TW201608020A - 新穎的醋酸桿菌菌株及葡糖酸醋酸桿菌菌株與其等用於抑制黃嘌呤氧化酶之代謝產物 - Google Patents
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Abstract
一種用於抑制黃嘌呤氧化酶及用於降低尿酸水平之方法，其係使用藉由在一培養基中培養漢氏葡糖酸醋酸桿菌(Gluconacetobacter hansenii)或巴斯德醋酸桿菌(Acetobacter pasteurianus)所得之一種組成物。亦揭露一種組成物，其包括用於降低一個體的尿酸水平之漢氏葡糖酸醋酸桿菌或巴斯德醋酸桿菌的一種代謝產物；及揭露用於生產該組成物之一種方法。
Description
本發明係有關於藉由乳酸細菌及其等的發酵代謝產物，而抑制黃嘌呤氧化酶活性。
尿酸是體內嘌呤代謝作用的終產物。血中的高尿酸水平導致尿酸結晶之形成，及沈積在關節、腎臟及其他器官。當血中尿酸濃度高於7毫克/分升時，即視為高尿酸血症。
高尿酸血症是一種常見的代謝病症，及與痛風、高血壓、心血管疾病、糖尿病及腎臟疾病相關聯。據1993年至2008年在臺灣進行的一項流行病學調查顯示，患有高尿酸血症的男性與女性病患之百分比分別為21.6%與9.57%。
黃嘌呤氧化酶是尿酸合成作用中的關鍵酵素。因此，抑制黃嘌呤氧化酶活性可減少尿酸之產生。誠然，黃嘌呤氧化酶抑制劑亦即尿酸酶可有效降低血中的尿酸濃
度。尿酸酶並非存在於人體內的一種酵素。其通常以重組型哺乳動物蛋白之形式分離出來，及藉由靜脈輸注投藥。因此，其生產可能昂貴，及在投藥上可能困難。
異嘌呤醇亦為一種黃嘌呤氧化酶抑制劑。在臨床上投予該化合物來降低血清尿酸水平。然而，異嘌呤醇具有副作用，諸如過敏反應、胃腸不適、白血球減少症與血小板減少症、肝炎、腎病及6-巰嘌呤中毒，其在某些情況下可能導致死亡。
鑑於現行高尿酸血症療法之缺點，許多生物製藥公司將重心放在開發新的降尿酸劑。例如，Izumida等人於期刊“J.Antibiotics”第50期第916-918頁乙文指出，已從海洋細菌橙黃農桿菌(Agrobacterium aurantiacum)分離出可降低尿酸水平的一種化合物，亦即羥阿卡酮(hydroxyakalone)。
其他微生物物種亦顯示具有降尿酸能力，包括醋酸菌(Acetobacter aceti)、巴斯德醋酸桿菌(Acetobacter pasteurianus)、過氧化醋酸桿菌(Acetobacter peroxydans)、脆壁克魯維酵母(Kluyveromyces fragilis)、枯草桿菌(Bacillus subtilis)、發酵乳酸桿菌(Lactobacillus fermentum)、戊糖乳酸桿菌(Lactobacillus pentosus)、加氏乳酸桿菌(Lactobacillus gasseri)、口乳酸桿菌(Lactobacillus oris)、比菲德氏龍根菌(Bifidobacterium longum)及啤酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)等菌株。如見美國專利申請公開案2010/0316618、2011/0014168及2013/0330299；歐洲專利申請公開案2457576與1649863；中國專利申請公開案
CN102370859；及韓國專利申請公開案KR20130099653與KR20130004456。
對於研發容易生產及投藥安全之來自天然來源的新穎黃嘌呤氧化酶抑制劑之需求，目前仍然存在。
為滿足這項需求，而揭露用於降低一個體的尿酸水平之一種方法。該方法之步驟包括在一培養基中培養一種醋酸細菌，以形成一種組成物；及在個體中，以有效降低尿酸水平之一量投予該組成物。該醋酸細菌為漢氏葡糖酸醋酸桿菌(Gluconacetobacter hansenii)或巴斯德醋酸桿菌(Acetobacter pasteurianus)。
