TW201343610A - ｍＧｌｕ ２／３拮抗劑 - Google Patents

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Abstract

本發明提供一種用於治療神經或精神疾病之新穎mGlu2/3拮抗劑。

Description

mGlu 2/3拮抗劑
本發明係關於一種mGlu2/3拮抗劑，更明確言之係關於一種新穎之4-經取代之雙環[3.1.0]己烷及其前藥、其醫藥組合物及其治療用途。
L-榖胺酸係神經系統中主要的興奮性神經遞質且係稱作興奮性胺基酸。代謝型榖胺酸(mGlu)受體係調節神經元興奮性之G蛋白偶聯受體。神經或精神疾病的治療已涉及選擇性激活mGlu興奮性胺基酸受體。更特定言之，研究表明mGlu2/3拮抗劑具有止痛、抗精神病、抗焦慮、抗抑鬱及神經保護特性。因此，mGlu2/3拮抗劑之此等特性可用於治療神經疾病(例如慢性疼痛症)或精神疾病(例如精神分裂症、雙極症(亦稱作狂躁抑鬱症)、泛焦慮症及創傷後壓力症)。
WO9717952揭示一些據稱係興奮性胺基酸受體拮抗劑之4-經取代之雙環[3.1.0]己烷化合物。
諸多中樞神經系統疾病狀態係與過量榖胺酸激導性能力有關；然而，臨床實踐中缺乏改變該等病理生理狀態之有效藥劑。特定言之，尚未實現臨床應用，因為缺乏具有適當類藥物性質之mGlu2/3拮抗劑。因此，仍需要強力有效之mGlu2/3拮抗劑。本發明提供一種新穎之4-經取代之雙環[3.1.0]己烷及其前藥，其係強力有效之mGlu2/3拮抗劑。本發明範圍內之特定前藥在口服後係經良好吸收且隨後水解 以釋放活性代謝物至體循環中，且因此適用於臨床開發。本發明之該等新穎化合物可解決對強力有效地治療神經疾病(例如慢性疼痛症(包括持續性疼痛、神經性疼痛、慢性炎性疼痛或內臟性疼痛))或精神疾病(例如精神分裂症、雙極症、泛焦慮症或創傷後壓力症)的需求。
本發明提供一種式I化合物或其醫藥上可接受之鹽，
其中R1係氫，R2係氫，且R3係氫；R1係氫，R2係(2S)-2-胺基丙醯基，且R3係氫；R1係氫，R2係(2S)-2-胺基-4-甲硫基-丁醯基，且R3係氫；R1係氫，R2係2-胺基乙醯基，且R3係氫；R1係苄基，R2係氫，且R3係苄基；或R1係(2-氟苯基)甲基，R2係氫，且R3係(2-氟苯基)甲基。
本發明提供(1S,2S,5R,6S)-2-胺基螺[雙環[3.1.0]己烷-4,1'-環丙烷]-2,6-二羧酸或其醫藥上可接受之鹽。
作為一特定實施例，本發明提供(1S,2S,5R,6S)-2-胺基螺[雙環[3.1.0]己烷-4,1'-環丙烷]-2,6-二羧酸。
作為一特定實施例，本發明提供(1S,2S,5R,6S)-2-胺基螺[雙環[3.1.0]己烷-4,1'-環丙烷]-2,6-二羧酸之鹽酸鹽。
本發明提供(1S,2S,5R,6S)-2-[[(2S)-2-胺基丙醯基]胺基]螺[雙環[3.1.0]己烷-4,1'-環丙烷]-2,6-二羧酸或其醫藥上可接受之鹽。
作為一特定實施例，本發明提供(1S,2S,5R,6S)-2-[[(2S)-2-胺基丙醯基]胺基]螺[雙環[3.1.0]己烷-4,1'-環丙烷]-2,6-二羧酸鹽酸鹽。
作為一特定實施例，本發明提供(1S,2S,5R,6S)-2-[[(2S)-2-胺基丙醯基]胺基]螺[雙環[3.1.0]己烷-4,1'-環丙烷]-2,6-二羧酸；1,4-二噁烷(1：0.5)；鹽酸鹽。
本發明提供(1S,2S,5R,6S)-2-[[(2S)-2-胺基-4-甲硫基-丁醯基]胺基]螺[雙環[3.1.0]己烷-4,1'-環丙烷]-2,6-二羧酸或其醫藥上可接受之鹽。
作為一特定實施例，本發明提供(1S,2S,5R,6S)-2-[[(2S)-2-胺基-4-甲硫基-丁醯基]胺基]螺[雙環[3.1.0]己烷-4,1'-環丙烷]-2,6-二羧酸鹽酸鹽。
本發明提供(1S,2S,5R,6S)-2-[(2-胺基乙醯基)胺基]螺[雙環[3.1.0]己烷-4,1'-環丙烷]-2,6-二羧酸或其醫藥上可接受之鹽。
作為一特定實施例，本發明提供(1S,2S,5R,6S)-2-[(2-胺基乙醯基)胺基]螺[雙環[3.1.0]己烷-4,1'-環丙烷]-2,6-二羧酸鹽酸鹽。
本發明提供(1S,2S,5R,6S)-2-胺基螺[雙環[3.1.0]己烷-4,1'-環丙烷]-2,6-二羧酸二苄酯或其醫藥上可接受之鹽。
作為一特定實施例，本發明提供(1S,2S,5R,6S)-2-胺基螺[雙環[3.1.0]己烷-4,1'-環丙烷]-2,6-二羧酸二苄酯；1,4-二噁烷；鹽酸鹽。
本發明提供(1S,2S,5R,6S)-2-胺基螺[雙環[3.1.0]己烷-4,1'-環丙烷]-2,6-二羧酸雙[(2-氟苯基)甲基]酯或其醫藥上可接受之鹽。
作為一特定實施例，本發明提供(1S,2S,5R,6S)-2-胺基螺[雙環[3.1.0]己烷-4,1'-環丙烷]-2,6-二羧酸雙[(2-氟苯基)甲基]酯鹽酸鹽。
本發明提供一種醫藥組合物，其包含(1S,2S,5R,6S)-2-胺基螺[雙環[3.1.0]己烷-4,1'-環丙烷]-2,6-二羧酸或其醫藥上可接受之鹽、(1S,2S,5R,6S)-2-[[(2S)-2-胺基丙醯基]胺基]螺[雙環[3.1.0]己烷-4,1'-環 丙烷]-2,6-二羧酸或其醫藥上可接受之鹽、(1S,2S,5R,6S)-2-[[(2S)-2-胺基-4-甲硫基-丁醯基]胺基]螺[雙環[3.1.0]己烷-4,1'-環丙烷]-2,6-二羧酸或其醫藥上可接受之鹽、(1S,2S,5R,6S)-2-[(2-胺基乙醯基)胺基]螺[雙環[3.1.0]己烷-4,1'-環丙烷]-2,6-二羧酸或其醫藥上可接受之鹽、(1S,2S,5R,6S)-2-胺基螺[雙環[3.1.0]己烷-4,1'-環丙烷]-2,6-二羧酸二苄酯或其醫藥上可接受之鹽或(1S,2S,5R,6S)-2-胺基螺[雙環[3.1.0]己烷-4,1'-環丙烷]-2,6-二羧酸雙[(2-氟苯基)甲基]酯或其醫藥上可接受之鹽及醫藥上可接受之載劑及視需要之其他治療成分。
本發明提供一種醫藥組合物，其包含(1S,2S,5R,6S)-2-胺基螺[雙環[3.1.0]己烷-4,1'-環丙烷]-2,6-二羧酸或其醫藥上可接受之鹽、(1S,2S,5R,6S)-2-[[(2S)-2-胺基丙醯基]胺基]螺[雙環[3.1.0]己烷-4,1'-環丙烷]-2,6-二羧酸或其醫藥上可接受之鹽、(1S,2S,5R,6S)-2-[[(2S)-2-胺基-4-甲硫基-丁醯基]胺基]螺[雙環[3.1.0]己烷-4,1'-環丙烷]-2,6-二羧酸或其醫藥上可接受之鹽、(1S,2S,5R,6S)-2-[(2-胺基乙醯基)胺基]螺[雙環[3.1.0]己烷-4,1'-環丙烷]-2,6-二羧酸或其醫藥上可接受之鹽、(1S,2S,5R,6S)-2-胺基螺[雙環[3.1.0]己烷-4,1'-環丙烷]-2,6-二羧酸二苄酯或其醫藥上可接受之鹽或(1S,2S,5R,6S)-2-胺基螺[雙環[3.1.0]己烷-4,1'-環丙烷]-2,6-二羧酸雙[(2-氟苯基)甲基]酯或其醫藥上可接受之鹽及醫藥上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑。
本發明提供一種治療神經或精神疾病之方法，其包括對有需要之患者投與有效量的(1S,2S,5R,6S)-2-胺基螺[雙環[3.1.0]己烷-4,1'-環丙烷]-2,6-二羧酸或其醫藥上可接受之鹽、(1S,2S,5R,6S)-2-[[(2S)-2-胺基丙醯基]胺基]螺[雙環[3.1.0]己烷-4,1'-環丙烷]-2,6-二羧酸或其醫藥上可接受之鹽、(1S,2S,5R,6S)-2-[[(2S)-2-胺基-4-甲硫基-丁醯基]胺基]螺[雙環[3.1.0]己烷-4,1'-環丙烷]-2,6-二羧酸或其醫藥上可接受之鹽、(1S,2S,5R,6S)-2-[(2-胺基乙醯基)胺基]螺[雙環[3.1.0]己烷-4,1'-環丙 烷]-2,6-二羧酸或其醫藥上可接受之鹽、(1S,2S,5R,6S)-2-胺基螺[雙環[3.1.0]己烷-4,1'-環丙烷]-2,6-二羧酸二苄酯或其醫藥上可接受之鹽、或(1S,2S,5R,6S)-2-胺基螺[雙環[3.1.0]己烷-4,1'-環丙烷]-2,6-二羧酸雙[(2-氟苯基)甲基]酯或其醫藥上可接受之鹽。
本發明提供一種(1S,2S,5R,6S)-2-胺基螺[雙環[3.1.0]己烷-4,1'-環丙烷]-2,6-二羧酸或其醫藥上可接受之鹽、(1S,2S,5R,6S)-2-[[(2S)-2-胺基丙醯基]胺基]螺[雙環[3.1.0]己烷-4,1'-環丙烷]-2,6-二羧酸或其醫藥上可接受之鹽、(1S,2S,5R,6S)-2-[[(2S)-2-胺基-4-甲硫基-丁醯基]胺基]螺[雙環[3.1.0]己烷-4,1'-環丙烷]-2,6-二羧酸或其醫藥上可接受之鹽、(1S,2S,5R,6S)-2-[(2-胺基乙醯基)胺基]螺[雙環[3.1.0]己烷-4,1'-環丙烷]-2,6-二羧酸或其醫藥上可接受之鹽、(1S,2S,5R,6S)-2-胺基螺[雙環[3.1.0]己烷-4,1'-環丙烷]-2,6-二羧酸二苄酯或其醫藥上可接受之鹽或(1S,2S,5R,6S)-2-胺基螺[雙環[3.1.0]己烷-4,1'-環丙烷]-2,6-二羧酸雙[(2-氟苯基)甲基]酯或其醫藥上可接受之鹽於製造用於治療神經或精神疾病之藥物之用途。
本發明提供一種用於治療之(1S,2S,5R,6S)-2-胺基螺[雙環[3.1.0]己烷-4,1'-環丙烷]-2,6-二羧酸或其醫藥上可接受之鹽、(1S,2S,5R,6S)-2-[[(2S)-2-胺基丙醯基]胺基]螺[雙環[3.1.0]己烷-4,1'-環丙烷]-2,6-二羧酸或其醫藥上可接受之鹽、(1S,2S,5R,6S)-2-[[(2S)-2-胺基-4-甲硫基-丁醯基]胺基]螺[雙環[3.1.0]己烷-4,1'-環丙烷]-2,6-二羧酸或其醫藥上可接受之鹽、(1S,2S,5R,6S)-2-[(2-胺基乙醯基)胺基]螺[雙環[3.1.0]己烷-4,1'-環丙烷]-2,6-二羧酸或其醫藥上可接受之鹽、(1S,2S,5R,6S)-2-胺基螺[雙環[3.1.0]己烷-4,1'-環丙烷]-2,6-二羧酸二苄酯或其醫藥上可接受之鹽或(1S,2S,5R,6S)-2-胺基螺[雙環[3.1.0]己烷-4,1'-環丙烷]-2,6-二羧酸雙[(2-氟苯基)甲基]酯或其醫藥上可接受之鹽。本發明亦提供一種用於治療神經或精神疾病之(1S,2S,5R,6S)-2-胺基螺[雙環[3.1.0] 己烷-4,1'-環丙烷]-2,6-二羧酸或其醫藥上可接受之鹽、(1S,2S,5R,6S)-2-[[(2S)-2-胺基丙醯基]胺基]螺[雙環[3.1.0]己烷-4,1'-環丙烷]-2,6-二羧酸或其醫藥上可接受之鹽、(1S,2S,5R,6S)-2-[[(2S)-2-胺基-4-甲硫基-丁醯基]胺基]螺[雙環[3.1.0]己烷-4,1'-環丙烷]-2,6-二羧酸或其醫藥上可接受之鹽、(1S,2S,5R,6S)-2-[(2-胺基乙醯基)胺基]螺[雙環[3.1.0]己烷-4,1'-環丙烷]-2,6-二羧酸或其醫藥上可接受之鹽、(1S,2S,5R,6S)-2-胺基螺[雙環[3.1.0]己烷-4,1'-環丙烷]-2,6-二羧酸二苄酯或其醫藥上可接受之鹽或(1S,2S,5R,6S)-2-胺基螺[雙環[3.1.0]己烷-4,1'-環丙烷]-2,6-二羧酸雙[(2-氟苯基)甲基]酯或其醫藥上可接受之鹽。
另外，本發明提供如文中所述之方法及用途之較佳實施例，其中該神經疾病係選自由持續性疼痛、神經性疼痛、慢性炎性疼痛及內臟性疼痛組成之群，且該精神疾病係選自由精神分裂症、雙極症、泛焦慮症及創傷後壓力症組成之群。
如上文中所使用且在整個本發明描述中，除非另有指示，否則以下術語應被理解為具有以下定義：「本發明化合物」包括前藥、活性化合物及/或活性代謝物。「前藥」係一種最初呈非活性形式且在人體中藉由正常代謝過程轉化成活性形式之藥物，其中式I中R1、R2及R3中之至少一者係非氫(例如，R1係氫，R2係(2S)-2-胺基丙醯基且R3係氫；R1係氫，R2係(2S)-2-胺基-4-甲硫基-丁醯基且R3係氫；R1係氫，R2係2-胺基乙醯基且R3係氫；R1係苄基，R2係氫且R3係苄基；或R1係(2-氟苯基)甲基，R2係氫且R3係(2-氟苯基)甲基)。「活性化合物」或「活性物」係對人體投與(例如，靜脈內或腹膜內投與)之活性形式之另一名稱，其中式I中之R1、R2及R3係氫。「活性代謝物」係由該前藥在人體中藉由正常代謝過程轉化所形成之活性形式之另一名稱，其中式I中之R1、R2及R3係氫。
「醫藥上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑」係此項技術中一般 接受之用於將生物活性劑遞送至哺乳動物(例如人)之介質。
「醫藥上可接受之鹽」係指本發明化合物之相對非毒性無機及有機鹽。
「治療上有效量」或「有效量」意指將引起研究者、獸醫、醫學博士或其他醫師所研究的組織、系統、動物、哺乳動物或人之生物或醫療反應或對其產生所需治療效應的本發明化合物或其醫藥上可接受之鹽或包含本發明化合物或其醫藥上接受之鹽之醫藥組合物之用量。
