KR101283856B1

KR101283856B1 - 항-ｔｇｆ-베타 수용체 ⅱ 항체

Info

Publication number: KR101283856B1
Application number: KR1020117010399A
Authority: KR
Inventors: 얀 우
Original assignee: 임클론 엘엘씨
Priority date: 2008-11-07
Filing date: 2009-10-29
Publication date: 2013-07-15
Also published as: TW201026326A; AR073909A1; JP5667067B2; EA025169B1; JP2012508170A; EP2356152A1; US20120177666A1; EA201170659A1; WO2010053814A1; US20100119516A1; CA2742961A1; CN102209727B; NZ591943A; PA8846101A1; JO3096B1; US8147834B2; AU2009311375A1; KR20110067155A; BRPI0921263A2; IL211842A0

Abstract

본 발명은 인간 형질전환 성장 인자 베타 수용체 Ⅱ (TGFβRⅡ)에 대한 항체, 상기 항체를 포함하는 제약 조성물, 및 예를 들면, 암 및 섬유증 치료를 위해 단독으로 또는 조합하여 상기 항체를 사용하는 방법에 관한 것이다.

Description

항-ＴＧＦ-베타 수용체 Ⅱ 항체{ANTI-TGF-BETA RECEPTOR Ⅱ ANTIBODIES}

본 출원은 2008년 11월 7일에 출원한 미국 출원 제61/198,697호 및 2009년 4월 17일에 출원한 동 제61/170,369호에 대해 우선권을 주장한다.
본 발명은 의약 분야, 특히, 인간 형질전환 성장 인자 베타 수용체 Ⅱ (TGFβRⅡ)에 결합하는 항체, 상기 항체를 포함하는 제약 조성물, 및 예를 들면, 암, 섬유증, 및 섬유성 질환 치료를 위해 상기 항체를 사용하는 방법에 대한 분야에 관한 것이다.

TGFβ는 세포 성장 및 분화, 운동성, 세포외 기질 생산, 및 면역 기능을 조절하는 다면 발현성 사이토카인이다. TGFβ는 3가지의 포유동물 이소형, TGFβ-1, TGFβ-2 및 TGFβ-3을 갖는데, 이들 각각은 생체내에서 상이한 기능들을 갖고 있다. 이들 3가지 TGFβ 모두 동일한 수용체 신호전달계를 갖고 있다. TGFβ가 TGFβRⅡ에 결합하는 것은 TGFβ 신호전달 경로의 활성화를 개시하는 데 있어 중요한 단계이며, 이를 통해 Smad2의 인산화가 일어나고, 활성화된 Smad2/Smad4 복합체가 핵으로 전위됨으로써 유전자 발현의 조정이 이루어진다.

신장 질환 및 조직 섬유증을 치료하며, 고친화성 (8.06 x 10^-10 내지 1.91 x 10^-9 M의 K_D)으로 인간 TGFβRⅡ에 결합하는 인간 모노클로날 항체 (mAb)가 JP 2004/121001A에 개시되어 있다. 상기 출원에는 또한 mAb가 TGFβ-유도성의 각질 세포 성장을 억제시킨다 (IC₅₀의 평균값 2.17-3.89, 3.17-4.95, 및 3.21-5.07 ㎍/ml)라는 것이 개시되어 있다. TGFβRⅡ에 대한 완전한 인간 모노클로날 항체를 사용하면 래트의 항-Thy-1 신장염에서 세포외 기질의 침착물을 감소시키는 효과가 있는 것으로 보고되었다 (문헌 [Kasuga, H., et al., Kidney Int'l, Vol. 60 (2001) 1745-1755]).

매우 고도한 친화성으로 인간 TGFβRⅡ의 세포외 도메인에 특이적으로 결합하거나, 인간 TGFβ1, TGFβ2 및 TGFβ3의 인간 TGFβRⅡ에의 결합을 차단하거나, 혈관형성을 저해하거나, 종양 세포 성장을 억제하거나, 암 세포의 이동 및 침윤을 저해하거나, 콜라겐 침착 및 간 기능을 감소시키거나, T 세포의 리간드 유도성 조절을 저해하거나, 세포독성제와 함께 조합하여 종양 성장을 저해하는 고도로 특이성인 고친화성 항-TGFβRⅡ 항체가 현재까지는 개시된 바 없으며, 이에 그러한 항체가 요구되고 있다.

본 발명은 이러한 요구들을 다룬 신규의 단리된 항-TGFβRⅡ mAb를 제공하고자 한다. TGF 베타 RⅡ는 포유동물의 것이며, 바람직하게는 인간의 것이다. 본 발명의 항체는 하기 활성들: 1) 인간 TGFβRⅡ의 세포외 도메인에 대한 고친화성 결합을 나타내거나; 2) TGFβRⅡ 리간드 (TGFβ1, TGFβ2 및 TGFβ3)의 TGFβRⅡ에의 결합을 차단함으로써 TGFβ-유도성 Smad2 인산화를 저해하거나; 3) TGFβRⅡ를 내재화시킴으로써 리간드-수용체 상호작용과는 상관없이 신호전달 하향-조절 기전으로서의 역할을 할 수 있도록 하거나; 4) 리간드-유도성 TGFβRⅡ 신호전달 경로를 저해하거나; 5) TGFβRⅡ-매개성 세포 활성을 저해하거나; 6) 시험관내 및 생체내 종양 성장을 저해하는 활성들 중 하나 이상을 수행할 수 있고; 또한 더욱 바람직하게는 추가로 하기들: 7) TGFβ-유도성 혈관 내피 성장 인자 A (VEGF-A) 분비를 감소시킴으로써 혈관형성을 저해하거나; 8) 암 세포의 이동 및 침윤을 저해하거나; 9) 콜라겐 침착 및 간 기능을 감소시키거나; 10) T 세포의 리간드 유도성 조절을 저해시킴으로써 면역억제성 효과를 갖는 Treg 세포를 형성하거나; 또는 11) 세포독성제와 함께 조합하여 종양 성장을 저해하는 활성들 중 하나 이상을 수행할 수 있다.

TGFβRⅡ에 특이적으로 결합하고, TGFβRⅡ-매개성 활성을 중화시키는 고친화성 모노클로날 항체는 특히 TGFβ 신호전달 매개 질환의 치료를 위한 치료학적인 생물 작용제로서 유용할 것이다.

본 발명의 제1 측면에 따라, 실온 (20-25℃)에서 100 pM 미만의 K_D로 인간 TGFβRⅡ의 세포외 도메인에 특이적으로 결합하는 단리된 항체를 제공한다.

하나의 측면에서, 본 발명의 항체는 ELISA에 의해 측정시, 1.0 nM 미만의 IC₅₀으로 인간 TGFβ1, TGFβ2 또는 TGFβ3의 인간 TGFβRⅡ에의 결합을 차단한다.

또 다른 측면에서, 본 발명의 항체는 30 nM 미만의 IC₅₀으로 TGFβ-유도성 Smad2 인산화를 저해시킨다.

추가의 또 다른 측면에서, 본 발명의 항체는

i) 서열 GGSISNSYF (서열번호: 1)를 갖는 CDRH1, 서열 SFYYGEKTYYNPSLKS (서열번호: 2)를 갖는 CDRH2, 서열 GPTMIRGVIDS (서열번호: 3)를 갖는 CDRH3, 서열 RASQSVRSYLA (서열번호: 10)를 갖는 CDRL1, 서열 DASNRAT (서열번호: 11)를 갖는 CDRL2, 및 서열 QQRSNWPPT (서열번호: 12)를 갖는 CDRL3; 또는

ii) 서열 GGSISSSSY (서열번호: 7)를 갖는 CDRH1, 서열 SFYYSGITYYSPSLKS (서열번호: 8)를 갖는 CDRH2, 서열 GFTMIRGALDY (서열번호: 9)를 갖는 CDRH3, 서열 RASQSVRSFLA (서열번호: 16)를 갖는 CDRL1, 서열 DASNRAT (서열번호: 11)를 갖는 CDRL2, 및 서열 QQRSNWPPT (서열번호: 12)를 갖는 CDRL3을 포함하며, TGFβRⅡ에 특이적으로 결합하는 항체를 포함한다.

삭제

또 다른 측면에서, 본 발명의 항체는

i) HCVR 아미노산 서열:

LCVR 아미노산 서열:

ii) HCVR 아미노산 서열:

삭제

LCVR 아미노산 서열:

를 포함한다.

또 다른 측면에서, 본 발명의 항체는

HCVR 아미노산 서열:

LCVR 아미노산 서열:

을 포함한다.

또 다른 측면에서, 본 발명의 항체는

i) 서열번호: 37의 중쇄 및 서열번호: 4의 경쇄; 또는

ii) 서열번호: 6의 중쇄 및 서열번호: 14의 경쇄를 포함한다.

삭제

또 다른 측면에서, 본 발명의 항체는 서열번호: 37의 2개의 중쇄, 및 서열번호: 4의 2개의 경쇄를 포함한다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 인간 TGFβRⅡ-결합 단편을 포함한다.

본 발명의 항체 중 임의의 것을 그를 필요로 하는 피험체에게 투여할 수 있다는 것이 주시된다. 따라서, 본 발명의 하나의 측면은 본 발명의 항체 또는 단편, 및 제약상 허용되는 담체, 희석제, 또는 부형제를 포함하는 제약 조성물을 제공한다.

삭제

본 발명의 바람직한 측면에서, 항체 또는 그의 기능적 단편은 경쟁 ELISA 분석에서 TGFβRⅡ의 세포외 도메인에의 결합에 대하여 경쟁 항체와 경쟁하며, 여기서 상기 경쟁 항체는 실온 (20-25℃)에서 100 pM 미만의 K_D로 TGFβRⅡ에 결합하는 것이다.

본 발명의 또 다른 바람직한 측면에서, 본 발명의 항체는 ELISA에 의해 측정시, 1.0 nM 미만의 IC₅₀으로 인간 TGFβ1, TGFβ2 또는 TGFβ3의 인간 TGFβRⅡ에의 결합을 차단한다.

본 발명의 mAb가 폐, 간, 및 신장의 섬유증 또는 섬유성 질환을 치료하는 데 사용될 수 있다는 것 또한 주시된다. 하나의 측면에서, 본 치료를 필요로 하는 피험체에게 유효량의 본 발명의 mAb를 투여하는 것을 포함하는, 폐, 간, 및 신장의 섬유증 또는 섬유성 질환을 치료하는 방법을 제공한다.

