JP6809979B2 - 凍結抑制剤 - Google Patents

Description

本発明は、水の凍結抑制機能を有する凍結抑制剤に関するものであり、より詳細には不凍タンパク質が有するような不凍活性を示す非タンパク質系の物質からなる、凍結抑制剤に関するものである。

水の氷点以下における凍結抑制を可能にする凍結抑制剤が、種々の分野で従来から広く使用されている。

ここで凍結抑制とは、一般に、氷晶形態が変化する過程において、氷晶の合一が抑制され、熱ヒステリシスが認められる作用を意味し、不凍活性や氷結晶成長抑制、抗氷核活性とも称されている。特に上記熱ヒステリシスが観察されることが必須であり、単なる凝固点降下や氷の付着低減作用とは機構が異なる。

例えば、凝固点降下は、一般に凝固点降下温度が溶質のモル濃度と正比例するモル凝固点降下則によって説明される現象であって、凍結抑制作用を有する物質を含まない水溶液では、これを過冷却して一度完全に凍結させ、次いで、系の温度を徐々に上昇させて融解した温度、即ち、融解温度（融点）よりも僅かに温度を降下させて放置すると凍結が始まり、融点と凝固点とが一致する。

一方、凍結抑制作用を有する物質を含む系では、上記操作を経て融解温度から温度を僅かに降下させても凍結は始まらず、更に温度を下げることによって凍結が始まり、上記融解温度と、凍結温度（凝固点）との間に温度差が観察され、この現象は一般に熱ヒステリシスと称される。この場合、凍結抑制作用を有する物質のモル濃度と凝固点降下温度とは正比例の関係を示さない。このような凍結抑制作用を有する物質を含む系においては、氷の結晶成長が抑制され、従って氷の結晶が大きくなることによる細胞組織等の損傷を抑制することができる。

上記のような凍結抑制剤は、例えば、農産物や、水産物、畜産物由来の生鮮食品、加工食品、冷凍食品、冷凍パン、飼料、生花（切花）、花粉、藻類、更には、生理活性物質や、医療用薬液、酵素等の凍結抑制のために古くから使用されている。また、食品の凍結、保存、流通、解凍等の一連の工程で生じる凍結障害を凍結抑制剤により解消することも可能であり、日々、技術改良の検討がなされている。また、消費者ニーズの変化に伴い、塗料や医薬・香粧品等の水性液体を媒体とする各種製品にも従来に増して凍結抑制技術が求められている。

上記凍結障害とは、種々要因が複合的に関与した現象であるが、（１）「凍結焼け」（又は「冷凍焼け」）と呼ばれる氷点以下での氷の昇華による組織の乾燥、氷昇華後の空隙での空気接触（酸化）、（２）未凍結水の局在化、（３）氷の局在化（氷結晶の成長や氷の再結晶化）による組織破壊、（４）解凍時のドリップへの成分流出等に起因した食品の劣化現象である。

つまり、凍結障害において、タンパク質は氷の昇華に伴う組織変性（スポンジ化）を生じ、それに由来する水や氷の局在化により、解凍時にドリップを生成し、脂質では加水分解による遊離脂肪酸の増加や空気酸化による変性を生じ、糖質ではデンプンの老化が進行する。その結果、栄養面においては酸化による変性や解凍時のドリップへの成分流出による損失等が生じ、また食品の味や、食感、風味等を著しく低下させ、商品価値を大きく低下させるという問題がある。

また、豚、牛、馬、鶏、サケ、ニシン等の畜産や水産業用の精子や受精卵の低温保存、凍結保存時の保護においても凍結抑制技術が古くから利用されている。特に、近年ではライフサイエンス分野における技術の急速な進歩から、生体細胞、生体組織、臓器に対する凍結抑制技術も注目されており、人の臓器移植時の細胞保護、精子や、卵子、臍帯血等の保護、自己血からの血液成分の保護、細胞移植や再生医療用組織の保護、更には、希少野生動植物や実験動物の細胞や精子等の保護といった低温保存、冷凍保存に関する新たな技術開発は急務である。

その他にも、水の凍結を抑制する技術は多方面で期待されている。一般住居や、公共施設の窓や、鍵、屋根等の凍結、着霜、着氷対策は未だ重要課題であり、熱交換器や、冷凍機、冷蔵庫、氷蓄熱システム用潜熱蓄熱材、太陽光発電設備等の凍結抑制技術による高効率稼働は、省エネルギーの観点から緊急課題のひとつである。

また、近年、航空機、鉄道、自動車の高速運行や精密制御の技術革新がみられるが、安全運行の観点から、凍結、着霜、着氷対策は未だ重要な技術課題となっている。更に、舗装道路や橋上道路の凍結、高層建築物や、橋梁、送電線、風力発電設備の回転翼等からの氷塊落下、更に、交通標識や、信号機、アンテナ、レーダー、カメラ、センサー等を有する屋外施設の凍結、着霜、着氷対策も、安定制御や保安上の観点から、その重要性が増している。