術語「治療」及類似術語意指包括減緩疾病之進展或使其好轉。此等術語亦包括緩解、改善、消除或減少疾病或病症中之一或多種症狀，即使該疾病或病症未被完全消除且即使該疾病或病症之進展本身未減緩或逆轉。
在本發明中所使用之標準命名法下，首先描述指定側鏈之末端部分，接著描述靠近鍵接點之相鄰官能基。例如，甲磺醯基取代基係相當於CH3-SO2-。
本發明化合物可與(例如)諸多無機及有機酸反應以形成醫藥上可接受之酸加成鹽或鹼加成鹽。該等醫藥上可接受之鹽及其等常見製備方法係此項技術中所熟知。參見(例如)P. Stahl等人，HANDBOOK OF PHARMACEUTICAL SALTS：PROPERTIES,SELECTION AND USE,(VCHA/Wiley-VCH,2002)；S.M. Berge等人，「Pharmaceutical Salts」，Journal of Pharmaceutical Sciences，第66卷，第1期，1977年1月。
本發明化合物較佳係使用醫藥上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑調配成醫藥組合物並藉由各種途徑投與。較佳地，該等組合物係用於口服或靜脈內投與。該等醫藥組合物及其製備方法係此項技術中所熟知。參見(例如)Remington：The Science and Practice of Pharmacy (A.Gernaro等人編輯，第21版，Mack Publishing Co.,2005)。
內科醫生將根據相關情況(包括欲治療之病症、所選投與途徑、所投與之本發明實際化合物、個體患者之年齡、體重及反應及患者症狀之嚴重度)確定實際投與之本發明化合物。日劑量通常在約0.1至約300mg的範圍內。在一些實例中，低於前述範圍下限之劑量水準可係足夠高，而在其他情況中，可使用更大劑量。
可藉由此項技術中已知之各種製程及彼等下文製法及實例中所述之方法來製備本發明化合物或其醫藥上可接受之鹽。可將所述各途徑之具體合成步驟以不同方式組合來製備本發明化合物或其醫藥上可接受之鹽。
除非另有指示，否則該等取代基係如先前所定義。一般技術者通常可容易獲得該等反應物及初始材料。其他反應物及材料可藉由有機及雜環化學之標準技術、類似於已知結構類似活性化合物及前藥之合成法之技術及以下製法及實例中所述之製程(包括任何新穎製程)製得。使用Symyx Draw 3.1完成以下製法及實例之命名。
如文中所使用，以下術語具有指定定義：「HPLC」係指高壓液體層析；「LC」係指液體層析；「MS(ES+)」係指使用電噴霧電離之質譜分析；「MS」係指質譜分析；「SFC」係指超臨界流體層析；「NMR」係指核磁共振；「TLC」係指薄層層析；「RT」係指滯留時間；「UV」係指紫外線；「EDTA」係指乙二胺四乙酸；「PBS」係指磷酸鹽緩衝鹽水；「PCR」係指聚合酶鏈式反應；「SCX」係指強陽離子交換及「HLB」係指親水親脂平衡。
製法1 (1S,2S,5R,6S)-2-(第三丁氧羰基胺基)-4-亞甲基-雙環[3.1.0]己烷-2,6-二羧酸二第三丁酯
將溴化甲基三苯基鏻(5.41g，14.9mmol)及四氫呋喃(93mL)添加至經烘箱乾燥之250mL圓底燒瓶中。使該懸浮液冷卻至0℃並滴加雙(三甲基矽烷基)醯胺鈉之1M四氫呋喃溶液(16.08mL，16.08mmol)。於0℃下攪拌所得之明黃色混合物20分鐘，接著添加含於四氫呋喃(31mL)中之(1S,2S,5R,6R)-2-(第三丁氧羰基胺基)-4-側氧基-雙環[3.1.0]己烷-2,6-二羧酸二第三丁酯(5.09g，12.4mmol，參見WO03/104217/A2中之合成細節)之溶液。使該反應升溫至室溫並攪拌16小時。將該混合物分配於乙酸乙酯(500mL)與水(350mL)之間。棄除水相並用鹽水(200mL)沖洗有機相。使該有機相於硫酸鎂上乾燥，過濾並於減壓下濃縮。藉由使用乙酸乙酯：異己烷(5：95至20：80)洗脫之急驟層析法進行純化，以產生呈白色固體之標題化合物(4.84g，11.2mmol)。1H NMR(CDCl3)δ 1.45(m,27H),1.87(t,J=2.9Hz,1H),1.98(m,1H),2.43(m,2H),3.07(br m,1H),4.86(br s,1H),5.03(d,J=2Hz,1H),5.1-5.3(br s,1H)。
製法2 (1S,2S,5R,6S)-2-(第三丁氧羰基胺基)螺[雙環[3.1.0]己烷-4,1'-環丙烷]-2,6-二羧酸二第三丁酯
藉由對Aldrich微型Diazald裝置之指形冷凍器添加乾冰(cardice)及異丙醇(填充至三分之一)，製備含於乙醚中之重氮甲烷之無乙醇溶液。將含於水(1.5mL)中之氫氧化鉀(740mg，13.2mmol)之溶液置於該裝置之反應部分中。將二乙二醇單乙醚(4mL)及乙醚(2.4mL)之混合物添加至此溶液中。使N-甲基-N'-硝基-N-亞硝基胍(1g，6.8mmol)溶解於乙醚(13mL)及二乙二醇單乙醚(4mL)之混合物中。將此溶液放置於具有光滑玻璃接頭且適配於該微型Diazald裝置之滴液漏斗中。使該氫氧化鉀溶液於維持在70℃的水浴中升溫，以確保該收集燒瓶及該裝置出口處之填充有乙醚之發泡器均於乾冰/異丙醇浴中冷卻。使該N-甲基-N'-硝基-N-亞硝基胍溶液以等於所得蒸餾之速率添加。當蒸餾完成時，經由該滴液漏斗滴加額外的乙醚直至該指形冷凍器上之冷凝物變為無色。將所得溶液儲存於乾冰/異丙醇浴中直至需要時。使乙酸鈀(17.2mg；76.5μmol)懸浮於乙醚(10mL)中。傾析並過濾所得之淡棕色溶液並小心加至已達到室溫之含(1S,2S,5R,6S)-2-(第三丁氧羰基胺基)-4-亞甲基-雙環[3.1.0]己烷-2,6-二羧酸二第三丁酯(330mg，765.5μmol)及乙醚(10mL)之重氮甲烷溶液混合物中。當氣體停止逸出時，過濾所得懸浮液並於減壓下濃縮以產生260mg未反應之(1S,2S,5R,6S)-2-(第三丁氧羰基胺基)-4-亞甲基-雙環[3.1.0]己烷-2,6-二羧酸二第三丁酯及標題化合物之混合物。
自含於水(4mL)、二乙二醇單乙醚(14mL)及乙醚(8mL)中之氫氧化鉀(2.5g，44.6mmol)的溶液及含於乙醚(30mL)及二乙二醇單乙醚(15mL)之混合物中之N-甲基-N'-硝基-N-亞硝基胍(4g，27.2mmol)製備含於乙醚中之重氮甲烷之無乙醇溶液。提取所得重氮甲烷溶液並歷時30分鐘將其分批添加至含於先前製得之未反應(1S,2S,5R,6S)-2-(第三丁氧羰基胺基)-4-亞甲基-雙環[3.1.0]己烷-2,6-二羧酸二第三丁酯及標題化合物之混合物(260mg)之乙醚(3mL)溶液中之乙酸鈀(20mg, 89.1μmol)的懸浮液中。當氣體停止逸出時，使其靜置過夜，隨後藉由相分離器玻璃料過濾並於減壓下濃縮以產生深色油。藉由使用乙酸乙酯：異己烷(0：100至75：25)洗脫之急驟層析法進行純化，以產生185mg未反應之(1S,2S,5R,6S)-2-(第三丁氧羰基胺基)-4-亞甲基-雙環[3.1.0]己烷-2,6-二羧酸二第三丁酯及標題化合物之混合物。
自含於水(5mL)、二乙二醇單乙醚(4mL)及乙醚(10mL)中之氫氧化鉀(3.2g，57mmol)的溶液及含於乙醚(35mL)及二乙二醇單乙醚(15mL)之混合物中之N-甲基-N'-硝基-N-亞硝基胍(5g，34mmol)製備含於乙醚中之重氮甲烷之無乙醇溶液。提取所得重氮甲烷溶液並歷時60分鐘將其分批添加至含於先前製得之未反應(1S,2S,5R,6S)-2-(第三丁氧羰基胺基)-4-亞甲基-雙環[3.1.0]己烷-2,6-二羧酸二第三丁酯及標題化合物之混合物(185mg)之乙醚(2mL)溶液中之乙酸鈀(20mg,89.1μmol)的懸浮液中。當氣體停止逸出時，使其靜置30分鐘，過濾並於減壓下濃縮以產生黃色油。藉由質量導向型HPLC(RT=6.4分鐘(UV)，6.37分鐘(MS)；LC管柱：Waters XBridgeTM 30mm x 100mm 5μm；水/0.1%甲酸；梯度：28-62%乙腈/0.1%甲酸，持續1.35分鐘，隨後62-95%，持續6.65分鐘，隨後於95%下持續3.55分鐘。管柱溫度：周圍溫度；流速：45mL/分鐘)進行純化以產生呈無色油之標題化合物(55.3mg，130.6μmol)。MS(m/z)：446(M+23)。
製法3 (1S,2S,5R,6R)-2-胺基-4-側氧基-雙環[3.1.0]己烷-2,6-二羧酸二乙酯
將含於乙醇(365mL)中之(1S,2S,5R,6R)-2-(第三丁氧羰基胺基)-4- 側氧基-雙環[3.1.0]己烷-2,6-二羧酸二第三丁酯(15g，36.4mmol)添加至配備有冷凝器、氮入口及溫度計之500mL三頸燒瓶中。經由針筒將亞硫醯氯(13.3mL，182.3mmol)添加至室溫下之攪拌溶液中(少量放熱)，隨後加熱至回流。24小時後，使該反應冷卻至室溫並於真空中濃縮。將殘餘物溶解於二氯甲烷(50mL)中，隨後於旋轉蒸發器上濃縮(重複3次)。將該殘餘物分配於乙酸乙酯(200mL)及飽和碳酸氫鈉(150mL)之間。用鹽水(150mL)沖洗有機相，於硫酸鈉上乾燥，過濾，且隨後濃縮至乾，以獲得呈油形式之標題化合物(8.24g，32.3mmol)。MS(m/z)：256(M+1)。
製法4 (1S,2S,5R,6R)-2-乙醯胺基-4-側氧基-雙環[3.1.0]己烷-2,6-二羧酸二乙酯
於室溫下，將乙酸酐(5mL，50.8mmol)添加至含於無水二氯甲烷(72mL)中之(1S,2S,5R,6R)-2-胺基-4-側氧基-雙環[3.1.0]己烷-2,6-二羧酸二乙酯(7.2g，28.2mmol)及三乙胺(7.9mL，56.4mmol)之攪拌溶液中。2小時後，用水(100mL)中止反應並強力攪拌20分鐘。藉由疏水性玻璃料分離二氯甲烷層並蒸發獲得淺棕色油(9.6g)。藉由使用乙酸乙酯：異己烷(70：30至90：10)洗脫之急驟層析法進行純化，以獲得呈在乾燥時發泡之淺黃色玻璃之標題化合物(6.53g，22mmol)。MS(m/z)：298(M+1)，320(M+23)，617(2M+23)。
製法5 (1S,2S,5R,6S)-2-乙醯胺基-4-亞甲基-雙環[3.1.0]己烷-2,6-二羧酸二乙酯
將溴化(甲基)三苯基鏻(9.72g，26.7mmol)及無水四氫呋喃(122mL)添加至經烘箱乾燥之250mL圓底燒瓶中。使該懸浮液冷卻至0至-5℃並用雙(三甲基矽烷基)醯胺鈉之2M四氫呋喃溶液(13.3mL，26.7mmol)逐滴處理。將所得明黃色混合物於0℃下攪拌20分鐘，隨後用(1S,2S,5R,6R)-2-乙醯胺基-4-側氧基-雙環[3.1.0]己烷-2,6-二羧酸二乙酯(6.1g，20.5mmol)之四氫呋喃(30mL)溶液處理。使該反應歷時3小時緩慢升溫至室溫。於室溫下攪拌20小時後，使用冰水(200mL)中止反應並用乙酸乙酯(200mL)萃取。使用水(100mL)、鹽水(100mL)沖洗萃取物，乾燥，過濾並蒸發以獲得深棕色油。添加乙醚(70mL)及異己烷(20mL)並將氧化三苯基膦接種至該溶液中。靜置2小時，傾析該溶液，添加矽石並於真空下濃縮。藉由使用乙酸乙酯：異己烷(60：40至80：20)洗脫之急驟層析法進行純化，以獲得受三苯基氧化膦污染之粉紅色油(6.81g)。藉由使用乙酸乙酯：異己烷(60：40)洗脫之急驟層析法再純化，以獲得呈黏性黃色油之標題化合物(3.98g，13.5mmol)。MS(m/z)：296(M+1)，318(M+23)，613(2M+23)。
製法6 (1S,2S,5R,6S)-2-乙醯胺基螺[雙環[3.1.0]己烷-4,1'-環丙烷]-2,6-二羧酸二乙酯
於氮氣下，將含於二氯甲烷(12.5mL)中之三氟乙酸(1.9mL，25 mmol)之溶液極緩慢地滴加至含於二氯甲烷(12.5mL)中之二乙基鋅(1M庚烷溶液)(25mL，25mmol)之冷卻(冰浴)攪拌溶液中。10分鐘後，添加含於二氯甲烷(12.5mL)中之二碘甲烷(2.01mL，25mmol)之溶液。10分鐘後，添加含於二氯甲烷(12.5mL)中之(1S,2S,5R,6S)-2-乙醯胺基-4-亞甲基-雙環[3.1.0]己烷-2,6-二羧酸二乙酯(2.46g，8.3mmol)之溶液。60分鐘後，移除該冰浴並於室溫下攪拌該反應混合物過夜。藉由於強力攪拌下將該反應混合物滴加至0.2M鹽酸水溶液(200mL)中，使該澄清反應溶液中止反應。1小時後，分離二氯甲烷層，用鹽水沖洗，於硫酸鎂上乾燥，過濾並於真空中濃縮，以產生受未反應初始材料污染之所需產物(4.4g)。藉由使用乙酸乙酯：環己烷(50：50至100：0)洗脫之急驟層析法進行純化，以獲得無色油(3.1g)。藉由SFC(RT=2.48分鐘(UV，200nm)；HPLC管柱：AD-H 30mm x 250mm 5μm；CO2梯度：5%異丙醇/0.2%二甲基乙胺，持續0.5分鐘，隨後5%-27%，持續2.2分鐘。管柱溫度：35℃；壓力：100000kPa；流速：210mL/分鐘)進行純化，以產生未反應之(1S,2S,5R,6S)-2-乙醯胺基-4-亞甲基-雙環[3.1.0]己烷-2,6-二羧酸二乙酯(580mg，2.0mmol)及標題化合物(1.82g,5.9mmol)。MS(m/z)：310(M+1)，332(M+23)。
