MX2011004871A - Anticuerpos de receptor ii anti-tgf-beta. - Google Patents

Abstract

La presente invención se dirige a anticuerpos contra el receptor II del factor de crecimiento transformante beta (TGFßRII) humano, composiciones farmacéuticas que comprenden los anticuerpos y métodos de uso de los anticuerpos, solos o en combinación, por ejemplo, para tratar cáncer y fibrosis.

Description

ANTICUERPOS DE RECEPTOR II ANTI-TGF-BETA La presente invención está en el campo de medicina, particularmente en el campo de anticuerpos que enlazan el receptor II del factor de crecimiento transformante beta (???ß???) humano, composiciones farmacéuticas que comprenden los anticuerpos y métodos de uso de los anticuerpos, por ejemplo, para tratar cáncer, fibrosis, y enfermedades fibróticas .

Los ?TGße son citocinas pleyotrópicas que regulan el crecimiento y diferenciación celular, motilidad, producción de matriz extracelular, y funciones inmunes. Los TGFps tienen tres isoformas de mamífero, TGFp-l, TGF -2 y TGF -3, cada una con distintas funciones in vivo. Todos los tres TGF s usan el mismo sistema de señalización de receptor. El enlace de los TGF s a TGF RII es una etapa crucial en la iniciación de la activación de la trayectoria de señalización de TGF , conduciendo a la fosforilación de Smad2, y translocación del complejo de Smad2/Smad4 activado al núcleo para modular la expresión de genes.

Los anticuerpos monoclonales humanos (mAbs) que enlazan el TGF RII humano con alta afinidad (KD de 8.06 x 10" 10 y 1.91 x 10"9 M) para tratar la enfermedad renal y fibrosis de tejidos se describen en JP 2004 /121001A. La solicitud también describe que los mAbs suprimen el crecimiento inducido por TGF de queratinocitos (valor promedio de IC50 de 2.17-3.89, 3.17-4.95, y 3.21-5.07 vq/ml) . Se reportó que el uso de un anticuerpo monoclonal completamente humano para TGF RII es efectivo para reducir el depósito de la matriz extracelular en nefritis anti-Thy-1 de rata. (Kasuga, H., et al., Kidney Int'l, Vol . 60 (2001) 1745-1755) .

Hasta la fecha, no ha habido descripción de anticuerpos 3?^-??Gß ?? de alta afinidad altamente específicos que enlazan específicamente el dominio extracelular de TGF RII humano con afinidad muy alta, bloquean el enlace de TGFPl, TGF 2 , y TGF 3 humanos a TGF RII humano, inhiben la angiogénesis, suprimen el crecimiento de células de tumor, inhiben la migración e invasión de células de cáncer, reducen la deposición de colágeno y función del hígado, inhiben la regulación inducida por ligando de células T, o inhiben el crecimiento de tumor en combinación con agentes citotóxicos, y por lo tanto son necesarios.

La presente invención busca proporcionar nuevos mAbs anti-TGF RII aislados que dirigen estas necesidades. El RII de TGF beta es mamífero, y preferiblemente es humano. Los anticuerpos de la presente invención son capaces de una o más de las siguientes actividades: 1) exhiben enlace de alta afinidad hacia el dominio extracelular de TGFpRII humano; 2) bloquean el enlace de ligandos de TGF RII (TGFpi, TGFp2, y TGF 3) a TGFPRII, inhibiendo la fosforilación de Smad2 inducida por TGFP; 3) internalizan el TGFPRII, el cual puede actuar como un mecanismo de ba o-regulación de señalización independiente de la interacción de ligando-receptor; 4) inhiben las trayectorias de señalización de TGFPRII inducida por ligando; 5) inhiben las actividades celulares mediadas por TGF RII; 6) inhiben el crecimiento de tumor in vitro e in vivo; y también son más preferiblemente adicionalmente capaces de uno o más de los siguientes: 7) inhiben la angiogénesis reduciendo la secreción del factor de crecimiento vascular endotelial A inducido por TGF (VEGF-A) ; 8) inhiben la migración e invasión de células de cáncer, 9) reducen la deposición de colágeno y función del hígado; 10) inhiben la regulación inducida por ligando de células T para formar células Treg que tienen efectos inmunosupresores; o 11) inhiben el crecimiento de tumor en combinación con agentes citotóxicos.

Un anticuerpo monoclonal de alta afinidad que específicamente enlaza a TGF RII y neutraliza la actividad mediada por TGFpRII podría ser particularmente útil como un bioagente terapéutico para el tratamiento de enfermedades mediadas por señalización de TGF .

De acuerdo con un primer aspecto de la presente invención, se proporcionan anticuerpos aislados que específicamente enlazan el dominio extracelular de TGFpRII humano con una KD menor que 100 pM a temperatura ambiente (20-25°C) .

En un aspecto, los anticuerpos de la presente invención bloquean el enlace de TGF i, TGF32 , o TGFp3 humanos a 6?ß??? humano con una IC50 menor que 1.0 nM como se determina por ELISA.

En otro aspecto, los anticuerpos de la presente invención inhiben la fosforilación de Smad2 inducida por GF con una IC50 menor que 30 nM.

En todavía otro aspecto, los anticuerpos de la presente invención comprenden un anticuerpo que específicamente enlaza a TGFßRII que comprende: i) una CDRH1 que tiene la secuencia GGSISNSYF (SEC ID NO: 1), una CDRH2 que tiene la secuencia SFYYGEKTYYNPSLKS (SEC ID NO: 2), una CDRH3 que tiene la secuencia GPTMIRGVIDS (SEC ID NO: 3), una CDRL1 que tiene la secuencia RASQSVRSYLA (SEC ID NO: 10), una CDRL2 que tiene la secuencia DASNRAT (SEC ID NO: 11), y una CDRL3 que tiene la secuencia QQRSNWPPT (SEC ID NO: 12) ; ii) una CDRH1 que tiene la secuencia GSGYRFTSY (SEC ID NO: 4), una CDRH2 que tiene la secuencia IIYPGDSDTRYSPSFQG (SEC ID NO: 5), una CDRH3 que tiene la secuencia HGRGYNGYEG (SEC ID NO: 6), una CDRL1 que tiene la secuencia RASQGISSWLA (SEC ID NO: 13), una CDRL2 que tiene la secuencia AASSLQS (SEC ID NO: 14), y una CDRL3 que tiene la secuencia QQYNSYPWT (SEC ID NO: 15); o ii) una CDRH1 que tiene la secuencia GGSISSSSY (SEC ID NO: 7), una CDRH2 que tiene la secuencia SFYYSGITYYSPSLKS (SEC ID NO: 8), una CDRH3 que tiene la secuencia GFTMIRGALDY (SEC ID NO: 9), una CDRL1 que tiene la secuencia RASQSVRSFLA (SEC ID NO: 16), una CDRL2 que tiene la secuencia DASNRAT (SEC ID NO: 11), y una CDRL3 que tiene la secuencia QQRSNWPPT (SEC ID NO: 12) .

En otro aspecto, los anticuerpos de la presente invención comprenden: i) una secuencia de aminoácido de HCVR: QLQVQESGPGLV PSETLSLTCTVSGGSISNSYFSWGWIRQPPGKG LEWIGSFYYGEKTYYNPSLKSRATISI DTSKSQFSLKLSSVTAADT AVYYCPRGPTMIRGVIDSWGQGTLVTVSS (SEC ID NO: 25) y una secuencia de aminoácido de LCVR: EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVRSYLAWYQQKPGQAPRL LIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRS NWPPTFGQGTKVEIK (SEC ID NO: 27); ii) una secuencia de aminoácido de HCVR: QVQLVQSGAAVKKPGESLKISCKGSGYRFTSY IGWVRQMPGKGLE WMGI IYPGDSDTRYSPSFQGQVTISAGKSISTAYLQWSSLKASDTA MYYCARHGRGYNGYEGAFDIWGQGTMVTVSS (SEC ID NO: 29) y una secuencia de aminoácido de LCVR: DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISSWLAWYQQKPEKAPKS LIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYN SYPWTFGQGTKVEIK (SEC ID NO: 31); o iii) una secuencia de aminoácido de HCVR: QLQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSI SSSSYSWGWIRQPPGKG LEWIGSFYYSGITYYSPSLKSRI I ISEDTSKNQFSLKLSSVTAADT AVYYCASGFTMIRGALDY GQGTLVTVSS (SEC ID NO: 33), y una secuencia de aminoácido de LCVR: EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVRSFLAWYQQKPGQAPRL LIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRS NWPPTFGQGTKVEIK ( SEC ID NO: 35).

En otro aspecto, los anticuerpos de la presente invención comprenden una secuencia de aminoácido de HCVR: QLQVQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISNSYFS GWIRQPPGKGLEWIGSFYYGEKTYY NPSLKSRATISIDTSKSQFSLKLSSVTAADTAVYYCPRGPTMIRGVIDSWGQGTLVTVSS (SEC ID NO: 25) y una secuencia de aminoácido de LCVR: EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVRSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPAR FSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPPTFGQGTKVEIK (SEC ID NO: En otro aspecto, los anticuerpos de la presente invención comprenden: i) una cadena pesada de SEC ID NO: 37 y una cadena ligera de SEC ID NO: 39; ii) una cadena pesada de SEC ID NO: 41 y una cadena ligera de SEC ID NO: 43; o iii) una cadena pesada de SEC ID NO: 45 y una cadena ligera de SEC ID NO: 47.

En otro aspecto, los anticuerpos de la presente invención comprenden dos cadenas pesadas de SEC ID NO: 37 y dos cadenas ligeras de SEC ID NO: 39.

En otro aspecto, la presente invención comprende un fragmento de enlace de TGFPRII humano.

Se contempla que cualquiera de los anticuerpos de la presente invención se puede administrar a un sujeto en necesidad del mismo. Por consiguiente, un aspecto de la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo o fragmento de la presente invención y un portador, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable .

En otro aspecto, la invención comprende un anticuerpo aislado que específicamente enlaza al dominio extracelular del TGFPRII humano y comprende una cadena pesada de SEC ID NO: 41 y una cadena ligera de SEC ID NO: 43.

