TW503315B

TW503315B - Marking of liquids with at least two markers and detection thereof

Info

Publication number: TW503315B
Application number: TW088106444A
Authority: TW
Inventors: Frank Meyer; Gerhard Wagenblast; Karin Heidrun Beck; Christos Vamvakaris
Original assignee: Basf Ag
Priority date: 1998-04-23
Filing date: 1999-04-22
Publication date: 2002-09-21
Also published as: SK286179B6; NO20005280L; DE19818176A1; US6312958B1; EP1082610B1; IL138845A0; DE59914509D1; AU754193B2; CN1145794C; EA002413B1; KR100609673B1; CO5090894A1; EE04508B1; JP4316804B2; PE20000447A1; WO1999056125A1; EP1082610A1; EA200001093A1; UA66381C2; HUP0102734A2

Description

503315 五、發明說明（1) 本發明係關於一種使用至少二個標記物 / ，其中該標記物在光譜600-12〇〇毫微半己液體之方毛射螢光，至少一個標記物之吸收範圍與:域吸收，並再之：收範圍重疊。少另-標記物本發明更關於一種於以本發明方法標吃 :己：J方法，其包括使用在該標記物吸吹體中❹“票一先源，亚偵測由該標記物再發射之螢光，壞1中發射輻射種在至少一個標記物與至少另一標記物垓光源中至少 :射輻射，且光源數目低於或等於標記2重疊吸收範圍發明更關於以本發明標記之液體。數目。例如，在使用中經常需要利用適當方 · =，使它們後來能夠偵測。這使得例如加=C或標示液子有種有利的租稅狀態，能夠與通常幹:、油，其正常下，，或者在大型工廠中標示液體產物流广向課稅之柴油區廠，亚因而追蹤它們。例如石油精煉倘若液體之標記肉眼看不見，必需依也 :外吸收並/或严射輻射之標記物。θ二使用在光譜可見又，=及以低$添加標記物達成可靠標則之極度敏銳在此處將所吸收輻射如營光般再發射之梓，附隨可能性，處。此再發射之輻射通常頻率低於所吸：:己物尤為其誇耀射），較不常為同頻率（共振螢光 ^射CST0KES輻 (ANTI-STOKES輻射）。或者甚至為較高頻率將經和fe混合物（例如，各級它礦油)標記具有重大經濟重：：油和-油：達燃料和其为I A H重要性。因為這些液體本身在

g 5頁 503315 五、發明說明（2) _ 光譜低於約600毫微米之區域内經常具 < 光，使用之標記物在約600毫微米以上口高吸收和/或發螢不意外。％ &和/或發螢光並理想情況下，用以作為標記物之化合下基本性質：切因而應該具有以在光譜之6 00- 1 2 0 0毫微米區域内強烈在光譜之可見區域内少量或不吸收/，在光譜超過約60 0至約12〇〇毫料丰夕^笨光，光，笔微未之區域内強烈發射螢當以低於1 ppm重量比添加於測之螢光放射量，和 w 之驵時，得到可偵在欲標記之液體中具有充分溶解度。此外，取決於特定之應用需求，物必需滿足一個或多個以下需求：乍為標記物之化合與其它標記物和任何其它存在之豆記和可能添加之液體亦應該彼此混溶）/、加劑混溶（所標用或溶於欲標記之液體中時，對於外在環 ;P:::性，例如溫度，光線，濕氣等等，等匕其被使用之環境，例如内部之燃燒引擎，貯存槽彳對於毒物學和生態學皆不虞危險。至專利第W〇 94/025 70號敘述標記液體，其使用在600 米且右笔微米範圍内具有吸收最大值和在620至1 20 0毫微一螢光最大值之標記物標記液體，該標記物僅可以選 503315 發明說明（3) -自-無„和含金屬酞青素，無金屬和含金屬之萘青素，鎳一/1··醇烯錯合物，芳香族胺之銨自由基鹽化合物，次/、二=科和奠方形酸染料。其更敘述一種方法，基本上包括區=液體中所存在標記物之螢光，該標記物在指定之光譜 :洌：丨吸收輻射。所例舉之參考資料亦敘述-種標記物‘ 物。然而，並未明確敘述同時使用二種或多種標記 f國專利第5，5 2 5，5丨6號同樣敘述一種以在N丨R區域中發之化合物標記礦油之方法。取代酞青*，取代萘“ :T形酸或克酮酸係用以作為此類標記物。· 敘述部份(第三欄，第35至40行)中提到，不僅以一Π· =U —個或多個在ί R區域巾發螢光之化合物標記—種或多種礦油，《中所述者亦在本發明之範圍中。在此章節中更提到，這二個或多個化合物係經選擇，為了不干擾個別的债測，它們在彼此非常不同之波長吸收輻射並/或再發射榮光。使用（當時的）技藝偵測設備狀態，咸相信（第4欄，第25至28行）此一吸收/發螢光差異，如波長2〇毫微米般小，能夠被辨別。此參考資料明確地排除使用具有重疊吸收區域之標記物。其更指出（第3攔，第41至44行），此螢光化合物應該較佳在低於波長85〇毫微米吸收，因為礦油在高於此波長吸收。之美國專利第5，52 5，5 1 6號更宣稱一種方法，以確認銀/ 個或多個標記物標記之礦油。將該標記礦油或摻入其中a 標記物，暴露於67 0-850毫微米範圍（吸收範圍）内之電磁

第7頁 503315 五、發明說明（4) 輻射。但是除此外，關於當礦油經一種以上標記物標記時如何進行，並未提供進一步之資料。美國專利第5，71 0, 〇 4 6號敘述一種標記汽油之方法，其再次基本上係以偵測一種溶於石油中之本質上無金屬螢光染料。將一種適當標記之石油係以6 0 0至2500毫微米波長帶之輻射激發，偵測在約6 〇〇至2 5 0 0毫微米波長帶中由染料發射之螢光，使用產生之偵測信號確認標示樣品。此參考資料更詳細敘述建構一種偵測劑，以偵測標示石油樣品中之螢光染料。然而，並未討論使用許多標記物（染料）。倘若欲標記不同來源或不同製造商之液體，例如烴和^瞻混合物（例如柴油和石油燃料及其它礦油），倘若每種液體僅使用一個標記物，則需要多種不同標記物。這些不同的標記物必需在其吸收和/或發螢光具有相當不同之特徵，、以便確認該液體之出處和/或生產者。此外，襠: 1 1皇从一個韓記物標記液體使得其它更容易由於添加該特有之妈。 ' 〜"々示纟己物而錯認未標記之液體。當化學性和定性相等之洛縣 ®員擔不ρη 的財政稅務b ’這疋非常重要的。一個實例為力、句加熟油和柴油0 本發明之目的係使用二個或多個具有難以複製之" ” 記號之標記物標記液體。 A 3 f _ 頃發現藉由使用至少二個標記物標記液體之方、去目的，其中 /達成此該標記物在光谱600 —1200宅微米區域内吸你廿光，且叹亚再發射螢

第8頁 503315

收五、發明說明（5) 至少一個標記物之吸收範圍與至少另一個標記範圍重疊。較佳圍内之使用圍和至能夠使要的是需要具收範圍假設之較窄重疊至若使用半存在吸收，源，則例則否使用個標記物一個或少一個用較多 ’任何有與原亦需具，例如吸收最某種程僅在吸類似之但原始預期在別最大吸收波長係在光譜6 0 0 -1 2 0 〇毫德: 米範多個標記物其它標記物數在所述波其它人所使始標記物類有與後者類，各不實標大值。進一度之吸收範收最大值區螢光光譜。標記物具有後例中將偵，其在至少一個標記物之吸收範圍間具有重疊長範圍内之標記物。然用企圖欺騙誤認之化合似之吸收最大值，而且似之特徵。記物僅具有一步假設，該原圍，即頃達成域發射之光源然而’倘若使重疊吸收範圍測由這些標記個對應原始標記物本發明之，則於該用在不實之波長發物發射之之〜方面 ’更重，不僅 &其它而物始榡額外具標記。 —«例中標記物射之光螢光， :另一實例。假設原始標記物Μ 1之吸收最大值位於Μ 1吸收最大值和其它原始標記物M2吸收最大值吸收重疊區域内。倘若該標記物Μ 1和Μ 2各於其吸收最大值内被激發，則Μ 1之螢光信號將僅是由於其激發作用，而該標記物Μ2之螢光信號將具有一種由於其個別激發作用（在Μ 2之吸收最大值中）之成份，和由於標記物Μ 1激發作用（在其吸收最大值及同

503315 五、發明說明（6) 時在標記物Ml和M2間之吸收重疊區域内）之其它成份。與其對照，與此一方式中無吸收範圍重疊之對應不實標記物，當激發時在吸收最大值中僅存在其個別之獨立螢光信號。這之後將在本文中將更詳細討論。在本發明中較佳使用η種標記物之組合物標記液體，其中 η 為整數 2 至 10，即2，3，4，5，6，7，8，9 或10。在本發明中尤其較佳使用η種標記物之組合物標記液體，其中η為整數2至6，即2，3，4，5或6。在本發明中特別較佳使用η種標記物之組合物標記液體，其中η為整數2至4，即2, 3或4。 < 在本發明之方法，及使用η = 2-10，η = 2- 6或η = 2- 4組合標記物之較佳具體實施例中，添加之較佳標記物係僅可以選自無金屬和含金屬酞青素，無金屬和含金屬萘青素，鎳-二硫醇烯錯合物，芳香族胺之銨自由基鹽類，次曱基染料，方形酸染料和克酮酸染料。適當之酞青素例如符合化學式la

第10頁 503315 五、發明說明（7) 其中

Me1為二個氫，二個鋰，鎂，鋅，鋼，鎳，v〇，Ti〇， A1C1，Al〇-CrCf 烷基，AlNH-CrC2。-烷基，ΑΙΝΚΊ ，）2 ’ Al〇-C6-C2。-芳基，a卜nh-c6-C2G-芳基或A1N(C6-C20- 方基）2 , AIN-Het，其中N-Het係一種雜環族飽和或不飽和五，六—或七-元環，以及至少一個氮原子，其在環中能夠包含一個或二個其它氮原子和/或其它氧或硫原子，該環為未取代或被匕-^-烷基，苯基，今基或苯基乙基單取代至三取代，且係經由一種（或該）環氮原子，或si(〇H)2 接合於鋁原子 ^應基Ri至W中至少4個各獨立為化學式反應基，其為-種化學鍵，氧，硫，亞⑮，n烧基亞胺基或苯 ^胺基’且基或基，被鍵官能至4個氧原子間斷與否，具有或無苯基取代基，金鋼烷基或取代或未取代之苯基，雜環族飽和之五六_ 一凡環，其在環中能夠額外包含一個式—伽* —斤二^ 或-個其它氧或硫原子，該環為代-，個/c' ” ：和/ 苯基，或笨基乙基單取代至三取Π*-:一基種 (或該）環氮原子接合於苯環，且任何剩下的反應基P至P係各為氫，由素，羥續基（

Ci - C4-二烧基胺確酿基。適當之酞青素更符合例如化學式I b

503315 五、發明說明（8)

