TW201834694A - 具有ＫＳＰ抑制劑之特異抗體－藥物接合物（ＡＤＣｓ） - Google Patents

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Abstract

本文係描述紡錘體驅動蛋白抑制劑之特異結合劑-藥物接合物(ADC)、這些ADC之有效代謝物、製備這些ADC之方法、這些ADC用於治療及/或防止疾病之用途以及這些ADC用於製備治療及/或防止疾病，特別是過度增生及/或血管生成病症，例如癌症疾病之醫藥品的用途。

Description

具有KSP抑制劑之特異抗體-藥物接合物(ADCs)
本發明係關於紡錘體驅動蛋白抑制劑之特異結合劑-藥物接合物(ADC)、這些ADC之有效代謝物、製備這些ADC之方法、這些ADC用於治療及/或防止疾病之用途以及這些ADC用於製備治療及/或防止疾病，特別是過度增生及/或血管生成病症，例如癌症疾病之醫藥品的用途。此等治療可以單一療法或另外與其他的醫藥品或其他治療方法組合來進行。
癌症為最多樣之組織不受控制細胞生長的結果。在許多的案例中此等新細胞穿透進入現有的組織(侵入性生長)，或其轉移進入遠端器官。癌症廣泛地發生在各種不同的器官且通常具有組織特異性進程。術語「癌症」為一通用術語因此係描述一大群不同器官、組織和細胞類型之該定義疾病。
某些腫瘤在早期階段可藉由手術和放射線治療方法來移除。轉移的腫瘤一般而言僅可藉由化療劑緩和性治療。本文之目標為達到改善生活品質和延長生命之最佳組合。
具有一或多個藥物分子之結合蛋白接合物已為所知，特別是其中針對腫瘤相關抗原之內化抗體係經由一連接子與一細胞毒性劑共價連結的抗體藥物接合物(ADC)之形式。在ADC導入腫瘤細胞後，接合物隨後解離，細胞毒性劑本身或從其所形成的細胞毒性代謝物在腫瘤細胞內釋放出並可在其中直接或選擇性展開其作用。用這種方式，與習用的癌症化療相反，明顯侷限對正常組織的傷害[參見，例如J.M.Lambert,Curr.Opin.Pharmacol.5,543-549(2005)；A.M.Wu and P.D.Senter,Nat.Biotechnol.23,1137-1146(2005)；P.D.Senter,Curr.Opin. Chem.Biol.13,235-244(2009)；L.Ducry and B.Stump,Bioconjugate Chem.21,5-13(2010)]。因此，WO2012/171020描述了其中多數個帶毒體(toxophore)分子係經由一聚合連接子與一抗體連結之ADC。作為可能的帶毒體，WO2012/171020提及，其中包括SB 743921、SB 715992(Ispinesib)、MK-0371、AZD8477、AZ3146和ARRY-520等物質。
上文所提及的物質為紡錘體驅動蛋白抑制劑。紡錘體驅動蛋白(KSP，異亦稱為Eg5、HsEg5、KNSL1或KIF11)為一種類驅動蛋白之動力蛋白，其為雙極有絲分裂紡錘體運作時所必須。抑制KSP造成有絲分裂受阻，且歷經一段相當長的時期，造成細胞凋亡(Tao et al.,Cancer Cell 2005 Jul 8(1),39-59)。在發現首種細胞穿透KSP抑制劑單星素(Monastrol)之後，KSP抑制劑已然成為一種新穎的化療劑(Mayer et al.,Science 286：971-974,1999)，且其為許多專利申請案之主體(例如WO2006/044825；WO2006/002236；WO2005/051922；WO2006/060737；WO03/060064；WO03/040979；及WO03/049527)。然而，因為KSP僅在相當短的有絲分裂期期間為活化的，因此KSP抑制劑在此階段期間必須以夠高的濃度存在。WO2014/151030揭示了包括特定KSP抑制劑之ADC。
帶有KSP抑制劑之另外的ADC已揭示於專利申請案WO2015/096982和WO2016/096610中。
儘管有各種抗體-藥物接合物之揭示文，但本發明之目的係提供在以相當低的濃投予後，展現持久性細胞凋亡作用且因此可有利於癌症治療之物質。本處，從ADC在細胞內釋放的的代謝物性質扮演要角。通常，來自ADC的代謝物為外排泵之基質及/或具有高的細胞膜滲透性。此二種現象可能造成短的滯留時間且因此造成在腫瘤細胞內次佳的細胞凋亡作用。
本發明係提供具有特異性帶毒體連接子組成物之ADC，其特別是具有與特異性抗-CD123抗體及與抗-CXCR5二者結合之增進的活性性質。
此抗體較佳地為人源化或嵌合的單株抗-CD123抗體或抗-CXCR5 抗體。特佳的係給予人源化抗-CD123抗體TPP-8987、TPP-8988和TPP-9476，以及人源化或嵌合的抗-CXCR5抗體TPP-9024、TPP-9574和TPP-9580。
已發現，式(I)之抗體-藥物接合物(ADC) 其中n係代表1至8，AK係代表由TPP-8987、TPP-9476和TPP-8988組成之群中選出的抗-CD123抗體，或AK係代表抗-CXCR5抗體，較佳地係由TPP-9574、TPP-9580和TPP-9024組成之群中選出，或AK係代表這些抗體的抗原結合片段，其中該抗體或抗原結合片段係經由半胱胺酸側基之硫原子相連結，及其鹽類、溶劑化物和這些溶劑化物的鹽類，係具有與已知接合物不相上下的優越性質。
較佳的係給予該等其中n係代表4至8之式(I)抗體-藥物接合物(ADC)。
較佳的係給予該等其中AK係代表由TPP-8987、TPP-9476和 TPP-8988組成之群中選出的抗-CD123抗體及這些抗體的抗原結合片段；特佳地AK係代表TPP-9476以及此抗體的抗原結合片段之式(I)抗體-藥物接合物(ADC)。
圖1：結合劑-藥物接合物之較佳抗體的註解序列。所顯示的為IgG之重鏈和輕鏈的蛋白序列，以及這些抗體的VH和VL區。在序列下方加註出重要區域(IgG的VH和VL區，以及CDR區(H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3、L-CDR1、L-CDR2、L-CDR3))。
圖2：結合劑-藥物接合物之較佳抗體序列的序列表以及標靶分子之序列的序列表。
本發明係提供人源化抗-CD123抗體或人源化或嵌合單株抗-CXCR5抗體之接合物，為紡錘體驅動蛋白抑制劑(KSP抑制劑)之藥物分子，其係經由一連接子L與抗體相連結。本處特佳的係給予人源化抗-CD123抗體TPP-8987、TPP-8988和TPP-9476，以及人源化或嵌合抗-CXCR5抗體TPP-9024、TPP-9574和TPP-9580。
結合劑
在最廣義上，術語「結合劑」請了解係指與存在特定目標細胞族群中之標靶分子相結合，以結合劑/活性化合物接合物提出之分子。術語接合子應以最廣泛的解釋來理解，並包括，例如卵磷酯、能與特定糖鏈結合的蛋白，或磷脂質結合蛋白。此等結合劑包括，例如高分子量蛋白(結合蛋白)、多肽或胜肽(結合胜肽)、非胜肽(例如適體(aptamer)(US5,270,163)參閱Keefe AD.，等人，Nat.Rev.Drug Discov.2010；9：537-550)，或維生素)及所有其他細胞結合分子或物質。結合蛋白有，例如抗體和抗體片段或抗體模擬物，例如親和體(affibody)、adnectin、抗運載蛋白(anticalin)、DARPin、高親和多聚體(avimer)、奈米抗體(nanobodies)(參閱Gebauer M.等人，Curr.Opinion in Chem.Biol.2009；13：245-255；Nuttall S.D.等人，Curr.Opinion in Pharmacology 2008；8：608-617)。結合胜肽有，例如配體-受體對之配體，例如配體-受體對VEGF/KDR之VEGF，例如配體-受體對運鐵蛋白/運鐵蛋白受體之運 鐵蛋白，或細胞激素/細胞激素受體，例如配體-受體對TNFα/TNFα受體之TNFα。
結合劑可為一結合蛋白。結合劑之較佳的實施例為抗體、抗原結合抗體片段、多專一性抗體或抗體模擬物。
文獻中亦揭示有機分子與結合劑，特別是抗體之各種共價結合(接合)選項。根據本發明較佳的係給予經由抗體半胱胺酸殘基的一或多個硫原子及/或經由抗體離胺酸殘基的一或多個NH基團相連接的帶毒體與抗體的接合物。然而，經由游離羧基基團或經由抗體的糖殘基結合帶毒體與抗體，亦為可能的。
「標靶分子」在最廣義上請了解係指存在目標細胞族群中並可為蛋白(例如生長因子之受體)之分子或非胜肽分子(例如糖或磷脂質)。較佳地其為一受體或抗原。
術語「胞外」標靶分子係描述與細胞相連結，其係位於細胞外之標靶分子或位於細胞外之標靶分子的部分，亦即結合劑可在完整細胞上與其胞外標靶分子結合。胞外標靶分子可固定在細胞膜中或可為細胞膜之部分。熟習本項技術者已了解辨識胞外標靶分子之方法。對於蛋白，此項可經由測定跨膜區和此蛋白在膜中之定向來進行。這些資料通常係儲存在蛋白資料庫中(例如SwissProt)。
術語「癌標靶分子」係描述，相較於相同組織類型之非癌細胞，其係更豐富存在一或多種癌細胞種類上之標靶分子。相較於相同組織類型之非癌細胞，較佳地此癌標靶分子係選擇性存在一或多種癌細胞類型上，其中選擇性係描述，相較於相同組織類型之非癌細胞，在癌細胞上至少為二倍豐富度(選擇性癌標靶分子)。使用癌標靶分子則得以使用本發明接合物進行選擇性癌細胞治療。
結合劑可經由一鍵與連接子相連結。結合劑可藉由結合劑之雜原子相連接。可用於連結之本發明結合劑的雜原子有硫(在一實施例中係經由結合劑的硫氫基基團)、氧(根據本發明係藉由結合劑的羧基或羥基基團)和氮(在一實施例中係經由結合劑的一級或二級胺基團或醯胺基團)。這些雜原子可存在天然的結合劑中或以化學方法或分子生物方法導入。根據本發明，結合劑與帶毒體之連結對於結合劑與標靶分子 之結合活性僅有極少的影響。在一較佳的實施例中，此連結對於結合劑與標靶分子之結合活性並無影響。
依照本發明，術語「抗體」係以最廣泛的意義理解並包括免疫球蛋白分子，例如完整或經修飾單株抗體、多株抗體或多專一性抗體(例如雙專一性抗體)。免疫球蛋白較佳地係包括具有四條多肽鏈，二條重鏈(H鏈)和二條輕鏈(L鏈)之分子，其典型地係以雙硫橋連接。各重鏈包括重鏈可變區(縮寫VH)和重鏈恆定區。重鏈恆定區可，例如包括CH1、CH2和CH3三個區。各輕鏈包括一可變區(縮寫VL)和一恆定區。輕鏈之恆定區包括一個區(縮寫CL)。VH和VL區可進一步細分為具有超變異性之區域，亦稱為互補決定區(縮寫CDR)及具有低序列變異性之區域(架構區，縮寫為FR)。典型地，各VH和VL區係由三個CDR和至高四個FR所組成。例如，以下列胺基端至羧基端之順序：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。抗體可由任何適合的物種來製得，例如兔、羊駝、駱駝、小鼠或大鼠。在一實施例中，此抗體為人類或鼠科來源之抗體。抗體可，例如為人類、人源化或嵌合的。
術語「單株」抗體係指從一群實質上同源的抗體得來之抗體，亦即該群族的個別抗體為相同，但是其中少數可能自然發生突變。單株抗體以高專一性辨識單一抗原結合位。術語單株抗體並非指特殊的製備方法。
術語「全(intact)」抗體係指不僅包括一抗原結合區亦包括輕鏈和重鏈恆定區之抗體。恆定區可為天然生成的區域或具有許多修飾的胺基酸位置之其變體，以及亦可經糖基化。
術語「經修飾全」抗體係指經由其胺基端或羧基端，藉由共價鍵(例如胜肽鍵)與另外非源自抗體的多肽或蛋白融合之全抗體。再者，抗體可經修飾，使得在定義位置導入反應性半胱胺酸，用以促進與帶毒體結合(參見Junutula et al.Nat Biotechnol.2008 Aug；26(8)：925-32)。
「胺基酸修飾」或「突變」在本處係指在多肽序列取代、插入及/或刪除一胺基酸。在本處較佳的胺基酸修飾為取代。「胺基酸取代」或「取代」在本處係指在一蛋白序列之特定位置的胺基酸與另一胺基 酸交換。例如，Y50W取代係描述一親代多肽之變體其中在位置50的酪胺酸係與一色胺酸交換。多肽之「變體」係描述具有一胺基酸序列的多肽實質上係與一參照多肽，典型地一天然或「親代」多肽相同。多肽變體可在一天然胺基酸序列的特定位置具有一或多個胺基酸交換、刪除及/或插入。
術語「人類」抗體係指可得自人類之抗體或為合成的人類抗體。「合成的」人類抗體為其部分或整體可從合成的序列，以人類抗體序列分析為基礎經電腦模擬所得來之抗體。人類抗體可，例如由人類來源之抗體序列庫分離出的核酸所編碼。此一抗體之實例可參見Söderlind et al.,Nature Biotech.2000,18：853-856。此等「人類」和「合成」抗體亦包括藉由以PNGaseF去糖基化或藉由重鏈之N297(Kabat編號)突變成任何其他胺基酸所產生的無糖基化變體。
術語「人源化」或「嵌合」抗體係描述由非人類和人類部份之序列所組成的抗體。在這些抗體中，部分的人類免疫球蛋白序列(受體)被非人類免疫球蛋白之序列部份(供體)所取代。在許多案例中，供體為鼠科免疫球蛋白。就人源化抗體之情況，受體CDR之胺基酸係被供體之胺基酸取代。有時候，架構之胺基酸亦被對應的供體胺基酸取代。在某些案例中，人源化抗體含有並非存在受體或供體中之胺基酸且其係在抗體最適化期間導入。就嵌合抗體之情況，供體免疫球蛋白之可變區係與人類抗體之恆定區融合。此等「人源化」和「嵌合」抗體亦包括藉由以PNGaseF去糖基化或藉由重鏈之N297(Kabat編號)突變成任何其他胺基酸所產生的無糖基化變體。
術語互補決定區(CDR)如文中所用係指該等抗體可變區中與抗原結合所必須的胺基酸。典型地，各可變區具有三個CDR區，稱為CDR1、CDR2和CDR3。各CDR區可包括根據Kabat定義之胺基酸及/或根據Chotia所定義之超變異環之胺基酸。根據Kabat之定義係包括，例如來自可變輕鏈/區(VL)之大約24-34(CDR1)、50-56(CDR2)和89-97(CDR3)胺基酸位置及可變重鏈/區(VH)之31-35(CDR1)、50-65(CDR2)和95-102(CDR3)胺基酸位置的區域(Kabat et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed.Public Health Service, National Institutes of Health,Bethesda,MD.(1991))。根據Chotia之定義係包括，例如來自可變輕鏈(VL)之大約26-32(CDR1)、50-52(CDR2)和91-96(CDR3)胺基酸位置及可變重鏈(VH)之26-32(CDR1)、53-55(CDR2)和96-101(CDR3)胺基酸位置的區域(Chothia和Lesk；J Mol Biol 196：901-917(1987))。在某些案例中，CDR可包括一來自Kabat和Chotia所定義的CDR區之胺基酸。
依照重鏈恆定區之胺基酸序列，抗體可分成不同的種類。有五種主要的全抗體：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，且其中數種可再分成另外的亞種(同型物)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。對應不同種類，重鏈恆定區稱為[alpha/α]、[delta/δ]、[epsilon/ε]、[gamma/γ]和[my/μ]。抗體之三元結構和亞單位結構已為所知。
術語抗體/免疫球蛋白之「功能性片段」或「抗原結合抗體片段」係定義為抗體/免疫球蛋白之片段(例如IgG之可變區)，其又包括抗體/免疫球蛋白之抗原結合區。抗體之「抗原結合區」典型地係包括一或多個抗體之超變異區列如CDR、CDR2及/或CDR3區。然而，抗體之「架構」或「骨架」區亦可在抗體與抗原結合期間扮演一角。架構區形成CDR之骨架。較佳地，抗原結合區係包括至少4至103個可輕鏈變之胺基酸和5至109個可變重鏈之胺基酸，更佳地，3至107個輕鏈可變區之胺基酸和4至111個重鏈可變區之胺基酸，特佳地，完整的可變輕鏈和重鏈，亦即VL之1-109和VH之1至113胺基酸(根據WO97/08320所編號)。
本發明之「功能性片段」或「抗原結合抗體片段」係涵蓋(非絕對)Fab、Fab’、F(ab’)2和Fv片段、雙抗體、單區抗體(DAb)、直鏈抗體、抗體的個別鏈(單鏈Fv，縮寫為ScFv)；和多專一性抗體，例如雙-和三-專一性抗體，例如由抗體片段所形成的C.A.K Borrebaeck,editor(1995)Antibody Engineering(Breakthroughs in Molecular Biology),Oxford University Press；R.Kontermann & S.Duebel,editors(2001)Antibody Engineering(Springer Laboratory Manual),Springer Verlag。「多專一性」或「多功能性」抗體以外的抗體為該等具有相同結合位之抗體。多專一性抗體可對抗原上的不同表位具專一性，或可 對一個以上的抗原之表位具專一性(參見，例如WO 93/17715；WO 92/08802；WO 91/00360；WO 92/05793；Tutt,et al.,1991,J.Immunol.14760 69；美國專利第4,474,893；第4,7 14,68 1號；第4,925,648號；第5,573,920號；第5,601,8 19號；或Kostelny et al.,1992,J.Immunol.148 1547 1553)。F(ab’)2或Fab分子可經建構使得發生在Ch1和CL區間的分子內雙硫鍵相互作用之數目可降低或另外完全防止。
「表位」係指能專一性與免疫球蛋白或T細胞受體結合之蛋白决定簇。表位決定簇通常係由分子之化學活化表面基團所組成，例如胺基酸或糖側鏈或其組合，且通常具有一特異的三元結構性質以及明確的電荷性質。
「功能性片段」或「抗原結合抗體片段」可與非源自抗體之另外的多肽或蛋白經由其胺基端或羧基端，藉由共價鍵(例如胜肽連接鏈)融合。再者，抗體和抗原結合片段可藉由在定義位置導入反應性半胱胺酸加以修飾，以便於促進與帶毒體結合(參見Junutula et al.Nat Biotechnol.2008 Aug；26(8)：925-32)。
