CN114176115A - 羧甲基壳聚糖席夫碱及其制备和应用 - Google Patents
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Abstract
本申请公开一种羧甲基壳聚糖席夫碱及其制备和应用，制备包括：将自制的羧甲基壳聚糖用水溶解；用乙醇溶解适量的紫苏精油，并加入步骤羧甲基壳聚糖溶液中，随后进行超声波‑微波处理，反应3.5～4.5h；依次进行过滤、洗涤和烘干，得到羧甲基壳聚糖席夫碱。本申请以壳聚糖作为原料，对壳聚糖进行羧甲基化，有效的改善了壳聚糖难溶于水和碱性环境的性质，并在此基础上利用天然抑菌物质紫苏精油对羧甲基壳聚糖进行席夫碱化改性，在保留壳聚糖良好水溶性的同时进一步提高壳聚糖的抑菌性。本申请羧甲基壳聚糖席夫碱有很好的抑菌效果，可用于制备抑菌剂。本申请羧甲基壳聚糖席夫碱有很好的抗冻效果，可制备抗冻剂用于水产品保鲜。
Description
技术领域
本申请涉及新型抑菌材料技术领域，尤其涉及一种新型羧甲基壳聚糖席夫碱的制备方法及其应用。
背景技术
紫苏精油是通过特定的提取方法从紫苏叶或秸秆中得到的一种高挥发性芳香油状物质。紫苏精油性温、无毒，具有高抗氧、抗菌、抗炎、杀虫、抗癌和抑郁等多种活性。目前，有关紫苏精油的研究与利用受到科研领域的普遍关注，在烘焙食品、饮料、冷冻乳制品、布丁、加工蔬菜和汤类中被广泛使用。此外，紫苏精油已经被证明是比化学合成的食品防腐剂和杀虫剂更可靠和有效的生物试剂。因此，紫苏精油在医药、食品、化妆品以及化学化工领域均带来了可观经济效益，极具科学研究价值和市场开发潜力。
壳聚糖作为一种天然的阳离子多糖，具有无毒、抑菌、抗氧化、化学可修饰性和高反应活性等特点，广泛地被应用于化工、医学、食品和生物技术等多个领域，但壳聚糖仅在稀酸溶液中的溶解性较好，不溶于水和碱性溶液，因此，壳聚糖的应用范围受到了极大的限制。
申请内容
本申请针对壳聚糖的抑菌性和水溶性进行壳聚糖的改性，使壳聚糖在碱性溶液中也可以溶解，并在保留壳聚糖优良抑菌性的基础上，增强其抑菌效果以及扩大壳聚糖的应用范围。
本申请目的之一在于提供一种对壳聚糖改性的羧甲基壳聚糖席夫碱，具有如式(1)所示的结构式：
本申请目的之二在于制备一种具有优异性能的羧甲基壳聚糖席夫碱，该方法所需设备简单，工艺简便，作用条件温和，重复性好。
一种羧甲基壳聚糖席夫碱的制备方法，包括：
(1)将壳聚糖置于40～45％氢氧化钠溶液中，壳聚糖和氢氧化钠的质量体积比为1:23～28(w/v，g:mL)，并在冰水浴中搅拌3.5～4.5h；
(2)向步骤(1)所得反应液中加入氯乙酸和异丙醇，异丙醇与步骤(1)中氢氧化钠溶液体积比为1:0.8～1.2，氯乙酸和异丙醇的质量体积比为2:23～28(w/v，g:mL)，再在常温条件下搅拌7.5～8.5h；
(3)将步骤(2)所得反应液沉淀后除去上层清液，并用乙醇洗涤沉淀物，再水溶，调节pH为6.5～7.5；
(4)向步骤(3)所得水溶液中加入乙醇，使羧甲基壳聚糖沉淀，最后过滤烘干得羧甲基壳聚糖；
(5)将步骤(4)所得羧甲基壳聚糖用水溶解，羧甲基壳聚糖和水的质量比为2～4％(w/w)，加热搅拌使羧甲基壳聚糖溶解；
(6)用乙醇溶解适量的紫苏精油，并加入步骤(5)所得羧甲基壳聚糖溶液中，随后进行超声波-微波处理，反应3.5～4.5h；羧甲基壳聚糖和紫苏精油质量比为1:6～8(w/w)。