亦揭露用於抑制黃嘌呤氧化酶的一種方法。該方法之步驟包括在一培養基中培養一種醋酸細菌，以形成一種組成物；及將黃嘌呤氧化酶與該組成物接觸。同樣地，該醋酸細菌為漢氏葡糖酸醋酸桿菌或巴斯德醋酸桿菌。
在本發明的範圍內亦涵蓋用於生產一種組成物的一種方法，該組成物係用於降低一個體的尿酸水平。該方法之步驟包括將一種醋酸細菌接種至一培養基中，及在培養基中培養該醋酸細菌。該醋酸細菌為漢氏葡糖酸醋酸桿菌或巴斯德醋酸桿菌。
此外，提供用於降低一個體的尿酸水平之一種組成物。該組成物含有醋酸細菌的一種代謝產物。該醋酸細菌為漢氏葡糖酸醋酸桿菌或巴斯德醋酸桿菌。
在如下的說明書、圖式及實例中，闡明本發明的一或多個實施例之細節。從數個實施例的詳細說明中以及從申請專利範圍中，將明瞭本發明的其他特性、目標及優點。本申請案所引述的所有文獻與專利文件皆在此完整地併入本案以為參考資料。
本發明如下之說明係參照所附圖式，其中：圖1係顯示醋酸細菌菌株的黃嘌呤氧化酶抑制活性之條形圖；圖2係顯示在不同的培養基中生長之巴斯德醋酸桿菌的AHU02菌株之黃嘌呤氧化酶抑制活性之條形圖；及圖3係顯示在不同體積的培養基中生長一段特定時間之巴斯德醋酸桿菌的AHU02菌株之黃嘌呤氧化酶抑制活性之條形圖。
如上述，揭露用於降低一個體的尿酸水平之一種方法，其步驟包括在一培養基中培養醋酸細菌漢氏葡糖酸醋酸桿菌或巴斯德醋酸桿菌，以形成一種組成物。醋酸細菌可選自巴斯德醋酸桿菌的AHU01與AHU02菌株，其等的寄存登錄號分別為DSM 28893與DSM 28894。任擇地，巴斯德醋酸桿菌菌株可為AHU03與AHU04菌株。在一個特定的實施例中，該醋酸細菌為漢氏葡糖酸醋酸桿菌的AHU06菌株，其寄存登錄號為DSM 28902。
培養步驟係在一培養基中進行。培養基可為但不限於M1A培養液、稻米萃取物、高粱萃取物、葡萄汁及梅汁。培養基中不含蘋果汁。在一個特定的實施例中，該方法在培養之後及在投予該組成物之前，係包括從培養基中移除醋酸細菌之一步驟。
該組成物可為一種醋或一種健康飲料。在一個特定的實施例中，該方法包括將組成物冷凍乾燥而形成粉末之一步驟。
在一實施例中，該組成物係以口服方式投藥至個體。在一個特定的實施例中，該個體罹患痛風或高尿酸血症。
所投予的該組成物的量，係有效降低該個體的尿酸水平之一量。例如，嫻熟技藝者可藉由測量該個體的血中尿酸濃度變化，而輕易地判定該有效量。
亦提供用於抑制黃嘌呤氧化酶之一種方法。如上述，該方法需要在一培養基中培養一種醋酸細菌，以形成一種組成物。醋酸細菌可為漢氏葡糖酸醋酸桿菌或巴斯德醋酸桿菌。在一實施例中，醋酸細菌係選自巴斯德醋酸桿菌的AHU01、AHU02、AHU03及AHU04菌株。在另一實施例中，該醋酸細菌為漢氏葡糖酸醋酸桿菌的AHU06菌株。
如上述，培養步驟係在一培養基中進行。培養基可為但不限於M1A培養液、稻米萃取物、高粱萃取物、葡萄汁及梅汁。培養基中不含蘋果汁。在一個特定的實施
例中，該方法在培養之後及在該組成物與黃嘌呤氧化酶接觸之前，係包括從培養基中移除醋酸細菌之一步驟。
在一實施例中，接觸步驟可在試管內進行。例如，可將黃嘌呤氧化酶的一製劑與該組成物一起置於一容器中。在另一實施例中，藉由口服方式將該組成物投藥至具有黃嘌呤氧化酶的一個體，而完成該接觸步驟。
如上述之用於降低一個體的尿酸水平之一種組成物之生產方法，該方法的步驟係包括將一種醋酸細菌接種至一培養基之一步驟。該醋酸細菌為漢氏葡糖酸醋酸桿菌或巴斯德醋酸桿菌。在一實施例中，醋酸細菌係選自巴斯德醋酸桿菌的AHU01、AHU02、AHU03及AHU04菌株。在一個特定的實施例中，該醋酸細菌為漢氏葡糖酸醋酸桿菌的AHU06菌株。
