TWI384998B - 抗-TGF-β受體II抗體 - Google Patents
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Description
本發明係關於醫學領域,具體而言以下領域:結合人類轉化生長因子β受體II(TGFβRII)之抗體、包含該等抗體之醫藥組合物及使用該等抗體於(例如)治療癌症、纖維變性及纖維變性疾病之方法。
本案係依據申請日為2008年11月7日之美國專利申請案號61/198,697及申請日為2009年4月17日之美國專利申請案號61/170,369主張優先權。
TGFβ係調節生長及分化、運動、細胞外基質產生及免疫功能之多效型細胞激素。TGFβ具有3種哺乳動物異構物(TGFβ-1、TGFβ-2及TGFβ-3),各具有不同的活體內功能。所有3種TGFβ皆使用相同的受體信號傳導系統。TGFβ與TGFβRII結合係起始TGFβ信號傳導途徑活化(導致Smad2磷酸化)並使經活化Smad2/Smad4複合物轉移至核以調節基因表現之關鍵步驟。
以高親和性(KD為8.06×10-10及1.91×10-9 M)結合人類TGFβRII以治療腎病及組織纖維變性之人類單株抗體(mAb)揭示於JP 2004/121001A中。該申請案亦揭示了mAb抑制由TGFβ誘導之角質細胞生長(IC50平均值為2.17-3.89、3.17-4.95及3.21-5.07 μg/ml)。據報導,使用針對TGFβRII之全人類單株抗體可有效降低大鼠抗-Thy-1腎炎中細胞外基質之沉積。(Kasuga,H.等人,Kidney Int'l,第
60卷(2001)1745-1755.)
迄今為止,尚未揭示具有以下特性之高特異性、高親和性抗-TGFβRII抗體:以極高親和性特異性結合人類TGFβRII之細胞外結構域,阻斷人類TGFβ1、TGFβ2及TGFβ3與人類TGFβRII結合,抑制血管發生,抑制腫瘤細胞生長,抑制癌細胞之遷移及侵襲,降低膠原沉積及肝功能,抑制由配體誘導之T細胞調節,或組合細胞毒性劑抑制腫瘤生長,且因此需要該等抗體。
本發明試圖提供滿足該等需求之新穎分離之抗-TGFβRII mAbs。TGFβRII係哺乳動物的,較佳係人類的。本發明抗體可具有一或多個以下活性:1)呈現對人類TGFβRII之細胞外結構域之高親和性結合;2)阻斷TGFβRII配體(TGFβ1、TGFβ2及TGFβ3)與TGFβRII結合,由此抑制TGFβ所誘導之Smad2磷酸化;3)內在化TGFβRII,其可用作獨立於配體-受體相互作用之信號傳導下調機制;4)抑制配體所誘導之TGFβRII信號傳導途徑;5)抑制TGFβRII所調介之細胞活性;6)抑制活體外及活體內腫瘤生長;且另外更佳可具有一或多個以下活性:7)藉由降低TGFβ所誘導之血管內皮生長因子A(VEGF-A)分泌而抑制血管發生;8)抑制癌細胞之遷移及侵襲;9)降低膠原沉積及肝功能;10)抑制配體所誘導之T細胞調節以形成具有免疫抑制作用之Treg細胞;或11)與細胞毒性劑組合抑制腫瘤生長。
與TGFβRII特異性結合並中和TGFβRII所調介之活性之
高親和性單株抗體特別可用作治療TGFβ信號傳導所介導之疾病之治療性生物製劑。
根據本發明第一態樣,提供分離之抗體,其在室溫(20-25℃)以小於100 pM之KD特異性結合人類TGFβRII之細胞外結構域。
在一個態樣中,本發明抗體以ELISA所測定小於1.0 nM之IC50阻斷人類TGFβ1、TGFβ2或TGFβ3與人類TGFβRII結合。
在另一態樣中,本發明抗體以小於30 nM之IC50抑制TGFβ所誘導之Smad2磷酸化。
在又一態樣中,本發明抗體包含與TGFβRII特異性結合之抗體,其包含:i)具有序列GGSISNSYF(SEQ ID NO:1)之CDRH1、具有序列SFYYGEKTYYNPSLKS(SEQ ID NO:2)之CDRH2、具有序列GPTMIRGVIDS(SEQ ID NO:3)之CDRH3、具有序列RASQSVRSYLA(SEQ ID NO:10)之CDRL1、具有序列DASNRAT(SEQ ID NO:11)之CDRL2及具有序列QQRSNWPPT(SEQ ID NO:12)之CDRL3;ii)具有序列GGSISSSSY(SEQ ID NO:7)之CDRH1、具有序列SFYYSGITYYSPSLKS(SEQ ID NO:8)之CDRH2、具有序列GFTMIRGALDY(SEQ ID NO:9)之CDRH3、具有序列RASQSVRSFLA(SEQ ID NO:
16)之CDRL1、具有序列DASNRAT(SEQ ID NO:11)之CDRL2及具有序列QQRSNWPPT(SEQ ID NO:12)之CDRL3。
在另一態樣中,本發明抗體包含:i)HCVR胺基酸序列:QLQVQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISNSYFSWGWIRQPPGKGLEWIGSFYYGEKTYYNPSLKSRATISIDTSKSQFSLKLSSVTAADTAVYYCPRGPTMIRGVIDSWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:25)及LCVR胺基酸序列:EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVRSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPPTFGQGTKVEIK(SEQ ID NO:27);ii)HCVR胺基酸序列:QLQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSSSYSWGWIRQPPGKGLEWIGSFYYSGITYYSPSLKSRIIISEDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCASGFTMIRGALDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:33)及LCVR胺基酸序列:EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVRSFLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPPTFGQGTKVEIK(SEQ ID NO:35)。
在另一態樣中,本發明抗體包含HCVR胺基酸序列:QLQVQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISNSYF
