TW421673B - Trehalose-releasing enzyme, and its preparation and uses - Google Patents

Trehalose-releasing enzyme, and its preparation and uses Download PDF

Info

Publication number
TW421673B
TW421673B TW083105726A TW83105726A TW421673B TW 421673 B TW421673 B TW 421673B TW 083105726 A TW083105726 A TW 083105726A TW 83105726 A TW83105726 A TW 83105726A TW 421673 B TW421673 B TW 421673B
Authority
TW
Taiwan
Prior art keywords
trehalose
enzyme
patent application
scope
item
Prior art date
Application number
TW083105726A
Other languages
English (en)
Inventor
Kazuhiko Maruta
Michio Kubota
Toshiyuki Sugimoto
Toshio Miyake
Original Assignee
Hayashibara Biochem Lab
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Hayashibara Biochem Lab filed Critical Hayashibara Biochem Lab
Application granted granted Critical
Publication of TW421673B publication Critical patent/TW421673B/zh

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C13—SUGAR INDUSTRY
    • C13K—SACCHARIDES OBTAINED FROM NATURAL SOURCES OR BY HYDROLYSIS OF NATURALLY OCCURRING DISACCHARIDES, OLIGOSACCHARIDES OR POLYSACCHARIDES
    • C13K13/00—Sugars not otherwise provided for in this class
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A21—BAKING; EDIBLE DOUGHS
    • A21D—TREATMENT, e.g. PRESERVATION, OF FLOUR OR DOUGH, e.g. BY ADDITION OF MATERIALS; BAKING; BAKERY PRODUCTS; PRESERVATION THEREOF
    • A21D2/00—Treatment of flour or dough by adding materials thereto before or during baking
    • A21D2/08—Treatment of flour or dough by adding materials thereto before or during baking by adding organic substances
    • A21D2/14—Organic oxygen compounds
    • A21D2/18—Carbohydrates
    • A21D2/181—Sugars or sugar alcohols
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A21—BAKING; EDIBLE DOUGHS
    • A21D—TREATMENT, e.g. PRESERVATION, OF FLOUR OR DOUGH, e.g. BY ADDITION OF MATERIALS; BAKING; BAKERY PRODUCTS; PRESERVATION THEREOF
    • A21D2/00—Treatment of flour or dough by adding materials thereto before or during baking
    • A21D2/08—Treatment of flour or dough by adding materials thereto before or during baking by adding organic substances
    • A21D2/14—Organic oxygen compounds
    • A21D2/18—Carbohydrates
    • A21D2/186—Starches; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A21—BAKING; EDIBLE DOUGHS
    • A21D—TREATMENT, e.g. PRESERVATION, OF FLOUR OR DOUGH, e.g. BY ADDITION OF MATERIALS; BAKING; BAKERY PRODUCTS; PRESERVATION THEREOF
    • A21D8/00—Methods for preparing or baking dough
    • A21D8/02—Methods for preparing dough; Treating dough prior to baking
    • A21D8/04—Methods for preparing dough; Treating dough prior to baking treating dough with microorganisms or enzymes
    • A21D8/042—Methods for preparing dough; Treating dough prior to baking treating dough with microorganisms or enzymes with enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23C—DAIRY PRODUCTS, e.g. MILK, BUTTER OR CHEESE; MILK OR CHEESE SUBSTITUTES; MAKING THEREOF
    • A23C9/00—Milk preparations; Milk powder or milk powder preparations
    • A23C9/005—Condensed milk; Sugared condensed milk
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23C—DAIRY PRODUCTS, e.g. MILK, BUTTER OR CHEESE; MILK OR CHEESE SUBSTITUTES; MAKING THEREOF
    • A23C9/00—Milk preparations; Milk powder or milk powder preparations
    • A23C9/12—Fermented milk preparations; Treatment using microorganisms or enzymes
    • A23C9/13—Fermented milk preparations; Treatment using microorganisms or enzymes using additives
    • A23C9/1307—Milk products or derivatives; Fruit or vegetable juices; Sugars, sugar alcohols, sweeteners; Oligosaccharides; Organic acids or salts thereof or acidifying agents; Flavours, dyes or pigments; Inert or aerosol gases; Carbonation methods
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23C—DAIRY PRODUCTS, e.g. MILK, BUTTER OR CHEESE; MILK OR CHEESE SUBSTITUTES; MAKING THEREOF
    • A23C9/00—Milk preparations; Milk powder or milk powder preparations
    • A23C9/152—Milk preparations; Milk powder or milk powder preparations containing additives
    • A23C9/156—Flavoured milk preparations ; Addition of fruits, vegetables, sugars, sugar alcohols or sweeteners
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23G—COCOA; COCOA PRODUCTS, e.g. CHOCOLATE; SUBSTITUTES FOR COCOA OR COCOA PRODUCTS; CONFECTIONERY; CHEWING GUM; ICE-CREAM; PREPARATION THEREOF
    • A23G1/00—Cocoa; Cocoa products, e.g. chocolate; Substitutes therefor
    • A23G1/30—Cocoa products, e.g. chocolate; Substitutes therefor
    • A23G1/32—Cocoa products, e.g. chocolate; Substitutes therefor characterised by the composition containing organic or inorganic compounds
    • A23G1/40—Cocoa products, e.g. chocolate; Substitutes therefor characterised by the composition containing organic or inorganic compounds characterised by the carbohydrates used, e.g. polysaccharides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23G—COCOA; COCOA PRODUCTS, e.g. CHOCOLATE; SUBSTITUTES FOR COCOA OR COCOA PRODUCTS; CONFECTIONERY; CHEWING GUM; ICE-CREAM; PREPARATION THEREOF
    • A23G3/00—Sweetmeats; Confectionery; Marzipan; Coated or filled products
    • A23G3/34—Sweetmeats, confectionery or marzipan; Processes for the preparation thereof
    • A23G3/346—Finished or semi-finished products in the form of powders, paste or liquids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23G—COCOA; COCOA PRODUCTS, e.g. CHOCOLATE; SUBSTITUTES FOR COCOA OR COCOA PRODUCTS; CONFECTIONERY; CHEWING GUM; ICE-CREAM; PREPARATION THEREOF
    • A23G3/00—Sweetmeats; Confectionery; Marzipan; Coated or filled products
    • A23G3/34—Sweetmeats, confectionery or marzipan; Processes for the preparation thereof
    • A23G3/36—Sweetmeats, confectionery or marzipan; Processes for the preparation thereof characterised by the composition containing organic or inorganic compounds
    • A23G3/42—Sweetmeats, confectionery or marzipan; Processes for the preparation thereof characterised by the composition containing organic or inorganic compounds characterised by the carbohydrates used, e.g. polysaccharides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23G—COCOA; COCOA PRODUCTS, e.g. CHOCOLATE; SUBSTITUTES FOR COCOA OR COCOA PRODUCTS; CONFECTIONERY; CHEWING GUM; ICE-CREAM; PREPARATION THEREOF
    • A23G4/00—Chewing gum
    • A23G4/06—Chewing gum characterised by the composition containing organic or inorganic compounds
    • A23G4/10—Chewing gum characterised by the composition containing organic or inorganic compounds characterised by the carbohydrates used, e.g. polysaccharides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L11/00—Pulses, i.e. fruits of leguminous plants, for production of food; Products from legumes; Preparation or treatment thereof
    • A23L11/05—Mashed or comminuted pulses or legumes; Products made therefrom
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L13/00—Meat products; Meat meal; Preparation or treatment thereof
    • A23L13/40—Meat products; Meat meal; Preparation or treatment thereof containing additives
    • A23L13/42—Additives other than enzymes or microorganisms in meat products or meat meals
    • A23L13/428—Addition of flavours, spices, colours, amino acids or their salts, peptides, vitamins, yeast extract or autolysate, nucleic acid or derivatives, organic acidifying agents or their salts or acidogens, sweeteners, e.g. sugars or sugar alcohols; Addition of alcohol-containing products
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L13/00—Meat products; Meat meal; Preparation or treatment thereof
    • A23L13/70—Tenderised or flavoured meat pieces; Macerating or marinating solutions specially adapted therefor
    • A23L13/72—Tenderised or flavoured meat pieces; Macerating or marinating solutions specially adapted therefor using additives, e.g. by injection of solutions
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L15/00—Egg products; Preparation or treatment thereof
    • A23L15/20—Addition of proteins, e.g. hydrolysates, fats, carbohydrates, natural plant hydrocolloids; Addition of animal or vegetable substances containing proteins, fats, or carbohydrates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L15/00—Egg products; Preparation or treatment thereof
    • A23L15/30—Addition of substances other than those covered by A23L15/20 – A23L15/25
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L17/00—Food-from-the-sea products; Fish products; Fish meal; Fish-egg substitutes; Preparation or treatment thereof
    • A23L17/70—Comminuted, e.g. emulsified, fish products; Processed products therefrom such as pastes, reformed or compressed products
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L2/00—Non-alcoholic beverages; Dry compositions or concentrates therefor; Their preparation
    • A23L2/385—Concentrates of non-alcoholic beverages
    • A23L2/39—Dry compositions
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L27/00—Spices; Flavouring agents or condiments; Artificial sweetening agents; Table salts; Dietetic salt substitutes; Preparation or treatment thereof
    • A23L27/30—Artificial sweetening agents
    • A23L27/33—Artificial sweetening agents containing sugars or derivatives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L29/00—Foods or foodstuffs containing additives; Preparation or treatment thereof
    • A23L29/30—Foods or foodstuffs containing additives; Preparation or treatment thereof containing carbohydrate syrups; containing sugars; containing sugar alcohols, e.g. xylitol; containing starch hydrolysates, e.g. dextrin
    • A23L29/35—Degradation products of starch, e.g. hydrolysates, dextrins; Enzymatically modified starches
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L9/00—Puddings; Cream substitutes; Preparation or treatment thereof
    • A23L9/10—Puddings; Dry powder puddings
    • A23L9/12—Ready-to-eat liquid or semi-liquid desserts, e.g. puddings, not to be mixed with liquids, e.g. water, milk
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
    • A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
    • A61K8/30—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds
    • A61K8/60—Sugars; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
    • A61Q19/00—Preparations for care of the skin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12G—WINE; PREPARATION THEREOF; ALCOHOLIC BEVERAGES; PREPARATION OF ALCOHOLIC BEVERAGES NOT PROVIDED FOR IN SUBCLASSES C12C OR C12H
    • C12G3/00—Preparation of other alcoholic beverages
    • C12G3/02—Preparation of other alcoholic beverages by fermentation
    • C12G3/021—Preparation of other alcoholic beverages by fermentation of botanical family Poaceae, e.g. wheat, millet, sorghum, barley, rye, or corn
    • C12G3/022—Preparation of other alcoholic beverages by fermentation of botanical family Poaceae, e.g. wheat, millet, sorghum, barley, rye, or corn of botanical genus Oryza, e.g. rice
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2405—Glucanases
    • C12N9/2451—Glucanases acting on alpha-1,6-glucosidic bonds
    • C12N9/2457—Pullulanase (3.2.1.41)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/90—Isomerases (5.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/12—Disaccharides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/14—Preparation of compounds containing saccharide radicals produced by the action of a carbohydrase (EC 3.2.x), e.g. by alpha-amylase, e.g. by cellulase, hemicellulase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/24—Preparation of compounds containing saccharide radicals produced by the action of an isomerase, e.g. fructose
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01141—4-Alpha-D-{(1->4)-alpha-D-glucano} trehalose trehalohydrolase (3.2.1.141)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23G—COCOA; COCOA PRODUCTS, e.g. CHOCOLATE; SUBSTITUTES FOR COCOA OR COCOA PRODUCTS; CONFECTIONERY; CHEWING GUM; ICE-CREAM; PREPARATION THEREOF
    • A23G2200/00—COCOA; COCOA PRODUCTS, e.g. CHOCOLATE; SUBSTITUTES FOR COCOA OR COCOA PRODUCTS; CONFECTIONERY; CHEWING GUM; ICE-CREAM; PREPARATION THEREOF containing organic compounds, e.g. synthetic flavouring agents
    • A23G2200/02—COCOA; COCOA PRODUCTS, e.g. CHOCOLATE; SUBSTITUTES FOR COCOA OR COCOA PRODUCTS; CONFECTIONERY; CHEWING GUM; ICE-CREAM; PREPARATION THEREOF containing organic compounds, e.g. synthetic flavouring agents containing microorganisms, enzymes, probiotics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23G—COCOA; COCOA PRODUCTS, e.g. CHOCOLATE; SUBSTITUTES FOR COCOA OR COCOA PRODUCTS; CONFECTIONERY; CHEWING GUM; ICE-CREAM; PREPARATION THEREOF
    • A23G2200/00—COCOA; COCOA PRODUCTS, e.g. CHOCOLATE; SUBSTITUTES FOR COCOA OR COCOA PRODUCTS; CONFECTIONERY; CHEWING GUM; ICE-CREAM; PREPARATION THEREOF containing organic compounds, e.g. synthetic flavouring agents
    • A23G2200/06—COCOA; COCOA PRODUCTS, e.g. CHOCOLATE; SUBSTITUTES FOR COCOA OR COCOA PRODUCTS; CONFECTIONERY; CHEWING GUM; ICE-CREAM; PREPARATION THEREOF containing organic compounds, e.g. synthetic flavouring agents containing beet sugar or cane sugar if specifically mentioned or containing other carbohydrates, e.g. starches, gums, alcohol sugar, polysaccharides, dextrin or containing high or low amount of carbohydrate
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
    • A61Q11/00—Preparations for care of the teeth, of the oral cavity or of dentures; Dentifrices, e.g. toothpastes; Mouth rinses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
    • A61Q17/00—Barrier preparations; Preparations brought into direct contact with the skin for affording protection against external influences, e.g. sunlight, X-rays or other harmful rays, corrosive materials, bacteria or insect stings
    • A61Q17/04—Topical preparations for affording protection against sunlight or other radiation; Topical sun tanning preparations
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
    • A61Q19/00—Preparations for care of the skin
    • A61Q19/02—Preparations for care of the skin for chemically bleaching or whitening the skin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
    • A61Q7/00—Preparations for affecting hair growth

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Agronomy & Crop Science (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Birds (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Marine Sciences & Fisheries (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Cosmetics (AREA)

