TW201811893A

TW201811893A - 凍結抑制劑

Info

Publication number: TW201811893A
Application number: TW106129418A
Authority: TW
Inventors: 橋本賀之; 田和貴純
Original assignee: 第一工業製藥股份有限公司
Priority date: 2016-09-01
Filing date: 2017-08-30
Publication date: 2018-04-01
Also published as: WO2018043479A1; CN109661448A; JP6373917B2; EP3508549A4; EP3508549A1; JP2018035302A; US20190249054A1; KR20190046805A

Abstract

本發明提供一種凍結抑制效果優異，且安全性亦優異，能夠大量生產的凍結抑制劑。使用含有以選自由纖維素、幾丁質及幾丁聚醣所組成的群組中的至少一種為來源的水不溶性纖維的凍結抑制劑。

Description

凍結抑制劑

本發明是有關於一種具有水的凍結抑制功能的凍結抑制劑，更詳細而言，是有關於一種包含顯示出如不凍蛋白質所具有般的不凍活性的非蛋白質系的物質的凍結抑制劑。

一直以來於各種領域廣泛使用能夠實現水的冰點以下的凍結抑制的凍結抑制劑。

此處所謂凍結抑制，一般是指於冰晶形態變化的過程中，抑制冰晶的合而為一，且確認到熱滯後的作用，亦稱為不凍活性或冰結晶成長抑制、抗冰核活性。尤其必須觀察到所述熱滯後，機制不同於單純的凝固點降低或冰的附著減少作用。

例如，凝固點降低一般為藉由凝固點降低溫度與溶質的莫耳濃度成正比的莫耳凝固點降低法進行說明的現象，於不含具有凍結抑制作用的物質的水溶液中，若對其進行過冷卻而使其一次完全凍結，繼而，使體系的溫度較熔解溫度（熔點）稍微降低並進行放置，所述熔解溫度（熔點）即為使體系的溫度緩慢上升而熔解的溫度，則凍結開始，熔點與凝固點一致。

另一方面，於包含具有凍結抑制作用的物質的體系中，即使經過所述操作來使溫度自熔解溫度稍微降低，亦不會開始凍結，藉由進一步降低溫度而凍結開始，於所述熔解溫度與凍結溫度（凝固點）之間觀察到溫度差，該現象一般被稱為熱滯後。該情況下，具有凍結抑制作用的物質的莫耳濃度與凝固點降低溫度未顯示出正比例的關係。於包含此種具有凍結抑制作用的物質的體系中，冰的結晶成長得到抑制，因此可抑制由冰的結晶變大導致的細胞組織等的損傷。

如上所述的凍結抑制劑自古以來用於例如源於農產品或水產品、畜產品的生鮮食品、加工食品、冷凍食品、冷凍面包、飼料、鮮花（鮮切花）、花粉、藻類；進而，生物活性物質或醫療用藥液、酵素等的凍結抑制。另外，亦能夠藉由凍結抑制劑來消除於食品的凍結、保存、流通、解凍等一系列的步驟中產生的凍結障礙，每天，技術改進的研究都在進行。另外，伴隨消費者需求的變化，塗料或醫藥、香料化妝品等以水性液體為介質的各種製品亦較先前更要求凍結抑制技術。

所謂所述凍結障礙，為各種因素綜合參與的現象，為由以下原因等引起的食品的劣化現象：（1）被稱為「凍結燒灼」（或「冷凍燒灼」）的由冰點以下的冰的昇華引起的組織的乾燥、於冰昇華後的空隙中的空氣接觸（氧化）；（2）未凍結水的局部化；（3）由冰的局部化（冰結晶的成長或冰的再結晶化）引起的組織破壞；（4）解凍時成分朝向滴液（drip）的流出。

即，於凍結障礙中，蛋白質伴隨冰的昇華而產生組織改質（海綿化），因源於其的水或冰的局部化，於解凍時生成滴液，於脂質中因水解而產生遊離脂肪酸的增加或者因空氣氧化而產生改質，於醣類中澱粉發生老化。其結果，存在如下問題：於營養方面，產生由氧化引起的改質或由解凍時成分向滴液的流出引起的損失等，另外使食品的味道、口感、風味等顯著降低，從而使商品價值大大降低。

另外，於豬、牛、馬、雞、鮭魚、鯡魚等畜產或水產業用的精子或受精卵的低溫保存、凍結保存時的保護中，亦自古以來利用凍結抑制技術。尤其，近年來因生命科學領域中的技術的快速進步，對於生物細胞、生物組織、臟器的凍結抑制技術亦受到關注，人的臟器移植時的細胞保護、精子或卵子、臍帶血等的保護、來自自身血的血液成分的保護、細胞移植或再生醫療用組織的保護、進而稀有野生動植物或實驗動物的細胞或精子等的保護之類的與低溫保存、冷凍保存有關的新技術開發是當務之急。

除此以外，抑制水的凍結的技術於多方面受到期待。普通住宅或公共設施的窗或鎖、屋頂等的凍結、結霜、結冰對策仍為重要課題，熱交換器或冷凍機、冷藏室、冰蓄熱系統用潛熱蓄熱材料、太陽光發電設備等的基於凍結抑制技術的高效運轉就節能的觀點來看，為緊急課題之一。

另外，近年來，看到了飛機、鐵路、汽車的高速運行或精密控制的技術革新，但就安全運行的觀點來看，凍結、結霜、結冰對策仍為重要的技術課題。進而，鋪裝道路或橋上道路的凍結，自高層建築物或橋樑、輸電線、風力發電設備的旋轉翼等的冰塊掉落，進而，交通標誌、或具有信號機、天線、雷達、照相機、感測器等的室外設施的凍結、結霜、結冰對策亦就穩定控制或安全上的觀點來看，其重要性增加。

作為具有凍結抑制作用的物質，已知有源於生存於極地的魚類、植物、甲蟲的幼蟲、昆蟲、菌、黴、地衣類或細菌類的不凍蛋白質或多醣類、精油提取物等。例如，普通魚類的體液於-0.8℃前後凍結，相對於此，於體內具有不凍蛋白質的魚類的情況下，體液具有下降至-2℃以下亦不會凍結的特徵。海水於-1.9℃左右就會結凍，因此體內具有不凍蛋白質的魚類能夠生存而體液不會結凍。

