JP2023508202A - ＴＧＦ－βＲＩＩ結合タンパク質 - Google Patents

ＴＧＦ－βＲＩＩ結合タンパク質 Download PDF

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Abstract

本発明は、ヒトＴＧＦ－βＲＩＩの細胞外ドメインに特異的に結合する抗体またはその抗体断片に関する。本発明はさらに、本発明の抗体または抗体断片をコードするポリヌクレオチドを含むベクター、本発明の抗体または抗体断片を産生する単離された細胞、および本発明の抗体または抗体断片を含む薬学的組成物に関する。本発明の抗体または抗体断片を使用して、がんを治療することができる。

Description

本発明は、医学分野に関する。より具体的には、本発明は、形質転換成長因子－ベータ受容体ＩＩ（ＴＧＦ－βＲＩＩ）に結合するタンパク質、およびヒトの治療、特に、がんの治療におけるそれらの使用に関する。
形質転換成長因子β（ＴＧＦ－β）は、ＴＧＦ－βスーパーファミリーのシグナル伝達分子部分である。様々な細胞機能を調節する３つのＴＧＦ－βリガンド（ＴＧＦ－β１、２、および３）が存在する。ＴＧＦ－βシグナル伝達は、正常細胞では腫瘍抑制的な役割を有するが、悪性細胞では腫瘍促進的な役割を有することができる。これらは、増殖、移動、分化、アポトーシス、血管新生、および上皮間葉転移などのプロセスに関与する（Ｂｉｅｒｉｅ ａｎｄ Ｍｏｓｅｓ，２００６．Ｓｉｅｇｅｌ ａｎｄ Ｍａｓｓａｇｕｅ，２００３）。これらのシグナルはＴＧＦ－β受容体２型（ＴＧＦ－βＲＩＩ）への結合により媒介され、ＴＧＦ－βＲＩとの二量体化およびそのリン酸化をもたらす。その後、２つのＴＧＦ－βＲＩＩおよび２つのＴＧＦ－βＲＩから成るこのヘテロ四量体複合体は、ＳＭＡＤ２およびＳＭＡＤ３を動員してリン酸化し、次いで、ＳＭＡＤ４を動員してｃｏ－ＳＭＡＤ分子に結合してＳＭＡＤ／ｃｏ－ＳＭＡＤ複合体を形成し、それがＴＧＦ－β標的遺伝子の転写を調節する核に移動する（Ｈａｔａ ａｎｄ Ｃｈｅｎ，２０１６．Ｖａｎｄｅｒ Ａｒｋ，Ｃａｏ ｅｔ ａｌ．，２０１８）。
高レベルのＴＧＦ－β発現は、がんにおける予後不良と関連することが示されている。ＴＧＦ－βは、がん細胞の移行および転移を促進する上皮間葉転移を誘導する場合がある。遺伝子発現プロファイルは、ＴＧＦ－βシグナル伝達が結腸直腸がんの肝転移における有意な経路であることを示している（Ｊｕｎｇ，Ｓｔａｕｄａｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１７）。さらに、間質と上皮との相互作用ががん進行に関与することが報告されている。固形腫瘍に見られる豊富な間質細胞成分は、がん関連線維芽細胞（ＣＡＦ）であり、腫瘍の足場となり得る細胞外マトリックスの構築および再構築に加えて、免疫回避にも寄与し、腫瘍発生および成長も促進する（Ｑｕａｉｌ ａｎｄ Ｊｏｙｃｅ，２０１３）。腫瘍由来のＴＧＦ－β１は、腫瘍形成促進性間質環境を促進することができるＴＧＦβＲＩＩに結合することにより、線維芽細胞の「活性化された」ＣＡＦへのトランス分化を誘導する。
ＣＡＦおよび腫瘍の異常ＴＧＦ－βシグナル伝達特性を阻害するためにＴＧＦ－βシグナル伝達経路を標的とする既存の方法は、これまでに、最適以下の有効性および／または開発責務を有していた。１つの抗ＴＧＦ－βＲＩＩモノクローナル抗体は、ＷＯ２０１０／０５３８１４に開示されているＬＹ３０２２８５９であり、これはＴＧＦ－βＲＩＩの細胞外ドメインを遮断することが報告されている。しかしながら、第Ｉ相用量漸増試験は、サイトカイン放出症候群を引き起こし、進行性固形腫瘍を有する患者には安全ではないとみなされた。ＷＯ２０１２／０９３１２５に開示されている別の薬剤は、より短い半減期を有する抗ＴＧＦ－βＲＩＩ単一可変ドメインであり、この分子の正確な作用機序または結合ドメインは確立されていない。これまでに、ＴＧＦ－β腫瘍調節の複雑さおよび多面性が薬剤開発を困難にするため、臨床試験に成功した抗ＴＧＦ－βＲＩＩ抗体は存在していない（Ｈａｏ，Ｂａｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１９）。本明細書では、我々は、ＴＧＦ－βＲＩＩに結合することができる新たな重鎖可変領域、重鎖、Ｆａｂ、および全長ＩｇＧ単一特異性抗体を記載する。これらの抗体、またはこれらの重鎖もしくは重鎖可変領域を含む抗体は、ＴＧＦ－βＲＩＩ上の新規の位置を標的とし、受容体とそのリガンドとの間の相互作用を遮断し、これは既存の抗体と比べて改善された点である。
本発明の目的は、ヒト疾患の治療、具体的には、がんの治療用の新たな医薬品を提供することである。この目的は、本明細書に記載され、かつ特許請求される、ヒトＴＧＦ－βＲＩＩの細胞外ドメインに特異的に結合する抗体またはその抗体断片、および特定の結合ドメインの提供によって満たされる。
第１の態様では、本発明は、ヒトＴＧＦ－βＲＩＩの細胞外ドメインに特異的に結合する抗体またはその抗体断片であって、抗体または抗体断片が、ヒトＴＧＦ－βＲＩＩの細胞外ドメインのエピトープに結合し、そのヒトＴＧＦ－βＲＩＩのアイソフォームＡの２５位またはヒトＴＧＦ－βＲＩＩのアイソフォームＢの５０位のフェニルアラニン（Ｆ）が結合のための必須残基である、抗体またはその抗体断片に関する。
好ましくは、かかる抗体または抗体断片は、ＴＧＦ－βＲＩＩに結合し、ヒトＴＧＦ－βのヒトＴＧＦ－βＲＩＩへの結合を遮断または阻害し、それにより、細胞へのシグナル伝達を阻害し、ＴＧＦ－βＲＩＩのヘテロ二量体化を遮断または阻害する。
第２の態様では、本発明は、本明細書に記載の抗体または抗体断片の重鎖および軽鎖のいずれかまたは両方をコードするポリヌクレオチドを含むベクターに関する。
第３の態様では、本発明は、本明細書に記載の抗体または抗体断片を産生する細胞に関する。
第４の態様では、本発明は、本明細書に記載の抗体または抗体断片と、薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤とを含む薬学的組成物に関する。
第５の態様では、本発明は、がんを予防する、がんの症状進行もしくは再発を抑制する、および／またはがんを治療するための医薬品であって、本明細書に記載の抗体またはその抗体断片を活性成分として含む、医薬品に関する。
第６の態様では、本発明は、対象におけるがんを治療する方法であって、対象に、本明細書に記載の抗体もしくは抗体断片、または本明細書に記載の薬学的組成物の有効量を投与することを含む、方法に関する。
第７の態様では、本発明は、細胞のヒトＴＧＦ－βのヒトＴＧＦ－βＲＩＩへの結合を遮断する方法であって、細胞に、本明細書に記載の抗体または抗体断片を提供することと、抗体または抗体断片が細胞のヒトＴＧＦ－βＲＩＩに結合することを可能にし、それにより、細胞のヒトＴＧＦ－βのヒトＴＧＦ－βＲＩＩへの結合を遮断することと、を含む、方法に関する。
第８の態様では、本発明は、細胞のヒトＴＧＦ－βのヒトＴＧＦ－βＲＩＩへの結合によって誘導される細胞へのシグナル伝達を阻害する方法であって、細胞に、本明細書に記載の抗体または抗体断片を提供することと、抗体または抗体断片が細胞のヒトＴＧＦ－βＲＩＩに結合することを可能にし、それにより、細胞へのシグナル伝達を阻害することと、を含む、方法に関する。
第９の態様では、本発明は、転移を予防または抑制する方法であって、対象に、本明細書に記載の抗体もしくは抗体断片、または本明細書に記載の薬学的組成物の有効量を投与することを含む、方法に関する。
概して、本発明は、ヒトＴＧＦ－βＲＩＩの細胞外ドメインに特異的に結合するタンパク質、具体的には、抗体またはその抗体断片に関する。好ましくは、抗体は、単離されている。好ましくは、抗体は、モノクローナル抗体である。より好ましくは、抗体は、単離されたモノクローナル抗体である。
「単離されたモノクローナル抗体」とは、クローン細胞によって産生された抗体を指す。単離された抗体の例には、親和性精製された抗体、インビトロでハイブリドーマまたは他の細胞株で産生された抗体、およびトランスジェニック非ヒト動物に由来するヒト抗体が挙げられるが、これらに限定されない。
「抗体」という用語は、２つの重鎖（Ｈ）および２つの軽鎖（Ｌ）の４つのポリペプチド鎖を含む免疫グロブリン分子を指す。重鎖は各々、重鎖可変領域（ＶＨ）および重鎖定常領域（ＣＨ）を含む。重鎖可変領域は、３つの重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）および４つのフレームワーク領域（ＦＲ）を含み、好ましくは、ヒトであるか、またはヒト化されている。重鎖定常領域は、３つのドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３から成り、任意の生物、好ましくはヒトに由来し得る。重鎖定常領域のＣＨ１ドメインおよびＣＨ２ドメインは、可動性ヒンジ領域を介して接続されている。軽鎖は各々、軽鎖可変領域（ＶＬ）および軽鎖定常領域（ＣＬ）を含む。軽鎖可変領域は、カッパ（Ｋ）またはラムダ（λ）の２種類であり得、ＶＨと同様に、３つの軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）および４つのフレームワーク領域を含む。軽鎖可変領域は、好ましくは、ヒトであるか、またはヒト化されている。軽鎖定常領域は、１つのドメイン、ＣＬから成り、任意の生物、好ましくはヒトに由来し得る。これらの２つの重鎖は、２つのヒンジ領域間のジスルフィド結合によって互いに連結され、これらの重鎖は各々、ＣＨ１領域とＣＬ領域との間のジスルフィド結合によって軽鎖と対になる。従来の抗体では、２つの重鎖と２つの軽鎖は同一であり、抗体に２つの同一の抗原結合部位を提供する。
抗体結合は、特異性および親和性を含む異なる特質を有する。特異性は、どの抗原またはそのエピトープが抗体結合ドメインによって特異的に結合されるかを決定する。親和性は、特定の抗原またはエピトープへの結合の強度の尺度である。
「ヒト」抗体とは、全ての抗体ドメインがヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する抗体を指す。本発明で使用されるヒト抗体は、ヒト抗体、例えば、Ｈｕｍａｂマウス、ＫＭマウス、Ｘｅｎｏマウス、Ｔｃマウス、またはＭｅＭｏ（登録商標）マウス（ＷＯ２００９／１５７７７１）を産生するように形質転換されたマウスを使用する方法によって産生することができる。ヒト抗体は、免疫時にヒト抗体応答が得られるようにヒト免疫細胞が再構築されたＳＣＩＤマウスを使用して調製することもできる。
「ヒト化」抗体領域とは、例えば、マウスまたはニワトリなどのヒト以外の動物の生殖細胞系に由来する抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）配列をヒト抗体のヒトフレームワーク配列に移植することによって調製された抗体を指す。また、ヒト化抗体は、抗体産生ハイブリドーマから単離された抗体のＣＤＲ領域をコードする核酸を、周知の方法を使用してヒト由来抗体のフレームワーク領域をコードする核酸に連結することによって産生することができる。
抗体は、その重鎖および／または軽鎖可変領域を介して、具体的には、その特異的ＣＤＲを介して抗原に結合することができる。抗体の重鎖および／または軽鎖可変領域のＣＤＲは、抗原の「エピトープ」（「抗原決定基」とも称される）に結合する。エピトープは、タンパク質の三次フォールディング、それぞれ、いわゆる直鎖状エピトープおよび立体構造エピトープによって並置された非隣接アミノ酸または非隣接アミノ酸から形成することができる。隣接直鎖状アミノ酸から形成されたエピトープは、典型的には、変性溶媒への曝露時に保持されるが、三次フォールディングによって形成されたエピトープは、典型的には、変性溶媒での処理時に立体構造が失われる。エピトープは、典型的には、特有の空間的立体構造内に３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５個のアミノ酸を含み得る。
「抗原」は、典型的には、宿主生物において免疫応答を誘導し、それにより、抗原に対する特異性を有する抗体を産生することができる分子である。分子レベルでは、抗原は、抗体の抗原結合部位によって結合される能力を特徴とする。上述のように、抗体の抗原結合部位は、その重鎖および／または軽鎖可変領域によって、具体的には、そのＣＤＲによって形成される。抗原は、少なくとも１つのエピトープを含むが、多くの場合、それ以上のエピトープを含む。
また、抗原の混合物は、「抗原」とみなすことができ、当業者であれば、腫瘍細胞溶解物またはウイルス粒子が「抗原」と示され得ることもあることを理解するであろう一方で、かかる腫瘍細胞溶解物またはウイルス粒子調製物には多くの抗原決定基が存在する。
本発明では、抗原は、ヒトＴＧＦ－βＲＩＩである。ヒトＴＧＦ－βＲＩＩは、異なるアイソフォームが存在する膜貫通タンパク質である。ヒトＴＧＦ－βＲＩＩアイソフォームＡのアミノ酸配列は、配列番号１０１として提供され、ヒトＴＧＦ－βＲＩＩアイソフォームＡの細胞外ドメインのアミノ酸配列は、配列番号１０２として提供される。ヒトＴＧＦ－βＲＩＩアイソフォームＢは、細胞外ドメインへの挿入のため、より長いアイソフォームをコードするスプライスバリアントである。ヒトＴＧＦ－βＲＩＩアイソフォームＢのアミノ酸配列は、配列番号１０３として提供され、ヒトＴＧＦ－βＲＩＩのアイソフォームＢの細胞外ドメインのアミノ酸配列は、配列番号１０４に記載の通りである。
ＴＧＦ－βＲＩＩは、セリン／スレオニンタンパク質キナーゼファミリーおよびＴＧＦＢ受容体サブファミリーのメンバーである。これは、ＴＧＦＢＲ２、ＡＡＴ３、ＦＡＡ３、ＬＤＳ１Ｂ、ＬＤＳ２、ＬＤＳ２Ｂ、ＭＦＳ２、ＲＩＩＣ、ＴＡＡＤ２、ＴＧＦＲ－２、ＴＧＦβ－ＲＩＩ、形質転換成長因子ベータ受容体２、およびＴＢＲ－ｉｉ、ＴＢＲＩＩを含む様々な同義語で知られている。ＴＧＦ－βＲＩＩは、別の受容体タンパク質とヘテロ二量体複合体を形成し、ＴＧＦ－βに結合する。この受容体／リガンド複合体は、タンパク質をリン酸化し、その後、それが核に入り、細胞増殖に関連する遺伝子のサブセットの転写を調節する。
抗体は、特定の結合親和性で抗原に結合する。「結合親和性」は、式：ｋｏｆｆ／ｋｏｎによって計算される解離定数（ＫＤ）によって決定され、抗体－抗原相互作用の強度を指す。所望の生物学的活性に応じて、抗体は、その高いｋｏｎ速度および／または低いｋｏｆｆ速度に基づいて選択することができる。
「抗体断片」には、重鎖および／または軽鎖の機能的断片が含まれるが、これらに限定されない。かかる機能的断片は、抗体重鎖または軽鎖由来のＣＤＲに由来するか、またはそれに基づいて合成される少なくとも１つのＣＤＲを含み、抗原を特異的に認識することができる。抗体断片は、例えば、Ｆａｂ，Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、ミニボディ、またはｓｄＡｂとすることができるが、これらに限定されない。「抗体断片」とは、抗体の機能的部分を含むタンパク質性部分をさらに指す。この場合では、本明細書に記載の少なくとも重鎖可変領域、またはＨＣＤＲのうちの１つ以上である。抗体断片は、一本鎖Ｆｖ、一本鎖またはタンデムダイアボディ（ＴａｎｄＡｂ（登録商標））、ＶＨＨ、Ａｎｔｉｃａｌｉｎｓ（登録商標）、Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓ（登録商標）、ＢｉＴＥ（登録商標）、Ｆａｂ、アンキリンリピートタンパク質またはＤＡＲＰＩＮ（登録商標）、Ａｖｉｍｅｒ（登録商標）、ＤＡＲＴ、ＴＣＲ様抗体、Ａｄｎｅｃｔｉｎ（登録商標）、Ａｆｆｉｌｉｎ（登録商標）、Ｔｒａｎｓ－Ｂｏｄｙ（登録商標）、Ａｆｆｉｂｏｄｙ（登録商標）、ＴｒｉｍｅｒＸ（登録商標）、ＭｉｃｒｏＰｒｏｔｅｉｎ、Ｆｙｎｏｍｅｒ（登録商標）、Ｃｅｎｔｙｒｉｎ（登録商標）、またはＫＡＬＢＩＴＯＲ（登録商標）を含むが、これらに限定されない任意の結合剤とすることができる。
「Ｆａｂ」とは、典型的には、重鎖可変領域、軽鎖可変領域、ＣＨ１、およびＣＬ領域を含む結合ドメインを意味する。
「Ｆ（ａｂ’）２」とは、典型的には、ヒンジ領域によって互いに連結された２つのＦａｂドメインを含む結合ドメインを意味する。
「一本鎖可変断片」（ｓｃＦｖ）とは、典型的には、リンカー、例えば、約１０～約２５アミノ酸長のペプチドリンカーを介して接続されたＶＨドメインおよびＶＬドメインを含む結合ドメインを意味する。
「ミニボディ」とは、典型的には、２つのｓｃＦｖおよびＣＨ３ドメインを含む結合ドメインを意味する。
「単一ドメイン抗体」（ｓｄＡｂ）とは、典型的には、通常、Ｆｃ領域に融合されるか、またはその一部に別様に連結された抗体のＶＨドメインまたはＶＬドメインのみを含む結合ドメインを意味する。全抗体と同様に、この抗体は、特異的抗原に選択的に結合することができる。単一ドメイン抗体断片は、ラクダ科動物に見られる重鎖抗体から操作され得、これらはＶＨＨ断片（Ｎａｎｏｂｏｄｙ（登録商標））と呼ばれることもある。いくつかの魚も重鎖のみの抗体（ＩｇＮＡＲ、「免疫グロブリン新規抗原受容体」）を有し、これらからＶＮＡＲ断片と呼ばれる単一ドメイン抗体断片を得ることができる。代替アプローチは、ヒトまたはマウス由来の一般的な免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）由来の二量体可変ドメインを単量体に分割することである。単一ドメイン抗体の研究のほとんどが、現在、重鎖可変ドメインに基づいているが、軽鎖に由来するナノボディが標的エピトープに結合することができることも示されている。したがって、ナノボディも本発明に包含される。
「抗体断片」は、少なくとも１つのＣＤＲも指し、少なくとも１つのＣＤＲは、抗原に対する結合特異性を呈するタンパク質構築物の一部である。好ましくは、少なくとも１つのＣＤＲは、ＨＣＤＲ３である。一実施形態では、タンパク質構築物は、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３を含む。別の実施形態では、タンパク質構築物は、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含む。タンパク質構築物は、ＣＨ２および／またはＣＨ３を含むＦｃ領域の一部をさらに含み得る。タンパク質構築物は、ＣＨ１領域も含み得る。ＣＨ１、ＣＨ２、および／またはＣＨ３領域は、抗原結合および／またはエフェクター機能に関して任意の所望の特性を得るように操作され得る。
本発明は、本発明の抗体または抗体断片のバリアントも包含する。本発明の抗体または抗体断片の「バリアント」は、本明細書に記載の抗体または抗体断片の少なくとも機能的部分、またはその誘導体または類似体を含む。かかる機能的部分、誘導体、または類似体は、本明細書に開示されるＣＤＲを含む重鎖可変領域および／または軽鎖可変領域を含む、本明細書に記載の抗体または抗体断片の少なくとも結合ドメインを含む。バリアントは、ＣＤＲのうちの１つ以上内に１～５個のアミノ酸置換を含み得る。例えば、アミノ酸残基は、保存的アミノ酸残基で置換され得る。バリアントは、１つ以上のフレームワーク領域内に１つ以上のアミノ酸置換も含み得る。好ましくは、バリアントは、本発明の抗体または抗体断片のＶＨアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するＶＨ領域を含む。好ましくは、バリアントは、本発明の抗体または抗体断片のＶＬアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するＶＬ領域を含む。
本明細書における核酸配列またはアミノ酸配列に関する「同一性パーセント（％）」は、最適比較目的のために配列を整列させた後の、選択された配列内の残基と同一の候補配列内の残基のパーセンテージとして定義される。これらの２つの配列間のアライメントを最適化するために、比較されるこれらの２つの配列のうちのいずれかにギャップが導入され得る。かかるアライメントは、比較される配列の全長にわたって行うことができる。あるいは、アライメントは、より短い長さ、例えば、約２０、約５０、約１００、またはそれ以上の核酸／ベースまたはアミノ酸にわたって行われ得る。配列同一性は、報告された整列した領域にわたるこれらの２つの配列間の完全な一致のパーセンテージである。
配列の比較および２つの配列間の配列同一性のパーセンテージの決定は、数学アルゴリズムを使用して達成することができる。当業者であれば、２つの配列を整列させて２つの配列間の同一性を決定するためのいくつかの異なるコンピュータプログラムが利用可能であるという事実を認識するであろう（Ｋｒｕｓｋａｌ，Ｊ．Ｂ．（１９８３）Ａｎ ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ Ｉｎ Ｄ．Ｓａｎｋｏｆｆ ａｎｄ Ｊ．Ｂ．Ｋｒｕｓｋａｌ，（ｅｄ．），Ｔｉｍｅ ｗａｒｐｓ，ｓｔｒｉｎｇ ｅｄｉｔｓ ａｎｄ ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ：ｔｈｅ ｔｈｅｏｒｙ ａｎｄ ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ，ｐｐ．１－４４ Ａｄｄｉｓｏｎ Ｗｅｓｌｅｙ）。
具体的には、２つの核酸配列間の本明細書に記載の本発明による配列同一性パーセントは、修正ＣｌｕｓｔａｌＷアルゴリズム（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｊ．Ｄ．，Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｄ．Ｇ．，ａｎｄ Ｇｉｂｓｏｎ Ｔ．Ｊ．（１９９４）Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．２２：４６７３－４６８０）、ｓｗｇａｐｄｎａｍｔスコア行列、ギャップ開口ペナルティ１５、およびギャップ伸長ペナルティ６．６６を用いる、初期設定を使用したＶｅｃｔｏｒ ＮＴＩ Ｐｒｏｇｒａｍ Ａｄｖａｎｃｅ １１．５．２ソフトウェアのＡｌｉｇｎＸアプリケーションを使用して決定され得る。アミノ酸配列は、修正ＣｌｕｓｔａｌＷアルゴリズム（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｊ．Ｄ．，Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｄ．Ｇ．，ａｎｄ Ｇｉｂｓｏｎ Ｔ．Ｊ．，１９９４）、ｂｌｏｓｕｍ６２ｍｔ２スコア行列、ギャップ開口ペナルティ１０、およびギャップ伸長ペナルティ０．１を用いる、初期設定を使用したＶｅｃｔｏｒ ＮＴＩ Ｐｒｏｇｒａｍ Ａｄｖａｎｃｅ １１．５．２ソフトウェアのＡｌｉｇｎＸアプリケーションを用いて整列させることができる。
バリアントは、本発明の抗体または抗体断片の結合特異性、例えば、抗原特異性を維持する。しかしながら、バリアントの結合親和性は、本発明の元の抗体または抗体断片の結合親和性とは異なる場合がある。バリアントは、例えば、本明細書に記載の抗体または抗体断片よりも低いまたは高いＫｏｎ速度および／またはＫｏｆｆ速度を有し得る。
本発明の抗体または抗体断片の機能的誘導体は、抗体模倣物、ポリペプチド、アプタマー、またはそれらの組み合わせとすることができる。これらのタンパク質またはアプタマーは、典型的には、１つの標的に結合する。これらの抗体、抗体模倣物、ポリペプチド、およびアプタマーの任意の組み合わせを当該技術分野で既知の方法によって一緒に連結することができることを理解されたい。例えば、いくつかの実施形態では、本発明の抗体または抗体断片は、コンジュゲートまたは融合タンパク質の一部である。
抗体模倣物は、抗体と同様に、抗原に特異的に結合することができるが、抗体と構造的に関連しないポリペプチドである。抗体模倣物は、通常、約３～２０ｋＤａのモル質量を有する人工ペプチドまたはタンパク質である。抗体模倣物の非限定的な例は、アフィボディ分子（典型的には、プロテインＡのＺドメインに基づく）、アフィン（典型的には、ガンマ－Ｂ結晶またはユビキチンに基づく）、アフィマー（典型的には、シスタチンに基づく）、アフィチン（典型的には、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ由来のＳａｃ７ｄに基づく）、アルファボディ（典型的には、トリプルヘリックスコイルドコイルに基づく）、アンチカリン（典型的には、リポカリンに基づく）、アビマー（典型的には、様々な膜受容体のＡドメインに基づく）、ＤＡＲＰｉｎ（典型的には、アンキリンリピートモチーフに基づく）、フィノマー（典型的には、Ｆｙｎ ７のＳＨ３ドメインに基づく）、クニッツドメインペプチド（典型的には、様々なプロテアーゼ阻害剤のクニッツドメインに基づく）、およびモノボディ（典型的には、フィブロネクチンのＩＩＩ型ドメインに基づく）である。
モノボディは、フィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン（ＦＮ３）を分子骨格として使用して構築された合成結合タンパク質である。モノボディは、標的結合タンパク質を作製するための抗体の代替物である。モノボディおよび他の抗体模倣物は、典型的には、骨格の一部分が分子ディスプレイを使用して、かつ指向進化技術、例えば、ファージディスプレイ、ｍＲＮＡディスプレイ、および酵母表面ディスプレイを使用して多様化されるコンビナトリアルライブラリから生成される。
アプタマーは、特定の標的分子に結合するオリゴヌクレオチドまたはペプチド分子である。アプタマーは、通常、大きいランダム配列プールからそれらを選択することによって作製されるが、天然アプタマーはリボスイッチにも存在する。アプタマーは、巨大分子として基礎研究目的および臨床目的の両方に使用することができる。