凍結抑制作用を有する物質としては、極地に生息する魚類、植物、甲虫の幼虫、昆虫、キノコ、カビ、地衣類、又は細菌類に由来する不凍タンパク質や、多糖類、精油抽出物等が知られている。例えば、一般の魚類の体液は、−０．８℃前後で凍結するのに対して、不凍タンパク質を体内に有する魚類の場合、体液は−２℃以下まで下がっても凍結しないという特徴がある。海水は−１．９℃程度で凍ってしまうため、不凍タンパク質を体内に有する魚類は体液が凍ることなく生息が可能となる。

しかし、上述のような極地に生息する動植物や、昆虫、キノコ、カビ、地衣類、細菌類の商業的規模での数量確保は容易ではなく、また、それらに由来する特定成分の抽出操作は非常に煩雑、且つ、精製に多大な労力を要するために大量生産には不向きである。また、実際的には安価に入手できない場合や、特異臭を有している場合、取り扱いが煩雑である場合、更には、由来原料のイメージから食品類への適用が敬遠される場合等、種々の問題を抱えている。

これらの問題を解決する方策として、以下のような技術が提案されている。

例えば、特許文献１では、甜菜に含まれるオリゴ糖の一種であるラフィノースが、極低温時に自身の細胞を凍結から守る物質として生成され、特にそのラフィノースのアルキルエーテル誘導体が極めて強い凍結防止効果があることを例示している。

また特許文献２では、汎用的に食品添加物として使用されているカルボキシメチルセルロースナトリウムが食品中で水に溶解して、氷の結晶成長の抑制と局部的な離水を抑制することで、冷凍食品の食感の変化や外表面の組織損傷を抑制する技術を例示している。

特開２００４−２８５１３７号公報 特開平６−２７７０２２号公報

しかしながら、特許文献１に記載の甜菜に含まれるオリゴ糖の一種であるラフィノースは、商業的規模での数量確保は容易ではなく、大量生産することが難しいという問題がある。

また、特許文献２に記載のカルボキシルメチルセルロースナトリウムは、凍結抑制効果が弱いという問題がある。

本発明は、以上の点に鑑み、凍結抑制効果に優れ、かつ安全性にも優れ、大量生産が可能である凍結抑制剤を提供することを目的とする。

本発明に係る凍結抑制剤は、セルロース繊維、キチン繊維、キトサン繊維、及びそれらの化学修飾体からなる群より選択された少なくとも１種の水不溶性繊維と、下記一般式（１）で表される化合物からなる群より選択された少なくとも１種とを含有してなるものとする。

式中、ＡＯは炭素数が２以上４以下のオキシアルキレン基を表し、ｎは１〜１００の整数を表す。ＡＯの付加形態はランダム付加、ブロック付加又はこれらの混合付加である。

上記水不溶性繊維は、セルロース繊維及び／又はその化学修飾体とすることができる。

上記水不溶性繊維の数平均繊維径は、１ｎｍ以上５０ｎｍ以下であるものとすることができる。

上記水不溶性繊維は、表面がアニオン性の置換基により化学修飾された水不溶性繊維及び／又はその塩であるものとすることができる。

上記アニオン性の置換基は、カルボキシル基、カルボキシメチル基、及びリン酸基からなる群より選択される少なくとも１種であるものとすることができる。

上記凍結抑制剤は、凍結抑制塗膜とすることができる。

上記凍結抑制塗膜の製造方法は、凍結抑制剤が水性分散媒に分散された水性分散液から水性分散媒を揮散させて製造する工程を含むものとする。

本発明の凍結抑制剤は凍結抑制効果に優れ、環境への負荷も小さく、大量生産も可能であるという効果が得られる。

実施例１の氷成長界面の形状を示す、顕微鏡撮影画像（倍率：５倍）である。 実施例２の氷成長界面の形状を示す、顕微鏡撮影画像（倍率：５倍）である。 比較例１の氷成長界面の形状を示す、顕微鏡撮影画像（倍率：５倍）である。 比較例２の氷成長界面の形状を示す、顕微鏡撮影画像（倍率：５倍）である。 比較例３の氷成長界面の形状を示す、顕微鏡撮影画像（倍率：５倍）である。 比較例５の氷成長界面の形状を示す、顕微鏡撮影画像（倍率：５倍）である。

以下、本発明の実施の形態を詳しく説明する。

本発明の凍結抑制剤に含有される水不溶性繊維は、セルロース、キチン、及びキトサンからなる群より選択された少なくとも１種の多糖類に由来するものであり、上記水不溶性繊維はその表面が化学修飾されていてもよく、具体的には上記多糖類に非イオン性基、アニオン性基、カチオン性基、又は両性基が導入されていてもよい。これらの水不溶性繊維を主体とする分散液、その濃縮ゲル、及びその乾燥塗膜も本発明に含まれる。

セルロース、キチン、若しくはキトサン、又は、それらに非イオン性基、アニオン性基、カチオン性基、若しくは両性基が導入された繊維状物質は常法により得られ、また市販されているものを利用することもできる。これらの繊維状物質を、例えば、叩解性、離解性に優れる分散機を用いて、解繊することにより、本発明で好適に用いられる不溶性繊維を得ることができる。