Description

經濟部中央標準局員工消費合作杜印製 421 673 a? _ B7_ 五、發明説明（） 1 發明背景 1 .發明領域 本發明是有關海藻糖釋放酵索，及其製法及用法，更 特別地是有關新穎的海藻糖釋放酵素，其可特異地水解在 非還原醣中，海藻糖部份及留下的糖基部份間之連接，此 醣係具有一個海藻糖結構爲末端單位，且有3以上的葡萄 糖聚合作用程度，以及有關酵素之製備。本發明進一步是 有關可形成酵素之微生物，利用酵素得到之海藻糖，及含 海藻糖之組成物。 2.先前技藝之說明 海藻糖或π，β —海藻糖已知爲由葡萄糖單位所組成 之非還原醣。如 Advances in Carbohydrate Chemistry, V ο 1 18，p p · 2 0 1 - 2 2 5 ( 19 6 3 )，由 A c a d e m i c P r e s s , U S A 出 版 » 及 Appli.ed and Environmental Microbiology, Vo 1 . 56，pp.3,213-3,21 5 ( 1 990 )中所述的，海藻糖廣泛地存 在於微生物，荤類，昆蟲等，然而含量相當低。海藻糖是 非還原醣，如此其既不與含胺基之物質反應，如胺基酸及 蛋白質，誘生胺基一羰基反應，也無有害的含胺基酸物質 。因此，可使用海藻糖而勿需擔心有令人不滿意之變褐及 有害作用。基於此，極需發展出海藻糖之工業規模製法。 海藻糖之傳統製劑，如揭示於日本專利公開公報N 〇 .1 5 4，4 8 5/7 5中者，其中利用微生物，及於日 本專利公開公報No· 2 1 6，6 9 5/8 3中者，其中 本紙張尺度適用中國國家標準'（CNS ) A4说格（210X297公釐） «m- n^i tm nn )^i— n (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 ζτ-- 娌濟部中央標隼局員工消費合作社印製 4 2 1 6 7 3 A7 B7 五、發明説明（2 ) 利用麥芽糖-及海藻糖-磷化酶之組合將麥芽糖轉化成海 藻糖。然而，前者不適用於工業規模之製備，因爲存在於 微生物中充作起始物的海藻糖之含量通常低於15w/w % ( 'w/w%〃在說明書中簡寫成，除非另有所 示），此按乾固體基礎計（d. s. b)，且萃取及純化 步驟十分複雜。後者有以下的缺點：由於海藻糖經由葡萄 糖- 1 一磷酸酯形成，充作受質之麥芽糖之漉度無法是在 令人滿意之髙水平下：（i i )磷酸化酶之酵素反應系統 是可逆的反應，且其主題海藻酶之産率相當低；及（i i i )實質上難以保持其反應系統穩定，及平穢地進行其酵 素反應。因此這些傳統製劑尙未確實充作工業規模製劑。 關於海藻糖之製備，在lood Chemicals"，No.88, p p , 0 7 - 2 2 ( A u g u s t, 19 9 2 )中棋題爲C u r r e π t S t a t u s of Starch Application Development and Related P r o b 1 e m s 〃 一章中，其、0 1 i g o s a c c h a r i d e s 〃段落中提及 $估不論海藻糖之廣泛應用，經由直接醣轉移反應或水解 反應所進行之酵素性製備在此領域就科學性而言是幾乎不 可能的'。因此，利用澱粉爲物質，經由酵素反應製備海 藻糖，在科學性而言確實十分困難。 已知，製備自澱粉材料之部份澱粉水解物，如液化澱 粉，糊精及麥芽寡糖，由於其還原性末基團故呈現還原力 。這些還原性之部份澱粉水解物之還原能力，通常以★右 旋糖等價（DE)値〃表示，此以乾重爲準。已知在還原 性之部份澱粉水解物中，具相當高DE値者通常有相當低 本紙張尺度適用中國國家橾準（CNS > A4規格（210X297公釐） ^^^1' ^^^^1 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 、^
A 421673 . Λ7 ___B7_ 五、發明説明（3 ) 的分子置及粘度，以及相當高的甜度及反應性，且容易與 具有胺基之物質反應，如胺基酸及蛋白質，而造成令人不 滿意之變褐，味道及有害其品質。 由於還原性部份澱粉水解物之特性依其D E値而變化 ，故還原性部份減粉水解物及其D E値間之相互關係十分 重大。咸信在此領域中是無法拆毀此相互關係的。 經濟部中央標準局負工消費合作杜印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 然而本發明確實改變此常識，且成功地發展出海藻糖 之製法，如日本專利案No. 3 6 2，1 3 1/9 2中所 揭示者，其中海藻糖是直接產自非還原性之部份澱粉水解 物，係令萄糖澱粉酶加上非還原醣形成酵素（其可形成非 還原醣，其具有海藻糖結構爲末端單位且有3以上之葡萄 糖聚合程度）作用在還原性部份澱粉水解酶上（其製備自 材料澱粉，具有3以上之葡萄糖聚合作用）。雖然海藻糖 之製備可自非還原性部份澱粉水解物中以約3 0 %産率生 成海藻糖，且可適用於工業規模之製備，但就海藻糖產率 之觀點而言，仍有顧慮會造成高的產製費用。因此，發展 新的海藻糖製法，其以增加之產率自非還原性部份澱粉水 解物中形成海藻糖是極需要的。 發明要點 本發明目的是提出海藻糖以相當高產率，自相當低費 用且穩定供應之澱粉中之新穎的製法。 爲了得到上述目的，本發明者徹底篩選可產生新穎酵 索之微生物，其可自以海藻糖結構爲末端單位且具有3以 本紙張尺度適用中國國家標率（CNS ) A4规格（210X297公釐） 气肌條正 42 1 67 3 A7 _ 補充|---- 五、發朗説祖、 4 上葡萄糖聚合作用程度之非還原性部份澱粉水解物中釋出 海藻糖。結果吾等發現一種屬於根瘤菌屬（Rhizobium) * 即 Rhizobium SP. (寄存號碼 CCRC 910002，寄存曰期 199 4年6月21日），分離自固體之非還原性醣形成微生物， 如日本專利案No, 362，131/92中所掲示的， 及一種節桿菌屬（Arthrobacter)，即 Arthrobacter SP .03 6(寄存號碼(^1?€ 910001,寄存日期199 4年6月21日）之 '非還原性醣彤成微生物•分離自土壤，如日本專利案N 〇 .26 5，41 6/9 3所掲示，可產生新穎的海藻糖釋 放酵素，吾等也發現，新穎的海藻糖釋放酵素當與非還原 性醣形成酵素合用時，有助於以令人滿意之高產率形成海 '1 經濟部t夬標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注項再填寫本頁) 藻糖之反應，且令新穎的海藻糖釋放酵素與非還原性醣形 成酵素作用在還原性部份澱粉水解物上可容易地製備海藻 糖，且回收含有相當髙純度海藻糖之反應混合物。吾等自 已知之微生物中充份地篩選可產生此海藻糖釋放酵素之微 生物。結果發現，短桿.菌屬及微球菌屬（Brevibacterium & Micrococeus)之微生物可產生海藻糖釋放酵素，其可 自具有海藻糖結構爲末端單位及具有3以上葡萄糖聚合作 用程度之非還原性醣中形成海藻糖，就如同根瘤菌及節桿 菌微生物所衍生之海藻糖釋放酵素般，且因此完成本發明 。吾等也發展出組成物，如食品，化粧品及藥物，含有本 製法製備之海藻糖，並完成本發明》 附圖說明 圖1示出本海藻糖釋放酵素及非還原性醣彤成酵素， 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS )八4规格（210Χ297公釐） 一 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 4 2 1 6 7 3，壚 A7 _B7_ 五、發明説明（5 ) 自以'^DEAE-Toyopearl®"凝膠充塡之管柱中溶離之溶離 型式。 圖2示出溫度對於本海藻糖釋放酵素，衍自根瘤菌 s p . Μ — 1 1之微生物活性之影響。 圖3示出pH對於衍自根瘤菌sp.Μ—11之微生 物之本發明海藻糖釋放酵索活性之影饗。 圖4示出溫度對於衍自根瘤菌sp.M—l1之微生 物之本發明海藻糖釋放酵素穩定性之影謇。 圖5示出pH對於衍自根瘤菌sp.Μ—11之微生 物之本發明海藻糖釋放酵素穩定性之影響。 圖6示出溫度對於衍自節桿菌sp. Q36之微生物 之本發明海藻糖釋放酵素/活性之影響。 圖7示出pH對於衍自節桿菌sp. Q36之微生物 之本發明海藻糖釋放酵素活性之影響。 圖8示出溫度對於衍自節桿菌sp. Q36之微生物 之本發明海藻糖釋放酵素穩定性之影響。 圖9示出pH對於衍自節桿菌sp. Q36之微生物 之本發明海藻糖釋放酵素穩定性之影響。 發明詳細鞔明 根瘤菌，即根瘤菌S p . Μ — 1 1微生物之鑑定試驗 ，依據本發明可得以下結果。試驗之進行依'^微生物分類 及鑑定〃中所述之方法，此書1丨36丨1)111511-11〇-811111：11卜 t 〇 - D 〇 t e i "，由 T a k e j i H a s e g a w a 編輯，由 J a p a η (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) r·
11T 6 本紙張尺度適用中國國家樣準（CNS > A4規格（2丨0X297公釐） -8 - 421673 經濟部中央標準局負工消費合作杜印製 A7 B7 五、發明説明（6 )
Scientific Societies Press, Tokyo, Japan出版( 1 9 8 5 )： A .外形學 細胞之鐙定係當培養於2 7 °C之營養瓊脂上 通常呈0. 6 — 0. 8X1. 0 — 1. 5微米之桿狀 a t 以單一型式呈現，罕見連績偶合一或連接型式： 未出現多形性； 具有運動力，非芽胞生殯性及具鞭毛； 非抗酸性； 革蘭氏染色：陰性； 莢膜：陰性； 異染小粒：陽性；及 可累積衆一々一羥基丁酸酯。 B.培養特性 (1 )當培養於2 7 °0營養瓊脂盤上所形成之集落特 性 外形：環狀集落，經2 4小時培育後具有約 1 . 5毫米之直徑； 緣：完整： 突出物：平面或半球型； 光澤：陽性 表面：平滑 本紙張尺度適用争國國家橾準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項苒填寫本頁)
經濟部中央標準局員工消費合作杜印製 421673 A7 ____B7 五、發明説明（7 ) 顔色：乳狀及半透明集落，不形成粉紅色色素 9 (2 )當培養在2 7 °C加有右旋糖及胰化蛋白賒之瓊 脂盤上所形成之集落特性 有粘液樣之乳狀及半透明集落； (3 )當培養在2 7 °(：有酵母浸資及甘露醇之瓊脂盤 上所形成之集落特性 外形：環狀集落，經5天培育後具有約3毫米 直徑； 顏色：有粘液樣之乳狀及半透明集落 (4 )當在2 7 °C，加有酵母浸育，甘露醇及剛果紅 之瓊脂盤上培育時所形成集落之特性 呈現的既無淡粉紅色也無剛果紅實質之吸收； (5 )可在2 7 °C加有酵母浸膏，甘露醇及2% NaCJZ之瓊脂盤上生長： (6 )當在2 7 °C，斜面營養瓊脂上培育時所形成之 集落之特性 生長：令人滿意， 外形：念珠狀：及 (7 )當在2 7 °C營養明膠上穿刺培養時並未液化明 膠0 C.生理特性 (1)硝酸鹽之還原作用：陽性 (請先閲讀背面之注^^項再填寫本頁) 訂 本紙張尺度適用中國國家橾準（CNS)A4麟（210X297公釐） -1〇 - 421673 A7 B7 五、發明説明（8 ) (2) 脫氮作用反應：陰性 (3) 甲基紅試驗：陰性 (4) VP —試驗：陰性 (5 )啤丨晬之形成：陰性 (6) 硫化氫之形成：陽性 (7) 澱粉之水解：陰性 (8 )檸檬酸之利用：陽性 (9 )無機氮源之利用：可利用銨鹽及硝酸鹽； (10)色素之形成：無 (1 1 )尿素酶：陽性 (12) 氧化酶：陰性 (13) 過氧化氫酶：陽性 (14) 生長條件：可在ρΗ5· 5 - 9 . 0範圍及 溫度4 一 3 5°C範圍下生長 (1 5 )氧需求：需氧 (1 6 )碳源之利用及酸之形成 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本I) 裝 訂 i 經濟部中央標準局負工消費合作社印製 -11 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 421673 五、發明説明（^ A7 B7 碳源 利用 酸之形成 D-葡萄糖 D-半乳糖 D-果糖 L-阿拉伯糖 D-木糖 L-鼠李糖 麥芽糖 蔗糖 乳糖 海藻糖 甜菜糖 甘露醇 糊精 衛系醇 + +++ ++ + + + + + + + + ++ + + + + + + (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (1 7 )在胺基酸上之脫羧酸試驗 對L 一賴胺酸，L 一精胺酸及L 一鳥胺酸呈陰性； (1 8 )胺基酸之利用性 可利用L 一穀胺酸鈉，L —天冬胺酸鈉，L 一組 胺酸及L _脯胺酸； (19) DNase:陰性； (20) 3 —酮基乳糖之形成：陰性；及 (2 1 ) DNA中鳥嘌呤（G)加胞嘧聢（C)之莫 本紙張尺度適用中國國家樣準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 經濟部中央標準局舅工消費合作社印聚 421673 , 五、發明説明（10) 耳 ％ : 6 1 % 細菌學特性與已知之微生物比較，參考Bergey’s Manual of Systematic Bactoriο 1ogy, 1st edition ( 1984 )。結果顯示出微生物被鑑知爲根瘤菌。此微生物和 苜宿根瘤菌（R. ineliloti)相似，但與其分別在於其可 利用麥芽糖，乳糖，及甘露醇，但不形成酸，而且其可產 生二種酵素，其當作用在還原性部份澱粉水解酶時可形成 具有海藻糖結構之非還原性醣，及一種新穎的海藻糖釋放 酵素，其可特異地水解在非還原性醣中介於海藻糖部份及 其餘糖基部份間之連接，以釋出海藻糖部份。尙無刊物報 告具有這些特性的此微生物。 本發明者命名此微生物爲、根瘤琶」P . Μ - 1 1， ，並在1 9 9 2年1 2月2 4日貯於日本（Ibaraki)工 業科學及技術部之醱酵硏究所。在同一天接受微生物之貯 置，且以FERM BP — 4 1 3 0之編號保存於硏究所 中。 除了上述鏟定之微生物，根瘤菌其他菌株及其突變株 ，只要可產生本海藻糖釋放酵素者均適用於本發明。 依據本發明節桿菌，即節桿菌s p . Q 3 6之銨定試 驗可得以下結果。試驗之進行依 '微生物分類及鑑定"中 所述之方法，此書由T a k e j i g a s e g a w a編輯，由J a p a η Scientific Societies Press, Tokyo, Japan出版（ 1 9 8 5 )。結果如下： 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -13 - --------,裝-- (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)
,1T 經濟部中央標準局負工消费合作社印製 42ι^73 , Α7 ______Β7五、發明説明（u ) A .外形學 (1 )當在2 7 °C營養瓊脂上培育時細胞之鑑定 通常呈現0· 5 — 0 7X0. 8-1_ 6微米之桿 狀；呈現單一型式； 呈現出多形性 不具有動力，鞭毛及非芽胞生殖性： 非耐酸性； 革蘭氏染色：陽性；. 莢膜：陰性：及 (2 )當在2 7 之EYG瓊脂上培育時細胞之鑑定 呈現桿狀-球狀循瓚 Β .培養特性 (1 )當在2 7 °C之營養瓊脂盤上培育時所形成集落 之鑑定 外型：環狀集落，經3天培育後直徑約2 — 2 · 5毫米； 綠：完整； 突出物：半球型； 光澤：水汽光澤： 表面：平滑 顔色：半透明及白或淺黃色； (2 )當在2 7 °C之營養培養盤斜面培養時細胞之鑑 定 (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家梂準（CNS)八4規潘（2丨0X297公鼇） -14 - A7 421 673 *4 B7 五、發明説明（12 ) 生長速率：令人滿意：及 外形：念珠狀： (3 )當在2 7 τ含有酵母浸膏及胰化蛋白腺之瓊脂 盤上斜面培養時細胞之鑑定 生長速率：令人滿意； 外形：念珠狀；及 (4 )當於2 7 °C之含bouillon及明膠的短柱（stub)— 培養時，進行細胞之鑑定。將bouillon及明膠 液化。 C.生理特性 (1) 硝酸鹽之還原作用：陽性 (2) 脫氮作用反應：陰性 (3) 甲基紅試驗：陰性 (4) VP —試驗：陽性 (5 )崎丨哚之形成：陰性 (6) 硫化氫之形成：陽性 (7) 澱粉之水解：陰性 (8 )纖維素之利用：陰性 (9)檸檬酸之利用：陽性 (1 0 )無機氮源之利用：利用餒鹽及硝酸鹽； (11)色素之形成：陰性 (1 1 )尿素酶：陽性 (請先閎讀背面之注意事項再填寫本頁) 聲 訂 i 經濟部中央標準局員工消費合作杜印製 本紙張尺度適用中國國家樣準（CMS ) A4規格（210X297公麓） -15 - 421 673 „ Δ7 Α7 Β7 五、發明説明（13 (1 2 )氧化酶：陰性 (13)過氧化氫酶：陽性 (1 4 )生長條件：在PH5 — 1 0範圍中及4 3 7 °C溫度範圍下生長； (1 5 )氧需求：需氧 (1 6 )碳源之利用及酸之形成 碳源 JJJ1 酸之形成 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標隼局員工消費合作社印製 D-葡荀糖 D-半乳糠 D-果糖 L-阿拉伯糖 D-木糖 L-鼠李糖 麥芽糖 蔴糖 乳糖 甜菜糖 甘露醇 糊精 衛矛醇 + + + 十 + + + + + + + + + 8 )胺基酸之利用 可利用L —穀胺酸鈉，L 一天冬胺酸鈉，L 一組胺酸 本紙珉尺度適用中國國家梯準（CNS ) A4規格（210X297公釐） <ΤΓ i 421673 A7 B7 經濟部中央標準局員Η消費合作社印製 五、發明説明（14) 及L 一脯胺酸； (19)DNase:陽性 (2 0 ) 3 —酮基乳糖之形成：陰性 (2 1 )細胞壁的主要二胺基酸：頼胺酸；及 (2 2 ) DNA之鳥嘌呤（G)加胞嘧啶（C)之莫 耳 ％ : 6 3 % 細菌學特性與已知微生物依Bergey's Manual of S y s t e ια a t i c B a c t e r i ο 1 o g y，V ο 1 . 2 (19 8 6 )比較。結果顯 示微生物被鐙知爲屬節桿菌。微生物之特色在於其可產生 非還原性醣形成酵素，當作用在還原性部份澱粉水解物上 時可形成具有海藻糖結構之非還原性醣，以及新穎的海藻 糖釋放酵素，其可在非還原性醣上特異地水解介於海藻糖 部份及留下的糖基部份間之連接，而釋出海藻糖部份。對 於具有這些特性之微生物並無刊物普有報告。 本發明者將此微生物命名爲節桿菌s p . 0,^6·" ，且於 1 9 9 3 年 6 月 3 日貯於 National Institute of Bioscience and Human-Technology Agency of Industrial Science and Technology, Ibaraki,曰本0 在同一天接受微生物之貯置，且於FERM BP— 4 3 1 6編號下維持於硏究所中。 除了上述微生物之外，節桿菌的其他菌株及其突變株 只要可產生本發明之海藻糖釋放酵素者均適用於本發明， 此酵素係可在具有海藻糖結構爲末端單倍且具有3以上葡 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝. 訂 i 本紙張尺度適用中國國家揉準（CNS ) A4規格（210X29?公釐） -17 - 421673 經濟部中央梯车局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（15) 萄糖聚合作用程度之非還原性部份澱粉水解物上特異性水 _解介於海藻糖部份及留下的糖基部份間之連接。 其他微生物只要可產生本酵素，均可用於本發明。如 ，除了上述根瘤菌s ρ. Μ— 1 1 (FERM BP — 4130)及節桿菌 sp.Q36(FERM B P -4 316)，其他迄今已知之微生物，如：微黃短桿菌（ Brevibacteriuin belvolum) ( A T C C 1 1 8 2 2 ) 及玫瑰色微球菌（Micrococcus roseus) (AT CC 1 8 6 )均可有益地使用。 任何營養培養基均可用於本發明，只要此微生物可於 其中生長且可產生本海藻糖釋放酵素：如，合成的及天然 的營養培養基可任意使用。任何含碳物質均可充作本發明 之碳源，只要其可爲微生物所利用：此種碳源之實例有醣 ，如葡萄糖，果糖，乳糠，蔗糖，甘露醇，山梨醇，糖蜜 及部份澱粉水解物：及有機酸如檸檬酸及琥珀酸。在營養 培養基中這些碳源的濃度可適當地選擇。如，於使用部份 澱粉水解物之例子中，較佳的濃度通常爲2 0 %以下，更 特別是5%以下，d. s. b，此基於微生物生長及增殖 而言。可用於本發明中之氮源有如：無機氮化合物如銨鹽 及硝酸鹽；及含有機氮之物質，如尿素，榖物浸漬液，酪 蛋白，胰化蛋白腺，酵母浸膏及牛肉溲育。可用於本發明 之無機組份有如：鈣鹽，鎂鹽，鉀鹽，鈉鹽，磷酸鹽及鑑 ，鋅，鐵，銅，鉬及鈷的其他鹽類。若必要時，可有益地 使用胺基酸及維生素。 本紙張尺度適用中國國家標隼（CMS ) Α4規格（210X297公釐） -18 - ---------裝-- (請先閲讀背面之注iW'項再填寫本I ) ,ιτ 421673 經濟部中央標隼局員工消費合作社印掣 A7 B7五、發明説明（16 ) 可用於本發明之微生物可在需氧條件下培養，溫度通 常在4 — 4 0°C範圍，較好2 0-3 5 °C範圍；及pH値 4一1 0，較好在5 — 9範国。適用於本發明之培養時間 定在較微生物生長開始所需還長之時間，較好1 0 — 1 0 0小時。營養培養基中溶氧（DO)濃度並未特別限 制，且通常0. 5 — 2 Oppm之DO範圍可令人滿意地 使用。OD濃度可保持在範圍內，由控制通氣率，攪拌營 養培養基，供應氧以通氣，及增加醸酵槽之內壓達成。培 養可批次或以連續方式進行。 一旦微生物之培養完全後，可回收本酵素。在細胞及 無細胞上清液中均可見儘可能多的本發明酵索活性，其可 回收並充作粗製酵素。生成之培養可呈粗製酵素般完整使 用。於本發明中可應用傳統的液谶一固體分離法，以移去 培養中之細胞。如，直接離心生成之培養物之方法，及以 預塗覆之濾器過濾之或利用膜過濾，平板濾器或中空濾器 均適用。如此得到的無細胞漶液可呈酵素溶液型式完整使 用，或可在使用前先濃縮。可用於本發明之濃縮方法有如 :利用硫酸銨鹽析，利用Η酮及醇沈降，及利用膜（如平 板濾器及中空濾器）濃縮。 無細胞濾液及其濃度可接受傳統的固化方法。傳統方 法之實例有利用離子交換之共軛方法，及利用樹脂及膜之 共價連接及吸收作用，以及利用高分子量物質之納入方法 。自所生成培養物中所分出之細胞，可勿需任何進一步處 理以粗製酵素使用，或在使用前可固化之。如，細胞之固 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