본 발명의 하나의 측면은 약제로서 사용하기 위한 본 발명의 항체를 제공한다. 본 발명의 하나의 측면은 암 치료에 사용하기 위한 본 발명의 항체를 제공한다. 본 발명의 추가의 측면은 유방암, 폐암 또는 췌장암 치료에 사용하기 위한 항체를 제공한다. 본 발명의 항체는 항암제와 함께 암 치료에 사용될 수 있다. 본 발명의 또 다른 측면은 항체 또는 단편 및 추가의 항암제를 함유하는, 요법에서 동시, 별개, 순차적으로 사용하기 위한 조합 치료용의 제품을 제공한다.

본 발명의 바람직한 측면은

서열 GGSISX₁SX₂X₃ (서열번호: 17) (여기서, X₁은 N 또는 S이고, X₂는 Y 또는 S이며, X₃은 F 또는 Y이다)을 갖는 CDRH1; 서열 SFYYX₁X₂X₃TYYX₄PSLKS (서열번호: 18) (여기서, X₁은 G 또는 S이고, X₂는 E 또는 G이며, X₃은 K 또는 I이고, X₄는 N 또는 S이다)를 갖는 CDRH2; 서열 GX₁TMIRGX₂X₃DX₄ (서열번호: 42) (여기서, X₁은 P 또는 F이고, X₂는 V 또는 A이며, X₃은 I 또는 L이고, X₄는 S 또는 Y이다)를 갖는 CDRH3; 서열 RASQSVRSX₁LA (서열번호: 20) (여기서, X₁은 Y 또는 F이다)를 갖는 CDRL1; 서열 DASNRAT (서열번호: 11)를 갖는 CDRL2; 및 서열 QQRSNWPPT (서열번호:12)를 갖는 CDRL3을 포함하며, hTGFβRⅡ의 세포외 도메인에 특이적으로 결합하는 단리된 항체를 제공한다.

본 발명의 또 다른 측면은 환자에게 유효량의, 본 발명의 항체를 투여하는 것을 포함하는, 환자에서 암을 치료하는 방법을 제공한다. 암은 유방암, 폐암 또는 췌장암일 수 있다. 항체는 유효량의 또 다른 항암제와 함께 동시에, 별개로, 또는 순차적으로 환자에게 투여될 수 있다. 항암제는 시클로포스파미드일 수 있다.

본 발명의 또 다른 측면은 서열 GGSISNSYF (서열번호: 1)를 갖는 CDRH1, 서열 SFYYGEKTYYNPSLKS (서열번호: 2)를 갖는 CDRH2, 서열 GPTMIRGVIDS (서열번호: 3)를 갖는 CDRH3, 서열 RASQSVRSYLA (서열번호: 10)를 갖는 CDRL1, 서열 DASNRAT (서열번호: 11)를 갖는 CDRL2, 및 서열 QQRSNWPPT (서열번호: 12)를 갖는 CDRL3을 포함하거나; 서열 GGSISSSSY (서열번호: 7)를 갖는 CDRH1, 서열 SFYYSGITYYSPSLKS (서열번호: 8)를 갖는 CDRH2, 서열 GFTMIRGALDY (서열번호: 9)를 갖는 CDRH3, 서열 RASQSVRSFLA (서열번호: 16)를 갖는 CDRL1, 서열 DASNRAT (서열번호: 11)를 갖는 CDRL2, 및 서열 QQRSNWPPT (서열번호: 12)를 갖는 CDRL3을 포함하며, 인간 TGFβ 수용체 Ⅱ (TGFβRⅡ)의 세포외 도메인에 특이적으로 결합하는 단리된 항체, 또는 상기 항체의 TGFβRⅡ-결합 단편을 제공한다.

본 발명의 또 다른 측면은

HCVR 아미노산 서열:

LCVR 아미노산 서열:

또는

HCVR 아미노산 서열:

LCVR 아미노산 서열:

를 포함하는, 본 발명의 항체, 또는 상기 항체의 TGFβRⅡ-결합 단편을 포함한다.

본 발명의 또 다른 측면은 서열번호: 37의 중쇄 및 서열번호: 4의 경쇄; 또는 서열번호: 6의 중쇄 및 서열번호: 14의 경쇄를 포함하는, 본 발명의 항체를 포함한다.

"단리된 항체"는 (1) 성분들로 이루어진 혼합물로부터 부분적으로, 실질적으로, 또는 전체적으로 정제되거나; (2) 그의 천연 환경의 성분으로부터 확인되고, 분리 및/또는 회수되거나; (3) 모노클로날이거나; (4) 동일한 종으로부터 유래된 다른 단백질을 함유하지 않거나; (5) 상이한 종으로부터 유래된 세포에 의해 발현되거나; 또는 (6) 자연 상태하에서는 발생되지 않는 항체이다. 그의 천연 환경의의 오염 성분은 항체의 진단학적 또는 치료학적 용도를 방해할 수 있는 물질이며, 이는 효소, 호르몬, 및 다른 단백질성 또는 비단백질성 용질을 포함할 수 있다. 단리된 항체의 예로는 친화성 정제된 항체, 시험관내에서 하이브리도마 또는 다른 세포주에 의해 제조된 항체, 및 트랜스제닉 마우스로부터 유래된 항체를 포함한다.

본원에서 사용되는 바, 용어 "항체"는 이황화 결합에 의해 상호연결되어 있는 2개의 중쇄 (H)와 2개의 경쇄 (L)인 4개의 폴리펩티드 쇄를 포함하는 면역글로불린 분자를 의미한다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 부위 (본원에서 HCVR 또는 VH로 약칭함) 및 중쇄 불변 부위로 구성된다. 중쇄 불변 부위는 3개의 도메인, CH1, CH2 및 CH3을 포함한다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 부위 (본원에서 LCVR 또는 VL로 약칭함) 및 경쇄 불변 부위로 구성된다. 임의의 척추동물 종으로부터 유래된 항체 (면역글로불린)의 경쇄는 불변 도메인의 아미노산 서열에 기초하여, 카파 (κ) 또는 람다 (λ)로 명명되는, 명확히 다른 2가지 유형 중 하나로 지정될 수 있다. 본원에서는 카파 경쇄의 가변 부위를 Vκ로 지칭한다. 본원에서 사용되는 바, VL이라는 표현은 카파형 경쇄 (Vκ)의 가변 부위 및 람다형 경쇄의 가변 부위 둘 모두를 포함하는 것으로 한다. 경쇄 불변 부위는 1개의 도메인, CL로 구성된다. VH 및 VL 부위는 프레임워크 부위 (FR)라 명명되며 더욱더 보존성을 띠는 부위가 산재되어 있는, 상보성 결정 부위 (CDR)로 명명되는 초가변성 부위를 포함한다. 각각의 VH 및 VL은 아미노-말단에서 카르복시-말단으로 하기와 같은 순서로 배열된, 3개의 CDR 및 4개의 FR로 구성된다: FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4.

"CDRH1"은 항체 중쇄에서 첫번째 CDR 부위를 지칭하고, "CDRH2"는 항체 중쇄에서 두번째 CDR 부위를 지칭하며, "CDRH3"은 항체 중쇄에서 세번째 CDR 부위를 지칭한다. "CDRL1"은 항체 경쇄에서 첫번째 CDR 부위를 지칭하고, "CDRL2"는 항체 경쇄에서 두번째 CDR 부위를 지칭하며, "CDRL3"은 항체 경쇄에서 세번째 CDR 부위를 지칭한다.

용어 "항원-결합 단편"은 본래의 항체의 항원-결합부 또는 가변 부위를 포함하는, 본래의 항체의 부분 또는 단편를 지칭한다. 항체 단편의 예로는 전장의 항체보다 작은 것, 예로서, Fab 단편, F(ab')₂ 또는 단일 쇄 가변 단편 (scFv)을 포함한다. 본 발명의 항원-결합 단편으로부터 형성되거나, 부분적으로 형성된 것인 디아바디, 선형 항체, 단일 쇄 항체, 융합 단백질, 재조합 단백질, 및 다가 또는 다중특이성 항체도 유사하게 본 발명에 포함된다.

본원에서 사용되는 바, 용어 "TGF-베타 수용체 Ⅱ" 또는 "TGFβRⅡ"는 TGFβ1, TGFβ2 및 TGFβ3을 포함하나, 이에 한정되지 않는 리간드에 결합함으로써, 그 결과, 세포 내의 신호 전달 경로를 개시하는 것인 세포 표면 수용체를 지칭한다. 인간 TGFβRⅡ는 서열번호: 40의 DNA 서열에 의해 코딩된 트랜스막 단백질이다.

본 발명의 항체는 인간 TGFβRⅡ, 더욱 특히, 인간 TGFβRⅡ의 세포외 도메인에 결합하고, 인간 TGFβ1, TGFβ2 및 TGFβ3의 인간 TGFβRⅡ에의 결합을 차단한다.

본 발명의 항체는 또한 당업계에 공지된 방법에 의한 직접 돌연변이, 친화도 성숙의 방법, 파지 디스플레이, 또는 쇄 셔플링에 의해 결합 특성이 개선된 항체를 포함한다. 본 발명의 항체는 TGF1 및 TGF3으로 지칭되는, 본 발명의 항체로부터의 중쇄 및 경쇄 (전장 또는 그의 일부분)의 임의 조합을 포함한다.

본 발명의 항체는 CDR-그라프팅, 베니어링 또는 리서페이싱, 및 쇄 셔플링 (예로서, 미국 특허 5,565,332에 개시되어 있는 것)을 비롯한, 다양한 기법을 사용하여 본 발명의 추가의 항체를 제조하는 데 주형 또는 모체 항체로서 사용될 수 있다. 본 발명의 인간 항체는 예를 들면, CDR 중 인간 생식계열 면역글로불린 서열에 의해 코딩되지 않는 아미노산 잔기 (예로서, 시험관내 무작위 또는 부위-특이적 돌연변이 유발법에 의해 또는 생체내 체세포 돌연변이에 의해 도입된 돌연변이)를 포함할 수 있다. 인간 항체에서는 적어도 하나의 위치가 아미노산 잔기, 예로서, 인간 생식계열 면역글로불린 서열에 의해서는 코딩되지 않는, 활성을 증진시키는 아미노산 잔기로 치환되어 있을 수 있고, 상기와 같은 치환이 존재할 경우, 본원에서 제공된 서열로부터 유래된 가변 부위 아미노산 서열이 추가로 생성될 수 있다.