然而，如上所述的生存於極地的動植物或昆蟲、菌、黴、地衣類、細菌類並不容易確保商業規模的數量，另外，源於該些的特定成分的提取操作非常繁雜，並且，精製需要大量勞力，因此不適合大量生產。另外，實際上存在以下情況等各種問題：無法廉價地獲取的情況；或者具有特殊惡臭的情況；處理繁雜的情況；進而，因來源原料的印象而回避應用於食品類的情況等。

作為解決該些問題的辦法，提出有如下技術。

例如，專利文獻1中例示出，作為甜菜中所含的寡醣的一種的棉子糖作為於極低溫度時保護自身的細胞不凍結的物質而生成，尤其該棉子糖的烷基醚衍生物具有極強的防凍結效果。

另外專利文獻2中例示出，作為非蛋白質系、合成系高分子的聚丙烯醯胺顯示出熱滯後，且具有類似不凍蛋白質的功能。

進而於專利文獻3中例示有如下技術：作為食品添加物而通用地使用的羧甲基纖維素鈉於食品中溶解於水，藉由抑制冰的結晶成長與抑制局部的離水來抑制冷凍食品的口感的變化或外表面的組織損傷。 [現有技術文獻] [專利文獻]

[專利文獻1]日本專利特開2004-285137號公報 [專利文獻2]日本專利特開2005-126533號公報 [專利文獻3]日本專利特開平6-277022號公報

[發明所欲解決的課題] 然而，專利文獻1記載的作為甜菜中所含的寡醣的一種的棉子糖存在並不容易確保商業規模的數量且難以大量生產的問題。

另外，專利文獻2記載的聚丙烯醯胺並非天然系原料，因此存在擔憂對環境或生態系統造成影響的問題。

進而，專利文獻3記載的羧甲基纖維素鈉存在凍結抑制效果弱的問題。

本發明鑒於以上方面，目的在於提供一種凍結抑制效果優異，且安全性亦優異，能夠大量生產的凍結抑制劑。 [解決課題之手段]

本發明的凍結抑制劑設為含有包含選自由纖維素、幾丁質（chitin）及幾丁聚醣（chitosan）所組成的群組中的至少一種的水不溶性纖維而成者。

所述水不溶性纖維的表面可設為經化學修飾者。

所述水不溶性纖維的數量平均纖維直徑較佳為1 μm以下，更佳為1 nm以上且10 nm以下。

所述水不溶性纖維可設為表面藉由陰離子性的取代基進行了化學修飾的水不溶性纖維及/或其鹽。

所述陰離子性的取代基可設為選自由羧基、羧甲基及磷酸基所組成的群組中的至少一種。

所述水不溶性纖維的鹽可設為與陽離子的中和鹽，所述陽離子源於選自由鹼金屬、鹼土金屬及含氮化合物所組成的群組中的至少一種。

所述凍結抑制劑可製成凍結抑制塗膜。

所述凍結抑制塗膜的製造方法設為包含如下步驟：自將凍結抑制劑分散於水性分散媒而成的水性分散液中使水性分散媒揮發來製造。 [發明的效果]

本發明的凍結抑制劑的凍結抑制效果優異，且可自生物分解性良好的天然系原料中獲取，因此可獲得對環境的負荷亦小且亦能夠大量生產的效果。

以下，詳細地說明本發明的實施形態。

本發明的凍結抑制劑為含有水不溶性纖維者，所述水不溶性纖維源於選自由纖維素、幾丁質及幾丁聚醣所組成的群組中的至少一種的多醣類，所述水不溶性纖維的表面可經化學修飾，具體而言可將非離子性基、陰離子性基、陽離子性基或兩性基導入至所述多醣類。以該些水不溶性纖維為主體的分散液、其濃縮凝膠及其乾燥塗膜亦包含於本發明中。

纖維素、幾丁質或幾丁聚醣、或者於該些中導入有非離子性基、陰離子性基、陽離子性基或兩性基的纖維狀物質可藉由通常方法獲得，另外亦可利用市售者。例如對該些纖維狀物質使用打漿性、解離性優異的分散機進行開纖，藉此可獲得本發明中適宜地使用的不溶性纖維。

所述水不溶性纖維的數量平均纖維直徑並無特別限定，較佳為1 μm以下，更佳為1 nm～500 nm，進而佳為2 nm～150 nm，尤佳為2 nm～100 nm，最佳為10 nm以下。即，本發明中使用的水不溶性纖維尤佳為一般被稱為「奈米纖維」者。

此處，數量平均纖維直徑可以如下方式進行測定。即，製備以固體成分率計為0.05質量%～0.1質量%的水不溶性纖維的水分散體，將該水分散體澆鑄於完成了親水化處理的碳膜被覆柵格上，製成穿透式電子顯微鏡（Transmission Electron Microscope，TEM）的觀察用試樣。再者，於包含大纖維直徑的纖維的情況下，亦可對澆鑄於玻璃上的表面的掃描式電子顯微鏡（Scanning Electron Microscope，SEM）圖像進行觀察。而且，根據構成的纖維的大小，以5000倍、10000倍或者50000倍的任一倍率來進行基於電子顯微鏡圖像的觀察。此時，以如下方式調節試樣及觀察條件（倍率等）：於所獲得的圖像內假設出縱橫任意的圖像寬度的軸，20條以上的纖維相對於該軸而交叉。而且，於獲得滿足該條件的觀察圖像後，相對於該圖像，對每一張圖像各作出縱橫2條隨機的軸，以目視讀取與軸交錯的纖維的纖維直徑。如此，利用電子顯微鏡對至少3張不重覆的表面部分的圖像進行拍攝，讀取各自與2個軸交錯的纖維的纖維直徑的值（因此，可獲得至少20條×2×3=120條的纖維直徑的信息）。藉由如此獲得的纖維直徑的資料，算出數量平均纖維直徑。

所述水不溶性纖維的結晶結構並無特別限定，就水不溶性的觀點來看，於構成的纖維為纖維素的情況下，較佳為具有I型結晶結構。此處，構成水不溶性纖維的纖維素具有I型結晶結構例如可根據以下來鑑定：於藉由廣角X射線繞射圖像測定而獲得的繞射分佈中，於2θ=14°～17°附近、與2θ=22°～23°附近這兩個位置具有典型的峰值。

