後製作厚度10μm的連續切片等步驟後，即可進行HE染色。此外，該業者除了上述例示以外，也可依照一般的方法進行組織染色，進行組織學的評估。
本說明書中的「齒胚」，是指已決定將來會長成牙齒之齒的初期胚，係指牙齒的生成階段中一般使用自蕾狀期(bud stage)、帽狀期(cap stage)至鐘狀期(bell stage)的階段者，尤其是指作為牙齒的硬組織之特徵的象牙質、琺瑯質之蓄積尚未能確認之組織。
本發明的一形態中，作為本發明中可使用的齒胚組織，可使用帽狀期、鐘狀期前期、鐘狀期後期的齒胚。此等帽狀期、鐘狀期前期、鐘狀期後期的齒胚，在與植體同時移植時，因對於機能性的牙周組織具有高分化能而較佳。尤其以使用鐘狀期前期的齒胚更佳。來自鐘狀期前期齒胚之細胞塊，因可隨著牙骨質的形成而更加促進機能性牙周組織的形成，故較佳。
又，例如為老鼠時，胎齡3至15天是相當於帽狀期，胎齡16至15天是相當於鐘狀前期，胎齡19至出生後是相當於鐘狀後期。
此外，作為本發明中可使用的齒胚，也可使用藉由細胞培養技術人工形成的「再生齒胚」。在使用再生齒胚時，可採 用適宜的發生階段之細胞塊。本發明中使用的再生齒胚，可以是任何方法製作的齒胚，例如可藉由包含使實質上以間葉系細胞質構成的第1細胞集合體與實質上以上皮細胞構成的第2細胞集合體密著之配置的步驟、以及以支撐擔體的內部培養第1及第2細胞集合體的步驟之方法製作。
再生齒胚的製造方法，已記載於例如國際公開2006/129672號公開小冊、日本特開2008-29756號公報、日本特開2008-206500號公報、日本特開2008-200033號公報、日本特開2008-29757號公報、國際公開2011/056007號公開小冊、國際公開2011/056008號公開小冊中說明，已將此等文獻之說明全部彙集在本說明書中作為參照。
齒胚及其他的組織，除了哺乳動物的靈長類(例如人類、猴等)、有蹄類(例如豬、牛、馬等)、小型哺乳類的齧齒類(例如小鼠、老鼠、兔等)之外，也可採自狗、猫等各種動物的顎骨或牙周組織等。齒胚及組織的採取，以及自齒胚的組織之分離，通常只要直接適用採取組織的條件，以無菌狀態取出，保存在適當的保存液中即可。然而，人類的齒胚，雖然除了所謂第3大臼齒的智齒之齒胚以外，也可舉出胎兒齒胚，但就自家組織的利用而言，宜使用智齒的齒胚。
本說明書中的「細胞塊」，是指可配置在植體表面之來自齒胚組織或牙根膜組織的細胞塊。同時，細胞塊是由來組織的全部或一部份，至少可部份性維持形成組織的細胞之間的機能性結合。
可使用於本發明中的來自齒胚組織之細胞塊中，含 有齒胚間葉組織、齒小囊組織等。齒胚間葉組織存在於蕾狀期、帽狀期或鐘狀期前期的齒胚中。此外，本發明中使用的牙根膜組織，可取自完成齒。自齒胚組織分離齒胚間葉組織、齒小囊組織，及自完成齒分離牙根膜組織，通常只要直接適用採取組織之條件，以無菌狀態取出，保存在適當的保存液中即可。此時，也可使用酵素，以容易進行分離。酵素，例如有分散酶、膠原蛋白酶、胰蛋白酶(trypsin)等。
同時，細胞塊，也可將自生體摘出的組織經物理性切斷成數塊細胞塊後使用。此時，細胞塊宜切斷成為可部份性保持形成組織之際的細胞間的機能性結合之樣態。尤其是，以使切斷後的細胞塊保持可區別組織外側及組織內側的形狀更佳。如此則本發明中使用的細胞塊，因具有部份組織形成之際的細胞之間的機能性結合，在與植體同時移植之際，可形成具有正常機能的牙周組織之形狀。又，切離的細胞塊之形狀，只要具有容易配置在植體表面之形狀，即無特別的限制，例如，可切離成短箋狀的細長條。這樣的細胞塊之切離，通常只要直接適用被用來採取組織的條件即可。
在植體的表面上配置細胞塊的方法，並無特別的限制。例如，可將切離成短箋狀的細胞塊以不使細胞塊相互重合的貼附在植體之表面上。或是，以不使細胞塊相互重疊的樣態捲附在植體之表面上而配置。此時，使已貼附細胞塊的植體在大氣中稍微乾燥，即可提高接著性。此外，在植體之表面上具有表面塗布劑的塗布層時，可將細胞塊配置在表面塗布劑的塗布層的更表面上。
本發明的一形態中，將細胞塊配置在植體表面上的位置，可配置在植體移植後被患者的齒槽骨圍繞之表面上的全部或部份。此外，宜配置在植體移入患者的齒槽骨的範圍。此外，宜配置成使細胞塊中形成組織內側之側面接觸植體表面之樣態。藉由如此配置，使形成組織外側之側面，與患者的齒槽骨對向。
又，本說明書中，例如將已配置齒小囊細胞的人工牙根稱為齒小囊賦與人工牙根。
此外，本發明的另一形態是提供一種植體的移植方法，其中包含將以本發明相關的植體之製造方法製造的植體，移植到牙齒的缺損部位之步驟。
藉由本發明相關的植體，在植體移植後，即可在植體周圍形成機能性的牙周組織。
