KR101518365B1 - Mglu 2/3 효능제 - Google Patents

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루르드 프리에토
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Abstract

본 발명은 신경계 또는 정신 장애의 치료에 유용한 하기 화학식 I의 신규 mGlu2/3 효능제를 제공한다.
<화학식 I>

Description

MGLU 2/3 효능제 {MGLU 2/3 AGONISTS}
본 발명은 mGlu2/3 효능제, 보다 구체적으로, 신규 4-치환된 비시클로[3.1.0]헥산 및 그의 전구약물, 그의 제약 조성물 및 그의 치료 용도에 관한 것이다.
L-글루타메이트는 중추 신경계에서 주요 흥분성 신경전달물질이고, 흥분성 아미노산으로 지칭된다. 대사성 글루타메이트 (mGlu) 수용체는 뉴런 흥분성을 조절하는 G-단백질-커플링된 수용체이다. 신경계 또는 정신 장애의 치료는 mGlu 흥분성 아미노산 수용체의 선택적 활성화와 연결되어 왔다. 보다 특히, 연구는 mGlu2/3 효능제가 진통, 항정신병, 불안완화, 항우울 및 신경보호 특성을 갖는 것을 증명한다. 따라서, mGlu2/3 효능제의 이러한 특성은, 신경계 장애, 예컨대 만성 통증 상태, 또는 정신 장애, 예컨대 정신분열증, 양극성 장애 (또한, 조울 장애로 공지됨), 범불안 장애 및 외상후 스트레스 장애의 치료에 유용할 수 있다.
WO9717952에는 흥분성 아미노산 수용체 길항제인 것으로 주장된 특정 4-치환된 비시클로[3.1.0]헥산 화합물이 개시되어 있다.
과잉의 글루타메이트성 긴장은 중추 신경계의 다수의 질환 상태에 관여되어 있으나; 이러한 병리생리학적 상태를 교정하기 위한 유효 작용제는 임상 실무에서 결여되어 있다. 특히, 임상 적용은 적절한 약물-유사 특성을 갖는 mGlu2/3 효능제의 결여로 인해 실현되지 않았다. 따라서, 강력하고 유효한 mGlu2/3 효능제에 대한 필요성이 여전히 존재한다. 본 발명은 강력하고 효과적인 mGlu2/3 효능제인 신규 4-치환된 비시클로[3.1.0]헥산 및 그의 전구약물을 제공한다. 본 발명의 범주 내의 특정한 전구약물은 경구 투여 후에 잘 흡수되고, 후속적으로 가수분해되어 활성 대사물을 체순환 내로 방출하며, 따라서 임상 개발에 적합하다. 본 발명의 이러한 신규 화합물은 신경계 장애, 예컨대 만성 통증 상태, 예를 들어 지속성 통증, 신경병증성 통증, 만성 염증성 통증 또는 내장통, 또는 정신 장애, 예컨대 정신분열증, 양극성 장애, 범불안 장애 또는 외상후 스트레스 장애의 강력하고 효과적인 치료에 대한 필요성을 해결할 수 있었다.
본 발명은 하기 화학식 I의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 제공한다.
<화학식 I>
Figure 112014071781979-pct00001
여기서,
R1은 수소이고, R2는 수소이고, R3은 수소이거나;
R1은 수소이고, R2는 (2S)-2-아미노프로파노일이고, R3은 수소이거나;
R1은 수소이고, R2는 (2S)-2-아미노-4-메틸술파닐-부타노일이고, R3은 수소이거나;
R1은 수소이고, R2는 2-아미노아세틸이고, R3은 수소이거나;
R1은 벤질이고, R2는 수소이고, R3은 벤질이거나; 또는
R1은 (2-플루오로페닐)메틸이고, R2는 수소이고, R3은 (2-플루오로페닐)메틸이다.
본 발명은 (1S,2S,5R,6S)-2-아미노스피로[비시클로[3.1.0]헥산-4,1'-시클로프로판]-2,6-디카르복실산 또는 그의 제약상 허용되는 염을 제공한다.
특정한 실시양태로서, 본 발명은 (1S,2S,5R,6S)-2-아미노스피로[비시클로[3.1.0]헥산-4,1'-시클로프로판]-2,6-디카르복실산을 제공한다.
특정한 실시양태로서, 본 발명은 (1S,2S,5R,6S)-2-아미노스피로[비시클로[3.1.0]헥산-4,1'-시클로프로판]-2,6-디카르복실산의 염산 염을 제공한다.
본 발명은 (1S,2S,5R,6S)-2-[[(2S)-2-아미노프로파노일]아미노]스피로[비시클로[3.1.0]헥산-4,1'-시클로프로판]-2,6-디카르복실산 또는 그의 제약상 허용되는 염을 제공한다.
특정한 실시양태로서, 본 발명은 (1S,2S,5R,6S)-2-[[(2S)-2-아미노프로파노일]아미노]스피로[비시클로[3.1.0]헥산-4,1'-시클로프로판]-2,6-디카르복실산 히드로클로라이드를 제공한다.
특정한 실시양태로서, 본 발명은 (1S,2S,5R,6S)-2-[[(2S)-2-아미노프로파노일]아미노]스피로[비시클로[3.1.0]헥산-4,1'-시클로프로판]-2,6-디카르복실산; 1,4-디옥산 (1: 0.5); 히드로클로라이드를 제공한다.
본 발명은 (1S,2S,5R,6S)-2-[[(2S)-2-아미노-4-메틸술파닐-부타노일]아미노]스피로[비시클로[3.1.0]헥산-4,1'-시클로프로판]-2,6-디카르복실산 또는 그의 제약상 허용되는 염을 제공한다.
특정한 실시양태로서, 본 발명은 (1S,2S,5R,6S)-2-[[(2S)-2-아미노-4-메틸술파닐-부타노일]아미노]스피로[비시클로[3.1.0]헥산-4,1'-시클로프로판]-2,6-디카르복실산 히드로클로라이드를 제공한다.
본 발명은 (1S,2S,5R,6S)-2-[(2-아미노아세틸)아미노]스피로[비시클로[3.1.0]헥산-4,1'-시클로프로판]-2,6-디카르복실산 또는 그의 제약상 허용되는 염을 제공한다.
특정한 실시양태로서, 본 발명은 (1S,2S,5R,6S)-2-[(2-아미노아세틸)아미노]스피로[비시클로[3.1.0]헥산-4,1'-시클로프로판]-2,6-디카르복실산 히드로클로라이드를 제공한다.
본 발명은 디벤질 (1S,2S,5R,6S)-2-아미노스피로[비시클로[3.1.0]헥산-4,1'-시클로프로판]-2,6-디카르복실레이트 또는 그의 제약상 허용되는 염을 제공한다.
특정한 실시양태로서, 본 발명은 디벤질 (1S,2S,5R,6S)-2-아미노스피로[비시클로[3.1.0]헥산-4,1'-시클로프로판]-2,6-디카르복실레이트; 1,4-디옥산; 히드로클로라이드를 제공한다.
본 발명은 비스[(2-플루오로페닐)메틸] (1S,2S,5R,6S)-2-아미노스피로[비시클로[3.1.0]헥산-4,1'-시클로프로판]-2,6-디카르복실레이트 또는 그의 제약상 허용되는 염을 제공한다.
특정한 실시양태로서, 본 발명은 비스[(2-플루오로페닐)메틸] (1S,2S,5R,6S)-2-아미노스피로[비시클로[3.1.0]헥산-4,1'-시클로프로판]-2,6-디카르복실레이트 히드로클로라이드를 제공한다.
본 발명은 (1S,2S,5R,6S)-2-아미노스피로[비시클로[3.1.0]헥산-4,1'-시클로프로판]-2,6-디카르복실산 또는 그의 제약상 허용되는 염, (1S,2S,5R,6S)-2-[[(2S)-2-아미노프로파노일]아미노]스피로[비시클로[3.1.0]헥산-4,1'-시클로프로판]-2,6-디카르복실산 또는 그의 제약상 허용되는 염, (1S,2S,5R,6S)-2-[[(2S)-2-아미노-4-메틸술파닐-부타노일]아미노]스피로[비시클로[3.1.0]헥산-4,1'-시클로프로판]-2,6-디카르복실산 또는 그의 제약상 허용되는 염, (1S,2S,5R,6S)-2-[(2-아미노아세틸)아미노]스피로[비시클로[3.1.0]헥산-4,1'-시클로프로판]-2,6-디카르복실산 또는 그의 제약상 허용되는 염, 디벤질 (1S,2S,5R,6S)-2-아미노스피로[비시클로[3.1.0]헥산-4,1'-시클로프로판]-2,6-디카르복실레이트 또는 그의 제약상 허용되는 염, 또는 비스[(2-플루오로페닐)메틸] (1S,2S,5R,6S)-2-아미노스피로[비시클로[3.1.0]헥산-4,1'-시클로프로판]-2,6-디카르복실레이트 또는 그의 제약상 허용되는 염을 제약상 허용되는 담체 및 임의로 다른 치료 성분과 함께 포함하는 제약 조성물을 제공한다.
본 발명은 (1S,2S,5R,6S)-2-아미노스피로[비시클로[3.1.0]헥산-4,1'-시클로프로판]-2,6-디카르복실산 또는 그의 제약상 허용되는 염, (1S,2S,5R,6S)-2-[[(2S)-2-아미노프로파노일]아미노]스피로[비시클로[3.1.0]헥산-4,1'-시클로프로판]-2,6-디카르복실산 또는 그의 제약상 허용되는 염, (1S,2S,5R,6S)-2-[[(2S)-2-아미노-4-메틸술파닐-부타노일]아미노]스피로[비시클로[3.1.0]헥산-4,1'-시클로프로판]-2,6-디카르복실산 또는 그의 제약상 허용되는 염, (1S,2S,5R,6S)-2-[(2-아미노아세틸)아미노]스피로[비시클로[3.1.0]헥산-4,1'-시클로프로판]-2,6-디카르복실산 또는 그의 제약상 허용되는 염, 디벤질 (1S,2S,5R,6S)-2-아미노스피로[비시클로[3.1.0]헥산-4,1'-시클로프로판]-2,6-디카르복실레이트 또는 그의 제약상 허용되는 염, 또는 비스[(2-플루오로페닐)메틸] (1S,2S,5R,6S)-2-아미노스피로[비시클로[3.1.0]헥산-4,1'-시클로프로판]-2,6-디카르복실레이트 또는 그의 제약상 허용되는 염, 및 제약상 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는 제약 조성물을 제공한다.
본 발명은 신경계 또는 정신 장애의 치료를 필요로 하는 환자에게 유효량의 (1S,2S,5R,6S)-2-아미노스피로[비시클로[3.1.0]헥산-4,1'-시클로프로판]-2,6-디카르복실산 또는 그의 제약상 허용되는 염, (1S,2S,5R,6S)-2-[[(2S)-2-아미노프로파노일]아미노]스피로[비시클로[3.1.0]헥산-4,1'-시클로프로판]-2,6-디카르복실산 또는 그의 제약상 허용되는 염, (1S,2S,5R,6S)-2-[[(2S)-2-아미노-4-메틸술파닐-부타노일]아미노]스피로[비시클로[3.1.0]헥산-4,1'-시클로프로판]-2,6-디카르복실산 또는 그의 제약상 허용되는 염, (1S,2S,5R,6S)-2-[(2-아미노아세틸)아미노]스피로[비시클로[3.1.0]헥산-4,1'-시클로프로판]-2,6-디카르복실산 또는 그의 제약상 허용되는 염, 디벤질 (1S,2S,5R,6S)-2-아미노스피로[비시클로[3.1.0]헥산-4,1'-시클로프로판]-2,6-디카르복실레이트 또는 그의 제약상 허용되는 염, 또는 비스[(2-플루오로페닐)메틸] (1S,2S,5R,6S)-2-아미노스피로[비시클로[3.1.0]헥산-4,1'-시클로프로판]-2,6-디카르복실레이트 또는 그의 제약상 허용되는 염을 투여하는 것을 포함하는, 신경계 또는 정신 장애의 치료 방법을 제공한다.
본 발명은 신경계 또는 정신 장애의 치료를 위한 의약의 제조를 위한, (1S,2S,5R,6S)-2-아미노스피로[비시클로[3.1.0]헥산-4,1'-시클로프로판]-2,6-디카르복실산 또는 그의 제약상 허용되는 염, (1S,2S,5R,6S)-2-[[(2S)-2-아미노프로파노일]아미노]스피로[비시클로[3.1.0]헥산-4,1'-시클로프로판]-2,6-디카르복실산 또는 그의 제약상 허용되는 염, (1S,2S,5R,6S)-2-[[(2S)-2-아미노-4-메틸술파닐-부타노일]아미노]스피로[비시클로[3.1.0]헥산-4,1'-시클로프로판]-2,6-디카르복실산 또는 그의 제약상 허용되는 염, (1S,2S,5R,6S)-2-[(2-아미노아세틸)아미노]스피로[비시클로[3.1.0]헥산-4,1'-시클로프로판]-2,6-디카르복실산 또는 그의 제약상 허용되는 염, 디벤질 (1S,2S,5R,6S)-2-아미노스피로[비시클로[3.1.0]헥산-4,1'-시클로프로판]-2,6-디카르복실레이트 또는 그의 제약상 허용되는 염, 또는 비스[(2-플루오로페닐)메틸] (1S,2S,5R,6S)-2-아미노스피로[비시클로[3.1.0]헥산-4,1'-시클로프로판]-2,6-디카르복실레이트 또는 그의 제약상 허용되는 염의 용도를 제공한다.
본 발명은 요법에 사용하기 위한, (1S,2S,5R,6S)-2-아미노스피로[비시클로[3.1.0]헥산-4,1'-시클로프로판]-2,6-디카르복실산 또는 그의 제약상 허용되는 염, (1S,2S,5R,6S)-2-[[(2S)-2-아미노프로파노일]아미노]스피로[비시클로[3.1.0]헥산-4,1'-시클로프로판]-2,6-디카르복실산 또는 그의 제약상 허용되는 염, (1S,2S,5R,6S)-2-[[(2S)-2-아미노-4-메틸술파닐-부타노일]아미노]스피로[비시클로[3.1.0]헥산-4,1'-시클로프로판]-2,6-디카르복실산 또는 그의 제약상 허용되는 염, (1S,2S,5R,6S)-2-[(2-아미노아세틸)아미노]스피로[비시클로[3.1.0]헥산-4,1'-시클로프로판]-2,6-디카르복실산 또는 그의 제약상 허용되는 염, 디벤질 (1S,2S,5R,6S)-2-아미노스피로[비시클로[3.1.0]헥산-4,1'-시클로프로판]-2,6-디카르복실레이트 또는 그의 제약상 허용되는 염, 또는 비스[(2-플루오로페닐)메틸] (1S,2S,5R,6S)-2-아미노스피로[비시클로[3.1.0]헥산-4,1'-시클로프로판]-2,6-디카르복실레이트 또는 그의 제약상 허용되는 염을 제공한다. 본 발명은 또한 신경계 또는 정신 장애의 치료에 사용하기 위한, (1S,2S,5R,6S)-2-아미노스피로[비시클로[3.1.0]헥산-4,1'-시클로프로판]-2,6-디카르복실산 또는 그의 제약상 허용되는 염, (1S,2S,5R,6S)-2-[[(2S)-2-아미노프로파노일]아미노]스피로[비시클로[3.1.0]헥산-4,1'-시클로프로판]-2,6-디카르복실산 또는 그의 제약상 허용되는 염, (1S,2S,5R,6S)-2-[[(2S)-2-아미노-4-메틸술파닐-부타노일]아미노]스피로[비시클로[3.1.0]헥산-4,1'-시클로프로판]-2,6-디카르복실산 또는 그의 제약상 허용되는 염, (1S,2S,5R,6S)-2-[(2-아미노아세틸)아미노]스피로[비시클로[3.1.0]헥산-4,1'-시클로프로판]-2,6-디카르복실산 또는 그의 제약상 허용되는 염, 디벤질 (1S,2S,5R,6S)-2-아미노스피로[비시클로[3.1.0]헥산-4,1'-시클로프로판]-2,6-디카르복실레이트 또는 그의 제약상 허용되는 염, 또는 비스[(2-플루오로페닐)메틸] (1S,2S,5R,6S)-2-아미노스피로[비시클로[3.1.0]헥산-4,1'-시클로프로판]-2,6-디카르복실레이트 또는 그의 제약상 허용되는 염을 제공한다
추가로, 본 발명은 신경계 장애가 지속성 통증, 신경병증성 통증, 만성 염증성 통증 및 내장통으로 이루어진 군으로부터 선택되고, 정신 장애가 정신분열증, 양극성 장애, 범불안 장애 및 외상후 스트레스 장애로 이루어진 군으로부터 선택된 것인, 본원에 기재된 바와 같은 방법 및 용도의 바람직한 실시양태를 제공한다.