SWGWIRQPPGKGLEWIGSFYYGEKTYYNPSLKSRATISIDTSKSQFSLKLSSVTAADTAVYYCPRGPTMIRGVIDSWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:25)及LCVR胺基酸序列:EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVRSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPPTFGQGTKVEIK(SEQ ID NO:27)。
在另一態樣中,本發明抗體包含:i)SEQ ID NO:37之重鏈及SEQ ID NO:4之輕鏈;ii)SEQ ID NO:6之重鏈及SEQ ID NO:14之輕鏈。
在另一態樣中,本發明抗體包含兩條SEQ ID NO:37之重鏈及兩條SEQ ID NO:4之輕鏈。
在另一態樣中,本發明包含人類TGFβRII結合片段。
本發明涵蓋可向有需要之個體投與任一本發明抗體。因此,本發明一個態樣提供醫藥組合物,其包含本發明之抗體或片段及醫藥上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑。
在本發明之一較佳態樣中,抗體或其功能片段在競爭ELISA分析中與競爭性抗體競爭與TGFβRII之細胞外結構域結合,其中該競爭性抗體在室溫(20-25℃)下以小於100 pM之KD與TGFβRII結合。
在本發明之另一較佳態樣中,本發明抗體以藉由ELISA所測定小於1.0 nM之IC50阻斷人類TGFβ1、TGFβ2或TGFβ3與人類TGFβRII結合。
亦涵蓋本發明mAb可用於治療肺、肝及腎之纖維變性或
纖維變性疾病。在一個態樣中,提供治療肺、肝及腎之纖維變性或纖維變性疾病之方法,其包含向需要此治療之個體投與有效量之本發明mAb。
本發明一個態樣提供本發明抗體用作藥劑。本發明一個態樣提供本發明抗體用於治療癌症。本發明再一態樣提供抗體用於治療乳癌、肺癌或胰腺癌。本發明抗體可與抗癌劑一起用於治療癌症。本發明另一態樣提供含有用於組合治療之抗體或片段與額外抗癌劑之產品以同時、分開或依序用於療法。
本發明之較佳態樣提供與hTGFβRII之細胞外結構域特異性結合之經分離抗體,其包含具有序列GGSISX1SX2X3(SEQ ID NO:17)之CDRH1,其中X1係N或S,X2係Y或S,且X3係F或Y;具有序列SFYYX1X2X3T YYX4PSLKS(SEQ ID NO:18)之CDRH2,其中X1係G或S,X2係E或G,X3係K或I,X4係N或S;具有序列GX1TMIRGX2X3DX4(SEQ ID NO:42)之CDRH3,其中X1係P或F,X2係V或A,X3係I或L,X4係S或Y;具有序列RASQSVRSX1LA(SEQ ID NO:20)之CDRL1,其中X1係Y或F;具有序列DASNRAT(SEQ ID NO:11)之CDRL2;及具有序列QQRSNWPPT(SEQ ID NO:12)之CDRL3。
本發明另一態樣提供治療病患之癌症之方法,其包含向該病患投與有效量之本發明抗體。癌症可為乳癌、肺癌或胰腺癌。抗體可與有效量之另一抗癌劑同時、分開或依序投與病患。抗癌劑可為環磷醯胺。
本發明另一態樣提供與人類TGFβ受體II(TGFβRII)之細胞外結構域特異性結合之經分離抗體,其包含:具有序列GGSISNSYF(SEQ ID NO:1)之CDRH1、具有序列SFYYGEKTYYNPSLKS(SEQ ID NO:2)之CDRH2、具有序列GPTMIRGVIDS(SEQ ID NO:3)之CDRH3、具有序列RASQSVRSYLA(SEQ ID NO:10)之CDRL1、具有序列DASNRAT(SEQ ID NO:11)之CDRL2及具有序列QQRSNWPPT(SEQ ID NO:12)之CDRL3;或具有序列GGSISSSSY(SEQ ID NO:7)之CDRH1、具有序列SFYYSGITYYSPSLKS(SEQ ID NO:8)之CDRH2、具有序列GFTMIRGALDY(SEQ ID NO:9)之CDRH3、具有序列RASQSVRSFLA(SEQ ID NO:16)之CDRL1、具有序列DASNRAT(SEQ ID NO:11)之CDRL2及具有序列QQRSNWPPT(SEQ ID NO:12)之CDRL3或抗體之TGFβRII結合片段。
本發明另一態樣包含本發明抗體,其包含HCVR胺基酸序列:QLQVQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISNSYFSWGWIRQPPGKGLEWIGSFYYGEKTYYNPSLKSRATISIDTSKSQFSLKLSSVTAADTAVYYCPRGPTMIRGVIDSWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:25)及LCVR胺基酸序列:EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVRSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPPTFGQGTKVEIK(SEQ ID NO:27);或HCVR胺基酸序列:QLQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSSSYSWGWIRQPPGKGLEWIGSFYYSGITYYSPSLKSRIIIS
EDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCASGFTMIRGALDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:33)及LCVR胺基酸序列:EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVRSFLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPPTFGQGTKVEIK(SEQ ID NO:35)或抗體之TGFβRII結合片段。
本發明另一態樣包含本發明抗體,其包含SEQ ID NO:37之重鏈及SEQ ID NO:4之輕鏈或SEQ ID NO:6之重鏈及SEQ ID NO:14之輕鏈。
「經分離抗體」係具有以下性質之抗體:(1)已自組份混合物部分、實質上、或完全純化;(2)已得到鑒定並自其天然環境組份分離及/或回收;(3)為單株;(4)不含來自相同物種之其他蛋白質;(5)由來自不同物種之細胞表現;或(6)非天然存在。其天然環境之污染組份係可干擾抗體之診斷或治療用途之物質,且可包括酶、激素、及其他蛋白質或非蛋白質溶質。經分離抗體之實例包括經親和純化之抗體、藉由雜交瘤或其他活體外細胞系制得之抗體、及衍生自轉基因小鼠之人類抗體。
