EA025169B1 - Антитела к рецептору ii tgf-бета - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к антителам, которые связывают рецептор II трансформирующего фактора роста бета (TGFβRII) человека, фармацевтическим композициям, содержащим антитела, и способам применения антител в отдельности или в комбинации, например, для лечения рака и фиброза.

Description

Настоящее изобретение относится к области медицины, в частности к антителам, которые связывают рецептор II трансформирующего фактора роста бета человека (ΤΟΡβΚΙΙ), фармацевтическим композициям, содержащим антитела, и способам применения таких антител, например, для лечения рака, фиброза и фиброзных заболеваний.

Факторы ΤΟΡβ представляют собой плейотропные цитокины, которые регулируют рост и дифференцировку клеток, подвижность, выработку внеклеточного матрикса и иммунные функции. Факторы ΤΟΡβ включают три изоформы ΤΟΡβ-1, ΤΟΡβ-2 и ΤΟΡβ-3 млекопитающих, каждая из которых выполняет определенные функции ίη νίνο. Все три ΤΟΡβ используют одну сигнальную рецепторную систему. Связывание ΤΟΡβ с ΤΟΡβΚΙΙ является ключевым этапом в первоначальной активации сигнального пути ΤΟΡβ, приводящего к фосфорилированию 8таб2 и переносу активированного комплекса 8таб2/§таб4 в ядро для модуляции экспрессии генов.

В документе ΙΡ 2004/121001А описаны моноклональные антитела человека (МАТ), которые связывают ΤΟΡβΚΙΙ человека с высокой степенью сродства (К_с 8,06х10^-10 и 1,91х 10^-9 М), для лечения заболевания почек и тканевого фиброза. В заявке также указано, что МАТ подавляют вызванный ΤΟΡβ рост кератиноцитов (среднее значение ΙΟ₅₀ 2,17-3,89, 3,17-4,95 и 3,21-5,07 мкг/мл). Сообщалось, что применение моноклонального антитела человека к ΤΟΡβΚΙΙ эффективно для снижения отложения внеклеточного матрикса в модели анти-ΤΗу-1 нефрита у крыс (Какида, Н., с1 а1., КИпсу Ιηΐ'1, νοί. 60 (2001). 1745-1755).

До сих пор не были описаны высокоспецифичные, обладающие высоким сродством антитела к ΤΟΡβΚΙΙ, которые специфично связывают внеклеточный домен ΤΟΡβΚΙΙ человека с очень высокой степенью сродства, блокируют связывание ΤΟΡβ1, ΤΟΡβ2 и ΤΟΡβ3 человека с ΤΟΡβΚΙΙ человека, подавляют ангиогенез, рост опухолевых клеток, миграцию и инвазию опухолевых клеток, снижают отложение коллагена и функцию печени, подавляют вызванную лигандами регуляцию Т-клеток или, в сочетании с цитотоксическими агентами, подавляют рост опухоли. Поэтому существует потребность в указанных антителах.

Настоящее изобретение направлено на обеспечение новых выделенных МАТ к ΤΟΡβΚΙΙ, которые удовлетворят эти потребности. ΤΟΡ бета ΚΙΙ представляет собой рецептор млекопитающего, предпочтительно человека. Антитела согласно настоящему изобретению оказывают одно или более из следующих действий: 1) связываются с высокой степенью сродства с внеклеточным доменом ΤΟΡβΚΙΙ человека; 2) блокируют связывание лигандов ΤΟΡβΚΙΙ (ΤΟΡβ1, ΤΟΡβ2 и ΤΟΡβ3) с ΤΟΡβΚΙΙ, тем самым ингибируют вызванное ΤΟΡβ фосфорилирование 8таб2; 3) интернализируют ΤΟΡβΚΙΙ, который способен выступать в качестве механизма понижающей регуляции передачи сигнала, независимого от взаимодействия лиганда с рецептором; 4) подавляют лиганд-индуцируемые пути передачи сигнала ΤΟΡβΚΙΙ; 5) подавляют функции клетки, опосредованные ΤΟΡβΚΙΙ; 6) подавляют рост опухоли ίη νίίτο и ίη νίνο; а также более предпочтительно дополнительно способны оказывать одно или более из следующих действий: 7) подавлять ангиогенез посредством снижения секреции фактора роста эндотелия сосудов А (νΕΟΡ-Α), вызванной ΤΟΡβ; 8) подавлять миграцию и инвазию раковых клеток; 9) снижать отложение коллагена и функцию печени; 10) подавлять вызванную лигандом регуляцию Т-клеток с образованием Т-регуляторных клеток, которые оказывают иммуносупрессивное действие; или 11) в комбинации с цитотоксическими агентами подавлять рост опухоли.

Моноклональное антитело с высокой степенью сродства, которое избирательно связывается с ΤΟΡβΚΙΙ и нейтрализует ΤΟΡβΚΙΙ-опосредованную активность, будет особенно полезно в качестве терапевтического биологического агента для лечения заболеваний, опосредованных сигналлингом ΤΟΡβ.

Согласно первому аспекту настоящее изобретение обеспечивает выделенные антитела, которые специфично связываются с внеклеточным доменом ΤΟΡβΚΙΙ человека с К_с менее 100 пМ при комнатной температуре (20-25°С).

Согласно одному аспекту настоящего изобретения антитела согласно настоящему изобретению блокируют связывание ΤΟΡβ1, ΤΟΡβ2 или ΤΟΡβ3 человека с ΤΟΡβΚΙΙ с Ιί\₀ менее 1,0 нМ согласно результатам анализа ΕΌΙδΑ.

Согласно другому аспекту настоящего изобретения антитела согласно настоящему изобретению подавляют вызванное ΤΟΡβ фосфорилирование 8таб2 с Ιί\₀ менее 30 нМ.

Согласно другому аспекту настоящего изобретения антитела согласно настоящему изобретению включают антитело, которое специфично связывается с ΤΟΡβΚΙΙ, содержащее:

ί) участок ΟΌΚΗ1, содержащий последовательность ΟΟδΙδΝδΎΡ (δΕΟ ΙΌ N0: 1), участок ΟΌΚΗ2, содержащий последовательность δΡΥΥΟΕΚΤΥΎΝΡδΕΚδ (δΕΟ ΙΌ N0: 2), участок ί.’ΌΡΗ3 содержащий последовательность ΟΡΤΜΙΚΟνΙΌδ (δΕΟ ΙΌ N0: 3), участок ί,’ΌΡΕΕ содержащий последовательность ΚΑδΟδνΚδΥΌΑ (δΕΟ ΙΌ N0: 10), участок ί.’ΌΡΕ2. содержащий последовательность ΌΑδΝΚΑΤ (δΕΟ ΙΌ N0: 11), и участок ί.’ΌΡΕ3, содержащий последовательность ^^ΚδN^ΡΡΤ (δΕΟ ΙΌ N0: 12); или

- 1 025169 ίί) участок ί'ΌΡΗΙ. содержащий последовательность ΟΟδΙδδδδΥ (δΕΟ ΙΌ N0: 7), участок СЭРН2. содержащий последовательность δΡΥΥδΟΙΤΥΥδΡδΕΚδ (δΕΟ ΙΌ N0: 8), участок СЭРН3. содержащий последовательность ΟΕΤΜΙΚΟΑΡΌΥ (δΕΟ ΙΌ N0: 9), участок СЭРЕ1. содержащий последовательность ΚΆδΟδνΚδΕΕΆ (δΕΟ ΙΌ N0: 16), участок СЭРЕ2. содержащий последовательность ΌΑδΝΚΆΤ (δΕΟ ΙΌ N0: 11), и участок 0ΌΚΡ3, содержащий последовательность ^^ΚδN^ΡΡΤ (δΕΟ ΙΌ N0: 12).

Согласно другому аспекту настоящего изобретения антитела согласно настоящему изобретению содержат:

ί) аминокислотную последовательность НС'УР:

0Ь0У0Е8ОРеЬУКР8ЕТЬ8ЪТСТУЗСе318ЫЗУР8И6И1Е0РРСКГЬЕИ1еЗРУУСЕК

ТУУЫР5ЬКБЕАТ15 ЮТЗКЗОРЗЬКЬЗЗЗГГААОТАУУУСРЕСРТРИЕОУЮЗИСООТЬУТУЗЗ (ВЕ$ ΙΏ N0:25) и аминокислотную последовательность ЬСУК:

Е1УЬТОЗРАТЬЗЬЗРСЕЕАТЬБСЕАЗОЗУЕЗУЕАИУООКРСОАРЕЬЫУОАЗЫЕАТС1

ΡΆΕΡ50308ΟΤΟΡΊΈΤΙ88ΕΕΡΕΌΡΑνΎΥ00<2Ε3ΝΝΡΡΤΡΟ<2<3ΤΚνΕΙΚ {ЗЕО Ю

N0:27); ИЛИ ίί) аминокислотную последовательность НСУК:

0Е0Ь0ЕЗСРОЬУКРЗЕТЬЗЬТСТУЗСО313БББУЗИ(ЗИ1Е0РРСКГЬЕН1ОЗРУУЗС1

ΤΥΥ3 Р 3 ЬКЗ ЕI113ΕΌΤ3ΚΝ0Ρ3 ЬКЬ3 3УТААОТАУУУСАЗΘΡΤΜIЕСАЕПУИООСТЪУТУЗ3 (5Е<2 ΙΏ N0:33) , И аминокислотную последовательность ЬСУК:

Е1УЬТаЗРА1Ъ5ЬЗРСЕЕАТЬ5СЕА5(25УЕ5РЬАИУ(2(ЭКРС<2АРЕЬЫ Υ0Α3ΝΕΑΤ0Ι

РАЕРЗОЗСЗСТОРТ1/Г185ЬЕРЕОРАУУУС00КЗКНРРТРС0СТКУЕ1К(ЗЕО ΙΌ

N0:35).

Согласно другому аспекту настоящего изобретения антитела согласно настоящему изобретению содержат аминокислотную последовательность НСУК:

ОЬОУОЕЗСРСЬУКРЗЕТЪЗЬТСТУЗССЗI3Ν3УРЗИСИ1ЕОРРСКГЪЕИЮЗРУУСЕК

ТУУЫРЗЬКЗЕАТХЗЮТЗКбОРЗЬКЬББУТААЛТАУУУСРКОРТМХЕОУЮЗИСЗООТЬУТУбЗ (ЗЕО Ю N0:25) и аминокислотную последовательность ЬСУК:

Е1УЬТОЗРАТЬЗЕЗРСЕЕАТЬЗСЕАЗОЗУЕЗУЬАМУООКРеОАРЕЬЫΥ0Α5ΝΕΑΤ0Ι

РАЕР5С5С5СТОРТЬТ153ЬЕРЕОРАУУУС2<2Е5ЫИРРТРа<ЭСТКУЕ1К (ЗЕО Ю

N0:27).

Согласно другому аспекту настоящего изобретения антитела согласно настоящему изобретению содержат:

ί) тяжелую цепь, содержащую последовательность δΕΟ ΙΌ N0: 37; или ίί) тяжелую цепь, содержащую последовательность δΕΟ ΙΌ N0: 6, и легкую цепь, содержащую последовательность δΕΟ ΙΌ N0: 14.

Согласно другому аспекту настоящего изобретения антитела согласно настоящему изобретению содержат две тяжелые цепи, содержащие последовательность δΕΟ ΙΌ N0: 37, и две легкие цепи.

Согласно другому аспекту настоящего изобретения настоящее изобретение включает фрагмент, связывающий ΤΟΕβΚΙΙ человека.

Предполагается, что любое антитело согласно настоящему изобретению можно вводить пациенту, нуждающемуся в таком лечении. Соответственно согласно одному аспекту настоящего изобретения предложена фармацевтическая композиция, содержащая антитело или фрагмент согласно настоящему изобретению и фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель или наполнитель.

Согласно предпочтительному аспекту настоящего изобретения антитело или функциональный фрагмент указанного антитела конкурирует за связывание с внеклеточным доменом ΤΟΕβΚΙΙ в процессе конкурентного анализа ΡΌΙδΑ с конкурентным антителом, при этом указанное конкурентное антитело связывает ΤΟΕβΚΙΙ с Κ менее 100 пМ при комнатной температуре (20-25°С).

Согласно другому предпочтительному аспекту настоящего изобретения антитело согласно настоящему изобретению блокирует связывание ΤΟΕβ1, ΤΟΕβ2 или ΤΟΕβ3 человека с ΤΟΕβΚΙΙ человека с Κ.’₅₀ менее 1,0 нМ согласно результатам анализа ΕΕΙδΆ.

Предполагается также, что МАТ согласно настоящему изобретению можно применять для лечения фиброза или фиброзных заболеваний легких, печени и почек. Согласно одному аспекту настоящего изо- 2 025169 бретения предложен способ лечения фиброза или фиброзных заболеваний легких, печени и почек, включающий введение пациенту, нуждающемуся в таком лечении, эффективного количества МАТ согласно настоящему изобретению.

Согласно одному аспекту настоящее изобретение обеспечивает антитела согласно настоящему изобретению для применения в качестве лекарственного средства. Согласно одному аспекту настоящее изобретение обеспечивает антитела согласно настоящему изобретению для применения для лечения рака. Согласно дополнительному аспекту настоящее изобретение обеспечивает антитела для применения для лечения рака молочной железы, рака легких или рака поджелудочной железы. Антитела согласно настоящему изобретению можно применять для лечения рака совместно с противоопухолевым агентом. Согласно другому аспекту настоящее изобретение обеспечивает продукт, содержащий антитело или фрагмент указанного антитела и дополнительный противоопухолевый агент для комбинированного одновременного, раздельного или последовательного терапевтического применения.

Согласно предпочтительному аспекту настоящее изобретение обеспечивает выделенное антитело, которое специфично связывается с внеклеточным доменом ΜΌΡβΚΙΙ, содержащим участок СЭКН1, содержащий последовательность ΟΟδΙδΧιδΧ₂Χ₃ (δΕΟ ГО N0: 17), где Χι представляет собой N или δ, Х₂ представляет собой Υ или δ и Х₃ представляет собой Р или Υ;

участок СГОКН2. содержащий последовательность δΡΥΥΧ₁Χ₂Χ₃ΤΥΥΧ₄ΡδΕΚδ (δΕΟ ΙΌ N0: 18), где Χ₁ представляет собой О или δ, Х₂ представляет собой Е или О, Х₃ представляет собой Κ или I, Х₄ представляет собой N или δ;

участок СЭКН3, содержащий последовательность ΟΧ1ΤΜΙΚΟΧ2Χ3ΌΧ4 (δΕΟ ΙΌ N0: 42), где Χ₁ представляет собой Р или Р, Х₂ представляет собой V или А, Х₃ представляет собой Ι или Ь, Х₄ представляет собой δ или Υ;

участок СЭКЫ, содержащий последовательность ΚΑδΟδνΚδΧ]Ε·Α (δΕΟ ΙΌ N0: 20), где Χ₁ представляет собой Υ или Р;

участок СОКЬ2, имеющий последовательность ΌΑδΧΚΑΤ (δΕΟ ΙΌ N0: 11); и участок С0КЬ3, содержащий последовательность СС^ЖУРРТ^ВС ГО N0: 12).

Согласно другому аспекту настоящее изобретение обеспечивает способ лечения рака у пациента, включающий введение указанному пациенту эффективного количества антител согласно настоящему изобретению. Рак может представлять собой рак молочной железы, рак легкого или рак поджелудочной железы. Антитела можно вводить пациенту совместно с эффективным количеством другого противоопухолевого агента одновременно, по отдельности или последовательно. Противоопухолевый агент может представлять собой циклофосфамид.

Согласно другому аспекту настоящее изобретение обеспечивает выделенное антитело, которое специфично связывается с внеклеточным доменом рецептора ΙΙ ΤΟΡβ (ΤΟΡβΚΙΙ) человека, содержащим участок С0КН1, содержащий последовательность ΟΟδΙδΧδΥΡ (δΕΟ ΙΌ N0: 1), участок С0КН2, содержащий последовательность δΡΥΥΟΕΚΤΥΥΥΡδΕ-Κδ (δΕΟ ΙΌ N0: 2), участок С0КН3, содержащий последовательность ΟΡΤΜΙΚΟνΙΌδ (δΕΟ ΙΌ N0: 3), участок С0КЬ1, содержащий последовательность ΚΑδρδνΚδΥΌΑ (δΕΟ ΙΌ N0: 10), участок С0КЬ2, содержащий последовательность ΌΑδΧΚΑΤ (δΕΟ ΙΌ N0: 11), и участок С0КЬ3, содержащий последовательность ΟΟΚδΧ^ΡΡΤ (δΕΟ ΙΌ N0: 12); или участок С0КН1, содержащий последовательность ΟΟδΙδδδδΥ (δΕΟ ΙΌ N0: 7), участок С0КН2, содержащий последовательность δΡΥΥδΟΙΤΥΥδΡδΌΚδ (δΕΟ ΙΌ N0: 8), участок СОКН3, содержащий последовательность ΟΡΤΜΙΚΟΑΌΌΥ (δΕΟ ΙΌ N0: 9), участок СОКЬ1, содержащий последовательность ΚΑδΟδνΚδΡΒΑ (δΕΟ ΙΌ N0: 16), участок СОКЬ2, содержащий последовательность ΌΑδΧΚΑΤ (δΕΟ ΙΌ N0: 11), и участок СОКЬ3, содержащий последовательность ΟΟΚδΧ^ΡΡΤ (δΕΟ ΙΌ N0: 12), или ΤΟΡβΚΙΙ-связывающий фрагмент антитела.

Другой аспект настоящего изобретения включает антитело согласно настоящему изобретению, которое содержит аминокислотную последовательность НСVΚ:

^^^V^ΕδΟΡΟ^VΚΡδΕΤ^δ^ΤСΤVδΟΟδIδNδΥΡδУΟУIΚ^ΡΡΟΚΟ^ΕУIΟδΡΥΥΟΕΚΤΥΥNΡ δΡΚδΚΑΤΙδΙΙ)ΤδΚδΕ)ΡδΡΙΚ,δδνΤΑΑΙ)ΤΑ\ΎΥΤ^-ΡΚΟΡΤ\1ΙΚΟ\ΊΙ)δ\\ΌΕ)(ΕΕΡνΤνδδ (δΙΤ) ΙΌ N0: 25) и аминокислотную последовательность ΌΟνΚ:

ΕIV^Τ^δΡΑΤ^δ^δΡΟΕΚΑΤ^δСΚΑδ^δVΚδΥ^ΑУΥ^^ΚΡΟ^ΑΡΚ^^IΥ^ΑδNΚΑΤΟIΡΑΚΡδ ΟδΟδ(ΕΕΙ)ΕΊΤΤΙδδΡΕΡΕΙ)ΡΑ\ΑΑΤΤ)Ε)Ρδ\\\'ΡΡΤΡΟΕ)(ΕΕΚ\ΈΙΚ (δΕΟ ΙΌ N0: 27) или аминокислотную последовательность НСVΚ:

^^^^^ΕδΟΡΟ^VΚΡδΕΤ^δ^ΤСΤVδΟΟδIδδδδΥδУΟУIΚ^ΡΡΟΚΤ^ΕУIΟδΡΥΥδΟIΤΥΥδΡ δ^ΚδΚШδΕ^ΤδΚN^Ρδ^Κ^δδVΤΑΑ^ΤΑVΥΥСΑδΟΡΤΜIΚΟΑ^^ΥУΟ^ΟΤ^VΤVδδ (δΕΟ ΙΌ N0: 33) и аминокислотную последовательность ΌΟνΚ:

ΕIV^Τ^δΡΑΤ^δ^δΡΟΕΚΑΤ^δСΚΑδ^δVΚδΡ^ΑУΥ^^ΚΡΟ^ΑΡΚ^^IΥ^ΑδNΚΑΤΟIΡΑΚΡδ ΟδΟδ(ΕΕΙ)ΕΊΤΤΙδδΕΕΡΕΙ)ΕΑ\ΑΑΤ^-ΟΟΡδ\\\'ΡΡΤΕΟΟ(ΕΕΚ\ΈΙΚ (δΕΟ ΙΌ N0: 35), или

- 3 025169

ΤΟΡβΚΙΙ-связывающий фрагмент антитела.

Другой аспект настоящего изобретения включает антитело согласно настоящему изобретению, содержащее тяжелую цепь, содержащую последовательность 8ЕО ГО N0: 37; или тяжелую цепь, содержащую последовательность 8Е0 ГО N0: 6, и легкую цепь, содержащую последовательность 8Е0 ГО N0: 14.

Термин выделенное антитело обозначает антитело, которое (1) частично, существенно или полностью очищено от смеси других компонентов; (2) идентифицировано и выделено и/или извлечено из компонента соответствующей естественной среды; (3) является моноклональным; (4) не содержит других белков тех же видов; (5) экспрессируется клеткой другого вида или (6) не встречается в природе.

Примесные компоненты соответствующей естественной природы.

Примесные компоненты соответствующей естественной среды представляют собой вещества, которые будут препятствовать диагностическому или терапевтическому применению антитела и могут включать ферменты, гормоны и другие белковые или небелковые вещества. К примерам выделенных антител относится антитело, которое было аффинно очищено, антитело, которое было продуцировано гибридомной клеткой или другой клеточной линией ίη νίίτο, и антитело человека, полученное из трансгенной мыши.