上記水不溶性繊維の数平均繊維径は、特に限定されないが、１μｍ以下であることが好ましく、１〜５００ｎｍであることがより好ましく、１〜１５０ｎｍであることがさらに好ましく、１〜５０ｎｍであることが特に好ましく、１０ｎｍ以下であることが最も好ましい。すなわち、本発明で用いる水不溶性繊維は、一般に「ナノファイバー」と称されるものであることが特に好ましい。

ここで、数平均繊維径は、次のようにして測定することができる。すなわち、固形分率で０．０５〜０．１質量％の水不溶性繊維の水分散体を調製し、その水分散体を、親水化処理済みのカーボン膜被覆グリッド上にキャストして、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）の観察用試料とする。なお、大きな繊維径の繊維を含む場合には、ガラス上へキャストした表面の走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）像を観察してもよい。そして、構成する繊維の大きさに応じて５０００倍、１００００倍あるいは５００００倍のいずれかの倍率で電子顕微鏡画像による観察を行う。その際に、得られた画像内に縦横任意の画像幅の軸を想定し、その軸に対し、２０本以上の繊維が交差するよう、試料及び観察条件（倍率等）を調節する。そして、この条件を満たす観察画像を得た後、この画像に対し、１枚の画像当たり縦横２本ずつの無作為な軸を引き、軸に交錯する繊維の繊維径を目視で読み取っていく。このようにして、最低３枚の重複しない表面部分の画像を、電子顕微鏡で撮影し、各々２つの軸に交錯する繊維の繊維径の値を読み取る（したがって、最低２０本×２×３＝１２０本の繊維径の情報が得られる）。このようにして得られた繊維径のデータにより、数平均繊維径を算出する。

上記水不溶性繊維の結晶構造は、特に限定されないが、水不溶性の観点から、構成する繊維がセルロースである場合、Ｉ型結晶構造を有することが好ましい。ここで、水不溶性繊維を構成するセルロースがＩ型結晶構造を有することは、例えば、広角Ｘ線回折像測定により得られる回折プロファイルにおいて、２シータ＝１４〜１７°付近と、２シータ＝２２〜２３°付近の２つの位置に典型的なピークをもつことから同定することができる。

上記水不溶性繊維は、上述の通り、その表面が化学修飾されたものであってもよく、化学修飾の例としては、非イオン性基、アニオン性基、カチオン性基、又は両性基の導入が挙げられる。Ｉ型結晶構造を維持することができ、ナノメートルレベルの繊維径まで効率良く解繊することができる観点からは、アニオン変性又はカチオン変性された水不溶性繊維が好ましく、アニオン変性がより好ましい。すなわち、セルロース分子中のグルコースユニット、又は、キチン、キトサン分子中のＮ−アセチルグルコサミンユニットやグルコサミンユニットに、アニオン性基又はカチオン性基を導入した水不溶性繊維であることが好ましい。

アニオン性基としては、特に限定されないが、カルボン酸基、リン酸基、スルホン酸基、硫酸基、又は塩をなしているこれらの基が挙げられ、これらのいずれか１種を有していてもよく、２種以上を有していてもよい。また、グルコースユニット、Ｎ−アセチルグルコサミンユニット、又はグルコサミンユニットと、上記アニオン性基との間に連結基を有していてもよい。

アニオン性基の塩としては、特に限定されないが、ナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩等のアルカリ金属塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、バリウム塩等のアルカリ土類金属塩、アンモニウム塩、ホスホニウム塩等のオニウム塩、１級アミン、２級アミン、３級アミン等のアミン塩等が挙げられる。

アニオン性基には、上記のように、カルボン酸基、リン酸基、スルホン酸基、硫酸基等の酸型と、カルボン酸塩基、リン酸塩基、スルホン酸塩基、硫酸塩基等の塩型があるが、好ましい実施形態としては、塩型のアニオン性基を含むことであり、塩型のアニオン性基のみ有する水不溶性繊維を使用してもよく、塩型のアニオン性基と酸型のアニオン性基が混在する水不溶性繊維を使用してもよい。

カチオン性基としては、特に限定されないが、４級アンモニウム塩、１級、２級、若しくは３級アミノ基、又はこれらと塩酸や酢酸等が塩をなしている基が挙げられ、これらのいずれか１種を有していてもよく、２種以上を有していてもよい。また、グルコースユニット、Ｎ−アセチルグルコサミンユニット、又はグルコサミンユニットと上記カチオン性基との間に連結基を有していてもよい。

以下、本発明の一実施形態である、アニオン変性された水不溶性繊維の例として、セルロースを構成するグルコースユニットの水酸基を酸化してなる酸化セルロース（Ａ）、及び、セルロースを構成するグルコースユニットの水酸基をカルボキシメチル化してなるカルボキシメチル化セルロース（Ｂ）についてより具体的に説明し、それぞれの製造方法の例についても説明する。

酸化セルロース（Ａ）としては、特に限定されないが、グルコースユニットの６位の水酸基が選択的に酸化されたものであることが好ましい。酸化セルロース（Ａ）がグルコースユニット上の６位の水酸基が選択的に酸化されたものであることは、例えば、^１３Ｃ−ＮＭＲチャートにより確認することができる。