상기 사용된, 및 본 발명의 설명에 걸쳐, 하기 용어는 달리 나타내지 않는 한, 하기 의미를 갖는 것으로 이해될 것이다:
"본 발명의 화합물(들)"은 전구약물, 활성 화합물 및/또는 활성 대사물을 포함한다. "전구약물"은 정상 대사 과정에 의해 신체 내에서 활성 형태로 전환되는 초기에 불활성 형태인 약물의 부류이며, 여기서 화학식 I에서 R1, R2 및 R3 중 적어도 1개는 수소 이외의 것 (예를 들어, R1은 수소이고, R2는 (2S)-2-아미노프로파노일이고, R3은 수소이거나; R1은 수소이고, R2는 (2S)-2-아미노-4-메틸술파닐-부타노일이고, R3은 수소이거나; R1은 수소이고, R2는 2-아미노아세틸이고, R3은 수소이거나; R1은 벤질이고, R2는 수소이고, R3은 벤질이거나; 또는 R1은 (2-플루오로페닐)메틸이고, R2는 수소이고, R3은 (2-플루오로페닐)메틸임)이다. "활성 화합물" 또는 "활성"은 신체로, 예를 들어, 정맥내로 또는 복강내로 투여되는 활성 형태에 대한 또 다른 명칭이며, 여기서 화학식 I에서 R1, R2 및 R3은 수소이다. "활성 대사물"은 정상 대사 과정에 의해 신체 내에서 전구약물의 전환으로부터 생성된 활성 형태에 대한 또 다른 명칭이며, 여기서 화학식 I에서 R1, R2, 및 R3은 수소이다.
"제약상 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제"는 포유동물, 예를 들어 인간에게 생물학적 활성제를 전달하기 위한, 당업계에서 일반적으로 인정되는 매질이다.
"제약상 허용되는 염"은 본 발명의 화합물의 상대적으로 비-독성인 무기 및 유기 염을 지칭한다.
"치료 유효량" 또는 "유효량"은 연구원, 수의사, 의사 또는 다른 임상의에 의해 조사되는 조직, 계통, 동물, 포유동물, 또는 인간에 대해 생물학적 또는 의학적 반응 또는 요구되는 치료 효과를 유도할, 본 발명의 화합물, 또는 그의 제약상 허용되는 염 또는 본 발명의 화합물, 또는 그의 제약상 허용되는 염을 함유하는 제약 조성물의 양을 의미한다.
용어 "치료," "치료하다," "치료하는" 등은 장애의 진행을 늦추거나 또는 역전시키는 것을 포함하도록 의미한다. 이들 용어는 또한, 비록 장애 또는 상태가 실제로 제거되지 않을지라도, 및 비록 장애 또는 상태의 진행 자체가 늦추어지거나 또는 역전되지 않을지라도 장애 또는 상태의 하나 이상의 증상을 경감, 완화, 약화, 제거 또는 감소시키는 것을 포함한다.
본 개시내용 전반에 걸쳐 사용된 표준 명명법 하에, 지정된 측쇄의 말단 부분이 먼저 기재되고, 이어서 부착 지점에 대해 인접한 관능기가 기재된다. 예를 들어, 메틸술포닐 치환기는 CH3-SO2-와 등가이다.
본 발명의 화합물은, 예를 들어 다수의 무기 및 유기 산과 반응하여 제약상 허용되는 산 부가염 또는 염기 부가염을 형성할 수 있다. 이러한 제약상 허용되는 염 및 이들을 제조하기 위한 통상적인 방법론은 당업계에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌 [P. Stahl, et al., HANDBOOK OF PHARMACEUTICAL SALTS: PROPERTIES, SELECTION AND USE, (VCHA/Wiley-VCH, 2002); S.M. Berge, et al., "Pharmaceutical Salts," Journal of Pharmaceutical Sciences, Vol 66, No. 1, January 1977]을 참조한다.
본 발명의 화합물은 바람직하게는 제약상 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제를 사용하여 제약 조성물로서 제제화되고, 다양한 경로에 의해 투여된다. 바람직하게는, 이러한 조성물은 경구 또는 정맥내 투여를 위한 것이다. 이러한 제약 조성물 및 그를 제조하는 방법은 당업계에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Remington: The Science and Practice of Pharmacy (A. Gennaro, et al., eds., 21st ed., Mack Publishing Co., 2005)]을 참조한다.
실제로 투여되는 본 발명의 화합물은 치료할 상태, 선택된 투여 경로, 투여되는 본 발명의 실제 화합물 또는 화합물들, 개별 환자의 연령, 체중 및 반응 및 환자의 증상의 중증도를 비롯한 관련 상황 하에서 의사가 결정할 것이다. 1일 투여량은 통상적으로 약 0.1 내지 약 300 ㎎ 범위내이다. 일부 경우에 상기 언급한 범위의 하한치 미만의 투여량 수준이 훨씬 더 충분할 수 있지만, 다른 경우에는 훨씬 더 큰 용량이 사용될 수 있다.
본 발명의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염은 당업계에 공지된 다양한 절차 뿐만 아니라 하기 제조예 및 실시예에 기재된 절차에 의해 제조될 수 있다. 기재된 각각의 경로에 대한 구체적인 합성 단계는 본 발명의 화합물, 또는 그의 제약상 허용되는 염을 제조하기 위해 다양한 방식으로 조합될 수 있다.
달리 나타내지 않는 한, 치환기는 이전에 정의된 바와 같다. 시약 및 출발 물질은 당업자에게 일반적으로 용이하게 입수가능하다. 다른 것들은 유기 및 헤테로시클릭 화학의 표준 기술, 공지된 구조적으로 유사한 활성 화합물 및 전구약물의 합성과 유사한 기술 및 임의의 신규 절차를 포함하는 하기 제조예 및 실시예에 기재된 절차에 의해 제조될 수 있다. 하기 제조예 및 실시예의 명명은 시믹스 드로우(Symyx Draw) 3.1을 사용하여 실시된다.
본원에 사용된 하기 용어는 제시된 의미를 갖는다: "HPLC"는 고압 액체 크로마토그래피를 지칭하고; "LC"는 액체 크로마토그래피를 지칭하고; "MS (ES+)"는 전기분무 이온화를 사용한 질량 분광분석법을 지칭하고; "MS"은 질량 분광분석법을 지칭하고; "SFC"는 초임계 유체 크로마토그래피를 지칭하고; "NMR"은 핵 자기 공명을 지칭하고; "TLC"는 박층 크로마토그래피를 지칭하고; "RT"는 체류 시간을 지칭하고; "UV"는 자외선을 지칭하고; "EDTA"는 에틸렌디아민테트라아세트산을 지칭하고; "PBS"는 포스페이트 완충 염수를 지칭하고; "PCR"은 폴리머라제 연쇄 반응를 지칭하고; "SCX"는 강한 양이온 교환을 지칭하고; "HLB"는 친수성-친지성 평형을 지칭한다.
제조예 1
디tert-부틸 (1S,2S,5R,6S)-2-(tert-부톡시카르보닐아미노)-4-메틸렌-비시클로[3.1.0]헥산-2,6-디카르복실레이트
Figure 112014071781979-pct00002
오븐-건조된 250 mL 둥근 바닥 플라스크를 메틸트리페닐포스포늄 브로마이드 (5.41 g, 14.9 mmol) 및 테트라히드로푸란 (93 mL)으로 충전하였다. 현탁액을 0℃로 냉각시키고, 테트라히드로푸란 중의 소듐 비스(트리메틸실릴)아미드 1M 용액 (16.08 mL, 16.08 mmol)을 적가하였다. 20분 동안 0℃에서 생성된 담황색 혼합물을 교반한 후, 테트라히드로푸란 (31 mL) 중의 디tert-부틸 (1S,2S,5R,6R)-2-(tert-부톡시카르보닐아미노)-4-옥소-비시클로[3.1.0]헥산-2,6-디카르복실레이트 (5.09 g, 12.4 mmol, 합성 세부사항을 위해 WO03/104217/A2 참조)의 용액을 첨가하였다. 반응을 실온으로 가온되도록 하고, 16시간 동안 교반하였다. 혼합물을 에틸 아세테이트 (500 mL) 및 물 (350 mL) 사이에 분배하였다. 수성 상을 폐기하고, 유기 상을 염수 (200 mL)로 세척하였다. 유기 상을 황산마그네슘 상에서 건조시키고, 여과하고, 감압 하에 농축시켰다. 에틸 아세테이트: 이소-헥산 (5:95 → 20:80)으로 용리하는 플래쉬 크로마토그래피 의해 정제하여 백색 고체로서 표제 화합물 (4.84 g, 11.2 mmol)을 수득하였다.
Figure 112014071781979-pct00003
제조예 2
디tert-부틸 (1S,2S,5R,6S)-2-(tert-부톡시카르보닐아미노)스피로[비시클로[3.1.0]헥산-4,1'-시클로프로판]-2,6-디카르복실레이트
Figure 112014071781979-pct00004
알드리치 미니-디아잘드(Aldrich mini-Diazald) 장치의 콜드-핑거를 카드아이스 및 이소-프로판올로 충전하여 그것을 1/3 채움으로써 디에틸 에테르 중의 디아조메탄의 에탄올 무함유 용액을 제조하였다. 상기 장치의 반응 일부에 물 (1.5 mL) 중의 수산화칼륨 (740 mg, 13.2 mmol)의 용액을 두었다. 이 용액에 디에틸렌 글리콜 모노에틸 에테르 (4 mL) 및 디에틸 에테르 (2.4 mL)의 혼합물을 첨가하였다. 디에틸 에테르 (13 mL) 및 디에틸렌 글리콜 모노에틸 에테르 (4 mL)의 혼합물 중에 N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘 (1 g, 6.8 mmol)을 용해시켰다. 이 용액을 매끈한 유리 연결부를 갖는 적하 깔때기 내에 두고, 미니-디아잘드 장치에 장착시켰다. 장치의 출구에서 디에틸 에테르로 채워진 수집 플라스크 및 버블러가 둘 다 카드아이스/ 이소-프로판올 배스 내에서 냉각되는 것을 확인하면서, 70℃에서 유지된 수조 내에서 수산화칼륨 용액을 가온하였다. N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘의 용액을 생성된 증류물의 속도와 동일한 속도로 첨가하였다. 일단 증류가 완결되면, 콜드 핑거 상의 응축물이 무색으로 될 때까지, 추가의 디에틸 에테르를 적하 깔때기를 통해 적가하였다. 필요시까지 생성된 용액을 카드아이스/이소-프로판올 배스 내에 저장하였다. 디에틸 에테르 (10 mL) 중의 아세트산팔라듐 (17.2 mg; 76.5 μmol)을 현탁시켰다. 생성된 연갈색 용액을 경사분리하고 여과하고, 디아조메탄 용액 디tert-부틸 (1S,2S,5R,6S)-2-(tert-부톡시카르보닐아미노)-4-메틸렌-비시클로[3.1.0]헥산-2,6-디카르복실레이트 (330 mg, 765.5 μmol) 및 디에틸 에테르 (10 mL)의 혼합물에 주의하여 첨가하고, 이를 주위 온도로 도달하도록 하였다. 일단 기체 발생이 중지되면, 생성된 현탁액을 여과하고, 감압 하에 농축시켜 미반응 디tert-부틸 (1S,2S,5R,6S)-2-(tert-부톡시카르보닐아미노)-4-메틸렌-비시클로[3.1.0]헥산-2,6-디카르복실레이트 및 표제 화합물의 혼합물 260 mg을 수득하였다.
물 (4 mL), 디에틸렌 글리콜 모노에틸 에테르 (14 mL) 및 디에틸 에테르 (8 mL) 중의 수산화칼륨 (2.5 g, 44.6 mmol), 및 디에틸 에테르 (30 mL) 및 디에틸렌 글리콜 모노에틸 에테르 (15 mL)의 혼합물 중의 N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘 (4 g, 27.2 mmol)의 용액으로부터의 디에틸 에테르 중의 디아조메탄의 에탄올 무함유 용액을 제조하였다. 생성된 디아조메탄의 용액을 취하고, 이것을 디에틸 에테르 (3 mL) 중의 미반응 디tert-부틸 (1S,2S,5R,6S)-2-(tert-부톡시카르보닐아미노)-4-메틸렌-비시클로[3.1.0]헥산-2,6-디카르복실레이트 및 표제 화합물 (260 mg)의 이전에 제조된 혼합물의 용액 중 아세트산팔라듐 (20 mg, 89.1 μmol)의 현탁액으로 30분에 걸쳐 조금씩 첨가하였다. 일단 기체 발생이 중지되면, 밤새 정치되도록 두고, 이어서 상 분리기 프릿을 통해 여과하고, 감압 하에 농축시켜 암색 오일을 수득하였다. 에틸 아세테이트: 이소-헥산 (0:100 → 75:25)으로 용리하는 플래쉬 크로마토그래피 의해 정제하여 미반응 디tert-부틸 (1S,2S,5R,6S)-2-(tert-부톡시카르보닐아미노)-4-메틸렌-비시클로[3.1.0]헥산-2,6-디카르복실레이트 및 표제 화합물의 혼합물 185 mg을 수득하였다.