(7)将步骤(6)反应后的液体依次进行过滤、洗涤和烘干，得到羧甲基壳聚糖席夫碱。
以下还提供了若干可选方式，但并不作为对上述总体方案的额外限定，仅仅是进一步的增补或优选，在没有技术或逻辑矛盾的前提下，各可选方式可单独针对上述总体方案进行组合，还可以是多个可选方式之间进行组合。
可选的，所述紫苏精油由如下方法提取：
经微波-超声波协同方式提取后再经蒸馏萃取法提取；所述微波-超声波协同方式的条件为：料液比1g:5～8mL，微波功率930W～940W，超声功率240W～250W，微波-超声温度45℃～55℃，微波-超声时间为4min～5min；所述蒸馏萃取法提取的提取时间为5.5～6.5h。
进一步地，所述微波-超声波协同方式的条件为：料液比1g:6mL，微波功率933W，超声功率245W，微波-超声温度50℃，微波-超声时间为4.5min；所述蒸馏萃取法提取的提取时间为6h。
所述料液比是指晒干的紫苏叶粉末与提取液的质量体积比，其中提取液为质量分数3％的Nacl溶液。
在料液比1g:6mL、微波功率933W、超声功率245W、微波-超声温度50℃、微波-超声时间为4.5min条件下紫苏精油提取率为2.34％。
可选的，步骤(1)中氢氧化钠溶液为质量分数42％氢氧化钠溶液，壳聚糖和氢氧化钠溶液的比例为1:25(w/v)，冰水浴中搅拌4h。
可选的，步骤(2)中异丙醇与步骤(1)中氢氧化钠溶液体积比为1:1，氯乙酸和异丙醇的比例为2:25(w/v)，搅拌时间为8h。
可选的，步骤(3)中水溶可以理解为将沉淀全部溶解即可。
可选的，步骤(4)中乙醇的以羧甲基壳聚糖全部沉淀即可。
可选的，步骤(5)中羧甲基壳聚糖和蒸馏水的质量比为3％(w/w)。
可选的，步骤(6)中羧甲基壳聚糖和紫苏精油质量比为1:7(w/w)，反应时间为4h。
可选的，步骤(6)中超声波-微波处理条件为：温度6℃5～75℃，微波功率180W～220W，超声波功率140W～160W。
进一步地，温度70℃，微波功率200W，超声波功率150W。
可选的，步骤(1)中所述壳聚糖为分子量为40～60kDa的壳聚糖。
进一步地，所述壳聚糖为分子量为50kDa的壳聚糖。
以低分子量1kDa的壳聚糖制备的席夫碱溶解性过高，后续应用于保鲜材料有一定的影响；以高分子量100kDa的壳聚糖制备的席夫碱溶解度太低，抑菌效果不明显，故优选分子量为40～60kDa的壳聚糖，最优选选用50kDa分子量的壳聚糖。
本申请还提供一种如所述制备方法制备得到的羧甲基壳聚糖席夫碱。
本申请还提供一种如所述羧甲基壳聚糖席夫碱作为水产品抗冻剂或在制备水产品抗冻剂中的用途。
本申请还提供一种所述羧甲基壳聚糖席夫碱作为抑菌剂或在制备抑菌剂中的用途。
可选的，所述抑菌剂为抑制菌希瓦氏菌(S.putrefaciens)、大肠杆菌(E.coli)或金黄色葡萄球菌(S.aureus)的制剂。
进一步地，所述抑菌剂为抑制大肠杆菌(E.coli)的制剂。
针对大肠杆菌(E.coli)，采用紫苏精油改性的羧甲基壳聚糖席夫碱比采用纯品紫苏醛改性的羧甲基壳聚糖席夫碱其抑菌效果显著提高，其MIC值和MBC值分别降低50％左右。紫苏精油与羧甲基壳聚糖进行席夫碱反应结合，除了紫苏精油中主要成分紫苏醛与羧甲基壳聚糖反应，还有精油中含量较少的其他醛类，如柠檬醛，也会和羧甲基壳聚糖进行了反应。它们具有一定的协同作用，使得席夫碱的抑菌性比纯品紫苏醛反应产生的席夫碱更强，尤其是针对大肠杆菌(E.coli)。