本文所用術語「抗體」係指包含藉由二硫鍵相互連接之4條多肽鏈、2條重鏈(H)及2條輕鏈(L)之免疫球蛋白分子。各重鏈包括重鏈可變區(本文縮寫為HCVR或VH)及重鏈恒定區。重鏈恒定區含有3個結構域:CH1、CH2及CH3。各輕鏈包括輕鏈可變區(本文縮寫為LCVR或VL)及輕鏈恒定區。來自任何脊椎動物物種之抗體(免疫球蛋白)之輕鏈基
於其恒定結構域之胺基酸序列可歸屬為兩種完全不同類型(稱作卡帕(kappa)(K)及蘭布達(lambda)(λ))中之一種。K輕鏈可變區在本文中稱作VK。本文所用措詞VL意欲包括來自K型輕鏈之可變區(VK)及來自λ輕鏈之可變區二者。輕鏈恒定區包括一個結構域(CL)。VH及VL區包括超變區(稱為互補決定區(CDR)),其間雜有較為保守區(稱為框架區(FR))。各VH及VL由3個CDR及4個FR構成,其自胺基末端至羧基末端之排列順序如下:FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。
「CDRH1」係指抗體重鏈中之第一CDR區,「CDRH2」係指抗體重鏈中之第二CDR區,且「CDRH3」係指抗體重鏈中之第三CDR區。「CDRL1」係指抗體輕鏈中之第一CDR區,「CDRL2」係指抗體輕鏈中之第二CDR區,且「CDRL3」係指抗體輕鏈中之第三CDR區。
術語「抗原結合片段」係指完整抗體之部分或片段,其包含其抗原結合區或可變區。抗體片段之實例包括小於全長抗體,例如Fab片段、F(ab')2或單鏈可變片段(scFv)。同樣,本發明亦涵蓋自本發明抗原結合片段所形成或部分形成之雙特異性抗體、線性抗體、單鏈抗體、融合蛋白、重組蛋白及多價或多特異性抗體。
本文所用術語「TGF-β受體II」或「TGFβRII」係指結合包括(但不限於)TGFβ1、TGFβ2及TGFβ3在內之配體並因而起始細胞內信號轉導途徑之細胞表面受體。人類TGFβRII係一跨膜蛋白,其由SEQ ID NO:40之DNA序列編碼而
成。
本發明抗體結合人類TGFβRII、更具體而言人類TGFβRII之細胞外結構域,並阻斷人類TGFβ1、TGFβ2及TGFβ3與人類TGFβRII結合。
本發明抗體亦包括已藉由定向突變、親和力成熟、噬菌體展示或鏈改組方法及藉由業內已知方法改良結合特性之彼等抗體。本發明抗體包括來自本發明抗體(稱作TGF1及TGF3)之重鏈及輕鏈(其全長或部分)之任一組合。
本發明抗體可用作模板或親代抗體以使用包括CDR移植、鑲飾或表面重建及鏈改組在內之各種技術製備本發明之其他抗體(例如,如美國專利第5,565,332號中所揭示)。本發明之人類抗體在(例如)CDR內可包括不由人類種系免疫球蛋白序列編碼之胺基酸殘基(舉例而言,藉由活體外隨機誘變或定點誘變或藉由活體內體細胞突變引入之突變)。人類抗體之至少一個位置可經不由人類種系免疫球蛋白序列編碼之胺基酸殘基(例如,增強活性之胺基酸殘基)取代,且由此可進一步產生衍生自本文所提供序列之可變區胺基酸序列。
在一種方法中,將親代抗體CDR移植至與親代抗體框架具有高序列一致性之人類框架中。新框架與親代抗體中相應框架之序列一致性通常可為至少80%、至少85%或至少90%。與親代抗體相比,該移植可導致結合親和性降低。若如此,則可基於由Queen公佈之特定標準(Queen等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88,2869(1991))使該框架於某
些位置回復突變為親代框架。可使用的其他方法包括(例如)Jones等人,Nature,321:522(1986);Riechmann等人,Nature,332:323-327(1988)及Verhoeyen等人,Science,239:1534(1988)。
可於特定取代位點引入至多所有20種天然存在之替代胺基酸。然後,此處所定義之活體外選擇方法可適宜用來篩選該等額外可變區胺基酸序列之具有所主張活體外交叉反應性之Fab片段。以該方法可鑒定適於製備本發明之人類化抗體之其他Fab片段。較佳地,框架內之胺基酸取代局限于本文所揭示一個或每個框架序列內之一個、兩個或三個位置。較佳地,CDR內之胺基酸取代局限於一個或每個CDR內之一至三個位置,更佳地,在一個或每個CDR內之一或兩個胺基酸位置實施取代。另外較佳地,在重鏈可變區之CDR中之一或兩個胺基酸位置實施胺基酸取代。組合CDR與框架取代以使用本文所述抗體作為親代抗體製備本發明替代抗體之適宜方法提供於Wu等人,J.Mol.Biol.,294:151-162中。
術語「KD」係指特定抗體-抗原相互作用之離解常數。其係藉由公式koff/kon=KD來計算。術語「kon」係指正向反應或複合物形成反應之締合或結合速率常數、或比反應速率,以單位M-1sec-1量測。術語「koff」係指抗體自抗體/抗原複合物離解之離解或解離速率常數、或比反應速率,以單位1/秒量測。本發明抗體之結合親和性與較低koff之相關程度通常高於與較高kon之相關程度,然而,不受理論限
制,涵蓋koff與kon二者經改良之實施例。在一更佳態樣中,本發明抗體係通常展現低koff值之高效能抗體或其片段。
在某些態樣中,本發明抗體具有約1 pM至約200 pM、約5 pM至約100 pM或約10 pM至約80 pM之KD。
本文所用術語「阻斷結合」及「抑制結合」(可互換使用)係指細胞激素與其受體結合之阻斷/抑制,導致細胞激素/受體信號途徑之生物功能之完全或部分抑制或降低。藉由量測一或多個TGFβ活性之活體外或活體內指示物(例如,受體結合、對細胞生長之抑制作用、趨化性、細胞凋亡、細胞內蛋白磷酸化或信號轉導)之完全或部分抑制或降低來評價TGFβ與TGFβRII結合之阻斷/抑制。可藉由本文所述ELISA量測阻斷TGFβ與TGFβRII結合之能力。可藉由量測細胞、例如如本文所述人類MDA-MB-231細胞中Smad2磷酸化之抑制來評價抑制TGFβ活性之能力。
本發明抗體以約0.05 nM至約1.0 nM、約0.08 nM至約0.75 nM或約0.10 nM至約0.60 nM之IC50阻斷人類TGFβ1、TGFβ2或TGFβ3與人類TGFβRII結合。
在活體外阻斷分析、例如如本文所述活體外MDA-MB-231細胞阻斷分析中,本發明抗體以小於或等於約2.0 nM至約30 nM、約3.0 nM至約15.0 nM或約4.0 nM至約7.5 nM之IC50抑制由TGFβ誘導之Smad2磷酸化。
抗體可具有與天然物種中所發現者不同或有所改變之糖基化模式。如業內所習知,糖基化模式可端視抗體序列
(例如,是否存在特定糖基化胺基酸殘基)或宿主細胞或產生該蛋白之生物體而定。涵蓋本發明抗體包括本文所揭示抗體以及其糖基化變型體。