本発明の抗体は、好ましくはＩｇＧ抗体、好ましくはＩｇＧ１またはＩｇＧ４抗体である。最も好ましくは、抗体は、ＩｇＧ１抗体である。かかる全長ＩｇＧ抗体は、その好ましい半減期のため、かつ免疫原性の理由により完全に自己の（ヒト）分子の近くに留まることを望むため、好ましい。ＩｇＧ１は、ヒトにおけるその長い循環半減期に基づいて好まれている。
本発明による「全長ＩｇＧ」または「全長抗体」という用語は、本質的に完全なＩｇＧを含むと定義されるが、必ずしもインタクトなＩｇＧの全ての機能を有するわけではない。誤解を避けるために、全長ＩｇＧは、２つの重鎖および２つの軽鎖を含む。これらの鎖は各々、定常（Ｃ）領域および可変（Ｖ）領域を含み、これらは、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、ＶＨ、およびＣＬ、ＶＬと指定されたドメインに分類することができる。ＩｇＧ抗体は、Ｆａｂ部分に含まれる可変領域ドメインを介して抗原に結合し、結合後、定常ドメインを介して、主にＦｃ部分を介して免疫系の分子および細胞と相互作用することができる。本発明による全長抗体は、所望の特徴を提供する変異が存在し得るＩｇＧ分子を包含する。
全長ＩｇＧは、抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）または細胞依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）を含むエフェクター機能を調節し（かかる機能の増加および緩和の両方）、異なる重鎖をコードする核酸を含む宿主細胞から単一特異性または多重特異性抗体を生成するためにホモ二量体化またはヘテロ二量体化を増加させ、かつかかる宿主細胞によって産生された抗体または抗体断片の分離を促進する変異を定常領域に含み得る。
例えば、ＥＵ番号付けシステムによる２３５位のロイシンがグリシンで置換され得、および／またはＥＵ番号付けシステムによる２３６位のグリシンがアルギニンで置換され得る。かかる修飾は、Ｆｃ受容体および／またはエフェクター機能への結合が排除または低減されることを確実にする。ＣＨ２およびＦｃ領域の他の変異も本発明に包含される。
全長ＩｇＧは、いずれの領域の実質的な部分の欠失を有してはならない。しかしながら、結果として得られたＩｇＧ分子の結合特性を本質的に変化させることなく、１つまたは複数のアミノ酸残基が欠失したＩｇＧ分子は、「全長ＩｇＧ」という用語に包含される。例えば、かかるＩｇＧ分子は、好ましくは非ＣＤＲ領域内で、１～１０個のアミノ酸残基の欠失を有することができ、欠失したアミノ酸は、ＩｇＧの結合特異性に必須ではない。
例えば、ＥＵ番号付けシステムによる４４７位のリジンが欠失し得る。かかる欠失により、抗体の不均一性が減少する。さらに、ＩｇＧ４抗体分子内のスワッピングを抑制するために、ＥＵ番号付けシステムによる２２８位のヒンジ領域に位置するセリンがプロリンで置換され得る。
本発明の抗体または抗体断片における使用に好適な軽鎖には、同族軽鎖と称される、抗原での免疫に応答して産生される軽鎖、またはそれに基づいて合成的に産生される軽鎖が含まれる。好適な軽鎖には、共通軽鎖（ｃＬＣ）、例えば、既存の抗体ライブラリ（湿潤ライブラリまたはインシリコ）における最も共通して用いられている軽鎖についてスクリーニングすることによって特定することができるものが含まれ、これらの軽鎖は、重鎖のエピトープ結合ドメインの親和性および／または選択性を実質的に妨害しないが、重鎖のアレイとの対合にも好適である。共通軽鎖は、好ましくは、再配列されているが、体細胞超変異を受けていないまたは最小限にしか受けていないＶ遺伝子セグメントおよびＪ遺伝子セグメントの生殖細胞系列配列によってコードされる。例えば、好適な軽鎖には、トランスジェニック非ヒト動物由来のもの、例えば、共通軽鎖をそのゲノムに組み込み、かつ重鎖で多様性を有し、当該抗原への曝露時にその抗原に特異的に結合することができる共通軽鎖抗体の大パネルを精製するために使用することができるＭｅＭｏ（登録商標）が含まれる。
したがって、「共通軽鎖」という用語は、２つ以上の異なる重鎖と会合することができ、かつ抗原への結合能力を呈する軽鎖を指す（例えば、ＷＯ２００９／１５７７７１、ＷＯ２０１９／１９０３２７、およびＷＯ２０１４／０５１４３３を参照されたい）。かかる共通軽鎖に好ましい軽鎖Ｖ遺伝子は、ＩＧＫＶ１－３９である。好ましい軽鎖Ｊ遺伝子は、ｊｋ１およびｊｋ５である。合わせられた配列は、ＩＧＫＶ１－３９／ｊｋ１およびＩＧＫＶ１－３９／ｊｋ５と示され、代替名は、ＩｇＶκ１－３９＊０１／ＩＧＪκ１＊０１またはＩｇＶκ１－３９＊０１／ＩＧＪκ５＊０１（ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇのＩＭＧＴデータベースによる命名）である。共通軽鎖の好ましい例には、ヒトκ軽鎖ＩｇＶκ１－３９＊０１／ＩＧＪκ１＊０１（ＩＭＧＴデータベースの命名）生殖系列遺伝子（以下、「ＩＧＶＫ１－３９／ＪＫ１共通軽鎖」と略される）によってコードされる軽鎖、およびＩｇＶκ１－３９＊０１／ＩＧＪκ５が挙げられる。上述の様々なＭｅＭｏ（登録商標）トランスジェニック動物は、ＩＧＶＫ１－３９／ＪＫ１共通軽鎖を含む。
本発明による共通軽鎖は、同一であり得るか、またはいくつかのアミノ酸配列差を有し得るが、本発明の抗体または抗体断片の結合特異性が影響されない軽鎖を指す。当業者であれば、「共通」が、アミノ酸配列が同一ではない軽鎖の機能的等価物も指すことを認識するであろう。機能的結合領域の形成に実質的に影響を及ぼさない親共通軽鎖と比較して変化が存在する当該軽鎖のバリアントが存在する。それ故に、かかるバリアントは、異なる重鎖に結合し、機能的抗原結合ドメインを形成することもできる。例えば、本明細書で使用される共通軽鎖の定義の範囲内で、例えば、保存的アミノ酸変化、同族鎖と対になったときに結合特異性に寄与しないか、または部分的にしか寄与しない領域におけるアミノ酸の変化などを導入して試験することにより、同一ではないが、依然として機能的に等価である可変の軽鎖を調製するか、または見つけることが可能である。それ故に、かかるバリアントは、異なる同族鎖に結合し、機能的抗原結合ドメインを形成することもできる。したがって、本明細書で使用される「共通軽鎖」という用語は、同一であり得るか、またはいくつかのアミノ酸配列差を有し得るが、重鎖と対になった後に結果として得られた抗体の結合特異性を保持する軽鎖を指す。ある特定の共通軽鎖とかかる機能的に等価なバリアントとの組み合わせは、「共通軽鎖」という用語に包含される。共通軽鎖の使用の詳細な説明については、ＷＯ２００４／００９６１８、ＷＯ２０１９／１９０３２７、およびＷＯ２００９／１５７７７１を参照する。好ましくは、生殖系列様軽鎖、より好ましくは生殖系列軽鎖、好ましくは再配列された生殖系列ヒトカッパ軽鎖、最も好ましくは再配列された生殖系列ヒトカッパ軽鎖ＩｇＶκ１－３９／ＪκまたはＩＧＶκ３－２０／Ｊκのいずれかである共通軽鎖が、本発明に使用される。
抗体または抗体断片は、例えば、ハイブリドーマ法を使用してハイブリドーマから産生することができる。あるいは、抗体または抗体断片は、重鎖および／もしくは軽鎖、またはそれらの断片を同時発現する哺乳類細胞からの分泌によって産生することができる。好ましくは、抗体または抗体断片は、非ヒト動物を免疫することによって産生される。これらおよび他の方法が当該技術分野で既知であり、本発明の抗体または抗体断片の産生に好適に使用することができる。
抗体は、様々な動物種から産生することができる。ＩＧＶＫ１－３９／ＪＫ１共通軽鎖を含む上述のＭｅＭｏ（登録商標）トランスジェニック動物を好適に使用することができる。一般に、トランスジェニックマウスは、ヒト標的ＤＮＡおよび／またはタンパク質で免疫され、その後、免疫ブーストが行われ、それにより、抗原特異的抗体の産生を含む免疫応答が引き起こされる。免疫マウス由来の血清力価は、ＥＬＩＳＡおよびＦＡＣＳ分析によって決定することができる。その後、免疫マウスの脾臓および排出リンパ系物質が収集され、単細胞懸濁液が生成され得る。かかる抗体の重鎖および／または可変領域をコードするＲＮＡを単離し、ｃＤＮＡ合成することができる。その後、ＶＨおよび／またはＶＬファミリー特異的ＰＣＲを行い、ファージディスプレイライブラリを生成することができる。その後、例えば、Ｋｉｎｇｆｉｓｈｅｒ選択ロボットを使用して、ヒト標的タンパク質結合Ｆａｂを選択することができる。標的タンパク質に結合するＦａｂの重鎖および／または軽鎖可変領域をコードする核酸を、宿主細胞における抗体の産生のために使用することができる。
トランスジェニック生物の免疫により抗体が生成されるが、かかる抗体がヒトおよびトランスジェニック動物に対して交差反応性ではなく、かかる抗体のアッセイおよび試験の効率を低下させる事例が存在する。したがって、可変領域および／または相補的決定領域（ＣＤＲ）を含む、キメラまたはヒト化結合ドメインまたは抗体を含む結合ドメインまたは抗体、ならびにヒトとは進化的に遠い種の核酸に基づくか、それに由来するか、またはそれから得られる当該可変領域および／またはＣＤＲをコードする核酸を得ることが有益であり得る。かかる可変領域の１つの潜在源は、鳥、例えば、ニワトリ、アヒル、またはダチョウなどの家畜鳥であり得る。鳥、例えば、ニワトリ、アヒル、またはダチョウの免疫により生成される抗体レパートリーは、マウスまたはヒトに進化的に近い他の種（例えば、齧歯類およびカニクイザル）の免疫により生成される抗体と比較して特有のエピトープを特定し得る。
一次ＤＮＡまたはタンパク質免疫が行われ、その後、追加のブースター免疫が行われ得る。ＩｇＹ抗体は、収集された卵の卵黄または免疫鳥由来の血清から単離することができる。脾臓および／または骨髄は、標的タンパク質に対する有意な体液性応答を示す鳥から除去される。その後、ＲＮＡを単離することができ、ｃＤＮＡが合成される。次いで、生成されたｃＤＮＡ試料が、２つのプライマーを使用してＶＨ遺伝子および／またはＶＬ遺伝子を増幅および消化するための鋳型として使用される。その後、ＰＣＲ産物が、本質的にｄｅ Ｈａａｒｄ ｅｔ ａｌ．（Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．（１９９９），Ｖｏｌ．２７４（２６），ｐｐ．１８２１８－１８２３０）に記載されるようにファージ上でのＦａｂ断片の表示のためにファージミドベクター内でクローニングされる。ＶＨ領域および／またはＶＬ領域をコードする核酸がベクターにライゲーションされ、結果として得られたライゲーションベクターが細胞に形質転換されてライブラリが得られる。その後、ＫｉｎｇＦｉｓｈｅｒ Ｆｌｅｘを使用したパニング選択が行われ、標的タンパク質に結合するファージを選択することができる。ヒトまたはマウス標的タンパク質を発現する細胞でのＦＡＣＳによってスクリーニングを行うことができる。ヒトおよび／またはマウス標的タンパク質に特異的に結合する全てのクローンのＶＨ遺伝子および／またはＶＬ遺伝子が配列決定される。標的タンパク質に結合する結合ドメインの重鎖および／または軽鎖可変領域をコードする核酸を、宿主細胞における抗体の産生のために使用することができる。
抗体断片は、当該技術分野で既知の方法によって産生することができる。
ｓｃＦｖ抗体は、ハイブリドーマまたは哺乳動物細胞からｍＲＮＡを単離し、その後、これをＰＣＲ増幅のためにｃＤＮＡに逆転写することによって産生することができる。これにより、様々な範囲のＶＨおよびＶＬ抗体遺伝子を含む大規模なライブラリが産生される（Ｍａｒｋｓ ａｎｄ Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９１），Ｖｏｌ．２２２，ｐｐ．５８１－５９７）。ＳｃＦｖを構築している間、ドメインは、ＶＨ－リンカー－ＶＬまたはＶＬ－リンカー－ＶＨとして順序付けられ得る（Ｈｕ，Ｏ’Ｄｗｙｅｒ ａｎｄ Ｗａｌｌ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２００５），Ｖｏｌ．１２０，ｐｐ．３８－４５）。リンカーの例は、古典的（Ｇ４Ｓ）３リンカーである（Ｈｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ（１９８８），Ｖｏｌ．８５，ｐｐ．５８７９－５８８３）。ミニボディの場合、ヒンジ－ＣＨ３ドメインをコードするＤＮＡ断片は、例えば、ヒトＩｇＧ１の配列に基づき得る（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，ＰＬＯＳ Ｏｎｅ（２０１４），Ｖｏｌ．９（１２），ｅ１１３４４２）。ｓｃＦｖおよびヒンジ－ＣＨ３領域は、ＸｈｏＩおよびＳＡＬＩによって生成された凝集末端をライゲーションすること、またはＰＣＲを使用してｓｃＦｖ産物のＸｈｏＩ制限部位をヒンジと一緒にＣＨ３のＮＨ２末端にもたらすことのいずれかによって組み立てることができる（Ｈｕ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（１９９６），Ｖｏｌ．５６，ｐｐ．３０５５－３０６１）。ＰＣＲ後、抗体のＶドメインは、プラスミドまたはファージミドのインビトロ組換えにより組換えることができる（Ｌｉｌｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ（１９９４），Ｖｏｌ．１７１，ｐｐ．２１１－２２６．Ｈｏｇｒｅｆｅ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ（１９９３），Ｖｏｌ．１２８，ｐｐ．１１９－１２６）。このファージディスプレイ技術は、抗体断片のファージマイナーコートタンパク質ｐＩＩＩまたはそのＣ末端ドメインへの融合に依存する（Ｓｍｉｔｈ，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８５），Ｖｏｌ．２２８，ｐｐ．１３１５－１３１７．Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２００５），Ｖｏｌ．２３，ｐｐ．１１０５－１１１６）。ｓｃＦｖ断片をディスプレイする以外に、ファージディスプレイは、現在、Ｆａｂ断片をディスプレイするためにも広く使用されている（Ｗｉｅｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．，Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ（２００６），Ｖｏｌ．１１０，ｐｐ．１２９－１４０）。
Ｆａｂ断片は、パパインまたはペプシンを使用した酵素消化によりモノクローナル抗体から生成することができる。抗体のパパイン消化により、３つの別個の断片：単一の抗原結合部位を各々有する、Ｆａｂ断片または領域と呼ばれる２つの抗原結合断片、およびＣＨ１ドメインの下で切断することによってもたらされる１つのＦｃ領域が産生される（Ｐｏｒｔｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍ（１９５９），Ｖｏｌ．７３，ｐｐ．１１９－１２６）。抗体のペプシン消化により、２つの断片：ヒンジ領域のジスルフィド架橋を介して接続された２つの抗原結合領域を含むＦ（ａｂ’）２断片、およびＦｃ断片が産生される（Ｖａｌｅｄｋａｒｉｍｉ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（２０１８），Ｖｏｌ．２６，ｐｐ．１７１－１７６）。これらのＦａｂ断片およびＦ（ａｂ’）２断片は、以下の技法：イオン交換、プロテインＡまたはＧ親和性、抗原親和性、またはゲル濾過クロマトグラフィーの組み合わせにより精製され得る（Ｍａｇｅ ａｎｄ Ｌａｍｏｙｉ．Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ Ｉｎｃ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８７，ｐｐ．７９－９７）。Ｆ（ａｂ’）ｎまたは（修飾Ｆ（ａｂ’）ｎ）は、本明細書に記載の本発明に関連して産生され得、任意の好適な酵素切断および／または消化技法を使用して得ることができる。ある特定の実施形態では、抗体断片は、ヒンジの下の特定の部位でヒトＩｇＧ１を切断してインタクトなＦ（ａｂ’）ｎ抗体断片を残すＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓのＩｇＧ分解酵素であるＩｄｅＳプロテアーゼでの切断によって得ることができ、ここで、ｎがＩｇＧ上に存在する抗体ドメインの数であり、Ｆ（ａｂ’）ｎの一方の側の重鎖がそれぞれのＣ末端で他方の側の重鎖と対になり、この対合は、２つ以上のジスルフィド架橋を含む。ｎが２以上である二重特異性および多重特異性抗体を生成するための方法が以前に説明されている。参照により本明細書に組み込まれる、ＰＣＴ／ＮＬ２０１９／０５０１９９、ＰＣＴ／ＮＬ２０１３／０５０２９４、ＰＣＴ／ＮＬ２０１３／０５０２９３を参照されたい。
あるいは、Ｆｃ領域を欠く抗体断片は、ヒンジ（ＫＳＣＤＫ／ＴＨＴＣＰＰＣ）の上の特定の部位でヒトＩｇＧ１を消化し、インタクトなＦａｂ断片およびＦｃ断片を生成する、Ｐｏｒｐｈｙｏｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ由来のシステインプロテアーゼの使用によって得ることができる。抗体断片は、本明細書に記載のリンカーを介して追加の可変ドメインに接続されるか、または本明細書に記載のリンカーを介して追加の可変ドメインに接続される軽鎖と対になる可変ドメインおよび定常ドメインを含む重鎖（例えば、ＣＨ１、ＣＨ２、および／またはＣＨ３）の発現によるこの技法によって形成することができ、タンパク質分解酵素、例えば、Ｐｏｒｐｈｙｏｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ由来のものは、当該重鎖の定常ドメインを切断して、インタクトな切断抗体結合断片を残す。
ｓｄＡｂの生成は、ファージディスプレイによって、かつラクダ科動物ｓｄＡｂ由来の可溶化残基のヒトＶＨへの組み込みに基づくナイーブまたは合成ＶＨまたはＶＬ ｄＡｂのレパートリーを使用することによって達成されている（Ｔａｎｈａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ（２００１），Ｖｏｌ．２７６，ｐｐ．２４７７４－２４７８０．Ｄａｖｉｅｓ ａｎｄ Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９５），Ｖｏｌ．１３，ｐｐ．４７５－４７９）。ヒトｓｄＡｂは、合成ヒトＶＨファージディスプレイライブラリからいくつかのＶＨをもたらした可逆的展開および親和性基準に基づく選択法によっても操作を必要とすることなく達成されている（Ｊｅｓｐｅｒｓ ａｔ ａｌ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ（２００４），Ｖｏｌ．３３７，ｐｐ．８９３－９０３）。別のファージ選択法を使用して、排他的非凝集ヒトＶＨドメインをナイーブヒトＶＨディスプレイライブラリから得ることができる（Ｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ（２００５），Ｖｏｌ．２８０，ｐｐ．４１３９５－４１４０３）。この同じ技法が得られたＶＬに適用され得る（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｌａｎｄｅｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（２０１４），Ｖｏｌ．６：１，ｐｐ．２１９－２３５）。
本発明の抗体または抗体断片は、がんの治療を必要とする対象に抗体または抗体断片の有効量を投与することにより、がんの治療に使用することができる。
本明細書で使用される場合、「対象」および「患者」という用語は、互換的に使用され、ヒト、マウス、ラット、ハムスター、テンジクネズミ、ウサギ、ネコ、イヌ、サル、ウシ、ウマ、ブタなどの哺乳動物（例えば、がんを有するヒト患者などの患者）を指す。
本明細書で使用される「治療する」、「治療すること」、および「治療」という用語は、疾患またはその症状の治癒または改善目的のために、対象に行われるか、または対象に活性薬剤または活性薬剤の組み合わせを投与する任意の種類の介入またはプロセスを指す。これには、疾患に関連する症状、合併症、状態、または生化学的兆候を逆転させる、緩和する、改善する、抑制する、または遅延させること、ならびに疾患に関連する症状、合併症、状態、または生化学的兆候の発症、進行、発生、重症化、または再発を予防することが含まれる。
本明細書で使用される場合、「有効な治療」または「肯定的な治療応答」とは、有益な効果、例えば、疾患または障害、例えば、がんの少なくとも１つの症状の改善をもたらす治療を指す。有益な効果は、その方法に従って治療を開始する前に行われた測定または観察を上回る改善を含む、ベースラインを上回る改善の形態をとることができる。例えば、有益な効果は、疾患の臨床症状もしくは診断症状、またはがんのマーカーの軽減または排除によって証明される、任意の臨床病期において対象におけるがんの進行を遅延させる、安定させる、停止する、または逆転させる形態をとることができる。有効な治療は、例えば、腫瘍サイズを減少させ得る、循環腫瘍細胞の存在を減少させ得る、腫瘍の転移を軽減もしくは予防し得る、腫瘍成長を遅延させ得るもしくは停止させ得る、および／または腫瘍再発（ｒｅｃｕｒｒｅｎｃｅ）もしくは再発（ｒｅｌａｐｓｅ）を予防し得るもしくは遅延させ得る。
「治療量」または「有効量」という用語は、所望の生物学的、治療的、および／または予防的結果を提供する薬剤または薬剤の組み合わせの量を指す。その結果は、疾患の兆候、症状、もしくは原因のうちの１つ以上の軽減（ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ）、改善、寛解、軽減（ｌｅｓｓｅｎｉｎｇ）、遅延、および／または緩和、または生物系の任意の他の所望の変化とすることができる。いくつかの実施形態では、治療量は、腫瘍発生を遅延させるのに十分な量である。いくつかの実施形態では、治療量は、腫瘍再発を予防するまたは遅延させるのに十分な量である。
薬物または組成物の治療量は、（ｉ）がん細胞の数を減少させ得る、（ｉｉ）腫瘍サイズを減少させ得る、（ｉｉｉ）がん細胞の末梢器官への浸潤を抑制し得る、遅らせ得る、ある程度遅延させ得る、かつ停止し得る、（ｉｖ）腫瘍転移を抑制し得る、（ｖ）腫瘍成長を抑制し得る、（ｖｉ）腫瘍の発生および／または再発を予防し得るまたは遅延させ得る、および／または（ｖｉｉ）がんに関連する症状のうちの１つ以上をある程度軽減し得る。
治療量は、治療される個体の病状、年齢、性別、および体重、ならびに個体において所望の応答を誘発する薬剤または薬剤の組み合わせの能力などの要因に応じて変化し得る。
治療量は、１回以上の投与で投与することができる。
治療量には、薬剤または薬剤の組み合わせの任意の毒作用または有害作用と、治療的に有益な効果とのバランスを保つ量も含まれる。
より具体的には、本発明は、ヒトＴＧＦ－βＲＩＩの細胞外ドメインに特異的に結合する抗体またはその抗体断片であって、抗体または抗体断片が、ヒトＴＧＦ－βＲＩＩの細胞外ドメインのエピトープに結合し、その２５位のフェニルアラニン（Ｆ）が結合のための必須残基である、抗体またはその抗体断片を提供する。
本発明に導く研究では、ヒトＴＧＦ－βＲＩＩの細胞外ドメインの特定のエピトープに結合する抗体が特定された。このエピトープは、ヒトＴＧＦ－βＲＩＩのアイソフォームＡの細胞外ドメインの２５位に少なくともアミノ酸残基を含む。ヒトＴＧＦ－βＲＩＩのアイソフォームＡの細胞外ドメインのアミノ酸配列は、配列番号１０２に記載の通りである。この配列の２５位のアミノ酸は、フェニルアラニン（Ｆ）である（太字および下線）。ヒトＴＧＦ－βＲＩＩタンパク質およびアイソフォームＡをコードする遺伝子のデータベース受入番号は、ＧｅｎＢａｎｋ ＮＭ＿００１０２４８４７．２である（タンパク質配列参照番号は、ＮＰ＿００１０２００１８．１（配列番号１０２）である）。細胞外ドメインへの挿入に起因するより長いアイソフォームをコードするスプライスバリアントは、アイソフォームＢである。アイソフォームＢをコードする遺伝子は、ＧｅｎＢａｎｋ ＮＭ＿００３２４２．６である（タンパク質配列参照は、ＮＰ＿００３２３３．４（配列番号１０３）であり、挿入に下線が引かれている）。アイソフォームＡの細胞外ドメインの２５位のアミノ酸は、アイソフォームＢの細胞外ドメインの５０位のアミノ酸に対応する。ヒトＴＧＦ－βＲＩＩのアイソフォームＢの細胞外ドメインのアミノ酸配列は、配列番号１０４に記載の通りである。この配列の５０位にあるアミノ酸、フェニルアラニン（Ｆ）は、太字表示になっており、下線が引かれている。これらの受入番号は、主に、ＴＧＦ－βＲＩＩタンパク質を標的として特定するさらなる方法を提供するために与えられ、抗体によって結合されたＴＧＦ－βＲＩＩタンパク質の実際の配列は、例えば、いくつかのがんなどで生じる変異などのコード遺伝子の変異のため、変化し得る。
この記述がヒトＴＧＦ－βＲＩＩの２５位のアミノ酸を指す箇所ではどこでも、それは、ヒトＴＧＦ－βＲＩＩのアイソフォームＡの細胞外ドメインの２５位のアミノ酸、ならびにヒトＴＧＦ－βＲＩＩの別のアイソフォームの対応する位置、具体的には、アイソフォームＢの５０位を指す。同じことが本明細書で特定される他のアミノ酸位置にも当てはまる。