与现有技术相比，本申请至少具有如下有益效果之一：
(1)紫苏精油的主要抑菌成分为紫苏醛，本专利利用紫苏精油中的醛类物质(主要是紫苏醛)通过席夫碱结构接枝到羧甲基壳聚糖上，成功合成一种新型抑菌物质羧甲基壳聚糖席夫碱。
(2)本申请的羧甲基壳聚糖席夫碱有大量的羧甲基和羟基，可与鱼肉细胞中的自由水结合，增加细胞中的结合水量，在冰晶产生的过程中可以减少大颗粒冰晶的产生，增加了鱼肉的保水性，并且降低了鱼肉的蒸煮损失率，在保存过程中可以延缓了鱼肉中蛋白的变性，提高了酶活。
(3)以壳聚糖作为原料，对壳聚糖进行羧甲基化，有效的改善了壳聚糖难溶于水和碱性环境的性质，并在此基础上利用天然抑菌物质紫苏精油对羧甲基壳聚糖进行席夫碱化改性，在保留壳聚糖良好水溶性的同时进一步提高壳聚糖的抑菌性。原料天然绿色，来源广泛。所制得产物有明显抑菌效果，且制备过程操作简单，条件温和，因此具有较广泛的应用前景。(4)利用紫苏精油与羧甲基壳聚糖进行席夫碱反应结合，除了紫苏精油中主要成分紫苏醛与羧甲基壳聚糖反应(主反应的原理如图1所示)，还有精油中含量较少的其他醛类，如柠檬醛，也会和羧甲基壳聚糖进行了反应。它们具有一定的协同作用，使得席夫碱的抑菌性比纯品紫苏醛反应产生的席夫碱更强。
(5)利用超声波-微波协同辅助合成席夫碱。超声波会产生空穴作用，改善反应环境，模糊相界面，加快反应速度和提高反应产率，大大减短了反应时间。微波一方面可以使得反应体系迅速提高至所需温度；另一方面可以降低反应能垒，在热力学上使反应更容易进行。
(6)反应中的羧甲基壳聚糖是实验室自制，纯度可保证。
附图说明
图1为本申请主反应的反应机制图。
图2为实施例2的红外表征图(图中a为壳聚糖、b为羧甲基壳聚糖、c为紫苏醛羧甲基壳聚糖席夫碱、d为紫苏精油羧甲基壳聚糖席夫碱)的红外表征图。
图3为实施例4冻融循环过程中大黄鱼持水力变化图。
图4为实施例4冻融循环过程中大黄鱼蒸煮损失率变化图。
图5为实施例4冻融循环过程中大黄鱼TBA变化图。
图6为实施例4冻融循环过程中大黄鱼蛋白浓度变化图。
图7为实施例4冻融循环过程中大黄鱼Ca2+-ATP酶活变化图。
具体实施方式
下面将结合本申请实施例中的附图，对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本申请的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本申请的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本申请。
以下实施例中所用乙醇如无明确浓度限定，均指无水乙醇，实验中所用到的试剂均可市购获得。
实施例1
(一)紫苏精油的提取：采用微波-超声波协同方式辅助同时蒸馏萃取法提取紫苏叶中挥发性精油，在料液比1:6(质量体积比：g：mL，料为紫苏叶粉末，液为质量分数3％的NaCl溶液)，微波功率933W，超声功率245W，微波-超声温度50℃，微波-超声时间4.5min条件下，紫苏精油提取率为2.34％。
具体步骤如下：
称取40目筛紫苏叶粉末40g置于圆底烧瓶中，按料液比1:6(w/v，g：mL0)加入质量分数为3％的NaCl溶液，将其置于微波-超声波组合萃取仪中，微波功率933W，超声功率245W，微波-超声温度50℃，微波-超声时间4.5min；然后利用蒸馏萃取法提取精油6h。