如上所述，所述水不溶性纖維可為其表面經化學修飾者，作為化學修飾的例子，可列舉非離子性基、陰離子性基、陽離子性基或兩性基的導入。就可維持I型結晶結構，且可效率良好地開纖至奈米級的纖維直徑的觀點來看，較佳為經陰離子改質或陽離子改質的水不溶性纖維，更佳為陰離子改質。即，較佳為於纖維素分子中的葡萄糖單元、或者幾丁質、幾丁聚醣分子中的N-乙醯基葡萄糖胺單元或葡萄糖胺單元中導入有陰離子性基或陽離子性基的水不溶性纖維。

作為陰離子性基，並無特別限定，可列舉羧酸基、磷酸基、磺酸基、硫酸基、或者形成鹽的該些基，可具有該些的任一種，亦可具有兩種以上。另外，亦可於葡萄糖單元、N-乙醯基葡萄糖胺單元或葡萄糖胺單元、與所述陰離子性基之間具有連結基。

作為陰離子性基的鹽，並無特別限定，可列舉：鈉鹽、鉀鹽、鋰鹽等鹼金屬鹽；鎂鹽、鈣鹽、鋇鹽等鹼土金屬鹽；銨鹽、膦鹽等鎓鹽；一級胺、二級胺、三級胺等的胺鹽等。

如上所述，陰離子性基中有羧酸基、磷酸基、磺酸基、硫酸基等酸型；與羧酸鹽基、磷酸鹽基、磺酸鹽基、硫酸鹽基等鹽型，較佳的實施形態為包含鹽型的陰離子性基，可使用僅具有鹽型的陰離子性基的水不溶性纖維，亦可使用鹽型的陰離子性基與酸型的陰離子性基混合存在的水不溶性纖維。

作為陽離子性基，並無特別限定，可列舉四級銨鹽、一級胺基、二級胺基或三級胺基、或者該些與鹽酸或乙酸等形成鹽的基，可具有該些的任一種，亦可具有兩種以上。另外，亦可於葡萄糖單元、N-乙醯基葡萄糖胺單元或葡萄糖胺單元與所述陽離子性基之間具有連結基。

以下，作為本發明的一實施形態即經陰離子改質的水不溶性纖維的例子，對將構成纖維素的葡萄糖單元的羥基加以氧化而成的氧化纖維素（A）、以及將構成纖維素的葡萄糖單元的羥基加以羧甲基化而成的羧甲基化纖維素（B）進行更具體的說明，亦對各自的製造方法的例子進行說明。

作為氧化纖維素（A），並無特別限定，較佳為葡萄糖單元的6位的羥基經選擇性地氧化者。氧化纖維素（A）為葡萄糖單元上的6位的羥基經選擇性地氧化者例如可藉由¹³ C-核磁共振（¹³ C-Nuclear Magnetic Resonance，¹³ C-NMR）圖表進行確認。

再者，氧化纖維素（A）於具有羧酸基（COOH）及/或羧酸鹽基（COOX，此處X表示與羧酸形成鹽的陽離子）的同時亦可具有醛基或酮基，較佳為實質上不具有醛基及酮基。

氧化纖維素（A）的製造方法並無限定，例如可藉由包含（1）氧化反應步驟、（2）還原步驟、（3）精製步驟、（4）分散步驟（微細化處理步驟）等的製造方法來製造，具體而言較佳為藉由以下各步驟來製造。

（1）氧化反應步驟將天然纖維素纖維與N-氧化合物分散於作為分散介質的水中後，添加共氧化劑，使反應開始。反應中pH降低，因此滴加0.5 mol/l的氫氧化鈉水溶液並將pH保持為10～11，於看不到pH變化的時刻視為反應結束。

關於天然纖維素，一般來說聚合度為1,000～3,000，結晶度為65%～95%，且具有纖維素I型結晶結構，將捆紮30條～50條纖維素分子而成的結晶性的纖維素微纖絲作為構成要素。高等植物中類似該纖維的纖維素微纖絲於其表面與半纖維素及木質素進行一部分複合化，形成纖維、纖維集合體、組織這一層次結構。

作為所述天然纖維素，可使用自植物或動物、產自細菌（bacteria）的凝膠等纖維素的生物合成體系中單離出的精製纖維素。更具體而言，針葉樹系紙漿或闊葉樹系紙漿等木材系紙漿、棉絨（cotton linter）或棉籽絨（cotton lint）等棉系紙漿、麥稈紙漿或蔗渣紙漿等非木材系紙漿等均可適宜地使用，亦能夠使用自細菌纖維素（Bacteria Cellulose，BC）、海鞘中單離出的纖維素、自海草中單離出的纖維素等。該些可單獨使用，亦可併用兩種以上。

再者，如上所述，天然纖維素於植物組織中與半纖維素及木質素進行一部分複合化而存在，因此存在無論有無精製步驟，天然纖維素中殘存有該成分的情況，允許於不妨礙本發明的凍結抑制效果的範圍內該成分包含於天然纖維素原料中。

另外，作為N-氧化合物，例如可列舉一般作為氧化觸媒而使用的具有氮氧自由基（nitroxyl radical）的化合物。N-氧化合物較佳為水溶性的化合物，其中更佳為哌啶氮氧自由基，進而佳為2,2,6,6-四甲基哌啶并氧自由基（2,2,6,6-Tetramethylpiperidinooxy Radical，TEMPO自由基），4-乙醯胺-TEMPO自由基。

N-氧化合物的添加量以所謂的觸媒量則足夠，例如為0.1 mmol/l～4 mmol/l左右。

此處，所謂所述共氧化劑，並非直接將纖維素的羥基加以氧化的物質，而為將用作氧化觸媒的N-氧化合物加以氧化的物質。

作為共氧化劑，例如可列舉次鹵酸、亞鹵酸、過鹵酸、過氧化氫、過有機酸、或者該些的鹽等，該些可單獨使用，亦可併用兩種以上。其中，較佳為次氯酸鈉、次溴酸鈉等鹼金屬次鹵酸鹽。於使用次氯酸鈉的情況下，就反應速度的方面來看，較佳為於溴化鈉等溴化鹼金屬的存在下促進反應。

氧化反應中的反應水溶液的pH較佳為維持於約8～11的範圍。水溶液的溫度於約4℃～40℃的範圍內為任意的溫度，並不特別需要控制溫度。藉由以共氧化劑的添加量與反應時間來控制氧化的程度，可獲得具有所需羧基量等的氧化纖維素（A）。通常，反應時間為約5分鐘～120分鐘，最長於240分鐘以內完成。