X 裝 訂 " 本紙張尺度適用中國國家榇準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） -19 - 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 421673 A7 _B7_五、發明説明（17 ) 化可將彼與藻酸鈉混合，將生成的混合物滴落在氣化鈉溶 液中以使滴狀物明膠化成顆粒。生成之顆粒再利用聚乙烯 亞胺或戊二醛固定。萃取自細胞之酵素製劑可呈粗製酵素 溶液型式應用於本發明。含有本酵素之澄清粗製酵素溶液 可由萃取細胞中之酵素而得，其先經超音波，利用玻璃珠 及鋁土之機械瓦解，法式壓力器瓦解等預處理，再將生成 之萃取物接受離心或膜過濾。 如此得到的粗製酵素溶液可完整使用，或在使用前先 以傳統方法純化。如，在電泳上呈現單一帶狀之經純化之 酵素製劑，可由透析粗製酵素製劑而得，其製備可以硫酸 銨鹽析粗製酵素培養物並再濃縮之，並相繼以下純化經透 析之溶液：利用'"DEAE-Toyopearl® 〃行陰離子交換管柱 層析，此爲一種陰離子交換器；利用"Buty卜Toyopearl 行疏水性管柱層析，一種疏水性樹脂；及利用t Toyopearl ® HW-55"之凝膠過濾層析，一種用於凝膠過 減之樹脂，均爲 Tosoh Corporation, Tokyo, Japan 之產 品0 如此得到的本海藻糖釋放酵素有以下物化特性： (1 )作用 可特異地水解在非還原醣上介於海藻糖部份及留下 的糖基部份間之連接，此醣具有海藻糖結構爲其末 端單位，及具3以上之葡萄糖聚合作用程度； (2 )分子量 在硫酸十二酯鈉一聚丙烯醯胺凝膠電泳（S D S - (請先閎讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 本紙張尺度適用中國國家榇準（CNS ) A4祝格（210X297公釐） - 20 - 421673 A7 B7 經濟部中央標準局貝工消费合作社印策 五、發明説明（18 ) PAGE)上有約 57，000 — 68，〇〇〇 道 耳呑； (3) 等電點（PI) 利用兩性電解質在等電電泳上約3· 3—4_ 6 (4) 最佳溫度 當在PH7. 0下培育3 0分鐘時約3 5 — 4 5°C; (5 )最佳p Η 當在4 0 Τ下培育3 0分鐘時約6_ 0 — 7. 5 ； (6)熱穗定性 當在ρΗ7· 0下培育60分鐘時，可稼定達約30 -4 5 °C ； (7 ) p Η穩定性 當在2 5 °C下培育16小時，可在約5. 〇 -1 0 . 0 p Η下穗定。 本海藻糖釋放酵素之活性可分析如下：1毫升酵素溶 液加至於5 0tnM磷酸鹽緩衝溶液（ρΗ7. 〇)中之4 毫升/2. 5w/v%的麥芽三糖基海藻糖別名α-麥芽 四糖基α —葡萄糖替，且混合物溶液在4 0°C下培育3 0 分。對生成的反應混合物中加入Soinogyi反應之銅溶液， 以懸浮酵素反應，之後決定Sowogyi-Nelsonis方法中之還 原力。至於對照組，將酵素溶液預熱於1 0 0°C下1 〇分 鐘以滅活酵素，再類似地分析。本發明酵素1單位活性定 義爲當以上述分析法分析時，毎分鐘增加每微莫耳葡萄糖 (請先閲讀背面之注意事項再填窝本頁)
本紙張尺度適用中國圃家標準（CNS ) Μ規格（210X297公釐） -21 - A7 421673 B7 五、發明説明（19 ) 還原力所需之酵索量。 (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁) 任何物質均可充作本酵素之受質，只要其是具有海藻 糖結構爲末端單位且具3以上菊萄糖聚合作用程度之非還 原糖：此受質實例有糖基海藻糖，如葡糖基海藻糖，麥芽 糖基海藻糖，麥芽三糖基海藻糖，麥芽四糖基海藻糖，及 麥芽五糖基海藻糖，其製備係令非還原糖形成酵素作用在 麥芽三糖，麥芽四糖，麥芽五糖，麥芽六糖及麥芽七糖。 除了這些受質，相當低還原性之部份澱粉水解物，其具有 海藻糖結構爲末端單位且具3以上的葡萄糖聚合作用程度 ，其製備是以澱粉酶或酸部份水解含澱粉性物質，如澱粉 ，澱粉果膠及直鏈澱粉，均適用於本發明。 可部份水解澱粉的此種澱粉酶之實例有：澱粉酶 ，麥芽五糖-形成澱粉酶及麥芽六糖一形成激粉酶，如 Handbook o f Amylases and Related Enzymes,
Pergamon Press publish, Tokyo.·, Japan (1988)。這些 澱粉酶可組合脫支酶使用，如支鍵澱粉酶及異澱粉酶。 鯉濟部中央標準局員工消費合作社印製 充作本發明受質之還原性部份澱粉水解物之濃度並未 特別限制。依據本發明之酵素反應，即使在含〇·1%或 5 0 %受質之溶液中仍可進行而形成海藻糖。於本發明中 可使用含有不溶性受質之懸浮液。可用於本酵素反應中之 反應溫度，可定在此時本酵素不被鈍化之溫度下，即髙達 約5 5°C之溫度，較好在4 0_5 5°C範圍中之溫度。可 用於本酵素反應中之反應pH値可定在5 — 1 〇範圍下， 較好是P Η値約6 — 8範圍。可用於本酵素反應中之反應 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) Α4規格（210X297公釐） -22 - 經濟部中央標隼局員工消費合作杜印製 421673 A7 ___B7 五、發明説明（2〇 ) 時間，可依酵素反應條件而適度選擇，且通常在約〇 . 1 —100小時範圍中，此係當本酵素用量爲約〇. 1 0 0單位/克受質，d. s. b.時而貢。 關於自材料受質中海藻糖之產率，特言之，在自相當 低DE値（即具相當髙葡萄糖聚合作用程度）之非還原性 部份澱粉水解物中製備海藻糖之例子中，本海藻糖之製法 有優點，即其可增加海藻糖之產率，較如日本專利案N 〇 • 3 6 2，1 3 1/9 2中所揭示製法所得的還多，在此 案中組合使用非還原性醣彤成酵素及葡糖澱粉酶。本製法 混用非還原性醣形成酵素及本海藻糖释放酵素，形成產率 約6 0 %以上之海藻糖，而日本專利案之製法僅形成產率 約3 0 %之海藻糖。 本發明之酵素機制如下：具有相當高葡萄糖聚合作用 程度之還原性部份澱粉水解物，先由非還原性醣形成酵素 轉化成1莫耳具有海藻糖結構爲末端單位之非還原性醣， 之後生成之非還原性醣再爲本海藻糖釋放酵素水解成1莫 耳海藻糖及1莫耳還原性部份澱粉水解物，後者具有的葡 萄糖聚合作用程度較原料還原性部份澱粉水解物少2。於 新形成之還原性部份澱粉水解物具有3以上葡萄糖聚合作 用程度之例子中*其可進一步轉化成具海藻糖結構爲末端 軍位之非還原性醣，再爲海藻糖釋放酵素轉化成一莫耳 海藻糖及部份的澱粉水解物。因此，上述非還原性釀_形 成酵素及海藻糖釋放酵素之重覆酵素反應，可由一莫耳非 還原性部份澱粉水解物形成一個以上的海藻糖分子，及非 本&張尺度適用中國國家標率（CNS ) A4規格（210X297公釐] _ 23 -—"' " (請先聞讀背面之注項再填寫本頁) 裝 訂
iN 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 421673 A7 ____B7_ 五、發明説明（21) 還原性部份澱粉水解物，所具有的葡荀糖聚合作用程度較 原料部份澱粉水解物低，爲所形成海藻糖分子之2倍以上 〇 於本製法中，非還原性醣成酵素及本海藻糖釋放酵素 可同時作用在非還原性部份濂粉水解物（其具有3以上之 葡荀糖聚合作用程度），或此二酵素相繼作用在非還原性 部份澱粉水解物上（以此次序）。爲了更增加海藻糖產率 ’生成之反應混合物可進一步接受菊糖澱粉酶之作用。 如此得到的反應混合物以一般方式接受過濾及離心， 以移去不溶物質，且生成之溶液以活性炭脫色，以Η —及 0Η —型之離子交換器脫鹽，再濃縮成糖漿狀產物。糖漿 狀產物可任意乾燥成粉末狀產物。 若必要時，粉末狀產物經由一種以上方法之純化，可 容易地處理成髙純度之海藻糖產物，如在離子交換管柱層 析上分級分離，利用活性炭在矽膠上管柱層析；利用有機 溶劑如醇及丙酮分離：及鹼處理以分解及移去留下之還原 性醣。 若必要時，依本發明含有海藻糖之醣產物，可以α 一 澱粉酶，一澱粉酶，葡糖澱粉酶，α —葡糖苷酶及/或 海藻糖酶水解，或利用環麥芽糊精葡聚糖轉移酶及/或葡 糖基轉移酶接受醣轉移反應，以控制其甜度及還原力，以 及減低粘度。再者，醣產物可任意地氫化，以將彼轉化成 糖醇以消除其還原力。由生成之產物，葡萄糖可利用上述 之純化法移去，如離子交換管柱層析，以製備高海藻糖含 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁〕 裝· Κ 本紙張尺度適用中國國家橾準（CNS ) Α4規格（210X297公癀） -24- 42 1 673 A7 B7 經濟部中央襟準局員工消費合作社印製 五、發明説明（22) 量之流份。如此得到之流份可容易地純化，並濃縮成糖漿 狀產物，且若必要時糖漿狀產物可進一步澳縮成過度飽和 之溶液並結晶以得含水之結晶狀海藻糖或無水的晶狀海藻 糖。 可用於本發明中之離子交換管柱層析技術，包括如應 用强酸陽離子交換樹脂，如日本專利公開公報N 〇 s . 23，799/83 及 72，598/83 中所揭示的。 利用此技術，含於粗製海藻糖產物中伴隨之醣可被容易地 移去，以得海藻糖高含量產物。於此例子中，可任意地使 用任一種固定床，移動床及半移動方法。 爲了製備含水之晶狀海藻糖，將約6· 5—90%海 藻糖溶液置於結晶器中，在〇.1—20%種晶存在之 9 5°C以下，較好是1 0 _ 9 0°C下以搅拌方式逐漸冷卻 ，可得含有水性晶狀海藻糖之糖育。傳統方法，如分離， 成塊粉碎，流化床製粒及噴灑乾燥，均可應用於本發明中 ，以自糖菁中製成含水之晶狀海藻糖或含彼之晶狀醣。 於分離之例中，糖育通常接受藍式離心以自母液中分 出含水之晶狀海藻糖，且若必要時含水晶狀海藻糖經由少 量冷水之噴灌可洗滌，以促進純度增加之含水晶狀海藻糖 之製備。於噴灑乾燥之例中，不具有或實質上無吸濕性之 晶狀醣可容易地製備，係自髙壓泵噴嘴噴灑澳度6 0 — 85%，d. s - b 及結晶度約 20 — 60%，d. s. b之糖裔：以約6 0 — 1 0 0°C之熱空氣乾燥生成物，其 並不會熔化生成之晶狀粉末；並老化生成之粉末歷約1一 (請先閲讀背面之注^^項再填寫本頁) 裝- 訂 本紙張尺度適用中國國家榇準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -25 421673 經濟部中夬標準局—工消費合作社印製 A7 B7五、發明説明（23 ) 2 0小時，同時吹至約3 0 — 6 09C熱空氣中。於成塊粉 碎之例子中，可容易地製備無或實黉上無吸濕性之晶狀醣 ，係令濕度約1 0 - 2 5 %及結晶度約1 0 - 6 0 %，d .s. b之糖育靜置數小時至3天左右以將完整內容物結 晶及固化成塊，再粉碎或切割生成之塊狀物，並乾燥生成 物。雖然將含水晶狀海藻糖乾燥可轉化成無水型可製備無 水晶狀海藻糖，但其製備通常是提供濕度少於10%之髙 海藻糖含量溶液，溶液置結晶器中，溶液保持在種晶存在 下，溫度範圍爲5 0-1 6 0 °C，較好是8 0 — 1 4 0 °C ，在攪拌條件下以得含無水晶狀海藻糖之糖育，結晶之再 於乾燥及相當髙溫條件下，以如成塊粉碎，流化床製粒及 噴灑乾燥等傳統方法粉碎生成之無水晶狀海藻糖。 如此得到的本海藻糖是穗定的且實質上無還原力的， 且可與其他材料混合及處理，特言之爲胺基酸及含胺基酸 物質，如寡肽及蛋白質，勿需掮憂會造成令人不滿意的變 褐及味道，以及對材料有害。海藻糖本身有令人滿意的髙 品質及甜度。由於海藻糖易爲海藻糖酶水解成葡萄糖單位 ，當口服時其可爲活體同化，吸收及利用成熱源。再者， 海藻糖實質上不爲誘生蛀牙的微生物所醱酵，因此可充作 甜昧劑而不致誘生蛀牙。 本海藻糖可製成作用物，如輸注及插管進食之營養劑 ，其可任意投予至活體且可爲活體容易地代謝及利用，而 勿需懼怕毒性及副作用。因此，這些產物可有益地充作活 體之能量供應劑。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝_ 訂
J 本紙張尺度逋用中國國家橾準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -26 - 421673 A7 _ B7_ 五、發明説明（24 ) 海藻糖是一種穩定的甜味劑，且尤其是晶狀海藻糖可 任意充作錠劑之糖衣劑，此係當與結合劑合用時之用途， 如支鏈澱粉，羥乙基澱粉或聚乙烯肶咯啶酮。此外，海藻 糖具有以下特性，如渗透壓控制能力，充塡劑一授給能力 ，光澤一授給能力，保濕能力，粘度一授給能力，實質上 無釀酵能力，預防明膠化瀕粉逆降解之能力，及預防其他 醣結晶化之能力。 因此，本海藻糖及含彼之餹組成物，可任意地充作甜 味劑，口味改進劑，品質改進劑，穂定劑及充塡劑，於各 樣組成物中，如食品，香煙，煙草，飼料，化粧品及薬品 Ο 經濟部中央橾準局員工消費舍作社印製 -------iln^! (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁)
-Q 本海藻糖及含彼之醣組成物可完整地充作甜化之調味 劑。若必要時，其可配合一種以上適量的甜昧劑合用，如 粉末狀糖漿，葡荀糖，果糖，麥芽糖，蔗糖，異構糖，蜂 蜜，楓糖，赤蘇糖醇，山梨醇，麥芽糖酵，乳糖醇，二氫 査耳酮，斯替_替，α —糖基斯替維替，rebaudioside， 甘草皀苷，L~天冬醯基L 一苯丙胺酸甲酯，糖精，甘胺 酸及丙胺酸；及/或充塡劑如糊精，澱粉及乳糖。 本海藻糖及含彼之醣組成物，呈粉末型式或結晶型式 可完整使用，或者若必要時可與賦形劑，充塡劑，稀釋劑 及粘合劑混合於使用前形成顆粒劑，小球，短柱狀，平板 ，立方塊及錠劑。 本海藻糖及含彼之醣組成物，可與其他具酸味，酸性 ，鹼味，苦味，收歛性及美味的物質調和，且具有相當高 本紙張尺度適用中國國家標隼（CNS〉A4規格（210X297公釐） 27 42ϊ 673 Α7 Β7 五、發明説明（25) 的耐酸性及耐熱性。因此，其可有益地用於食品中，一般 是充作甜味劑，口味改進劑，及品質改進劑。 (請先閲讀背面之注$項再填寫本頁) 本海藻糖及含彼之醣組成物，可用於調昧料中，如胺 基酸，肽，醬油，醬油粉末，、味噌，，、funmatsu-miso，（一種味噌粉），、or〇W (—種精製的sake) ，^hishio# (—種精製的轚油），、fUrikake'(—種 季節性魚粉），美乃滋，調味汁，食用醋，"*5£ΐη5&ί-ζνι (一種糖，醬油及食用醋之醬汁），^funmatsu-sushi （一種薄司用之食用醋粉），ichuka-no-motof ( 一種用於中國菜之即食混合物），'"tentsuyu〃（一種日 本厚脂油炸食品用之醬汁），'"mentsuyu 〃（一種日本細 麵用之醬汁），醬汁，蕃茄替，lyakiniku-no-tare"( 一種日本烤炙之肉所用之醬汁），咖喱粉，即食燉料混合 物，即食湯料混合物，'"dashi-no-moto，（一種即食湯 原汁），核酸佐料，混合調味料，、ηιίι·ίιι〃 （一種甜的 s a k e ) ，、s h i u - m i r i η '( —種合成的 m i r i η )，烹飪用 糖及咖啡用糖。 經濟部中央標準局貞工消費合作社印裝 本海藻糖及含彼之組成物也可自由地用於甜化| wagashi’ （―種日本點心），如^senbei'(米餅乾） kingyoku'(— ，''arare-mochi’ （一種米製餅）i ’okoshi* ( — 種 粟及米製餅），、嫲糌，（一種米糊），、manju，（一 種有豆醤之麵包），（一種甜米凍），（ 一種豆替），、y 〇 k a η '(—種甜的豆凍），、m i z u-yoka〆（一種軟的zdzuki-豆凍），、 -28 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 42 彳 673 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7____ 五、發明説明（26) 種 yokan)，果凍，pao de castella 及'"araedama’ （一 種日本太妃糖）；糖果如麵包，餅千，硬餅干，小甜餅， 派，布丁，乳油，軟凍奶油，泡芙，威法餅，海棉蛋糕* 甜甜圈，巧克力，口香糖，焦糖及硬糖果；冷凍點心如冰 淇淋，冰凍果子露：糖漿如-syrup-zuke# (一種鹽漬水果）及、koriraits〆（刨冰用之糖漿）： 糊劑，如麵糊，花生糊，水果糊，及蓽膂；經處理之水果 及蔬菜，如醬，橘子醬，""syrup-zuk〆（水果醃汁）及 ' toka，（鹽清物）；醃汁及經醃過之產品，如 fukujin-zuke，（紅色辣根淸物），’bettara- zuk〆 (―種完全新鮮的辣根潰物），'"senmai-zuk〆（一種 切片之新鮮辣根漬物），及halikyo-zuke〃（醃過的慈 葱）：醃汁及醃潰物之預混物，如★takuan-zuke-no -111(^0〃（醃過之辣根預混物），及、1^1^3&丨-211116-11〇-moto〃 （新鮮白油菜之漬物預混物）；肉類產品如火腿及 香腸；魚肉產品如魚火腿，魚香腸，* kamaboko"(—種 蒸過的魚糊），icliikuva 〃（一種魚糊），及Menpura ’（日本式油炸魚糊）；％chinmi'(佐料）如Ή-ηο -shiokara〃（海膽鹽漬的內臟），Mka-no-shiokara # (烏賊鹽漬的內臟），％su-konbi^ (經處理過的海藻 )，* s a k i - s u r u m e 〃（炸過的烏賊條）及 * f u g u - η 〇-mirin-boshi 〃（油炸之mirin調味之河膝）；111 tsukudani 〃（於醬油中煮過之食物）如紫菜，可食野生 植物，乾烏賊，魚及貝：每天的菜如’nimaiae'(煮過之 (請先閲绩背面之注意事項再填寫本頁)
本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） 29 427 e73 A7 B7 五、發明説明（ 27 豆），馬鈴薯沙拉及、konbu-maki"(—種海藻卷）；乳 製品：罐頭及瓶裝食品，如肉，魚肉，水果及蔬菜食品； 油類飮料如合成的sake，酒及飲品：清涼飮料如咖啡，茶 *可可’果汁，碳酸飮料，酸乳飮料及含乳酸菌之飮料； 即食產品如即含布丁混合物，即食熱西點混合物，及* sokuseki-shiruco 種即食之有米糕之ad zuki-豆汁 經濟部中央標準局員工消費合作杜印製 混合物），及即食湯汁混合物；及飲料如嬰兒食品，治療 食品’及添加有營養品之飮料：以及改進上述食品口味及 品質之飮料。 本發明之海藻糖及含彼之醣組成物，可用於動物飼料 及寵物食品中，如家畜動物，家禽，蜜蜂，薄；，及魚類， 以改進其口味好惡。海藻糖及含彼之醣組成物可任意地充 作甜味劑，口味改進劑，品質改進劑及稻定劑，呈糊狀及 液體型式於其他產物中，如煙草，香煙，牙育，唇育，胭 脂，辱用乳育，內服藥，錠劑，含錠，鳕魚肝油（受油滴 型式），口香片，口服清涼劑，漱口劑，化粧品及藥物。 本海藻糖及含彼之醣組成物，可充作疑似喪失其有效 組份及活性之生物活性物質之品質改進劑及槺定劑，以及 用於含有生物活性物質之健康食品及薬學組成物中。此種 生物活性物質之實例有淋巴激素，如：—，及？·一 干摄素，腫瘤壞死因子一 a (TNF— π)，腫瘤壞死因 子一卢（TNF— /3〉，巨噬細胞移動抑制性因子，集落 刺激因子，轉移因子及間白素L ( I L 一 2 );激素如胰 島素，生長激素，催乳激素，促紅血球生成素及濾泡刺激 (请先閎請背面之注意事項界填寫本頁) .裝. 訂 私紙張尺度適用中國國家標準（CNS > Α4規格（210X297公釐} -30 經濟部中央標準局員工消费合作杜印製 4 2 1 6 7 B7 五、發明説明（28) 激素；生物製劑，如BCG疫苗，日本腦炎疫苗，麻瘓疫 苗，活小兒麻痺疫苗，天花疫苗，破傷風類毒素， Trimeresurus抗毒素及人類免疫球蛋白；抗生素如青徽素 ，紅撇素，氯徽素，四環素，鏈徽素及康徽素硫酸鹽；維 生素如硫胺素，核黃素，L 一抗壤血酸，饍魚肝油，胡蘿 葡素，麥角固醇，及生育酵；酵素如脂酶，弾性蛋白酶， 尿激酶，蛋白酶，β -澉粉酶，異澱粉酶，葡聚糖酶及乳 糖酶；萃取物如人參萃取物，烏翁萃取物，綠藻萃取物， 逋薈萃取物及propolis萃取物；有活力之微生物如病毒， 乳酸菌及酵母；及其他生物活性物質如蜂乳。利用本海藻 糖及含彼之醣組成物，上述之生物活性物質可容易地製成 健康食品及藥學組成物，有令人滿意之髙穩定性及品質* 且勿需懼怕喪失或鈍化其有效組份及活性。 如上述，本海藻糖及含彼之醣組成物納入上述物質及 組成物中之方法包括如：混合，捏和，溶解，熔化，浸泡 ，浸透，酒潑，應用，塗覆，噴湄，注射，結晶及固化。 海藻糖及含彼之醣組成物通常以0. 1 %以上之量納入上 述物質及組成物中，較好1%以上，d. s. b。 以下實驗說明衍自根瘤菌s p . Μ - 1 1及節桿菌 s p . Q 3 6微生物之本海藻糖釋放酵素之產製及純化， 以及自迄今已知之微生物所得者： 實驗1 由·根瘤菌s Ό. Μ— 1 1產製海藻糖顆放酶素 —•II-----: '裝-- (請先閎讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（21〇Χ297公釐） -31 - 421673 A7 B7 _ 五、發明説明（29) (請先閲讀背面之注$項再填寫本頁) 將含有 2. Ον^/ν%、ρΐΝΕ — DEX#4'( 一種 M a t s u t a n i C h e in i c a I I n d , C ο · , L t d · , K y o t ο , Japan之澱粉產物），0 . 5 w / v %胰化蛋白陳，
0. Iw/v%酵母浸菁，〇 lw/v%碟酸氫二納， 0. 6w/v%磷酸氫鉀及水之液體營養培養基調至pH 7。將每份1 0 0毫升之液體營養培養基置於5 0 0毫升 錐形瓶中，在1 2 0°C下滅菌2 〇分以達成滅菌，冷卻， 以根瘤菌 8p. M— 11 (FERM BP— 4130) 之種子培養物接種，再於2 7 °C下以1 3 0 r pm之攪拌 條件培育2 4小時。生成之培養物匯集，並充作種子培養 物。 相同液體營養培養基約2 0升之新鮮製劑，置於3 0 升之醱酵槽中，滅菌，冷卻至2 7°C，並接種1 w/v% 的種子培養物，再於2 7°C，pH6. 0 — 8. 0之捶拌 及需氧條件下培育約7 2小時。 累稹於培養物中之非還原性醣形成酵素及本海藻糖釋 放酵素之活性分別爲約1. 5單位/毫升及約2單位/毫 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 升。部份培養物以離心分出細胞及上清液，且細胞懸浮於 5 0mM磷酸鹽緩衝溶液（pH7. 0)以生成和此部份 同體積，再分析細胞懸液及上清液之酵素活性。在細胞懸 液中’非還原性醣形成酵素及本海藻糖釋放酵素之活性分 別爲約0· 6單位/毫升及約〇. 8單位/毫升，且在培 養物上清液中含有約〇. 9單位/毫升之非還原性醣形成 酵素，及約1 . 2單位/毫升之本海藻糖釋放酵索。 32 本紙張尺度逋用中國國家橾隼（CNS ) A4規格（210X297公釐） 421673 A7 B7 五、發明説明（3〇 ) 非還原性醣形成酵素之分析如下·· 1毫升的酵素溶液 加至4毫升 1 . 2 5w/v%麥芽五糖於5 OmM磷酸 鹽緩衝溶液中（PH7. 0)，且混合物溶液在4 0 °C下 培育1 0分鐘，再於1 0 0°C下加熱1 0分鐘以懸浮酵素 反應。生成之反應混合物以緩衝溶液精確地稀釋1 0次， 且以Somogyi-Nelson’s方法決定還原力。至於對照組，將 酵素溶液預熱至1 0 1 〇分鐘以鈍化酵素，再如上 分析之0.1單位的非還原性醣形成酵素之活性定義爲， 當以上述分析法分析時，消除每分鐘1微莫耳麥芽五糖還 原力所需之酵素量。 窗驗2 酵素之純化 約18升以上實驗1方法得到之培養物，以' Μ I N I — R A B 0’ （ 一種由 Daimppon Pharma C e u t i c a 1 C ο .，L t d，T o k y ο , J a p a η出品之超高壓細胞瓦 解裝置）處理以瓦解細胞。生成之懸浮液在1 〇，〇 〇 〇 r pm下離心3 0分，以得到約1 0升之上清液。加硫酸 銨至上清液中，並在其中溶解以生成〇. 2之飽和度，且 生成的溶液令其在4 °C下靜置1小時，在1 〇，〇 〇 〇 r p in下離心3 0分以得上清液。 加硫酸銨至生成之上清波中，並在其中溶解以得 0 - 6之飽和度，且生成之溶液在1 〇，〇 〇 〇 r pm下 離心3 0分，再回收沈澱物且再溶於1 〇mM磷酸鹽緩衝 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) -訂 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -33 · 經濟部中央摞準局員工消费合作社印製 4 21 6 7 3 ^ A? B7 五、發明説明（31) 溶液中（ρΗ7· 0)。如此得到之溶液以相同緩衝溶液 之新鮮製劑再透析2 4小時，並在1 0，0 0 0 r pm下 離心3 0分以移去不溶物質。生成之經透析溶液3 6 0毫 升，分成2份再分別接受管柱層析，管柱中充塡有3 0 0 毫升的 ' D E A E - T 〇 y 〇 p e a r 1 ® 〃 ，一種由 T 〇 s ο ίι