ヒトＴＧＦ－βＲＩＩの細胞外ドメインの２５位のアミノ酸残基は、アラニンスキャニングによって決定される、本発明の抗体の結合のための必須残基であることが見出された。アラニンスキャニングでは、抗原、この場合ではＴＧＦ－βＲＩＩの各位置のアミノ酸がアラニンで１つずつ置換される。これにより非修飾抗原に結合する抗体の結合が弱まるか、または有意に減少する場合、置換されるアミノ酸は、結合に寄与し、必須残基であるとみなされる。したがって、抗体または抗体断片は、かかる残基を含むエピトープに特異的に結合する。この文脈で、アミノ酸残基の結合活性または反応性が非修飾アミノ酸配列と比較して５０％超減少する場合、アミノ酸残基は必須残基とみなされる。したがって、「有意に減少した」とは、ヒトＴＧＦβＲＩＩの細胞外ドメインの非修飾アミノ酸配列と比較して少なくとも５０％超減少した結合活性または反応性を意味する。
したがって、本発明の抗体または抗体断片は、ヒトＴＧＦβＲＩＩの細胞外ドメインのアミノ酸配列（その野生型配列は配列番号１０２に記載される通りである）の２５位のフェニルアラニン（Ｆ）がアラニン（Ａ）で置換された場合、ヒトＴＧＦβＲＩＩの細胞外ドメインの野生型アミノ酸配列と比較して、５０％未満、好ましくは４０％、３０％、２０％、１０％、５％、または２％未満の結合活性または反応性を有する。
したがって、本発明の抗体または抗体断片は、ヒトＴＧＦ－βＲＩＩの細胞外ドメインのアミノ酸配列の２５位にフェニルアラニン（Ｆ）を含むヒトＴＧＦ－βＲＩＩのエピトープに特異的に結合する。好ましくは、抗体または抗体断片のこのエピトープへの結合は、アラニンスキャニングによって決定され、ここで、このエピトープに結合する抗体または抗体断片は、アラニン（Ａ）がヒトＴＧＦ－βＲＩＩの細胞外ドメインのアミノ酸配列の２５位に存在する場合、フェニルアラニン（Ｆ）が２５位に存在する場合と比較して、５０％未満、好ましくは４０％、３０％、２０％、１０％、５％、または２％未満の結合活性または反応性を有する。
本発明の抗体または抗体断片を定義する別の方法は、それが、ヒトＴＧＦβＲＩＩのアイソフォームＡ（その野生型配列は配列番号１０２に記載される通りである）の２５位にあるフェニルアラニン（Ｆ）残基のアラニン（Ａ）での置換により、抗体または抗体断片の結合が少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９８％減少する、ヒトＴＧＦβＲＩＩの細胞外ドメインのエピトープに結合することである。
本発明の抗体または抗体断片は、ヒトＴＧＦ－βＲＩＩの細胞外ドメイン内のエピトープに結合する抗体または抗体断片として定義される場合もあり、このエピトープは、ヒトＴＧＦ－βＲＩＩのアイソフォームＡ（その野生型配列は配列番号１０２に記載の通りである）の２５位にあるフェニルアラニン（Ｆ）残基を含む。２５位の必須アミノ酸残基に加えて、ヒトＴＧＦ－βＲＩＩのアイソフォームＡの細胞外ドメインのエピトープの１１９位のアスパラギン酸（Ｄ）を、結合のためのさらなる必須残基として特定した。ヒトＴＧＦ－βＲＩＩのアイソフォームＡの１１９位のアミノ酸は、アイソフォームＢ（配列番号１０４）の細胞外ドメインの１４４位のアミノ酸に対応する。本発明の抗体または抗体断片は、好ましくは、ヒトＴＧＦ－βＲＩＩの細胞外ドメインの野生型アミノ酸配列の１１９位のアスパラギン酸（Ｄ）がアラニン（Ａ）で置換された場合、ヒトＴＧＦ－βＲＩＩの細胞外ドメインの野生型アミノ酸配列と比較して、１０％未満、より好ましくは５％、４％、３％、または２％未満の結合反応性を有する。
特定の実施形態では、抗体または抗体断片は、好ましくは、ヒトＴＧＦβＲＩＩの細胞外ドメインの野生型アミノ酸配列と比較して、
－ヒトＴＧＦ－βＲＩＩの細胞外ドメインの野生型アミノ酸配列の２５位のフェニルアラニン（Ｆ）がアラニン（Ａ）で置換された場合、５％未満、好ましくは３％未満の結合反応性、
－ヒトＴＧＦ－βＲＩＩの細胞外ドメインの野生型アミノ酸配列の１１９位のアスパラギン酸（Ｄ）がアラニン（Ａ）で置換された場合、５％未満、好ましくは３％未満の結合反応性を有する。
したがって、本発明は、ヒトＴＧＦ－βＲＩＩの細胞外ドメインのアミノ酸配列の２５位にフェニルアラニン（Ｆ）を含み、かつ１１９位にアスパラギン酸（Ｄ）を含むヒトＴＧＦ－βＲＩＩのエピトープに特異的に結合する抗体または抗体断片を包含する。好ましくは、抗体または抗体断片のこのエピトープへの結合は、アラニンスキャニングによって決定され、ここで、このエピトープに結合する抗体または抗体断片は、フェニルアラニン（Ｆ）およびアスパラギン酸（Ｄ）がそれぞれの当該位置に存在する場合と比較して、アラニンがヒトＴＧＦ－βＲＩＩの細胞外ドメインのアミノ酸配列の２５位に存在する場合、５０％未満、好ましくは５％または３％未満の結合活性または反応性を有し、アラニン（Ａ）がヒトＴＧＦ－βＲＩＩの細胞外ドメインのアミノ酸配列の１１９位に存在する場合、１０％未満、好ましくは５％または３％未満の結合活性または反応性を有し、各変化は、野生型細胞外ドメインと比較して２つの変化の組み合わせとしてではなく単独で試験される。
本発明の抗体または抗体断片を定義する別の方法は、それが、
－ヒトＴＧＦβＲＩＩのアイソフォームＡ（その野生型配列は配列番号１０２に記載される通りである）の２５位にあるフェニルアラニン（Ｆ）残基のアラニン（Ａ）での置換により、抗体または抗体断片の結合が少なくとも５０％、好ましくは少なくとも９５％または９７％減少し、かつ
－ヒトＴＧＦβＲＩＩのアイソフォームＡ（その野生型配列は配列番号１０２に記載される通りである）の１１９位にあるアスパラギン酸（Ｄ）残基のアラニン（Ａ）での置換により、抗体または抗体断片の結合が少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％または９７％減少する、ヒトＴＧＦβＲＩＩ細胞外ドメインのエピトープに結合することである。
本発明の抗体または抗体断片は、ヒトＴＧＦ－βＲＩＩの細胞外ドメイン内のエピトープに結合する抗体または抗体断片として定義される場合もあり、このエピトープは、それぞれ、ヒトＴＧＦ－βＲＩＩのアイソフォームＡ（その野生型配列は配列番号１０２に記載の通りである）の２５位および１１９位にあるフェニルアラニン（Ｆ）残基およびアスパラギン酸（Ｄ）残基を含む。
別の実施形態では、抗体または抗体断片は、ヒトＴＧＦ－βＲＩＩの細胞外ドメインのエピトープに結合し、ヒトＴＧＦ－βＲＩＩのアイソフォームＡの細胞外ドメインのエピトープの５２位のスレオニン（Ｔ）は、結合のためのさらなる必須残基である。ヒトＴＧＦ－βＲＩＩのアイソフォームＡの５２位のアミノ酸は、アイソフォームＢの７７位のアミノ酸に対応する。この実施形態では、抗体または抗体断片は、好ましくは、ヒトＴＧＦ－βＲＩＩの細胞外ドメインの野生型アミノ酸配列と比較して、
－ヒトＴＧＦ－βＲＩＩの細胞外ドメインの野生型アミノ酸配列の２５位のフェニルアラニン（Ｆ）がアラニン（Ａ）で置換された場合、５％未満、好ましくは２％未満の結合反応性、
－ヒトＴＧＦ－βＲＩＩの細胞外ドメインの野生型アミノ酸配列の５２位のトレオニン（Ｔ）がアラニン（Ａ）で置換された場合、６０％未満、好ましくは４０％または３０％未満、より好ましくは２０％未満の結合反応性、および
－ヒトＴＧＦ－βＲＩＩの細胞外ドメインの野生型アミノ酸配列の１１９位のアスパラギン酸（Ｄ）がアラニン（Ａ）で置換された場合、３％未満の結合反応性を有する。
したがって、本発明は、ヒトＴＧＦ－βＲＩＩの細胞外ドメインのアミノ酸配列の２５位にフェニルアラニン（Ｆ）、５２位にスレオニン（Ｔ）、および１１９位にアスパラギン酸（Ｄ）を含むヒトＴＧＦ－βＲＩＩのエピトープに特異的に結合する抗体または抗体断片を包含する。好ましくは、抗体または抗体断片のこのエピトープへの結合は、アラニンスキャニングによって決定され、ここで、このエピトープに結合する抗体または抗体断片は、フェニルアラニン（Ｆ）、トレオニン（Ｔ）、およびアスパラギン酸（Ｄ）がそれぞれの当該位置に存在する場合と比較して、アラニン（Ａ）がヒトＴＧＦ－βＲＩＩの細胞外ドメインのアミノ酸配列の２５位に存在する場合、５０％未満、好ましくは５％または２％未満の結合活性または反応性を有し、アラニン（Ａ）がヒトＴＧＦ－βＲＩＩの細胞外ドメインのアミノ酸配列の５２位に存在する場合、６０％未満、好ましくは４０％、３０％、または２０％未満の結合活性または反応性を有し、アラニン（Ａ）がヒトＴＧＦ－βＲＩＩの細胞外ドメインのアミノ酸配列の１１９位に存在する場合、１０％未満、好ましくは３％未満の結合活性または反応性を有し、各変化は、野生型細胞外ドメインと比較して２つの変化の組み合わせとしてではなく単独で試験される。
本発明の抗体または抗体断片を定義する別の方法は、それが、
－ヒトＴＧＦβＲＩＩのアイソフォームＡ（その野生型配列は配列番号１０２に記載される通りである）の２５位にあるフェニルアラニン（Ｆ）残基のアラニン（Ａ）での置換により、抗体または抗体断片の結合が少なくとも５０％、好ましくは少なくとも９５％または９８％減少し、
－ヒトＴＧＦβＲＩＩのアイソフォームＡ（その野生型配列は配列番号１０２に記載される通りである）の５２位にあるトレオニン（Ｔ）残基のアラニン（Ａ）での置換により、抗体または抗体断片の結合が少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％または８０％減少し、かつ
－ヒトＴＧＦβＲＩＩのアイソフォームＡ（その野生型配列は配列番号１０２に記載される通りである）の１１９位にあるアスパラギン酸（Ｄ）残基のアラニン（Ａ）での置換により、抗体または抗体断片の結合が少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９７％減少する、ヒトＴＧＦβＲＩＩ細胞外ドメインのエピトープに結合することである。
本発明の抗体または抗体断片は、ヒトＴＧＦ－βＲＩＩの細胞外ドメイン内のエピトープに結合する抗体または抗体断片として定義される場合もあり、このエピトープは、それぞれ、ヒトＴＧＦ－βＲＩＩのアイソフォームＡ（その野生型配列は配列番号１０２に記載の通りである）の２５位、５２位、および１１９位にあるフェニルアラニン（Ｆ）残基、トレオニン（Ｔ）残基、およびアスパラギン酸（Ｄ）残基を含む。
別の実施形態では、抗体または抗体断片は、ヒトＴＧＦ－βＲＩＩの細胞外ドメインのエピトープに結合し、ヒトＴＧＦ－βＲＩＩのアイソフォームＡの細胞外ドメインのエピトープの５４位のイソロイシン（Ｉ）および１２０位のグルタミン酸（Ｅ）は、結合のためのさらなる必須残基である。ヒトＴＧＦ－βＲＩＩのアイソフォームＡの５４位および１２０位のアミノ酸は、それぞれ、アイソフォームＢの７９位および１４５位のアミノ酸に対応する。この実施形態では、抗体または抗体断片は、好ましくは、ヒトＴＧＦ－βＲＩＩの細胞外ドメインの野生型アミノ酸配列と比較して、
－ヒトＴＧＦ－βＲＩＩの細胞外ドメインの野生型アミノ酸配列の２５位のフェニルアラニン（Ｆ）がアラニン（Ａ）で置換された場合、１０％未満の結合反応性、
－ヒトＴＧＦ－βＲＩＩの細胞外ドメインの野生型アミノ酸配列の５４位のイソロイシン（Ｉ）がアラニン（Ａ）で置換された場合、２０％未満の結合反応性、
－ヒトＴＧＦ－βＲＩＩの細胞外ドメインの野生型アミノ酸配列の１１９位のアスパラギン酸（Ｄ）がアラニン（Ａ）で置換された場合、３％未満、好ましくは２％未満、より好ましくは１％未満の結合反応性、および
－ヒトＴＧＦ－βＲＩＩの細胞外ドメインの野生型アミノ酸配列の１２０位のグルタミン酸（Ｅ）がアラニン（Ａ）で置換された場合、８０％未満、好ましくは７０％、６０％、５０％、４０％未満、より好ましくは３０％未満、最も好ましくは１０％または５％未満の結合反応性を有する。
したがって、本発明は、ヒトＴＧＦ－βＲＩＩの細胞外ドメインのアミノ酸配列の２５位にフェニルアラニン（Ｆ）、５４位にイソロイシン（Ｉ）、１１９位にアスパラギン酸（Ｄ）、および１２０位にグルタミン酸（Ｅ）を含むヒトＴＧＦ－βＲＩＩのエピトープに特異的に結合する抗体または抗体断片を包含する。好ましくは、抗体または抗体断片のこのエピトープへの結合は、アラニンスキャニングによって決定され、ここで、このエピトープに結合する抗体または抗体断片は、フェニルアラニン（Ｆ）、トレオニン（Ｔ）、アスパラギン酸（Ｄ）、およびグルタミン酸（Ｅ）がそれぞれの当該位置に存在する場合と比較して、アラニン（Ａ）がヒトＴＧＦ－βＲＩＩの細胞外ドメインのアミノ酸配列の２５位に存在する場合、５０％未満、好ましくは１０％未満の結合活性または反応性を有し、アラニン（Ａ）がヒトＴＧＦ－βＲＩＩの細胞外ドメインのアミノ酸配列の５４位に存在する場合、２０％未満の結合活性または反応性を有し、アラニン（Ａ）がヒトＴＧＦ－βＲＩＩの細胞外ドメインのアミノ酸配列の１１９位に存在する場合、１０％未満、好ましくは３％、２％、または１％未満の結合活性または反応性を有し、アラニン（Ａ）がヒトＴＧＦ－βＲＩＩの細胞外ドメインのアミノ酸配列の１２０位に存在する場合、８０％未満、好ましくは７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、１０％、または５％未満の結合活性または反応性を有し、各変化は、野生型細胞外ドメインと比較して２つの変化の組み合わせとしてではなく単独で試験される。
本発明の抗体または抗体断片を定義する別の方法は、それが、
－ヒトＴＧＦβＲＩＩのアイソフォームＡ（その野生型配列は配列番号１０２に記載される通りである）の２５位にあるフェニルアラニン（Ｆ）残基のアラニン（Ａ）での置換により、抗体または抗体断片の結合が少なくとも５０％、好ましくは少なくとも９０％減少し、
－ヒトＴＧＦβＲＩＩのアイソフォームＡ（その野生型配列は配列番号１０２に記載される通りである）の５４位にあるイソロイシン（Ｉ）残基のアラニン（Ａ）での置換により、抗体または抗体断片の結合が少なくとも８０％減少し、
－ヒトＴＧＦβＲＩＩのアイソフォームＡ（その野生型配列は配列番号１０２に記載される通りである）の１１９位にあるアスパラギン酸（Ｄ）残基のアラニン（Ａ）での置換により、抗体または抗体断片の結合が少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９７％、９８％、または９９％減少し、かつ
－ヒトＴＧＦβＲＩＩのアイソフォームＡ（その野生型配列は配列番号１０２に記載される通りである）の１２０位にあるグルタミン酸（Ｅ）残基のアラニン（Ａ）での置換により、抗体または抗体断片の結合が少なくとも３０％、好ましくは少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％、９０％、または９５％減少する、ヒトＴＧＦβＲＩＩ細胞外ドメインのエピトープに結合することである。
本発明の抗体または抗体断片は、ヒトＴＧＦ－βＲＩＩの細胞外ドメイン内のエピトープに結合する抗体または抗体断片として定義される場合もあり、このエピトープは、それぞれ、ヒトＴＧＦ－βＲＩＩのアイソフォームＡ（その野生型配列は配列番号１０２に記載の通りである）の２５位、５４位、１１９位、および１２０位にあるフェニルアラニン（Ｆ）残基、イソロイシン（Ｉ）残基、アスパラギン酸（Ｄ）残基、およびグルタミン酸（Ｅ）残基を含む。
本発明者らは、２５位のフェニルアラニン（Ｆ）が結合に必須である細胞外ＴＧＦ－βＲＩＩのエピトープに特異的に結合する重鎖可変領域を含むいくつかの抗体を特定した。かかる抗体の一例は、以下を有する重鎖可変領域（ＶＨ）：
（ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列を含むＶＨ－ＣＤＲ１、
（ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列を含むＶＨ－ＣＤＲ２、および
（ｃ）配列番号３に記載のアミノ酸配列を含むＶＨ－ＣＤＲ３を含み、
ここで、１～５個のアミノ酸残基が、ＶＨ－ＣＤＲ１、ＶＨ－ＣＤＲ２、およびＶＨ－ＣＤＲ３から選択されるＣＤＲのうちのいずれか１つ以上内のその保存的アミノ酸で変えられてもよい。この抗体は、本発明に包含される。
かかる抗体の別の例は、以下を有する重鎖可変領域（ＶＨ）：
（ａ）配列番号４に記載のアミノ酸配列を含むＶＨ－ＣＤＲ１、
（ｂ）配列番号５に記載のアミノ酸配列を含むＶＨ－ＣＤＲ２、および
（ｃ）配列番号６に記載のアミノ酸配列を含むＶＨ－ＣＤＲ３を含み、
ここで、１～５個のアミノ酸残基が、ＶＨ－ＣＤＲ１、ＶＨ－ＣＤＲ２、およびＶＨ－ＣＤＲ３から選択されるＣＤＲのうちのいずれか１つ以上内のその保存的アミノ酸で変えられてもよい。この抗体も本発明に包含される。
かかる抗体の別の例は、以下を有する重鎖可変領域（ＶＨ）：
（ａ）配列番号７に記載のアミノ酸配列を含むＶＨ－ＣＤＲ１、
（ｂ）配列番号８に記載のアミノ酸配列を含むＶＨ－ＣＤＲ２、および
（ｃ）配列番号９に記載のアミノ酸配列を含むＶＨ－ＣＤＲ３を含み、
ここで、１～５個のアミノ酸残基が、ＶＨ－ＣＤＲ１、ＶＨ－ＣＤＲ２、およびＶＨ－ＣＤＲ３から選択されるＣＤＲのうちのいずれか１つ以上内のその保存的アミノ酸で変えられてもよい。この抗体も本発明に包含される。
したがって、本発明の抗体または抗体断片の重鎖可変領域は、配列番号１、４、および７に記載の配列からなる群から選択されるＣＤＲ１、配列番号２、５、および８に記載の配列からなる群から選択されるＣＤＲ２、および／または配列番号３、６、および９に記載の配列からなる群から選択されるＣＤＲ３を含んでもよく、ここで、１～５個のアミノ酸残基が、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３から選択されるＣＤＲのうちのいずれか１つ以上内のその保存的アミノ酸で変えられてもよい。
重鎖可変領域のフレームワーク領域は、任意の好適なフレームワーク領域から選択され得る。好適なフレームワーク領域の例は、ヒトＶ遺伝子ＩＧＨＶ３－１５およびＩＧＨＶ３－２３によってコードされるフレームワーク領域である。これらの生殖系列Ｖ遺伝子は、１つ以上の体細胞変異を含み得る。
本発明の一実施形態では、抗体またはその抗体断片は、アミノ酸配列：ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＤＩＹＡＭＴＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＶＩＳＧＳＧＧＴＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＲＧＱＹＲＤＩＶＧＡＴＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号１０）を有するＶＨ、またはそれと少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％の同一性を有するＶＨアミノ酸配列を含む。
別の実施形態では、抗体またはその抗体断片は、アミノ酸配列：ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＥＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＮＡＷＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＧＲＩＫＴＴＩＳＧＧＡＴＤＦＡＡＰＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＤＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＫＴＥＤＴＡＶＹＹＣＴＬＤＬＲＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号１１）を有するＶＨ、またはそれと少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％の同一性を有するＶＨアミノ酸配列を含む。
別の実施形態では、抗体またはその抗体断片は、アミノ酸配列：ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＶＳＧＦＴＦＲＲＹＡＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＡＩＳＡＳＧＤＲＴＨＮＴＤＳＶＫＧＲＦＳＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＦＣＡＫＧＩＡＡＳＧＫＮＹＦＤＰＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号１２）を有するＶＨ、またはそれと少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％の同一性を有するＶＨアミノ酸配列を含む。
重鎖可変領域は、示されるアミノ酸配列に対して０～１０個、好ましくは０～５個のアミノ酸変異を有することができる。好ましい実施形態では、重鎖可変領域は、ＣＤＲ以外の位置に、示されるアミノ酸配列に対して０～９、０～８、０～７、０～６、０～５、０～４個、好ましくは０～３個、好ましくは０～２個、好ましくは０～１個、より好ましくは０個のアミノ酸変異、挿入、欠失、置換、付加、またはそれらの組み合わせを含む。挿入、付加、欠失、または置換の組み合わせは、整列させた配列の１０個以下の位置、好ましくは５個以下の位置が異ならない場合の組み合わせである。整列させた配列のうちの一方内のギャップは、他方の配列内でスキップされたアミノ酸と同数のアミノ酸に値する。アミノ酸置換は、存在する場合、好ましくは保存的アミノ酸置換である。重鎖可変領域内の置換は、上述の１つ以上のＣＤＲ内の置換に加えられてもよい。保存的アミノ酸は、電荷、疎水性、親水性、酸性、塩基性、およびサイズなどの特徴に基づくそれぞれの官能基の類似性に基づいて当該技術分野で既知である。
アミノ酸変異、挿入、欠失、置換、付加、またはそれらの組み合わせは、好ましくは、重鎖および軽鎖の結合界面では行われない。
アミノ酸が重鎖／軽鎖相互作用の界面で変化した場合、他方の鎖内の対応するアミノ酸がその変化に順応するように変化することが好ましい。アミノ酸の挿入または付加は、好ましくは、プロリンの挿入または付加を伴わない。
本発明は、本明細書に記載の抗体または抗体断片のバリアントを含む抗体または抗体断片を包含する。具体的には、配列番号２２～９１および９３のうちのいずれか１つ、すなわち、図４に示されるＶＨ配列のうちのいずれか１つを有するＶＨを含む抗体または抗体断片を包含する。配列番号２２～９１および９３のうちのいずれか１つの少なくともＨＣＤＲ３または全てのＣＤＲを含む抗体または抗体断片も包含される。好ましい抗体または抗体断片は、配列番号４０、４３、４６、４７、４８、または５４に記載のアミノ酸配列を有するか、またはそれに由来する重鎖可変領域を含み、これは、配列番号１１に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む抗体のバリアントである。他の好ましい抗体または抗体断片は、配列番号６７、７０、７５、７６、７７、７８、８３、８４、または８８に記載のアミノ酸配列を有するか、またはそれに由来する重鎖可変領域を含み、これは、配列番号１２に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む抗体のバリアントである。他の好ましい抗体または抗体断片は、配列番号２４または２６に記載のアミノ酸配列を有するか、またはそれに由来する重鎖可変領域を含み、これは、配列番号１０に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む抗体のバリアントである。最も好ましいバリアントは、配列番号４０、４３、４６、４７、４８、５４、６７、７０、７５、７６、７７、７８、８３、８４、または８８に記載のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含むものである。
かかるバリアントの重鎖可変領域は、示されるアミノ酸配列に対して０～１０個、好ましくは０～５個のアミノ酸変異を有することができる。好ましい実施形態では、重鎖可変領域は、ＣＤＲ以外の位置に、示されるアミノ酸配列に対して０～９、０～８、０～７、０～６、０～５、０～４個、好ましくは０～３個、好ましくは０～２個、好ましくは０～１個、より好ましくは０個のアミノ酸変異、挿入、欠失、置換、付加、またはそれらの組み合わせを含む。
本発明の抗体もしくは抗体断片、または結合ドメインは、例えば、本明細書で定義される同族軽鎖または共通軽鎖などの任意の好適な軽鎖を含み得る。
一実施形態では、軽鎖可変領域は、０～１０個、好ましくは０～５個のアミノ酸変異、挿入、欠失、置換、付加、またはこれらの組み合わせを有する図１Ｂに示されるＩｇＶκ１－３９＊０１遺伝子セグメントのアミノ酸配列を含む。ＩｇＶκ１－３９は、免疫グロブリン可変カッパ１－３９遺伝子の略である。この遺伝子は、免疫グロブリンカッパ可変１－３９、ＩＧＫＶ１３９、ＩＧＫＶ１－３９としても知られている。この遺伝子の外部Ｉｄは、ＨＧＮＣ：５７４０、Ｅｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅ：２８９３０、Ｅｎｓｅｍｂｌ：ＥＮＳＧ０００００２４２３７１である。ＩｇＶκ１－３９の好ましいアミノ酸配列が図１Ａに提示される。この図は、Ｖ領域の配列を列記する。Ｖ領域は、５つのＪ領域のうちの１つと組み合わせることができる。図１Ｂおよび図１Ｃは、Ｊ領域と組み合わせたＩｇＶκ１－３９の２つの好ましい配列を記載する。合わせられた配列は、ＩＧＫＶ１－３９／ｊｋ１およびＩＧＫＶ１－３９／ｊｋ５と示され、代替名は、ＩｇＶκ１－３９＊０１／ＩＧＪκ１＊０１またはＩｇＶκ１－３９＊０１／ＩＧＪκ５＊０１（ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇのＩＭＧＴデータベースによる命名）である。