В настоящем описании термин антитело обозначает молекулы иммуноглобулина, содержащие 4 полипептидные цепи, две тяжелые цепи (Н) и две легкие цепи (Ь), поперечно связанные дисульфидными связями. Каждая тяжелая цепь состоит из вариабельного участка тяжелой цепи (сокращенно НСУК или УН) и константного участка тяжелой цепи. Константный участок тяжелой цепи состоит из трех доменов СН1, СН2 и СН3. Каждая легкая цепь состоит из вариабельного участка легкой цепи (сокращенно ЬСУК. или УЪ) и константного участка легкой цепи. Легкие цепи антител (иммуноглобулинов) любого вида позвоночных на основе аминокислотных последовательностей их константных доменов можно отнести к одному из двух четко выраженных типов, обозначаемых каппа (к) и лямбда (λ). В настоящем описании вариабельные участки легких каппа цепей обозначаются Ук. Термин УЪ в настоящем изобретении включает вариабельные участки легких цепей каппа-типа (У к) и легких цепей лямбда-типа. Константный участок легкой цепи состоит из одного домена СЬ. Участки УН и УЪ содержат участки гипервариабельности, обозначаемые термином участки, определяющие комплементарность (СОК), между которыми расположены более консервативные участки, обозначаемые термином каркасные участки (РК). Каждый УН и УЪ состоит из трех СОК и четырех РК, которые расположены от амино- до карбоксигруппы в следующем порядке: РК1-СПК1-РК2-СПК2-РК3-СПК3-РК4.

СПКН1 обозначает первый участок СОК в тяжелой цепи антитела, СПКН2 обозначает второй участок СОК тяжелой цепи антитела, и СПКН3 обозначает третий участок СОК тяжелой цепи антитела. СПКЬ1 обозначает первый участок СОК легкой цепи антитела, СПКЬ2 обозначает второй участок СОК легкой цепи антитела, и СПКР3 третий участок СОК легкой цепи антитела.

Термин антигенсвязывающий фрагмент обозначает часть или фрагмент интактного антитела, содержащего его антигенсвязывающий или вариабельный участок. К примерам фрагментов антител относятся антитела неполной длины, например фрагмент РаЬ, Р(аЬ')₂ или одноцепочечный вариабельный фрагмент (δοΡν). Аналогично, изобретение включает диатела, линейные антитела, одноцепочечные антитела, химерные белки, рекомбинантные белки, мультивалентные или мультиспецифичные антитела, состоящие или частично состоящие из антигенсвязывающего фрагмента согласно настоящему изобретению.

В настоящем описании термин ΤΟΡ-β рецептор II или ΤΟΡβΒΙΙ обозначает рецептор поверхности клеток, который связывает лиганд, включая, но не ограничиваясь указанными, ΤΟΡβ1, ΤΟΡβ2, и ΤΟΡβ3, и в результате инициирует путь сигнальной трансдукции в клетке. ΤΟΡβΒΙΙ человека представляет собой трансмембранный белок, который кодируется последовательностью ДНК 8Е0 ГО N0: 40.

Антитела согласно настоящему изобретению связывают ΤΟΡβΒΙΙ человека, в частности внеклеточный домен ΤΟΡβΒΙΙ человека, и блокируют связывание ΤΟΡβ1, ΤΟΡβ2 и ΤΟΡβ3 человека с ΤΟΡβΒΙΙ человека.

Антитела согласно настоящему изобретению также включают антитела, связывающие характеристики которых улучшили с помощью направленного мутагенеза, методами созревания аффинности, методом фагового дисплея или перестановкой цепей, известными в данной области техники. Антитела согласно настоящему изобретению включают любую комбинацию тяжелых и легких цепей (как полноразмерных, так и их частей) антител согласно изобретению, обозначенных ΤΟΡ1 и ΤΟΡ3.

Антитела согласно настоящему изобретению можно применять в качестве матрицы или родительского антитела для создания дополнительных антител согласно изобретению с помощью различных методов, включая пересадку СОК, обшивку или нанесение нового покрытия и перестановку цепей (например, согласно патенту И8 5565332). Антитела человека согласно настоящему изобретению могут включать аминокислотные остатки, не кодируемые зародышевыми последовательностями иммуноглобулинов человека (например, мутации, возникшие из-за случайного или сайт-специфического мутагенеза ίη νίΐτο или соматических мутаций ίη νίνο), например, в СОК. Антитело человека может содержать по меньшей мере одну аминокислотную замену, например остаток аминокислоты, усиливающий активность, который

- 4 025169 не кодируется эмбриональной последовательностью иммуноглобулина человека, и таким образом, образуются дополнительные аминокислотные последовательности вариабельного участка, полученные из приведенных в настоящем описании последовательностей.

Согласно одному из подходов СОК родительского антитела пересаживают на каркас человека, последовательность которого в высокой степени идентична каркасу родительского антитела. Обычно последовательность нового каркаса по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85% или по меньшей мере на 90% идентична соответствующему каркасу родительского антитела. Эта пересадка может приводить к снижению связывающего сродства по сравнению с родительским антителом. В этом случае каркас может мутировать к первоначальному виду родительского каркаса в определенных позициях на основе специфических критериев, предложенных Онссп (Оиссп. е! а1., Ргос. Νηΐ1. Асай. δοί. И8Л, 88, 2869 (1991)). Можно использовать другие методы, включая, например, 1оие8 е! а1., ΝαΙυΓΟ, 321:522 (1986); ЮесЬтаии е! а1., №!иге, 332:323-327 (1988) и Уегйоеуеи е! а1., 8с1епсе, 239:1534 (1988).

В специфический сайт замены можно ввести до 20 различных природных аминокислот. Затем с помощью процесса отбора ίη νίίτο, определенного в настоящем описании, можно отобрать среди этих дополнительных аминокислотных последовательностей вариабельных участков РаЬ фрагменты, обладающие необходимой перекрестной реактивностью ίη νίίτο. Таким образом, определяют дополнительные фрагменты РаЬ, которые подходят для получения гуманизированного антитела согласно настоящему изобретению. Предпочтительно замены аминокислот в каркасе ограничиваются одной, двумя или тремя позициями в пределах одной или каждой каркасной последовательности, указанной в настоящем изобретении. Предпочтительно замены аминокислот в пределах СОК ограничены одной-тремя позициями в пределах одного или каждого СОК, более предпочтительно, проводят замену аминокислот в одной или двух позициях в пределах одного или каждого СОК. Еще более предпочтительно проводят замену аминокислот в одной или двух позициях в СОК вариабельного участка тяжелой цепи. Соответствующие методы комбинирования СОК и замен в каркасе для получения альтернативных антител согласно настоящему изобретению с использованием антител, указанных в настоящем изобретении, представлены в работе №и е! а1., 1. Мо1. Вю1., 294:151-162.

Термин К_с обозначает константу диссоциации конкретного взаимодействия антигена с антителом. Ее высчитывают по формуле к_о££/к_оп=К_с. Термин к_оп обозначает константу ассоциации или скорость прямой реакции или константу скорости прямой реакции или комплекс образующей реакции, измеряемую в единицах: М^-1-с^-1. Термин к_о££ обозначает константу диссоциации или константу скорости реакции диссоциации антитела из комплекса антитела с антигеном, измеряемую в единицах: 1/с. Зачастую связывающая способность антитела согласно настоящему изобретению соответствует более низкой ко££, чем с повышенной коп, однако, не будучи связанной с теорией, изобретение включает варианты реализации изобретения с повышенными ко££ и коп. В одном более предпочтительном аспекте антитела согласно настоящему изобретению представляют собой антитела с большой мощностью или их фрагменты, характеризующиеся низкими значениями ко££.

В некоторых аспектах антитела согласно настоящему изобретению характеризуются К_с приблизительно 1-200 пМ, приблизительно 5-100 пМ или приблизительно 10-80 пМ.

В настоящем описании термины блокирует связывание и подавляет связывание, употребляемые взаимозаменяемо, обозначают блокирование/подавление связывания цитокина с его рецептором, что приводит к полному или частичному подавлению или снижению биологической функции сигнального пути через цитокин/рецептор. Блокирование/подавление связывания ΤΟΡβ с ΤΟΡβΒΙΙ определяют посредством полного или частичного подавления или снижения одного или более ίη νίΙΐΌ или ίη νί\Ό показателей активности ΤΟΡβ, таких как связывание с рецептором, подавляющее действие на рост клеток, хемотаксис, апоптоз, фосфорилирование внутриклеточных белков или передача сигнала. Способность блокировать связывание ΤΟΡβ с ΤΟΡβΡΙΙ можно измерять с помощью ЕЬТЗА, как указано в настоящем описании. Способность подавлять работу ΤΟΡβ можно оценить через измерение подавления фосфорилирования §тай2 в клетке, например, клетках МОА-МВ-231 человека, как указано в настоящем описании.

Антитела согласно настоящему изобретению блокируют связывание ΤΟΡβ1, ΤΟΡβ2, или ΤΟΡβ3 человека с ΤΟΡβΒΙΙ человека с 1С₅₀ приблизительно 0,05-1,0 нМ, приблизительно 0,08-0,75 нМ или приблизительно 0,10-0,60 нМ.

Антитела согласно настоящему изобретению подавляют фосфорилирование 8тай2, вызванное ΤΟΡβ, с Ιί\₀ меньше или равно приблизительно 2,0-30 нМ, приблизительно 3,0-15,0 нМ или приблизительно 4,0-7,5 нМ в анализе блокирования ίη νί^Ό, например в анализе блокирования клеток МОА-МВ-231 ίη νίΟΌ, как указано в настоящем описании.

Антитела могут иметь отличающиеся или измененные характеристики гликозилирования по сравнению с природными антителами. Как известно из предшествующего уровня техники, характеристики гликозилирования могут зависеть от последовательности антитела (например, присутствия или отсутствия конкретных аминокислотных остатков гликозилирования) или клетки-хозяина или организма, в котором вырабатывается белок. Предполагается, что антитела согласно настоящему изобретению включают антитела, указанные в настоящем изобретении, а также их гликозилированные варианты.

- 5 025169

Настоящее изобретение также включает векторы экспрессии, содержащие любые из указанных в настоящем описании полинуклеотиды. К примерам векторов относятся плазмиды, фагмиды, вирусы и фаговые нуклеиновые кислоты или другие молекулы аминокислот, способные к репликации в хозяинепрокариоте или эукариоте, таком как клетка-хозяин, например клетка млекопитающего. Вектор может представлять собой вектор экспрессии, где полинуклеотид, кодирующий антитело, действенным образом связан с элементами контроля экспрессии. Типичные векторы экспрессии включают терминаторы транскрипции и трансляции, последовательности инициации и промоторы, применяемые для экспрессии молекул нуклеиновых кислот согласно настоящему изобретению. Векторы также могут включать кассеты экспрессии генов, содержащие независимую последовательность терминатора, последовательности, разрешающие репликацию вектора в организме как прокариот, так и эукариот, т.е. челночные векторы, и маркеры селекции для эукариотических и прокариотических систем. Векторы обычно содержат маркер фенотипического признака для отбора трансформированных хозяев, например маркеры устойчивости к антибиотикам, например ампициллину или неомицину.

Соответствующие промоторы включают конститутивные и индуцибельные промоторы. К примерам промоторов относятся промоторы, полученные из цитомегаловируса человека, промотор металлотионеина, ранний промотор 8У-40, поздний промотор 8У-40, промотор вируса рака молочной железы мыши, промотор вируса саркомы Рауса и промотор полиэдрина.

Также настоящее изобретение включает рекомбинатные клетки, содержащие молекулу нуклеиновой кислоты или вектор экспрессии согласно настоящему изобретению. Термин рекомбинантная клетка обозначает многоклеточный организм, не относящийся к человеку, или клетку-хозяина, что обозначает клетку или популяцию клеток, в которую вводят молекулу нуклеиновой кислоты или вектор согласно настоящему изобретению. Клетка-хозяин согласно настоящему изобретению может представлять собой клетку эукариота или клеточную линию, например клетку или клеточную линию растения, позвоночного, млекопитающего, грызуна, мыши, примата или человека.

Согласно одному аспекту настоящего изобретения хозяин согласно настоящему изобретению может представлять собой прокариота или эукариота. Соответствующие хозяева-прокариоты включают, например, такие штаммы ЕксйейсЫа сой, как Е.сой 80-936, Е.сой НВ 101, Е.сой ^3110, Е.сой Х1776, Е.сой Х2282, Е.сой ΌΗΙ и Е.сой МК.С1, Ркеийотопак, Васй1и8, такие как Васй1и8 8иЬйЙ8, и 8йер1отусе8. Соответствующие клетки эукариот включают дрожжи и другие грибы, клетки насекомых, растений, человека и животных, включая клетки млекопитающих, такие как гибридомные линии, клетки СО8, N80 и СНО.

Настоящее изобретение включает способы получения антитела посредством культивирования рекомбинантной клетки, экспрессирующей одну или более последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую антитело согласно настоящему изобретению, и очистку антитела из культуральной среды. Синтезированное таким образом антитело обычно очищают или выделяют после экспрессии. Антитела можно выделять или очищать различными способами, известными специалисту в данной области техники. Стандартные способы очистки включают методы хроматографии, электрофореза, иммунологические методы, методы преципитации, диализа, фильтрации, концентрирования и хроматофокусирования. Как хорошо известно в данной области техники, различные природные белки связывают антитела, например бактериальные белки А, О, и Ь, и эти белки можно использовать для очистки в настоящем изобретении. Можно проводить очистку с использованием определенного связывающего агента. Например, белки можно очищать с использованием глутатионовой смолы, если применяют О8Т слияние, аффинной хроматографией на ионах №⁺², если применяют Ηίδ-Тад, или иммобилизованного антитела к Р1ад, если применяют Ηίδ-Тад. Антитело можно очищать посредством выделения его из культуральной среды. Можно получать антитела, имеющие более одной цепи, посредством экспрессии каждой цепи совместно в одном хозяине, или можно получать отдельные цепи, которые собирают до или после выделения из культуральной среды.

Можно проводить анализ антител с помощью различных методов, включая, но не ограничиваясь указанными, анализы ίη νίύΌ, анализы, основанные на клетках ίη У11го. анализы ίη νί\Ό и методы селекции. Можно анализировать свойства антител, включая, но не ограничиваясь указанными, биологическое действие, стабильность, растворимость и связывающую активность в отношении мишени. Можно анализировать различные свойства одновременно или по отдельности. В зависимости от условий анализа можно очищать или не очищать белки. Согласно одному аспекту настоящего изобретения анализ представляет собой качественный или количественный анализ связывания антител с белковой или небелковой молекулой, о которой известно, что она связывает или предположительно связывает антитело. Согласно одному аспекту настоящего изобретения анализ представляет собой анализ связывания для измерения связывания с антигеном-мишенью. Для анализа можно использовать автоматические методы и методы с высокой пропускной способностью. В анализе можно использовать гибридный белок или меченый белок. Анализ связывания можно проводить различными методами, известными в данной области техники, включая, но не ограничиваясь указанными, анализ ЕЬ18А. В настоящем описании фраза конкурирует за связывание обозначает ситуацию, в которой антитело снижает связывание или сигналлинг по меньшей мере на 20, 30, 50, 70 или 90% согласно методам, доступным в данной области техники, на- 6 025169 пример конкурентный анализ ЕЬ18А или измерение Κ,ι с помощью В1Асоге, но не означает полное исключение связывания.

Одним из приборов для измерения взаимодействий по связыванию, хорошо известных в данной области техники, является прибор В1Асоге™ 2000, который можно приобрести у РЬагшаша Вюкеиког (Ирр8а1а, 8\\ебеп).

Настоящее изобретение включает фармацевтическую композицию, содержащую антитело согласно настоящему изобретению, указанное в настоящем описании, и фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель или наполнитель. Дополнительно фармацевтическая композиция может содержать другие терапевтические ингредиенты. В настоящем описании термин фармацевтически приемлемый носитель включает растворители, диспергаторы, оболочки, антибактериальные и противогрибковые средства, изотонические агенты и средства, замедляющие всасывание и т.п. физиологически совместимые вещества.

К примерам фармацевтически приемлемых носителей относятся вода, физиологический раствор, фосфатно-солевой буфер, декстроза, глицерол, этанол и т.п. вещества или их сочетания. Также фармацевтически приемлемые носители могут включать незначительные количества дополнительных веществ, например, увлажняющие компоненты или эмульгаторы, консерванты или буферы, которые увеличивают срок годности или эффективность антитела, а также изотонические агенты, такие как сахара, полиспирты, например маннит и сорбит, и хлорид натрия.

Фармацевтические композиции согласно настоящему изобретению могут быть приготовлены различными способами, включая, например, жидкие, полутвердые и твердые лекарственные формы, такие как жидкие растворы (например, инъецируемые и инфузионные растворы), дисперсии или суспензии, порошки, липосомы и суппозитории. Предпочтительно лекарственные композиции находятся в форме инъецируемых или инфузионных растворов.

Предпочтительным способом введения является парентеральное введение (например, внутривенное, подкожное, внутрибрюшинное, внутримышечное). В частности, предпочтительными способами введения являются внутривенная инфузия или инъекция, внутримышечная инъекция или подкожная инъекция. Указанные композиции получают согласно традиционным способам, например, РепйпдЮп. ТНе 8шепсе и РгасЕсе οί РЬагшасу, 19* Εάίΐίοη, Оеппаго, Еб., Маск РиЬЬкНпд Со., Еа§1оп, РА 1995, который содержит сборник способов получения составов, которые обычно известны специалистампрактикам.

Эффективные дозы композиций согласно настоящему изобретению для лечения заболевания или нарушения, указанные в настоящем описании, различаются в зависимости от различных факторов, включая способ введения, место направленного воздействия, физиологическое состояние пациента, того, является ли пациент человеком или животным, других вводимых лекарственных средств, и является ли лечение профилактическим или терапевтическим. Дозировки лекарственного средства можно менять традиционными способами, известными специалисту в данной области техники, для оптимизации безопасности и эффективности.

Термины лечить, лечение обозначают терапевтическое лечение, при котором требуется уменьшить нежелательные физиологические изменения, связанные с заболеванием или нарушением. Благоприятные или желаемые клинические результаты включают, но не ограничиваются указанными, облегчение симптомов, уменьшение масштаба заболевания или нарушения, стабилизацию заболевания или нарушения (т.е. если заболевание или нарушение не ухудшается), задержку или замедление прогрессирования заболевания или нарушения и ремиссию (частичную или полную) заболевания или нарушения, заметную или незаметную. Термин лечение также может обозначать большую продолжительность жизни по сравнению с предполагаемой продолжительностью в отсутствие приема лекарственного средства. Пациенты, которые нуждаются в таком лечении, включают тех, которые уже страдают от этого заболевания или нарушения, а также склонных к развитию заболевания или нарушения.

Фармацевтические композиции согласно настоящему изобретению могут содержать терапевтически эффективное количество антитела к ΤΟΡβΚΙΙ согласно настоящему изобретению. Термин терапевтически эффективное количество означает количество, эффективное при дозировках и в течение периода времени, необходимых для достижения желаемого терапевтического результата. Терапевтически эффективное количество антитела может различаться в зависимости от таких факторов, как стадия болезни, возраст, пол, вес пациента и способность антитела или части антитела вызывать желаемый ответ у пациента. Терапевтически эффективное количество также представляет собой количество, при котором любые токсические или вредные эффекты антитела или его части превышают его терапевтически благоприятные эффекты.

Можно подбирать режим дозирования для достижения оптимального желаемого ответа. Например, можно вводить одну дозу, несколько отдельных доз в течение времени или можно соответственно уменьшать или увеличивать дозу в зависимости от того, как продвигается лечение. Особенно преимущественным является приготовление парентеральных композиций в дозированной форме для простоты введения и равномерности дозирования. Дозированная форма означает дозу, содержащую заданное количество активного вещества, рассчитанное для получения желаемого терапевтического эффекта, в соче- 7 025169 тании с необходимым фармацевтическим носителем. Выбор конкретной дозированной формы согласно изобретению непосредственно зависит от (а) индивидуальных особенностей активного вещества и конкретного профилактического или терапевтического действия, которое необходимо оказать, и (б) ограничений, существующих в области приготовления лекарственных составов, таких как активное соединение для лечения чувствительности у пациентов.

Терапевтически эффективное количество антитела согласно настоящему изобретению примерно находится в пределах, но не ограничивается указанными значениями, 0,1-50 мг/кг. Согласно другому аспекту настоящего изобретения эффективное количество антитела составляет 3-35 мг/кг. Согласно другому аспекту настоящего изобретения эффективное количество составляет 10-25 мг/кг. Согласно другому аспекту настоящего изобретения эффективное количество составляет 5-20 мг/кг. Согласно другому аспекту настоящего изобретения эффективное количество составляет 3-15 мг/кг. Согласно другому аспекту настоящего изобретения эффективное количество составляет 2-10 мг/кг. Согласно другому аспекту настоящего изобретения эффективное количество составляет 5-10 мг/кг. Согласно другому аспекту настоящего изобретения эффективное количество антитела составляет 1-10 мг/кг. Следует отметить, что размер доз может различаться в зависимости от типа и тяжести состояния, которое необходимо облегчить. Также следует понимать, что для каждого конкретного пациента необходимо с течением времени корректировать дозу согласно потребностям пациента и рекомендации врача, который вводит или наблюдает за введением композиций, при этом диапазоны дозировок, указанные в настоящем описании, приведены для примера и не ограничивают объем притязаний или применение заявленной композиции.