多株抗體可藉由本項技術之一般技術者已知的方法來製備。單株抗體可藉由本項技術之一般技術者已知的方法來製備(Köhler和Milstein,Nature,256,495-497,1975)。人類和人源化單株抗體可藉由本項技術之一般技術者已知的方法來製備(Olsson et al.,Meth Enzymol.92,3-16或Cabilly等人US 4,816,567或Boss等人US 4,816,397)。
本項技術之一般技術者已知各種用於製備人類抗體及其片段之方法，例如藉由基因轉殖小鼠(N Lonberg和D Huszar,Int Rev Immunol.1995；13(1)：65-93)或噬菌體表現技術(Clackson et al.,Nature.1991 Aug 15；352(6336)：624-8)。本發明之抗體可由匯集大量健康自願者之大量抗體的胺基酸序列所組成之重組的抗體庫來獲得。抗體亦可藉由已知的重組DNA技術來製造。抗體之核酸序列可藉由慣用的定序來取得或可得自公共的資料庫。
「分離的」抗體或結合劑係經純化以移除其他的細胞組成份。可能干擾診斷或治療用途之沾染的細胞組成份有，例如酵素、荷爾蒙或其他細胞之胜肽和非胜肽性組成份。較佳的抗體或結合劑為，相對於 抗體或結合劑已純化至95%重量比以上程度者(例如以Lowry法，UV-Vis光譜或以SDS毛細管電泳測定)。再者，抗體係經純化至可能測定至少15個胺基端之胺基酸或內部胺基酸序列之程度，或經純化至均質性，而該均質性係以SDS-PAGE於還原或非還原條件所測(偵測可藉由馬考斯藍染色(Coomassie Blau staining)或較佳地以銀著色來測定)。然而，抗體一般係以一或多個純化步驟來製備。
術語「專一性結合」係指與預定的抗原/標靶分子結合之抗體或結合劑。抗體或結合劑之專一性結合典型地係描述為具有至少10-7M親和力(為Kd值；亦即，較佳地具有小於10-7M之Kd值)之抗體或結合劑，其中該抗體或結合劑對於預定的抗原/標靶分子比對於非專一性抗原/標靶分子(例如牛血清白蛋白或酪蛋白)具有至少高二倍的親和力，其中非專一性抗原/標靶分子並非預定的抗原/標靶分子或密切相關之抗原/標靶分子。抗體或結合劑之專一性結合並不排除抗體或結合劑與多數個抗原/標靶分子結合(例如不同物種的同源體)。抗體較佳地係具有至少10-7M(為Kd值；亦即，較佳地具有小於10-7M之Kd值)，較佳地至少10-8M，更佳地在10-9M至10-11M範圍內。Kd值可例如，藉由表面電漿共振光譜來測定。
本發明之抗體-藥物接合物同樣具有在這些範圍內之親和力。此親和力較佳地實質上不會受藥物接合之影響(一般而言，親和力下降少於一量級，換言之，例如最多從10-8M變為10-7M)。
依照本發明所用的抗體較佳地亦以高選擇性為著稱。當本發明抗體展現對標靶蛋白之親和力時，其比對無關的其他抗原，例如人類血清白蛋白，較佳的係存有至少2倍，較佳地5倍或更佳地10倍之高選擇性(親和力，例如可藉由表面電將共振光譜來測定)。
再者，所用的本發明抗體較佳地係具交叉反應性。為了能促進和提高闡明臨床前研究，例如毒性學或活性研究(例如於異種移植小鼠中)，若本發明所用的抗體不僅與人類標靶蛋白結合亦與用於研究中之物種的標靶蛋白結合則為有利的。在一實施例中，本發明所用的抗體，除了人類標靶蛋白外，係與至少一另外物種之標靶蛋白交叉反應。就毒性學和活性研究，其較佳的係使用囓齒科、狗和非人類靈長類之物 種。較佳的齧齒類物種為小鼠和大鼠。較佳的非人類靈長類為恆河猴、黑猩猩和長尾獼猴。
在一實施例中，本發明所用的抗體，除了人類標靶蛋白外，係與至少一種由下列組成之群中選出的另外物種之標靶蛋白交叉反應：小鼠、大鼠和長尾獼猴(Macaca fascicularis)。特佳的本發明所用的抗體除了人類標靶蛋白外，係至少與小鼠的標靶蛋白交叉反應。較佳的係給予交叉反應性之抗體，其對於另外非人類物種之標靶蛋白的親和力與對人類標靶蛋白的親和力之差異不大於50倍，更特佳地不大於10倍。
抗癌標靶分子之抗體
結合劑，例如抗體或其抗原結合片段所針對之標靶分子，較佳地為癌標靶分子。術語「癌標靶分子」係描述比相同組織類型之非癌細胞更大量存在於一或多種癌細胞種類上之標靶分子。較佳地，相較於相同組織類型之非癌細胞，此癌標靶分子係選擇性存在一或多種癌細胞類型上，其中選擇性係描述，相較於相同組織類型之非癌細胞，在癌細胞上至少為二倍豐富度(選擇型癌標靶分子)。使用癌標靶分子則得以使用本發明接合物進行選擇性癌細胞治療。
專一性對抗一抗原例如癌細胞抗原之抗體較佳地可由本項技術之一般技術者藉由其熟悉的方法(例如重組表現)或可由市面取得的(例如來自德國默克公司(Merck KGaA))方法來製備。癌症治療中已知的市售抗體之實例有Erbitux®(西妥昔單抗，Merck KGaA)、Avastin®(貝伐單抗，Roche)和Herceptin®(曲妥珠單抗，Genentech)。曲妥珠單抗為IgG1κ型之重組的人源化單株抗體，其在一以細胞為基準的分析中係以高親和力與人類表皮生長受體之胞外區結合(Kd=5nM)。該抗體係於CHO細胞中以重組來產生。所有的這些抗體亦可藉由以PNGaseF去糖基化或藉由重鏈之N297(Kabat編號)突變成任何胺基酸，製造成這些抗體的無糖基化變體。
在本發明中，癌標靶分子有
(1)受體蛋白CXCR5(CD185；SwissProt：P32302；NCBI Gene ID 643,NCBI參考序列：NP_001707.1；SEQ ID NO：61)
(2)表面受體CD123(IL3RA；NCBI Gene ID：3563；NCBI參考序列：NP_002174.1；Swiss-Prot：P26951；SEQ ID NO：62)
在本發明一特佳的主題中，結合劑係與癌標靶分子CXCR5和CD123組成之群中選出之胞外癌標靶分子專一性結合。在一較佳的實施例中，在與標靶細胞上的其胞外標靶分子結合後，此結合劑經由結合而被標靶細胞內化。由此形成了結合劑-藥物接合物，其可為一免疫接合物或ADC，而被標靶細胞吸收。然後此結合劑則被處理，較佳地在細胞內，較佳的經溶酶體處理。
在一實施例中，此結合劑為一結合蛋白。在一較佳的實施例中，此結合劑為一抗體、抗原結合抗體片段、多專一性抗體或抗體模擬物。
較佳的抗體模擬物為親和體(affibody)、adnectin、抗運載蛋白(anticalin)、DARPin、高親和多聚體(avimer)和奈米抗體(nanobodies)。較佳的多專一性抗體為雙專一性和三專一性抗體。
在一較佳的實施例中，該結合劑為抗體、抗原結合抗體片段，更佳地分離的抗體或分離的抗原結合抗體片段。
較佳的抗原結合抗體片段有Fab、Fab’、F(ab’)2和Fv片段、雙抗體、DAb、直鏈抗體和scFv。特佳地為Fab、雙抗體和scFv。
在一特佳的實施例中，該結合劑為抗體。特佳地為單株抗體或其抗原結合抗體片段。更特佳的為人類、人源化或嵌合抗體或其抗原結合抗體片段。
與癌標靶分子結合之抗體或抗原結合抗體片段可由本項技術之一般技術者使用已知的方法，例如化學合成或重組表現來製備。用於癌標靶分子之結合劑可從市面取得或可由本項技術之一般技術者使用已知的方法，例如化學合成或重組表現來製備。另外製備抗體或抗原結合抗體片段之方法係描述於WO 2007/070538(參見第22頁“Antibodies”)中。熟習本項技術者已知如何匯集例如噬菌體表現庫(例如Morphosys HuCAL Gold)之方法及用於尋找抗體或抗原結合抗體片段(參見WO 2007/070538，第24頁ff和第70頁之AK實例1，第72頁之AK實例2)。使用B細胞之DNA庫製備抗體之另外的方法係描述於，例如26頁(WO 2007/070538)。用於人源化抗體之方法係描述於 WO2007070538的第30-32頁和詳細描述於Queen，等人，Pros.Natl.Acad.Sci.USA 86：10029-10033,1989或於WO 90/0786中。再者，用於一般蛋白和特定抗體的重組表現方法已為熟習本項技術者所知(參見，例如Berger和Kimrnel(Guide to Molecular Cloning Techniques,Methods in Enzymology,Vol.152,Academic Press,Inc.)；Sambrook,et al.,(Molecular Cloning A Laboratory Manual,(Second Edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press；Cold Spring Harbor,N.Y.；1989)Vol.1-3)；Current Protocols in Molecular Biology,(F.M.Ausabel et al.[Eds.],Current Protocols,Green Publishing Associates,Inc./John Wiley & Sons,Inc.)；Harlow et al.,(Monoclonal Antibodies A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press(19881,Paul[Ed.])；Fundamental Immunology,(Lippincott Williams & Wilkins(1998))；及Harlow,et al.,(Using Antibodies A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1998))。熟習本項技術者了解用於表現蛋白/抗體所須之對應的載體、啟動子和訊息胜肽。一般性的方法亦描述於WO 2007/070538的第41-45頁。製備IgG1抗體之方法係描述於，例如WO 2007/070538之第74頁ff的實例6中。可在抗體與其抗原結合後，測量抗體內化之方法已為熟習本項技術者所知並描述於例如WO 2007/070538的第80頁。熟習本項技術者能使用已用於製備碳酸酐酶IX(Mn)抗體之WO 2007/070538中所述的方法，類似地製備具有不同標靶分子專一性之抗體。
細菌表現
熟習本項技術者知悉其中可在細菌表現的幫助下製造抗體、其抗原結合片段或其變體之方法。
適合用於所欲蛋白之細菌表現的表現載體可藉由在功能閱讀框架內插入一編碼所欲蛋白之DNA序列並以適合的轉譯啟動和轉譯終止訊號及以功能性啟動子共同來建構。此載體係包括一或多個表型上可選擇的標記及複製原點以便能留住載體且若需要，在宿主內增幅。適合用於轉化的原核細胞宿主包括(但不限於)大腸桿菌(E.coli)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、腸道沙門氏菌(Salmonella typhimurium)和 各種來自假單孢菌屬(Pseudomonas)、鏈黴菌屬(Streptomyces)和葡萄球菌屬(Staphylococcus)屬的菌屬。細菌載體可，例如以噬菌體、質體或噬粒為基礎。這些載體可含有可選擇標記和一細菌複製原點，其可衍生自市售的質體。許多市售的質體典型地係含有熟知的選殖載體pBR322(ATCC 37017)之成份。在細菌系統中，可以所希望的表現蛋白之用途為基準，選擇許多有利的表現載體。
在將適合的宿主菌體轉化以及宿主菌體長到適當的細胞密度後，藉由適合的方法(例如改變溫度或化學誘導)將所選的啟動子去-再引發/誘發，並將細胞另再培養一段時間。典型地係以離心來收取細胞且若需要以物理方式或化學方法消化，並保留所生成的原萃取物供進一步的純化。
因此，本發明之另一實施例為一表現載體，其係包括編碼本發明之新穎抗體的核酸。
本發明之抗體或其抗原結合片段係包括天然純化的產物、源自化學合成之產物以及由重組技術於原核細胞宿主，例如大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、腸道沙門氏菌和各種來自假單孢菌屬、鏈黴菌屬和葡萄球菌屬之菌屬，較佳地大腸桿菌中所製造的產物。
哺乳動物細胞表現
熟習本項技術者知悉其中可在哺乳動物細胞表現的幫助下製造抗體、其抗原結合片段或其變體之方法。
於哺乳動物細胞宿主中供表現之較佳的調控序列包括在哺乳動物細胞中產生高表現的病毒成份，例如衍生自巨細胞病毒(CMV)例如CMV啟動子/強化子)、猿猴病毒40(SV40)(例如SV40啟動子/強化子)、來自腺病毒(例如腺病毒晚期啟動子(AdMLP))及來自多瘤病毒之啟動子及/或表現增幅子。抗體之表現可經建構或調控(例如藉由加入或移除小分子誘導劑，例如四環黴素與Tet系統之組合來誘發)。
就病毒調控成份及其序列之進一步說明，請參照，例如Stinski之U.S.5,168,062，Bell等人之U.S.4,510,245以及Schaffner等人之U.S.4,968,615。重組表現載體同樣地可包括一複製原點和可選擇標記(參見，例如U.S.4,399,216、4,634,665和U.S.5,179,017)。適合的可選 擇標記包括賦予對物質，例如G418、嘌呤黴素(puromycin)、潮黴素(hygromycin)、保米黴素(blasticidin)、zeocin/博萊黴素(bleomycin)或甲氨喋呤(methotrexate)之阻抗性的基因，或當此載體已導入細胞時，導致宿主細胞營養缺陷之可選擇標記，例如麩醯胺酸合成酶(Bebbington et al.,Biotechnology(N Y).1992 Feb；10(2)：169-75)。
例如，二氫葉酸還原酶(DHFR)基因係賦予對甲氨喋呤的抗性，neo基因係賦予對G418的抗性，來自土麴菌(Aspergillus terreus)的bsd基因係賦予對保米黴素的抗性，嘌呤黴素N-乙醯基移轉酶係賦予對嘌呤黴素的抗性，Sh ble基因產物係賦予對博萊黴素的抗性，而大腸桿菌潮黴素阻抗基因(hyg或hph)係賦予對潮黴素的抗性。可選擇標記，例如DHFR或麩醯胺酸合成酶亦有助於結合MTX和MSX之增幅技術。
將表現載體轉染至宿主細胞中可借助標準技術來執行，包括藉由電穿孔、核轉染、磷酸鈣沉澱、脂質轉染、聚陽離子為基礎的轉染，例如聚乙烯亞胺(PEI)-為基礎的轉染和DEAE-葡聚糖轉染。
適合用於抗體、其抗原結合片段或其變體表現之哺乳動物宿主細胞包括中國倉鼠卵巢(CHO)細胞，例如CHO-K1、CHO-S、CHO-K1SV[包括DHFR-CHO細胞，描述於Urlaub和Chasin,(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：4216-4220及Urlaub et al.,Cell.1983 Jun；33(2)：405-12，使用DHFR-可選擇標記，如R.J.Kaufman和P.A.Sharp(1982)Mol.Biol.159：601-621中所述，及其他剔除細胞，如詳述於Fan et al.,Biotechnol Bioeng.2012 Apr；109(4)：1007-15中)，NS0骨髓瘤細胞、COS細胞、HEK293細胞、HKB11細胞、BHK21細胞、CAP細胞、EB66細胞和SP2細胞。
抗體、其抗原結合片段或其變體之表現亦可於表現系統例如HEK293、HEK293T、HEK293-EBNA、HEK293E、HEK293-6E、HEK293 Freestyle、HKB11、Expi293F、293EBNALT75、CHO Freestyle、CHO-S、CHO-K1、CHO-K1SV、CHOEBNALT85、CHOS-XE、CHO-3E7或CAP-T細胞(例如，如Durocher et al.,Nucleic Acids Res.2002 Jan 15；30(2)：E9)中以過渡或半穩定方式來進行。
在某些實施例中，此表現載體係以所表現的蛋白分泌至其中宿主 細胞生長的細胞培養基中之方式來建構。抗體、其抗原結合片段或其變體亦可借助熟習本項技術者已知的蛋白純化方法，從細胞培養基中取得。
純化
抗體、其抗原結合片段或其變體可從重組的細胞培養物中借助熟知的方法來取得，該方法之實例包括硫酸銨或乙醇沉澱、酸萃取、蛋白A層析、蛋白G層析、陰離子或陽離子交換層析、磷酸素層析、疏水作用層析(HIC)、親和層析、羥磷灰石層析和凝集素層析。高效液相層析(「HPLC」)同樣地可用來純化。參見，例如Colligan,Current Protocols in Immunology,or Current Protocols in Protein Science,John Wiley & Sons,NY,N.Y.,(1997-2001)，例如第1、4、6、8、9、10章。
本發明之抗體、其抗原結合片段或其變體係包括天然純化產物、化學合成法之產物及借助重組技術於原核或真核宿主細胞中所製造的產物。真核細胞宿主包括，例如酵母菌細胞、高等植物細胞、昆蟲細胞和哺乳動物細胞。依照所選擇用於重組表現的宿主細胞，所表現的蛋白可為糖基化或非糖基化形式。
在一較佳的實施例中，此抗體係經純化，(1)到達高於95%重量比之程度，例如以Lowry法，以UV-vis光譜或以SDS毛細管凝膠電泳法(例如以Caliper LabChip GXII,GX 90或Biorad Bioanalyzer儀器)所測量，及在更佳的實施例中，高於99%重量比，到達(2)適合測定至少15個N-端之殘基或內部胺酸序列之程度，或(3)到達以SDS-PAGE於還原或非還原條件下借助馬考斯藍染色或較佳地銀染色所測定的均質性。
通常，分離的抗體係借助至少一個蛋白純化步驟所製得。
抗-CD123抗體
根據本發明，可使用抗-CD123抗體。
「抗-CD123抗體」或「專一與CD123結合之抗體」一詞係關於與癌標靶分子CD123(NCBI參考序列：NP_002174.1；SEQ ID NO：62)結合的抗體，較佳地以足夠供診斷及/或治療應用的親和力結合。在特別的實施例中，此抗體係以1μM，100nM，10nM，1nM， 0.1nM，0.01nM或0.001nM之解離常數(KD)與CD123結合。
Sun等人(Sun et al.,1996,Blood 87(1)83-92)描述了與IL-3Rα的N端區，CD123結合之單株抗體7G3的世代和性質。US專例第6,177,078號(Lopez)係關於抗-CD123抗體7G3。此抗體的嵌合變體(CSL360)係描述於WO 2009/070844，及人源化版本(CSL362)係描述於WO 2012/021934中。7G3抗體之序列係揭示於EP2426148從。此序列構成了由CDR嫁接所到的人源化抗體之起始點。