軽鎖可変領域を含むＩｇＶκ１－３９＊０１が生殖系列配列であることが好ましい。軽鎖可変領域を含むＩＧＪκ１＊０１またはＩＧＪκ５＊０１が生殖系列配列であることがさらに好ましい。ＩＧＫＶ１－３９／ｊｋ１またはＩＧＫＶ１－３９／ｊｋ５軽鎖可変領域が生殖系列配列であることがさらに好ましい。
軽鎖を有する抗体を産生する成熟Ｂ細胞は、多くの場合、生殖系列配列に対して１つ以上の変異を経た軽鎖を産生し、これは、生物の非リンパ系細胞における正常配列を意味する。これらの変異に関与するプロセスは、体細胞超変異と称される。結果として得られた軽鎖は、親和性成熟軽鎖と称される。かかる軽鎖は、生殖系列ＩｇＶκ１－３９＊０１配列に由来する場合、ＩｇＶκ１－３９＊０１由来の軽鎖である。本明細書では、「ＩｇＶκ１－３９＊０１」という語句は、ＩｇＶκ１－３９＊０１由来の軽鎖を含む。体細胞超変異によって軽鎖をコードする核酸に導入される変異は、研究室で人工的に導入することもできる。研究室では、軽鎖の他の変異も、必ずしも量ではなく種類に関して軽鎖の特性に影響を及ぼすことなく導入することができる。軽鎖は、０～１０個、好ましくは０～５個のアミノ酸変異、挿入、欠失、置換、付加、またはこれらの組み合わせを有する図１Ａ、図１Ｂ、または図１Ｃに示される配列を含む場合、少なくともＩｇＶκ１－３９＊０１軽鎖である。好ましくは、ＩｇＶκ１－３９＊０１軽鎖は、０～９、０～８、０～７、０～６、０～５、０～４個のアミノ酸変異、挿入、欠失、置換、付加、またはこれらの組み合わせを有する図１Ａ、図１Ｂ、または図１Ｃに示される配列、より好ましくは、０～５個、好ましくは０～４、０～３、０～２、０～１個のアミノ酸変異、挿入、欠失、置換、付加、またはこれらの組み合わせを有する図１Ａ、図１Ｂ、または図１Ｃに示される配列、さらにより好ましくは、０～３個のアミノ酸変異、挿入、欠失、置換、付加、またはこれらの組み合わせを有する図１Ａ、図１Ｂ、または図１Ｃに示される配列、より好ましくは、０～２個のアミノ酸変異、挿入、欠失、置換、付加、またはこれらの組み合わせを有する図１Ａ、図１Ｂ、または図１Ｃに示される配列、より好ましくは、０～１個のアミノ酸変異、挿入、欠失、置換、付加、またはこれらの組み合わせを有する、最も好ましくは、０個のアミノ酸変異、挿入、欠失、置換、付加、またはこれらの組み合わせを有する図１Ａ、図１Ｂ、または図１Ｃに示される配列を含む軽鎖である。
一実施形態では、本抗体もしくはその抗体断片、または本結合ドメインは、以下を有する軽鎖可変領域（ＶＬ）：
（ａ）配列番号１９に記載のアミノ酸配列を含むＶＬ－ＣＤＲ１、
（ｂ）配列番号２０に記載のアミノ酸配列を含むＶＬ－ＣＤＲ２、および
（ｃ）配列番号２１に記載のアミノ酸配列を含むＶＬ－ＣＤＲ３を含み、
ここで、１～５個のアミノ酸残基が、ＶＬ－ＣＤＲ１、ＶＬ－ＣＤＲ２、およびＶＬ－ＣＤＲ３から選択されるＣＤＲのうちのいずれか１つ以上内のその保存的アミノ酸で置換されてもよい。
本発明の抗体もしくは抗体断片、または結合ドメインの軽鎖可変領域は、好ましくは、アミノ酸配列ＣＤＲ１－ＱＳＩＳＳＹ（配列番号１３）、ＣＤＲ２－ＡＡＳ（配列番号１４）、ＣＤＲ３－ＱＱＳＹＳＴＰＰＴ（配列番号１５）を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３領域、すなわち、（ＩＭＧＴによる）ＩＧＫＶ１－３９のＣＤＲを含み、示されるアミノ酸配列に対して０～５個のアミノ酸置換を可能にする。Ｋａｂａｔ番号付けによれば、アミノ酸配列は、ＣＤＲ１－ＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮ（配列番号１９）、ＣＤＲ２－ＡＡＳＳＬＱＳ（配列番号２０）、ＣＤＲ３－ＱＱＳＹＳＴＰＰＴ（配列番号２１）である。任意のアミノ酸変異、挿入、欠失、置換、付加、またはそれらの組み合わせは、好ましくは軽鎖可変領域のＣＤＲ３領域内には存在せず、好ましくは軽鎖可変領域のＣＤＲ１またはＣＤＲ２領域内には存在しない。アミノ酸置換は、好ましくは、保存的アミノ酸置換である。
具体的には、本発明の抗体もしくは抗体断片、または結合ドメインの軽鎖可変領域は、好ましくは、ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＡＡＳＳＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＳＹＳＴＰＰＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号１６）のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも８０％の同一性を有するＶＬアミノ酸配列を含む。したがって、これにより、０～５個のアミノ酸変異、挿入、欠失、置換、付加、またはそれらの組み合わせが可能になる。アミノ酸置換は、好ましくは、保存的アミノ酸置換である。
本発明の抗体は、任意のアイソタイプ：ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＤ、またはＩｇＥのものであり得る。好ましくは、抗体は、ＩｇＧ、具体的には、ＩｇＧ１またはＩｇＧ４である。最も好ましくは、抗体は、ＩｇＧ１である。
本発明の抗体の定常領域は、好ましくはヒト定常領域であるが、任意の動物のものであってもよい。これは、マウスまたはラット定常領域とすることができる。免疫される宿主生物に応じて、または抗原に応答して生成された組換え抗体を選択するために用いられるスクリーニング方法に応じて、マウス定常領域またはラット定常領域が有利に使用され得る。
抗体またはその抗体断片は、配列番号１７に記載のアミノ酸配列を含む重鎖定常領域を含み得る。抗体またはその抗体断片は、配列番号１８に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖定常領域を含み得る。定常領域は、従来のヒト抗体の定常領域と１個以上、好ましくは１０個以下、好ましくは５個以下のアミノ酸差を含み得る。
いくつかの抗体は、例えば、Ｆｃ受容体相互作用を減少させるか、またはＡＤＣＣ、Ｃ１ｑ結合、または他のエフェクター活性を減少させるように、ＣＨ２／下部ヒンジ領域が修飾される。本発明の抗体は、抗体とＦｃ－ガンマ受容体との相互作用が減少するように、バリアントＣＨ２および／または下部ヒンジドメインを有するＩｇＧ抗体であり得る。かかる変異体ＣＨ２および／または下部ヒンジドメインは、好ましくは、２３５位および／または２３６位（ＥＵ番号付け）にアミノ変異を含み、好ましくは２３５Ｇ位および／または２３６Ｒ位に残基を含む。
単離されたモノクローナル抗体は、ＩｇＧ１抗体の２つの重鎖定常領域を含み得、ここで、ＥＵ番号付けシステムによる４４７位のリジンが欠失している。
本発明の好ましい抗体または抗体断片は、表１に列記される重鎖可変領域ＣＤＲと軽鎖可変領域ＣＤＲとの組み合わせを含む。
Figure 2023508202000001
本発明の好ましい抗体または抗体断片は、配列番号１０、１１、１２、２２～９１、および９３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＶＨ、具体的には、本明細書に記載の好ましいＶＨを有する重鎖と、配列番号１６に記載のアミノ酸配列を含むＶＬを有する軽鎖とを含む。この抗体または抗体断片は、本明細書に記載の任意の定常ドメインを含むことができる。
一実施形態では、本明細書に記載の抗体またはその抗体断片は、配列番号１０に記載のアミノ酸配列を含むＶＨを有する重鎖と、配列番号１６に記載のアミノ酸配列を含むＶＬを有する軽鎖とを含む。
別の実施形態では、本明細書に記載の抗体またはその抗体断片は、配列番号１１に記載のアミノ酸配列を含むＶＨを有する重鎖と、配列番号１６に記載のアミノ酸配列を含むＶＬを有する軽鎖とを含む。
別の実施形態では、本明細書に記載の抗体またはその抗体断片は、配列番号１２に記載のアミノ酸配列を含むＶＨを有する重鎖と、配列番号１６に記載のアミノ酸配列を含むＶＬを有する軽鎖とを含む。
別の実施形態では、本明細書に記載の抗体またはその抗体断片は、配列番号４３に記載のアミノ酸配列を含むＶＨを有する重鎖と、配列番号１６に記載のアミノ酸配列を含むＶＬを有する軽鎖とを含む。
別の実施形態では、本明細書に記載の抗体またはその抗体断片は、配列番号７５に記載のアミノ酸配列を含むＶＨを有する重鎖と、配列番号１６に記載のアミノ酸配列を含むＶＬを有する軽鎖とを含む。
別の実施形態では、本明細書に記載の抗体またはその抗体断片は、配列番号７０に記載のアミノ酸配列を含むＶＨを有する重鎖と、配列番号１６に記載のアミノ酸配列を含むＶＬを有する軽鎖とを含む。
別の実施形態では、本明細書に記載の抗体またはその抗体断片は、配列番号８４に記載のアミノ酸配列を含むＶＨを有する重鎖と、配列番号１６に記載のアミノ酸配列を含むＶＬを有する軽鎖とを含む。
別の実施形態では、本明細書に記載の抗体またはその抗体断片は、配列番号８８に記載のアミノ酸配列を含むＶＨを有する重鎖と、配列番号１６に記載のアミノ酸配列を含むＶＬを有する軽鎖とを含む。
別の実施形態では、本明細書に記載の抗体またはその抗体断片は、配列番号４０に記載のアミノ酸配列を含むＶＨを有する重鎖と、配列番号１６に記載のアミノ酸配列を含むＶＬを有する軽鎖とを含む。
別の実施形態では、本明細書に記載の抗体またはその抗体断片は、配列番号８３に記載のアミノ酸配列を含むＶＨを有する重鎖と、配列番号１６に記載のアミノ酸配列を含むＶＬを有する軽鎖とを含む。
別の実施形態では、本明細書に記載の抗体またはその抗体断片は、配列番号７８に記載のアミノ酸配列を含むＶＨを有する重鎖と、配列番号１６に記載のアミノ酸配列を含むＶＬを有する軽鎖とを含む。
別の実施形態では、本明細書に記載の抗体またはその抗体断片は、配列番号４７に記載のアミノ酸配列を含むＶＨを有する重鎖と、配列番号１６に記載のアミノ酸配列を含むＶＬを有する軽鎖とを含む。
別の実施形態では、本明細書に記載の抗体またはその抗体断片は、配列番号７６に記載のアミノ酸配列を含むＶＨを有する重鎖と、配列番号１６に記載のアミノ酸配列を含むＶＬを有する軽鎖とを含む。
一実施形態では、本明細書に記載の抗体またはその抗体断片は、配列番号１０の２つの重鎖可変領域と、配列番号１６の２つの軽鎖可変領域とを含む。
別の実施形態では、本明細書に記載の抗体またはその抗体断片は、配列番号１１の２つの重鎖可変領域と、配列番号１６の２つの軽鎖可変領域とを含む。
別の実施形態では、本明細書に記載の抗体またはその抗体断片は、配列番号１２の２つの重鎖可変領域と、配列番号１６の２つの軽鎖可変領域とを含む。
一実施形態では、本明細書に記載の抗体またはその抗体断片は、配列番号４３の２つの重鎖可変領域と、配列番号１６の２つの軽鎖可変領域とを含む。
一実施形態では、本明細書に記載の抗体またはその抗体断片は、配列番号７５の２つの重鎖可変領域と、配列番号１６の２つの軽鎖可変領域とを含む。
一実施形態では、本明細書に記載の抗体またはその抗体断片は、配列番号７０の２つの重鎖可変領域と、配列番号１６の２つの軽鎖可変領域とを含む。
一実施形態では、本明細書に記載の抗体またはその抗体断片は、配列番号８４の２つの重鎖可変領域と、配列番号１６の２つの軽鎖可変領域とを含む。
一実施形態では、本明細書に記載の抗体またはその抗体断片は、配列番号８８の２つの重鎖可変領域と、配列番号１６の２つの軽鎖可変領域とを含む。
一実施形態では、本明細書に記載の抗体またはその抗体断片は、配列番号４０の２つの重鎖可変領域と、配列番号１６の２つの軽鎖可変領域とを含む。
一実施形態では、本明細書に記載の抗体またはその抗体断片は、配列番号８３の２つの重鎖可変領域と、配列番号１６の２つの軽鎖可変領域とを含む。
一実施形態では、本明細書に記載の抗体またはその抗体断片は、配列番号７８の２つの重鎖可変領域と、配列番号１６の２つの軽鎖可変領域とを含む。
一実施形態では、本明細書に記載の抗体またはその抗体断片は、配列番号４７の２つの重鎖可変領域と、配列番号１６の２つの軽鎖可変領域とを含む。
一実施形態では、本明細書に記載の抗体またはその抗体断片は、配列番号７６の２つの重鎖可変領域と、配列番号１６の２つの軽鎖可変領域とを含む。
一実施形態では、本発明の抗体は、
（Ａ）配列番号１０に記載のアミノ酸配列を含むＶＨと、配列番号１７に記載のアミノ酸配列を含む重鎖定常領域とを有する重鎖、および
（Ｂ）配列番号１６に記載のアミノ酸配列を含むＶＬと、配列番号１８に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖定常領域とを有する軽鎖を含む。
別の実施形態では、本発明の抗体は、
（Ａ）配列番号１１に記載のアミノ酸配列を含むＶＨと、配列番号１７に記載のアミノ酸配列を含む重鎖定常領域とを有する重鎖、および
（Ｂ）配列番号１６に記載のアミノ酸配列を含むＶＬと、配列番号１８に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖定常領域とを有する軽鎖を含む。
別の実施形態では、本発明の抗体は、
（Ａ）配列番号１２に記載のアミノ酸配列を含むＶＨと、配列番号１７に記載のアミノ酸配列を含む重鎖定常領域とを有する重鎖、および
（Ｂ）配列番号１６に記載のアミノ酸配列を含むＶＬと、配列番号１８に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖定常領域とを有する軽鎖を含む。
一実施形態では、本発明の抗体は、
（Ａ）配列番号４３に記載のアミノ酸配列を含むＶＨと、配列番号１７に記載のアミノ酸配列を含む重鎖定常領域とを有する重鎖、および
（Ｂ）配列番号１６に記載のアミノ酸配列を含むＶＬと、配列番号１８に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖定常領域とを有する軽鎖を含む。
一実施形態では、本発明の抗体は、
（Ａ）配列番号７５に記載のアミノ酸配列を含むＶＨと、配列番号１７に記載のアミノ酸配列を含む重鎖定常領域とを有する重鎖、および
（Ｂ）配列番号１６に記載のアミノ酸配列を含むＶＬと、配列番号１８に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖定常領域とを有する軽鎖を含む。
一実施形態では、本発明の抗体は、
（Ａ）配列番号７０に記載のアミノ酸配列を含むＶＨと、配列番号１７に記載のアミノ酸配列を含む重鎖定常領域とを有する重鎖、および
（Ｂ）配列番号１６に記載のアミノ酸配列を含むＶＬと、配列番号１８に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖定常領域とを有する軽鎖を含む。
一実施形態では、本発明の抗体は、
（Ａ）配列番号８４に記載のアミノ酸配列を含むＶＨと、配列番号１７に記載のアミノ酸配列を含む重鎖定常領域とを有する重鎖、および
（Ｂ）配列番号１６に記載のアミノ酸配列を含むＶＬと、配列番号１８に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖定常領域とを有する軽鎖を含む。
一実施形態では、本発明の抗体は、
（Ａ）配列番号８８に記載のアミノ酸配列を含むＶＨと、配列番号１７に記載のアミノ酸配列を含む重鎖定常領域とを有する重鎖、および
（Ｂ）配列番号１６に記載のアミノ酸配列を含むＶＬと、配列番号１８に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖定常領域とを有する軽鎖を含む。
一実施形態では、本発明の抗体は、
（Ａ）配列番号４０に記載のアミノ酸配列を含むＶＨと、配列番号１７に記載のアミノ酸配列を含む重鎖定常領域とを有する重鎖、および
（Ｂ）配列番号１６に記載のアミノ酸配列を含むＶＬと、配列番号１８に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖定常領域とを有する軽鎖を含む。
一実施形態では、本発明の抗体は、
（Ａ）配列番号８３に記載のアミノ酸配列を含むＶＨと、配列番号１７に記載のアミノ酸配列を含む重鎖定常領域とを有する重鎖、および
（Ｂ）配列番号１６に記載のアミノ酸配列を含むＶＬと、配列番号１８に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖定常領域とを有する軽鎖を含む。
一実施形態では、本発明の抗体は、
（Ａ）配列番号７８に記載のアミノ酸配列を含むＶＨと、配列番号１７に記載のアミノ酸配列を含む重鎖定常領域とを有する重鎖、および
（Ｂ）配列番号１６に記載のアミノ酸配列を含むＶＬと、配列番号１８に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖定常領域とを有する軽鎖を含む。
一実施形態では、本発明の抗体は、
（Ａ）配列番号４７に記載のアミノ酸配列を含むＶＨと、配列番号１７に記載のアミノ酸配列を含む重鎖定常領域とを有する重鎖、および
（Ｂ）配列番号１６に記載のアミノ酸配列を含むＶＬと、配列番号１８に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖定常領域とを有する軽鎖を含む。
一実施形態では、本発明の抗体は、
（Ａ）配列番号７６に記載のアミノ酸配列を含むＶＨと、配列番号１７に記載のアミノ酸配列を含む重鎖定常領域とを有する重鎖、および
（Ｂ）配列番号１６に記載のアミノ酸配列を含むＶＬと、配列番号１８に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖定常領域とを有する軽鎖を含む。
本発明は、ヒトＴＧＦ－βＲＩＩに特異的に結合する結合ドメインであって、
以下から選択される重鎖可変領域（ＶＨ）：
（Ａ）ＶＨ－ＣＤＲ１、ＶＨ－ＣＤＲ２、およびＶＨ－ＣＤＲ３を有するＶＨであって、配列番号１２に記載のアミノ酸配列を有する、ＶＨ、
（Ｂ）ＶＨ－ＣＤＲ１、ＶＨ－ＣＤＲ２、およびＶＨ－ＣＤＲ３を有するＶＨであって、配列番号２６に記載のアミノ酸配列を有する、ＶＨ、
（Ｃ）ＶＨ－ＣＤＲ１、ＶＨ－ＣＤＲ２、およびＶＨ－ＣＤＲ３を有するＶＨであって、配列番号３０に記載のアミノ酸配列を有する、ＶＨ、
（Ｄ）ＶＨ－ＣＤＲ１、ＶＨ－ＣＤＲ２、およびＶＨ－ＣＤＲ３を有するＶＨであって、配列番号４０に記載のアミノ酸配列を有する、ＶＨ、
（Ｅ）ＶＨ－ＣＤＲ１、ＶＨ－ＣＤＲ２、およびＶＨ－ＣＤＲ３を有するＶＨであって、配列番号６１に記載のアミノ酸配列を有する、ＶＨ、
（Ｆ）ＶＨ－ＣＤＲ１、ＶＨ－ＣＤＲ２、およびＶＨ－ＣＤＲ３を有するＶＨであって、配列番号６５に記載のアミノ酸配列を有する、ＶＨ、
（Ｇ）ＶＨ－ＣＤＲ１、ＶＨ－ＣＤＲ２、およびＶＨ－ＣＤＲ３を有するＶＨであって、配列番号７０に記載のアミノ酸配列を有する、ＶＨ、
（Ｈ）ＶＨ－ＣＤＲ１、ＶＨ－ＣＤＲ２、およびＶＨ－ＣＤＲ３を有するＶＨであって、配列番号７６に記載のアミノ酸配列を有する、ＶＨ、
（Ｉ）ＶＨ－ＣＤＲ１、ＶＨ－ＣＤＲ２、およびＶＨ－ＣＤＲ３を有するＶＨであって、配列番号８５に記載のアミノ酸配列を有する、ＶＨ、および
（Ｊ）ＶＨ－ＣＤＲ１、ＶＨ－ＣＤＲ２、およびＶＨ－ＣＤＲ３を有するＶＨであって、配列番号８６に記載のアミノ酸配列を有する、ＶＨのうちのいずれか１つを含み、
ここで、１～５個のアミノ酸残基が、ＶＨ－ＣＤＲ１、ＶＨ－ＣＤＲ２、およびＶＨ－ＣＤＲ３から選択されるＣＤＲのうちのいずれか１つ以上内のその保存的アミノ酸で置換されてもよい、結合ドメインをさらに提供する。
これらのＶＨ－ＣＤＲ１、ＶＨ－ＣＤＲ２、およびＶＨ－ＣＤＲ３配列は、本明細書に提供される配列表では、太字で示され、下線が引かれている。
一実施形態では、本発明の結合ドメインは、配列番号１２、２６、３０、４０、６１、６５、７０、７６、８５、および８６から選択されるＶＨアミノ酸配列、またはそれと少なくとも８０％の同一性を有するＶＨアミノ酸配列を含む。
本発明の結合ドメインは、一価および多価形態で有用であることが示されており、一価分子または二価分子で、または多重特異性分子に組み込まれる１つ以上の結合ドメインとして様々な用途を提供する。一価形態での当該結合ドメインは、一価対照抗体と比較して優れたＴＧＦ－βＲＩＩ遮断能力を有し、それらを上記の用途に好適なものにする。
ある特定の実施形態では、本発明は、一価形態での本発明の結合ドメインを含む抗体、好ましくは多重特異性抗体を提供し、この抗体は、好ましくは同じアッセイで測定される、二価単一特異性対照抗体と比較して等モル濃度で同等の受容体遮断活性を有する。ある特定の実施形態では、対照抗体は、配列番号９７に記載のアミノ酸配列を有する２つの重鎖可変領域と、配列番号１３５に記載のアミノ酸配列を有する２つの軽鎖可変領域とを含む。ある特定の実施形態では、アッセイは、ＴＧＦβ－レポーターアッセイ、好ましくは、実施例５に記載のＴＧＦβ－レポーターアッセイである。ある特定の実施形態では、同等の受容体遮断活性は、対照抗体の受容体遮断活性からの５～２倍、好ましくは３倍偏差を含む。
本明細書に記載され、かつ特許請求される抗体および結合ドメイン、例えば、上記の実施形態に記載の抗体および結合ドメインなどは、好ましくは、単離された抗体または結合ドメインである。好ましくは、それらは、モノクローナル抗体である。より好ましくは、それらは、単離されたモノクローナル抗体である。
本発明の抗体もしくは抗体断片、または結合ドメインは、リガンドＴＧＦ－β１、ＴＧＦ－β２、および／またはＴＧＦ－β３のＴＧＦ－βＲＩＩへの結合を妨害する。「結合を妨害する」という用語は、抗体または抗体断片がＴＧＦ－βＲＩＩ上のエピトープに指向され、ＴＧＦ－βＲＩＩへの結合についてＴＧＢ－β１、ＴＧＢ－β２、および／またはＴＧＢ－β３と競合することを意味する。本抗体もしくは抗体断片、または本結合ドメインは、リガンド結合を弱め、これがＴＧＦ－βＲＩＩにすでに結合している場合、リガンド結合を置換してもよく、または、例えば、立体障害により、リガンドがＴＧＦ－βＲＩＩに結合することを少なくとも部分的に防止し、かつ／またはＴＧＦ－βＲＩ－ＴＧＦ－βＲＩＩ複合体形成を妨害もしくは防止してもよい。本抗体もしくは抗体断片、または本結合ドメインは、ＴＧＦ－βＲＩとＴＧＦ－βＲＩＩとの複合体の形成を弱め、複合体がすでに形成された場合、かかる複合体を置換してもよく、または、例えば、立体障害により、ＴＧＦ－βＲＩがＴＧＦ－βＲＩＩと複合体形成することを少なくとも部分的に防止してもよい。「結合を妨害する」という用語は、本発明の抗体もしくは抗体断片、または結合ドメインが、リガンドＴＧＦ－β１、ＴＧＦ－β２、および／またはＴＧＦ－β３のＴＧＦ－βＲＩＩへの結合を遮断することに意味する。
本発明は、本明細書に記載の抗体もしくは抗体断片、または結合ドメインの重鎖および軽鎖のいずれかまたは両方をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターをさらに提供する。ベクターの例には、原核宿主細胞もしくは真核宿主細胞、例えば、哺乳類細胞内で複製可能なプラスミド、ファージミド、コスミド、ウイルス、およびファージ核酸、または他の核酸分子が挙げられる。ベクターは、本発明の抗体または抗体断片の重鎖および軽鎖のいずれかまたは両方をコードするポリヌクレオチドが発現制御要素に作動可能に連結されている発現ベクターであり得る。典型的な発現ベクターは、ポリヌクレオチドの発現の調節に有用な転写および翻訳ターミネーター、開始配列、およびプロモーターを含む。
当該技術分野では、抗体を産生するための様々な方法が存在する。抗体は、典型的には、その抗体をコードする核酸を発現する細胞によって産生される。したがって、本発明は、本発明の抗体または抗体断片を産生および／または含む単離された細胞、または組織培養物中の細胞も提供する。典型的には、これは、インビトロ細胞、単離された細胞、または組換え細胞である。かかる細胞は、本発明の抗体または抗体断片をコードする核酸を含む。この細胞は、好ましくは動物細胞、より好ましくは哺乳類細胞、より好ましくは霊長類細胞、最も好ましくはヒト細胞である。本発明の目的のために、好適な細胞は、本発明による抗体を含むことができ、好ましくは産生することができ、かつ／または本発明による核酸を含むことができる任意の細胞である。好ましくは、この細胞は、ハイブリドーマ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＮＳ０細胞、またはＰＥＲ．Ｃ６細胞である。細胞がＣＨＯ細胞であることが特に好ましい。
本発明による細胞を含む細胞培養物または細胞株がさらに提供される。タンパク質および抗体の工業規模産生のために開発された細胞株は、本明細書でさらに工業的細胞株と称される。
本発明は、本発明の抗体もしくは抗体断片、または結合ドメインを産生するための方法であって、本発明の細胞を培養することと、抗体もしくは抗体断片、または結合ドメインを当該培養物から採取することと、を含む、方法をさらに提供する。当該細胞は、無血清培地中で培養され得る。好ましくは、前述の細胞は、浮遊増殖に適している。本抗体もしくは抗体断片、または本結合ドメインは、培養物の培地から精製され得る。好ましくは、当該抗体もしくは抗体断片、または結合ドメインは、親和性精製される。
本発明は、本明細書に記載の抗体もしくは抗体断片、または結合ドメインと、薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤とを含む薬学的組成物をさらに提供する。