(lb),

其中 R17和R18或R18和R19或R19和R2G係二個一對，以形成化學式 X2 -C2 H4 - X3之反應基，其中X2和X3之一為氧，另一為亞胺基或匕-C4 -烧基亞胺基，且 R19和R2G或R17和R2G或R17和R18係各獨立為氫或鹵素，且 Me1係如上所定義般。更適合之酞青素，除非已於上述酞青素中敘述，係於美國專利第5，526，516號以通式I，並於表3中說明，以及在美國專利第5, 70 3, 229號以通式I I，並於表3說明。

適合之萘青素係符合例如化學式I I

第12頁 503315 五、發明說明（9)

γ12 (II) _ 其中 γΐ ，γ2 Υ3，Υ4，γ5，γ6，γ7和γ8係各獨立為氫，羥基 (:厂‘-烷基，或C3-C1Q-環院基或(：厂(：2()-烧氧基，其中該烷基可以被醚官能中之1至4個氧原子間斷，且可以為苯基取代，雜環族飽和之五-，六-或七-元環，其在環中能夠額外包含一個或二個其它氮原子和/或一個其它氧或硫原子，該環為未取代或被q-Crl基，苯基，今基或苯基乙基單取代至三取代，且係.經由一種（或該）環氮原子接合於苯環， γ9，Υη，γη和―係各獨立為氫，Ci —烷基或Q烷氧基，其中該烷基可以各被醚官能中之1至4個氧原子間斷，齒素’經續基或-二烧基胺續酿基間斷，且 Me2為Me1或反應基

第13頁 503315 五、發明說明（ίο) Y17 s/ · λγΐΒ 其中 Υ17和Υ18係各獨立為羥基，（：「(：2() -烷氧基，C2Q -烷基， c2-c2() -烯基，c3-c2。-烯氧基或以下化學式之反應基 γ20 I * O-Si-O-Y19 I ' γ21 其中Υ19為(：广(：2。-烷基，C2-C2Q-烯基或C4-C2。-二烯基，且Υ2〇和Υ21各獨立為匕-^ -烷基，C2-C12-烯基或上述反應基0Υ19 〇關於此尤其令人注意的是化學式I I之萘青素，其中Υ1至 Υ8中至少一個並非氫。 g 更適合之萘青素，除非已述於上述萘青素中，係於美國專利第5, 526,516號中以通式II表示，並於表4中說明，以及在美國專利第5, 703, 229號以通式III表示，並於表4中說明。

適合之萘青素係符合例如化學式I I I

第14頁 503315 五、發明說明（11)

(III), 其中 L1，L2，L3和L4係各獨立為-烷基，被醚官能中之1至4 個氧原子間斷與否，苯基，q-c%-烷基苯基，-烷氧基苯基，其中該烷基可以各被醚官能中之1至4個氧原子間斷，或者在各例中L1和L2且/或L3和L4係一起為以下化學式_ 之反應基

ch3

適合之銨自由基鹽化合物係符合例如化學式I V «

第15頁 503315 五、發明說明（12) 其中 Z1，Z2，Z3和Z4係各獨立為(：广(：2{)-烷基，被醚官能中之1至4 個氧原子間斷與否，q-C2()-醇基或以下化學式之反應基

其中Z6為氫，被醚官能中之1至4個氧原子間斷與否之 (：厂(：2()-烷基，或(:厂^ -醇基，Z7為氫或被醚官能中之1至4 個氧原子間斷與否之q-c% -烷基，Z8為氫，被醚官能中之1 至4個氧原子間斷與否之q-Cu-烷基或鹵素，且 Αη θ為一種陰離子之相等物。

適合之次曱基染料係符合例如化學式V

⑺，其中環Α和Β可以獨立為苯并稠化且經取代， E1和E2各獨立為氧，硫，亞胺基或一種以下化學式之反應基

第16頁 503315 五、發明說明（13) ，C(CH3)2—或一CH=CH——, D為以下化學式之反應基

其中E3為氫，CrQ -烷基，氯化溴，且E4為氫或q-Ce-烷基， Q1和Q2各獨立為苯基，C5-C7-環烷基，被醚官能中之1至3個氧原子間斷與否之匕-(：12-烷基，且被羥基，氯，溴，羧基，匕-(：4-烷氧羰基，丙烯醯氧基，曱基丙烯醯氧基，羥石黃基，C〗-C7 -酿基胺基，q - C6 -烧基胺曱醯基，C! - C6 -烧基胺曱醯氧基或化學式(ίθ(Κ)3之反應基取代與否，其中G為氮或碟’且K為苯基，C5_C7_環烧基或匕-。-烧基’ Αηθ為一種陰離子相等物，且 η為1，2或3。適合之方形酸染料係例如美國專利第5，5 2 6，5 1 6號於通式III下並於表2中說明者，以及在美國專利第5,703, 229 號中於通式IV下並於表2中說明者。

第17頁 503315 五、發明說明（14) 適合之方形酸染料亦包括符合例如以下化學式V I之奠方形酸染料

T5 fp4 T3 (VI), 其中籲 J為C! - C: 2 伸烧基， Τ1為氫，鹵素，胺基，羥基，-烷氧基，苯基，取代苯基，羧基，CrC12-烷氧羰基，氰基或化學式-NT7-C〇-T6 ，-C0-NT6T7或0-C0-NT6T7之反應基，其中T6和T7各獨立為氫，（：1-(：12-烷基，（：5-(：7-環烷基，苯基，2,2,6,6-四甲基六鼠卩比唆- 4"-基或環己基胺基魏基^且 T2，T3，T4和T5係各獨立為氫或匕-。-烷基，具鹵素，胺基，c「c12-烷氧基，苯基，取代苯基，羧基，（：广(：12-烷氧羰基或氰基取代基與否， _ 限制條件為當T5為氫時，在奠環中取代基J-T1和T4之環位置亦可以在任一或二個奠環中交換。適合之方形酸染料更包括例如符合以下化學式V I a者：

第18頁

五、發明說明 (15) οθ

Ar㊉ (Via), ==各Ar係獨立為一種未取代或匕―烷氧—，C1—C2Q-烷 >以基’ G〜C2Q -二烧基胺基-或C! - C2Q -烧基硫取代，芳香教或雜芳香族五-或六-元環，例如，苯基，萘基，噻吩，_ ^比咬或噻唾。該烷基可以各被醚官能中之1至4個氧原子間斷且可以被笨基取代。

Ar較佳為笨基，其係在位置2-，2, 4 -或2, 4, 6 -被所述之反，基單取代，二取代或三取代。較佳當苯基為多取代時，以些反應基是相同的。尤其令人注意的是其中該二個ΑΓ為相同之化合物。 _ 、適合之克酮酸染料係例如美國專利第5, 526, 5 1 6號以通式’並於表5中說明者。任何在上述化學式中出現之烷基，伸烷基或烯直鏈或支鏈。 ^ ^ 在化學式la，II，III，IV或Via中，適合之^—c 一产基’其可以被謎官能中1至4個氧原子間斷，係‘如2G甲二，乙基，丙基，異丙基，丁基，異丁基，二級丁基，三級丁基，戊基，異戊基，新戊基，二級戊基，己基，2〜曱美戊

第19頁

503315 五、發明說明（16) 基，庚基，辛基，2-乙基己基，異辛基，壬基，異壬基，癸基，異癸基，Η--碳基，十二碳基，十三碳基，3,5,5, 7-四甲基壬基，異十三碳基（以上標示之異辛基，異壬基，異癸基和異十三碳基係俗名，從以羰氧化法得到之醇類衍生一比較烏爾曼化學技術百科全書（U1 1 m a η n s Encyklop士die der technischen Chemie)，第4 版，第7 冊，第215至217頁，及第11冊，第435和436頁），十四碳基，十五碳基，十六碳基，十七碳基，十八碳基，十九碳基，二十破基，2-甲氧乙基，2_乙氧乙基，2-丙氧乙基， 2 -異丙氧乙基，2-丁氧乙基，2-或3 -甲氧丙基，2-或3-乙春氧丙基，2-或3-丙氧丙基，2-或3 - 丁氧丙基，2 -或4-曱氧丁基’2-或4-乙氧丁基，2-或4-丙氧丁基，2 -或4- 丁氧丁基，3, 6-二氧庚基，3, 6 -二氧辛基，4, 8-二氧壬基，3, 7-一氧辛基’3, 7-二氧壬基，4, 7-二氧辛基，4, 7 -二氧壬基’4, 8 -二氧癸基，3, 6, 8 -三氧癸基，3, 6, 9_三氧十一碳基’ 3, 6, 9, 12-四氧十三碳基或3, 6, 9,丨2-四氧十四碳基。在化學式la或II中，適合之匕—匕厂環烷基係支鏈或非支鏈環烧基’其可以被醚官能中之1至4個氧原子間斷，例如，環丙基，環丁基，環戊基，四氫呋喃基，環己基，四氫四氫哌喃基，環庚基，曙今基，甲基環丙基，卜乙基· 壞丙基’1-丙基環丙基，丨-丁基環丙基，卜戊基環丙基， 1 -甲基-1- 丁基環丙基，1>2 —二甲基環丙基曱基一 2-乙基環丙基’環辛基，環壬基或環癸基。在化學式la，lb或I I中，在Mei和Me2之A10-C6_C2。-芳基-

第20頁丄：) 五、發明說明（17) 芳基-或A1N(-c6-c2。-芳基V基中適合之二二應基，為例如苯基，必要時可被達到二個 4到W甲芙達式到三個H貌基，達到四個n烧基或 _ , Γ 土或乙基取代，或者為萘基，必要時可被達一個C丨-c厂烷基，達到三個Γ ρ使々土女町』伋建到基取代，ϋ些必要時可7 /1 3_烷基或達到四個甲基或乙烷基中敘述7 肖了存在之烷基取代基頃於上述C〜在化學式Ia，Ib扣中，在Mel和Me2之㈣如基中適合 :广係如從吡洛，吡咯咬，吡唾，吡洛啶…米。坐，味疋，1H_1，2,3-三唑，1，2,3-三唑啶，my 2 4_三唑 Π三线，卩比咬，派咬，吼哄，六氫吼哄：嗎啉’1H-V呼，2H—吖呼，卩丫冲，噚唾’噚唾啶，三吐，三唑啶，i，2, 3_，i，2, 4~ 或 1，3, 4-噚二唑，1, 2, 3-，1，2, 4-或1,3,4_噚二唑啶，^,3-，12,4-或i’3,4—噻唑或 1，2’ 3-，1，2’ 4-或1，3, 四氫噻唑，該雜環為未取代或被 q-c、4-烷基’苯基，斗基或苯基乙基單取代，二取代或三取代。對應選用之C「G —烷基係以上關於匕-C2Q -烷基所述者0 在化學式1 a或11中，適於R1至R16或Y1至Y8之雜環，環形鲁反應基係從雜環之不飽和五一，六一或七一元環衍：，其在― 環中可以額外包含一個或二個其它氮原子，和/或一個其它軋或V原子’例如，D比咯啶，唯唑唆，咪唑啉，1，2，3 -三唑啶，1，2，4-三唑啶，哌啶，派畊，嗎啉，吖许，嚀唑症’唾唾唆’ 1，2, 3-，1，2, 4-或丨，3, 4_曙二唑啶，或