물 (5 mL), 디에틸렌 글리콜 모노에틸 에테르 (4 mL) 및 디에틸 에테르 (10 mL) 중의 수산화칼륨 (3.2 g, 57 mmol) 및 디에틸 에테르 (35 mL) 및 디에틸렌 글리콜 모노에틸 에테르 (15 mL)의 혼합물 중의 N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘 (5 g, 34 mmol)의 용액으로부터 디에틸 에테르 중의 디아조메탄의 에탄올 무함유 용액을 제조하였다. 생성된 디아조메탄의 용액을 취하고, 이것을 디에틸 에테르 (2 mL) 중의 미반응 디tert-부틸 (1S,2S,5R,6S)-2-(tert-부톡시카르보닐아미노)-4-메틸렌-비시클로[3.1.0]헥산-2,6-디카르복실레이트 및 표제 화합물 (185 mg)의 이전에 제조된 혼합물의 용액 중 아세트산팔라듐 (20 mg, 89.1 μmol)의 현탁액으로 60분에 걸쳐 조금씩 첨가하였다. 일단 기체 발생이 중지되면, 30분 동안 정치되도록 두고, 여과하고, 감압 하에 농축시켜 황색 오일을 수득하였다. 질량 유도 HPLC (RT = 6.4분 (UV), 6.37분 (MS); LC 칼럼: 워터스 엑스브리지(Waters XBridge)™ 30mm x 100mm 5μm; 물 w/0.1% 포름산; 구배: 1.35분 내 28-62% 아세토니트릴 w/0.1% 포름산, 이어서 6.65분 내 62-95%, 이어서 3.55분 동안 95%에서 유지. 칼럼 온도: 주위; 유량: 45 mL/분)에 의해 정제하여 무색 오일로서 표제 화합물 (55.3 mg, 130.6 μmol)을 수득하였다.
Figure 112014071781979-pct00005
제조예 3
디에틸 (1S,2S,5R,6R)-2-아미노-4-옥소-비시클로[3.1.0]헥산-2,6-디카르복실레이트.
Figure 112014071781979-pct00006
응축기, 질소 유입구 및 온도계를 장착한 500 mL 3구 플라스크를 에탄올 (365 mL) 중의 디tert-부틸 (1S,2S,5R,6R)-2-(tert-부톡시카르보닐아미노)-4-옥소-비시클로[3.1.0]헥산-2,6-디카르복실레이트 (15 g, 36.4 mmol)로 충전하였다. 티오닐 클로라이드 (13.3 mL, 182.3 mmol)를 시린지를 통해 실온에서 교반 용액에 첨가하고 (약한 발열), 이어서 가열 환류시켰다. 24시간 후에 반응물을 실온으로 냉각시키고, 진공 하에 농축시켰다. 디클로로메탄 (50 mL) 중의 잔류물을 용해시키고, 이어서 회전 증발기 상에서 농축시켰다 (3회 반복). 잔류물을 에틸 아세테이트 (200 mL) 및 포화 나트륨 수소화 카르보네이트 (150 mL) 사이에 분배하였다. 염수 (150 mL)로 유기 상을 세척하고, 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고, 이어서 농축 건조시켜 오일로서 표제 화합물 (8.24 g, 32.3 mmol)을 수득하였다.
Figure 112014071781979-pct00007
제조예 4
디에틸 (1S,2S,5R,6R)-2-아세트아미도-4-옥소-비시클로[3.1.0]헥산-2,6-디카르복실레이트.
Figure 112014071781979-pct00008
아세트산 무수물 (5 mL, 50.8 mmol)을 건조 디클로로메탄 (72 mL) 중의 디에틸 (1S,2S,5R,6R)-2-아미노-4-옥소-비시클로[3.1.0]헥산-2,6-디카르복실레이트 (7.2 g, 28.2 mmol) 및 트리에틸아민 (7.9 mL, 56.4 mmol)의 교반 용액에 실온에서 첨가하였다. 2시간 후에, 물 (100 mL)로 켄칭하고, 20분 동안 격렬하게 교반하였다. 소수성 프릿을 통해 디클로로메탄 층을 분리하고, 담갈색 오일 (9.6 g)로 증발시켰다. 에틸 아세테이트: 이소-헥산 (70:30 → 90:10)으로 용리하는 플래쉬 크로마토그래피 의해 정제하여 건조시 발포되는 연황색 유리로서 표제 화합물 (6.53 g, 22 mmol)을 수득하였다.
Figure 112014071781979-pct00009
제조예 5
디에틸 (1S,2S,5R,6S)-2-아세트아미도-4-메틸렌-비시클로[3.1.0]헥산-2,6-디카르복실레이트.
Figure 112014071781979-pct00010
오븐-건조된 250 mL 둥근 바닥 플라스크를 (메틸)트리페닐포스포늄 브로마이드 (9.72 g, 26.7 mmol) 및 건조 테트라히드로푸란 (122 mL)으로 충전하였다. 현탁액을 0 내지 -5℃로 냉각시키고, 테트라히드로푸란 (13.3 mL, 26.7 mmol) 중의 2M 소듐 비스(트리메틸실릴)아미드를 적가 방식으로 처리하였다. 이어서, 20분 동안 0℃에서 생성된 담황색 혼합물을 교반하고, 테트라히드로푸란 (30 mL) 중의 디에틸 (1S,2S,5R,6R)-2-아세트아미도-4-옥소-비시클로[3.1.0]헥산-2,6-디카르복실레이트 (6.1g, 20.5 mmol)의 용액으로 처리하였다. 반응물을 3시간에 거쳐 실온으로 천천히 가온되도록 하였다. 실온에서 20시간 동안 교반한 후, 차가운 물 (200 mL)로 켄칭하고, 에틸 아세테이트 (200 mL)로 추출하였다. 추출물을 물 (100 mL), 염수 (100 mL)로 세척하고, 건조시키고, 여과하고, 암갈색 오일로 증발시켰다. 디에틸 에테르 (70 mL) 및 이소-헥산 (20 mL)을 첨가하고, 용액을 트리페닐포스핀 옥시드로 시딩하였다. 2시간 동안 정치되도록 하고, 용액을 경사분리하고, 실리카를 첨가하고, 진공 하에 농축시켰다. 에틸 아세테이트: 이소-헥산 (60:40 → 80:20)으로 용리하는 플래쉬 크로마토그래피 의해 정제하여 트리페닐포스핀 옥시드로 오염된 분홍색 오일 (6.81 g)을 수득하였다. 에틸 아세테이트: 이소-헥산 (60:40)으로 용리하는 플래쉬 크로마토그래피 의해 재정제하여 점성 황색 오일로서 표제 화합물 (3.98 g, 13.5 mmol)을 수득하였다.
Figure 112014071781979-pct00011
제조예 6
디에틸 (1S,2S,5R,6S)-2-아세트아미도스피로[비시클로[3.1.0]헥산-4,1'-시클로프로판]-2,6-디카르복실레이트
Figure 112014071781979-pct00012
질소 하에, 디클로로메탄 (12.5 mL) 중의 트리플루오로아세트산 (1.9 mL, 25 mmol)의 용액을 디클로로메탄 (12.5 mL) 중의 디에틸아연 (헵탄 중 1M) (25 mL, 25 mmol)의 차가운 (빙조) 교반 용액에 매우 천천히 적가하였다. 10분 후에, 디클로로메탄 (12.5 mL) 중의 디아이오도메탄 (2.01 mL, 25 mmol)의 용액을 첨가하였다. 10분 후에, 디클로로메탄 (12.5 mL) 중의 디에틸 (1S,2S,5R,6S)-2-아세트아미도-4-메틸렌-비시클로[3.1.0]헥산-2,6-디카르복실레이트 (2.46 g, 8.3 mmol)의 용액을 첨가하였다. 60분 후에 빙조를 제거하고, 반응 혼합물을 실온에서 밤새 교반되도록 두었다. 격렬한 교반 하에 투명한 반응 용액을 0.2M 수성 염산 (200 mL)으로 반응 혼합물의 적가에 의해 켄칭하였다. 1시간 후에 디클로로메탄 층을 분리하고, 염수로 세척하고, 황산마그네슘 상에서 건조시키고, 여과하고, 진공 하에 농축시켜 미반응 출발 물질로 오염된 필요한 생성물 (4.4 g)을 수득하였다. 에틸 아세테이트: 시클로헥산 (50:50 → 100:0)으로 용리하는 플래쉬 크로마토그래피 의해 정제하여 무색 오일 (3.1 g)을 수득하였다. SFC (RT = 2.48분 (UV, 200 nm); HPLC 칼럼: AD-H 30 mm x 250 mm 5 μm; CO2 구배: 0.5분 동안 5% 이소-프로필 알콜 w/0.2% 디메틸에틸아민, 이어서 2.2분 내 5%-27%. 칼럼 온도: 35℃; 압력: 100000 kPa; 유량: 210 mL/분)에 의해 정제하여 미반응 디에틸 (1S,2S,5R,6S)-2-아세트아미도-4-메틸렌-비시클로[3.1.0]헥산-2,6-디카르복실레이트 (580 mg, 2.0 mmol) 및 표제 화합물 (1.82 g, 5.9 mmol)을 수득하였다.
Figure 112014071781979-pct00013
제조예 7
디에틸 (1S,2S,5R,6S)-2-아미노-4-메틸렌-비시클로[3.1.0]헥산-2,6-디카르복실레이트.
Figure 112014071781979-pct00014
방법 1:
트리메틸실릴 클로라이드 (13.8 mL, 108 mmol)를 에탄올 (110 mL)에 적가함으로써 에탄올 중의 대략 1M 염화수소의 용액을 제조하였다. 상기 산성 용액 중에 디tert-부틸 (1S,2S,5R,6S)-2-(tert-부톡시카르보닐아미노)-4-메틸렌-비시클로[3.1.0]헥산-2,6-디카르복실레이트 (7.4 g, 18.1 mmol)를 용해시키고, 16시간 동안 60℃로 가열하였다. 점성 황색 오일로 증발시키고, 물 (50 mL) 중에 재용해시키고, 흐린 용액을 여과하여 미량의 불용성물질을 제거하였다. 중탄산나트륨 (8.4 g, 0.1 mol)으로 수성 산성 용액을 중화시키고, 디클로로메탄 (2 x 100 mL)으로 추출하였다. 합한 디클로로메탄 용액을 소수성 프릿을 통해 건조시키고, 연황색 액체 (4.14 g)로 증발시켰다. 에틸 아세테이트: 이소-헥산 (20:80 → 80:20)으로 용리하는 아미노-결합된 실리카 상에서 크로마토그래피에 의해 정제하여 무색 액체 (3.6 g)를 수득하였다. 에틸 아세테이트: 이소-헥산 (20:80)으로 용리하는 아미노-결합된 실리카 상에서 크로마토그래피에 의해 재정제하여 표제 생성물의 무색 액체 (2.81 g, 61%)를 수득하였다.
Figure 112014071781979-pct00015
방법 2:
p-톨루엔술폰산 1수화물 (6.97 g, 36.6 mmol)을 3일 동안 50℃에서 진공 하에 건조시켰다. 에탄올 (35.5 mL) 중의 디tert-부틸 (1S,2S,5R,6S)-2-(tert-부톡시카르보닐아미노)-4-메틸렌-비시클로[3.1.0]헥산-2,6-디카르복실레이트 (5.0 g, 12.2 mmol)의 교반 용액에 첨가하고, 3일 동안 60℃로 가열하였다. 용매를 감압 하에 제거하여 잔류물을 수득하였다. 잔류물을 물 (100 mL) 중에 녹이고, 중탄산나트륨을 사용하여 염기성으로 만들고, 디클로로메탄 (3 x 100 mL)으로 추출하였다. 추출물을 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고, 이어서 감압 하에 농축시켜 표제 화합물의 오렌지색 잔류물 (1.52 g, 51%)을 수득하였다.
Figure 112014071781979-pct00016
제조예 8
디에틸 (1S,2S,5R,6S)-2-(9H-플루오렌-9-일메톡시카르보닐아미노)-4-메틸렌-비시클로[3.1.0]헥산-2,6-디카르복실레이트
Figure 112014071781979-pct00017
고체 9-플루오레닐메틸 클로로포르메이트 (3.15 g, 12.2 mmol)를 0-5℃로 냉각된 테트라히드로푸란 (28 mL) 및 물 (8.4 mL) 중의 디에틸 (1S,2S,5R,6S)-2-아미노-4-메틸렌-비시클로[3.1.0]헥산-2,6-디카르복실레이트 (2.8 g, 11.1 mmol) 및 중탄산나트륨 (2.04 g, 24.3 mmol)의 교반 용액에 5분에 걸쳐 조금씩 첨가하였다. 1시간 후에, 물 (10 mL)을 첨가하고, 에틸 아세테이트 (50 mL)로 추출하였다. 추출물을 염수 용액 (20 mL)으로 세척하고, 건조시키고, 여과하고, 연황색 오일 (6.5 g)로 증발시켰다. 에틸 아세테이트: 이소-헥산 (10:90 → 20:80)으로 용리하는 플래쉬 크로마토그래피 의해 정제하여 점성 무색 오일 (4.58 g)을 수득하였다. 에틸 아세테이트: 이소-헥산 (20:80)으로 용리하는 플래쉬 크로마토그래피 의해 재정제하여 표제 화합물의 백색 반고체 발포체 (4.22 g, 80%)를 수득하였다.
Figure 112014071781979-pct00018
제조예 9
디에틸 (1S,2S,5R,6S)-2-(9H-플루오렌-9-일메톡시카르보닐아미노)스피로[비시클로[3.1.0]헥산-4,1'-시클로프로판]-2,6-디카르복실레이트
Figure 112014071781979-pct00019
디클로로메탄 (11.7 mL) 중의 트리플루오로아세트산 (2.66 g, 23.3 mmol)의 용액을 질소 하에 0-5℃로 냉각된 디클로로메탄 (11.7 mL) 중의 헵탄 중 디에틸 아연 1M (23.3 mL, 23.3 mmol)의 교반 용액에 5분에 걸쳐 적가하였다 (발열 반응). 10분 후에, 디클로로메탄 (11.7 mL) 중의 디아이오도메탄 (6.25 g, 23.3 mmol)의 용액을 첨가하였다. 10분 후에, 디클로로메탄 (11.7 mL) 중의 디에틸 (1S,2S,5R,6S)-2-(9H-플루오렌-9-일메톡시카르보닐아미노)-4-메틸렌-비시클로[3.1.0]헥산-2,6-디카르복실레이트 (3.70 g, 7.8 mmol)의 용액을 첨가하였다. 0℃에서 2시간 후에, 실온으로 가온되도록 하고, 16시간 동안 교반하였다. 차가운 0.5M 염산 (50 mL) 및 디클로로메탄 (20 mL)으로 반응 혼합물을 켄칭하고, 격렬하게 교반하였다. 소수성 프릿을 통해 디클로로메탄 층을 분리하고, 이어서 연황색 오일로 증발시켰다. 에틸 아세테이트: 이소-헥산 (10:90 → 20:80)으로 용리하는 플래쉬 크로마토그래피 의해 정제하여 무색 오일 (3.49 g)을 수득하였다. 에틸 아세테이트: 이소-헥산 (20:80)으로 용리하는 플래쉬 크로마토그래피 의해 재정제하여 중간 분획을 취하여 표제 화합물의 무색 발포체 (2.12 g, 56%)를 수득하였다.
Figure 112014071781979-pct00020
크로마토그래피를 반복함으로써 보다 덜 순수한 분획으로부터의 생성물의 제2 로트 (363 mg, 추가의 9%)를 수득하였다.
제조예 10
디에틸 (1S,2S,5R,6R)-2-벤질옥시카르보닐아미노-4-옥소-비시클로[3.1.0]헥산-2,6-디카르복실레이트
Figure 112014071781979-pct00021
방법 1:
디벤질 디카르보네이트 (18.6 mL, 76.1 mmol)를 디클로로메탄 (500 mL) 중의 디에틸 (1S,2S,5R,6R)-2-아미노-4-옥소-비시클로[3.1.0]헥산-2,6-디카르복실레이트 (16.2 g, 63.5 mmol)의 용액에 첨가하고, 이어서 트리에틸아민 (10.6 mL, 76.1 mmol)을 적가하였다. 1N 염산 (200 mL)으로 세척한 후, 반응 혼합물을 30분 동안 교반하였다. 디클로로메탄 상을 염수로 세척하고, 분리하고, 진공 하에 농축시켰다. 에틸 아세테이트: 이소-헥산 (0:100 → 75:25)으로 용리하는 플래쉬 크로마토그래피 의해 정제하여 표제 화합물 (11.6 g, 47%)을 수득하였다.
