CN110537987B - 用于控制恒牙胚发育的方法、支架及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开用于控制恒牙胚发育的方法、支架及其用途。控制恒牙胚发育的方法包括在有此需要的受试者内调节牙板周围的间充质环境的步骤。

Description

用于控制恒牙胚发育的方法、支架及其用途

技术领域

本发明大致涉及牙发育与再生领域，具体地涉及调控牙发育早期的生物力学环境，从而重新启动早期终止发育的恒牙胚或抑制过早启动发育的恒牙胚。

背景技术

先天性恒牙缺失在人群中的具有较高的发病率，除第三磨牙外，平均每个患者缺失1.5颗牙齿。先天缺牙可导致咀嚼功能部分丧失并影响美观，降低了罹患人群的生活质量。一般认为先天性恒牙缺失的发病与遗传相关，但仍然有大部分的患者不能明确原因。在临床中，一般以X线片观察恒牙牙胚的形态、数量及位置为主要诊断方法，如果明确颌骨内没有钙化的恒牙胚，则诊断为先天性恒牙缺失。

本领域已知，牙齿由牙板发育而来，牙板为特异的上皮条索，在合适的环境以及激活因素的条件下开始发育，在经历了蕾状期、帽状期以及钟状期之后开始钙化，逐渐在颌骨内显现出牙齿钙化影像。目前研究表明，先天性恒牙缺失一般与早期牙板未启动发育有关，而牙板在发育初始为什么没有进一步发育分化的原因仍然不清楚。这也是治疗此类疾病的关键。

发明内容

为解决至少部分上述技术问题，本发明在深入研究后发现，通过调节牙板周围的间充质环境可控制恒牙胚的发育。至少部分地基于该发现完成了本发明。具体地，本发明包括以下内容。

本发明的第一方面，提供一种控制恒牙胚发育的方法，其包括在有此需要的受试者内调节牙板周围的间充质环境的步骤。

在某些实施方案中，在选自下述(a)-(c)的至少之一的时间内调节所述间充质环境：

(a)乳牙萌出至生理情况下乳牙应当脱落的年龄；

(b)乳牙未正常萌出或萌出延迟，或者恒牙牙板周围的间充质存在生物应力期间；

(c)恒牙牙板尚未开始发育或已发育但恒牙胚尚未钙化期间。

在某些实施方案中，所述调节包括选自由下述组成的组中的至少之一：

(1)降低、释放牙板周围的间充质的张力；

(2)控制所述间充质的张力至规定的第一范围内，其中第一范围为适于恒牙胚发育的张力范围；

(3)抑制或降低牙板周围的间充质细胞中RUNX2的活性或表达量；

(4)抑制或降低牙板周围的间充质细胞中Wnt/β-catenin通路的活性或表达量。

在某些实施方案中，所述调节包括选自由下述组成的组中的至少之一：

(1)控制所述间充质的张力至规定的第二范围内，其中第二范围为适于抑制恒牙胚发育的张力范围；

(2)提高或增加牙板周围的间充质细胞中RUNX2的活性或表达量；

(3)提高或增加牙板周围的间充质细胞中Wnt/β-catenin通路的活性或表达量。

在某些实施方案中，通过机械处理、植入改变生物张力的支架和/或施用改变生物张力的活性因子来调节所述间充质环境。

在某些实施方案中，所述控制包括启动、促进或抑制恒牙胚发育，控制恒牙胚的发育速度，引导恒牙胚向所需方向生长。

本发明的第二方面，提供一种用于控制恒牙胚发育的支架，其具有适于贴附在乳牙根表面且植入龈沟下方的结构。

在某些实施方案中，用于控制恒牙胚发育的支架包括孔隙直径为1-10μm、孔隙密度为50-200个/mm²的多孔材料。

在某些实施方案中，所述多孔材料包括选自人工合成材料、天然衍生材料和复合材料组成的组中的至少之一。

在某些实施方案中，用于控制恒牙胚发育的支架进一步包含改变生物张力的活性因子。

在某些实施方案中，所述改变生物张力的活性因子包括调控Integrinβ1-Erk1-Runx2-Wnt/beta-catenin通路的分子。优选地，所述分子为细胞因子、重组蛋白、核酸和小分子药物。更优选地，所述分子包括选自由Wnt抑制剂(Dkk1、Sfrp1、Sostdc1等)、Wnt配体分子、U0126、RUNX2抑制剂、shh激活剂、TGF/Smad通路调节剂、FGF重组蛋白组成的组中的至少之一。

在某些实施方案中，用于控制恒牙胚发育的支架中的核酸包括含有RUNX2基因的构建体、调控RUNX2基因表达的干扰RNA、含有Wnt基因的构建体或调控Wnt基因表达的干扰RNA。

在某些实施方案中，用于控制恒牙胚发育的支架为具有凹面的弧形，其中凹面用于贴附在乳牙根表面，所述支架的顶部宽3-6mm，底部宽1.5-3.5mm，平均厚度300-500μm，顶部厚度400-600μm，底部厚度200-400μm。