本発明の抗体または抗体断片が点滴用の注射溶液または注入溶液として使用されるように製剤化された場合、注射溶液または注入溶液は、任意の形態の水溶液、懸濁液、または乳濁液であり得るか、またはその薬剤が使用時に溶媒中に溶解するか、懸濁されるか、または乳化されるように、薬学的に許容される担体と一緒に固体薬剤として製剤化され得る。点滴用の注射溶液または注入溶液に使用される溶媒の例には、注射用蒸留水、生理食塩水、グルコース溶液、および等張溶液（例えば、その中で、塩化ナトリウム、塩化カリウム、グリセリン、マンニトール、ソルビトール、ホウ酸、ホウ砂、プロピレングリコールなどが可溶性である）が挙げられる。
薬学的に許容される担体の例には、安定剤、可溶化剤、懸濁剤、乳化剤、鎮静剤、緩衝剤、防腐剤、消毒剤、ｐＨ調整剤、および抗酸化剤が挙げられる。安定剤として、様々なアミノ酸、アルブミン、グロブリン、ゼラチン、マンニトール、グルコース、デキストラン、エチレングリコール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、アスコルビン酸、亜硫酸水素ナトリウム、チオ硫酸ナトリウム、エデト酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、ジブチルヒドロキシトルエンなどを使用することができる。可溶化剤として、アルコール（例えば、エタノール）、ポリオール（例えば、プロピレングリコールおよびポリエチレングリコール）、非イオン性界面活性剤（例えば、Ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ ２０（登録商標）、Ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ ８０（登録商標）、およびＨＣＯ－５０）などを使用することができる。懸濁剤として、モノステアリン酸グリセリン、モノステアリン酸アルミニウム、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ラウリル硫酸ナトリウムなどを使用することができる。乳化剤として、アラビアガム、アルギン酸ナトリウム、トラガカントなどを使用することができる。鎮静剤として、ベンジルアルコール、クロロブタノール、ソルビトールなどを使用することができる。緩衝剤として、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、炭酸緩衝液、クエン酸緩衝液、トリス緩衝液、グルタミン酸緩衝液、イプシロンアミノカプロン酸緩衝液などを使用することができる。防腐剤として、パラヒドロキシ安息香酸メチル、パラヒドロキシ安息香酸エチル、パラヒドロキシ安息香酸プロピル、パラヒドロキシ安息香酸ブチル、クロロブタノール、ベンジルアルコール、塩化ベンザルコニウム、デヒドロ酢酸ナトリウム、エデト酸ナトリウム、ホウ酸、ホウ砂などを使用することができる。消毒剤として、塩化ベンザルコニウム、パラヒドロキシ安息香酸、クロロブタノールなどを使用することができる。ｐＨ調整剤として、塩酸、水酸化ナトリウム、リン酸、酢酸などを使用することができる。抗酸化剤として、（１）アスコルビン酸、塩酸システイン、重硫酸ナトリウム、重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウムなどの水性抗酸化剤、（２）パルミチン酸アスコルビル、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエン、レシチン、没食子酸プロピル、およびα－トコフェロールなどの油溶性抗酸化剤、または（３）クエン酸、エチレンジアミン四酢酸、ソルビトール、酒石酸、およびリン酸などの金属キレート剤を使用することができる。
点滴用の注入溶液または注入溶液は、最終プロセスで滅菌、または無菌操作、例えば、フィルターでの濾過による滅菌を行い、その後、無菌容器に充填することによって生産することができる。点滴用の注射溶液または注入溶液は、使用時に真空乾燥または凍結乾燥した無菌粉末（薬学的に許容される担体粉末を含み得る）を適切な溶媒中に溶解させることによって使用され得る。
本発明は、対象におけるがんを治療する方法であって、それを必要とする対象に、本明細書に記載の抗体もしくは抗体断片、結合ドメイン、または薬学的組成物の有効量を投与することを含む、方法をさらに提供する。したがって、本発明は、対象におけるがんの治療に使用するための、本明細書に記載の抗体もしくは抗体断片、または結合ドメインを提供する。本発明は、がんを予防する、がんの症状進行もしくは再発を抑制する、および／またはがんを治療するための医薬品であって、本明細書に記載の抗体もしくはその抗体断片、または結合ドメインを活性成分として含む、医薬品をさらに提供する。
がん患者は、通常、体から除去される異常細胞を有する。本明細書で使用される「異常細胞」という用語には、腫瘍細胞、より具体的には、正常ＴＧＦ－βＲＩＩ発現よりも高い発現と相関するがん型に関連する任意の種類のがん性組織上に存在する腫瘍細胞が含まれる。異常細胞とは、本明細書では、増加したＴＧＦ－β発現および／もしくはＴＧＦ－β放出の結果としてシグナル伝達が増加した細胞、ならびに異常ＴＧＦ－βシグナル伝達および／もしくは発現、または正常よりも高いＴＧＦ－β、ＴＧＦ－βＲＩ、および／もしくはＴＧＦ－βＲＩＩ発現、ならびに／または正常よりも高い潜在性ＴＧＦ－βの放出に起因して腫瘍免疫の有効性を低下させる抑制環境を形成する細胞をさらに指す。
本発明の抗体もしくは抗体断片、または結合ドメインは、例えば、正常よりも高いＴＧＦ－βシグナル伝達、具体的には、正常よりも高いＴＧＦ－βＲＩＩ発現と相関するがん型を含む、いくつかのがん型の治療に有効であろう。例には、乳がん、結腸がん、結腸直腸がん、胃がん、神経膠芽腫、頸部がん、肝細胞がん、非小細胞肺がん、小細胞肺がん、黒色腫、骨髄異形成症候群、膵臓がん、前立腺がん、および腎臓がんが挙げられるが、これらに限定されない。
本発明の抗体もしくは抗体断片、または結合ドメインは、細胞のヒトＴＧＦ－βのヒトＴＧＦ－βＲＩＩへの結合を遮断し、それにより、ＴＧＦ－βＲＩＩシグナル伝達を阻害する。これにより、有害もしくは異常細胞の増殖の減少、ならびに／または腫瘍免疫および他の有益な効果の増強がもたらされる。
したがって、本発明は、細胞のヒトＴＧＦ－βのヒトＴＧＦ－βＲＩＩへの結合を遮断する方法であって、細胞に、本明細書に記載の抗体もしくは抗体断片、または結合ドメインを提供することと、抗体または抗体断片が細胞のヒトＴＧＦ－βＲＩＩに結合することを可能にし、それにより、細胞のヒトＴＧＦ－βのヒトＴＧＦ－βＲＩＩへの結合を遮断することと、を含む、方法も提供する。これは、インビトロ法であり得る。
所望の活性に応じて、本発明の抗体は、調節されたエフェクター機能を有し得る。抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）は、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性とも称され、細胞媒介性免疫防御機構であり、それにより、免疫系のエフェクター細胞が、膜表面抗原が特定の抗体によって結合された標的細胞を能動的に溶解する。ＡＤＣＣエフェクター機能は、典型的には、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）によって媒介される。これらの受容体は、抗体媒介性（体液性）免疫応答を細胞エフェクター機能に接続する主要な免疫調節受容体である。ＦｃγＲ（ＩｇＧ）、ＦｃεＲＩ（ＩｇＥ）、ＦｃαＲＩ（ＩｇＡ）、ＦｃμＲ（ＩｇＭ）、およびＦｃδＲ（ＩｇＤ）を含む全てのクラスの免疫グロブリンの受容体が特定されている。白血球上に見られるヒトＩｇＧの３つのクラスの受容体：ＣＤ６４（ＦｃγＲＩ）、ＣＤ３２（ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ、およびＦｃγＲＩＩｃ）、およびＣＤ１６（ＦｃγＲＩＩＩａおよびＦｃγＲＩＩＩｂ）が存在する。ＦｃγＲＩが高親和性受容体（ナノモル範囲のＫＤ）に分類される一方で、ＦｃγＲＩＩおよびＦｃγＲＩＩＩは、低～中間親和性（マイクロモル範囲のＫＤ）である。抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）では、エフェクター細胞（ナチュラルキラー細胞、マクロファージ、単球、および好酸球）の表面上のＦｃｖＲは、それ自体が標的細胞に結合するＩｇＧのＦｃ領域に結合する。結合時、標的細胞の破壊を媒介する溶解酵素、パーフォリン、グランザイム、および腫瘍壊死因子などの様々な物質の分泌をもたらすシグナル伝達経路が引き起こされる。ＡＤＣＣエフェクター機能のレベルは、ヒトＩｇＧサブタイプによって異なる。これは、簡単に言えば、アロタイプおよび特定のＦｃｖＲに依存するが、ＡＤＣＣエフェクター機能は、ヒトＩｇＧ１およびＩｇＧ３では高く、ＩｇＧ２およびＩｇＧ４では低い。ＦｃｖＲの結合部位が抗体上に存在するという知識により、ＡＤＣＣエフェクター機能を有しない操作された抗体がもたらされた。
エフェクター機能の別のタイプは、エフェクター細胞に依存せず、補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）と称される。これは、ＩｇＧおよびＩｇＭ抗体のエフェクター機能である。治療抗体または抗体断片が抗腫瘍効果を達成することができる別の作用機序である。ＣＤＣは、古典的な補体経路の開始成分であるＣ１ｑが標的結合抗体のＦｃ部分に固定されたときに開始される。これは、最終的に抗体標識細胞の溶解をもたらすことができる複合体補体活性化カスケードの第１のステップである。
本発明の抗体では、ＡＤＣＣ活性は、定常領域をわずかに修飾することにより、異なる技法によって増強することができ、それらのうちの１つは、フコースの除去である。フコースの除去により、いくつかのインビボモデルに抗腫瘍活性の増加がもたらされた（Ｊｕｎｔｔｉｌａ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２０１０），Ｖｏｌ．７０（２２），ｐｐ．４４８１－４４８９）。アフコシル化技術を適用してもよく、それにより、Ｆｃ領域内のＮ結合炭水化物構造のフコシル化を防止する。
本発明の抗体では、エフェクター機能を低下させるまたは排除することができる。例えば、ＥＵ番号付けシステムによる２３５位のロイシンがグリシンで置換され得、および／またはＥＵ番号付けシステムによる２３６位のグリシンがアルギニンで置換され得る。かかる修飾は、Ｆｃ受容体および／またはエフェクター機能への結合が排除または低減されることを確実にする。同じ趣旨で当該技術分野で既知の他の置換、欠失、または挿入も本発明に包含される。
本発明は、細胞のヒトＴＧＦ－βのヒトＴＧＦ－βＲＩＩへの結合によって誘導される細胞へのシグナル伝達を阻害する方法であって、細胞に、本明細書に記載の抗体もしくは抗体断片、または結合ドメインを提供することと、抗体または抗体断片が細胞のヒトＴＧＦ－βＲＩＩに結合することを可能にし、それにより、細胞へのシグナル伝達を阻害することと、を含む、方法をさらに提供する。これは、インビトロ法であり得る。
本発明は、転移を予防または抑制する方法であって、対象に、本明細書に記載の抗体もしくは抗体断片、結合ドメイン、または薬学的組成物の有効量を投与することを含む、方法も提供する。
本発明の抗体もしくは抗体断片、または結合ドメインは、単剤療法としてがんの治療に使用され得るが、他の抗がん剤と組み合わせられる場合もある。他の抗がん剤には、同じまたは異なる腫瘍抗原を標的とするか、または免疫系の要素を調節する治療抗体、化学療法で使用される薬剤（例えば、シクロホスファミド）、およびホルモン療法または腫瘍溶解性ウイルスを含む局所投与に関連する用途で使用される薬剤が含まれるが、これらに限定されない。本発明の抗体もしくは抗体断片、または結合ドメインでの治療は、例えば、手術または放射線療法などの他の抗がん治療と組み合わせられる場合もある。治療の組み合わせは、同時、別個、または順次であり得る。
本明細書および添付の特許請求の範囲を通して、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、および「有する（ｈａｖｉｎｇ）」という単語、ならびに「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、および「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」などの変形は、包括的に解釈されるものとする。すなわち、これらの単語は、内容が許容する場合、具体的に列挙されていない他の要素または整数の可能な包含を伝えることを意図している。
冠詞「ａ」および「ａｎ」は、冠詞の１つまたは１つより多く（すなわち、１つまたは少なくとも１つ）の文法的目的語を指すために本明細書で使用される。例として、「要素（ａｎ ｅｌｅｍｅｎｔ）」は、１つの要素または１つより多くの要素を意味し得る。
「複数」とは、２つ以上を意味する。
本明細書では、別途記載されない限り、抗体または抗体断片の可変領域内のＣＤＲおよびフレームワークに割り当てられたアミノ酸位置がＫａｂａｔ番号付けにより指定されていることに留意されたい（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．，１９８７ ａｎｄ １９９１）を参照されたい）。定常領域内のアミノ酸は、Ｋａｂａｔのアミノ酸位置に基づくＥＵ番号付けシステムにより示される（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｔｅｒｅｓｔ，ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．９１－３２４２を参照されたい）。
受入番号は、主に、標的のさらなる特定方法を提供するために与えられ、結合されたタンパク質の実際の配列は、例えば、いくつかのがんなどに生じる変異などのコード遺伝子の変異のため、変化し得る。抗原結合部位は、抗原およびその様々なバリアント、例えば、いくつかの抗原陽性免疫細胞または腫瘍細胞によって発現されるものに結合する。
本明細書で遺伝子、タンパク質について言及される場合、好ましくは、その遺伝子またはタンパク質のヒト形態について言及される。本明細書で遺伝子またはタンパク質について言及される場合、天然遺伝子またはタンパク質、ならびに腫瘍、がんなどで検出することができる、好ましくは、ヒト腫瘍、がんなどで検出することができるその遺伝子またはタンパク質のバリアントについて言及される。
ＨＧＮＣは、ＨＵＧＯ Ｇｅｎｅ命名委員会の略である。略語の後の数字は、遺伝子および遺伝子によってコードされるタンパク質に関する情報をＨＧＮＣデータベースから読み出すことができる受入番号である。Ｅｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅは、遺伝子または遺伝子によってコードされるタンパク質に関する情報をＮＣＢＩ（全米バイオテクノロジー情報センター）データベースから読み出すことができる受入番号または遺伝子ＩＤを提供する。Ｅｎｓｅｍｂｌｅは、遺伝子または遺伝子によってコードされるタンパク質に関する情報をＥｎｓｅｍｂｌｅデータベースから得ることができる受入番号を提供する。Ｅｎｓｅｍｂｌは、選択された真核生物ゲノムに関する自動注釈を生成して維持するソフトウェアシステムを開発するためのＥＭＢＬ－ＥＢＩとＷｅｌｌｃｏｍｅ Ｔｒｕｓｔ Ｓａｎｇｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅとの共同プロジェクトである。
ＩＧＫＶ１－３９軽鎖可変Ｖ領域（図１Ａ）、ＩＧＫＶ１－３９／ｊｋ１軽鎖可変領域（図１Ｂ）、およびＩＧＫＶ１－３９／ｊｋ５軽鎖可変領域（図１Ｃ）のアミノ酸配列を提示する。 ＣＣＤ１８Ｃｏ細胞上で内因的に発現されたＴＧＦ－βＲＩＩへの抗体結合のＦＡＣＳデータを示す。図２Ａは、配列番号９２（陰性対照）、配列番号９３、および配列番号９４を有する重鎖可変領域を含む抗体のＭＦＩ ＰＥを示す。図２Ｂは、配列番号９２（陰性対照）、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号９５、および配列番号９６を有する重鎖可変領域を含む抗体のＭＦＩ ＰＥを示す。 配列番号９２（陰性対照）、配列番号９３、および配列番号９４を有する重鎖可変領域を含む抗体（図３Ａ）、ならびに配列番号９２（陰性対照）、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号９５、および配列番号９６を有する重鎖可変領域を含む抗体（図３Ｂ）のリガンド遮断活性のＥＬＩＳＡデータを提示する。 配列番号１０（中央アライメント）、配列番号１１（下部アライメント）、および配列番号１２（上部アライメント）を有する重鎖可変領域を含む重鎖のＶｅｃｔｏｒ ＮＴＩ Ｐｒｏｇｒａｍ Ａｄｖａｎｃｅ １１．５．２ソフトウェアのＡｌｉｇｎＸアプリケーションを使用して生成したアミノ酸配列アライメントを、それらのそれぞれの親和性成熟バリアントとともに提示する。同一のアミノ酸を白色の背景に対して黒色の文字で示し、わずかに類似したアミノ酸を灰色の背景に対して白色の文字で示し、保存的変化を灰色の背景に対して黒色の文字で示し、類似していないアミノ酸を濃灰色の背景に対して白色の文字で示す。 親抗体（配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２）および親和性成熟バリアント（配列番号１０バリアント、配列番号１１バリアント、配列番号１２バリアント）の結合親和性を示す。ｋａは、１／ミリ秒でのオン速度であり、ｋｄは、１／秒でのオフ速度である。 親和性成熟バリアントのルシフェラーゼレポーターアッセイからのデータを示す。Ｘ軸は、抗体の濃度（μｇ／ｍＬ）を示す。Ｙ軸は、ＴＧＦ－βシグナル伝達阻害の尺度としてＳｍａｄ複合体の誘導倍率を示す。グラフＡ～Ｋは各々、親和性成熟バリアントの活性を対照抗体（配列番号９７）と比較する。基礎ＴＧＦ－βを細胞のＴＧＦ－β刺激の対照として含める。 アラニンスキャニングからのデータを示す。図７Ａは、必須残基がどのように特定されてマッピングされるかの概要を提示する。図７Ｂは、野生型と比較した配列番号１０、配列番号１２、および配列番号９３の平均蛍光をパーセンテージで示す。図７Ｃは、野生型と比較した配列番号１０、配列番号１２、配列番号９３、および配列番号９８（対照）の結合反応性をパーセンテージで示す表である。結合のための必須残基を長方形で囲んで示す。図７Ｄは、ＴＧＦβＲＩＩ上の必須残基のマッピングを示す。 ＴＧＦ－βレポーターアッセイにおける本発明のＴＧＦ－βＲＩＩ結合ドメインを含む様々な二重特異性抗体のスクリーニングからの結果を示す。Ｘ軸は、抗体の濃度（μｇ／ｍＬ）を示す。Ｙ軸は、Ｓｍａｄシグナル伝達の誘導倍率を示す。グラフＡ～Ｅは各々、単一のＴＧＦ－βＲＩＩ結合ドメインを含む二重特異性抗体の活性を、実施例１に記載されるように、ＴＧＦ－βＲＩＩ（＋）へのリガンド結合を遮断することで知られている陽性対照抗体と比較する。基礎ＴＧＦ－βを細胞のＴＧＦ－β刺激の対照として含める。 Ａ）Δは、配列番号７６に記載のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含むＴＧＦ－βＲＩＩ結合ドメインであり、□は、配列番号６１に記載のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含むＴＧＦ－βＲＩＩ結合ドメインであり、●は、配列番号２６に記載のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含むＴＧＦ－βＲＩＩ結合ドメインである。 Ｂ）○は、配列番号７０に記載のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含むＴＧＦ－βＲＩＩ結合ドメインであり、＊は、配列番号７０に記載のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含むＴＧＦ－βＲＩＩ結合ドメインであり、□は、配列番号６１に記載のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含むＴＧＦ－βＲＩＩ結合ドメインであり、●は、配列番号８６に記載のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含むＴＧＦ－βＲＩＩ結合ドメインであり、Δは、配列番号６５に記載のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含むＴＧＦ－βＲＩＩ結合ドメインである。 Ｃ）＊は、配列番号６５に記載のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含むＴＧＦ－βＲＩＩ結合ドメインであり、○は、配列番号４０に記載のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含むＴＧＦ－βＲＩＩ結合ドメインであり、●は、配列番号１２に記載のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含むＴＧＦ－βＲＩＩ結合ドメインであり、□は、配列番号７６に記載のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含むＴＧＦ－βＲＩＩ結合ドメインであり、Δは、配列番号２６に記載のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含むＴＧＦ－βＲＩＩ結合ドメインである。 Ｄ）●は、配列番号１２に記載のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含むＴＧＦ－βＲＩＩ結合ドメインであり、□は、配列番号８５に記載のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含むＴＧＦ－βＲＩＩ結合ドメインである。 Ｅ）●は、配列番号８６に記載のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含むＴＧＦ－βＲＩＩ結合ドメインである。
以下の実施例は、本発明を例証するものであって、いかなる方法によっても本発明を限定するようには意図されていない。
実施例１－抗体の産生
共通ＩＧＫＶ１－３９軽鎖を含むトランスジェニックマウス（ＭｅＭｏ（登録商標）マウス）をヒトＴＧＦ－βＲＩＩ（アイソフォームＡ）で免疫し、それにより、ヒト抗ＴＧＦ－βＲＩＩ特異的抗体の産生を含む免疫応答を生成した。免疫マウスのリンパ系物質を収集し、それから核酸を抽出し、かかる抗体の重鎖可変領域をコードするｃＤＮＡの合成に使用した。ｃＤＮＡを使用してファージディスプレイライブラリを生成し、Ｋｉｎｇｆｉｓｈｅｒ選択ロボットを使用してそれからヒトＴＧＦ－βＲＩＩ結合Ｆａｂを選択した。
異なる濃度のビオチン化組換えタンパク質を有する２ラウンドの親和性駆動選択を、Ｋｉｎｇｆｉｓｈｅｒロボットを使用して行った。ヒトＴＧＦ－βＲＩＩ－Ｆｃを、製造業者のプロトコルに従ってＥＺ－Ｌｉｎｋ（商標）Ｓｕｌｆｏ－ＮＨＳ－Ｂｉｏｔｉｎキット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、カタログ番号２１２１７）を用いてビオチン化し、等量ずつに分割し、さらに使用するまで－２０℃で保管した。その後の２ラウンドの溶液中選択を、Ｋｉｎｇｆｉｓｈｅｒロボットを使用してビオチン化ヒトＴＧＦ－βＲＩＩ－Ｆｃを用いて行った。第１の選択ラウンドでは、３つの異なる濃度のタンパク質を使用した。陰性対照として、抗原を含まない選択を含めた。全てのファージライブラリインキュベーション中に５０μｇ／ｍＬの総ヒトＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号１４５６）を溶液中に添加して、Ｆｃ結合剤の選択を最小限に抑えた。洗浄後、結合したファージをトリプシンで溶出させた。ファージ出力をスポット法に従って決定し、ここで、ＴＧ１細胞を感染させ、ＬＢ－Ａｍｐ／Ｇｌｕ寒天プレート上にプレーティングし、スクリーニングのために単一コロニーを採取した。第１のラウンドからの出力を用いて第２の選択ラウンドを行った。第２の選択ラウンドでは、ＴＧＦ－βＲＩＩ－Ｆｃ－ビオチンを、それぞれの第１の選択ラウンド出力に使用した濃度から始めて減少したタンパク質量で使用した。
コロニーを９６ウェルプレートに採取して、可溶性Ｆａｂを含有するペリプラズム抽出物を調製した。得られたＦａｂ含有画分を、ＦＡＣＳを使用したＴＧＦ－βＲＩＩ特異的クローンの特定に使用した。
ヒトＴＧＦ－βＲＩＩを一過的にトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞をＦＡＣＳスクリーニングに使用した。Ｆａｂ最終濃度は０．５～５μｇ／ｍＬであった。ＴＧＦ－βＲＩＩに結合するＦａｂを、ヤギ抗カッパ軽鎖抗体（Ａｂ０６４６、５μｇ／ｍＬ）、その後、ウサギ抗ヤギＰＥ（Ａｂ０３３０、１／１００希釈）で検出した。
２ラウンドの免疫を行い、さらなる特徴付けのためのＦａｂの大パネルを得た。第２の免疫ラウンドでは、異なるベクターを使用して発現レベルを増加させ、マウスをヒトＴＧＦ－βＲＩで共免疫した。これは、第２の免疫ラウンド中に観察されたマウスに生成されたより高い免疫応答に寄与した可能性がある。
ＵＳ２０１０／０１１９５１６から得た情報に基づいて、陽性対照抗体を産生した。この陽性対照抗体は、それに記載されているｍＡｂ ＴＧＦ１のアミノ酸配列（それぞれ、配列番号９７および配列番号１３５）を有する２つの重鎖可変領域および２つの軽鎖可変領域を含む。これらの重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む抗体は、ＴＧＦ－βＲＩＩへのリガンド結合を遮断することが報告されている。