在細胞表面抗原結合後被特別完全內化的抗體為Kuo等人所揭示的抗-CD123抗體12F1(Kuo et al.,2009,Bioconjug Chem.20(10)：1975-82)。抗體12F1係以比抗體7G3更高的親和力與CD123結合，且在與細胞表面抗原結合後，明顯比7G3更快內化。以12F1為基礎的雙專一性scFv免疫融合蛋白係揭示於WO 2013/173820。抗體TPP-6013為一12F1之嵌合變體。
本發明特別是關於帶有衍生自小鼠來源之抗體7G3(Sun et al.,1996,Blood 87(1)：83-92)和12F1(Kuo et al.,2009,Bioconjug Chem.20(10)：1975-82)的抗體或其抗原結合片段或其變體的接合物，或帶有衍生自小鼠來源的抗體12F1(Kuo et al.,2009,Bioconjug Chem.20(10)：1975-82)之抗體或其抗原結合片段或其變體的接合物。
特佳地在本發明內文中係給予抗-CD123抗體TPP-9476、TPP-8988和TPP-8987。
抗-CXCR5抗體
根據本發明，可使用抗-CXCR5抗體。
「抗-CXCR5抗體」或「專一與CXCR5結合之抗體」一詞係關於與癌標靶分子CXCR5(NCBI參考序列：NP_001707.1；SEQ ID NO：61)結合的抗體，較佳地以足夠供診斷及/或治療應用的親和力結合。在特別的實施例中，此抗體係以1μM，100nM，10nM，1nM，0.1nM，0.01nM或0.001nM之解離常數(KD)與CXCR5結合。
與CXCR5結合之抗體和抗原結合片段之實例已為熟習本項技術者所知並描述於，例如EP2195023中。
用於大鼠抗體RF8B2(ACC2153)之雜交瘤細胞係購自DSMZ並藉 由標準方法鑑別此抗體之序列。製備TPP-9024，一種此抗體的嵌合變體，在位置67帶有一位點突變(S67F)。再者，藉由CDR嫁接至人類框架得到用於人源化抗體之大鼠抗體序列建構起點。
這些抗體和抗原結合片段可用於本發明內容中。
特佳地在本發明內文中係給予人源化抗-CXCR5抗體TPP-9574、TPP-9580和嵌合抗體TPP-9024。
用於本發明結合劑-藥物接合物之較佳的抗體和其抗原結合抗體片段
在本申請案中，就結合劑-藥物接合物之情況，係提出如下表中所示之下列較佳的抗體：抗-CD123抗體TPP-8987、TPP-8988和TPP-9476以及抗-CXCR5抗體TPP-9024、TPP-9574和TPP-9580。
TPP-8987、TPP-8988、TPP-9476、TPP-9024、TPP-9574和TPP-9580為在重鏈可變區(VH)或氫鏈可變區(VL)包括一或多個上表所指之CDR序列(H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3、L-CDR1、L-CDR2、L-CDR3)的抗體。較佳地，此等抗體係包括所指的重鏈可變區(VH)及/或輕鏈可變區(VL)。較佳地，此等抗體係包括所指的重鏈區(IgG重鏈)及/或所指的輕鏈區(IgG輕鏈)。
TPP-8987為包括重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)之抗-CD123抗體，該重鏈可變區係包括如SEQ ID NO：2所示之重鏈可變CDR1序列(H-CDR1)，如SEQ ID NO：3所示之重鏈可變CDR2序列(H-CDR2) 及如SEQ ID NO：4所示之重鏈可變CDR3序列(H-CDR3)，而該輕鏈可變區係包括如SEQ ID NO：6所示之輕鏈可變CDR1序列(L-CDR1)，如SEQ ID NO：7所示之輕鏈可變CDR2序列(L-CDR2)和如SEQ ID NO：8所示之輕鏈可變CDR3序列(L-CDR3)。
TPP-8988為包括重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)之抗-CD123抗體，該重鏈可變區係包括如SEQ ID NO：12所示之重鏈可變CDR1序列(H-CDR1)，如SEQ ID NO：13所示之重鏈可變CDR2序列(H-CDR2)及如SEQ ID NO：14所示之重鏈可變CDR3序列(H-CDR3)，而該輕鏈可變區係包括如SEQ ID NO：16所示之輕鏈可變CDR1序列(L-CDR1)，如SEQ ID NO：17所示之輕鏈可變CDR2序列(L-CDR2)和如SEQ ID NO：18所示之輕鏈可變CDR3序列(L-CDR3)。
TPP-9024為包括重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)之抗-CXCR5抗體，該重鏈可變區係包括如SEQ ID NO：22所示之重鏈可變CDR1序列(H-CDR1)，如SEQ ID NO：23所示之重鏈可變CDR2序列(H-CDR2)及如SEQ ID NO：24所示之重鏈可變CDR3序列(H-CDR3)，而該輕鏈可變區係包括如SEQ ID NO：26所示之輕鏈可變CDR1序列(L-CDR1)，如SEQ ID NO：27所示之輕鏈可變CDR2序列(L-CDR2)和如SEQ ID NO：28所示之輕鏈可變CDR3序列(L-CDR3)。
TPP-9476為包括重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)之抗-CD123抗體，該重鏈可變區係包括如SEQ ID NO：32所示之重鏈可變CDR1序列(H-CDR1)，如SEQ ID NO：33所示之重鏈可變CDR2序列(H-CDR2)及如SEQ ID NO：34所示之重鏈可變CDR3序列(H-CDR3)，而該輕鏈可變區係包括如SEQ ID NO：36所示之輕鏈可變CDR1序列(L-CDR1)，如SEQ ID NO：37所示之輕鏈可變CDR2序列(L-CDR2)和如SEQ ID NO：38所示之輕鏈可變CDR3序列(L-CDR3)。
TPP-9574為包括重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)之抗-CXCR5抗體，該重鏈可變區係包括如SEQ ID NO：42所示之重鏈可變CDR1序列(H-CDR1)，如SEQ ID NO：43所示之重鏈可變CDR2序列(H-CDR2)及如SEQ ID NO：44所示之重鏈可變CDR3序列(H-CDR3)，而該輕鏈可變區係包括如SEQ ID NO：46所示之輕鏈可變CDR1序列 (L-CDR1)，如SEQ ID NO：47所示之輕鏈可變CDR2序列(L-CDR2)和如SEQ ID NO：48所示之輕鏈可變CDR3序列(L-CDR3)。
TPP-9580為包括重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)之抗-CXCR5抗體，該重鏈可變區係包括如SEQ ID NO：52所示之重鏈可變CDR1序列(H-CDR1)，如SEQ ID NO：53所示之重鏈可變CDR2序列(H-CDR2)及如SEQ ID NO：54所示之重鏈可變CDR3序列(H-CDR3)，而該輕鏈可變區係包括如SEQ ID NO：56所示之輕鏈可變CDR1序列(L-CDR1)，如SEQ ID NO：57所示之輕鏈可變CDR2序列(L-CDR2)和如SEQ ID NO：58所示之輕鏈可變CDR3序列(L-CDR3)。
TPP-8987較佳地為包括如SEQ ID NO：1中所示之重鏈可變區(VH)和如SEQ ID NO：5中所示之輕鏈可變區(VL)的抗-CD123抗體。
TPP-8988較佳地為包括如SEQ ID NO：11中所示之重鏈可變區(VH)和如SEQ ID NO：15中所示之輕鏈可變區(VL)的抗-CD123抗體。
TPP-9024較佳地為包括如SEQ ID NO：21中所示之重鏈可變區(VH)和如SEQ ID NO：25中所示之輕鏈可變區(VL)的抗-CXCR5抗體。
TPP-9476較佳地為包括如SEQ ID NO：31中所示之重鏈可變區(VH)和如SEQ ID NO：35中所示之輕鏈可變區(VL)的抗-CD123抗體。
TPP-9574較佳地為包括如SEQ ID NO：41中所示之重鏈可變區(VH)和如SEQ ID NO：45中所示之輕鏈可變區(VL)的抗-CXCR5抗體。
TPP-9580較佳地為包括如SEQ ID NO：51中所示之重鏈可變區(VH)和如SEQ ID NO：55中所示之輕鏈可變區(VL)的抗-CXCR5抗體。
TPP-8987較佳地為包括如SEQ ID NO：9中所示之重鏈區和如SEQ ID NO：10中所示之輕鏈區的抗-CD123抗體。
TPP-8988較佳地為包括如SEQ ID NO：19中所示之重鏈區和如SEQ ID NO：20中所示之輕鏈區的抗-CD123抗體。
TPP-9024較佳地為包括如SEQ ID NO：29中所示之重鏈區和如SEQ ID NO：30中所示之輕鏈區的抗-CXCR5抗體。
TPP-9476較佳地為包括如SEQ ID NO：39中所示之重鏈區和如SEQ ID NO：40中所示之輕鏈區的抗-CD123抗體。
TPP-9574較佳地為包括如SEQ ID NO：49中所示之重鏈區和如SEQ ID NO：50中所示之輕鏈區的抗-CXCR5抗體。
TPP-9580較佳地為包括如SEQ ID NO：59中所示之重鏈區和如SEQ ID NO：60中所示之輕鏈區的抗-CXCR5抗體。
治療用途
可使用本發明化合物治療之過度增生疾病包括，特別是癌症和腫瘤疾病之群。在本發明內文中，請了解這些係指，特別是下列疾病(但不限於此)：乳腺癌和乳腺腫瘤(乳腺癌包括乳管和小葉形式，以及原位)、呼吸道腫瘤(小細胞和非小細胞癌、支氣管癌)、腦腫瘤(例如腦幹和下視丘之腫瘤、星細胞瘤、室管膜瘤、髓母細胞瘤、膠質細胞瘤、神經管胚細胞瘤、腦膜瘤和神經上皮細胞瘤及松果體腫瘤)、消化器官之腫瘤(食道癌、胃癌、膽癌、小腸癌、大腸癌、直腸癌和肛門癌)、肝腫瘤(其中包括，肝細胞癌、膽管細胞癌和混合肝細胞及膽管細胞癌)、頭頸區之腫瘤(喉頭、下咽、鼻咽、口咽、嘴唇和口腔癌、口腔黑色素瘤)、皮膚腫瘤(基底細胞癌、刺狀細胞癌、鱗狀細胞癌、卡波西氏肉瘤、惡性黑素瘤、非黑色素皮膚癌、梅克爾細胞皮膚癌、肥大細胞腫瘤)、結締組織之腫瘤(其中包括，軟組織癌、骨肉瘤、惡性纖維組織細胞瘤、軟骨肉瘤、纖維肉瘤、血管肉瘤、平滑肌肉瘤、脂肪肉瘤、淋巴肉瘤和橫紋肌肉瘤)、眼睛之腫瘤(其中包括，眼內黑色素瘤和視網膜母細胞瘤)、內分泌和外分泌腺之腫瘤(例如甲狀腺和副甲狀腺之腫瘤、胰臟和唾腺癌、腺癌)、泌尿道之腫瘤(膀胱、陰莖、腎、腎盂和輸尿管之腫瘤)和生殖器官之腫瘤(女性的子宮內膜、子宮頸、卵巢、陰道、外陰和子宮之腫瘤，及男性前列腺和睪丸之腫瘤)。這些亦包括實體形式和循環血液細胞之血液、淋巴系統和骨髓的增生性疾病，例如白血病、淋巴瘤和骨髓增生性疾病，如急性骨髓性、急性淋巴母細胞性、慢性淋巴細胞性、慢性粒細胞性和髮細胞白血病，以及AIDS- 相關的淋巴瘤、何杰金氏淋巴瘤、非何杰金氏淋巴瘤、皮膚T-細胞淋巴瘤、伯基特氏淋巴瘤和中樞神經系統之淋巴瘤。
這些人類中完整記述之疾病亦可以類似病因發生於其他哺乳動物並可同樣的以本發明之化合物來治療。
文中所述及抗CD123的抗體-藥物接合物(ADC)可用於治療CD123-表現病症，例如CD123-表現癌症。典型地，此等癌細胞在蛋白測量上係具有可測定量的CD123(例如使用免疫分析)或RNA量。相較於同類型的非癌組織，某些的此等癌症組織顯現升高的CD123量，較佳地係於相同的病患中所測。視需要，CD123的含量係在以本發明抗體-藥物接合物(ADC)治療癌症開始之前測量(病患分層)。抗CD123之抗體-藥物接合物(ADC)可用來治療CD123-表現病症，例如CD123-表現的癌症疾病，例如造血和淋巴組織之腫瘤或造血和淋巴惡性腫瘤。 與CD123表現有關的癌症疾病之實例包括骨髓疾病，例如急性骨髓性白血病(AML)和骨髓增生不良症候群(MDS)。其他類型的癌症包括B-細胞急性淋巴母細胞白血病(B-ALL)、髮細胞白血病、母細胞胞漿性樹突狀細胞瘤(BPDCN)、何杰金氏淋巴瘤、未成熟T-細胞急性淋巴性白血病(未成熟T-ALL)、伯基特氏淋巴瘤、濾泡淋巴瘤、慢性淋巴性白血病(CLL)、被套細胞淋巴瘤(MCL)。本發明所述的方法係包括治療患有CD123-表現癌症之病患，此方法係包括投予本發明之抗體-藥物接合物(ADC)。
以本發明化合物治療上述癌症疾病係包括治療實體腫瘤和治療其轉移或循環形式。
在本發明內文中，術語「治療(treatment或treat)」係以其習用的意義來使用且係指以打擊、減低、減弱或緩解疾病或健康異常為目的來看護、照顧及護理病患，並改善受此疾病衝擊，例如癌症事件的生活狀況。
本發明因此進一步係提供本發明化合物用於治療及/或防止病症，特別是上述病症之用途。
本發明進一步係提供本發明化合物用於製造醫藥品供治療及/或防止病症，特別是上述病症之用途。
本發明進一步係提供本發明化合物於治療及/或預防病症，特別是上述病症之方法中的用途。
本發明進一步係提供使用一有效量之至少一種本發明化合物，治療及/或防止病症，特別是上述病症之方法。
本發明化合物可單獨使用，或若需要與一或多種其他的藥理活性物質組合，只要此組合不會導致不欲的及不可接受的副作用。本發明因此進一步係提供包括至少一種本發明化合物和一或多種另外的活性化合物之醫藥品，特別是供治療及/或預防上述疾病。
例如，本發明化合物可與已知的抗過度增生、細胞生長抑制、細胞毒性或免疫治療物質組合，用於治療癌症。適合的組合藥物之實例包括：131I-chTNT、阿巴瑞克(abarelix)、阿比特龍(abiraterone)、阿柔比星(aclarubicin)、阿達木單抗(adalimumab)、曲妥珠單抗-美坦新(ado-trastuzumab emtansine)、阿法替尼(afatinib)、阿柏西普(aflibercept)、阿地白介素(aldesleukin)、阿來組單抗(Alemtuzumab)、阿崙磷酸(alendronic acid)、阿利維甲酸(alitretinoin)、六甲蜜胺(altretamine)、胺磷汀(amifostine)、胺基格魯米特(aminoglutethimide)、5-胺基酮戊酸己酯、胺柔比星(amrubicin)、安吖啶(amsacrine)、阿那曲唑(anastrozole)、安塞司亭(ancestim)、茴香腦二硫雜環戊二烯硫酮(anethole dithiolethione)、anetumab ravtansine、血管收縮素II、抗凝血酶III、阿瑞批坦(aprepitant)、阿西莫單抗(arcitumomab)、阿加來必(arglabin)、三氧化砷(arsenic trioxide)、天門冬醯胺酶(asparaginase)、阿特珠單抗(atezolizumab)、阿曲單抗(avelumab)、阿西替尼(axitinib)、氮胞啶(azacitidine)、貝洛替康(belotecan)、苯達莫司汀(bendamustin)、貝索單抗(besilesomab)、貝伐珠單抗(bevacizumab)、貝沙羅汀(bexaroten)、比卡魯胺(bicalutamide)、比生群(bisantrene)、博萊黴素(bleomycin)、博納吐單抗(blinatumomab)、硼替佐米(bortezomib)、布舍瑞林(buserelin)、博舒替尼(bosutinib)、(brentuximab vedotin)、白消安(busulfan)、卡巴他賽(cabazitaxel)、卡博替尼(cabozantinib)、降鈣素(calcitonin)、亞葉酸鈣(calcium folinate)、左旋亞葉酸鈣(calcium levofolinate)、卡培他濱 (capecitabine)、卡羅單抗(capromab)、卡馬西平(carbomazepine)、卡鉑(carboplatin)、卡波醌(carboquon)、卡非佐米(carfilzomib)、卡莫氟(carmofur)、卡莫司汀(carmustine)、卡妥索單抗(catumaxomab)、塞來昔布(celecoxib)、西莫白介素(celmoleukin)、色瑞替尼(ceritinib)、西妥昔單抗、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、氯地孕酮(chlormadinone)、氮芥(chlormethine)、西多福韋(cidofovir)、西那卡塞(cinacalcet)、順鉑(cisplatin)、克拉屈濱(cladribin)、唑來膦酸(clodronic acid)、克羅拉濱(clofarabine)、考比替尼(cobimetinib)、copanlisib、克立他酶(crisantaspase)、克佐替尼(crizotinib)、環磷醯胺(cyclophosphamide)、環丙孕酮(cyproterone)、阿糖胞苷(cytarabine)、達卡巴嗪(dacarbazine)、放線菌素(dactinomycin)達雷木單抗(daratumumab)、達拉非尼(dabrafenib)、darolutamide、達沙替尼(dasatinib)、柔紅黴素(daunorubicin)、地西他濱(decitabine)、地加瑞克(degarelix)、地尼白介素融合二毒素(denileukin diftitox)、地諾單抗(denosumab)、地普奧肽(depreotide)、地洛瑞林(deslorelin)、右雷佐生(dexrazoxane)、二溴螺氯銨(dibrospidium chloride)、二去水衛矛醇(dianhydrogalactitol)、雙氯芬酸(diclofenac)、多西它賽(docetaxel)、朵拉司瓊(dolasetron)、去氧氟尿苷(doxifluridine)、多柔比星(doxorubicin)、多柔比星+雌激酮(estrone)、屈大麻酚(dronabinol)、度伐魯單抗(durvalumab)、依決洛單抗(edrecolomab)、依利醋銨(elliptinium