本发明第三方面，提供本发明的支架在控制恒牙胚发育中的用途，其包括将所述支架植入受试者体内的过程。

本发明的第四方面，提供本发明所述的支架在制备用于控制恒牙胚发育的医疗器材中用途。

本发明的第五方面，提供调控Integrinβ1-Erk1-Runx2-Wnt/beta-catenin通路的分子在制备用于控制恒牙胚发育的组合物的中用途。优选地，所述分子选自Runx2激活或抑制剂、Wnt激活剂或抑制剂。

本发明的第六方面，提供检测恒牙胚发育的第一方法，其包括检测牙板周围的间充质内Integrinβ1-Erk1-Runx2-Wnt/beta-catenin通路中的分子的表达水平或活性的步骤。优选地，所述分子包括Runx2和/或Wnt。

在某些实施方案中，检测恒牙胚发育的第一方法包括检测同一受试者的牙板周围间充质在不同时间的Runx2和/或Wnt基因的表达水平，并比较不同时间的表达水平的步骤。

在某些实施方案中，检测恒牙胚发育的方法包括：

(1)在第一时间T1时，检测牙板周围的间充质内Runx2基因的表达水平A1和/或Wnt基因的表达水平B1；

(2)此后在第二时间T2时，再次检测牙板周围的间充质内Runx2基因的表达水平A2和/或Wnt基因的表达水平B2；

(3)当A1大于A2和/或B1大于B2时，则判定恒牙胚趋向于发育，当A1小于A2和/或B1小于B2时，则判定恒牙胚趋向于被抑制。

本发明的第七方面，提供检测恒牙胚发育的第二方法，其包括检测同一受试者的牙板周围的间充质内和牙板上皮细胞内的Wnt基因的表达水平的步骤，当Wnt信号在间充质内的表达水平降低且同时牙板上皮细胞内的表达水平升高时，判定牙胚发育启动。

附图说明

图1示出恒尖牙胚启动发育过程。

图2示出胚胎90天小型猪恒尖牙胚解剖位置。

图3示出生物应力调控恒牙胚的启动。

图4示出力学调控通路Integrinβ1-ERK1-RUNX2在乳恒牙之间间充质内的高表达。

图5示出过表达RUNX2可以抑制恒牙胚的启动，敲减RUNX2则可以激活启动。

图6示出Wnt/β-catenin通路表达在乳恒牙之间间充质内。

图7示例性示出植入生物支架材料的过程。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为具体公开了该范围的上限和下限以及它们之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

本发明以小型猪(miniature pig)为模型进行研究后发现，恒牙牙板最初从乳牙钟状期成釉器上分离下来，在乳牙萌出之前保持长时间的静止。当乳牙萌出时，颌骨内生物应力得以释放，恒牙牙板周围间充质内的生物力学相关通路的分子表达及功能下调，恒牙开始启动发育。进一步研究后发现，恒牙牙板的位置和周围间充质微环境，以及在启动过程中牙板与周围间充质环境的交互作用对于解决先天性恒牙缺失问题是重要的。至少部分地基于上述发现完成了本发明。具体地，本发明至少包括下述几方面的内容。下面详细说明。

[控制恒牙胚发育的方法]

本发明的第一方面，提供一种控制恒牙胚发育方法(本发明中有时简称为“本发明的方法”)，其包括在有此需要的受试者内调节牙板周围的间充质环境的步骤。

本发明的“受试者”为需要控制恒牙胚发育的受试者，通常情况下受试者患有先天性恒牙缺失。与一般的先天性牙缺失不同，先天性恒牙缺失的患者通常存在乳牙，且乳牙通常情况下是正常发育。先天性恒牙缺失可以X线片观察恒牙牙胚的形态、数量及位置为主要诊断方法，如果明确颌骨内没有钙化的恒牙胚，则诊断为先天性恒牙缺失。需要说明的是，虽然通常情况下先天性恒牙缺失存在乳牙，但有或无对应乳牙并不影响本发明的方法的实施，只要能够确认受试者牙板及周围的间充质位置即可。本发明的受试者除了被诊断为先天性恒牙缺失以外，优选无下述情形：(a)无明显遗传性疾病的先天性恒牙缺失；(b)在实施本发明的方法之前使用X线片检查明确颌骨内存在钙化恒牙胚；(c)有明确遗传因素为病因的恒牙缺失。

本发明的方法中，调节牙板周围的间充质环境的时机是重要的。优选地，在选自下述(a)-(c)的至少之一的时间内调节所述间充质环境：

(a)乳牙萌出至生理情况下乳牙应当脱落的年龄；

(b)乳牙未正常萌出或萌出延迟，或者恒牙牙板周围的间充质存在生物应力期间；

(c)恒牙牙板尚未开始发育或已发育但恒牙胚尚未钙化期间。

本发明的“控制”包括启动、促进或抑制恒牙胚发育，控制恒牙胚的发育速度，引导恒牙胚向所需方向生长等。其中启动是指恒牙胚原本处于静止状态，通过诱导等使其由静止状态转变为开始发育状态。促进是指恒牙胚已开始发育，但是发育速度过慢，通过调控加速恒牙胚的发育速度。抑制是指恒牙胚发育速度过快，而通过调节牙板周围的间充质环境使其速度变慢。在某些实施方案中，本发明的控制恒牙胚发育的方法包括降低、释放牙板周围的间充质的张力，从而促进或启动恒牙胚发育。