（2）還原步驟藉由所述而獲得的氧化纖維素（A）較佳為於所述氧化反應後進行還原反應。藉此，藉由氧化反應而形成的醛基及酮基的一部分或全部經還原，可恢復為羥基。具體而言，將氧化反應後的氧化纖維素分散於精製水中，將水分散體的pH調整為約10，藉由各種還原劑進行還原反應。

作為還原劑，能夠使用一般的還原劑，例如可列舉：LiBH₄ 、NaBH₃ CN、NaBH₄ 等。還原劑的調配量以氧化纖維素為基準，較佳為0.1質量%～4質量%。

反應是於室溫或較室溫高一些的溫度下，通常進行10分鐘～10小時左右、較佳為30分鐘～2小時左右。

反應結束後，藉由各種酸將反應混合物的pH調整為約2，一面噴灑精製水一面利用離心分離機進行固液分離，藉此可獲得濾餅（cake）狀的氧化纖維素。

（3）精製步驟結束了所述還原步驟的氧化纖維素通常於該階段並未分離並分散至奈米纖維單位，因此藉由通常的精製法、即重覆進行水洗與過濾，將未反應的共氧化劑（次氯酸等）或各種副產物等去除，可製成包含高純度（99質量%以上）的氧化纖維素與水的分散體。

精製步驟中的精製方法如利用離心脫水的方法（例如，連續式傾析器）般，若為可達成所述目的的裝置，則利用任何裝置亦無妨。

（4）分散步驟（微細化處理步驟）使於精製步驟中獲得的含浸有水的氧化纖維素（水分散體）分散於分散介質中而進行分散處理。伴隨處理而黏度上升，可獲得經微細化的氧化纖維素奈米纖維的分散體。

作為於分散步驟中使用的分散機，理想的是使用高速旋轉下的均質混合機、高壓均質機、超音波分散處理機、打漿機（beater）、盤型精製機（refiner）、圓錐形精製機、雙盤型精製機、研磨機（grinder）等強力的且打漿性或解離性優異的裝置。

再者，該分散步驟於本發明的凍結抑制劑的製造步驟中，可作為如下步驟來共通地加以應用：自纖維素、幾丁質或幾丁聚醣、或者於該些中導入有非離子性基、陰離子性基、陽離子性基或兩性基的纖維狀物質開纖而獲得奈米纖維。

繼而，所述羧甲基化纖維素（B）的製造方法亦無限定，例如可將所述天然纖維素用作原料，並藉由以下方法來製造。

即，首先於天然纖維素中添加作為溶媒的低級醇。具體而言，較佳為使用甲醇、乙醇、正丙醇、異丙醇等低級醇一種或兩種以上、與水的混合溶媒。再者，與水的混合溶媒中的低級醇的混合比例較佳為60質量%～95質量%。溶媒的添加量較佳為天然纖維素的質量的3倍～20倍的質量。

繼而，對於纖維素與溶媒，針對每單位纖維素的葡萄糖殘基而混合0.5倍莫耳～20倍莫耳的絲光化劑來進行絲光化處理。作為絲光化劑，可列舉氫氧化鹼金屬，具體而言可使用氫氧化鈉或氫氧化鉀。此時的反應溫度較佳為約0℃～70℃，更佳為約10℃～60℃，反應時間較佳為約15分鐘～8小時，更佳為約30分鐘～7小時。

之後，每單位葡萄糖殘基添加0.05倍莫耳～10倍莫耳的羧甲基化劑來進行醚化反應。作為羧甲基化劑可使用一般所使用者，例如，可列舉單氯乙酸鈉等。此時的反應溫度較佳為約30℃～90℃，更佳為約40℃～80℃，反應時間較佳為約30分鐘～10小時，更佳為約1小時～4小時。

所述醚化反應後，藉由高壓均質機等進行開纖處理，藉此可獲得羧甲基化纖維素（B）的奈米纖維。

繼而，對作為本發明的一實施形態的、具有作為陰離子性基的磷酸基或其鹽的陰離子改質纖維素（C）的製造方法進行說明。

即，該製造方法亦無限定，例如可使用如下方法等：於乾燥狀態或濕潤狀態的天然纖維素原料中混合磷酸或磷酸衍生物的粉末或者水溶液；於天然纖維素原料的分散液中添加磷酸或磷酸衍生物的水溶液。

該些方法中，通常混合或添加磷酸或磷酸衍生物的粉末或者水溶液之後，進行脫水處理、加熱處理等。藉此，於構成纖維素的葡萄糖單元的羥基中，包含磷酸基的化合物或其鹽發生脫水反應而形成磷酸酯，並導入磷酸基或其鹽。

此處，作為磷酸或磷酸衍生物，例如可列舉選自含有磷原子的含氧酸、聚含氧酸或該些的衍生物中的至少一種化合物。

陰離子改質纖維素中的陰離子性基的量並無特別限定，例如可含有0.05 mmol/g～3.0 mmol/g，亦可含有0.1 mmol/g～2.5 mmol/g。

此處，陰離子性基的量可藉由以下方法來求出。即，由精確秤量了乾燥重量的陰離子改質纖維素試樣製備0.5質量%～1質量%的漿料60 ml，藉由0.1 mol/l的鹽酸水溶液使pH成為約2.5之後，滴加0.05 mol/l的氫氧化鈉水溶液，進行導電率測定，此過程持續至pH成為約11，根據於導電率的變化平緩的弱酸的中和階段所消耗的氫氧化鈉量（V），按照下述式（1）可求出所述陰離子性基的量。

式（1）：陰離子性基量（mmol/g） =V（ml）×[0.05（mol/l）/纖維素試樣重量（g）]

關於作為本發明的凍結抑制劑的必需成分的水不溶性纖維，作為固體成分，較佳為於0.001質量%～100質量%的範圍內加以應用，亦可以分散液、或者其濃縮凝膠、或其乾燥塗膜的任一形態來使用，但實際上表現出功能時的實用濃度較佳為0.05質量%～100質量%。

此時，本發明的凍結抑制劑的用途並無特別限定，出於抑制水的凍結的目的，可添加於農水產品或畜產品、或者源於該些的各種製品、加工食品，此外，生物組織、生物活性物質、醫療用藥液、酵素類，進而，塗料或醫藥·香料化妝品等以水性液體為介質的各種製品等中來利用。