acetate)、內皮抑素(endostatin)、依諾他濱(enocitabine)、恩雜魯胺(enzalutamide)、epacadostat、表柔比星(epirubicin)、環硫雄醇(epitiostanol)、依伯汀-α(epoetin-alfa)、依泊汀-β(epoetin-beta)、依泊丁-ζ(epoetin-zeta)、依鉑(eptaplatin)、eribulin、厄洛替尼(erlotinib)、埃索美拉唑(esomeprazole)、雌莫司汀(estramustine)、依託泊苷(etoposide)、炔雌醇(ethylnyl oestradiol)、依維莫司(everolimus)、依西美坦(exemestane)、法屈唑(fadrozole)、法曲唑(fadrozole)、芬太尼(fentanyl)、氟甲基睾丸素(fluoxymesterone)、氟尿苷(floxuridine)、氟達拉濱(fludarabine)、氟尿嘧啶(fluorouracil)、氟他胺(flutamide)、葉酸、福美坦(formestane)、福沙匹坦(fosaprepitant)、福莫司汀(fotemustine)、氟維司群(fulvestrant)、氟維司群(fulvestrant)、釓布醇(gadobutrol)、釓 特醇(gadoteridol)、釓特酸葡胺鹽(gadoteric acid meglumine salt)、釓弗塞胺(gadoversetamide)、釓塞酸二鈉鹽(gadoxetic acid disodium salt)(gd-EOB-DTPA二鈉鹽)、硝酸鎵、加尼瑞克(ganirelix)、吉非替尼(gefitinib)、吉西他濱(gemcitabine)、吉姆單抗(gemtuzumab)、穀卡匹酶(glucarpidase)、glutoxim、戈舍瑞林(goserelin)、granisetron、粒細胞群落刺激因子(G-CSF)、粒細胞巨噬細胞群落刺激因子(GM-CSF)、組織胺二鹽酸鹽、組氨瑞林(histrelin)、羥基脲、I-125粒子、伊班膦酸(ibandronic acid)、替伊莫單抗(ibritumomab-tiuxetan)、依魯替尼(ibrutinib)、伊達比星(idarubicin)、異環磷醯胺(ifosfamide)、伊馬替尼(imatinib)、咪喹莫德(imiquimod)、英丙舒凡(improsulfan)、吲地司瓊(indisetron)、伊班膦酸(incadronic acid)、巨大戟醇甲基丁烯酸酯(ingenol mebutate)、干擾素-α、干擾素-β、干擾素-γ、碘比醇(iobitridol)、碘苄胍(iobenguane)(123I)、碘美普爾(iomeprol)、伊匹木單抗(ipilimumab)、伊立替康(irinotecan)、伊曲康唑(itraconazole)、伊沙匹隆(ixabepilone)、伊克薩姆畢(ixazomib)、蘭瑞肽(lanreotide)、蘭索拉唑(lansoprazole)、拉帕替尼(lapatinib)、lasocholine、來那度胺(lenalidomide)、樂伐替尼(lenvatinib)、來格司亭(lenograstim)、香菇多糖(lentinan)、來曲唑(letrozole)、亮丙瑞林(leuprorelin)、左旋咪唑(levamisole)、左炔諾孕酮(levonorgestrel)、左旋甲狀腺素鈉(levothyroxin-sodium)、利培非格司(lipegfilgrastim)、麥角乙脲(lisuride)、洛鉑(lobaplatin)、洛莫司汀(lomustine)、氯尼達明(lonidamine)、馬索羅酚(masoprocol)、甲羥孕酮(medroxyprogesterone)、甲地孕酮(megestrol)、美拉胂醇(melarsoprol)、美法侖(melphalan)、美雄烷(mepitiostane)、巰嘌呤(mercaptopurine)、美司鈉(mesna)、美沙酮(methadone)、甲氨蝶呤(methotrexate)、甲氧沙林(methoxsalen)、甲基氨基酮戍酸(methylaminolevulinate)、甲基培尼皮質醇(methylprednisolone)、甲睾酮(methyltestosterone)、甲酪氨酸(metirosine)、米伐木肽(mifamurtide)、米替福新(miltefosine)、miriplatin、二溴甘露醇(mitobronitol)、米托胍腙(mitoguazone)、二溴衛矛醇(mitolactol)、絲裂黴素(mitomycin)、米托坦(mitotane)、米托蒽醌(mitoxantrone)、莫加珠單抗(mogamulizumab)、莫拉司亭(molgramostim)、 莫呱達醇(mopidamol)、嗎啡鹽酸鹽(morphine hydrochloride)、嗎啡硫酸鹽(morphine sulfate)、那密濃(nabilone)、nabiximols、那法瑞林(nafarelin)、納洛酮(naloxone)+噴他佐辛(pentazocine)、那曲酮(naltrexone)、那托司亭(nartograstim)、耐昔妥珠單抗(necitumumab)、奈達鉑(nedaplatin)、奈拉濱尼洛替尼(nelarabine)、奈立膦酸(neridronic acid)、萘妥吡坦/帕洛諾司瓊(netupitant/palonosetrone)、nivolumab、噴曲肽(pentetreotide)、尼祿替尼(nilotinib)、尼魯米特(nilutamide)、尼莫唑(nimorazole)、尼妥珠單抗(nimotuzumab)、尼莫司汀(nimustine)、尼達尼布(nintedanib)、二胺硝吖啶(nitracrine)、nivolumab、阿托珠單抗(obinutuzumab)、奧曲肽(octreotide)、奧法木單抗(ofatumumab)、奧拉帕尼(olaparib)、olaratumab、高三尖杉酯鹼(omacetaxin mepesuccinate)、奧美拉唑(omeprazole)、歐丹西挫(ondansetron)、奧古蛋白(orgotein)、orilotimod、奧希替尼(osimertinib)、奧沙利鉑(oxaliplatin)、羥考酮(oxycodone)、羥甲烯龍(oxymetholone)、ozogamicin、p53基因治療、太平洋紫杉醇(paclitaxel)、palbociclib、帕利夫明(palifermin)、鈀-103粒子、帕洛司瓊(palonosetron)、帕米膦酸(pamidronic 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alfa)、硫鳥嘌呤(tioguanine)、托西莫單抗(tocilizumab)、曲貝替定(topotecan)、托瑞米芬(toremifene)、托西莫單抗(tositumomab)、他比特定(trabectedin)、曲美替尼(trametinib)、曲馬多(tramadol)、曲妥珠單抗(trastuzumab)、曲奧舒凡(treosulfan)、維甲酸(tretinoin)、曲氟尿苷(trifluridine)+tipiracil、曲美替尼(trametinib)、曲洛司坦(trilostane)、曲普瑞林(triptorelin)、曲磷胺(trofosfamide)、促血小板生成素(thrombopoietin)、烏苯美司(ubenimex)、戍柔比星(valrubicin)、凡德他尼(vandetanib)、伐普肽(vapreotide)、瓦他拉尼(vatalanib)、維羅非尼(vemurafenib)、長春鹼(vinblastine)、長春新鹼(vincristine)、長春地辛(vindesine)、長春氟寧(vinflunine)、長春瑞濱(vinorelbin)、vismodegib、伏林司他(vorinostat)、釔-90玻璃微珠、淨司他丁(zinostatin)、淨司他丁斯酯(zinostatin stimalamer)、唑來膦酸(zoledronic acid)、佐柔比星(zorubicin)。
此外，本發明之化合物可與，例如能與下列標靶結合之結合劑(例如抗體)組合：OX-40、CD137/4-1BB、DR3、IDO1/IDO2、LAG-3、CD40。
因為抗體-藥物結合物(ADC)之非細胞可穿透帶毒體代謝物對於後天免疫系統的細胞應無損害效應，因此本發明進一步係提供本發明之抗體-藥物結合物(ADC)與癌症免疫治療之組合供用於治療癌症或腫瘤。細胞毒性抗體-藥物結合物之內在作用機制係包括直接觸發腫瘤細胞死亡及因此釋放可刺激免疫反應之腫瘤抗原。再者，有跡象顯示KSP抑制劑帶毒體類在活體外引發致免疫細胞死亡(ICD)的標記。因此，本發明抗體-藥物結合物(ADC)與一或多種癌症免疫治療法或與一或多種活性化合物，較佳地抗癌症治療之分子標靶抗體之組合，係代表一治療腫瘤之較佳方法。i)癌症免疫治療之治療法的實例包括免疫調節單株抗體和抗癌症免疫治療之標靶的低分子量物質、疫苗、CAR T細胞、雙專一性T-細胞-招募抗體、溶瘤病毒、以細胞為基礎的疫苗接種法。ii)適用於免疫調節單株抗體之所選的癌症免疫治療標靶之實例包括CTLA-4、PD-1/PDL-1、OX-40、CD137、DR3、IDO1、IDO2,TDO2、LAG-3、TIM-3 CD40.,ICOS/ICOSL,TIGIT；GITR/GITRL、VISTA、CD70、CD27、HVEM/BTLA、CEACAM1、CEACAM6、ILDR2、CD73、CD47、B7H3、TLR。因此，本發明抗體-藥物結合物(ADC)與癌症治療之組合，在一方面，應可給予帶有微弱的致免疫性之腫瘤更大的致免疫性並增強癌症免疫治療的效用，及更進一步展開持久的治療作用。
此外，本發明之化合物亦可與放射線治療及/或手術介入組合使用。
一般而言，以本發明化合物與其他細胞抑制或細胞毒性或免疫治療活性劑的組合可實行下列目標：‧相較於以個別的活性化合物治療，在減緩腫瘤生長、降低其大小或甚至完全將其消除上具增進效用；‧比單一治療之情況，可能使用較低劑量化療劑；‧相較於個別給藥，可能為帶有極少副作用之更耐受的治療； ‧可能治療更廣泛的腫瘤病症；‧對治療達到較高的反應率；‧相較於目前標準治療，更長的病患存活時間。
此外，本發明化合物再者亦可與放射線治療及/或手術介入組合使用。
本發明進一步係提供包括至少一種本發明化合物，典型地以及一或多種惰性、無毒、醫藥上可接受賦形劑之醫藥品，及其用於上述目的之用途。
本發明化合物可全身性及/或局部作用。就此目的，其可以適合之方式來給藥，例如非經腸，可能地藉由吸入或為植入物或支架。
本發明化合物可以適合這些給藥路徑之給藥形式來投予。
非經腸給藥可繞過吸收步驟(例如靜脈內、動脈內、心內、脊椎內或腰內)或包括吸收(例如肌肉內、皮下、皮內、經皮或腹膜內)。適合非經腸投予之給藥形式包括溶液、懸浮液、乳液或凍乾物形式之注射和輸注用之調配物。較佳的為非經腸給藥，特別是靜脈給藥。
一般而言，已發現在非經腸給藥之情況下有利的為給予約0.1至20mg/kg體重之量，較佳地約0.3至7mg/kg體重之量，以便達到效果。
然而在某些情況下可能須偏離所述之量，且特言之是依體重、給藥路徑、個體對活性化合物之反應、調配物的性質和給藥進行的時間點或間隔而定。因此，在某些情況下以低於上述最小量即足夠，而在其他的情況下則必須超過所述之上限量。就給予相當大量的情況下，適當的係將這些量分成數個個別的劑量分散於一天中。
實例
下列實例係說明本發明。本發明不限於此等實例。
除非另有說明，否則下列試驗和實例中的百分比為重量百分比；分量為重量份。在各案例中，液體/液體溶液之溶劑比例、稀釋比例和濃度數據係以體積為基準。
若在實驗說明中並無反應進行時之相關的溫度資料，則視為是室溫。
合成路徑：
作為操作實例之示例，下列流程係顯示產生此等操作實例之示例性合成路徑：合成的順序和保護基團策略可依目標化合物的路徑而變。
[a)：例如三乙醯氧基硼氫化鈉，乙酸，DCM，RT；b)例如乙醯氧基乙醯氯，NEt3,DCM,RT；c)例如LiOH,THF/水，RT；d)例如H2,Pd-C,EtOH,RT；e)例如Teoc-OSu,NEt3，二烷，RT；f)例如Fmoc-Cl，二異丙基乙基胺，二烷/水2：1,RT]
[a)：HATU,DMF,N,N-二異丙基乙基胺，RT；b)：H2,10% Pd-C，甲醇，RT c)：1,1’-[(1,5-二側氧吡咯啶-1-基)氧基]-2-側氧乙基}-1H-吡咯-2,5-二酮，N,N-二異丙基乙基胺，DMF，於RT攪拌；d)2,2,2-三氟乙醇，4-8當量的氯化鋅，2-6h於50℃；e)AK溶於PBS，於氬氣下加入3-4當量溶於PBS緩衝液的TCEP及於RT攪拌約30min，然後加入5-10當量溶於DMSO的化合物D，於RT攪拌約90min，然後藉由以PBS緩衝劑(pH 8)平衡PD 10管柱(Sephadex® G-25,GE Healthcare)再緩衝至pH 8，然後於RT攪拌至隔夜，然後視需要藉由以PBS緩衝劑(pH 7.2)平衡的PD 10管柱(Sephadex® G-25,GE Healthcare)純化，及隨後藉由超離心濃縮並以PBS緩衝劑(pH 7.2)設定所欲的濃度]。在活體內批件的 情況下，接著將其視需要無菌過濾。
A.實例 縮寫及首字母縮寫：
HPLC和LC-MS法： 方法1(LC-MS)：
儀器：Waters ACQUITY SQD UPLC System；管柱：Waters Acquity UPLC HSS T3 1.8μ 50 x 1mm；移動相A：1l的水+0.25ml的99%濃度甲酸；移動相B：1l的乙腈+0.25ml的99%濃度甲酸；梯度：0.0min 90% A→1.2min 5% A→2.0min 5% A；烘箱：50℃；流速：0.40ml/min；UV偵測：208-400nm。
方法2(LC-MS)：
MS儀器類型：Waters Synapt G2S；UPLC儀器類型：Waters Acquity I-CLASS；管柱：Waters,BEH300,2.1 x 150mm,C18 1.7μm；移動相A：1l的水+0.01%甲酸；移動相B：1l的乙腈+0.01%甲酸；梯度：0.0min 2% B→1.5min 2% B→8.5min 95% B→10.0min 95% B；烘箱：50℃；流速：0.50ml/min；UV偵測：220nm
方法3(LC-MS)：
MS儀器：Waters(Micromass)QM；HPLC儀器：Agilent 1100系列；管柱：Agilent ZORBAX Extend-C18 3.0 x 50mm 3.5微米；移動相A：1l的水+0.01mol的碳酸銨，移動相B：1l的乙腈；梯度：0.0min 98% A→0.2min 98% A→3.0min 5% A→4.5min 5% A；烘箱：40℃；流速：1.75ml/min；UV偵測：210nm
方法4(LC-MS)：
MS儀器類型：Waters Synapt G2S；UPLC儀器類型：Waters Acquity I-CLASS；管柱：Waters,HSST3,2.1 x 50mm,C18 1.8μm；移動相A：1l的水+0.01%甲酸；移動相B：1l的乙腈+0.01%甲酸；梯度：0.0min 10% B→0.3min 10% B→1.7min 95% B→2.5min 95% B；烘箱：50℃；流速：1.20ml/min；UV偵測：210nm
方法5(LC-MS)：
儀器：Waters ACQUITY SQD UPLC System；管柱：Waters Acquity UPLC HSS T3 1.8μ 50 x 1mm；移動相A：1l的水+0.25ml的99%濃度甲酸；移動相B：1l的乙腈+0.25ml的99%濃度甲酸；梯度：0.0min 95% A→6.0min 5% A→7.5min 5% A；烘箱：50℃；流速：0.35ml/min；UV偵測：210-400nm。
方法6(LC-MS)：
儀器：Micromass Quattro Premier with Waters UPLC Acquity；管柱：Thermo Hypersil GOLD 1.9μ,50 x 1mm；移動相A：1l的水+0.5ml的50%濃度甲酸；移動相B：1l的乙腈+0.5ml的50%濃度甲酸；梯度：0.0min 97% A→0.5min 97% A→3.2min 5% A→4.0min 5% A烘箱：50℃；流速：0.3ml/min；UV偵測：210nm。
方法7(LC-MS)：
儀器：Agilent MS Quad 6150；HPLC：Agilent 1290；管柱：Waters Acquity UPLC HSS T3 1.8μ 50 x 2.1mm；移動相A：1l的水+0.25ml的99%濃度甲酸；移動相B：1l的乙腈+0.25ml的99%濃度甲酸；梯度：0.0min 90% A→0.3min 90% A→1.7min 5% A→3.0min 5% A烘箱：50℃；流速：1.20ml/min；UV偵測：205-305nm。
方法8(LC-MS)：
MS儀器類型：Waters Synapt G2S；UPLC儀器類型：Waters Acquity I-CLASS；管柱：Waters,HSST3,2.1 x 50mm,C18 1.8μm；移動相A：1l的水+0.01%甲酸；移動相B：1l的乙腈+0.01%甲酸；梯度：0.0min 2% B→2.0min 2% B→13.0min 90% B→15.0min 90% B；烘箱：50℃；流速：1.20ml/min；UV偵測：210nm。
方法9：(LC-MS製備式純化方法)
MS儀器：Waters,HPLC儀器：Waters(管柱Waters X-Bridge C18,19mm x 50mm,5μm，溶離液A：水+0.05%氨水，移動相B：乙腈(ULC)以梯度；流速：40ml/min；UV偵測：DAD；210-400nm).或MS儀器：Waters,HPLC儀器：Waters(管柱Phenomenex Luna 5μ C18(2)100A,AXIA Tech.50 x 21.2mm，溶離液A：水+0.05%甲酸，溶離液B：乙腈(ULC)以梯度；流速：40ml/min；UV偵測：DAD；210-400nm).