本發明相關的將植體移植到口腔內牙齒缺損部位的方法，宜使配置在植體的來自齒胚組織或來自牙根膜組織的細胞塊中，形成組織內側之側與植體的表面接觸。藉此，使形成組織外側之側面，與患者的齒槽骨對向配置。如此，因使來自齒胚組織或來自牙根膜組織的細胞塊近似於存在實際的天然牙齒的牙周組織之狀態，而可促進機能性牙周組織之形成。
又，缺損部位，是指因拔牙等而設置在齒肉中的部份，其形狀並無特別限制。只要可埋設本發明的植體，對於缺損處、目的牙齒的種類即無特別限定。
缺損部位通常位於顎骨、口腔的齒槽骨等。如因隨著牙齒的喪失而使齒槽骨量降低時，也可由針對缺損部位以GTR法(guided tissue regeneration；組織再生誘導法)等，為埋設植體而 藉由臨床使用的已知方法進行骨的再生，而使骨量增加。在配置到作為植體對象的缺損部位之後，宜依照通常的處理進行縫合等。
此外，在將植體移植到缺損部位之際，為防止貼附在植體表面上的細胞塊自表面剝離，也可以外科手段使缺損部位形成具有較植體徑稍大之徑。在將植體移植到具有這樣大徑的缺損部位時，可使移植後的植體與患者的齒骨槽之間的空間充滿來自周圍組織的血液。
在與本發明相關的植體之移植方法中，宜使移植對象與製造植體時摘出使用的齒胚組織或牙根膜組織的動物同種，使移植對象與摘出齒胚組織或牙根膜組織的個體為同一個體更佳。動物可舉出包含人類、牛、馬、豬、狗、猫、老鼠等哺乳動物。以非人類哺乳動物為佳。
植體的移植部位，該業者可容易的由目視或CT影像等觀察形態。CT影像或CT剖面像，該業者可由已知儀器之使用而易於攝影。在CT影像中，可使用例如實驗動物用3D微X線CT R_mCT(Rigaku)，例如可於90kV、150mA、斷層厚10mm的條件下進行。此外，該業者可在CT攝影後使用適當的影像解析軟體，進行影像構築及解析等。影像解析軟體，可使用：例如小動物用影像歸檔軟體(filing software)i-VIEW型R及高精密3D/4D影像解析軟體Imaris(Bitplane)。此外，只要是該從業者，除了上述例示之外，也可使用相同的儀器設定適切的條件，利用相同的影像解析軟體，進行CT攝影及解析。
藉由本發明的植體，在移植到患者後，可於植體周圍形成牙周組織。本發明中的機能性牙周組織，是指(i)具有機能 性牙骨質及機能性牙根膜，或(ii)具有機能性神經纖維之意，並宜為兼具(i)及(ii)的兩項特徵者。
亦即，機能性牙周組織，例如，可以是否具有機能性牙骨質及機能性牙根膜進行評估。機能性牙骨質及機能性牙根膜，是指例如在以HE染色、偶氮卞紅染色等進行組織學的分析之際，可以確認是否具有與天然牙齒的牙周組織同等的層結構進行評估。此處，天然牙齒的牙根膜，通常具有相對於牙根的長軸方向之垂直方向驅動的牙根膜纖維。此牙根膜，尤其是擔當支撐牙齒的咬合力之重要角色。所以，藉由解析是否形成與天然牙齒同樣相對於植體的長軸方向垂直驅動的牙根膜纖維，尤其可評估牙根膜之機能。牙周組織形態之解析或牙根膜之驅動的解析，除了上述方法之外，也可應用例如掃描型電子顯微鏡或穿透型電子顯微鏡觀察其形態。此外，為了確認牙周組織中的硬組織-纖維性組織-硬組織之三層結構，例如藉由使用X線微分析儀解析元素的分布，可確認牙周組織的層結構。
另外的方法，可如下述實施例4中所述，進行相對於矯正力的負荷之骨再構築(bone remodeling)的機能。或是，可藉由解析移植後的植體可否因矯正力的負荷而移動以進行評估。在評估骨再構築時，可以例如解析矯正力負荷後的骨形成標記及/或骨吸收標記之表現而進行評估。本發明的植體移植之際形成的牙周組織，在施加與天然牙齒相同的矯正力時，與天然牙齒比較，具有68%的移動量，並以具有80%以上的移動量為佳。
此外，機能性牙周組織，可以是否具有機能性神經纖維進行評估。機能性神經纖維，是指對於牙周組織有刺激等時， 可將刺激傳達到中樞神經系統的神經纖維。神經纖維是否具有機能性，可藉由例如下述實施例6中所述的方法，對評估對象的牙周組織以矯正力負荷施加刺激後，解析三叉神經路核中的c-fos之表現以進行評估。
此外，藉由本發明的牙科用植體，不僅可形成機能性牙骨質或牙根膜，也可促進齒槽骨的再生，並改善齒槽骨的再生能。本說明書中的「改善齒槽骨的再生能」，是指在如部份齒槽骨缺損的移植部位中，藉由移植與本發明相關的牙科用植體，與以往的植體移植的情形或未移植植體的情形比較，可使齒槽骨再生成近似於齒槽骨的原來形狀之意。藉此，與本發明相關的牙科用植體，可防止植體移植後因齒槽骨之部份缺損而逐漸落入齒槽骨內之狀況，而可維持移植後的植體之位置(例如，高度)或方向等。
又，本說明書中使用的用語，是為說明特定的實施形態而使用，並無限定發明的意圖。
此外，本說明書中使用的「包含」之用語，是除去文章脈絡上明顯曲解的所有情形，意指存在所述的事項(構件、步驟(階段)、要素、數字等)，並不排除存在此之外的事項(構件、步驟(階段)、要素、數字等)。