Corporation, Tokyo, Japan出品之離子交換器。 主題之非還原性醣形成酵素及海藻糖釋放酵素，吸附 在離子交換器上，並以添加不同鹽澳度之相同磷酸鹽緩衡 溶液之新鮮製劑，自管柱中分別溶離。管柱之溶離型式或 管柱層析圖示於圖1。非還原性醣形成酵素於約0. 2M 鹽濃度下自管柱中溶離，而海藻糖釋放酵素於約0. 3M 鹽澳度下自管柱中溶離。含任一主題酵素之流份分別匯集 及純化。 經匯集之含有非還原性醣形成酵素之流份，以添加有 2 Μ硫酸銨之相同磷酸鹽緩衝溶液之新鮮製劑透析。經透 析溶液在1 0，0 0 0 r pm下離心3 0分以移去不溶物 質，且生成之上清液再接受疏水性管柱層析，此管柱中係 充塡有 3 0 0 毫升、B c i t y 卜 T 〇 y 〇 p e a r 1 ® 6 5 (T，一種由
Tosoh Corporation, Tokyo, Japan出品之疏水性凝膠。 吸附在凝膠上之酵素以2 M至6 M線性梯度緩衝溶液自管 柱中溶離，再回收具有酵素活性之流份。生成之流份接受 凝膠過濾層析，所用之管柱中充塡有3 0 0毫升的 Toyopearl® Hff-55# ，一種用於凝膠層析之樹脂，由 Tosoh Corporation, Tokyo Japan出品，再回收具有酵素 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） 34 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 421673 A7 B7 五、發明説明（32 ) 活性之流份。 利用自'DEAE-Toyopearl®#管柱中溶離出的具海藻 糖釋放酵素活性之經匯集之流份，流份可類似非還原性醣 形成酵素製法中之純化步驟般處理，如此將之以含2 Μ硫 酸銨之緩衝溶液透析，並相繼接受疏水性管柱層析及凝膠 過濾層析。 於各純化步驟中，非還原性醣形成酵素之總酵素活性 ，比活性及產率示於表1，而海藻糖釋放酵素的示於表2 中。 (請先閎讀背面之法意事項再填寫本頁) 訂 經濟部中央標準局舅工消費合作社印製 本紙浪尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） ~ 35 ~ 421673 : A7 B7 五、發明説明（33 ) 表1 純化步驟 總酵素活性 ' 比活性 產率 (單位） (單位/ ⑴ 毫克蛋白質） 材料培養物 28,500 - 100 經細胞瓦解後 22,900 0.12 80 之上清液 鹽析後經透析溶液 21,100 0.43 74 自離子交換管柱 15,200 6 . 2 53 所得之溶離液 自疏水管柱得之 7,950 101 28 溶離液 自凝膠過濾管柱 5,980 197 21 得之溶離液 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 註，符號表示非還原性醣形成酵素 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -36 - 421673 A7 B7 五、發明説明（34 ) 表2 純化歩驟 總酵素活性_ (單位） 比活性 (單位/ 毫克蛋白質） 產率 (%) 材料培養物 37,400 - 100 經細胞瓦解後 31,500 0.17 84 之上清液 鹽析後經透析溶液 29,200 0.60 78 自離子交換管柱 25,400 5.3 68 所得之溶離液 自疏水管柱得之 18,700 98.5 50 溶離液 自凝膠過濾管柱 11,600 240 31 得之溶離液 (請先閣讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝. 訂 % 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 註：—符號表示本海藻糖釋放酵素 自表1及2中凝膠過濾管柱所得之溶離液中得到的經 純化之酵素製劑，在7. 5 %聚丙烯醯胺凝膠上檢視其純 度。結果，各酵素製劑可見一單一蛋白質帶，且此表示其 爲相當高純度之電泳上均質的製劑。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） -37 - 經濟部中央標準局負工消费合作社印製 421 673 4 Α7 Β7 五、發明説明（35 ) 窗驗3 海蓬糖釋放酵素之特件 以實驗2方法所得之經純化之海藻糖釋放酵素製劑， 取一部份接受電泳，凝膠中含有1 0 % SDS —聚丙烯 酿胺，並與 J a p a η B i 〇 - R a d L a b 〇 r a t 〇 r i e s , T 〇 k y 〇 ,
Japan之商品化標幟蛋白質比較，可估計出其分子量約爲 57，000-68，000道耳呑。 另一部份經純化之酵素製劑接受等電電泳，聚丙烯醯 胺凝膠中含有2 v/v%的兩性電解質’AMPH0LINE# ， 是由 P h a r m a c i a L K B B i 〇 t e c h u ο 1 〇 g y A B，ϋ p p s a 1 a，
Sweden出品。生成之凝膠切成片，再偵測其p H値且得酵 素之pi値爲約3_ 3 — 4. 3。 依酵素活性之分析法硏究本酵素活性上，溫度及p Η 値對彼之影響。結果個別示於圖2 (溫度之影響）及圖3 (pH之影響）。當在ρΗ7. 〇下培育3Q分，酵素之 最佳溫度爲約4 5°C，當在4 0°C下培育3 0分，則最佳 之pH爲約6. 0—7. 5。酵素熱穩定性之決定係將之 培育在不同溫度下之5 OmM磷酸鹽緩衝溶液（pH 7. 0)歷60分，緩衝溶液以冷水冷卻於試管中，再於 各緩衝溶液中決定留下之酵素活性。酵素p Η値穗定性之 決定則是培育在具不同pH値之5 OmM磷酸鹽緩衝溶液 中，2 5°C下歷1 6小時，pH値調至7，再分析各緩衝 溶液中留下之酵素活性。酵素之熱及p Η -穗定性結果分 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） -38 - -- 〇 > ---------裝-- (請先閲讀#面之注意事項再填寫本頁) 訂 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 4^1673 , A7 A7 -- B7 五、發明説明（36 ) 別示於圖4及5中。酵素可穂定髙至約4 〇〇c，及約5 — 1 〇之PH値下。 實驗4 直非還原性醸中郸備海藻糖，此醣息有海藻糖結墉爲末端 里位且有3以卜夕葡菊糖聚合作用葙麽 以具有海藻糖結構爲末端單位具有3以上葡荀糖聚合 作用程度之非還原性醣爲受質，此醣之製備是依日本專利 案No. 3 6 2，1 3 1/9 2中所述之方法而成。對充 作受質之含2 〇%麥芽三糖，麥芽四糖，麥芽五糖，麥芽 六糖或麥芽七糖之水溶液中加入2單位/克受質（d . s • b)之實驗2方法所得之經純化的酵素製劑，生成之混 合物再接受4 0°C及pH7 0之酵素反應4 8小時。反 應混合物加熱以鈍化留下之酵素，過濾，脫色，去鹽並濃 縮，以得濃縮之醣溶液，其再利用、ΧΤ — 1 0 1 6 (、 N a*-型，4 %聚合程度），一種由 Tokyo Organic C h e m i c a 1 I n (3 u s t r i e s，L t d . , T o k y ο , J a p a η 出品之離子 交換樹脂，進行管柱層析。於管柱層析中，離子交換樹脂 充塡至3個有汽套之不銹鋼管柱中，其具有2. 0公分內 經且長1米，再將之聯接，加熱至內部管柱溫度爲5 5 °C ，對樹脂施加5 v/v %濃縮的醣溶液，同時保持在 5 5°C，再以SV (空間速率）0· 13之5 5°C熱水充 塡，以得到高純度之非還原性酿，其具有充作末端單位之 海藻糖結構，及3以上之聚合作用程度。在生成之製劑中 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS〉A4規格（210X297公漦） (請先閎讀背面之注意事項再填寫表頁)
42 彳 67 3 A7 B7 __ 五、發明説明（37〉 ，葡糖基海藻糖製劑含有純度97.6%，d. s. b之 葡糖基海藻糖，且麥芽糖基海藻糖，麥芽三糠基海藻糖， 麥芽四糖基海藻糖及麥芽五糖基海藻糖在其高純度製劑中 之純度分別爲98. 6%，99. 6%，98. 3%及 9 8 . 1 % » d . s . b 0 含有上述5種非還原性醣製劑中各一者2 Ο %，d . s. b之水溶液，即糖基海藻糖製劑，製備妥再將之與2 單位/克受質（d. s . b)之實驗2所得之經純化的海 藻糖釋放酵素混合，生成之溶液接受酵素反應，在4 0°C ，pH7. 0下歷48小時。生成之各反應混合物脫鹽， 並在高性能液相層析（HPLC)上分析其組成，利用t WAKOBZADS WB-T- 300 管柱 # ，一種 ffako Pure Chemical I n d u s t r i e s L t d .，T o k y ο , J a p a η 之管柱。至於對照組， 令相同的海藻糖釋放酵素新鮮製劑作用在麥芽寡醣上，如 麥芽三糖，麥芽四糖，麥芽五糖，麥芽六糖及麥芽七糖， 且生成的各反應混合物以HP LC分析其組成。結果示於 表3中。 - --—•—^1 ^^1 m 1^1 -- n (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 經濟部中央榡準局貝工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS > A4規格（210X297公釐） 4 2 1 6 7 3 A7 B7 五、發明説明（38 ) 表3 經濟部中央標準扃員工消費合作社印製 受質 HPLC上之 流離時時 (分） 百分率 (¾) 萄糖基海藻糖 海藻糖 27.4 17.5 葡萄糖 33 . 8 6.5 萄糖基海藻糖 23.3 76.0 麥芽糖基海藻糖 海藻糖 27.4 44.3 麥芽糖 28.7 44.4 葡糖基海藻糖 21.6 11.3 麥芽三糖基 海藻糖 27.4 39.5 海藻糖 麥芽三糖 25.9 60.0 麥芽三糖基海藻糖 19.7 0.5 麥芽四糖基 海藻糖 27 . 4 34.2 海藻糖 麥芽四糖 24.1 6 5.5 麥芽四糖基海藻糖 18.7 0.3 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（力Ο X 297公釐） 41 421673 A7 B7 五、發明説明（39 ) (續） 麥芽五糖基 海藻糖 海藻糖 麥芽五糖 麥芽五糖基海藻糖 27.4 22.6 17.8 29 . 1 70.6 0 . 3 麥芽三糖 麥芽三糖 25 . 9 100 麥芽四糖 麥芽四糖 24.1 100 麥芽五糖 麥芽五糖 22.6 100 麥芽六糖 麥芽六糖 21.8 100 麥芽七糖 麥芽七糠 21.0 100 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 由表3之結果明白地顯示： 1. 依據本發明之海藻糖釋放酵素可特異地水解在非 還原性醣上介於海藻糖部份及糖基部份間之連接 ，此醣具有海藻糖爲末端單位且有3以上之葡萄 糖聚合程度，以形成海藻糖及具葡萄糖聚合程度 1以上之非還原性醣；及 2. 麥芽寡糖不爲本海藻糖釋放酵素所水解。 由道些結果可證實，本發明的海藻糖釋放酵素爲一種 極新穎的酵素，其具有可特異水解非還原性醣中介於海藻 糖部份及其餘糖基部份間連接之機制，且此醣具有海藻糖 結構爲末端單位，並具有3以上葡萄糖聚合程度，以自非 還原性醣中釋出海藻糖。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Μ規格（210X297公釐） 42 - 經濟部中央標準局员工消費合作社印裝 4 2 彳 6 7 3 :、 A7 B7 五、發明説明（40) 爲了純化各反應混合物中之海藻糖，反應混合物接受 管柱層析，其中管柱內充塡有*ΧΤ— 1 ο 1 6 (Na + —型）# 是一種由 T o k y ο 0 r g a u i c C h e m i c a 1 I n d u s t r i e s， Ltd., Tokyo, Japan出品之鹸金屬强酸陽離子交換樹脂 ，之後再回收海藻糖含量在9 7 %以上之流份。流份匯集 並再濃縮成約6 5%溶液，令濃縮物在2 5 °C下靜置2天 以使含水之晶狀海藻糖結晶，再分離並於眞空下乾燥，以 得髙純度之海藻糖製劑，其純度在99%以上，d. s. b。自葡糖基海藻糖，麥芽糖基海藻糖，麥芽三糖基海藻 糖，麥芽四糖基海藻糖及麥芽五糖基海藻糖充作受質所得 之海藻糖產率，分別爲9. 5%，14. 9%，16. 0 %，18. 5%及17. 7%(d· s. b)。髙純度的 海藻糖製劑及充作標準品之商品化海藻糖檢品，分析其熔 點，融合熱，比旋光度，紅外光吸收光譜，粉未X射線繞 射型式，及爲來自豬腎之海藻糖酶檢品（購自 Sigma Chemi ca丨Co . , St · Lou i s USA )水解之謫數。結果，每 一海藻糖製劑顯示出97. 0 土 〇_ 5 °C之熔點， 57. 8土1. 2仟焦耳/莫耳之融合熱，及+182土 1 . 1 °之比旋光度，且道些數値極相當於檩準海藻糖檢 品的，而海藻糖製劑之紅外光吸收光譜及粉末X射線繞射 型式和標準品的也極相當。和標準海藻糖檢品相似的’海 藻糖製劑可分解成葡萄糖單位。 由這些結果明顯地證實，非還原性醣，其由本海藻糖 釋放酵素作用在具有海藻糖結構爲末端單位且具有3以上 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210Χ297公;f ) 43 - (請先閲讀背面之注$項再填寫本頁) 訂 421673 A7 B7 五、發明説明（41) 葡萄糖聚合程度之非還原性醣上而形成，是海藻糖。
實賒S i_j肖還原性部份澱粉水緬物中製備海藻糖 含有5 %蠟質玉米澱粉之懸浮液使明膠化之，係將之 加熱，調至ρΗ4· 5，加熱至5 0 °C，並以每克澱粉混 合以4，0 0 0單位的異澱粉酶檢品（購自Hayashibara Biochemical Laboratories Inc., Okayama, Japan ) » 再接受酵素反應共歷2 0小時。反應混合物在1 2 0°C下 高壓滅菌1 0分鐘，冷卻至6 0°C，再接受凝膠過濾管柱 層析，利用管柱中充塡有7 5 0毫升的、Toyopearl® 50S凝膠〃（購自 Tosoh Corporation, Tokyo, Japan)以 得葡萄糖聚合作用有3 5 - 1 0程度之還原性部份澱粉水 解物。 如此得到之還原性部份澱粉水解物，或具有葡萄糖聚 合作用程度3之麥芽三糖任一者可充作受質，將之溶於 10mM磷酸鹽緩衝溶液（PH7. 0)中，此中1%溶 液再混合以4單位/克受質（d. s. b)的經純化的非 還原性醣形成酵素，及以實驗2方法所製備之經純化之海 藻糖釋放酵素，在4 0°C下接受24小時之酵素反應。於 酵素反應完全後，所生成的各反應混合物取一部份脫鹽， 再於H L P C上分析以鑑定其組成。 留下的各反應混合物，加熱至5 0°C，調整至ρ Η 4. 5，再以每克受質摻合5 0單位（d. s. b)的葡 本紙浪尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） -44 - (請先閎讀背面之注Ϊ項再填寫本頁) 裝· 訂 經濟部中央標準爲員工消费合作社印製 421673 A7 _B7___ 五、發明説明（42 ) 糖澱粉酶檢品（此購自Seikagaku-Kogyo Co‘，Ltd·，
Tokyo, Japan)，並接受2 4小時的酵素反應。類似上述 的，生成的各反應混合物，取部份脫鹽之再於HP LC上 分析其組成。結果示於表4。 表4 還原性部份澱 粉水解物之葡 萄糖聚合作用 程度 反應產物 組成物U) Αβ Β*' 34 .1 海藻糖 80.8 83.5 -s-t- -jf-f-r 葡萄糖 0.2 16.5 還原性寡醣 14.4 0.0 糖基海藻糖 4.6 0.0 26.2 海藻糖 79.7 82.5 葡萄糖 0 . 2 17.5 還原性寡醣 15.3 0.0 糖基海藻糖 4.8 0.0 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 -45 - (請先閲請背面之注意事項再填窝本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2丨0 X 297公釐） 421 673 . A7 B7 五、發明説明（43 ) (績） 經濟部中央標準扃負工消費合作社印裝 18.1 海藻糖 77 _ 7 80.7 葡萄糖 0 . 2 19 . 3 還原性寡醣 17.0 0.0 糖基海藻糖 5.1 0.0 15.2 海藻糖 75 . 0 78.5 葡萄糖 0.3 21.5 還原性寡醣 18.6 0 . 0 糖基海藻糖. 6.1 0.0 10.0 海藻糖 66 . 1 70.1 葡萄糖 0.3 29.9 還原性寡醣 27.6 0.0 糖基海藻糖 7.7 0.0 3 海藻糖 4 . 2 20.8 (麥芽三糖） 葡萄糖 2 . 1 79 . 2 還原性寡醣 65 . 0 0.0 糖基海藻糖 28.7 0.0 註：符號表示經非還原醣形成酵素及本海藻糖釋放 酵素之酵素反應後之組成物，且符號'表示經萄 糖基澱粉酶之酵素反應後之信號。於表中，^糖基海 - - If ^^^1 - - yr ί^-士! (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -46 - 42 1 673 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作杜印製 五、發明説明（44 ) 藻糖，表示非還原性醣，其具有海藻糖結構爲末端單 位及3以上葡萄糖聚合程度。 如表4中所述，於利用具有3葡萄糖聚合作用程度之 麥芽三糖爲受質之例子中，經非還原性醣形成酵素及本海 藻糖釋放酵素之酵素反應後生成之海藻糖產率十分低，即 4. 2%，而於使用部份澱粉水解物（其具有— 34.1之葡萄糖聚合作用程度）爲受質之例子中，海藻 糖之產率相當髙，即6 6· 1 — 8 0. 8%。頃發現，材 料之還原性部份澱粉水解物其葡萄糖聚合程度愈高時，所 生成海藻糖之純度愈高。也發現到，令葡糖澱粉酶作用在 由二種酵素水解還原性部份澱粉水解物而製備之反應混合 物上，可使生成之海藻糖純度更增加，此乃將伴隨的非還 原性醣（具有海藻糖結構爲末端單位及具3以上之葡萄糖 聚合程度〉水解成海藻糖及葡萄糖分子之故° 窗驗6 梅拉反應（Maillard Reaction) 含有1%甘胺酸，1 0%高砘度的海藻糖製劑（具有 99. 5%，d. s. b之純度，且由實驗4之方法得到 )及50mM磷酸鹽緩衝溶液（PH7. 0)之溶液*保 持在1 0 0°C下9 0分，再冷卻生成之溶液，並在4 8 0 毫微米下於1公分小池中決定其吸光度。至於對照組，葡 萄糖及麥芽糖如上述般類似地處理，且生成物接受4 8 0 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度通用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -47 - 421673 B7 .、發明説明（45) 毫微米波長下吸先度之檢査。結果示於表5中。 表5 醣製劑 著色程度（480毫微米） 海藻糖（本發明） 0.006’ 葡荀糖（對照組） 1 . 671 麥芽糖（對照組） 0.926 (锖先閲讀背面之注意事項存填寫本貫) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 由表5結果可證知，其中顯示依據本發明之海藻糖製 劑僅示出由梅拉反應誘生之些微著色現象，即著色程度僅 爲葡萄糖及麥芽糖之約0. 4—0. 6%。 結果顯示，本海藻糖實質上無梅拉反應。因此，本海 藻糖爲一種醣，其當與胺基酸混合時較不必怕會造成彼之 受害。 窗臁7 活镰內之利用試驗 依據 A t s u j i e t a 1 .,在、R i n s h 〇 - E i y 〇 ♦，V ο 1 · 4 1， No.2, pp.200-208 ( 1972)中所報告之方法，3 〇克髙純 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X29*7公釐> -48 - _ 經濟部中央標準局員工消費合作社印装 4 2 16 7 3 A7 B7 五、發明説明（46 ) 度之海藻糖製劑，具99· 5%d_ s· b純度，以實驗 4方法得到後溶於水中，使成爲2 0 w/v %水溶液，其 再口服至6位健康志願男子’ 2 6 ’ 2 7 ’ 2 8 ’ 2 9 ’ 3 0及3 1歲。在預定時間間隔下收集志願者血樣進行血 糖及胰島素水平分析°至於對照組則使用葡萄糖。結果’ 海藻糖製劑顯示和葡萄糖相同之動力學’即可於投藥約 〇 5—1小時後顯出血糖及胰島素最大水平。由此顯示 ，海藻糖製劑可容易地同化*吸化，.代謝及爲身髋利用爲 能量來源。 實驗8 急A毒性試驗_ 利用老鼠，將由實驗4方法所得之9 9. 5 % ( d . s. b)髙純度之海藻糖製劑口服至老鼠以進行急性毒性 試驗。結果顯示，海藻糖製劑爲相當低毒性之物質，且即 使以可能最髙劑量投予時仍無老鼠死亡。雖然並非精確， 海藻糖製劑之LD so在5 0克/公斤以上。 啻驗9 由節槔苗s n. Q36產生海藻糖釋放酵瘭 類似實驗1，將節桿菌sp· Q36 (FERM BP — 4 3 1 6 )之種子培養物以醱酵槽培養約7 2小時 ，以替代根瘤菌spx Μ - 1 1 (FERM BP — 4 1 3 0 )。於生成培養物中，非還原性醣形成酵素及本 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本育) X, 裝. 訂 -丨^' 本紙張尺度逍用中國國家標準（CMS〉A4说格（2丨0X297公釐） -49 - 42 1 673 A7 B7 五、發明説明（47) 海藻糖釋放酵素之活性分別爲約1. 3單位/毫升及約 1. 8單位/毫升。和實驗1類似地，分析由生成培養物 所製備之細胞懸浮液及培養物上清液。前者之非還原性醣 形成活性爲約5單位〆毫升，且海藻糖釋放酵素約 0. 5單位/毫升，而後者之非還原性醣形成酵素約 0. 8單位/毫升，且海藻糖釋放酵索爲約1. 3單位/ 毫升。 音驗1 〇一 雔素之純化 利用約18升以實驗9方法所得之培養物，所得之非 還原性醣形成酵素如實驗2般類似地純化。各純化步驟之 結果表列於表6中。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本筲) 訂 經濟部中央標準局員工消費合作社印裝 本紙張尺度適用中國國家梯事（CNS)A4規格（210x297公釐） -50 - 4 2 1 67 3 ，身 a? B7 五、發明説明（48 ) 表6 純化步驟 酵素活性’ 比活性（單位）產率U) (單位/毫克 蛋白質） 培養物 23,700 , - 100 細胞瓦解後上清液 22,400 0 . 15 95 以硫酸銨鹽析後經 20,200 0.51 85 透析之溶液 自離子交換管柱得 15,100 6,5 64 之溶離液 自疏水性管柱得之 8,450 115 36 溶離液 自凝膠過濾管柱得 6,120 217 26 之溶離液 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) h 裝 、tr. 1 經濟部中央標準局員工消費合作杜印製 註：符號表示非還原性醣形成酵素。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐）