另外，就固體表面的水的凍結抑制、冰的局部化抑制、以及冰結晶的成長抑制的作用而言，本發明的凍結抑制劑亦可應用於不希望產生凍結、結霜、結冰的固體表面。

例如，作為一實施形態，可添加具有流動性的奈米纖維分散液來利用，所述奈米纖維分散液於以水為必需成分且含有一種以上有機溶劑的溶媒中分散有作為本發明的凍結抑制劑的必需成分的水不溶性纖維。另外，秤取了其所需量之後，可視需要使用混合裝置、混煉裝置、攪拌裝置等，均勻混合並添加奈米纖維成分。另外，於本發明的凍結抑制劑中，可視需要進行將多餘的液體成分去除的操作，亦可進行追加不足的液體成分的操作。另外，亦可適當選擇所需的器具、裝置，並藉由刷毛或噴霧等來塗佈本發明的凍結抑制劑。

另外，作為其他實施形態，可添加固體狀、半固體狀或凝膠狀的奈米纖維分散體來利用，所述奈米纖維分散體於以水為必需成分且含有有機溶劑及/或油類的溶媒中分散有作為本發明的凍結抑制劑的必需成分的水不溶性纖維。

進而，藉由刷毛或噴霧等塗佈所述各實施形態的奈米纖維分散體之後，經過去除液體成分的操作，或者藉由自然放置而使其乾燥，亦可用作乾燥塗膜。

本發明的凍結抑制劑於不妨礙本發明的效果的範圍內，於實際使用時，允許包含（未反應）纖維素、合成觸媒殘渣、纖維膨潤助劑、開纖助劑、pH調整劑、溶劑、保濕劑、無機鹽、有機酸鹽、其他種類增黏劑、其他種類凝膠化劑、防腐劑、抗菌劑、界面活性劑類、調平劑、水溶性聚合物、其他種類有機性及無機性填料類、著色劑、香料等。 [實施例]

關於作為本發明的凍結抑制劑的必需成分的水不溶性纖維、適宜地為水不溶性奈米纖維的製備方法，例示如下。但是，本發明並不限定於該些實施例。再者，於以下說明中，只要無特別描述，則濃度以質量%表示，調配比例等為質量基準。

（製造例1）＜氧化纖維素奈米纖維＞於利用家用混合機粉碎的20 g針葉樹紙漿（針葉漂白牛皮紙漿（Needle Bleached Kraft Pulp，NBKP））中添加1500 ml水、2.5 g溴化鈉、0.25 g的2,2,6,6-四甲基哌啶并氧自由基（TEMPO），充分攪拌使其分散後，以相對於10 g所述紙漿而次氯酸鈉量成為6.5 mmol/g的方式添加13質量%次氯酸鈉水溶液（共氧化劑），使反應開始。伴隨反應的進行而pH降低，因此一面滴加0.5 N氫氧化鈉水溶液以使pH保持為10～11，一面使其反應120分鐘至看不到pH的變化為止。

反應結束後，添加0.1 N鹽酸進行中和後，重覆進行過濾與水洗來精製，從而獲得纖維表面經氧化的陰離子改質纖維素纖維。繼而，於該陰離子改質纖維素纖維中添加純水以稀釋至2質量%，使用高壓均質機以壓力140 MPa進行三次處理，藉此獲得本發明中使用的陰離子改質纖維素奈米纖維的水分散體。所獲得的陰離子改質纖維素奈米纖維具有羧酸鈉鹽基（-COONa）作為陰離子性基，最大纖維直徑為10 nm，數量平均纖維直徑為4 nm，陰離子性基（羧基）量為1.83 mmol/g。

（製造例2）＜羧甲基纖維素奈米纖維＞於利用家用混合機粉碎的20 g針葉樹紙漿（NBKP）中添加112 g異丙醇（Isopropyl Alcohol，IPA）與48 g水的160 g混合溶媒，繼而添加8.8 g氫氧化鈉並加以攪拌使其混合後，於30℃下攪拌60分鐘。繼而，將反應液升溫至70℃，並添加12 g（有效成分換算）單氯乙酸鈉。使其反應1小時後，取出反應物並進行中和、清洗，從而獲得每一葡萄糖單元的取代度0.05的陰離子改質纖維素纖維。之後，將陰離子改質纖維素纖維設為固體成分濃度2%，使用高壓均質機以壓力140 MPa進行五次處理，藉此獲得具有源於羧甲基的羧酸鈉鹽基（-CH₂ COONa）作為陰離子性基的、本發明中使用的陰離子改質纖維素奈米纖維的水分散體。所獲得的陰離子改質纖維素奈米纖維的數量平均纖維直徑為25 nm，陰離子性基（羧基）量為0.30 mmol/g。

（製造例3）＜杉木酵素處理纖維素奈米纖維＞將自國立研究開發法人森林綜合研究所獲取的杉木酵素處理纖維素奈米纖維（對進行了基於燒鹼·蒽醌法的鹼蒸解的杉木紙漿進行酵素處理，進而藉由濕式粉碎法進行了開纖的纖維素奈米纖維）稀釋為規定的濃度，並作為本發明的纖維素奈米纖維水分散體供於試驗。

（製造例4）＜磷酸化纖維素奈米纖維＞使20 g脲、12 g磷酸二氫鈉二水合物、8 g磷酸氫二鈉溶解於20 g水中而製備磷酸化劑，一面藉由捏合機對利用家用混合機粉碎的20 g針葉樹紙漿（NBKP）進行攪拌，一面噴霧磷酸化劑，從而獲得含浸磷酸化劑的紙漿。繼而，於加熱至140℃的帶減震器的鼓風乾燥機內對含浸磷酸化劑的紙漿進行60分鐘加熱處理，而獲得磷酸化紙漿。於所獲得的磷酸化紙漿中添加水而成為固體成分濃度2%，進行攪拌、混合使其均勻分散之後，重覆進行兩次過濾、脫水的操作，從而獲得回收紙漿。繼而，於所獲得的回收紙漿中添加水而成為固體成分濃度2%，一面攪拌一面逐次少量添加1 N氫氧化鈉水溶液，從而獲得pH12～13的紙漿漿料。接著，對該紙漿漿料進行過濾、脫水，進而添加水並重覆進行兩次過濾、脫水的操作，於藉由該一系列的操作所獲得的磷酸化紙漿的回收物中添加水而製成固體成分濃度2%的水分散體，使用高壓均質機以壓力140 MPa進行三次處理，藉此獲得本發明中使用的陰離子改質纖維素奈米纖維的水分散體。所獲得的陰離子改質纖維素奈米纖維具有磷酸鈉鹽基（-PO₄ Na₂ ）作為陰離子性基，數量平均纖維直徑為5 nm。