該方法之步驟亦包括在培養基中培養該醋酸細菌，以形成該組成物。培養基可為但不限於M1A培養液、稻米萃取物、高粱萃取物、葡萄汁及梅汁。培養基中不含蘋果汁。
在一個特定的實施例中，該方法在培養之後及在投予該組成物之前，係包括從培養基中移除醋酸細菌之一步驟。在一個較佳的實施例中，在移除步驟之前的醋酸細菌培養密度為1x107至1x108個細胞/毫升。
按此方式所產生的組成物可為一種醋或一種健康飲料。在一個特定的實施例中，該方法包括將組成物冷凍乾燥而形成粉末之一步驟。
揭露用於降低一個體的尿酸水平之一種組成物，其中含有漢氏葡糖酸醋酸桿菌或巴斯德醋酸桿菌的一種代謝產物。如上述，醋酸細菌可選自巴斯德醋酸桿菌的AHU01、AHU02、AHU03及AHU04菌株。在一實施例中，該醋酸細菌為漢氏葡糖酸醋酸桿菌的AHU06菌株。該組成物可為粉末形式。在一實施例中，該組成物亦含有一種食品配料，如添加劑、防腐劑、著色劑及調味劑。在另一實施例中，該組成物包括一種藥學上可接受的賦形劑。在一個特定的實施例中，該組成物係一種食品。
無需進一步詳盡說明，嫻熟技藝者即可根據本申請案的揭露內容，將本發明應用至其最大限度。
因此，應理解下列特定實例僅供說明之用，而非以任何方式侷限揭露內容的其餘部分。
將51株的醋酸細菌菌株分別接種至M1A平皿(2.5%甘露糖醇、0.5%酵母萃取物、0.3%蛋白腖及2%瓊脂)上，及該等平皿於30℃培養2天，以形成菌落。
如下測量黃嘌呤氧化酶抑制活性。首先，從M1A平皿刮取10微升的各菌株，及添加至96孔式平皿的一孔中。然後在各孔中添加150微升的50mM磷酸鹽緩衝型食鹽水(PBS)及80微升的150μM黃嘌呤。在各孔中添加10微升的黃嘌呤氧化酶(0.1單位)之前，測定在290奈米的初始吸光度數值(OD之前)。之後，在25℃培養該平皿30分鐘，再度測
定在290奈米的吸光度數值(OD之後)。依據下列公式計算各試樣的黃嘌呤氧化酶抑制活性：
結果示於圖1。在所檢視之51株不同的醋酸細菌菌株中，僅7株菌株對於黃嘌呤氧化酶的抑制作用超過30%。尤其，巴斯德醋酸桿菌的AHU01菌株對於黃嘌呤氧化酶活性之抑制作用達73.6%。
按照布達佩斯條約之條款，本案申請者於2014年6月5日將巴斯德醋酸桿菌的AHU01與AHU02菌株寄存於德國布倫瑞克D-38124因荷夫街(Inhoffenstr.)7B之國際菌株寄存機構萊布尼茲研究所DSMZ-德國微生物與細胞培養保存中心。巴斯德醋酸桿菌的AHU01與AHU02菌株之登錄號分別為DSM 28893與DSM 28894。本案申請者亦於2014年6月5日將漢氏葡糖酸醋酸桿菌的AHU06菌株寄存於上述儲存庫，及其登錄號為DSM 28902。
將巴斯德醋酸桿菌的AHU02菌株接種在M1A平皿上，及於30℃培養4天。用7毫升的無菌M1A種菌培養液清洗各平皿。將含有細胞的種菌培養液(1毫升)接種至位於250毫升的三角燒瓶中之50毫升的不同培養基中。在125rpm振盪下，接種後的培養基於30℃培養7天。如上述分析各培養基的試樣之黃嘌呤氧化酶抑制作用。結果示於圖
2。
巴斯德醋酸桿菌的AHU02菌株產生最高的黃嘌呤氧化酶抑制活性水平，其抑制作用達到60%。相反地，當巴斯德醋酸桿菌的AHU02菌株在蘋果汁中生長之後，未偵測到對於黃嘌呤氧化酶活性之抑制作用。當巴斯德醋酸桿菌的AHU02菌株在高粱、葡萄汁、稻米萃取物及梅汁中培養時，產生自15%至50%之中等水平的抑制活性。
如上文的例2中所述，製備含有巴斯德醋酸桿菌的AHU02菌株之種菌培養液。種菌培養液係按2%體積/體積添加至位於1公升的三角振盪瓶中之200、300及400毫升的SPS培養基(1%蔗糖、1%蛋白腖、1%大豆蛋白腖及0.2%硝酸鈉)，及在125rpm振盪下，於30℃培養3至10天。如上文的例1中所述，測量黃嘌呤氧化酶抑制作用。結果示於圖3。