只要無不同的定義，此處使用的所有用語(包含技術用語及科學用語)，具有與本發明的所屬技術之該業者廣為理解的相同意義。此處使用的用語，只要無明示不同的定義，均可解釋為具有本說明書及相關技術領域中的意思之整合性意思，不能解釋為理想化或過度形式上的意含。
本發明的實施形態雖然是一面參照模式圖一面說明的情形，如為模式圖時，為能明確說明也有誇張表現的情形。
第一、第二等的用語雖然是為表現各種的要素而使用，但可理解此等要素並不受限於該等用語。此等用語是僅為區別一個要素與其他的要素而使用，例如，可將第一要素記為第二要素，同樣的，將第二要素記為第一要素，並不脫離本發明的範圍。
本說明書中，為表示數值範圍等而使用的數值，如無特別的明示，可解釋為包含用語「大約」之意。例如，「10倍」，如無特別的明示，可理解為「大約10倍」之意。
本說明書中引用的文獻，其中的所有說明均為本說明書中所援用，該業者依照本說明書之脈絡，不脫離本發明的精神及範圍，援用該等的先前技術文獻中相關的說明內容作為本說明書之一部份以進行理解。
以下，參照實施例更詳細說明本發明。不過，本發明可由各種形態而更具體實現，不能解釋為受限於此處所述之實施例。
[實施例] <實施例1. 由牙根膜去除模型的齒小囊組織移植解析牙周組織形成能>
(齒小囊組織之調製)
本實驗中的齒小囊組織，是得自鐘狀期的胎齡18天的C57/BL/6老鼠。具體上，齒小囊組織是由成為下顎第一臼齒的齒胚分離。齒胚的摘出，是依照Nakao等的方法(Nakao K,et al.Nat Methods.2007；4(3)：227-30.)進行。
自摘出之胎齡18天的齒胚摘出齒小囊組織的方法，是如下述進行。以含有Ca2+及Mg2+的PBS(-)(phosphate-buffered saline)清洗齒胚二次後，使用100U/mL膠原蛋白酶I(Worthington，Lakewood，NJ)以室溫進行2分鐘的酵素處理。然後，在已添加含有20U/mL DNase I(Takadabio，滋賀，日本)的Fetal calf serum(ECG；Hyclone，Logan，UT)及100U/mL盤尼西林(penicillin)、100mg/mL鏈黴素(streptomycin)(SIGMA，St.Louis，MO)的Dulbecco’s modified eagle medium(D-MEM，WAKO，大阪，日本)中，以25G針(NN-2516R，Terumo，東京，日本)物理性的將組織分離。自老鼠胎齡18天的齒胚分離的齒小囊組織，具有囊狀的形態(參照第1圖)。
(牙根膜去除模型的製作及齒小囊組織之移植)
為解析牙根膜去除部位中的牙周組織形成能，以Saito等的方法(Saito M，et al.J Biol Chem.2011；286(44)，38602-13.)，去除4週齡的C57/BL/6老鼠之第二臼齒的牙根膜(牙根膜去除模型)。更具體言之，是在深度麻醉下的老鼠中，藉手技上的問題而方便的將下顎第一臼齒拔牙。然後，自隣接在第一臼齒的第二臼齒之齒槽中隔，使用25G針(NN-2516R，Terumo，東京，日本)將第二臼齒的頰側側面之牙根膜物理性的去除。
將自老鼠胎齡18天的齒胚分離的齒小囊組織，物理性的切離形成短箋狀的數個細胞塊。接著，以使齒小囊組織的內側形成的細胞塊之側面朝向已去除牙根膜的第二臼齒牙根側貼附在牙根膜去除部位的方式進行移植。此時，使各別細胞塊不重疊的貼附在牙根膜除去部位。移植後第21天將顎骨摘除，以HE染 色進行齒小囊組織移植部位的組織解析。
在未移植齒小囊組織的對照區上，除去牙根膜部位 的牙根膜組織之大部份有埋入盡骨樣組織的骨性癒著(ankylosis)之生成(第2圖A的小星號)。相對於此，已移植齒小囊組織的區域，則形成正常的牙骨質與牙根膜。此外，在已移植齒小囊組織的群中，確認具有相對於牙根之長軸方向垂直驅動的牙根膜組織，已形成與天然牙齒同等的牙周組織結構(第2圖A及第2圖B)。由此可顯示，齒小囊組織可形成以牙骨質、牙根膜組織、及以齒槽骨構成的牙周組織之全部組織，在牙根膜損傷部位中也可形成牙周組織。
<實施例2. 藉由已賦與齒小囊組織的植體之移植評估牙周組織形成能>
(植體的調製)
移植用的植體體，是將直徑0.6mm的鈦線(株式會社Nilaco，東京，日本)切出長度1.7mm，在根尖方向側大約0.5mm成形為圓錐形即製成。植體體的表面以真空蒸鍍進行羥磷灰石的塗布，藉由被覆厚度2μm的羥磷灰石層，製成塗布羥磷灰石的植體體(以下，稱為HA植體)(山八齒材工業株式會社，愛知縣，日本)
以與實施例1相同的方法，在HA植體周圍，捲附自胎齡18天的C57BL/6老鼠摘出的齒小囊組織(以下稱為齒小囊賦與HA植體；第4圖A)。又，齒小囊組織是使用以外科切離之數個短箋狀的細胞塊。對HA植體的細胞塊配置，是以不使細胞塊之間重疊的方式捲附。此外，使形成齒小囊組織內側的細胞塊 之側面，與HA植體的表面接觸。