在某些实施方案中，本发明的控制恒牙胚发育的方法中通过机械处理来调节所述间充质环境。通过机械处理包括使乳牙牙根表面与牙周膜分开的任何处理方式。可以是切割、剥离等。机械处理的目的是释放待处理位置的应力等。优选地，在萌出乳牙舌侧龈沟下方一定距离内进行机械处理。更优选地，进行显微操作。机械处理的位置包括乳牙舌侧靠近龈沟。机械处理以使乳牙牙根表面与牙周膜分开，直至恒牙胚下方，从而使乳恒牙之间的间隙暴露。

在某些实施方案中，本发明的控制恒牙胚发育的方法中通过植入可以改变生物张力的支架来调节所述间充质环境。植入的位置可与机械处理的位置相同。优选地，植入位置为乳牙牙根表面与牙周膜之间分开的位置，或两者之间暴露的位置。此处术语“改变生物张力的支架”可与下文将描述的“用于控制恒牙胚发育的支架”相同。在此不再详细说明。

在某些实施方案中，本发明的控制恒牙胚发育的方法中通过施用改变生物张力的活性因子来控制恒牙牙板的发育。本发明中“施用”的效果包括增加或减少牙板周围的间充质中的改变生物张力的活性因子的量，包括绝对量和相对量；还包括促进或延缓牙板周围的间充质细胞释放改变生物张力的活性因子至胞外，从而增加或减少胞外活性因子的量。发明人研究发现，当乳牙萌出时，颌骨内生物应力得以释放，恒牙牙板周围间充质内的生物力学相关通路，特别是Integrinβ1-Erk1-Runx2-Wnt/β-catenin通路的分子表达及功能下调，恒牙开始启动发育。本发明中将参与或调控生物力学相关通路的物质统称为“改变生物张力的活性因子”。本发明的方法优选包括施用能够调控或参与Integrinβ1-Erk1-Runx2-Wnt/β-catenin通路的物质。此类物质优选包括细胞因子、重组蛋白、核酸和小分子药物。重组蛋白的实例包括但不限于Dkk1、Sostdc1和Sfrp1。小分子药物的实例包括但不限于U0126。核酸的实例包括但不限于RUNX2基因、含有RUNX2的构建体(例如，载体)、调控RUNX2基因表达的干扰RNA、Wnt基因、含有Wnt的构建体(例如，载体)、调控Wnt基因表达的干扰RNA等。优选地，核酸为含有RUNX2基因的表达载体(例如，慢病毒载体)，或含有RUNX2干扰RNA的敲减载体(例如，慢病毒载体)。核酸制备或构建方法是本领域已知的，可参考例如冷泉港的《分子克隆实验指南》第四版等公开出版物。

本发明的施用方法不特别限定，但优选为使上述物质靶向恒牙牙板周围间充质的施用方法，此处靶向指的是特异性地作用在间充质中而非上皮。发明人发现在牙板周围的间充质中抑制或减少Runx2的表达会促进恒牙发育。在恒牙牙板周围间充质中过表过Runx2则抑制恒牙胚的发育。

在某些实施方案中，本发明的控制恒牙胚发育的方法通过选自机械处理、植入改变生物张力的支架和施用改变生物张力的活性因子中的至少两种来调节所述间充质环境中的生物力学，从而进一步增强控制效果。特别优选同时进行机械处理、植入改变生物张力的支架且施用改变生物张力的活性因子的方法。

[用于控制恒牙胚发育的支架]

本发明的第二方面，提供一种用于控制恒牙胚发育的支架(本发明中有时简称为“本发明的支架”)，其具有适于贴附在乳牙牙根表面且植入龈沟下方的结构。

本发明的支架用于控制恒牙胚发育，为了能够贴附在乳牙牙根表面且植入龈沟下方，本发明的支架可为具有凹面的弧形，其中凹面用于贴附在乳牙表面，所述支架的顶部宽3-6mm，底部宽1.5-3.5mm，平均厚度300-500μm，顶部厚度400-600μm，底部厚度200-400μm。

本发明的支架一般具有0.25-0.40，优选0.28-0.38的泊松比。本发明的支架的杨氏模量一般为0.10-0.25MPa，优选0.15-0.20MPa。本发明的泊松比和杨氏模量可采用已知方式测定。

本发明的支架材料包括人工合成材料、天然衍生材料和复合材料。其中人工合成材料包括无机材料、有机材料和机材料。其中无机材料的实例包括但不限于生物陶瓷(例如，氧化铝陶瓷、羟基磷灰石、磷酸三钙)、多孔金属(不锈钢、钴基合金、记忆合金)、钛及钛合金、磷酸钙水泥(例如，羟基磷灰石、磷酸三钙)。有机材料的实例包括但不限于聚丁酸、聚偶磷氮、聚酸酐、聚乙二醇、聚尿烷、聚乳酸、聚羟基乙酸及其共聚物。优选为聚乳酸、聚羟基乙酸及聚乳酸-聚羟基乙酸共聚物。纳米材料是从原子水平制备的支架材料，其最大的特点是具有高比表面积和孔隙率，有利于细胞接种、迁移和增殖。纳米纤维材料仿生化的微环境能影响细胞与细胞、细胞与基质之间的相互作用，调节细胞的生物学行为。