Антитела согласно настоящему изобретению можно применять для лечения рака. Рак представляет собой большую группу заболеваний, классифицируемых в зависимости от ткани или степени развития опухоли. Также рак можно подразделять на первичные опухоли и метастазирующие опухоли, а также устойчивые или рецидивирующие опухоли. Устойчивые опухоли представляют собой опухоли, которые не отвечают на химиопрепараты или устойчивы к лечению химиопрепаратами в отдельности, антителами в отдельности, облучением в отдельности или их сочетанием. Рецидивирующие опухоли представляют собой опухоли, которые, как кажется, подавляются при лечении с использованием таких агентов, но появляются вновь через 5 лет, иногда 10 лет или более после прекращения лечения.

Тип рака, который поддается лечению, также включает неваскуляризированные, недостаточно васкуляризированные, а также васкуляризированные опухоли. Рак может включать несолидные или солидные опухоли.

Антитела к ΤΟΡβΚΙΙ согласно настоящему изобретению можно применять для лечения расстройств, заболеваний или состояний, вызванных ΤΟΡβΚΙΙ, которые включают хронические и острые нарушения или расстройства, включая патологические состояния, которые обеспечивают предрасположенность млекопитающего к заболеванию. К заболеваниям, которые необходимо вылечить согласно настоящему изобретению, относятся фиброз, вызванный травмой артерий, инфекцией, ревматоидным артритом, диабетом или диабетическим состоянием, опухолью, заболевания, для которых характерно отложение внеклеточного матрикса, заболевания, опосредованные сигналлингом ΤΟΡβΚΙΙ, заболевания, вызванные подавлением иммунной системы из-за действия ΤΟΡβΚΙΙ, острый иммунный дефицит, возникающий изза тяжелых ожогов, травм, и такие заболевания, как вирусные или бактериальные инфекции, и системные заболевания, поражающие множество органов, опосредованные ΤΟΡβΚΙΙ.

ΤΟΡβ играют важную роль в обновлении, пролиферации и дифференцировке гемопоэтических стволовых клеток. Антитела согласно настоящему изобретению можно применять для обогащения и регенерации стволовых клеток и содействия способам лечения, основанным на стволовых клетках, для восстановления тканей после инфаркта миокарда, нейрональных заболеваний и других нарушений.

Антитела согласно настоящему изобретению можно вводить по отдельности или в сочетании с противоопухолевыми агентами, кроме антител к ΤΟΡβΚΙΙ человека, включая химиотерапевтические агенты, облучение, другие антагонисты ΤΟΡβΚΙΙ, антагонисты ΤΟΡβ, антиангиогенные агенты, антитела к другим мишеням и малые молекулы. Антитела к ΤΟΡβΚΙΙ особенно подходят для лечения опухолей, устойчивых к νΕΟΡ-Α. Введение антител совместно с другими антителами и/или способами лечения можно осуществлять совместно или по отдельности, одним и тем же путем или различными путями, одновременно или в разное время.

Способы лечения, описанные в настоящем изобретении, можно применять для лечения соответствующих млекопитающих, включая приматов, например обезьян, и людей, лошадей, коров, кошек, кроликов, грызунов, например крыс и мышей. Представленные ниже примеры приводятся в целях иллюстрации и никоим образом не ограничивают изобретение.

- 8 025169

Примеры

Материалы и клеточные линии.

ΤΟΡβ1, ΤΟΡβ2, и ΤΟΡβ3 человека получали рекомбинантными методами и очищали или приобретали, например, у Κ&Ό 8у81ет8. Рекомбинантные химерные белки ΤΟΡβΚΙΙ Рс (ΤΟΡβΚΙΙ-Рс) и растворимые рекомбинантные белки ΤΟΡβΚΙΙ с щелочной фосфатазой (ΤΟΡβΚΙΙ-ΆΡ) экспрессировались в стабильно трансфицированных клетках и их выделяли из супернатантов клеточных культур методами, известными специалистам в данной области техники (Το881ογ, 1. Β10Ι. СНет., 269:12456-12461 (1994)).

Линии клеток опухоли человека ВХРС-3, РАЯС-1, ΜΌΆ-ΜΒ-231, линии опухолевых клеток мышей ЕМТ6, 4Т1, СТ26, Β16-Ρ10 и линии клеток миеломы Р3-Х63-Ад8.653 получали из Американской коллекции культур тканей (Мапа88а8, УА). Линию клеток ΜΌΆ-ΜΒ-231, трансфицированных люциферазой, получали в 8иппуЬгоок НеаИЬ 8аепсе8 Сейте. Клетки культивировали в среде ΚΡΜΙ1640 или ΙΜΌΜ (Ιηуйтодеп/ЕИ'е ΤесЬηо1од^е8, Шс., КоскуШе, ΜΌ) с 10% фетальной бычьей сывороткой (РС8, Нус1опе, Ьодап, ϋΤ). Все клетки культивировали при 37°С во влажной атмосфере 5% СО₂.

Получение МАТ к ΤΟΡβΚΙΙ.

МАТ к ΤΟΡβΚΙΙ получали с помощью стандартной гибридомной технологии (Нат1оте & Ьапе, еб., АпбЬоб1е8: А ЬаЬога1огу Μаηиа1, Со1б 8ртшд НагЬог, р. 211-213 (1998)) с использованием трансгенных по генам иммуноглобулинов ^ебатех, 8ап 1о8е, СА) мышей, которые продуцируют тяжелые гамма-цепи и легкие каппа-цепи иммуноглобулина человека, или крыс Льюиса (СЬат1е8 Шует ЕаЬота1опе8, ХУПттдЮн Μ^. В общих чертах, мышей или крыс иммунизировали подкожно (8.с.) рекомбинантным белком ΤΟΡβΚΙΙ-Рс человека или мыши, эмульгированным в полном адъюванте Фрейнда. Животным трижды вводили внутрибрюшинно (ί.ρ.) одинаковый белок ΤΟΡβΚΙΙ-Тс в неполном адъюванте Фрейнда. Через месяц животным вводили ί.ρ. последнюю дозу 50 мкг белка ΤΟΡβΚΙΙ-Тс в фосфатно-солевом буфере (ΡΒ8). Из иммунизированных мышей выделяли спленоциты и сливали с клетками плазмоцитомы Р3-Х63-Ад8.653 с применением полиэтиленгликоля (ΡΕΟ, Μν: 1450 КИ). После этого клетки ресуспендировали в среде НАΤ (гипоксантин, аминоптерин, тимидин), дополненной 10% фетальной бычьей сывороткой (ΡΒ8), и сеяли в 96-луночные планшеты при плотности 200 мкл/лунка для получения клеток гибридомы.

Через 10-12 дней гибридомы исследовали на образование антител и наличие специфической связывающее активности супернатантов культуры с белком ΤΟΡβΚΙΙ в процессе анализа связывания и блокировки, основанном на анализе ЕЫ8А. В частности, гибридомы, продуцирующие МАТ к ΤΟΡβΚΙΙ, первоначально определяли с помощью определения антитела, связавшего ΤΟΡβΚΙΙ с антителом козы к легкой каппа-цепи человека или конъюгата антител к ^Ο мыши с пероксидазой хрена (ΠΚΡ) согласно описанной ниже методике. ΤΟΡβΚΙΙ-Тс человека или ΤΟΡβΚΙΙ-Ρο мыши наносили в 96-луночные микротитровальные планшеты в концентрации 100 нг/лунка при 4°С в течение ночи. Затем блокировали реакцию блокирующим буфером (ΡΒ8 0,05% ΤνΕΕΝ® 20, 5% сухого молока) при комнатной температуре в течение 2 ч. Супернатанты гибридом или очищенные антитела разбавляли ΡΒ8 с 2% альбумином бычьим сывороточном (Е8А) и 0,05% ΤνΕΕΝ® 20 (Еи8А буфер) и инкубировали в 96-луночных микротитровальных планшетах, покрытых ΤΟΡβΚΙΙ, в течение 30 мин. Планшеты промывали буфером Ε^I8А и инкубировали антителами козы к легкой каппа-цепи или конъюгатом антител к ^Ο мыши с ΠΚΡ в течение 30 мин. Для получения цвета использовали субстрат ТМВ (3,3',5,5'-тетра-метилбензидин) согласно инструкциям изготовителя. Для количественного определения связывающего сродства антител считывали поглощение при длине волны 450 нм. Для определения гибридом, вырабатывающих нейтрализующие МАТ к ΤΟΡβΚΙΙ, проводили блокирующий анализ Ε^I8А согласно описанной ниже методике. ΤΟΡβ1, ΤΟΡβ2 или ΤΟΡβ3 наносили в лунки 96-луночного планшета в концентрации 200 нг/лунка, затем реакцию в лунках блокировали блокирующим буфером. Супернатанты гибридом инкубировали с буфером ΕΤΑΑ содержащим ΤΟΡβΚII-ΆΡ в 96-луночных планшетах, покрытых ΤΟΡβ в течение 1 ч. После отмывки в лунки добавляли субстрат для АР п-нитрофенил фосфат (ΡΝΡΡ) для получения цвета согласно инструкциям производителя. Измеряли поглощение при длине волны 405 нм для количественной оценки связывания ΤΟΡβΚΙΙ с ΤΟΡβ1, ΤΟΡβ2, и ΤΟΡβ3. Оптическую плотность (ОИ) определяли на ридере микротитровальных планшетов (Μо1еси1а^ Иеуюе8 Силир., 8иппууа1е, СА).

Положительные гибридомы клонировали трижды методом предельного разведения для получения моноклональных гибридомных клеточных линий.

В табл. 1 показаны аминокислотные последовательности ΤΌΚ легкой и тяжелой цепей МАТ к ΤΟΡ1 и ΤΟΡ3.

- 9 025169

Таблица 1

	ΜΑΤ Т6Р1	МАТ ТСРЗ
С0ЕН1	есз1зызур (ЗЕО Ю N0: 1)	ОС315555У (ЗЕО Ю N0:7)
С0ЕН2	ЗРУУСЕКТУУНРЗЬКЗ (ЗЕО Ю N0:2)	ЗРУУЗС1ТУУЗРЗЬК8 (ЗЕО Ю N0:8)
СБЕНЗ	ΟΡΤΜΙΕΟνίΌδ (ЗЕО Ιϋ N0:3)	0РТМ1Е0АЬЦУ (ЗЕО Ю N0:9)
СОРТ. 1	ЕАЗОЗУЕЗУЬА (ЗЕО Ю N0:10)	ЕАЗОЗУЕЗРЬА (ЗЕО Ю N0:16)
СОНЫ	ЗАЗЫРАТ (ЗЕО Ю N0:11)	0Α3ΝΕΑΓ (ЗЕО Ю N0:11)
СБЕЬЗ	00ЕЗЫИРРТ (ЗЕО Ю N0:12)	ОСКЗЫНРРТ (8Е0 ΙΌ N0:12)

δΕΟ ГО N0 аминокислотных последовательностей и последовательностей ДНК, кодирующих аминокислотные последовательности НСУК, БСУК, тяжелых цепей (НС) и легких цепей (ЬС) МАТ к ТСР1 и ТСР3 представлены в табл. 2.

Таблица 2 δΕΟ ГО N0 аминокислотных последовательностей и кодирующих последовательностей ДНК МАТ к ТСЕЗКП человека

Аминокислотные последовательности	МАТ ТСР1	МАТ ТСРЗ
НОТЕ	(ЗЕО Ю N0:25)	(ЗЕО 10 N0:33)
ЬОТЕ	(ЗЕО ΙΌ N0:27)	(ЗЕО Ю N0:35)
НС	(ЗЕО 10 N0:37) (ЗЕО Ю N0:30)*	(ЗЕО Ю N0:6) (ЗЕО Ю N0:31)*
ЬС	(ЗЕО Ю N0:32)*	(ЗЕО Ю N0:14) (ЗЕО Ю N0:29)*
Последовательности ДНК	МАТ ТСР1	МАТ ТСРЗ
НОТЕ	(ЗЕО Ю N0:26)	(ЗЕО Ю N0:34)
ЬОТЕ	(ЗЕО Ю N0:28)	(ЗЕО Ю N0:36)
НС**	(ЗЕО Ю N0:38)	(ЗЕО Ю N0:13)
ьс**		(ЗЕО Ю N0:15)

* Аминокислотные последовательности с секреторной или сигнальной последовательностью.

** Последовательности кДНК включают секреторную сигнальную последовательность.

Разработка и экспрессия антител человека 1дС1 к рецептору II ТСЕ(1 человека.

Последовательности ДНК, кодирующие вариабельные участки легкой и тяжелой цепи МАТ к ТСЕЗКП амплифицировали методом ПЦР для клонирования в векторы экспрессии. Вариабельные участки тяжелой цепи объединяли в одну рамку считывания с константным участком тяжелой гамма 1 цепи иммуноглобулина в вектор рЕЕ6.1 (Боп/а Βίο1ο§ίε8 ρίο. δίοιίβΐι. ВегкзЫге, ИК). Всю кДНК легкой цепи человека непосредственно клонировали в вектор рЕЕ12.1 (Боп/а Βίοίοβίοδ РБС, δίοιίβΐτ ВегкзЫге, ИК). Полученными методами инженерии векторами экспрессии иммуноглобулина стабильно трансфицировали клетки миеломы ΝδΟ методом электропорации и отбирали векторы на среде для селекции на активность глутамин синтетазы. Проводили анализ стабильных клонов на экспрессию антител методом ΕΜδΑ, в котором исследовали специфическое связывание ТСЕЗКП. Положительные клоны культивировали в бессывороточной среде в роллерных колбах или биореакторах для продукции антител. Полноразмерные антитела 1дС1 очищали методом аффинной хроматографии (Ροτοδ Α, РегёерГОе ВюзуПеиъ 1пс., Εοδ^τ СПу, СА) и элюировали в нейтральный солевой раствор.

кДНК, кодирующую вариабельные участки легкой и тяжелой цепей МАТ ТСЕ1 и ТСЕ3 к ТСЕЗКП человека, клонировали и объединяли в одной рамке считывания с константным участком тяжелой гаммацепи 1 иммуноглобулина в вектор экспрессии СБ (глутаминсинтетаза). Полученными векторами, экспрессирующими иммуноглобулин, стабильно трансфицировали клетки СНО. В стабильных клонах подтверждали экспрессию антитела, которое специфически связывает ТСЕЗКП человека. Положительные клоны культивировали в бессывороточной среде в биореакторах для продукции антитела. Полно- 1Ο 025169 размерные антитела 1§01 очищали методом аффинной хроматографии на белке А и элюировали в нейтральный буферный солевой раствор.

МАТ к ΤΟΡβΚΙΙ связываются с ΤΟΡβΚΙΙ и блокируют связывание ΤΟΡβΚΙΙ с лигандами. Связывающую и блокирующую активность очищенных МАТ к ΤΟΡβΚΙΙ определяли с помощью анализа ΕΜδΑ согласно описанию Получение МАТ к ΤΟΡβΚΙΙ выше. ΕΌ₅₀ и ΙΟ₅₀ антител анализировали с помощью программного обеспечения ОгарЬРаБ Ргйт® 5оП\\чге 3.03 (ОгарЬРаБ 8оП\\аге Ιηο.. 8аи Ωίοβο. СА). ΜΑΤ к ΤΟΡβΚΙΙ человека ΤΟΡ1 и ΤΟΡ3 по отдельности имели связывающую активность в отношении ΤΟΡβΚΙΙ человека ΕΌ₅₀ 0,031-0,059 нМ по результатам анализа связывания, основанного на анализе ЕЬТЗА, тогда, как нормальный Ι§Ο не связывался со своим рецептором. Очищенные ΜΑΤ ΤΟΡ1 и ΤΟΡ3 по отдельности эффективно блокировали связывание ΤΟΡβ1, ΤΟΡβ2, или ΤΟΡβ3 человека с ΤΟΡβΚΙΙ человека с К', 0,10-0,54 нМ.

Связывающие и блокирующие свойства антител к ΤΟΡβΚΙΙ человека представлены в табл. 3.

Таблица 3

Связывающие и блокирующие свойства антител к ΤΟΡβΚΙΙ человека

Клон	Связывающая активность в отношении ΤΟΡβΚΙΙ человека (Εϋ50) методом ЕЫЗА	Связывающая активность в отношении ТСГрКИ человека (газ) методом Вдасоге	Блокирующая активность в отношении связывания ΤΟΕβΚΙΙ человека с ΤΟΡβΙ, 2, или 3 (1С50) методом ЕЫЗА
ТСР1	0,059 нМ	0,011 нМ	0,12 нМ: ΤΟΡβΙ 0,54 нМ: Τ0Ρβ2 0,19 нМ: ТбРрЗ
ТОРЗ	0,031 нМ	0,019 нМ	0,10 нМ: ΤΟΓβΙ 0,41 нм: тегрг 0,13 нМ: ТСГРЗ

Связывающая активность ΜΑΤ ΜΤ1 к ΤΟΡβΚΙΙ мыши в отношении ΤΟΡβΚΙΙ мыши составила: ΕΌ₅₀ 0,054 нМ и блокирующая активность ΜΑΤ ΜΤ1 в отношении связывания ΤΟΡβΚΙΙ мыши с ΤΟΡβ1, ΤΟΡβ2, или ΤΟΡβ3 мыши составила: Ι'₅₀ 0,12-0,54 нМ.

Связывающие и блокирующие свойства ΜΑΤ ΜΤ1 представлены в табл. 4.

Таблица 4

Связывающие и блокирующие свойства ΜΑΤ ΜΤ1 к ΤΟΡβΚΙΙ мыши

Связывающая активность в отношении ΤΟΡβΚΙΙ мыши (Εϋ5ο) по результатам ЕЫЗА	Связывающее сродство к ΤΟΡβΚΙΙ мыши (Кс) методом В1асоге	Блокирующая активность в отношении связывания ΤΟΡβΚΙΙ мыши с ΤΟΡβΙ, 2, или 3 мыши (1С50> методом ЕЫЗА
0,054 нМ	0,033 нМ	0,12 нН: ΤΟΡβΙ 0,54 нМ: Τ0Ρβ2 0,19 нМ: Τ0Ρβ3

Связывающее сродство МАТ к ΤΟΡβΚΙΙ.

Связывающую способность МАТ по отношению к ΤΟΡβΚΙΙ определяли методом поверхностного плазмонного резонанса с использованием ВМсоге™ 2000 при комнатной температуре(20-25°С) (РЬагтас1а, Р18са1а№ау, N1). Кинетические анализы МАТ проводили посредством иммобилизации гибридного белка, состоящего из связанного рекомбинантного внеклеточного домена ΤΟΡβΚΙΙ мыши (8Е0 ГО N0: 41) или внеклеточного домена ΤΟΡβΚΙΙ человека, который кодируется (8Е0 ГО N0: 40), соответственно с Ρс константным участком тяжелой цепи мыши или человека, на сенсорной поверхности в концентрации 5-100 нМ. ΜΑΤ ΤΟΡ1 и ΤΟΡ3 к ΤΟΡβΚΙΙ человека проявляли высокое сродство со значением К 11, 78, 19 пМ соответственно. ΜΑΤ ΜΤ1 к ΤΟΡβΚΙΙ мыши демонстрировали высокое сродство со значением К_с 33 пМ.

Кинетические свойства МАТ приведены в табл. 5.

- 11 025169

Таблица 5

Кинетические свойства МАТ по отношению к ΤΟΡβΚΙΙ человека

МАТ	Коп(1/Мс)	Ко££(1/с)	Кс (М)
ТСР1	1,5x10®	1,7х10'ь	1, 1x10'“
ТСРЗ	1,4хЮ6	2,7x10 5	1,9x10'“

Видовая специфичность МАТ к ΤΟΡβΚΙΙ человека.

Специфичность МАТ к ΤΟΡβΚΙΙ человека определяли посредством измерения взаимодействия антител с ΤΟΡβΚΙΙ человека или мыши методом ЕЫ8А. ΤΟΡ1 к ΤΟΡβΚΙΙ человека проявляло перекрестную реактивность с ΤΟΡβΚΙΙ мыши тогда, как ΜΑΤ ΤΟΡ3 проявляло минимальную или среднюю перекрестную реактивность в отношении ΤΟΡβΚΙΙ мыши. Однако ΜΑΤ ΤΟΡ3 не блокировало связывание ΤΟΡβ 1 человека с ΤΟΡβΚΙΙ мыши.

Связывание МАТ к ΤΟΡβΚΙΙ с природным ΤΟΡβΚΙΙ на клетках, экспрессирующих ΤΟΡβΚΙΙ.