하나의 접근법에서, 모체 항체 CDR을, 모체 항체 프레임워크와 높은 서열 동일성을 갖는 인간 프레임워크 내로 그라프팅시킬 수 있다. 새로운 프레임워크의 서열 동일성은 일반적으로 모체 항체 중의 상응하는 프레임워크와 적어도 80%, 적어도 85%, 또는 적어도 90%일 수 있다. 이러한 그라프팅을 통해 결합 친화성은 모체 항체와 비교하였을 때 감소할 수 있다. 그러한 경우, 문헌 [Queen (Queen, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 2869 (1991))]에 공개된 구체적인 기준에 기초하여 프레임워크를 특정 위치에서 모체 프레임워크로 역-돌연변이화시킬 수 있다. 사용될 수 있는 추가의 방법으로는 예를 들면, 문헌 ([Jones et al., Nature, 321 :522 (1986)]; [Riechmann et al., Nature, 332:323-327 (1988)]; 및 [Verhoeyen et al., Science, 239:1534 (1988)])의 것을 포함한다.

천연적으로 발생된 모두 20종 이하의 대체 아미노산이 특정의 치환 부위에 도입될 수 있다. 이어서, 본원에서 정의된 시험관내 선별 방법을 적절히 사용하여 주장하는 교차 반응성을 갖는 Fab 단편에 대하여 이들 추가의 가변 부위 아미노산 서열을 시험관내에서 스크리닝할 수 있다. 이러한 방법으로 본 발명에 따라 인간화된 항체를 제조하는 데 적합한 추가의 Fab 단편을 확인할 수 있다. 프레임워크 내의 아미노산 치환이 본원에 개시된 프레임워크 서열 중 하나 또는 그 각각의 내부 중에 1, 2, 또는 3개의 위치로 한정되는 것이 바람직하다. CDR 내의 아미노산 치환이 하나 또는 각 CDR의 내부 중에 1 내지 3개의 위치로 한정되는 것이 바람직하며, 하나 또는 각 CDR의 내부 중 1 또는 2개의 아미노산 위치에서 치환이 이루어지는 것이 더욱 바람직하다. 중쇄 가변 부위의 CDR 중 1 또는 2개의 아미노산 위치에서 아미노산 치환이 이루어지는 것이 추가로 바람직하다. 모체 항체로서 본원에 기술된 항체를 사용하여, 본 발명에 따른 대체 항체를 제조하기 위해 CDR 및 프레임워크 치환을 조합하는 데 적합한 방법은 문헌 [Wu et al., J. Mol. Biol., 294:151-162]에 제공되어 있다.

용어 "K_D"란 특정 항체-항원 상호작용의 해리 상수를 의미하는 것이다. 이는 공식: k_오프/k_온=K_D에 의해 계산된다. 용어 "k_온"은 단위: M^-1sec^-1로 측정되는, 전향, 또는 복합체 형성 반응의 회합 또는 온 속도 상수, 또는 특정 반응 속도를 의미한다. 용어 "k_오프"는 단위: 1/초로 측정되는, 항체/항원 복합체로부터 항체를 해리시키는, 해리 또는 오프 속도 상수, 또는 특정 반응 속도를 의미한다. 이론으로 제한하고자 하는 것은 아니지만, 본 발명의 항체의 결합 친화성은 대개 보다 높은 k_온보다는 보다 낮은 k_오프와 상관관계에 있고, 개선된 k_오프 및 k_온, 둘 모두의 실시태양이 포함된다. 더욱더 바람직한 측면에서, 본 발명의 항체는 일반적으로는 낮은 k_오프 값을 나타내는, 효능이 높은 항체, 또는 그의 단편이다.

특정 측면에서, 본 발명의 항체는 약 1 pM 내지 약 200 pM, 약 5 pM 내지 약 100 pM 또는 약 10 pM 내지 약 80 pM의 K_D를 갖는다.

본원에서 사용되는 바, 상호교환적으로 사용되는 "결합을 차단한다" 및 "결합을 저해시킨다"라는 용어는 사이토카인이 그의 수용체에 결합하는 것을 차단/저해시킴으로써 사이토카인/수용체 신호 경로의 생물학적 기능을 완전하게 또는 부분적으로 저해 또는 감소시키는 것을 의미한다. TGFβ의 TGFβRⅡ에의 결합을 차단/저해하는 것은 예로서, 수용체 결합, 세포 성장에 대한 저해 효과, 화학주성, 아포프토시스, 세포내 단백질 인산화, 또는 신호 전달과 같은, TGFβ 활성의 시험관내 또는 생체내 지표들 하나 이상을 완전하게 또는 부분적으로 저해 또는 감소시키는 것을 측정함으로써 평가할 수 있다. TGFβ의 TGFβRⅡ에의 결합을 차단할 수 있는 능력은 본원에 기술된 바와 같이 ELISA에 의해 측정할 수 있다. TGFβ 활성을 저해시킬 수 있는 능력은 세포, 예를 들면, 본원에 기술된 바와 같은 인간 MDA-MB-231 세포에서 Smad2 인산화의 저해를 측정함으로써 평가할 수 있다.

본 발명의 항체는 약 0.05 nM 내지 약 1.0 nM, 약 0.08 nM 내지 약 0.75 nM, 또는 약 0.10 nM 내지 약 0.60 nM의 IC₅₀으로 인간 TGFβ1, TGFβ2 또는 TGFβ3의 인간 TGFβRⅡ에의 결합을 차단한다.

본 발명의 항체는 시험관내 차단 분석법, 예로서, 본원에 기술된 바와 같은 시험관내 MDA-MB-231 세포 차단 분석법에서 약 2.0 nM 내지 약 30 nM, 약 3.0 nM 내지 약 15.0 nM 또는 약 4.0 nM 내지 약 7.5 nM 보다 작거나 동일한 값의 IC₅₀으로 TGFβ-유도성 Smad2 인산화를 저해시킨다.

항체는 천연 종에서 발견되는 것과 상이하거나, 그로부터 변경된 당화 패턴을 가질 수 있다. 당업계에 공지되어 있는 바와 같이, 당화 패턴은 항체의 서열 (예로서, 특정 당화 아미노산 잔기의 존재 또는 부재), 또는 숙주 세포, 또는 단백질이 생산되는 유기체에 따라 달라질 수 있다. 본 발명의 항체는 본원에 개시된 항체 뿐만 아니라, 그의 당화 변이체도 포함한다는 것에 주시한다.

본 발명은 또한 본원에 기술된 폴리뉴클레오티드 중 임의의 것을 포함하는 발현 벡터를 포함한다. 예시적인 벡터로는 플라스미드, 파지미드, 코스미드, 바이러스 및 파지 핵산, 또는 원핵 또는 진핵 숙주, 예를 들면, 세포, 예로서, 포유동물 세포에서 복제가능한 다른 핵산 분자를 포함한다. 벡터는, 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 발현 제어 요소에 작동가능하게 연결되어 있는 것인 발현 벡터일 수 있다. 전형적인 발현 벡터는 본 발명의 핵산 분자의 발현 조절에 유용한 전사 및 번역 종결 인자, 개시 서열, 및 프로모터를 포함한다. 벡터는 또한 독립적인 종결 인자 서열, 진핵 및 원핵 생물, 둘 모두에서 벡터의 복제를 허용하는 서열, 즉, 셔틀 벡터, 및 진핵 및 원핵 생물계, 둘 모두에 대한 선별 마커를 포함하는 유전자 발현 카세트를 포함할 수 있다. 벡터는 전형적으로 항생제, 예로서, 암피실린 또는 네오마이신에 대한 내성을 부여하는 것과 같은, 형질전환된 숙주의 선별을 위해 표현형 형질을 제공하는 마커를 포함한다.

적합한 프로모터로는 구성적 프로모터 및 유도성 프로모터를 포함한다. 대표적인 프로모터로는 인간 사이토메갈로바이러스로부터 유래된 프로모터, 메탈로티오네인 프로모터, SV-40 조기 프로모터, SV-40 후기 프로모터, 뮤린 유방 종양 바이러스 프로모터, 라우스 육종 바이러스 프로모터 및 폴리헤드린 프로모터를 포함한다.

본 발명은 또한 본 발명의 핵산 분자 또는 발현 벡터를 포함하는 재조합 세포를 포함한다. "재조합 세포"란 비-인간 다세포 유기체 또는 "숙주 세포"를 의미하는 것으로서, 이는 본 발명의 핵산 분자 또는 벡터가 도입되어 있는 것인 세포 또는 세포 군집을 지칭하는 것이다. 본 발명의 숙주 세포는 진핵 세포 또는 세포주, 예로서, 식물, 동물, 척추동물, 포유동물, 설치류, 마우스, 영장류, 또는 인간 세포, 또는 세포주일 수 있다.

하나의 측면에서, 본 발명의 숙주는 원핵성 또는 진핵성 숙주일 수 있다. 적합한 원핵성 숙주로는 예를 들면, 에스케리키아 콜리(Escherichia coli), 예로서, E. 콜리(E. coli) SG-936, E. 콜리 HB 101 , E. 콜리 W3110, E. 콜리 X1776, E. 콜리 X2282, E. 콜리 DHI, 및 E. 콜리 MRC1, 슈도모나스(Pseudomonas), 바실러스(Bacillus), 예로서, 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 및 스트렙토미세스(Streptomyces)를 포함한다. 적합한 진핵 세포로는 효모 및 다른 진균, 곤충 세포, 식물 세포, 인간 세포, 및 포유동물 세포를 비롯한 동물 세포, 예로서, 하이브리도마 세포주, COS 세포, NS0 세포 및 CHO 세포를 포함한다.