提取结束后用无水硫酸钠干燥有机相，过滤，旋蒸，纯化浓缩，得紫苏精油，进行GC-MS分析，结果如表1：
表1紫苏精油的GC-MS鉴定结果
(二)羧甲基壳聚糖的制备：
(1)将壳聚糖(CS)置于质量分数42％氢氧化钠溶液中，壳聚糖和氢氧化钠的质量体积比例为1:25(w/v)，并在冰水浴中搅拌4h；
(2)向步骤(1)中的溶液中加入氯乙酸和异丙醇，异丙醇和步骤(1)中氢氧化钠溶液的体积比例为1:1(v/v)，氯乙酸和异丙醇的质量体积比例为2:25(w/v)，再在常温条件下搅拌8h；
(3)将步骤(2)中所得的溶液沉淀后除去上层清液，并用乙醇洗涤沉淀物，再水溶，用浓盐酸调节pH为7；
(4)向步骤(3)中的所得到的溶液中加入乙醇，使羧甲基壳聚糖沉淀，最后过滤烘干得到羧甲基壳聚糖，记为CMC。
(三)羧甲基壳聚糖席夫碱的制备：
(5)将步骤(4)的羧甲基壳聚糖用蒸馏水溶解，羧甲基壳聚糖和蒸馏水的比例为3％(w/w)，加热搅拌使羧甲基壳聚糖溶解；
(6)用乙醇(乙醇与步骤(5)的蒸馏水体积比为5:1)溶解紫苏精油，并加入步骤(5)的羧甲基壳聚糖溶液中，随后进行超声波-微波处理，反应4h；反应条件：温度70℃，微波功率200W，超声波功率150W，羧甲基壳聚糖和紫苏精油质量比为1:7(w/w)；
(7)将步骤(6)反应后的液体进行过滤洗涤烘干，得到羧甲基壳聚糖席夫碱，记为PEOSB。
实施例2
将实施例1步骤(6)中的紫苏精油替换为纯品紫苏醛，羧甲基壳聚糖和紫苏醛质量比为1:7(w/w)，其他操作步骤同实施例1，所得改性产品记为PSB。
图2所示为壳聚糖(CS)、羧甲基壳聚糖(CMC)(实施例1制备)、紫苏醛羧甲基壳聚糖席夫碱(PSB)(实施例2制备)及紫苏精油羧甲基壳聚糖席夫碱(PEOSB)(实施例1制备)的红外表征图。
由图2可知，a中壳聚糖主要的峰有1676cm-1处的C＝O的峰和1597cm-1处氨基N-H变形振动峰，在1156cm-1处是环反对称伸缩振动峰，1083cm-1处为C-OH的吸收峰，891cm-1处是吡喃环的振动峰。
b中羧甲基壳聚糖在3425cm-1处有强吸收峰，它是-OH和-NH的特征吸收峰部分重叠的结果，与壳聚糖相比该特征峰较窄，由于取代后的CMC中-OH或-NH发生了取代而减少，缔合而形成氢键的数量减少。1602cm-1处为-NH2的特征吸收峰，这表明壳聚糖分子链上的大量-NH2没有发生羧甲基化反应。1415cm-1和1324cm-1的吸收峰并未叠加，说明CMC中不含N-C，即未出现-NH-CH2-键。在1261cm-1处出现了弱吸收峰，是-CH2-COOH中C-O伸缩振动和-OH面内弯曲振动偶合而产生的特征吸收，表明产物分子中含有羧甲基。1149cm-1和1076cm-1处出现C-O-C和C-O的伸缩振动吸收峰，这说明壳聚糖上的-OH发生了羧甲基化反应。
c和d中1602cm-1氨基消失以及1641cm-1和1635cm-1的C＝N峰的出现表明有席夫碱的生成。
实施例3抑菌实验
MIC是最小抑菌浓度，指能抑制微生物生长的最低浓度。MBC是最小杀菌浓度，指能杀死微生物生长的最低浓度。