Связывающую активность ΜΑΤ ΤΟΡ1 к ΤΟΡβΚΙΙ человека и антитела козы против Ι§Ο человека, меченного флуоресцеин изотиоционатом (ΡΙΤΟ), определяли с помощью окрашивания с использованием 293 трансфицированных по ΤΟΡβΚΙΙ клеток человека и клеток карциномы человека. В частности, отбирали аликвоты трансфицированных клеток, клеток карциномы, селезенки или лимфатических узлов, и инкубировали с первичными антителами к желаемым молекулам, меченным или немеченым флуоресцеином, в РВ8 с 1% В8А (буфер для окраски) в течение 1 ч на льду. Соответствующий изотип Ι§Ο использовали в качестве отрицательного контроля. Клетки дважды промывали буфером для окрашивания и затем инкубировали с вторичным видоспецифичным антителом, меченым ΡΙΤΟ, фикоэритрином (РЕ) или А1хаз Рсб. к первичному антителу (Вю8оигсе ЕНегпаОопак СатагШо, СА) в буфере в течение 30 мин на льду. Клетки промывали, как описано выше, и анализировали на проточном цитометре. Мертвые клетки и дебрис исключали из анализа на основе прямого и бокового светорассеяния. Среднюю единицу интенсивности флюоресценции (ΜΡΙυ) вычисляли как среднее логарифмическое флуоресценции, умноженную на процент положительной популяции. Среднее соотношение интенсивности флуоресценции (ΜΡΙΚ) рассчитывали для количественного определения относительного уровня экспрессии ΤΟΡβΚΙΙ в линиях клеток. ΜΡΙΚ представляет собой среднюю интенсивность флуоресценции (ΜΡΙ) клеток, окрашенных ΤΟΡβΚΙΙ специфичным МАТ, разделенную на ΜΡΙ клеток, окрашенных изотипическим контрольным антителом.

ΜΑΤ ΤΟΡ1 к ΤΟΡβΚΙΙ человека проявляли связывающую реактивность в отношении 293 трансфицированных по ΤΟΡβΚΙΙ клеток человека и клеток карциномы молочной железы человека Μ^Α-ΜВ-231 с ΜΡΙΚ 46 и 209, соответственно, тогда как нормальные ΙβΟ человека не взаимодействовали с клетками. Полученные результаты показали, что ΜΑΤ ΤΟΡ1 обладает специфической реактивностью в отношении нативного ΤΟΡβΚΙΙ, экспрессируемого на поверхности клеток.

Подавляющее действие МАТ к ΤΟΡβΚΙΙ на активацию киназы 8таб2, зависящую от ΤΟΡβΚΙΙ, в ответ на ΤΟΡβ1.

Фосфорилирование 8таб2 (р-8таб2), вызываемое ΤΟΡβ, запускает традиционный сигнальный путь ΤΟΡβ через ΤΟΡβΚΙΙ, который опосредует биологические ответы клеток, например, пролиферацию, смерть, выживание и дифференцировку различных типов клеток. Способность МАТ к ΤΟΡβΚΙΙ человека и МАТ к ΤΟΡβΚΙΙ мыши подавлять активацию р-8таб2 можно определять с помощью клеток опухоли молочной железы мыши 4Т1 и клеток карциномы молочной железы человека Μ^Α-ΜВ-231 согласно представленной ниже процедуре. В общих чертах, клетки культивировали до достижения 80% покрытия на среде, содержащей ΡС8. После смены среды на бессывороточную клетки обрабатывали антителом или изотипическим контролем в присутствии 10 нг/мл ΤΟΡβ в течение 1 ч. После промывки клетки лизировали лизирующим буфером и проводили электрофорез и перенос на нитроцеллюлозную мембрану. Фосфорилированные 8таб2 и 8таб2 определяли методом вестерн-блоттинга с использованием моноклональных антител к фосфорилированным 8таб2 и 8таб2 (ΜίΙΙίροΓβ Согрога!е) и электрогенерированной хемилюминесценции (ЕСЬ), делали снимки и определяли количественно методом денситометрии с использованием Ецр Опаде Аиа1у/ег.

ΜΑΤ ΤΟΡ1 и МТ1 к ΤΟΡβΚΙΙ снижали фосфорилирование 8таб2, вызванное ΤΟΡβ, в клетках человека Μ^Α-ΜВ-231 и клетках рака молочной железы мыши 4Т1 дозозависимым образом. Определили, что Ιί’₅₀ ΜΑΤ ΤΟΡ1 и МТ1 по результатам анализа подавления фосфорилирования 8таб2 составляли 5±0,5 нМ, тогда, как ΜΑΤ ΤΟΡ3 имело ГС₅₀ менее 25±0,5 нМ.

Ингибиторная активность МАТ к ΤΟΡβΚΙΙ в отношении миграции и инвазии ίη У1!го опухолевых клеток.

Ингибиторная активность МАТ к ΤΟΡβΚΙΙ в отношении инвазивности опухолевых клеток можно определить с помощью анализов миграции и инвазии ίη У1!го. В общих чертах, клетки карциномы высевали при плотности 5х10³ в лунку в верхние камеры, вставленные в нижние камеры, покрытые коллаге- 12 025169 ном I и IV, 48-луночных планшетов в бессывороточной среде. Клетки обрабатывали ΜΑΤ ТОР1 или МТ1 в количестве 3, 10, и 30 мкг/мл в присутствии 10 нг/мл ΤΟΡβ при 37°С в течение 24-48 ч. В качестве положительного и отрицательного контролей использовали ΤΟΡβΚΠ-Гс или изотип Ι§Ο в концентрации 25 мкг/мл. Анализ инвазии проводили в аналогичных условиях, за исключением того, что использовали верхние камеры, покрытые матригелем. После инкубации клетки, мигрировавшие на противоположные стороны верхних камер, фиксировали в 10% растворе формалина и окрашивали раствором НоесйЦ 33342, тригидрохлорида, тригидрата (Шуйгодеи) в концентрации 2 мкг/мл и подсчитывали при увеличении 20Х с помощью 2е188 Όίβίΐαΐ 1таде Сатега и программного обеспечения 1таде-Рго Р1и8 5.1.

ΜΑΤ ТОР1 и МТ1 к ΤΟΡβΚΙΙ значительно подавляли миграцию клеток карциномы поджелудочной железы человека ВХРС-3 и инвазию клеток карциномы молочной железы мыши 4Т1 на 100% (Р<0,0001) и 93% (Р<0,0005), соответственно, по сравнению с контролем, обработанным Ι§Ο.

Полученные результаты показали ингибиторное действие антител к ΤΟΡβΚΙΙ согласно настоящему изобретению на инвазивность опухолевых клеток, несущих на своей поверхности ΤΟΡβΚΙΙ.

.Ингибиторная активность МАТ к ΤΟΡβΚΙΙ по отношению к секреции νΕΟΡ-Α опухолевыми клетками

ΤΟΡβ участвует в обеспечении ангиогенеза при развитии патологических состояний посредством стимуляции секреции νΕΟΡ-Α в опухолевых клетках и модуляции работы клеток эндотелия. Ингибиторное действие МАТ к ΤΟΡβΚΙΙ на секрецию νΕΟΡ-Α, вызванную ΤΟΡβ, в опухолевых клетках определяли в культуре клеток.

Вкратце, опухолевые клетки культивировали в бессывороточной среде при 37°С в инкубаторе при 5% СО₂ в присутствии или отсутствии 10 нг/мл ΤΟΡβ и серийных разведений МАТ в течение 48 ч. Изменения секреции νΕΟΡ-Α в супернатантах культур определяли набором ΕΜΚΟΝ (Κ&Ό ДуЦепъ) согласно инструкциям производителя.

ΜΑΤ ΤΟΡ1 к ΤΟΡβΚΙΙ человека в концентрации 10 мкМ/мл подавляло продукцию νΕΟΡ-Α, вызванную ΤΟΡβ, в опухолевых клетках ΜΌΑ-ΜΒ-231 человека на 63% (Р<0,01). ΜΑΤ ΜΤ1 к ΤΟΡβΚΙΙ мыши в концентрации 10 мкМ/мл подавляло продукцию νΕΟΡ-Α, вызванную ΤΟΡβ, в клетках опухоли молочной железы мыши 4Т1 на 30% (Р<0,02).

Полученные результаты показали, что МАТ к ΤΟΡβΚΙΙ согласно настоящему изобретению подавляли ангиогенез посредством снижения секреции νΕΟΡ-Α, вызванной ΤΟΡβ.

Ингибиторная активность МАТ к ΤΟΡβΚΙΙ по отношению к конверсии Τιό§, вызванной ΤΟΡβ, ίη νίίτο.

Показано, что ΤΟΡβ способен индуцировать превращение наивных Т-клеток в регуляторные Т-клетки (Τιό§), которые отрицательно влияют на иммунный ответ. Ингибиторное действие МАТ к ΤΟΡβΚΙΙ на конверсию регуляторных клеток, вызванную ΤΟΡβ можно оценить ίη νίίτο, как описано ниже.

В общих чертах, выделенные наивные СИ4+ клетки стимулировали 1 мкг/мл антитела к СИ3 и выделяли антигенпрезентирующие клетки (АРС) в присутствии или отсутствии 10 нг/мл ΤΟΡβ и серийных разведениях ΜΑΤ ΜΤ1 в полной среде ΚΡΜΙ при 37°С в инкубаторе при 5% СО₂ в течение 7 дней. Затем клетки снимали для окрашивания СИ25+/Еохр3+ Τιό§ клеток и окрашенные клетки анализировали на проточном цитометре.

ΜΑΤ ΜΤ1 к ΤΟΡβΚΙΙ мыши в концентрации 10 мкМ/мл снижало количество Τγβ§, индуцированных ΤΟΡβ ίη уйго на 75% (Р<0,005) по сравнению с контрольными обработанными Ι§Ο клетками.

Ингибиторная активность МАТ к ΤΟΡβΚΙΙ по отношению к росту опухоли и метастазированию.

Противоопухолевое действие МАТ к ΤΟΡβΚΙΙ исследовали на моделях подкожных или внутривенных метастазирующих опухолей.

Бестимусных голых мышей (Сйаг1е8 Муег БаЬогаЮпех. ХУПпипдЮп. ΜΑ), Ва1Ь/с или С57В6 (Сйаг1е8 Муег ЬаЬога1ог1е8, ХУПтшдЮп, ΜΑ) использовали для инокуляции клетками карциномы мыши или человека. Для лечения образованных опухолей на подкожных моделях допускали рост опухоли приблизительно до 200 мм³ и затем мышей делили на группы по 12-15 животных. На модели метастаз легких мышам внутривенно вводили опухолевые клетки через хвостовую вену. Животным вводили ί.ρ. (интраперитонально) МАТ к ΤΟΡβΚΙΙ в количестве 10-40 мг/кг три раза в неделю. Мышам в контрольной группе вводили равный объем физиологического раствора или нормальный раствор ΙβΟ. В течение всего эксперимента лечение животных продолжали. Размер опухолей определяли дважды в неделю с помощью кронциркуля. Размер опухоли определяли по формуле [π/6 (ν1 X ν2 X ν2)], в которой ν1 обозначает максимальный диаметр опухоли и ν2 обозначает наименьший диаметр опухоли.

Данные о размере опухоли анализировали методом повторных измерений ΑΝΟνΑ (ΚΜ-ΑΝΟνΑ) для определения значимых различий в размерах опухолей в зависимости от способа лечения, временных точек и режима введения. Рост опухолевых клеток ίη уйго в контрольной группе и лечебной группе анализировали с помощью двустороннего ΐ-критерия Стьюдента. Значение Р менее 0,05 считали статистически значимым.

- 13 025169

Мышам с опухолями вводили МАТ к Т0Р1 в количестве 40 мг/кг три раза в неделю через 24 ч после внутривенного введения опухолевых клеток или после образования первичных опухолей. Системное введение МАТ к ТСР1 подавляло рост первичной подкожной опухоли ксенотрансплантатов карциномы поджелудочной железы РАЫС-1 (Т/С=69%, ΑΝΟνΑ р<0,03), ксенотрансплантатов поджелудочной железы ВХРС-3 (Т/С=30%, ΑΝΟνΑ р<0,0001) и ксенотрансплантатов карциномы молочной железы ΜΌΑ-ΜΒ-231 (Т/С=63%, ΑΝΟνΑ р<0,01).

ΜΑΤ МТ1 к ΤΟΡβΚΙΙ мыши исследовали на модели сингенных опухолей мыши для определения противоопухолевой активности в отношении первичных и метастазирующих опухолей у иммунокомпетентных мышей. Мышам вводили внутривенно (ί.ν.) клетки карциномы мыши 4Т1, СТ26 или В16 Р10 или подкожно (з.с.) опухолевые клетки мыши ЕМТ6. Мышам вводили МАТ к ТСР1 в количестве 40 мг/кг три раза в неделю через 24 ч после внутривенного введения опухолевых клеток или после образования первичных подкожных опухолей.

Системное введение ΜΑΤ МТ1 значительно снижало метастазирование легких опухолей 4Т1, СТ26 и В16 Р10 на 84% (Р<0,0001), 94% (Р<0,0001) и 63% (Р<0,001) соответственно. МАТ МТ1 к ТСРрКЛ мыши подавляет рост первичной опухоли на 28% (Р<0,05) и спонтанное метастазирование легких на 84% (Р<0,0001) на модели з.с. опухоли ЕМТ6.

Известно, что миелоидные клетки фенотипа От-1/СЭ11Ъ+ играют значительную роль в метастазировании и иммуносупрессии ангиогенеза при развитии опухоли. Тгед клетки СО4/СО25/Рохр3+ способны подавлять действие эффекторных клеток иммунной системы естественных киллеров и цитотоксических Т лимфоцитов (СТЬ) на опухолевые клетки. Подавляющее действие ΜΑΤ МТ1 в отношении иммуносупрессивных клеток, т.е. Тгед СО4/СЭ25/Рохр3/ТСРвК11+ клеток и миелоидных От-1+/СП11Ъ+/ТОРвКН+ клеток, определяли на модели з.с. опухоли ЕМТ6. Подавляющее действие антител к ТСРРКП на Тгед клетки и популяцию миелоидных клеток Ст-1+/СЭ11Ъ+ у мышей, имеющих опухоли, определяли помощью анализа ΡΑΕ8 по изменениям в популяциях Ст-1+/СЭ11Ъ+ и СЭ4/СЭ25/Рохр3/ТСРвК11+ и Сг-1+/СЭ11Ь+/ТСРвР11+ клеток после обработки мышей ΜΑΤ МТ1.

ΜΑΤ МТ1 к ТСРЗКП мыши значительно снижало количество миелоидных клеток Ст-1+СП11Ъ+/ТСРвК11+ на 95% (Р<0,0001) и Тгед клеток СП4/СП25/Рохр3/ТСРвК11 + на 71% (Р<0,0005) соответственно у пролеченных мышей, имеющих опухоли ЕМТ6.

Полученные результаты показали, что антитела к ТОРвКП контролировали популяции СО4/СЭ25/Рохр3/ТСРвК11+ и Сг-1+/СЭ11Ь+ через подавление или/и элиминацию ТОРвКП+ Тгед и миелоидных клеток.

Мышиная модель фиброза.

ТС.1Д является ключевым регулятором активации звездчатых клеток печени (Н8С) и дифференциации миофибробластов, а также отложения внеклеточного матрикса, который способствует фиброзу. Животные модели фиброза печени широко используются в качестве экспериментальных моделей для оценки активности ингибиторов сигнального пути ТСРЗ по подавлению фиброза. Известно, что отложение коллагена является показателем фиброза печени. Терапевтическое действие антитела к ТОРвКП в отношении защиты и нарушения фиброза определяли на моделях фиброза печени, вызванного четыреххлористым углеродом (СС1₄).

В общих чертах, мышам С57ВЬ6 1.р. (интраперитонально) вводили раствор СС1₄ 1 мл/кг, смешанный с кукурузным маслом, два раза в неделю. Мышам в лечебной группе вводили ΜΑΤ МТ1 в количестве 40 мг/кг трижды в неделю в течение 14 дней после 1.р. введения СС1₄. Мышам в контрольной группе вводили контрольные 1дС крысы в таком же количестве. Через 8 недель после введения СС1₄ у пролеченных мышей брали ткани печени и плазму. Показатель нарушения работы печени - уровень аланинаминотрансферазы (ΑΕ-Т) в плазме - определяли с помощью набора для определения ΑΕ-Т в сыворотке (Рош1е 8с1еи1Шс, 1пс. М1). Ткань печени анализировали методом иммуногистохимического анализа (1НС) с окраской 8ши8 Рей на отложение коллагена.

В исследованиях, которые проводили согласно описанию выше, ΜΑΤ МТ1 к ΟΡβΚΙΙ значительно уменьшало отложение коллагена на 95% (Р< 00001) в печени мышей, которым вводили СС1₄, по сравнению с контролем 1дС крысы. ΜΑΤ МТ1 к ТСРЗРП мыши предотвращало нарушение работы печени на 85% (Р<0,001) согласно измерениям уровня ΑΕ-Т в плазме мышей, которым вводили СС1₄ тогда, как у мышей, которым вводили контрольный 1дС. наблюдали значительно повышенный уровень ΑΕ-Т.

Данные результаты позволили предположить, что антитело МТ1 к ТСРЗРП эффективно защищало мышей от фиброза, вызванного травмами и нарушением работы печени.

Ιη νί\Ό исследования комбинированной терапии с помощью МАТ МТ1 и циклофосфамида.

Известно, что циклофосфамид (СТХ), сильный цитотоксический агент, обладающий способностью подавлять гемопоэтические и миелоидные прогениторные клетки, оказывает подавляющее действие на миелоидные клетки (см. Нопеусйитсй, е1 а1., Сапсег Рез. 65:7493-7501 (2005)). Мыши с опухолью ЕМТ6 подвергались лечению ΜΑΤ МТ1, СТХ по отдельности или их комбинацией. Например, мышей Ва1Ъ/с или С57В6 (Сйаг1е8 РАег ЕаЪогаФпев, ХУПттдЮп, ΜΑ) инокулировали клетками карциномы. Инокулированных мышей разделили на группы по 12 животных, например. Животным вводили 1.р. 40 мг/кг МАТ

- 14 025169 к ΤΟΡβΚΙΙ, 80 мг/кг СХТ или их комбинацию три раза в неделю. Мыши в контрольной группе получали равный объем физиологического раствора или нормального раствора ΙβΟ. Размер опухоли определяли по формуле [π/6 (^1х^2х^2)], в которой Ά1 обозначает максимальный диаметр опухоли и \у2 обозначает наименьший диаметр опухоли.

Комбинированная терапия ΜΑΤ ΜΤ1 к ΤΟΡβΚΙΙ человека и СТХ, проведенная в точности согласно описанию выше, приводило к снижению роста первичной опухоли на 80% (Р<0, 0 0 01) и спонтанных метастаз легких на 99,99% (Р<0,000001) у мышей с опухолью ЕМТ6 по сравнению со снижением роста первичной опухоли при монотерапии ΜΑΤ ΜΤ1 на 28% (Р<0,05) или СТХ на 62% (Р<0,0005) и с подавлением метастазирования при монотерапии ΜΑΤ ΜΤ1 на 84% (Р<0,0001) или СТХ на 96 % (Р<0,00001).

Результаты показали, что подавление популяции миелоидных клеток антителом к ΤΟΡβΚΙΙ в сочетании с супрессивной в отношении миелоидных клеток химиотерапией представляет собой эффективную стратегию воздействия на рост опухоли и метастазирование.