본 발명은 본 발명의 항체를 코딩하는 하나 이상의 핵산 서열을 발현하는 재조합 세포를 배양하고, 배양 배지로부터 상기 항체를 회수함으로써 항체를 생산하는 방법을 포함한다. 그렇게 발현된 항체는 전형적으로 발현 후에 정제시키거나, 또는 단리시킨다. 항체는 당업자에게 공지되어 있는 다양한 방법으로 단리 또는 정제시킬 수 있다. 표준 정제 방법으로는 크로마토그래피 기법, 전기영동 기법, 면역학적 기법, 침전 기법, 투석 기법, 여과 기법, 농축 기법, 및 크로마토포커싱 기법을 포함한다. 당업계에 주지되어 있는 바와 같이, 예를 들면, 세균 단백질 A, G, 및 L과 같은 다양한 천연 단백질이 항체에 결합할 수 있고, 이러한 단백질은 정제를 위해 본 발명에서 사용될 수 있다는 것을 알 수 있다. 정제는 대개 특정의 융합 파트너에 의해 이루어질 수 있다. 예를 들면, GST 융합이 사용될 경우에는 글루타티온 수지를, His-Tag가 사용될 경우에는 Ni⁺² 친화성 크로마토그래피를, 또는 His-Tag가 사용될 경우에는 고정화된 항-Flag 항체를 사용함으로써 단백질을 정제할 수 있다. 항체를 배양 배지로부터 분리시킴으로써 항체를 정제할 수 있다. 1 초과의 쇄를 포함하는 항체는 동일한 숙주에서 각각의 쇄를 함께 발현시킴으로써; 또는 배양 배지로부터 회수하기 이전 또는 이후에 조립되는 별개의 쇄로서 발현시킴으로써 생산할 수 있다.

항체는 시험관내 분석법, 시험관내 세포 기반 분석법, 생체내 분석법, 및 선별 기술을 포함하나, 이에 한정되지 않는 다양한 방법을 사용함으로써 스크리닝될 수 있다. 스크리닝될 수 있는 항체의 특성으로는 생물학적 활성, 안정성, 가용성, 및 표적에 대한 결합 친화성을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 다수의 특성들이 동시에 또는 개별적으로 스크리닝될 수 있다. 분석법의 요건에 따라서 단백질은 정제될 수 있거나, 또는 정제되지 않을 수 있다. 하나의 측면에서, 스크린은 항체에 결합한다고 알려져 있거나 판단되는 단백질 또는 비단백질 분자에의 항체의 결합에 대한 정질적 또는 정량적 결합 분석이다. 하나의 측면에서, 스크린은 표적 항원에의 결합을 측정하는 결합 분석이다. 자동화 및 고효율 스크리닝 기술이 스크리닝 방법에서 사용될 수 있다. 스크리닝은 융합 단백질 또는 표지된-단백질의 용도를 사용할 수 있다. 결합 분석법은 ELISA를 포함하나, 이에 한정되지 않는, 당업계에 공지되어 있는 다양한 방법을 사용함으로써 수행될 수 있다. 본원에서 사용되는 바, "결합에 대하여 경쟁한다"라는 것은 예로서, 경쟁 ELISA와 같이 당업계에서 이용가능한 기법에 의해 측정시, 또는 비아코어(BIAcore)를 사용하여 얻은 Kd 측정에 의해, 항체가 결합 또는 신호전달을 적어도 약 20%, 30%, 50%, 70% 또는 90% 만큼 감소시키되, 단, 완전하게 결합을 제거하고자 하는 것은 아닌 상황을 의미하는 것이다.

결합 상호작용을 측정하는 것에 대해 당업계에 주지되어 있는 하나의 기기로는 비아코어™ 2000(BIAcore™ 2000) 장치가 있는데, 이는 파마시아 바이오센서(Pharmacia Biosensor) (스웨덴 웁살라 소재)를 통해 상업적으로 이용할 수 있다.

본 발명은 본원에 기술되어 있는 본 발명의 항체 및 제약상 허용되는 담체, 희석제, 또는 부형제를 포함하는 제약 조성물을 포함한다. 제약 조성물은 임의로 다른 치료학적 성분들을 포함할 수 있다. 본원에서 사용되는 바, "제약상 허용되는 담체"로는 생리학적으로 화합성인 용매, 분산 매질, 코팅제, 항균제 및 항진균제, 등장화제, 및 흡수 지연제 등을 포함한다.

제약상 허용되는 담체의 예로는 물, 염수, 포스페이트 완충처리된 염수, 덱스트로스, 글리세롤, 에탄올 등과, 그의 조합물을 포함한다. 제약상 허용되는 담체는 소량의 보조제 물질, 예를 들어, 습윤제 또는 유화제, 방부제 또는 완충제 (이들은 항체의 저장 수명 또는 유효성을 향상시켜준다) 뿐만 아니라, 등장화제, 예로서, 당, 폴리알콜, 예로서, 만니톨 및 소르비톨, 및 염화나트륨을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 제약 조성물은 예를 들면, 액체, 반-고체, 및 고체 제형, 예로서, 액상 액제 (예로서, 주사용 액제 및 주입용 액제), 분산제 또는 현탁제, 분제, 리포좀 및 좌제를 비롯한 다양한 방식으로 제형화될 수 있다. 조성물은 주사용 액제 및 주입용 액제 형태인 것인 바람직하다.

바람직한 투여 방식은 비경구 (예로서, 정맥내, 피하, 복강내, 근육내) 방식이다. 정맥내 주입 또는 주사, 근육내 주사 및 피하 주사가 특히 바람직한 방식이다. 예로서, 일반적으로 당업자에게 공지되어 있는 제법 기술에 관한 요약을 제공하는 문헌 [Remington, The Science and Practice of Pharmacy, 19^th Edition, Gennaro, Ed., Mack Publishing Co., Easton, PA 1995]에서와 같은 종래 기법에 따라 상기 조성물이 디자인된다.

본원에 기술되어 있는 바와 같은 질환 또는 질병을 치료하기 위한 본 발명의 조성물의 유효량은 투여 수단, 표적 부위, 피험체의 생리학적 상태, 피험체가 인간인지 또는 동물인지의 여부, 투여받고 있는 다른 약제, 및 치료가 예방 목적인지 또는 치료 목적인지의 여부를 비롯한, 다수의 상이한 요소들에 따라 달라질 수 있다. 안전성 및 효능을 최적화하기 위해서 당업자에게 공지되어 있는 통상의 방법을 사용하여 치료 투여량은 적정될 수 있다.

"치료하다," "치료하는," 및 "치료"라는 용어는 치료학적인 치료를 언급하는 것으로서, 그 목적은 질환 또는 질병과 관련된 원치않는 생리학적인 변화를 저속화 (감소)시키는 것이다. 유익하거나, 또는 원하는 임상적인 결과로는 증상의 완화, 질환 또는 질병 정도의 경감, 질환 또는 질병의 안정화 (즉, 질환 또는 질병이 악화되지 않는 경우), 질환 또는 질병 진행의 지연 또는 저속화, 및 검출가능 여부와는 상관없이 질환 또는 질병의 (부분적인 또는 전체적인) 완화를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. "치료"는 또한 치료를 받지 않았을 때 예상되는 생존 기간과 비교하였을 때 생존 기간을 연장시키는 것을 의미할 수도 있다. 그러한 치료를 필요로 하는 대상으로는 이미 질환 또는 질병에 걸린 대상 뿐만 아니라, 질환 또는 질병에 걸릴 가능성이 있는 대상도 포함한다.

본 발명의 제약 조성물은 "치료 유효량"의 본 발명의 항-TGFβRⅡ 항체를 포함할 수 있다. "치료 유효량"이란 원하는 치료학적 결과를 달성하는 데 필요한 기간 동안 및 투여량에서 유효성을 발휘하는 양을 의미한다. 본 항체의 치료 유효량은 예로서, 개체의 질환 상태, 연령, 성별, 체중, 및 개체에서 원하는 반응을 유도할 수 있는 항체 또는 항체 부분의 능력과 같은 요소에 따라 달라질 수 있다. 치료 유효량이란 또한 치료학적으로 유익한 효과가 항체 또는 항체 부분의 임의의 독성 또는 유해한 효과를 능가하는 양이다.

최적의 원하는 반응을 제공하기 위해 투여 요법을 조정할 수 있다. 예를 들면, 단일 볼루스를 투여할 수 있거나, 수개의 분할된 투여량을 시간이 경과함에 따라 투여할 수 있거나, 또는 치료학적 상태의 요건에 의해 지시되는 바와 같이 투여량을 비례적으로 감소시키거나 증가시킬 수 있다. 투여의 용이함 및 제형의 균일성을 위해 비경구용 조성물을 단위 투여 제형으로 제조하는 것이 특히 이롭다. 단위 투여 제형이란 필요한 제약학적 담체와 함께, 원하는 치료학적 효과를 발휘할 수 있도록 계산된 소정량의 활성 화합물을 함유하는 1회분의 것을 의미한다. 본 발명의 단위 투여 제형에 대한 설명은 (a) 활성 화합물의 독특한 특징과 달성하고자 하는 특별한 치료학적 또는 예방학적 효과, 및 (b) 개체의 감작성 치료를 위한 것으로서 상기 활성 화합물을 화합하는 분야에서 고유한 것인 제한에 따라 조정되고, 직접적으로는 그에 의존하여 달라질 수 있다.

본 발명의 항체의 치료 유효량에 대한 예시적인 비제한적 범위는 0.1-50 mg/kg이다. 또 다른 측면에서, 항체의 유효량은 3-35 mg/kg이다. 또 다른 측면에서, 유효량은 10-25 mg/kg이다. 또 다른 측면에서, 유효량은 5-20 mg/kg이다. 또 다른 측면에서, 유효량은 3-15 mg/kg이다. 또 다른 측면에서, 유효량은 2-10 mg/kg이다. 또 다른 측면에서, 유효량은 5-10 mg/kg이다. 또 다른 측면에서, 항체의 유효량은 1-10 mg/kg이다. 투여량 값은 완화시키고자 하는 상태의 유형 및 중증도에 따라 달라질 수 있다는 것에 주의하여야 한다. 임의의 특정 피험체의 경우, 특이적인 투여 요법은 개인의 필요와, 본 조성물을 투여하고, 그러한 투여를 감독하는 사람의 전문적인 판단에 따라 시간 경과에 따라서 조정되어야 하며, 본원에 기술되어 있는 투여량 범위는 단지 예시적인 것이며, 청구하는 조성물의 범주 또는 실시를 제공하고자 하는 것은 아님을 추가로 이해되어야 한다.