第21頁 503315 五、發明說明（18) I，2,3-，1，2,4-或I,3,4 -四氫噻唑，該雜環為未取代或被 (：厂(：4-烷基，苯基，斗基或苯基乙基單取代’二取代或三取代。對應之C!_C4_烷基係以上關於^〜G。-烧基所述者。烷基在化學式I，I I或Via中，適合之苯基一取代Ci 一C2〇為例如4基或1 -或2 -苯基乙基。 +1四噗氣十八碜氣，2〜乙& ^ ^氧乙氧乙氣義，或3-乙氧丙氧基’2〜或3〜而氣基，2-或3 -丁氧丙氧基，2-或4-曱氧丁氧基，2 -或4〜乙氣丁氧基，2-或4-丙氧丁氧基，2-或4 - 丁氧丁氧基乙氣在化學式I I，II I，IV或Via中，適合之Cl —C2〇 —埝氣基，其可以被醚官能中之1至4個氧原子取代，為例如甲氣義乙氧基，丙氧基，異丙氧基，丁氧基，異丁氧基，戊氣基，己氧基，庚氧基，辛氧基，2-乙基己氧基，異辛^ 基，壬氧基，異壬氧基，癸氧基，異癸氧基，· 氣基，十二碳氧基，十三碳氧基，異十三碳氧基基，十五碳氧基，十六碳氧基，十七碳氧基，基，十九碳氧基，二十碳氧基，2-甲氧乙氧基氧基，2-丙氧乙氧基，2 -異丙氧乙氧基，2- 丁 -或3-曱氧丙氧基 5 3,6 〜 As· 二氣 S四氧基為氧庚氧基，3, 6-二氧辛氧基，4, 8 -二氧壬氧基，3，j 辛氧基，3, 7 -二氧壬氧基，4, 7-二氧辛氧基，4, I1 氧基，4, 8 -二氧癸氧基，3, 6,8 -三氧癸氧基，3, 6,丨十一碳氧基，3, 6, 9,12-四氧十三碳氧基或3, 6,9, 十四碳氧基。 ' 在化學式II或Via中，適合之笨基取代Ci—C2Q-烷例如气氧基或1-或2 -苯基乙氧基。

^3315 五、發明說明（19) 在化學式la，11 I或VI中，適合之取代苯基為例如Ci_c6〜烧基~，（^-(:厂烷氧基-，羥基-或鹵素取代之笨基。取代基之數目通常能夠為1至3。尤其，苯基係被1或2個q — c6 -烷基或C广(：6-烷氧基取代基所取代。以單取代而論，該取代基較佳在對位。以二取代而論，該取代基較佳在2, 3一， 2, 4-，3，4 -和 3，5-位置。在化學式lb，II，IV或VI中之鹵素為例如氟，氯或溴。在化學式I a之W和化學式I b中之X2或X3為例如甲基亞胺基，乙基亞胺基，丙基亞胺基，異丙基亞胺基或丁基亞胺基。錢在化學式la中之R1至R16以及在化學式π中之γ9至…為如一曱基胺％醯基，二乙基胺石黃醯基，二丙基胺續酸義二丁基胺磺醯基或Ν-曱基-Ν-乙基胺磺醯基。土在化學式II中C：2-^-烯基以及q-c；2广烷二稀基各為乙烯基，烯丙基，丙-1-烯-丨—基，曱晞丙基，乙烯丙丁-3-烯-1-基，戊烯基，戊二烯基，己二烯基，3, 7、暴，基辛-1,6-二烯基，十一-10 一烯一 J—基，6, 1〇一二甲基〜:甲 -5,9-二烯-2-基，十八-9—烯〜！-基，十八-9，12—二〜基，3, 7, 11，15-四曱基十六q—烯一 3 —基或二十一 9〜烯基。在化學式I I中之C3--烯氧基為例如丙烯氧基，甲烯氧基，丁-3 -烯-1-氧基，十一 _1〇—烯—丨―氧基，十:丙稀-1-氧基或二十-9 -晞-氧基。在化學式I V中之Z6為例如甲醯基，乙醯基，丙醯基，丁

第23頁五、發明說明（2〇) •基’戊酿基，己酿| Ρ Μί 基。基1醯基，辛醯基或2-乙基己醯基，胺基，單〜或」二=烷氧基，苯氧基，鹵素，麵之數目通常為1至3。疋基胺基或氰基。環上取代基乙基異戊異丁基基，新戊基 Q1和Q2亦可以為例如己基在化學式V中之P，E4，Q1*Q 丙基，異丙基，丁基，異丁基，二纟為例如曱基戊基級戊基或己基。丁基 2 2- 乙基己基，異辛基，壬基，異壬基基’庚基，辛基，探基，十二碳基，環戊基，環己基%，癸基1癸基十一乙基，2-或3-甲氧丙基，2—或3一乙岛甲氣乙基，2—乙氧或3-羥丙基，2-氯乙基，2-溴乙基，2、基，2〜羥乙基，2一 3- 溴丙基，2 -羧乙基，2 -或3 -羧丙基，或3〜氯丙基，2 —或 2-乙氧羰基乙基，2-或3-甲氧羰基内基2〜甲氧羰基乙基，丙基’ 2 -丙稀酿氧基乙基，2 _或3〜曱我 2或3 -乙氧幾美 2 -甲基丙烯醯氧丙基，2 -羥磺基乙基烯醯氧基丙基t 基’2-乙酿基胺基乙基，2-或3-乙驗甘或3 —經石黃基丙胺曱醯基乙基，2-乙基胺曱醯基乙爲 I丙基，2-曱其基丙基，2-或3 -乙基胺甲酸基丙基，2、或3-甲基胺甲酸基，2-乙基胺甲醯氧基乙基，2-或3、甲甲基胺甲醯氧基乙基，2-或3-乙基胺曱醯氧基丙基，=1按甲醯氧基丙 2-(三乙基銨）乙基，2-或3-（三甲基甲基銨）乙基， )内基，2-或3 —(三

第24頁 503315 五、發明說明（21) 乙基銨）丙基，2-(三苯基鱗）乙基或2 -或3-(三苯基鱗）丙基。在化學式I V或V中之Αη θ係從例如有機酸或無機酸衍生。關於此尤其較佳為例如甲烷磺酸鹽，4-曱基-苯磺酸鹽，乙酸鹽，三氟乙酸鹽，七氟丁酸鹽，氣化物，溴化物，碘化物，過氣酸鹽，四氟硼酸鹽，硝酸鹽，六氟磷酸鹽或四苯基硼酸鹽。在化學式VI中之J為例如亞甲基，伸乙基，1，2-或1，3-伸丙基，1，2-，1，3-，2,3-或1，4-伸丁基，五亞甲基，六亞曱基，七亞曱基，八亞甲基，九亞甲基，十亞甲基，十® 一亞甲基或十二亞甲基。在化學式V I中之Τ2，Τ3，Τ4和Τ5各為例如曱基，乙基，丙基，異丙基，丁基，異丁基，二級丁基，三級丁基，戊基，異戊基，新戊基，三級戊基，2 -曱基丁基，己基，2-曱基戊基，庚基，辛基，2-乙基己基，異辛基，妥基，異壬基，癸基，十一碳基，十二碳基，氟曱基，氯甲基，二氟曱基，三獻甲基，三氣甲基，2-氟乙基，2 -氯乙基，2-溴乙基’1，1，1-三氣乙基，七氟丙基，4-氯丁基，5·*氟戊基，6-氯己基，氰曱基，2-氰乙基，3 -氰丙基，2-氰丁 _ 基，4-氰丁基，5-氰戊基，6 -氰己基，2 -胺基乙基，2-胺基丙基’3 -胺基丙基，2 -胺基丁基^4 -胺基丁基^5 -胺基戊基，6-胺基己基，2-羥乙基，2-羥丙基，3-羥丙基，2-羥丁基，4-羥丁基，5-羥戊基，6-羥己基，2-曱氧乙基， 2-乙氧乙基，2-丙氧乙基，2-異丙氧乙基，2- 丁氧乙基，

第25頁 503315 五、發明說明（22) 2-甲氧丙基，2-乙氧丙基，3-乙氧丙基，4-乙氧丁基，4-異丙氧丁基，5-乙氧戊基，6-曱氧己基，彳基，1-苯基乙基，2-苯基乙基，4-氯齐基，4-曱氧芩基，2-(4-曱基苯基）乙基，羧曱基，2 -羧乙基，3 -羧丙基，4 -羧丁基，5-羧戊基，6 -羧己基，曱氧羰基曱基，乙氧羰基甲基，2-曱氧羰基乙基，2-乙氧羰基乙基，3-曱氧羰基丙基，3-乙氧羰基丙基，4 -曱氧羰基丁基，4-乙氧羰基丁基，5-曱氧羰基戊基，5-乙氧羰基戊基，6-甲氧羰基己基或6-乙氧羰基己基。在化學式VI中之T1為例如曱氧羰基，乙氧羰基，丙氧羰® 基，異丙氧羰基，丁氧羰基，異丁氧羰基，二級丁氧羰基，三級丁氧羰基，戊氧羰基，異戊氧羰基，新戊氧羰基，三級戊氧幾基，己氧藏基，庚氧藏基，辛氧魏基，異辛氧羰基，壬氧魏基，異壬氧羰基，癸氧羰基，異癸氧羰基，十一羰氧羰基，十二碳氧羰基，甲氧基，乙氧基，丙氧基，異丙氧基，丁氧基，異丁氧基，戊氧基，己氧基，乙醯胺基，胺曱醯基，單-或二曱基胺曱醯基，單-或二乙基胺曱醯基，單環己基碳基，苯基胺曱醯基，二甲基胺甲醯氧基或二乙基胺甲醯氧基。 _ 尤其值得注意之標記物更包括化學式I I a之萘青素

第26頁 503315

第27頁叫315 五、發明說明（24) :U tc: MCir烷氧基。該烷氧基能夠是相同或相異。 ς左思其中Me為二個氫之化學式⑴之萘青素。人，值付庄思之標記物更包括化學式Η〖之鎳_二硫醇烯 ^物，其中，L2，l3r4各獨立為苯基，H貌基苯二-烷氧苯基或羥基广烷基_取代苯基，或者L和L2及L3和L4各一起為以下化學式之反應基

τ 1 ^於此尤其注意化學式11 1之鎳-二硫醇烯錯合物，其中各為苯基，且[2和[4各為化學式4_[C2H「C(CH3)小 H4 〇於本發明方法及較佳具體實施例中使用之標記物較佳為上不化學式la之酞青素及美國專 25,516號中所例舉之駄青素，上示化學式^之萘青素，美國專利第戶斤 5^ 525’ 51—6號中表4所例舉之萘青素，尤其較佳為上示化學 / 1 1 a之奈青素。以此而論尤其值得注意其中M e1或M e2為一 _ 個氫之酞青素和萘青素。一光〜中超過6 〇〇至約8 5 〇毫微米之區域習慣上被酞青素浐 :且光邊向於約8 0 0毫微米之區域習慣上被萘青素覆