本發明亦包括包含任一本文所述聚核苷酸之表現載體。例示性載體包括質粒、噬菌粒、黏粒、病毒及噬菌體核酸或能夠在諸如細胞(例如,哺乳動物細胞)等原核或真核宿主中複製之其他核酸分子。載體可為表現載體,其中編碼抗體之聚核苷酸與表現控制元件以可操作方式連接。典型表現載體含有可用于調節本發明核酸分子表現之轉錄及翻譯終止子、起始序列及啟動子。載體亦可含有具有獨立終止子序列之基因表現序列盒、允許載體在真核生物與原核生物二者中複製之序列(即,穿梭載體)及用於原核及真核系統二者之選擇標記物。載體通常含有標記物以提供選擇轉化宿主之表現型性狀,例如賦予對諸如氨苄西林(ampicillin)或新黴素(neomycin)等抗生素之抗性。
適宜啟動子包括組成型啟動子及誘導型啟動子。代表性啟動子包括衍生自人類巨細胞病毒之啟動子、金屬硫蛋白啟動子、SV-40早期啟動子、SV-40後期啟動子、鼠科動物乳房腫瘤病毒啟動子、勞斯(Rous)肉瘤病毒啟動子及多角體蛋白啟動子。
本發明亦包括含有本發明核酸分子或表現載體之重組細胞。「重組細胞」意指非人類多細胞生物體或「宿主細胞」,其係指引入本發明核酸分子或載體之細胞或細胞群。本發明宿主細胞可為真核細胞或細胞系,例如植物、
動物、脊椎動物、哺乳動物、齧齒類動物、小鼠、靈長類動物或人類細胞或細胞系。
在一個態樣中,本發明宿主可為原核或真核宿主。適宜原核宿主包括(例如)大腸桿菌(Escherichia coli),例如大腸桿菌SG-936、大腸桿菌HB 101、大腸桿菌W3110、大腸桿菌X1776、大腸桿菌X2282、大腸桿菌DHI及大腸桿菌MRC1;假單胞菌屬(Pseudomonas);芽孢桿菌屬(Bacillus),例如枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis);及鏈黴菌屬(Streptomyces)。適宜真核細胞包括酵母及其他真菌、昆蟲細胞、植物細胞、人類細胞及動物細胞,該等動物細胞包括諸如雜交瘤系、COS細胞、NS0細胞及CHO細胞等哺乳動物細胞。
本發明包括製備抗體之方法,其藉由培養表現一或多個編碼本發明抗體之核酸序列之重組細胞並自培養基回收該抗體來實施。如此表現之抗體通常在表現後加以純化或分離。可以彼等熟習此項技術者所熟知之各種方法分離或純化抗體。標準純化方法包括層析技術、電泳技術、免疫學技術、沉澱技術、透析技術、過濾技術、濃縮技術及層析聚焦技術。如業內所熟知,各種天然蛋白可結合抗體,例如細菌蛋白A、G及L,且該等蛋白可在本發明中用於純化。通常可藉由特定融合伴侶來實施純化。舉例而言,若採用GST融合,則可使用麩胱甘肽樹脂來純化蛋白;若採用His-標簽,則可使用Ni+2親和層析來純化蛋白;或若使用His-標簽,則可使用經固定抗-Flag抗體來純化蛋白。可
藉由自培養基分離抗體來純化之。包含一條以上鏈之抗體可藉由使各鏈一起表現在相同宿主中或作為單獨鏈表現並在自培養基回收之前或之後組裝該等單獨鏈來製備。
可使用各種方法篩選抗體,該等方法包括(但不限於)活體外分析、活體外基於細胞分析、活體內分析及選擇技術。可篩選之抗體性質包括(但不限於)生物活性、穩定性、溶解性及對靶之結合親和性。可同時或個別地篩選多個性質。蛋白可加以純化或不加以純化,端視分析需要而定。在一個態樣中,篩選係抗體與已知或據認為結合抗體之蛋白或非蛋白分子結合之定性或定量結合分析。在一個態樣中,篩選係量測與靶抗原之結合之結合分析。在篩選程序中可利用自動化及高通量篩選技術。篩選可採用融合蛋白或經標記蛋白。可使用業內所熟知之各種方法來實施結合分析,該等方法包括(但不限於)ELISA。本文所用「競爭結合」係指抗體使結合或信號傳導降低至少約20%、30%、50%、70%或90%之情形,如藉由業內可用技術(例如,競爭ELISA或使用BIAcore之Kd量測)所量測,但並不意欲完全消除結合。
一種為業內所熟知的量測結合相互作用之裝置係購自Pharmacia Biosensor(Uppsala,Sweden)之BIAcoreTM 2000儀器。
本發明包括包含本文所述本發明抗體及醫藥上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑之醫藥組合物。醫藥組合物可視情況含有其他治療成份。本文所用「醫藥上可接受之載劑」
包括在生理上相容的溶劑、分散介質、塗布劑、抗細菌劑及抗真菌劑、等滲劑及吸收延遲劑、及諸如此類。
醫藥上可接受之載劑之實例包括水、鹽水、磷酸鹽緩衝鹽水、葡萄糖、甘油、乙醇及諸如此類,以及其組合。醫藥上可接受之載劑可進一步包括諸如潤濕劑或乳化劑、防腐劑或緩衝劑等少量輔助物質(其可提高抗體之存架壽命或效力)以及等滲劑,例如糖、多元醇(例如甘露醇及山梨醇)及氯化鈉。
本發明醫藥組合物可以各種方式調配,包括(例如)液體、半固體及固體劑型,例如液體溶液(例如,可注射及可輸注溶液)、分散液或懸浮液、粉劑、脂質體及栓劑。較佳地,該等組合物係呈可注射或可輸注溶液形式。
較佳投與模式係非經腸(例如,靜脈內、皮下、腹膜內、肌內)投與。尤佳模式係靜脈內輸注或注射、肌內注射及皮下注射。根據如(例如)Remington,The Science and Practice of Pharmacy,第19版,Gennaro編輯,Mack出版公司,Easton,PA 1995中之習用技術設計該等組合物,該出版物提供通常為從業人員所熟知之調配技術之綱要。
用於治療本文所述疾病或病症的本發明組合物之有效劑量端視許多不同因素而有所變化,該等因素包括投與手段、靶位點、患者之生理狀態、患者是人類還是動物、所投與之其他藥劑、及治療是預防性的還是治療性的。治療劑量可使用彼等熟習此項技術者已知之常規方法來滴定以使安全性及功效最優化。
術語「治療」(「treat」、「treating」及「treatment」)係指治療性治療,其中目的在於減緩(減小)與疾病或病症有關之不期望生理變化。有益或期望臨床結果包括(但不限於)症狀之緩解、疾病或病症程度之降低、疾病或病症之穩定(即,疾病或病症不惡化)、疾病或病症進展之延遲或減緩、及疾病或病症之消除(部分或完全),此等結果可檢測或不可檢測。「治療」亦可意指與預期的若不接受治療之存活期相比存活期延長。彼等需要治療者包括彼等業已患有該疾病或病症者以及彼等易於患該疾病或病症者。
本發明醫藥組合物可包括「治療有效量」之本發明抗TGFβRII抗體。「治療有效量」意指以所需劑量及在所需時期內有效達成期望治療結果之量。抗體之治療有效量可根據以下因素而有所變化:例如疾病狀態、年齡、性別、個體體重、及抗體或抗體部分於該個體內引發期望反應之能力。治療有效量亦為抗體或抗體部分之治療有益作用勝過其任何毒性或有害作用之量。