なお、酸化セルロース（Ａ）は、カルボン酸基（ＣＯＯＨ）及び／又はカルボン酸塩基（ＣＯＯＸ、ここでＸはカルボン酸と塩を形成するカチオンを示す）と共に、アルデヒド基又はケトン基を有していてもよいが、アルデヒド基及びケトン基を実質的に有していないことが好ましい。

酸化セルロース（Ａ）の製造方法は限定されないが、例えば、（１）酸化反応工程、（２）還元工程、（３）精製工程、（４）分散工程（微細化処理工程）等を含む製造方法により製造することができ、具体的には以下の各工程により製造することが好ましい。

（１）酸化反応工程
天然セルロース繊維とＮ−オキシル化合物とを分散媒体である水に分散させた後、共酸化剤を添加して、反応を開始する。反応中はｐＨが低下するので０．５ｍｏｌ／ｌの水酸化ナトリウム水溶液を滴下してｐＨを１０〜１１に保ち、ｐＨに変化が見られなくなった時点で反応終了と見なす。

天然セルロースは、一般に重合度が１,０００〜３,０００、結晶化度が６５〜９５％であり、セルロースＩ型結晶構造を有し、セルロース分子が３０〜５０本束ねられた結晶性のセルロースミクロフィブリルを構成要素としている。高等植物ではこの繊維様のセルロースミクロフィブリルは、その表面でヘミセルロース及びリグニンと一部複合化して、繊維、繊維集合体、組織という階層構造を形成している。

上記天然セルロースとしては、植物や、動物、バクテリア産生ゲル等のセルロースの生合成系から単離した精製セルロースを使用できる。より具体的には、針葉樹系パルプや広葉樹系パルプ等の木材系パルプ、コットンリンターやコットンリント等の綿系パルプ、麦わらパルプやバガスパルプ等の非木材系パルプ等がいずれも好適に用いられ、バクテリアセルロース（ＢＣ）、ホヤから単離されるセルロース、海草から単離されるセルロース等も使用可能である。これらは単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。

なお、上記の通り、天然セルロースは植物組織中でヘミセルロース及びリグニンと一部複合化して存在していることから、精製工程の有無に関わらず、天然セルロース中にこれらの成分が残存していることがあるが、本発明の凍結抑制効果を阻害しない範囲でこれらの成分が天然セルロース原料に含有していることは許容される。

また、Ｎ−オキシル化合物としては、例えば、一般に酸化触媒として用いられるニトロキシラジカルを有する化合物が挙げられる。Ｎ−オキシル化合物は、水溶性の化合物が好ましく、中でもピペリジンニトロキシオキシラジカルであることがより好ましく、２，２，６，６−テトラメチルピペリジノオキシラジカル（ＴＥＭＰＯラジカル）、４−アセトアミド−ＴＥＭＰＯラジカルであることがさらに好ましい。

Ｎ−オキシル化合物の添加量は、いわゆる触媒量で充分であり、例えば０．１〜４ｍｍｏｌ／ｌ程度である。

ここで、上記共酸化剤とは、直接的にセルロースの水酸基を酸化する物質ではなく、酸化触媒として用いられるＮ−オキシル化合物を酸化する物質のことである。

共酸化剤としては、例えば、次亜ハロゲン酸、亜ハロゲン酸、過ハロゲン酸、過酸化水素、過有機酸、又はこれらの塩等が挙げられ、これらは単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。中でも、次亜塩素酸ナトリウム、次亜臭素酸ナトリウム等のアルカリ金属次亜ハロゲン酸塩であることが好ましい。次亜塩素酸ナトリウムを使用する場合、反応速度の点から、臭化ナトリウム等の臭化アルカリ金属の存在下で反応を進めることが好ましい。

酸化反応における反応水溶液のｐＨは、約８〜１１の範囲で維持されることが好ましい。水溶液の温度は約４〜４０℃の範囲において任意であり、特に温度の制御は必要としない。共酸化剤の添加量と反応時間で、酸化の程度を制御することにより、所望のカルボキシル基量等を有する酸化セルロース（Ａ）を得ることができる。通常、反応時間は約５〜１２０分間であり、長くとも２４０分以内に完了する。

（２）還元工程
上記により得られた酸化セルロース（Ａ）は、上記酸化反応後に還元反応を行うことが好ましい。これにより、酸化反応により形成されたアルデヒド基及びケトン基の一部ないし全部が還元され、水酸基に戻すことができる。具体的には、酸化反応後の酸化セルロースを精製水に分散し、水分散体のｐＨを約１０に調整し、各種還元剤により還元反応を行う。

還元剤としては、一般的なものを使用することが可能であり、例えば、ＬｉＢＨ_４、ＮａＢＨ_３ＣＮ、ＮａＢＨ_４等が挙げられる。還元剤の配合量は、酸化セルロースを基準として、０．１〜４質量％であることが好ましい。