第28頁 503315 五、發明說明（25) 化學式I a之酞青素係本身已知，且於例如德國專利第 DE-B - 1 07373 9號或歐洲專利第EP-A- 1 55780號中敘述，或者可以製備酞青素或萘青素之傳統方法得到，例如在F · H· 莫瑟（Moser) ’ A.L.湯姆士（Thomas)"献青素（The Phthalocyanines)" ，CRC版，波卡羅達（Boca Rota),佛羅里達（Florida)，1 983，或J· Am· Chem· Soc·第 106 冊，第7404至7410頁，1984，所述。化學式lb之酞青素同樣為本身已知，且在例如歐洲專利第EP-A-1 55780中敘述’或可以從上述先前技藝（莫瑟，j. Am. Chem. Soc.) 之方法得到。 _ 化學式11之萘青素同樣是本身已知，並於例如歐洲專利第EP-A-3362 1 3號，歐洲專利第EP-A - 358080號，英國專利第GB-A-2 1 68 3 72號或英國專利第GB-A - 2200650號中敘述，或者可以上述先前技藝（莫瑟，j· Am. Chem. Soc·)之方法得到。化學式11 I之鎳-二硫醇烯錯合物同樣是本身已知，例如在歐洲專利第EP-A -1 922 1 5號中敘述。化學式IV之鍵化合物同樣是本身已知，並於例如美國專利第US-A-34 844 67號中敘述，或者可以以其中所述之方法得到。化學式V之次曱基染料同樣是本身已知，且於歐洲專利第EP-A-464543號中敘述，或者可以以其中所述之方法得到。 ' 方形酸染料之製備係於美國專利第5, 525, 5 1 6和

第29頁 503315 五、發明說明（26) 5，7 0 3，2 2 9號及各例舉之參考資料中敘述。克酮酸染料之製備係於美國專利第5, 525, 5 1 6和各例舉之參考資料中敘述。化學式VI之奠方形酸染料同樣是本身已知，例如在歐洲專利第£?4- 3 1 0 08 0號或美國專利第1^4-4 9 90 6 49號中敘述，或者可以以其中所述之方法得到。可以由本發明之方法使用一種至少二個上述化合物作為標記物而標記之液體慣例上為有機液體，例如醇類，如曱醇，乙醇，丙醇，異丙醇，丁醇，異丁醇，二級丁醇，戊醇，異戊醇，新戊醇或己醇， < 二醇類，如1,2-乙二醇，1,2-或1,3-丙二醇，1，2-，2, 3-或1,4- 丁二醇，二-或三甘醇或二-或三丙二醇。醚類，如曱基三級丁醚，1,2-乙二醇單曱基醚，1，2-乙二醇二曱基醚，1,2-乙二醇單乙基醚，1,2-乙二醇二乙基醚，3-甲氧丙醇，3 -異丙氧丙醇，四氫呋喃或二卩萼烷，酮類，如丙酮，曱基乙基酮或二丙酮醇，酯類，如乙酸甲酯，乙酸乙酯，乙酸丙酯或乙酸丁酯，脂肪族或芳香族烴類，如戊烧，己烧，庚烧，辛烧，異辛烷，石油醚，曱苯，二曱苯，乙基苯，四氫萘，十氫萘，二曱基萘，揮發油，天然油類，如橄欖油，黃豆油或葵花油，或天然或合成引擎油，水壓機或齒輪油，例如汽車引擎油或缝紉機油，或煞車油，和礦油類，如汽油，煤油，柴油或加熱油。

第30頁 ^315 五、發明說明（27) 上述化合物對於姆> 例如基於課稅理由。=市彳確二形式之礦油類尤其有用，記礦油與任何其它存在：】二可士保2至最低，但亦將標 :J將標記物之用量保；能：的父j作用減至最低， ^盡可能低之進—步理由，係能夠^將標記物用量保杲心例如在内部燃繞引擎之燃料入口 = y能之損害效如頃敘述般，通常希望使用產生古^排氣出口區域。 2合物標記液體，即其將大部二:：量：產：之標記光置子般再發射。收之輻射1子如螢這些將用以作為標記物之化合物量添加於液體中。標記液體中標記物油：保可jy貞測之冷在約〇. 1至5〇〇〇 ppb範圍内，較佳在約^ 重里土底）經常内，尤其較佳在PPC2°o° _範圍二:記液體，:n:作為標記物之化合物，至少二：標記物之組合物，通常係以 U 液之形式添加。尤其以礦油而論，製備叶h合劑較佳為芳香族烴類，如曱笨，二曱笨:二二'合、之之溶族混合物。甲本或更商沸點之芳香為了避免此類具有太高黏性（因而計量力和操之供料溶液，標記物之總濃度通常設定在〇 5至5〇。/ 田艮）範圍内，以這些供料溶液之總量為基準。· 。重量比本發明更提供一例標記之液體中偵物吸收範圍中發射種在以本發明之方法測標記物之方法，其韓射之光源，和彳貞滴】或其較佳具體實施包括使用在該標記由該標記物再發射

503315

之螢光，該光源中至少一物之重疊吸收範圍中發射記物數目。個在至少一個標記物與另一標記輻射，且光源數目低於或等於標係二：二下定義：標記物M"波長範圍，於其中該消光双巧加到標記物Μ #吸收最大值數值為"X%波長FPV,T ，取大值數值之“或更多，將稱中卜己上 # 因為’例如’在較佳具體實施例 = 至6或2至4,…因此假設分 M3，或至6或1至4(分別相當於標記物Ml，M2， Μ3. Ζ，Μ1〇·，Μ2，Μ3，...，M5，M6，或M1 们，M4)。則對應區間分別為L1(x)，L2(x)， ::uo 或L1(x)，L2⑴，L3⑴，·..，L5(x): 為4 (X) IL2(X)，L3(X)，L4(X)。這些區間通常豹，但亦症夠為不連接。例如，特定區間L β(χ )亦月匕夠由一個或多個次區間組成’於該設定）稱之為Ly(x)。 τ —以聯σ 取=於標記物和/或欲標記之液體，χ之值能夠獨立選擇’或用以將標記物Μ “之吸收範圍"定義"為特定需求之函數。以欲標記液體之高吸收而論’例如，數值1〇，2〇，或甚至5〇對於X能夠是敏感的。相反地，例如，以具向吸收力之標記物和/或在所涵蓋波長範圍中具有些許吸丨收之欲標記液體而論，5或3之X值能夠是足夠的。根據這些x值，例如，L3(10)，L3(20)和L3(25)表示波長區間，於其中標記物M3之消光系數分別為M3吸收最大值數值之至少10% ’ 20%或25°/。。同樣地，例如，L3(5) *L3(3)係用以 503315 五、發明說明（29) 疋義波長區間，於其中標記物M3之消光糸數分別為M3吸收最大值數值之至少5%和3%。甚至能夠敏感地在整體標記物内使用不同X值。為了簡便，以下將L # (x)(表示標記物 Μ #之X%區間）僅寫為[# 。根據本發明標記所涵蓋之各種標記物Μ #之區間l #( χ) 疋義更於其個別之吸收光譜上發現，其係在對照環境下測定’頃經測定中使用之溶劑空白值校正。根據以上觀察，標記物Μ #吸收最大值同樣能约稱為區間L“x)e如此，則χ“;見例如80，90，95甚至99之數值要假。又為六種不同標記物Μ 1，Μ 2，M q MA ur 相當於一種較佳具體奋，，5和M6之說明例，其值6，產生區間LI，L2貝，t列，其中標記物數目n假設為數區域，以數學用語表示，3 ’ L4，L5和L6。該區間之重疊。它們能夠條理化列表為為其交集，此處因此稱為L “ ^

234563456 111112222 Lljlllll*ll I 一 •二 il II 11.==ii = ίί 234563456 lllllllllc.ccc.ccccc 111112222 lllllllll

4 5 6 5 LLLL0 c η n 3 3 3 4 L L L L

4 5 6 5 3 3 3 4 LLLL

ϋμμμΙΙμΙΙμ:! or Ur nr or /\ /ff\ /\ ( /19 /f\ #f\ /r\ /\ #f\ #c\ /f\ /V •2 \/ \/ \—/ \/ \/ *\/ \)# \/ \/ 234563456 =r==JI.==II = i/ II = 5 6 5

頁 3 3 第 503315 五、發明說明（30) L4 o*L6 = L46 (μ= 4, v= 6)和 L5 n L6 = L56 (μ = 5, v = 6) · · L#與本身之重疊區域（L μ y ，其中^ = μ )能夠類似定義

Ll n Ll = lAl = L1 (μ= 1, v= 1), L2 n L2 = L22 = L2 (μ= 2, v= 2), L3 n L3 = L33 = L3 (μ= 3, v= 3), L4 O L4 = L44 = L4 (μ = 4, v= 4), L5 〇 L5 = L55 = L5 (|.i = 5, v= 5)和 L6 〇 L6 = L66 = L6 (μ = 6, v = 6) ·

在總共n個標記物中，任二個標記物間可能的重疊區域數目N通常計算為N = n/2 .(11-1)。因此，在現有η等於6之例中，得到以上例舉之1 5個重疊區間。將預期個別的重疊區域L /ζ ^ (例如L34)理所當然等於L 2^ // (例如L43)，且因此不再進一步考慮。根據本發明，至少一個標記物之吸收範圍將與至少一個其它標記物之吸收區域重疊。以六個標記物Μ 1至Μ 6為例，這表示該1 5個重疊區域中至少一個必需為非空集合。可能性如下，例如： Α)所有鄰近波長區間L//和L( /ζ+1)形成非空白重豐（交集）；所有非鄰近波長區間L //和L ^ ( 2^ > μ +1 )不具有”更高η重疊（交集），即在各例中形成空集合，即：，對於 ^=#+1或^=# 一1 且

第34頁 503315 五、發明說明（31) 以上表示，僅存在重疊之說明例為L12，L23，L34，L45 和L56(且理所當然L11，L22，L33，L44，L55和L66等於區間LI，L2，L3，L4，L5和L6)。其它的重疊全部為空集 σ 藉由使用五個在這些重疊區域中發射之光源，因而所有六個標記物Ml至Μ6能夠被激發以再發射螢光，於該例中’各光源一次且同時激發二個標記物。通常，在區域 L12 ’ L23，· · · ，L(n_2) (n-1 )中發射之n-l個光源將激發^ 個標記物Μ #。此外，標記物Ml和Μη (例如Μ6)將各僅具有單一重疊區域（L12或L(n_l)n，例如L56)，而其它標記物 (例如M2至M5)將各具有二個重疊區域（例如，μ //具有區$ 1(#-1)#和乙#(#+1))。 Β )至少一個標記物Μ #將具有波長區間l # ，其與標記物 Μ( μ+2)之波長區間L( μ +2)交集，形成•，更高·，重疊L β (# +2)。倘若此”更高"重疊區域與標記物Μ( # +1)之波長區域重疊L(//+l)，其通常是如此，這將產生區間， U //+1)和 L( #+2)之"三重•’ 重疊 L/z( //+1)( //+2)。藉由使用在此區域中發射之光源，因而能夠同時激發標記物M A ，M( /z +1 )和M( # +2)以再發射螢光。以數學用語表示，运能夠公式化為··