製法7 (1S,2S,5R,6S)-2-胺基-4-亞甲基-雙環[3.1.0]己烷-2,6-二羧酸二乙酯
方法1：
藉由將氯化三甲基矽烷(13.8mL，108mmol)滴加至乙醇(110mL)中製備氯化氫之約1M乙醇溶液。將(1S,2S,5R,6S)-2-(第三丁氧羰基胺 基)-4-亞甲基-雙環[3.1.0]己烷-2,6-二羧酸二第三丁酯(7.4g，18.1mmol)溶解於此酸溶液中並加熱至60℃(持續16小時)。蒸發以獲得黏性黃色油，將其再溶解於水(50mL)中，並過濾該渾濁溶液以移除微量不溶物。使用碳酸氫鈉(8.4g，0.1mol)中和該酸性水溶液並用二氯甲烷(2 x 100mL)萃取。藉由疏水性玻璃料乾燥合併之二氯甲烷溶液並蒸發至淺黃色液體(4.14g)。藉由於胺基鍵合矽石上層析(用乙酸乙酯：異己烷(20：80至80：20)洗脫)進行純化，以獲得無色液體(3.6g)。藉由於胺基鍵合矽石上層析(用乙酸乙酯：異己烷(20：80)洗脫)進行再純化，以獲得標題產物之無色液體(2.81g，61%)。MS(m/z)：254(M+1)。
方法2：
使對甲苯磺酸單水合物(6.97g，36.6mmol)於50℃的真空中乾燥3天。將其添加至含於乙醇(35.5mL)中之(1S,2S,5R,6S)-2-(第三丁氧羰基胺基)-4-亞甲基-雙環[3.1.0]己烷-2,6-二羧酸二第三丁酯(5.0g，12.2mmol)之攪拌溶液中並加熱至60℃(持續3天)。於減壓下移除溶劑以獲得殘餘物。將該殘餘物溶於水(100mL)中，使用碳酸氫鈉使其鹼化並用二氯甲烷(3 x 100mL)萃取。使該等萃取物於硫酸鈉上乾燥，過濾且隨後於減壓下濃縮，以獲得標題化合物之橙色殘餘物(1.52g，51%)。MS(m/z)：254(M+1)。
製法8 (1S,2S,5R,6S)-2-(9H-茀-9-基甲氧羰基胺基)-4-亞甲基-雙環[3.1.0]己烷-2,6-二羧酸二乙酯
將固體氯甲酸9-茀基甲酯(3.15g，12.2mmol)歷時5分鐘分批添加至冷卻至0-5℃之含於四氫呋喃(28mL)及水(8.4mL)中之(1S,2S,5R,6S)-2-胺基-4-亞甲基-雙環[3.1.0]己烷-2,6-二羧酸二乙酯(2.8g，11.1mmol)及碳酸氫鈉(2.04g，24.3mmol)之攪拌溶液中。1小時後，添加水(10mL)並用乙酸乙酯(50mL)萃取。使用鹽水溶液(20mL)沖洗該萃取物，乾燥，過濾並蒸發至淺黃色油(6.5g)。藉由使用乙酸乙酯：異己烷(10：90至20：80)洗脫之急驟層析法進行純化，以獲得黏性無色油(4.58g)。藉由使用乙酸乙酯：異己烷(20：80)洗脫之急驟層析法進行再純化，以獲得標題化合物之白色半固體發泡體(4.22g，80%)。MS(m/z)：476(M+1)。
製法9 (1S,2S,5R,6S)-2-(9H-茀-9-基甲氧羰基胺基)螺[雙環[3.1.0]己烷-4,1'-環丙烷]-2,6-二羧酸二乙酯
於氮氣下，將三氟乙酸(2.66g，23.3mmol)之二氯甲烷(11.7mL)溶液歷時5分鐘滴加至冷卻至0-5℃的含於二氯甲烷(11.7mL)中之二乙基鋅(1M庚烷溶液)(23.3mL,23.3mmol)之攪拌溶液中(放熱反應)。10 分鐘後，添加含於二氯甲烷(11.7mL)中之二碘甲烷(6.25g，23.3mmol)之溶液。10分鐘後，添加含於二氯甲烷(11.7mL)中之(1S,2S,5R,6S)-2-(9H-茀-9-基甲氧羰基胺基)-4-亞甲基-雙環[3.1.0]己烷-2,6-二羧酸二乙酯(3.70g，7.8mmol)之溶液。於0℃下持續2小時後，使其升溫至室溫並攪拌16小時。使用0.5M冷鹽酸(50mL)及二氯甲烷(20mL)使該反應混合物中止反應並強力攪拌。藉由疏水性玻璃料分離二氯甲烷層且隨後蒸發至淺黃色油。藉由使用乙酸乙酯：異己烷(10：90至20：80)洗脫之急驟層析法進行純化，以獲得無色油(3.49g)。藉由使用乙酸乙酯：異己烷(20：80)洗脫之急驟層析法進行再純化，提取中心餾分，以獲得標題化合物之無色發泡體(2.12g，56%)。MS(m/z)：490(M+1)。藉由重複層析法自次純餾分獲得第二批產物(363mg，額外9%)。
製法10 (1S,2S,5R,6R)-2-苄氧羰基胺基-4-側氧基-雙環[3.1.0]己烷-2,6-二羧酸二乙酯
方法1：
將二碳酸二苄酯(18.6mL，76.1mmol)添加至含於二氯甲烷(500mL)中之(1S,2S,5R,6R)-2-胺基-4-側氧基-雙環[3.1.0]己烷-2,6-二羧酸二乙酯(16.2g，63.5mmol)之溶液中，隨後滴加三乙胺(10.6mL，76.1mmol)。攪拌該反應混合物30分鐘，接著用1N鹽酸(200mL)沖洗。使用鹽水沖洗二氯甲烷相，分離並於真空中濃縮。藉由使用乙酸 乙酯：異己烷(0：100至75：25)洗脫之急驟層析法進行純化，以產生標題化合物(11.6g，47%)。MS(m/z)：388(M+1)，410(M+23)。
方法2：
將(1S,2S,5R,6R)-2-胺基-4-側氧基-雙環[3.1.0]己烷-2,6-二羧酸二乙酯鹽酸鹽(226.86g，777.65mmol)、水(1.13L)及四氫呋喃(1.13L)添加至圓底燒瓶中。分5批緩慢添加碳酸氫鈉(143.72g，1.71mol)(觀察到CO2逸出且內部溫度自31℃降低至25℃)。隨後，添加含於四氫呋喃(226.9mL)中之氯甲酸苄酯(120.6mL，855.42mmol)之溶液並使內部溫度維持低於28℃(10分鐘)並於25℃下攪拌該反應1小時。將該混合物倒入甲基第三丁基醚(1.25L)中。分離各層，用乙酸乙酯(750ml)萃取水相並棄除該水相。用鹽水沖洗該混合物，於硫酸鎂上乾燥，過濾並濃縮至乾，以獲得標題化合物之無色油(302.82g，777.65mmol)。MS(m/z)：388(M+1)。
製法11 (1S,2S,5R,6S)-2-苄氧羰基胺基-4-亞甲基-雙環[3.1.0]己烷-2,6-二羧酸二乙酯
方法1：
將溴化(甲基)三苯基鏻(15.4g，43.1mmol)及無水四氫呋喃(112mL)添加至經烘箱乾燥之500mL圓底燒瓶中。使該懸浮液冷卻至0至-5℃並用雙(三甲基矽烷基)醯胺鈉之2M四氫呋喃溶液(23mL，46mmol)逐滴處理。將所得明黃色懸浮液於0℃下攪拌30分鐘，隨後用 含於四氫呋喃(22.4mL)中之(1S,2S,5R,6R)-2-苄氧羰基胺基-4-側氧基-雙環[3.1.0]己烷-2,6-二羧酸二乙酯(11.2g，28.8mmol)之溶液處理。使該反應緩慢升溫至室溫。4小時後，使用冰(120g)、鹽水(120mL)中止該反應並用乙酸乙酯(250mL)萃取。使用鹽水(2 x 100mL)沖洗該等萃取物，乾燥，過濾並蒸發至紅色油。將其再溶解於乙醚(100mL)中並分批緩慢添加異己烷(80mL)以沉澱呈紅色半固體之氧化三苯基膦(5.2g)。使用無水矽石(~50g)處理該溶液並濃縮至乾。藉由使用乙酸乙酯：異己烷(20：80)洗脫之急驟層析法進行純化，以獲得呈無色黏性油之標題化合物(7.37g，66%)。MS(m/z)：388(M+1)，410(M+23)。
方法2：
於室溫下，將第三丁醇鉀(104.72g，933.18mmol)添加至含於四氫呋喃(1.82L)中之溴化(甲基)三苯基鏻(340.16g，933.18mmol)之懸浮液中(內部溫度不變)。隨後添加含於四氫呋喃(1.82L)中之(1S,2S,5R,6R)-2-苄氧羰基胺基-4-側氧基-雙環[3.1.0]己烷-2,6-二羧酸二乙酯(302.82g，777.65mmol)之溶液並使溫度維持在24℃。於50℃下攪拌該混合物3小時。使用乙酸乙酯(1.5L)稀釋該反應，用水(2 x 3L)及鹽水沖洗。於硫酸鎂上乾燥該有機相，過濾並濃縮，以獲得深棕色油。藉由使用乙酸乙酯：己烷(9：1)洗脫之急驟層析法進行純化，以獲得標題化合物之無色油(183.35g，473.25mmol)。MS(m/z)：388(M+1)，410(M+23)。
製法12 (1S,2S,5R,6S)-2-苄氧羰基胺基螺[雙環[3.1.0]己烷-4,1'-環丙烷]-2,6-二羧酸二乙酯
方法1：
於氮氣下，將含於二氯甲烷(14.6mL)中之二乙基鋅(1M庚烷溶液，64.1mL，64.1mmol)之溶液歷時10分鐘緩慢滴加至冷卻至0-5℃之含於二氯甲烷(73mL)中之三氟乙酸(4.27mL，56.5mmol)的攪拌溶液中。10分鐘後，添加含於二氯甲烷(14.6mL)中之二碘甲烷(4.6mL，56.5mmol)之溶液。10分鐘後，添加含於二氯甲烷(14.6mL)中之(1S,2S,5R,6S)-2-苄氧羰基胺基-4-亞甲基-雙環[3.1.0]己烷-2,6-二羧酸二乙酯(7.3g，18.8mmol)之溶液。1小時後，移除冰浴並於室溫下攪拌該渾濁溶液20小時。24小時後，使用冰冷0.5M鹽酸水溶液(160mL，80mmol)及二氯甲烷(200mL)使該反應混合物中止反應，並強力攪拌該混合物。分離二氯甲烷層，該二氯甲烷相隨後過濾通過2次疏水性玻璃料而乾燥。蒸發至淺黃色油，其過夜後轉變成棕色。藉由使用乙酸乙酯：異己烷(20：80)洗脫之急驟層析法進行純化，以獲得標題化合物與未反應之(1S,2S,5R,6S)-2-苄氧羰基胺基-4-亞甲基-雙環[3.1.0]己烷-2,6-二羧酸二乙酯之無色油狀混合物(5.1g)。
於氮氣下，將含於二氯甲烷(10mL)中之三氟乙酸(2.93mL，38.7mmol)之溶液歷時10分鐘緩慢滴加至冷卻至0-5℃之含於二氯甲烷(50mL)中之二乙基鋅(1M庚烷溶液，38.7mL，38.7mmol)的攪拌溶液中。10分鐘後，將含於二氯甲烷(10mL)中之二碘甲烷(3.12mL，38.7mmol)之溶液添加至該反應混合物中。10分鐘後，添加含於二氯甲烷(10mL)中之烯烴及(1S,2S,5R,6S)-2-苄氧羰基胺基螺[雙環[3.1.0]己烷- 4,1'-環丙烷]-2,6-二羧酸二乙酯(5g，12.9mmol)之混合物之溶液。1小時後，移除冰浴並於室溫下攪拌該渾濁溶液16小時。20小時後，使用冰冷0.5M氯化氫(140mL，70mmol)及二氯甲烷(160mL)使該反應混合物中止反應並強力攪拌該混合物。使用0.5M鹽酸水溶液(100mL)沖洗該二氯甲烷層，於硫酸鈉上乾燥且隨後過濾通過2次疏水性玻璃料。蒸發成淺黃色油(5.89g)。藉由使用乙酸乙酯：異己烷(15：85至25：75)洗脫之急驟層析法進行純化，以獲得受少量反應物污染之標題化合物之無色油(4.28g)。
將其再溶解於丙酮(40mL)、水(20mL)、碳酸氫鈉(0.54g，6.45mmol)及硫酸鎂(0.78g，6.45mmol)中。冷卻至0℃並添加高錳酸鉀(0.2g，1.29mmol)，以獲得亮紫色混合物。於室溫下保持3小時後，使用固體五水合硫代硫酸鈉(0.32g，1.29mmol)中止反應並使該懸浮液過濾通過矽藻土墊，並使用丙酮沖洗。蒸發至少量體積，用水(20mL)稀釋並用乙酸乙酯(60mL)萃取。使用鹽水沖洗該等萃取物，乾燥，過濾並蒸發成油。藉由使用乙酸乙酯：異己烷(15：85至25：75)洗脫之急驟層析法進行純化，以獲得標題化合物之無色油(3.62g，70%)。MS(m/z)：402(M+1)。
方法2：
將二乙基鋅之1M庚烷溶液(1.6L，1.6mol)經由套管添加至0℃(浴溫-5℃)之二氯甲烷(870.9mL)中，隨後緩慢添加含於二氯甲烷(870.9mL)中之三氟乙酸(121.02mL，1.6mol)之溶液並使溫度維持低於3℃。在添加後1小時，攪拌該混合物5分鐘，隨後一次性添加二碘甲烷(130.3mL，1.6mol)並攪拌15分鐘。歷時10分鐘添加含於二氯甲烷(348.4mL)中之(1S,2S,5R,6S)-2-苄氧羰基胺基-4-亞甲基-雙環[3.1.0]己烷-2,6-二羧酸二乙酯(183.35g，449.58mmol)之溶液並於室溫下攪拌該混合物過夜。冷卻至0℃，使用0.5M鹽酸(1.5L)中止反應並強力 攪拌該混合物。分離該有機層，用鹽水沖洗並濃縮至乾。將其溶解於水(733.4mL)及丙酮(733.4mL)中，冷卻至0℃，隨後依序添加硫酸鎂(81.17g，674.37mmol)、碳酸氫鈉(56.65g，674.37mmol)及高錳酸鉀(28.42g，179.83mmol)。於室溫下攪拌該混合物。30分鐘後，依序添加五水合硫代硫酸鈉(197.10g，311.03mmol)及矽藻土(100g)。攪拌30分鐘並過濾通過矽藻土墊。使用甲基第三丁基醚沖洗該墊並用甲基第三丁基醚萃取水層。使有機層於硫酸鎂上乾燥，過濾並於真空中濃縮。藉由使用己烷：甲基第三丁基醚(10：90至50：50)洗脫之急驟層析法進行純化，以產生標題化合物之無色油(92.67g，51%)。1H NMR(CDCl3)δ：0.39-0.52(m,1H),0.55-0.78(m,3H),1.25(寬t,J=7.1Hz,6H),1.58(寬dd,J=2.9及6.3Hz,1H),1.64-1.73(m,1H),1.95(寬t,J=2.9Hz,1H),2.03-2.17(m,1H),2.52(dd,J=2.7及6.3Hz,1H),4.09(q,J=7.1Hz,2H),4.16-4.32(m,2H),5.08(寬s,2H),5.44(寬s,1H),7.28-7.41(m,5H)。