方法10：(LC-MS分析法)
MS儀器：Waters SQD；HPLC儀器：Waters UPLC；管柱：Zorbax SB-Aq(Agilent),50mm x 2.1mm,1.8μm；移動相A：水+0,025%甲酸，溶離液B：乙腈(ULC)+0,025%甲酸；梯度：0.0min 98%A-0.9min 25%A-1.0min 5%A-1.4min 5%A-1.41min 98%A-1.5min 98%A；烘箱：40℃；流速：0,600ml/min；UV偵測：DAD；210nm。
方法11(HPLC)：
儀器：HP1100 Series，管柱：Merck Chromolith SpeedROD RP-18e,50-4.6mm，型號1.51450.0001,precolumn Chromolith Guard Cartridge套組，RP-18e,5-4.6mm，型號1.51470.0001；梯度：流速5ml/min；注射體積5μl；溶劑A：HClO4(70%)溶於水(4ml/l)，溶劑B：乙腈開始20% B,0.50min 20% B,3.00min 90% B,3.50min 90% B,3.51min 20% B,4.00min 20% B，管柱溫度：40℃，波長：210nm
方法12(LC-MS)：
MS儀器類型：Thermo Scientific FT-MS；儀器類型UHPLC+：Thermo Scientific UltiMate 3000；管柱：Waters,HSST3,2.1 x 75mm,C18 1.8μm；移動相A：1l的水+0.01%甲酸；移動相B：1l的乙腈+0.01%甲酸；梯度：0.0min 10% B→2.5min 95% B→3.5min 95% B；烘箱：50℃；流速：0.90ml/min；UV偵測：210nm/最佳積分路徑210-300nm
方法13：(LC-MS)：
MS儀器：Waters(Micromass)Quattro Micro；儀器Waters UPLC Acquity；管柱：Waters BEH C18 1.7μ 50 x 2.1mm；移動相A：1l的水+0.01mol的甲酸銨，移動相B：1l的乙腈；梯度：0.0min 95% A→0.1min 95% A→2.0min 15% A→2.5min 15% A→2.51min 10% A→3.0min 10% A；烘箱：40℃；流速：0.5ml/min；UV偵測：210nm。
方法14：(LC-MS)：
MS儀器類型：ThermoFisherScientific LTQ-Orbitrap-XL；HPLC儀器類型：Agilent 1200SL；管柱：Agilent,POROSHELL 120,3 x 150mm,SB-C18 2.7μm；移動相A：1l的水+0.1%三氟乙酸；移動相B：1l的乙腈+0.1%三氟乙酸；梯度：0.0min 2% B→0.3min 2% B→5.0min 95% B→10.0min 95% B；烘箱：40℃；流速：0.75ml/min；UV偵測：210nm
對於其製備並未明確描述於下文中的所有反應物或試劑，其係由市售一般可取得的來源所購得。對於其製備同樣並未描述於下文，且並非市售或由非一般性可取得的來源所獲得的其他反應物或試劑，係給予其中描述其製備之公開文獻作為參考。
起始化合物和中間物： 中間物C52
(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙-1-胺
將10.00g(49.01mmol)的4-溴-1H-吡咯-2-羧酸甲酯先載入100.0ml的DMF中，並加入20.76g(63.72mmol)的碳酸銫和9.22g(53.91mmol)的苯甲基溴。將反應混合物於RT攪拌至隔夜。將反應混合物置於水和乙酸乙酯間分溶並以乙酸乙酯萃取水層。將組合的有機層以硫酸鎂乾燥並於減壓下蒸發溶劑。以90.0g的4-溴-1H-吡咯-2-羧酸甲酯重複此反應。
將二個組合的反應以製備式RP-HPLC純化(管柱：Daiso 300x100；10μ，流速：250ml/min,MeCN/水)。於減壓下蒸發溶劑並將殘餘物於高真空下乾燥。由此得到125.15g(87%的理論值)的1-苯甲基-4-溴-1H- 吡咯-2-羧酸甲酯化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=1.18min；MS(ESIpos)：m/z=295[M+H]+。
於氬氣下，將4.80g(16.32mmol)的1-苯甲基-4-溴-1H-吡咯-2-羧酸甲酯先載入DMF中，並加入3.61g(22.85mmol)的(2,5-二氟苯基)硼酸、19.20ml飽和的碳酸鈉溶液和1.33g(1.63mmol)的[1,1'-雙(二苯基膦基)二茂鐵]-二氯鈀(II)：二氯甲烷。將反應混合物於85℃攪拌至隔夜。將反應混合物經由矽藻土(Celite)過濾並以乙酸乙酯清洗濾餅。以水萃取有機層及然後以飽和NaCl溶液清洗。將有機層以硫酸鎂乾燥並於減壓下蒸發溶劑。於矽膠上純化殘餘物(移動相：環己烷/乙酸乙酯100：3)。於減壓下蒸發溶劑並將殘餘物於高真空下乾燥。由此得到3.60g(67%的理論值)的1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-羧酸甲酯化合物。
LC-MS(方法7)：Rt=1.59min；MS(ESIpos)：m/z=328[M+H]+。
將3.60g(11.00mmol)的1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-羧酸甲酯先載入90.0ml的THF中，並於0℃加入1.04g(27.50mmol)的氫化鋰鋁(2.4M溶於THF)。將反應混合物於0℃攪拌30分鐘。於0℃加入飽和的酒石酸鉀鈉溶液並將反應混合物與乙酸乙酯混合。將有機層以飽和的酒石酸鉀鈉溶液萃取三次。以飽和的NaCl溶液清洗有機層一次並以硫酸鎂乾燥。於減壓下蒸發溶劑並將殘餘物溶於30.0ml的二氯甲烷。加入3.38g(32.99mmol)的氧化錳(IV)，並將混合物於RT攪拌48h。另外加入2.20g(21.47mmol)的氧化錳(IV)，並將混合物於RT攪拌至隔夜。將反應混合物以矽藻土過濾並以二氯甲烷清洗濾餅。於減壓下蒸發溶劑並將殘餘物2.80g的(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-甲醛)在無進一步純化下用於下個合成步驟。
LC-MS(方法7)：Rt=1.48min；MS(ESIpos)：m/z=298[M+H]+.
將28.21g(94.88mmol)的1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-甲醛與23.00g(189.77mmol)的(R)-2-甲基丙-2-亞磺醯胺一起先載入403.0ml的無水THF中，及加入67.42g(237.21mmol)的異丙醇鈦(IV) 並將混合物於RT攪拌至隔夜。加入500ml的飽和的NaCl溶液和1000.0ml的乙酸乙酯，並將混合物於RT攪拌1h。將混合物經由矽藻土過濾並以飽和的NaCl溶液清洗濾液二次。以硫酸鎂乾燥有機層，於減壓下蒸發溶劑並使用Biotage Isolera純化殘餘物(矽膠，管柱1500+340g SNAP，流速200ml/min，乙酸乙酯/環己烷1：10)。
LC-MS(方法7)：Rt=1.63min；MS(ESIpos)：m/z=401[M+H]+.
將25.00g(62.42mmol)的(R)-N-{(E/Z)-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]伸甲基}-2-甲基丙-2-亞磺醯胺於氬氣下先載入無水THF中並冷卻至-78℃。然後於-78℃加入12.00g(187.27mmol)的第三丁基鋰(1.7M溶於戊烷之溶液)並將混合物於此溫度攪拌3h。然後於-78℃連續加入71.4ml的甲醇和214.3ml的飽和氯化銨溶液並讓反應混合物升溫至RT及於RT攪拌1h。以乙酸乙酯稀釋混合物並以水清洗。將有機層以硫酸鎂乾燥並於減壓下蒸發溶劑。將殘餘物(R)-N-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2-甲基丙-2-亞磺醯胺在無進一步純化下用於下個分析步驟。
LC-MS(方法6)：Rt=2.97min；MS(ESIpos)：m/z=459[M+H]+.
將28.00g(61.05mmol)的(R)-N-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2-甲基丙-2-亞磺醯胺先載入186.7ml的1,4-二烷中，及然後加入45.8ml的HCl之1,4-二烷溶液(4.0M)。將反應混合物於RT攪拌2h並於減壓下蒸發溶劑。以製備式HPLC純化殘餘物(管柱：Kinetix 100x30；流速：60ml/min,MeCN/水)。於減壓下蒸發乙腈並將二氯甲烷加到水性殘餘物中。將有機層以碳酸氫鈉溶液清洗並以硫酸鎂乾燥。於減壓下蒸發溶劑及於高真空下乾燥殘餘物。由此得到16.2g(75%的理論值)的標題化合物。
LC-MS(方法6)：Rt=2.10min；MS(ESIpos)：m/z=338[M-NH2]+,709[2M+H]+.
1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)：δ[ppm]=0.87(s,9H),1.53(s,2H),3.59(s,1H),5.24(d,2H),6.56(s,1H),6.94(m,1H),7.10(d,2H),7.20(m, 1H),7.26(m,2H),7.34(m,2H),7.46(m,1H).
中間物C58
(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇醯基)胺基]-2-({[2-(三甲基矽基)乙氧基]羰基}胺基)丁酸
將4.3g(12.2mmol)的中間物C52溶於525ml的DCM，並加入3.63g(17.12mmol)的三乙醯氧基硼氫化鈉和8.4ml的乙酸。於RT攪拌5min後，加入溶於175ml的DCM之8.99g(24.5mmol)的中間物L57並將反應於RT另再攪拌45min。然後以300ml的DCM稀釋反應並以100ml的碳酸氫鈉溶液清洗二次及以飽和的NaCl溶液清洗一次。將有機層以硫酸鎂乾燥，於減壓下蒸發溶劑及於高真空下乾燥殘餘物。然後以製備式RP-HPLC純化殘餘物(管柱：Chromatorex C18)。將適當的溶離份組合後，於減壓下蒸發溶劑並於高真空下乾燥殘餘物。由此得到4.6g(61%的理論值)的(2S)-4-({(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基)-2-({[2-(三甲基矽基)乙氧基]羰基}胺基)丁酸甲酯。
LC-MS(方法12)：Rt=1.97min；MS(ESIpos)：m/z=614(M+H)+.
將2.06g(3.36mmol)的此中間物先載入76ml的DCM中並以0.81ml(7.17mmol)的2-氯-2-側氧乙基乙酸酯在2.1ml三乙胺的存在下醯化。於RT攪拌20h後，加入0.36ml的2-氯-2-側氧乙基乙酸酯和0.94 ml的三乙胺並將反應於RT另再攪拌15min。然後以500ml的乙酸乙酯稀釋混合物並連續以300ml的5%檸檬酸萃取二次，以300ml的飽和碳酸氫鈉溶液萃取二次及以100ml的飽和氯化鈉溶液萃取一次，及然後以硫酸鎂乾燥和濃縮。於高真空下乾燥，得到2.17g(79%的理論值)保護的中間物。
LC-MS(方法1)：Rt=1.48min；MS(ESIpos)：m/z=714(M+H)+.
將2.17mg(2.64mmol)的此中間物溶於54ml的THF和27ml的水，並加入26ml的2-莫耳濃度氫氧化鋰溶液。將混合物於RT攪拌30min及然後使用1.4ml的TFA調整pH至3到4之間。於減壓下濃縮混合物。一旦大部分的THF蒸發掉，則以DCM萃取水性溶液二次及然後於減壓下濃縮至乾。以製備式HPLC純化殘餘物(管柱：Chromatorex C18)。將適當的溶離份組合後，於減壓下蒸發溶劑並將殘餘物從乙腈/水凍乾。由此得到1.1g(63%的理論值)的標題化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=1.34min；MS(ESIpos)：m/z=656(M-H)-.
1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)：δ[ppm]=0.03(s,9H),0.58(m,1H),0.74-0.92(m,11H),1.40(m,1H),3.3(m,2H),3.7(m,1H),3.8-4.0(m,2H),4.15(q,2H),4.9 and 5.2(2d,2H),5.61(s,1H),6.94(m,2H),7.13-7.38(m,7H),7.48(s,1H),7.60(m,1H),12.35(s,1H).
中間物C66
2-(三甲基矽基)乙基[(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇醯基)胺基]-1-{[2-(甘胺醯基胺基)乙基]胺基}-1-側氧丁-2-基]胺甲酸酯
首先，藉由胜肽化學習用的方法(HATU偶合和Boc裂解)從N-[(苯甲基氧基)羰基]甘胺酸和(2-胺基乙基)胺甲酸第三丁酯製備三氟乙酸苯甲基{2-[(2-胺基乙基)胺基]-2-側氧乙基}胺甲酸酯。
將13mg(0.036mmol)的此中間物和25mg(0.033mmol)的中間物C58置於3ml的DMF中處理並加入19mg(0.05mmol)的HATU和17μl的N,N-二異丙基乙基胺。於RT攪拌10min後，將混合物濃縮並以製備式HPLC純化殘餘物。由此得到17.8mg(60%的理論值)的中間物。
LC-MS(方法1)：Rt=1.36min；MS(ESIpos)：m/z=891(M+H)+.
17mg(0.019mmol)的此中間物溶於10ml的乙醇，加入碳上鈀(10%)並於RT使用氫氣於標準壓力下將混合物氫化2h。濾出催化劑，於減壓下蒸發溶劑並於高真空下乾燥殘餘物。由此得到9mg(62%的理論值)的標題化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=1.03min；MS(ESIpos)：m/z=757(M+H)+.
中間物C118
N-[(8S)-8-{2-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇醯基)胺基]乙基}-2,2-二甲基-6,9-二側氧-5- 氧雜-7,10-二氮雜-2-矽代十二烷-12-基]-D-α-麩醯胺酸第三丁酯
此標題化合物係藉由胜肽化學之習用方法以中間物L119和中間物C58在HATU的存在下偶合及後續氫化裂解Z保護基所製備。
LC-MS(方法1)：Rt=1.05min；MS(ESIpos)：m/z=885(M+H)+.
中間物C119
甘胺醯基-N-[(8S)-8-{2-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇醯基)胺基]乙基}-2,2-二甲基-6,9-二側氧-5-氧雜-7,10-二氮雜-2-矽代十烷-12-基]-D-α-麩醯胺酸第三丁酯
中間物C119係藉由胜肽化學之習用方法以2,5-二側氧吡咯啶-1-基N-[(苯甲基氧基)羰基]甘胺酸酯和中間物C118在HATU的存在下偶合及後續藉由氫作用於10%活性碳上鈀上在中甲醇/二氯甲烷於RT氫氣標準壓力下移除Z保護基所製備。
LC-MS(方法1)：Rt=1.03min；MS(ESIpos)：m/z=942(M+H)+.
中間物L1
N-(2-胺基乙基)-2-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯胺三氟乙酸鹽
標題化合物係藉由胜肽化學之習用方法從市售的(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙酸和(2-胺基乙基)胺甲酸第三丁酯所製備。
LC-MS(方法1)：Rt=0.17min；MS(ESIpos)：m/z=198(M+H)+.
中間物L57
(2S)-4-側氧-2-({[2-(三甲基矽基)乙氧基]羰基}胺基)丁酸甲酯
將500.0mg(2.72mmol)的L-天門冬醯胺酸甲酯鹽酸鹽和706.3mg(2.72mmol)的2-(三甲基矽基)乙基2,5-二側氧吡咯啶-1-羧酸酯先載入5.0ml的1,4-二烷中，並加入826.8mg(8.17mmol)的三乙胺。將反應混合物於RT攪拌至隔夜。將反應混合物直接以製備式RP-HPLC純化(管柱：Reprosil 250x40；10μ，流速50ml/min,MeCN/水，0.1% TFA)。然後於減壓下蒸發溶劑並於高真空下乾燥殘餘物。由此得到583.9mg(74%的理論值)的(3S)-4-甲氧基-4-側氧-3-({[2-(三甲基矽基)乙氧基]羰基}胺基)丁酸化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.89min；MS(ESIneg)：m/z=290(M-H)-.
將592.9mg的(3S)-4-甲氧基-4-側氧-3-({[2-(三甲基矽基)乙氧基]羰基}胺基)丁酸先載入10.0ml的1,2-二甲氧基乙烷中，將反應冷卻至-15℃並加入205.8mg(2.04mmol)的4-甲基嗎福啉和277.9mg(2.04mmol)的氯甲酸異丁酯。15min後以抽氣過濾出沉澱並每次各以10.0 ml的1,2-二甲氧基乙烷清洗二次。將濾液冷卻至-10℃，並於劇烈攪拌下加入溶於10ml水的15.5mg(3.05mmol)硼氫化鈉。進行相分離並將有機層各以飽和的碳酸氫鈉溶液及飽和的NaCl溶液清洗一次。將有機層以硫酸鎂乾燥，於減壓下蒸發溶劑並於高真空下乾燥殘餘物。由此得到515.9mg(91%的理論值)的N-{[2-(三甲基矽基)乙氧基]羰基}-L-高絲胺酸甲酯化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.87min；MS(ESIpos)：m/z=278(M+H)+.
將554.9mg(2.00mmol)的N-{[2-(三甲基矽基)乙氧基]羰基}-L-高絲胺酸甲酯先載入30.0ml的二氯甲烷中，並加入1.27g(3.0mmol)的戴斯-馬汀過碘烷(Dess-Martin periodinane)和474.7mg(6.00mmol)的吡啶。將混合物於RT攪拌至隔夜。4h後，以二氯甲烷醯式反應並將有機層每次各以10%濃度的Na2S2O3溶液、10%濃度的檸檬酸溶液及飽和的碳酸氫鈉溶液清洗三次。將有機層以硫酸鎂乾燥及於減壓下蒸發溶劑。由此得到565.7mg(97%的理論值)的標題化合物。
1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)：δ[ppm]=0.03(s,9H),0.91(m,2H),2.70-2.79(m,1H),2.88(dd,1H),3.63(s,3H),4.04(m,2H),4.55(m,1H),7.54(d,1H),9.60(t,1H).