Figure 112014071781979-pct00022
방법 2:
둥근 바닥 플라스크에 디에틸 (1S,2S,5R,6R)-2-아미노-4-옥소-비시클로[3.1.0]헥산-2,6-디카르복실레이트 히드로클로라이드 (226.86 g, 777.65 mmol), 물 (1.13 L) 및 테트라히드로푸란 (1.13 L)을 첨가하였다. 천천히 중탄산나트륨 (143.72 g, 1.71 mol)을 5 부분으로 나누어 첨가하였다 (CO2 발생 및 31℃로부터 25℃로의 내부 온도를 관찰함). 이어서, 테트라히드로푸란 (226.9 mL) 중의 벤질 클로로포르메이트 (120.6 mL, 855.42 mmol)의 용액을 첨가하고, 내부 온도를 28℃ 미만으로 유지하고 (10분), 1시간 동안 25℃에서 반응물을 교반하였다. 혼합물을 메틸-t-부틸 에테르 (1.25 L) 내로 부었다. 층을 분리하고, 수성 상을 에틸 아세테이트 (750 ml)로 추출하고, 수성 상을 폐기하였다. 혼합물을 염수로 세척하고, 황산마그네슘 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축 건조시켜 무색 오일로서 표제 화합물 (302.82 g, 777.65 mmol)을 수득하였다.
Figure 112014071781979-pct00023
제조예 11
디에틸 (1S,2S,5R,6S)-2-벤질옥시카르보닐아미노-4-메틸렌-비시클로[3.1.0]헥산-2,6-디카르복실레이트
Figure 112014071781979-pct00024
방법 1:
오븐 건조된 500 mL 둥근 바닥 플라스크를 (메틸)트리페닐포스포늄 브로마이드 (15.4 g, 43.1 mmol) 및 건조 테트라히드로푸란 (112 mL)으로 충전하였다. 현탁액을 0 내지 -5℃로 냉각시키고, 테트라히드로푸란 중의 2M 소듐 비스(트리메틸실릴)아미드 (23 mL, 46 mmol)를 적가 방식으로 처리하였다. 30분 동안 0℃에서 생성된 담황색 현탁액을 교반하고, 이어서 테트라히드로푸란 (22.4 mL) 중의 디에틸 (1S,2S,5R,6R)-2-벤질옥시카르보닐아미노-4-옥소-비시클로[3.1.0]헥산-2,6-디카르복실레이트 (11.2 g, 28.8 mmol)의 용액으로 처리하였다. 반응물을 천천히 실온으로 가온되도록 하였다. 4시간 후에, 얼음 (120 g), 염수 (120 mL)로 켄칭하고, 에틸 아세테이트 (250 mL)로 추출하였다. 추출물을 염수 (2 x 100 mL)로 세척하고, 건조시키고, 여과하고, 적색 오일로 증발시켰다. 디에틸 에테르 (100 mL) 중에 재용해시키고, 이소-헥산 (80 mL)을 여러 번 나누어 천천히 첨가하여 적색 반고체로서 트리페닐포스핀 옥시드 (5.2 g)를 침전시켰다. 용액을 건조 실리카 (~50 g)로 처리하고, 농축 건조시켰다. 에틸 아세테이트: 이소-헥산 (20:80)으로 용리하는 플래쉬 크로마토그래피 의해 정제하여 무색 점성 오일로서 표제 화합물 (7.37 g, 66%)을 수득하였다.
Figure 112014071781979-pct00025
방법 2:
포타슘 tert-부톡시드 (104.72 g, 933.18 mmol)를 테트라히드로푸란 (1.82 L) 중의 (메틸)트리페닐포스포늄 브로마이드 (340.16 g, 933.18 mmol)의 현탁액에 실온에서 첨가하였다 (내부 온도 변화 없음). 이어서, 온도를 24℃로 유지하면서 테트라히드로푸란 (1.82 L) 중의 디에틸 (1S,2S,5R,6R)-2-벤질옥시카르보닐아미노-4-옥소-비시클로[3.1.0]헥산-2,6-디카르복실레이트 (302.82 g, 777.65 mmol)의 용액을 첨가하였다. 3시간 동안 50℃에서 혼합물을 교반하였다. 반응물을 에틸 아세테이트 (1.5 L)로 희석하고, 물 (2 x 3 L) 및 염수로 세척하였다. 유기 상을 황산마그네슘 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축시켜 암갈색 오일을 수득하였다. 에틸 아세테이트: 헥산 (9:1)으로 용리하는 플래쉬 크로마토그래피 의해 정제하여 무색 오일로서 표제 화합물 (183.35 g, 473.25 mmol)을 수득하였다.
Figure 112014071781979-pct00026
제조예 12
디에틸 (1S,2S,5R,6S)-2-벤질옥시카르보닐아미노스피로[비시클로[3.1.0]헥산-4,1'-시클로프로판]-2,6-디카르복실레이트
Figure 112014071781979-pct00027
방법 1:
디클로로메탄 (14.6 mL) 중의 헵탄 중 1M 디에틸아연 (64.1 mL, 64.1 mmol)의 용액을 질소 하에 0-5℃로 냉각된 디클로로메탄 (73 mL) 중의 트리플루오로아세트산 (4.27 mL, 56.5 mmol)의 교반 용액에 10분에 걸쳐 천천히 적가하였다. 10분 후에, 디클로로메탄 (14.6 mL) 중의 디아이오도메탄 (4.6 mL, 56.5 mmol)의 용액을 첨가하였다. 10분 후에, 디클로로메탄 (14.6 mL) 중의 디에틸 (1S,2S,5R,6S)-2-벤질옥시카르보닐아미노-4-메틸렌-비시클로[3.1.0]헥산-2,6-디카르복실레이트 (7.3 g, 18.8 mmol)의 용액을 첨가하였다. 1시간 후에, 빙조를 제거하고, 흐린 용액을 실온에서 20시간 동안 교반되도록 두었다. 24시간 후에, 반응 혼합물을 차가운 0.5M 수성 염산 (160 mL, 80 mmol) 및 디클로로메탄 (200 mL)으로 켄칭하고, 혼합물을 격렬하게 교반하였다. 디클로로메탄 층을 분리하고, 이어서 디클로로메탄 상을 건조시키고, 2개의 소수성 프릿을 통해 여과하였다. 밤새 연황색 오일로 증발시켜 갈색으로 변하였다. 에틸 아세테이트: 이소-헥산 (20:80)으로 용리하는 플래쉬 크로마토그래피 의해 정제하여 미반응 디에틸 (1S,2S,5R,6S)-2-벤질옥시카르보닐아미노-4-메틸렌-비시클로[3.1.0]헥산-2,6-디카르복실레이트과의 혼합물로서 무색 오일로서 표제 화합물 (5.1 g)을 수득하였다.
디클로로메탄 (10 mL) 중의 트리플루오로아세트산 (2.93 mL, 38.7 mmol)의 용액을 질소 하에 0-5℃로 냉각된 디클로로메탄 (50 mL) 중의 헵탄 중 디에틸아연 1M (38.7 mL, 38.7 mmol)의 교반 용액에 10분에 걸쳐 천천히 적가하였다. 10분 후에, 디클로로메탄 (10 mL) 중의 디아이오도메탄 (3.12 mL, 38.7 mmol)의 용액을 반응 혼합물에 첨가하였다. 10분 후에, 디클로로메탄 (10 mL) 중의 올레핀 및 디에틸 (1S,2S,5R,6S)-2-벤질옥시카르보닐아미노스피로[비사이클 [3.1.0]헥산-4,1'-시클로프로판]-2,6-디카르복실레이트 (5 g, 12.9 mmol)의 혼합물의 용액을 첨가하였다. 1시간 후에 빙조를 제거하고, 흐린 용액을 실온에서 16시간 동안 교반되도록 두었다. 20시간 후에, 반응 혼합물을 차가운 0.5M 염화수소 (140 mL, 70 mmol) 및 디클로로메탄 (160 mL)으로 켄칭하고, 혼합물을 격렬하게 교반하였다. 디클로로메탄 층을 0.5M 수성 염산 (100 mL)으로 세척하고, 황산나트륨 상에서 건조시키고, 이어서 2개의 소수성 프릿을 통해 여과하였다. 연황색 오일 (5.89 g)로 증발시켰다. 에틸 아세테이트: 이소-헥산 (15:85 → 25:75)으로 용리하는 플래쉬 크로마토그래피 의해 정제하여 소량의 반응물로 오염된 무색 오일로서 표제 화합물 (4.28 g)을 수득하였다.
아세톤 (40 mL), 물 (20 mL) 중에 중탄산나트륨 (0.54 g, 6.45 mmol) 및 황산마그네슘 (0.78 g, 6.45 mmol)을 재용해시켰다. 0℃로 냉각시키고, 과망가니즈산칼륨 (0.2 g, 1.29 mmol)을 첨가하여 밝은 자주색 혼합물을 수득하였다. 실온에서 3시간 후에, 고체 티오황산나트륨 5수화물 (0.32 g, 1.29 mmol)로 켄칭하고, 현탁액을 규조토의 패드를 통해 여과하고, 아세톤으로 세척하였다. 작은 부피로 증발시키고, 물 (20 mL)로 희석하고, 에틸 아세테이트 (60 mL)로 추출하였다. 추출물을 염수로 세척하고, 건조시키고, 여과하고, 오일로 증발시켰다. 에틸 아세테이트: 이소-헥산 (15:85 → 25:75)으로 용리하는 플래쉬 크로마토그래피 의해 정제하여 무색 오일로서 표제 화합물 (3.62 g, 70%)을 수득하였다.
Figure 112014071781979-pct00028
방법 2:
헵탄 중의 1M 디에틸아연 (1.6 L, 1.6 mol)의 용액을 디클로로메탄 (870.9 mL)으로 0℃ (조 온도 -5℃)에서 캐뉼라를 통해 첨가하고, 이어서 온도를 3℃ 미만으로 유지하면서 디클로로메탄 (870.9 mL) 중의 트리플루오로아세트산 (121.02 mL, 1.6 mol)의 용액을 천천히 첨가하였다. 첨가 1시간 후에 혼합물을 5분 동안 교반하고, 이어서 디아이오도메탄 (130.3 mL, 1.6 mol)을 한번에 첨가하고, 15분 동안 교반하였다. 디클로로메탄 (348.4 mL) 중의 디에틸 (1S,2S,5R,6S)-2-벤질옥시카르보닐아미노-4-메틸렌-비시클로[3.1.0]헥산-2,6-디카르복실레이트 (183.35 g, 449.58 mmol)의 용액을 10분에 걸쳐 첨가하고, 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 0℃로 냉각시키고, 0.5M 염산 (1.5 L)으로 켄칭하고, 혼합물을 격렬하게 교반하였다. 유기 층을 분리하고, 염수로 세척하고, 농축 건조시켰다. 물 (733.4 mL) 및 아세톤 (733.4 mL) 중에 용해시키고, 0℃로 냉각시키고, 이어서 황산마그네슘 (81.17 g, 674.37 mmol), 중탄산나트륨 (56.65 g, 674.37 mmol)에 이어서 과망가니즈산칼륨 (28.42 g, 179.83 mmol)을 첨가하였다. 실온에서 혼합물을 교반하였다. 30분 후에 티오황산나트륨 5수화물 (197.10 g, 311.03 mmol)에 이어서 규조토 (100 g)를 첨가하였다. 30분 동안 교반하고, 규조토의 패드를 통해 여과하였다. 패드를 메틸-t-부틸 에테르로 세척하고, 수성 층을 메틸-t-부틸 에테르로 추출하였다. 유기 층을 황산마그네슘 상에서 건조시키고, 여과하고, 진공 하에 농축시켰다. 헥산: 메틸-t-부틸 에테르 (10:90 → 50:50)로 용리하는 플래쉬 크로마토그래피 정제하여 무색 오일로서 표제 화합물 (92.67 g, 51%)을 수득하였다.
Figure 112014071781979-pct00029
또한, 부산물로서 디에틸 (1S,2S,5R,6S)-2-(벤질옥시카르보닐(메틸)아미노)스피로[비시클로[3.1.0]헥산-4,1'-시클로프로판]-2,6-디카르복실레이트 (22.67 g, 5.46 mmol)를 수득하였다.
Figure 112014071781979-pct00030
제조예 13
디에틸 (1S,2S,5R,6S)-2-아미노스피로[비시클로[3.1.0]헥산-4,1'-시클로프로판]-2,6-디카르복실레이트
Figure 112014071781979-pct00031
방법 1:
피페리딘 (3.16 g, 37.2 mmol)을 디클로로메탄 (10.5 mL) 중의 디에틸 (1S,2S,5R,6S)-2-(9H-플루오렌-9-일메톡시카르보닐아미노)스피로[비시클로[3.1.0]헥산-4,1'-시클로프로판] 2,6-디카르복실레이트 (2.10 g, 4.29 mmol)의 교반 용액에 실온에서 첨가하였다. 30분 후에, 황색 고체로 증발시켰다. 에틸 아세테이트: 이소-헥산 (30:70 → 80:20)으로 용리하는 플래쉬 크로마토그래피 의해 정제하여 먼저 1-(9H-플루오렌-9-일메틸)-피페리딘을 용리하고, 이어서 표제 화합물의 연황색 액체 (1.07 g, 93%)를 용리하였다.
Figure 112014071781979-pct00032
방법 2:
에탄올 (54 mL) 중의 디에틸 (1S,2S,5R,6S)-2-벤질옥시카르보닐아미노스피로[비시클로[3.1.0]헥산-4,1'-시클로프로판]-2,6-디카르복실레이트 (3.62 g, 9 mmol)를 용해시키고, 용액을 10% 탄소상 팔라듐 (데구사(Degussa) 유형 E101 NE/W, 0.18 g, 0.17 mmol)에 첨가하였다. 345 kPa에서 4시간 동안 파르(Parr) 장비 상에서 수소화하였다. 반응물을 규조토의 패드를 통해 여과하여 촉매를 제거하고, 에탄올로 세척하고, 무색 오일로 표제 화합물 (2.23 g, 93%)로서 증발시켰다.
Figure 112014071781979-pct00033
제조예 14
디에틸 (1S,2S,5R,6S)-2-[[(2S)-2-(tert-부톡시카르보닐아미노)프로파노일]아미노]스피로[비시클로[3.1.0]헥산-4,1'-시클로프로판]-2,6-디카르복실레이트
Figure 112014071781979-pct00034
디에틸 (1S,2S,5R,6S)-2-아미노스피로[비시클로[3.1.0]헥산-4,1'-시클로프로판]-2,6-디카르복실레이트 (1.92 g, 7.17 mmol), (2S)-2-(tert-부톡시카르보닐아미노)프로판산 (1.92 g, 10 mmol), 4-디메틸아미노피리딘 (9 mg, 717 μmol) 및 1-히드록시벤조트리아졸 (1.36 g, 10 mmol)을 디클로로메탄 (48 mL) 중에서 합하였다. 트리에틸아민 (1.5 mL, 10.8 mmol) 및 1-(3-디메틸아미노프로필)-3-에틸카르보디이미드 히드로클로라이드 (1.92 g, 10 mmol)를 첨가하고, 질소 분위기 하에 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 반응물을 에틸 아세테이트 (200 mL), 물 (50 mL) 및 염수 (50 mL)로 희석하였다. 격렬하게 교반하고, 이어서 에틸 아세테이트 층을 분리하고, 0.2M 염산 (50 mL), 물 (50 mL), 포화 탄산수소나트륨 (50 mL) 및 염수 (50 mL)로 세척하였다. 용액을 건조시키고, 여과하고, 농축시켜 황색 오일 (3.48 g)을 수득하였다. 에틸 아세테이트: 이소-헥산 (15:85 → 25:75)에 이어서 (25:75 → 40:60)로 용리하는 플래쉬 크로마토그래피 의해 정제하여 물질을 오일로서 수득하였다. 디클로로메탄 중에 재용해시키고, 농축시키고, 진공 하에 건조시켜 백색 발포성 물질로서 표제 화합물 (3.05 g, 6.95 mmol)을 수득하였다.