En otro aspecto, el anticuerpo de la invención específicamente enlaza al dominio extracelular del receptor II de TGFP (TGFPRII) humano que comprende una CDRH1 que tiene la secuencia GSGYRFTSY (SEC ID NO: 4), una CDRH2 que tiene la secuencia IIYPGDSDTRYSPSFQG (SEC ID NO: 5), una CDRH3 que tiene la secuencia HGRGYNGYEG (SEC ID NO: 6), una CDRL1 que tiene la secuencia RASQGISS LA (SEC ID NO: 13), una CDRL2 que tiene la secuencia AASSLQS (SEC ID NO: 14), y una CDRL3 que tiene la secuencia QQYNSYP T (SEC ID NO: 15) .

En otro aspecto de la invención, el anticuerpo comprende una secuencia de aminoácido de HCVR: QVQLVQSGAAVKKPGESLKISCKGSGYRFTSYWIGWVRQMPGKGLEWMGIIYPGDSDTRYS PSFQGQVTISAGKSISTAYLQWSSLKASDTAMYYCARHGRGYNGYEGAFDIWGQGTMVTVS S (SEC ID NO: 29) y una secuencia de aminoácido de LCVR: DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISSWLA YQQKPEKAPKSLIYAASSLQSGVPSR FSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYNSYPWTFGQGTKVEIK (SEC ID NO: 31) .

En un aspecto preferido de la invención, el anticuerpo o un fragmento funcional del mismo compite para el enlace al dominio extracelular de TGF RII en un ensayo de ELISA de competencia con un anticuerpo competente, en donde el anticuerpo competente enlaza TGF RII con una KD menor que 100 pM a temperatura ambiente (20-25°C) .

En otro aspecto preferido de la invención, el anticuerpo de la invención bloquea el enlace de TGF(J1, TGF 2, o TGF 3 humanos a TGF RII humano con una ICs0 menor que 1.0 nM como se determina por ELISA.

También se contempla que los mAbs de la presente invención se pueden usar para tratar fibrosis o enfermedades fibróticas de los pulmones, hígado, y ríñones. En un aspecto, se proporciona un método para tratar fibrosis o enfermedades fibróticas de los pulmones, hígado, y ríñones que comprende administrar a un sujeto en necesidad de tal tratamiento una cantidad efectiva de un mAb de la presente invención.

Un aspecto de la presente invención proporciona los anticuerpos de la presente invención para uso como un medicamento. Un aspecto de la presente invención proporciona los anticuerpos de la presente invención para uso en el tratamiento de cáncer. Un aspecto adicional de la invención proporciona anticuerpos para uso en el tratamiento de cáncer de mama, pulmón o pancreático. Los anticuerpos de la invención se pueden usar en el tratamiento de cáncer conjuntamente con un agente anti-cáncer. Otro aspecto de la presente invención proporciona un producto que contiene el anticuerpo o fragmento y un agente anti-cáncer adicional para el tratamiento en combinación para uso simultáneo, separado o consecutivo en terapia.

Un aspecto preferido de la invención proporciona un anticuerpo aislado que específicamente enlaza el dominio extracelular de hTGF3RII, que comprende una CDRH1 que tiene la secuencia GGS I SX1 SX2X3 (SEC ID NO: 17), en donde Xi es N o S, X2 es Y o S, y X3 es F o Y; una CDRH2 que tiene la secuencia S FYYX1X2X3TYYX4 PSLKS (SEC ID NO: 18), en donde Xi es G o S, X2 es E o G, X3 es K o I, X4 es N o S; una CDRH3 que tiene la secuencia GXiTMI RGX2X3 DX (SEC ID NO: 53), en donde Xi es P o F, X2 es V o A, X3 es I o L, X4 es S o Y; una CDRL1 que tiene la secuencia RASQSVRSXiLA (SEC ID NO: 54), en donde x es Y, o F; una CDRL2 que tiene la secuencia DASNRAT (SEC ID NO: 11); y una CDRL3 que tiene la secuencia QQRSNWPPT ( SEC ID NO: 12) .

Otro aspecto de la presente invención proporciona un método para tratar cáncer en un paciente, que comprende administrar al paciente una cantidad efectiva de los anticuerpos de la invención. El cáncer puede ser cáncer de mama, pulmón o pancreático. Los anticuerpos se pueden administrar al paciente, con una cantidad efectiva u otro agente anti-cáncer, simultáneamente, separadamente o consecutivamente. El agente anti-cáncer puede ser ciclofosfamida .

Otro aspecto de la invención proporciona un anticuerpo aislado que específicamente enlaza al dominio extracelular del receptor II de TGF (TGF RI I ) humano que comprende: una CDRH1 que tiene la secuencia GGSISNSYF (SEC ID NO: 1), una CDRH2 que tiene la secuencia SFYYGEKTYYNPSLKS (SEC ID NO: 2), una CDRH3 que tiene la secuencia GPT IRGVIDS (SEC ID NO: 3), una CDRL1 que tiene la secuencia RASQSVRSYLA (SEC ID NO: 10), una CDRL2 que tiene la secuencia DASNRAT (SEC ID NO: 11), y una CDRL3 que tiene la secuencia QQRSNWPPT (SEC ID NO: 12); o una CDRH1 que tiene la secuencia GGSISSSSY (SEC ID NO: 7), una CDRH2 que tiene la secuencia SFYYSGITYYSPSLKS (SEC ID NO: 8), una CDRH3 que tiene la secuencia GFTMIRGALDY (SEC ID NO: 9), una CDRL1 que tiene la secuencia RASQSVRSFLA (SEC ID NO: 16), una CDRL2 que tiene la secuencia DASNRAT (SEC ID NO: 11), y una CDRL3 que tiene la secuencia QQRSNWPPT (SEC ID NO: 12), o un fragmento de enlace de TGFßRII del anticuerpo.

Otro aspecto de la invención comprende un anticuerpo de la invención, que comprende una secuencia de aminoácido de HCVR: QLQVQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISNSYFS G IRQPPGKGLEWIGSFYYGEKTYY NPSLKSRATISIDTSKSQFSLKLSSVTAADTAVYYCPRGPTMIRGVIDSWGQGTLVTVSS (SEC ID NO: 25) y una secuencia de aminoácido de LCVR: EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVRSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPAR FSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPPTFGQGTKVEIK (SEC ID NO: 27); o una secuencia de aminoácido de HCVR: QLQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSSSYSWGWIRQPPGKGLEWIGSFYYSGITYY SPSLKSRI IISEDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCASGFTMIRGALDYWGQGTLVTVSS (SEC ID NO: 33) , y una secuencia de aminoácido de LCVR: EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVRSFLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPAR FSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPPTFGQGTKVEIK (SEC ID NO: 35), o un fragmento de enlace de ??G ??? del anticuerpo.

Otro aspecto de la invención comprende un anticuerpo de la invención que comprende una cadena pesada de SEC ID NO: 37 y una cadena ligera de SEC ID NO: 39; o una cadena pesada de SEC ID NO: 45 y una cadena ligera de SEC ID NO: 47.

Un "anticuerpo aislado" es un anticuerpo que (1) se ha purificado parcialmente, sustancialmente, o completamente de una mezcla de componentes; (2) se ha identificado y separado y/o recuperado de un componente de su ambiente natural; (3) es monoclonal; (4) está libre de otras proteínas de la misma especie; (5) se expresa por una célula de una especie diferente; o (6) no se presenta en la naturaleza. Los componentes contaminantes de su ambiente natural son materiales los cuales podrían interferir con usos de diagnóstico o terapéuticos para el anticuerpo, y pueden incluir enzimas, hormonas, y otros solutos proteínicos o no proteínicos. Los ejemplos de anticuerpos aislados incluyen un anticuerpo que se ha purificado por afinidad, un anticuerpo que se ha hecho por un hibrídoma u otra línea celular in vítro, y un anticuerpo humano derivado de un ratón transgénico .

Como se usa en la presente, el término "anticuerpo" se refiere a moléculas de inmunoglobulina que comprenden 4 cadenas de polipéptido, dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L) interconectadas por enlaces de disulfuro. Cada cadena pesada está comprendida de una región variable de cadena pesada (abreviada en la presente como HCVR o VH) y una región constante de cadena pesada. La región constante de cadena pesada contiene tres dominios, CH1, CH2 y CH3. Cada cadena ligera está comprendida de una región variable de cadena ligera (abreviada en la presente como LCVR o VL) y una región constante de cadena ligera. Las cadenas ligeras de los anticuerpos ( inmunoglobulinas ) de cualquier especie de vertebrados se pueden asignar a uno o dos tipos claramente distintos, llamados kappa (K) y lambda (?) , con base en las secuencias de aminoácido de sus dominios constantes. Las regiones variables de cadenas ligeras kappa son referidas en la presente como VK. La expresión VL, como se usa en la presente, se propone que incluya regiones variables tanto de cadenas ligeras tipo kappa (VK) como de cadenas ligeras tipo lambda. La región constante de cadena ligera está comprendida de un dominio, CL. Las regiones VH y VL incluyen regiones de hipervariabilidad, llamadas regiones determinantes de complementariedad (CDRs), intercaladas con regiones que son más conservadas, llamadas regiones de armazón (FR) . Cada VH y VL está compuesta de tres CDRs y cuatro FRs, arregladas de amino término a carboxi término en el siguiente orden: FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR .

"CDRH1" se refiere a la primera región CDR en una cadena pesada de anticuerpo, "CDRH2" se refiere a la segunda región CDR en una cadena pesada de anticuerpo, y "CDRH3" se refiere a la tercera región CDR en una cadena pesada de anticuerpo. "CDRL1" se refiere a la primera región CDR en una cadena ligera de anticuerpo, "CDRL2" se refiere a la segunda región en una cadena ligera de anticuerpo, y "CDRL3" se refiere a la tercera región CDR en una cadena ligera de anticuerpo .