可調整劑量方案以提供最佳期望反應。舉例而言,可投與單次濃注劑,可經一段時間投與若干分開劑量或者可依照治療情形之緊急程度所示按比例減少或增加劑量。以劑量單元形式來調配非經腸組合物特別有利於方便投與及達成劑量一致性。劑量單元形式意指含有所計算用以產生期望治療效果的預定量之活性化合物以及所需醫藥載劑之劑量。本發明劑量單元形式之規格取決於且直接依賴於以下因素:(a)活性化合物之獨特特性及欲達成之特定治療或預
防效果,及(b)調配此一活性化合物以治療個體敏感性之技術中固有限制條件。
本發明抗體之治療有效量之一個例示性非限制性範圍係0.1至50 mg/kg。在另一態樣中,抗體之有效量係3至35 mg/kg。在另一態樣中,有效量係10至25 mg/kg。在另一態樣中,有效量係5至20 mg/kg。在另一態樣中,有效量係3至15 mg/kg。在另一態樣中,有效量係2至10 mg/kg。在另一態樣中,有效量係5至10 mg/kg。在另一態樣中,抗體之有效量係1至10 mg/kg。應注意的是,劑量值可隨欲緩解病況之類型及嚴重程度而變。應進一步瞭解,對於任一特定個體而言,應根據個體需要及投與組合物或監督組合物投與之個人的專業判斷隨時間調整具體劑量方案,且本文所述之劑量範圍僅為例示性而非意欲限制所主張組合物的範圍或實踐。
本發明抗體可用於治療癌症。癌症被認為一大群由起源組織及腫瘤進展程度所分類之疾病。癌症亦可分類為原發性腫瘤及轉移性腫瘤,以及頑固性或復發性腫瘤。頑固性腫瘤係對單獨化學治療劑、單獨抗體、單獨輻射或其組合之治療不反應或抵抗之腫瘤。復發性腫瘤係似乎受到此等藥劑治療所抑制,但在中斷治療後多至5年、有時多至10年或更長復發之腫瘤。
可治療之癌症亦包括未血管化或尚未實質上血管化之腫瘤以及血管化腫瘤。癌症可包括非實體腫瘤或實體腫瘤。
本發明抗-TGFβRII抗體亦可用來治療TGFβRII相關之病
症、疾病或病況,包括慢性及急性病症或疾病,包括使哺乳動物易患該病症之病理病況。本文擬治療之病症包括由動脈損傷、感染、類風濕性關節炎、糖尿病或糖尿病病況、或惡性腫瘤所造成之纖維變性;特徵在於細胞外基質累積之疾病;TGFβRII信號傳導所造成之疾病;TGFβRII調介之活性所致之免疫系統抑制所造成之病況;嚴重損傷、燒傷及諸如病毒或細菌感染等疾患所致之急性免疫缺陷;及TGFβRII調介之活性所致之多器官全身性疾患。
TGFβs在造血幹細胞之自我更新、增殖及分化中起重要作用。本發明抗體可用於幹細胞之富集及再生,及促進心肌梗塞後、神經元病症及各種類型之組織再生中基於幹細胞之治療。
本發明抗體可單獨投與,或與抗人類TGFβRII抗體以外之抗腫瘤劑組合投與,該等抗腫瘤劑包括化學治療劑、輻射、其他TGFβRII拮抗劑、TGFβ拮抗劑、抗血管發生劑、其他靶之抗體及小分子。抗-TGFβRII抗體尤其可用於治療對於抗-VEGF-A抵抗之腫瘤。投與該等抗體與其他抗體及/或治療可在相同或不同的時間經由相同或不同的途徑同時或分開實施。
本文所述治療方法可用來治療任一適宜的哺乳動物,包括諸如猴及人類等靈長類動物、馬、牛、貓、狗、兔及諸如大鼠及小鼠等齧齒類動物。
僅出於闡釋目的提供以下實例,且並非意欲以任何方式限定本發明之範圍。
人類TGFβ1、TGFβ2及TGFβ3可以重組方式產生並純化或可購自(例如)R&D Systems。重組TGFβRII Fc融合蛋白(TGFβRII-Fc)及可溶重組TGFβRII鹼性磷酸酶(TGFβRII-AP)蛋白可在經穩定轉染之細胞中表現並依照熟習此項技術之人員已知之程序自細胞培養上清液純化(Tessler,J.Biol.Chem.,269:12456-12461(1994))。
人類癌症細胞系(BXPC-3、PANC-1、MDA-MB-231)及小鼠腫瘤細胞系(EMT6、4T1、CT26、B16-F10)及骨髓瘤細胞系P3-X63-Ag8.653可自美國典型培養物保藏中心(American Type Tissue Culture Collection)(Manassas,VA)獲得。MDA-MB-231螢光素酶轉染細胞系可自桑尼布魯克健康科學中心(Sunnybrook Health Sciences Centre)獲得。可在含有10%胎牛血清(FCS,Hyclone,Logan,UT)之RPMI1640或IMDM培養基(Invitrogen/Life Technologies公司,Rockville,MD)中保存細胞。可於37℃下在5% CO2增濕氣氛中保存所有細胞。
可基本上藉由標準雜交瘤技術(Harlow & Lane編輯,Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor,第211至213頁(1998))使用產生人類免疫球蛋白γ重鏈及K輕鏈之人類免疫球蛋白轉基因小鼠(Medarex,San Jose,CA)、或Lewis大鼠(Charles River Laboratories,Wilmington,MA)
產生抗-TGFβRII mAb。簡言之,用經完全弗氏佐劑(complete Freund's adjuvant)乳化之重組人類或小鼠TGFβRII-Fc蛋白經皮下(s.c.)免疫小鼠或大鼠。用存於不完全弗氏佐劑中之相同TGFβRII-Fc蛋白經腹膜內(i.p.)對動物加強3次。使動物休息一個月,之後使其接受最後一次存於磷酸鹽緩衝溶液(PBS)中之50微克(μg)TGFβRII-Fc蛋白之經腹膜內加強。自免疫小鼠收穫脾細胞並使用聚乙二醇(PEG,MW:1450 KD)使其與P3-X63-Ag8.653漿細胞瘤細胞融合。在融合後,將細胞再懸浮於補充有10%胎牛血清(FBS)之HAT(次黃嘌呤、胺基蝶呤、胸苷)培養基中並以200微升/孔之密度分佈至96孔板以建立雜交瘤細胞。
在融合後第10至12天,在基於ELISA之結合及阻斷分析中針對抗體產生及培養上清液與TGFβRII蛋白之特異性結合活性篩選雜交瘤。具體而言,首先藉由使用與山羊抗人類K輕鏈或抗小鼠IgG辣根過氧化物酶(HRP)結合之抗體依照以下程序檢測TGFβRII結合抗體來鑒定產生抗-TGFβRII mAb之雜交瘤。以100 ng/孔將人類TGFβRII-Fc或小鼠TGFβRII-Fc塗布於96微量滴定板上並於4℃下過夜。在室溫下用阻斷緩衝液(含有5%幹乳之PBS 0.05%吐溫(TWEEN)® 20)阻斷經塗布板2小時。在具有2%牛血清白蛋白(BSA)及0.05%吐溫® 20之PBS(ELISA緩衝液)中稀釋雜交瘤上清液或純化抗體,並將其在經TGFβRII塗布之96孔微量滴定板中培養30分鐘。用ELISA緩衝液洗滌各板,並將其與山羊抗人類K輕鏈或抗小鼠IgG-HRP結合物一起培