17¾¾¾ 明（ A7 B7 經濟部中央梯準局員工消費合作社印製 421673 表7 純化步驟 酵素活性: 比活性（單位）產率（¾) (單位/毫克 蛋白質） 培養物 3 2, 5 0 0 — 100 細胞瓦解後上清液 30,100 0.19 93 以硫酸銨鹽析後經 2 5,4 0 0 0.72 78 透析之溶液 自離子交換管柱得 2 2, 700 22.3 70 之溶離液 自疏水性管柱得之 15, 200 215 47 溶離液 自凝膠過濾管柱得 11,600 497 36 之溶離液 註：符號，…〃表示本海藻糖釋放酵素。 由表6及7凝膠過濾管柱之溶離液所得之非還原性醣 形成酵素及海藻糖釋放酵素之經純化酵素製劑，利用如實 驗2相似之電泳研究酵素之純度。結果*其分別以單一蛋 白質精被觀察到，且此意味其爲可呈現電泳單一帶之相當 高純度之酵素製劑》___ ‘紙張尺度適用中國困家棣準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） (請先間讀背面之注意事項再填寫本頁)
-52 - A7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 421673 B7 五、發明説明（5〇 ) 實驗1 1 酵棄之特性 由實驗1 〇方法所得之經純化的海藻糖釋放酵素製劑 ，在SDS— PAGE上決定其分子量，可得約 57，000 — 67，000道耳呑。酵素製劑之pi値 在類似實驗3之等電電泳上決定，可得約3. 6—4. 6 之pI値。溫度及pH値對酵素活性之影響，以及熱糖定 性及p Η穗定性，如實驗3般類似地硏究。溫度影響， Ρ Η値影響，熱穗定性及Ρ Η穂定性之結果分別示於圖6 ，7，8及9中。 由圖中可證知，酵素製劑之最佳溫度爲約4 5 °C ;最 佳pH値約6. 0 - 7. 5;熱穩定性，高達約4 5 °C， 且pH値穩定性約5· 0-10. 0。 實驗1 2 自非擐Μ件醣中製備海蓮糖，眈醣具有海荡糖結構爲末端 簞位且具3以上之葡葡糠聚合作用程度 利用以實驗1 0方法所得之經純化之酵素製劑，海藻 糖可實驗性製備自非還原性醣，此醣依實驗4之方法具有 海藻糖結構及3以上之葡萄糖聚合程度。結果可顯示，酵 素製劑可自非還原性醣中釋出海藻糖，類似由根瘤菌s ρ .Μ — 1 1中所衍生者。 (請先閲讀背面之注$項再填寫本頁〕
本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4规格（210Χ297公釐） -53 - A7 B7 421673 五、發明説明（51) 實驗1 3 自已知微牛物中海蓮糖釋放酵素之產製及特性u 在已知之微生物中，微黃短桿菌（B. heUoUm)( ATCC 1 1 8 2 2 )及玫瑰色微球菌（M. roseus) (ATCC 1 8 6 )，已爲本發明者證實可產生本海藻 糖釋放酵素，將之如實驗1般分別在2 7 °C之醱酵槽中培 育7 2小時。各生成之培養物1 8升，接受細胞瓦解裝置 ，並離心以得上清液，再以硫酸銨相繼鹽析，透析，及接 受離子交換管柱，以得部份純化之酵素製劑，之後硏究其 特性。結果並加上根瘤菌sp.Μ—11及節桿菌sp. Q36者表列於表8。 (請先閲請背面之注意事項再填寫本頁) 訂 經濟部中央標準局貝工消費合作社印褽 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS )八4規格（210X297公嫠） 421673 A7 B7 五、發明説明) 經濟部中央操準局員工消費合作社印製 表8 触物 白離子交換管柱之溶離 液酵素活性（單位） 最佳難 (0〇 最佳p Η 熱穩定(。。） pH穩定性 B.helYOlum (ATCC 11822) 6,070 約40 約 6ϋ.8 高達約40 約5.5-9.5 M, raseus (ATCC 186) 3,010 約35 細.8 高達約30 約6.5-7.2 根瘤菌Μ-11 (FERM BP-4130) 25,400 約45 約6.0-7.5 高達約40 約5.0-10.0 節桿菌Q36 (FERM BP-4316) 22,700 約45 約6.0-7.5 高達約45 約5.0-10.0 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） - 42 1673 經濟部中央標準局員工消費合作杜印製 A7 B7_ 五、發明説明（53 ) 官驗1 4 海蓬糖釋放酵素之部份胺某酸序列 啻験1 4 ( 1 ) 含有N —末端之胺基酸序列 由實驗2方法所得之，由根瘤菌s ρ . Μ- 1 1衍生 之經純化的酵素製劑，及由實驗1 〇方法所得之，由節桿 菌s p . Q 3 6衍生之經純化的酵素製劑，各取一部份以 蒸餾水透析，且各生成之製劑約8 0微克蛋白質充作樣品 可決定其含有N_末端之胺基酸序列。胺基酸序列在％蛋 白質定序儀4 7 3 A 〃上分析，此裝置爲Applied Biosystems, inc., Foster City, USA的可顯示自其N — 末端起的1 0個胺基酸殘基◊酵素製劑含有N —末端之部 份胺基酸序列示於表9。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)
本紙張尺度適用中國國家標準（CNS > A4規格（210X297公釐） -56 - 4 2 1 6 7 3 .兌 B7五、發明説明（54 ) 表9 來源 含N -末端之部份 胺基酸序列 根瘤菌M-11 (FERM BP-4130) 丙胺酸-賴胺酸-脯胺酸-纈胺酸-穀胺醯 胺-甘胺酸-丙胺酸-甘胺酸-精胺酸-苯 丙胺酸 節桿菌Q36 (FERM BP-4316) 蘇胺酸-脯胺酸-蘇胺酸-酪胺酸-脯胺酸 -精胺酸-穀胺酸-精胺酸-丙胺酸-賴胺 酸 由表9可證知 ，根瘤菌Μ—1酵素製劑之N—末端爲 (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 丙胺酸，其繼以賴胺酸-脯胺酸一纈胺酸-穀胺醯胺-甘 胺酸一丙胺酸一甘胺酸-精胺酸-苯丙胺酸之胺基酸序列 。於衍自節桿菌Q 3 6之酵素製劑例中，N -末端是蘇胺 酸，並繼以脯胺酸—蘇胺酸一酪胺酸—脯胺酸—精胺酸一 穀胺酸-精胺酸-丙胺酸一賴胺酸之胺基酸序列。 窗驗14 (2) 內部部份胺基酸序列 以實驗2方法所得之，衍自根瘤菌Μ-11之經純化 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4规格（HOX297公嫠） -57 - 421673 A7 B7 五、發明説明（55 ) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 之酵素製劑，及以賁驗10方法所得之，衍自節桿菌 Q3 6之經純化之酵素製劑，取部份以1 OmM Tris— HCJ2緩衝溶液（PH9. 0)透析，且生成 物以新鮮製劑之相同緩衝溶液分別稀釋，至濃度爲約1毫 克/毫升。各生成之1毫升溶液中加入1 〇微克"LYSYL ENDOPEPTIDASE’ （爲 Walco .Pure Chemical Industries, Ltd., Tokyo, Japan之產物〉，再令其於3 0 °C下反應 2 2小時以形成肽，之後於逆相HP LC上分離。用來分 離根瘤菌Μ—11酵素製劑之肽之裝置及條件爲：在逆相 Η P L C 中爲 CAPCELL PAKC18管柱 # (4. 6 毫米直 徑，長 2 5 0 毫米）爲 Shiseido Co., Ltd., Tokyo, Japan之產物；流速，0. 6毫升/分；溫度，環境溫度 :溶離時間：6 0分：梯度，線性梯度，爲含〇. lv/ v%三氟醋酸及乙睛，由1 6 — 4 8 v/v%之溶液。用 來分離節桿菌Q 3 6酵素製劑之肽之裝置及條件爲：在逆 相 HPLC 中爲 ％#-B0NDAPAKC18管柱 # (2. 1 毫米 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 直徑，長 1 5 0 毫米）爲 a t e r s C h r 〇 m a t 〇 g r a p h y D i v ., MiLLIPOEE Corp., Milford, USA之產品；流速，0 . 9 毫升/分：溫度，環境溫度；溶離時間，6 0分；梯度爲 線性梯度，含0. lv/v%三氟醋酸及乙腈由30— 5 5 v/v%之溶液。自管柱中溶離出之肽，以2 1 0毫 微米波長之吸光度追踪而偵測之。自根瘤菌Μ—11之酵 素製劑中，有三個肽：RT41，TR46及RT54 < 分別具有約4 1，4 6及5 4之滯留時間）可與其他伴隨 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4C格（210X297公嫠） 421673 v. ΐ« 、 -Λ.- h -rr 娘；ϋ A 7 B7 概赞·ρ 56 之肽分離；而自節桿菌Q 3 6酵素製劑中，有三個肽： AT7，AT30及AT48 (分別具有約7，30及. 4 8之滯留時間）可與其他伴隨之肽分離，將分離的肽於 真空中乾燥，再溶於200微升有不同的0. 1 — 50v /v%乙腈濃度之溶液中。如此得到的各肽檢品於蛋白質 定序儀上分析其胺基酸序列高達1 0個胺基酸殘基。所分 析之內部部份胺基酸序列示於表1 0中。 表1 0 來源 肽 內部部份胺基酸序列 RT41 組胺酸-甘胺酸-穀胺酸-甘胺酸-天冬醯 胺-蘇胺酸-色胺酸-甘胺酸-天冬胺酸- 絲胺酸 經濟部中央標準局員工消費合作社印裝 根瘤菌 M-11 (FERM BP-41 30) RT46 天冬胺酸-榖胺酸-精胺酸-丙胺酸-纈 胺酸-組胺酸-異白胺酸-白胺酸-穀胺酸 穀胺酸 RT54 白胺酸-天冬胺酸-色胺酸-丙胺酸-穀胺 酸-丙胺酸-絲胺酸-丙胺酸-甘胺酸-天 冬胺酸 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)
私紙張尺度通用中國國家標隼（CNS ) A4規格< 2I0X297公釐） -59 - f/r -r 年月日4 85- 〇, 421873 -// A7 B7 57 (續） AT30 穀胺醯胺-甘胺酸-穀胺酸-甘胺酸-天冬 醯胺-蘇胺酸-色胺酸-甘胺酸-天冬胺酸 -絲胺酸 節桿菌 AT48 Q36 (FERM BP-4316)——— 天冬胺酸-穀胺酸-精胺酸-丙胺酸-纈胺 酸-組胺酸-異白胺酸-白胺酸-穀胺酸-天冬胺酸 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁} 經濟部中央標準局貝工消費合作社印製 AT7 白胺酸-天冬胺酸-色胺酸-丙胺酸-穀胺 酸-丙胺酸-丙胺酸-穀胺酸-甘胺酸-天^ 冬胺酸 由表10中可證知，在衍自根瘤菌M—11酵素之肽 RT41內部部份胺基酸序列中1〇個胺基酸殘基中有9 個與衍自節桿菌Q 3 6酵素之肽AT 3 0者符合，而肽 RT46中與AT48也有10個胺基酸殘基9個符合之 現象。於肽RT54及AT7之例子中，10個胺基酸殘 基中有8個相同。因此，可判斷衍自根瘤菌微生物之酵素 和衍自節桿菌微生物之酵素，在內部部份胺基酸序列上有 髙度同質性*此可由下列表示：白胺酸_天冬胺酸一色胺 酸一丙胺酸一穀胺酸一丙胺酸一 Xi— X2-甘胺酸一天冬 胺酸（其中Αχ，表示絲胺酸^或丙胺酸 私紙張尺度適用中國國家標準_( CNS > Α4说格（210Χ297公釐） 且 -60 — A7 42彳 673 __—______ B7 五、發明説明（58) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)
Xs"表示、丙胺酸〃或、穀胺酸〃）；天冬胺酸一穀胺 酸一精胺酸一丙胺酸一纈胺酸一組胺酸一異白胺酸一白胺 酸一榖胺酸一χ3(其中表示、穀胺酸#或、天冬 胺酸# );及Χ4 —甘胺酸—穀胺酸一甘胺酸一天冬醢胺 -蘇胺酸一色胺酸一甘胺酸一天冬醯胺—絲胺酸（其中I X，表示t組胺酸|或 '穀胺酿胺〃）。 以下實例Α說明本海藻糖釋放酵素之製備，以之製備 之海藻糖，及含海藻糖之醣組成物；而實例乃說明含一個 以上道些海藻糖之組成物及醣組成物： 實例A — 1 根瘤菌M_1 1之種子培養（FERM BP — 4 1 3 0 )接種至營養培養基中，再依實驗1之方法於醸 酵槽中培育約8 0小時。於培育完全後，生成之培養物過 瀘以移去細胞，利用SF —膜可得約1 8升之濾液，再以 U F _膜澳縮瀘液至約1升的酵素溶波，其中含有 17. 2單位/毫升之非還原性醣形成酵素及20. 8單 經濟部中央標準局負工消費合作社印製 位/毫升之本海藻糖釋放酵索。 對15%之馬鈴薯澱粉懸液，d. s. b，加入碳酸 鈣使終濃度爲0. l%(d. s. b)且生成之溶液調至 p Η 6 . 0，再與 0 · 2 %按重計之*TERMAMYL 601^ 混 合（一種α —澱粉酶檢品，購自Novo Industri A/S, Copenhagen, Denmark)，並接受 9 5 °C 之酵素反應 1 5 分鐘。反應混合物在2公斤/公分2壓力下高壓滅菌3 0 -61 - 本紙張尺度適用肀國國家楯率（〇灿）八4規格（210><297公釐） 421673 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（59) 分，冷卻至4 5Ό，再與1，0 0 0單位/克澱粉（d/ s . b )的 'PULLULANASE (EC3· 2 . 1 . 4 1 ) ^ 混合（其爲一種酵素檢品，購自Hayashibara Biochemical Laboratories, Inc., Okayama, Japan )及 〇. 2毫升/克澱粉（d. s. b)的上述酵素溶液混合 ，且接受4 8小時之酵素反應。反應混合物得到後保持在 9 5 °C下1 0分鐘，冷卻再過濾，生成之濾液以一般方式 以活性炭脫色，去鹽及以離子交換純化（H —及OH —型 )，再濃縮生成之溶液，得6 0%糖漿，産率約9 2% ( d . s . b ) 0 此糖漿，含有70. 2%海藻糖，2. 4%葡糖基海 藻糖，3. 3%麥芽糖基海藻糖，0. 7%葡萄糖， 10.1%麥芽糖，12. 9%麥芽三糖及0. 4%麥芽 四糖及更髙級之寡糖，d. s. b，具有中度及髙品質之 甜味，及相當低的還原力，以及適合的粘度及保濕性。由 於此其可任意地用於食品，化粧品及藥品中，充作甜味劑 ，口味改進劑，品質改進劑，穩定劑，稀釋劑，充塡劑及 賦形劑。 窗例A — 2 充作飼料溶液的醣溶液，以實例A- 1方法獲得，利 用充塡有— 1 0 1 6 (Na+—型，4%之聚合作 用程度）（一種購自 Tokyo Organic Chemical Industries Ltd., Tokyo, Japan之齡金屬强酸陽離子交 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) b '裝· 訂 本紙張尺度適用中國國家榇準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） -62 - 421673 A7 B7 五、發明説明（6〇 ) 換樹脂）之管柱分級分離。其步驟如下：樹脂充塡於4個 有汽套之不銹鋼管柱中，其具有5. 4公分之內徑，且管 柱聯接使凝膠床總深度爲2 0米。管柱加熱使內部管柱溫 度爲5 5 °C，再充塡以5 v/v%醣溶液同時保持溫度， 再充塡以5 5 °C熱水以分級分離醣溶液並移去摻雜的醣， 如麥芽糖及麥芽三糖，之後回收富含海藻糖之流份。如此 得到之流份匯集，純化，濃縮，眞空乾燥並粉碎以得產率 約56%(d. s. b)之髙海藻糖含量粉末。 產物中海藻糖含惫約9 7% (d. s. b )，且產物 具有中及髙品質甜度，且因爲此其可任意使用於食品，化 粧品及藥品中，充作甜味劑，口味改進劑，品質改進劑， 穗定劑，賦形劑及充塡劑。 窗例A _ 3 以實例A — 2方法所得之髙海藻糖含量流份，以一般 方式利用活性炭脫色，離子交換脫鹽，及濃縮成約7 0 % 溶液，其再置於結晶器中，與約2 %含水晶狀海藻糖充作 種晶摻和，再逐漸冷卻以得到結晶度約4 5%之糖膏。糖 育自裝置在乾燥塔頂之噴嘴中以1 5 0公斤/公分2萵壓 噴灑。在噴灑步驟中，糖育同時通以8 5 °C熱風（巳被送 至乾燥塔頂），所生成之晶狀粉末收集在乾燥塔底部之金 屬網輸送帶上，逐漸移出乾燥塔同時令4 5 °C空氣氣流由 金屬網向上通過。生成之晶狀粉末注入老化塔中置10小 時以使結晶完全，再乾燥，之後回收粉狀含水晶狀海藻糖
Itt- n ^^^1 ^^^1 —^1 ^^^1 n (請先閎讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Μ規格（210X297公釐〉 -63 - 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 421673 A7 _B7 五、發明説明（61 ) ，對原料之髙海藻糖含量流份而言之產率約9 0 % ( d . s b ) 〇 產物實質上是無吸潮性的且易處理，且如此使其可任 意用於食品，化粧品及藥物中，充作甜味劑，口味改進劑 ，品質改進劑，穗定劑，賦形劑及充塡劑。 管例A - 4 以實例A- 2方法所得之高海藻糖含量之流份，類似 實例A - 3般純化，且生成物置蒸發器中，在眞空下煮開 以得水汽含量約3· 0 %之糖漿。生成之糖漿置於結晶器 中，以1 %無水晶狀海藻糖（就糖漿之乾重而言）摻和， 在1 2 0°C下結晶5分鐘（在攪拌條件下），且生成之混 合物置於鋁面容器中並老化於1 0 0°C下6小時以得塊狀 物。 生成之塊以切割機粉碎，再於流化床乾燥器上乾燥可 得粉狀無水晶狀海藻糖，水汽含量約0. 3%，就高海藻 糖含量流份而言產率約8 5% (d. s. b)。產物可任 意地用於食品，化粧品，藥品及其材料及中間物中，且也 可充作白粉狀甜味劑於各種組成物中，如食品，化粧品及 藥品中。 實例A _ 5 依據實例A— 1之方法，根瘤菌Μ — 1 1 (FERM ΒΡ — 4 1 3 0 )突變種之種子培養物接種至營養培養 (請先閎讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝· 訂 本紙張尺度適用中國國家棵準（CNS M4規格（210X297公釐） -64 - 421673 A7 B7 五、發明説明（62) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 基中，再於醱酵槽中培育約7 0小時。培育完全後，生成 之細胞以SF—膜過濾，可回收約1 〇 〇升濾液，其再以 UF_膜澳縮可得約5升酵索溶液，含有約410單位/ 毫升的非還原性醣形成酵素，及約4 9 0單位/毫升的海 藻糖釋放酵素。 6%馬鈴薯澱粉懸液以加熱凝膠化，調至PH4. 5 ，加熱至50 °C，再與500單位/克澱粉（d, s. b )之異澉粉酶檢品混合（購自Hayashibara Biochemical Laboratories, Inc.，Okayama, Japan)並接受 2 0 小時 之酵素反應。反應混合物調至pH6 . 5，在1 2 0°C下 加壓滅菌10分鐘，冷卻至9 5 °C，與0. 1% /克澉粉 (<1.3.1))的”£]11^11丫1^601^混合（一種《—澱粉 酶檢品，購自 N 〇 v ο I n d u s t r i A / S C 〇 p e n h a g e n D e n m a r k ) ，並接受1 5分鐘之酵索反應。反應混合物在1 3 0°C下 高壓滅菌3 0分，冷卻至4 5 °C，與0. 0 1毫升/克澱 經濟部中央標準局員工消費合作杜印製 粉（d. s. b)的上述反應溶液混合，並接受6 4小時 之酵素反應。生成之反應混合物保持在9 5 °C，1 〇分鏟 ，冷卻至5 0°C，調至PH5. 0，再與1 0單位/克澱 粉（d . s b )的' GLUC0ZYME〃混合（一種葡糖基澱 粉酶檢品，購自 N a g a s e B i 〇 c h e m i c a 1 s，L t d . , K y 〇 t 〇， Japan)，接受4 0小時之酵索反應再加熱滅活其餘的酵 素。如此得到的溶液以一般方式以活性炭脫色，以離子交 換去鹽再渙縮成約60%溶液，其中含有80. 5%海藻 糖（d. s. b)。溶液濃縮成約8 4%溶液，再置結晶 -65 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 42 1 673 A7 B7 五、發明説明（63 ) 器中並與約2 %含水晶狀海藻糖混合，後者係充作晶種且 係就溶液之乾重對晶狀海藻糖而言之比率在攪拌條件下加 入。生成物置平底塑質槽內，令其在環境溫度下靜置3天 以形成塊狀物，再以切割機粉碎得到粉狀無水晶狀海藻糖 ，產率爲對材料澱粉而宵約90%，d. s. b。 產物實質上是非吸濕性的，且易於處理，如此使其可 任意用於各種組成物中，如食品，化粧品，及薬品，充作 甜味劑，口味改進劑，品質改進劑，穩定劑，賦形劑及充 塡劑。 實例A — 6 節桿菌Q36(FERM BP-4316)微生物 之種子培養，接種至營養培養基中，再培養於酸酵槽中歷 7 2小時，依實驗9方法進行。生成之培養物在 1 0，0 0 0 r pm下離心3 0分以移去細胞，生成之上 清液再以U F _膜濃縮以得1升酵素溶液，其中含有 1 6 . 3單位/毫升的非還原性醣形成酵素，及2 5 1 單位/毫升的本海藻糖釋放酵素。 1份按重計之馬鈴薯澱粉，混合以6份按重計的水及 0.0 1份按重計之％心0-5?11々5£#(—種〇?-澱粉酶 ，購自 U a g a s e B i 〇 c h e m i c a 1 s L t d ·，K y 〇 t 〇 , J a p a η )，且 生成之混合物搅拌混合，調至PH6. 2,再加熱至85 一 9 0°C以明膠化及液化澱粉。生成之液化澱粉在 1 2 0°C下高壓滅菌1 0分鐘，以滅活其餘的酵素，冷卻 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本I) ·-C3 裝. 訂 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS )八4規格（210X297公釐） -66 - 421673 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7___ 五、發明説明（64 ) 至4 5°C，與5 0 0單位/克澱粉的異澱粉酶混合（購自 Hayashibara Biochemical Laboratories, Inc.,