天然衍生材料包括天然骨、天然有机高分子材料和天然无机材料。其中天然骨的来源有同种异体或异种动物骨。天然有机高分子材料的实例包括但不限于胶原、纤维蛋白、几丁质、藻酸盐、壳聚糖。天然无机材料的实例包括但不限于珊瑚材料，其优点是具有多孔性和高孔隙率及良好的生物降解性，另外有一定的机械强度和可塑性，来源丰富。

复合支架材料包括羟基辛酸共聚体和与胶原复合的纳米羟基磷灰石。其中羟基辛酸共聚体由微生物合成的天然高分子聚酯材料多聚羟基烷酸，其具有良好的细胞相容性和生物可降解性。与胶原复合的纳米羟基磷灰石具有良好的生物相容性和可降解性。

本发明的支架材料优选包括多孔材料，特别是可吸收的多孔材料。多孔材料的平均孔隙直径一般为1-10μm、优选为2-8μm，更优选4-6μm。多孔材料的平均孔隙密度一般为50-200个/mm²，优选为60-180个/mm²，更优选为70-150个/mm²。在某些实施方案中，多孔材料的平均孔隙直径为5μm，平均孔隙密度为100个/mm²。

本发明的支架优选进一步包括改变生物张力的活性因子。如上所述已对改变生物张力的活性因子进行了详细说明。在此不再赘述。本发明中，支架可通过包埋、结合等方式包含改变生物张力的活性因子。优选地，改变生物张力的活性因子包含于支架多孔材料的孔隙内部。还优选地，改变生物张力的活性因子可以从支架中进行释放，优选以能够控制释放速度的方式从支架释放。

在某些实施方案中，本发明的支架包含有RUNX2过表达的载体(例如，慢病毒载体)，利用生物支架的缓释作用将慢病毒载体特异性转染至乳恒牙之间的间充质细胞，从而抑制恒牙发育启动。本某些实施方案中，本发明的支架包括RUNX2敲减慢病毒载体，利用支架的缓释作用将慢病毒载体特异性转染至乳恒牙之间的间充质细胞，从而促进恒牙启动提前发生。RUNX2过表达慢病毒载体和RUNX2敲减慢病毒载体的构建方法是本领域已知的，可参考例如冷泉港的《分子克隆实验指南》第四版等公开出版物。由于本发明的支架植入受试者的特定部位，有利于载体(例如慢病毒载体)仅调节或控制特定部位的细胞，避免由此带来副作用。

本发明的支架还可包括除了上述改变生物张力的活性因子以外的其他活性因子。其他活性因子的实例包括但不限于上皮生长因子(EGF)、上皮生长因子受体(EGFR)、成纤维细胞生长因子(FGF)等。本发明的其他活性因子可以是上述物质中的一种或组合使用多种。其他活性因子与支架的结合或包埋方式与改变生物张力的活性因子的方式可一致。

[支架的第一用途]

本发明的第三方面，提供本发明的支架在制备用于控制恒牙胚发育的医疗器材中用途，简称第一用途。如上所述已对本发明的支架进行了详细说明。在此不再赘述。本发明的用途是指用于控制恒牙胚发育的医疗器材。其中医疗器材优选包括体内植入物，特别是能够将其插入乳恒牙之间，隔离乳恒牙，从而改变恒牙生长的生物力学环境的植入物。优选地，植入物具有柔性，特别是具有小于乳牙根表面的硬度的柔性。本发明的植入物的主要目的是植入龈沟下方，起到支撑舌侧牙龈的作用，维持舌侧牙龈软组织与乳牙之间的孔隙，防止舌侧牙龈过度黏附在乳牙表面形成张力。通过手术等植入本发明的支架，结合生物活性因子的缓释，调节牙板发育初期的生物力学环境，可以有效的达到治疗的目的，具有较大的社会效益及经济效益。

[支架的第二用途]

本发明的第四方面，提供本发明的支架在控制恒牙胚发育中的用途，简称第二用途。其包括将所述支架植入受试者体内的过程。本发明的第二用途可理解为利用本发明的支架控制恒牙胚发育的方法。本发明的支架已在上文进行了详细说明，并且在控制恒牙胚发育的方法中亦提及利用本发明的支架控制恒牙胚发育的方法。具体参见上述，在此不再赘述。

[调控Integrinβ1-Erk1-Runx2-Wnt/β-catenin通路的分子在制备用于控制恒牙胚发育的组合物的中用途]

本发明的第五方面，提供调控Integrinβ1-Erk1-Runx2-Wnt/β-catenin通路的分子在制备用于控制恒牙胚发育的组合物中的用途。本发明发现参与Integrinβ1-Erk1-Runx2-Wnt/β-catenin通路的分子(本发明有时简称为“本发明的分子”)与恒牙胚发育之间存在密切关联。并证明了使用Integrinβ1-Erk1-Runx2-Wnt/β-catenin通路的分子可调节牙板周围的间充质的环境，影响恒牙胚发育。

在某些实施方案中，本发明的分子选自Runx2激活剂和/或抑制剂、Wnt激活剂和/或抑制剂组成的组中的至少之一。

[检测恒牙胚发育的第一方法]