相較於在300毫升或400毫升的培養基中生長之巴斯德醋酸桿菌的AHU02菌株，在200毫升的培養體積生長之該菌株在各時間點所產生的黃嘌呤氧化酶抑制活性水平最高。已知培養體積越小，在培養期間的培養加氧作用之效率越高。在不受限於理論之前提下，巴斯德醋酸桿菌很可能需要高的氧氣水平，方能有效率地產生氧化酶抑制活性。
當巴斯德醋酸桿菌的AHU02菌株在200毫升的體
積中培養3天之後，所獲致的黃嘌呤氧化酶抑制活性之水平最高。該水平隨著培養時間之增加而降低，在培養10天之後降低將近65%。在300毫升與400毫升的培養中，觀察到黃嘌呤氧化酶抑制活性亦有隨時間降低之類似現象。
如上文的例2中所述，製備含有巴斯德醋酸桿菌的AHU01菌株之種菌培養液。在一個250毫升的三角燒瓶中，將0.5毫升的種菌培養液接種至50毫升的培養基中，培養基各含有自8%至16%(重量/體積)的不同葡萄糖濃度。除了葡萄糖之外，培養基含有1.5%大豆蛋白腖與3%酵母萃取物。在150rpm振盪之下，該等培養物於30℃培養7天。
依據下列程序，藉由HPLC測量黃嘌呤氧化酶抑制活性。在一個反應試管中，將880微升的黃嘌呤(於100mM PBS中的濃度為50微克/毫升)與40微升的50mM PBS或40微升的培養上清液預先混合，及添加80微升的黃嘌呤氧化酶(0.1單位)而起始反應。在30℃培養該反應30分鐘，之後添加等體積的無水乙酶以終止反應。將終止後的反應過濾通過0.22微米的薄膜過濾器，及藉由HPLC分析該反應中的黃嘌呤含量。如下計算試樣的黃嘌呤氧化酶抑制活性：
結果示於下列表1：
a數值係以培養基中之葡萄糖的重量/體積%示之。
b數值係以對於黃嘌呤氧化酶活性的抑制百分比示之。
在生長培養基的葡萄糖含量與在該培養基中生長之巴斯德醋酸桿菌所產生的黃嘌呤氧化酶活性水平之間，存在明確的相關性。
將巴斯德醋酸桿菌的AHU01菌株接種至一個M1A平皿上，及於30℃培養2天。用7毫升的無菌水清洗該平皿，無菌水係作為種菌培養液。將0.5毫升的種菌培養液接種至位於一個250毫升的三角燒瓶中之50毫升的訂製培養基(1%大豆蛋白腖、0.2%酵母萃取物、3%葡萄糖、0.2%麥芽萃取物及3%果糖)中；及在150rpm振盪下，於30℃培養7天。然後收集培養基，及於3000rpm離心15分鐘。在離心之後，收集上清液，進行冷凍乾燥，而形成一種固態發酵產物及供動物實驗所用。
以ICR小鼠作為實驗動物。使用一種尿酸酶抑制劑即氧嗪酸鉀，在小鼠中引發高血清尿酸水平。讓小鼠
禁食1小時，然後經由餵食管投予食鹽水或氧嗪酸鉀(400毫克/公斤)。1小時之後，對於經氧嗪酸鉀處理的小鼠供給食鹽水、異嘌呤醇(10毫克/公斤)或如上述所製備之巴斯德醋酸桿菌的AHU01菌株發酵產物(對於每隻小鼠投予懸浮於食鹽水中之150毫克或200毫克的發酵產物)。在實驗組與對照組中各使用10隻動物。該等動物在1小時之後犧牲，及分析其等的血清尿酸水平。
結果示於下列表2。
在本說明書中所揭露的所有特性可按任何組合方式進行組合。在本說明書中所揭露的各項特性可由供相同、等效或類似目的所用之替代特性所置換。因而，所揭露的各項特性僅為一通用系列的等效或類似特性中之一實例，除非另有明確說明。
從上述說明，嫻熟技藝者可輕易探明本發明的本質特性，及可進行本發明的各種修改與修飾，使其適合各種用途與條件，而不偏離本發明的精神與範圍。因此，其他實施例亦涵蓋在申請專利範圍內。
國內寄存資訊【請依寄存機構、日期、號碼順序註記】
1.財團法人食品工業發展研究所、民國103年5月30日、BCRC 910632
2.財團法人食品工業發展研究所、民國103年5月30日、BCRC 910633
3.財團法人食品工業發展研究所、民國103年7月3日、BCRC 910638
國外寄存資訊【請依寄存國家、機構、日期、號碼順序註記】
1.德國、DSMZ、2014年6月5日、DSM 28893