反応は、室温又は室温より若干高い温度で、通常、１０分間〜１０時間程度、好ましくは３０分間〜２時間程度行う。

反応終了後、各種の酸により反応混合物のｐＨを約２に調整し、精製水をふりかけながら遠心分離機で固液分離を行うことにより、ケーキ状の酸化セルロースを得ることができる。

（３）精製工程
上記還元工程を終えた酸化セルロースは、通常、この段階ではナノファイバー単位まで分かれて分散していないため、通常の精製法、すなわち水洗とろ過を繰り返すことで未反応の共酸化剤（次亜塩素酸等）や各種副生成物等を除き、高純度（９９質量％以上）の酸化セルロースと水とを含む分散体とすることができる。

精製工程における精製方法は、遠心脱水を利用する方法（例えば、連続式デカンダー）のように、上述した目的を達成できる装置であればどのような装置を利用しても差し支えない。

（４）分散工程（微細化処理工程）
精製工程にて得られる水を含浸した酸化セルロース（水分散体）を、分散媒体中に分散させ分散処理を行う。処理に伴って粘度が上昇し、微細化された酸化セルロースナノファイバーの分散体を得ることができる。

分散工程で使用する分散機としては、高速回転下でのホモミキサー、高圧ホモジナイザー、超音波分散処理機、ビーター、ディスク型レファイナー、コニカル型レファイナー、ダブルディスク型レファイナー、グラインダー等の、強力で叩解性や離解性に優れる装置を使用することが望ましい。

なお、この分散工程は、本発明の凍結抑制剤の製造工程のうち、セルロース、キチン、若しくはキトサン、又は、それらに非イオン性基、アニオン性基、カチオン性基、若しくは両性基が導入された繊維状物質から解繊してナノファイバーを得る工程として、共通して適用できる。

次に、上記カルボキシメチル化セルロース（Ｂ）の製造方法も限定されないが、例えば、上記天然セルロースを原料として用いて、以下のような方法により製造することができる。

すなわち、まず天然セルロースに、溶媒として低級アルコールを加える。具体的には、メタノール、エタノール、ｎ−プロピルアルコール、イソプロピルアルコール等の低級アルコール１種又は２種以上と、水との混合溶媒を使用するのが好ましい。なお、水との混合溶媒中の低級アルコールの混合割合は、６０〜９５質量％であることが好ましい。溶媒の添加量は、天然セルロースの質量の３〜２０倍の質量であることが好ましい。

次いで、セルロースと溶媒に対して、セルロースのグルコース残基当たり０．５〜２０倍モルのマーセル化剤を混合してマーセル化処理を行う。マーセル化剤としては、水酸化アルカリ金属が挙げられ、具体的には水酸化ナトリウムや水酸化カリウムを使用することができる。このときの反応温度は約０〜７０℃であることが好ましく、より好ましくは約１０〜６０℃であり、反応時間は約１５分間〜８時間であることが好ましく、より好ましくは約３０分間〜７時間である。

その後、カルボキシメチル化剤をグルコース残基当たり０．０５〜１０倍モル添加してエーテル化反応を行う。カルボキシメチル化剤としては一般に使用されているものが使用でき、例えば、モノクロロ酢酸ナトリウム等が挙げられる。このときの反応温度は約３０〜９０℃であることが好ましく、より好ましくは約４０〜８０℃であり、反応時間は約３０分間〜１０時間であることが好ましく、より好ましくは約１時間〜４時間である。

上記のエーテル化反応後、高圧ホモジナイザー等によって解繊処理することでカルボキシメチル化セルロース（Ｂ）のナノファイバーを得ることができる。

次に、本発明の一実施形態である、アニオン性基としてリン酸基又はその塩を有するアニオン変性セルロース（Ｃ）の製造方法について説明する。

すなわち、その製造方法も限定されないが、例えば乾燥状態又は湿潤状態の天然セルロース原料にリン酸又はリン酸誘導体の粉末や水溶液を混合する方法、天然セルロース原料の分散液にリン酸又はリン酸誘導体の水溶液を添加する方法等を用いることができる。

これらの方法においては、通常、リン酸又はリン酸誘導体の粉末や水溶液を、混合又は添加した後に、脱水処理、加熱処理等を行う。これにより、セルロースを構成するグルコースユニットの水酸基に、リン酸基を含む化合物又はその塩が脱水反応してリン酸エステルが形成され、リン酸基又はその塩が導入される。

ここで、リン酸又はリン酸誘導体としては、例えば、リン原子を含有するオキソ酸、ポリオキソ酸又はそれらの誘導体から選ばれる少なくとも１種の化合物が挙げられる。

アニオン変性セルロースにおけるアニオン性基の量は、特に限定されず、例えば、０．０５〜３．０ｍｍｏｌ／ｇ含有してもよく、０．１〜２．５ｍｍｏｌ／ｇ含有してもよい。

ここで、アニオン性基の量は、次の方法により求めることができる。すなわち、乾燥重量を精秤したアニオン変性セルロース試料から０．５〜１質量％スラリーを６０ｍｌ調製し、０．１ｍｏｌ／ｌの塩酸水溶液によってｐＨを約２．５とした後、０．０５ｍｏｌ／ｌの水酸化ナトリウム水溶液を滴下して、電気伝導度測定を行い、ｐＨが約１１になるまで続け、電気伝導度の変化が緩やかな弱酸の中和段階において消費された水酸化ナトリウム量（Ｖ）から、下記の式（１）に従い求めることができる。