本发明的第六方面，提供检测恒牙胚发育的第一方法(本发明有时简称为“第一检测方法”)，其包括检测牙板周围的间充质内Integrinβ1-Erk1-Runx2-Wnt/β-catenin通路中的分子的表达水平或活性的步骤。优选地，本发明的分子包括Runx2和/或Wnt。

在某些实施方案中，第一检测方法包括检测同一受试者的牙板周围间充质在不同时间的Runx2和/或Wnt基因的表达水平，并比较不同时间的表达水平的步骤。优选地，本发明的第一检测方法包括：

(1)在第一时间T1时，检测牙板周围的间充质内Runx2基因的表达水平A1和/或Wnt基因的表达水平B1；

(2)此后在第二时间T2时，再次检测牙板周围的间充质内Runx2基因的表达水平A2和/或Wnt基因的表达水平B2；

(3)当A1大于A2和/或B1大于B2时，则判定恒牙胚趋向于发育，当A1小于A2和/或B1小于B2时，则判定恒牙胚趋向于被抑制。还优选地，本发明的第一检测方法包括检测牙板周围间充质内Runx2的表达水平A1和/或Wnt的表达水平，并将所得检测值与参照物进行比较的步骤。

在某些实施方案中，所述参照物包括正常或健康同类个体中牙板周围间充质内的Runx2的表达水平A0和/或Wnt的表达水平B0；且当A1大于A0和/或B1大于B0时，则判定恒牙胚趋向于被抑制，当A1等于A0和/或B1等于B0时，则判定恒牙胚趋向于发育。

在某些实施方案中，所述参照物包括对多个同类个体检测得到的相同牙板周围间充质内Runx2的表达值进行统计得到的第一参考数值区间，和/或对多个同类个体检测得到的相同牙板周围间充质内Wnt表达值进行统计得到的第二参考数值区间；且当A1大于第一参考数值区间的最大值和/或B1大于第二参考数值区间的最大值时，则判定恒牙胚趋向于被抑制；当A1在第一参考数据区间内和/或B1在第二参考数据区间内时，则判定恒牙胚趋向于静止；当A1小于第一参考数值区间的最小值和/或B1小于第二参考数值区间的最小值时，则判定恒牙胚趋向于发育。

[检测恒牙胚发育的第二方法]

本发明的第七方面，提供检测恒牙胚发育的第二方法(本发明有时简称为“第二检测方法”)，其包括检测同一受试者的牙板周围的间充质内和牙板周围的上皮细胞内的Wnt基因的表达水平的步骤，且当Wnt信号由所述间充质向上皮转移时，判定牙胚发育启动。此处的“转移”包括Wnt信号在牙板周围的间充质内趋于减弱或消失，而同时Wnt信号在牙板上皮内趋于增强。

实施例

试验模型和受试者详情

动物试验程序经首都医科大学动物护理和使用委员会(中国，北京)批准，(许可号：AEEI-2016-063)。怀孕小型猪(miniature pig)获自中国农业大学动物科学中心(中国，北京)。

人胚的收集程序经潍坊医科大学宜都中心医院批准(许可号：035)。

体外颌骨培养

从下颌骨上沿尖牙近远中面切开颌骨，获得的颌骨片包含乳恒尖牙，手术释放了颌骨内生物应力。在Eagle培养液(alpha-modification)中，将下颌骨片培养于transwell膜上(孔径0.4μm)，Eagle培养液含15％的胚牛血清、2mM谷氨酰胺、100U/mL青霉素和100mg/mL链霉素。在5％二氧化碳、37℃下孵育组织2天。第24小时后更新培养基。向培养基中加入LiCl(20mM/L,Sigma Cat#746460)激活Wnt通路。在对照组中，添加相同浓度的NaCl。为抑制Wnt通路，向培养基中加入重组蛋白Dkk1(50ng/ml,PreproTech Cat#120-30)。在对照组中，添加相同量的BSA。为在下颌骨体外过表达RUNX2，设计RUNX2过表达慢病毒。将RUNX2(XM_013977989.1)的全长mRNA克隆至pLent-Puro-CMV(Vigene Biosciences,Rockville,MD)。为在下颌骨体外敲除RUNX2，设计敲除RUNX2的慢病毒。将ShRNA(5’-GAGAAGGGAAACCUGUGAATT-3’)克隆至慢病毒(LV3,GenePharma,Shanghai,China)。对于过表达和敲除组，将慢病毒(1×10⁷IU/ml)与聚凝胺(5μg/mL)混合添加至培养基中。向对照组中添加对照病毒。

牙囊细胞(DFCs)的初次培养

从牙胚周围显微取下牙囊组织。在37℃用dispase II(4mg/ml)和collagenasetype I(3mg/ml)消化组织1小时。过滤消化液并在1,100rpm下离心5分钟得到细胞。将单细胞悬液接种于培养皿中，并用含15％的胚牛血清、2mM谷氨酰胺、100U/mL青霉素和100mg/mL链霉素的Eagle培养液(alpha-modification)培养。在5％二氧化碳、37℃下孵育细胞。