(齒小囊賦與HA植體對顎骨之移植及著生評估)
將4週C57BL/6老鼠的下顎第一臼齒拔下，設置牙齒缺損部位，設計4至5日間的牙肉治癒期間。然後，進行下顎第一臼齒的拔牙部位之牙肉切開、剝離。利用牙科用微馬達(Viva-Mate Plus，Nakanishi，東京，日本)及牙科用鉸刀(MANI，栃木，日本)切削牙齒缺損部位的齒槽骨，形成直徑0.9mm、深度1.2mm的移植窩。將上述製作的齒小囊賦與HA植體移植在移植窩中。也製作移植未捲附齒小囊組織的HA植體的對照區。以8-0尼龍縫合線(Bearmedic，千葉，日本)縫合植體移植部位的牙肉(第3圖)。各移植植體的老鼠，在移植後當下及移植後第21天進行微CT攝影(In vivo Micro X-ray CT System；R_mCT，株式會社Rigaku，東京，日本)。影像數據是使用統合影像處理軟體(i-VIEW-3DX，株式會社Morita，大阪，日本)經時評估植體與患者的齒槽骨之結合。此外，在移植後第21日，自患者老鼠摘出含有植體的顎骨，以HE染色進行組織學評估。
移植後第21日，在已移植HA植體的對照區中，呈現出齒槽骨直接結合在植體表層的骨整合(osseointegration)(第4圖B及第5圖)。相對於此，在賦與齒小囊組織的HA植體中，在植體表層與周圍齒槽骨之間確認有牙根膜腔(第4圖B下段、右中圖中的箭形記號)。此外，在賦與齒小囊組織的HA植體中，在HE染色圖像中，由植體表層可確認所謂的牙骨質、牙根膜、齒槽骨等與天然牙齒的牙周組織同等的組織結構(第5圖)。
並且，為確認形成的牙周組織是來自與植體同時移 植的牙周組織，而同樣製作並移植已賦與來自GFP老鼠(C57BL/6-Tg(CAG-EGFP)老鼠)(日本SLC株式會社，日本)的齒小囊組織的HA植體體，觀察移植部位。移植部位，是利用螢光實體顯微鏡(AxioLumer，Carl Zeiss，Jene，德國)，對GFP發色進行攝影。其結果是，第21天在植體周圍的牙根膜、齒槽骨區域觀察到來自GFP老鼠的組織之形成(第6圖)。由此可顯示，藉由賦與齒小囊組織的植體的移植，具有伴隨牙周組織形成而著生於患者顎骨之可能性。
<實施例3. 植體移植後形成的牙周組織之解析>
如實施例2中所示，齒小囊賦與HA植體的移植，形成著生於顎骨的牙周組織。此處，為解析齒小囊賦與HA植體移植後形成的牙根膜之驅動，將天然牙齒的牙周組織、齒小囊賦與HA植體移植後第21天的植體周圍之牙周組織、以及未捲附齒小囊組織的HA植體移植後第21天的植體周圍之牙周組織，以偶氮卞紅染色後，解析牙根膜之驅動。
此外，為解析齒小囊賦與HA植體移植後形成的牙周組織之形態，藉由掃描型電子顯微鏡及穿透型電子顯微鏡觀察齒小囊賦與HA植體移植後第28天的植體周圍之牙周組織，以解析植體移植後形成的牙周組織之形態。
並且，為確認齒小囊賦與HA植體移植後形成的牙周組織中，是否形成硬組織-纖維性組織-硬組織的三層結構，對於齒小囊賦與HA植體移植後第28天的植體周圍之牙周組織，進行使用X線微分析儀的鈦(Ti)、鈣(Ca)及磷(P)之元素分布的解析。
(由偶氮卞紅染色解析牙根膜之驅動)
以與實施例2相同的方法，將齒小囊賦與HA植體移植到4週齡C57BL/6老鼠的下顎第一臼齒缺損部位。移植後第21天將顎骨摘出，將顎骨在4%三聚甲醛溶液中進行固定24小時。然後，使用10%甲酸檸檬酸鈉及22.5%甲酸脫灰液進行72小時的脫灰操作。脫灰操作之後，進行顎骨的石蠟包埋。包埋後，利用凍結切片機(CM3050S；Leica micrisystems)將顎骨製作成6μm厚的切片。
接著，將製作成6μm厚的石蠟切片，浸漬在二甲苯中6分鐘。然後，在100%、90%、70%乙醇中分別浸漬3分鐘去除石蠟。對已去除石蠟的切片，以流水沖洗5分鐘使其與水平衡之後，浸漬在10%三氯醋酸．10%重鉻酸鉀中15分鐘。再以流水沖洗切片之後，浸漬在胭脂紅G(azocarmine G)液中30分鐘，使核以及細胞質染色。以流水將胭脂紅清洗之後，在苯胺．乙醇中進行10秒的浸漬分離，在醋酸乙醇中浸漬1分鐘後停止分離。分離停止後以流水清洗切片，浸漬在5%磷鎢酸(phosphotungstic acid)中1小時。浸漬後，再度以流水清洗之後，浸漬在苯胺藍．橙G混合液中10分鐘，使牙根膜纖維染色。最後以100%乙醇進行分離，在二甲苯中浸漬6分鐘使清晰。然後，利用四氫大麻酚(tetrahydrocannabinol，marinol)封入以實施組織解析。
移植齒小囊賦與HA植體後，第21天在植體周圍形成的牙根膜組織，有如同天然牙齒的牙根膜之驅動，具有對於植體的長軸方向之垂直方向的驅動(第7圖)。
(應用電子顯微鏡的形態解析)