亦獲得副產物(1S,2S,5R,6S)-2-(苄氧羰基(甲基)胺基)螺[雙環[3.1.0]己烷-4,1'-環丙烷]-2,6-二羧酸二乙酯(22.67g，5.46mmol)。1H NMR(CDCl3)δ：0.37-0.52(m,1H),0.54-0.80(m,3H),1.26(寬t,J=7.1Hz,6H),1.55-1.68(m,1H),1.64-1.73(m,1H),1.70-1.80(m,1H),1.97(寬t,J=3.1Hz,1H),2.30(dd,J=3.1及6.3Hz,1H),3.16(s,3H),3.99-4.29(m,4H),5.09(寬s,2H),7.38-7.62(m,5H)。
製法13 (1S,2S,5R,6S)-2-胺基螺[雙環[3.1.0]己烷-4,1'-環丙烷]-2,6-二羧酸二乙酯
方法1：
於室溫下，將哌啶(3.16g，37.2mmol)添加至含於二氯甲烷(10.5mL)中之(1S,2S,5R,6S)-2-(9H-茀-9-基甲氧羰基胺基)螺[雙環[3.1.0]己烷-4,1'-環丙烷]2,6-二羧酸二乙酯(2.10g，4.29mmol)之攪拌溶液中。30分鐘後，蒸發至黃色固體。藉由使用乙酸乙酯：異己烷(30：70至80：20)洗脫之急驟層析法進行純化，以首先洗脫1-(9H-茀-9-基甲基)-哌啶且隨後洗脫標題化合物之淺黃色液體(1.07g，93%)。MS(m/z)：268(M+1)。
方法2：
將(1S,2S,5R,6S)-2-苄氧羰基胺基螺[雙環[3.1.0]己烷-4,1'-環丙烷]-2,6-二羧酸二乙酯(3.62g，9mmol)溶解於乙醇(54mL)中並將溶液添加至10%碳載鈀(Degussa型號E101 NE/W，0.18g，0.17mmol)中。在Parr設備上於345kPa下氫化4小時。使該反應過濾通過矽藻土墊以移除觸媒，使用乙醇沖洗並蒸發以獲得標題化合物之無色油(2.23g，93%)。MS(m/z)：268(M+1)。
製法14 (1S,2S,5R,6S)-2-[[(2S)-2-(第三丁氧羰基胺基)丙醯基]胺基]螺[雙環[3.1.0]己烷-4,1'-環丙烷]-2,6-二羧酸二乙酯
於二氯甲烷(48mL)中合併(1S,2S,5R,6S)-2-胺基螺[雙環[3.1.0]己烷-4,1'-環丙烷]-2,6-二羧酸二乙酯(1.92g，7.17mmol)、(2S)-2-(第三 丁氧羰基胺基)丙酸(1.92g，10mmol)、4-二甲基胺基吡啶(9mg，717μmol)及1-羥基苯并三唑(1.36g，10mmol)。添加三乙胺(1.5mL，10.8mmol)及1-(3-二甲基胺基丙基)-3-乙基碳化二亞胺鹽酸鹽(1.92g，10mmol)並於室溫及氮氣氛下攪拌2小時。使用乙酸乙酯(200mL)、水(50mL)及鹽水(50mL)稀釋該反應。強力攪拌，隨後分離乙酸乙酯層，用0.2M鹽酸(50mL)、水(50mL)、飽和碳酸氫鈉(50mL)及鹽水(50mL)沖洗。乾燥，過濾並濃縮該溶液，以獲得黃色油(3.48g)。藉由使用乙酸乙酯：異己烷(15：85至25：75)及隨後(25：75至40：60)洗脫之急驟層析法進行純化，以獲得油狀材料。將其再溶解於二氯甲烷中，濃縮並於真空下乾燥，以獲得標題化合物之白色發泡材料(3.05g，6.95mmol)。MS(m/z)：461(M+23)。
以下化合物係基本上藉由製法14之方法來製備。
製法17 (1S,2S,5R,6S)-2-[[(2S)-2-(第三丁氧羰基胺基)丙醯基]胺基]螺[雙環[3.1.0]己烷-4,1'-環丙烷]-2,6-二羧酸
方法1：
於氮氣下，將2M氫氧化鋰水溶液(27.8mL，55.6mmol)添加至含於四氫呋喃(36mL)中之(1S,2S,5R,6S)-2-[[(2S)-2-(第三丁氧羰基胺基)丙醯基]胺基]螺[雙環[3.1.0]己烷-4,1'-環丙烷]-2,6-二羧酸二乙酯(3.05g，6.9mmol)之冷攪拌溶液中。於室溫下攪拌該雙層溶液20小時。使用2M鹽酸(29mL)、冰(~20g)酸化並用乙酸乙酯(100mL)萃取。用鹽水(50mL)沖洗該等萃取物，於硫酸鈉上乾燥，過濾並蒸發至白色半固體發泡體。將該材料再溶解於熱乙酸乙酯(15mL)中。過濾並於真空下乾燥該材料，以獲得標題化合物之白色固體(2.06g，5.4mmol)。MS(m/z)：405(M+23)。
方法2：
將(1S,2S,5R,6S)-2-苄氧羰基胺基螺[雙環[3.1.0]己烷-4,1'-環丙烷]-2,6-二羧酸二乙酯(159g，396.05mmol)溶解於乙醇(792.1mL)中並依序添加至10%碳載鈀(15.9g，14.94mmol)及37.5%(重量/重量)鹽酸水溶液(6.62mL，79.21mmol)。在2L Parr設備上，於413kPa及室溫下氫化。4小時後，使該混合物過濾通過矽藻土及玻璃微纖維過濾器(Whatman)並於真空中濃縮。將該粗製物溶解於四氫呋喃(396mL) 中，添加氯二甲氧基三嗪(74.50g，415.86mmol)及(2S)-2-(第三丁氧羰基胺基)丙酸(79.88g，415.86mmol)。使此混合物冷卻至0℃並添加N-甲基嗎啉(131.06mL，1.19mol)。於室溫下攪拌該混合物。5小時後，使該粗製物過濾通過矽藻土並用四氫呋喃(200mL)沖洗濾餅。於真空下移除部分溶劑並使所得橙色溶液冷卻至0℃。滴加2M氫氧化鈉水溶液(792.1mL，1.58mol)。攪拌該混合物過夜，使該反應達到室溫。添加二氯甲烷(1L)並分離各相。使用更多水(300mL)沖洗有機層。使用1N硫酸氫鉀將合併的水層酸化至pH=2-3且隨後用乙酸乙酯萃取。使該有機層於硫酸鎂上乾燥，過濾並於真空下蒸發。將該粗製物溶解於四氫呋喃(600mL)中並加熱至回流。添加庚烷(2.1L)並使該溶液冷卻。過濾固體並於真空下乾燥，以獲得標題化合物之白色固體(149g，98%)。MS(m/z)：405(M+23)。
以下化合物係基本上藉由製法17之方法1來製備。
製法20 (1S,2S,5R,6S)-2-(第三丁氧羰基胺基)螺[雙環[3.1.0]己烷-4,1'-環丙烷]-2,6-二羧酸二乙酯
方法1：
依序將聚合物負載型二異丙基乙胺(1.02g，3.61mmol)及含於二氯甲烷(6.00mL)中之二碳酸二第三丁酯(0.41g，1.88mmol)添加至含於二氯甲烷(5mL)中之(1S,2S,5R,6S)-2-胺基螺[雙環[3.1.0]己烷-4,1'-環丙烷]-2,6-二羧酸二乙酯(0.47g，722.38μmol)之溶液中並於室溫下攪拌該反應混合物過夜。添加額外的二碳酸二第三丁酯(0.32g，1.36mmol)，並再攪拌2小時。用乙醇(20mL)稀釋並藉由經2份管柱體積乙醇預處理之SCX-2離子交換樹脂濾芯(10g)純化。裝載該濾芯後，用4份管柱體積的乙醇沖洗，接著於真空中濃縮該洗脫液，以產生粗產物(808mg)。藉由使用乙酸乙酯：環己烷(0：100至40：60)洗脫之急驟層析法純化該粗製材料，以產生所需材料(100mg)。使用2份管柱體積的含於甲醇中之3M氨沖洗該濾芯，以產生未反應之粗製(1S,2S,5R,6S)-2-胺基螺[雙環[3.1.0]己烷-4,1'-環丙烷]-2,6-二羧酸二乙酯之黃色固體(430mg)。將二碳酸二第三丁酯(0.32g，1.44mmol)添加至含於四氫呋喃(20mL)中之回收的(1S,2S,5R,6S)-2-胺基螺[雙環[3.1.0]己烷-4,1'-環丙烷]-2,6-二羧酸二乙酯中，並於室溫下攪拌過夜。隨後添加三乙胺(201.37μL，1.44mmol)及額外的二碳酸二第三丁酯(0.32g，1.44mmol)並維持攪拌72小時。添加額外的三乙胺(201.37μL，1.44mmol)、二碳酸二第三丁酯(0.32g，1.44mmol)及觸媒N,N-二甲基4- 胺基吡啶(40.93μmol)並攪拌過夜。使用乙醇(30mL)稀釋並藉由經2份管柱體積乙醇預處理之SCX-2離子交換樹脂濾芯(10g)純化該溶液。使用4份管柱體積乙醇沖洗並於真空中濃縮該溶液，以產生757mg粗製所需產物。藉由使用乙酸乙酯：環己烷(0：100至40：60)洗脫之急驟層析法進行純化，以產生第二部分的所需標題產物(24mg)。合併兩個部分以產生標題化合物(337.47μmol，47%)。MS(m/z)：390(M+23),757(2M+23)。
方法2：
於氮氣下，將二碳酸二第三丁酯(0.88g，4.01mmol)添加至含於四氫呋喃(30mL)中之(1S,2S,5R,6S)-2-胺基螺[雙環[3.1.0]己烷-4,1'-環丙烷]-2,6-二羧酸二乙酯(1.4g，5.24mmol)之溶液中並於室溫下攪拌該反應混合物過夜。過濾通過疏水性玻璃料，用乙酸乙酯沖洗無色凝膠。於真空中濃縮合併的有機層，以獲得無色油。藉由使用乙酸乙酯：異己烷(0：100至30：70)洗脫之急驟層析法進行純化，以產生1.82g油。於高真空下進一步乾燥，以產生標題化合物(1.79g，93%)。MS(m/z)：390(M+23),757(2M+23)。
製法21 (1S,2S,5R,6S)-2-(第三丁氧羰基胺基)螺[雙環[3.1.0]己烷-4,1'-環丙烷]-2,6-二羧酸
將含於四氫呋喃(29.2mL)中之(1S,2S,5R,6S)-2-(第三丁氧羰基胺基)螺[雙環[3.1.0]己烷-4,1'-環丙烷]-2,6-二羧酸二乙酯(1.79g，4.87mmol)添加至新製備之含於水(19.5mL)中之氫氧化鋰單水合物(1.64 g，38.97mmol)之溶液中並於60℃下攪拌過夜。用水(30mL)稀釋，並用乙酸乙酯(2 x 50mL)萃取。分離水層及有機層。使用2M鹽酸沖洗有機層。使用2M鹽酸(25mL)沖洗水層，隨後用乙酸乙酯(2 x 50mL)萃取。合併該等有機層並用鹽水(15mL)沖洗。於硫酸鎂上乾燥，過濾並濃縮至乾。將其再溶解於二氯甲烷中並濃縮至乾，以獲得標題化合物(1.49g，98%)。MS(m/z)：334(M+23)。
製法22 (1S,2S,5R,6S)-2-(第三丁氧羰基胺基)螺[雙環[3.1.0]己烷-4,1'-環丙烷]-2,6-二羧酸二苄酯
將碳酸銫(0.24g，730.7μmol)及苄基溴(87.16μL，730.7μmol)添加至含於N,N-二甲基甲醯胺(2mL)中之(1S,2S,5R,6S)-2-(第三丁氧羰基胺基)螺[雙環[3.1.0]己烷-4,1'-環丙烷]-2,6-二羧酸(0.09g，292.29μmol)之溶液中。於室溫及氮氣下攪拌1.5小時。用水中止反應並用乙酸乙酯萃取。分離各層並使有機物過濾通過疏水性玻璃料，接著濃縮至乾，以產生粗產物(134mg)。藉由使用乙酸乙酯：異己烷(1：99至25：75)洗脫之急驟層析法進行純化，以獲得澄清油。藉由使用乙酸乙酯：異己烷(1：99至10：90)洗脫之急驟層析法進一步純化，以產生標題化合物之澄清油(105mg，68%)。MS(m/z)：514(M+23)。
以下化合物係基本上藉由製法22之方法來製備。
實例1 (1S,2S,5R,6S)-2-胺基螺[雙環[3.1.0]己烷-4,1'-環丙烷]-2,6-二羧酸鹽酸鹽
將(1S,2S,5R,6S)-2-(第三丁氧羰基胺基)螺[雙環[3.1.0]己烷-4,1'-環丙烷]-2,6-二羧酸二第三丁酯(55mg，129.8μmol)添加至5mL ReactiVial反應瓶中。將5N鹽酸水溶液(3mL；20.8mmol)及1,4-二噁烷(1mL)添加至此反應物中。於90℃下攪拌該混合物1小時。密封該ReactiVial反應瓶並於90℃下連續攪拌3小時。使其冷卻至室溫並靜置3天。於減壓下濃縮成暗色固體。藉由先後用2份管柱體積甲醇及6份管柱體積水沖洗來製備Oasis®HLB Waters(1g)濾芯。將該暗色固體溶解於水中並將其裝載至該濾芯上。用水(2份管柱體積)沖洗該濾芯並收集洗脫液。使該溶液冷凍乾燥，以產生標題化合物(16.1mg，65μmol)。MS(m/z)：212(M+1)。1H NMR(D2O)δ 0.45(m,1H),0.53(m, 1H),0.64(m,1H),0.74(m,1H),1.72-1.78(m,2H)1.86(d,J=14.2Hz,1H),2.07(m,1H),2.37(m,1H)。
實例2 (1S,2S,5R,6S)-2-胺基螺[雙環[3.1.0]己烷-4,1'-環丙烷]-2,6-二羧酸