ＲＳＶに対する陰性対照抗体を産生した。この陰性対照抗体は、配列番号１３６に記載のアミノ酸配列を有する２つの重鎖可変領域と、配列番号１６に記載の２つの軽鎖可変領域とを含む。
実施例２－抗体の特徴付け
実施例１で特定したＴＧＦ－βＲＩＩ結合ＦａｂのＶＨ断片をＩｇＧ発現形式に再クローニングして、ＩｇＧを発現させ、２９３Ｔフリースタイル細胞から精製した。
抗原結合
抗体を、ＦＡＣＳを使用してＣＣＤ１８Ｃｏ細胞上で内因的に発現されたヒトＴＧＦ－βＲＩＩへの結合についてスクリーニングした。結果を図２に示す。試験した全ての抗体は、ＣＣＤ１８Ｃｏ細胞に対して同様の結合を示した。
第１の免疫ラウンドから得られた配列番号１１に記載のアミノ酸を有する重鎖可変領域を含むＦａｂは、第２の免疫ラウンドから得られたＦａｂと同じＨＣＤＲ３配列、例えば、配列番号９３に記載のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含むＦａｂを含む。これは、マウスにおけるＶＤＪ遺伝子セグメントの組換えがこの抗原に応答してほぼ同じであることを示す。
結合親和性
配列番号１０、配列番号１１、配列番号９３、および配列番号１２に記載のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含む抗体の結合親和性をＳＰＲによって決定した。このために、抗体を、ＴＧＦβＲＩＩに対する二価ＩｇＧの単一特異性として再フォーマットした。
抗ＴＧＦ－βＲＩＩ ＩｇＧ抗体を、固定化抗ＣＨ１抗体（Ａｂ０６６９、ＢＤカタログ番号ＢＤ５５５７８４）を用いてＣＭ５センサーチップ表面上に捕捉し、その後、ヒト組換えＴＧＦ－βＲＩＩ（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓカタログ番号２４１－Ｒ２／ＣＦ、領域Ｉｌｅ２４－Ａｐｓ１９５）を添加した。測定を２５℃で行った。カップリングをｐＨ４．５で行った。結果を表２に示す。
Figure 2023508202000002
リガンド遮断
ＩｇＧ試料のリガンド遮断活性を、ＥＬＩＳＡアッセイを使用して決定した。
ＥＬＩＳＡプレートに０．４μｇ／ｍＬのＴＧＦ－β１をコーティングした。ヒトＴＧＦ－βＲＩＩ－Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ、カタログ番号３４１－ＢＲ）を０．０１μｇ／ｍＬの終濃度で添加した。抗体を、１０μｇ／ｍＬの最終濃度から始めて３倍濃度範囲でインキュベートした。配列番号９２に記載のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含む破傷風トキソイドに特異的に結合する抗体を対照として含めた。ヒトＴＧＦ－βＲＩＩ－Ｆｃに結合する抗体を、ビオチンコンジュゲート抗ヒトＦｃ抗体（１：１０．０００）およびストレプトアビジン－ＨＲＰ（１：２０００）で検出した。
図３に示されるように、試験した全ての抗体は、対照抗体と比較して良好なリガンド遮断活性を示す。選択された抗体のＩＣ５０値を表３に提示する。
Figure 2023508202000003
実施例３－親和性成熟
ＴＧＦ－βＲＩＩに特異的に結合し、かつＴＧＦ－βＲＩＩとのリガンド相互作用およびＴＧＦ－βＲＩＩとＴＧＦ－βＲＩとのヘテロ二量体化を遮断する配列番号１０、配列番号１１、および配列番号１２に記載のアミノ酸配列を有する可変重鎖領域を含むバリアント重鎖のＦａｂファージディスプレイライブラリを生成して、より高い親和性を有する抗体が産生され得るかを評価した。このライブラリを、増加した親和性を有する重鎖可変領域を生成し、かつ典型的には３～４つの変異、すなわち、ＣＤＲ１に１つ、ＣＤＲ２に１つ、およびＣＤＲ３に１つまたは２つの変異を有し、ある特定の数の変異が全体的に４つを超える変異を有するように設計した。これらのバリアントの概要を図４に配列アライメントとして提供する。
より高い親和性を有するバリアントを２つの異なる選択法を使用して選択し、いずれもビオチン化ヒトＴＧＦ－βＲＩＩ－Ｆｃを抗原とし、いずれもＫｉｎｇｆｉｓｈｅｒ選択ロボットを使用した。いくつかの選択ラウンドを行った。第１の選択ラウンドは、異なる濃度のビオチン化ＴＧＦ－βＲＩＩ－Ｆｃを使用した、実施例１に記載の親和性ベースの選択を含んだ。その後、明確な濃縮を示す抗原濃度が最も低い選択からの出力のみを、２つの別個の選択法にさらに使用した。第１の選択法は、２つの追加の親和性ベースの選択ラウンドを伴うが、今回は、前の選択ラウンドで使用した最適抗原濃度と比較して低下した濃度の抗原を用いた。第２の選択法も、低下した濃度の抗原を用いたいずれも親和性ベースの２つの追加の選択ラウンドを伴い、過剰量の非ビオチン化抗原の存在下での洗浄ステップを含むオフ速度ベースも伴う。
全てのファージライブラリインキュベーション中に５０μｇ／ｍＬの総ヒトＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｉ４５０６）を溶液中に添加して、Ｆｃ結合剤の選択を最小限に抑えた。洗浄後、結合したファージをトリプシンで溶出させた。ファージ出力をスポット法に従って決定し、ここで、ＴＧ１細胞にファージ出力の連続希釈物を感染させ、ＬＢ－Ａｍｐ／Ｇｌｕ寒天プレート上にプレーティングして、翌日コロニーを計数した。
ファージ出力を細菌感染によりレスキューし、その後の選択に十分なファージを生成し、細菌コロニーを有するプレートも生成した。コロニーを抗体産生のために９６ウェルプレートに採取した。生成した抗体を、可溶性Ｆａｂを含有するペリプラズム抽出物の調製に使用した。
親和性成熟バリアントを、ＴＧＦβＲＩＩに対する二価ＩｇＧの単一特異性として再フォーマットした。ＳＰＲ分析を行い、ＴＧＦ－βＲＩＩに対するバリアントの親和性を決定した。結果を表４および図５に示す。
Figure 2023508202000004
Figure 2023508202000005
Figure 2023508202000006
バリアントのレポーターアッセイ
親和性成熟バリアントを実施例２に記載の二価ＩｇＧ形式に再フォーマットした。得られた抗体をＴＧＦ－βＲＩＩルシフェラーゼベースのレポーターアッセイに使用して、その受容体のリガンド誘導性活性化を阻害する抗体の能力を試験した。
２９３Ｆフリースタイル細胞にレポーターＣＡＧＡ１２ルシフェラーゼを一過的にトランスフェクトした。翌日、トランスフェクトした細胞をプレーティングし、抗ＴＧＦ－βＲＩＩ抗体の６点半対数連続希釈の存在下／不在下で、１ｎｇ／ｍＬのｈＴＧＦ－β１で刺激した。抗ＴＧＦ－βＲＩＩ抗体を同時に添加した。抗体の開始濃度および最高濃度は１０μｇ／ｍＬであり、最低濃度は０．０３μｇ／ｍＬであった。２９３Ｆフリースタイル細胞とｈＴＧＦ－β１と抗ＴＧＦ－βＲＩＩ抗体との混合物を、３７℃の５％ＣＯ２インキュベーター内で３時間インキュベートした。各プレート
配列番号９７を有する重鎖可変領域を含む陰性競合対照およびＴＧＦ－βを含まない１つのウェルの滴定。読み出しとして、Ｓｔｅａｄｙ－Ｇｌｏルシフェラーゼアッセイシステム検出試薬を添加し、５分間のインキュベーション後にルシフェラーゼをＥｎＶｉｓｉｏｎ上で測定した。フォールディング応答を以下のように計算した。
Figure 2023508202000007
結果を図６に示す。このデータは、バリアントのうちのいくつかが、それらの親抗体と比較して改善されたリガンド遮断活性を呈することを示す。選択された抗体のＩＣ５０値を表５に提示する。
Figure 2023508202000008
実施例４－エピトープマッピング
本明細書で生成された抗体によって結合されるエピトープの一部であるＴＧＦ－βＲＩＩの残基を特定するために、標準技法を使用してショットガン変異誘発実験を行った（Ｄａｖｉｄｓｏｎ ａｎｄ Ｄｏｒａｎｚ，２０１４）。ショットガン変異誘発アプローチにおける対照として、配列番号９８を有する重鎖可変領域を含む抗体を使用した。この抗体は、受容体へのリガンド結合を遮断することができず、全ての機能的ＴＧＦ－βＲＩＩ抗体の存在下で受容体に結合することができた。結果を図７に示す。
実施例５－ＴＧＦ－βＲＩＩ結合ドメインを含む抗体のＴＧＦ－βＲＩＩ遮断活性
ＲＳＶｘＴＧＦ－βＲＩＩおよび抗原ＡｘＴＧＦ－βＲＩＩ抗体をＴＧＦβレポーターアッセイでスクリーニングした。
本明細書に記載の一連の抗体のＶＨ領域を含むＴＧＦ－βＲＩＩに結合する第１の結合ドメインと、配列番号１３６に記載のアミノ酸配列を有するＶＨ領域を含むＲＳＶに結合する第２の結合ドメイン、またはＴＧＦ－βＲＩＩと同じ細胞上に発現する抗原（抗原Ａ）に結合する第２の結合ドメインとを含む二重特異性抗体を産生した。抗原Ａは、ＴＧＦβと反応しないか、またはＴＧＦβレポーターアッセイで試験したシグナル伝達カスケードに影響を及ぼす任意に選択された抗原である。実施例１に記載の陽性対照抗体および陰性対照抗体も含めた。
ＴＧＦβレポーターアッセイは、ＳＭＡＤ３結合配列およびＳＭＡＤ４結合配列であるＣＡＧＡボックスの１２コピーを含むＣＡＧＡ１２ルシフェラーゼベクターを使用する［Ｄｅｎｎｌｅｒ ｅｔ ａｌ，１９９８］。ＴＧＦβのＴＧＦ－βＲＩＩへの結合により、ＴＧＦ－βＲＩのリン酸化がもたらされる。ＴＧＦ－βＲＩのリン酸化は、ＳＭＡＤ２およびＳＭＡＤ３のリン酸化および活性化をもたらすシグナル伝達カスケードを開始し、その後、それらがＳＭＡＤ４と複合体を形成する。その後、ＳＭＡＤ複合体は核に移動し、核内のＳＭＡＤ結合要素（ＳＢＥ）に結合し、ＴＧＦβ／ＳＭＡＤ応答性遺伝子の転写および発現をもたらす。ＣＡＧＡ１２ルシフェラーゼレポーターを使用して、ＴＧＦβによる活性化を監視し、哺乳類細胞にレポーターをトランスフェクトした後、ＴＧＦ－βＲＩＩ遮断抗体をスクリーニングすることができる。
抗原Ａを発現するように安定してトランスフェクトした凍結保存した２９３ＦＦ細胞にＴＧＦβレポーターを一過的にトランスフェクトした。ＩｇＧを、１０μｇ／ｍＬ～１００ｐｇ／ｍＬの最終濃度で試験した。ＩｇＧを最終体積２５μＬ（４倍濃縮）で添加した。その後、２５μＬのｈＴＧＦβ１（４倍濃縮）を１ｎｇ／ｍＬの最終濃度で添加した。５０μＬのトランスフェクト細胞懸濁液（５×１０４細胞）を添加した。１００μＬのＳｔｅａｄｙ－Ｇｌｏ（商標）基質を各ウェルに添加し、５分間インキュベートした。発光をＥｎＶｉｓｉｏｎ上で測定し、Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍを使用して結果を分析した。
結果を図８に示す。ＴＧＦ－βＲＩＩに対する一価結合ドメインおよびＲＳＶに対する対照結合ドメインを含む二重特異性抗体、ならびにＴＧＦ－βＲＩＩおよび抗原Ａに対する一価結合ドメインを含む二重特異性抗体は、ＴＧＦ－βとＴＧＦ－βＲＩＩとの相互作用を遮断する。配列番号７６および７０に記載のアミノ酸配列を有するＶＨ領域を含むＴＧＦ－βＲＩＩ結合ドメインを含むＴＧＦ－βＲＩＩおよびＲＳＶを標的とする二重特異性抗体は、二価単一特異性陽性対照抗体とほぼ同等に強力である。配列番号７０、６１、８６、６５、１２、および７６に記載のアミノ酸配列を有するＶＨ領域を含むＴＧＦ－βＲＩＩ結合ドメインを含むＴＧＦ－βＲＩＩおよび抗原Ａを標的とする二重特異性抗体は、二価単一特異性陽性対照抗体よりも強力である。したがって、本開示の抗ＴＧＦ－βＲＩＩ結合ドメインは、一価形態で同程度の、同等の、かつ優れたＴＧＦ－βＲＩＩ遮断能力を示し、一価分子、二価分子、または多重特異性分子に組み込まれる１つ以上のバレンセンとして様々な用途を提供する。
重鎖可変領域の配列決定
ヒトＴＧＦ－βＲＩＩに結合し、かつそのリガンドとの相互作用を遮断すると特定された一連の抗体のＶＨ領域をコードする核酸を配列決定した。配列情報を以下に提供する。
配列
配列番号１：ＫａｂａｔによるＨＣＤＲ１
ＩＹＡＭＴ
配列番号２：ＫａｂａｔによるＨＣＤＲ２
ＶＩＳＧＳＧＧＴＴＹＹＡＤＳＶＫＧ
配列番号３：ＫａｂａｔによるＨＣＤＲ３
ＲＧＱＹＲＤＩＶＧＡＴＤＹ
配列番号４：ＫａｂａｔによるＨＣＤＲ１
ＮＡＷＭＳ
配列番号５：ＫａｂａｔによるＨＣＤＲ２
ＲＩＫＴＴＩＳＧＧＡＴＤＦＡＡＰＶＫＧ
配列番号６：ＫａｂａｔによるＨＣＤＲ３
ＤＬＲＤＹ
配列番号７：ＫａｂａｔによるＨＣＤＲ１
ＲＹＡＭＳ
配列番号８：ＫａｂａｔによるＨＣＤＲ２
ＡＩＳＡＳＧＤＲＴＨＮＴＤＳＶＫＧ
配列番号９：ＫａｂａｔによるＨＣＤＲ３
ＧＩＡＡＳＧＫＮＹＦＤＰ
配列番号１０：重鎖可変領域
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＤＩＹＡＭＴＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＶＩＳＧＳＧＧＴＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＲＧＱＹＲＤＩＶＧＡＴＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
配列番号１１：重鎖可変領域
ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＥＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＮＡＷＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＧＲＩＫＴＴＩＳＧＧＡＴＤＦＡＡＰＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＤＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＫＴＥＤＴＡＶＹＹＣＴＬＤＬＲＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
配列番号１２：重鎖可変領域
Figure 2023508202000009
 ＱＳＩＳＳＹ
配列番号１４：ＩＭＧＴによるＬＣＤＲ２
ＡＡＳ
配列番号１５：ＩＭＧＴによるＬＣＤＲ３
ＱＱＳＹＳＴＰＰＴ
配列番号１６：軽鎖可変領域
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＡＡＳＳＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＳＹＳＴＰＰＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ
配列番号１７：重鎖定常領域
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧ
配列番号１８：軽鎖定常領域
ＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
配列番号１９：ＫａｂａｔによるＬＣＤＲ１
ＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮ
配列番号２０：ＫａｂａｔによるＬＣＤＲ２
ＡＡＳＳＬＱＳ
配列番号２１：ＫａｂａｔによるＬＣＤＲ３
ＱＱＳＹＳＴＰＰＴ
配列番号２２：重鎖可変領域
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＤＩＮＡＭＴＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＶＩＳＧＳＧＧＴＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＲＧＱＹＲＤＩＶＧＡＴＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
配列番号２３：重鎖可変領域
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＤＩＱＡＭＴＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＶＩＳＧＳＧＧＴＴＹＹＡＤＳＶＱＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＲＧＱＹＲＤＩＶＧＡＴＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
配列番号２４：重鎖可変領域
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＤＩＹＲＭＴＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＶＩＳＧＳＧＧＴＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＱＧＱＹＲＥＩＶＧＡＴＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
配列番号２５：重鎖可変領域
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＹＦＤＩＹＡＭＴＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＶＩＳＧＳＧＧＴＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＲＳＱＹＲＤＫＶＧＡＴＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
配列番号２６：重鎖可変領域
Figure 2023508202000010
 ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＡＦＤＩＹＡＭＴＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＶＩＳＧＳＧＧＴＩＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＲＧＱＹＲＤＩＶＧＡＴＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
配列番号２８：重鎖可変領域
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＤＩＹＡＭＴＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＶＩＳＧＳＧＧＴＶＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＲＧＱＹＲＤＩＡＧＧＴＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
配列番号２９：重鎖可変領域
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＤＦＤＩＹＡＭＴＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＶＩＳＧＳＧＧＴＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＲＳＱＹＲＤＫＶＧＡＴＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
配列番号３０：重鎖可変領域
Figure 2023508202000011
 ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＤＩＮＡＭＴＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＶＩＳＧＳＧＧＴＴＡＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＲＧＱＹＲＹＩＡＧＡＴＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
配列番号３２：重鎖可変領域
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＤＩＴＡＭＴＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＶＩＳＧＳＧＧＴＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＲＧＱＹＲＤＩＡＧＡＴＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
配列番号３３：重鎖可変領域
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＳＦＤＩＹＡＭＴＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＶＩＳＧＳＧＧＴＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＲＡＱＹＲＤＫＶＧＡＴＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
配列番号３４：重鎖可変領域
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＤＩＹＡＭＴＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＶＩＳＧＳＧＧＴＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＲＧＱＹＲＹＶＶＧＡＴＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
配列番号３５：重鎖可変領域
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＹＦＤＩＹＡＭＴＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＶＩＳＧＳＧＧＴＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＲＧＱＹＲＨＩＡＧＡＴＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
配列番号３６：重鎖可変領域
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＲＦＤＩＹＡＭＴＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＶＩＳＧＳＧＧＴＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＲＧＱＹＲＤＩＶＧＡＴＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
配列番号３７：重鎖可変領域
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＤＩＮＡＭＴＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＶＩＳＧＳＧＡＴＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＲＧＱＹＲＥＩＱＧＡＮＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
配列番号３８：重鎖可変領域
ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＥＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＲＡＷＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＧＲＩＫＴＴＩＳＧＧＡＴＱＦＡＡＰＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＤＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＫＴＥＤＴＡＶＹＹＣＴＬＤＬＲＮＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
配列番号３９：重鎖可変領域
ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＥＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＲＡＷＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＧＲＩＫＴＴＶＳＧＧＡＴＡＦＡＡＰＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＤＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＫＴＥＤＴＡＶＹＹＣＴＬＤＬＲＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
配列番号４０：重鎖可変領域
Figure 2023508202000012
 ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＥＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＲＡＷＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＧＲＩＫＴＴＹＳＧＧＡＴＤＦＡＡＰＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＤＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＫＴＥＤＴＡＶＹＹＣＴＬＤＬＲＫＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