以與實施例2相同的方法，將齒小囊賦與HA植體 移植到4週齡C57BL/6老鼠的下顎第一臼齒缺損部位。在植體移植後第28天，於老鼠深度麻醉下使用Karnovasky固定液進行經心的灌流固定。經心的灌流固定之後，摘出老鼠的顎骨，然後，在4℃的條件下以31%四氯化鋨進行顎骨的後固定。接著，以乙醇使顎骨脫水後，在臨界點乾燥器(HCP-2，日立，東京，日本)中使其乾燥，在環氧樹脂中進行取代．包埋。
以環氧樹脂包埋的試料之一部份，利用金剛石磨盤(diamond disc)以使移植的植體之中央部份成為切斷面的方式切出縱斷。應用離子濺鍍器(E-1030，日立)進行切出試料之導電處理，進行Au-Pd蒸鍍處理。然後，將已蒸鍍Au-Pd的試料，應用掃描型電子顯微鏡(S-4700，日立)，以加速電壓5kV進行觀察。同時，與上述方法相同，也由別的C57BL/6老鼠製作天然牙齒試料，應用掃描型電子顯微鏡觀察天然牙齒的牙周組織。
此外，對於由已移植齒小囊賦與HA植體的老鼠製作的環氧樹脂包埋後之試料的一部份，應用Ultramicrom(ULTRA CUT-UCT；Leica microsystems)製作100nm的超薄切片。製作的切片，應用穿透型電子顯微鏡(H-7600，日立)，以加速電壓75kV進行觀察。
如同上述，取得齒小囊賦與HA植體移植第28天的植體周圍的牙周組織之掃描型電子顯微鏡(SEM)影像，進行觀察。其結果是，在SEM影像中，可觀察到由植體表層朝齒槽骨伸展的緻密牙根膜之纖維束與層板狀的牙骨質之形成，確認與天然牙齒是幾乎相同的組織形態(第8圖)。此外，在觀察植體移植後的植體周圍的牙周組織之SEM影像中，觀察到植體表層與牙根膜纖維 之結合(第8圖下段)。此外，在觀察植體移植後的植體周圍的牙周組織之穿透型電子顯微鏡(TEM)影像中，也觀察到牙骨質與牙根膜纖維之結合(第9圖中箭形記號)。
(應用X線微分析儀的元素分析)
為更明確的解析齒小囊賦與HA植體移植後的植體周圍之牙周組織中的硬組織-纖維性組織-硬組織之三層結構，應用X線微分析儀進行元素分布的解析。選擇植體的構成元素之鈦(Ti)、骨組織與牙骨質的構成元素之鈣(Ca)及磷(P)作為解析對象元素，解析各元素的分布。此外，元素分布的解析，是針對來自上述掃描型電子顯微鏡的解析中使用的相同老鼠的試料(包埋在環氧樹脂中，以金剛石磨盤切出縱斷狀的試料)，應用電子束微分析儀(EPMA-1610，島津製作所，京都，日本)進行上述三元素的分布之解析。
由解析結果發現，鈦製的植體表層有Ca及P的分布(第10圖)。由於植體表面的羥磷灰石塗布層之厚度為2μm以下的非常薄質，故認為此表層的Ca及P的分布，是來自含有Ca及P作為構成元素之牙骨質。所以，可知植體表面有由牙骨質構成的硬組織之形成。此外，植體移植後的植體周圍的牙周組織之SEM影像中，在纖維伸展的部份中，未能確認Ca與P的分布。由於牙根膜不含有Ca及P作為構成元素，故可知未能確認Ca與P的分布之部份，確保是牙根膜區域。
此外，使各構成元素的分布影像重合，再更明確的觀察三元素的分布時，在植體表面上(Ti表面上)，可確認Ca及P蓄積之佈點(第11圖)。
<實施例4. 植體移植後形成的牙根膜之機能解析>
為解析齒小囊賦與HA植體移植後形成的牙根膜之機能，對於天然牙齒、移植後第21天的齒小囊賦與HA植體、移植後第21天的未捲附齒小囊組織的HA植體，進行實驗性矯正，量測牙齒及植體的經時移動量。此外，解析在矯正力負荷後的牙周組織中的骨吸收標記與骨形成標記之表現，作為實驗性矯正的骨再構築之解析。
(植體之實驗性矯正)
天然牙齒及植體的實驗性矯正，及因矯正力負荷而造成天然牙齒及植體之移動量的解析方法，如下述進行。以與實施例2相同的方法，將齒小囊賦與HA植體及HA植體分別移植到C57/BL/6老鼠中。移植後第21天將老鼠於深度麻醉下固定。將直徑0.010吋的鎳鈦線(VIM-NT，Oralcare Co.,Ltd.東京，日本)在下顎切齒與作為矯正對象的天然牙齒及植體進行樹脂固定。利用錶盤式張力測量儀(dial tension gauge)(Mitutoyo)，在水平方向使負荷10g至15的荷重。矯正力是針對天然牙齒、HA植體、齒小囊賦與HA植體，自舌側朝頰側方向(相對於齒列側面的垂直方向，口腔的外側方向)施加14天。
又，老鼠下顎切齒是朝顎骨的前方向生長，臼齒是朝上部方向萌生。移植後的植體是移植到臼齒側(第12圖)。以微CT進行矯正前、矯正後第3天、第7天、矯正後第14天的攝影。利用攝得的影像數據使用TRI/3D-BON軟體(Ratoc，大阪，日本)，測定矯正力造成的經時移動距離。