中間物L119
N-(2-胺基乙基)-N2-[(苯甲基氧基)羰基]-D-α-麩醯胺酸第三丁酯三氟乙酸鹽
中間物L119係以胜肽化學之習用方法藉由市售的(2R)-2-{[(苯甲基氧基)羰基]胺基}-5-第三丁氧基-5-側氧戊酸(1.00g,2.96mmol)和(2-胺基乙基)胺甲酸第三丁酯(560μl,3.6mmol)在HATU的存在下偶合及 後續使用10%濃度的TFA之二氯甲烷溶液酸移除Boc保護基所製備，其中實質上保留第三丁基酯保護基。以製備式HPLC純化，得到標題化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.62min；MS(ESI-pos)：m/z=380(M+H)+.
中間物L120
N-(2-胺基乙基)-N2-[(苯甲基氧基)羰基]-D-α-麩醯胺酸苯甲基酯
中間物L120係以胜肽化學之習用方法藉由市售的(2R)-5-(苯甲基氧基)-2-{[(苯甲基氧基)羰基]胺基}-5-側氧戊酸(830mg,2.23mmol)和(2-胺基乙基)胺甲酸第三丁酯(420μl,2.7mmol)在HATU的存在下偶合及後續使用TFA之二氯甲烷溶液酸移除Boc保護基所製備。
中間物F104
(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇醯基)胺基]-N-(2-{[(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯基]胺基}乙基)丁醯胺三氟乙酸鹽
將300mg(0.456mmol)的中間物C58溶於38ml的DMF，並加入142mg(0.456mmol)的中間物L1和260mg(0.684mmol)的HATU及318μl的N,N-二異丙基乙基胺。將混合物於RT攪拌60min及然後濃縮。以製備式HPLC純化殘餘物，凍乾後，得到338mg(87%的理論值)保護的中間物。
LC-MS(方法1)：Rt=1.30min；MS(ESIpos)：m/z=837(M+H)+.
在第二步驟中，將338mg(0.404mmol)的此中間物溶於40ml的2,2,2-三氟乙醇。加入330.2mg(2.42mmol)的氯化鋅並將混合物於50℃攪拌3h。然後加入708mg(2.42mmol)的乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸和4ml的0.1%濃度三氟乙酸水溶液。將混合物以製備式HPLC純化。將適當的溶離份濃縮並從乙腈/水凍乾殘餘物，得到265mg(81%的理論值)的標題化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.82min；MS(ESIpos)：m/z=693(M+H)+.
中間物F325
N-[2-({(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇醯基)胺基]丁醯基}胺基)乙基]-N2-[(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯基]-D-α-麩胺酸三氟乙酸鹽
將30mg(0.046mmol)的中間物C58與29mg(0.055mmol)的N-(2-胺基乙基)-N2-[(苯甲基氧基)羰基]-D-α-麩胺酸苯甲基酯三氟乙酸鹽(中間物L120)在1.5當量HATU和3當量N,N-二異丙基乙基胺的存在下偶合。以製備式HPLC純化，得到39.5mg(82%的理論值)保護的中間物。由此中間物，起初以氫解移除苯甲基酯基團。隨後，與1-{2-[(2,5-二側氧吡咯啶-1-基)氧基]-2-側氧乙基}-1H-吡咯-2,5-二酮在DMF中於3當量N,N-二異丙基乙基胺的存在下進行偶合。在最後步驟中，將13.5mg(0.012mmol)的此中間物溶於5ml的2,2,2-三氟乙醇。加入13mg(0.096mmol)的氯化鋅並將混合物於50℃攪拌3h。隨後，加入28mg(0.096mmol)的乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸。以製備式HPLC純化混合物。將適當的溶離份濃縮並從乙腈/水凍乾殘餘物，得到9mg(81%的理論值)的標題化合物。
LC-MS(方法12)：Rt=1.44min；MS(ESIpos)：m/z=822(M+H)+.
B：製備抗體-藥物接合物(ADC) B-1.用於產生抗-CD123和抗-CXCR5抗體及抗-CD123與抗-CXCR5抗體之嵌合和人源化變體之通用方法
將所用的抗體，例如抗-CD123抗體TPP-8987、TPP-8988和TPP-9476，以及抗-CXCR5抗體TPP-9024、TPP-9574和TPP-9580之蛋白序列(胺基酸序列)，藉由熟習本項技術者已之的方法轉變成編碼個別蛋白之DNA序列並插入一適用於過渡哺乳動物細胞培養之表現載體中(如Tom等人所述，Methods Express之第12章：Expression Systems由Micheal R.Dyson及Yves Durocher所編輯，Scion Publishing Ltd,2007)。
B-2.於哺乳動物細胞中表現抗體之通用方法
抗體，例如抗-CD123抗體TPP-8987、TPP-8988和TPP-9476，以及抗-CXCR5抗體TPP-9024、TPP-9574和TPP-9580係以過渡的哺乳動物細胞培養來產生，如Tom等人所描述，Methods Express之第12章：Expression Systems由Micheal R.Dyson及Yves Durocher所編輯，Scion Publishing Ltd,2007。
B-3.由細胞上清液純化抗體之通用方法
抗體，例如抗-CD123抗體TPP-8987、TPP-8988和TPP-9476，以及抗-CXCR5抗體TPP-9024、TPP-9574和TPP-9580係由細胞培養上清液所獲得。藉由離心細胞來澄清細胞上清液。然後藉由親和層析於MabSelect Sure(GE Healthcare)層析管柱上純化細胞上清液。就此，係以DPBS pH 7.4(Sigma/Aldrich)平衡管柱，施予細胞上清液並以約10個管柱體積的DPBS pH 7.4+500mM氯化鈉沖洗管柱。以50mM乙酸鈉pH 3.5+500mM氯化鈉溶離抗體及然後進一步以凝膠過濾層析於Superdex 200管柱上(GE Healthcare)以DPBS pH 7.4純化。
市售抗體係從市售產品藉由標準層析法純化(蛋白A，製備式凝膠過濾層析(SEC-粒徑排除層析))。
B-4.用於偶合半胱胺酸側鏈之通用方法
在偶合反應中係使用下列抗體：抗-CD123 AK TPP-8987
抗-CD123 AK TPP-8988
抗-CD123 AK TPP-9476
抗-CXCR5 AK TPP-9024
抗-CXCR5 AK TPP-9574
抗-CXCR5 AK TPP-9580
小規模偶合：
將溶於PBS緩衝劑之2至5當量間的叁(2-羧乙基)膦鹽酸鹽(TCEP)，加到濃度範圍介於1mg/m至20mg/ml，較佳地約5mg/ml至15mg/ml範圍之2-5mg適當的抗體之PBS緩衝劑溶液中，並將混 合物於RT攪拌30min至1h。隨後，依照希望的載量，可加入2至12當量，較佳地約5-10當量偶合用的馬來醯亞胺前驅化合物之DMSO溶液。本處，DMSO的量不應超過總量的10%。將混合物於RT攪拌60-240min，及隨後以之前已調整至pH 8的PBS緩衝液稀釋至2.5-7.5ml的體積，及然後通過以PBS緩衝液pH 8平衡過的PD 10管柱(Sephadex® G-25,GE Healthcare)，並以PBS緩衝液pH 8溶離。將溶離液於RT氬氣下攪拌至隔夜。隨後，以超離心濃縮溶液並以PBS緩衝液(pH 7.2)再稀釋。
中度規模偶合：
於氬氣下，將2-5當量，較佳地3當量溶於PBS緩衝液的TCEP之溶液(c~0.2-0.8mg/ml，較佳地0.5mg/ml)加到20-200mg溶於PBS緩衝液的所指抗體之溶液中(c~5-15mg/ml)。將混合物於RT攪拌30min，及然後加入溶於DMSO之2-12當量，較佳地5-10當量的馬來醯亞胺前驅化合物。於RT另再攪拌1.5h-2h後，以之前已調整至pH 8的PBS緩衝液稀釋混合物。
然後將此溶液施用於經PBS緩衝液pH 8平衡過的PD 10管柱(Sephadex® G-25,GE Healthcare)並以PBS緩衝劑pH 8溶離。以PBS緩衝液pH 8稀釋溶離液至1-5mg/ml濃度。將此溶液於RT氬氣下攪拌至隔夜。若需要，然後將此溶液再緩衝至pH 7.2。將ADC溶液以超離心濃縮，以PBS緩衝液(pH 7.2)稀釋及然後視需要再次濃縮至約10mg/ml的濃度。
在所示的結構式中，AK可具有操作實例表格中所採用的意義：抗-CD123 AK TPP-8987(部分還原)-S§1
抗-CD123 AK TPP-8988(部分還原)-S§1
抗-CD123 AK TPP-9476(部分還原)-S§1
抗-CXCR5 AK TPP-9024(部分還原)-S§1
抗-CXCR5 AK TPP-9574(部分還原)-S§1
抗-CXCR5 AK TPP-9580(部分還原)-S§1其中§1係代表連接琥珀醯亞胺基團或連接異構性水解的開鏈琥珀醯胺之 鍵連或從其所形成的伸烷基，及S係代表部份還原抗體之半胱胺酸殘基的硫原子。
本發明接合物之進一步純化及定性
反應後，在某些情況下將反應混合物濃縮，例如以超過濾，及然後脫鹽並以層析純化，例如使用Sephadex® G-25管柱。例如，以磷酸-緩衝食鹽水(PBS)進行溶離。然後將溶液殺菌過濾並冷凍。另一種選擇，可將接合物凍乾。
B-7.測定抗體、帶毒體載量及開鏈半胱胺酸接合物之比例
就蛋白鑑別，除了分子量測定之外，係在去糖基化及/或變性後進行胰蛋白酶消化，其在變性、還原及衍生後，經由發現的胰蛋白酶胜肽確認蛋白的身份。
操作實例中所述接合物所得到的PBS緩衝劑溶液之帶毒體載量(在表中稱為DAR，藥物-對-抗體比率)係如下測定：測定離胺酸-連接的ADC之帶毒體載量係藉由質譜測量個別接合物種類的分子量來進行。本處，首先將抗體接合物以PNGaseF去糖基化，並將樣本酸化，及HPLC分離/脫鹽後，使用ESI-MicroTofQ(Bruker Daltonik)藉由質譜分析。加入在TIC(總離子層析圖)訊號上的所有光譜並以MaxEnt反摺積為基礎，計算不同接合物種類之分子量。然後將不同種類的訊號積分後計算DAR(=藥物/抗體比率)。就此目的，係將帶毒體計數所加權之所有種類的積分結果總和除以所有種類之簡單加權積分結果的總和。
半胱胺酸-連接的接合物之帶毒體載量係藉由還原及變性的ADC之逆相層析來測定。將胍鹽酸鹽(GuHCl)(28.6mg)及DL-二硫蘇糖醇溶液(DTT)(500mM,3μl)加到ADC溶液(1mg/ml,50μl)中。將混合物於55℃培養1小時並以HPLC分析。
HPLC分析係在Agilent 1260 HPLC系統上以220nm偵測來進行。以1ml/min之流速以下列梯度使用Polymer Laboratories PLRP-S聚合物逆相管柱(型號PL1912-3802)(2.1 x150mm,8μm粒徑，1000Å)：0min,25%B；3min,25%B；28min,50%B。溶離液A由0.05%三氟乙酸(TFA)之水溶液組成，溶離液B為0.05%三氟乙酸之乙腈溶液。
所偵測的波峰係藉由與非接合抗體的輕鏈(L0)和重鏈(H0)相比較之滯留時間來分派。在接合的樣本中所獨有偵測到的波峰係歸屬於含一個帶毒體之輕鏈(L1)及含一、二或三個帶毒體(H1、H2、H3)之重鏈。
含帶毒體之抗體的平均載量(稱為DAR，藥物-對-抗體比率)係由積分所測定的波鋒面積來計算，為HC載量和LC載量之總和的二倍，其中LC載量係由所有LC波峰之帶毒體-平均加權積分結果的總和除以所有LC波峰之單一加權積分結果之總和所計算，及其中HC載量係由所有HC波峰之帶毒體-平均加權積分結果的總和除以所有HC波峰之單一加權積分結果之總和所計算。在個別的情況下，由於某些波峰之共溶離，可能無法精確測定帶毒體載量。
就其中輕鏈和重鏈不能充分地以HPLC分離之情況，測定半胱胺酸-連接的結合物之帶毒體載量係藉由質譜測定個別接合物種類在輕鏈和重鏈之分子量來進行。
就此目的，係將胍鹽酸鹽(GuHCl)(28.6mg)及DL-二硫蘇糖醇溶液(DTT)(500mM,3μl)加到ADC溶液(1mg/ml,50μl)中。將混合物於55℃培養1小時及於線上脫鹽後使用ESI-MicroTofQ(Bruker Daltonik)藉由質譜來分析。
就DAR測定，係加入在TIC(總離子層析圖)訊號上的所有光譜並以MaxEnt反摺積為基礎，計算不同接合物種類在輕鏈和重鏈之分子量。含帶毒體之抗體的平均載量係由積分所測定的波鋒面積之所測定，為HC載量和LC載量之總和的二倍。在本文中，LC載量係由帶毒體計數加權的所有LC波峰之積分結果的總和除以所有LC波峰之簡單加權積分結果之總和所計算，及HC載量係由帶毒體計數加權的所有HC波峰之積分結果的總和除以所有HC波峰之簡單加權積分結果之總和所計算。
就打開的結構之情況，測量打開的半胱胺酸加合物之比例，係測定所有個別接合的輕鏈和重鏈之封閉與打開的半胱胺酸加合物(分子量△(delta)18道爾頓)之分子量面積比率。由所有變體之平均得到打開的半胱胺酸加合物之比例。
B-8.確認ADC之抗原結合
與標靶分子結合之結合劑能力係在偶合發生後檢測。熟習本項技術者熟悉可用於此目的之各種方法；例如，接合物之親和力可使用ELISA技術或表面電漿共振分析(BIAcoreTM測量)來檢測。接合物濃度可由熟習本項技術者使用習用的方法來測量，例如就抗體接合物係以蛋白測定(亦參見Doronina et al.；Nature Biotechnol.2003；21：778-784及Polson et al.,Blood 2007；1102：616-623)。
操作實例ADC
操作實例和參考實例之結構式中所示的ADC，其係經由馬來醯亞胺基與抗體的半胱胺酸側鏈偶合，係依照連接子和偶合程序，主要以所示的開環形式呈現。然而，此製備可能包括一小部分的閉環形式。
實例1：
示例製程A：
於氬氣下，將0.029mg溶於0.05ml PBS緩衝液的TCEP溶液加到5mg所指抗體之0.5ml的PBS溶液中(c=10mg/ml)。將混合物於RT攪拌30min，及然後加入溶於50μl DMSO的0.26mg(0.00023mmol)中間物F325。於RT另再攪拌90min後，將混合物稀釋至先前經調整至pH 8之2.5ml PBS緩衝液的體積及然後通過經PBS緩衝液pH 8平衡過的PD 10管柱(Sephadex® G-25,GE Healthcare)，並以PBS緩衝液pH 8溶離。然後將溶離液於RT氬氣壓下攪拌至隔夜。接著以超離心濃縮及以PBS緩衝液(pH 7.2)稀釋。
示例製程B：
於氬氣下，將0.172mg溶於0.3ml PBS緩衝液的TCEP溶液加到30mg所指抗體之0.3ml的PBS溶液中(c=10mg/ml)。將混合物於RT攪拌30min，及然後加入溶於300μl DMSO之1.57mg(0.0014mmol)的中間物F325。於RT另再攪拌90min後，將混合物稀釋至先前經調整至pH 8之5ml PBS緩衝液的體積，然後通過事先經PBS緩衝液pH 8平衡過的PD 10管柱(Sephadex® G-25,GE Healthcare)，以PBS緩衝液pH 8溶離。然後將溶離液於RT氬氣壓下攪拌至隔夜。然後將此溶液施予事先經PBS緩衝液pH 7.2平衡過的PD 10管柱(Sephadex® G-25,GE Healthcare)，並以PBS緩衝液pH 7.2溶離。然後將溶離液以超離心濃縮，以PBS緩衝液(pH 7.2)再稀釋，再濃縮及然後無菌過濾。
下列ADC係類似這些製程所製備且其特徵係如下表中所示：
代謝物之操作實例 實例M1
N-(3-{[(2R)-2-胺基-2-羧乙基]硫烷基}-3-羧基丙醯基)甘胺醯基-N-[2-({(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇醯基)胺基]丁醯基}胺基)乙基]-D-α-麩醯胺酸三氟乙酸鹽
位置異構物1，表異構物混合物
將三乙胺(10ml,73mmol)及然後1-({[2-(三甲基矽基)乙氧基]羰基}氧基)吡咯啶-2,5-二酮(8.31g,32.0mmol)加到L-半胱胺酸甲酯鹽酸鹽(1：1)(5.00g,29.1mmol)之1,4-二烷(200ml)溶液中。將反應於室溫攪拌20h。然後將固體濾出並於高真空下濃縮濾液。以製備式HPLC純化殘餘物。
將210μl(1.4mmol)的1,8-二氮雜雙環[5.4.0]十一-7-烯加到所得到的N-{[2-(三甲基矽基)乙氧基]羰基}-L-半胱胺酸甲酯(130mg,465μmol)和3-溴-4-甲氧基-4-側氧丁酸(393mg,1.86mmol)之DMF(6.5ml)溶液中並將反應於室溫攪拌10min。然後將反應於減壓下濃縮並以製備式HPLC純化殘餘物。於減壓下蒸發溶劑及於高真空下乾燥殘餘物。
將生成的中間物藉由胜肽化學之習用方法在HATU的存在下與中間物C119偶合。然後藉由以氫氧化鋰之THF/水(1：1)溶液處理將甲酯水解。
在最後的步驟中，將得到的22mg中間物溶於10ml的2,2,2-三氟乙醇。加入34mg(0.252mmol)的氯化鋅並將混合物於50℃攪拌1h。然後加入74mg(0.252mmol)的乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸、10ml的水和500μl的TFA。將混合物過濾並於減壓下蒸發溶劑。以製備式HPLC純化殘餘物。將適當的溶離份濃縮並從乙腈/水將殘餘物凍乾，得到13mg(72%的理論值)的標題化合物。
LC-MS(方法5)：Rt=2.44min；MS(ESIneg)：m/z=959[M-H]-
實例M2