본 발명의 항체는 암 치료에 사용될 수 있다. 암은 기원이 되는 조직과 종양 진행 정도에 의해 분류되는 큰 질환군으로서 간주된다. 암은 또한 원발성 종양 및 전이성 종양 뿐만 아니라, 난치성 또는 재발성 종양으로 분류될 수 있다. 난치성 종양이란 화학치료제 단독, 항체 단독, 방사선 단독, 또는 그의 조합을 사용한 치료에 대하여 반응하지 못하거나, 그에 내성을 띠는 종양이다. 재발성 종양은 상기 제제를 사용하여 이루어지는 치료에 의해 저해된 것처럼 보이지만, 치료를 중단한 후 5년 이하, 때로는 10년 이하, 또는 그 이상의 기간이 경과한 후 재발하는 종양이다.

치료될 수 있는 암으로는 혈관이 분포되지 않는 종양, 또는 아직은 실질적으로 혈관이 분포되지 않은 것인 종양 뿐만 아니라, 혈관이 분포된 종양을 포함한다. 암은 비-고형 종양 또는 고형으로 구성될 수 있다.

본 발명의 항-TGFβRⅡ 항체는 또한 포유동물이 쉽게 질병에 걸리게 하는 병적 상태를 비롯한, 만성 및 급성 질병 또는 질환을 포함하는 TGFβRⅡ와 관련된 질병, 질환, 또는 상태를 치료하는 데 사용될 수 있다. 본원에서 치료하고자 하는 질병으로는 동맥 손상으로 유발된 섬유증, 감염, 류마티스 관절염, 당뇨병 또는 당뇨 증상, 또는 악성 암, 세포외 기질 축적을 특징으로 하는 질환, TGFβRⅡ 신호전달에 의해 유발되는 질환, TGFβRⅡ 매개성 활성에 기인하여 면역계의 억제에 의해 유발되는 상태, 중증 손상, 화상, 및 예로서, 바이러스 또는 세균 감염과 같은 질병으로부터 일어난 급성 면역 결핍증, 및 TGFβRⅡ-매개성 활성에 기인한 다중기관 전신성 질병을 포함한다.

TGFβ는 조혈 줄기 세포의 자가 재생, 증식 및 분화에서 중요한 역할을 한다. 본 발명의 항체는 줄기 세포의 강화 및 재생, 및 심근 경색 후, 신경계 질병 및 다양한 유형의 조직 재생에서 줄기 세포 기반의 치료제를 촉진시키는 데 사용될 수 있다.

본 발명의 항체는 단독으로, 또는 화학요법제, 방사선, 다른 TGFβRⅡ 길항제, TGFβ 길항제, 항-혈관형성제, 다른 표적에 대한 항체, 및 소형 분자를 비롯한, 항-인간 TGFβRⅡ 항체 이외의 항-신생물제와 함께 조합하여 투여될 수 있다. 항-TGFβRⅡ 항체는 특히 항-VEGF-A 내성 종양을 치료하는 데 유용하다. 본 항체를 다른 항체 및/또는 치료법과 함께 투여하는 것은 동시에 또는 별개로 동일한 또는 상이한 경로를 통해서 동일한 또는 다른 시점에 이루어질 수 있다.

본원에 기술된 치료 방법은 영장류, 예로서, 원숭이 및 인간, 말, 소, 고양이, 개, 토끼, 및 설치류, 예로서, 래트 및 마우스를 비롯한 임의의 적합한 포유동물을 치료하는 데 사용될 수 있다.

하기 실시예는 단지 예시적인 목적으로 제공되는 것이며, 어느 방식으로든 본 발명의 범주를 제한하고자 하는 것은 아니다.

실시예

재료 및 세포주

인간 TGFβ1, TGFβ2 및 TGFβ3은 재조합적으로 생산하여 정제할 수 있거나, 예를 들면, R&D 시스템즈(R&D Systems)로부터 구입할 수 있다. 당업자에게 공지된 방법에 따라, 재조합 TGFβRⅡ Fc 융합 단백질 (TGFβRⅡ-Fc) 및 가용성 재조합 TGFβRⅡ 알칼리성 포스파타제 (TGFβRⅡ-AP) 단백질을 안정적으로 형질감염된 세포에서 발현시키고, 세포 상등액으로부터 정제시킬 수 있다 (문헌 [Tessler, J. Biol. Chem ., 269:12456-12461 (1994)]).

인간 암 세포주 BXPC-3, PANC-1, MDA-MB-231 및 마우스 종양 세포주 EMT6, 4T1, CT26, B16-F10 및 골수종 세포주 P3-X63-Ag8.653을 아메리칸 타입 티슈 컬쳐 콜렉션(American Type Tissue Culture Collection) (버지니아주 매너서스 소재)으로부터 입수할 수 있다. MDA-MB-231 루시퍼라제 형질감염체 세포주는 써니브룩 헬쓰 사이언시즈 센터(Sunnybrook Health Sciences Centre)로부터 입수할 수 있다. 세포는 10% 우태아 혈청 (FCS (유타주 로건 소재의 하이클론(Hyclone))을 함유하는 RPMI 1640 또는 IMDM 배지 (메릴랜드주 로크빌 소재의 인비트로겐/라이프 테크놀러지스, 인크(Invitrogen/Life Technologies, Inc.)) 중에서 유지시킬 수 있다. 세포 모두 습윤화된 5% CO₂ 대기 중 37℃에서 유지시킬 수 있다.

항- TGF βRⅡ mAb 생성

인간 면역글로불린 감마 중쇄 및 카파 경쇄를 생산하는 인간 면역글로불린 트랜스제닉 마우스 (캘리포니아주 산호세 소재의 메다렉스(Medarex)), 또는 루이스 래트 (메사추세츠주 윌밍턴 소재의 찰스 리버 래버러토리스(Charles River Laboratories))를 사용하여 본질적으로는 표준 하이브리도마 기술 (문헌 [Harlow & Lane, ed., Antibodies : A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, pages 211-213 (1998)])에 의해 항-TGFβRⅡ mAb를 생성할 수 있다. 간략하면, 완전 프로인트 애주번트로 유화된 재조합 인간 또는 마우스 TGFβRⅡ-Fc 단백질을 피하 (s.c.)로 투여하여 마우스 또는 래트를 면역화시켰다. 동물에게 불완전 프로인트 애주번트 중 동일한 TGFβRⅡ-Fc 단백질을 복강내로 (i.p.) 3회에 걸쳐 추가투여하였다. 최종적으로 동물에게 포스페이트 완충액 (PBS) 중 50 마이크로그램 (㎍)의 TGFβRⅡ-Fc 단백질을 i.p.로 추가투여하기 전 1개월 동안 동물에게 휴지기를 주었다. 면역화된 마우스로부터 비장세포를 수거하고, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG, MW: 1450 KD)을 사용하여 P3-X63-Ag8.653 형질세포종 세포와 융합시켰다. 융합시킨 후, 10% 우태앙 혈청 (FBS)으로 보충된 HAT (하이포크산틴, 아미노프테린, 티미딘) 배지 중에 재현탁시키고, 하이브리도마 세포를 확립하기 위해 웰당 200 마이크로리터의 밀도로 96 웰 플레이트에 분포시켰다.

융합 후 10 내지 12일째, ELISA 기반 결합 및 차단 분석법으로 항체 생산에 대하여, 및 TGFβRⅡ 단백질과의 배양 상등액의 특이적인 결합 특성에 대하여 하이브리도마를 스크리닝하였다. 구체적으로, 하기 방법에 따라 염소 항-인간 카파 경쇄 또는 항-마우스 IgG 호스 래디시 퍼옥시다아제 (HRP) 접합된 항체를 사용한 TGFβRⅡ-결합 항체의 검출에 의해 항-TGFβRⅡ mAb를 생산하는 하이브리도마를 먼저 확인하였다. 인간 TGFβRⅡ-Fc 또는 마우스 TGFβRⅡ-Fc를 4℃에서 밤새도록 96 마이크로타이터 플레이트 상에 100 ng/웰로 코팅하였다. 코팅된 플레이트를 실온에서 2시간 동안 차단 완충액 (5% 분유를 함유하는 PBS 0.05% 트윈(TWEEN)® 20)으로 차단시켰다. 하이브리도마 상등액 또는 정제된 항체를 2% 소 혈청 알부민 (BSA) 및 0.05% 트윈® 20 (ELISA 완충액)을 함유하는 PBS 중에서 희석하고, 30분 동안 TGFβRⅡ로 코팅된 96 웰 마이크로타이터 플레이트 중에서 인큐베이션시켰다. 플레이트를 ELISA 완충액으로 세척하고, 30분 동안 염소 항-인간 카파 경쇄 또는 항-마우스 IgG-HRP 접합체와 함께 인큐베이션시켰다. 제조사의 설명서에 따라 색상이 발색될 수 있도록 하기 위해 TMB (3,3', 5,5'-테트라-메틸벤지딘) 기질을 사용하였다. 항체의 결합 활성을 정량화하기 위해 450 나노미터 (nm)에서의 흡광도를 판독하였다. 하이브리도마를 생산하는 중화 항-TGFβRⅡ mAb를 확인하기 위해 하기 방법에 따라 ELISA 기반 차단 분석법을 수행하였다. TGFβ1, TGFβ2 또는 TGFβ3을 96 웰 플레이트 상에 웰당 200 ng으로 코팅한 후, 웰을 차단 완충액으로 차단시켰다. 1시간 동안 TGFβ로 코팅된 96 웰 마이크로타이터 플레이트 중에서 TGFβRⅡ-AP를 함유하는 ELISA 완충액과 함께 하이브리도마 상등액을 인큐베이션시켰다. 세척 후, 제조사의 설명서에 따라 색상이 발색될 수 있도록 하기 위해 AP에 대한 p-니트로페닐 포스페이트 (PNPP) 기질을 웰에 첨가하였다. TGFβRⅡ의 TGFβ1, TGFβ2 및 TGFβ3에의 결합에 대하여 정량화하기 위해 405 nm에서의 흡광도를 판독하였다. 마이크로타이터 플레이트 판독기 (캘리포니아주 서니베일 소재의 몰레큘라 디바이시즈 코포레이션(Molecular Devices Corp.)) 상에서 광학 밀도 (OD) 값을 판독하였다.

모노클로날 하이브리도마 세포주를 확립시키기 위해 제한 희석 배양에 의해 3회에 걸쳐 양성 하이브리도마를 서브클로닝시켰다.