添加2M氫氧化鈉(11.5mL，23.1mmol)及(1S,2S,5R,6S)-2-乙醯胺基螺[雙環[3.1.0]己烷-4,1'-環丙烷]-2,6-二羧酸二乙酯(1.19g，3.8mmol)。當添加時，於氮氣包覆下，加熱該反應混合物至回流。21小時後，添加額外的2M氫氧化鈉(5.8mL，11.5mmol)並繼續加熱120小時。藉由如下之陽離子交換層析法(DowexTM50X8-100)進行純化。過濾任何不溶性顆粒並用HPLC級水沖洗。將該溶液濃縮至一半。將該溶液裝載至該樹脂上，使其以約1滴/1-2秒之滴速流動通過管柱。在初始裝載體積已滴至該樹脂表面後，使用HPLC級水(~1至2份管柱體積)沖洗該樹脂並重複3次。監測流出物之pH並用HPLC級水繼續沖洗直至施加完成(pH恢復至pH=7)。當已觀察到完整pH循環且該流出物已恢復至pH=7時，依序使用HPLC級水、HPLC級水：四氫呋喃(1：1)、HPLC級水(各至少1份管柱體積)沖洗該管柱。使用10%吡啶：HPLC級水自該樹脂置換該產物並用10%吡啶：HPLC級水繼續洗脫，直至藉由TLC檢測不到額外產物。合併包含所需材料之部分，濃縮至乾以獲得白色固體。冷凍乾燥，以產生標題化合物(795mg，3.8mmol)。MS(m/z)：212(M+1)。1H NMR(D2O+5% d5-吡啶)δ：0.38(m,1H),0.45(m,1H),0.55(m,1H),0.69(m,1H),1.50(dd,J=2.9Hz,1H),1.62(d,J=13.7Hz,1H),1.78(m,2H),2.11(dd,J=2.9Hz,1H)。
實例3 (1S,2S,5R,6S)-2-[[(2S)-2-胺基丙醯基]胺基]螺[雙環[3.1.0]己烷-4,1'-環丙烷]-2,6-二羧酸；1,4-二噁烷(1：0.5)；鹽酸鹽
於室溫及氮氣下，將含於1,4-二噁烷中之4M氯化氫溶液(1.57mL，6.3mmol)添加至含於1,4-二噁烷(1.6mL)中之(1S,2S,5R,6S)-2-[[(2S)-2-(第三丁氧羰基胺基)丙醯基]胺基]螺[雙環[3.1.0]己烷-4,1'-環丙烷]-2,6-二羧酸(0.16g，418.4μmol)之攪拌懸浮液中。16小時後，過濾白色固體，用1,4-二噁烷沖洗，於60℃的真空中乾燥過夜，以產生標題化合物(0.14g)：MS(m/z)：283(M+1)。1H NMR(D2O)δ：0.46(m,1H),0.65(m,1H),1.47(d,J=7Hz,3H),1.70(dd,J=2.7Hz,1H),1.81(q,J=15Hz,2H),1.87(寬t,J=2.7及2.9Hz,1H),2.65(dd,J=2.7及2.9Hz,1H),3.68(s,4H),4.00(q,J=7Hz,1H),4.70(m,2H)。
實例4 (1S,2S,5R,6S)-2-[[(2S)-2-胺基丙醯基]胺基]螺[雙環[3.1.0]己烷-4,1'-環丙烷]-2,6-二羧酸
將濃鹽酸(36.94mL，430.11mmol)添加至含於丙酮(822.4mL)中之(1S,2S,5R,6S)-2-[[(2S)-2-(第三丁氧羰基胺基)丙醯基]胺基]螺[雙環[3.1.0]己烷-4,1'-環丙烷]-2,6-二羧酸(82.24g，215.06mmol)之溶液 中，並於50℃下攪拌該混合物。1.5小時後，使該混合物冷卻至0℃並添加50%氫氧化鈉水溶液，以使pH=3.6-3.8。攪拌所得固體1小時，過濾並用水沖洗。於真空下乾燥48小時，以產生標題化合物之白色固體(36g，127.53mmol)。MS(m/z)：283(M+1)。
實例5 (1S,2S,5R,6S)-2-[[(2S)-2-胺基丙醯基]胺基]螺[雙環[3.1.0]己烷-4,1'-環丙烷]-2,6-二羧酸鹽酸鹽
於室溫及氮氣下，將含於1,4-二噁烷中之4M氯化氫(20mL，80mmol)添加至含於1,4-二噁烷(21mL)中之(1S,2S,5R,6S)-2-[[(2S)-2-(第三丁氧羰基胺基)丙醯基]胺基]螺[雙環[3.1.0]己烷-4,1'-環丙烷]-2,6-二羧酸(2.06g，5.4mmol)之攪拌懸浮液中。超音波處理該反應混合物幾分鐘且隨後維持攪拌16小時。過濾固體，用1,4-二噁烷沖洗，於60℃的真空中乾燥6小時，以獲得2.2g白色固體。將該材料再溶解於HPLC級水(20mL)中，過濾移除任何不溶性顆粒並使該濾液冷凍乾燥，以產生標題化合物(1.51g，4.75mmol)。MS(m/z)：283(M+1)。1H NMR(D2O)δ 0.46(m,1H),0.65(m,1H),1.46(d,J=7.1Hz,3H),1.69(dd,J=2.9Hz,1H),1.81(q,J=14.3Hz,2H),1.87(寬t,J=2.9Hz,1H),2.65(dd,J=2.9Hz,1H),4.00(q,J=7.02Hz,1H),4.70(m,2H)。
以下化合物係基本上藉由實例4之方法來製備。
實例8 (1S,2S,5R,6S)-2-胺基螺[雙環[3.1.0]己烷-4,1'-環丙烷]-2,6-二羧酸二苄酯；1,4-二噁烷；鹽酸鹽
於室溫及氮氣下，將含於1,4-二噁烷中之4M氯化氫(493.30μL，1.97mmol)添加至含於1,4-二噁烷(970μL)中之(1S,2S,5R,6S)-2-(第三丁氧羰基胺基)螺[雙環[3.1.0]己烷-4,1'-環丙烷]-2,6-二羧酸二苄酯(0.1g，0.2mmol)之攪拌懸浮液中並攪拌20小時。額外添加含於1,4-二噁烷中之4M氯化氫溶液(493.30μL，1.97mmol)並加熱至80℃。濃縮至乾，使用乙腈研磨並使該懸浮液冷凍乾燥，以獲得呈白色固體之標題化合物(89.9mg，88%)，其係呈與1,4-二噁烷之(1：1)加成物。MS(m/z)：392(M+1)。
實例9 (1S,2S,5R,6S)-2-胺基螺[雙環[3.1.0]己烷-4,1'-環丙烷]-2,6-二羧酸雙[(2-氟苯基)甲基]酯鹽酸鹽
於室溫及氮氣下，將含於1,4-二噁烷中之4M氯化氫溶液(4.64mL，18.58mmol)添加至含於1,4-二噁烷(4.64mL)中之(1S,2S,5R,6S)-2-(第三丁氧羰基胺基)螺[雙環[3.1.0]己烷-4,1'-環丙烷]-2,6-二羧酸雙[(2-氟苯基)甲基]酯(0.98g，1.86mmol)之攪拌溶液中並攪拌該溶液20小時。於真空中濃縮以獲得油(0.93g)。將其溶解於乙腈(10mL)及水(30mL)之混合物中並冷凍乾燥整個週末，以獲得呈標題化合物及(1S,2S,5R,6S)-2-胺基-2-[(2-氟苯基)甲氧羰基]螺[雙環[3.1.0]己烷-4,1'-環丙烷]-6-羧酸(~7-10%)之混合物形式之白色固體(820mg)。MS(m/z)：320(M+H)。將該白色固體溶解於乙腈(8mL)中，以產生半透明溶液。使其靜置1小時，接著過濾。於真空中濃縮該濾液，以產生黏性發泡體。使其再溶解於乙酸乙酯中，用碳酸氫鈉飽和溶液沖洗，於硫酸鎂上乾燥，過濾並於真空中濃縮，以產生774mg材料。將其再溶解於乙醚(11mL)中，添加含於乙醚中之1M氯化氫(1.86mL，1.86mmol)，於真空中濃縮，以產生白色固體發泡體。於50℃的真空中進一步乾燥過夜，以產生標題化合物(0.74g，85%)。MS(m/z)：428(M+1),450(M+23)。
實例10 (1S,2S,5R,6S)-2-[[(2S)-2-胺基丙醯基]胺基]螺[雙環[3.1.0]己烷-4,1'-環丙烷]-2,6-二羧酸二水合物
步驟1：(1S,2S,5R,6R)-2-胺基-4-側氧基-雙環[3.1.0]己烷-2,6-二羧酸二乙酯鹽酸鹽
於氮氣氛下，將乙醯氯(86.5mL，1.2mol)滴加至無水乙醇(1.0L，17.2mol)中且同時使內部反應溫度維持低於30℃。攪拌所得混合物15分鐘並一次性添加(1S,2S,5R,6R)-2-(第三丁氧羰基胺基)-4-側氧基-雙環[3.1.0]己烷-2,6-二羧酸二第三丁酯(100g，0.24mol)。加熱所得混合物至回流，持續16-20小時。使該反應混合物於減壓下濃縮成油。將該粗產物溶解於二氯甲烷(250mL)中並於真空中濃縮。重複該二氯甲烷/濃縮方法以獲得白色發泡體。添加乙酸乙酯(150mL)並將該混合物加熱至65℃。添加甲基第三丁基醚(100mL)並於65℃下攪拌該混合物15分鐘。歷時15分鐘添加甲基第三丁基醚(300mL)，於65℃下攪拌15分鐘，隨後停止加熱並使該漿液冷卻至周圍溫度。過濾該混合物並用甲基第三丁基醚(150mL)沖洗該濾餅。將該濾餅轉移至真空烘箱中並於25℃下乾燥過夜，以獲得粗產物(67.5g)。將該等固體轉移至圓底燒瓶中，用乙酸乙酯(170mL)稀釋並將該混合物加熱至65℃。攪拌該混合物1小時，添加四氫呋喃(68mL)及乙醇(3mL)。關閉熱源並歷時20分鐘添加甲基第三丁基醚(272mL)，使該混合物冷卻至周圍溫度。過濾該漿液，使用95/5甲基第三丁基醚/乙酸乙酯(2 x 75mL)沖洗該濾餅並使該等固體於真空烘箱中在25℃下進一步乾燥過 夜，以獲得呈白色固體之標題化合物(60.0g，98.0%)。MS(m/z)：256(M+1)。
步驟2：(1S,2S,5R,6R)-2-苄氧羰基胺基-4-側氧基-雙環[3.1.0]己烷-2,6-二羧酸二乙酯
使(1S,2S,5R,6R)-2-胺基-4-側氧基-雙環[3.1.0]己烷-2,6-二羧酸二乙酯鹽酸鹽(55.0g，188.5mmol)懸浮於四氫呋喃(220mL)中，隨後添加水(220mL)及碳酸鉀(92.1g，659.9mmol)。攪拌所得混合物30分鐘。歷時45分鐘將氯甲酸苄酯(26.7mL，175.3mmol)添加至該混合物中，並使該反應溫度保持低於25℃。攪拌反應混合物30分鐘，隨後用乙酸乙酯(550mL)及水(275mL)稀釋。分離各相並用乙酸乙酯(250mL)反萃取水層。合併有機物並依序使用HCl水溶液(0.5N，100mL)、飽和NaHCO3(100mL)及鹽水(100mL)沖洗。使該有機溶液於Na2SO4上乾燥，過濾並於真空中濃縮，以獲得標題化合物之澄清油(67.6g，92.1%)。1H NMR(CDCl3)δ 1.24-1.26(m,6H),2.36(bs,1H),2.47(dd,1H),2.78(dd,1H),2.90(dd,1H),4.09-4.19(m,4H),5.08(s,2H),5.73(s,1H),7.24-7.36(m,5H)。
步驟3：(1S,2S,5R,6S)-2-苄氧羰基胺基-4-亞甲基-雙環[3.1.0]己烷-2,6-二羧酸二乙酯
於氮氣氛下，藉助攪拌合併溴化甲基三苯基鏻(67.4g，184.9mmol)及四氫呋喃(300mL)。將第三丁醇鉀之1M四氫呋喃溶液(184.9mL，184.9mmol)歷時15分鐘添加至該反應混合物中並於周圍溫度下攪拌所得漿液3小時。使(1S,2S,5R,6R)-2-苄氧羰基胺基-4-側氧基-雙環[3.1.0]己烷-2,6-二羧酸二乙酯(12.3kg，31.6mol)溶解於四氫呋喃(120mL)中並歷時1小時添加至該反應混合物中，並使該反應溫度維持低於30℃。於周圍溫度下攪拌所得漿液過夜，隨後用乙酸乙酯(600mL)稀釋並用水(300mL)中止反應。在攪拌該雙相混合物30分鐘後，分離各層並先後用水(300mL)及0.25M HCl(300mL)沖洗有機物。使該等有機物於Na2SO4上乾燥，過濾並於真空(45℃)中濃縮，以獲得呈暗色油之粗產物(111.0g)。藉由矽膠填料層析法(1Kg Kieselgel-60，4L 15%EtOAc/庚烷，隨後10L 30%EtOAc/庚烷)純化該材料，以獲得標題化合物之澄清油(37.3g，87.9%效價，54.9%)。MS(m/z)：388(M+1)。
步驟4：(1S,2S,5R,6S)-2-苄氧羰基胺基螺[雙環[3.1.0]己烷-4,1'-環丙烷]-2,6-二羧酸二乙酯
於氮氣氛下，將二乙基鋅溶液(157.2mL，157.2mmol，1M庚烷 溶液)添加至連接有冷卻裝置之夾套反應燒瓶中。使該溶液冷卻至-15℃並用冷(-15℃)無水二氯乙烷(157.2mL)稀釋。將三氟乙酸(11.1mL，146.7mmol)溶解於二氯乙烷(11.1mL)中並歷時50分鐘添加至反應容器中，並使內部溫度維持低於-10℃。於-10至-15℃下攪拌所得懸浮液30分鐘。將二碘甲烷(12.7mL，42.1g，157.2mmol)溶解於二氯乙烷(12.7mL)中並歷時50分鐘添加至反應混合物中，並使內部溫度維持低於-10℃。於-10至-15℃下攪拌所得之白色稀懸浮液30分鐘。將(1S,2S,5R,6S)-2-苄氧羰基胺基-4-亞甲基-雙環[3.1.0]己烷-2,6-二羧酸二乙酯(20.3g，87.9%效價，46.0mmol)溶解於二氯乙烷(30.4mL)中並歷時10分鐘添加至反應混合物中，並使內部溫度維持低於-10℃。於-10℃下攪拌該澄清淺黃色溶液5分鐘並監測潛在放熱。將該冷卻器上之設定值更改至0℃並於該溫度下攪拌該反應混合物48小時。藉由歷時15分鐘添加5N HCl(62.9mL，314.4mmol)使該反應混合物中止反應，並使內部溫度維持低於6℃。於0-5℃下攪拌所得混合物20分鐘，隨後轉移至漏斗中並分離各層。先後使用1N HCl(2 x 50mL)、1：1飽和NaHCO3/H2O(60mL)、1：1飽和Na2CO3/H2O(60mL)及水(50mL)沖洗該有機層。使該等有機物於Na2SO4上乾燥並於真空中濃縮，以獲得呈淺黃色油之標題化合物(19.6g，60.3%效價，63.9%校正產率)。1H NMR(DMSO-d6)δ 0.37(m,2H),0.52-0.55(dm,2H),1.13-1.17(m,6H),1.49-1.50(m,1H),1.51-1.56(m,1H),1.60-1.79(m,2H),3.97-4.10(m,5H),5.00(s,2H),7.29-7.34(m,5H),8.04(s,1H)。