为抑制ERK1/2，向培养基中添加70nM U0126(MedChem Express Cat#HY-12031)。向对照组中添加相同量的DMSO。为阻断integrinβ-1，向培养基中添加小鼠抗integrinβ-1的抗克隆抗体(5μg/ml,Abcam Cat#ab30388,RRID:AB_775736)。所有组中，在收获细胞前处理持续6小时。

具体方法：

用于组化分析的组织的准备

在4％多聚甲醛-PBS(PFA-PBS)中4℃固定样本过夜。在PBS中清洗10分钟两次之后，将E50、E60和E90-100的下颌骨片用10％EDTA-PBS分别脱钙2、7和30-40天。每两天更新培养基。然后，通过梯度醇(30、50、70、90、95和100％)使样本脱水，并包埋于石蜡中。样本切片(5-7μm厚度)用于染色。使用Hematoxylin and eosin(H&E)染色来检测形态。

原位杂交

本步骤包括两阶段，即探针制备和切片染色。在第一阶段中，使用获自牙胚的mRNA进行靶基因的RT-PCR。从琼脂糖凝胶中切下正确大小的带，并纯化DNA。然后进行DNA测序。通过用RNA polymerase(Roche Cat#10881767001)T7体外转录和DIG RNA labeling Mix(Roche Cat#11277073910)来制备RNA探针并标记digoxigenin-UTP。在第二染色阶段，加热切片并首先复水，然后用蛋白酶K(1μg/ml in PBS)在37℃下处理30分钟。在用4％PFA-PBS重新固定后，在梯度醇(25,50,75和100％)中使切片脱水，然后置于生物安全室空气干燥1小时。最后，样本加载稀释探针，塑料盖覆盖，然后70℃杂交过夜。在洗涤3-4小时后，用抗体(alkaline phosphatase conjugated anti-digoxigenin Fab,Roche Cat#11093274910,RRID:AB_514497)孵育切片过夜。在最后一天，用NBT/BCIP底物(Promega Cat#S3771)检测信号。显色反应可持续12-36小时。

免疫组化和荧光免疫染色

加热石蜡切片脱蜡并复水。用抗原处理后，将切片浸入10％H₂O₂/甲醇10分钟以漂白和猝灭内源性过氧化物酶活性。然后，4℃下用一抗孵育切片过夜。洗清10分钟三次后，室温下用二抗(HRP-conjugated或Alexa Fluor series)孵育2小时。使用Leica聚焦显微镜拍摄荧光图像。用DAB substrate kit(Cell Signaling Technology Cat#8059)检测免疫组化信号。

一抗包括：Mouse monoclonal anti-integrinβ-1(Abcam Cat#ab30388,RRID:AB_775736)；Rabbit monoclonal anti-Phospho-ERK1/ERK2(ThermoFisher Scientific Cat#MA5-15173,RRID:AB_11009630)；Mouse monoclonal anti-RUNX2(Santa CruzBiotechnology Cat#sc-390351)；Mouse monoclonal anti-Myc-Tag(Cell SignalingTechnology Cat#2276S,RRID:AB_331783)；Rabbit polyclonal anti-Lef1(Abcam Cat#ab22884,RRID:AB_447344)；Rabbit polyclonal anti-pan-Cytokeratin(Santa CruzBiotechnology Cat#sc-15367,RRID:AB_2134438)和Mouse monoclonal anti-PCNA(AbcamCat#ab29,RRID:AB_303394)。

二抗包括：Goat anti-rabbit IgG-HRP(Santa Cruz Biotechnology Cat#SC-2004,RRID:AB_631746)；Mouse monoclonal anti-mouse-IgGκBP-HRP(Santa CruzBiotechnology Cat#SC-516102,RRID:AB_2687626)；Donkey polyclonal anti-RabbitIgG(H+L),Alexa Fluor 594(ThermoFisher Scientific Cat#A-21207,RRID:AB_141637)和Donkey polyclonal anti-Mouse IgG(H+L),Alexa Fluor488(ThermoFisherScientific Cat#A-21202,RRID:AB_141607)。

三维重构

取一系列下颌骨和牙胚的5μm切片并用H&E染色。拍摄所有切片的显微图像，并用ImageJ 1.50i软件(National Institutes of Health)排列。使用软件Amira6.0.1(ThermoFisher Scientific)重构下颌骨和牙胚的轮廓。

手术后下颌骨变形的量化

取新鲜胚胎并迅速切下下颌骨。将下颌骨固定于平台上，在手术和扫描期间不移动。进行第一次micro-CT。扫描后，在尖牙上方牙龈上切开释放应力，然后进行第二次micro-CT。上述操作在半小时内完成。因此，获得手术前后下颌骨的micro-CT数据。用软件Geomagic Studio(3D Systems)分离含尖牙的下颌骨片段的图像。然后，用软件GeomagicControl(3D Systems)排列手术前后的图像从而产生三维彩色图像。选取穿过尖牙的顶部截面得到2-D图像。通过测量2-D图像的轮廓上的“短棒”的长度量化形变。