El término "fragmento de enlace de antigeno" se refiere a una porción o fragmento de un anticuerpo intacto, que comprende el enlace de antigeno o región variable del mismo. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpo incluyen menores que anticuerpos de longitud completa, por ejemplo, un fragmento Fab, F(ab')2' o un fragmento variable de cadena única (scFv) . Igualmente se abarcan por la invención diacuerpos, anticuerpos lineales, anticuerpos de cadena única, proteínas de fusión, proteínas recombinantes, y anticuerpos multivalentes o multiespecífieos formados o parcialmente formados de un fragmento de enlace de antígeno de la presente invención.

El término "receptor II de TGF-beta" o "TGFßRII" como se usa en la presente se refiere a un receptor de superficie celular que enlaza un ligando, incluyendo, pero no limitado a, TGFpl, TGFP2, y TGFP3, y como un resultado inicia una trayectoria de transducción de señal dentro de la célula.

El ?TG ??? humano es una proteína de transmembrana de 567 aminoácidos (SEC ID NO: 20) : residuos aminoácido 1-22: péptido señal; residuos aminoácido 23-166 (143 aa) (SEC ID NO: 52) : dominio extracelular ; residuos aminoácido 167-187 (21 aa) : transmembrana; residuos aminoácido 188-567 (380 aa): y un dominio citoplásmico .

Los anticuerpos de la presente invención enlazan el GF RII humano, más específicamente el dominio extracelular del TGF RII humano, y bloquean el enlace de TGF 1, TGF 2, y TGFp3 humanos a TGF RII humano.

Los anticuerpos de la presente invención también incluyen aquellos para los cuales las características de enlace se han mejorado por mutación directa, métodos de maduración por afinidad, expresión en fagos, o transposición de cadena, por métodos conocidos en el arte. Los anticuerpos de la invención incluyen cualquier combinación de cadenas pesadas y ligeras (ya sea de longitud completa o porciones de las mismas) de los anticuerpos de la invención, referidos como TGF1 , TGF2 y TGF3.

Los anticuerpos de la presente invención se pueden usar como un anticuerpo modelo o progenitor para hacer anticuerpos adicionales de la invención usando una variedad de técnicas incluyendo injerto, restauración o recubrimiento de CDR, y transposición de cadena (por ejemplo, como se describe en la Patente de Estados Unidos 5,565,332) . Los anticuerpos humanos de la invención pueden incluir residuos aminoácido no codificados por secuencias de inmunoglobulina de linea germinal humana (por ejemplo, mutaciones introducidas por mutagénesis aleatoria o de sitio especifico in vitro o por mutación somática in vivo), por ejemplo en las CDRs . El anticuerpo humano puede tener al menos una posición reemplazada con un residuo de aminoácido, por ejemplo, un residuo de aminoácido mej orador de actividad el cual no se codifica por la secuencia de inmunoglobulina de linea germinal humana, y al hacerlo generar secuencias de aminoácido de región variable adicionales derivadas de las secuencias proporcionadas en la presente.

En un procedimiento las CDRs de anticuerpo progenitor son injertadas en un armazón humano que tiene alta identidad de secuencia con el armazón de anticuerpo progenitor. La identidad de secuencia del nuevo armazón generalmente será al menos 80, al menos 85, o al menos 90% con el armazón correspondiente en el anticuerpo progenitor. Este injerto puede resultar en la reducción de la afinidad de enlace en comparación con el anticuerpo progenitor. Si es asi, el armazón se puede mutar de nuevo al armazón progenitor en ciertas posiciones con base en los criterios específicos publicados por Queen (Queen, et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 88, 2869 (1991)). Los métodos adicionales que se pueden usar incluyen, por ejemplo, Jones et al., Nature, 321:522 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-327 (1988); y Verhoeyen et al . , Science, 239:1534 (1988).

Hasta 20 aminoácidos que se presentan naturalmente, alternativos, se pueden introducir en un sitio de sustitución especifico. El proceso de selección in vitro definido aquí entonces puede ser adecuadamente usado para seleccionar estas secuencias de aminoácido de región variable adicionales para fragmentos Fab que tienen la reactividad cruzada reivindicada e in vitro. De esta forma se identifican fragmentos Fab adicionales que son adecuados para preparar un anticuerpo humanizado de conformidad con la presente invención. Preferiblemente, la sustitución de aminoácido dentro de los armazones se restringe a una, dos o tres posiciones dentro de una o cada una de las secuencias de armazón descritas en la presente. Preferiblemente, la sustitución de aminoácido dentro de las CDRs se restringe a una a tres posiciones dentro de una o cada CDR, más preferiblemente la sustitución en una o dos posiciones de aminoácido dentro de una o cada CDR se realiza. Adicionalmente preferido, la sustitución de aminoácido se realiza en una o dos posiciones de aminoácido en las CDRs de la región variable de cadena pesada. Una metodología adecuada para combinar sustituciones de CDR y armazón para preparar anticuerpos alternativos de acuerdo con la presente invención, usando un anticuerpo descrito en la presente como un anticuerpo progenitor, se proporciona en u et al., J. Mol. Biol., 294:151-162.

El término "KD" se refiere a la constante de disociación de una interacción de anticuerpo-antigeno particular. Se calcula por la fórmula: koff/kon = KD. El término "kon" se refiere a la asociación o una constante de velocidad, o velocidad de reacción especifica, de la reacción hacia delante, o formadora de complejo, medida en unidades: -1seg-1. El término "koff" se refiere a la disociación o constante de velocidad off, o velocidad de reacción especifica, para disociación de un anticuerpo del complejo de anticuerpo/antigeno, medida en unidades: 1/segundo. La afinidad de enlace de un anticuerpo de la presente invención frecuentemente está correlacionada con una k0ff menor más que con una Kon mayor, sin embargo, no está obligado por teoría, se abarcan modalidades tanto koff como kon mejoradas. En un aspecto más preferido, los anticuerpos de la presente invención son anticuerpos de alta potencia, o fragmentos de los mismos, que generalmente exhiben bajos valores de koff.

En ciertos aspectos, los anticuerpos de la presente invención tienen una KD de aproximadamente 1 pM a aproximadamente 200 pM, aproximadamente 5 pM a aproximadamente 100 pM o aproximadamente 10 pM a aproximadamente 80 pM.

Como se usa en la presente, los términos "bloquea el enlace" e "inhibe el enlace", usados intercambiablemente, se refieren al bloqueo/inhibición del enlace de una citocina a su receptor, resultando en la inhibición o reducción completa o parcial de una función biológica de la trayectoria de señal de citocina/receptor . El bloqueo/inhibición del enlace de TGFp a TGFpRII se evalúa midiendo la inhibición o reducción completa o parcial de uno o más indicadores in vitro o in vivo de la actividad de ???ß, tal como, enlace de receptor, un efecto inhibitorio en el crecimiento celular, quimiotaxis, apoptosis, fosforilación de proteina intracelular, o transducción de señal. La capacidad de bloquear el enlace de TGF a TGF RII se puede medir por ELISA como se describe en la presente. La capacidad de inhibir la actividad de TGF se puede evaluar midiendo la inhibición de fosforilación de Smad2 en una célula, por ejemplo, en células MDA-MB-231 humanas como se describe en la presente.

Los anticuerpos de la presente invención bloquean el enlace de TGFpl, TGF 2, o TGF 3 humanos a TGF RII humano con una IC50 de aproximadamente 0.05 nM a aproximadamente 1.0 nM, aproximadamente 0.08 nM a aproximadamente 0.75 nM, o aproximadamente 0.10 nM a aproximadamente 0.60 nM.

Los anticuerpos de la presente invención inhiben la fosforilación de Smad2 inducida por TGF con una IC50 menor que o igual a aproximadamente 2.0 nM a aproximadamente 30 nM, aproximadamente 3.0 nM a aproximadamente 15.0 nM o aproximadamente 4.0 nM a aproximadamente 7.5 nM en un ensayo de bloqueo in vitro, por ejemplo, en un ensayo de bloqueo de células MDA-MB-231 in vitro como se describe en la presente.

Los anticuerpos pueden tener un patrón de glicosilación que es diferente o alterado de aquel encontrado en la especie nativa. Como se conoce en el arte, los patrones de glicosilación pueden depender de la secuencia de un anticuerpo (por ejemplo, la presencia o ausencia de residuos aminoácido de glicosilación particulares), o la célula huésped, o el organismo en el cual la proteina se produce. Se contempla que los anticuerpos de la presente invención incluyen los anticuerpos descritos en la presente asi como también variantes de glicosilación de los mismos.

La presente invención también incluye vectores de expresión que comprenden cualquiera de los polinucleótidos descritos en la presente. Los vectores ejemplares incluyen ácidos nucleicos de plásmidos, fagomidos, cósmidos, virus y fagos u otras moléculas de ácido nucleico que son capaces de la replicación en un huésped procariota o eucariota tal como una célula, por ejemplo, una célula de mamífero. El vector puede ser un vector de expresión, en donde el polinucleótido que codifica el anticuerpo es operativamente enlazado a los elementos de control de expresión. Los vectores de expresión típicos contienen terminadores de transcripción y traducción, secuencias de iniciación, y promotores útiles para la regulación de la expresión de las moléculas de ácido nucleico de la invención. Los vectores también pueden contener casetes de expresión genética que contienen una secuencia terminadora independiente, secuencias que permiten la replicación del vector tanto en eucariotas como procariotas, es decir, vectores de lanzadera y marcadores de selección para sistemas tanto procariotas como eucariotas. Los vectores típicamente contienen un marcador para proporcionar un rasgo fenotípico para la sección de huéspedes transformados tal como conferir resistencia a antibióticos tales como ampicilina o neomicina.

Los promotores adecuados incluyen promotores constitutivos y promotores inducibles. Los promotores representativos incluyen promotores derivados del citomegalovirus humano, promotor de metalotioneína, promotor temprano de SV-40, promotor tardío de SV-40, promotor de virus de tumor mamario murino, promotor de virus de sarcoma de Rous y promotor de polihedrina.

La invención también incluye células recombinantes que contienen una molécula de ácido nucleico o un vector de expresión de la invención. "Célula recombinante" significa un organismo multicelular no humano o una "célula huésped", la cual se refiere a una célula o población de células en la cual una molécula de ácido nucleico o vector de la invención se introduce. Una célula huésped de la presente invención puede ser una línea celular o célula eucariota, tal como una célula de planta, animal, vertebrado, mamífero, roedor, ratón, primate, o humano, o linea celular.