표 1은 mAb TGF1 및 TGF3의 경쇄 및 중쇄 CDR의 아미노산 서열을 보여준다.

mAb TGF1 및 TGF3에 대한 HCVR, LCVR, 중쇄 (HC), 및 경쇄 (LC)의 아미노산 서열 및 상기 아미노산을 코딩하는 DNA 서열에 대한 서열번호를 하기 표 2에서 제공한다.

인간 IgG1 항-인간 TGF β 수용체 Ⅱ 항체의 공학처리 및 발현

발현 벡터로 클로닝하기 위해 항-TGFβRⅡ mAb의 중쇄 및 경쇄 가변 부위를 코딩하는 DNA 서열을 PCR에 의해 증폭시킬 수 있다. 중쇄 가변 부위를 프레임 내에서 벡터 pEE6.1 (영국 버크셔 슬라우 소재의 론자 바이올로직스 PLC(Lonza Biologics PLC)) 중 인간 면역글로불린 중쇄 감마 1 불변 부위에 융합시킬 수 있다. 완전한 인간 경쇄 cDNA를 벡터 pEE12.1 (영국 버크셔 슬라우 소재의 론자 바이올로직스 PLC) 내로 직접 클로닝시킬 수 있다. 전기천공에 의해 공학처리된 면역글로불린 발현 벡터를 NS0 골수종 세포에 안정하게 형질감염시킬 수 있고, 글루타민 신테타제 선별 배지 중에서 선별할 수 있다. 항-인간 TGFβRⅡ 특이 결합 ELISA에 의해 항체 발현에 대하여 안정한 클론을 스크리닝할 수 있다. 스피너 플라스크 또는 생물 반응기 중에서 항체를 생산하기 위해 무혈청 배지 배양물 내로 양성 클론을 배양할 수 있다. 단백질 A 친화성 크로마토그래피 (포로스 A(Poros A), 캘리포니아주 포스터 시티 소재의 퍼셉티브 바이오시스템즈 인크.(PerSeptive Biosystems Inc.))에 의해 전장의 IgG1 항체를 정제하고, 중성 완충처리된 염수액으로 용리시킬 수 있다.

항-인간 TGFβRⅡ mAb TGF1 및 TGF3의 중쇄 및 경쇄 가변 부위를 코딩하는 cDNA를 코딩하고, 프레임 내에서 GS (글루타민 신테타제) 발현 벡터 중 인간 면역글로불린 중쇄 감마 1 불변 부위에 융합시킬 수 있다. 공학처리된 면역글로불린 발현 벡터를 CHO 세포에 안정하게 형질감염시킬 수 있다. 인간 TGFβRⅡ에 특이적으로 결합하는 항체의 발현에 대하여 안정한 클론을 확인할 수 있다. 생물 반응기 중에서 항체를 생산하기 위해 무혈청 배지 배양물 내로 양성 클론을 확장시킬 수 있다. 단백질 A 친화성 크로마토그래피에 의해 전장의 IgG1 항체를 정제하고, 중성 완충처리된 염수액으로 용리시킬 수 있다.

항- TGF βRⅡ mAb 는 TGF βRⅡ에 결합하고, TGF βRⅡ의 그의 리간드에의 결합을 차단한다.

상기 "항-TGFβRⅡ mAb의 생성"에 기재되어 있는 바와 같이 ELISA로 정제된 항-TGFβRⅡ mAb의 결합 및 차단 활성을 측정하였다. 그래프패드 프리즘® 소프트웨어 3.03(GraphPad Prism® software 3.03) (캘리포니아주 샌디에고 소재의 그래프패드 소프트웨어 인크.(GraphPad Software Inc.))을 사용하여 항체의 ED₅₀ 및 IC₅₀을 분석하였다. ELISA 기반 결합 분석법에서 항-인간 TGFβRⅡ mAb TGF1 및 TGF3은 각각 별개로 0.031-0.059 nM의 ED₅₀으로 인간 TGFβRⅡ에의 결합 활성을 나타낸 반면, 일반 인간 IgG는 수용체에의 결합 활성을 나타내지 않았다. 정제된 mAb TGF1 및 TGF3은 각각 별개로 0.10-0.54 nM의 IC₅₀으로 인간 TGFβ1, TGFβ2 또는 TGFβ3의 인간 TGFβRⅡ에의 결합을 효과적으로 차단시켰다.

항-인간 TGFβRⅡ 항체의 결합 및 차단 특징은 표 3에 요약되어 있다.

항-마우스 TGFβRⅡ mAb MT1의 마우스 TGFβRⅡ에의 결합 활성은 0.054 nM의 ED₅₀을 가졌고, 마우스 TGFβRⅡ의 마우스 TGFβ1, TGFβ2 또는 TGFβ3에의 결합에 대한 mAb MT1의 차단 활성은 0.12-0.54 nM의 IC₅₀을 가졌다.

mAb MT1의 결합 및 차단 특징은 표 4에 요약되어 있다.

항- TGF βRⅡ mAb 의 결합 친화성.

실온 (20-25℃)에서 비아코어™ 2000 (뉴저지주 피츠카타웨이 소재의 파마시아(Pharmacia))을 사용하여 표면 플라즈몬 공명 기술에 의해 항-TGFβRⅡ mAb의 결합 친화도를 측정하였다. 각각 마우스 또는 인간 Fc 또는 중쇄 불변 부위와 연결된 마우스 TGFβRⅡ의 재조합 세포외 도메인 (서열번호: 41), 또는 인간 TGFβRⅡ의 세포외 도메인 (서열번호: 40에 의해 코딩됨)의 융합 단백질을 5 내지 100 nM의 농도로 센서 표면상에 고정화시킴으로써 mAbs의 동역학적 성질에 대한 분석을 수행하였다. 항-인간 TGFβRⅡ mAb TGF1 및 TGF3은 각각 11, 78, 19 pM의 K_D 값으로 고친화성을 나타내었다. 항-뮤린 TGFβRⅡ mAb MT1은 33 pM의 K_D 값으로 고친화성을 나타내었다.

mAb의 동역학적 성질은 표 5에 요약되어 있다.

항-인간 TGF βRⅡ mAb 의 종 특이성

ELISA에 의해 항체의 인간 TGFβRⅡ 또는 마우스 TGFβRⅡ에 대한 반응성을 측정함으로써 항-인간 TGFβRⅡ mAb의 특이성을 측정하였다. 항-인간 TGFβRⅡ mAb TGF1은 마우스 TGFβRⅡ와의 교차 반응성을 나타내지 않지만, mAb TGF3은 마우스 TGFβRⅡ와 중간 정도의 또는 최소한의 교차 반응성을 나타내었다. 그러나, mAb TGF3은 인간 TGFβ1의 마우스 TGFβRⅡ에의 결합을 차단하지 않았다.

항- TGF βRⅡ mAb 의, TGF βRⅡ를 발현하는 세포 상의 천연 TGF βRⅡ 에의 결합

293-인간 TGFβRⅡ 형질감염체 세포 및 인간 암종 세포를 사용하여 염색 분석법에 의해 항-인간 TGFβRⅡ mAb TGF1 및 플루오레세인 이소티오시아네이트 (FITC)-표지된 염소 항-인간 IgG 항체의 결합 활성을 측정할 수 있다. 구체적으로, 분취량의 형질감염체 세포, 암종 세포, 지라 세포, 또는 림프절 세포를 서브컨플루언트 배양물로부터 수거하고, 얼음 상에서 1시간 동안 1% BSA를 포함하는 PBS (염색 완충액) 중 원하는 분자에 대한 플루오레세인-표지된 또는 비표지된 1차 항체와 함께 인큐베이션시켰다. 매치되는 IgG 이소타입을 음성 대조군으로서 사용하였다. 염색 완충액을 사용하여 세포를 2회에 걸쳐 세척하고, 얼음 상에서 30분 동안 완충액 중 1차 항체에 대한 FITC, 피코에리트린 (PE) 또는 알삭스 레드(Alxas Red) 표지된 종-특이 2차 항체 (캘리포니아주 카마릴로 소재의 바이오소스 인터내셔날(BioSource International)와 함께 인큐베이션시켰다. 상기와 같이 세포를 세척하고, 유세포 분석기 상에서 분석하였다. 전방 및 측면 광 산란에 기초하여 분석으로부터 사멸 세포 및 파편을 제거하였다. 양성 군집의 비율(%)을 곱하여 평균 로그 형광값으로서 평균 형광 강도 유니트 (MFIU)를 계산하였다. 평균 형광 강도비 (MFIR)를 계산하여 세포주 중 TGFβRⅡ의 상대적인 발현 수준을 정량하였다. MFIR은 TGFβRⅡ 특이 mAb로 염색된 세포의 평균 형광 강도 (MFI)를 이소타입 대조군 항체로 염색된 세포의 MFI로 나눈 값이다.

항-인간 TGFβRⅡ mAb TGF1은 293-인간 TGFβRⅡ 형질감염체 세포 및 MDA-MB-231 인간 유방 암종 세포와 각각 46 및 209의 MFIR로 결합 반응성을 나타낸 반면, 일반 인간 IgG는 어떤 세포와도 반응성을 나타내지 않았다. 본 결과는 mAb TGF1이 세포 표면 상에서 발현된 천연 인간 TGFβRⅡ와 특이적인 반응성을 갖는다는 것을 시사한다.

TGF β1에 대한 반응으로 일어나는 TGF βRⅡ 하류 키나제 Smad2 의 활성화에 대한 항- TGF βRⅡ mAb 의 저해 활성

TGFβ에 의해 유도된 Smad2의 인산화 (p-Smad2)는 다양한 유형의 세포에서 예를 들면, 증식, 운동성, 생존, 및 분화와 같은 세포의 생물학적 반응을 매개하는, TGFβRⅡ를 통해 이루어지는 TGFβ 신호전달의 전형적인 하류 신호전달 경로이다. 하기 방법에 따라 4T1 뮤린 유방 암 세포 및 MDA-MB-231 인간 유방 암종 세포를 사용하여 항-인간 TGFβRⅡ 및 항-인간 마우스 TGFβRⅡ mAb의 p-Smad2 활성화를 저해시킬 수 있는 능력에 대해 측정할 수 있다. 간략하면, 세포를 FCS 함유 배지 중에서 80%로 컨플루언트될 때까지 성장시켰다. 배양 배지를 무혈청 배지로 대체한 후, 1시간 동안 10 ng/mL TGFβ의 존재하에 세포를 항체 또는 이소타입 대조군으로 처리하였다. 세척한 후, 용해 완충액을 사용하여 세포 용해물을 제조하고, 전기영동하고, 니트로셀룰로스 막에 전기 이동시켰다. 항-포스포-Smad2 및 Smad2 모노클로날 항체 (밀리포어 코포레이트(Millipore Corporate))를 사용하여 웨스턴 블롯에 의해 인산화된 Smad2, 및 Smad2를 검출하고, 화학발광 시스템 (ECL)을 사용하여 전기를 발생시키고, 후지 영상 분석기(Fuji Image Analyzer)를 사용하여 영상화하고 밀도 측정에 의해 정량화하였다.