- 15 025169

Перечень последовательностей

<110>	Ми, Уап
<120>	АНТИТЕЛА к РЕЦЕПТОРУ
<130>	Х18533
<140>	12/608034
<141>	2009-10-29
<150>	61/198697
<151>	2008-11-07
<150>	61/170369
<151>	2009-04-17
<160>	40
<170>	РаеепЪ1п уегзхоп	3.5
<210>	1
<211>	9
<212>	Белок
=213>	Ното заргепз
<400>	1
С1у С1у Зег Не Зег Азп	Зег

<210= 2 <211> 16 <212= Белок <213> Ното зархепз <400> 2

Зег РНе Туг Туг С1у С1и Ьуэ ТЬг Туг Туг Азп Рго Зег Ьеи Ьуз Зег <210> 3 <211> 11 <212> Белок <213> Ното еархепз <400> 3

С1у Рго ТЬг меъ Не Агд О1у Уа1 Не Азр Зег

<210>	4
<211>	451
<212>	Белок
<213>	Искусственный
<220>

- 16 025169

<223> ί

Синтетический

<400> -

1

С1п

Ьеи

О1п

Ьеи

О1п

С1и

Зег

С1у

Рго

61у

Ьеи

Уа1

Ьуз

Рго

Зег

С1и

1

5

10

15

ТЬг

Ьеи

Зег

Ьеи

ТЬг

Суа

ТЬг

Уа1

Зег

С1у

С1у

Зег

Не

Зег

Зег

Зег

20

25

30

Зег

Туг

Зег

Тгр

О1у

Тгр

Не

Агд

С1п

Рго

Рго

О1у

Ьуз

С1у

Ьеи

<31 и

35

40

45

Тгр

Не

С1у

Зег

РЬе

Туг

Туг

Зег

С1у

Не

ТЬг

Туг

Туг

Зег

Рго

Зег

50

55

60

Ьеи

Ьуз

Зег

Агд

Не

Не

Не

Зег

С1и

Азр

ТЬг

Зег

Ьуз

Азп

С1п

РЬе

65

70

75

80

Зег

Ьеи

Ьуз

Ьеи

Зег

Зег

Уа1

ТЬг

А1а

А1а

Азр

ТЬг

А1а

Уа1

Туг

Туг

85

ЭО

95

Суз

А1а

Зег

С1у

РЬе

ТЬг

Мер

11е

Агд

О1у

А1а

Ьеи

Азр

Туг

Тгр

С1у

100

105

110

51п

61у

ТЬг

Ьеи

Уа1

ТЬг

Уа1

Зег

Зег

А1а

Зег

ТЬг

Ьуа

С1у

Рго

Зег

115

120

125

Уа1

РЬе

Рго

Ьеи

А1а

Рго

Зег

Зег

Ьуз

Зег

ТЬг

Зег

С1у

<31у

ТЬг

А1а

130

135

140

А1а

Ьеи

σίγ

Су 5

Ьеи

Уа1

Ьуз

Азр

Туг

РЬе

Рго

С1и

Рго

Уа1

ТЬг

Уа1

145

150

155

160

Зег

Тгр

Азп

Зег

С1у

А1а

Ьеи

ТЬг

Зег

С1у

Уа1

ΗΪ3

ТЬг

РЬе

Рго

А1а

165

170

175

Уа1

Ьеи

О1п

Зег

Зег

О1у

Ьеи

Туг

Зег

Ьеи

Зег

Зег

Уа1

νθΐ

ТЬг

Уа1

160

185

190

Рго

Зег

Зег

Зег

Ьеи

С1у

ТЬг

01 п

ТЬг

Туг

11е

Суз

Аеп

νθΐ

Азп

Н1з

195

200

205

Ьуз

Рго

Зег

Азп

ТЬг

Ьув

Уа1

Αερ

Ьуз

Агд

Уа1

С1и

Рго

Ьуз

Зег

Суз

210 215 220

- 17 025169

Айр Ьув ТНг Н1з ТНг Суз Рго Рго Суз Рго А1а Рго С1и Ьеи Ьеи С1у 225 230 235 240

С1у Рго Зег 7а1 РЬе Ьеи РНе Рго Рго Ьуз Рго Ьуз Азр ТНг Ьеи МеП 245 250 255

Не Зег Агд ТНг Рго С1и ν&1 ТНг Суз Уа1 Уа1 Д/а1 Азр Уа1 Зег Нхз 260 265 270

С1и Азр Рго С1и ν^Ι Ьуз РНе Азп Тгр Туг Уа1 Азр О1у Уа1 С1и Уа1 275 280 285 н!з Азп А1а Ьуз ТНг Ьуз Рго Агд С1и С1и <31п Туг Азп Зег ТНг Туг 290 295 300

Агд Уа1 Уа1 Зег Уа1 Ьеи ТНг Уа1 Ьеи Ηίε С1п Азр Тгр Ьеи Азп С1у 305 310 315 320

Ьуз С1и Туг Ьуз Суз Ьуз Уа1 Зег Азп Ьуз А1а Ьеи Рго А1а Рго 11е 325 330 335

С1и Ьуз ТНг Не Зег Ьуз А1а Ьуз С1у С1п Рго Агд С1и Рго С1п Уа1 340 345 350

Туг ТНг Ьеи Рго Рго Зег Агд С1и С1и Ме£ ТНг Ьуз Азп <31п νβΐ Зег 355 360 365

Ьеи ТНг Суз Ьеи \7а1 Ьуз С1у РНе Туг Рго Зег Азр Не А1а Уа1 С1и 370 375 380

Тгр С1и Зег Азп С1у С1п Рго С1и Азп Азп Туг Ьуз ТНг ТНг Рго Рго 385 390 395 400

Уа1 Ьеи Азр Зег Азр С1у Зег РНе РНе Ьеи Туг Зег Ьу5 Ьеи ТНг Уа1 405 410 415

Азр Ьуз Зег Агд Тгр О1п С1п С1у Азп Уа1 РНе Зег Суз Зег Уа1 Мер 420 425 430

Ηίδ С1и А1а Ьеи Ηΐε Айп Ηίδ Туг ТНг О1п Ьуз Зег Ьеи Зег Ьеи Зег 435 440 445

Рго О1у Ьуз 450

<210> 10 <211> 9 <212> Белок <213> Ното зархепв

- 19 025169 <400> 10

С1п О1п Агд Зег Азп Тгр Рго Рго Тпг 1 5 <210> 11 <211> 1413 <212> ДНК <213> Искусственная <220>

<223 > Синтетическая <400> 11

а^дддаСддС	саСдСа^саЪ	ссС^ЪЪЪсСа	дЬадсаасЪд	саас1:ддадЪ	аса££еасад	60
сЪасадсЬдс	аддадесддд	сссаддасед	дедаадсссс	сддадасссс	ассссссасс	120
£дсасСд£с1:	сЬддСддсСс	саЬсадсадЬ	адЬадМ;ас11	ссЬддддсЪд	даЪссдссад	130
сссссаддда	адддссЬдда	деддаесддд	адС££с£аъе	асадСдддаС	сассСасЬас	240
адсссд^ссс	ЕсаададСсд	ааССаСсаСа	Сссдаадаса	сдЪссаадаа	ссад^СсЬсс	300
сЪдаадсСда	дССсЬд'Ьдас	сдссдсадас	асддсЪдЪдС	аИСасЪдЬдс	дадсдддЬЬГ	360
асЪасдаССс	ддддадсссъ	ЬдасСасЬдд	ддссадддаа	сссСддСсас	сдЕсСссЬса	420
дсЕадсасса	адддсссаЬС	ддссЕесссс	седдсасссс	ссСссаадад	сассСсиддд	430
ддсасадсдд	сссЕдддсЬд	ссСддЬсаад	дасЬасЪСсс	ссдаассддС	дасддедЬсд	540
Сддаас^сад	дсдсссОдас	садсддсдъд	сасасс^Ссс	сддсЬдСссС	асадЬссЬса	600
ддас£с£ас1:	сссЪсадсад	сдСддЬдасс	дЬдсссСсса	дсадс+Ьддд	сасссадасс	660
ЬасаСсСдса	асдЕдаа^са	саадсссадс	аасассаадд	Ьддасаадад	адЪЬдадссс	720
аааСсЬСдЬд	асаааасЬса	саса^дссса	ссд£дсссад	сассЪдаасе	ссХдддддда	730
ссд£сад£с1:	ессЪсЪЕссс	сссаааассс	ааддасассс	ЬсаЬда^сЪс	ссддасссс^	840
дадд^сасаС	дсд+ддЬддЬ	ддасдЬдадс	сасдаадасс	сЬдаддЬсаа	дЬЁсаасЬдд	900
Ьасд1:ддасд	дсдьддадде	дсасааьдсс	аадасааадс	сдсдддадда	дсадсасаас	960
адсасдЬасс	д^дСддЬсад	сдЪссЕсасс	дСсс^дсасс	аадасСддсЪ	дааЪддсаад	1020
дадСасаадС	дсааддЬсЬс	саасааадсс	сСсссадссс	ссаЬсдадаа	аассаЕсЬсс	1080
ааадссааад	ддсадссссд	адаассасад	дсдгасассс	сдсссссасс	ссдддаддад	1140
аЪдассаада	ассаадСсад	ссЬдассЪдс	сСддЪсааад	дс£Ьс£аЪсс	садсдасаЬс	1200
дссдСддадЬ	дддададсаа	£дддсадссд	дадаасаасЪ	асаадассас	дсс£сссдСд	1260
сЬддасЪссд	асддсИссЪС	сЕСссЪсСаЪ	ИссаадсЪса	ссдЬддасаа	дадсаддСдд	1320
садсадддда	асдссЪссЪс	аЪдсЪссдЪд	а£дсаСдадд	сЪсЪдсасаа	ссасСасасд	1380

- 20 025169 садаададсо £сСсссСд£с ьссдддсааа Ъда

<210> <211> <212> <213>	12 214 Белок Искусственный
<220>
<223>	Синтетический
<400>	12
С1и 11е	: Уа1 Ъеи ТЬг <

С1и Агд А1а ТЬг Ьеи Зег Суз Агд А1а Зег С1п Зег Уа1 Агд Зег РЬе 20 25 30

Ъеи А1а Тгр Туг С1п С1п Ъуз Рго О1у О1п А1а Рго Агд Ъеи Ъеи Не 35 40 45

Туг Азр А1а Зег Азп Агд А1а ТЬг С1у Не Рго А1а Агд РЬе Зег С1у 50 55 60

Зег С1у Зег С1у ТЬг Азр РЬе ТЬг Ъеи ТЬг 11е Зег Зег Ъеи С1и Рго 65 70 75 80

С1и Азр РЬе А1а \7а1 Туг Туг Суз С1п 01п Агд Зег Азп Тгр Рго Рго 85 90 95

ТЬг РЬе С1у С1п С1у ТЬг Ъуз Уа1 О1и Не Ъуз Агд ТЬг Уа1 А1а А1а 100 105 110

Рго Зег Уа1 РЬе Не РЬе Рго Рго Зег Азр С1и С1п Ъеи Ъуз Зег С1у 115 120 125

ТЬг А1а Зег Уа1 Уа1 Суз Ъеи Ъеи Азп Азп РЬе Туг Рго Агд С1и А1а 130 135 140

Ъуз Уа1 С1п Тгр Ъуз Уа1 Азр Азп А1а Ъеи О1п Зег С1у Азп Зег С1п 145 150 155 160

С1и Зег Уа1 ТЬг С1и С1п Азр Зег Ъуз Азр Зег ТЬг Туг Зег Ъеи Зег 165 170 175

Зег ТЬг Ъеи ТЬг Ъеи Зег Ъуз А1а Азр Туг С1и Ъуз Нхз Ъуз Уа1 Туг 180 185 190

А1а Суз 01и Уа1 ТЬг Нхз 01п С1у Ьеи Зег Зег Рго Уа1 ТЬг Ьуз Зег 195 200 205

РЬе Азп Агд С1у О1и Суз 210 <210=· 13 <211=· 711 <212> ДНК <213 > Искусственная <220=· <22 3=· Синтетическая <400> 13

дссдссасса	СдддаСддСс	аСдСаЪсаЪс	съсъсесьдд	ьадсаасьдс	аасьддадьа	60
саСЛсадааа	ССд£дС£дас	асад£с1;сса	дссасссСдС	сьььдьсьсс	^дддд^аада	120
дссассс£с1:	ссЪдсадддс	садСсададе	д^СадаадСЬ	ЬсЬЬадссЬд	дЬассаасад	180
ааассЬддсс	аддсЬсссад	дсЪссесаЬс	СаСдаЬдсаЬ	ссаасадддс	сасЬддсаЬс	240
ссадссаддС	СсадСддсад	ьдддес^ддд	асадасССса	сЬсЬсассаЬ	садсадссЬа	300
дадссьдаад	аьсеъдсадс	ССаГСасЬдЬ	садсадсдьа	дсаасьддсс	ьссдасдсьс	360
ддссааддда	ссааддСдда	аа^сааасда	асЬдЬддсЬд	сассаЬсЬдЬ	сЬЬсаЬсЬЬс	420
ссдссаГсРд	аЬдадсадСА	даааСсСдда	асЬдссЬсЬд	ЬЬдЬдЬдссЬ	дсЬдааЬаас	480
ъссЪаЬссса	дададдссаа	адСасадЬдд	ааддЬддаЬа	асдсссЬсса	аьсдддааас	540
ссссаддада	дЪдСсасада	дсаддасадс	ааддасадса	ссЬасадссЬ	садсадсасс	600
сСдасдсЬда	дсааадсада	сЬасдадааа	сасааадЬсь	асдссЬдсда	адЬсасссаЬ	660
садддссСда	дсСсдсссдЬ	сасааададс	ЬЬсаасаддд	дададЬдЬЬа	д	711

<210> 14 <211> 11 <212> Белок <213> Ното зартепз <400> 14

Агд А1а Зег <31п Зег Уа1 Агд Зег РЬе Ьеи А1а 15 10

<210>	15
<211>	9
<212>	Белок
<213>	Искусственный
<220>
<223>	Синтетический

- 22 025169 <220>

<221 > М13С_РЕАТШ<Е <222> {6) . . ΐ 6) <223> Хаа в положении 6 = Ν или 3 <220>

< 2 21 > ΜΙ5С ΡΕΑΤυΚΕ <222> ί8),,(8) <223> Хаа в положении 8 = У или 3 <220>

<221> М13С_РЕАТиКЕ <222> Ϊ9).-(9) <223> Хаа в положении 9 = Р или У <400> 15

01у С1у Зег Не Зег Хаа Зег Хаа Хаа 1 5 <210> 16 <211> 16 <212> Белок <213> Искусственный <220>

<223> Синтетический <220>

<221> М13С_РЕАТШЕ <222> (5)..(5)

<223>	Хаа в	положении	5 = С	или	3
<220> <221>	М15С	РЕАТиКЕ
<222>	(6) . .	(6)
<223>	Хаа в	положении	6 = Е	или	с
<220> <221>	М13С	РЕАТиЕЕ
<222>	(7) - .	(7)
<223>	Хаа в	положении	7 - К	или	I

<220>

<221> М13С_ЕЕАТиКЕ <222> (11)..(11) <223> Хаа в положении 11 = N или 5 <400> 16

Зег РНе Туг Туг Хаа Хаа Хаа ТЬг Туг Туг Хаа Рго Зег Ьеи Ьуз Зег 15 10 15 <210> 17 <211> 592 <212> Белок <213> Мие тизси1иа

- 23 025169 <400> 17

Мей С1у Агд 01у Ьеи Ьеи Агд <31у Ьеи Тгр Рго Ьеи Ηίε Не Уа1 Ьеи 15 10 15 тгр ТЬг Агд Не А1а Зег ТЬг Не Рго Рго Нхз \7а1 Рго Ьуз Зег Адр 20 25 30

Уа1 О1и Мей Пи А1а С1п Ьуз Азр А1а Зег Не Нхз Ьеи Зег Суд Азп 35 40 45

Агд ТЬг Не Ηίδ Рго Ьеи Ьуд Нхз РЬе Азп Зег Азр ^7а1 Мей А1а Зег 50 55 60

Адр Азп С1у С1у А1а Уа1 Ьуз Ьеи Рго С1п Ьеи Суз Ьуз РЬе Суз Азр 65 70 75 80

7а1 Агд Ьеи Зег ТЬг Суд Азр Азп С1п Ьуз Зег Суз Мей Зег Αεη Суд 85 90 95

Зег Не ТЬг А1а Не Суз 01и Ьуз Рго Нгз С1и Уа1 Суз Уа1 А1а Уа1 100 105 110

Тгр Агд Ьуе Азп Авр Ьуз Азп Не ТЬг Ьеи С1и ТЬг Уа1 Суз Нхз Азр 115 120 125

Рго Ьуе Ьеи ТЬг Туг Нхз <31у РЬе ТЬг Ьеи С1и Азр А1а А1а Зег Рго 130 135 140

Ьуз Суз Уа1 Мей Ьуз С1и Ьуз Ьуз Агд А1а С1у СЯи ТЬг РЬе РЬе Мей 145 150 155 160

Су5 А1а Суз Азп Мей О1и С1и Суд Азп Азр Туг Не Не РЬе Зег С1и 165 170 175

С1и Туг ТЬг ТЬг Зег Зег Рго Азр Ъеи Ьеи Ьеи А/а1 Не 11е С1п Уа1 180 185 190

ТЬг С1у \Га1 Зег Ьеи Ъеи Рго Рго Ъеи С1у Не А1а Не А1а Уа1 Не 195 200 205

Не Не РЬе Туг Суз Туг Агд Уа1 Нхз Агд <51п <31п Ъуд Ъеи Зег Рго 210 215 220

Зег Тгр С1и Зег Зег Ъуд Рго Агд Ьуз Ьеи Мей Азр РЬе Зег Азр 225 230 235

АЗП

240

- 24 025169

Суз А1а Не Не Ъеи С1и Азр Азр Агд Зег Азр Не Зег Зег ТНг Суз 245 250 255

А1а Азп Азп Не Азп Ηΐδ Азп ТНг С1и Ьей Ьей Рго Не <31и Ъеи Азр 260 265 270

ТЪг Ъеи ν^Ι С1у Ъуз С1у Агд РНе А1а С1и ν&1 Туг Ъуз А1а Ъуз Ъеи 275 280 285

Ъуз С1п Азп ТНг Зег С1и С1п РНе С1и ТНг Уа1 А1а Уа1 Ъуз 11е РЬе 290 295 300

Рго Туг <31и С1и Туг Зег Зег Тгр Ъуз ТНг С1и Ъуз Азр Не РНе Зег 305 310 315 320

Азр Не Азп Ъеи Ъуз Ηίβ С1и Азп Не Ъеи 01п РНе Ъеи ТНг А1а С1и 325 330 335

С1и Агд Ъуз ТНг С1и Ъеи С1у Ъуз 01п Туг Тгр Ъеи 11е ТНг А1а РНе 340 345 350

ΗΪ3 А1а Ъуз О1у Азп Ъеи С1п с1и Туг Ъеи ТНг Агд Н1з Уа1 Не Зег 355 360 365

Тгр С1и Азр Ъеи Агд Ъу8 Ъеи <31у Зег Зег Ъеи А1а Агд С1у Не А1а 370 375 380

Ηΐδ Ъеи ΗΪ8 Зег Азр Ηίβ ТНг Рго Суз 01у Агд Рго Ъуз МеЬ Рго Не 385 390 395 400

Уа1 ΗΪ5 Агд Азр Ъеи Ъуз Зег Зег Азп Не Ъеи \7з1 Ъуз Азп Авр Ъеи 405 410 415

ТНг Суз Суз Ъеи Суз Азр РНе С1у Ъеи Зег Ъеи Агд Ъеи Азр Рго ТНг 420 425 430

Ъеи Зег Уа1 Азр Азр Ъеи А1а Азп Зег С1у С1п Уа1 С1у ТНг А1а Агд 435 440 445

Туг МеЬ А1а Рго <31и 7а1 Ъеи С1и Зег Агд МеЬ Азп Ъеи <31и Азп Уа1 450 455 460

С1и Зег РНе Ъуз О1п ТНг Азр Уа1 Туг Зег МеЬ А1а Ъеи Уа1 Ъеи 465 470 475

Тгр

480

С1и МеЬ ТНг Зег Агд Суз Аеп А1а Уа1 С1у С1и Уа1 Ьуз Азр Туг 01и 485 490 495

Рго Рго РНе С1у Зег Ьуз Уа1 Агд С1и ΗΪ8 Рго Суз Уа1 С1и Зег МеЬ 500 505 510

Ьуз Азр Зег Уа1 Ьеи Агд Азр Агд С1у Агд Рго О1и Не Рго Зег РНе 515 520 525

Тгр Ьеи Азп ΗΪ3 С1п О1у Не С1п 11е Уа1 Суз О1и ТНг Ьеи ТНг С1и 530 535 540

Суз Тгр Азр ΗΪΒ Аар Рго <31и А1а Агд Ьеи ТНг А1а С1п Суз Уа1 А1а 545 550 555 560

С1и Агд РНе Зег С1и Ьеи С1и Нхз Рго С1и Агд Ьеи Зег С1у Агд Зег 565 570 575

Суз Зег О1п С1и Ьуз 11е Рго О1и Азр С1у Зег Ьеи Азп ТНг ТНг Ьуз 580 535 590 <210> 18 <211> 11 <212> Белок <213 > искусственный <220>

<223 > Синтетический <220>

<221> М13С_РЕАТиКЕ <222> (9)..(9) <223> хаа в положении 9 = У или Р <400> 18

Агд А1а Зег С1п Зег 7а1 Агд Зег хаа ьеи А1а 15 10

<210>	19
<211>	20
<212>	ДНК
<213>	ното еархепе
<400>	19
а£ддад££Ьд ддсСдадсЪд	20

<210> 20 <211> 21 <212> ДНК <213> Ното заргепз <400^ 20

Ьдссаддддд аадассдаСд д 21 <210> 21 <211> 24 <212> ДНК <213> Ното заргепз <400> 21 аСддааассс садсдсадсС ссЬс 24 <210> 22 <211> 20 <212> ДНК <213> Ното гаргепз <400> 22 сдддаадаСд аадасадаЬд 20