Figure 112014071781979-pct00035
하기 화합물을 본질적으로 제조예 14의 방법에 의해 제조하였다.
Figure 112014071781979-pct00036
제조예 17
(1S,2S,5R,6S)-2-[[(2S)-2-(tert-부톡시카르보닐아미노)프로파노일]아미노]스피로[비시클로[3.1.0]헥산-4,1'-시클로프로판]-2,6-디카르복실산
Figure 112014071781979-pct00037
방법 1:
물 중의 2M 수산화리튬 (27.8 mL, 55.6 mmol)의 용액을 테트라히드로푸란 (36 mL) 중의 디에틸 (1S,2S,5R,6S)-2-[[(2S)-2-(tert-부톡시카르보닐아미노)프로파노일]아미노]스피로[비시클로[3.1.0]헥산-4,1'-시클로프로판]-2,6-디카르복실레이트 (3.05 g, 6.9 mmol)의 차가운 교반 용액에 질소 하에 첨가하였다. 이중층 용액을 20시간 동안 실온에서 교반하였다. 2M 염산 (29 mL), 얼음 (~20 g)으로 산성화하고, 에틸 아세테이트 (100 mL)로 추출하였다. 추출물을 염수 (50 mL)로 세척하고, 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고, 백색 반고체 발포체로 증발시켰다. 물질을 뜨거운 에틸 아세테이트 (15 mL) 중에 재용해시켰다. 여과하고, 진공 하에 물질을 건조시켜 백색 고체로서 표제 화합물 (2.06 g, 5.4 mmol)을 수득하였다.
Figure 112014071781979-pct00038
방법 2:
디에틸 (1S,2S,5R,6S)-2-벤질옥시카르보닐아미노스피로[비시클로[3.1.0]헥산-4,1'-시클로프로판]-2,6-디카르복실레이트 (159 g, 396.05 mmol)를 에탄올 (792.1 mL) 중에 용해시키고, 10% 탄소상 팔라듐 (15.9 g, 14.94 mmol)에 이어서 물 중의 37.5%wt/wt 염산 용액 (6.62 mL, 79.21 mmol)을 첨가하였다. 2 L 파르 장비 상에서 실온에서 413 kPa에서 수소화하였다. 4시간 후에 혼합물을 규조토 및 유리 마이크로섬유 필터 (와트만(Whatman))를 통해 여과하고, 진공 하에 농축시켰다. 조물질을 테트라히드로푸란 (396 mL) 중에 용해시키고, 클로로디메톡시트리아진 (74.50 g, 415.86 mmol) 및 (2S)-2-(tert-부톡시카르보닐아미노) 프로판산 (79.88 g, 415.86 mmol)을 첨가하였다. 이 혼합물을 0℃로 냉각시키고, N-메틸모르폴린 (131.06 mL, 1.19 mol)을 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 교반하였다. 5시간 후에 규조토를 통해 조물질을 여과하고, 케이크를 테트라히드로푸란 (200 mL)으로 세척하였다. 진공 하에 용매를 부분적으로 제거하고, 생성된 오렌지색 용액을 0℃로 냉각시켰다. 물 중의 2M 수산화나트륨 (792.1 mL, 1.58 mol)을 적가하였다. 반응물을 실온에 도달하게 하면서, 혼합물을 밤새 교반하였다. 디클로로메탄 (1 L)을 첨가하고, 상을 분리하였다. 유기 층을 추가의 물 (300 mL)로 세척하였다. 합한 수성 층을 1N 황산수소칼륨으로 pH=2-3으로 산성화하고, 이어서 에틸 아세테이트로 추출하였다. 유기 층을 황산마그네슘 상에서 건조시키고, 여과하고, 진공 하에 증발시켰다. 조물질을 테트라히드로푸란 (600 mL) 중에 용해시키고, 가열 환류시켰다. 헵탄 (2.1 L)을 첨가하고, 용액을 냉각시켰다. 고체를 여과하고, 진공 하에 건조시켜 백색 고체로서 표제 화합물 (149 g, 98%)을 수득하였다.
Figure 112014071781979-pct00039
하기 화합물을 본질적으로 제조예 17의 방법 1에 의해 제조하였다.
Figure 112014071781979-pct00040
제조예 20
디에틸 (1S,2S,5R,6S)-2-(tert-부톡시카르보닐아미노)스피로[비시클로[3.1.0]헥산-4,1'-시클로프로판]-2,6-디카르복실레이트.
Figure 112014071781979-pct00041
방법 1:
디클로로메탄 (5 mL) 중의 디에틸 (1S,2S,5R,6S)-2-아미노스피로[비시클로[3.1.0]헥산-4,1'-시클로프로판]-2,6-디카르복실레이트 (0.47 g, 722.38 μmol)의 용액에 중합체 지지된 디이소-프로필-에틸아민 (1.02 g, 3.61 mmol)에 이어서 디클로로메탄 (6.00 mL) 중의 디-t-부틸디카르보네이트 (0.41 g, 1.88 mmol)을 첨가하고, 반응 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 추가의 디-t-부틸디카르보네이트 (0.32 g, 1.36 mmol)를 첨가하고, 추가의 2시간 동안 교반하였다. 에탄올 (20 mL)로 희석하고, 2 칼럼 부피의 에탄올로 전처리된 SCX-2 이온 교환 수지 카트리지 (10 g)에 의해 정제하였다. 로딩 후에 카드리지를 4 칼럼 부피의 에탄올로 세척한 후, 용리액을 진공 하에 농축시켜 조 생성물 (808 mg)을 수득하였다. 에틸 아세테이트: 시클로헥산 (0:100 → 40:60)으로 용리하는 플래쉬 크로마토그래피 의해 조 물질을 정제하여 목적 물질 (100 mg)을 수득하였다. 카트리지를 2 칼럼 부피의 메탄올 중 3M 암모니아로 플러싱하여 미반응 조질의 디에틸 (1S,2S,5R,6S)-2-아미노스피로[비시클로[3.1.0]헥산-4,1'-시클로프로판]-2,6-디카르복실레이트의 황색 고체 (430 mg)를 수득하였다. 디-t-부틸디카르보네이트 (0.32 g, 1.44 mmol)를 회수된 테트라히드로푸란 (20 mL) 중의 디에틸 (1S,2S,5R,6S)-2-아미노스피로[비시클로[3.1.0]헥산-4,1'-시클로프로판]-2,6-디카르복실레이트에 첨가하고, 실온에서 밤새 교반하였다. 이어서, 트리에틸아민 (201.37 μL, 1.44 mmol) 및 추가의 디-t-부틸디카르보네이트 (0.32 g, 1.44 mmol)를 첨가하고, 교반을 72시간 동안 유지하였다. 과량의 트리에틸아민 (201.37 μL, 1.44 mmol), 디-t-부틸디카르보네이트 (0.32 g, 1.44 mmol) 및 촉매 N,N-디메틸 4-아미노피리딘 (40.93 μmol)를 첨가하고, 밤새 교반하였다. 에탄올 (30 mL)로 희석하고, 2 칼럼 부피의 에탄올로 전처리된 SCX-2 이온 교환 수지 카트리지 (10 g)에 의해 용액을 정제하였다. 4 칼럼 부피의 에탄올로 세척하고, 용액을 진공 하에 농축시켜 조질의 목적 생성물 757 mg을 수득하였다. 에틸 아세테이트: 시클로헥산 (0:100 → 40:60)으로 용리하는 플래쉬 크로마토그래피 의해 정제하여 바람직한 표제 생성물의 제2 분획 (24 mg)을 수득하였다. 두 분획을 합하여 표제 화합물 (337.47 μmol, 47%)을 수득하였다.
Figure 112014071781979-pct00042
방법 2:
디-t-부틸디카르보네이트 (0.88 g, 4.01 mmol)을 테트라히드로푸란 (30 mL) 중의 디에틸 (1S,2S,5R,6S)-2-아미노스피로[비시클로[3.1.0]헥산-4,1'-시클로프로판]-2,6-디카르복실레이트 (1.4 g, 5.24 mmol)의 용액에 첨가하고, 반응 혼합물을 실온에서 질소 하에 밤새 교반하였다. 소수성 프릿을 통해 여과하고, 무색 겔을 에틸 아세테이트로 세척하였다. 합한 유기부 층을 진공 하에 농축시켜 무색 오일을 수득하였다. 에틸 아세테이트: 이소-헥산 (0:100 → 30:70)으로 용리하는 플래쉬 크로마토그래피 의해 정제하여 오일 1.82 g을 수득하였다. 고진공 하에 추가로 건조시켜 표제 화합물 (1.79 g, 93%)을 수득하였다.
Figure 112014071781979-pct00043
제조예 21
(1S,2S,5R,6S)-2-(tert-부톡시카르보닐아미노)스피로[비시클로[3.1.0]헥산-4,1'-시클로프로판]-2,6-디카르복실산
Figure 112014071781979-pct00044
테트라히드로푸란 (29.2 mL) 중의 디에틸 (1S,2S,5R,6S)-2-(tert-부톡시카르보닐아미노)스피로[비시클로[3.1.0]헥산-4,1'-시클로프로판]-2,6-디카르복실레이트 (1.79g, 4.87 mmol)를 물 (19.5 mL) 중의 수산화리튬 1수화물 (1.64 g, 38.97 mmol)의 새로이 제조된 용액에 첨가하고, 60℃에서 밤새 교반하였다. 물 (30 mL)로 희석하고, 에틸 아세테이트 (2 x 50 mL)로 추출하였다. 수성 및 유기 층을 분리하였다. 유기 층을 2M 염산으로 세척하였다. 수성 층을 2M 염산 (25 mL)으로 세척하고, 이어서 에틸 아세테이트 (2 x 50 mL)로 추출하였다. 유기 층을 합하고, 염수 (15 mL)로 세척하였다. 황산마그네슘 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축 건조시켰다. 디클로로메탄 중에 재용해시키고, 농축 건조시켜 표제 화합물 (1.49 g, 98%)을 수득하였다.
Figure 112014071781979-pct00045
제조예 22
디벤질 (1S,2S,5R,6S)-2-(tert-부톡시카르보닐아미노)스피로[비시클로[3.1.0]헥산-4,1'-시클로프로판]-2,6-디카르복실레이트
Figure 112014071781979-pct00046
탄산세슘 (0.24 g, 730.7 μmol) 및 벤질 브로마이드 (87.16 μL, 730.7 μmol)를 N,N-디메틸포름아미드 (2 mL) 중의 (1S,2S,5R,6S)-2-(tert-부톡시카르보닐아미노)스피로[비시클로[3.1.0]헥산-4,1'-시클로프로판]-2,6-디카르복실산 (0.09 g, 292.29 μmol)의 용액에 첨가하였다. 질소 하에 1.5시간 동안 실온에 교반하였다. 물로 켄칭하고, 에틸 아세테이트로 추출하였다. 층을 분리하고, 소수성 프릿을 통해 유기부를 여과한 후 농축 건조시켜 조 생성물 (134 mg)을 수득하였다. 에틸 아세테이트: 이소-헥산 (1:99 → 25:75)으로 용리하는 플래쉬 크로마토그래피 의해 정제하여 투명한 오일을 수득하였다. 에틸 아세테이트: 이소-헥산 (1:99 → 10:90)으로 용리하는 플래쉬 크로마토그래피 의해 추가로 정제하여 투명한 오일로서 표제 생성물 (105 mg, 68%)을 수득하였다.
Figure 112014071781979-pct00047
하기 화합물을 본질적으로 제조예 22의 방법에 의해 제조하였다.
Figure 112014071781979-pct00048
실시예 1
(1S,2S,5R,6S)-2-아미노스피로[비시클로[3.1.0]헥산-4,1'-시클로프로판]-2,6-디카르복실산 히드로클로라이드
Figure 112014071781979-pct00049
5 mL 리액티바이알(ReactiVial)을 디tert-부틸 (1S,2S,5R,6S)-2-(tert-부톡시카르보닐아미노)스피로[비시클로[3.1.0]헥산-4,1'-시클로프로판]-2,6-디카르복실레이트 (55 mg, 129.8 μmol)로 충전하였다. 여기에 5N 수성 염산 용액 (3 mL; 20.8 mmol) 및 1,4-디옥산 (1 mL)을 첨가하였다. 1시간 동안 90℃에서 혼합물을 교반하였다. 리액티바이알을 밀봉하고, 3시간 동안 90℃에서 교반을 지속하였다. 주위 온도로 냉각시키고, 3일 동안 정치시켰다. 감압 하에 암색 고체로 농축시켰다. 2 칼럼 부피의 메탄올에 이어서 6 칼럼 부피의 물로 세척함으로써 오아시스(Oasis)® HLB 워터스(Waters) (1 g) 카트리지를 제조하였다. 암색 고체를 물 중에 용해시키고, 카트리지 상에 로딩하였다. 카트리지를 물 (2 칼럼 부피)로 세척하고, 용리액을 수집하였다. 용액을 동결-건조시켜 표제 화합물 (16.1 mg, 65 μmol)을 수득하였다.
Figure 112014071781979-pct00050
실시예 2
(1S,2S,5R,6S)-2-아미노스피로[비시클로[3.1.0]헥산-4,1'-시클로프로판]-2,6-디카르복실산
Figure 112014071781979-pct00051
디에틸 (1S,2S,5R,6S)-2-아세트아미도스피로[비시클로[3.1.0]헥산-4,1'-시클로프로판]-2,6-디카르복실레이트 (1.19 g, 3.8 mmol)와 함께 2M 수산화나트륨 (11.5 mL, 23.1 mmol)을 첨가하였다. 첨가시, 반응 혼합물을 질소의 블랭킷 하에 가열 환류시켰다. 21시간 후에 과량의 2M 수산화나트륨 (5.8 mL, 11.5 mmol)을 첨가하고, 120시간 동안 가열을 재개하였다. 다음과 같이 양이온 교환 크로마토그래피 (다우엑스(Dowex)™ 50X8-100)에 의해 정제하였다. 임의의 불용성 입자를 여과하고, HPLC 등급 물로 헹궜다. 용액을 반으로 농축시켰다. 1-2초마다 약 1 방울의 점적 속도로 칼럼을 통해 흐르게 하면서 용액을 수지 상에 로딩하였다. 초기 로딩 부피를 수지 표면에 점적시킨 후, 수지를 HPLC 등급 물 (~ 1 내지 2 칼럼 부피)로 헹구고, 이를 3회 반복하였다. 적용이 완료될 때까지 (다시 pH=7로의 pH 복귀), 용출액의 pH를 모니터링하고 HPLC 등급 물로 헹궜다. 일단 완전한 pH 사이클이 관찰되고, 용출액이 pH=7로 복귀되면, 칼럼을 HPLC 등급 물, HPLC 등급 물: 테트라히드로푸란 (1:1), 이어서 HPLC 등급 물의 각각 1 칼럼 부피 이상으로 세척하였다. 생성물을 수지로부터 10% 피리딘: HPLC 등급 물로 대체하고, TLC에 의해 어떠한 추가의 생성물도 검출되지 않을 때까지 10% 피리딘: HPLC 등급 물로 용리를 지속하였다. 목적 물질을 함유하는 분획을 합하고, 농축 건조시켜 백색 고체를 수득하였다. 동결-건조시켜 표제 화합물 (795 mg, 3.8 mmol)을 수득하였다.