样本杨氏模量的试验

下颌骨的骨壁切成小扁平片。使用Piuma Chiaro Nanoindenter(Optics11,Netherlands)测量样本的杨氏模量。使用胶水将样本固定到平台上。表示材料抵御外力的抗变形能力的杨氏模量E类似于弹簧的弹性常数k。为了便于理解，使用Hooke定律F＝kx可解释纳米压痕的原理，该定律揭示了施加的力(F)、伸长率(x)和弹性常数(k)之间的关系。在试验中，施加到样本上的力通过力传感器记录，并使用干涉仪跟踪压痕δ的深度。然后选取Hertz模型来计算杨氏模量E。总计制备9个样本用于纳米压痕试验。对于每个样本，试验大于10个测量点，每个点重复5次。进行超过500次的测量。

模型中泊松比的测定

泊松比是材料抵御外力的抗体积变形的固有性质。对于日常多数材料，当假定0表示无限可压缩，0.5表示不可压缩时，泊松比的值在0-0.5范围内。由于对此类小型样本泊松比试验测量的复杂性，本研究中泊松比的大小是基于泊松比对下颌骨变形的影响的实验来测定。本实验测试了三种梯度泊松比(0.15,0.35和0.48)。结果表明三个组之间在变形时没有明显的变化(在同一数量级内)。考虑到已报道的软骨的泊松比为0.15-0.45(Korhonen等人,2002)，在计算时选取中间值0.35。

“茶杯”模型中建立和应力值的计算

使用ANSYS 15.0(ANSYS)进行模拟。建立“茶杯”模型来模拟无“盖”圆筒状下颌骨。将下颌骨的舌侧、唇侧、前部、后部和底部壁设置为一种均匀的材质。测定最可能的网孔大小用于计算。

施加到下颌骨的应力如下计算(在此提供一维空间的单柱拉伸予以解释)。将柱的原始的长度记为“I”，施加力后的长度记为l+Δl(Δl为准确的变形)。每单位长度的变形定义为ε＝Δl/l(变形的程度)。柱的截面积为“S”。沿柱施加力(F)，然后每单位面积的力(即，应力)可计算为：σ＝F/S。杨氏模量为常数并可以计算为E＝σ/ε。结果在得到物质的几何形状(l,S)，并得到E和ε的值后，可以计算力(应力)：F＝ε*E*S(σ＝ε*E)。在3D模型中，应考虑泊松比。

模型中的边界条件

密封下颌骨的外周组织的轮廓限定了骨壁的移动。为了考虑其影响同时简化模型，在两种边界条件下测量下颌骨的内壁上的应力。其一是下颌骨的外表面固定不动(模型中内外向的形变设定为0)，另一种是完全自由的外表面。真实的变形应当介于两者之间。

计算结果的评价

可以使用三种方法评估施加到模型内壁上的应力范围。第一种是使用下颌骨壁的最大变形来评估施加到模型内壁上的应力。结果得到了范围区间较大的应力(3-20kPa)。第二种是由杨氏模量的测试峰值(μ＝0.23MPa)显示杨氏模量最可能在0.2-0.3MPa之间，这意味着施加到下颌骨内壁的最可能的应力范围为5–13.6kPa。第三种是根据其线性变形，因为舌侧和唇侧下颌骨壁的平均变形为最大变形的一半，这意味着最可能的应力范围为最大范围的一半左右(3-20kPa)。

体外施加到下颌骨的力

下颌骨片置于BioPress^TM Compression Plates(

International)的单个孔中。通过使用

FX-5000^TM Compression System(

International)施加静态压缩力。机械施加持续48小时，并由许多个循环组成。在一个循环中，施加3 kPa的静态压缩力30分钟，随后释放压力(0kPa)5分钟。释放压力是为了培养基能够更好地渗入组织。在对照组中，样本保持空载无压力的状态。

加载至DFCs的力

使用简单设备施加在DFCs上的压力。首先用PBS清洗圆形玻璃盖玻片(5cm²)，然后放置在超过80％融合度的细胞层上方。在盖玻片顶部放置另外的砝码(5g)，从而施加了约1g/cm²的压力。在对照组中仅有盖玻片但没有砝码。在施加力后的第4小时收获试验组和对照组的细胞。

实时RT-PCR

显微切下胚胎60天的恒尖牙和周边软组织，并提取总RNA。使用SuperScript IIIfirst-Strand synthesis system(Invitrogen)进行逆转录。在CFX96real-time system(Bio-Rad)上进行实时PT-PCT。反应体系与SYBRGreenPCR mix(Applied Biosystems)混合。进行三次反应。分析融合曲线。各基因的表达水平通过Gapdh的水平来标准化。用2^ΔΔCT方法测定相对表达水平。

蛋白质印迹

在施加力后，进行慢病毒感染和/或化学处理，收获DFCs。在RIPA和提取缓冲液(Thermo Fisher Scientific)中裂解细胞。上样细胞裂解物(10μg/lane)并通过SDS-PAG分离。将蛋白带转移至Immobilon-P polyvinylidene difluoride membrane(Millipore)。然后用一抗孵育膜带。在用二抗孵育后，用Pierce ECL蛋白印迹底物(Thermo FisherScientific)处理膜带，随后曝光并数字成像。其中一抗如下：rabbit monoclonal to non-phospho(Active)β-Catenin(Cell Signaling Technology Cat#8814S,RRID:AB_11127203)；rabbit polyclonal to Lef1(Abcam Cat#ab22884,RRID:AB_447344)；mousemonoclonal antibody against RUNX2(Santa Cruz Biotechnology Cat#sc-390351)；rabbit monoclonal anti-Phospho-ERK1/ERK2(ThermoFisher Scientific Cat#MA5-15173,RRID:AB_11009630),和rabbit polyclonal toβ-Actin(Abcam Cat#ab129348,RRID:AB_11157949)。