En un aspecto, un huésped de la presente invención puede ser procariota o eucariota. Los huéspedes procariotas adecuados incluyen, por ejemplo, Escherichia coli, tal como E. coli SG-936, E. coli HB 101, E. coli W3110, E. coli X1776, E. coli X2282, E. coli DHI, y E. coli MRC1, Pseudomonas, Bacillus, tal como Bacillus subtilis, y Streptomyces . Las células eucariotas adecuadas incluyen levadura y otros hongos, células de insecto, células de planta, células humanas, y células animales, incluyendo células de mamífero, tales como líneas de hibridoma, células COS, células NSO y células CHO.

La invención incluye métodos para producir un anticuerpo cultivando una célula recombinante que expresa una o más secuencias de ácido nucleico que codifican un anticuerpo de la presente invención, y recuperando el anticuerpo del medio de cultivo. Un anticuerpo así expresado típicamente se purifica o aisla después de la expresión. Los anticuerpos se pueden aislar o purificar en una variedad de formas conocidas por aquellos expertos en el arte. Los métodos de purificación estándares incluyen técnicas cromatográficas, técnicas electroforéticas, inmunológicas, precipitación, diálisis, filtración, concentración, y cromatoenfoque . Como es bien conocido en la técnica, una variedad de proteínas naturales enlazan anticuerpos, por ejemplo proteínas bacterianas A, G, y L, y estas proteínas pueden encontrar uso en la presente invención para purificación. La purificación frecuentemente se puede habilitar por un socio de fusión particular. Por ejemplo, las proteínas se pueden purificar usando resina de glutationa si se emplea una fusión GST, cromatografía de afinidad de Ni+2 si se emplea una His-Tag o anticuerpo anti-Flag inmovilizado si se usa una His-Tag. El anticuerpo se puede purificar separándolo del medio de cultivo. Los anticuerpos que comprenden más de una cadena se pueden producir expresando cada cadena conjuntamente en el mismo huésped; o como cadenas separadas, las cuales se ensamblan antes o después de la recuperación del medio de cultivo.

Los anticuerpos se pueden seleccionar usando una variedad de métodos, incluyendo, pero no limitados a, ensayos in vitro, ensayos basados en células in vitro, ensayos in vivo, y tecnologías de selección. Las propiedades de anticuerpos que se pueden seleccionar incluyen, pero no se limitan a, actividad biológica, estabilidad, solubilidad, y afinidad de enlace para el objetivo. Las múltiples propiedades se pueden seleccionar simultáneamente o individualmente. Las proteínas pueden ser purificadas o no purificadas, dependiendo de los requerimientos del ensayo. En un aspecto, la selección es un ensayo de enlace cualitativo o cuantitativo para el enlace de anticuerpos a una molécula de proteína o no proteína que se conoce o piensa que enlaza el anticuerpo. En un aspecto, la selección es un ensayo de enlace para medir el enlace al antígeno objetivo. Las tecnologías de selección de alto rendimiento y automatización se pueden utilizar en los procedimientos de selección. La selección puede emplear el uso de una proteína de fusión o proteína etiquetada. Los ensayos de enlace se pueden realizar usando una variedad de métodos conocidos en la técnica, incluyendo, pero no limitado a, ELISA. Como se usa en la presente, "compite para enlace" se refiere a la situación en la cual un anticuerpo reduce el enlace o señalización por al menos aproximadamente 20%, 30%, 50%, 70% o 90% como se mide por una técnica disponible en el arte, por ejemplo, ELISA de competencia o medición de Kd con BIAcore, pero no se propone que elimine completamente el enlace.

Un aparato bien conocido en la técnica para medir las interacciones de enlace es un instrumento BIAcore™ 2000 el cual es comercialmente disponible a través de Pharmacia Biosensor (Uppsala, Suecia) .

Esta invención incluye una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo de la invención descrito en la presente y un portador, diluyente, o excipiente farmacéuticamente aceptable. La composición farmacéutica puede contener opcionalmente otros ingredientes terapéuticos. Como se usa en la presente, "portador farmacéuticamente aceptable" incluye solventes, medios de dispersión, revestimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes retardantes de absorción e isotónicos y similares que son fisiológicamente compatibles.

Los ejemplos de portadores farmacéuticamente aceptables incluyen agua, solución salina, solución salina amortiguada con fosfato, dextrosa, glicerol, etanol y similares, asi como también combinaciones de los mismos. Los portadores farmacéuticamente aceptables pueden incluir adicionalmente cantidades menores de sustancias auxiliares tales como agentes de humectación o emulsión, conservadores o amortiguadores, los cuales mejoran la vida útil o efectividad del anticuerpo, asi como también agentes isotónicos tales como azúcares, polialcoholes tales como manitol y sorbitol, y cloruro de sodio.

Las composiciones farmacéuticas de la presente invención se pueden formular en una variedad de formas, incluyendo, por ejemplo, formas de dosificación liquidas, semi-sólidas y sólidas, tales como soluciones liquidas (por ejemplo, soluciones inyectables e infusibles), dispersiones o suspensiones, polvos, liposomas y supositorios. Las composiciones están preferiblemente en la forma de soluciones inyectables o infusibles.

El modo de administración preferido es parenteral (por ejemplo, intravenoso, subcutáneo, intraperitoneal, intramuscular) . Los modos particularmente preferidos son infusión o inyección intravenosa, inyección intramuscular e inyección subcutánea. Las composiciones se diseñan de conformidad con las técnicas convencionales como en, por ejemplo, Remington, The Science and Practice of Pharmacy, 19a Edición, Gennaro, Ed., Mack Publishing Co., Easton, PA 1995 la cual proporciona un compendio de técnicas de formulación como son generalmente conocidas por los profesionales.

Las dosis efectivas de las composiciones de la presente invención para el tratamiento de una enfermedad o trastorno como se describe en la presente varían dependiendo de muchos factores diferentes, incluyendo medio de administración, sitio objetivo, estado fisiológico del sujeto, si el sujeto es humano o un animal, u otros medicamentos administrados, y si el tratamiento es profiláctico o terapéutico. Las dosificaciones de tratamiento se pueden titular usando métodos rutinarios conocidos por aquellos de experiencia en la técnica para optimizar la seguridad y eficacia.

Los términos "tratar", "tratando" y "tratamiento" se refieren al tratamiento terapéutico, en donde el objeto es retardar (disminuir) un cambio fisiológico no deseado asociado con una enfermedad o trastorno. Los resultados clínicos benéficos o deseados incluyen, pero no se limitan a, alivio de los síntomas, disminución del grado de una enfermedad o trastorno, estabilización de una enfermedad o trastorno (es decir, donde la enfermedad o trastorno no empeora) , retrasar o retardar la progresión de una enfermedad o trastorno, y remisión (si es parcial o total) de la enfermedad o trastorno, si es detectable o no detectable. "Tratamiento" también puede significar supervivencia prolongada en comparación con la supervivencia esperada si no se recibe el tratamiento. Aquellos en necesidad del tratamiento incluyen aquellos ya con la enfermedad o trastorno asi como aquellos que también son propensos a tener la enfermedad o trastorno.

Las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden incluir una "cantidad terapéuticamente efectiva" de un anticuerpo anti-TGF RII de la presente invención. Una "cantidad terapéuticamente efectiva" significa una cantidad efectiva en dosificaciones y por periodos de tiempo necesarios para lograr el resultado terapéutico deseado. Una cantidad terapéuticamente efectiva del anticuerpo puede variar de acuerdo con factores tales como el estado de la enfermedad, edad, sexo, peso del individuo, y la capacidad del anticuerpo o porción de anticuerpo para producir una respuesta deseada en el individuo. Una cantidad terapéuticamente efectiva también es una en la cual cualquiera de los efectos tóxicos o nocivos del anticuerpo o porción de anticuerpo es superado por los efectos terapéuticamente benéficos.

Los regímenes de dosificación se pueden ajustar para proporcionar la respuesta óptima deseada. Por ejemplo, se puede administrar un bolo único, varias dosis divididas con el tiempo o la dosis se puede reducir o incrementar proporcionalmente como se indica por las exigencias de la situación terapéutica. Es especialmente ventajoso formular composiciones parenterales en forma de dosificación unitaria para la fácil administración y uniformidad de la dosificación. La forma de dosificación unitaria significa una dosis que contiene una cantidad predeterminada de compuesto activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el portador farmacéutico requerido. La especificación para las formas de dosificación unitarias de la invención se dicta y es directamente dependiente de (a) las características únicas del compuesto activo y el efecto terapéutico o profiláctico particular a ser alcanzado, y (b) las limitaciones inherentes en la técnica de composición de tal compuesto activo para el tratamiento de sensibilidad en individuos.

Un intervalo ejemplar, no limitante, para una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo de la invención es 0.1-50 mg/kg. En otro aspecto, la cantidad efectiva de un anticuerpo es 3-35 mg/kg. En otro aspecto, la cantidad efectiva es 10-25 mg/kg. En otro aspecto, la cantidad efectiva es 5-20 mg/kg. En otro aspecto, la cantidad efectiva es 3-15 mg/kg. En otro aspecto, la cantidad efectiva es 2-10 mg/kg. En otro aspecto, la cantidad efectiva es 5-10 mg/kg. En otro aspecto la cantidad efectiva de un anticuerpo es 1-10 mg/kg. Se señalará que los valores de dosificación pueden variar con el tipo y severidad de la afección que es aliviada. Adicionalmente se entiende que para cualquier sujeto particular, los regímenes de dosificación específicos se deberán ajusfar, con el tiempo, de acuerdo con la necesidad individual y el juicio profesional de la persona que administra o supervisa la administración de las composiciones, y que los intervalos de dosificación descritos en la presente sean ejemplares solamente y no se propongan limitar el alcance o práctica de la composición reivindicada.