2.德國、DSMZ、2014年6月5日、DSM 28894
3.德國、DSMZ、2014年6月5日、DSM 28902
Claims (23)
- 一種用於降低一個體的尿酸水平之方法，該方法包括在一培養基中培養一種醋酸細菌以形成一種組成物，以及對於有需要的一個體投予該組成物，所投予的量係有效降低尿酸水平之一量，其中該醋酸細菌為漢氏葡糖酸醋酸桿菌(Gluconacetobacter hansenii)或巴斯德醋酸桿菌(Acetobacter pasteurianus)。
- 如請求項1之方法，其中該醋酸細菌係選自由寄存登錄號為DSM 28902之漢氏葡糖酸醋酸桿菌的AHU06菌株及寄存登錄號為DSM 28893之巴斯德醋酸桿菌的AHU01菌株、寄存登錄號為DSM 28894之AHU02、AHU03及AHU04所組成之群組。
- 如請求項1之方法，其中該個體罹患痛風或高尿酸血症。
- 如請求項1之方法，其進一步包括在投藥步驟之前，從組成物移除醋酸細菌。
- 如請求項1之方法，其中該組成物係以口服方式投藥。
- 如請求項1之方法，其中該培養基係選自由M1A培養液、稻米萃取物、高粱萃取物、葡萄汁及梅汁所組成之群組。
- 如請求項1之方法，其中該組成物係一種醋或一種健康飲料。
- 如請求項1之方法，其進一步包括將組成物冷凍乾燥以形成粉末。
- 一種用於抑制黃嘌呤氧化酶之方法，該方法包括在一培養基中培養一種醋酸細菌以形成一種組成物，以及將黃嘌呤氧化酶與該組成物接觸，其中該醋酸細菌為漢氏葡糖酸醋酸桿菌或巴斯德醋酸桿菌。
- 如請求項9之方法，其中該醋酸細菌係選自由寄存登錄號為DSM 28902之漢氏葡糖酸醋酸桿菌的AHU06菌株及寄存登錄號為DSM 28893之巴斯德醋酸桿菌的AHU01菌株、寄存登錄號為DSM 28894之AHU02、AHU03及AHU04所組成之群組。
- 如請求項10之方法，其中該接觸步驟係藉由口服方式將該組成物投藥至具有黃嘌呤氧化酶的一個體來完成的。
- 如請求項9之方法，其中該培養基係選自由M1A培養液、稻米萃取物、高粱萃取物、葡萄汁及梅汁所組成之群組。
- 一種用於生產一組成物之方法，其中該組成物係用於降低一個體的尿酸水平，該方法包括在一培養基中接種一種醋酸細菌，及在培養基中培養該醋酸細菌以形成一種組成物，其中該醋酸細菌為漢氏葡糖酸醋酸桿菌或巴斯德醋酸桿菌。
- 如請求項13之方法，其中該醋酸細菌係選自由寄存登錄號為DSM 28902之漢氏葡糖酸醋酸桿菌的AHU06菌株及寄存登錄號為DSM 28893之巴斯德醋酸桿菌的AHU01菌株、寄存登錄號為DSM 28894之AHU02、AHU03及AHU04所組成之群組。
- 如請求項13之方法，其進一步包括從培養中移除醋酸細菌。
- 如請求項13之方法，其中該培養基係選自由M1A培養液、稻米萃取物、高粱萃取物、葡萄汁及梅汁所組成之群組。
- 如請求項13之方法，其中該組成物係一種醋或一種健康飲料。
- 如請求項15之方法，其中在移除步驟之前的培養密度為1x107至1x108個細胞/毫升。
- 一種用於降低一個體的尿酸水平之組成物，該組成物包含一醋酸細菌的一代謝產物，其中該醋酸細菌為漢氏葡糖酸醋酸桿菌或巴斯德醋酸桿菌。
- 如請求項19之組成物，其中醋酸細菌係選自由寄存登錄號為DSM 28902之漢氏葡糖酸醋酸桿菌的AHU06菌株及寄存登錄號為DSM 28893之巴斯德醋酸桿菌的AHU01菌株、寄存登錄號為DSM 28894之AHU02、AHU03及AHU04所組成之群組。
- 如請求項19之組成物，其進一步包含一種食品配料。
- 如請求項19之組成物，其中該組成物係一種食品。
- 如請求項19之組成物，其進一步包含一種藥學上可接受的賦形劑。
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