第35頁 503315 五、發明說明（32) 在六個標記物Μ1至Μ 6之以上說明例中，這表示，例如，存在與區間L2(重疊L22)重疊之重疊區域L13，即形成交集 (1 AL3)门 L2=L1 门 L3 flL2 = Ll f!L2 flL3，類似上述二個區間之交集，其能夠縮寫為三個區間之交集L1 2 3 (或者通常為L// 。更立即顯而易見地： ^ U ν ω-Ιβ 〇) v=Ly ω β-L ν β ω = L ω μ ν = L ω ν β ，即所有"可排列"之區域彼此相等。例如，藉由使用三個在重疊L1 2 3，L4 5和L5 6中發射之光源，六個標記物Ml至Μ6能夠全部被激發以再發射螢光，該光源a(L123)同時激發該標記物Ml，M2和M3，光源a(L45)鲁和a(L5 6)分別一方面同時激發標記物M4和M5，另一方面M5 和M6 °或者，在後者中亦能夠使用不在區域L56，但僅在例如區域L66-L56中發射之光源，即在區間L6減L5和L6間之重疊（交集）中。這將僅激發標記物M6，標記物M5則否。倘若額外存在重疊L45 6，僅二個光源，分別各在區域 L123和L456發射，將足以激發全部六個標記物]〇至1^6之螢光發射’同時一方面激發標記物Ml，M2和M3之激發，另一方面M4，Μ5#σΜ6。其後’ Μ 將表示相較於標記物μ #彼此不重疊，但各具有吸收最大值之標記物。 _ 關於對應以上討論章節A )之混合物，即六種標記物μ 1至 Μ6之混合物，其具有區域L12，L23，L34，L45和L56(且理所當然區域Lll，L22，L33，L44，L55和L66等於區間LI， L2 ’ L3，L4，L5和L6)，所有標記物之激發能夠僅以五個

第36頁 503315 五、發明說明（33) 適當光源（稱為a(L/z y)，即a(L12)，a(L23)，a(L34)， a(L45)，和a(L56))達成。相反地，六個標記物M1，， M2’ ，M3’ ，M4’ ，M5，，和M6，之混合物不能以光源a(L12) 至a (L 5 6)激發以再發射螢光。此一混合物相當於先前技藝提出之混合物，例如在美國專利第5，5 2 5，5 1 6號中。以上討論之章節B )亦相同。此處單一光源a ( l 1 2 3 )發生標記物Μ1，Μ 2和Μ 3之激發。以標記物Μ 1，，Μ 2，和Μ 3，而論，僅標記物M2 ’將被激發，倘若其吸收最大值波長係在區域L1 2 3中。然而，標記物μ 1 ’和Μ 3 ’將不被此一光源激發以再發射螢光。 | 根據本發明，更能夠藉由使用具有重疊L1 23，L34， L55( = L5)和L66(=L6)之標記物Ml至Μ6標記液體。光源 a(L123) ’a(L34)，a(L55)和a(L66)將激發全部標記物。相反地，以標記物Ml’至M6，而論，這些光源僅發生標記物 M5’ ，Μ6’ ，以及可能M2’之激發，而非標記物Ml，，M3，和 M4，。此外，根據本發明，例如，能夠使用標記物Μ 1和M2之混合物’其（由定義）具有重疊L12。倘若，例如，標記物Ml 之吸收最大值波長區間（此”主要吸收範圍"能夠被定義為（如例如Ll(80)，L1(90)，L1(95)或Ll(99)(見以上）落於區域L12内所需要，則能夠一方面使用二個在標記物Ml和M2 個別吸收最大值範圍（或個別”主要吸收範圍"）中發射之光源 a(Ll)和 a(L2)，（例如一方面 Ll(80)，L1(90)，L1(95) 或 Ll(99)，另一方面 L2(80)，L2(90)，L2(95)或

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五、發明說明（34) L2(99))。由Ml再發射之螢光密度係藉由從光源a(Li)吸之輻射強度完全測定。相反地，由M2再發射之螢光宓声源自M2從重疊L,12中光源a(L2)和光源&(1^)吸收之輕^射度。以Ml,和M2’之混合物而論，由M1，或M2,再發射之個別螢光強度係完全由從光源a(L1 ) *a(L2)分別吸收之輻射測定。此一Ml，和Μ2’之混合物相當於先前技藝所提出之混合物，例如在美國專利第5，5 2 5，5 1 6號中。 ° 更能夠使用對應章節A )和/或Β )之標記物混合物，此類標記物不具有與其它標記物之重疊區域。作為進一步之包護免於欺騙誤認，亦能夠以偵測由各種定義之光源組合物丨· 激發之螢光而進行標記物之偵測。然而，以下為說明之具體實施例，並非限制本發明。實例1 ··標記物Ml至M4具有重疊L12，L23和L34。波長區間Ll(x) ’L2(x) ’L3(x)和L4(x)分別為標記物Ml至M4之吸收最大值（這些"主要吸收範圍"能夠定義為，例如， L/z(x)，其中X為例如80，90，95或99(%)，見以上），不具有與區域L12，L23和L34之重疊（交集）。組合 1·1 :使用光源a(Ll(x))，a(L2(x)，a(L3(x))和 a (L4 (x ))。該標記物再發射其個別螢光。不存在螢光之結I 合激發。組合1· 2 :使用光源a(L12)，a(L23)和a(L34)。標記物將歸因結合激發之個別螢光再發射^ a ( L1 2 )激發標記物Μ1 和Μ 2，a (L 2 3 )激發標記物Μ 2和Μ 3，a ( L 3 4 )激發標記物Μ 3和 Μ4，以再發射螢光。倘若標記物Μ1至Μ4同時被光源激發，

第38頁 503315 五、發明說明（35) 一方面由於a(L12)和a(L23)之激發，另一方面由於 a(L(23)和a(L34)之激發，將分別構成標記物M2和M3之螢光強度。倘若標記物被光源連續激發，則得到個別次光譜形式之再發射螢光，其顯示由於與前例不同之標記物Μ 2和 Μ 3螢光強度分佈。然而，這些（三個）次光譜能夠結合（以算術，例如，利用適合之電腦程式）形成前例之整體光譜。在一般例中，組合1 · 2中（結合激發）標記物Ml至Μ4螢光發射之強度分佈將與組合1 · 1之強度分佈不同。根據組合物1 · 1和1 · 2之偵測順序因而產生標記物混合物或包括此一標記物混合物之液體的”二層指紋”。當然，在組合丨.1 _ 和1 · 2中敘述之光源亦能夠彼此結合。實例2 ··標記物具有重疊L12，L23和L34。波長區間 Ll(x) ’L2(x) ’L3(x)和L4(x)分別為標記物Ml至M4之吸收最大值（這些”主要吸收範圍”能夠定義為，例如，L “（χ) ’其中χ為例如80，90，95或99(%)，見以上），具有與區域L12，L23和L34之重疊（交集），例如，L12PiLl(x)# {Φ} ’L23nL2(x)=^{(|)} ，L23nL3(x)#{(|)丨且 L34p| L4(x) Φ { Φ }。 (組合2· 1 ··使用光源a(Ll(x))，a(L2(x))，a(L3(x))和呀4(x))。標記物將其歸因結合激發之個別螢光再發射ϋ丨 a(Ll(x))激發標記物 Ml 和 M2，a(L2(x))和 a(L3(x))\ 記物M2和M3，且a(L4(x))激發標記物M3和M4，以再蘇發標 #。、射螢組合 2·2 :使用光源a(Ll(x))，a(L3(x))和 a(L4(x))

第39頁 503315 五、發明說明（36) 標記物將其歸因結合激發之個 1 fx)) ^ ^ λ/ y 1 u ο 、引愛光再發射。a(Ll(x))激發標圮物Ml和M2，a(L3(x))激放加、、私恭ρλ ^教發標記物M2和M3，a(L4(x)) 激發“ §己物Μ 3和Μ 4，以再蘇紅& ^ 妗泌路士考介處m a x射聲光。關於以光源同時或連縯激發’此處亦應用關於實似命a μ也4人0 ，，只例1組合1 · 2之註解。然而，強度比例與組合2 · 1以外者相|。組合2 · 3 :使用光源a ( l 1 ?、 /τη ./ ^ A 、iZ)，a(L23)和 a(L34)。標記物將其歸因結合激發之個別螢光再發射。a ( l丨2)激發標記物 Ml和M2a(L23)激發軚記物M2和㈣，a(L34)激發標記物M3 和M4以再發射螢光關於以光源同時或連續激發，此^ 亦應用關於實例1組合1. 2製造之註解。在一般例中，組合修 2. 3中標記物Ml至M4之螢光發射強度分佈將與組合2. }和 2 · 2之強度分佈相異。根據組合2 · 1，2 · 2和2 · 3之偵測順序因而產生一種標§己混合物或包括此一標記物混合物之液體的”二重指紋n。當然’在組合2 · 1，2 · 2和2 · 3中敘述之光源亦能夠彼此結合。根據本發明之標記液體，亦能夠且將預期使用標記物相對里不同之才示δ己物組合物。例如’液體能夠以一種標記物 Ml至Μ4之混合物標記，其中Μι : m2 ·· M3 : M4 = l : 1 ·· 1 : 1 ’而另一液體能夠以一種混合物標記，其比例為例如 2:1:1:1 ， 4:1:1:1 ， 8:1:1:1 ， 2:2:1:1 ,2:4:1:1 ， 2 ·· 8 : 1 : 1，4 : 4 : 1 : 1，4 : 8 : 1 : 1，8 : 8 : 1 : 1，2 : 2 ·· 2 : 1， 2:2:4:1 ， 2:2:8:1 ， 2:2:2:2 ,2:2:2:4 ， 2:2:2:8 或其適當排列之比例。倘若打算僅以固定標記混合物（例如Ml至M4)之不同濃度

第40頁 503315 五、發明說明（37) 標記不同液體，經常將選擇個別之濃度，所以液體與液體間以至少因數2相異，所以偵測之明確性可以受到保護。然而，較佳使用相對彼此不同莫耳比例之標記物混合物標記不同液體。在根據本發明標記之液體中，激發和偵測螢光之基本架構包括：一包含標記液體之樣品光析槽，一激發單元（A)，包括： α丨）一種光源，經常裝置準直器透鏡，和 α2)經常為一種平面鏡，其定位於遠離光源之樣品光析槽⑩ 邊上之光源對面，並反射透射之輻射以增加進入樣品之輻射強度，一偵測單元（D )，包括： 5!) —種光偵檢器（經常具備準直器透鏡），在其前面經常存在定位之光學濾光片（例如，截止或干擾濾光片）和選用之Ν I R偏光鏡，其配置方式使得沿其方向再發射之螢光係入射於其上（映像）並偵測，和 δ 2)經常為一種凹鏡，其係定位於遠離光檢器之樣品準質器面上的光偵檢器對面，並反射沿相對方向（遠離光偵檢鲁器）再發射之螢光，因此用以提高偵測之敏銳度。此一架構原則上於世界專利第W09 4/02 570號中說明（關於光源之照射方向係相異）。關於輻射方向，螢光不需要被平行偵測，但能夠以任何希望之角度垂直偵測。然而，顯然不包括0 °和1 8 0。之角度。