其結果如第13圖中所示。未捲附齒小囊組織的HA 植體，未能確認矯正力造成的植體之移動。相對於此，在天然牙齒，可確認自矯正力開始負荷至第7天有77.0±5.5μm的移動。齒小囊賦與HA植體，可確認自矯正力開始負荷至第7天有55.6±6.3μm的移動。天然牙齒及齒小囊賦與HA植體，可確認第7天以後牙齒之緩慢移動(第13圖A及第13圖B)。
(解析矯正力負荷後骨吸收標記及骨形成標記的表現)
其次，解析實驗性矯正造成的植體移植部位之骨再構築。骨再構築的解析方法，是解析骨吸收標記之集落刺激因子I(Colony stimulating factor 1,CSF-1)與骨形成標記之骨鈣素(Osteocalcin,OCN)之表現。
具體上，首先應用GenBank公開的Mrna序列資訊，設計可使OCN以及CSF-1的遺傳基因序列特異增幅的引子(primer)。在該引物上附加T7 RNA聚合酶啟動子(polymerase promoter)，藉由PCR使標的序列增幅。利用所得的PCR產物與T7 RNA聚合酶及毛地黃苷(digoxigenin，DIG)之RNA標識混合物(RNA Labeling Mix,Roche，Mannheim，德國)，合成經DIG標識的RNA探針。
接著，與前述的方法相同，進行天然牙齒及植體的實驗性矯正，矯正第6天將顎骨摘出。將摘出的顎骨在4%三聚甲醛溶液中固定24小時之後，使用10%甲酸檸檬酸鈉及22.5%甲酸脫灰液進行72小時的脫灰操作。然後將顎骨依序在12.5%(w/v)及25%(w/v)的各蔗糖溶液中分別浸漬12小時，使用OCT複合物(Miles Inc,Naperville，IL)進行凍結包埋。包埋後，利用低溫恒溫器(CM3050S；Leica microsvstems)將顎骨製作成10μm厚的切片。
製作厚度10μm的凍結切片後，以4%三聚甲醛溶液處理凍結切片10分鐘以進行固定，浸泡在乙醯化溶液中1分鐘。經過1小時的預雜交(prehybridization)後，使先前合成的RNA探針以70℃雜交16小時。藉由使用經鹼性磷酸酶(alkaline phosphatase)標識的抗DIG Fab Fragments與NBT/BCIP(Roche，Mannheim，德國)的免疫學方式，在30℃以適切的時間使進行酵素呈色而檢出mRNA之存在。
試驗中使用的引子如下述。
．老鼠骨鈣素(mOCN)、正向引子(forward primer)(序列編號1)TAGCAGACACCATGAGGACC
．老鼠骨鈣素(mOCN)、逆向引子(reverse primer)(序列編號2)TGACATCCATACTTGCAGGG
．老鼠集落刺激因子I(mCSF-1)、正向引子(序列編號3)TACTGAACCTGCCTGCTGAA
．老鼠集落刺激因子I(mCSF-1)、逆向引子(序列編號4)CCAGAGCTTGTGACAGGACA
其結果是，在壓迫側可確認表現CSF-1 mRNA的破骨細胞之存在，在牽引側則可確認表現OCN mRNA的骨芽細胞之存在(第14圖)。由此可顯示，已捲附齒小囊組織的HA植體，形成具有可使牙齒移動的機能之牙周組織。
<實施例5. 植體移植後形成的牙根膜組織中的神經纖維之解析>
在天然牙齒的牙根膜組織中，有末梢神經的侵入，擔負傳達求心性的刺激之機能，以維持牙齒的機能及恒常性。所 以，在移植後第21天的HA植體及移植後第21天的齒小囊賦與HA植體周圍的牙根膜組織中，也評估是否形成具有正常機能的神經纖維。
首先，與實施例2的方法相同，將齒小囊賦與HA植體及HA植體移植到C57/BL/6老鼠上。然後，在移植第21天時，自患者老鼠摘出含有齒小囊賦與HA植體或HA植體的顎骨。將摘出的顎骨在4%三聚甲醛溶液中固定24小時之後，使用10%甲酸檸檬酸鈉及22.5%甲酸脫灰液進行72小時的脫灰操作。然後，依序在12.5%(w/v)及25%(w/v)的各蔗糖溶液中分別浸漬12小時，使用OCT複合物(Miles Inc,Naperville，IL)進行凍結包埋。包埋後，利用低溫恒溫器(CM3050S；Leica microsystems)將顎骨製作成10μm厚的切片，進行該等組織切片的免疫染色。
為檢測植體周圍形成的牙根膜中的神經纖維，而進行神經纖維標記神經絲(neurofilament)之免疫染色。一次抗體是使用神經絲SMI312(老鼠抗神經線抗體；1：1000，Abcam，Cambridge，MA)，二次抗體是使用連結Alexa Fluor594之山羊抗老鼠IgG(1：500，Molecular Probes)。此等免疫染色影像是應用共焦雷射顯微鏡(LSM510 Meta；Carl Zeiss，Jene，德國)檢測螢光而觀察神經纖維。
在未形成牙根膜區域的HA植體中，完全未能確認可被神經絲(NF)染色的神經纖維之侵入。另一方面，在已形成牙周組織的齒小囊賦與HA植體之牙根膜組織內，是與天然牙齒相同的可確認NF陽性之神經纖維(第15圖)。由此可顯示，齒小囊賦與HA植體，在移植後可形成具有神經纖維之牙根膜組織。