Figure 112014071781979-pct00052
실시예 3
(1S,2S,5R,6S)-2-[[(2S)-2-아미노프로파노일]아미노]스피로[비시클로[3.1.0]헥산-4,1'-시클로프로판]-2,6-디카르복실산; 1,4-디옥산 (1: 0.5); 히드로클로라이드.
Figure 112014071781979-pct00053
1,4-디옥산 중의 4M 염화수소 (1.57 mL, 6.3 mmol)의 용액을 1,4-디옥산 (1.6 mL) 중의 (1S,2S,5R,6S)-2-[[(2S)-2-(tert-부톡시카르보닐아미노)프로파노일]아미노]스피로[비시클로[3.1.0]헥산-4,1'-시클로프로판]-2,6-디카르복실산 (0.16 g, 418.4 μmol) 교반 현탁액에 질소 하에 실온에서 첨가하였다. 16시간 후에 백색 고체를 여과하고, 1,4-디옥산으로 세척하고, 진공 하에 60℃에서 밤새 건조시켜 표제 화합물 (0.14 g)을 수득하였다.
Figure 112014071781979-pct00054
실시예 4
(1S,2S,5R,6S)-2-[[(2S)-2-아미노프로파노일]아미노]스피로[비시클로[3.1.0]헥산-4,1'-시클로프로판]-2,6-디카르복실산
Figure 112014071781979-pct00055
진한 염산 (36.94 mL, 430.11 mmol)을 아세톤 (822.4 mL) 중의 (1S,2S,5R,6S)-2-[[(2S)-2-(tert-부톡시카르보닐아미노)프로파노일]아미노]스피로[비시클로[3.1.0]헥산-4,1'-시클로프로판]-2,6-디카르복실산 (82.24 g, 215.06 mmol)의 용액에 첨가하고, 혼합물을 50℃에서 교반하였다. 1.5시간 후에 혼합물을 0℃로 냉각시키고, 물 중의 50% 수산화나트륨을 pH=3.6-3.8로 첨가하였다. 수득한 고체를 1시간 동안 교반하고, 여과하고, 물로 세척하였다. 진공 하에 48시간 동안 건조시켜 백색 고체로서 표제 화합물 (36 g, 127.53 mmol)을 수득하였다.
Figure 112014071781979-pct00056
실시예 5
(1S,2S,5R,6S)-2-[[(2S)-2-아미노프로파노일]아미노]스피로[비시클로[3.1.0]헥산-4,1'-시클로프로판]-2,6-디카르복실산 히드로클로라이드
Figure 112014071781979-pct00057
1,4-디옥산 중의 4M 염화수소 (20 mL, 80 mmol)를 1,4-디옥산 (21 mL) 중의 (1S,2S,5R,6S)-2-[[(2S)-2-(tert-부톡시카르보닐아미노)프로파노일]아미노]스피로[비시클로[3.1.0]헥산-4,1'-시클로프로판]-2,6-디카르복실산 (2.06 g, 5.4 mmol)의 교반 현탁액에 실온에서 질소 하에 첨가하였다. 반응 혼합물 수 분 초음파처리하고, 이어서 교반을 16시간 유지하였다. 고체를 여과하고, 1,4-디옥산으로 세척하고, 진공 하에 6시간 동안 60℃에서 건조시켜 백색 고체 2.2 g을 수득하였다. 물질을 HPLC 등급 물 (20 mL) 중에 재용해시키고, 여과하여 임의의 불용성 입자를 제거하고, 여과물을 동결-건조시켜 표제 화합물 (1.51 g, 4.75 mmol)을 수득하였다.
Figure 112014071781979-pct00058
하기 화합물을 본질적으로 실시예 4의 방법에 의해 제조하였다.
Figure 112014071781979-pct00059
실시예 8
디벤질 (1S,2S,5R,6S)-2-아미노스피로[비시클로[3.1.0]헥산-4,1'-시클로프로판]-2,6-디카르복실레이트; 1,4-디옥산; 히드로클로라이드
Figure 112014071781979-pct00060
1,4-디옥산 중의 4M 염화수소 (493.30 μL, 1.97 mmol)를 1,4-디옥산 (970 μL) 중의 디벤질 (1S,2S,5R,6S)-2-(tert-부톡시카르보닐아미노)스피로[비시클로[3.1.0]헥산-4,1'-시클로프로판]-2,6-디카르복실레이트 (0.1 g, 0.2 mmol)의 교반 현탁액에 실온에서 질소 하에 첨가하고, 20시간 동안 교반하였다. 1,4-디옥산 중의 과량의 4M 염화수소 용액 (493.30 μL, 1.97 mmol)을 첨가하고, 80℃로 가열하였다. 농축 건조시키고, 아세토니트릴로 연화처리하고, 현탁액을 동결-건조시켜 1,4-디옥산과의 (1:1) 부가물로서 백색 고체로서 표제 화합물 (89.9 mg, 88%)을 수득하였다.
Figure 112014071781979-pct00061
실시예 9
비스[(2-플루오로페닐)메틸] (1S,2S,5R,6S)-2-아미노스피로[비시클로[3.1.0]헥산-4,1'-시클로프로판]-2,6-디카르복실레이트 히드로클로라이드
Figure 112014071781979-pct00062
1,4-디옥산 중의 4M 염화수소 용액 (4.64 mL, 18.58 mmol)을 1,4-디옥산 (4.64 mL) 중의 비스[(2-플루오로페닐)메틸] (1S,2S,5R,6S)-2-(tert-부톡시카르보닐아미노)스피로[비시클로[3.1.0]헥산-4,1'-시클로프로판]-2,6-디카르복실레이트 (0.98 g, 1.86 mmol)의 교반 용액에 실온에서 질소 하에 첨가하고, 용액을 20시간 동안 교반하였다. 진공 하에 농축시켜 오일 (0.93 g)을 수득하였다. 아세토니트릴 (10 mL), 물 (30 mL)의 혼합물 중에 용해시키고, 주말에 걸쳐 동결 건조시켜 (1S,2S,5R,6S)-2-아미노-2-[(2-플루오로페닐)메톡시카르보닐]스피로[비시클로[3.1.0]헥산-4,1'-시클로프로판]-6-카르복실산 (~7-10%)으로 오염된 표제 화합물의 혼합물로서 백색 고체 (820 mg)를 수득하였다.
Figure 112014071781979-pct00063
백색 고체를 아세토니트릴 (8 mL) 중에 용해시켜 반투명 용액을 수득하였다. 1시간 동안 정치되도록 한 후, 여과하였다. 여과물을 진공 하에 농축시켜 점착성 발포체를 수득하였다. 에틸 아세테이트 중에 재용해시키고, 탄산수소나트륨의 포화 용액으로 세척하고, 황산마그네슘 상에서 건조시키고, 여과하고, 진공 하에 농축시켜 774 mg을 수득하였다. 디에틸 에테르 (11 mL) 중에 재용해시키고, 디에틸 에테르 중의 1M 염화수소 (1.86 mL, 1.86 mmol)를 첨가하고, 진공 하에 농축시켜 백색 고체 발포체를 수득하였다. 진공 하에 50℃에서 추가로 밤새 건조시켜 표제 화합물 (0.74 g, 85%)을 수득하였다.
Figure 112014071781979-pct00064
실시예 10
(1S,2S,5R,6S)-2-[[(2S)-2-아미노프로파노일]아미노]스피로[비시클로[3.1.0]헥산-4,1'-시클로프로판]-2,6-디카르복실산 2수화물
Figure 112014071781979-pct00065
단계 1: 디에틸 (1S,2S,5R,6R)-2-아미노-4-옥소-비시클로[3.1.0]헥산-2,6-디카르복실레이트 히드로클로라이드
Figure 112014071781979-pct00066
질소 분위기 하에, 내부 반응 온도를 30℃ 미만으로 유지하면서 아세틸 클로라이드 (86.5 mL, 1.2 mol)를 무수 에탄올 (1.0 L, 17.2 mol)에 적가하였다. 생성된 혼합물을 15분 동안 교반하고, 디-t-부틸 (1S,2S,5R,6R)-2-(tert-부톡시카르보닐아미노)-4-옥소-비시클로[3.1.0]헥산-2,6-디카르복실레이트 (100 g, 0.24 mol)를 한번에 첨가하였다. 생성된 혼합물을 16-20시간 동안 가열 환류시켰다. 반응 혼합물을 감압 하에 오일에 농축시켰다. 조 생성물을 메틸렌 클로라이드 (250 mL) 중에 용해시키고, 진공 하에 농축시켰다. 메틸렌 클로라이드/농축 공정을 반복하여 백색 발포체를 수득하였다. 에틸 아세테이트 (150 mL)를 첨가하고, 혼합물을 65℃로 가열하였다. 메틸 t-부틸 에테르 (100 mL)를 첨가하고, 15분 동안 65℃에서 혼합물을 교반하였다. 메틸 t-부틸 에테르 (300 mL)를 15분에 걸쳐 첨가하고, 15분 동안 65℃에서 교반하고, 이어서 가열을 중단하고, 슬러리를 주위 온도로 냉각되도록 하였다. 혼합물을 여과하고, 필터 케이크를 메틸 t-부틸 에테르 (150 mL)로 세척하였다. 케이크를 진공 오븐으로 옮기고, 25℃에서 밤새 건조시켜 조 생성물 (67.5 g)을 수득하였다. 고체를 둥근 바닥 플라스크로 옮기고, 에틸 아세테이트 (170 mL)로 희석하고, 혼합물을 65℃로 가열하였다. 1시간 동안 혼합물을 교반하고, 테트라히드로푸란 (68 mL) 및 에탄올 (3 mL)를 첨가하였다. 가열 공급원을 중단하고, 혼합물이 주위 온도로 냉각되도록 하면서 메틸 t-부틸 에테르 (272 mL)를 20분에 걸쳐 첨가하였다. 슬러리를 여과하고, 케이크를 95/5 메틸 t-부틸 에테르 /에틸 아세테이트 (2 x 75 mL)로 세척하고, 추가로 고체를 진공 오븐 내에서 25℃에서 밤새 건조시켜 백색 고체로서 표제 화합물 (60.0g, 98.0%)을 수득하였다.
Figure 112014071781979-pct00067
단계 2: 디에틸 (1S,2S,5R,6R)-2-벤질옥시카르보닐아미노-4-옥소-비시클로[3.1.0]헥산-2,6-디카르복실레이트
Figure 112014071781979-pct00068
디에틸-(1S,2S,5R,6R)-2-아미노-4-옥소-비시클로[3.1.0]헥산-2,6-디카르복실레이트-히드로클로라이드 (55.0 g, 188.5 mmol)를 테트라히드로푸란 (220 mL) 중에 현탁시키고, 이어서 물 (220 mL) 및 탄산칼륨 (92.1 g, 659.9 mmol)을 첨가하였다. 생성된 혼합물을 30분 동안 교반하였다. 반응 온도를 25℃ 미만으로 유지하면서, 벤질 클로로포르메이트 (26.7 mL, 175.3 mmol)를 45분에 걸쳐 혼합물에 첨가하였다. 30분 동안 반응 혼합물을 교반하고, 이어서 에틸 아세테이트 (550 mL) 및 물 (275 mL)로 희석하였다. 상을 분리하고, 수성 층을 에틸 아세테이트 (250 mL)로 다시 추출하였다. 유기부를 합하고, 그것을 수성 HCl (0.5N, 100 mL), 포화 NaHCO3 (100 mL) 및 염수 (100 mL)로 순차적으로 세척하였다. 유기 용액을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 진공 하에 농축시켜 투명한 오일로서 표제 화합물 (67.6 g, 92.1%)을 수득하였다.
Figure 112014071781979-pct00069
단계 3: 디에틸 (1S,2S,5R,6S)-2-벤질옥시카르보닐아미노-4-메틸렌-비시클로[3.1.0]헥산-2,6-디카르복실레이트
Figure 112014071781979-pct00070
질소 분위기 하에, 메틸-트리페닐포스포늄 브로마이드 (67.4 g, 184.9 mmol) 및 테트라히드로푸란 (300 mL)을 교반하면서 합하였다. 테트라히드로푸란 중의 포타슘 tert-부톡시드 (1M) (184.9 mL, 184.9 mmol)의 용액을 반응 혼합물로 15분에 걸쳐 첨가하고, 생성된 슬러리를 3시간 동안 주위 온도에서 교반하였다. 디에틸 (1S,2S,5R,6R)-2-벤질옥시카르보닐아미노-4-옥소-비시클로[3.1.0]헥산-2,6-디카르복실레이트 (12.3 kg, 31.6 mol)를 테트라히드로푸란 (120 mL) 중에 용해시키고, 반응 온도를 30℃ 미만으로 유지하면서, 반응 혼합물을 1시간에 걸쳐 첨가하였다. 주위 온도에서 생성된 슬러리를 밤새 교반하고, 이어서 에틸 아세테이트 (600 mL)로 희석하고, 물 (300 mL)로 켄칭하였다. 30분 동안 2상 혼합물을 교반한 후, 층을 분리하고, 유기부를 물 (300 mL)에 이어서 0.25M HCl (300 mL)로 세척하였다. 유기부를 Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 진공 하에 농축시켜 (45℃), 암색 오일로서 조 생성물 (111.0 g)을 수득하였다. 실리카 겔 플러그 크로마토그래피 (1 Kg 키젤겔(Kieselgel)-60, 헵탄 중 15% EtOAc 4 L, 이어서 헵탄 중 30% EtOAc 10 L)에 의해 물질을 정제하여 투명한 오일로서 표제 화합물 (37.3 g, 87.9% 농도, 54.9%)을 수득하였다.