Los anticuerpos de la presente invención se pueden usar para tratar cáncer. El cáncer se considera que es un grupo grande de enfermedades clasificadas por el tejido de origen y el grado de progresión del tumor. El cáncer también se puede clasificar como tumores primarios y tumores metastásicos, así como también tumores refractarios o recurrentes. Los tumores refractarios son tumores que fallan al responder o son resistentes al tratamiento con agentes quimioterapéuticos solos, anticuerpos solos, radiación sola o combinaciones de los mismos. Los tumores recurrentes son tumores que parecen ser inhibidos por el tratamiento con tales agentes, pero vuelven hasta cinco años, algunas veces hasta diez años o más tiempo después que el tratamiento se interrumpe .

El cáncer que se puede tratar también incluye tumores que no son vascularizados , o todavía no son sustancialmente vascularizados, así como también tumores vascularizados. El cáncer puede estar comprendido de tumores no sólidos o tumores sólidos.

Los anticuerpos anti-TGFpRII de la invención también se pueden usar para tratar trastornos, enfermedades, o afecciones relacionadas con TGFPRII que incluyen trastornos o enfermedades crónicas y agudas, incluyendo las condiciones patológicas que predisponen al mamífero al trastorno. Los trastornos a ser tratados en la presente incluyen fibrosis causada por una lesión arterial, una infección, artritis reumatoide, diabetes o una condición diabética, o una malignidad, enfermedades caracterizadas por la acumulación de matriz extracelular, enfermedades causadas por señalización de TGFpRII, condiciones causadas por la supresión del sistema inmune debido a la actividad mediada por TGFPRII, deficiencias inmunes aguadas resultantes de lesiones severas, quemaduras, y dolencias tales como infecciones virales o bacterianas, y dolencias sistémicas de órganos múltiples debido a la actividad mediada por TGFpRII.

Los TGFPs juegan un papel significativo en la auto- renovación, proliferación y diferenciación de las células madre hematopoyéticas . Los anticuerpos de la presente invención se pueden usar para el enriquecimiento y regeneración de células madre, y la facilitación de terapéuticos basados en células madre en infarto postmiocardio, trastornos neuronales y varios tipos de regeneración de tejidos.

Los anticuerpos de la presente invención se pueden administrar solos, o en combinación con un agente anti-neoplásico diferente de los anticuerpos de TGFPRII antihumano, incluyendo agentes quimioterapéuticos , radiación, otros antagonistas de TGF RII, antagonistas de TGFp, agentes anti-angiogénesis, anticuerpos para otros objetivos, y moléculas pequeñas. , Los anticuerpos anti-TGF RII son especialmente útiles en el tratamiento de tumores resistentes a anti-VEGF-A. La administración de los anticuerpos con otros anticuerpos y/o tratamientos puede ocurrir simultáneamente, o separadamente, vía la misma o diferente ruta, en los mismos o diferentes tiempos.

Los métodos de tratamiento descritos en la presente se pueden usar para tratar cualquier mamífero adecuado, incluyendo primates, tales como monos y humanos, caballos, vacas, gatos, perros, conejos, y roedores tales como ratas y ratones .

Los siguientes ejemplos se ofrecen para propósitos ilustrativos solamente, y no se proponen limitar el alcance de la presente invención en alguna forma.

Ejemplos Materiales y Líneas Celulares TGF i, TGF>2, y TGF 3 humanos se pueden producir recombinantemente y purificar o se pueden comprar, por ejemplo de R&D Systems. Las proteínas de fusión Fe de ??Gß??? recombinante (TGF RII-Fc) y proteínas de fosfatasa alcalina de TGFPRII recombinante soluble (TGFPRII-AP) se pueden expresar en células establemente transfectadas y purificar de sobrenadantes de cultivo celular siguiendo los procedimientos conocidos por un experto en la técnica (Tessler, J. Biol. Chem., 269:12456-12461 (1994)).

Las líneas celulares de cáncer humanas BXPC-3, PANC-1, MDA-MB-231 y líneas celulares de tumor de ratón EMT6, 4T1, CT26, B16-F10 y líneas celulares de mieloma P3-X63-Ag8.653 se pueden obtener de la American Type Tissue Culture Collection (Manassas, VA) . La línea celular transfectante de luciferasa MDA-MB-231 se puede obtener de Sunnybrook Health Sciences Centre. Las células se pueden mantener en medio RPMI1640 o IMDM ( Invitrogen/Li fe Technologies, Inc., Rockville, MD) que contiene 10% suero de ternero fetal (FCS, Hyclone, Logan, UT) . Todas las células se pueden mantener a 37 °C en una atmósfera humidificada de 5% CO2.

Generación de los mAbs 3???-???ß ?? Los mAbs anti-TGF RII se pueden generar esencialmente por tecnología de hibridoma estándar (Harlow & Lañe, ed., Antibodies : A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, páginas 211-213 (1998)) usando ratones transgénicos de inmunoglobulina humana (Medarex, San José, CA) , los cuales producen cadenas pesada gamma y ligera kappa de inmunoglobulina humana, o ratas Lewis (Charles River Laboratories, Wilmington, MA) . Brevemente, los ratones o ratas son inmunizados subcutáneamente (s.c.) con proteina TGF RII-Fc humana o de ratón recombinante emulsionada con adyuvante de Freund completo. Los animales son intraperitonealmente (i.p.) reforzados tres veces con la misma proteína TGFPRII-Fc en adyuvante de Freund incompleto. Los animales se dejan descansar por un mes antes que reciban un refuerzo i.p. final de 50 microgramos (pg) de proteína TGFPRII-Fc en solución amortiguadora de fosfato (PBS) . Los esplenocitos se recolectan de los ratones inmunizados y se fusionan con células de plasmacitoma P3-X63-Ag8.653 usando polietilenglicol (PEG, M : 1450 KD) . Después de la fusión, las células se vuelven a suspender en medio HAT (hipoxantina, aminopterina, timidina) complementado con 10% suero bovino fetal (FBS) y se distribuyen a placas de 96 cavidades a una densidad de 200 microlitros por cavidad para el establecimiento de las células de hibridoma.

Al día 10 ó 12 de post-fusión, los hibridomas se seleccionan para producción de anticuerpo y actividad de enlace específico de los sobrenadantes de cultivo con proteína de TGF3RII en ensayos de enlace y bloqueo basados en ELISA. Específicamente, los hibridomas que producen mAbs anti-TGF RII primero se identifican por detección de anticuerpo unido a ??Gß?¾?? con un anticuerpo conjugado de peroxidasa de rábano picante (HRP) de IgG anti-ratón o cadena ligera kappa anti-humana de cabra de acuerdo con el siguiente procedimiento. TGFpRII-Fc humana o TGFpRII-Fc de ratón se reviste a 100 ng/cavidad en placas de microtitulación de 96 cavidades a 4°C durante la noche. Las placas revestidas se bloquean con el amortiguador de bloqueo (PBS 0.05% TWEEN© 20 que contiene 5% leche seca) a temperatura ambiente por 2 horas. Los sobrenadantes de hibridoma o ánticuerpos purificados se diluyen en PBS con 2% albúmina de suero bovino (BSA) y 0.05% TWEEN© 20 (amortiguador de ELISA) y se incuban en placas de microtitulación de 96 cavidades revestidas con TGFpRII por 30 minutos. Las placas se lavan con el amortiguador de ELISA y se incuban con conjugado de IgG-HRP anti-ratón o cadena ligera kappa anti-humana de cabra por 30 minutos. Se usa sustrato de TMB (3, 31 , 5, 5' -tetra-metilbencidina) para el desarrollo de color siguiendo las instrucciones del fabricante. La absorbancia a 450 nanómetros (nm) se lee para la cuantificación de la actividad de enlace de los anticuerpos. Para la identificación de hibridomas que producen mAbs anti-TGF RII neutralizantes, un ensayo de bloqueo basado en ELISA se realiza de acuerdo con el siguiente procedimiento. ?TG ?, TGF 2, o TGF 3 es revestido a 200 ng por cavidad en placas de 96 cavidades, y las cavidades luego se bloquean con amortiguador de bloqueo. Los sobrenadantes de hibridoma se incuban con amortiguador de ELISA que contiene TGFpRII-AP en placas de microtitulación de 96 cavidades revestidas con TG por 1 hora. Después del lavado, sustrato de fosfato de p-nitrofenilo (PNPP) para AP se agrega a las cavidades para el desarrollo de color siguiendo las instrucciones del fabricante. La absorbancia a 405 nm se lee para la cuantificación del enlace de TGF RII a TGF l, TGF 2, y ?T?ß3. Los valores de densidad óptica (OD) se leen en un lector de placas de microtitulación (Molecular Devices Corp., Sunnyvale, CA) .

Los hibridomas positivos son subclonados tres veces por un cultivo de dilución limitante para el establecimiento de las lineas celulares de hibridoma monoclonal.

La Tabla 1 muestra las secuencias de aminoácido de las CDRs de cadena ligera y cadena pesada de los mAbs TGF1, TGF2, y TGF3.

Tabla 1 Secuencias de aminoácido de las CDRs de cadena ligera y cadena pesada de mAbs de TGFpRII antihumano .

Las SEC ID NOs de las secuencias de aminoácido y las secuencias de DNA que codifican las secuencias de aminoácido de HCVRs, LCVRs, las cadenas pesadas (HCs), y las cadenas ligeras (LCs) para mAbs TGF1, TGF2, y TGF3 se proporcionan en la Tabla 2 posterior.

Tabla 2 SEC ID NOs de las secuencias de aminoácido y las secuencias de DNA codificantes de mAbs de TGF RII anti-humano .

Secuencias de mAb TGF1 mAb TGF2 mAb TGF3 aminoácido HCV (SEC ID NO: 25) (SEC ID NO: 29) (SEC ID NO: 33) LCVR (SEC ID NO: 27) (SEC ID NO: 31) (SEC ID NO: 35) Secuencias de mAb TGF1 mAb TGF2 mAb TGF3 aminoácido (SEC ID NO: 37) (SEC ID NO: 41) (SEC ID NO: 45) HC (SEC ID NO: 55) * (SEC ID NO: 57) * (SEC ID NO: 59) * (SEC ID NO: 39) (SEC ID NO: 43) (SEC ID NO: 47) LC (SEC ID NO: 56) * (SEC ID NO: 58) * (SEC ID NO: 60) * Secuencias mAb TGF1 mAb TGF2 mAb TGF3 de DNA HCVR (SEC ID NO: 26) (SEC ID NO: 30) (SEC ID NO: 34) LCVR (SEC ID NO: 28) (SEC ID NO: 32) (SEC ID NO: 36) HC** (SEC ID NO: 38) (SEC ID NO: 42) (SEC ID NO: 46) LC** (SEC ID NO: 40) (SEC ID NO: 44) (SEC ID NO: 48) * Secuencias de aminoácido con una secuencia de señal secretora.