步驟5：(1S,2S,5R,6S)-2-胺基螺[雙環[3.1.0]己烷-4,1'-環丙烷]-2,6-二羧酸二乙酯鹽酸鹽
將無水乙醇(100mL，10份體積)、濃HCl(2.1mL，1.0N)及(1S,2S,5R,6S)-2-苄氧羰基胺基螺[雙環[3.1.0]己烷-4,1'-環丙烷]-2,6-二羧酸二乙酯(9.7g，24.16mmol)添加至HEL反應器中，接著添加Pd黑(3.9g，40重量%)。使用氮氣清洗該反應器三次，接著使用氫氣清洗三次並加壓至40psi氫。於20-30℃之間攪拌該反應至少2小時，直至HPLC監測到該反應完成。使所得漿液過濾通過Hyflo Super Cel®墊並用無水乙醇(2 x 30mL，3份體積)沖洗濕濾餅。將濾液轉移至潔淨反應器中並根據自校準曲線獲得之原位產物產率使用約5份體積乙酸異丙酯置換乙醇。歷時至少3小時使所得漿液冷卻至0-5℃。過濾所得漿液並用冷乙酸異丙酯(3 x 5mL，0.5份體積)沖洗濕濾餅。於30℃及減壓下乾燥至少12小時，以提供標題化合物(4.66g，15.34mmol，63.5%)。1H NMR(DMSO-d6,400MHz)：δ 8.84(s,3H),4.31-4.15(m,2H),4.03(q,J=7.0,2H),2.42(dd,J=3.1,2.6,1H),2.24(dd,J=6.2,2.6,1H),1.94(d,J=14.1,1H),1.68(d,J=14.1,1H),1.63(dd,J=6.6,3.1,1H),1.25(t,J=7.0,3H),1.17(t,J=7.0,3H),0.77-0.71(m,1H),0.65-0.59(m,1H),0.56-0.51(m,1H),0.50-0.44(m,1H)。
步驟6：(1S,2S,5R,6S)-2-[[(2S)-2-(第三丁氧羰基胺基)丙醯基]胺基]螺[雙環[3.1.0]己烷-4,1'-環丙烷]-2,6-二羧酸二乙酯
將四氫呋喃(45mL，10份體積)及(2S)-2-(第三丁氧羰基胺基)丙酸(3.4g，1.2當量)添加至反應器中，接著添加N-甲基嗎啉(1.96mL，1.2當量)及2-氯-4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪(3.12g，1.2當量)。於20-25℃之間攪拌所得稀漿液至少3小時，直至藉由HPLC監測到該反應完成。於20-25℃之間一次性添加(1S,2S,5R,6S)-2-胺基螺[雙環[3.1.0]己烷-4,1'-環丙烷]-2,6-二羧酸二乙酯鹽酸鹽(4.55g，14.81mmol)，接著歷時至少10分鐘添加N-甲基嗎啉(1.63mL，1.0當量)並使該溫度維持在20-25℃之間。於20-25℃之間攪拌所得稀漿液至少2小時，直至藉由HPLC監測到該反應完成。過濾所得固體並用四氫呋喃(2 x 10mL，2.2份體積)沖洗該濕濾餅，以提供假定具有100%產率之標題化合物。假定100%產率，則使用未經進一步純化之標題化合物之淺琥珀色四氫呋喃溶液。1H NMR(DMSO-d6,400MHz)：δ 8.46(s,1H),6.72(d,J=7.9,1H),4.08-3.92(m,5H),2.42-2.37(m,1H),1.81-1.64(m,3H),1.47(dd,J=6.6,3.1,1H),1.34(s,9H),1.18-1.08(m,9H),0.66-0.59(m,1H),0.57-0.52(m,1H),0.46-0.36(m,2H)。
步驟7：(1S,2S,5R,6S)-2-[[(2S)-2-(第三丁氧羰基胺基)丙醯基]胺基]螺[雙環[3.1.0]己烷-4,1'-環丙烷]-2,6-二羧酸
將2N NaOH(37mL，5.0當量)及(1S,2S,5R,6S)-2-[[(2S)-2-(第三丁氧羰基胺基)丙醯基]胺基]螺[雙環[3.1.0]己烷-4,1'-環丙烷]-2,6-二羧酸二乙酯(6.50g，14.81mmol)添加至反應器中並於20-30℃之間攪拌至少12小時，直至藉由HPLC監測到該反應完成。將該反應轉移至分液 漏斗中並使其靜置至少10分鐘。分離各相並將下層水層回加至該反應器中。將乙酸乙酯(90mL，13.8份體積)添加至該混合物中，且隨後添加1N NaHSO4，直至pH達到2至2.5。分離各層並用水(45mL，6.9份體積)沖洗該有機物。移除有機相中的水，使用乙酸乙酯常壓蒸餾以移除殘餘水分。使所得漿液歷時至少2小時冷卻至20-30℃並於此溫度下粒化至少90分鐘。過濾所得固體並用乙酸乙酯(3 x 15mL，2.3份體積)沖洗該濕濾餅。於45℃及減壓下乾燥，以提供呈白色固體之標題化合物(4.45g，11.64mmol，78.6%)。1H NMR(DMSO-d6,400MHz,50℃)：δ 12.01(s,2H),8.22(s,1H),6.49(bs,1H),4.00(bs,1H),2.43(dd,J=6.5,2.8,1H),1.83(d,J=14.0,1H),1.68-1.62(m,2H),1.42(dd,J=6.5,2.8,1H),1.36(s,9H),1.15(d,J=7.1,3H),0.67-0.61(m,1H),0.56-0.51(m,1H),0.46-0.36(m,2H)。
步驟8：(1S,2S,5R,6S)-2-[[(2S)-2-胺基丙醯基]胺基]螺[雙環[3.1.0]己烷-4,1'-環丙烷]-2,6-二羧酸二水合物
將水(32mL，8份體積)及(1S,2S,5R,6S)-2-[[(2S)-2-(第三丁氧羰基胺基)丙醯基]胺基]螺[雙環[3.1.0]己烷-4,1'-環丙烷]-2,6-二羧酸(3.99g，10.4mmol)添加至反應器中，接著添加濃HCl(1.80mL，2.0當量)且隨後將該反應加熱至45-55℃，直至該反應完成(藉由HPLC監測)。使該反應混合物冷卻至20-30℃並使用5N NaOH將pH調整至約3.6。於20-30℃之間，將無水乙醇(15mL，3.75份體積)歷時至少30分鐘添加至所得漿液中。使所得漿液於20-30℃之間粒化至少12小時。使該混合物冷卻至-5-5℃之間並使其粒化至少60分鐘。過濾所得固體並用 30%無水乙醇水溶液(2 x 9mL，2.25份體積)沖洗該濾餅。使該等固體於35℃及減壓下乾燥至少12小時，且隨後使所得固體靜置在天平上直至在至少2小時內無其他重量變化，以提供呈白色固體之標題化合物(2.71g，8.51mmol，81.6%)。1H NMR(D2O,400MHz)：δ 3.90(q,J=7.2,1H),2.56(dd,J=6.5,2.9,1H),1.74-1.66(m,2H),1.62-1.54(m,2H),1.39(d,J=7.1,3H),0.61-0.56(m,1H),0.55-0.49(m,1H),0.40-0.30(m,2H)。
於配備有CuKa源(λ=1.54060Å)及Vantec偵測器之Bruker D4 Endeavor X射線粉末繞射儀(於35kV及50mA下操作)上獲得結晶固體之X射線粉末繞射(XRD)圖案。於4至40°的2θ之間，以0.0087°的2θ步長及0.5秒/步的掃描速率及0.6mm發散、5.28mm固定式抗散射器及9.5mm偵測器狹縫掃描該樣品。將乾燥粉末填充在石英樣品支架上並使用玻璃載片獲得光滑表面。根據於8.85及26.77度2θ下的NIST 675標準峰調整繞射圖案。在結晶學技術中已熟知：就任何指定晶形而言，該等繞射峰之相對強度可因由諸如晶體慣態之因素所導致之較佳定向而變化，且角峰位置可略微變化。例如，峰位置可因分析樣品時的溫度或濕度之變化及樣品位移而移動。在本發明情況中，在不妨礙明確鑒定指定晶形的情況下，±0.2(2θ)之峰位置可變性將涵蓋此等可能變化。可根據識別峰(單位為°2θ)(通常為更突出峰)之任何獨特組合確認晶形。於周圍溫度及相對濕度下採集該等晶形繞射圖案。
因此，製得之實例10樣品之特徵係使用CuKa輻射獲得之具有如下表1中所述之繞射峰(2θ值)之XRD圖案。明確言之，該圖案包含5.20的峰及一或多個選自由10.45、11.70、15.75、21.06及23.59組成之群之峰，其中繞射角公差為0.2度。
該等mGlu受體係調節神經元興奮性之G蛋白偶聯受體。更特定言之，榖胺酸神經傳遞改變係與神經疾病(例如慢性疼痛症，包括持續性疼痛、神經性疼痛、慢性炎性疼痛或內臟性疼痛)、精神疾病(例如精神分裂症、雙極症、泛焦慮症或創傷後壓力症)或神經退化性疾病有關。
由於本發明化合物係mGlu2/3拮抗劑，因此其等可適用於治療前述病症。
人類mGlu2及mGlu3拮抗劑FLIPR分析
此等研究使用AV-12細胞株，其來源於敘利亞倉鼠成纖維細胞且安定地表現人類mGlu2或mGlu3受體且經大鼠榖胺酸轉運體EAAT1(興奮性胺基酸轉運體1)及Gα15亞單元共轉染。Gα15之表現允許Gi偶聯受體經由磷脂酶C途徑傳導信號，此導致可藉由螢光鈣反應分析來測量受體激活。該等細胞株係藉由培養在具有高葡萄糖及鹽酸吡多辛且 補充有5%透析胎牛血清、1mM丙酮酸鈉、10mM HEPES(4-(2-羥乙基)-1-哌嗪乙磺酸)、1mM L-穀胺醯胺及5μg/mL殺稻瘟菌素之杜貝卡氏改良依格培養基(DMEM)中來維持(所有培養基均購自Invitrogen)。使用無酶裂解液(Chemicon S-004-B)使長滿培養物每兩周繼代一次。於分析前24小時收穫細胞並使用Matrix Well-Mate細胞接種機以85,000(mGlu2)或115,000(mGlu3)細胞/孔將其分配至96孔黑壁聚-D-離胺酸塗層板(BD BioCoat #354640)中的僅包含250(mGlu2)或125(mGlu3)μM L-穀胺醯胺(新添加)的培養基中。使用螢光成像讀板器(FLIPR，分子裝置)於添加化合物前後監測細胞內鈣濃度。該分析緩衝劑係由補充有20mM HEPES的漢克斯緩衝鹽溶液(HBSS；Sigma)組成。移除該培養基並使用8μM Fluo-3AM(分子探針，F-1241；50μL/孔)在分析緩衝劑中於25℃下培養該等細胞90分鐘(mGlu2)或120分鐘(mGlu3)。移除該染液並換成新鮮分析緩衝劑(50μL/孔)。在各實驗前，針對激動劑榖胺酸(Fisher A125-100)進行生成11點濃度反應曲線之單摻FLIPR分析(3倍稀釋，開始於10uM)，以確定典型EC50反應。使用Prism v4.03(GraphPad軟體)分析結果。於使用10點濃度反應曲線並使用開始於25μM最終濃度的3倍稀釋之單摻FLIPR分析中測試本發明化合物。將本發明化合物以10mM原液形式溶於0.1N NaOH中並儲存於-20℃下。藉由連續三倍稀釋將其稀釋於分析緩衝劑中。在於FLIPR儀器上進行初始5秒螢光讀數後，將本發明化合物添加至細胞板中(50μL/孔)。在前30秒內，每秒採集數據一次且隨後每3秒採集數據一次(總計90秒)以檢測拮抗劑活性。最大反應係定義為由ECmax(100μM榖胺酸)引起的反應。化合物效應係經測量為以針對在缺少榖胺酸時測得之基礎螢光校準之相對螢光單位(RFU)表示之最大峰高減去最小峰高。使用單板進行測定。拮抗劑效應係經定量為單獨由化合物誘發之刺激相對於最大榖胺酸反應之百分比。所有數據係使 用四參數邏輯曲線擬合程式(ActivityBase v5.3.1.22)計算為相對EC50值。
在實質上如上進行的hmGlu2 FLIPR分析中，測得實例2具有39.0nM±5.9(n=3，以SEM計算誤差)的EC50。另外，在實質上如上進行的hmGlu3 FLIPR分析中，測得實例2具有285nM±52.5(n=8，以SEM計算誤差)的EC50。此等結果顯示實例2係強效的mGlu2及mGlu3拮抗劑。
由注射福馬林所誘發之持續性疼痛之逆轉
將福馬林投與至大鼠後爪足底，導致其急性疼痛反應行為(例如舔、咬及撓經注射的爪)的兩個階段：在投與福馬林後約5分鐘的早期階段及注射福馬林後約第10分鐘至第60分鐘的後期階段。兩個階段之間相隔約第5分鐘至第10分鐘的休止期。可使用藉由加速計檢測大鼠活動之驚嚇反應室(SR-Lab，San Diego Instruments，San Diego，CA)自動為此等由福馬林誘發之行為評分。在蹠內注射福馬林之前1小時，對非空腹雄性Sprague-Dawley大鼠投與(腹膜內途徑)0.3-10mg/kg測試化合物(活性)。隨後將該等大鼠個別放置於馴化用測試室內的圓筒中。在蹠內注射福馬林之前2小時，對非空腹雄性Sprague-Dawley大鼠經口投與0.45-15mg/kg測試化合物(前藥)。隨後將該等大鼠個別放置於馴化用測試室內的圓筒中。在特定時間點，自圓筒移除該等大鼠並將福馬林(50μL的5%鹽水溶液)皮下注射至其右後爪足底中，並立即放回該等圓筒中。將該等圓筒放置於測試室內之檢測系統之荷重計上，由此允許連續60分鐘監測1秒內之反應。計算5分鐘時間間隔內之急性疼痛反應事件總數[1秒內測得>20-荷重單位的數量]。20-荷重單位臨限值係足以排除正常生理事件(例如呼吸或喘氣)但可顯著檢測急性疼痛反應事件。換算數據，以決定在60分鐘期間所收集每1秒內超過臨限值(20個荷重單位)之事件的總數。早期階段分數係自第0至5分鐘期間大於20個荷重單位之事件總數。後期階段分數係自第11分鐘 至第40分鐘的數據採集階段大於20個荷重單位之事件加總獲得。藉由單向變異數分析(ANOVA)及藉由使用JMP(v 6.0.2)統計分析程式(SAS Institute Inc,Cary,NC)進行杜納t檢驗之雙向比較法分析適當對比，來評估福馬林數據。若p值小於0.05，則認為差異顯著。由各劑量之逆轉數據百分比擬合至非線性回歸曲線，計算ED50。