（製造例5）＜源於蝦殼的幾丁質奈米纖維＞將黑虎蝦的殼（20 g）添加於5%KOH水溶液中，進行6小時回流，將蝦殼中的蛋白質去除，對蝦殼進行過濾、回收後，利用水充分清洗至成為中性。將蝦殼於7%HCl水溶液中於室溫下攪拌兩天，將蝦殼中的灰分去除，繼而對蝦殼進行過濾、回收後，利用水充分清洗至成為中性。繼而，將回收的蝦殼添加於1.7%亞氯酸鈉的0.3 mol/l乙酸鈉緩衝溶液中，於80℃下攪拌6小時，將蝦殼中所含的色素成分去除，對蝦殼進行過濾、回收後，利用水充分清洗至成為中性。將回收的蝦殼分散於水中，利用家用混合機將分散液粉碎後，利用石臼式磨碎機對蝦殼進行開纖而獲得幾丁質奈米纖維水分散體。進而於所獲得的幾丁質奈米纖維水分散體中添加水而製成固體成分濃度1%的水分散體，使用高壓均質機以壓力140 MPa進行一次處理。所獲得的幾丁質奈米纖維的數量平均纖維直徑為18 nm。

（製造例6）＜源於蝦殼的幾丁聚醣奈米纖維＞將黑虎蝦的殼（20 g）添加於5%KOH水溶液中，進行6小時回流，將蝦殼中的蛋白質去除，對蝦殼進行過濾、回收後，利用水充分清洗至成為中性。將蝦殼於7%HCl水溶液中於室溫下攪拌兩天，將蝦殼中的灰分去除，繼而對蝦殼進行過濾、回收後，利用水充分清洗至成為中性。繼而，將回收的蝦殼添加於1.7%亞氯酸鈉的0.3 mol/l乙酸鈉緩衝溶液中，於80℃下攪拌6小時，將蝦殼中所含的色素成分去除，對蝦殼進行過濾、回收後，利用水充分清洗至成為中性。於藉由所述操作去除了蛋白質、灰分、色素成分的蝦殼中添加40%氫氧化鈉，一面不停吹入氮氣，一面進行6小時回流，進行脫乙醯化之後，對蝦殼進行過濾、回收後，利用水充分清洗至成為中性。將回收的蝦殼分散於水中，利用家用混合機將分散液粉碎後，利用石臼式磨碎機對蝦殼進行開纖而獲得幾丁聚醣奈米纖維水分散體。進而於所獲得的幾丁聚醣奈米纖維水分散體中添加水而製成固體成分濃度1%的水分散體，使用高壓均質機以壓力140 MPa進行一次處理。所獲得的幾丁聚醣奈米纖維中N-乙醯基的取代度為35%（元素分析結果），數量平均纖維直徑為25 nm。

（製造例7）＜纖維素奈米晶體＞將粒子尺寸為200 μm的10 g微小結晶纖維素於玻璃製可分離式燒瓶內懸浮於200 ml的蒸餾水中，將該可分離式燒瓶置於冰浴中，一面攪拌，一邊將體系中的溫度維持於40℃以下，一面緩慢添加濃硫酸至最終濃度成為48質量%。繼而，將該懸浮液移至60℃的水浴中，繼續攪拌30分鐘後，將粗製物取出，以8000 rpm進行10分鐘離心分離。藉由該離心分離操作將剩餘的硫酸去除，並使殘留物再懸浮於蒸餾水中，離心分離後，重覆進行再次添加蒸餾水的操作且重覆進行五次清洗與再懸浮。使該操作中所獲得的殘留物懸浮於蒸餾水中，將pH調整為8之後，以固體成分濃度成為5質量%的方式進行調整而獲得纖維素奈米晶體漿料。之後，使用高壓均質機以壓力140 MPa對所獲得的纖維素奈米晶體漿料進行一次處理而獲得纖維素奈米晶體水分散體。所獲得的纖維素奈米晶體水分散體的數量平均纖維直徑為15 nm，結晶長度為約190 nm。

＜基礎評價＞（實施例1～實施例10、比較例1）視需要對於所述製造例1中獲得的氧化纖維素奈米纖維的水分散體添加水，將固體成分濃度分別調整為1質量%、0.5質量%、0.1質量%，依次設為實施例1～實施例3。

另外，視需要對於所述製造例2中獲得的羧甲基纖維素奈米纖維的水分散體添加水，將固體成分濃度分別調整為1質量%、0.5質量%，依次設為實施例4、實施例5。

另外，對於所述製造例3～製造例7中獲得的奈米纖維水分散體添加水，分別調整為固體成分濃度0.5質量%，依次設為實施例6～實施例10。

進而，作為比較例1，對羧甲基纖維素（第一工業製藥（股）製造，商品名「賽洛根（serogen）BSH-12」，取代度0.7）添加水，而調整成固體成分濃度0.5質量%的水分散液來使用。

關於所獲得的實施例1～實施例10、及比較例1的各水分散液，添加作為冰結晶核劑的AgI（1 mg/1 ml）並攪拌之後進行示差掃描熱量測定（DSC測定），根據其結果分別求出供試品的凍結開始溫度（T_SC ）、蒸餾水的凍結開始溫度（T_SCW ）、凝固點（T_F ）、熔點（T_M ）、表示供試品相對於蒸餾水的過冷卻程度的凍結抑制活性（△T_SC =T_SC -T_SCW ）、以及表示供試品的凝固點與熔點的差異的熱滯後（△T=T_M -T_F ）。測定結果以實施例1～實施例10及比較例1的形式示於表1。所使用的測定裝置、測定條件如下。

·測定裝置：理學熱加（Rigaku Thermo plus）EVO DSC 8230型裝置 ·降溫速度：0.25℃/min ·升溫速度：0.25℃/min

[表1]

根據表1，實施例1～實施例3的氧化纖維素奈米纖維的凍結開始溫度低於蒸餾水的凍結開始溫度，對於蒸餾水的凍結抑制效果、即過冷卻的程度於供試的0.1質量%～1.0質量%的濃度範圍內為-2.2℃～-5.3℃。