<實施例6. 植體移植後形成的牙根膜組織中的神經纖維之機能解析>
在因過度咬合等而對牙齒組織施加侵害刺激之際，配列在牙根膜內的末梢神經將侵害刺激投射到延髓的三叉神經脊髓路核而咸知疼痛。此機制可迴避．抑制組織的傷害或機能不全化而與生體防禦有關。所以，即使在具有牙周組織的植體中，不僅只是形成神經纖維，重要的是使該等末梢神經進行與中樞神經的連帶機能。
所以，評估齒小囊賦與HA植體移植後，侵入植體周圍形成的牙根膜內的神經纖維可否將侵害刺激傳達到中樞。評估方法是對天然牙齒、移植第21天後的HA植體、移植第21天後的齒小囊賦與HA植體施加實驗性矯正力之後，藉由解析在三叉神經脊髓路核中誘導產生作為痛感刺激指標的c-Foc蛋白質之表現之方式進行。
具體上，首先與實施例2的方法相同，將齒小囊賦與HA植體及HA植體移植到C57/BL/6老鼠上。在移植後第21天，於深度麻醉下將老鼠固定。對天然第一臼齒及著生於顎骨的植體，與實施例4相同，自舌側朝向頰側負荷10至15g的矯正力。在矯正刺激開始的2小時後，利用剪刀將麻醉下的老鼠胸腔剪開。然後，使心臟露出，從左心室下部刺入25G針，利用蠕動泵(peristaltic pump)使PBS(-)溶液由心臟灌流至全身。此外，將左心房切除以確保脫血通路。完全脫血之後，接著使4%三聚甲醛溶液同樣的在全身內迴流以進行固定。
然後，與實施例5中所述之方法相同，自老鼠的頭 蓋骨內摘出延髓組織，依序在12.5%(w/v)及25%(w/v)的各蔗糖溶液中各浸漬12小時。浸漬後，使用OCT複合物(Miles Inc,Naperville，IL)將延髓組織凍結包埋。包埋後，利用低溫切片機(CM3050S；Leica microsystems)製作成40μm厚的切片，製作的切片，以已加入0.3%H2O2的甲醇封阻內在性過氧化酶，再以3%的血清進行閉塞。然後，以抗-c-Foc抗體(1：10,000，Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz，CA)使其反應，以經過氧化酶標記之山羊抗免子IgG(1：300，Cappel Laboratories，Aurora，Ohio)作為一次抗體使其反應。然後，使用PAP免疫複合物(1：3000，Cappel)進行免疫染色。
HA植體對於矯正負荷力，並未能確認c-Foc蛋白質之表現。至於天然牙齒及齒小囊賦與HA植體，在矯正刺激2小時後確認c-Foc蛋白質之表現，顯示已將對於牙根膜之侵害刺激傳達至中樞神經(第16圖)。由此結果顯示，在移植齒小囊賦與HA植體之後，植體周圍的牙根膜內形成可傳達侵害刺激的神經機能。
<實施例7.三壁性骨缺損模型中植體移植後齒槽骨再生的解析>
為瞭解是否可能因齒小囊賦與HA植體的移植而使齒槽骨再生，製作缺少植體移植部位齒槽骨之1側面骨之三壁性骨缺損模型，將齒小囊賦與HA植體移植至該模型後，進行齒槽骨的再生量之解析。
拔掉4週齡C57/BL/6老鼠的下顎第一臼齒，設計2至3週的骨組織之治癒期間。然後，進行該部牙肉的切開、剝離，利用牙科用微型馬達(Viva-Mate Plus，Nakanishi，東京，日本)及牙科用鉸刀(MANI，栃木，日本)切削齒槽骨，形成直徑 0.8mm、深度1.2mm的移植窩。使用費舍爾錐型硬質合金鑽針(tapered Fisher type carbide bur(MANI，栃木，日本)，將存在移植窩之處的齒槽骨之頰側骨削去，製成欠缺頰側骨的三壁性骨缺損模型(第17圖)。將齒小囊賦與HA植體或HA植體移植到移植窩內，以8-0尼龍縫合線(Bearmedic，千葉，日本)進行牙肉縫合。移植植體的老鼠，移植後當下以及在移植第14天、第28天及第50天，利用微型CT裝置(In vivo Micro X-ray CT System；R_mCT，株式會社Rigaku，東京，日本)取得微型CT影像。此外，取得的微型CT影像(各切片之影像)數據使用統合影像處理軟體(i-VIEW-3DX，株式會社Morita，大阪，日本)構築三次元，而取得三次元CT影像。應用所得的微型CT影像及三次元CT影像，進行移植部位的齒槽骨中的頰側骨再生之經時變化評估。
又，此時的對象區，是製作未移植植體之三壁性骨缺損的試樣品，同樣的也進行齒槽骨中的頰側骨再生之經時變化評估。
第18圖中所示，是未移植植體的三壁性骨缺損模型區、對三壁性骨缺損模型移植HA植體的區域、對三壁性骨缺損模型移植齒小囊賦與HA植體的區域，在移植後當下以及移植後第14天、第28天及第50天的三次元CT影像。在移植HA植體的區域及未移植植體的區域，雖然在第50天可觀察到若干程度的齒槽骨之再生，但是齒槽骨並未再生至原來齒槽骨存在的整個位置(圖中的虛線)。尤其是在移植HA植體的區域，植體自體是沉入齒槽骨內。另一方面，移植齒小囊賦與HA植體的區域，在移植後第50天，齒槽骨幾乎完全回復。此外，齒小囊賦與HA植體自 體在移植者的齒槽骨中，也維持在移植時的相同位置。