<210> <211> <212> <213> <400>

23 121 Белок

Ното 23 αΐη

зархепз Уа1 С1п С1и Зег С1у Рго О1у

Ьеи

Уа1

Ьуз

Рго

Зег 15

С1и

С1п 1

Ьеи

5

10

ТЬг

Ьеи

Зег

Ьеи

ТЬг

Суз

ТЬг

Уа1

Зег

С1у

С1у

Зег

Не

Зег

Азп

Зег

20

25

30

Туг

РЬе

Зег

Тгр

С1у

Тгр

11е

Агд

С1п

Рго

Рго

С1у

Ьуз

С1у

Ьеи

С1и

35

40

45

Тгр

Не

С1у

Зег

РЬе

Туг

Туг

С1у

С1и

Ьуз

ТЬг

Туг

Туг

Агп

Рго

Зег

50

55

60

Ьеи

Ьуз

Зег

Агд

А1а

ТЬг

11е

Зег

11е

Азр

ТЬг

Зег

Ьуз

Зег

<31п

РЬе

65

70

75

80

Зег

Ьеи

Ьу5

Ьеи

Зег

Зег

Уа1

ТЬг

А1а

А1а

Азр

ТЬг

А1а

Уа1

Туг

Туг

85

90

95

Суз

Рго

Агд

С1у

Рго

ТЬг

МеЬ

Не

Агд

С1у

Уа1

Не

Азр

Зег

Тгр

О1у

100

105

110

- 27 025169

С1л <31у ТЬг Ьеи Уа1 ТЬг Уа1 Зег Зег 115 120

<210> 24 <211> 363 <212> ДНК <213> Ноте зарДепз
<400> 24 садсЬдсадд	ЬдсаддадСс	дддсссадда	с£дд£даадс	сСЪсддадас	ссСдСсссСс	60
асс£дсас1:д	ЬсЁсЬддРдд	сьссассадс	аасадЬГаЪЬ	гсгсссдддд	сРддаессдс	120
садсссссад	ддаадддасЪ	ддадРддаЫ:	дддадГЪСсС	аГГаРддГда	ааааассЪас	1Θ0
касаасссдЬ	сссЬсаадад	ссдадссасс	аГаГссаЬСд	асасдСссаа	дадссадЪСс	240
Ссссгдаадс	ДдадсСсСдД	дассдссдса	дасасддссд	ДдСаССасЪд	Сссдададдд	300
ссСасСаСда	ЬГсддддадГ	Ъа£адасСсс	Сддддссадд	даасссЁдд1;	сассдЬсЬсс	360
Гса						363

<210>

25

<211>

107

<212>

Белок

<213>

Ното

зарХепз

<400>

25

О1и Не

Уа1

Ьеи

ТЬг

С1п

Зег

Рго

А1а

ТЬг

Ьеи

Зег

Ьеи

Зег

Рго

С1у

1

5

10

15

С1и Агд

А1а

ТЬг

Ьеи

Зег

Суз

Агд

А1а

Зег

61п

Зег

Уа1

Агд

Зег

Туг

20

25

30

Ьеи А1а

Тгр

Туг

С1п

О1п

Ьуз

РГО

С1у

Θΐη

А1а

Рго

Агд

Ьеи

Ьеи

Не

35

40

45

Туг Аэр

А1а

Зег

Аеп

Агд

А1а

ТЬг

С1у

Пе

Рго

А1а

Агд

РЬе

Зег

<31у

50

55

60

Зег С1у

Зег

СПу

ТЬг

Агр

РЬе

ТЬг

Ьеи

ТЬг

Не

Бег

Зег

Ьеи

О1и

Рго

65

70

75

Θ0

О1и Азр

РЬе

А1а

Уа1

Туг

Туг

Суз

<31п

С1п

Агд

Зег

Азп

Тгр

Рго

Рго

85

90

95

ТЬг РЬе

С1у

С1п

О1у

ТЬг

Ьуз

Уа1

С1и

11е

Ьуз

100

105

- 28 025169 <210> 26 <211=> 321 <212> ДНК <213 > Ногло зар1еп5 <400> 26

даааССдСдЪ	СдасасадСс Сссадссасс сСдЪсЪЪЪде сЪссадддда аададссасс	60
с£с£ссЬдса	дддссадСса дадЬд^Ьсдс адсЬасЪЪад ссЬдд^асса асадааассЬ	120
ддссаддсСс	ссаддс£сс£ саЁсДаДдаЁ дса^ссааса дддссас^дд саЬсссадсс	180
аддСЬсадЬд	дсадСдддис Сдддасадас ССсасЬсЬса ссаСсадсад ссСададссЬ	240
даада£Ь££д	садЪСХаССа с^дСсадсад сд^адсаасе ддссЬссдас дПСсддссаа	300

дддассаадд Дддаааисаа а 321

<210>	27
<211>	236
<212>	Белок
<213>	Искусственный
<220> <223>	Синтетический
<400>	27

А1а 1

А1а

ТЬг

Мее

С1у 5

Тгр

Зег

Сус

Не

Не 10

Ьеи

РНе

Ьеи

Уа1

А1а 15

ТЬг

А1а

ТЬг

О1у

Уа1 20

ΗΪ3

Зег

01 и

Не

Уа1 25

Ьеи

ТНг

О1п

Зег

Рго 30

А1а

ТЬг

Ьеи

Зег

Ьеи 35

Зег

Рго

С1у

01 и

Агд 40

А1а

ТЬг

Ьеи

Зег

Суз 45

Агд

А1а

Зег

С1п

Зег 50

Уа1

Агд

Зег

РЬе

Ьеи 55

А1а

Тгр

Туг

О1п

<51 п 60

Ьу8

Рго

О1у

О1п

А1а 65

Рго

Агд

Ьеи

Ьеи

11е 70

Туг

Азр

А1а

Зег

Азп 75

Агд

А1а

ТЬг

С1у

11е 80

Рго

А1а

Агд

РЬе

Зег 85

О1у

Зег

О1у

Ее г

О1у 90

ТНг

Азр

РЬе

ТЬг

Ьеи 95

ТЬг

Не

Зег

Зег

Ьеи 100

О1и

Рго

О1и

Азр

РНе 105

А1а

Уа1

Туг

Туг

Суз 110

<31п

<31п

Агд

Зег

Азп 115

Тгр

Рго

Рго

ТЬг

РЬе 120

О1у

О1п

61у

ТНг

Ьуз 125

Уа1

С1и

Не

- 29 025169

Ьуз

С1у ТНг 130

Уа1

А1а

А1а

Рго Зег 135

Уа1

РНе

Не

РНе 140

Рго

Рго

Зег

Азр

С1и

О1п

Ьеи

Ьув

Зег

С1у

ТНг

А1а

Зег

Уа1

Уа1

Сув

Ьеи

Ьеи

Азп

Азп

145

150

155

160

РНе

Туг

Рго

Агд

С1и

А1а

Ьуз

Уа1

01п

Тгр

Ьуз

Уа1

Азр

Азп

А1а

Ьеи

165

170

175

С1п

Зег

О1у

Азп

Зег

С1п

С1и

Зег

Уа1

ТНг

С1и

С1п

Азр

Зег

Ьуз

АЗр

180

185

190

Зег

ТНг

Туг

Зег

Ьеи

Зег

Зег

ТНг

Ьеи

ТНг

Ьеи

Зег

Ьуз

А1а

Азр

Туг

195

200

205

С1и

ЬуЗ

Ηί&

Ьуе

νδΐ

Туг

А1а

Суз

О1и

ν3ΐ

ТНг

Н1в

ОТп

С1у

Ьеи

Зег

210

215

220

Зег

РГО

Уа1

ТНг

Ьув

Зег

РНе

Авп

Агд

О1у

С1и

Суз

225 230 235 <210> 28 <211> 470 <212> Белок <213> Искусственный <220>

<223> Синтетический <400> 28

МеЬ 1

С1у

Тгр

Зег

Суз 5

Не

Не

Ьеи

РНе

Ьеи ’/а! А1а ТЬг А1а ТЬг

О1у

10

15

Уа1

ΗΪ3

Зег

О1п

Ьеи

С1п

Уа1

О1п

С1и

Зег

С1у

Рго

С1у

Ьеи

Уа1

Ьу5

20

25

30

Рго

Зег

С1и

ТНг

Ьеи

Зег

Ьеи

ТНг

Суз

ТНг

Уа1

Зег

С1у

С1у

Зег

Не

35

40

45

Зег

Азп

Зег

Туг

РНе

Зег

Тгр

С1у

Тгр

Не

Агд

С1п

Рго

Рго

С1у

Ьуз

50

55

60

<31у

Ьеи

О1и

Тгр

Не

С1у

Зег

РНе

Туг

Туг

С1у

<31и

Ьу8

ТНг

Туг

Туг

65

70

75

80

Азп

Рго

Вег

Ьеи

Ьуз

Зег

Агд

А1а

ТНг

Не

Зег

11е

Азр

ТНг

Зег

Ьуз

85

90

95

- 3Ο 025169

Зег 01п РЬе Зег Ъеи Ъуз Ъеи Зег 100

Зег Уа1 ТЬг А1а А1а Азр ТЬг А1а 105 110

Уа1 Туг туг Суз Рго Агд О1у Рго 115 120

ТЬг меь Не Агд С1у 7а1 Не Азр 125

Зег Тгр С1у С1п С1у ТЬг Ъеи Уа1 130 135

ТЬг Уа1 Зег Зег А1а Зег ТЬг Ъуз 140

С1у Рго Зег Уа1 РЬе Рго Ъеи А1а 145 150

Рго Зег Зег Ъуз Зег ТЬг Зег С1у 155 160

О1у ТЬг А1а А1а Ъеи С1у Суз Ъеи 165

Уа1 Ъуз Азр Туг РЬе Рго С1и Рго 170 175 \Га1 ТЬг Уа1 Зег Тгр Азп Зег С1у 180

А1а Ъеи ТЬг Зег О1у Уа1 Шз ТЬг 185 190

РЬе Рго А1а А7а1 Ъеи С1п Зег Зег 195 200

С1у Ъеи Туг Зег Ъеи Зег Зег Уа1 205

Уа1 ТЬг Уа1 Рго Зег Зег Зег Ъеи 210 215

С1у ТЬг 01п ТЬг Туг 11е Суз Азп 220

Уа1 Азп Шз Ъуз Рго Зег Азп ТЬг 225 230

Ъуз Уа1 Азр Ъуз Агд Уа1 01и Рго 235 240

Ъуз Зег Суз Азр Ъуз ТЬг Шз ТЬг 245

Суз Рго Рго Суз Рго А1а Рго С1и 250 255

Ъеи Ъеи С1у С1у Рго Зег Уа1 РЬе 260

Ъеи РЬе Рго Рго Ъуз Рго Ъуз Азр 265 270

ТЬг Ъеи МеИ 11е Зег Агд ТЬг Рго 275 280

С1и Уа1 ТЬг Сув Уа1 Уа1 Уа1 Азр 285

Уа1 Зег Шз С1и Азр Рго С1и Уа1 290 295

Ъуз РЬе Азп Тгр Туг Уа1 Азр <31у 300

Уа1 С1и Уа1 Шз Азп А1а Ъуз ТЬг 305 310

Ъуз Рго Агд С1и С1и О1п Туг Азп 315 320

Зег ТЬг Туг Агд Уа1 Уа1 Зег Уа1 325

Ъеи ТЬг Уа1 Ъеи Шз О1п Азр Тгр 330 335

- 31 025169

Ьеи Азп

О1у

Ьуз 340

<31и Туг Ьуз

Суз

Ьуз 345

Уа1

Зег Азп Ьуз

А1а 350

Ьеи

Рго

А1а

Рго

Не

С1и

Ьуз

ТНг

11е

Зег

Ьуз

А1а

Ьуз

С1у

С1п

Рго

Агд

С1и

355

360

365

Рго

О1п

Уа1

Туг

ТНг

Ьеи

Рго

Рго

Зег

Агд

С1и

<31и

МеС

ТНг

Ьуз

Азп

370

375

380

01п

Уа1

Зег

Ьеи

ТЬг

Суз

Ьеи

Уа1

Ьуз

С1у

РНе

Туг

Рго

Зег

Азр

Не

385

390

395

400

А1а

Уа1

С31и

Тгр

С1и

зег

Азп

б1у

О1п

Рго

Й1и

АЗП

Азп

Туг

Ьуз

ТНг

405

410

415

ТНг

Рго

Рго

Уа1

Ьеи

Азр

Зег

Азр

<31у

Зег

РНе

РНе

Ьеи

Туг

Бег

Ьуз

420

425

430

Ьеи

ТНг

Уа1

Азр

Ьуз

Зег

Агд

Тгр

О1п

С1п

С1у

Азп

Уа1

РНе

Бег

Суз

435

440

445

Зег

Уа1

МеС

ΗΪ5

С1и

А1а

Ьеи

ΗΪ3

Азп

ΗΪ3

Туг

ТНг

С1п

Ьуз

Бег

Ьеи

450

455

460

Зег

Ьеи

Зег

Рго

С1у

Ьуз

465 470 <210> 29 <211> 470 <212 > Белок <213> Искусственный

<220>

<223>

Синтетический

<400>

29

Мер О1у

Тгр

Зег

Суз Не

11е

Ьеи

РНе

Ьеи

ν3ι

А1а

ТНг

А1а

ТНг

Й1у

1

5

10

15

ν&1 ΗΪ3

Зег

Й1п

Ьеи сз1п

Ьеи

□1п

<31и

Зег

О1у

Рго

С1у

Ьеи

Уа1

Ьуз

20

25

30

Рго Зег

С1и

ТНг

Ьеи Зег

Ьеи

ТНг

Суз

ТНг

Уа1

Зег

С1у

О1у

Бег

Не

35

40

45

Зег Зег

Зег

Зег

Туг Зег

Тгр

Э1у

Тгр

Не

Агд

С1п

Рго

Рго

СТу

Ьуз

50

55

60

01у Ьеи С1и Тгр Не С1у Зег РЬе Туг Туг Зег 65 70 75

С1у 11е ТЬг Туг Туг 30

Зег Рго Зег Ьеи Ьуз Зег Агд 11е Пе Пе Зег 85 90

С1и Азр ТЬг Зег Ьуз 95

Азп О1п РЬе Зег Ьеи Ьуз Ьеи Зег Зег Уа1 ТЬг 100 105

А1а А1а Азр ТЬг А1а 110

Уа1 Туг Туг Суз А1а Зег О1у РЬе ТЬг МеЬ Пе 115 120

Агд С1у А1а Ьеи Аер 125

Туг Тгр С1у <31п С1у ТЬг Ьеи Уя1 ТЬг Уа1 Зег 130 135

Зег А1а Зег ТЬг Ьуз 140

С1у Рго Зег ’/а1 РЬе Рго Ьеи А1а Рго Зег Зег 145 150 155

Ьуз Зег ТЬг Зег О1у 160

С1у ТЬг А1а А1а Ьеи 61у Суз Ьеи Уа1 Ьуз Азр 165 170

Туг РЬе Рго С1и Рго 175

Уа1 ТЬг Уа1 Зег Тгр Азп Зег С1у А1а Ьеи ТЬг 180 185

Зег С1у Уа1 Нгз ТЬг 190

РЬе Рго А1а Уа1 Ьеи О1п Зег Зег С1у Ьеи Туг 195 200

Зег Ьеи Зег Зег Уа1 205

’.'а! ТЬг Уа1 Рго Зег Зег Зег Ьеи С1у ТЬг С1п 210 215

ТЬг Туг Пе Суз Азп 220 ’7а1 Азп Ша Ьуз Рго Зег Азп ТЬг Ьуз Уа1 Азр 225 230 235

Ьуз Агд Уа1 С1и Рго 240

Ьуз Зег Суз Азр Ьуз ТЬг н!з ТЬг Суз Рго Рго 245 250

Суз Рго А1а Рго 01 и 255

Ьеи Ьеи С1у С1у Рго Зег Уа1 РЬе Ьеи РЬе Рго 260 265

Рго Ьуз Рго Ьуз Азр 270

ТЬг Ьеи Нес Пе Зег Агд ТЬг Рго С1и Уа1 ТЬг 275 280

Суз Уа1 Уа1 Уа1 Азр 285

Уа1 Зег Нхз О1и Азр Рго О1и Т7а1 Ьуз РЬе Авп 290 295

Тгр Туг Уа1 Авр 61у 300

ν*1 305

С1и

Уа1

ΗΪ3

Азп

А1а 310

Ьуе

ТЬг

Ьуе

Рго

Агд 315

С1и

С1и

О1п

Туг

Азп 320

Зег

ты

Туг

Агд

νβΐ 325

ш

Зег

Уа1

Ьеи

ТЬг 330

Уа1

Ьеи

Ηί 3

С1п

Азр 335

Тгр

Ьеи

Азп

С1у

Ьуз 340

С1и

Туг

Ьуз

Сус

Ьуз 345

Уа1

Зег

Азп

Ьуз

А1а 350

Ьеи

РГО

А1а

Рго

Не 355

С1и

Ьуз

ТЬг

Не

Зег 360

Ьуз

А1а

Ьуз

С1у

σΐη 365

Рго

Агд

С1и

Рго

С1п

Уа1

Туг

ТЫ

Ьеи

Рго

Рго

Зег

Агд

Й1и

О1и

МеЪ

ТЬг

Ьуз

Азп

370 375 380

О1п Та1 Зег Ьеи ТЫ Суз Ьеи Уа1 Ьуа О1у РЬе Туг Рго Зег Азр Не 385 390 395 400

А1а νθΐ С1и Тгр С1и Зег Азп С1у С1п Рго О1и Азп Азп Туг Ьуз ТЬг 405 410 415

ТЬг Рго Рго Уа1 Ьеи Азр Зег Азр О1у Зег РЬе РЬе Ьеи Туг Зег Ьуз 420 425 430

Ьеи ТЬг \<а1 Азр Ьуз Зег Агд Тгр О1п С1п 01у Азп Уа1 РЬе Зег Суз 435 440 445

Зег νδΐ МеЪ Н±з О1и А1а Ьеи Нхз Азп ΗΪ3 Туг ТЬг О1п Ьуз Зег Ьеи 450 455 460

Зег Ьеи Зег Рго ОТу Ьуз 465 470

<210>	30
<211>	236
<212>	Белок
<213>	Искусственный
<220>
<223>	Синтетический

<400> 30

А1а

А1а ТЬг

МеЪ

С1у Тгр

Зег

Суз

Не

Не

Ьеи

РЬе

Ьеи

Уа1

А1а

ТЬг

1

5

10

15

А1а

ТЫ С1у

Уа1

Нхз Зег

С1и

11е

Уа1

Ьеи

ТЫ

С1п

Зег

Рго

А1а

ТЬг

20

25

30

- 34 025169

Ьеи Зег Ьеи Зег Рго СЬу СЬи Агд АЬа ТЬг Ьеи Зег Суз Агд АЬа Зег 35 40 45

СЬп Зег УаЬ Агд Зег Туг Ьеи АЬа Тгр Туг СЬп СЬп Ьуз Рго СЬу СЬп 50 55 60

АЬа Рго Агд Ьеи Ьеи ЬЬе Туг Азр АЬа Зег Азп Агд АЬа ТЬг СЬу ЬЬе 65 70 75 80

Рго АЬа Агд РЬе Зег СЬу Зег СЬу Зег СЬу ТЬг Азр РЬе ТЬг Ьеи ТЬг 85 ЭО 95

1Ье Зег Зег Ьеи СЬи Рго СЬи Азр РЬе АЬа УаЬ Туг Туг Суз СЬп СЬп 100 105 110

Агд Зег Азп Тгр Рго Рго ТЬг РЬе СЬу СЬп СЬу ТЬг Ьуз УаЬ СЬи Ые 115 120 125

Ьуз СЬу ТЬг УаЬ АЬа АЬа Рго Зег УаЬ РЬе Ые РЬе Рго Рго Зег Азр 130 135 140

СЬи СЬп Ьеи Ьуз Зег СЬу ТЬг АЬа Зег УаЬ УаЬ Суз Ьеи Ьеи Азп Азп 145 150 155 160

РЬе Туг Рго Агд СЬи АЬа Ьуз УаЬ СЬп Тгр Ьуз УаЬ Азр Азп АЬа Ьеи 165 170 175

СЬп Зег СЬу Азп Зег СЬп СЬи Зег УаЬ ТЬг СЬи СЬп Азр Зег Ьуз Азр 180 185 190

Зег ТЬг Туг Зег Ьеи Зег Зег ТЬг Ьеи ТЬг Ьеи Зег Ьуз АЬа Азр Туг 195 200 205

СЬи Ьуз НЬз Ьуз УаЬ Туг АЬа Суз СЬи УаЬ ТЬг НЬз СЬп СЬу Ьеи Зег 210 215 220

Зег Рго УаЬ ТЬг Ьуз Зег РЬе Азп Агд СЬу СЬи Суз 225 230 235

<2105	31
<211>	121
<212>	Белок
<213>	Ното зарЬепз
<400>	31

- 35 025169

01η Ъеи. 01η Ъеи 01η 01и Зег 01у Рго 01у Ъеи Уа1 Ъуз Рго Зег О1и 15 10 15

ТНг Ъеи Зег Ъеи ТНг Суз ТНг Уа1 Зег 01у 01у Зег Не Зег Зег Зег 20 25 30

Зег Туг Зег Тгр 01у Тгр 11е Агд 01п Рго Рго О1у Ъуз О1у Ъеи 01и 35 40 45

Тгр Не 01у Зег РНе Туг Туг Зег С1у Не ТНг Туг Туг Зег Рго Зег 50 55 60

Ъеи Ъуз Зег Агд Не 11е Не Зег О1и Азр ТНг Зег Ъуз Азп О1п РНе 65 70 75 80

Зег Ъеи Ъуз Ъеи Зег Зег Уа1 ТНг А1а А1а Азр ТНг А1а Уа1 Туг Туг 85 90 95

Суз А1а Зег 01у РНе ТНг МеЬ 11е Агд С1у А1а Ъеи Азр Туг Тгр 01у 100 105 110

О1п О1у ТНг Ъеи Уа1 ТНг Уа1 Зег Зег 115 120 <210> 32 <211> 363 <212> ДНК <213> Ношо зархепв <400> 32