另外，同樣地，實施例1～實施例3的凝固點為-1.2℃～-2.1℃，成為較本試驗條件下的水的凝固點-0.2℃低1.0℃以上的結果。

另外，與實施例1～實施例3同樣，實施例4～實施例10中亦確認，本發明的凍結抑制劑的凍結開始溫度低於蒸餾水的凍結開始溫度，均具有優異的凍結抑制效果。另外，凝固點處於-1.1℃～-1.8℃的範圍內，成為低於本試驗條件下的水的凝固點的結果。

進而，實施例1～實施例10的任一體系中，於利用DSC測定實施的本評價中，均確認到以凝固點（T_F ）與熔點（T_M ）的溫度差（=T_M -T_F ）的形式定義的熱滯後（△T），且考慮到配合所述結果而獲得類似可知顯示出不凍活性的不凍蛋白質的效果。

比較例1使用了既非水不溶性亦非纖維狀的羧甲基纖維素，且本質上為與本發明不同樣態的供試檢體。於該比較例1中，凍結溫度與蒸餾水的凍結開始溫度之間未確認到大的差異，另外，與同樣具有羧基且以水不溶性的奈米纖維為主體的實施例1～實施例10相比，其凍結抑制效果小。另外，熱滯後較實施例1～實施例10小。

此處，為了說明DSC測定結果，將實施例2與比較例1的DSC測定結果示意化所得的圖表示於表1。本評價中，若以0.25℃/min.進行降溫，則實施例2、比較例1均自過冷卻狀態出現DSC散熱峰值，作為凝固點（T_F ），於實施例2中觀測到-2.0℃，於比較例1中觀測到-0.2℃，確認到水的凍結。另外，若以0.25℃/min.進行升溫，則實施例2、比較例1均出現DSC吸熱峰值，作為熔點（T_M ），觀測到0.7℃，確認到於該些溫度下產生了冰的熔解。

＜應用評價＞ 1. 鋁箔上的冰晶成長確認試驗（實施例11～實施例14、比較例2）一面攪拌一面將蒸餾水添加至於所述製造例1、製造例2、製造例4、製造例7中獲得的奈米纖維水分散體中，分別製備固體成分0.3質量%的水分散體，依次作為實施例11～實施例14供試於以下試驗。再者，比較例2同樣地供試蒸餾水。

向卷有鋁箔的300 ml的不鏽鋼製容器中注入200 ml的液體氮，蓋上不鏽鋼製的蓋子後，靜置2分鐘而確認到鋁箔表面充分冷卻至水的冰點以下。繼而，使用市售的扳機式噴霧瓶分別將固體成分0.3質量%的奈米纖維的水分散體及蒸餾水噴霧至鋁箔表面，隨著時間經過來觀察鋁箔表面的冰晶的成長狀態，按照以下評價基準進行評價。將其結果以實施例11～實施例14及比較例2的方式示於表2。

評價基準（冰晶成長評價）： ◎…僅確認到不足2 mm直徑的微小冰晶於整個鋁箔表面上大致均勻 ○…於多處確認到不足2 mm直徑的冰晶的成長 △…藉由冰晶的成長而散布著2 mm直徑以上的霜狀結晶 ×…藉由冰晶的成長而於整體上確認到2 mm直徑以上的霜狀結晶

[表2] ※1：照片（1） ※2：照片（2）

於實施例11～實施例14中，自試驗開始後1分鐘過後於整體上逐漸確認到1 mm直徑左右的微小冰晶，但之後冰晶的成長變慢，試驗開始2分鐘後，冰晶仍停留於不足2 mm直徑。另一方面，比較例2中，剛剛進行蒸餾水噴霧後冰晶開始迅速成長為霜狀，試驗開始2分鐘後於整個表面上確認到3 mm～5 mm的霜狀結晶。根據試驗開始2分鐘後的表面觀察，以供試品是否含有奈米纖維而於冰晶的樣態中產生明顯的差異，自圖2所示的照片（1）～照片（3）中亦可知，藉由奈米纖維產生的冰結晶成長抑制效果明確。

之後，於實施例11～實施例14中均於多處確認到冰晶的成長，即使試驗開始5分鐘後，藉由奈米纖維產生的冰結晶成長抑制效果與比較例2相比亦明確。之後，於試驗開始15分鐘後，於實施例11～實施例14及比較例2的任一體系中，均以粗大的霜狀結晶覆蓋表面，目視上的差異消失。

2. 透明膠凍的冰晶成長確認試驗（實施例15～實施例17、比較例3、比較例4）一面攪拌一面將蒸餾水添加至於所述製造例1、製造例2、製造例6所獲得的奈米纖維水分散體中，分別製備固體成分1質量%的水分散體，依次作為實施例15～實施例17並按照以下配方製備膠凍調配液而供試於試驗。再者，作為比較例3，使用蒸餾水，作為比較例4，使用對羧甲基纖維素（第一工業製藥（股）製造，商品名「賽洛根（serogen）BSH-12」，取代度0.7）添加水而調整成固體成分濃度1質量%的水分散液，按照以下配方製備膠凍調配液並供試於試驗。

向杯中添加30 g水（表3中的自來水（1）），繼而，添加3 g明膠（gelatin）輕輕攪拌後，放置15分鐘。繼而，投入30 g糖，利用微波爐加熱1分鐘，充分攪拌至明膠與糖均勻。繼而添加60 g的1%-奈米纖維水分散體（實施例15～實施例17），進而添加140 g水（表3中的自來水（2）），充分攪拌以使得整體均勻。準備市售的膠凍模子（各2個），向其中添加規定量的膠凍調配液後，於冷藏室內冷卻3小時左右而製備膠凍。比較例3為透明膠凍的標準配方，將1%-奈米纖維水分散體的添加當量置換成水並同樣添加200 g水（表3中的自來水（2））作為剩餘部分，除此以外，進行同樣的操作而製備透明膠凍。

[表3]

繼而，為了確認膠凍的成型性與外觀，自冷藏室中各取出1個膠凍，將膠凍取出至玻璃製皮氏培養皿（Schale）之上，以目視觀察，關於其成型性與透明性，按照以下的評價基準進行評價。將其結果示於表4。

評價基準（膠凍的成型性）： ○…自模子中取出亦保持膠凍的形狀保持性 △…自模子中取出時膠凍的形狀崩壞且看到分離或扁平 ×…自模子中取出時膠凍的形狀崩壞且未確認到形狀保持性