養30分鐘。依照製造商說明書使用TMB(3,3',5,5'-四-甲基聯苯胺)受質達成顯色。讀取450奈米(nm)下吸光率以定量抗體結合活性。為了鑒定產生中和抗-TGFβRII mAb之雜交瘤,依照以下程序實施基於ELISA之阻斷分析。以200 ng/孔將TGFβ1、TGFβ2或TGFβ3塗布于96孔板上,並隨後用阻斷緩衝液阻斷各孔。在經TGFβ塗布之96孔微量滴定板中將雜交瘤上清液與含有TGFβRII-AP之ELISA緩衝液一起培養1小時。在洗滌後,依照製造商說明書向各孔添加AP之磷酸對硝基苯酯(PNPP)受質以達成顯色。讀取450 nm下吸光率以定量TGFβRII與TGFβ1、TGFβ2及TGFβ3之結合。在微量滴定板讀數器(Molecular Devices公司,Sunnyvale,CA)上讀取光學密度(OD)值。
藉由有限稀釋培養對陽性雜交瘤實施3次亞選殖以建立單株雜交瘤細胞系。
表1展示mAb(TGF1及TGF3)之輕鏈及重鏈CDR之胺基酸序列。
mAb(TGF1及TGF3)之HCVR、LCVR、重鏈(HC)及輕鏈(LC)之胺基酸序列及編碼該等胺基酸序列之DNA序列的SEQ ID NO提供於下表2中。
編碼抗-TGFβRII mAb之重鏈及輕鏈可變區DNA序列可藉由PCR擴增以選殖至表現載體中。可在框架內使重鏈可變區融合至載體pEE6.1(Lonza Biologics plc,Slough,Berkshire,UK)中之人類免疫球蛋白重鏈γ1恒定區。全部人類輕鏈cDNA可直接選殖至載體pEE12.1(Lonza Biologics PLC,Slough,Berkshire,UK)中。所構建免疫球蛋白表現載體可藉由電空孔在NS0骨髓瘤細胞穩定轉染並
在麩胺醯胺合成酶選擇培養基中選擇。可藉由抗人類TGFβRII特異性結合ELISA針對抗體表現來篩選穩定純系。可將陽性純系置於旋轉燒瓶或生物反應器中之無血清培養基培養物中培養以產生抗體。可藉由蛋白A親和層析(Poros A,PerSeptive Biosystems公司,Foster City,CA)純化全長IgG1抗體並將其洗脫至中性緩衝鹽水溶液中。
可選殖編碼抗人類TGFβRII mAb(TGF1及TGF3)之重鏈及輕鏈可變區之cDNA並使其在框架內融合至GS(麩胺醯胺合成酶)表現載體中之人類免疫球蛋白重鏈γ1恒定區。經工程設計之免疫球蛋白表現載體可在CHO細胞中穩定轉染。可驗證穩定純系之與人類TGFβRII特異性結合抗體之表現。可在生物反應器中將陽性純系擴展至無血清培養基培養物中以產生抗體。可藉由蛋白A親和層析純化全長IgG1抗體並將其洗脫至中性緩衝鹽水溶液中。
如上文「抗-TGFβRII mAb之產生」中所述在ELISA中測定經純化抗-TGFβRII mAb之結合及阻斷活性。使用GraphPad Prism®軟體3.03(GraphPad Software公司,San Diego,CA)分析抗體之ED50及IC50。在基於ELISA之結合分析中,抗人類TGFβRII mAb(TGF1及TGF3)各單獨展現與人類TGFβRII之結合活性(ED50為0.031至0.059 nM),而正常人類IgG與該受體無結合活性。經純化mAb(TGF1及TGF3)各單獨有效阻斷人類TGFβ1、TGFβ2或TGFβ3與人類
TGFβRII結合(IC50為0.10至0.54 nM)。
抗人類TGFβRII抗體之結合及阻斷特性匯總於表3中。
抗小鼠TGFβRII mAb MT1與小鼠TGFβRII之結合活性之ED50為0.054 nM且mAb MT1對與小鼠TGFβ1、TGFβ2或TGFβ3結合之小鼠TGFβRII之阻斷活性的IC50值為0.12至0.54 nM。
mAb MT1之結合及阻斷特性匯總於表4中。
藉由表面電漿共振技術使用BIAcoreTM 2000(Pharmacia,Piscataway,NJ)於室溫(20-25℃)下測定抗-TGFβRII mAb之結合親和性。藉由以5至100 nM之濃度將分別與小鼠或人類Fc或重鏈恒定區連接的小鼠TGFβRII之重組細胞外結構域(SEQ ID NO:41)或由(SEQ ID NO:40)編碼之人類TGFβRII之細胞外結構域之融合蛋白固定至感測器表面上來實施mAb之動力學分析。抗人類TGFβRII mAb(TGF1及TGF3)展現高親和性,KD分別值為11、78、19 pM。抗鼠科動物TGFβRII mAb MT1展現高親和性,KD值為33 pM。
mAb之動力學匯總於表5中。
藉由ELISA量測抗體與人類TGFβRII或小鼠TGFβRII之反應性來測定抗人類TGFβRII mAb之特異性。抗人類TGFβRII mAb TGF1未展現與小鼠TGFβRII之交叉反應性,而mAb(TGF3)展現中度或最小的與小鼠TGFβRII之交叉反應性。然而,mAb(TGF3)不阻斷人類TGFβ1與小鼠TGFβRII結合。
可藉由用293-人類TGFβRII轉染細胞及人類癌細胞實施染色分析來測定抗人類TGFβRII mAb TGF1與經螢光素異硫氰酸酯(FITC)標記之山羊抗人類IgG抗體之結合活性。具體而言,自分匯合培養物收穫轉染細胞、癌細胞、脾細胞或淋巴結細胞之等分試樣,並將其在冰上於含有1% BSA之PBS(染色緩衝液)中與經螢光素標記或未經標記之一級抗體一起培養1小時以獲得期望分子。使用匹配IgG同種型作為陰性對照。用染色緩衝液將細胞洗滌2次並隨後在冰上於緩衝液中與經FITC、藻紅蛋白(PE)或Alxas Red標記之物種特異性二級抗體一起培養30 min以達成一級抗體(BioSource International,Camarillo,CA)。將細胞如上文洗滌並在流式細胞儀上分析。基於前向及側向光散射分析清除死細胞及碎片。以平均log螢光乘以陽性群之百分比計算平均螢光強度單元(MFIU)。計算平均螢光強度比率(MFIR)以定量細胞系中TGFβRII之相對表現量。MFIR係經TGFβRII特異性mAb染色細胞之平均螢光強度(MFI)除以經同種型對照抗體染色細胞之MFI。
抗人類TGFβRII mAb TGF1顯示與293-人類TGFβRII轉染細胞及MDA-MB-231人類乳癌細胞之結合反應性,其中MFIR分別為46及209,而正常人類IgG與細胞無反應性。結果顯示mAb TGF1與在細胞表面上所表現之天然人類TGFβRII具有特異性反應性。
由TGFβ誘導之Smad2之磷酸化(p-Smad2)係藉助TGFβRII之TGFβ信號傳導之典型下游信號傳導途徑,其調介各種細胞類型中之細胞生物反應,例如增殖、運動、存活及分化。可藉由使用4T1鼠科動物乳癌細胞及MDA-MB-231人類乳癌細胞根據以下程序來測定抗人類TGFβRII及抗人類小鼠TGFβRII mAb抑制p-Smad2活化之能力。簡言之,在含FCS培養基中使細胞生長至80%匯合。在用無血清培養基替換該培養基後,於10 ng/mL TGFβ存在下用抗體或同種型對照處理細胞1小時。在洗滌後,用溶胞緩衝液製備細胞裂解物並實施電泳並且電轉移至硝酸纖維素膜。磷酸化Smad2及Smad2可藉由西方墨點法使用抗-磷酸化-Smad2及Smad2之單株抗體(Millipore公司)及電致化學發光系統(ECL)來檢測,並藉由使用Fuji影像分析儀實施密度量測來成像及定量。