Okayama, Japan)，並加上0. 2毫升/克減粉的上述酵 素溶液，再接受4 8小時之酵素反應。於反應完全後，反 應混合物加熱至9 5 °C歷1 0分鏟以滅活其餘的酵素，調 至5 0°C及PH5 . 0，與1 0單位/克澱粉之^ GLUCOZYME 〃混合（一種萄糖基澱粉酶，購自Nagase Biochemicals Ltd.，Kyoto, Japan) » 再接受 4 0 小時 酵索反應，並加熱以滅活留下之酵素。如此得到之反應混 合物以一般方式以活性炭脫色，以離子交換去鹽，並濃縮 成約60%溶液，含有78· 3%的海藻糖（d. s. b )。依據實例A— 2中之方法，但利用離子交換樹脂'" CG 6 0 0 0 (Na+ —型）〃除外，其爲一種鹸金腾 强酸性陽離子交換樹脂，可購自Japan Organo Co., Ltd. ，Tokyo, Japan，經澳縮的溶液接受離子交換管柱層析， 可得含有約9 5%海藻糖，d. s. b之髙海藻糖含量之 流份。流份濃縮可得7 5%濃度，置於結晶器中，加約2 %含水晶狀海藻糖爲種晶，在搅拌條件下結晶，轉移至塑 質容器內，令其靜置並在環境溫度下老化3天以得塊狀物 ，之後粉碎得粉狀含水晶狀海藻糖，對材料澱粉而言之產 率爲約70%，d. s. b。 產物，其實質上無吸潮性且易於處理，可任意地充作 甜味劑，口味改進劑，品質改進劑，賦形劑，充塡劑及稀 釋劑，於各樣的組成物中如食品，化粧品及藥品。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)
本紙張尺度適用中國國家標準（CNS } A4規格（210X297公釐） -67 - 42 1673 ， A7 __B7___ 五、發明説明（65 ) 實例A — 7 依據實驗1 3中之方法，微黃短桿菌（ATCC 1 1 8 2 2 >微生物之種子培養，接種至營養培養基中， 並以醱酵槽培養約7 2小時，生成之培養物再以細胞瓦解 裝置處理。生成的混合物在1 0，0 〇 〇 r pm下離心 3 0分以移去殘留物，且生成之上清液利用UF_膜濃縮 ，再回收約7 0 0毫升溶液，其中含有約8單位/毫升的 非還原性醣形成酵素，及約1 2單位/毫升的海藻糖釋放 酵素。
33%樹薯澱粉懸液與碳酸鈣混合，得到〇.1%終 濃度，再調整至PH6· 0且與0· TEKMAMYL 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 60L，混合（一種 cr —澱粉酶，購自 Novo Industri A/S, Copenhagen, Denmark，並接受9 5 °C下2 0分鐘之酵素 反應。生成之反應混合物在2公斤/公分2之壓力下高壓 滅菌3 0分，冷卻至4 0°C，2 0 0單位/克澱粉的異澱 粉酶混合（其購自 Hayashibara Biochemical Laboratories, Inc., Okayama, Japan)，並加上 0 , 2 毫升/克澱粉之上述酵素溶液，再接受4 8小時之酵素反 應。反應混合物得到後保持在9 5 °C下1 0分鐘，冷卻及 過濾後可得濾液，其再以一般方式以活性炭脫色，以離子 交換去鹽（H —及OH —型），並濃縮生成6 0%糖漿， 產率爲約90%，d. s· b。 產物含有60·1%海藻糖，1. 4%萄糖基海藻糖 68 (請先閲讀背面之注^^項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 421673 A7 B7 五、發明説明（66 ) ，1.5%麥芽糖基海藻糖，1· 〇%葡荀糖，6. 5% 麥芽糖，8. 3%麥芽三糖，21. 2%麥芽四糖及更高 級寡糖，其具有中及高品質之甜度，以及極低之還原力， 及適度的保濕力。基於此，其可任意應用於各種組成物中 ，食品，化粧品及薬品中，充作甜味劑，口味改進劑，品 質改進劑，穩定劑，賦形劑，充塡劑及稀釋劑。 音例A - 8 由實例A — 6方法所得之含有約9 5 %海藻糖之高海 藻糖含量溶液，以一般方式脫色及去鹽。生成的溶液濃縮 至約7 5%溶液，其再轉移至結晶器中，與約2%含水晶 狀海藻糖充作種晶混合，加熱至5 0°C，逐漸冷卻至 2 5 °C而仍攙拌，再接受藍式離心機之分離。生成之晶體 經由少量水之噴溷而洗滌，可得純度在9 9 %以上之高純 度含水晶狀海藻糖，產率約5 0 %。 窗例B _ 1 經濟部中央標準局員工消費合作社印黎 甜味劑 對1份按重計之粉末含水晶狀海藻糖，以實例A — 5 之方法所得的，均勻地加入〇 0 1份按重計之'"aG SWEET，（一種江一糖基斯替維苷產物，購自To yo S u g a r R e f i n i n g C ο ，L t d . , T o k y ο，J a p a η )及 0 0 1 份按重計之、ASPARTAME# (—種L—天冬胺醸基一L-苯丙胺酸甲酿’購自 Ajinomoto Co.，Ltd.，Tokyo, ~ 69 - (請先閎讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（0X297公釐） A7 B7 五、發明説明（67 )
Japan)，生成的混合物加至製粒機中以得顆粒狀甜味劑 。產物具有令人滿意之甜莩，且有較蔗糖高約2. 5倍之 甜度，熱置値較蔗糖低至約2/5。 由於產物有令人滿意之穗定性及不會分解欲混合之其 他甜味劑，因此其逋用作低熱量之甜味劑應用於肥胖個人 及糖尿病而熱置攝取受限者之低熱量食品中。 產物實質上當誘生蛀牙之微生物作用其上時，並不會 形成酸及不溶的荀聚糖，因此其可用於甜化食品而預防蛀 牙〇 實例B _ 2 硬糖果 經濟部中央標準局負工消費合作社印聚 1 0 0份按重計的5 5%蔴糖溶液，在加熱下混合物 以3 0份按重計之海藻糖糖漿，後者以實例A — 7之方法 得到，且生成之溶液眞空澳縮直到水汽含量低至2 %以下 。經濃縮的溶液再混合以1份按重計之檸檬酸，及逋量檸 檬香料以及著色劑，生成之混合物以一般方式形成欲求產 物。 產物是高品質之硬糖果，具有令人滿意之口昧及刺激 特性，以及勿需害怕會造成蔗糖之結晶化作用。 實例B — 3 口香糖 3份按重計之膠基劑，加熱熔融至軟化，生成物再混 -70 - (請先W讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 經濟部中央揉率局另工消費合作社印衷 42 ί 673 at Β7 五、發明説明（68) 合以4倍按重計之蔗糖及3份按重計之含水晶狀海藻糖粉 末（以實例A — 3方法獲得並進一步混合以適量之香 料及著色劑。生成之混合物以一般方式由滾筒捏製，成型 再包裝成欲求產物。 產物爲具令人滿意之觸感及口味之口香糖。 實例B - 4 甜化之煉乳 3份按重計之海藻糖糖漿（以實例A— 1方法獲得） ，及1份按重計之蔗糖，溶於1 0 0份按重計之新鮮牛乳 中，生成的溶液以平板加熱器加熱滅菌，再縮合成7 0 % 濃度，之後在無菌下裝罐此生成之濃縮物成欲求產物。 產物具有中度甜度及令人滿意之口味，且如此使其可 任意充作嬰兒食品，孩童食品，水果，咖啡，可可及茶中 之調味品。 青例B - 5 乳酸飲品 1 7 5份按重計之脫脂乳，1 3 0按重計之海藻糖糖 漿（以實例A — 1方法獲得），及5 0份按重計之髙乳蔴 糖含量粉末（如日本專利公開公報No. 281，795 /9 2中所揭示）溶於1 1 5 0份按重計之水中。生成的 溶液在6 5°C下滅菌3 0分，冷卻至4 0°C，再接種以 3 0份按重計之乳酸菌爲起始者，之後在3 7 °C下培育8 本紙張又度適用中國國家標準（CNS ) A4规格（210X297公釐）
421673 A7 B7 五、發明説明（69 ) 小時以得欲求產物。 產物爲乳酸飮品，具有令人滿意之口味及香昧。由於 產物含有寡糖，其可穩定保有乳酸菌並促進雙岐桿菌之生 長0 官例B - 6 裔 % 經濟部中央樣準局員工消费合作社印製 果汁粉L 33份按重計之橘子汁粉由噴灑乾燥製成/將之與 5 0份按重計之高海藻糖含量粉未均勻混合（以實例A — 2方法獲得），再加上10份按重計之蔴糖，0. 65份 按重計之無水檸檬酸，0. 1份按重計之蘋果酸，0. 1 按重計之L—抗壤血酸，〇. 1份按重計之檸樺酸鈉， 0. 5份按重計之支鏈澱粉，及適董的香料粉末。生成之 混合物粉碎，並加至流化床製粒機上以得顆粒，同時喷以 充作粘合劑之海藻糖糖漿，其以實例A - 1方法獏得，並 通以4 0°C之空氣。如此得到之顆粒稱重再包裝以得欲求 產物。 產物中含有3 0%橘子汁（d. s. b)可長期保有 髙品質而不致有令人不滿意之口味及味道。 實例B _ 7 乳蛋糕乳脂 1 〇 〇份按重計之玉米澱粉，1 〇 0份按重計以實例 A- 7方法得到之海藻糖糖漿，8 〇份按重計之麥芽糖， 本紙張尺度遗用中國國家操準（CNS ) A4規格（210X297公着：） -72 - I Ϊ t 經濟部中央揲準局貞工消費合作社印裝 421 673 1 A7 B7 五、發明説明（70) 2 0份按重計之蔗糖，及1份按重計之鹽混合均匀。生成 之混合物與2 8 0份按重計之蛋混合，並逐漸加入 1 0 0 0份按重計之沸騰的牛乳。混合物得到後再繼績攪 拌於加熱條件下，當玉米澱粉完全凝膠於混合物中生成完 全半透明狀時停止加熱，再冷卻混合物並於其中加入適量 的香草香料。生成之混合物稱重，注入並包裝以得欲求之 產物。 產物有平滑外表及光澤，以及緩和口味及甜度。 窗例8
Uiro-TiQ-moto (澱粉糊預混物） 9 0份按重計之米粉，2 0份按重計之玉米澱粉， 4 0份按重計之蔗糖，8 0份按重計之含水晶狀海藻糖粉 末（以實例A — 3方法獲得），及4份按重計之支鏈澱粉 ，混合均勻以得Uiro-no-moto。產物以適量matcha (綠茶 )及水捏和，混合物置容器中再向上吹蒸汽歷6 0分，以 得到 matcha-uiro。 產物具有令人滿意之光澤及刺激特性，以及令人滿意 之香味及口味，且有極長之貯架期因激粉之退減作用被充 份抑制。 窗例B — 9 A n_ (豆糊） 1 0份按重計之adz uki豆充作原料，以一般方式與水 本紙乐尺度逍用中國國家揉準（CNS ) A4规格（2I0X297公釐） (*wf彙之法—««f表買) :WISH- 42 ί 673 Α7 Β7 經濟部中央標準局貞工消費合作社印裝 五、發明説明（71) 混合再煮沸，再移去豆之收歛性，粗澀性，及水溶性雜質 以得約2 1份按重計之'•'adzuki-tsubu-an* 。於生成物 中加入1 4份按重計之蔗糖，5份按重計之海藻糖糖漿（ 以實例A—1方法得到），及4份按重計的水，生成之混 合物煮沸，混合以少量沙拉油，再小心捏和如此不使豆子 變糊。因此，欲求的產物可得約3 5公斤產率。 產物並無煮沸可誘生之變色，且如此使其可充作原料 用於有豆雔之麵包，有豆醬充塡之麵包，粞，有苴轚之威 法餅，水凍果子露及冰淇淋。 官例B — 1 0 麵包 1 0 (3份按重計之小麥粉，2份按重計之酵母，5份 按重計之糖，1份按重計之含水晶狀海藻糖粉（以實例A 一3之方法獲得），0.1份按重計之無機酵母食品，加 水以一般方式捏和，在2 6°C下醱酵2小時，老化3 0份 鐘再焙烤。 產物爲高品質之麵包，具有令人滿意之色調及隆起， 以及令人滿意之彈性及中度甜度° 音例B — 1 1_ 火腿 對1 0 0份按重計切片之火腿肉，加入1 5份按重計 的鹽及3按重計之硝酸鉀，並磨至均匀，且火腿肉片堆起 本紙張尺度逍用中國蔺家標準（CNS)A4规格（ 210X297公釐） -74 _ (请if #之涑f項-s-f4霣>
.-V 泌· 經濟部中央搮準局負工消費合作社印掣 4 21 6 7 3 A7 ___B7 __ 五、發明説明（72 ) 來再靜置於冷藏室中—夜。之後生成之薄片先浸於含有 5 0 Q份按重計的水，1 〇 〇份按重計的鹽，3份按重計 之硝酸鉀，4 0份按重計含以實例A — 4方法製成之非還 原性醣粉末，及適量的薄荷的鹽溶液中7天，於冷藏室中 進行，再以冷水以一般方式洗條，綁緊，煙動，烹煮，冷 卻及包裝以得欲求產物。 產物爲髙品質火腿，具有令人滿意的色調，口味及香 味0 實例B — 1 2 肽粉 1份按重計的'"HIMTES'(—種肽溶液，含有4 0 % 可食性大豆，購自 Fuji Oil Co.., Ltd., Tokyo,
Japan )混合以2份按重計之以實例A - 6方法製備之含 水晶狀海藻糖粉末，生成之混合物置塑質容器中，在 5 0°C眞空下乾燥，再粉碎以得肽粉末。 產物具有令人滿意之口味及香味，可任意充作原料用 於點心中，如預混物，冰凍果子露及冰淇淋，以及嬰兒食 品及治療用營養品，可呈口服或插管餵食型式。 實例B — 1 3 m i s 〇 粉 對1份按重計之akamiso (—種miso)，加入3 份按重計之無水晶狀海藻糖粉末（以實例A - 4方法得到 本紙張尺度逋用中國國家樣準（CNS ) A4规格（210X297公釐} -75 - (请if*之注f备f本霣)
421673 A7 B7 五、發明説明（73 ) )，且混合物倒入金厲盤上，其表面有半球型孔洞，令其 在環境溫度下靜置一夜可得m i s 〇固體粒子*各約重4 克，再將之粉碎生成欲求產物。 產物可任意充作即食麵條及湯之調味料，以及 m i s 〇點心。 眚例B — 1 4 之 注 經濟部中央揉準局属工消費合作社印裝 蛋黃粉末 製備自新鮮雞蛋 一 6 4 °C )，且 1 份 計，以實例A — 4方 1份按重計液體而言 靜置一夜後形成塊狀 水之晶狀海藻糖。如 粉末狀蛋黃。 產物可任意充作 露，冰淇淋及乳化劑 口服或插管餵食型式 原劑。 的蛋黃，在平板加熱器上滅菌（6 0 按重計生成之液體再混合以4份按重 法製備之無水晶狀海藻糖粉末，此就 。生成之混合物轉移至容器中，令其 ，同時令無水晶狀海藻糖可轉化成含 此得到的塊狀物以切割機粉碎，以得 點心之原料，用於預混物，冰凍果子 ，以及嬰兒食品及治療用營養品，呈 。產物也可充作皮虜精練劑及頭髮復 實例B — 1 5 化粧乳液 2份按重計之聚氧乙二醇單硬脂酸酯，5份按重計之 單硬脂酸甘油酯，自我乳化，2份按重計之高海藻糖含量 項 驀 f 本 Ϊ 貧 本紙張尺度逍用中國國家標準（CNS ) A4规格（210X297公釐） -76 - 經濟部中央梂準局貝工消費合作社印製 4 21 6 7 3 -ί Α7 _____Β7 五、發明説明（74) 粉末（以實例A— 2方法獲得），1份按重計之议一糖基 芸香替》1份按重計之液體石蠘，1 0份按重計之三—2 -乙基己酸甘油酯，及適當的抗菌劑，以一般方式加熱溶 解。生成的溶液與2份按重計之L —乳酸，5份按重計之 1，3 —丁二醇及6 6份按重計之精製水混合，生成的混 合物以勻漿機乳化，再混合以適量的香料，在攬拌條件下 可得化粧品乳液。 具有相當髙穂定性之產物可任意充作髙品質之防隳劑 ，皮麻精練劑及漂白劑。 實例Β - 1 6 人參萃取物粉未 〇. 5份按重計之人參萃取物混合以1. 5份按重計 之無水晶狀海藻糖粉末（以實例Α — 4方法製備），生成 的混合物轉移至普通容器，令其靜置2天以使無水晶狀海 藻糖轉化成含水晶狀海藻糖，而形成塊狀。生成之塊狀以 切割機粉碎並分類以得粉末狀人參萃取物。 將產物及逋量的粉末維生素Β 1及Β 2接受製粒以得 含有維生素之人參萃取物粉未。 如此得到之產物可任意充作緊張，疲勞舒緩劑，及活 力提供劑。產物也可充作頭髮復原劑。 啻例Β — 1 7 固體薬物 (請·之泣本霣) 幸 本紙張尺度適用中國國家梯準（CNS ) Α4规格（210X297公釐） 77 經濟部中央#準局貝工消費合作社印製 421673 A7 B7 五、發明説明（75) 天然的人類干擾素一<?製劑（購自Ccsmo Bio,
Tokyo, Japan)以一般方式充塡至經固化之抗一人類干捶 素- α抗體管柱中，以吸附干捷素- α，再將含有牛血清 白蛋白爲穗定劑之緩衝溶液充塡至管柱中，之後移去過量 的白蛋白。之後，干擾素一ΩΤ以含有實例Α — 2方法製備 之5 %髙海藻糖含量粉末之生理食鹽水溶離，同時變化生 理食鹽水之ρ Η値。生成之溶離物以膜過濾，且濾液加約 2 0倍體稹之tFINETOSE®# (—種無水晶狀麥芽糖粉末 ，購自 Hayashibara Shoji，Inc., Ok.ayama, Japan)以 脫水，再粉碎生成之脫水產物，並將粉末以製錠機製錠以 得含有每錠約1 5 0單位天然人類干捷素- or之錠劑，約 重2 0 0毫克。 產物可呈舌下錠型式口服，劑量爲1 一 1 0錠/成人 /天，且可任意用來治療病毒疾病，過敏，風濕症，糠尿 病及惡性腫瘤。更特別地，產物逋合充作A I D S及肝炎 之治療劑，此類疾病患者之數目已顯著增加。產物中之海 藻糖及麥芽糖可充作天然人類干擾素- α之穩定劑，如此 可充份保留其活性達長時期，甚至在環境溫度下亦然。 啻 Μ Β — 1 8 糖衣錠 呈核心（重1 5 0毫克）之粗製錠塗襃以含下列之溶 液：4 0份按重計之以實例Α - 3方法得之含水晶狀海藻 糖粉末，2 1份按重計平均分子量2 0 0，〇 〇 〇之支鍵 (請之注49^項脣Ϊ本夏)
本紙張尺度逍用中國國家梂準（CNS ) A4规格（210X297公釐） -78 - 421 673 ; at B7 五、發明说明（76) 澱粉，3 0份按重計之水，2 5份按重計的滑石，及3份 按重計之氧化鈦，直到總重達到約2 3 0毫克爲止，且生 成物進一步塗覆以含下列之溶液：6 5份按重計之相同的 含水晶狀海藻糖粉末之新鮮製劑，1份按重計之支鏈澱粉 ，及3 4份按重計的水，並以液體蠛打光以得有令人滿意 光澤及外觀之糖衣錠。 產物具極髙之耐寅性，且可長期保有其高品質。 官例B — 1 芽窨 以一般方式混合下列組份製備牙甯： 0箏 經濟部中央梂準局舅工消费合作社印掣 磷酸單氫鈣 支鏈澱粉 硫酸十二酯鈉 甘油酯 聚氧乙烯山梨聚醣月桂酸酯 抗菌劑 以實例A - 3製成之粉狀含水 之晶狀海藻 麥芽糖醇 水 5.0% 2.95% 1.5%0.0% 0 _ 5 % 0.05% 2.0% 5 3 0 % 0 % 產物可令人滿意地充作幼兒用牙育，因其具有適度的 甜味。 -首. tf. -79 - 本紙張尺度逍用中國國家揉準（匸阳）八4规格（2丨0父297公釐） 421673 A7 B7 五、發明説明（ 77 管例B - 2 Ω 供插管餵食用之固髏製劑 製備由下 A — 6方法製 計之粉狀蛋黃 計之氯化鈉， 酸鎂，0 . 0 壤血酸鈉，0 份按重計之菸 列組成之組成物：5 0 0份按 備之粉狀含水之晶狀海藻糖， ，2 0 9份按重計之脫脂乳， 1. 8份按重計之氯化鉀，4 1份按重計之硫胺素，0 . 1 .6份按重計之醋酸維生素E 鹼醯胺。2 5克一份的組成物 重計之以實例 2 7 0份按重 4 . 4份按重 份按重計之硫 份按重計之抗 * 及 0 · 0 4 注入防水之層 請 面 之 注
I 霣 € 壓小袋中，再熱熔封以得欲求產物。 一袋產物溶於約1 5 0 - 3 0 0毫升水中成爲流體食 品，並口服或腸外投藥至鼻腔，胃或腸，經插管餵食以補 充能童至活體。 眚例Β - 2 1 高詧巷物 以實例Α - 8方法製備之高純度含水之晶狀海藻糖， 溶於水中成爲約1Ow/v%水性海藻糖溶液，其再以一 般方式行膜過減以移去熱原，無菌地注入塑質瓶中，並熔 封得欲求產物。 產物是一種令人滿意的穗定髙營養物，經靜置後實質 上無變化，適用於靜脈內及腹膜內投藥。產物之1Ow/ v %溶液是與血液等張的，此表示其可以較葡萄糖2倍以 本紙張尺度適用中國國家搮準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 努 經濟部中央橾準局員工消費合作社印製 -80 - 421 673 A7 B7 五、發明説明（78 ) 上髙濃度型式補充能量至活體。 音例B - 2 2 高營巷物 以實例A - 8方法製備之高純度含水之晶狀海藻糖， 及含下列組份之胺基酸組成物，以攪拌方式溶於水中，使 成爲5w/v%及3 Ow/v%個別濃度，且類似實例B -1 0般，生成之溶液純化成無熱原之溶液，再注入塑質 袋中並熔封以得欲求產物。 ------iu / 裝 it {谙先53¾面之注項再Ϊ本頁) 經濟部中央橾準局員工消費合作社印策 胺某酸組成物之組份 組份 L 一異白胺酸 L 一白胺酸 L -賴胺酸單鹽酸鹽 L —甲硫胺酸 L 一苯丙胺酸 L 一蘇胺酸 L 一色胺酸 L 一纈胺酸 L-精胺酸鹽酸鹽 L 一組胺酸單鹽酸鹽 甘胺酸 毫克/ 1 0 0毫升 18 0 4 10 6 2 0 2 4 0 2 9 0 18 0 6 0 2 0 0 2 7 0 13 0 3 4 0 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） -81 42 1 673 at B7 五、發明説明（79) 雖然本產物爲含有海藻酸及胺基酸之多重高營養物， 其是令入滿意地穩定；靜置也無實質變化，且適用於靜脈 內及腹膜內投予至活體內。產物可任意用於補充能量以及 胺基酸至活體。 竇例B - 2 3 洎瘠外傷用軟蕾 2 0 0份按重計之以實例A — 2方法製備之高海藻糖 含量粉末，及3 0 0份按重計之麥芽糖，與5 0份按重計 ，含有3份按重計碘之甲醇溶液摻和，且生成之溶液混合 以2 0 0按重計之1 Ow/v %支鏈澱粉水溶液，以得欲 求產物具有令人滿意之延伸性及粘著性。 含於產物中之碘呈現制菌活性，且產物中之海藻糖作 用爲活存細胞上之能量補充劑，且基於此產物縮短癒合時 間且可令人滿意地癒合傷口表面。 經濟部中央標率局貝工消費合作社印製 由以上可證知，本新穎的海藻糖釋放酵素可自具有海 藻糖結構爲末端單位且具3以上葡萄糠聚合程度之非還原 性醣中釋出海藻糖，且當作用在還原性部份澱粉水解物上 ，並加上非還原性醣形成酵素，則可形成相當高產率之海 藻糖。如此得到之海藻糖可容易地分離及純化，且生成之 經純化海藻糖及含彼之醣組成物，具有令人滿意之穂定性 及相當髙的品質及緩和甜度。當口服完整投f或呈輸注液 型腸外投藥時，可容易地爲活體所同化，吸收及利用。海 藻糖本身及含彼之醣組成物可任意地充作甜味劑，口味改 -82 - ---------V I! (请先M面之注ί項再頁) 本紙張尺度適用中國國家揉準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 4 2 16 7 3 A7 _B7 五、發明説明（8〇 ) 進劑，品質改進劑*穩定劑*賦形劑及充塡劑，應用於各 種組成物中，如食品，化粧品及薬品。 因此，本發明提出新穎的技術以製備海藻糖及含彼之 組成物，係以工業規模及相當低費用製備自由澱粉（一種 便宜且豐富之來源）所製備之部份澱粉水解物中。因此， 本發明對於如澱粉-，酵素-及生化-科學領域及其他工 業領域，尤其是食品，化粧品及藥品工業，以及林業，7欠 產業，及裊業，畜牧業及化學工業上可有深不可測之重大 影響。因此，本發明在各領域之影響是難測的逮大。 雖已描述本發明被認爲較佳之具體實例，但仍要了解 此中可有各種變化，且其意欲涵蓋在所附之申請專利範圍 之內，只要所有的此種變化均靥本發明眞義及範疇內即可 (諸先之注f項再Ϊ本頁) -杯_ .f 經濟部中央橾準局舅工消費合作社印製 本紙張尺度逍用中國國家揉準（CNS ) A4规格（210X297公釐） -83 -