садсЬасадс	СдсаддадГс	дддсосадда	сЬддЬдаадс	сЬЬсддадас	ссЬаЬсссЬс	60
ассЬдсасЬд	СсЬсЬдд+дд	сЬссаЬсадс	адЬадЬадЬЬ	асЬссЬдддд	оЬддаЬссдс	120
садссоосад	ддаадддссС	ддадЬддаЬЬ	зэдядьььоь	аЬЬасадЬдд	даЬсассЬас	180
ЬасадсссдЬ	ссс+саадад	ЬсдааЬЬаЬс	аЬаЬссдаад	асасдЬссаа	даассадЬЬс	240
ЬсссЬдаадс	ДдадДДсДдЬ	дассдссдса	дасасддсьд	ЬдьаЬЬасЬд	Ьдсдадсддд	300
ЬЬЬасЬаЬда	ь~сддддас'с	ссьЬдасЬас	ьддддссадд	даасссЬддЬ	сассдЬсЬсс	360
Ьса						363

<210>	33
<211>	107
<212>	Белок
<213>	Ношо вархепз
<400>	33

- 36 025169

С1и Не Уа1 Ьеи ТЬг <31п Зег Рго 1 5

А1а ТЬг Ьеи Зег Ьеи Зег Рго С1у 10 15

С1и Агд А1а ТЬг Ьеи Бег Суз Агд 20

А1а Бег <31п Бег Уа1 Агд Бег РЬе 25 30

Ьеи А1а Тгр Туг С1п С1п Ьуз Рго 35 40

С1у С1п А1а Рго Агд Ьеи Ьеи Не 45

Туг Азр А1а Зег Азп Агд А1а ТЬг 50 55

31у Не Рго А1а Агд РЬе Бег С1у 60

Зег С1у Зег <?1у ТЬг Азр РЬе ТЬг 65 70

Ьеи ТЬг 11е Зег Зег Ьеи 01 и Рго 75 80

С1и Азр РЬе А1а Уа1 Туг Туг Суз 85

СЬп С1п Агд Зег Азп Тгр Рго Рго 90 95

ТЬг РЬе О1у С1п С1у ТЬг Ьуз Уа1 100

С1и Не Ьуз 105 <210> 34 <211> 321 <212> ДНК <213> Ното зархепз <400> 34

даааЬбд^дЬ	Ьдасасад^с	Ьссадссасс	сГдЪс1:Ы;д£	сГссадддда	аададссасс	60
сЬсЬссСдса	дддссадЬса	дадЬдСХада	адГССсЫад	ссЬддСасса	асадааассС	120
ддссаддсЬс	ссаддс£ссЬ	саСсСагдаС	дсаГссааса	дддссасСдд	саЬсссадсс	180
адд1£садСд	дсадЬдддЬс	1дддасадас	ЬСсасЪсСса	ссаксадсад	ссСададссС	240
даадаСНЛд	садССГаПа	сЬдСсадсад	сдГадсаас!	ддссОссдас	дГЬсддссаа	300
дддассаадд	ЬддаааГсаа	а				321

<210> 35 <211> 451 <212> Белок <213> Искусственный <220>

<223> Синтетический <400> 35

С1п Ьеи С1п Уа1 С1п С1и Зег С1у Рго С1у Ьеи Уа1 Ьуз Рго Зег С1и 15 10 15

- 37 025169

Не

Зег

Агд

ТЬг 260

Рго

О1и

Уа1

ТЬг

Суз 265

Уа1

Уа1

Уа1

Авр

Уа1 270

Зег

ΗΪ3

С1и

Азр

Рго 275

С1и

Уа1

Ьув

РЬе

Азп 2В0

Тгр

Туг

νπ

Азр

С1у 235

Уа1

С1и

Уа1

Н1з

Азп 290

А1а

Ьуз

ТЬг

Ьуз

Рго 295

Агд

01и

С1и

С1п

Туг 300

Азп

Зег

ТЬг

Туг

Агд 305

Уа1

Уа1

Зег

ναΐ

Ьеи 310

ТЬг

Уа1

Ьеи

ΗΪΞ

σΐη 315

Азр

Тгр

Ьеи

Азп

01у 320

Ьуз

С1и

Туг

Ьув

Суз 325

Ьуз

Уа1

Зег

Авп

Ьуз 330

А1а

Ьеи

Рго

А1а

Рго 335

Не

С1и

Ьуз

ТЬг

Не 340

Зег

Ьув

А1а

Ьуз

С1у 345

С1п

Рго

Агд

С1и

Рго 350

С1п

ν&1

Туг

ТЬг

Ьеи 355

Рго

Рго

Зег

Агд

01 и 360

С1и

МеС

ТЬг

Ьуз

Азп 365

С1п

νπ

Зег

Ьеи

ТЬг 370

Суз

ьеи

Уа1

Ьуз

С1у 375

РЬе

Туг

Рго

Зег

Азр 380

Не

А1а

Уа1

С1и

Тгр 385

С1и

Зег

АЗП

С1у

С1п 390

Рго

С1и

Азп

Аеп

Туг 395

Ьуз

ТЬг

ТЬг

Рго

Рго 400

Уа1

Ьеи

Азр

Зег

Азр 405

<31у

Зег

РЬе

РЬе

Ьеи 410

Туг

Бег

Ьуз

Ьеи

ТЬг 415

νβΐ

Азр

Ьуз

Зег

Агд 420

Тгр

σΐη

С1п

О1у

Азп 425

Уа1

РЬе

Зег

Суз

Зег 430

Уа1

МеС

Ηΐ5

С1и

А1а 435

Ьеи

Й13

Азп

Нгз

Туг 440

ТЬг

О1п

Ьуз

Зег

Ьеи 445

Зег

Ьеи

Зег

Рго С1у Ьуз 450

<210>	36
<211>	1413
<212>	ДНК
<213>	Искусственный
<220>
<223>	Синтетический

<400> 36

айдддагддй сасдйайсай ссйгййСсйа дйадсаасйд саасйддадй асаййсасад	60
сйдсаддйдс аддадседдд сссаддассд дйдаадссйй сддадасссй дйсссйсасс	120
СдсасСдйсС сйддСддсСс саСсадсаас адССаСССсС ссСддддсйд даСссдссад	180
сссссаддда адддасСдда дйддаССддд адСССсйаСС айддСдаааа аассСасСас	240
аасссдйссс ссаададссд адссассаса СссайСдаса сдессаадад ссадсссссс	300
сСдаадсСда дсЬсСдСдас сдссдсадас асддсСдСдС аССасЪдСес дададддссС	360
асйаСдаССс ддддадССаС адасСссСдд ддссадддаа сссСддйсас сдСсСссйса	420
дссадсасса адддсссайс ддйсССсссс сСддсасссС ссйссаадад сассйсйддд	480
ддсасадсдд сссСдддсСд ссСддСсаад дасСасССсс ссдаассддС дасддСдйсд	540
СддаасСсад дсдсссСдас садсддсдйд сасассССсс сддсСдСссС асадйссСса	600
ддасСсгасС сссСсадсад сдСддйдасс дСдсссСсса дсадсССддд сасссадасс	660
СасаСсйдса асдСдаайса саадсссадс аасассаадд сддасаадад адссдадссс	720
ааассссдсд асаааассса сасасдссса ссдСдсссад сассйдаасС ссйдддддда	780
ссдйсадйсс СссСсССссс сссаааассс ааддасассс СсаСдаСсСс ссддассссС	840
даддСсасаС дсдСддСддС ддасдСдадс сасдаадасс сйдаддСсаа дССсаасйдд	900
СаСдСддасд дсдйддаддс дсасаасдсс аадасааадс сдсдддадда дсадсасаас	960
адсасдсасс дсдсддссад сдсссссасс дссссдсасс аадассддсс даасддсаад	1020
дадСасаадС дсааддСсСс саасааадсс сСсссадссс ссаСсдадаа аассаСсСсс	1080
ааадссааад ддсадссссд адаассасад дЬдСасассс СдсссссаСс ссдддаддад	1140
аСдассаада ассаадСсад ссСдассСдс сСддСсааад дсССсСаСсс садсдасаСс	1200
дссдСддадС дддададсаа Сдддсадссд дадаасаасс асаадассас дссссссдсд	1260
сСддасСссд асддсСссСС сССссЬсСаС СссаадсСса ссдСддасаа дадсаддСдд	1320
садсадддда асдСсСЬсСс аСдсСссдйд аСдсаСдадд сСсСдсасаа ссасСасасд	1380
садаададсс йсСсссСдСс Сссдддсааа Сда	1413

<210> 37 <211> 4702

<212>	ДНК
<213>	МЦ8	тизси1ие
<400>	37
дадСсасСсд	сдсдсассда	ссдасдасас	сссСсдсдсд	сдсасасдсс	сдссЬддддд	60
асддадсссс	адссйссСдс	СсадсСсЬсс	Ссддссдссд	ддддссСссС	ссдддссСсс	120

- 40 025169

дадсСседдд	даЬсдссддс	сасаЬсЬддс	ссдсаЬссЬд	ададддсдад	дадЬаааддс	180
дсадсссддд	дЬссссдадд	сЬсддЬЬсдС	ддсдсассад	дддссддЬсЬ	аьдасдадсд	240
асдддддсЬд	ссаЬдддЬсд	ддддсЬдсЬс	сддддссЬдь	ддссдсьдса	ЬаЬСдЬССЬд	300
Ьддасдсдса	Ьсдссадсас	даЬсссдссд	сасдЬЬссса	адЬсддаЬдЬ	ддаааЬддаа	360
дсссадааад	аЬдсаЬссаЬ	ссасдЬаадс	ЬдЬааЬадда	ссаЬссаЬсс	асЬдааасаЬ	420
съеаасадьд	аЬдЬсаЬддс	садсдасааь	ддсддьдсдд	ЬсаадсЬЬсс	асадсЬдЬдс	480
аадСЬСЬдсд	аЬдЬдадасС	дессасььдс	дасаассада	адЬссСдсаС	дадсаасЬдс	540
адсаЬсасдд	ссаСсЬдЬда	даадссдсаь	даадЬсЬдсд	ЬддссдЬдЬд	даддаадаас	600
дасаадааса	ЬЬасЬсЬдда	дасддЬРЬдс	сасдасссса	адсЬсассЬа	ссасддсЬСс	660
асЬсЬддаад	аЬдссдсЬЬс	ЬсссаадЬдЬ	дЬсаЬдаадд	аааадаааад	ддсдддсдад	720
асЬЬЬсЪЬса	ьдЬдЬдссЬд	ЬаасаЬддаа	дадЬдсаасд	аЫзасаЬсаЬ	сЬЬЬЬсддаа	780
дааьасасса	ссадсадЬсс	сдассьдсЬд	ЬСддЬсаЬЬа	Ьссаадьдас	дддЬдЬсадс	840
ссссЬдссСс	сдсЪддддаС	ьдссаСадсЬ	дЬсаСсаСса	ЬсЬЬсЬасЬд	сЬассдЬдЬс	900
сассддсадс	адаадсЬдад	сссдЬссЬдд	дададсадса	адссссддаа	асЬдаЬддаЬ	960
ЬЬсадЬдаса	аЬЬдЬдссаЬ	саЬссЬддад	дасдассдсЬ	ссдасаЬсад	сЪссасдСдс	1020
дссаасааса	Ссаассасаа	сасддадсЬд	сьдсссаьсд	адссддасас	дсьддгдддд	1080
аадддссдсь	ьсдссдаддЬ	сЬасааддсс	аадсЬдаадс	адаасассЬс	ададсадььь	1140
дадассдЬдд	сЬдЬсаадаЬ	сЬСссссЬас	даддад+асЬ	ссЬсдЬддаа	аасададаад	1200
дасаЬсЬЬсЬ	ссдаЬаЬсаа	ссЬдаадсаЬ	дадаасаЬсс	ЬдсадЬЬссЬ	дасддссдад	1260
дадсддаада	сададсЬддд	саадсадЬас	ЬддсЬдаЬса	сддсдЬЬсса	сдсдаадддс	1320
аассЬдсадд	адЬассЬсас	даддсаЬдЬс	аЬсадсЬддд	аддассьдад	даадсьдддс	1380
адсЬсссЬдд	сссддддсаЬ	сдсЬсаЬсЬс	сасадЬдасс	асасЬссЬЬд	Ьдддаддссс	1440
аадаЬдссса	ЬЬдЬЬсасад	ддассЬсаад	адсьсьааса	гссЬадЬдаа	даасдасЬЬд	1500
ассЬдЬЬдсс	ЬдЬдЬдасЬЬ	сдддсьдЬсс	ЬЬдсдссЬдд	асссЬасЬсЬ	дЬсЬдЬддаЬ	1560
дассСддсса	асадсдддса	ддЬдддаасд	дсаадаЬаса	Ьддссссдда	адЬЬсЬадаа	1620
Сссаддаьда	аЬсЬддаааа	С3с99а9^с9	ЬЬсаадсада	сддаЬдЬсЬа	сЬссаЬддсЬ	1680
сЬддЬасЬсЬ	дддаааЬдас	дЬсссдсЬдс	ааЬдсЬдЬдд	дадаадЬдаа	ддаЬЬасдад	1740
сссссаЬЬЬд	дСЬссааддЬ	дсдддадсас	сссЬдЬдЬдд	ададсаЬдаа	адасадЬдЬд	1800
сЬдададасс	дадддсддсс	ддаааььссс	адсЬЬсЬддс	Ьсаассасса	дддсаЬссад	1860
ассдьдсдЬд	адасььсдас	сдад£дсгдд	дассаьдасс	ссдаадсссд	ЬсЬсасадса	1920

- 41 025169

садЬдЬдЬдд	сададсдскх	садЬдадсЬд	дадсаьссдд	ададасЬсЬс	Ьдддаддадс	1980
ЬдсСсссадд	адаадаСЬсс	адаадаСддс	ЬсдсЬдааса	сСассаааЬа	дсЬЬЬЬЬсЬд	2040
ддсаддсСдд	дссаадссЬс	садаадссдь	ссЬсЬадсса	аадассадад	дсадсаддаЬ	2100
ЬсГсЬссЪда	сЬдаЬдсЬЬс	ьддаааасса	аддасььдсь	сссЫзсЬЬсс	ссаддадсЬд	2160
ссссдЬдГС£	адаадсддса	дсадсадсад	саасаассаЬ	адсддсддЬд	дсадсддсдд	2220
дддаьдадьд	асадададсд	ьссьаьдссь	ЬддадасЬдЬ	саЪддсаСаа	дсЬдЬдсЬад	2280
сассСссЬса	ддаааЬдада	ЬЬдаЬЬСЬЬа	саасадссаа	ЬааедЬЬЬдс	асЬЬЬаЬЬаа	2340
ьдссьдьдьд	саааьасдаа	ьадсьаьдсх	ььаьаьагаь	сьасаСассЬ	аьаЬдьсСаЬ	2400
аьсьсьсьаь	аьаьадссас	асссьдсаад	дадасааада	аааьдаьсаа	аьдьдсьссс	2460
сддддааЬЬа	дЬЬЬЬЬаЬЬд	дададсьсьа	дааьддадса	даадддасьс	дддаьадсдс	2520
СадсасЬЬда	сааЬсадЬса	сасаадсаас	даСссссСда	садсадддЫ;	дддддсасаа	2580
ЬЬдЬаЬдада	аддаЬссаЬд	ссЬЬдсадсс	ЬдсЬЬЬддсс	асаааасасЬ	ььдььььдса	2640
аЬааьдассс	ЬсЬасадЬад	ддЬдсЬЫзаЬ	ддассаддда	дсЬдадсЬсс	адЬссадсас	2700
ьдадьсссад	даСсЬсссаЬ	дЬдЬсЬЬЬдс	ььсьсььддь	ЬдЬЬаЬсЬЬЬ	дасаЬЬсаад	2760
ссссасьсЬд	асСЬдЬдаас	сььсьдасьь	адссььдааа	сЬЬддсссса	ЬЬЬЬЬсЬдсЬ	2820
ьььасдддсь	ассаааааЬс	ааадаадасс	дСЬссссасс	саьдаааььд	дссЬассаЬс	2880
ЬасЬааЬаад	аььдадььсь	ГЬдаСссЬЫ:	ссЬдЬдсаЬа	адЬаасЬдЬЬ	аЬЬЬдЬЬссс	2940
ЬдссаЬЬаЬс	сЬЬЬдЬЬдаЬ	ЬЬСЬЬЬаааа	сааддсасас	ссЬасасЬса	дссссЬсадс	3000
сЬсасЬдЬдЬ	ЪЬааЬЬСЬЬд	ЬсдсЬсЬдсЬ	дсЬдддЬсЬЬ	ссадсЬЬдсс	аЬддсаасас	3060
садСдддЬЬс	саЬЬаЬссса	дссьсссааа	Ьадсддасад	даЬЬЬдааСд	дсдсасдсЬд	3120
сссаЬасЬдЬ	асадсьдьдь	ссддддасьс	ьььдаасссь	ССЬЬСЬСССС	даьсаасаса	3180
сЬдЬсдаааа	адызадььда	дсСЬсЬЫзад	аасСаЫзЬдд	даддЬЬдсад	адаадсЬЬад	3240
аЬЬссссааЬ	аадсададда	ддЬддЬЬссЬ	адсЬссдссс	ссадддддса	ЬсаЬЬЬссад	3300
саадаадддс	аЬддсЬдсад	сЬдссЬсасЬ	дсьсасьссь	аадссЬссад	асььсссаьь	3360
асЬсасассс	ассссадЬсЬ	ддаааЬдааа	дсЬдсЬЬсса	дЬсаддаЬсс	аЬЬдЬаадаа	3420
аадЬдсдЫзс	дьдадсасдд	ададаьадса	адсаааааСд	дСЬдсассас	аадсаадасд	3480
ассьдадььс	аассссьсса	даасссасда	саааадьсаь	дььсадьддд	дсасъсыаь	3540
саЬсьсадсс	сЬдддаадас	даасассссЬ	ддаадсссад	ддсЬаддаад	аЬЬдЬсЬсса	3600
аадсадддЬд	адсадсассс	ЬдаддаасаС	сЬдасаЬЬда	сЬдасЫсЬд	дЬсЬссаЬса	3660
саддЬдсасс	сасдаасасс	сасасасасд	ЬдсасасасЬ	адаааЬдЬдс	аЪЬсаЬЬЬеа	3720

- 42 025169

ССсЬдЬЬсрд	ддаасадаЪР	ддаДСдсаса	ааасССаСсС	даЪд£Са£да	«СдаааЬСд	3780
асаСаааНд	даса^садда	дассасс£д£	дЬдрдассЬс	аСЬаддЬсад	ддсЬсРЪИдЪ	3840
аЪдсаЬаа^а	ад^е^саСс!:	дссДсЪдсаа	дддаассЬсЪ	седсхсСаад	аа£с1ХЪсГЛ	3900
РаСддсЪасС	ддРсЬсСдса	ЁддРссРаас	с^рддсадаа	аЫзасаадЬд	саьаЪРЪдаа	3960
саддддЬсас	асаддасСсс	ЬдСдЬадада	садддасСсЬ	дСдСссасЫ:	ддаЪдададс	4020
адддааСдад	сесхаааадд	ааасПдсеа	а^сссссаас	аааедеддаг	д££дсааасс	4090
ааадСсСдСс	ЬСдЬЪаадаа	аСРдЬдРЬЬЪ	СдаадсдасЬ	СаЪЪЬЬСаас	саааЬаддад	4140
саРдаЬСдда	даассассаа	дддддссСЬС.	ЪдЁРсРдРРС	ддрсаасард	дРсаааЬЬдд	4200
дддЬаддаса	ааааРсРаЪд	ЪдРРсЪдРдд	сЪЪсдаасас	саСддааасс	сссаадссса	4260
сЪедсНсГС	МддаССдсс	адрдсгаасс	сад^адсЬдС.	ЪдЁЬсассдс	ссИсЬадсдд	4320
ддааССЪаса	дааЪдсЪдд1;	ссассадсдд	да^ггсСадд	дслсаааад£	дасРрсаср£	4330
ссддд^саРс	аСсадааас^	ддааРаСддс	д^саъдъъас	рдгддспдс	СГСдГСГаСд	4440
^саРРРсЬМ:	ЪсХЬеаЬЪса	адааааадас	сааддааЪад	сагсдссдъс	аъсссссааа	4500
дГдЪСдасРс	^ГдТГсасГа	с^сРасаРаа	адддааадСС	РРаЬСсССЬС	аМСдаасасЪ	4560
есддссаьас	ъсаСдсассс	аааСаддаар	дСдааРдааЬ	дсасааЬа1:С	с1СС£Ьа£а£	4620
саааассраа	адсасРЬасс	сьсааессае	дсадсдесгд	сс^сссагас	аааСаааааЪ	4680
дРсСадЬада	РсаааРаааР	сс				4702