항-TGFβRⅡ mAb TGF1 및 MT1은 투여량에 의존하는 방식으로 인간 MDA-MB-231 및 마우스 4T1 유방 암 세포 중 Smad2의 TGFβ-유도성 인산화를 감소시켰다. p-Smad2 저해 분석에서 mAb TGF1 및 MT1의 IC₅₀은 5 ± 0.5 nM인 것으로 측정된 반면, mAb TGF3의 IC₅₀은 25 ± 0.5 nM 미만인 것으로 나타났다.

종양 세포의 시험관내 이동 및 침윤에 대한 항- TGF βRⅡ mAb 의 저해 활성

시험관내 이동 및 침윤 분석법에 의해 종양 세포의 침윤성에 대한 항-TGFβRⅡ mAb의 저해 효과를 측정할 수 있다. 간략하면, 무혈청 배지 중 48 웰 플레이트의 콜라겐 I 및 IV로 코팅된 하부 챔버 중에 삽입된 상부 챔버 내로 암종 세포를 웰 당 5 x 10³개의 밀도로 로딩하였다. 24-48시간 동안 37℃에서 10 ng/mL의 TGFβ의 존재하에서 3, 10, 및 30 ㎍/mL의 투여량으로 mAb TGF1 또는 MT1을 사용하여 세포를 처리하였다. 분석에서 양성 및 음성 대조군으로서 25 ㎍/mL TGFβRⅡ-Fc 또는 이소타입 IgG를 사용하였다. 침윤 분석법에서는 마트리젤(Matrigel)로 코팅된 챔버를 사용한 것을 제외하고는, 상기와 동일한 조건을 사용하였다. 인큐베이션시킨 후, 상부 챔버의 반대측에서 이동을 한 세포를 10% 완충처리된 중성 포르말린으로 고정시키고, 2 ㎍/mL의 훽스트(Hoechst) 33342, 트리하이드로클로라이드, 트리하이드레이트 용액 (인비트로겐)으로 염색시키고, 자이스 디지털 이미지 카메라(Zeiss Digital Image Camera) 및 소프트웨어 이미지-프로 플러스 5.1(Image-Pro Plus 5.1)을 사용하여 20X 배율로 계수하였다.

IgG 처리된 대조군과 비교하였을 때, 항-TGFβRⅡ mAb TGF1 및 MT1은 BXPC-3 인간 췌장암종 세포의 이동 및 4T1 뮤린 유방 암종 세포의 침윤을 각각 100% (P<0.0001) 및 93% (P<0.0005) 만큼 유의적으로 저해시켰다.

이러한 결과는 그의 표면 상에 TGFβRⅡ를 보유하는 암 세포의 침윤에 대한 본 발명의 항-TGFβRⅡ 항체의 저해 효과를 입증하였다.

종양 세포에서 VEGF -A 분비에 대한 항- TGF βRⅡ mAb 의 저해 활성

TGFβ는 종양 세포에서 VEGF-A 분비의 자극 및 내피 세포 기능의 조정을 통해 병적 상태가 진행되는 동안 혈관형성을 촉진시키는 데 있어 중요한 역할을 한다. 종양 세포에서 VEGF-A의 TGFβ-유도성 분비에 대한 항-TGFβRⅡ mAb의 저해 효과를 세포 배양물 중에서 측정할 수 있다.

간략하면, 10 ng/mL TGFβ 및 mAb의 일련의 희석액의 존재 또는 부재하에 48시간 동안 5% CO₂하에서 37℃ 인큐베이터 중의 무혈청 배지 중에서 종양 세포를 배양하였다. 조절된 배양 상등액 중 VEGF-A 분비의 변화를 엘리콘(ELIKON) 키트 (R&D 시스템즈)를 사용하여 제조사의 설명서에 따라 측정하였다.

10 μM/mL의 항-인간 TGFβRⅡ mAb TGF1은 MDA-MB-231 인간 유방 종양 세포에서 VEGF-A의 TGFβ-유도성 생산을 63% (P<0.01) 만큼 저해시켰다. 10 μM/mL의 항-마우스 TGFβRⅡ mAb MT1은 4T1 마우스 유방 종양 세포에서 VEGF-A의 TGFβ-유도성 생산을 30% (P<0.02) 만큼 저해시켰다.

이러한 결과는 본 발명의 항-TGFβRⅡ mAb가 TGFβ-유도성 VEGF-A 분비를 감소시킴으로써 혈관형성을 저해시킨다는 것을 입증한다.

시험관내 TGF β-유도성 Treg 전환에 대한 항- TGF βRⅡ mAb 의 저해 활성

TGFβ는 미접촉 T 세포를 유도함으로써 음성적으로 면역 반응을 조절할 수 있는 면역억제능을 갖는 조절성 T (Treg) 세포를 형성하는 것으로 나타났다. TGFβ-유도성의 조절성 세포 전환에 대한 항-TGFβRⅡ mAb의 저해 효과를 하기와 같이 시험관내에서 평가할 수 있다.

간략하면, 10 ng/mL TGFβ 및 mAb MT1의 일련의 희석액의 존재 또는 부재하에 7일 동안 5% CO₂하에서 37℃ 인큐베이터 중의 완전 RPMI 배지 중에서 정제된 미접촉 CD4+ 세포를 1 ㎍/mL 항-CD3 항체 및 정제된 항원 제시 세포 (APC)로 자극하였다. 이어서, CD25+/Foxp3+ Treg 세포의 염색을 위해 세포를 수거하고, 염색된 세포를 유세포 분석기 상에서 분석하였다.

시험관내에서 10 μM/mL의 항-마우스 TGFβRⅡ mAb MT1은 대조군인 IgG 처리된 세포와 비교하였을 때, TGFβ-유도성 Treg 세포의 개수를 75% (P<0.005) 만큼 감소시켰다.

종양 성장 및 전이에 대한 항- TGF βRⅡ mAb 의 저해 활성

피하 또는 정맥내 전이 종양 모델에서 항-TGFβRⅡ mAb의 항종양 효능을 시험할 수 있다.

마우스 또는 인간 암종 세포를 접종하는 데 무흉선 누드 마우스 (메사추세츠주 윌밍턴 소재의 찰스 리버 래버러토리스), Balb/c 마우스, 또는 C57B6 마우스 (메사추세츠주 윌밍턴 소재의 찰스 리버 래버러토리스)를 사용할 수 있다. 확립된 종양으로 피하 모델을 처리하기 위해, 크기가 대략 200 ㎣가 될 때까지 종양을 성장시킨 후, 군당 12-15마리의 동물을 포함하는 군으로 마우스를 무작위화할 수 있다. 폐 전이 모델에서, 꼬리 정맥을 통해 종양 세포를 정맥내로 마우스에 주사할 수 있다. 동물은 매주 3회에 걸쳐 항-TGFβRⅡ mAb를 10-40 mg/kg의 투여량으로 i.p.로 투여받을 수 있다. 대조군에 포함되어 있는 마우스는 동량의 염수 또는 일반 IgG 용액을 투여받을 수 있다. 시험하는 동안 계속하여 동물을 처리할 수 있다. 캘리퍼를 사용하여 매주 2회에 걸쳐 종양을 측정할 수 있다. 공식 [π/6 (w1 X w2 X w2)] (여기서, "w1"은 종양 직경 중 가장 긴 것을 나타내고, "w2"는 종양 직경 중 가장 작은 것을 나타낸다)을 사용하여 종양 부피를 계산할 수 있다.

처리, 시점, 및 처리-시점 상호작용 사이에서 종양 크기에 대한 유의적인 차이를 측정하기 위해 반복-측정 ANOVA (RM-ANOVA)를 사용하여 종양 부피 데이터를 분석할 수 있다. 양측 스튜던츠 t 검정을 사용하여 시험관내 종양 세포 성장에 관한 처리군과 대조군 사이의 비교를 수행하였다. 0.05 미만의 P 값을 통계학적으로 유의적인 것으로 간주하였다.

종양 세포를 정맥내로 주사한 후 24시간이 경과하였을 때 또는 원발성 종양이 확립된 후에 매주 3회에 걸쳐 mAb TGF1을 40 mg/kg의 투여량으로 종양을 보유하는 마우스를 처리하였다. mAb TGF1의 전신 투여는 PANC-1 췌장암종 이종이식편 (T/C=69%, ANOVA p<0.03), BXPC-3 췌장암종 이종이식편 (T/C=30%, ANOVA p<0.0001), 및 MDA-MB-231 유방암종 이종이식편 (T/C=63%, ANOVA p<0.01)의 피하 원발성 종양 성장을 억제시켰다.

면역적격 마우스에서 원발성 및 전이성 종양에 대한 항종양 활성을 측정하기 위해 마우스 동계 종양 모델에서 항-마우스 TGFβRII mAb MT1을 시험하였다. 마우스에 마우스 4T1, CT26 또는 B16 F10 암종 세포를 정맥내로 (i.v.), 또는 EMT6 마우스 종양 세포를 피하로 (s.c.) 주사하였다. i.v. 접종 후 24시간이 경과하였을 때 또는 원발성 피하 종양이 확립된 후에 매주 3회에 걸쳐 40 mg/kg의 투여량으로 mAb MT1을 마우스에 투여하였다.

mAb MT1의 전신 투여는 4T1, CT26, 및 B16 F10 종양의 폐 전이를 각각 84% (P<0.0001), 94% (P<0.0001), 및 63% P<0.001) 만큼 억제시켰다. 항-마우스 TGFβRⅡ mAb MT1은 EMT6 s.c. 종양 모델에서 원발성 종양 성장을 28% (P<0.05) 만큼, 및 자발성 폐 전이를 84% (P<0.0001) 만큼 저해시켰다.