**Secuencias de cDNA que incluyen una secuencia de señal secretora.

Modificación genética y expresión de anticuerpos del Receptor II de TGFfi anti-humano de IgGl humana Las secuencias de DNA que codifican las regiones variables de cadena pesada y cadena ligera de los mAbs anti-TGFPRII se pueden amplificar por PCR por clonación en vectores de expresión. Las regiones variables de cadena pesada se pueden fusionar en armazón a la región constante gammal de cadena pesada de inmunoglobulina humana en el vector pEE6.1 (Lonza Biologics pie, Slough, Berkshire, UK) . El cDNA de cadena ligera humana completa se puede clonar directamente en el vector pEE12.1 (Lonza Biologics PLC, Slough, Berkshire, UK) . Los vectores de expresión de inmunoglobulina modificados genéticamente se pueden transfectar establemente en células de mieloma NSO por electroporación y seleccionar en medio de selección de glutamina sintetasa. Los clones estables se pueden seleccionar para expresión de anticuerpo por ELISA de enlace especifico de TGF RII anti-humano. Los clones positivos se pueden cultivar en cultivo de medio libre de suero para la producción de anticuerpo en matraces de agitación o bioreactores . El anticuerpo de IgGl de longitud completa se puede purificar por cromatografía de afinidad de proteína (Poros A, PerSeptive Biosystems Inc., Foster City, CA) y eluir en una solución salina amortiguada neutra.

El cDNA que codifica las regiones variables de cadena pesada y ligera de los mAbs TGF1, TGF2, y TGF3 de TGF RII anti-humano se puede clonar y fusionar en armazón al vector de expresión de la región constante gammal de cadena pesada de inmunoglobulina humana en GS (glutamina sintetasa) . Los vectores de expresión de inmunoglobulina modificados genéticamente se pueden transfectar establemente en células CHO. Los clones estables se pueden verificar para la expresión del anticuerpo que específicamente enlaza al TGF RII humano. Los clones positivos se pueden expandir en cultivo de medio libre de suero para la producción de anticuerpo en bioreactores. El anticuerpo de IgGl de longitud completa se puede purificar por cromatografía de afinidad de proteína A y eluir en una solución salina amortiguada neutra. mAbs anti-TGFfiRII enlazan al TGFfiRII y bloquean el enlace de TGF RII a sus ligandos .

La actividad de enlace y bloqueo de los mAbs anti-TGFpRII purificados se determina en ELISA como se describe en "Generación de mAbs ???-??Gß???" anteriormente. Las ED50 e IC50 de los anticuerpos se analizan usando el software GraphPad Prism® 3.03 (GraphPad Software Inc., San Diego, CA) . Los mAbs TGF1, TGF2 , y TGF3 de TGF RII anti-humano exhiben separadamente actividad de enlace a TGF RII humano con ED50S de 0.031-0.059 nM en un ensayo de enlace basado en ELISA mientras que la IgG humana normal no tiene actividad de enlace al receptor. Los mAbs purificados mAbs TGF1, TGF2, y TGF3 separadamente bloquean efectivamente el enlace de TGF i, TGFP2, o TGF 3 humanos a TGF3RII humano con IC50s de 0.10-0.54 nM.

Las características de enlace y bloqueo de los anticuerpos de TGFpRII anti-humano se resumen en la Tabla 3.

Tabla 3 Características de Enlace y Bloqueo de los anticuerpos de TGF RII anti-humano La actividad de enlace del mAb MTl de TGFßRI I anti- ratón a TGF RI I de ratón tiene una ED50 de 0.054 nM y la actividad de bloqueo del mAb MTl al enlace de TGF RI I de ratón a TGF 1, GF 2, o TGF 3 de ratón tiene un valor de IC50 de 0.12-0.54 nM.

Las características de enlace y bloqueo del mAb MTl se resumen en la Tabla 4.

Tabla 4 Características de Enlace y Bloqueo de mAb MTl de TGFPRII anti-ratón Afinidad de Enlace de mAbs Anti-TGFfiRII.

Las afinidades de enlace de mAbs anti-TGFpRII se determinan por tecnología de resonancia de plasmón de superficie usando BIAcore™ 2000 a temperatura ambiente (20 -25 °C) (Pharmacia, Piscataway, NJ) . Los análisis cinéticos de los mAbs se realizan por inmovilización de una proteína de fusión de dominio extracelular recombinante ya sea de TGFpRII de ratón (SEC ID NO: 51), o el dominio extracelular de TGFPRII humano (SEC ID NO: 52) enlazado, respectivamente, ya sea con Fe humana o de ratón o región constante de cadena pesada, sobre una superficie sensora a una concentración de 5 a 100 nM. Los mAbs TGF1, TGF2, y TGF3 de TGFPRII anti-humano exhiben una alta afinidad, con valores de KD de 11, 78, 19 pM, respectivamente. El mAb MTl de TGFPRII anti-murino exhibe una alta afinidad, con un valor de KD de 33 pM.

Las cinéticas de los mAbs se resumen en la Tabla 5.

Tabla 5 Cinéticas de mAbs de TGF RII anti-humano Especificidad de especie de mAbs de TGFfiRII anti-humano .

La especificidad de mAbs de TGF RII anti-humano se determina midiendo la reactividad de los anticuerpos a TGFPRII humano o TGF RII de ratón por ELISA. El mAb TGF1 de TGF RII anti-humano no exhibe reactividad cruzada con el TGFßRII de ratón, mientras que los mAbs TGF2 y TGF3 exhiben reactividad cruzada intermedia o mínima con el TGF RII de ratón. Sin embargo, los mAbs TGF2 y TGF3 no bloquean el enlace de TGF l humano a TGF|3RII de ratón.

Enlace de mAbs anti-TGFfiRII a TGFfiRII nativo en células que expresan TGFfiRII.

La actividad de enlace del mAb TGF1 de TGF RII anti-humano y anticuerpo de IgG anti-humana de cabra etiquetado con isotiocianato de fluoresceína (FITC) se puede determinar por un ensayo de manchado con células 293 transfectantes de TGF RII humano y células de carcinoma humano. Específicamente, alícuotas de células transfectantes , células de carcinoma, células de bazo, o células de nodulo linfático se recolectan de cultivos sub-confluentes y se incuban con anticuerpos primarios no etiquetados o etiquetados con fluoresceina a las moléculas deseadas en PBS con 1% BSA (amortiguador de manchado) por 1 hora en hielo. Un isotipo de IgG igualado se usa como un control negativo. Las células se lavan dos veces con el amortiguador de manchado y luego se incuban con anticuerpo secundario de especie específica etiquetado con FITC, Ficoeritrina (PE) o Alxas Red al anticuerpo primario (BioSource International, Camarillo, CA) en el amortiguador por 30 min en hielo. Las células se lavan como anteriormente y se analizan en un citómetro de flujo. Las células muertas y residuos se eliminan del análisis sobre la base del dispersor de luz hacia delante y hacia los lados. Las unidades de intensidad fluorescente media (MFIU) se calculan como la fluorescencia logarítmica media multiplicada por el porcentaje de población positiva. La' relación de intensidad fluorescente media (MFIR) se calcula para cuantificar los niveles de expresión relativos del TGF RII en las líneas celulares. La MFIR es la intensidad de fluorescencia media (MFI) de las células manchadas con mAb específico de TGF RII dividida por la MFI de las células manchadas con un anticuerpo de control de isotipo.

El mAb TGF1 de TGF RII anti-humano demuestra la reactividad de enlace con las células 293 transíectantes de TGF RII humano y las células de carcinoma de mama humano MDA-MB-231 con MFIRs de 46 y 209, respectivamente, mientras que la IgG humana normal no es reactiva con las células. Los resultados indican que el mAb TGF1 tiene reactividad especifica con el TGFPRII humano nativo expresado en la superficie celular.

Actividad Inhibitoria de mAbs ß???-??Gß??? en la activación de cinasa Smad2 cadena abajo de TGF/3j II en respuesta al ?ß?ß? .

La fosforilación de Smad2 (p-Smad2) inducida por GF es una trayectoria de señalización cadena abajo típica de la señalización de TGF a través de TGFPRII que media las respuestas biológicas celulares tales como proliferación, motilidad, supervivencia, y diferenciación de la variedad de tipos de células. La capacidad de los mAbs de TGF RII de ratón anti-humano y TGFpRII anti-humano para inhibir la activación de p-Smad2 se puede determinar usando células de cáncer de mama murino 4T1 y células de carcinoma de mama humano MDA-MB-231 de acuerdo con el siguiente procedimiento. Brevemente, las células se hacen crecer a 80% de confluencia en medio que contiene FCS . Después del reemplazo del medio de cultivo con medio libre de suero, las células se tratan con anticuerpo o control de isotipo en la presencia de 10 ng/mL de GF por 1 hora. Después del lavado, los lisados celulares se preparan con amortiguador de lisis y se someten a electroforesis y Electro-Transferencia a membrana nitrocelulosa . La Smad2 fosforilada y Smad2 se detectan por análisis Western blot usando anticuerpos monoclonales anti-fosfo-Smad2 y Smad2 (Millipore Corporate) y sistema de quimioluminiscencia electrogenerada (ECL) , y se forman imágenes y se cuantifican por densitometria usando un Analizador de Imágenes Fuji.

Los mAbs TGF1 y MT1 anti-TGFpRII reducen la fosforilación inducida por TGF de Smad2 en células de cáncer de mama humano MDA-MB-231 y 4T1 de ratón en una manera dependiente de la dosis. La IC50 de los mAbs TGF1 y MT1 en los ensayos de inhibición de p-Smad2 se determina que es 5 ± 0.5 nM, mientras que, los mAbs TGF2 y TGF3 exhiben una IC50 menor que 25 ± 0.5 nM.