Figure 112014071781979-pct00071
단계 4: 디에틸 (1S,2S,5R,6S)-2-벤질옥시카르보닐아미노스피로[비시클로[3.1.0]헥산-4,1'-시클로프로판]-2,6-디카르복실레이트
Figure 112014071781979-pct00072
냉각기 유닛에 연결된 재킷 반응 플라스크에, 질소 분위기 하에 디에틸아연 용액 (157.2 mL, 157.2 mmol, 헵탄 중 1M)을 첨가하였다. 용액을 -15℃로 냉각시키고, 차가운 (-15℃) 건조 디클로로에탄 (157.2 mL)으로 희석하였다. 트리플루오로아세트산 (11.1 mL, 146.7 mmol)을 디클로로에탄 (11.1 mL) 중에 용해시키고, 내부 온도를 -10℃ 미만으로 유지하면서 50분에 걸쳐 반응 용기에 첨가하였다. 생성된 현탁액을 -10 내지 -15℃에서 30분 동안 교반하였다. 디아이오도메탄 (12.7 mL, 42.1 g, 157.2 mmol)을 디클로로에탄 (12.7 mL) 중에 용해시키고, 내부 온도를 -10℃ 미만으로 유지하면서 50분에 걸쳐 반응 혼합물에 첨가하였다. 생성된 묽은 백색 현탁액을 -10 내지 -15℃에서 30분 동안 교반하였다. 디에틸 (1S,2S,5R,6S)-2-벤질옥시카르보닐아미노-4-메틸렌-비시클로[3.1.0]헥산-2,6-디카르복실레이트 (20.3 g, 87.9% 농도, 46.0 mmol)을 디클로로에탄 (30.4 mL) 중에 용해시키고, 내부 온도를 -10℃ 미만으로 유지하면서 10분에 걸쳐 반응 혼합물에 첨가하였다. 투명한 연황색 용액을 -10℃에서 5분 동안 교반하고, 잠재 발열을 모니터링하였다. 냉각기 상의 설정점을 0℃로 변경하고, 반응 혼합물을 상기 온도에서 48시간 동안 교반하였다. 내부 온도를 6℃ 미만으로 유지하면서, 15분에 걸쳐 5N HCl (62.9 mL, 314.4 mmol)을 첨가함으로써 반응 혼합물을 켄칭하였다. 생성된 혼합물을 20분 동안 0-5℃에서 교반하고, 이어서 깔때기로 옮기고, 층을 분리하였다. 유기 층을 1N HCl (2 x 50 mL)에 이어서 1:1 포화 NaHCO3/H2O (60 mL), 1:1 포화 Na2CO3/H2O (60 mL) 및 물 (50 mL)로 세척하였다. 유기부를 Na2SO4 상에서 건조시키고, 진공 하에 농축시켜 연황색 오일로서 표제 화합물 (19.6 g, 60.3% 농도, 63.9% 보정된 수율)을 수득하였다.
Figure 112014071781979-pct00073
단계 5: 디에틸 (1S,2S,5R,6S)-2-아미노스피로[비시클로[3.1.0]헥산-4,1'-시클로프로판]-2,6-디카르복실레이트 히드로클로라이드
Figure 112014071781979-pct00074
무수 에탄올 (100 mL, 10 부피), 진한 HCl (2.1 mL, 1.0 N) 및 디에틸 (1S,2S,5R,6S)-2-벤질옥시카르보닐아미노스피로[비시클로[3.1.0]헥산-4,1'-시클로프로판]-2,6-디카르복실레이트 (9.7 g, 24.16 mmol)에 이어서 Pd 블랙 (3.9 g, 40 중량%)을 HEL 반응기에 충전하였다. 반응기를 질소로 3회에 이어서 수소로 3회 퍼징하고, 40 psi 수소로 가압하였다. 반응의 완결이 HPLC에 의해 모니터링될 때까지 반응물을 2시간 이상 동안 20-30℃에서 교반되도록 하였다. 생성된 슬러리를 하이플로 수퍼 셀(Hyflo Super Cel)®의 패드를 통해 여과하고, 습윤 케이크를 무수 에탄올 (2 x 30 mL, 3 부피)로 세척하였다. 여과물을 깨끗한 반응기로 옮기고, 보정 곡선으로부터의 계내 생성물 수율을 기준으로 하여 대략 5 부피로 에탄올을 이소프로필 아세테이트로 대체하였다. 생성된 슬러리를 3시간 이상에 걸쳐 0-5℃로 냉각시켰다. 생성된 슬러리를 여과하고, 차가운 이소프로필 아세테이트 (3 x 5 mL, 0.5 부피)로 세척된 습윤 케이크를 세척하였다. 감압 하에 12시간 이상 동안 30℃에서 건조시켜 표제 화합물 (4.66 g, 15.34 mmol. 63.5%)을 수득하였다.
Figure 112014071781979-pct00075
단계 6: 디에틸 (1S,2S,5R,6S)-2-[[(2S)-2-(tert-부톡시카르보닐아미노)프로파노일]아미노]스피로[비시클로[3.1.0]헥산-4,1'-시클로프로판]-2,6-디카르복실레이트
Figure 112014071781979-pct00076
테트라히드로푸란 (45 mL, 10 부피) 및 (2S)-2-(tert-부톡시카르보닐아미노)프로판산 (3.4 g, 1.2 당량)에 이어서 N-메틸모르폴린 (1.96 mL, 1.2 당량) 및 2-클로로-4,6-디메톡시-1,3,5-트리아진 (3.12 g, 1.2 당량)을 반응기에 충전하였다. 반응이 HPLC에 의해 완결될 때까지 생성된 묽은 슬러리를 3시간 이상 동안 20-25℃에서 교반하였다. 디에틸 (1S,2S,5R,6S)-2-아미노스피로[비시클로[3.1.0]헥산-4,1'-시클로프로판]-2,6-디카르복실레이트 히드로클로라이드 (4.55 g, 14.81 mmol)를 한번에 20-25℃에서 충전하고, 이어서 20-25℃의 온도를 유지하면서 N-메틸모르폴린 (1.63 mL, 1.0 당량)을 10분 이상에 걸쳐 충전하였다. 반응이 HPLC에 의해 완결될 때까지 생성된 슬러리를 2시간 이상 동안 20-25℃에서 교반하였다. 생성된 고체를 여과하고, 습윤 케이크를 테트라히드로푸란 (2 x 10 mL, 2.2 부피)으로 세척하여 100% 수율을 가정하면서 표제 화합물을 수득하였다. 100% 수율을 가정하면서 표제 화합물의 연호박색 테트라히드로푸란 용액을 추가의 정제 없이 사용하였다.
Figure 112014071781979-pct00077
단계 7: (1S,2S,5R,6S)-2-[[(2S)-2-(tert-부톡시카르보닐아미노)프로파노일]아미노]스피로[비시클로[3.1.0]헥산-4,1'-시클로프로판]-2,6-디카르복실산
Figure 112014071781979-pct00078
2 N NaOH (37 mL, 5.0 당량) 및 디에틸 (1S,2S,5R,6S)-2-[[(2S)-2-(tert-부톡시카르보닐아미노)프로파노일]아미노]스피로[비시클로[3.1.0]헥산-4,1'-시클로프로판]-2,6-디카르복실레이트 (6.50 g, 14.81 mmol)을 반응기에 충전하고, 반응이 HPLC에 의해 완결될 때까지 12시간 이상 동안 20-30℃에서 교반되도록 하였다. 반응물을 분리 깔때기로 옮기고, 이를 10분 이상 동안 침강되도록 하였다. 상을 분리하고, 하부 수성 층을 반응기로 복귀시켰다. 에틸 아세테이트 (90 mL, 13.8 부피)를 혼합물에 첨가하고, 이어서 pH가 2 내지 2.5에 도달할 때까지 1 N NaHSO4를 첨가하였다. 층을 분리하고, 유기부를 물 (45 mL, 6.9 부피)로 세척하였다. 유기 상 중의 물을 에틸 아세테이트로 상압 증류에 의해 제거하여 잔류하는 물을 제거하였다. 생성된 슬러리를 2시간 이상에 걸쳐 20-30℃에서 냉각시키고, 90분 이상 동안 상기 온도에서 과립화되도록 하였다. 생성된 고체를 여과하고, 습윤 케이크를 에틸 아세테이트 (3 x 15 mL, 2.3 부피)로 세척하였다. 감압 하에 45℃에서 건조시켜 백색 고체로서 표제 화합물 (4.45 g, 11.64 mmol, 78.6%)을 수득하였다.
Figure 112014071781979-pct00079
단계 8: (1S,2S,5R,6S)-2-[[(2S)-2-아미노프로파노일]아미노]스피로[비시클로[3.1.0]헥산-4,1'-시클로프로판]-2,6-디카르복실산 2수화물
Figure 112014071781979-pct00080
물 (32 mL, 8 부피) 및 (1S,2S,5R,6S)-2-[[(2S)-2-(tert-부톡시카르보닐아미노)프로파노일]아미노]스피로[비시클로[3.1.0]헥산-4,1'-시클로프로판]-2,6-디카르복실산 (3.99 g, 10.4 mmol)에 이어서 진한 HCl (1.80 mL, 2.0 당량)을 반응기에 충전하고, 이어서 반응이 완결될 때까지 (HPLC에 의해 모니터링함) 반응물을 45-55℃로 가열하였다. 반응 혼합물을 20-30℃로 냉각시키고, 5 N NaOH를 사용하여 pH를 대략 3.6으로 조정하였다. 무수 에탄올 (15 mL, 3.75 부피)을 30분 이상에 걸쳐 20-30℃에서 생성된 슬러리에 첨가하였다. 생성된 슬러리를 12시간 이상 동안 20-30℃에서 과립화되도록 하였다. 혼합물을 -5-5℃로 냉각시키고, 이를 60분 이상 동안 과립화되도록 하였다. 생성된 고체를 여과하고, 케이크를 물 중의 30% 무수 에탄올 (2 x 9 mL, 2.25 부피)로 세척하였다. 고체를 12시간 이상 동안 35℃에서 감압 하에 건조시키고, 이어서 2시간 이상 동안 추가의 중량 변화가 없을 때까지 생성된 고체를 저울 상에서 유지하여 백색 고체로서 표제 화합물 (2.71 g, 8.51 mmol, 81.6%)을 수득하였다.
Figure 112014071781979-pct00081
결정질 고체의 X-선 분말 회절 (XRD) 패턴은 35 kV 및 50 mA에서 작동하는 CuKa 공급원 (λ = 1.54060 Å) 및 반텍 (Vantec) 검출기가 구비된 브루커 D4 엔데버(Bruker D4 Endeavor) X-선 분말 회절계로 수득하였다. 이 샘플을, 0.0087° (2θ)의 스텝 크기 및 0.5 초/스텝의 스캔 속도를 사용하고, 0.6 mm의 발산 슬릿, 5.28 mm 고정 산란방지 슬릿 및 9.5 mm 검출 슬릿을 사용하여, 4 내지 40°(2θ) 사이에서 스캐닝하였다. 건조 분말을 석영 샘플 홀더 상에 패킹하고, 유리 슬라이드를 사용하여 평활면을 수득하였다. 회절 패턴을 8.85 및 26.77 도 2-세타에서 NIST 675 표준 피크를 기준으로 하여 조정하였다. 임의의 주어진 결정 형태의 경우에, 결정 습성과 같은 요인에 기인하는 바람직한 배향으로 인해 회절 피크의 상대 강도가 달라질 수 있고, 각도 피크 위치가 약간 달라질 수 있다는 것이 결정학계에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 피크 위치는 샘플을 분석하는 온도 또는 습도에서의 변화 및 샘플 변위로 인해 이동할 수 있다. 본 경우에, 피크 위치 가변도 ± 0.2 (2θ)는 지시된 결정 형태의 명백한 확인을 방해하지 않으면서 이들 잠재적인 변화를 고려할 것이다. 결정 형태의 확인은 특징적인 피크 (° 2θ의 단위), 전형적으로 보다 두드러진 피크의 임의의 독특한 조합을 기초로 하여 이루어질 수 있다. 결정 형태 회절 패턴을 주위 온도 및 상대 습도에서 수집하였다.
따라서, 실시예 10의 제조된 샘플은 하기 표 1에 기재된 바와 같은 회절 피크 (2-세타 값)를 갖는, CuKa 방사선을 사용한 XRD 패턴을 특징으로 한다. 구체적으로 패턴은 0.2 도의 회절각에 대한 허용오차로 5.20에서의 피크를 10.45, 11.70, 15.75, 21.06 및 23.59로 이루어진 군으로부터 선택된 피크 중 1개 이상과 조합하여 함유한다.
<표 1> 실시예 10의 X선 분말 회절 피크
Figure 112014071781979-pct00082
mGlu 수용체는 뉴런 흥분성을 조절하는 G-단백질-커플링된 수용체이다. 보다 특히, 변경된 글루타메이트 신경전달은 신경계 장애, 예컨대 만성 통증 상태, 예를 들어 지속성 통증, 신경병증성 통증, 만성 염증성 통증 또는 내장통; 정신 장애, 예컨대 정신분열증, 양극성 장애, 범불안 장애 또는 외상후 스트레스 장애; 또는 신경변성 장애와 연결된다.
본 발명의 화합물은 mGlu2/3 효능제이기 때문에, 이들은 상기 언급된 상태를 치료하는데 적합할 수 있다.
인간 mGlu2 및 mGlu3 효능제 FLIPR 검정
시리안 햄스터(Syrian Hamster) 섬유모세포로부터 유래되고 인간 mGlu2 또는 mGlu3 수용체를 안정하게 발현하며 래트 글루타메이트 수송체 EAAT 1 (흥분성 아미노산 수송체 1) 및 Gα15 서브유닛으로 공동-형질감염된 AV-12 세포주를 이들 연구에 사용하였다. Gα15의 발현은 Gi-커플링된 수용체가 포스포리파제 C 경로를 통해 신호전달하도록 하여, 형광측정 칼슘 반응 검정에 의해 수용체 활성화를 측정하는 능력을 생성한다. 세포주를 5% 투석된 태아 소 혈청, 1 mM 피루브산나트륨, 10 mM HEPES (4-(2-히드록시에틸)-1-피페라진에탄술폰산), 1 mM L-글루타민 및 5 μg/mL 블라스티시딘으로 보충된 고 글루코스 및 피리독신 히드로클로라이드를 함유하는 둘베코 변형 이글 배지 (DMEM) 중에서 배양함으로써 유지하였다 (모든 배지는 인비트로젠(Invitrogen)으로부터 구입함). 전면생장 배양물을 효소-무함유 해리 용액 (케미콘(Chemicon) S-004-B)을 사용하여 격주로 계대하였다. 세포를 검정 24시간 전에 수확하고, 매트릭스 웰-메이트(Matrix Well-Mate) 세포 시딩기를 사용하여 단지 250 (mGlu2) 또는 125 (mGlu3) μM L-글루타민 (새로이 첨가함)만을 함유하는 배지 중에서 96-웰 흑색-벽 폴리-D-리신-코팅된 플레이트 (BD 바이오코트(BioCoat) #354640) 내에 웰당 85,000개 (mGlu2) 또는 115,000개 (mGlu3) 세포로 분배하였다. 세포내 칼슘 수준은 형광측정 영상화 플레이트 판독기 (FLIPR, 몰레큘라 디바이시스(Molecular Devices))를 사용하여 화합물의 첨가 전 및 후에 모니터링하였다. 검정 완충제는 20 mM HEPES로 보충된 행크 완충 염 용액 (HBSS; 시그마(Sigma))으로 구성되었다. 배지를 제거하고, 세포를 25℃에서 90분 (mGlu2) 또는 120분 (mGlu3) 동안 검정 완충제 중에서 8 μM 플루오(Fluo)-3AM (몰레큘라 프로브스(Molecular Probes), F-1241; 웰당 50 μL)과 함께 인큐베이션하였다. 염료 용액을 제거하고, 새로운 검정 완충제 (웰당 50 μL)로 교체하였다. 효능제 글루타메이트 (피셔(Fisher) A125-100)에 대한 11-포인트 농도 반응 곡선 (10uM에서 출발하여 3X 희석)을 생성하는 단일-첨가 FLIPR 검정을 각각의 실험 이전에 수행하여 전형적 EC50 반응을 확인하였다. 결과는 프리즘(Prism) v4.03 (그래프패드 소프트웨어(GraphPad Software))을 사용하여 분석하였다. 본 발명의 화합물을 25 μM의 최종 농도에서 출발하여 3X 희석을 사용하여 10-포인트 농도 반응 프로파일을 사용하여 단일-첨가 FLIPR 검정으로 시험하였다. 본 발명의 화합물을 0.1N NaOH 중의 10mM 스톡으로서 가용화시키고, -20℃에서 보관하였다. 이들을 3배 희석 시리즈를 통해 검정 완충제 중에 희석하였다. FLIPR 기기 상에서 판독한 초기 5-초 형광을 구한 후, 본 발명의 화합물을 세포 플레이트에 첨가하였다 (웰당 50 μL). 효능제 활성을 검출하기 위해, 데이터를 처음 30초 동안 매초 수집하고, 이어서 총 90초 동안 매 3초마다 수집하였다. 최대 반응은 ECmax (100 μM 글루타메이트)에 의해 유도된 것으로 규정하였다. 화합물 효과는 글루타메이트의 부재 하에 측정된 기준 형광에 대해 보정한 상대 형광 단위 (RFU)에서 최대 마이너스 최소 피크 높이로서 측정하였다. 결정은 단일 플레이트를 사용하여 수행하였다. 효능제 효과는 최대 글루타메이트 반응과 관련하여 화합물 단독에 의해 유도된 자극 퍼센트로서 정량화하였다. 모든 데이터는 4-변수 로지스틱 곡선 피팅 프로그램 (액티비티베이스(ActivityBase) v5.3.1.22)을 사용하여 상대 EC50 값으로서 계산하였다.