抗-TGFβRII mAb(TGF1及MT1)可以劑量依賴方式降低人類MDA-MB-231及小鼠4T1乳癌細胞中Smad2之由TGFβ誘導之磷酸化。在p-Smad2抑制分析中測定mAb(TGF1及MT1)之IC50為5±0.5 nM,而mAb(TGF3)展現低於25±0.5 nM之IC50。
抗-TGFβRII mAb對腫瘤細胞侵襲性之抑制作用可藉由活體外遷移及侵襲分析來測定。簡言之,以5×103/孔之密度將癌細胞裝入插入48孔板之經膠原I及IV塗布之下室中
之上室的無血清培養基中。在10 ng/mL TGFβ存在下於37℃下用mAb(TGF1或MT1)以3、10及30 μg/mL之劑量處理該等細胞24至48小時。25 μ在分析中使用25 μg/mL TGFβRII-Fc或同種型IgG作為陽性及陰性對照。在侵襲分析中除使用經Matrigel塗布之上室以外使用相同條件。在培養後,用10%緩衝中性甲醛固定上室對側中之遷移細胞,並用2 μg/mL Hoechst 33342、三氫氯酸、三水合物溶液(Invitrogen)染色並且使用Zeiss數位影像相機及軟體Image-Pro Plus 5.1以20×放大率計數。
當與經IgG處理之對照比較時,抗-TGFβRII mAb(TGF1及MT1)將BXPC-3人類胰腺癌胞之遷移及4T1鼠科動物乳癌細胞之侵襲分別顯著抑制100%(P<0.0001)及93%(P<0.0005)。
該等結果表明本發明抗-TGFβRII抗體對在表面上具有TGFβRII之癌細胞之侵襲性之抑制作用。
TGFβ藉助刺激腫瘤細胞中之VEGF-A分泌及調節內皮細胞功能在促進病理病況進展期間之血管發生中起重要作用。可在細胞培養中測定抗-TGFβRII mAb對腫瘤細胞中由TGFβ誘導之VEGF-A分泌之抑制作用。
簡言之,在5% CO2培養箱中之無血清培養基中在存在或不存在10 ng/mL TGFβ及mAb之連續稀釋液時於37℃下培養腫瘤細胞48小時。使用ELIKON套組(R&D Systems)依照製造商說明書測定條件化培養上清液中VEGF-A分泌之
變化。
10 μM/mL之抗人類TGFβRII mAb TGF1將MDA-MB-231人類乳腺腫瘤細胞中由TGFβ誘導之VEGF-A之產生抑制63%(P<0.01)。10 μM/mL之抗小鼠TGFβRII mAb MT1將4T1小鼠乳腺腫瘤細胞中由TGFβ誘導之VEGF-A之產生抑制30%(P<0.02)。
該等結果表明本發明抗-TGFβRII mAb藉由降低由TGFβ誘導之VEGF-A分泌來抑制血管發生。
已表明TGFβ能夠誘導天然T細胞形成具有反向控制免疫反應之免疫抑制能力之調節性T(Treg)細胞。可在活體外如以下評價抗-TGFβRII mAb對由TGFβ誘導之調節性細胞轉化之抑制作用。
簡言之,在5% CO2培養箱中之完全RPMI培養基中在存在或不存在10 ng/mL TGFβ及mAb MT1之連續稀釋液時於37℃下用1 μg/mL抗-CD3抗體及經純化抗原呈遞細胞(APC)刺激經純化天然CD4+細胞7天。隨後收穫細胞以供CD25+/Foxp3+ Treg細胞染色並在流式細胞儀上對染色細胞實施分析。
與經IgG處理之對照細胞相比,10 μM/mL之抗小鼠TGFβRII mAb MT1將由TGFβ誘導之活體外Treg細胞之量降低75%(P<0.005)。
可在皮下或靜脈內轉移腫瘤模型中測試抗-TGFβRII mAb之抗腫瘤功效。
可使用無胸腺裸小鼠(Charles River Laboratories,Wilmington,MA)、Balb/c小鼠或C57B6小鼠(Charles River Laboratories,Wilmington,MA)來接種小鼠或人類癌細胞。治療皮下模型中已建立之腫瘤時,可使腫瘤生長至約200 mm3大小,隨後將小鼠隨機分成12-15只動物/組之組。在肺轉移模型中,經由尾部靜脈經靜脈內向小鼠注射腫瘤細胞。動物可每週經腹膜內接受所投與10至40 mg/kg劑量之抗-TGFβRII mAb 3次。對照組中之小鼠可接受等體積鹽水或正常IgG溶液。動物之治療可持續整個實驗期間。可每週用測徑器量測腫瘤2次。可使用公式[π/6(w1×w2×w2)]來計算腫瘤體積,其中「w1」表示最大腫瘤直徑且「w2」表示最小腫瘤直徑。
可使用重複量測ANOVA(RM-ANOVA)分析腫瘤體積數據以測定在治療、時間及治療-時間相互作用中腫瘤大小之顯著差異。可使用雙尾Student's t測試來實施對治療與對照間之活體外腫瘤生長之比較。認為小於0.05之P值具有統計學顯著性。
在靜脈內注射腫瘤細胞後24小時或在建立原發性腫瘤後,每週用mAb TGF1以40 mg/kg之劑量處理具有腫瘤之小鼠3次。全身性投與mAb TGF1可抑制PANC-1胰腺癌異種移植物(T/C=69%,ANOVA p<0.03)、BXPC-3胰腺癌異種移植物(T/C=30%,ANOVA p<0.0001)及MDA-MB-231乳癌
異種移植物(T/C=63%,ANOVA p<0.01)之皮下原發性腫瘤生長。
在小鼠同系腫瘤模型中測試抗小鼠TGFβRII mAb MT1以測定對免疫活性小鼠中原發性及轉移性腫瘤之抗腫瘤活性。用小鼠4T1、CT26或B16 F10癌細胞經靜脈內(i.v.)或用EMT6小鼠腫瘤細胞或經皮下(s.c.)注射小鼠。在經靜脈內接種後24小時或在已建立原發性皮下腫瘤後,使小鼠每週接受40 mg/kg劑量之mAb MT1之投與3次。
全身性投與mAb MT1將4T1、CT26及B16 F10腫瘤之肺轉移分別顯著抑制84%(P<0.0001)、94%(P<0.0001)及63% P<0.001)。在EMT6皮下腫瘤模型中,抗小鼠TGFβRII mAb MT1將原發性腫瘤生長抑制28%(P<0.05)且將自發性肺轉移抑制84%(P<0.0001)。
已報導具有Gr-1/CD11b+表現型之髓樣細胞在促進腫瘤進展期間之轉移及血管發生免疫抑制中起重要作用。CD4/CD25/Foxp3+ Treg細胞能夠抑制天然殺傷細胞及細胞毒性T淋巴細胞(CTL)免疫效應細胞對腫瘤細胞之功能。在EMT6經皮下腫瘤模型中評價mAb MT1對免疫抑制細胞(即,CD4/CD25/Foxp3/TGFβRII+ Treg細胞及Gr-1+/CD11b+/TGFβRII+髓樣細胞)之抑制活性。可藉由在用mAb MT1處理小鼠後對Gr-1+/CD11b+群及CD4/CD25/Foxp3/TGFβRII+及Gr-1+/CD11b+/TGFβRII+群之變化實施FACS分析來測定抗-TGFβRII抗體對具有腫瘤小鼠中之Treg及Gr-1+/CD11b+髓樣細胞群之抑制作用。