Actividad Inhibitoria de mAbs anti-TGFßRII en la migración e invasión in vitro de células de tumor.

El efecto inhibitorio de mAbs anti-TGF RII en la invasividad de células de tumor se puede determinar por ensayos de migración e invasión in vitro. Brevemente, las células de carcinoma se cargan a una densidad de 5 x 103 por cavidad en cámaras superiores insertadas en cámaras inferiores revestidas con Colágeno I y IV de placas de 48 cavidades en medio libre de suero. Las células se tratan con mAbs TGFl o MTl a dosis de 3, 10, y 30 µ?/mL en la presencia de 10 ng/mL de TGF a 37 °C por 24-48 horas. 25 pg/mL de TGFPRII-Fc o IgG de isotipo se usan en los ensayos como control positivo y negativo. Las mismas condiciones se usan en el ensayo de invasión con la excepción que se usan cámaras superiores revestidas con Matrigel. Después de la incubación, las células migradas en los lados opuestos de las cámaras superiores se fijan con 10% formalina neutra amortiguada, y se manchan con 2 µg/mL de Hoechst 33342, triclorhidrato, solución de trihidrato (Invitrogen) y se cuentan a aumento de 20X usando una Cámara de Imagen Digital Zeiss y software Image-Pro Plus 5.1.

Los mAbs TGFl y MTl anti-TGF RII significativamente inhiben la migración de células de carcinoma pancreático humano BXPC-3 y la invasión de células de carcinoma de mama murino 4T1 por 100% (P<0.0001) y 93% (P<0.0005), respectivamente, cuando se compara con el control tratado con IgG.

Estos resultados demuestran el efecto inhibitorio de los anticuerpos anti-TGFPRII de la presente invención en la invasividad de células de cáncer que portan TGFPRII en su superficie .

Actividad Inhibitoria de mAbs anti-TGF RII en la secreción de VEGF-A en células de tumor.

Los TGF s juegan un papel en la promoción de angiogénesis durante la progresión de las condiciones patológicas a través de la estimulación de la secreción de VEGF-A en células de tumor y la modulación de funciones de células endoteliales . El efecto inhibitorio de rnAbs anti-?6? ??? en la secreción inducida por 7GF de VEGF-A en células de tumor se puede determinar en cultivo celular.

Brevemente, las células de tumor se cultivan en medio libre de suero a 37°C en un incubador bajo 5% CO2 en la presencia o ausencia de 10 ng/mL de TGF y una dilución en serie de los mAbs por 48 horas. La alteración de la secreción de VEGF-A en sobrenadantes de cultivo acondicionados se determina usando un kit ELIKON (R&D Systems) según las instrucciones del fabricante.

El mAb TGF1 de TGF RII anti-humano a 10 µ?/mL inhibe la producción inducida por TGF de VEGF-A en células de tumor de mama humano MDA-MB-231 por 63% (P<0.01). El mAb MT1 de TGFPRII anti-ratón a 10 µ?/mL inhibe la producción inducida por TGF de VEGF-A en células de tumor de mama de ratón 4T1 30% (P<0.02).

Estos resultados demuestran que los mAbs anti-TGFPRII mAbs de la presente invención inhiben la angiogénesis reduciendo la secreción de VEGF-A inducida por ??? .

Actividad Inhibitoria de mAbs anti-TGFfiRII en la conversión de Treg inducida por TGFfi in vitro.

Se ha mostrado que el TGFP es capaz de inducir células T naturales para formar células T regulatorias (Treg) que tienen capacidad inmunosupresora a la respuesta inmune negativamente de control. El efecto inhibitorio de los mAbs anti-TGF RII en la conversión de células regulatorias inducida por TGF se puede evaluar in vitro como sigue.

Brevemente, células CD4+ naturales purificadas se estimulan con 1 µg/mL de anticuerpo anti-CD3 y células que presentan antigeno purificado (APC) en la presencia o ausencia de 10 ng/mL de TGF y una dilución en serie de mAb MT1 en medio RPMI completo a 37 °C en un incubador bajo 5% C02 por 7 dias. Las células luego se recolectan para manchado de células Treg CD25+/Foxp3+ y las células manchadas se analizan en un citómetro de flujo.

El mAb MT1 de TGFpRII anti-ratón a 10 µ?/mL reduce el número de células Treg inducidas por TG in vitro por 75% (P<0.005) en comparación con las células tratadas con IgG de control .

Actividad inhibitoria de mAbs 3???-???ß ?? en el crecimiento de tumor y metástasis .

La eficacia antitumor de los mAbs 3?^-??Gß??? se puede probar en modelos de tumor de metástasis subcutánea o intravenosa .

Ratones desnudos atimicos (Charles River Laboratories, ilmington, MA) , ratones Balb/c, o ratones C57B6 (Charles River Laboratories, Wilmington, MA) se pueden usar para inoculación con células de carcinoma de ratón o humanas. Para el tratamiento de tumores establecidos en modelos subcutáneos, los tumores se pueden dejar crecer a aproximadamente 200 mm3 de tamaño, y luego los ratones se pueden aleatorizar en grupos de 12-15 animales por grupo. En modelos de metástasis de pulmón, los ratones pueden ser inyectados intravenosamente con células de tumor vía la vena de la cola. Los animales pueden recibir mAb anti-TGFpRII administrado i.p. a una dosis de 10-40 mg/kg tres veces por semana. Los ratones en los grupos de control pueden recibir un volumen igual de solución salina o solución de IgG normal. El tratamiento de los animales se puede continuar por la duración del experimento. Los tumores se pueden medir dos veces por semana con calibradores. Los volúmenes de tumores se pueden calcular usando la fórmula [n/6 (wl X 2 X w2)], donde "wl" representa el diámetro de tumor más grande y "w2" representa el diámetro de tumor más pequeño.

Los datos de volumen de tumor se pueden analizar usando ANOVA de mediciones repetidas (RM-ANOVA) para determinar las diferencias significativas en los tamaños de tumores entre los tratamientos, puntos de tiempo, e interacciones de tratamiento-tiempo. Las comparaciones del crecimiento de célula de tumor in vi tro entre el tratamiento y control se pueden conducir usando la prueba t de Student de dos colas. Un valor P menor que 0.05 se considera que es estadísticamente significativo.

Los ratones que portan tumores se tratan con mAb TGF1 a una dosis de 40 mg/kg tres veces por semana 24 horas posterior a la inyección intravenosa de células de tumor o después que los tumores primarios se establecen. La administración sistémica de mAb TGF1 suprime el crecimiento de tumor primario subcutáneo de xenoinjertos de carcinoma pancreático PANC-1 (T/C=69%, ANOVA p<0.03), xenoinjertos de carcinoma pancreático BXPC-3 (T/C=30%, ANOVA p<0.0001), y xenoinjertos de carcinoma de mama MDA-MB-231 (T/C=63%, ANOVA p<0.01) .

El mAb MT1 de TGF RII anti-ratón se prueba en modelos de tumor singenéticos de ratón para determinar la actividad anti-tumor contra tumores primarios y metastásicos en ratones inmunocompetentes . Los ratones son inyectados intravenosamente (i.v.) con células de carcinoma de ratón 4T1, CT26 o B16 FIO o subcutáneamente (s.c.) con células de tumor de ratón EMT6. Los ratones reciben la administración de mAb MT1 a una dosis de 40 mg/kg tres veces por semana 24 horas posterior a la inoculación i.v. o después que los tumores subcutáneos se establecen.

La administración sistémica de mAb MT1 significativamente suprime la metástasis pulmonar de tumores 4T1, CT26, y B16 FIO por 84% (P<0.0001), 94% (P<0.0001), y 63% P<0.001), respectivamente. El mAb MTl de TGFpRII antiratón inhibe el crecimiento de tumor primario por 28% (P<0.05) y metástasis pulmonar espontánea por 84% (P<0.0001) en el modelo de tumor s.c. EMT6.

Se ha reportado que las células mieloides con un fenotipo Gr-l/CDllb+ juegan un papel significativo en la promoción de metástasis e inmunosupresión de angiogénesis durante la progresión del tumor. Las células Treg CD4/CD25/Foxp3+ tienen la capacidad de suprimir la función de las células Asesinas Naturales y células efectoras inmunes de linfocitos T citotóxicos (CTL) contra las células de tumor. La actividad inhibitoria de mAb MTl contra células inmunosupresoras , es decir, células Treg CD4/CD25/Foxp3/TGF RII+ y células mieloides Gr-l+/CDllb+/TGF3RII+ se evalúa en un modelo de tumor s.c. EMT6. El efecto inhibitorio del anticuerpo anti-TGF RII en la población de células Treg y mieloides Gr-l+/CDllb+ en ratones portadores de tumor se puede determinar por análisis FACS en la alteración de la población de Gr-l+/CDllb+ y población de CD4/CD25/Foxp3/TGF RII+ y Gr-l+/CDllb+/TGF RII+ después del tratamiento de ratones con mAb MTl.

El mAb MTl de TGFßRII anti-ratón significativamente disminuye el número de células mieloides Gr- l+/CDllb+/TGF RII+ por 95% (P<0.0001) y células Treg CD4/CD25/Foxp3/TGF RII+ por 71% (P<0.0005), respectivamente, en ratones tratados que portan tumores EMT6.

Estos resultados indican que los anticuerpos anti-??G ??? pueden controlar la población de CD4/CD25/Foxp3/TGF3RII+ y Gr-l+/CDllb+ por inhibición y/o depleción de células mieloides y Treg de TGF RII+.

Modelo de fibrosis en ratones.

El TGF es un regulador clave en la activación de las células estrelladas hepáticas (HSC) y la diferenciación de miofibroblastos, asi como también la acumulación de matriz extracelular que contribuye a la fibrosis. Los modelos de fibrosis hepática en animales se han usado ampliamente como modelos experimentales para la evaluación de la actividad de inhibidores de señalización de GFfi para inhibir la fibrosis. La deposición de colágeno es un indicador conocido de la formación de fibrosis en el hígado. La actividad terapéutica del anticuerpo anti-TGFPRII en la protección e intervención de fibrosis se puede evaluar en modelos de fibrosis hepática inducida por tetracloruro de carbono (CCI4) .