式（１）：
アニオン性基量（ｍｍｏｌ／ｇ）
＝Ｖ（ｍｌ）×〔０．０５（ｍｏｌ／ｌ）／セルロース試料重量（ｇ）〕

本発明の凍結抑制剤の必須成分である水不溶性繊維は、固形分としては、好ましくは、０．００１〜９９質量％の範囲で調製され、分散液、若しくは、その濃縮ゲル、又は、その乾燥塗膜のいずれの形態でも用いることができるが、実際に機能を発現させる際の実用濃度は０．０５〜９５質量％であるのが好ましい。

また、本発明の凍結抑制剤は、上記水不溶性繊維に加えて、下記一般式（１）で表されるフェノキシエタノール及びその誘導体（以下、フェノキシエタノール誘導体も含めて単にフェノキシエタノールという）の少なくとも1種を含有する。

式中、ＡＯは炭素数が２以上４以下のオキシアルキレン基を表し、ｎは１〜１００の整数を表す。

一般式（１）における（ＡＯ）ｎ鎖部分は、炭素数が２以上４以下のオキシアルキレン基として、エチレンオキサイド、プロピレンオキサイド、ブチレンオキサイドの１種又は２種以上の付加重合体であり、重合形態は特に限定されず、１種類のアルキレンオキサイドの単独重合体、２種類以上のアルキレンオキサイドのランダム共重合体、ブロック共重合体、又はそれらランダム付加体とブロック共重合の組み合わせのいずれであってもよい。なお、（ＡＯ）ｎ鎖部分が上記で示した重合体である一般式（１）で表される化合物（フェノキシエタノールを除く）は、いずれもフェノキシエタノール誘導体に含まれるものとする。

上記オキシアルキレン基としてはオキシエチレン基が特に好ましい。２種類以上のオキシアルキレン基を含有する場合には、その１種類はオキシエチレン基であることが好ましく、より具体的には、（ＡＯ）ｎ鎖部分は、好ましくはオキシエチレン基を５０〜１００モル％、より好ましくは７０〜１００モル％含有する（ポリ）オキシアルキレン鎖である。

ｎはアルキレンオキサイドの付加モル数を表し、平均値で、１〜１００の範囲の数であり、好ましくは１〜５０の範囲であり、より好ましくは１〜１０の範囲であり、特に好ましくは１〜５の範囲である。

本発明の凍結抑制剤の必須の成分である上記フェノキシエタノールは、好ましくは、０．０００１〜３０質量％の範囲で調製され、分散液、若しくは、その濃縮ゲル、又は、その乾燥塗膜のいずれの形態でも用いることができるが、実際に機能を発現させる際の実用濃度は０．０００５〜２０質量％であるのが好ましい。

また、上記水不溶性繊維と上記フェノキシエタノールとの含有割合（水不溶性繊維／フェノキシエタノール）は、質量比で０．０１〜２０であることが好ましく、０．１〜１０であることがより好ましい。

本発明の凍結抑制剤の製法は特に限定されないが、例えば上記水不溶性繊維を予め水分散体にして、フェノキシエタノールを加えて混合攪拌することにより得ることができる。その際、粘度調整等のために、必要に応じて、水や、有機溶剤、後述する添加剤等を加えてもよい。

本発明の凍結抑制剤の用途は、特に限定されるものではないが、水の凍結を抑制する目的で農水産物や畜産物、又は、それらに由来する各種製品、加工食品、その他、生体組織、生理活性物質、医療用薬液、酵素類、更に、塗料や医薬・香粧品等の水性液体を媒体とする各種製品等に添加して利用できる。

また、本発明の凍結抑制剤は、固体表面における水の凍結抑制、氷の局在化抑制、及び氷結晶の成長抑制の作用から、凍結、着霜、着氷を所望しない固体表面にも適用することができる。

例えば、一の実施形態として、水を必須成分として、有機溶剤を１種以上含んだ溶媒に、本発明の凍結抑制剤の必須成分である水不溶性繊維とフェノキシエタノールが分散した、流動性を有するナノファイバー分散液を添加して利用することができる。また、その所望量を秤取した後、必要に応じて混合装置、混練装置、攪拌装置等を用いて、ナノファイバー成分を均一混合して添加することができる。また、本発明の凍結抑制剤において、必要に応じて余分の液体成分を除去する操作を行ってもよく、不足の液体成分を追加する操作を行ってもよい。また、適宜所望の器具、装置を選択して、本発明の凍結抑制剤を刷毛やスプレー噴霧等により塗布してもよい。

また、他の実施形態として、水を必須成分として、有機溶剤及び／又は油類を含有した溶媒に、本発明の凍結抑制剤の必須成分である水不溶性繊維が分散した、固形状、半固形状、又はゲル状のナノファイバー分散体を添加して利用することができる。