配列番号４２：重鎖可変領域
ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＥＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＲＡＷＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＧＲＩＫＴＴＩＳＧＧＡＴＤＦＡＡＰＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＤＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＫＴＥＤＴＡＶＹＹＣＴＬＤＬＲＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
配列番号４３：重鎖可変領域
ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＥＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＫＦＳＮＡＷＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＧＲＩＫＴＴＩＳＧＧＡＴＱＦＡＡＰＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＤＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＫＴＥＤＴＡＶＹＹＣＴＬＤＬＲＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
配列番号４４：重鎖可変領域
ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＥＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＮＡＷＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＧＲＩＫＴＴＹＳＧＧＡＴＤＦＡＡＰＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＤＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＫＴＥＤＴＡＶＹＹＣＴＬＤＬＲＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
配列番号４５：重鎖可変領域
ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＥＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＮＡＷＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＧＲＩＫＴＴＹＳＧＧＡＴＥＦＡＡＰＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＤＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＫＴＥＤＴＡＶＹＹＣＴＬＤＬＲＫＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
配列番号４６：重鎖可変領域
ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＥＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＮＹＷＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＧＲＩＫＴＴＩＳＧＧＡＴＤＦＡＡＰＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＤＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＫＴＥＤＴＡＶＹＹＣＴＬＤＬＲＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
配列番号４７：重鎖可変領域
ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＥＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＲＡＷＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＧＲＩＫＴＴＩＳＧＡＡＴＤＦＡＡＰＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＤＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＫＴＥＤＴＡＶＹＹＣＴＬＤＬＲＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
配列番号４８：重鎖可変領域
ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＥＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＡＮＡＷＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＧＲＩＫＴＴＹＳＧＧＡＴＤＦＡＡＰＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＤＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＫＴＥＤＴＡＶＹＹＣＴＬＤＬＲＫＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
配列番号４９：重鎖可変領域
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配列番号５０：重鎖可変領域
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配列番号５１：重鎖可変領域
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配列番号５２：重鎖可変領域
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配列番号５３：重鎖可変領域
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配列番号５４：重鎖可変領域
ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＥＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＶＦＳＮＡＷＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＧＲＩＫＴＴＦＳＧＧＡＴＤＦＡＡＰＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＤＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＫＴＥＤＴＡＶＹＹＣＴＬＤＬＲＫＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
配列番号５５：重鎖可変領域
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配列番号５６：重鎖可変領域
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配列番号５７：重鎖可変領域
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配列番号５８：重鎖可変領域
ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＶＳＧＦＱＦＲＲＹＡＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＡＩＳＡＳＧＤＲＴＨＮＴＤＳＶＫＧＲＦＳＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＦＣＡＫＧＩＡＫＳＧＫＮＹＦＤＰＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
配列番号５９：重鎖可変領域
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配列番号６０：重鎖可変領域
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配列番号６１：重鎖可変領域
Figure 2023508202000013
 ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＶＳＧＦＴＦＲＲＹＡＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＡＩＳＡＳＧＤＲＴＫＮＴＤＳＶＫＧＲＦＳＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＦＣＡＫＧＴＡＡＳＧＲＮＹＦＤＰＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
配列番号６３：重鎖可変領域
ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＶＳＧＦＡＦＲＲＹＡＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＳＩＳＡＳＧＤＲＴＫＮＴＤＳＶＫＧＲＦＳＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＦＣＡＫＧＩＡＡＳＧＫＮＹＦＤＰＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
配列番号６４：重鎖可変領域
ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＶＳＧＦＴＦＲＲＹＡＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＡＩＳＡＳＧＤＲＴＨＮＴＤＳＶＫＧＲＦＳＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＦＣＡＫＧＩＦＡＳＧＫＨＹＦＤＰＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
配列番号６５：重鎖可変領域
Figure 2023508202000014
 ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＶＳＧＦＱＦＲＲＹＡＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＤＩＳＡＳＧＤＲＴＨＮＴＤＳＶＫＧＲＦＳＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＦＣＡＫＧＩＡＲＳＧＫＮＹＦＤＰＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
配列番号６７：重鎖可変領域
ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＶＳＧＦＴＦＲＲＹＡＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＡＩＳＡＳＧＤＲＴＬＮＴＤＳＶＫＧＲＦＳＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＦＣＡＫＧＴＡＡＲＧＫＮＹＦＤＰＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
配列番号６８：重鎖可変領域
ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＶＳＧＦＡＦＲＲＹＡＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＡＩＳＡＦＧＤＲＴＨＮＴＤＳＶＫＧＲＦＳＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＦＣＡＫＧＴＡＡＳＧＫＮＦＦＤＰＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
配列番号６９：重鎖可変領域
ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＶＳＧＦＴＦＲＲＹＡＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＡＩＳＡＳＧＤＲＴＫＮＴＤＳＶＫＧＲＦＳＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＦＣＡＫＧＴＡＡＳＧＫＮＦＦＤＰＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
配列番号７０：重鎖可変領域
Figure 2023508202000015
 ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＶＳＧＦＱＦＲＲＹＡＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＡＩＳＡＨＧＤＲＴＨＮＴＤＳＶＫＧＲＦＳＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＦＣＡＫＧＴＡＡＳＧＫＮＹＦＤＰＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
配列番号７２：重鎖可変領域
ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＶＳＧＦＴＩＲＲＹＡＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＹＩＳＡＳＧＤＲＴＨＮＴＤＳＶＫＧＲＦＳＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＦＣＡＫＧＴＡＮＳＧＫＮＹＦＤＰＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
配列番号７３：重鎖可変領域
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配列番号７４：重鎖可変領域
ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＶＳＧＦＴＦＥＲＹＡＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＡＩＳＡＳＧＤＲＴＱＮＴＤＳＶＫＧＲＦＳＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＦＣＡＫＧＴＡＡＳＧＲＮＹＦＤＰＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
配列番号７５：重鎖可変領域
ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＶＳＧＦＥＦＲＲＹＡＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＡＩＳＡＧＧＤＲＴＡＮＴＤＳＶＫＧＲＦＳＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＦＣＡＫＧＴＡＡＲＧＫＮＹＦＤＰＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
配列番号７６：重鎖可変領域
Figure 2023508202000016
 ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＶＳＧＦＳＦＲＲＹＡＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＡＩＳＡＳＧＤＲＴＬＮＴＤＳＶＫＧＲＦＳＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＦＣＡＫＧＴＡＡＲＧＫＮＹＦＤＰＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
配列番号７８：重鎖可変領域
ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＶＳＧＦＥＦＲＲＹＡＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＡＩＳＡＳＧＤＲＴＤＮＴＤＳＶＫＧＲＦＳＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＦＣＡＫＧＩＡＲＳＧＫＮＦＦＤＰＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
配列番号７９：重鎖可変領域
ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＶＳＧＦＮＦＲＲＹＡＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＡＩＳＡＳＧＤＲＴＨＮＴＤＳＶＴＧＲＦＳＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＦＣＡＫＧＬＡＡＳＧＫＮＹＦＤＰＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
配列番号８０：重鎖可変領域
ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＶＳＧＦＡＦＲＲＹＡＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＡＩＳＡＨＧＤＲＴＨＮＴＤＳＶＫＧＲＦＳＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＦＣＡＫＧＴＡＡＳＧＫＮＹＦＤＰＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
配列番号８１：重鎖可変領域
ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＶＳＧＦＴＦＲＲＹＡＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＡＩＳＡＳＧＤＲＴＨＮＴＤＳＶＫＧＲＦＳＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＦＣＡＫＧＬＡＡＳＧＫＮＦＦＤＰＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
配列番号８２：重鎖可変領域
ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＶＳＧＦＡＦＲＲＹＡＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＳＩＳＡＳＧＤＲＴＨＮＴＤＳＶＫＧＲＦＳＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＦＣＡＫＧＬＡＳＳＧＫＮＹＦＤＰＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
配列番号８３：重鎖可変領域
ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＶＳＧＦＱＦＲＲＹＡＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＳＩＳＡＳＧＤＲＴＨＮＴＤＳＶＫＧＲＦＳＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＦＣＡＫＧＬＡＡＳＧＫＮＹＦＤＰＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
配列番号８４：重鎖可変領域
ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＶＳＧＦＱＦＲＲＹＡＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＡＩＳＡＳＧＤＲＹＨＮＴＤＳＶＫＧＲＦＳＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＦＣＡＫＧＴＡＡＳＧＫＮＹＦＤＰＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
配列番号８５：重鎖可変領域
Figure 2023508202000017
Figure 2023508202000018
 ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＶＳＧＦＴＦＫＲＹＡＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＡＩＳＡＳＧＤＲＳＨＮＴＤＳＶＫＧＲＦＳＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＦＣＡＫＧＬＡＡＲＧＫＮＹＦＤＰＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
配列番号８８：重鎖可変領域
ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＶＳＧＦＮＦＲＲＹＡＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＡＩＳＡＳＧＤＲＴＨＮＴＤＳＶＫＧＲＦＳＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＦＣＡＫＧＴＡＡＲＧＫＮＹＦＤＰＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
配列番号８９：重鎖可変領域
ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＶＳＧＦＴＦＲＲＹＡＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＡＩＳＡＳＧＤＲＴＨＮＴＤＳＶＫＧＲＦＳＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＦＣＡＫＧＩＡＡＳＧＫＮＦＦＤＰＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
配列番号９０：重鎖可変領域
ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＶＳＧＦＴＦＲＲＹＡＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＡＩＳＡＳＧＤＲＴＨＮＴＤＳＶＫＧＲＦＳＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＦＣＡＫＧＩＡＡＲＧＫＮＹＦＤＰＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
配列番号９１：重鎖可変領域
ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＶＳＧＦＲＦＲＲＹＡＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＡＩＳＡＳＧＤＲＴＨＮＴＤＳＶＫＧＲＦＳＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＦＣＡＫＧＩＡＡＲＧＫＮＦＦＤＰＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
配列番号９２：重鎖可変領域
ＥＶＱＬＶＥＴＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＤＹＩＦＴＫＹＤＩＮＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＷＭＳＡＮＴＧＮＴＧＹＡＱＫＦＱＧＲＶＴＭＴＲＤＴＳＩＮＴＡＹＭＥＬＳＳＬＴＳＧＤＴＡＶＹＦＣＡＲＳＳＬＦＫＴＥＴＡＰＹＹＨＦＡＬＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ
配列番号９３：重鎖可変領域