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五、發明說明（38) 以下觀察將以以下定義操作：標記物通常稱激發和偵測單元一般稱為A和D (見以上）為Μ。利用適當光源將激發單元調整至特定波長區間L “（" 或Lw#同義）’重疊或重疊““ 光源在標記物Μ v之波長區間L "内發射輻射，在標記 μ以ν間之重疊或在標記物Μ “ ，Μ ^和讨ω間之7y聂域内）係統一參照為A(Lp ω)，或簡寫〇^，或且者° 種此類單元係參照為A ^ ωι ’ ...，Α ^ ^ ，別假設為數值1至1 〇，1至6和1至4 ，例如，η等於2至10或2至6或2至4，參數"，ν和;;（或 & ’ . ·.，〜^ ’ . . . ，^ 和叫，...，ωη)能夠各分理所田然地，許多單元A# ^ ω由於^ ω之定義將是相等的’如以上頃敘述般。例如，因L丨23之定義為L丨n L2 nL3( = L3 flLl nL2=L2 DL3 nLl=L2 nu nL3 = Ll nL3 门 L2 = L3 DL2 DL1)，單元A123( #i = 1，心=2 且 ω3 = 3), A312( //3 = 3，v1 = l 且 ω2 = 2)，A231( #2 = 2，y3 = 3 且％二1)，A213( μ2 = 2，ή 且叫=3)，A132(〜=1，h = 3 且 ω2 = 2)和A321(/z3 = 3，y2 = 2且6^ = 1)係相同。這些與單一鲁單=相同之其它單元將不被進一步涵蓋，如同以最初既定重^:區域之定義’L# ^和[^ //為相等之重疊而論般。，理所當然地’較高’’重疊，，，即L # ^ ω %等等，和特定光源Α /ζ ν ω义等等，是可能的。然而，這些於此處將不再進一步考慮。

第42頁 503315 五、發明說明（39) Α β ，A # 和A a # #必需被認定為同義之專有名詞，並表示相同激發單元，其在標記物Μ #之波長區間L # ( =L # # /z)内發射輻射。一種特定偵測單元，其例如利用適當光學濾光片（和選用之偏光鏡），經特別調整至來自標記物Μ #之一再發射之螢光，係以D //表示（或者為偵測導槽# )。因此，例如，該三個標記物Μ1，M2和M3能夠被分配激發單元A1(=A11=A111) ，A2(=A22=A222) ，A3(=A33=A333)， A12(=A112=A122) ,A13(=A113=A133) ,A23(=A223=A233) 和A123，和適配偵測單元D1，D2和D3。（此外，例如，對於二個標記物M1和M2 (倘若存在重疊 L1 2 )，該標記物Μ1和Μ 2之螢光亦能夠利用相同單元A丨2激發。然後利用個別單元D 1和D 2彳貞測螢光。則激發和彳貞測之結合能夠被寫為A1 2/D1和A1 2/D2。倘若，在激發單元A内，個別重疊L // v ω之適配僅經由利用適當光源a! // ν ω而發生（即在標記物Μ #波長區間内後來的發射輻射，在標記物Μ #和Μ ν間之重疊區域内，或特定標記物Μ #，Μ ν和Μ ω間之重疊區域内發射轄射内）’以η個標記物而論，這係以a ( //1 ν i ω〗，· · ·，表示，其中，例如，對於η等於2至10或2至6或2 至4，參數以1，··· ，#η，心，··· ，2^和叫，··· ，ωη 能夠每一個分別假設為數值1至1 0或1至6或1至4。例如， A(lll，112，223)( = A(1,12,23))表示一激發單元，其利用光源，¢^112(=0^12)，和 ^223( = 〇^23)

第43頁 503315 五、發明說明（40) ，能夠一方面配合標記物Μ1之波長區間l 1 (重疊L 1 1 1 )和標記物Ml和M2之重疊L1 2和L23，另一方面配合ο和M3。關於偵測單元D #，其中來自個別標記物μ #再發射之螢光的適配，全然藉由利用適當光偵檢器和/或光學濾光片 (和選用之偏光鏡）完成，以η個標記物而論，分別以 D(l，2)，D(1，2,3)等等，到〇(1，2,3，...，9，10)，或 D(l,2)，D(1，2,3)等等，到D(1，2，._，5,6)，！D(1，2)， D ( 1，2，3 )，D ( 1，2，3，4 )表示，此處η分別例如依次為2至1 0 或2至δ或2至4 〇 •倘若η個標記物Μ #之重疊L // ν ω，其中η再次例如為2 _ 至10或2至6或2至4，係各分別被與其配合之單元Α /ζ ν ω 激發，且由個別標記物Μ //再發射之螢光係以D #偵測，這是分別以，A//2y26j2/D2，···"等等，至 A //9 ^9 ω9 / D 9 5 Α βιο ν ιο ω1〇β10Η ，或"Α/Ζι ， A u2 p2 oj2/D2 ，· · ·"等等，至"· · · A w5/D5 ， A ω6ϋθπ ，或"A 】o^/Dl ^ k β2 v2 ω2/ϋ2 , A "3 v3 w3/D3，A g4/D4n 之標註表示。倘若該n個標記物Μ #之重疊L /z v ω係使用適當數目之單元A # ω同時激發，且其再發射螢光係使用η個單元 | D “ 同時偵測，這記為"A α ν 1 ω! / A //2 ν 2 ω2 / · · · / Α /ζ η ν η 0n/Dl/D2/··. /Dn"。否主·根據以上’能夠存在η或其它更少之單元A // v 。然而，為了簡便，這記為·，A a v! ω! / Α μ2 2 ω2/· · · / A /zn ^ ωη/" 〇

第44頁 503315 五、發明^^(41) " ~ - 钩若該η個標記物之重疊L /z v ω係使用適當壑s 一 Δ η 双目之早70 一以ρ ω同時激發，且由標記物μ #再發射之螢光係使用單元D读測，例如一種多波長偵測器（由光學發散元件，例如 "稜鏡或隔膜，和直線或面積偵測器組成），這係記為基本上，在以單元A激發之標記樣品間必需由以下作區分， ί )以相同之樣品體積或 1 1 )以不同之樣品體積。於案I)中，能夠使用以下方法和說明架構作為该測設備 1 (此處η為例如2至1〇或2至6或2至4): h 1)A a 岣/Dl，A v2 w2/D2，· · ·，A ^ 1 % 1 /Dn-1 ’ A χ；η gn/Dn(該n個標記物係各在重疊L # v ω中由其對應單元A # ν ω激發，標記物Μ //之螢光發射係各以單元D #偵測）。 a)架構基本上相當於文初所提及和在世界專利第μ 94/025 70號中所說明之架構。差異處在於各標記物Μ #係使用特疋單元A# ^ 0和1)#。這能夠採取許多對單元a# υ ω和D # (等於欲偵測之標記物數目）放射狀圍繞樣品光丨析槽之空間分枝排列方式。後者其後較佳具有一種圓截1 面。、然而’由單元Α # ν ω照射之樣品體積（或樣品路徑）全然不相同。但激發射線（位於一個平面中）於常見之樣品體積内父錯。許多單元A // ω能夠（且通常是）相同的。例如’以二個標記物Μ1至Μ 3而論（例如，具有重疊L 1 2和

第45頁 503315 五、發明說明（42) '~~" L23) ’ 特定（三個）配對 A12/D1，A12/D2*A23/D3 或者 A12/D1 ’ A23/D2和A2 3/D3能夠被用於激發和偵測。該11個標記物Μ #之激發與偵測結合不僅能夠是連續，而且時發生。 b )架構基本上相當於文初所提及和在世界專利第㈣ 94/j25 70號中所說明之架構。差異處在於光源αι # ν ω 和單元A # ^ ω #之光偵檢器\ #係各定位於特定旋 ΐ台代獨立平面鏡α2 #ν ω和凹面鏡5…於此例甲’ ·、、、頁…、'在各例中僅使用一個固定面或凹面鏡）。測標記物Μ Α ，以轉動個別旋轉台將對應和斜雍伞：目if邸Ρ 4 μ Ρ ω 樣si:二，“分別移人激發和彳貞測位置中。通過標記 7 田射樣品體積之射線軌道對於各欲測定之；Ρ 。以11個軚圮物Μ //之激發和偵測結合能夠僅連續發 4^· 端2以使用一種圓柱形樣品光析槽1能夠在- 將與光析槽相同之材料製成之視窗密#，或者1 將一 h社、封且較佳具有側邊樣品出二能夠被定之光源鏡取代個別平ΪΪ (於其中顯然僅使用-個固定平面射平行於光：=γω)。個別單元“〜於是照個別次單元5 刎早兀1^ β (此期間附隨其置於其上（因此她μ μ i 九析才曰周圍以放射狀例中再發射之替 _ )，以#、測各之螢先。该η個標記物M #之激發和偵測結合僅

第46頁 503315 五、發明說明（43) '^^—- 能夠連續發生（當然，假定由許多標記物同時再發射光能約以單元D //同時貞測）。、營 I.2)A/D1，A/D2 ’··· ，A/Dn-1，A/Dn(n 個標記物^^ 全部以一種’’複光”光源同時激發，並利用其個別偵測導样^ ° 偵測）。、、曰β a )架構能夠類似I · 1 )之b )中所述。然而，不使用次單元 «! # υ ω之特定旋轉台，使用一個複光激發單元a。谓測係根據I· 1)之b)中所述之架構完成。該η個標記物!^ A之激發和偵測僅能夠連續發生。 b)倘若，根據I· 1)之c)中所述之架構，例如使用一種# 柱形樣品光析槽，則單元A將照射平行光析槽縱轴之樣品。個別單元D //能夠再次於該處沿樣品光析槽周圍以放射狀配置（因此於各例中係與激發光線之輻射方向垂直）。該η個標記物μ #之激發和偵測組合能夠連續且同時發生。 v χ ωχ/ϋ } λ μ2 ν 2 ω2/ϋ jA^n-i ν η-\ ωη-ι /D 5 Α "η ωη/β(該η個標記物Μ β係各於重疊L # ω中以對應單元Α /χ ν ω激發，且標記物Μ #之螢光發射係各以單元 D #偵測）。口 a)架構能夠類似I · 1 )之b)中所述。然而，不使用光偵檢· 二占1 A之特定旋轉台，僅使用一個债測單元ρ，例如使用一種多波長偵測器。激發係根據I · 1 )之b )中所述的架構完成。該η個標記物Μ #之激發和偵測僅能夠連續發生。 b)倘若’根據I · 1 )之c )中所述之架構，例如使用一種圓柱化樣dct光析槽’則單元D彳貞測平行光析槽縱轴之再發射

第47頁 503315 五、發明說明（44) 螢光。個別單元A # y ω(與其對應平面鏡a 能夠於該處沿樣品光析槽周圍以放射狀配置2( / 〇 —起）槽縱軸垂直）^該η個標記以之激發和偵，與光析續且同時發生。、成合能夠連因此，將此處所述之架構可能性與][· 2 )之3 ) 者對fl?、，僅激發和偵測單元之空間交換不同。）中所述 1.4) A (μίνΐω!, μ2ν2〇)2, · · Α(μΐνΐω^μ2ν2ω2,·· Α(μΐνιωι /μ2ν2ω2# .. A(^ijVjQi ,μ2ν2ω2ί .. 'Mn'iVnqcOr^ , μηνηωη) /D1, 'μη-1νΑ-1〇)η-ΐ, μηνηωη) /D2 , · · ^ Μη-ινη-1ωη_1, μηνηωη) /Dn~l r 'Μη-ινη-ιωη小 μηνηωη) /Dn (該η個標記物Μ #係各於重疊l // ν ω中被激發，個別偵測導槽D #偵測）。