さらに、上記各実施形態のナノファイバー分散体を、刷毛やスプレー噴霧等により塗布した後、液体成分を除去する操作を経て、又は、自然放置により乾燥させて乾燥塗膜として利用することもできる。

本発明の凍結抑制剤は、本発明の効果を阻害しない範囲において、実際の使用に際して、（未反応）セルロース、合成触媒残渣、繊維膨潤助剤、解繊助剤、ｐＨ調整剤、溶剤、保湿剤、無機塩、有機酸塩、他種増粘剤、他種ゲル化剤、防腐剤、抗菌剤、界面活性剤類、レベリング剤、水溶性ポリマー、他種有機性及び無機性フィラー類、着色剤、香料等を含むことは許容される。

本発明の凍結抑制剤の必須成分である水不溶性繊維、好適には水不溶性ナノファイバーの調製方法について、以下の通り、例示する。ただし、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。なお、以下の説明において特に記述がない限り、濃度は質量％で示され、配合割合等は質量基準である。

〈製造例１（酸化セルロースナノファイバーの製造）〉
家庭用ミキサーで粉砕した針葉樹パルプ（ＬＢＫＰ）２０ｇに、水を１５００ｍｌ、臭化ナトリウムを２．５ｇ、２，２，６，６−テトラメチルピペリジノオキシラジカル（ＴＥＭＰＯ）を０．２５ｇ加え、充分撹拌して分散させた後、１３質量％次亜塩素酸ナトリウム水溶液（共酸化剤）を、上記パルプ１０ｇに対して次亜塩素酸ナトリウム量が６．５ｍｍｏｌ／ｇとなるように加え、反応を開始した。反応の進行に伴いｐＨが低下するため、ｐＨを１０〜１１に保持するように０．５Ｎ水酸化ナトリウム水溶液を滴下しながら、ｐＨの変化が見られなくなるまで１２０分間反応させた。

反応終了後、０．１Ｎ塩酸を添加して中和したのち、ろ過と水洗を繰り返して精製し、繊維表面が酸化されたアニオン変性セルロース繊維を得た。次いで、該アニオン変性セルロース繊維に純水を加えて２質量％に希釈し、高圧ホモジナイザーを用いて圧力１４０ＭＰａで３回処理することにより、本発明で用いるアニオン変性セルロースナノファイバーの水分散体を得た。得られたアニオン変性セルロースナノファイバーは、アニオン性基としてカルボン酸ナトリウム塩基（−ＣＯＯＮａ）を有し、最大繊維径が１０ｎｍ、数平均繊維径が４ｎｍ、アニオン性基（カルボキシル基）量は１．８３ｍｍｏｌ／ｇであった。

上記製造例１で得られた酸化セルロースナノファイバー、フェノキシエタノール（ＡＯ＝オキシエチレン基（ＥＯ）、ｎ＝１又は４）、エチレングリコールを、表１に示す含有割合（質量％）に従い混合し、必要に応じて水を加えて水分散体を調製した。

得られた水分散体について、一方向凍結実験装置を用いて、過冷却度の測定、及び氷成長界面の形状の観察をした。

〈過冷却度〉
具体的には、室温８℃に設定した定温恒温室内に倒立顕微鏡（株式会社ニコン製、ＥＣＬＩＰＳＥ Ｔｉ２−Ｅ）を設置し、顕微鏡のステージ上に試料冷却部を固定した。冷却部のペルチェ素子に銅板を取り付け、その上に、隙間を０．０２ｍｍに保ったカバーガラス２枚を設置した。その隙間に上記試料又は純水を注入し、冷却した。なお、一度冷却した試料は廃棄し、計測ごとに試料を取り換え、それぞれ５回実験を行った。

２枚のカバーガラスの隙間に、呼び径０．０１３ｍｍの熱電対（株式会社アンベエスエムティ製、ＫＢＴ−１３）を挿入し、温度を計測した。水分散体の氷成長界面の先端が熱電対の接点中央部に達したときの温度を界面温度とした。そして、水分散体の界面温度と純水の界面温度との差（以下、過冷却度ともいう）を測定し、その平均値を表１に示した。

表１より、酸化セルロースナノファイバーを単独で使用した比較例１の過冷却度とフェノキシエタノール（ＡＯ＝ＥＯ、ｎ＝１）を単独で使用した比較例２の過冷却度との合計値よりも、実施例１の酸化セルロースナノファイバーとフェノキシエタノール（ＡＯ＝ＥＯ、ｎ＝１）とを混合した水分散体の過冷却度は大きかった。

同様に、比較例１の過冷却度とフェノキシエタノール（ＡＯ＝ＥＯ、ｎ＝４）を単独で使用した比較例３の過冷却度との合計値よりも、実施例２の酸化セルロースナノファイバーとフェノキシエタノール（ＡＯ＝ＥＯ、ｎ＝４）とを混合した水分散体の過冷却度は大きかった。

従って、本発明に係る水不溶性繊維とフェノキシエタノールとを併用することで、相乗効果による凍結抑制の顕著な効果が得られることが認められた。これは、フェノキシエタノールによって局所的に凝集した酸化セルロースナノファイバーが氷結晶に吸着することで氷界面の成長をより強く抑制していることによるものと推測できる。