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＤＬＶＫＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＮＡＷＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＧＲＶＫＴＴＶＳＧＧＴＴＤＹＡＡＡＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＤＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＫＴＥＤＴＡＩＹＹＣＴＩＤＬＲＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
配列番号９４：重鎖可変領域
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配列番号９５：重鎖可変領域
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配列番号９６：重鎖可変領域
ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＳＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＲＹＡＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＳＩＮＴＳＧＧＮＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＧＩＡＡＳＧＫＮＹＦＤＰＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
配列番号９７：重鎖可変領域
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＶＶＱＰＧＲＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＮＹＧＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＶＩＳＹＤＧＳＴＫＹＳＡＤＳＬＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＤＤＴＡＶＹＹＣＡＫＥＧＷＳＦＤＳＳＧＹＲＳＷＦＤＳＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
配列番号９８：重鎖可変領域
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配列番号９９：ＩＧＫＶ１－３９
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＡＡＳＳＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＳＹＳＴＰ
配列番号１００：ＩＧＫＶ１－３９／ｊｋ５
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＡＡＳＳＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＳＹＳＴＰＰＩＴＦＧＱＧＴＲＬＥＩＫ
配列番号１０１：ヒトＴＧＦ－βＲＩＩのアイソフォームＡ
Figure 2023508202000019
Figure 2023508202000020
Figure 2023508202000021
Figure 2023508202000022
 ＮＡＷＭＳ
配列番号１０６：ＫａｂａｔによるＨＣＤＲ２
ＲＩＫＴＴＩＳＧＧＡＴＱＦＡＡＰＶＫＧ
配列番号１０７：ＫａｂａｔによるＨＣＤＲ３
ＤＬＲＤＹ
配列番号１０８：ＫａｂａｔによるＨＣＤＲ１
ＲＹＡＭＳ
配列番号１０９：ＫａｂａｔによるＨＣＤＲ２
ＡＩＳＡＧＧＤＲＴＡＮＴＤＳＶＫＧ
配列番号１１０：ＫａｂａｔによるＨＣＤＲ３
ＧＴＡＡＲＧＫＮＹＦＤＰ
配列番号１１１：ＫａｂａｔによるＨＣＤＲ１
ＲＹＡＭＳ
配列番号１１２：ＫａｂａｔによるＨＣＤＲ２
ＡＩＳＡＳＧＤＲＴＫＮＴＤＳＶＫＧ
配列番号１１３：ＫａｂａｔによるＨＣＤＲ３
ＧＴＡＡＡＧＫＮＹＦＤＰ
配列番号１１４：ＫａｂａｔによるＨＣＤＲ１
ＲＹＡＭＳ
配列番号１１５：ＫａｂａｔによるＨＣＤＲ２
ＡＩＳＡＳＧＤＲＹＨＮＴＤＳＶＫＧ
配列番号１１６：ＫａｂａｔによるＨＣＤＲ３
ＧＴＡＡＳＧＫＮＹＦＤＰ
配列番号１１７：ＫａｂａｔによるＨＣＤＲ１
ＲＹＡＭＳ
配列番号１１８：ＫａｂａｔによるＨＣＤＲ２
ＡＩＳＡＳＧＤＲＴＨＮＴＤＳＶＫＧ
配列番号１１９：ＫａｂａｔによるＨＣＤＲ３
ＧＴＡＡＲＧＫＮＹＦＤＰ
配列番号１２０：ＫａｂａｔによるＨＣＤＲ１
ＮＹＷＭＳ
配列番号１２１：ＫａｂａｔによるＨＣＤＲ２
ＲＩＫＴＴＹＳＧＧＡＴＤＦＡＡＰＶＫＧ
配列番号１２２：ＫａｂａｔによるＨＣＤＲ３
ＤＬＲＤＹ
配列番号１２３：ＫａｂａｔによるＨＣＤＲ１
ＲＹＡＭＳ
配列番号１２４：ＫａｂａｔによるＨＣＤＲ２
ＳＩＳＡＳＧＤＲＴＨＮＴＤＳＶＫＧ
配列番号１２５：ＫａｂａｔによるＨＣＤＲ３
ＧＬＡＡＳＧＫＮＹＦＤＰ
配列番号１２６：ＫａｂａｔによるＨＣＤＲ１
ＲＹＡＭＳ
配列番号１２７：ＫａｂａｔによるＨＣＤＲ２
ＡＩＳＡＳＧＤＲＴＤＮＴＤＳＶＫＧ
配列番号１２８：ＫａｂａｔによるＨＣＤＲ３
ＧＩＡＲＳＧＫＮＦＦＤＰ
配列番号１２９：ＫａｂａｔによるＨＣＤＲ１
ＲＡＷＭＳ
配列番号１３０：ＫａｂａｔによるＨＣＤＲ２
ＲＩＫＴＴＩＳＧＡＡＴＤＦＡＡＰＶＫＧ
配列番号１３１：ＫａｂａｔによるＨＣＤＲ３
ＤＬＲＤＹ
配列番号１３２：ＫａｂａｔによるＨＣＤＲ１
ＲＹＡＭＳ
配列番号１３３：ＫａｂａｔによるＨＣＤＲ２
ＡＩＳＡＳＧＤＲＴＬＮＴＤＳＶＫＧ
配列番号１３４：ＫａｂａｔによるＨＣＤＲ３
ＧＴＡＡＲＧＫＮＹＦＤＰ
配列番号１３５：軽鎖可変領域
ＥＩＶＬＴＱＳＰＡＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＱＳＶＲＳＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＤＡＳＮＲＡＴＧＩＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＱＱＲＳＮＷＰＰＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ
配列番号１３６：重鎖可変領域
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＶＶＱＰＧＲＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＮＹＧＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＶＩＳＹＤＧＳＴＫＹＳＡＤＳＬＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＤＤＴＡＶＹＹＣＡＫＥＧＷＳＦＤＳＳＧＹＲＳＷＦＤＳＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ

Claims (40)

  1. ヒトＴＧＦ－βＲＩＩの細胞外ドメインに特異的に結合する抗体またはその抗体断片であって、前記抗体または抗体断片が、ヒトＴＧＦ－βＲＩＩの細胞外ドメインのエピトープに結合し、そのヒトＴＧＦ－βＲＩＩのアイソフォームＡの２５位またはヒトＴＧＦ－βＲＩＩのアイソフォームＢの５０位のフェニルアラニン（Ｆ）が結合のための必須残基である、抗体またはその抗体断片。
  2. ヒトＴＧＦ－βＲＩＩのアイソフォームＡの細胞外ドメインの前記エピトープの１１９位またはヒトＴＧＦ－βＲＩＩのアイソフォームＢの１４４位のアスパラギン酸（Ｄ）が結合のためのさらなる必須残基である、請求項１に記載の抗体または抗体断片。
  3. ヒトＴＧＦ－βＲＩＩのアイソフォームＡの細胞外ドメインの前記エピトープの５２位またはヒトＴＧＦ－βＲＩＩのアイソフォームＢの７７位のトレオニン（Ｔ）が結合のためのさらなる必須残基である、請求項１または２に記載の抗体または抗体断片。
  4. ヒトＴＧＦ－βＲＩＩのアイソフォームＡの細胞外ドメインの前記エピトープの５４位のイソロイシン（Ｉ）および１２０位のグルタミン酸（Ｅ）またはヒトＴＧＦ－βＲＩＩのアイソフォームＢの７９位のイソロイシン（Ｉ）および１４５位のグルタミン酸（Ｅ）が結合のためのさらなる必須残基である、請求項１または２に記載の抗体または抗体断片。
  5. 前記抗体または抗体断片が、以下から選択される重鎖可変領域（ＶＨ）：
    （Ａ）ＶＨであって、
    （ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列を含むＶＨ－ＣＤＲ１、
    （ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列を含むＶＨ－ＣＤＲ２、および
    （ｃ）配列番号３に記載のアミノ酸配列を含むＶＨ－ＣＤＲ３を有する、ＶＨ、
    （Ｂ）ＶＨであって、
    （ａ）配列番号４に記載のアミノ酸配列を含むＶＨ－ＣＤＲ１、
    （ｂ）配列番号５に記載のアミノ酸配列を含むＶＨ－ＣＤＲ２、および
    （ｃ）配列番号６に記載のアミノ酸配列を含むＶＨ－ＣＤＲ３を有する、ＶＨ、
    （Ｃ）ＶＨであって、
    （ａ）配列番号７に記載のアミノ酸配列を含むＶＨ－ＣＤＲ１、
    （ｂ）配列番号８に記載のアミノ酸配列を含むＶＨ－ＣＤＲ２、および
    （ｃ）配列番号９に記載のアミノ酸配列を含むＶＨ－ＣＤＲ３を有する、ＶＨのうちのいずれか１つを含み、
    ここで、１～５個のアミノ酸残基が、ＶＨ－ＣＤＲ１、ＶＨ－ＣＤＲ２、およびＶＨ－ＣＤＲ３から選択される前記ＣＤＲのうちのいずれか１つ以上内のその保存的アミノ酸で置換されてもよい、請求項１～４のいずれか１項に記載の抗体または抗体断片。
  6. ヒトＴＧＦ－βＲＩＩの細胞外ドメインに特異的に結合する抗体またはその抗体断片であって、前記抗体または抗体断片が、１つ以下から選択される重鎖可変領域（ＶＨ）：
    （Ａ）ＶＨであって、
    （ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列を含むＶＨ－ＣＤＲ１、
    （ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列を含むＶＨ－ＣＤＲ２、および
    （ｃ）配列番号３に記載のアミノ酸配列を含むＶＨ－ＣＤＲ３を有する、ＶＨ、
    （Ｂ）ＶＨであって、
    （ａ）配列番号４に記載のアミノ酸配列を含むＶＨ－ＣＤＲ１、
    （ｂ）配列番号５に記載のアミノ酸配列を含むＶＨ－ＣＤＲ２、および
    （ｃ）配列番号６に記載のアミノ酸配列を含むＶＨ－ＣＤＲ３を有する、ＶＨ、
    （Ｃ）ＶＨであって、
    （ａ）配列番号７に記載のアミノ酸配列を含むＶＨ－ＣＤＲ１、
    （ｂ）配列番号８に記載のアミノ酸配列を含むＶＨ－ＣＤＲ２、および
    （ｃ）配列番号９に記載のアミノ酸配列を含むＶＨ－ＣＤＲ３を有する、ＶＨのうちのいずれか１つを含み、
    ここで、１～５個のアミノ酸残基が、ＶＨ－ＣＤＲ１、ＶＨ－ＣＤＲ２、およびＶＨ－ＣＤＲ３から選択される前記ＣＤＲのうちのいずれか１つ以上内のその保存的アミノ酸で置換されてもよい、抗体またはその抗体断片。
  7. 前記ＶＨのＦＲ１領域、ＦＲ２領域、ＦＲ３領域、およびＦＲ４領域が、体細胞変異を含み得る生殖系列Ｖ遺伝子ＩＧＨＶ３－１５およびＩＧＨＶ３－２３によってコードされるアミノ酸配列に対応する、請求項１～６のいずれか１項に記載の抗体またはその抗体断片。
  8. 前記抗体が、
    ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＤＩＹＡＭＴＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＶＩＳＧＳＧＧＴＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＲＧＱＹＲＤＩＶＧＡＴＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号１０）、
    ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＥＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＮＡＷＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＧＲＩＫＴＴＩＳＧＧＡＴＤＦＡＡＰＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＤＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＫＴＥＤＴＡＶＹＹＣＴＬＤＬＲＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号１１）、
    ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＶＳＧＦＴＦＲＲＹＡＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＡＩＳＡＳＧＤＲＴＨＮＴＤＳＶＫＧＲＦＳＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＦＣＡＫＧＩＡＡＳＧＫＮＹＦＤＰＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号１２）、
    から選択されるＶＨアミノ酸配列、またはそれと少なくとも８０％の同一性を有するＶＨアミノ酸配列を含む、請求項１～７のいずれか１項に記載の抗体またはその抗体断片。
  9. 前記抗体が、配列番号２２～９１のうちのいずれか１つから選択されるＶＨアミノ酸配列、またはそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の同一性を有するＶＨアミノ酸配列を含む、請求項１～８のいずれか１項に記載の抗体またはその抗体断片。
  10. 前記抗体または抗体断片が、
    軽鎖可変領域（ＶＬ）であって、
    （ａ）配列番号１９に記載のアミノ酸配列を含むＶＬ－ＣＤＲ１、
    （ｂ）配列番号２０に記載のアミノ酸配列を含むＶＬ－ＣＤＲ２、および
    （ｃ）配列番号２１に記載のアミノ酸配列を含むＶＬ－ＣＤＲ３を有する、ＶＬをさらに含み、
    ここで、１～５個のアミノ酸残基が、ＶＬ－ＣＤＲ１、ＶＬ－ＣＤＲ２、およびＶＬ－ＣＤＲ３から選択される前記ＣＤＲのうちのいずれか１つ以上内のその保存的アミノ酸で置換されてもよい、請求項１～９のいずれか１項に記載の抗体またはその抗体断片。
  11. 前記抗体が、ＶＬアミノ酸配列：
    ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＡＡＳＳＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＳＹＳＴＰＰＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号１６）、またはそれと少なくとも８０％の同一性を有するＶＬアミノ酸配列を含む、請求項１～１０のいずれか１項に記載の抗体またはその抗体断片。
  12. 前記抗体が、配列番号１０、１１、または１２の重鎖可変領域、および配列番号１６の軽鎖可変領域を含む、請求項１～８、１０、または１１のいずれか１項に記載の抗体またはその抗体断片。
  13. 前記抗体が、配列番号２２～９１のうちのいずれか１つの重鎖可変領域、および配列番号１６の軽鎖可変領域を含む、請求項１～１２のいずれか１項に記載の抗体またはその抗体断片。
  14. 前記抗体が、配列番号１０の２つの重鎖可変領域および配列番号１６の２つの軽鎖可変領域、配列番号１１の２つの重鎖可変領域および配列番号１６の２つの軽鎖可変領域、または配列番号１２の２つの重鎖可変領域および配列番号１６の２つの軽鎖可変領域を含む、請求項１～８または１０～１２のいずれか１項に記載の抗体またはその抗体断片。
  15. 前記抗体が、配列番号２２～９１のうちのいずれか１つの２つの重鎖可変領域、および配列番号１６の２つの軽鎖可変領域を含む、請求項１１～１３のいずれか１項に記載の抗体またはその抗体断片。
  16. 前記抗体がＩｇＧ抗体である、請求項１～１５のいずれか１項に記載の抗体。
  17. 前記抗体がＩｇＧ１抗体またはＩｇＧ４抗体である、請求項１～１６のいずれか１項に記載の抗体。
  18. 前記抗体がＩｇＧ１抗体である、請求項１～１７のいずれか１項に記載の抗体。
  19. 前記抗体または抗体断片が、配列番号１７に記載のアミノ酸配列を含む重鎖定常領域をさらに含む、請求項１～１８のいずれか１項に記載の抗体またはその抗体断片。
  20. 前記抗体または抗体断片が、配列番号１８に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖定常領域をさらに含む、請求項１～１９のいずれか１項に記載の抗体またはその抗体断片。
  21. 前記抗体のＦｃ受容体への結合が排除または低減される、請求項１～２０のいずれか１項に記載の抗体。
  22. ヒトＴＧＦ－βＲＩＩに特異的に結合する抗体であって、
    （Ａ）配列番号１０～１２および配列番号２２～９１から選択されるいずれか１つに記載のアミノ酸配列を含むＶＨと、配列番号１７に記載のアミノ酸配列を含む重鎖定常領域とを有する重鎖、および
    （Ｂ）配列番号１６に記載のアミノ酸配列を含むＶＬと、配列番号１８に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖定常領域とを有する軽鎖を含む、抗体。
  23. 前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項１～２２のいずれか１項に記載の抗体またはその断片。
  24. ヒトＴＧＦ－βＲＩＩに特異的に結合する結合ドメインであって、
    以下から選択される重鎖可変領域（ＶＨ）：
    （Ａ）ＶＨ－ＣＤＲ１、ＶＨ－ＣＤＲ２、およびＶＨ－ＣＤＲ３を有するＶＨであって、配列番号１２に記載のアミノ酸配列を有する、ＶＨ、
    （Ｂ）ＶＨ－ＣＤＲ１、ＶＨ－ＣＤＲ２、およびＶＨ－ＣＤＲ３を有するＶＨであって、配列番号２６に記載のアミノ酸配列を有する、ＶＨ、
    （Ｃ）ＶＨ－ＣＤＲ１、ＶＨ－ＣＤＲ２、およびＶＨ－ＣＤＲ３を有するＶＨであって、配列番号３０に記載のアミノ酸配列を有する、ＶＨ、
    （Ｄ）ＶＨ－ＣＤＲ１、ＶＨ－ＣＤＲ２、およびＶＨ－ＣＤＲ３を有するＶＨであって、配列番号４０に記載のアミノ酸配列を有する、ＶＨ、
    （Ｅ）ＶＨ－ＣＤＲ１、ＶＨ－ＣＤＲ２、およびＶＨ－ＣＤＲ３を有するＶＨであって、配列番号６１に記載のアミノ酸配列を有する、ＶＨ、
    （Ｆ）ＶＨ－ＣＤＲ１、ＶＨ－ＣＤＲ２、およびＶＨ－ＣＤＲ３を有するＶＨであって、配列番号６５に記載のアミノ酸配列を有する、ＶＨ、
    （Ｇ）ＶＨ－ＣＤＲ１、ＶＨ－ＣＤＲ２、およびＶＨ－ＣＤＲ３を有するＶＨであって、配列番号７０に記載のアミノ酸配列を有する、ＶＨ、
    （Ｈ）ＶＨ－ＣＤＲ１、ＶＨ－ＣＤＲ２、およびＶＨ－ＣＤＲ３を有するＶＨであって、配列番号７６に記載のアミノ酸配列を有する、ＶＨ、
    （Ｉ）ＶＨ－ＣＤＲ１、ＶＨ－ＣＤＲ２、およびＶＨ－ＣＤＲ３を有するＶＨであって、配列番号８５に記載のアミノ酸配列を有する、ＶＨ、および
    （Ｊ）ＶＨ－ＣＤＲ１、ＶＨ－ＣＤＲ２、およびＶＨ－ＣＤＲ３を有するＶＨであって、配列番号８６に記載のアミノ酸配列を有する、ＶＨのうちのいずれか１つを含み、
    ここで、１～５個のアミノ酸残基が、ＶＨ－ＣＤＲ１、ＶＨ－ＣＤＲ２、およびＶＨ－ＣＤＲ３から選択される前記ＣＤＲのうちのいずれか１つ以上内のその保存的アミノ酸で置換されてもよい、結合ドメイン。
  25. 前記結合ドメインが、配列番号１２、２６、３０、４０、６１、６５、７０、７６、８５、および８６から選択されるＶＨアミノ酸配列、または
    それと少なくとも８０％の同一性を有するＶＨアミノ酸配列を含む、請求項２４に記載の結合ドメイン。
  26. 前記抗体もしくは抗体断片、または前記結合ドメインが、
    軽鎖可変領域（ＶＬ）であって、
    （ａ）配列番号１９に記載のアミノ酸配列を含むＶＬ－ＣＤＲ１、
    （ｂ）配列番号２０に記載のアミノ酸配列を含むＶＬ－ＣＤＲ２、および
    （ｃ）配列番号２１に記載のアミノ酸配列を含むＶＬ－ＣＤＲ３を有する、ＶＬをさらに含み、
    ここで、１～５個のアミノ酸残基が、ＶＬ－ＣＤＲ１、ＶＬ－ＣＤＲ２、およびＶＬ－ＣＤＲ３から選択される前記ＣＤＲのうちのいずれか１つ以上内のその保存的アミノ酸で置換されてもよい、請求項２４または２５に記載の結合ドメイン。
  27. 前記抗体または結合ドメインが、ＶＬアミノ酸配列：
    ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＡＡＳＳＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＳＹＳＴＰＰＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号１６）、またはそれと少なくとも８０％の同一性を有するＶＬアミノ酸配列を含む、請求項２４～２６のいずれか１項に記載の結合ドメイン。
  28. ＴＧＦ－βＲＩＩへの結合のための一価の抗体または抗体断片であって、同じアッセイで、配列番号９７に記載のアミノ酸配列を有する２つの重鎖可変領域と、配列番号１３５に記載のアミノ酸配列を有する２つの軽鎖可変領域とを含む二価単一特異性対照抗体と比較して、等モル濃度で少なくとも同程度もしくは同等、またはより高い受容体遮断活性を有する、抗体または抗体断片。
  29. 前記抗体または抗体断片が、請求項２４～２７のいずれか１項に記載のＴＧＦ－βＲＩＩ結合ドメインを含む、請求項に記載の抗体。
  30. 請求項１～２３、２８、または２９のいずれか１項に記載の抗体もしくは抗体断片、または請求項２４～２７のいずれか１項に記載の結合ドメインの前記重鎖および前記軽鎖のいずれかまたは両方をコードするポリヌクレオチドを含む、ベクター。
  31. 請求項１～２３、２８、または２９のいずれか１項に記載の抗体もしくは抗体断片、または請求項２４～２７のいずれか１項に記載の結合ドメインを産生する、細胞。
  32. 前記細胞が、請求項３０に記載のベクターで形質転換された組換え細胞である、請求項３１に記載の細胞。
  33. 請求項１～２３、２８、または２９のいずれか１項に記載の抗体もしくは抗体断片、または請求項２４～２７のいずれか１項に記載の結合ドメインと、薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤と、を含む、薬学的組成物。
  34. がんの予防、がんの症状進行もしくは再発の抑制、および／またはがんの治療に使用するための医薬品であって、請求項１～２３、２８、または２９のいずれか１項に記載の抗体もしくはその抗体断片、または請求項２４～２７のいずれか１項に記載の結合ドメインを活性成分として含む、医薬品。
  35. 前記がんが、正常よりも高いＴＧＦ－βシグナル伝達、具体的には、正常よりも高いＴＧＦ－βＲＩＩ発現と相関するがん型である、請求項３４に記載の医薬品。
  36. 前記がんが、乳がん、結腸がん、結腸直腸がん、胃がん、神経膠芽腫、頸部がん、肝細胞がん、非小細胞肺がん、小細胞肺がん、黒色腫、骨髄異形成症候群、膵臓がん、前立腺がん、および腎臓がんからなるから選択される、請求項３４または３５に記載の医薬品。
  37. がんの治療を必要とする対象におけるがんを治療する方法であって、前記対象に、請求項１～２３、２８、または２９のいずれか１項に記載の抗体もしくは抗体断片、または請求項２４～２７のいずれか１項に記載の結合ドメイン、または請求項３３に記載の薬学的組成物の有効量を投与することを含む、方法。
  38. 細胞のヒトＴＧＦ－βのヒトＴＧＦ－βＲＩＩへの結合を遮断する方法であって、前記細胞に、請求項１～２３、２８、または２９のいずれか１項に記載の抗体もしくは抗体断片、または請求項２４～２７のいずれか１項に記載の結合ドメインを提供することと、前記抗体もしくは抗体断片、または前記結合ドメインが前記細胞の前記ヒトＴＧＦ－βＲＩＩに結合することを可能にし、それにより、前記細胞のヒトＴＧＦ－βのヒトＴＧＦ－βＲＩＩへの結合を遮断することと、を含む、方法。
  39. 細胞のヒトＴＧＦ－βのヒトＴＧＦ－βＲＩＩへの結合によって誘導される前記細胞へのシグナル伝達を阻害する方法であって、前記細胞に、請求項１～２３、２８、または２９のいずれか１項に記載の抗体もしくは抗体断片、または請求項２４～２７のいずれか１項に記載の結合ドメインを提供することと、前記抗体もしくは抗体断片、または前記結合ドメインが前記細胞の前記ヒトＴＧＦ－βＲＩＩに結合することを可能にし、それにより、前記細胞への前記シグナル伝達を阻害することと、を含む、方法。
  40. 転移の予防または抑制を必要とする対象における転移を予防または抑制する方法であって、前記対象に、請求項１～２３、２８、または２９のいずれか１項に記載の抗体もしくは抗体断片、または請求項２４～２７のいずれか１項に記載の結合ドメイン、または請求項３３に記載の薬学的組成物の有効量を投与することを含む、方法。
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