在實質上如上進行的此分析中，測得實例2具有0.7mg/kg(i.p.)的ED50。在實質上如上進行的此分析中，測得實例10具有4.8mg/kg(p.o.)的ED50。此等結果顯示本發明範圍內之化合物係用於持續性疼痛之有效藥物。
由L5/L6神經結紮誘發之觸覺異常性疼痛之逆轉
支配後腿區域之神經之單側結紮將導致大鼠之表現為觸覺異常性疼痛之慢性持續性疼痛。進行L5/L6神經結紮(Kim等人，Pain(1992)50,355-363)。藉由於使用異氟醚(3%用於誘發及2%用於維持)及氧氣之混合物之氣體麻醉下緊緊結紮左側L5及L6脊神經產生神經損傷。在手術後的至少14天後，藉由使用漸增彎曲力(0.3至15g)測量受傷爪子對von Frey長絲之觸覺敏感度來評估觸覺異常性疼痛(Chaplan等人，J.of Neuroscience Methods(1994)53,55-63)。當大鼠顯示觸覺異常性疼痛(對施加小於2公克的彎曲力做出縮爪反應)時，則認為其過敏。測定基線值，然後立即評估測試化合物。經口投與15mg/kg測試化合物(前藥)且於給藥後1、2及4小時測量縮爪之觸覺閾值。在各時間點，數據係以反應閾值(公克(g))表示且數值係具有標準誤差均值(±SE均值)。先後使用方差分析法及杜納(Dunnett)事後分析法分析數據且其表示疼痛閾值(Cmax=最大反應基線)之絕對值變化並以均值[log(最大反應)-log預劑量分數)](g)表示。
在實質上如上進行的此分析中，測得口服的15mg/kg實例10(其中n=8；以SEM計算誤差)比媒劑處理後的對應值(在1、2及4小時分別 為1.50±0.60、1.34±0.75及2.35±0.62)具有顯著更高的機械閾值(在1、2及4小時分別為9.06±2.26、12.31±1.86及8.63±1.98)。此等結果顯示本發明範圍內之化合物係用於神經性疼痛症之有效藥物。
CFA誘發之機械性痛覺過敏之逆轉
誘發大鼠後爪之局部發炎將導致持續性機械痛覺過敏，其可藉由測定對產生疼痛反應之壓力刺激之閾值來測量。完全費氏(Freund's)佐劑(CFA)誘發大鼠機械性痛覺過敏之方法係主要描述於Iadarola等人，Brain Res.(1988)455,205-212中。藉由異氟醚麻醉大鼠，同時對右爪足底內注射50μl CFA(Sigma C5881，含於85%石蠟油及15%二縮甘露醇單油酸酯中之1mg/ml分枝桿菌萃取物)。使大鼠於柔軟墊料籠具中恢復並於CFA注射後24小時測量機械性痛覺過敏變化。藉由溫和地限制大鼠並將其爪放置於底座與推桿之間(Ugo Basile Analgesy-meter)來測定機械性痛覺過敏(Randall Sellito測試)。記錄大鼠縮爪時的公克力。施加不大於250公克的最大力且若大鼠不縮爪，則記錄250公克的值。
於CFA注射前，測試大鼠的基線反應。於次日早晨(注射CFA後約24小時)測試CFA注射後反應。根據CFA注射後反應將大鼠隨機分組，其中不對顯示分數>150公克的任何大鼠做進一步測試。經口投與1.5至15mg/kg範圍內的測試化合物(前藥)並於投藥後1及2小時測量縮爪之機械閾值。統計顯著係定義為在針對各時間點之協方差分析及隨後之杜納事後檢驗中p值<0.05。下表2提供實質上如上進行之實例10之統計顯著結果。此等結果顯示本發明範圍內之化合物係用於慢性炎性疼痛症(例如骨關節炎或類風濕性關節炎)之有效藥物。
結腸直腸擴張誘發之疼痛行為之逆轉
可藉由結腸直腸腔擴張誘發大鼠內臟性疼痛並藉由獲取腹肌反射性收縮監測疼痛。由大鼠結腸直腸擴張誘發之腹肌反射性收縮疼痛之測量係實質上如Fioramonti等人，Neurogastroenterology and Motility(2003)15,363-369及Urban等人，J.of Pharmacology and Exp.Ther.(1999)290,207-213中所述來進行。在雄性Sprague Dawley大鼠的斜腹肌中手術植入肌電圖(EMG)電極並使其恢復一周，在此期間使大鼠適應操作及局部約束以使壓力效應最小化。在將連接至壓力監測器/調節器之潤滑乳膠氣球插入直腸(8cm)以使壓力在20、40及60mmHg之間步進(持續20秒，其中試驗之間相隔3分鐘休止時間)後，採集並記錄基線EMG測量值。在將壓力調高至下一水準之前，記錄各壓力下之一組3次暴露。採集之數據係壓力刺激期間之EMG讀數(μ伏特/ 秒)曲線下的面積並計算三次試驗之平均值。在結腸直腸擴張開始前90分鐘，經口投與1.5至17mg/kg測試化合物(前藥)。統計顯著係定義為在協方差分析及隨後之杜納事後檢驗中p值<0.05。下表3提供實質上如上進行之實例10之統計顯著結果。此等結果顯示本發明範圍內之化合物係用於內臟性疼痛症之有效藥物。
苯環己哌啶(PCP)誘發之大鼠移動加快行為之逆轉
投與NMDA受體拮抗劑(例如氯胺酮或苯環己哌啶(PCP))會引起人類之擬精神病樣效應，其類似於彼等在精神分裂症患者中所觀察到的症狀。試劑使NMDA拮抗劑之運動刺激效應逆轉之能力係經常用作精神病之動物模型，此顯示用於檢測精神分裂症及雙極症用藥物之臨床效力之良好預測效度。
藉由將個別雄性Sprague Dawley(Harlan，Indianapolis，IN)大鼠放置於尺寸為45 x 25 x 20cm的透明塑膠鞋盒籠(其中以1cm深的木屑 作為墊料且籠子頂部具有金屬格柵)中來監測運動行為。運動監測器(Kinder Scientific)係由位於5cm高度且配置成8 x 4陣型之12條光束(或呈15x7圖案之22條之高密度分組)之矩形托架及位於15cm高度之第二托架(用於測量直立行為)組成。該鞋盒籠係放置於此等托架內部，其中該等托架係位於隔離室中3英尺高的桌面上。投與(腹膜內途徑)0.3-10mg/kg範圍內的本發明化合物(活性物)，30分鐘後，投與5mg/kg攻毒劑量的苯環己哌啶(PCP)。對過夜空腹大鼠經口投與0.3-30mg/kg範圍內的本發明化合物(前藥)，4小時後，投與5mg/kg攻毒劑量的PCP。在測試當天，將大鼠放置於測試籠中並允許其適應30分鐘，接著進行PCP攻毒；在投與PCP後，再監測大鼠60分鐘。
使用GraphPad Prism(San Diego,CA.USA)進行數據分析及ED50計算。功效分析已測定需要8-10隻大鼠/組以具有適用於檢測治療差異之統計功效(功效=0.8)。對總計60分鐘之運動行為進行單向方差分析(ANOVA)及事後杜納多重比較檢驗。由各劑量之逆轉數據百分比擬合至非線性回歸曲線，計算ED50。
在實質上如上進行的此分析中，測得實例2具有1.46mg/kg(腹膜內)的ED50。在實質上如上進行的此分析中，測得實例5及6分別具有2.95mg/kg(口服)及4.31mg/kg(口服)的ED50。此等結果顯示本發明範圍內之化合物係用於精神分裂症及雙極症之有效藥物。
壓力誘發之大鼠高熱之減弱
高熱(中心體溫上升)係諸多哺乳動物(包括人類)應對壓力已穩定顯現的普遍現象。在諸多焦慮症中，高熱作為病理之部分出現且被視為該疾病之症狀。據信使壓力誘發之動物高熱減弱之化合物可用於治療人類焦慮症。泛焦慮症及創傷後壓力症係屬於可經該等化合物治療之疾病。用於分析壓力誘發之高熱之習知微創方法係藉由使用直腸溫度計測量體溫及壓力誘發之體溫增加。測試重量在275-350g之間的 雄性費歇爾F-344大鼠(Harlan,Indianapolis,IN,USA)。使用可隨意獲取之食物及自動水個別地圈養所有動物並維持12h光/暗週期(在06：00時開燈)。在實驗前，使大鼠空腹約12-18小時，此係在光階段期間進行。對大鼠腹膜內(IP)投與具有0.3、1、3及10mg/kg本發明化合物之1mL/kg之劑量體積。媒劑係鹽水+NaOH(其經添加以獲得5-7的pH)。使用mGluR5拮抗劑MTEP(3-[(2-甲基-1,3-噻唑-4-基)乙炔基]吡啶)(其在臨床前模型中已顯示穩定類抗焦慮藥活性)作為比較物(5mg/kg，IP途徑，溶解於水中)。在給藥後立即將大鼠放回籠子中且實驗者關閉光源並離開房間。使給藥室於1小時預處理階段之剩餘時間下暗化。
在該預處理階段後，將大鼠個別地放置於明亮之相鄰室中，在該室中藉由插入經礦物油潤滑之直腸探針測定基線體溫。使用具有PHYSITEMP RET-2®大鼠直腸探針之PHYSITEMP BAT-12®微探針溫度計(Physitemp Instruments Inc.,Clifton,NJ,USA)評定體溫。將該探針插入直腸內約2cm，以測量中心體溫(此係基線體溫T1，以攝氏度表示)。十分鐘後，記錄第二次體溫測量(T2)。體溫差(T2-T1)係定義為壓力誘發之高熱反應。本發明化合物使壓力誘發之高熱反應相對於媒劑反應下降35%之劑量係定義為T35劑量。
在實質上如上進行的此分析中，測得實例2具有0.57mg/kg的T35。在實質上如上進行的此分析中，測得實例5具有6.4mg/kg的T35。此等結果顯示本發明範圍內之化合物係用於焦慮症之有效藥物。更特定言之，本發明範圍內之化合物可係用於泛焦慮症及/或創傷後壓力症之有效藥物。
活體外PepTl GlySar抑制篩選及IC 50 測定
建立PepT1分析以檢驗該等前藥與腸吸收轉運體PepT1相互作用之能力。
於5%CO2濕化氣氛中及37℃下，使源自人類腸道之HeLa細胞(美 國模式培養物集存庫)於Hyclone培養基(Invitrogen，Cat號SH30243)中生長，該培養基包含10%胎牛血清(FBS)、0.1mM非必需胺基酸(NEAA)及100單位/mL青黴素及100μg/mL鏈黴素。該細胞株係用於至多40次繼代且隨後將其棄除。將1ml小瓶中之冷凍細胞於水浴中解凍1-2分鐘並添加至5mL 37℃的細胞培養基中。各T燒瓶具有8.5mL新鮮培養基及1.5mL細胞原液。使細胞於一周內繼代兩次。此係藉由以下步驟來實現：使用10mL磷酸鹽緩衝鹽水-乙二胺四乙酸(PBS-EDTA)沖洗該等燒瓶，歷時2-5分鐘添加2mL胰蛋白酶以使細胞分離，並添加8mL新鮮培養基以抑制胰蛋白酶之進一步活性。對各新燒瓶添加8.5mL新鮮培養基及1.5mL細胞原液之組合，以獲得1：6細胞稀釋液。於37℃下培養細胞，直至可用於攝取研究。
於轉染步驟前1天，用平板培養在T燒瓶中長滿70-80%的細胞。使用PBS-EDTA及胰蛋白酶處理具有細胞原液之燒瓶，以使細胞分離，並從此刻開始使用轉染培養基。轉染培養基係由杜貝卡氏改良依格培養基(DMEM)+NEAA組成。將0.5mL細胞混合物(1.3x105係所需細胞濃度)添加至各孔中且於37℃下培養該等細胞過夜。於分析前24小時，使用PEPT1轉染該等細胞。藉由混合600μL無血清轉染培養基、18μL FuGene6(Roche Diagnostics)及11μg PepT1 DNA來製備轉染混合物。培養轉染試劑-DNA錯合物20分鐘並將24μL該試劑-DNA錯合物添加至各孔中。
如先前所公佈(Zhang等人，2004.J.Pharm.Exper Ther.310：437-445)，於轉染後24小時測量於24孔板中培養之細胞中對PEPT1介導型[甘胺醯-1-2-14C]甘胺醯肌胺酸(GlySar)攝取活性之抑制作用。為測量本發明化合物抑制攝取[14C]Gly-Sar之能力，在存在5μM[14C]Gly-Sar(Moravek Biochemicals)及20μM冷Gly-Sar之pH6.0攝取培養基中，使用80至90%長滿之PepT1臨時轉染HeLa細胞培養5mM前藥。攝取培 養基係由140mM NaCl、5.4mM KCl、1.8mM CaCl2、0.8mM MgSO4、5mM葡萄糖、25mM叁(羥甲基)甲烷緩衝劑(TRIS)組成。隨後使用2-(N-嗎啉基)乙磺酸將該溶液調整至pH6.0。該培養體積係500μL且於室溫下進行3分鐘。為在培養時間結束時停止攝取，抽吸掉細胞單層中之攝取培養基並將500μL冰冷PBS添加至孔中。使用500μL不含Ca+2及Mg+2之室溫PBS沖洗該等細胞3次。隨後使用300μL 1% Triton X100 H2O溶液溶解該等細胞。移除200μL分液並藉由液體閃爍計數法測定放射性，以測量各培養孔中所存在之[14C]Gly-Sar。建立無抑制劑對照組並計算各前藥相對於此對照組之抑制百分比。在各實驗的同時進行陰性對照(甘胺酸)及兩個陽性對照(頭孢羥胺苄(Cefadroxil)及頭孢胺苄(Cefalexin))以顯示分析系統之有效性。GlySar攝取抑制作用等效於或優於頭孢胺苄之前藥係視為可接受。就甘胺酸而言，平均值±標準偏差係10.1±9.5%(n=19)；就頭孢羥胺苄而言，平均值±標準偏差係53.2±13.2%(n=19)；且就頭孢胺苄而言，平均值±標準偏差係37.5±14.7%(n=18)。