此外，第19圖中所示，是移植齒小囊賦與HA植體的三壁性骨缺損模型中，在移植後第14天、第28天及第50天的微型CT影像。在移植後第14天可見到齒槽骨的再生，在移植後第50天中，可觀察到幾乎完全回復的齒槽骨。此時，在再生的齒槽骨與齒小囊賦與HA植體之間，可確認牙根膜腔模樣的間隙(第19圖中的箭頭)。就這樣，齒小囊賦與植體不僅可形成牙根膜，也可能隨著齒槽骨再生而使植體著生。
另外，對於三壁性骨缺損模型移植齒小囊賦與HA植體的區域、對於三壁性骨缺損模型移植HA植體的區域、及對於三壁性骨缺損模型未移植植體的三種區域，作成移植第0天與移植後第50天的影像之重合，進行齒槽骨再生面積之定量化。其結果如第20圖中所示。如第20圖中所示，在齒小囊賦與HA植體的移植區中，與另外兩區比較，可確認有意義的較高之齒槽骨再生量。
此外，為評估移植後的植體陷入齒槽骨之情況，將HA植體移植到與實施例2相同(非三壁性骨缺損)製作的移植窩之區域、對於三壁性骨缺損模型移植HA植體的區域、及對於三壁性骨缺損模型未移植植體的三種區域中，測定移植第0天與移植後第50天中植體的垂直性移動量，並圖示化(第21圖及第22圖)。其結果是，在對三壁性骨缺損模型移植HA植體的區域中，可觀察到移植的植體之沈陷，但齒槽骨無缺損。將HA植體移植到移植窩的區域及對於三壁性骨缺損模型移植齒小囊賦與HA植體的區域中，未觀察到植體之沈陷。由此顯示，齒小囊賦與HA植體 的移植，可防止植體自體的沈陷。
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<223> 老鼠集落刺激因子I逆向引子
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Claims (12)

  1. 一種牙科用植體，其特徵為：係可形成機能性牙周組織的牙科用植體，此處，使來自齒小囊組織的細胞塊配置在前述植體的表面，前述細胞塊係自齒小囊組織物理性切斷成可部分性保持細胞彼此間的機能性結合，並且保持可區別組織之外側及內側的形狀，俾配置成使形成組織內側之側面接觸植體表面，配置有前述細胞塊的前述植體的表面，係前述植體移植時被患者的齒槽骨圍繞之表面的全部或一部份。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之植體，其中，前述齒小囊組織為選自帽狀期、鐘狀前期、及鐘狀後期所形成之群組中的任何一個發展階段。
  3. 如申請專利範圍第1項所述之植體，其中，在植體移植後可矯正者。
  4. 如申請專利範圍第1項所述之植體，其中，前述形成的牙周組織具有(i)具有機能性的牙骨質及機能性的牙根膜、(ii)具有機能性的神經纖維其中的至少一種特徵。
  5. 如申請專利範圍第1項所述之植體，其中，前述植體在植體的全部或部份表面，進一步含有表面塗布劑的塗布層，使前述細胞塊配置在前述塗布層的表面上。
  6. 如申請專利範圍第5項所述之植體，其中，前述塗布劑是選自羥磷灰石、α-磷酸三鈣、β-磷酸三鈣、及膠原蛋白所形成之 群組。
  7. 一種植體的製造方法，其特徵為：係可形成機能性牙周組織的牙科用植體之製造方法，包含在前述植體移植時，將來自齒小囊組織的細胞塊配置在被患者的齒槽骨圍繞之植體的全部或部份表面之步驟，其中，前述細胞塊係自齒小囊組織物理性切斷成可部分性保持細胞彼此間的機能性結合，並且保持可區別組織之外側及內側的形狀，俾配置成使形成組織內側之側面接觸植體表面。
  8. 如申請專利範圍第7項所述之植體的製造方法，其中，前述齒小囊組織為選自帽狀期、鐘狀前期、及鐘狀後期所形成之群組中的任何一個發展階段。
  9. 如申請專利範圍第7項所述之植體的製造方法，其中，在前述植體移植後，可矯正前述植體者。
  10. 如申請專利範圍第7項所述之植體的製造方法，其中，前述形成的牙周組織具有(i)具有機能性的牙骨質及機能性的牙根膜、(ii)具有機能性的神經纖維其中的至少一種特徵。
  11. 如申請專利範圍第7項所述之植體的製造方法，其中，在配置前述細胞塊的步驟前，又包含在植體移植時被患者之齒槽骨圍繞的植體的全部或部份表面上，形成表面塗布劑的塗布層之步驟，使前述細胞塊配置在前述塗布層的表面上者。
  12. 如申請專利範圍第11項所述之植體的製造方法，其中，前述 塗布劑是選自羥磷灰石、α-磷酸三鈣、β-磷酸三鈣、及膠原蛋白所形成之群組者。
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