評價基準（膠凍的透明性）： ○…自模子中取出的膠凍整體透明，亦未看到離水或成分的分離而均勻 △…自模子中取出的膠凍中，看到局部不透明的部分、或者由離水或成分的分離引起的不均勻的部分 ×…自模子中取出的膠凍看到整體上混濁、或者離水或成分的分離

繼而，為了評價膠凍凍結後的冰晶成長的情況，將以所述操作製備的各1個膠凍自冷藏室移至設定為-20℃的商業用冷凍庫，並靜置一週。一週後，自冷凍庫取出膠凍並移至零度冷藏室（chilled chamber）靜置3小時後，將膠凍取出至玻璃製皮氏培養皿之上，利用菜刀小心地將膠凍等量切分，並放置於25℃的恆溫室內，於15分鐘後、及45分鐘後，以目視觀察膠凍中央部的凍結（冰晶）的樣態，關於該樣態，按照以下的評價基準進行評價。將其結果示於表4。

評價基準（膠凍的冰晶成長評價）： ◎…膠凍整體透明 ○…於膠凍中心部看到少量混濁，但整體有透明感 △…於膠凍週邊部有透明感，但於膠凍中心部殘存有凍結（冰晶）部 ×…遍布膠凍整體殘存有凍結（冰晶）部，或者發生離水或成分的分離而不均勻

[表4]

實施例15～實施例17中，膠凍的成型性（形狀保持性）或透明性與標準配方（比較例3）無差異，可良好地製備透明膠凍。另外，關於自冷凍保存解凍後的膠凍的凍結（冰晶成長）的樣態，實施例15～實施例17與標準配方（比較例3）相比，膠凍的透明性均高，另外，亦未確認到膠凍內部的離水或不均勻。

另外，與使用了既非水不溶性亦非纖維狀的羧甲基纖維素的比較例4相比，使用了水不溶性的纖維狀的羧甲基纖維素奈米纖維的實施例16的冰晶成長抑制效果明確。

根據該些結果，使用了本發明的凍結抑制劑的透明膠凍能夠進行冷凍流通·冷凍保存，即使解凍，與現有品相比，形狀保持性或透明性等外觀亦得到改善，因此可有助於提高商業上的商品價值。

如上所述，本發明的凍結抑制劑顯示出特殊的凍結抑制效果，另外，明顯顯示出本發明的凍結抑制劑的特性、即更大的熱滯後。 [產業上之可利用性]

於有可能以冷凍流通或冷凍保存來處理的以下製品中可適宜地使用本發明的凍結抑制劑。具體而言，除米飯、面包、餅、糰子類、煉製品、豆腐、豆皮、煮雞蛋之外，還可列舉畜肉製品、火腿、香腸、蔬菜、水果、經切削加工的蔬菜、經切削加工的水果、魚貝類、魚乾、煮製魩仔魚（kamaagesirasu）、魚子類等。另外，作為冷凍食品，可列舉：冷凍肉類、冷凍魚貝類、冷凍面包胚、冷凍麵、冷凍飯、冷凍蔬菜、冷凍水果、炸肉類、炸肉排、天婦羅、包子、煎餃、燒賣、春捲、拔絲地瓜、薯條、餡餅（pie）、披薩（pizza）等。進而，可列舉：冷凍布丁、冷凍膠凍、瓊脂、冰淇淋、冷凍點心、醃菜、液體調味料、醬汁類、調味汁、冷凍乾燥食品、鮮花（鮮切花）等。

就固體表面的水、或冰的局部化抑制以及冰結晶的成長抑制作用而言，本發明的凍結抑制劑發揮凍結、結霜、結冰抑制作用，於普通住宅或公共設施的窗或鎖、屋頂等，另外，冷凍機或冷藏室等的熱交換器，另外，飛機或鐵路、汽車等的運行控制機器或窗，進而，鋪裝道路、橋上道路、高層建築物、橋樑、輸電線，進而，具有信號機或天線、雷達、照相機、感測器等的室外設施中，可作為凍結、結霜、結冰抑制劑來加以應用。

本發明中的凍結抑制效果亦可應用於塗料或醫藥·香料化妝品等以水性液體為介質的各種製品、生物細胞、生物組織、臟器、生物活性物質、醫療用藥液中。

無

圖1為示意性地表示實施例2與比較例1的凍結抑制劑的示差掃描熱量測定（DSC（Differential Scanning Calorimetry）測定）的結果的圖表。圖2（1）～圖2（3）為表示於實施例11及比較例2中，對充分冷卻至水的凍結溫度以下的鋁箔表面噴霧於製造例1中獲得的氧化纖維素水分散體及蒸餾水時的鋁箔表面的樣態的經時變化的照片。照片（1）表示製造例1的纖維素纖維水分散體（固體成分0.3質量%）的噴霧2分鐘後的鋁箔表面，照片（2）表示蒸餾水噴霧2分鐘後的鋁箔表面，照片（3）表示試驗開始2分鐘後的鋁箔表面（未進行水噴霧）。

Claims

一種凍結抑制劑，其含有包含選自由纖維素、幾丁質及幾丁聚醣所組成的群組中的至少一種的水不溶性纖維而成。
如申請專利範圍第1項所述的凍結抑制劑，其中，所述水不溶性纖維的表面經化學修飾。
如申請專利範圍第1項或第2項所述的凍結抑制劑，其中，所述水不溶性纖維的數量平均纖維直徑為1 μm以下。
如申請專利範圍第3項所述的凍結抑制劑，其中，所述水不溶性纖維的數量平均纖維直徑為1 nm以上且10 nm以下。
如申請專利範圍第2項所述的凍結抑制劑，其中，所述水不溶性纖維為表面藉由陰離子性的取代基進行了化學修飾的水不溶性纖維及/或其鹽。
如申請專利範圍第5項所述的凍結抑制劑，其中，所述陰離子性的取代基為選自由羧基、羧甲基及磷酸基所組成的群組中的至少一種。
如申請專利範圍第5項或第6項所述的凍結抑制劑，其中，所述水不溶性纖維的鹽為與陽離子的中和鹽，所述陽離子源於選自由鹼金屬、鹼土金屬及含氮化合物所組成的群組中的至少一種。
一種凍結抑制塗膜，其含有如申請專利範圍第1項至第7項中任一項所述的凍結抑制劑而成。
一種凍結抑制塗膜的製造方法，其包含如下步驟：自將如申請專利範圍第1項至第7項中任一項所述的凍結抑制劑分散於水性分散媒而成的水性分散液中使水性分散媒揮發來製造凍結抑制塗膜。