N-(2-{[(2R)-2-胺基-2-羧乙基]硫烷基}-3-羧基丙醯基)甘胺醯基 -N-[2-({(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇醯基)胺基]丁醯基}胺基)乙基]-D-α-麩醯胺酸三氟乙酸鹽
位置異構物2，表異構物混合物
標題化合物M2係類似實例M1所製備為表異構物混合物：將801μl(5.4mmol)的1,8-二氮雜雙環[5.4.0]十一-7-烯加到N-{[2-(三甲基矽基)乙氧基]羰基}-L-半胱胺酸甲酯(1000mg,3.58mmol)和2-溴-4-乙氧基-4-側氧丁酸(926mg,4.11mmol)之DMF(40ml)溶液中並將反應於室溫攪拌2h。然後將反應於減壓下濃縮並以製備式HPLC純化殘餘物。
將得到的中間物藉由胜肽化學之習用方法在HATU和甲基嗎福啉的存在下與中間物C119偶合。然後藉由以氫氧化鋰之THF/水(1：1)溶液處理將甲酯和乙酯水解。
在最後的步驟中，將48mg的此中間物溶於5ml的2,2,2-三氟乙醇。加入75mg(0.550mmol)的氯化鋅並將混合物於50℃攪拌3h。然後加入160mg(0.550mmol)的乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸、2ml的水和20μl的TFA。於減壓下蒸發溶劑並以製備式HPLC純化殘餘物。將適當的溶離份濃縮並從乙腈/水將殘餘物凍乾，得到14mg(39%的理論值)的標題化合物。
LC-MS(方法5)：Rt=2.41min；MS(ESIneg)：m/z=959[M-H]-
製備參考-ADC R1作為比較。在C章節中，實例1之本發明ADC優於對應的參考-ADC R1之優勢係以示例方式來表示。
參考實例R1
示例製程
於氬氣下，將0.172mg溶於300μl PBS緩衝液的TCEP溶液加到30mg溶於3ml PBS(c=10mg/mL)的適當AK溶液中。將混合物於RT攪拌30min，及然後加入溶於300μl DMSO之1.291mg(1.6μmol)的中間物F104。於RT另再攪拌90min後，以事先經調整至pH 8之1.4ml的PBS緩衝液將混合物稀釋。
然後將此溶液通過事先經PBS緩衝液pH 8平衡過的PD 10管柱(Sephadex® G-25,GE Healthcare)，並以PBS緩衝液pH 8溶離。將溶離液以PBS緩衝液pH 8稀釋至7.5ml的總體積。將此溶液於RT氬氣下攪拌至隔夜及然後再次使用PD-10管柱，再緩衝至pH 7.2。將溶離液稀釋至14ml的總體積。然後藉由超離心將混合物濃縮至2ml，以PBS緩衝液(pH 7.2)再稀釋至14ml並再濃縮至3ml體積。將樣本經由離心管過濾(Microsep Advance Centrifugal Device 0.2μm Supor Membrane/from PALL)。得到ADC批件其特徵係如下：下列ADC係類似這些製程所製備且其特徵係如下表所示：
亦製備從參考實例R1所形成的代謝物Rm1和Rm2作為比較：
參考實例Rm1
4-[(2-{[2-({(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇醯基)胺基]丁醯基}胺基)乙基]胺基}-2-側氧乙基)胺基]-2-{[(2R)-2-胺基-2-羧基乙基]硫烷基}-4-側氧丁酸三氟乙酸鹽
位置異構物1為表異構物混合物：
首先使用1-({[2-(三甲基矽基)乙氧基]羰基}氧基)吡咯啶-2,5-二酮在DMF中，於N,N-二異丙基乙基胺的存在下，將L-半胱胺酸甲酯鹽酸鹽(1：1)轉變為N-{[2-(三甲基矽基)乙氧基]羰基}-L-半胱胺酸甲酯。
每次少許將208μl(1.4mmol)的1,8-二氮雜雙環[5.4.0]十一-7-烯加到N-{[2-(三甲基矽基)乙氧基]羰基}-L-半胱胺酸甲酯(130mg,465μmol)和3-溴-4-甲氧基-4-側氧丁酸(393mg,1.86mmol)之DMF(6.5ml)溶液中，並將反應於室溫攪拌10min。然後將混合物於減壓下濃縮並以製備式HPLC純化殘餘物。於減壓下蒸發溶劑及於高真空下乾燥殘餘物。
將所得到的中間物藉由胜肽化學之習用方法在HATU的存在下與中間物C66偶合。然後藉由以氫氧化鋰之THF/水(1：1)溶液處理將甲酯水解。
在最後的步驟中，將18mg的此中間物溶於10.6ml的2,2,2-三氟 乙醇。加入22mg(0.16mmol)的氯化鋅並將混合物於50℃攪拌2h。然後加入47mg(0.16mmol)的乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸和2ml的水以及2-3滴的TFA。將混合物過濾並於減壓下蒸發溶劑。以製備式HPLC純化殘餘物。將適當的溶離份濃縮並從乙腈/水將殘餘物凍乾，得到10.5mg(78.5%的理論值)的標題化合物(異構物2)為位置異構物混合物。
LC-MS(方法5)：Rt=2.43min；MS(ESI-pos)：m/z=832[M+H]+
參考實例Rm2
4-[(2-{[2-({(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇醯基)胺基]丁醯基}胺基)乙基]胺基}-2-側氧乙基)胺基]-3-{[(2R)-2-胺基-2-羧基乙基]硫烷基}-4-側氧丁酸三氟乙酸鹽
異構物2為表異構物混合物：
首先使用1-({[2-(三甲基矽基)乙氧基]羰基}氧基)吡咯啶-2,5-二酮於DMF中，在N,N-二異丙基乙基胺的存在下，將L-半胱胺酸甲酯鹽酸鹽(1：1)轉變為N-{[2-(三甲基矽基)乙氧基]羰基}-L-半胱胺酸甲酯。
將801μl(5.4mmol)的1,8-二氮雜雙環[5.4.0]十一-7-烯加到N-{[2-(三甲基矽基)乙氧基]羰基}-L-半胱胺酸甲酯(1000mg,3.58mmol)和2-溴-4-乙氧基-4-側氧丁酸(926mg,4.11mmol)之DMF(40ml)溶液中，並將反應於室溫攪拌2h。然後將混合物於減壓下濃縮並以製備式HPLC純化殘餘物。於減壓下蒸發溶劑及於高真空下乾燥殘餘物。
將得到的中間物藉由胜肽化學之習用方法在HATU的存在下與中間物C66偶合。然後藉由以氫氧化鋰之THF/水(1：1)溶液處理將甲酯和乙酯水解。
在最後的步驟中，將24mg的此中間物溶於6.4ml的2,2,2-三氟乙醇。加入28.5mg(0.21mmol)的氯化鋅並將混合物於50℃攪拌2h。然後加入61mg(0.21mmol)的乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸和2ml的水及2-3滴的TFA。將混合物過濾並於減壓下蒸發溶劑。以製備式HPLC純化殘餘物。將適當的溶離份濃縮及從乙腈/水將殘餘物凍乾，得到14.5mg(71%的理論值)的標題化合物。
LC-MS(方法5)：Rt=2.41min；MS(ESI-pos)：m/z=832[M+H]+
C：生物效用之評估
本發明化合物之生物活性可如下列所述的分析所示：
C-1a：測定抗CD123和CXCR5之ADC的細胞毒性效應
示例的ADC之細胞毒性效應的分析係以各種細胞株來進行：NCI-H292：人類黏液表皮樣肺癌細胞，ATCC-CRL-1848，標準培養基：RPMI 1640(Biochrom；#FG1215，穩定麩醯胺酸)+10%FCS(Biochrom；#S0415),TWEAKR-陽性，EGFR-陽性，KPL4：人類乳癌細胞，Bayer Pharma AG(身分檢測及於19.7.2012在DSMZ確認)，標準培養基：RPMI 1640(來自Gibco；#21875-059，穩定麩醯胺酸)+10%熱滅活的FBS(Gibco,No.10500-064)；ERBB2-陽性。
SK-HEP-1：人類肝細胞癌，ATCC No.HTB-52，標準培養基：MEM含有Earle's鹽類+Glutamax I(Invitrogen 41090)+10%熱滅活的FCS(來自Gibco,No.10500-064)；TWEAKR-陽性
MOLM-13：人類急性單核細胞白血病細胞(AML-M5a),DSMZ,No.ACC 554，標準培養基：RPMI 1640(來自Gibco；#21875-059，穩定麩醯胺酸)+20%熱滅活的FCS(Gibco,No.10500-064)；CD123-陽性。
MV-4-11：得自週圍血液之人類雙表型B骨髓單核細胞白血病細胞，ATCC-CRL-9591，標準培養基：IMDM(ATCC：30-2005)+10%熱滅活的FCS(Gibco,No.10500-064)；CD123-陽性
NB4：得自骨髓之人類急性前骨髓細胞白血病細胞，DSMZ,No.ACC 207，標準培養基：RPMI 1640+GlutaMAX I(Invitrogen 61870)+10%熱滅活的FCS(Gibco,No.10500-064)+2.5g的葡萄糖(20%葡萄糖溶液，Gibco,No.19002)+10mM Hepes(Invitrogen 15630)+1mM丙酮酸鈉(Invitrogen 11360)；CD123-陰性
Rec-1：人類被套細胞淋巴瘤細胞(B細胞非何杰金氏淋巴瘤)ATCC CRL-3004，標準培養基：RPMI 1640+GlutaMAX I(Invitrogen 61870)+10%熱滅活的FCS(Gibco,No.10500-064)CXCR5-陽性
就所指的細胞株，係以如美國菌種保存中心(American Tissue Type Collection)(ATCC)或德國微生物菌種保藏中心(Leibniz-Institut DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH(DSMZ))所述之標準方法培養細胞。
MTT分析
細胞係藉由標準方法，以C-1章節中所述的生長培養基所培養。此試驗係藉由以Accutase之PBS溶液(來自Biochrom AG #L2143)分離細胞，形成小團，再懸浮於培養基中，計數並種入白底的96-孔培養盤(來自Costar #3610)(NCI H292：2500個細胞/孔；SK-HEP-1：1000個細胞/孔；KPL-4：1200個細胞/孔；總體積100μl)。然後於37℃及5%二氧化碳的培養箱中培養細胞。48h後，置換培養基。然後將抗體藥物接合物以10-5M至10-13M濃度的10μl培養基吸量到細胞中(三重複)，及然後於37℃及5%二氧化碳的培養箱中培養。將懸浮液細胞計數並種入白底的96-孔培養盤(來自Costar #3610)(MOLM-13：2000個細胞/孔；NB4：7000個細胞/孔；MV-4-11：5000個細胞/孔，總體積100μl)。於37℃及5%二氧化碳中培養6小時後，更換培養基並藉由吸量10-5M至10-13M的濃度之10μl的培養基將抗體藥物接合物或代謝物加到細胞中(三重複)90μl。將此批於37℃及5%二氧化碳的培養箱中培養。96h後，使用MTT分析(ATCC,Manassas,Virginia,USA，型 號30-1010K)偵測細胞增生。就此，係將MTT試劑與細胞培養4h，接著藉由加入清潔劑解離細胞至隔夜。於570nm偵測所形成的染劑(Infinite M1000 pro,Tecan)。使用DRC(劑量反應曲線)，使用所測的數據計算生長抑制之IC50。未經試驗物質處理但經同樣處理的細胞之增生係定義為100%計數。
下表1a係列出來自此分析之代表性操作實例的IC50值：
下表1b係列出來自此分析之代表性參考實例的IC50值。
所提出的活性數據係關於本發明實驗部份所述的操作實例，其中係指出藥物/mAb比率。此等數值對不同的藥物/mAb比率可能有偏差。IC50值為數個獨立的實驗或個別值之平均。抗體藥物接合物之作用對於包括各別連接子及帶毒體之各別同型對照組係具有選擇性。此外，抗CD123之抗體-藥物接合物的標靶特異性係藉由以CD123-陰性細胞(NB4)檢測來驗證。
C-1b：測定所選實例之紡錘體驅動蛋白KSP/Eg5的抑制作用
將人類紡錘體驅動蛋白KSP/Eg5之動力區(tebu-bio/Cytoskeleton Inc,No.027EG01-XL)用10nM之濃度以經50μg/ml taxol(Sigma No.T7191-5MG)安定化的微管(牛或豬，tebu-bio/Cytoskeleton Inc)於RT在15mM PIPES,pH 6.8(5mM MgCl2和10mM DTT,Sigma)中培養5min。將此新鮮製備的混合物分成等份置入384 MTP(來自Corning)。然後加入濃度1.0 x 10-6M至1.0 x 10-13M之欲檢測的抑制劑及ATP(最終濃度500μM，自Sigma)。於RT培養2h。使用孔雀石綠(Biomol)藉由偵測所形成無機磷酸鹽來偵測ATP酶活性。加入試劑後，將此分析於RT培養50分鐘，之後於620nm波長偵測吸收度。使用Monastrol(Sigma,M8515-1mg)及伊斯平斯(Ispinesib)(AdooQ Bioscience A10486)作為正性對照。劑量-活性曲線之個別的數據為8-倍的測定值。IC50值為二個獨立實驗之平均。100%對照組為未經抑制劑處理之樣本。
下表2係列出來自所述分析之代表操作實例的IC50值以及概括對應的細胞毒性數據(MTT分析)：
所提出的活性數據係關於本發明實驗部份中所描述的操作實例。
C-2a內化分析
內化為能經由抗體藥物接合物(ADC)在表現抗原的癌細胞中專一及有效提供細胞毒性酬載(cytotoxic payload)之關鍵過程。此過程係經由螢光標定的專一性抗體及同型對照抗體(M014)來監測。首先，將螢光染劑與抗體的離胺酸接合。接合係使用2-倍莫耳超量的CypHer 5E單NHS酯(Batch 357392,GE Healthcare)於pH 8.3來進行。偶合後，將 反應混合物以矽膠層析純化(Zeba Spin脫鹽管柱，40K,Thermo Scientific,No.87768；溶離緩衝液：DULBECCO'S PBS,Sigma-Aldrich,No.D8537)，用以移除過量的染劑並調整pH。使用VIVASPIN 500管柱(Sartorius stedim biotec)濃縮蛋白溶液。藉由分光光度分析(來自NanoDrop)測定抗體的染劑載量及隨後計算(D/P=A染劑ε蛋白：(A280-0.16A染劑)ε染劑)。
本處所檢測的抗體及同型對照組之染劑載量具有相當的數量級。在細胞結合分析中，確認了偶合不會造成任何抗體親和力的改變。
將經標定的抗體用於內化分析。在開始處理前，將細胞(2 x 104/孔)以100μl培養基種入96-孔MTP中(豐厚、黑色、底部透明No 4308776，來自Applied Biosystems)。於37℃/5%CO2培養18h後，置換培養基並加入不同濃度的標定抗體(10、5、2.5、1、0.1μg/ml)。以相同的處理方法施用於經標定的對照組(負性對照)。所選擇的培養時間為0、0.25h、0.5h、1h、1.5h、2h、3h、6h及24h。螢光測量係使用InCellanalyser 1000(來自GE Healthcare)來進行。接著經由測量參數顆粒數/細胞及總顆粒密集度/細胞，評估動力學。
在與受體結合後，檢測抗體之內化能力。就此目的，係選擇帶有不同受體表現程度的細胞。就本發明抗體係觀察到標靶-媒介的高特異性內化，而同型對照組並無顯現內化。
C-2b：懸浮細胞之內化分析
如C-2章節中所述進行螢光染劑之結合。所欲檢測的抗原係藉由造血懸浮細胞來表現；因此，內化作用係以FACS-為基礎的內化分析來檢測。
檢測具有不同標靶表現程度之細胞。將細胞(5x104/孔)以100μl總體積種入96-MTP中(Greiner bio-one,CELLSTAR,650 180,U型底)。加入最終濃度10μg/ml之標靶-專一性抗體後，將整批於37℃培養不同的時間(1h、2h、6h，三重複)。於相同的條件下處理同型對照組。處理平行批件並持續於4℃培養(負性對照組)。使用Guava流式細胞儀(Millipore)進行FACS分析。藉由測量螢光強度進行動力學評估，及使用guavaSoft 2.6軟體(Millipore)進行評估。就本處所述的標靶和標靶 -專一性抗體，在不同的細胞中偵測到顯著及特異性內化；同型對照組則無顯現內化。
C-2c：共定位：抗-CD123抗體之分析
由於連接子，抗體-藥物接合物之活性代謝物係藉由溶酶體降解來產生。因此，內化後胞內運輸之進行至關重要。有關使用對溶酶體胞器特異性標記(例如，表面分子或小GTP酶)之抗體共定位的研究可選擇具有所欲性質之抗體。就此，係將總體積100μl之標靶-陽性細胞(5x104/孔)種入96-MTP(Greiner bio-one,CELLSTAR,650 180,U-型底)。在加入CypHer5E-標定的抗-標靶抗體(最終濃度20μg/ml)後，將整批(每個時間點雙重複)於培養箱中以37℃培養30min、2h和6h(5% CO2)。在所選的培養時間結束前30min，於欲檢測的批件中加入溶酶體特異性標記。將溶酶體以CytoPainter LysoGreen指示劑染色(最終濃度1：2000；abcam,ab176826)。培養後，加入200μl冰冷的FACS緩衝液(DULBECCO'S PBS,Sigma-Aldrich,No.D8537+3%FBS熱滅活的FBS,Gibco,No.10500-064)並將細胞懸浮液以400 x g及4℃離心5min。將細胞團塊再懸浮於300μl冰冷的FACS緩衝液及再次離心(4min,400 x g於4℃)。離心後，將上清液丟棄並將細胞團塊置於30μl冰冷的FACS緩衝液中處理。然後立刻將樣本進行FACS/造影分析(FlowSight amnis,Millipore)。使用特別的軟體(共定位軟體IDEAS Application v6.1)評估共定位。表3係概括來自抗-CD123抗體之實例的分析。
相較於親代鼠科抗體，抗體TPP-8987和TPP-9476展現顯著提升的特質。
C-3測定細胞通透性之活體外試驗