Claims (1)

  1. 421673 、申請專利範圍 A8 B8 C8 D8 附杜一f A、
    第 831 0 5 7 2 6 號 中文申請專利 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1 . 一種海藻糖釋放酵素 中介於海藻糖部份與其餘糖基 醣係具有海藻糖結構爲末端單 程度，該糖基部份由一個以上 酵素具有以下物化特性： (1 )作用 可特異地水解非還原性醣 基部份之間的鍵結，此非還原 位且具3以上之葡萄糖聚合作 (2 )分子量 在硫酸十二酯鈉一聚丙烯 PAGE)上有 57，000 (3 )等電點（p I ) 在利用兩性電解質之等電 (4 )最佳溫度 當在PH7. 0下培育3 (5 )最佳p Η值 當在4 0°C下培育3 0分 (6 )熱穩定性 當在PH7. 0下培育6 專利申請案 範圍修正本 民國8 9年1月修正 ’其可特異地水解非還原醣 部份之間的鍵結，此非還原 位且具3以上之葡萄糖聚合 的葡萄糖殘基所組成，且該 中介於海藻糖部份舆其餘糖 醣具有海藻糖結構爲末端單 用程度； 醯胺凝膠電泳（SDS 至6 8，Ό 0 0道耳吞； 電泳上 3至4 . 0分鐘時爲35 — 45 aC; 鐘時爲6. 0 — 7. 5 ; 0分鐘時，可穩定達到3 0 本紙張尺度適用令國國家標準（CNS)A4规格（210 X 297公釐〉 請 先 閱 讀 背 之 注 意 事 項 再 訂 線 灿880808 、申請專利範圍 -4 5 °C ;及 (7 ) p Η值穩定性 當在2 5 °C下培育1 6小時，可在 P Η下 0 10 0 穩定 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 如申請專利範圍第1項之酵素，其具有選自下歹[J 的一種以上的部份胺基酸序列： (1 )白胺酸—天冬胺酸-色胺酸一丙胺酸一穀胺酸 —丙胺酸一 Xi— x2—甘胺酸一天冬胺酸（其 ， 中Xi表示絲胺酸或丙胺酸，且表示丙胺酸 或穀胺酸）； (2 )天冬胺酸—穀胺酸一精胺酸一丙胺酸一纈胺酸 一組胺酸一異白胺酸一白胺酸一穀胺酸一 (其中X 3表示穀胺酸或天冬胺酸）；及 (3 ) Χ4 —甘胺酸—穀胺酸一甘胺酸一天冬醯胺一 蘇胺酸-色胺酸一甘胺酸一天冬胺酸-絲胺駿 (其中X 4表示組胺酸或穀胺醯胺）。 3 .如申請專利範圍第1項之酵素，其係一種衍生自 之酵素。 .如申請專利範圍第3項之酵素，其中該微生物係 列菌屬之微生物：根瘤菌屬（Rhizobium)，節桿 Ar th robac ter)，短桿菌屬（Brev i bacter i um )及 屬（Micrococcus) 0 2 微生物 4 選自下 菌屬 微球菌 5 微生物 .如申請專利範圍第4項之酵素，其中根瘤菌屬之 是根瘤菌M—ll (CCRC 910002， 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 請 先 m 讀 背 面 之 注 意 事 項 再 寫 頁
    訂 -2 - 421673 A8 B8 C8 D8 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 力、申請專利範圍 FERM BP- 4130)。 6 .如申請專利範圍第4項之酵素，其中節桿菌屬之 微生物是節桿菌Q36 (CCRC 9 10001, FERM B P - 4 3 1 6 ) β 7. —種製備如申請專利範圍第1項之海藻糖釋放酵 素的方法’此方法包括在營養培養基上培養可產生該酵素 之微生物以形成該酵素，並回收生成之酵素》 8. 如申請專利範圍第7項之方法，其具有選自下列 一種以上的部份胺基酸序列： (1)白胺酸-天冬胺酸-色胺酸-丙胺酸一榖胺酸 —丙胺酸—Χα — Χ2 一甘胺酸一天冬胺酸（其 中Xt表示絲胺酸或丙胺酸，且表示丙胺酸 或穀胺酸）； (2 )天冬胺酸~穀胺酸-精胺酸-丙胺酸一纈胺酸 一組胺酸一異白胺酸一白胺酸一榖胺酸一 (其中X 3表示穀胺酸或天冬胺酸）；及 (3 ) X 4—甘胺酸—榖胺酸一甘胺酸—天冬醯胺一 蘇胺酸-色胺酸-甘胺酸—天冬胺酸一絲胺酸 (其中X 4表示組胺酸或穀胺醯胺）^ 9. 如申請專利範圍第7項之方法’其中酵素係衍生 自微生物。 1 0 ·如申請專利範圍第9項之方法’其中該微生物 係選自下列菌屬之微生物··根瘤菌屬’節桿菌屬，短桿菌 屬及微球菌屬。 (請先閱讀背面之注意事項再^寫本頁) -線· •ri 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（2〗0 X 297公爱） A8 B8 C8 D8 421 673 六、申請專利範圍 1 1 .如申請專利範圍第ίο項之方法，其中根瘤菌靡 之微生物是根瘤菌Μ— 11 (CCRC 9 1 0 0 0 2' FERM ΒΡ — 4130)。 1 2 .如申請專利範圍第項之方法，其中節桿菌屬 之微生物是節桿菌Q36 (CCRC 910001， FERM ΒΡ-4316)。 1 3 . —種製備海藻糖之方法，此方法包括： (a )令如申請專利範圍第1項之海藻糖釋放酵素作 用在含有非還原性醣之溶液上，此醣具有海藻糖結構爲宋 端單位，且具3以上之葡萄糖聚合程度，以形成海藻糠； (b)純化生成之海藻糖；及 (c )回收經純化之海藻糖。 1 4.如申請專利範圍第1 3項之方法，其中在（a )步驟中該酵素係與非還原性醣形成酵素合用，其可形成 一個以上具有海藻糖結構爲末端單位且具3以上葡萄糖聚 合程度之非還原性醣》 '- 15.如申請專利範圍第13項之方法1其中（a) 步驟中進一步包括令萄糖基澱粉酶作用在（a )步驟生成 之溶液上之步驟。 1 6 ·如申請專利範圍第1 3項之方法，其中（b ) 步驟包括將在（a )步驟中生成之含有海藻糖之溶液接受 充填有強酸陽離子交換樹脂之管柱之層析，以純化海藻糖 〇 17.如申請專利範圍第13項之方法，其中（b) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） ------------ί I —----訂----I---- \請先閲婧背面之泫意事頊存/濟窩本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 4 421673 韻0808 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 六、申請寻利範圍 步步·包括將（b )步驟中生成溶液中之海藻糖結晶 成含水的或無水的晶狀海藻糖。 1 8 .如申請專利範圍第1 3項之方法，其中該酵素 具有選自下列一種以上的部份胺基酸序列： (1 )白胺酸一天冬胺酸一色胺酸-丙胺酸一榖胺酸 一丙胺酸_又1_又2 -甘胺酸—天冬胺酸（其 中Xi表示絲胺酸或丙胺酸，且X2表示丙胺酸 或穀胺酸）； (2 )天冬胺酸一穀胺酸一精胺酸一丙胺酸-纈胺酸 —組胺酸—異白胺酸—白胺酸一縠胺酸一X 3 (其中X3表示穀胺酸或天冬胺酸）；及 (3 ) X4-甘胺酸—榖胺酸—甘胺酸一天冬酿胺— 蘇胺酸一色胺酸-甘胺酸一天冬胺酸-絲胺酸 (其中乂4表示組胺酸或穀胺醯胺）。 1 9 .如申請專利範圍第1 3項之方法，其中該·酵奉 係衍生自微生物。 2 0 .如申請專利範圍第1 9項之方法，其中該微生 物係選自下列菌屬之微生物：根瘤菌屬，節桿菌屬，短桿 菌屬及微球菌屬。 2 1 .如申請專利範圍第2 〇項之方法，其中根瘤胃 屬之微生物是根瘤菌Μ—11(CCRC > F E R M BP-4130)。 22.如申請專利範圍第20項之方法 屬之微生物是節桿菌Q36 (CCRC 9 1 〇 0 0 2 其中節桿菌0 0 0 1. 請 先 閱 讀 背 之 注 意 事 項 再
    訂 K紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -^ 673 A8 B8 C8 D8 夂、申請專利範圍 ferm bp-4316)。 2 3 .如申請專利範圍第1 3項之方法，其中係藉由 利用澱粉酶（摻雜或不摻雜脫支酶）以進行部份水解澱粉 物溶液，而獲致該含有非還原性醣之溶液，該非還原性醣 係具有海藻糖結構爲末端單位，且其葡萄糖聚合作用程度 係爲3或3以上。 2 4 . —種製備含有海藻糖之醣組成物之方法，此方 法包括： (a-)令如申請專利範圍第1項之海藻糖釋放酵素作 用在含有非還原性醣之溶液上，此醣具有海藻糖結構爲末 端單位，且具3以上之葡萄糖聚合程度，以形成海藻糖； 及 (b )回收生成之含有海藻糖及其他醣之醣組成物。 2 5 .如申請專利範圍第2 4項之方法，其中在（a )步驟中以酵素係與非還原性醣形成酵素合用，其可形成 一個以上具有海藻糖結構爲末端單位且具3以上葡萄糖聚 合程度之非還原性醣。 26. 如申請專利範圍第24項之方法’其中（a) 步驟中進一步包括令萄糖基澱粉酶作用在（a)步驟生成 之溶液上之步驟。 27. 如申請專利範圍第24項之方法，其中（b) 步驟進一步包括將（b )步驟中生成溶液中之海藻糖結晶 成含水的或無水的晶狀海藻糖。 28. 如申請專利範圍第24項之方法，其中該酵素 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再本頁) '-°. 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 673 §§ _________六、申請麥利範圍 具有選自下列—種以上的部份胺基酸序列： (1 )白胺酸-天冬胺酸一色胺酸一丙胺酸-榖胺酸 —沔胺酸- Xi——甘胺酸—天冬胺酸（其 中Xi表示絲胺酸，或沔胺酸，且x2表示丙胺酸 或穀胺酸）‘ (2 )天冬胺酸—穀胺酸—精胺酸一丙胺酸—纈胺酸 —組胺酸一異白胺酸—白胺酸一穀胺酸—χ3 (其中Χ3表示穀胺酸或天冬胺酸）：及 (3 )又4一甘胺酸—榖胺酸—甘胺酸—天冬醯胺_ 蘇胺酸-色胺酸-甘胺酸-天冬胺酸-絲胺酸 (其中又4表示組胺酸或穀胺醯胺）^ 2 9 如申請專利範圍第2 4項之方法，其中該酵素 係衍生自微生物。 3 0 .如申請專利範圍第2 9項之方法’其中該微生 物係選自下列菌屬之微生物：根瘤菌屬，節桿菌屬，短桿 菌屬及微球菌屬° 一 3 1 如申請專利範圍第3 0項之方法，其中根瘤菌 屬之微生物是根瘤菌(CCRC 9 1 0 0 0 2 > F E R M BP - 4130) * 32,如申請專利範圍第30項之方法’其中節桿菌 屬之微生物是節桿菌Q36 (CCRC 910001’ FERM BP-4316)。 3 3 .如申請專利範圍第2 4項之方法，其中係藉由 利用澱粉酶（摻雜或不摻雜脫支酶）以進行部份水解搬粉 請 先 閱 讀 背 & 之 注 意 事 項 再
    寫C 本 頁 訂 線 本紙張尺度適用_國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1673 A8 B8 C8 D8 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 六、申請專利範圍 物溶液’而獲致該含有非還原性醣之溶液，該非還原性醣 係具有海藻糖結構爲末端單位，且其葡萄糖聚合作用程度 係爲3或3以上。 3 4 . —種製備含有海藻糖組成物之方法，此方法包 括： (a )令非還原性醣形成酵素（I )加上如申請專利 範圍第1項之海藻糖釋放酵素作用在含有一種以上還原性 部份澱粉水解物之溶液上，此水解物具有3以上之葡萄糖 聚合程度以形成海藻糖，該酵素（I )可形成具有海藻糖 結構爲末端單位且具3以上葡萄糖聚合程度之非還原性醣 r (b )回收生成之海藻糖，加上或無其他醣；及 (c )將海藻糖加上或無其他醣，納入組成物材料中 〇 3 5 .如申請專利範圍第3 4項之方法，其係一種食 品。 一 3 6 ·如申請專利範圍第3 4項之方法’其係一種化 粧品組成物。 37. 如申請專利範圍第34項之方法，其係一種藥 學組成物。 38. 如申請專利範圍第34項之方法’其中該酵素 具有選自下列一種以上的部份胺基酸序列： (1 )白胺酸—天冬胺酸一色胺酸一两胺酸-榖胺酸 一丙胺酸—Χϊ—Χζ —甘胺酸—天冬胺酸（其 (請先閱讀背面之注意事項再¾寫本頁) •言 ί 4v> 本紙張又度適用中固囤家標準（CNS〉A4規格（210 x 297公釐） 421 673 bI C8 D8 六、申請專利範圍 中Xi表示絲胺酸或丙胺酸，且x2表示丙胺酸 或穀胺酸）； (2)天冬胺酸一穀胺酸-精胺酸_丙胺酸-纈胺酸 —組胺酸一異白胺酸一白胺酸一穀胺酸_X3 (其中X 3表示穀胺酸或天冬胺酸）：及 (3 ) X4 —甘胺酸—榖胺酸—甘胺酸—天冬醯胺— 蘇胺酸-色胺酸-甘胺酸一天冬胺酸-絲胺酸 (其中X 4表示組胺酸或穀胺醯胺）。 3 9 .如申請專利範圍第3 4項之方法，其中該酵素 係衍生自微生物。 40.如申請專利範圍第39項之方法，其中該微生 物係選自下列菌屬之微生物：根瘤菌屬，節桿菌屬，短桿 菌屬及微球菌屬。 4 1 .如申請專利範圍第4 0項之方法，其中根瘤菌 屬之微生物是根瘤菌M-ll (CRCC 9 1 0 0 0 2 ，FERM BP — 4130)。 4 2.如申請專利範圍第4· 0項之方法’其中節桿菌 屬之微生物是節桿菌Q36 (CCRC 910001， Β Ρ - 4 3 1 6 43.如申請專利範圍第34項之方法，其中係藉由 利用澱粉酶（摻雜或不摻雜脫支酶）以進行部份水解澱粉 物溶液，而獲致該含有非還原性醣之溶液，該非還原性醣 係具有海藻糖結構爲末端單位，且其葡萄糖聚合作用程度 係爲3或3以上。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（2〗0 X 297公釐） 請 先 閱 讀 背 面 之 注 意 事 項 1¾ 頁 訂 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 F E R Μ -9 - 421673 tl C8 D8 六、申請專利範圍 44. 一種可降低還原性部份澱粉水解物葡萄糖聚合 作用程度但不增加其還原力之方法，此方法包括令非還原 性醣形成酵素（I〕加上如申請專利範圍第1項之海藻糖 釋放酵素作用在含有一種以上具3以上葡萄糖聚合程序之 還原性部份澱粉水解物上，該酵素（I )可形成具有海藻 糖結構爲末端單位且具3以上葡萄糖聚合程度之非還原性 醣。 4 5 .如申請專利範圍第4 4項之方法，其中該酵素 具有選自下列一種以上的部份胺基酸序列： (1)白胺酸一天冬胺酸一色胺酸一丙胺酸-榖胺酸 —丙胺酸— Xx—Xs —甘胺酸—天冬胺酸（其 中Xi表示絲胺酸或丙胺酸’且表示丙胺酸 或穀胺酸）； (2 )天冬胺酸-穀胺酸一精胺酸一芮胺酸一纈胺酸 一組胺酸一異白胺酸一白胺酸一穀胺酸一 χ3 (·'其中Χ3表示穀胺酸或天冬胺酸）；及 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 (3) Χ4 —甘胺酸—榖胺酸一甘胺酸一天冬醯胺一 蘇胺酸-色胺酸-甘胺酸-天冬胺酸一絲胺酸 (其中χ4表示組胺酸或穀胺醯胺）° 46. 如申請專利範圍第44項之方法’其中該酵素 係衍生自微生物。 47. 如申請專利範圍第46項之方法’其中該微生 物係選自下列菌屬之微生物：根瘤菌屬’節桿菌屬’短桿 菌屬及微球菌屬。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規袼（210 X 297公釐） 421 673 a| C8 D8 六、申請專利範圍 48.如申請專利範圍第47項之方法，其中根瘤菌 屬之微生物是根瘤菌M— 11 (CCRC 9 1 0 0 0 2 ，FERM BP-4130)。 4 9 .如申請專利範圍第4 7項之方法，其中節桿菌 屬之微生物是節桿菌Q36 (CCRC 91000， FERM BP-4316) » 50.如申請專利範圍第44項之方法，其中係藉由 利用澱粉酶（摻雜或不摻雜脫支酶）以進行部份水解澱粉 物溶液，，而獲致該含有非還原性醣之溶液，該非還原性醣 係具有海藻糖結構爲末端單位，且其葡萄糖聚合作用程度 係爲3或3以上。 (請先閱讀背面之注意事項再辦寫本頁)
    ,訂· -線- 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公楚） -11 -
TW083105726A 1993-06-03 1994-06-23 Trehalose-releasing enzyme, and its preparation and uses TW421673B (en)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP15633893 1993-06-03
JP34034393 1993-12-09
JP07929194A JP3559585B2 (ja) 1993-06-03 1994-03-28 トレハロース遊離酵素とその製造方法並びに用途