<210>	38
<211>	4704
<212>	ДНК
<213>	Ното еархепа
<400>	38

ддададддад	ааддсъс^сд	ддсддадада	ддЪссРдссс	адсрдррддс	даддадСССс	60
сЪд££Ьессс	сдсадсдсЪд	адссдаадсъ	дад^дадЬса	сЬсдсдсдса	сддадсдасд	120
асасссссдс	дсдЬдсассс	дсЬсдддаса	ддадссддас	РссСдЪдсад	сССсссСсдд	180
ссдссддддд	ссСссссдсд	ссесдссддс	сЪссаддссс	ссСссДддсС	ддсдадсддд	240
сдссасаСсГ	ддсссдсаса	СсСдсдсСдс	сддсссддсд	сдддд^ссдд	ададддсдсд	300
дсдсддаддс	дсадссаддд	дрссдддаад	дсдссд^ссд	срдсдсхддд	ддсДсддСсС	360
ардасдадса	дсддддСсЬд	ссаЬдддЪсд	ддддсЬдсСс	аддддссСдЪ	ддссдсСдса	420
саСсдЪсссд	ЪддасдсдСа	Ссдссадсас	дассссассд	сасдЬ^сада	адСсддаСдс	480
ддаааСддад	дсссадааад	ардаааСсаЪ	сЬдссссадс	СдРааСадда	сСдсссаСсс	540
асСдадасаС	аССааЬаасд	асаЬдаСадс	сасСдасаас	аасддСдсад	СсаадСССсс	600

- 43 025169

асаасЪдИдЪ	аааСЬЬЬдЬд	аЬдЬдадаЬЬ	ЬЬссассСдЬ	дасаассада	ааЬссЬдсаЬ	660
дадсаасЁдс	адсаЬсассЬ	ссаЬсЬдСда	даадссасад	даадЬсСдЬд	ЬддсЬдЬаЬд	720
дадааадааЪ	дасдадааса	ЬаасасЬада	дасадСЬЬдс	саЬдасссса	адсьссссьа	780
ссаЬдасЁНЪ	аььсьддаад	аьдсьдсььс	ЬссааадЬдс	аЬЪаЬдаадд	аааааааааа	840
дссСддСдад	асЬЬЬсЬЬса	ЬдЬдЬЬссЬд	ЬадсЬсЬдаЬ	дадьдсааЬд	асаасаЬсаЬ	900
сЪ^сЪсадаа	дааЬаЬааса	ссадсааЬсс	ЬдасЬЬдЬЬд	сЬадЬсаЬаЬ	ЬЬсаадЬдас	960
аддсаДсадс	сЬссЬдссас	сасЬдддадЬ	ьдссаьаьсь	дЬсаСсаЬса	ьсььсьасьд	1020
сгассдсдЫ	аассддсадс	адаадсЬдад	ЬьсаассЬдд	дааассддса	адасдсддаа	1080
дсьсадддад	ььсадсдадс	асьдьдссаь	саьссьддаа	даьдассдсь	сьдасаьсад	1140
сЁссасд^дЪ	дссаасааса	ьсаассасаа	сасададсьд	сьдсссаььд	адсСддасас	1200
ссЬддЬдддд	аааддьсдсс	ььдсьдаддь	сьасааддсс	аадссдаадс	адаасасЬсс	1260
ададсадСЫ;	дадасадЬдд	садЬсаадаЬ	сьььсссьаь	даддадЬаЬд	ссЬсЬЬддаа	1320
дасададаад	дасаьсььсь	садасаЬсаа	ЬсЬдаадсаЬ	дадаасаЬас	ЬссадЬЬссЬ	1360
дасддсгдад	дадсддаада	сддадЬЬддд	дааасааЬас	ЬддсЬдаЬса	ссдссЬЬсса	1440
сдссаадддс	аассЬасадд	адЬассЬдас	дсддсаЬдЬс	аЬсадсЬддд	аддассЬдсд	1500
саадсЬдддс	адсьсссьсд	сссдддддаь	ьдсьсасссс	сасадьдаЬс	асасьссаьд	1560
Ьдддаддесс	аадаЬдссса	ЬсдЬдсасад	ддассьсаад	адсЬссааЬа	ЬссЬсдЬдаа	1620
даасдассЬа	ассьдсьдсс	ЬдЬдЬдасЬЬ	ЬдддсЬЬЬсс	сПдсдЬсСдд	асссЬасЬсЬ	1660
дЬсЬдЬддаЬ	дассЬддсЬа	асадЬдддса	ддЬдддаасЬ	дсаадаьаса	ЬддеХссада	1740
адЬссЬадаа	ЬссаддаЬда	аЬЬСддадаа	ЬдЬЬдадЬсс	ЬЬсаадсада	ссдаьдЬсьа	1800
сЬссаЬддсЬ	сЬддЬдсЬсЬ	дддаааЬдас	аЬсЬсдсЬдЬ	ааЬдсадЬдд	дадаадЬааа	1860
адаььаьдад	ссЬссаЬЬЬд	дЬЬссааддЬ	дсдддадсас	сссЬдЬдЬсд	ааадсаЬдаа	1920
ддасаасдьд	ььдададаьс	дадддсдасс	адаааЬЬссс	адсЬЬсЬддс	Ьсаассасса	1960
дддсаЬссад	аЬддЬдЬдЬд	адасдЬЬдас	ЬдадЪдсЬдд	дассасдасс	сададдсссд	2040
ЬсЬсасадсс	садЬдЬдЬдд	садаасдсЬЬ	садЬдадсЬд	дадсаЬсЬдд	асаддсЬсЬс	2100
ддддаддадс	ЬдсЬсддадд	адаадаЬЬсс	Ьдаадасддс	ЬсссЬаааса	сьассаааьа	2160
дсЬСЬЬСЬдд	ддсаддсьдд	дссаьдссса	аададдссдс	сссьсьсасс	ааадаасада	2220
ддсадсадда	адсЬдссссЬ	даасЬдаЬдс	ЬЬссЬддааа	ассааддддд	ЬсасЬссссЬ	2230
сссСдСаадс	СдЬддддаЬа	адсадаааса	асадсадсад	ддадьдддсд	асаЬададса	2340
сьсЬаЬдссЬ	ЬЬдасаЬЬдЬ	саЬаддаЬаа	дсЬдЬдЬЬад	сасЫ-ссЬса	ддаааЬдада	2400

- 44 025169

ЪЪдаЪЪЪЪЪа	сааЪадссаа	ЪаасаЪЪЪдс	асЪЪЪаЬЪаа	ЪдссЪдЪаЪа	ЪаааЪаЪдаа	2460
ЪадсЬаСдЪЕ	ЪЪаЪаСаЪаЪ	аСаЪаЪаЬаЬ	сСаЪаЪаЪдС	сЪаЪадсЪсЪ	аЬаЪаЪаЪад	2520
ссаЪассЪЪд	аааададаса	аддаааааса	ЪсаааЪаЪЪс	ссаддаааЪЪ	ддЪЪЪСаЫгд	2530
дадаасЪсса	даассаадса	дадааддаад	ддасссаЪда	садсаЪЪадс	аЬЪЪдасааЪ	2640
сасасаЪдса	дЪддЕЪсЪсЪ	дасЪдЪаааа	садЪдаасЪЪ	ЪдсаЪдадда	аададдсЪсс	2700
аЬдЪсЪсаса	дссадсЪаЪд	ассасаЪЬдс	асЪЪдсЪЪЪС	дсааааЪааЪ	саЪЪсссЬдс	2760
с^адсасЪЪс	ЪсЪЪсЪддсс	аЪддаасЪаа	дЪасадЪддс	асЪдЪЪЪдад	дассадЪдЪЪ	2820
сссддддЪЪс	сЪдЪдЪдссс	ЪЪаЪсъсЪсс	ЪддасЪЪЫгс	аъъъаадсъс	саадссссаа	2880
аСсЪдддддд	сЪадЬЪЪада	аасЪсЪсссЬ	саассЪадЬЬ	ЪадааасЪсЪ	ассссаЪсЪЬ	2940
ЪааЪассНд	ааЪдЪЪСЪда	ассссасЪЪЪ	ЪЪассЪЪсаЪ	дддСЪдсада	ааааъсадаа	3000
садаьдъссс	саъссаъдсд	аъЬдссссас	саъсЪасЬаа	СдаааааЪСд	ъссъсьъесе	3060
саЪсЪЪЪссс	сЪдсасЪЪаЪ	дЪЪасЪаЪЪс	ЪсЪдсЪссса	дссЪЪсаЪсс	ЪЪЪЪсЪаааа	3120
аддадсаааъ	ЪсЪсасъсЪа	ддсьъъаъсд	ъдъъъасеъъ	ъъсаъъасас	ЪЪдасЪЪдас.	3180
ЪЫСЪадЪЪЪ	ъсъасасааа	сассааъддд	ЪГссаъсъЪЪ	сСдддсЪссЪ	даЪЪдсЪсаа	3240
дсасадъъъд	дссЪдаСдаа	даддаЪЪЪса	асСасасааъ	асЪаЪсаЪЪд	ЪсаддасЪаЬ	3300
дассъсаддс	асЪсЪаааса	ъаъдъсъъдъ	ЪЪддЪсадса	садсдЪЪЪса	аааадЪдаад	3360
ссасъсъаъа	ааъаъъъдда	даъсъъдсад	дааааЪсЬдд	аЪссссаддЪ	ааддаЪадса	3420
даЪддЪЪЪЪс	адЪЪаЪсЪсс	адСссасдЪЪ	сасааааСдЪ	дааддЪдЪдд	адасасЪЪас	3480
ааадсЪдссЪ	сасЫзсЬсас	ъдЪааасаЬЪ	адсЪсЪЪЪсс	асЪдссЬасс	Ъддассссад	3540
ес^аддааЪЪ	аааЪсЪдсас	сСаассаадд	ЬсссЪЪдСаа	даааЪдЪсса	ЪЪсаадсадГ	3600
саСЬсЪсЪдд	дСаЪаЪааСа	ЪдаЫзЪЪдас	ЪассЪЪаЪс!:	ддсдЪЪаада	еъъдаадьъд	3660
дссЪЪЪЪаЪС	ддасЪааадд	ддаасъссъъ	ЪаадддЪсЪс	адЪЪадссса	адЪЪЪсСЪЪЪ	3720
дсЪЪаЪаЪдЪ	ЪааЪадЪЪЪЪ	асссЪсСдса	ЪЪддададад	дадЪдсЪЪЪа	сЪссаадаад	3780
сЪЪЪссЪсаЪ	ддЪЪассдЪЪ	сЪсЪссаЪса	ЪдссадссЪЪ	сЪсаассЪЪЪ	дсадаааЪЪа	3840
сЪадададда	ЪЪЪдааЪдЪд	ддасасааад	дЪессаЪЪЪд	садЪЪадааа	аЪЪЪдЪдСсс	3900
асааддасаа	даасааадСа	ЪдадсЪЪЪаа	аасЪссаЪад	дааасЪЪдЪЪ	ааЪсаасааа	3960
даадЪдЪЪаа	ЪдсЪдсаадЪ	ааЪсЪсЪЪЬЪ	ЪЬаааасЪН	ЪЪдаадсСас	ЬЪаЪЪЪЪсад	4020
ссаааЪадда	аЪаЪЪадада	дддасЪддЪа	дЪдадааЪаЪ	садсСсСдЪЪ	ЪддаЪддЪдд	4080
ааддЪсСсаЪ	СЪЬаСЪдада	ЪЪЪЪЪаадаЪ	асаЪдсааад	дСЪЪддаааЪ	адаассЪсСа	4140
ддсасссЪсс	ЪсадЪдЪддд	СдддсЪдада	дСЪааадаса	дЪдСддсСдс	адСадсаЪад	4200

- 45 025169

аддсдсеЕад	аааСГссасС	СдсассдСад	ддсаСдсСтда	£асса£ссса	аСадс£дЫ:д	4260
сссаЕЕдасс	СсСадСддСд	адСЫтсСада	аСасСддСсс	аС£саСдада	СаССсаадаЪ	4320
ίсаададЬаЕ	ЬсГсасСХсС	дддСЬаГсад	саЬааасЪдд	ааСдСад^дС	сададдаЬас	4380
ЕдЕддсЕЕдЕ	есхдсесаед		СЛаЫзсаада	ааааадасса	аддаагааса	4440
ЕЕсЕдЕадЕЕ	ссЁаааааЬа	с£дас£СЛИС	СсасЬасЬаЬ	асаЪаааддд	ааадс.£ГСаС.	4500
ЕеЕЕЕЕаЕдд	аасасъесад	с£д£ас£сае	дЪаЪЪааааЪ	аддааЬдеда	аЬдсЪаьаъа	4560
сЕсЕЕЕЕЕаЕ	а£саааад£с	ЪсаадсасС!;	аъгЪССаСХс	гаСдсаССдЪ	ъсдссъслса	4620
саСаааСааа	аед^ССаега	даССдааЪаа	адсааааСас	ГсаддСдадс	аСсс^дсссо	4680
сЕдЕЬсссаЕ	ЬссъадДадс	Ьааа				4704

<210> 39 <21Ι> 161 <212> Белок

<213> Миз тизси1из

<400> :

39

Не

Рго

Рго

Нхз

Уа1

Рго

Ьуз

Зег

Азр

Уа1

С31и

МеС

С1и

А1а

С1п

Ьуз

1

5

10

15

Азр

А1а

Зег

Не

НХЗ

Ьеи

Зег

Суз

Азп

Агд

ТЬг

Не

Нхе

Рго

Ьеи

Ьуз

20

25

20

Нхз

РЬе

Азп

Зег

Азр

Уа1

МеС

А1а

Зег

Азр

Азп

С1у

С1у

А1а

ν«α

Ьуз

35

40

45

Ьеи

Рго

С1п

Ьеи

Суз

Ьуз

РЬе

Суз

Азр

Уа1

Агд

Ьеи

5ег

ГЬг

Суэ

Азр

50

55

60

Азп

С1п

Ьуз

Зег

Суз

МеЁ

Зег

Азп

Суз

Зег

Не

ТЬг

А1а

Не

Суз

С1ц

65

70

75

80

Ьуз

Рго

Нхз

О1и

Уа1

Суз

Уа1

А1а

Уа1

Тгр

Агд

Ьуз

Азп

Азр

Ьуз

АЗП

85

90

95

11е

ТЬг

Ьеи

С1и

ТЬг

Уа1

Суз

Нхз

Азр

Рго

Ьуз

Ьеи

ТЬг

Туг

Н1з

С1у

100

105

110

РЬе

ТЬг

Ьеи

С1и

Азр

А1а

А1а

Зег

Рго

Ьув

Суз

Уа1

Мес.

Ьуз

О1и

Ьуз

115

120

125

Ьуз

Агд

А1а

С1у

С1и

ТЬг

РЬе

РЬе

МеГ

Суз

А1а

Суз

Азп

МеС

<51 и

<51и

130 135 140

Сув Азп Азр Туг 11е	Не РЬе	Зег <31и С1и Туг ТЬг ТЬг	Зег Зег Рго
145	150	155	160
Азр

<210>	40
<211>	11
<212>	Белок
<213>	Искусственный
<220>
<223>	Синтетический

<220> <221> <222> <223>	М15С_РЕАТиРЕ
(2) . Хаа	. (2} в положении	2 = Р или	Р
<220> <221>	М13С	РЕАТиНЕ
<222>	(8 Ϊ -	. (8}
<223>	Хаа	в положении	8 = V или	А
<220> <221>	М13С	РЕАТЦРЕ
<222>	(9)	. (9)
<223>	Хаа	в положении	9=1 или	Ъ
<220> <221>	М13С	ΡΕΑΤϋΚΞ
<222>	(11}'	..(11)
<223 >	Хаа	в положении	11 = 3 или Υ
<400>	40
С1у Хаа ТЬг	МеЬ 11е Агд	С1у Хаа :	Каа	Азр Хаа
1		5			10

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

Claims (12)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Антитело человека, которое специфически связывается с ΤΟΡβΚΙΙ человека, содержащее:

   'ΌΚΗ1 с последовательностью ΟΟ8Ι8Ν8ΥΡ (8Е0 ГО N0: 1);

   СЭРН2 с последовательностью 8ΡΥΥΟΕКΤΥΥNР8^К8 (8ΙΥ) ГО N0: 2);

   'ΌΚΗ3 с последовательностью ΟРΤΜIΚΟVI^8 (8Е0 ГО N0: 3);

   'ΌΚΌ1 с последовательностью ΡΑ8Ο8νΡ8ΥΡΑ (8Е0 ΙΌ N0: 10);

   'ΌΚΌ2 с последовательностью ^Α8NΚΑΤ (8Е0 ΙΌ N0: 11);

   'ΌΚΌ3 с последовательностью ^^Κ8N^РРΤ (8Е0 ГО N0: 12), или фрагмент указанного антитела, которое специфически связывается с ΤΟΡβΚΙΙ человека и содержит указанные 'ΌΚΗ1-3 и 'ΌΚΌ1-3.
2. 2. Антитело по п.1, содержащее аминокислотную последовательность Η'νΚ:

   ОЬОУОЕЗСРСЬУКРЗЕТЬЗЬТСТУЗСЗЗI8Ν5ΥΡ5ΐί(3ΝΙ Р.ОРРОКСЬЕИ!СЗΡΥΥ6ΕΚ ТУУЫРЗЬКЗЕАТГЗЮТЗКЗОРЗЬКЬЗЗУТААОТАУУУСРКеРТМГЕСУГБбИССгСТЬУТУеЗ (ЗЕО Ю N0:25); и аминокислотную последовательность ЬСУЕ:

   Е1УЬТ05РАТ1.5Ь5Р0ЕКАТЬ5СКА803УкЗ¥ЬАНУ<2|2КРСС>АРКЪЫУОА5ЫКАТО1 РАКРЗ(ЗЗО5еТПРТЬТ135ЬЕРЕОРАУУ¥С00КЗЫИРРТРО0СТКУЕ1К (ЗЕО Ю N0:27).
3. 3. Антитело по п.2, содержащее тяжелую цепь 8Е0 ГО N0: 37.
4. 4. Антитело по п.2, содержащее тяжелую и легкую цепи, где указанная тяжелая цепь содержит 8Е0 ГО N0: 37, указанная легкая цепь содержит аминокислотную последовательность ЬСУЕ

   Е1УЬТОЗРАТЬЗЬБРСЕЕАТЬЗСКАЗОЗУЕЗ¥ЬАМУООКРСОАРЕЬЫУОА5ЦРАТа1

   ΡΑΚΕ3Ο3<350ΤΟΡΤΙιΤΙ33Ι:ΕΡΕΌΡΑνΥΥΟΟ<2Κ3ΝΗΡΡΤΡΟθαΤΚνΕΙΚ (ЗЕО ΙΏ N0:27) и константную область легкой цепи.
5. 5. Антитело по п.2, содержащее две тяжелые и две легкие цепи, где указанные тяжелые цепи содержат 8Е0 ГО N0: 37, указанные легкие цепи содержат аминокислотную последовательность ЬСУЕ:

   ΕΙУЬТОЗРАТЬЗЬЗРСЕКАТЬЗСКАЗОЗУКЗУЬАНУООКРООАРКЬЫУОАЗНКАТО!

   ΡΑΚΡεΟεΟδαΤΟΡΤΕΤίεείιΕΡΕΌΡΑνΥΥΟΟΟΚδΝΝΡΡΤΡαΟΟΤΚνΕΙΚ (ЗЕО Ιϋ N0:27) и две константные области легкой цепи.

   - 47 025169
6. 6. Антитело по любому из пп.1-5, которое специфически связывается с экстрацеллюлярным доменом рецептора ΙΙ ΤΟΡβ человека (ΤΟΡβΚΙΙ) с К_с, равным 10-80 пМ.
7. 7. Антитело по любому из пп.1-5, которое ингибирует ΤΟΡβ-индуцируемое фосфорилирование 8тай2 с ΙΟ₅₀, равным 4-30 нМ.
8. 8. Антитело по любому из пп.1-5, которое ингибирует ΤΟΡβ-индуцируемое фосфорилирование 8тай2 с ΙΟ₅₀, равным 4,5-25,5 нМ.
9. 9. Антитело по любому из пп.1-5, где указанное антитело блокирует связывание ΤΟΡβ1, ΤΟΡβ2 или ΤΟΡβ3 человека с ΤΟΡβΚΙΙ человека с ΙΟ₅₀, равным 0,10-0,54 нМ, как определено ΕΟδΑ.
10. 10. Фармацевтическая композиция для лечения рака, где раком является рак молочной железы, рак поджелудочной железы или рак легких, содержащая антитело по любому из пп.1-9 и фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель или эксципиент.
11. 11. Комбинация для одновременного, раздельного или последовательного применения для лечения рака, где раком является рак молочной железы, рак поджелудочной железы или рак легких, содержащая антитело по любому из пп.1-9 и дополнительное противоопухолевое средство.
12. 12. Применение антитела или фрагмента по любому из пп.1-9 для получения лекарственного средства для лечения рака, где раком является рак молочной железы, рак поджелудочной железы или рак легких.