Brevemente, ratones C57BL6 pueden ser inyectados i.p. con 1 mL/kg de solución de CC14 mezclada con aceite de maíz dos veces por semana. Los ratones en el grupo de tratamiento de intervención pueden ser administrados con mAb MT1 a dosis de 40 mg/kg 3 veces por semana 14 días después que los ratones se inyectaron i.p. con CC14. Los ratones en el grupo de control pueden ser administrados con una IgG de rata de control a la misma dosificación. Ocho semanas después de la inyección de CC14, los tejidos del hígado y muestras de plasma se pueden colectar de los ratones tratados. Los niveles en plasma de alanina aminotransferasa (ALT) , un indicador de la disfunción hepática, se pueden determinar usando un kit ALT de suero (Pointe Scientific, Inc. MI). Los tejidos del hígado se pueden evaluar por análisis de inmunohistoquímica (IHC) con manchado con Rojo Sirio de deposición de colágeno.

En estudios conducidos esencialmente como se describió anteriormente, el mAb MT1 de ?TGß??? anti-ratón significativamente reduce la deposición de colágeno por 95% (P<00001) en hígados de ratones administrados con CCI4 mientras que la IgG de rata de control no tiene efecto. El mAb T1 de ?TG ?%?? anti-ratón protege al hígado de la disfunción por 85% (P<0.001) como se mide por el nivel en plasma de ALT en ratones administrados con CCl^ mientras que los ratones tratados con la IgG de rata de control tienen niveles significativamente mayores de ALT.

Estos resultados sugieren que el anticuerpo MT1 de anti-TGF RII es eficaz en la protección de ratones contra fibrosis inducida por lesión y disfunción hepática.

Estudios in vivo en el tratamiento de combinación con mAb MTl y ciclofosfamida .

La ciclofosfamida (CTX) , un potente agente citotóxico con la capacidad de suprimir las ¦ células progenitoras hematopoyéticas y mieloides, se ha reportado que tiene efectos inhibitorios en las células mieloides (Ver, Honeychurch, et al., Cáncer Res. 65:7493-7501 (2005)). Los ratones portadores de tumor EMT6 se pueden tratar con mAb MTl solo, CTX sola, o una combinación de los mismos. Por ejemplo, ratones Balb/c o ratones C57B6 (Charles River Laboratories, Wilmington, MA) se pueden usar para la inoculación con células de carcinoma. Los ratones con tumores establecidos se pueden aleatorizar en 12 animales por grupo, por ejemplo. Los animales pueden ser administrados i.p. con. 40 mg/kg de mAb anti-TGFpRII, 80 mg/kg de CXT, o una combinación de ambos 3 veces por semana. Los ratones en los grupos de control pueden recibir un volumen igual de solución salina o solución de IgG normal. Los volúmenes de tumores se pueden calcular usando la fórmula [n/6 (wl X w2 X w2)], donde "wl" representa el diámetro de tumor más grande y " 2" representa el diámetro de tumor más pequeño.

Los tratamientos de combinación con mAb MTl de TGF RII anti-ratón y CTX realizados esencialmente como se describió anteriormente reducen el crecimiento de tumor primario por 80% (P<0.0001) y metástasis pulmonar espontánea por 99.99% (P<0.000001) en ratones portadores de tumor EMT6 en comparación con la monoterapia con mAb MT1 28% (P<0.05) o CTX 62% (P<0.0005) en la inhibición del crecimiento de tumor primario y mAb MT1 84% (P<0.0001) o CTX 96 % (P<0.00001) en la inhibición de metástasis.

Los resultados demuestran que la inhibición de un subconjunto de células mieloides positivas a ??Gß??? por el anticuerpo anti-TGFpRII en combinación con quimioterapia supresora de células mieloides es una estrategia efectiva para la intervención en el crecimiento de tumor y metástasis.

Claims (18)

1. REIVINDICACIONES 1. Un anticuerpo aislado, caracterizado porque específicamente enlaza al dominio extracelular del receptor II de TGF (TGFfiRII) con una KD menor que 100 pM a temperatura ambiente (20-25°C) . 2. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque bloquea el enlace de TGFpi, TGF 2 , o TGF 3 humanos a TGF RII humano con una IC50 menor que 1.0 nM como se determina por ELISA. 3. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1 o reivindicación 2, caracterizado porque inhibe la fosforilación de Smad2 inducida por TGF3 con una IC50 menor que 30 nM. . El anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, que específicamente enlaza al TGFpRII humano, caracterizado porque comprende: i) una CDRH1 que tiene la secuencia GGSISNSYF (SEC ID NO: 1), una CDRH2 que tiene la secuencia SFYYGEKTYYNPSLKS (SEC ID NO: 2), una CDRH3 que tiene la secuencia GPTMIRGVIDS (SEC ID NO: 3), una CDRL1 que tiene la secuencia RASQSVRSYLA (SEC ID NO: 10), una CDRL2 que tiene la secuencia DASNRAT (SEC ID NO: 11), y una CDRL3 que tiene la secuencia QQRSNWPPT (SEC ID NO: 12) ; ii) una CDRH1 que tiene la secuencia GSGYRFTSY (SEC ID NO: 4), una CDRH2 que tiene la secuencia IIYPGDSDTRYSPSFQG (SEC ID NO: 5), una CDRH3 que tiene la secuencia HGRGYNGYEG (SEC ID NO: 6), una CDRL1 que tiene la secuencia RASQGISSWLA (SEC ID NO: 13), una CDRL2 que tiene la secuencia AASSLQS (SEC ID NO: 14), y una CDRL3 que tiene la secuencia QQYNSYPWT (SEC ID NO: 15) ; o, iii) una CDRH1 que tiene la secuencia GGSISSSSY (SEC ID NO: 7), una CDRH2 que tiene la secuencia SFYYSGITYYSPSLKS (SEC ID NO: 8), una CDRH3 que tiene la secuencia GFTMIRGALDY (SEC ID NO: 9), una CDRL1 que tiene la secuencia RASQSVRSFLA (SEC ID NO: 16), una CDRL2 que tiene la secuencia DASNRAT (SEC ID NO: 11), y una CDRL3 que tiene la secuencia QQRSN PPT (SEC ID NO: 12) . 5. El anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-4, caracterizado porque comprende: i) una secuencia de aminoácido de HCVR: QLQVQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISNSYFSWGWIRQPPGKGLE IGSFYYGEKTYY NPSLKSRATISIDTSKSQFSLKLSSVTAADTAVYYCPRGPTMIRGVIDSWGQGTLVTVSS (SEC ID NO: 25) y una secuencia de aminoácido de LCVR: EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVRSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPAR FSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSN PPTFGQGTKVEIK (SEC ID NO: 27) ; ii) una secuencia de aminoácido de HCVR: QVQLVQSGAAVKKPGESLKISCKGSGYRFTSYWIGWVRQMPGKGLEWMGIIYPGDSDTRYS PSFQGQVTISAGKSISTAYLQWSSLKASDTAMYYCARHGRGYNGYEGAFDIWGQGT VTVS S (SEC ID NO: 29) y una secuencia de aminoácido de LCVR: DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISSWLAWYQQKPEKAPKSLIYAASSLQSGVPSR FSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYNSYP TFGQGTKVEIK (SEC ID NO: 31); o iii) una secuencia de aminoácido de HCVR: QLQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSSSYSWGWIRQPPGKGLE IGSFYYSGITYY SPSLKSRI I ISEDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCASGFTMIRGALDY GQGTLVTVSS (SEC ID NO: 33) , y una secuencia de aminoácido de LCVR: EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVRSFLA YQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPAR FSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPPTFGQGTKVEIK ( SEC ID NO: 35) . 6. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque comprende: i) una cadena pesada de SEC ID NO: 37 y una cadena ligera de SEC ID NO: 39; ii) una cadena pesada de SEC ID NO: 41 y una cadena ligera de SEC ID NO: 43; o iii) una cadena pesada de SEC ID NO: 45 y una cadena ligera de SEC ID NO: 47. 7. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque comprende: i) una secuencia de aminoácido de HCVR: QLQVQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISNSYFSWGWIRQPPGKGLE IGSFYYGEKTYY NPSLKSRATISIDTSKSQFSLKLSSVTAADTAVYYCPRGPTMIRGVIDSWGQGTLVTVSS (SEC ID NO: 25) y ii) una secuencia de aminoácido de LCVR: EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVRSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPAR FSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPPTFGQGTKVEIK (SEC ID NO: 27) . 8. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque comprende dos cadenas pesadas de SEC ID NO: 37 y dos cadenas ligeras de SEC ID NO: 39. 9. Un fragmento de enlace de TGFPRII humano del anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-8. 10. Un anticuerpo aislado o fragmento funcional del mismo, caracterizado porque el anticuerpo compite para enlace al dominio extracelular de TGF RII en un ensayo de ELISA de competencia con un anticuerpo competente de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 4 a 9, en donde el anticuerpo competente enlaza a TGF RII con una KD menor que 100 pM a temperatura ambiente (20-25°C) . 11. El anticuerpo aislado de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque el anticuerpo bloquea el enlace de TGFpi, TGFP2, o TGFp3 humanos al TGF RII humano con una IC50 menor que 1.0 nM como se determina por ELISA. 12. Una composición farmacéutica, caracterizada porque comprende un anticuerpo o fragmento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-11 y un portador, diluyente, o excipiente farmacéuticamente aceptable. 13. Un producto, caracterizado porque contiene un anticuerpo o fragmento, de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-11, y un agente anti-cáncer adicional para el tratamiento en combinación para uso simultáneo, separado o consecutivo en terapia. 14. Un anticuerpo o fragmento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-11, caracterizado para uso como un medicamento . 15. Un anticuerpo o fragmento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-11, caracterizado para uso en el tratamiento de cáncer. 16. Un anticuerpo o fragmento de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque el cáncer es de mama, pulmón o pancreático. 17. Un anticuerpo o fragmento de conformidad con la reivindicación 16, con untamente con un agente anti-cáncer. 18. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque el agente anti-cáncer es ciclofosfamida .