物質的細胞通透性可藉由活體外試驗以通量分析使用Caco-2細胞來評估[M.D.Troutman和D.R.Thakker,Pharm.Res.20(8),1210-1224(2003)]。就此目的，將細胞置於24-孔過濾盤上培養15-16天。就通透作用之測定，係將個別的試驗物質於HEPES緩衝液中以頂端(A)或基部(B)施用於細胞，並培養2小時。0小時及2小時後，將樣本從順槽和反槽取出。將樣本以HPLC(Agilent 1200,Böblingen,Germany)使用逆相管柱分離。HPLC系統係經由Turbo離子噴霧界面與Triple Quadropol質譜儀API 4000(AB SCIEX Deutschland GmbH,Darmstadt,Germany)結合。通透性係以Papp值為基準來評估，該值係使用Schwab等人所發表的公式來計算[D.Schwab等人，J.Med.Chem.46,1716-1725(2003)]。當Papp(B-A)與Papp(A-B)之比率(外排比率)為>2或<0.5時，則該物質被歸類為主動轉運。
對於胞內釋放帶毒體至關重要的為從B到A之通透性[Papp(B-A)]及Papp(B-A)與Papp(A-B)之比率(外排比率)：此通透性越低，物質經由Caco-2細胞之單層的主動和被動運輸越慢。再者，若外排比率並未指出為主動運輸，則此物質在胞內釋放後，可留在細胞中越久。因此可與生化標靶(本處：紡錘體驅動蛋白KSP/Eg5)相互作用的時間亦增加。
下表4係列出此分析之代表性操作實例的通透性數據：
可由本發明實例1中之ACD所形成的代謝物M1和M2，相較於由參考實例1中之ACD所形成的參照代謝物RM1和RM2，係展現降低的細胞之運輸及降低的外排比率。
C-4測定P-糖蛋白(P-gp)之基質性質的活體外試驗
許多腫瘤細胞對藥物表現轉運子蛋白，且此項通常伴隨對細胞抑制劑產生抗藥性。非此等非轉運蛋白基質之物質，例如P-糖蛋白(P-gp)或BCRP，例如，可能因此展現增進的活性性質。
P-gp(ABCB1)物質之基質性質係藉由通量分析使用過度表現P-gp之LLC-PK1細胞(L-MDR1細胞)來測定[A.H.Schinkel et al.,J.Clin.Invest.96,1698-1705(1995)]。就此目的，係將LLC-PK1細胞或L-MDR1細胞於96-孔過濾盤上培養3-4天。就滲透性之測量，係將個別的試驗物質單獨或在抑制劑(例如伊維菌素(Ivermectin)或維拉帕米(Verapamil))之存在下於HEPES緩衝液中以頂端(A)或基部(B)施用於細胞並培養2小時。在0小時及2小時後，將樣本從順槽和反槽取出。將樣本以HPLC使用逆相管柱分離。HPLC系統係經由渦輪離子噴霧界面(Turbo Ion Spray Interface)與API 3000三段四極質譜儀(Applied Biosystems Applera,Darmstadt,Germany)結合。通透性係以Papp值為基準加以評估，該值係使用Schwab等人所發表的公式來計算[D.Schwab等人，J.Med.Chem.46,1716-1725(2003)]。當Papp(B-A)與Papp(A-B)之外排比率>2時，則該物質被歸類為P-gp基質。
作為評估P-gp物質性質之另外的標準，L-MDR1及LLC-PK1細胞中外排比率或在有或無抑制劑的存在下之外排比率可作比較。若這些值的差異為二倍以上，則該所指的物質為P-gp基質。
C-5a：鑑定內化後活體外ADC代謝物 方法說明：
進行免疫接合物之內化研究用以分析胞內所形成的代謝物。就此，將人類肺腫瘤細胞NCI H292(3x105/孔)種入6-孔盤中並培養至隔夜(37℃,5% CO2)。以10μg/ml(66nM)欲檢測的ADC處理細胞。內化係在37℃及5% CO2下進行。在不同的時間點(0、4、24、48、72h)採取細胞樣本供進一步的分析。首先，收取上清液(約5ml)及，在離心後(2min,RT,1000rpm Heraeus Variofuge 3.0R)，儲存於-80℃。將細胞以PBS清洗及以Accutase剝離，並測定細胞數。再次清洗後，將一定義數量的細胞(2 x 105)以100ml的解離緩衝劑處理(哺乳動物細胞解 離套組(Sigma MCL1)並以連續震盪(Thermomixer,15min,4℃,650rpm)於蛋白LoBind試管中(eppendorf型號0030 108.116)培養。培養後，將解離液離心(10min,4℃,12000g,eppendorf 5415R)並收取上清液。將得到的上清液儲存於-80℃。然後如下分析所有的樣本。
培養上清液或細胞解離液中的化合物係在以甲醇或乙腈沉澱蛋白後，藉由高壓液相層析(HPLC)結合三段四極質譜儀(MS)來分析。
就50μl培養上清液/細胞解離液之後續處理，係加入150μl的沉澱劑(甲醇)並將混合物震盪10秒。沉澱劑含有適合濃度(一般在20-100ng/ml範圍內)之內標(ISTD)。以1881g離心10分鐘後，將上清液轉置於自動取樣器小瓶中，添加300μl符合溶離液之緩衝劑並再次震盪及以1881g離心10分鐘。
最後使用來自AB SCIEX Deutschland GmbH公司之HPLC-結合API4200三段四極質譜儀，分析細胞解離液和上清液樣本。
就校準，係將空白解離液或空白上清液以適當濃度(0.1-1000μg/l)混合。偵測極限(LOQ)為約2μg/l。
就檢測有效性之質性對照組係含有4及40μg/l。
C-5b：鑑別活體內ADC代謝物 可能代謝物之定量分析
以i.v.將10mg/kg不同的本發明接合物投予異種移植之小鼠後，可測量抗體之血漿、腫瘤、肝、脾和腎濃度及投予這些接合物24小時後所產生的任何代謝物。有關異種移植模型方法之更詳細的說明可參見C-6。本處僅處理本發明接合物之代謝物的濃物。在提及的矩陣中就代謝物所測量的值另外係指出相較於腫瘤中的負荷，在血漿、腎、脾和肝臟中所宣稱的代謝物負荷係如何。
可能代謝物之定量分析
血漿、腫瘤、肝、脾和腎中的化合物分析一般係在以甲醇沉澱蛋白後，藉由高壓液相層析(HPLC)結合三段四極質譜儀(MS)來進行。
就50μl血漿的後處理，係加入150μl的沉澱劑(一般為甲醇)並將混合物震盪10秒。沉澱劑含有適合濃度(一般在20-100μg/l範圍內)之內標(ISTD)。以1881g離心10分鐘後，將上清液轉置於自動取樣 器小瓶中，添加300μl符合溶離液的緩衝液並再次震盪。
在腫瘤或器官物質檢查中，係將特定物質與3-20倍量的萃取緩衝液混合。萃取緩衝液係含有50ml的組織蛋白萃取試劑(Pierce,Rockford,IL)、兩團完全-蛋白酶-抑制劑-混合物(Roche Diagnostics GmbH,Mannheim,Germany)和最終濃度1mM之苯甲基磺醯氟(Sigma,St.Louis,MO)。根據組織類型(硬：腫瘤；軟：肝、腎、脾)，選擇Prescellys 24溶離(www.prescellys.com)之均質程序和均質系統(Bertin Technologies)。將均質過的樣本留置於4℃至隔夜。將50μl的均質液轉置於自動取樣器小瓶中並添加150μl包含ISTD的甲醇，搖盪10秒及然後放置5min。加入300μl的乙酸銨緩衝液(pH 6.8)並簡短搖盪，將樣本以1881g離心10分鐘。
就校準，係將血漿樣本之血漿和對應的組織樣本之空白矩陣以0.6-1000μg/l之濃度混合。根據樣本類型或組織類型，偵測極限(LOQ)係介於1至20μg/l之間。
最後將血漿和矩陣樣本使用來自AB SCIEX Deutschland GmbH公司之HPLC-結合API4200三段四極柱質譜儀分析。
用於檢測有效性的質性對照組係含有4、40和400μg/l。
表5：在REC-1異種移植nunu小鼠中單一10mg/kg靜脈內(i.v.)投予實例1x-9024後24小時之腫瘤、肝、腎、脾和血漿中代謝物M1的濃度與同型對照組之比較
C-6活體內之活性檢測
本發明接合物之活性，例如，可使用異種移植模型於活體中檢測。熟習本項技術者已熟悉先前技術中能檢測本發明化合物活性之方法(參見，例如WO 2005/081711；Polson et al.,Cancer Res.2009 Mar 15；69(6)：2358-64)。
將表現抗體-藥物接合物之抗原的人類腫瘤細胞以皮下接種至免疫抑制小鼠，例如NMRi裸小鼠或SCID小鼠的側腹。從細胞培養中分離1百萬-1千萬個細胞，離心並再懸浮於培養基或培養基/基質膠(Matrigel)中。將細胞懸浮液注射至小鼠的皮膚下。
於數天內，使腫瘤生長。在腫瘤建立後，腫瘤大小約40mm2時建議治療。就檢驗對較大腫瘤之效用，治療係在腫瘤大小50-100mm2時才開始治療。
ADC之治療係以經由靜脈內(i.v.)路徑進入小鼠尾靜脈來進行。ADC係以5ml/kg之量來給藥。
治療方法係依抗體接合物的藥物動力學而定。治療係每連續七天進行三次，作為標準。就快速評估，單一治療之方法亦為適合的。然而，治療亦可持續進行，或於以後的某時間點接著第二輪的另外治療天數。
每個治療組使用8隻動物作為標準。除了投予活性物質之組別外，以一組作為對照組，依照相同的方法僅以緩衝劑或等張鹽溶液治療。
在實驗期間，使用游標尺定期地測量二維(長/寬)腫瘤面積。腫瘤的面積係以長x寬來測定。治療組的平均腫瘤面積與對照組腫瘤面積之比率係以T/C面積表示。
當治療結束後，所有的實驗組同時停止，可將腫瘤移出並稱重。 治療組與對照組之腫瘤平均重量的比率係以T/C表示。
C-6a.小鼠中實驗腫瘤之生長抑制/消退
將腫瘤細胞(REC-1、MOLM-13或MV-4-11)以皮下接種至雌性NMRI-裸小鼠(Janvier)的側腹。在腫瘤大小為40-50mm2時，以抗體-藥物接合物每周一次進行靜脈內治療歷時2或3週。
相較於對照組，以本發明ADC治療明顯抑制腫瘤生長。表6係顯示在實驗結束的個別天數就腫瘤面積所測之T/C值，其係從治療開始時計算。
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Claims (11)

  1. 一種式(I)之抗體-藥物接合物(ADC) 其中n係代表1至8，AK係代表由TPP-8987、TPP-9476和TPP-8988組成之群中選出的抗-CD123抗體，或AK係代表抗-CXCR5抗體，較佳地係由TPP-9574、TPP-9580和TPP-9024組成之群中選出，或AK係代表這些抗體之抗原結合片段，其中該抗體或抗原結合片段係經由半胱胺酸側鏈之硫原子連接，及其鹽類、溶劑化物和這些溶劑化物之鹽類。
  2. 根據請求項1之式(I)抗體-藥物接合物(ADC)，其中n係代表2至8。
  3. 根據請求項1之式(I)抗體-藥物接合物(ADC)，其中n係代表4至8。
  4. 根據請求項1至3中任一項之抗體-藥物接合物(ADC)，其中AK (i)係代表包括重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)之抗-CD123抗體，該重鏈可變區係包括如SEQ ID NO：2所示之重鏈可變CDR1序列(H-CDR1)，如SEQ ID NO：3所示之重鏈可變CDR2序列(H-CDR2)及如SEQ ID NO：4所示之重鏈可變CDR3序列(H-CDR3)，而該輕鏈可變區係包括如SEQ ID NO：6所示之輕鏈可變CDR1序列(L-CDR1)，如SEQ ID NO：7所示之輕鏈可變CDR2序列(L-CDR2)和如SEQ ID NO：8所示之輕鏈可變CDR3序列(L-CDR3)，(ii)係代表包括重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)之抗-CD123抗體，該重鏈可變區係包括如SEQ ID NO：12所示之重鏈可變CDR1序列(H-CDR1)，如SEQ ID NO：13所示之重鏈可變CDR2序列(H-CDR2)及如SEQ ID NO：14所示之重鏈可變CDR3序列(H-CDR3)，而該輕鏈可變區係包括如SEQ ID NO：16所示之輕鏈可變CDR1序列(L-CDR1)，如SEQ ID NO：17所示之輕鏈可變CDR2序列(L-CDR2)和如SEQ ID NO：18所示之輕鏈可變CDR3序列(L-CDR3)，(iii)係代表包括重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)之抗-CXCR5抗體，該重鏈可變區係包括如SEQ ID NO：22所示之重鏈可變CDR1序列(H-CDR1)，如SEQ ID NO：23所示之重鏈可變CDR2序列(H-CDR2)及如SEQ ID NO：24所示之重鏈可變CDR3序列(H-CDR3)，而該輕鏈可變區係包括如SEQ ID NO：26所示之輕鏈可變CDR1序列(L-CDR1)，如SEQ ID NO：27所示之輕鏈可變CDR2序列(L-CDR2)和如SEQ ID NO：28所示之輕鏈可變CDR3序列(L-CDR3)，(vi)係代表包括重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)之抗-CD123抗體，該重鏈可變區係包括如SEQ ID NO：32所示之重鏈可變CDR1序列(H-CDR1)，如SEQ ID NO：33所示之重鏈可變CDR2序列(H-CDR2)及如SEQ ID NO：34所示之重鏈可變CDR3序列(H-CDR3)，而該輕鏈可變區係包括如SEQ ID NO：36所示之輕鏈可變CDR1序列(L-CDR1)，如SEQ ID NO：37所示之輕鏈可 變CDR2序列(L-CDR2)和如SEQ ID NO：38所示之輕鏈可變CDR3序列(L-CDR3)，(v)係代表包括重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)之抗-CXCR5抗體，該重鏈可變區係包括如SEQ ID NO：42所示之重鏈可變CDR1序列(H-CDR1)，如SEQ ID NO：43所示之重鏈可變CDR2序列(H-CDR2)及如SEQ ID NO：44所示之重鏈可變CDR3序列(H-CDR3)，而該輕鏈可變區係包括如SEQ ID NO：46所示之輕鏈可變CDR1序列(L-CDR1)，如SEQ ID NO：47所示之輕鏈可變CDR2序列(L-CDR2)和如SEQ ID NO：48所示之輕鏈可變CDR3序列(L-CDR3)，或(vi)係代表包括重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)之抗-CXCR5抗體，該重鏈可變區係包括如SEQ ID NO：52所示之重鏈可變CDR1序列(H-CDR1)，如SEQ ID NO：53所示之重鏈可變CDR2序列(H-CDR2)及如SEQ ID NO：54所示之重鏈可變CDR3序列(H-CDR3)，而該輕鏈可變區係包括如SEQ ID NO：56所示之輕鏈可變CDR1序列(L-CDR1)，如SEQ ID NO：57所示之輕鏈可變CDR2序列(L-CDR2)和如SEQ ID NO：58所示之輕鏈可變CDR3序列(L-CDR3)，或代表這些抗體之抗原結合片段。
  5. 根據請求項1至4中任一項之抗體-藥物接合物(ADC)，其中AK(i)係代表包括如SEQ ID NO：1中所示之重鏈可變區(VH)和如SEQ ID NO：5中所示之輕鏈可變區(VL)的抗-CD123抗體，(ii)係代表包括如SEQ ID NO：11中所示之重鏈可變區(VH)和如SEQ ID NO：15中所示之輕鏈可變區(VL)的抗-CD123抗體，(iii)係代表包括如SEQ ID NO：21中所示之重鏈可變區(VH)和如SEQ ID NO：25中所示之輕鏈可變區(VL)的抗-CXCR5抗體，(iv)係代表包括如SEQ ID NO：31中所示之重鏈可變區(VH)和如SEQ ID NO：35中所示之輕鏈可變區(VL)的抗-CD123抗體，(v)係代表包括如SEQ ID NO：41中所示之重鏈可變區(VH)和如SEQ ID NO：45中所示之輕鏈可變區(VL)的抗-CXCR5抗體，或 (vi)係代表包括如SEQ ID NO：51中所示之重鏈可變區(VH)和如SEQ ID NO：55中所示之輕鏈可變區(VL)的抗-CXCR5抗體，或代表這些抗體之抗原結合片段。
  6. 根據請求項1至5中任一項之抗體-藥物接合物(ADC)，其中AK(i)係代表包括如SEQ ID NO：9中所示之重鏈區和如SEQ ID NO：10中所示之輕鏈區的抗-CD123抗體，(ii)係代表包括如SEQ ID NO：19中所示之重鏈區和如SEQ ID NO：20中所示之輕鏈區的抗-CD123抗體，(iii)係代表包括如SEQ ID NO：29中所示之重鏈區和如SEQ ID NO：30中所示之輕鏈區的抗-CXCR5抗體，(iv)係代表包括如SEQ ID NO：39中所示之重鏈區和如SEQ ID NO：40中所示之輕鏈區的抗-CD123抗體，(v)係代表包括如SEQ ID NO：49中所示之重鏈區和如SEQ ID NO：50中所示之輕鏈區的抗-CXCR5抗體，或(vi)係代表包括如SEQ ID NO：59中所示之重鏈區和如SEQ ID NO：60中所示之輕鏈區的抗-CXCR5抗體，或代表這些抗體之抗原結合片段。
  7. 一種醫藥組成物，其係包括至少一種根據一或多項前述請求項中之抗體-藥物接合物(ADC)，與惰性、無毒、醫藥上適合的賦形劑之組合。
  8. 根據一或多項前述請求項中之抗體-藥物接合物(ADC)，其係用於治療及/或預防疾病之方法中。
  9. 根據一或多項前述請求項中之抗體-藥物接合物(ADC)，其係用於治療過度增生及/或血管生成病症之方法中。
  10. 根據一或多項前述請求項中之抗體-藥物接合物(ADC)，其係用於治療癌症和腫瘤之方法中。
  11. 根據一或多項前述請求項中之抗體-藥物接合物(ADC)，其係與一或多種癌症免疫治療之治療方法，或與一或多種對抗癌症免疫治療之分子標靶的活性化合物組合，以用於治療癌症和腫瘤之方法中。
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