なお、比較例５に示す不凍液と知られるエチレングリコールと酸化セルロースナノファイバーとを混合した水分散体では、本発明のような相乗効果は認められず、むしろ比較例４のエチレングリコールを単独で使用した過冷却度と、比較例１の過冷却度との合計値よりも劣っていた。

〈氷成長界面の形状〉
図１〜６に実施例１，２、及び比較例１〜３，５の氷成長界面の形状を示した。比較例１の氷成長界面は、図３に示すように界面に特異的な形状が見られたものの、氷結晶同士の合一が観察された。また、比較例１の氷成長界面と図１，２に示す実施例１，２の氷成長界面とを比較すると、実施例１，２では、氷結晶間の筋がはっきりと観察できた。この筋は氷結晶間に液体領域が存在することを意味し、液体領域は、比較例１よりも、実施例１，２の方が広く、そして細長く形成され、氷結晶同士の合一が抑制されていた。

また図４，５に示す比較例２，３の氷成長界面では、氷結晶間の筋がはっきりとせず、液体領域が飛び石状に形成されており、所々氷結晶同士が合一しているのが観察できる。従って、比較例２，３と比較しても、図１，２に示す実施例１，２の氷成長界面の方が氷結晶間の筋がはっきりと形成され、氷結晶同士の合一が抑制されていた。

一方、図６に示す比較例５では、氷結晶の幅が太く、氷結晶成長抑制機能が低い結果となった。

以上のように、本発明の凍結抑制剤は、特異的な凍結抑制効果を示し、また、本発明の凍結抑制剤の特性である、より大きな熱ヒステリシスを示すことが明らかである。

本発明の凍結抑制剤は、冷凍流通や冷凍保存で取り扱われる可能性のある以下製品において好適に使用できる。具体的には、米飯、パン、餅、団子類、練り物製品、豆腐、湯葉、ゆで卵の他、畜肉製品、ハム、ソーセージ、野菜、果物、カット野菜、カットフルーツ、魚介類、魚の干物、釜揚げシラス、魚卵類等が挙げられる。また、冷凍食品として、冷凍肉類、冷凍魚介類、冷凍パン生地、冷凍麺、冷凍ご飯、冷凍野菜、冷凍果物、肉類のフライ、カツ、天ぷら、中華まん、餃子、シュウマイ、春巻、中華ポテト、フライドポテト、パイ、ピザ等が挙げられる。更に、冷凍プリン、冷凍ゼリー、寒天、アイスクリーム、冷菓、漬物、液体調味料、ソース類、ドレッシング、フリーズドライ食品、生花（切花）等が挙げられる。

本発明の凍結抑制剤は、また、固体表面における水又は氷の局在化抑制と氷結晶の成長抑制作用から、凍結、着霜、着氷抑制作用を発揮し、一般住居や公共施設の窓や、鍵、屋根等、又、冷凍機や冷蔵庫等の熱交換器、又、航空機や、鉄道、自動車等の運行制御機器や窓、更に、舗装道路、橋上道路、高層建築物、橋梁、送電線、更に、信号機や、アンテナ、レーダー、カメラ、センサー等を有する屋外施設において凍結、着霜、着氷抑制剤としても適用することができる。

本発明における凍結抑制効果は、塗料や医薬・香粧品等、水性液体を媒体とする各種製品、生体細胞、生体組織、臓器、生理活性物質、医療用薬液にも適用することができる。

Claims (7)

1. セルロース繊維、キチン繊維、キトサン繊維、及びそれらの化学修飾体からなる群より選択された少なくとも１種の水不溶性繊維と、
   下記一般式（１）で表される化合物からなる群より選択された少なくとも１種とを含有する凍結抑制剤。
   式中、ＡＯは炭素数が２以上４以下のオキシアルキレン基を表し、ｎは１〜１００の整数を表す。ＡＯの付加形態はランダム付加、ブロック付加、又はこれらの混合付加である。
2. 前記水不溶性繊維が、セルロース繊維及び／又はその化学修飾体である、請求項１に記載の凍結抑制剤。
3. 前記水不溶性繊維の数平均繊維径が、１ｎｍ以上５０ｎｍ以下であることを特徴とする、請求項１又は２に記載の凍結抑制剤。
4. 前記水不溶性繊維が、表面がアニオン性の置換基により化学修飾された水不溶性繊維及び／又はその塩であることを特徴とする、請求項２又は３に記載の凍結抑制剤。
5. 前記アニオン性の置換基が、カルボキシル基、カルボキシメチル基、及びリン酸基からなる群より選択される少なくとも１種であることを特徴とする、請求項４に記載の凍結抑制剤。
6. 請求項１〜５のいずれか１項に記載の凍結抑制剤を含有してなる凍結抑制塗膜。
7. 請求項１〜５のいずれか１項に記載の凍結抑制剤が水性分散媒に分散された水性分散液から水性分散媒を揮散させて凍結抑制塗膜を製造する工程を含む、凍結抑制塗膜の製造方法。