Publications (1)

Publication Number Publication Date
TW421673B true TW421673B (en) 2001-02-11

Family

ID=27302973

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TW083105726A TW421673B (en) 1993-06-03 1994-06-23 Trehalose-releasing enzyme, and its preparation and uses

Country Status (11)

Country Link
US (3) US5472863A (zh)
EP (1) EP0628630B1 (zh)
JP (1) JP3559585B2 (zh)
KR (1) KR100306868B1 (zh)
AT (1) ATE165865T1 (zh)
CA (1) CA2124758C (zh)
DE (1) DE69410012T2 (zh)
DK (1) DK0628630T3 (zh)
ES (1) ES2116532T3 (zh)
IL (7) IL121712A0 (zh)
TW (1) TW421673B (zh)

Families Citing this family (81)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ATE182359T1 (de) * 1992-12-28 1999-08-15 Hayashibara Biochem Lab Nichtreduzierendes saccharidbildendes enzym, und dessen herstellung und verwendungen
JP4165878B2 (ja) * 1993-06-03 2008-10-15 株式会社林原生物化学研究所 トレハロース遊離酵素とその製造方法並びに用途
JP3633648B2 (ja) * 1993-07-20 2005-03-30 株式会社林原生物化学研究所 マルトース・トレハロース変換酵素とその製造方法並びに用途
JP3659985B2 (ja) * 1993-12-28 2005-06-15 三栄源エフ・エフ・アイ株式会社 トレハラーゼ及び該酵素を用いた糖類の製法
DE69510116T2 (de) * 1994-02-23 1999-11-18 Kabushiki Kaisha Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo, Okayama Nicht reduzierendes Saccharid bildendes Enzym, dieses kodierende DNA, und deren Herstellungen und Verwendungen
DE69519532T2 (de) * 1994-03-01 2001-05-31 Hayashibara Biochem Lab Crystalline maltosylglucosid, Verfahren zu seiner Herstellung sowie seiner Verwendung
KR100374449B1 (ko) * 1994-03-07 2003-09-06 가부시끼가이샤 하야시바라 세이부쓰 가가꾸 겐꾸조 효소를인코우드하는디엔에이(dna),재조합디엔에이(dna)와효소,형질전환체및이들의제조방법과용도
JP3557277B2 (ja) * 1994-06-25 2004-08-25 株式会社林原生物化学研究所 耐熱性トレハロース遊離酵素とその製造方法並びに用途
US5908767A (en) * 1994-06-02 1999-06-01 Kabushiki Kaisha Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo Non-reducing saccharide and its production and use
JP3793590B2 (ja) * 1994-06-27 2006-07-05 株式会社林原生物化学研究所 非還元性糖質とその製造方法並びに用途
DE69535865D1 (de) * 1994-06-15 2008-11-27 Kirin Brewery Transferase und Amylase, Verfahren zur Herstellung dieser Enzyme, ihre Verwendung und kodierende Gene
EP0693558B1 (en) * 1994-07-19 2002-12-04 Kabushiki Kaisha Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo Trehalose and its production and use
JP3557289B2 (ja) 1994-07-21 2004-08-25 株式会社林原生物化学研究所 非還元性糖質からトレハロースを遊離する組換え型耐熱性酵素
DE69532106T2 (de) * 1994-09-16 2004-07-22 Nihon Shokuhin Kako Co., Ltd. Maltose Phospharylase, Trehalose Phophorylase, Plesiomonasstamm, und Herstellung von Trehalose
JPH08157491A (ja) * 1994-11-30 1996-06-18 Hayashibara Biochem Lab Inc トレハロース誘導体の製造方法
TW449619B (en) * 1995-02-10 2001-08-11 Hayashibara Biochem Lab Non-reducing saccharides, their preparations and uses
US5858992A (en) * 1995-02-10 1999-01-12 Kabushiki Kaisha Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo Non-reducing saccharides, their preparation and use
NL9500292A (nl) * 1995-02-16 1996-10-01 Stichting Nl Instituut Voor Ko Werkwijze voor omzetting van een zetmeelmateriaal, en daarvoor bruikbaar enzympreparaat.
JP3084609B2 (ja) * 1995-04-12 2000-09-04 株式会社林原生物化学研究所 トレハロース含有シラップ
US5958455A (en) * 1996-02-09 1999-09-28 Quadrant Holdings Cambridge Ltd Oral solid dosage forms, methods of making same and compositions thereof
JP3549366B2 (ja) * 1996-06-20 2004-08-04 株式会社林原生物化学研究所 飲食物の塩から味及び／又は旨味増強方法
FR2750298B1 (fr) * 1996-07-01 1998-09-18 Gefa Composition en poudre pour la preparation d'un aliment a base de yaourt
US5916881A (en) * 1996-10-07 1999-06-29 Kabushiki Kaisha Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo High trehalose content syrup
JP2001505906A (ja) * 1996-12-10 2001-05-08 ハダジット メディカル リサーチ サービシズ アンド ディベラップメント カンパニー リミテッド 細胞の分化を誘導する血清由来因子およびその医薬的使用
JP4034846B2 (ja) * 1996-12-10 2008-01-16 株式会社林原生物化学研究所 結晶性粉末糖質とその製造方法並びに用途
EP0868916A3 (en) * 1997-03-04 2004-09-15 Kabushiki Kaisha Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo Reduction inhibitory agent for active-oxygen eliminating activity
JP4153057B2 (ja) * 1997-03-10 2008-09-17 中国化薬株式会社 Ｄ−グルクロノラクトンの製造方法
JP4034862B2 (ja) 1997-06-02 2008-01-16 株式会社林原生物化学研究所 スクロースの後味改善方法とその用途
US5858735A (en) * 1997-10-16 1999-01-12 Development Center For Biotechnology Process for producing trehalose
JPH11116588A (ja) 1997-10-16 1999-04-27 Hayashibara Biochem Lab Inc トレハロース及び糖アルコールの製造方法
JP4295840B2 (ja) * 1997-12-09 2009-07-15 株式会社林原生物化学研究所 血行改善剤
JP4203159B2 (ja) 1997-12-09 2008-12-24 株式会社林原生物化学研究所 神経機能調節剤
JP3908868B2 (ja) 1997-12-26 2007-04-25 株式会社林原生物化学研究所 トリメチルアミン生成抑制方法とその用途
JP3944323B2 (ja) 1998-04-22 2007-07-11 株式会社林原生物化学研究所 ノンフライ調理法とその用途
US6455096B1 (en) 1998-04-28 2002-09-24 Kabushiki Kaisha Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo Hard candy with a relatively-high moisture and hardness, and process of the same
JP4221078B2 (ja) 1998-07-09 2009-02-12 株式会社林原生物化学研究所 トレハロース２含水結晶とその製造方法並びに用途
WO2000003735A1 (fr) * 1998-07-15 2000-01-27 Asahi Kasei Kogyo Kabushiki Kaisha Excipient
US6268353B1 (en) 1998-09-03 2001-07-31 Kabushiki Kaisha Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo Method for inhibiting the formation of volatile aldehydes including their related compounds and/or the decomposition of fatty acids including their related compounds, and uses thereof
JP3958884B2 (ja) 1998-09-11 2007-08-15 株式会社林原生物化学研究所 非還元性糖質生成酵素及びトレハロース遊離酵素ならびに該酵素を用いる糖質の製造方法
JP2000262252A (ja) 1999-01-11 2000-09-26 Aoba Kasei Kk タンパク質変性抑制剤、冷凍変性が抑制された擂潰食肉およびその製造方法ならびに練り製品の製造方法
JP2002536005A (ja) * 1999-02-10 2002-10-29 デーエスエム・ナムローゼ・フェンノートシャップ 飼料酵素含有粒状物
EP1055731A1 (en) 1999-05-26 2000-11-29 Kabushiki Kaisha Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo DNA which encodes trehalase and uses thereof
DE19929257A1 (de) 1999-06-25 2000-12-28 Basf Ag Polymerbeschichtete, granulierte enzymhaltige Futtermittelzusätze und Verfahren zu deren Herstellung
TWI283695B (en) 1999-10-21 2007-07-11 Hayashibara Biochem Lab Thermoplastic shaped-body of trehalose, process and uses thereof
JP4652540B2 (ja) 2000-03-02 2011-03-16 株式会社林原生物化学研究所 体臭抑制剤とその用途
JP4919198B2 (ja) 2000-05-22 2012-04-18 株式会社林原生物化学研究所 α−イソマルトシル転移酵素とその製造方法並びに用途
HUP0300840A2 (hu) 2000-07-28 2003-07-28 Henkel Kommanditgesellschaft Auf Aktien Új, Bacillus sp. A 7-7 (DSM 12368)-ból extrahált amilolitikus enzim, valamint használata mosó- és tisztítószerekben
TWI312369B (en) 2000-08-01 2009-07-21 Hayashibara Biochem Lab A-isomaltosylglucosaccharide synthase,process for producing the same and use thereof
AU781975B2 (en) 2000-09-14 2005-06-23 Hayashibara Co., Ltd Pharmaceutical composition for ophthalmic use
JP4982643B2 (ja) * 2000-09-14 2012-07-25 株式会社林原 眼科用医薬組成物
ATE364692T1 (de) * 2000-11-16 2007-07-15 Hayashibara Biochem Lab Polypeptide mit alpha-isomaltosyl transferase aktivität
WO2002044350A2 (de) 2000-11-28 2002-06-06 Henkel Kommanditgesellschaft Auf Aktien Cyclodextrin-glucanotransferase (cg tase) aus bicillus agaradherens (dsm 9948) sowie wasch- und reinigungsmittel mit dieser neuen cyclodextrin-glucanotransferase
JP4754066B2 (ja) 2000-12-22 2011-08-24 株式会社林原生物化学研究所 抗関節障害剤
JP3942543B2 (ja) 2001-01-12 2007-07-11 株式会社林原生物化学研究所 α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性を有するポリペプチド
US7659102B2 (en) 2001-02-21 2010-02-09 Verenium Corporation Amylases, nucleic acids encoding them and methods for making and using them
US7323336B2 (en) 2001-02-21 2008-01-29 Verenium Corporation Enzymes having alpha amylase activity and methods of use thereof
DK2333099T3 (da) 2001-02-21 2017-11-27 Basf Enzymes Llc Enzymer med alpha-amylase-aktivitet og fremgangsmåder til anvendelse deraf
US7749538B2 (en) 2001-04-26 2010-07-06 Kabushiki Kaisha Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo Molded object having high pullulan content, process for the producing the same, and use thereof
JP4132767B2 (ja) 2001-07-19 2008-08-13 株式会社林原生物化学研究所 プルラン含有粉末とその製造方法並びに用途
JP3759018B2 (ja) * 2001-10-18 2006-03-22 株式会社林原生物化学研究所 トレハロースを使用した梅肉シート
DE10163748A1 (de) 2001-12-21 2003-07-17 Henkel Kgaa Neue Glykosylhydrolasen
RU2348175C9 (ru) 2002-01-15 2011-12-20 Басф Акциенгезелльшафт Способ получения ферментсодержащего гранулята для животных, ферментсодержащий гранулят для животных, кормовая композиция и способ стимулирования роста животного
EP1568284B1 (en) 2002-11-25 2007-03-14 Kabushiki Kaisha Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo Method of producing rice flour
CN100539879C (zh) 2002-12-19 2009-09-16 株式会社林原生物化学研究所 抑制组合物中的水份变动的方法及其用途
CN111484996A (zh) 2003-03-06 2020-08-04 巴斯夫酶有限责任公司 淀粉酶、编码它们的核酸及其制备和应用方法
JP4568035B2 (ja) 2003-08-28 2010-10-27 株式会社林原生物化学研究所 環状マルトシルマルトース及び環状マルトシルマルトース生成酵素とそれらの製造方法並びに用途
CN1953755A (zh) * 2004-05-17 2007-04-25 株式会社林原生物化学研究所 强化接触水系环境的生物的生命活动和/或扩张生命活动适合区域的方法
US8231925B2 (en) * 2004-08-20 2012-07-31 Cargill, Incorporated Ingredient systems comprising trehalose, food products containing trehalose, and methods of making same
CA2577657C (en) * 2004-08-20 2013-03-19 Cargill, Incorporated Ingredient systems comprising trehalose, food products containing trehalose, and methods of making same
CA2581487C (en) 2004-09-27 2013-07-30 Kabushiki Kaisha Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo Isocyclomaltooligosaccharide (s), isocyclomaltooligosaccharide-forming enzyme, their preparation and uses
CN101232891A (zh) 2005-08-11 2008-07-30 株式会社林原生物化学研究所 胶原产生增强剂及其用途
US20070116825A1 (en) * 2005-11-23 2007-05-24 The Coca-Cola Company Confection with High-Potency Sweetener
US9101160B2 (en) 2005-11-23 2015-08-11 The Coca-Cola Company Condiments with high-potency sweetener
JP5184768B2 (ja) * 2006-09-05 2013-04-17 株式会社林原 トレハロース高含有糖液の回収方法並びに結晶トレハロースの製造方法
US8017168B2 (en) 2006-11-02 2011-09-13 The Coca-Cola Company High-potency sweetener composition with rubisco protein, rubiscolin, rubiscolin derivatives, ace inhibitory peptides, and combinations thereof, and compositions sweetened therewith
KR20090081392A (ko) 2006-11-24 2009-07-28 가부시끼가이샤 하야시바라 세이부쓰 가가꾸 겐꾸조 당질 함유 건조 야채와 그 제조 방법 및 용도
DK2479267T3 (en) 2006-12-21 2017-03-27 Basf Enzymes Llc Amylases and Glucoamylases, Nucleic Acids Encoding Them, and Methods for Preparing and Using Them
WO2012080100A1 (en) 2010-12-14 2012-06-21 Universiteit Gent Trehalose phosphorylases and their use in the biocatalytic production of trehalose-analogues and glycosyl phosphates
SG10201606201UA (en) 2011-09-21 2016-09-29 Hayashibara Co Process for producing a particulate composition comprising crystalline alpha, alpha-trehalose di-hydrate
CN105132265A (zh) * 2015-10-10 2015-12-09 安徽省葛根生产力促进中心有限公司 一种葛根树莓石花果酒的酿制方法
WO2022138631A1 (ja) 2020-12-25 2022-06-30 株式会社林原 家畜及び／又は家禽の生産性改善方法及び腸内菌叢改善方法

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4762857A (en) * 1986-05-30 1988-08-09 E. I. Du Pont De Nemours And Company Trehalose as stabilizer and tableting excipient
CA2016363A1 (en) * 1989-06-05 1990-12-05 Kazuho Matsuura Method of producing trehalose
JP2896598B2 (ja) * 1990-10-06 1999-05-31 株式会社林原生物化学研究所 ラクトネオトレハロースとその製造方法並びに用途
US5229276A (en) * 1990-10-31 1993-07-20 Mitsui Sugar Co., Ltd. Process for preparing trehalulose and isomaltulose
FR2671099B1 (fr) * 1990-12-27 1995-05-05 Orsan Procede de production de trehalose par fermentation de microorganisme dans des conditions induisant une variation de la pression osmotique.
JPH05211882A (ja) * 1991-12-11 1993-08-24 Ajinomoto Co Inc トレハロースの製造法

Also Published As

Publication number Publication date
IL121712A (en) 2000-08-31
EP0628630B1 (en) 1998-05-06
KR100306868B1 (ko) 2001-11-30
EP0628630A3 (en) 1995-06-14
IL109822A0 (en) 1994-08-26
US5591611A (en) 1997-01-07
US5591612A (en) 1997-01-07
AU6349994A (en) 1994-12-08
KR950000872A (ko) 1995-01-03
DE69410012T2 (de) 1998-10-29
CA2124758A1 (en) 1994-12-04
IL121711A (en) 2000-08-31
JP3559585B2 (ja) 2004-09-02
IL121713A (en) 2000-08-31
EP0628630A2 (en) 1994-12-14
JPH07213283A (ja) 1995-08-15
IL121712A0 (en) 1998-02-22
DE69410012D1 (de) 1998-06-10
ES2116532T3 (es) 1998-07-16
CA2124758C (en) 2010-08-17
IL121711A0 (en) 1998-02-22
ATE165865T1 (de) 1998-05-15
AU686141B2 (en) 1998-02-05
US5472863A (en) 1995-12-05
IL121713A0 (en) 1998-02-22
DK0628630T3 (da) 1998-06-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
TW421673B (en) Trehalose-releasing enzyme, and its preparation and uses
TW493001B (en) A process for producing trehalose and uses thereof
TW414807B (en) Maltose-trehalose converting enzyme, and preparation and uses thereof
JP4560104B2 (ja) 非還元性糖質生成酵素とその製造方法並びに用途
TW507008B (en) Thermostable trehalose-releasing enzyme, and its preparation and uses
TW400334B (en) Novel non-reducing oligosaccharide having a structure represented by the formula of alpha-d-oligoglucosyl alpha-d-oligoglucosides, processes and uses thereof
TW426737B (en) Saccharide composition with reduced reducibility, and preparation and uses thereof
TW426736B (en) Non-reducing saccharide and its production and use
JP3533239B2 (ja) マルトヘキサオース・マルトヘプタオース生成アミラーゼとその製造方法並びに用途
KR100391375B1 (ko) 내열성 비환원성 당질 생성 효소와 그 제조방법 및 용도
KR960011095B1 (ko) 말토테트라오스 생성 아밀라아제와 그의 제조 방법 및 용도
TW494137B (en) β-fructofuranosidase, its preparation and uses
TW426738B (en) Non-reducing saccharide and its production and use
JP2660836B2 (ja) マルトテトラオース生成アミラーゼ活性を有するポリペプチドとその用途
JP2787764B2 (ja) マルトテトラオースとそれを含有する飲食物
JPH0873482A (ja) 還元性を低減させた糖質とその製造方法並びに用途
JPH099986A (ja) トレハロースとその製造方法並びに用途
JP5240480B2 (ja) トレハロース遊離酵素とその製造方法並びに用途
US5908767A (en) Non-reducing saccharide and its production and use
JP3725148B2 (ja) マルトース・トレハロース変換酵素とその製造方法並びに用途

Legal Events

Date Code Title Description
GD4A Issue of patent certificate for granted invention patent
MK4A Expiration of patent term of an invention patent