並利用其 a)架構能夠類似I · 2·)之a)中所述。然而，以包含，例、例），可交換光源〇； 1 β ω之激發單元a取代光源α 之旋轉台。此外，然而，Α亦能夠包含許多光源α 1 a ^二 ’其個別輻射，例如（例％ )，係利用光源個別射線之光纖或光纖束或同直線疊加而導向，使用光學元件，例如光束分散鏡，二色光束分散鏡，隔膜等等，以一種分別進入同位置之樣品光析槽之方式。個別螢光係根據I · 2 )之a )中所述之架構偵測。該n個標記物Μ #之激發和偵測結合僅能夠連續發生。 b )倘若，根據I · 1 ) )中所述之架構，使用一種圓柱形樣品光析槽，例如，則a )中所述之早元A (例A或例& )將照射平行光析槽縱軸之樣品。個別單元D #此夠再人於该處

第48頁 503315 五、發明說明（45) 沿樣品光析槽周圍以放射狀配置（因此在各例中與激發光之輻射方向垂直）。使用對應例&之單元A，該n個標記物 Μ #之激發和偵測結合僅能夠連續發生。使用對應例^之單元A，該η個標記物μ #之激發和偵測結合能夠連續且假定亦同時發生。 I. 5)Α βχ w^DCl, 2, . . . , n-1, n) 5 A /z2 卜 ω2/0(1, 2, · · ·，n-i, n)，· · ·， A ωηΜ / D( 1，2，···，η-1，η)， A/zn νηωη/Ι)(1，2，···，η-l，n)，（該n個標記物Μ μ 係各於重疊L /z v ω中以其對應單元a # v ω激發並偵測）。 < a )該架構能夠類似丨· 1 ) )中所述。不使用光偵檢器心μ之特定旋轉台，使用一種偵測單元d，其例如（例〜）包含可父換光偵檢器和/或可交換光學濾光片（和選用之偏光鏡）（5】。此外，然而，D亦能夠包含許多光偵檢器心μ，個別再發射螢光例如（例心）利用光纖或光纖束通過該處。激發係根據I·丨）之^中所述之架構進行。該η個標記物Μ //之激發和偵測結合僅能夠連續發生。 b)倘若，根據I· 1)之㈠中所述之架構，使用一種圓柱形樣品光析槽，例如，a)中所述之單U(例^或例將债測各例中平行光析槽縱軸之再發射螢光。個別單元a #以ω 能夠再次於該處沿樣品光析槽周圍以放射狀配置（因此於各= >中與光析槽縱軸垂直）。使用對應例％之單元d，該η 個標記物Μ //之激發和偵測結合僅能夠連續發生。應例a2之單元D，_個標記物激發和铺測結合能夠

川 3315 五、發明說明（46) 連續且假定亦同時發生。 1 · ^ 2^1 ωι ， μ2 ω2 ，· · · ， ^η-1 ν^{ ω〇_ι ， βηWn)/D(l，2, · · ·，η-1，n)(該n 個標記物Μ # 係各於重豐L # ^ ω中激發並偵測）。架構能夠使用激發早元A完成’该單元，例如（例ai)，包含可交換光源α 1 /z ^ ω或光源α 1 V ^ ω ，其個別輻射’例如（例a2)，係利用光源個別射線之光纖或光纖束或同直線疊加導向，使用光學元件，例如光束分散鏡，二色光束分散鏡，隔膜等等，以一種輕射分別進入同位置之樣品光析槽之方式。因此能夠使用一種偵測單元D，其包含鲁例如（例a!)可交換光债檢器和/或可交換光學濾光片（和選用之偏光鏡）51 #或其它許多光偵檢器（5 i #，個別再發射螢光例如（例)利用光纖或光纖束通過該處。關於例a (例 a! ) / D (例 ai)，A (例 a〗）/ D (例 a2)和 A (例 a2) / D (例 ai),該 η 個標記物Μ #之激發和偵測結合僅能夠連續發生。關於例 Α (例as ) / D (例)，該η個標記物Μ #之激發和彳貞測結合能夠連續且假定亦同時發生。

此處激發和福測單元間之幾何關係基本上相當於文初和世界專利第W0 94/ 02570號中所述之情況。 I. 7)Α βχ νλ ωλ/k β2 ν2 ω2/. . . /α μη^ ν ωηΜ/Α μη νη ωη) /D1/D2/· · · / Dn-l/Dn(該η個標記物μ //係於重疊中以對應單元A #同時激發，並以單元d #同時偵測）。該η個標記物之同時激發和偵測原則上係使用丨· 1 )之a) 中，I· 2)之b)中，I· 3)之b)中，Γ· 4)之b)的例a2 中，I· 5)

第50頁 503315 五、發明說明（47)

之b)的例中和I · 6 )之A (例a?) / D (例as)中所述之幾何進行0 在例11)中，即在不同樣品體積中進行激發，以下架構和偵測設備之方法及說明方式能夠找到應用（此處假設為例如數值2至1〇或2至6或2至4): II.1)A1/D1 ’A2/D2 ’··· ，An-l/Dn-l ，An/Dn(該η 個標兮己物Μ #係各於重疊1^//^〇中以對應單元人//以6；激發，並以個別之單元D #偵測）。個別配對A # ^ ω / D μ之排列基本上相當於在文初和 I· 1)之a)中所解釋，並於世界專利第w〇 94/〇25 7〇號中所鲁述之幾何。也就是說，單元A# ν ω之光軸（相當於激發光束之方向）和對應單元D #之光軸係位於一平面中，該平面對於樣品光析槽之縱軸是垂直的。這二個光軸以以下定義為條件，形成在0 °和1 8 〇。範圍内之角度χ :當沿單位 Α # ^ ω之照射方向投影時，此角度將為+ χ或一 χ ，取決於對應單元D μ是否分別定位於此投影方向之右或左方0此分別以標註Α /ζ ρ ω( + )1) #和a #以—)D //作為 '己號；即一方面為Α Α ^ ω!( +)D1，A /z2 h ω2( +)D2， A#3p3〇3(+)D3 荨等，另一方面為 Α#ι2^ιωι(_)β1 ， A^2 ω2( — )D2，A〜—）D3等等。空間不同之樣 σ 口體積的激發係藉由在平行面中排列個別配對A # 2； ω / 而70成。平面之順序能夠以Aa ， “2 h ω2( +)D2，Α ω“ +)D3，· · ·，A "n Vn 吨 (+)Dn之形式（其等於以A^ihUi(_)D1，a〜V2W2

第51頁 503315 五、發明說明（48) (—)D2 *A^3 _ )，··· 式），或者例如以A/Z! 2^6^(+)1)1 A A ^ ω3( +)D3 ’ ...，A #ni A#n^n0n(+/~)Dn 之形式。倘若，係排成排，則於前例中單元D #同樣在 (右手邊）排成一排，在 λ 後者中則在樣品光析槽之對侧排成二排二/ ::這經常僅當各單元Α-…發：Τ可〗依然垂直入射樣品光析槽之外部平面上時才被涵务先這將是具有長方形截面之井狀^ u 通料田I尤析槽，而非具圓載面者β 這些平面亦能夠相對於狨士 ^ 了於谈此而旋轉。當沿光析槽縱細执影時，屬於二個相鄰單元Α 袖心 ^ M la— 早兀之光軸形成在0至36〇。範圍内的角度。例如，當n^9 Q c , _ .. 田η馮2，3，4，5或6時（且以正當之螺旋排列而論），相鄰嚴分Α 仰那早兀Α/ζ 產生之角度將為ι80 ’ 120，90，72或60。。對於η為3，4，5或6時，所涵蓋之角度240 ，270 ，288 ，和3〇〇。（或_12〇，_9〇，_?2 或_6〇。 )將暗示排列之對應相反螺旋（以n等於2而論，即18〇β ，為不存在）。此外可以注意到，理所當然此處亦能夠存在一些平面，其不僅根據A仏卜ω1( + )D1，A a 叫 (+)D2 Αμ3 ν3ω3(+)Β3 ’ ，A"n Vn<yn(+)Dn 之順序，（其等於h%(-)Di，〇2 ，、 A A ^ω3(—)D3 ，A〜yn%(_)Dn 之順序），但類似例如以^1(+)D1，“2_2(_)1)2，a^m3 (+)D3 ... A un_1 p ω,,^ ( _/ +)Dn-i ^ k βη vn c〇n ( +

A u' ωη( —)Dn 之形〉2ω2(— )D2卜iC 〜/ + )Dn-l j 例如，單元A // y (〇側平面移動是可_ 常

503315 五、發明說明（49) / -)Dn之順序。對於n等於2(18()。）或4(9〇。），習慣上使用具有長方截面之光析槽，而對於η等於3(丨2〇。）， 5(72 ° )或6(60。），習慣上將使用（對於η等於2或4，這當然也是可能）具有圓截面之光析槽。該η個標記物μ #之激發和偵測結合不僅能夠同時，亦能夠使用所述之排列連續進行。、 2)Α βχ ω]/ϋ . Α ω2/〇 .... , Α ω〇 ι ，Α 〇n/D(該η個標記物μ以係各於重最庫、a )單元A v ω之排列能夠根據π · j ) 成。倘若單元Λ μ ν ω係排成一排（例aU，。。疋定接合於特定之位[條件為其;J二早-:能夠被固或者使用一種特定映像光學。否則（例口視自足夠大 (移動）再調整以成為特定位置。以單元2a ，必需進行一種 =它排列而論，必需進行一種單元D之// ω (例％ )之 i ’成為對應之Z —位置。因此，在例a 和轉動）再調 M “之激發和偵測結合不僅能夠同時;I，該η個標記物但在例h和a3中僅為連續。彳一亦能夠連續發生， ^原則上沿1.3)之b)中之直線排列亦·

“軸係平行於圓柱形樣品光析槽之。忐；即單元D 不？ ω係根據Η.1)之既定方向排列;块且單元之i之路徑長度，其必需以個別標記物μ ::、r ’這將產生之路徑上再發射之瑩光通過樣品，且以在其到達單元[ 將以不同固體角 503315 五、發明說明（50) 度落於單元D上（或者，更明確地，偵 ^处夠導致偵測之強度不正續，或者二二、二視。&月匕 & ^ 4者汗估时必需特別者虞。麸排列中，該°個標記物M"之激發和;; 測結合不僅旎夠同時，而且連續發生。 ^I.3)A //j ν γ 6Ji/D(12 n-1 n、 a /DC1 9 ' 、 ·· ）， A "2 ^ % n/，; ，···，η ，n)，··· liAVDdj，··，。i，夂於舌Wn/D(1，2, · · ·，n —l n)，（該11 個標記物M // 係各於重璧L# u ω中以對應單元^ ω激發並偵測）。 a)排列基本上相當於11.2)之〇中所例舉者。然而，不使用一個單元D(例如多波長偵測器），而使用一種福測單元、，例如（例ai)，其包含可交換光偵檢器和/或可交換光學濾光片（和選用之偏光鏡）h # 。此外，然而，D亦能夠包含許多光偵檢器L //，個別再發射螢光利用例如光纖或光纖束而到達該處（例心）。以對應例七之單元D，該η個標記物Μ #之激發和偵測結合僅能夠連續發生，因為將需要改變次單元心#，且視需要亦再調整單元D之（移動而或移動和轉動）。以對應例心之單元D，該^個標記物Μ #之激發和偵測組合能夠連續亦可能同時發生（既定單元 A // ρ ω之適當排列），倘若，例如，經由適當光學設備，發生螢光光束（例如利用光學透鏡）同時由標記物Μ “再發射於光纖或光束上。 b )排列基本上相當於點11 · 2 )之b )中所例舉者。不使用一個單元D(例如多波長偵測器），使用一種销測單元’例如（例ai)，其包含可交換光偵檢器和/或可交換光