结果：

图1示出了恒尖牙胚启动发育过程。图1中左右并列图为同一图像的不同视图。其中右侧A’-F’表示的各图为对应左侧A-F表示的各图中方框区域的放大图。A示胚胎第50天(E50)时恒牙牙板贴附在乳牙成釉器表面；B示E55时恒牙牙板逐渐与乳牙分离；C示E60时恒牙牙板已经与乳牙分离，成为独立的恒牙胚，周围间充质包围恒牙胚成为微环境，此时恒牙胚保持静止；D示E85时乳牙正在萌出，恒牙牙板周围间充质环境被破坏，恒牙开始启动发育；E示E90时乳牙已萌出，恒牙启动发育至帽状早期；此时恒牙胚位置较高，位于乳牙舌侧并靠近龈沟。F示PN10时恒牙继续发育至钟状期；此时恒牙胚仍在位于较高位置。

图2示E90小型猪恒尖牙胚解剖位置；A图示在乳尖牙舌侧牙龈上行拐杖形切口；B图示切开黏膜和黏骨膜，并向外翻瓣；C图示切开舌侧骨板，并向外侧翻开，暴露出贴附于舌侧骨板上的恒牙胚；D图为C图区域放大，黑色虚线示蕾状期的恒牙胚，可见此时恒牙胚位于高位，靠近舌侧牙龈。

图3示出生物应力调控恒牙胚的启动；A图为示意图，说明从下颌骨上沿尖牙近远中面切开颌骨，获得的颌骨片包含乳恒尖牙，手术释放了颌骨内生物应力。在体外培养体系中，给予3kPa压力达到应力补偿，在对照组中不予施加压力，体外培养2天；B图示在体外培养2天后，实验组、对照组以及正常E60三者之间的形态学比较，可见对照组明显启动发育至帽状早期，而实验组与E60组保持了恒牙胚的静止状态。

图4示出力学调控通路Integrinβ-1-ERK1-RUNX2在乳恒牙之间间充质内的高表达；A-M示加力组与正常E60组表达相似；加力对照组(非加力组)与正常E90组表达相似；N-R示该分子通路在人牙胚发育中有相似的表达模式；S-U示在细胞水平上该分子通路受力学调控。

图5示过表达RUNX2可以抑制恒牙胚的启动，敲减RUNX2则可以激活启动；A-K示相比于对照组及正常E60组，过表达RUNX2抑制恒牙胚的启动；L-N示与对照组相同，敲减RUNX2可以启动恒牙胚的发育。

图6示Wnt/β-catenin通路与RUNX2表达模式相似，均表达在乳恒牙之间间充质内。当乳恒牙之间间充质高表达Wnt通路信号时牙胚发育受到抑制，而间充质内Wnt信号向上皮内转移时牙胚发育启动。

图7示出植入生物支架材料；早期的恒牙胚位于乳牙舌侧，靠近牙龈缘；顺乳牙牙根表面将牙周膜切开，至恒牙胚下方，暴露乳恒牙之间的间隙；将生物支架材料插入乳恒牙之间，隔离乳恒牙，利用生物支架材料改变恒牙生长的生物力学环境。

在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。

Claims (8)

1.一种制备用于调节恒牙牙板周围间充质张力从而启动或促进恒牙胚发育的支架的方法，其特征在于，所述支架包含改变生物张力的活性因子，且具有适于贴附在乳牙根表面且植入龈沟下方的结构，且具有0.25-0.40的泊松比或0.10-0.25MPa的杨氏模量；所述活性因子为调控Integrin β1-Erk1-Runx2-Wnt/beta-catenin通路的分子。

2.根据权利要求1所述的方法，所述支架包括孔隙直径为1-10μm、孔隙密度为50-200个/mm²的多孔材料。

3.根据权利要求2所述的方法，其中所述多孔材料包括选自人工合成材料、天然衍生材料和复合材料组成的组中的至少之一。

4.根据权利要求1所述的方法，其中所述分子为细胞因子、重组蛋白、核酸和小分子药物。

5.根据权利要求1所述的方法，其中所述分子包括选自由Wnt 抑制剂、Wnt配体分子U0126、RUNX2抑制剂、shh激活剂、TGF/Smad通路调节剂、FGF重组蛋白组成的组中的至少之一。

6.根据权利要求5所述的方法，其中所述Wnt抑制剂为Dkk1、Sfrp1、Sostdc1。

7.根据权利要求4所述的方法，其中所述核酸包括含有RUNX2基因的构建体、调控RUNX2基因表达的干扰RNA、含有Wnt基因的构建体或调控Wnt基因表达的干扰RNA。

8.根据权利要求1所述的方法，其中所述支架具有凹面的弧形，且所述凹面用于贴附在乳牙根表面，所述支架的顶部宽3-6mm，底部宽1.5-3.5mm，平均厚度300-500μm，顶部厚度400-600μm，底部厚度200-400μm。

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