在經處理具有EMT6腫瘤之小鼠中,抗小鼠TGFβRII mAb MT1分別將Gr-1+/CD11b+/TGFβRII+髓樣細胞及CD4/CD25/Foxp3/TGFβRII+Treg細胞之量顯著降低95%(P<0.0001)及71%(P<0.0005)。
該等結果顯示抗-TGFβRII抗體可藉由抑制及/或耗竭TGFβRII+ Treg及髓樣細胞來控制CD4/CD25/Foxp3/TGFβRII+及Gr-1+/CD11b+群。
TGFβ係肝星形細胞(HSC)之活化及肌纖維母細胞之分化以及導致纖維變性之細胞外基質累積之關鍵調節物。已將動物之肝纖維變性模型廣泛用作評價TGFβ信號傳導抑制劑抑制纖維變性之活性之實驗模型。膠原物沉積係肝纖維變性形成之已知指示物。可在經四氯化碳(CCl4)誘導之肝纖維變性模型中評價抗-TGFβRII抗體在保護及干擾纖維變性中之治療活性。
簡言之,可每週用混合有玉米油之1 mL/kg CCl4溶液經腹膜內注射C57BL6小鼠2次。可在用CCl4經腹膜內注射小鼠後14天每週以40 mg/kg之劑量向干擾處理組中之小鼠投與mAb MT1 3次。可以相同劑量向對照組中之小鼠投與對照大鼠IgG。在注射CCl4後第八週,自經處理小鼠採集肝組織及血漿試樣。可藉由使用血清ALT套組(Pointe Scientific公司,MI)來測定丙胺酸胺基轉移酶(ALT)之血漿濃度(肝功能異常之指示物)。可藉由應用膠原沉積物之Sirius Red染色實施免疫組織化學(IHC)分析來評價肝組
織。
在基本上如上文所述所實施之研究中,在給與CCl4之小鼠之肝中,抗小鼠TGFβRII mAb MT1將膠原沉積顯著降低95%(P<00001),而對照大鼠IgG無作用。抗小鼠TGFβRII mAb MT1保護肝免于功能異常達85%(P<0.001),如藉由給與CCl4之小鼠中之ALT的血漿濃度所量測,而用對照大鼠IgG處理之小鼠具有明顯更高之ALT之濃度。
該等結果表明抗-TGFβRII抗體MT1可有效保護小鼠免於由損傷誘導之纖維變性及肝功能異常。
已報導環磷醯胺(CTX)(能夠抑制造血及髓樣祖細胞之有效細胞毒性劑)對髓樣細胞具有抑制作用(參見,Honeychurch等人,Cancer Res.65:7493-7501(2005))。可單獨用mAb MT1、CTX或其組合處理具有EMT6-腫瘤之小鼠。舉例而言,可使用Balb/c小鼠或C57B6小鼠(Charles River Laboratories,Wilmington,MA)來接種癌細胞。舉例而言,可將具有已建立之腫瘤之小鼠隨機分成12只動物/組。可每週經腹膜內向動物投與40 mg/kg抗-TGFβRII mAb、80 mg/kg CXT或二者之組合3次。對照組中之小鼠可接受等體積鹽水或正常IgG溶液。可使用公式[π/6(w1×w2×w2)]來計算腫瘤體積,其中「w1」表示最大腫瘤直徑且「w2」表示最小腫瘤直徑。
在具有EMT6腫瘤之小鼠中,基本上如上文所述所實施的抗小鼠TGFβRII mAb MT1與CTX之組合治療將原發性腫
瘤生長降低80%(P<0.0001)且將自發性肺轉移降低99.99%(P<0.000001),相比之下,單一療法作用如下:在抑制原發性腫瘤生長中,mAb MT1為28%(P<0.05)或CTX為62%(P<0.0005)且在抑制轉移中,mAb MT1為84%(P<0.0001)或CTX為96%(P<0.00001)。
結果表明藉由抗-TGFβRII抗體組合髓樣細胞抑制化學療法來抑制TGFβRII-陽性髓樣細胞之亞群係干擾腫瘤生長及轉移之有效策略。
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Claims (10)
- 一種抗體或人類TGFβRII結合片段,其特異性結合至人類TGFβRII,其包含:具有序列GGSISNSYF(SEQ ID NO:1)之CDRH1;具有序列SFYYGEKTYYNPSLKS(SEQ ID NO:2)之CDRH2;具有序列GPTMIRGVIDS(SEQ ID NO:3)之CDRH3;具有序列RASQSVRSYLA(SEQ ID NO:10)之CDRL1;具有序列DASNRAT(SEQ ID NO:11)之CDRL2;及具有序列QQRSNWPPT(SEQ ID NO:12)之CDRL3。
- 如請求項1之抗體,其包含i)HCVR胺基酸序列:QLQVQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISNSYFSWGWIRQPPGKGLEWIGSFYYGEKTYYNPSLKSRATISIDTSKSQFSLKLSSVTAADTAVYYCPRGPTMIRGVIDSWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:25)及ii)LCVR胺基酸序列:EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVRSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPPTFGQGTKVEIK(SEQ ID NO:27)。
- 如請求項2之抗體,其包含SEQ ID NO:37之重鏈及SEQ ID NO:4之輕鏈。
- 如請求項3之抗體,其包含兩條SEQ ID NO:37之重鏈及 兩條SEQ ID NO:4之輕鏈。
- 如請求項1至4中任一項之抗體,其於室溫(20-25℃)以小於100 pM之KD特異性結合人類TGFβRII之細胞外結構域。
- 如請求項1至4中任一項之抗體,其中該抗體以如ELISA所測定小於1.0 nM之IC50阻斷人類TGFβ1、TGFβ2或TGFβ3與人類TGFβ RII結合。
- 如請求項1至4中任一項之抗體,其以小於30 nM之IC50抑制TGFβ所誘導之Smad2磷酸化。
- 一種抗體或其功能性片段,其中該抗體在競爭ELISA分析中與如請求項1至4中任一項之競爭性抗體競爭與TGFβRII之細胞外結構域結合,其中該競爭性抗體在室溫(20-25℃)下以小於100 pM之KD與TGFβRII結合。
- 一種醫藥組合物,其包含如請求項1至8中任一項之抗體或片段及醫藥上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑。
- 一種產品,其包含用於組合治療之如請求項1至8中任一項之抗體或片段及額外抗癌劑,其同時、分開或依序用於治療。
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