503315 五、發明說明（51) 學濾光片（和選用之偏光鏡）之偵測單元I # 。此外，怒而，D亦能夠包含許多光偵檢器& 個別再發射營’光用例如光纖或光纖束而導向至該光偵檢器（例〜）。以對鹿例ai之單元D而論，該n個標記物Μ //之激發和偵測結人僅' 能夠連續發生。以對應例％之單元D而論，該η個標記"物 Μ #之激發和偵測結合能夠連續，且假定亦同時^。在 II.:)下於b)中之觀察’此處當然亦應用關於由標記物再發射之螢光不同路徑長度和固體角度。 Π. 4)Α βι νχ ωι/Α β2 ν2 ω2/. . . Α/ /Ζη ΐ ΐ ω^η ^ ^ A)/D1(D2/. . . /Dn-l/Dn (該η個標記"係各於重』/鲁以ω中以對應單元a # w ω同時激各一測）。町救發，亚以早tcD μ同時偵該η個標記物之同時激發和偵夠使用II. U，Π 2)中所述^原則上在a)之例ai)中能 _2)則使用ί ί, 2)之b) W h 3二=幾何^，而在a)之為II.3)所述者。）所迷者，且在b)之例中例I中架構读測之排列和說明激#而认，式，即以同樣品體積之 ΐ 標記物M…序連續激發尤其有例π中架構偵測之排列和說之激f m 式，即以不同樣品體積 <双知向哪，對於全部η個標印只當。此外，、士 , 知。己物Μ #之同時激發尤其適在各例中再發射之'螢光能夠 ^和說明方式中’其中其特別有。约在不同空間位置被同時偵測尤

五、發明說明（52) 連t二’、由單元八# ^ ω發射之激發光能夠以脈衝形式或自=„式’即以連續波（cw,)形式照射於樣品t。此外，來所以Γ ^ ω之激發光強度能夠以頻率ί A 2^ ω調整，調敕总Γ Αω將激發該標記物M a之類f # ^ 0強度此ί款瓶ί射’其能夠以D ^選擇性測量。習慣上不需要此頻ίΐί數fί主要網路頻率（.經f為5’）不㈤，以及 M a再私射I技半正數倍。以同時激發和偵測全部標記物成將螢，光r屬營於光而論，不同調整頻率f # ^ ω能夠用以達訊比例。：慣二：標記物…以及-種較佳之信號-雜調整之螢光信號。關閉法（Iock_in method)偵測經強度明之方J二：’巧實施例，用以在頃根據本發择rb _中偵測標記物’包括，在相Π嫂〇 f 積中，將η個標記物以枯纟相同樣口口肢以及（按序連續）偵测^應早兀A # υ ω按序連續激發， -種本發明再發射之營光。據本發明之方法伊却 V ^佳具體實施例，用以在頃根樣品體積中，將n個體、中销測標記物’包括，於相同發，以及利用多波俏以其對應I元A "以ω同時激之螢光。、Μ器同時或連續偵測由各Μ //再發射一種本發明方法之一上據本發明之方法標記二^佳具體實施例，用以在頃根樣品體積中，將n個輕X肢、偵測標記物，包括，於相同用多波偵測器同時以複光單元A同時激發，以及利 ¥次連績债測由各M/z再發射之螢光。五、發明說明（53) 一種本發明方法 _ i ^〜據本發明之方法产:v較佳具體實施例，用以在頃招樣品體積中，將^ 43^：液體中偵測標記物，包括，於相回X A " ω強度同‘激‘:己：以頻：f " ?調整之個別單：射經強度調整之個別&螢光以。及同時或連續偵測由各Μ β再發一種本發明方法 — 據本發明之方，二V較佳具體實施例，用以在

體積中，將體中偵測標記物，包括，在X 貝T將η個標記物以覃开a ,, 在不同用個別單元！）“ ^ ω於同時激發，以及單元a " ω較佳t m測由各μ “再發射之鸯光。態雷射作為光源。：：m雷射，半導體二極管或固，部份將於其主#明丨^ ω。倘右該標記物Μ〆中全部戍 8。，9。，1或99):單^ 〜“ ^ ω較佳Α车^:兀#" ω中使用之光源射，其在光，Ή體雷射，半導體二極管或固態雷區域内具有^ 100宅微米延伸至U20毫微米之最大值之波‘：：值’其中、x為個別標記物Μ P及收 # > t Φ 廷些發射最大值於是通常在個％對應主要吸收範圍内。缺而：§己物之適當選擇X採取主要夕明此r m 亦犯夠如前述般經由尤指：ΓΛ二'光餘器~"較有利為半導體❹“，4 枝二尤一極官或鍺光二極管。 j。° 二右‘屺物Μ “中全部或一部份將於苴 “⑴内被激發(其中χ為例如80，9。、；=收， D #之光偵檢器3 朵與或9 9 )，在早兀 1 “中使用之先予4光片較佳為干擾濾光

第57頁五、發明說明（54) 米物和/或截止濾光片，发* ^ , 之區域内具有短波傳遞戴：從其延伸至Amax + 80毫微為個別對應標記 MU之吸收最大值波長。視需要亦能夠額外使用一個或多個N J R偏光鏡。以下實例係說明本發明。實例1 ··

將 0·5 ppm A(PcH2 -（3’ -曱基苯氧基）4)和〇·5 ppm B ((PcH2-(3’ -曱基六氫吡啶基入）之混合物溶於無鉛汽油引擎燃料（RON 95)中，Pel表示酞青素系統，其中Mel(化學籲式I a)為二個氫’在各例中於化學式I a内配對和r4，妒和 R8，R9和R12以及R13和R16中一個反應基為氫，而另一個分別為3’ -甲基苯氧基或3’ -曱基六氫吡啶基。標記物A和B之吸收光譜，在所使用雷射之6 8 5和7 5 4毫微米波長具有表1中所例舉之吸收（於任意單元中）：表1 雷射吸收A 吸收B 685¾微米 1.3151 0.3137 754毫微米 0.0171 "——- 0.9954 ^—-——

能夠看到，以6 8 5毫微米雷射激發a亦將同時激發b，雖然到達較小延伸。

第58頁 503315 五、發明說明（55) 當以68 5毫微米雷射激發A並以754毫微米雷射發二螢光信號係由因為以685毫微米雷射激發B ‘組份和因為以754毫微米雷射激發8之組份組成。 f使用Α和一種（不實）標記物β，時，其不具區域，並以6 85毫微米雷射激發Α和以754毫微;；之重/ Β’ ，在Β，螢光區域内測量之螢光_ 一田射激毛微米雷射激發Β，之.量小。 ^將比不存在以685毫广:严，標記物混合物(或者，精確^ 。為才示§己液體）強度，-方面能夠測定當同時過標記物“Β螢光區域内特定渡光：通广測定以一個雷射激發和以另一雷二;=強满 Ϊ例2H則量值一起形成—種（可能之）特定指紋。將〇· 5 ppm B((PcH2-(3’〜曱基六氫吡啶美 c (nCh2-(0C4h9)8)之混合⑯溶於無心;.卿 95) t-NcH2 ^ ^ ^ ^ ^ ^ t Me2( 全部為〇c4H9。和Y，Y。和mY>Y8 =物之吸收，，在所使用雷射之754和85 未波長具有表2中所例舉之吸收（於任意單元中）： ^

第59頁川 3315 五、發明說明（56) 表2 雷射吸收B 吸收C 754毫微米 09954 ~ 0.3824 ' 855亳微米 0.0037^_ 1.9860 -- 能夠看到，以754毫微米雷射激發β亦同時激發c，到達較小延伸。當以754毫微米雷射激並以855毫微米雷射激發c時，丨來自c之螢光信號係由因為以754毫微米雷射激發c之組份和因為以8 5 5宅微米雷射激發c之組份組成。當使用B和一種（不實）標記物c，時，其不具有與B之重疊區域，並以754毫微米雷射激發B和以855毫微米雷射激發 C ’在c’螢光區域内測量之螢光信號將比不存在以754毫微米雷射激發C’之量小。此外，為了再確認B和C標記物混合物之強度，能夠測定同時和個別激發之螢光信號，如先前於實例1中般進行。實例3 : 將化合物A，Β和C各0· 5 ppm之混合物溶於無鉛汽油引擎燃料（RON 95)中，並以685，754和855毫微米之三種雷射同時激發。將產生之螢光通過三個波帶濾光片（傳遞波長為7 2 0，7 9 0和8 6 0毫微米）濾光，並利用矽針二極管偵測。得到表3中所例舉之螢光強度（任意單元）：

第60頁 503315 五、發明說明（57) 表3 波帶濾光片螢光信號 720毫微米 2,705 790毫微米 572 855毫微米 1,589 實例4 將 2/9(0.22) ppm 化合物A，8/9(0.88) ppm 化合物B 和 8 / 9 ( 0 · 8 8 ) p pm化合物C之混合物溶於無錯汽油引擎燃料 _ (RON 95)中，並以685，754和855毫微米之三種雷射同時激發。將產生之螢光通過三個波帶濾光片（傳遞波長為 7 2 0，7 9 0和8 6 0毫微米）濾光，並利用矽針二極管偵測。得到表4中所例舉之螢光強度（任意單元）：表4 波帶遽光片螢光信號 720毫微米 2,340 790毫微米 950 855毫微米 · 2,705 從實例3和4 (既定特定刻度），經由其螢光信號強度能夠區別標記物之不同相對比例以及標記物之不同絕對量。

第61頁

Claims

503315 於 2B 馬_ 中言軎塞洚1丨.-aJSL 58106^ …年^月曰修正本 1 . 一種使用至少記物在光譜之6 0 0 -且至少一個標記物收範圍重疊，其中屬之酞青素，無金合物，芳香族胺之酸染料和克酮酸染 2. 根據申請專利其個別吸收最大值内。 3. 根據申請專利標記物，η為整數2 4. 根據申請專利標記物，η為整數2 5. 根據申請專利標記物，η為整數2 6. —種在根據申中偵測標記物之方發射輻射之光源，源中至少一個在至重疊吸收範圍内發數目。 7. 根據申請專利體雷射，半.導體二範圍至1 0 範圍至6 範圍至4 請專法，二個標記物標記液體之方法，其中該標 1 2 0 0毫微米區域内吸收並再發射螢光，之吸收範圍與至少一個其它標記物之吸添加之標記物僅可以選自無金屬和含金屬和含金屬之萘青素，鎳-二硫醇烯錯銨自由基鹽化合物，次甲基染料，方形料。範圍第1項之方法，其中使用之標記物波長係在光譜之6 0 0 - 1 2 0 0毫微米區域第1或2項之方法，其中係添加η個第1或2項之方法，其中係添加η個第1或2項之方法，其中係添加η個利範圍第1或2項之方法標記之液體其包括使用在該標記物吸收範圍内並偵測由該標記物再發射之螢光，該光少一個標記物與至少一個其它標記物之射輻射，且光源數目低於或等於標記物範圍第6項之方法，其中該光源為半導極管或固態雷射。

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