将供试菌希瓦氏菌(S.putrefaciens)、大肠杆菌(E.coli)和金黄色葡萄球菌(S.aureus)分别以1:1000接种到LB肉汤中，希瓦氏菌30℃，大肠杆菌和金黄色葡萄球菌37℃，200rmp摇床，在12-16h内进行第1次活化。再以1:100接种到LB肉汤中，希瓦氏菌30℃，大肠杆菌和金黄色葡萄球菌37℃，200rmp摇床进行第2次活化至OD600nm为0.6。再用LB肉汤1:1000稀释菌悬液到106CFU/mL。将上述菌悬液以1:100接种到用二倍稀释法稀释成不同浓度的样品肉汤中，适宜温度摇床培养24h。培养过后，用肉眼观察试管中溶液的澄清情况。
澄清试管中的最小浓度就是样品溶液对被测菌的MIC值。通过MIC值，从溶液澄清试管中取200μL溶液涂布到LB固体培养基中，适宜温度恒温培养24h，观察培养基上是否有菌落生长。将无菌落生长的培养基对应的最小样品浓度作为被测菌的MBC值。样品有壳聚糖(CS)、羧甲基壳聚糖(CMC)(实施例1制备)、紫苏醛羧甲基壳聚糖席夫碱(PSB)(实施例2制备)及紫苏精油羧甲基壳聚糖席夫碱(PEOSB)(实施例1制备)，结果如表2：
表2抑菌实验结果
注：–表示溶液澄清透明/无菌生长；+表示溶液浑浊/菌体生长。
由表2可知，改性后的壳聚糖衍生物都有良好的抑菌性，且针对大肠杆菌(E.coli)，产物PEOSB抑菌效果要比单纯用纯品紫苏醛反应得到的PSB以及中间产物CMC的效果好，MIC和MBC各自降低50％，所以PEOSB作为一种新型抑菌物质具有较好的前景。
实施例4抗冻剂保鲜实验
新鲜大黄鱼购自杭州物美大卖场西溪欢乐城店，鱼长34.2±2.3cm，宽8.1±0.8cm，重450±130g。将新鲜的大黄鱼去内脏，洗净沥干，每条鱼切成大小大致相等六块。将处理好的鱼分为2组，用事先选取制备好的试剂(清水与1％PEOSB)浸泡两小时(清水作为对照组)在浸泡好后，沥干水分，将其放到-18℃开始按照设定好的冻融循环进行实验，在1,3,5,7的循环结束后测一系列数据。循环设定见下表3。
表3冻融循环
冻融循环过程中大黄鱼持水力变化如图3所示；冻融循环过程中大黄鱼蒸煮损失率变化如图4所示；冻融循环过程中大黄鱼TBA变化如图5所示；冻融循环过程中大黄鱼蛋白浓度变化如图6所示；冻融循环过程中大黄鱼Ca2+-ATP酶活变化如图7所示。
PEOSB作为壳聚糖的衍生物，其不仅保留了壳聚糖良好的理化性质，还增加了抑菌性。PEOSB上携带有大量的-OH，生物降解性及生物相容性良好，因此可与鱼肉细胞中的自由水结合，增加细胞中的结合水量。这样在冰晶产生的过程中，可以减少大颗粒冰晶的产生，增加了鱼肉的保水性，并且降低了鱼肉的蒸煮损失率。
在蛋白方面，大的冰晶颗粒会破坏鱼肉的蛋白结构，进而加快蛋白的变化，而PEOSB存在大量的-OH其可以减少大冰晶的产生，在保存过程中可以延缓了鱼肉中蛋白的变性，提高了酶活。PEOSB也有一定的抗氧化性，它也能减少延缓鱼肉的脂肪氧化。因此，实验结果表明，PEOSB具有作为一种新型抗冻剂的用途。
以上所述实施例仅表达了本申请的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对申请专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本申请的保护范围。因此，本申请专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (10)