Gr-1/CD11b+ 표현형을 갖는 골수성 세포는 종양이 진행되는 동안 전이 및 혈관형성 면역억제를 촉진시키는 데 있어 중요한 역할을 하는 것으로 보고된 바 있다. CD4/CD25/Foxp3+ Treg 세포는 종양 세포에 대한 자연 살세포 및 세포독성 T 림프구 (CTL) 면역 효과기 세포의 기능을 억제하는 능력을 갖고 있다. EMT6 s.c. 종양 모델에서 면역억제성 세포, 즉, CD4/CD25/Foxp3/TGFβRⅡ+ Treg 세포 및 Gr-1+/CD11b+/TGFβRⅡ+ 골수성 세포에 대한 mAb MT1의 저해 활성을 평가하였다. mAb MT1로 마우스를 처리한 후, Gr-1+/CD11b+ 군집 및 CD4/CD25/Foxp3/TGFβRⅡ+ 및 Gr-1+/CD11b+/TGFβRⅡ+ 군집의 변화에 대하여 FACS 분석에 의해 종양을 보유하는 마우스에서 Treg 및 Gr-1+/CD11b+ 골수성 세포 군집에 대한 항-TGFβRⅡ 항체의 저해 효과를 측정할 수 있다.

EMT6 종양을 보유하는 처리된 마우스에서 항-마우스 TGFβRⅡ mAb MT1은 각각 Gr-1+/CD11b+/TGFβRⅡ+ 골수성 세포의 개수를 95% (P<0.0001) 만큼, CD4/CD25/Foxp3/TGFβRⅡ+ Treg 세포의 개수를 71% (P<0.0005) 만큼 유의적으로 감소시켰다.

이러한 결과는 항-TGFβRⅡ 항체가 TGFβRⅡ+ Treg 및 골수성 세포의 저해 또는/및 고갈에 의해 CD4/CD25/Foxp3/TGFβRⅡ+ 및 Gr-1+/CD11b+ 군집을 조절할 수 있다는 것을 시사한다.

마우스에서 섬유증 모델

TGFβ는 섬유증의 원인이 되는 세포외 기질 축적에서 뿐만 아니라, 간 성상 세포 (HSC)의 활성화 및 근육섬유모세포의 분화에서 중요한 조절 인자이다. 섬유증을 저해하는 TGFβ 신호전달 저해인자의 활성을 평가하기 위한 실험용 모델로서 동물 간 섬유증 모델이 광범위하게 사용되어 왔다. 콜라겐 침착이 간에서 섬유증 형성에 관한 공지의 지표가 된다. 섬유증의 방어 및 개입에서 항-TGFβRⅡ 항체의 치료학적인 활성은 사염화탄소 (CCl₄) 유도성 간 섬유증 모델에서 평가할 수 있다.

간략하면, 옥수수유와 혼합된 1 mL/kg CCl₄ 용액을 C57BL6 마우스에 주당 2회에 걸쳐 i.p.로 주사할 수 있다. 마우스에 CCl₄를 i.p.로 주사한 후 14일이 경과하였을 때 매주 3회에 걸쳐 mAb MT1를 40 mg/kg의 투여량으로 개입 처리군에 있는 마우스에 투여할 수 있다. 동일한 투여 방식으로 대조군 래트 IgG를 대조군에 있는 마우스에 투여할 수 있다. CCl₄를 주사한 후 8주가 경과하였을 때, 처리된 마우스로부터 간 조직 및 혈장 샘플을 수집할 수 있다. 혈청 ALT 키트 (미시간주 소재의 포인테 사이언티픽, 인크.(Pointe Scientific, Inc.))를 사용함으로써 간 기능 장애의 지표인 알라닌 아미노트랜스퍼라제 (ALT)의 혈장 수준을 측정할 수 있다. 콜라겐 침착의 시리우스 레드(Sirius Red) 염색을 사용하여 면역조직화학 (IHC) 분석에 의해 간 조직을 평가할 수 있다.

본질적으로 상기 기술된 바와 같이 수행된 연구에서, 항-마우스 TGFβRⅡ mAb MT1은 CCl₄를 투여받은 마우스의 간에서 콜라겐 침착을 95% (P<0.0001) 만큼 유의적으로 감소시킨 반면, 대조군 래트 IgG는 어떤 효과도 나타내지 않았다. CCl₄를 투여받은 마우스에서 ALT의 혈장 수준에 의해 측정시, 항-마우스 TGFβRⅡ mAb MT1은 기능장애로부터 간을 85% (P<0.001) 만큼 보호한 반면, 대조군 래트 IgG로 처리된 마우스에서는 ALT의 수준이 유의적으로 더 높게 나타났다.

이러한 결과는 손상-유도성 섬유증 및 간 기능장애로부터 마우스를 보호하는 데 있어서 항-TGFβRⅡ 항체 MT1이 효능이 있음을 제안한다.

mAb MT1 및 시클로 포스파미드를 함께 사용하는 조합 치료법에 대한 생체내 연구

조혈 및 골수성 전구 세포를 억제시킬 수 있는 능력이 있는 강력한 세포독성제인 시클로포스파미드 (CTX)가 골수성 세포에 대한 저해 효과를 갖고 있는 것으로 보고된 바 있다 (문헌 [Honeychurch, et al., Cancer Res. 65:7493-7501 (2005)] 참조). EMT6-종양을 보유하는 마우스를 mAb MT1 단독으로, CTX 단독으로, 또는 그를 조합하여 처리할 수 있다. 예를 들면, 암종 세포를 접종하는 데 Balb/c 마우스 또는 C57B6 마우스 (메사추세츠주 윌밍턴 소재의 찰스 리버 래버러토리스)를 사용할 수 있다. 예를 들면, 확립된 종양을 포함하는 마우스를 각 군당 12마리를 포함하는 군으로 무작위할 수 있다. 40 mg/kg 항-TGFβRⅡ mAb, 80 mg/kg CXT, 또는 상기 둘의 조합물을 매주 3회에 걸쳐 동물에 i.p.로 투여할 수 있다. 대조군에 있는 마우스에는 동량의 염수 또는 일반 IgG 용액을 투여할 수 있다. 공식 [π/6 (w1 X w2 X w2)] (여기서, "w1"은 종양 직경 중 가장 긴 것을 나타내고, "w2"는 종양 직경 중 가장 작은 것을 나타낸다)을 사용하여 종양 부피를 계산할 수 있다.

EMT6 종양을 보유하는 마우스에서 원발성 종양 성장 저해에서는 mAb MT1이 28% (P<0.05) 만큼이거나 또는 CTX가 62% (P<0.0005) 만큼이고, 전이 저해에서는 mAb MT1이 84% (P<0.0001) 만큼이거나 또는 CTX가 96% (P<0.00001) 만큼인 단일요법과 비교하여, 본질적으로 상기 기술된 바와 같이 수행된 항-마우스 TGFβRⅡ mAb MT1 및 CTX를 사용한 조합 치료를 통해 원발성 종양 성장은 80% (P<0.0001) 만큼 및 자발적인 폐 전이는 99.99% (P<0.000001) 만큼 감소하였다.

본 결과는 골수성 세포 억제성 화학요법과 함께 조합하여 항-TGFβRⅡ 항체에 의해 TGFβRⅡ-양성 골수성 세포의 서브세트를 저해하는 것이 종양 성장 및 전이에서의 개입을 위해 효과적인 전략법이라는 것을 입증한다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims

서열 GGSISNSYF (서열번호: 1)를 갖는 CDRH1;
서열 SFYYGEKTYYNPSLKS (서열번호: 2)를 갖는 CDRH2;
서열 GPTMIRGVIDS (서열번호: 3)를 갖는 CDRH3;
서열 RASQSVRSYLA (서열번호: 10)를 갖는 CDRL1;
서열 DASNRAT (서열번호: 11)를 갖는 CDRL2; 및
서열 QQRSNWPPT (서열번호: 12)를 갖는 CDRL3
을 포함하며, 인간 TGFβRⅡ에 특이적으로 결합하는 항체 또는 인간 TGFβRⅡ-결합 단편.
제1항에 있어서,
HCVR 아미노산 서열

LCVR 아미노산 서열

을 포함하는 항체.
제1항 또는 제2항에 있어서, 서열번호: 37의 중쇄 및 서열번호: 4의 경쇄를 포함하는 항체.
제1항 또는 제2항에 있어서, 서열번호: 37의 2개의 중쇄 및 서열번호: 4의 2개의 경쇄를 포함하는 항체.
제1항 또는 제2항에 있어서, ELISA에 의해 측정시, 1.0 nM 미만의 IC₅₀으로 인간 TGFβ1, TGFβ2 또는 TGFβ3의 인간 TGFβRⅡ에의 결합을 차단하는 항체.
제1항 또는 제2항에 있어서, 실온 (20-25℃)에서 100 pM 미만의 K_D 값을 갖는 항체.
제1항 또는 제2항에 있어서, 30 nM 미만의 IC₅₀으로 TGFβ에 의해 유도된 Smad2 인산화를 저해하는 항체.
제1항 또는 제2항의 항체 또는 단편, 및 제약상 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는, 췌장암, 유방암, 대장암 또는 흑색종을 치료하는데 사용하기 위한 제약 조성물.
제1항 또는 제2항에 따른 항체 또는 단편, 및 동시, 별개 또는 순차적으로 사용되는 조합 요법을 위한 추가의 항암제를 함유하는, 췌장암, 유방암, 대장암 또는 흑색종을 치료하는데 사용하기 위한 제품.
서열번호: 37의 2개의 중쇄 및 서열번호: 4의 2개의 경쇄를 포함하며 인간 TGFβRⅡ에 특이적으로 결이적으로 결합하는 항체 또는 인간 TGFβRⅡ-결합 단편, 및 제약상 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는, 췌장암, 유방암, 대장암 또는 흑색종을 치료하는데 사용하기 위한 제약 조성물.
제10항에 기재된 항체 또는 단편, 및 동시, 별개 또는 순차적으로 사용되는 조합 요법을 위한 추가의 항암제를 함유하는, 췌장암, 유방암, 대장암 또는 흑색종을 치료하는데 사용하기 위한 제품.
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