就PepT IC50分析而言，於5μM[14C]Gly-Sar及20μM冷Gly-Sar之存在下，以0.0625至25mM的濃度範圍培養前藥。該等培養及取樣步驟係與上述PepT1篩選完全相同。針對各前藥濃度評估[14C]Gly-Sar攝取數據並計算IC50值。
在實質上如上進行的此分析中，測得實例5、6及7在5mM下分別具有89%、87%及78%之hPepT1[3H]Gly-Sar攝取抑制。在實質上如上進行的此分析中，測得實例5及6分別具有1.98mM及0.25mM之hPepT1[3H]Gly-Sar攝取抑制IC50。此等結果顯示本發明範圍內之化合物係經由PepT1轉運體經口吸收。
活體外腸道前藥水解分析
自Celsius In Vitro Technologies(Baltimore，MD)獲得不含苯甲基 磺醯氟(PMSF)及EDTA之冷凍人類十二指腸腸道勻漿(1：2組織：緩衝劑比例，使用100mM Tris磷酸鹽緩衝劑，pH 7.4)。
各組人類十二指腸係自單一供體獲得且刮拭該腸道並冷凍分離各部分。於4℃下收集所有原始組織並立即於-70℃下冷凍。使人類腸道勻漿解凍並於100mM PBS緩衝劑(pH 7.4)中稀釋至0.5mg/mL之最終蛋白質濃度，接著立即培養。
於96孔板中進行培養且所有前藥係每天重複操作。於水中製備濃度為1mM之前藥原液。將0.5mg/mL腸道勻漿之200μL分液及196μL 100mM PBS緩衝劑放置於37℃水浴中之96孔板中。使用96孔移液器，將4μL 1mM前藥溶液轉移至該勻漿中。在剛添加完該前藥後(時間零點)及培養1小時後，使用自動可棄式同步96孔移液器移出50μL培養混合物樣品並將其直接添加至含有100ng/mL內標物之200μL甲醇淬滅溶液中。隨後使該等樣品於10℃下以3500rpm離心5分鐘。將上清液(200μL)轉移至最終96孔PCR板中並密封以用於LC/MS/MS分析。
於具有Analyst版本1.4.2、TurboIonSpray(正離子化)及選擇性反應監測(SRM)之Sciex API 4000四極桿質譜儀上使用LC/MS/MS測定該等培養混合物中之水解活性代謝物之濃度。於室溫下，使用流速為1.0mL/min且流動相梯度係自0.1%流動相A至99%流動相A之Waters Atlantis®T3(20 x 2.1mm，5μM)HPLC管柱。流動相A係1000：5水：七氟丁酸且流動相B係1：1甲醇：冰乙酸。
自藉由在100mM PBS(pH 7.4)中重複進行開始於10μM之兩倍稀釋且隨後使用與該等樣品相同之甲醇-內標溶液淬滅所製得之標準曲線測定該等腸培養混合物中之水解活性代謝物之濃度。使用Microsoft®Office Excel®2007計算平均數及標準偏差。水解量係測定為所形成之活性代謝物相對於添加之前藥濃度之莫耳百分比。在各組 中進行之陽性對照之水解(內部前藥A水解成內部活性代謝物藥物A)平均為75.3%(n=20)。隨後，使最終值相對於內部活性代謝物藥物A之形成標準化。
在實質上如上進行的此分析中，測得實例5、6及7相對於內部前藥A分別具有36%(n=3，SD=2.7)、44%(n=3，SD=4.1)及34%(n=1)之人類腸道水解度。此等結果顯示本發明範圍內之化合物係在人類腸道中水解。
活體外人肝S-9勻漿水解分析
肝S9部分係自Xenotech LLC(Lenexa，MO)獲得。該批料係自兩個供體(一個雄性及一個雌性)庫獲得。製備肝S9部分並使用由50mM Tris(在4℃下pH為7.4)及150mM氯化鉀組成之不含EDTA之均質化緩衝劑稀釋。於37℃下，將前藥於肝臟勻漿中培養2小時，然後藉由LC/MS/MS測定活性代謝物之濃度。氯吡格雷(Clopidogrel)水解成氯吡格雷羧酸係用作分析陽性對照。
以96孔模式進行培養且所有前藥係每天重複操作。於水中製備濃度為1mM之前藥原液。將人肝S9部分於100mM PBS緩衝劑(pH 7.4)中稀釋至0.5mg/ml的最終蛋白質濃度。
將0.5mg/mL人肝S-9勻漿之200μL分液及196μL之100mM PBS緩衝劑放置於37℃水浴中之96孔板中。使用96孔移液器，將4μL之1mM前藥溶液轉移至該勻漿中。為確保水解係並非由於化學不安定性，亦單獨使用不含肝S-9之PBS緩衝劑培養前藥。在剛添加完該前藥後(時間零點)及培養1小時後，使用自動可棄式同步96孔移液器移出50μL培養混合物樣品並將其直接添加至含有100ng/mL內標物之200μL甲醇淬滅溶液中。隨後使該等樣品於10℃下以3500rpm離心5分鐘。將上清液(200μL)轉移至最終96孔PCR板中並密封以用於LC/MS/MS分析。
於Sciex API 4000(Analyst版本1.4.2、TurboIonSpray(正離子化)及選擇性反應監測(SRM))上進行於培養期間形成之活性代謝物之LC/MS/MS定量。所使用之HPLC管柱係在周圍溫度下之流動相流速為1.0mL/min之Waters Atlantis®T3(20 x 2.1mm，5μm)。流動相A係1000：5水：七氟丁酸且流動相B係1：1甲醇：冰乙酸。所使用的流動相梯度係初始流動相比例A/B為99.9/0.1且最終比例為1/99。
自藉由在100mM PBS(pH 7.4)中重複進行開始於10μM之兩倍稀釋且隨後使用與該等樣品相同之甲醇-內標溶液淬滅所製得之標準曲線測定該等培養混合物中之水解活性代謝物之濃度。使用Microsoft®Office Excel®2007計算平均數及標準偏差。最終值係以形成之活性代謝物相對於添加之前藥濃度之莫耳百分比表示。氯吡格雷水解成氯吡格雷羧酸係用作陽性對照且平均值為73.0%(n=27)。
在實質上如上進行的此分析中，測得實例8及9分別具有23%及59.3%之人肝S9水解度。此等結果顯示本發明範圍內之化合物係在人肝中水解。
該數據顯示示例性胺基酸前藥對PepT1底物GlySar之攝入之抑制作用等效於或優於頭孢羥胺苄及頭孢胺苄(Zhang等人，2004.JPET 310：437-445)，此顯示可經由PepT1轉運體實現人類經口吸收。除前藥吸收以外，當前藥進入人體時，其必須水解產生活性代謝物。當前活體外水解顯示示例性胺基酸前藥可經人類腸道水解。示例性二酯前藥之水解發生於人肝勻漿中，此顯示示例性二酯前藥可在口部接觸後在人體中水解。此等數據共同指示示例性胺基酸前藥及示例性二酯前藥可在人體中水解以釋放活性代謝物。
藥物動力學分析
以標準交叉設計(N=3，其中各大鼠接受靜脈內及口服給藥)的方式，對空腹的雄性Sprague Dawley大鼠靜脈內投與1mg/kg實例2或灌 胃7.5mg/kg(與實例2之5mg/kg莫耳當量相等)劑量的實例5。就靜脈內投與而言，將實例2溶解於水中且就口服給藥而言實例5係於羥乙基纖維素(1%)、聚山梨醇酯80(0.25%)及防沫劑1510-US(0.05%)之水性媒劑中製備。藉由手術植入插管以促進連續血液採集。在投藥後0至24小時期間，將血液採集於EDTA管中，離心並冷凍儲存血漿直至用於分析。
解凍血漿樣品，將50μL分液轉移至96孔板中，添加50μL內標溶液並混合該等樣品。隨後添加300μL乙腈，震盪混合該等樣品3分鐘並離心。將上清液之300μL分液轉移至另一板中並於40℃及氮氣下蒸發。使該殘餘物於100μL之0.5%七氟丁酸水溶液中復水，震盪混合並離心。隨後藉由使用Shimadzu自動取樣器及連接有AB Sciex 4000質譜儀之HPLC系統之LC/MS/MS，在正離子Turbospray模式下分析20μL分液。MS/MS躍遷係283.2->44.2amu(前藥實例5)及212.1->103.1amu(活性實例2)。使用Atlantis T3(50 x 2.1mm，5微米HPLC管柱，流動相流速為1.0mL/分鐘且二元流動相為(A)0.2%甲酸水溶液及(B)乙腈-水(1：1，體積/體積)且梯度為2%B至98%B(歷時0.8分鐘))。實例2之滯留時間係約0.53分鐘。
使用Windows之Watson(Thermo Scientific)自血漿濃度數據計算藥物動力學參數。藉由比較靜脈內投與活性實例2後之血漿濃度時間曲線下面積(AUC)與口服前藥實例5後活性代謝物之AUC來測定相對口服生物利用率。
成功的前藥必須係在口服後經良好吸收且隨後水解以釋放活性代謝物至體循環中。相對生物利用率藉由比較口服前藥後活性代謝物之AUC與靜脈內投與該活性化合物後活性物之AUC包括兩種參數。在雄性大鼠中，在實質上如上進行的此分析中測得口服前藥實例5後之活性代謝物之相對生物利用率係60±14%(平均值±標準偏差)，此顯示 前藥實例5係在活體內經良好吸收且充分水解以產生活性代謝物。

Claims (26)

  1. 一種式I化合物或其醫藥上可接受之鹽， 其中R1係氫，R2係氫，且R3係氫；R1係氫，R2係(2S)-2-胺基丙醯基，且R3係氫；R1係氫，R2係(2S)-2-胺基-4-甲硫基-丁醯基，且R3係氫；R1係氫，R2係2-胺基乙醯基，且R3係氫；R1係苄基，R2係氫，且R3係苄基；或R1係(2-氟苯基)甲基，R2係氫，且R3係(2-氟苯基)甲基。
  2. 如請求項1之化合物，其係(1S,2S,5R,6S)-2-胺基螺[雙環[3.1.0]己烷-4,1'-環丙烷]-2,6-二羧酸或其醫藥上可接受之鹽。
  3. 如請求項1之化合物，其係(1S,2S,5R,6S)-2-胺基螺[雙環[3.1.0]己烷-4,1'-環丙烷]-2,6-二羧酸鹽酸鹽。
  4. 如請求項1之化合物，其係(1S,2S,5R,6S)-2-[[(2S)-2-胺基丙醯基]胺基]螺[雙環[3.1.0]己烷-4,1'-環丙烷]-2,6-二羧酸或其醫藥上可接受之鹽。
  5. 如請求項1之化合物，其係(1S,2S,5R,6S)-2-[[(2S)-2-胺基丙醯基]胺基]螺[雙環[3.1.0]己烷-4,1'-環丙烷]-2,6-二羧酸鹽酸鹽。
  6. 如請求項1之化合物，其係(1S,2S,5R,6S)-2-[[(2S)-2-胺基丙醯基]胺基]螺[雙環[3.1.0]己烷-4,1'-環丙烷]-2,6-二羧酸；1,4-二噁烷 (1：0.5)；鹽酸鹽。
  7. 如請求項1之化合物，其係(1S,2S,5R,6S)-2-[[(2S)-2-胺基-4-甲硫基-丁醯基]胺基]螺[雙環[3.1.0]己烷-4,1'-環丙烷]-2,6-二羧酸或其醫藥上可接受之鹽。
  8. 如請求項1之化合物，其係(1S,2S,5R,6S)-2-[[(2S)-2-胺基-4-甲硫基-丁醯基]胺基]螺[雙環[3.1.0]己烷-4,1'-環丙烷]-2,6-二羧酸鹽酸鹽。
  9. 如請求項1之化合物，其係(1S,2S,5R,6S)-2-[(2-胺基乙醯基)胺基]螺[雙環[3.1.0]己烷-4,1'-環丙烷]-2,6-二羧酸或其醫藥上可接受之鹽。
  10. 如請求項1之化合物，其係(1S,2S,5R,6S)-2-[(2-胺基乙醯基)胺基]螺[雙環[3.1.0]己烷-4,1'-環丙烷]-2,6-二羧酸鹽酸鹽。
  11. 如請求項1之化合物，其係(1S,2S,5R,6S)-2-胺基螺[雙環[3.1.0]己烷-4,1'-環丙烷]-2,6-二羧酸二苄酯或其醫藥上可接受之鹽。
  12. 如請求項1之化合物，其係(1S,2S,5R,6S)-2-胺基螺[雙環[3.1.0]己烷-4,1'-環丙烷]-2,6-二羧酸二苄酯；1,4-二噁烷；鹽酸鹽。
  13. 如請求項1之化合物，其係(1S,2S,5R,6S)-2-胺基螺[雙環[3.1.0]己烷-4,1'-環丙烷]-2,6-二羧酸雙[(2-氟苯基)甲基]酯或其醫藥上可接受之鹽。
  14. 如請求項1之化合物，其係(1S,2S,5R,6S)-2-胺基螺[雙環[3.1.0]己烷-4,1'-環丙烷]-2,6-二羧酸雙[(2-氟苯基)甲基]酯鹽酸鹽。
  15. 一種醫藥組合物，其包含如請求項1至14中任一項之化合物或鹽及醫藥上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑。
  16. 如請求項1至14中任一項之化合物或鹽，其係用於治療。
  17. 如請求項1至14中任一項之化合物或鹽，其係用於治療選自由持續性疼痛、神經性疼痛、慢性炎性疼痛及內臟性疼痛組成之群 之神經疾病。
  18. 如請求項17所使用之化合物或鹽，其中該神經疾病係持續性疼痛。
  19. 如請求項17所使用之化合物或鹽，其中該神經疾病係神經性疼痛。
  20. 如請求項17所使用之化合物或鹽，其中該神經疾病係慢性炎性疼痛。
  21. 如請求項17所使用之化合物或鹽，其中該神經疾病係內臟性疼痛。
  22. 如請求項1至14中任一項之化合物或鹽，其用於治療選自由精神分裂症、雙極症、泛焦慮症及創傷後壓力症組成之群之精神疾病。
  23. 如請求項22所使用之化合物或鹽，其中該精神疾病係精神分裂症。
  24. 如請求項22所使用之化合物或鹽，其中該精神疾病係雙極症。
  25. 如請求項22所使用之化合物或鹽，其中該精神疾病係泛焦慮症。
  26. 如請求項22所使用之化合物或鹽，其中該精神疾病係創傷後壓力症。
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