1.一种羧甲基壳聚糖席夫碱，其特征在于，具有如式(1)所示的结构式：
2.如权利要求1所述的羧甲基壳聚糖席夫碱作为水产品抗冻剂或在制备水产品抗冻剂中的用途。
3.一种如权利要求1所述羧甲基壳聚糖席夫碱的制备方法，其特征在于，包括：
(1)将壳聚糖置于质量分数为40～45％氢氧化钠溶液中，壳聚糖和氢氧化钠的质量体积比为1g:23～28mL，并在冰水浴中搅拌3.5～4.5h；
(2)向步骤(1)所得反应液中加入氯乙酸和异丙醇，异丙醇与步骤(1)中氢氧化钠溶液体积比为1:0.8～1.2，氯乙酸和异丙醇的质量体积比为2g:23～28mL，再在常温条件下搅拌7.5～8.5h；
(3)将步骤(2)所得反应液沉淀后除去上层清液，并用乙醇洗涤沉淀物，再水溶，调节pH为6.5～7.5；
(4)向步骤(3)所得水溶液中加入乙醇，使羧甲基壳聚糖沉淀，最后过滤烘干得羧甲基壳聚糖；
(5)将步骤(4)所得羧甲基壳聚糖用水溶解，羧甲基壳聚糖和水的质量比为2～4％，加热搅拌使羧甲基壳聚糖溶解；
(6)将紫苏精油用乙醇溶解后加入步骤(5)所得羧甲基壳聚糖溶液中，随后进行超声波-微波处理，反应3.5～4.5h；羧甲基壳聚糖与紫苏精油的质量比为1:6～8。
(7)将步骤(6)反应后的反应液依次进行过滤、洗涤和烘干，得到羧甲基壳聚糖席夫碱。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述紫苏精油由如下方法提取：
经微波-超声波协同方式提取后再经蒸馏萃取法提取；所述微波-超声波协同方式的条件为：料液比1g:5～8mL，微波功率930W～940W，超声功率240W～250W，微波-超声温度45℃～55℃，微波-超声时间为4min～5min；所述蒸馏萃取法提取的时间为5.5～6.5h。
5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中氢氧化钠溶液为质量分数42％氢氧化钠溶液，壳聚糖和氢氧化钠溶液的质量体积比为1g:25mL，冰水浴中搅拌4h；
步骤(2)中异丙醇与步骤(1)中氢氧化钠溶液体积比为1:1，氯乙酸和异丙醇的质量体积比为2g:25mL，搅拌时间为8h；
步骤(5)中羧甲基壳聚糖和蒸馏水的质量比为3％。
6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤(6)中羧甲基壳聚糖与紫苏精油的质量比为1:7，反应时间为4h。
7.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤(6)中超声波-微波处理条件为：温度65℃～75℃，微波功率180W～220W，超声波功率140W～160W。
8.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述壳聚糖为分子量为40～60kDa的壳聚糖。
9.如权利要求1所述羧甲基壳聚糖席夫碱作为抑菌剂或在制备抑菌剂中的用途。
10.根据权利要求9所述的用途，其特征在于，所述抑菌剂为抑制菌希瓦氏菌(S.putrefaciens)、大肠杆菌(E.coli)或金黄色葡萄球菌(S.aureus)的制剂。
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