실시예 2는 상기와 같이 실질적으로 실행한 hmGlu2 FLIPR 검정으로 측정하여 39.0 nM ± 5.9의 EC50 (n = 3, SEM으로서 계산한 오차)을 얻었다. 실시예 2는 또한 상기와 같이 실질적으로 실행한 hmGlu3 FLIPR 검정으로 측정하여 285 nM ± 52.5의 EC50 (n = 8, SEM으로서 계산한 오차)을 얻었다. 이러한 결과는 실시예 2가 강력한 mGlu2 및 mGlu3 효능제인 것을 입증하였다.
포르말린 주사에 의해 유발된 지속성 통증의 역전
래트 뒷발의 족저면에의 포르말린의 투여는 침해방어성 행동 (예컨대, 주사된 발의 핥기, 물기 및 움찔하기)의 2개의 단계: 포르말린 투여 후 대략 5분 동안의 초기 단계, 및 포르말린 주사 후 대략 10분 내지 60분의 후기 단계를 야기시켰다. 대략 5분 내지 10분의 정지 기간을 2개의 단계로 분리하였다. 이들 포르말린-유발 행동의 점수화는 가속도계에 의해 래트의 운동을 검출하는 자극 챔버 (SR-랩(SR-Lab), 샌 디에고 인스트루먼츠(San Diego Instruments), 캘리포니아주 샌디에고)를 사용하여 자동화할 수 있었다. 시험 화합물 (활성)을 비-금식 수컷 스프라그-돌리(Sprague-Dawley) 래트에서 0.3 - 10 mg/kg 범위 내에서 (복강내 경로) 투여한 지 1시간 후, 포르말린을 족저내 주사하였다. 이어서, 래트를 순응을 위해 시험 챔버 내의 실린더 중에 개별적으로 두었다. 시험 화합물 (전구약물)을 비-금식 수컷 스프라그-돌리 래트에서 0.45 - 15 mg/kg 범위 내에서 경구 투여한 지 2시간 후, 포르말린을 족저내 주사하였다. 이어서, 래트를 순응을 위해 시험 챔버 내의 실린더 중에 개별적으로 두었다. 특정 시점에서, 래트를 실린더로부터 제거하고, 후속적으로 포르말린 (염수 중 5% 용액 50 μL)을 우측 뒷발의 발바닥 표면 내로 투여하고, 즉시 실린더 내에 다시 두었다. 실린더를 시험 챔버 내의 검출 시스템의 로딩 세포 상에 배치하고, 이로 인해 반응을 1-초 빈에서 60분 동안 연속적으로 모니터링하였다. 침해방어성 사건의 수 [>20개-로딩 유닛을 갖는 1-초 빈(bin)의 수]를 5-분 간격으로 합하였다. 20개-로딩 유닛 역치는 정상 생리학적 사건, 예컨대 호흡 또는 스니핑의 포접을 제거하는데 충분히 크지만, 침해방어성 사건을 검출하는데 중요한 규모이다. 데이터 수집의 60분에 걸쳐 각각 1초 시간 빈에서 역치 (20개 로딩 유닛)에 걸친 사건의 수를 결정하여 데이터를 변환하였다. 초기 단계 점수는 시간 0 내지 5분에서 20개 초과의 로딩 유닛의 사건의 합이었다. 후기-단계 점수는 제11분 내지 제40분의 데이터 수집 기간에서 20개 초과의 로딩 유닛의 사건의 총 수를 더함으로써 수득하였다. 포르말린 데이터를 일원 분산 분석 (ANOVA)으로 평가하였고, 적절한 대조군을 JMP (v 6.0.2) 통계적 분석 프로그램 (에스에이에스 인스티튜트 인크.(SAS Institute Inc.), 노스캐롤라이나주 캐리)를 사용하여 양측 비교에 대해 던넷(Dunnett) 't' 검정에 의해 분석하였다. 차이는 p-값이 0.05 미만인 경우에 중요한 것으로 간주하였다. ED50 계산은 각각의 투여에 대해 역전 변환된 데이터 퍼센트 상에서 비-선형 회귀 곡선 피팅을 사용하여 수행하였다.
실시예 2는 상기와 같이 실질적으로 실행한 본 검정에서 측정하여 0.7 mg/kg (i.p.)의 ED50을 얻었다. 실시예 10은 상기와 같이 실질적으로 실행한 본 검정에서 측정하여 4.8 mg/kg (p.o.)의 ED50을 얻었다. 이들 결과는 본 발명의 범주 내의 화합물이 지속성 통증에 대해 유용한 의약인 것을 입증하였다.
L5/L6 신경 라이게이션 유발 촉각 이질통의 역전
뒷다리 부위를 신경자극한 신경의 일측성 라이게이션은 래트에서 촉각 이질통으로 나타난 만성 지속성 통증을 초래하였다. L5/L6 신경 라이게이션을 수행하였다 (문헌 [Kim et al. Pain (1992) 50, 355-363]). 좌측 L5 및 L6 척수 신경을 이소플루란 (유발을 위한 3% 및 유지를 위한 2%) 및 산소의 혼합물을 갖는 기체상 마취 하에 단단히 라이게이션함으로써 신경 손상을 생성하였다. 수술 후 최소 14일 후에, 점증적 굽힘력 (0.3 내지 15 g)으로 폰 프라이 필라멘트에 대한 손상된 발의 촉각적 민감성을 측정함으로써 촉각 이질통을 평가하였다 (Chaplan et al. J. of Neuroscience Methods (1994) 53, 55-63). 래트가 촉각 이질통을 증명한 경우에 (2 그램 미만의 굽힘력의 적용에 반응한 발 회피), 이들은 과민성으로 간주되었다. 기준선 값을 시험 화합물의 평가 직전에 결정하였다. 시험 화합물 (전구약물)을 15 mg/kg으로 경구 투여하고, 발 회피에 대한 촉각 역치를 투여 후 1, 2 및 4시간에서 측정하였다. 데이터를 반응 역치 (그램 (g))로 표현하였고, 값은 각 시점에 대해 평균 표준 오차 (± SE 평균)를 가졌다. 데이터를 분산 분석에 이어서 던넷 사후 분석을 사용하여 분석하고, 통증 역치의 절대 변화 (Cmax = 최대 반응 기준선)를 나타내고, 평균 [로그 (최대 반응) - 로그 (투여전 점수)] (g)로 표현하였다.
15 mg/kg으로 경구 투여된 실시예 10 (여기서, n=8; SEM으로서 계산한 오차)은 상기와 같이 실질적으로 실행한 본 검정에서 측정하여, 비히클 처치 후의 기계적 역치 (각각 1, 2 및 4시간에서 1.50 ± 0.60, 1.34 ± 0.75 및 2.35 ± 0.62)와 비교하여 유의하게 증가된 상응하는 값 (각각 1, 2 및 4시간에서 9.06 ± 2.26, 12.31 ± 1.86 및 8.63 ± 1.98)을 얻었다. 이들 결과는 본 발명의 범주 내의 화합물이 신경병증성 통증 상태에 대해 유용한 의약인 것을 입증하였다.
CFA-유발 기계적 통각과민의 역전
래트 뒷발에서의 국부 염증의 유발은 통증성 반응을 주기 위한 압력 자극에 대한 역치를 결정함으로써 측정될 수 있는 지속성 기계적 통각과민을 일으켰다. 래트에서 기계적 통각과민을 유발한 완전 프로인트 아주반트 (CFA)를 위한 방법은 대부분 문헌 [Iadarola et al. Brain Res. (1988) 455, 205-212]에 기재되어 있다. 래트를 이소플루란 마취 하에 두면서 우측 발에 50 μl의 CFA (시그마 C5881, 85% 파라핀 오일, 15% 만니드 모노올레에이트 중의 1 mg/ml 미코박테리움 추출물)를 족저내 주사하였다. 동물을 부드러운 깔짚 케이지 내에서 회복시키고, 기계적 통각과민 변화를 CFA 주사 24시간 후에 측정하였다. 래트를 조심스럽게 저지하고 발을 플린트 및 푸셔 (유고 바실 아날제시-미터(Ugo Basile Analgesy-meter)) 사이에 둠으로써 기계적 통각과민 (란돌 셀리토 시험(Randall Sellito Test))을 결정하였다. 동물이 발을 회피하는 경우에 그램 힘을 기록하였다. 250 그램 이하의 최대 힘을 적용하고, 래트가 발을 회피하지 않는 경우에, 250 그램의 값을 기록하였다.
래트를 CFA 주사 전에 기준선 반응에 대해 시험하였다. CFA 후 반응을 다음날 아침에 시험하였다 (CFA의 주사한 지 약 24시간 후). 래트를 추가의 시험으로부터 제외된 >150 그램의 점수를 보여주는 임의의 래트와 함께 CFA 후 반응을 기준으로 하여 무작위화하였다. 시험 화합물 (전구약물)을 1.5 내지 15 mg/kg 범위 내에서 경구 투여하고, 발 회피에 대한 기계적 역치를 투여 후 1 및 2시간에 측정하였다. 통계적 유의성은 각 시점에 대해 공분산 분석에 이어서 던넷 사후 검정에서 p 값 < 0.05로서 규정하였다. 하기 표 2는 상기와 같이 실질적으로 실행한 실시예 10에 대한 통계적으로 유의한 결과를 제공하였다. 이들 결과는 본 발명의 범주 내의 화합물이 만성 염증성 통증 상태, 예컨대 골관절염 또는 류마티스 관절염에 대해 유용한 의약인 것을 입증하였다.
<표 2>
Figure 112014071781979-pct00083
값은 그룹당 N = 8-10에 대해 평균 ± SEM이다.
* 동일한 시점에서의 p 값 < 0.05 vs. 비히클 (ANOVA 및 던넷 t-검정)
결장직장 팽만-유발 통증 행동의 역전.
래트의 내장통을 결장직장강의 팽만에 의해 유발하고, 통증을 복근의 반사적 수축에 접근함으로써 모니터링하였다. 래트에서 결장직장 팽만에 의해 초래된 통증을 갖는 복근 반사적 수축의 측정은 문헌 [Fioramonti et al. Neurogastroenterology and Motility (2003) 15, 363-369, 및 Urban et al. J. of Pharmacology and Exp. Ther. (1999) 290, 207-213]에 기재된 바와 같이 실질적으로 수행하였다. 수컷 스프라그 돌리 래트를 복사근 내에서 근전도 (EMG) 전극을 사용하여 외과적으로 이식하고, 1주 동안 회복시키고, 그동안 동물을 취급 및 부분 통제에 순응시켜 스트레스의 효과를 최소화하하였다. 시험 사이에 3분 휴면 기간을 갖는 20초 지속기간 동안에 20, 40 및 60 mm Hg의 압력을 단계화한 압력 모니터/레귤레이터에 부착된 윤활 라텍스 벌룬을 직장 (8 cm) 내로 삽입한 후에 기준선 EMG 측정을 수집하고 기록하였다. 각각의 압력에서의 3회 노출의 세트를 기록한 후, 압력을 다음 수준으로 단계화하였다. 압력 자극 동안에 EMG 판독을 위해 곡선 하 면적 (초당 μ볼트)으로 데이터를 수집하였고, 3회 시험에 걸쳐 평균하였다. 시험 화합물 (전구약물)을 1.5 내지 17 mg/kg 범위 내에서 경구 투여한 지 90분 후에 결장직장 팽만을 시작하였다. 통계적 유의성은 공분산 분석에 이어서 던넷 사후 검정에서 p 값 < 0.05로서 규정하였다. 하기 표 3은 상기와 같이 실질적으로 실행한 실시예 10에 대한 통계적으로 유의한 결과를 제공하였다. 이들 결과는 본 발명의 범주 내의 화합물이 내장통 상태에 대해 유용한 의약인 것을 입증하였다.
<표 3>
Figure 112014083662868-pct00087
값은 그룹당 N = 8-16에 대해 평균 ± SEM이다.
* 동일한 시점에서의 p 값 < 0.05 vs. 비히클 (ANOVA 및 던넷 t-검정)
래트에서의 펜시클리딘 (PCP)-유발 과운동 활성의 역전
NMDA 수용체 길항제, 에컨대 케타민 또는 펜시클리딘 (PCP)의 투여는 정신분열증을 앓는 환자에게서 관찰되는 증상과 유사한 인간에서의 정신병유발-유사 효과를 생성하였다. NMDA 길항제의 운동-자극 효과를 역전시키는 작용제의 능력은 종종 정신병의 동물 모델로서 사용되며, 이는 정신분열증 및 양극성 장애에 대한 의약의 임상 효능을 검출하기 위한 우수한 예측 타당성을 입증하였다.
깔짚으로서 1 cm 깊이의 우드 칩, 및 케이지의 상부 상에 금속 그릴을 갖는 치수 45 x 25 x 20cm의 투명한 플라스틱 신발 상자 케이지 내에 개별 수컷 스프라그-돌리 (하를란(Harlan), 인디애나주 인디애나폴리스) 래트를 둠으로써 운동 활성을 모니터링하였다. 운동 모니터 (킨더 사이언티픽(Kinder Scientific))는 5 cm의 높이의 8 x 4 형식 (또는 15x7 패턴으로 22개의 고밀도 그룹화)으로 배열된 12개의 포토빔의 직사각형 랙, 및 15 cm의 높이의 두번째 랙 (사육 행동을 측정하기 위함)으로 구성되었다. 신발 상자 케이지를 이들 랙의 내부에 두었고, 여기서 랙은 분리된 방 내에 3 피트 높이의 테이블탑에 두었다. 본 발명의 화합물 (활성)을 0.3 - 10 mg/kg 범위 내로 (복강내 경로) 투여한 지 30분 후에 5 mg/kg 용량의 펜시클리딘 (PCP)을 시험투여하였다. 본 발명의 화합물 (전구약물)을 밤새 금식한 래트에게 0.3 - 30 mg/kg 범위 내로 경구 투여한 지 4시간 후에 5 mg/kg 용량의 PCP를 시험투여하였다. 시험 당일에, 래트를 시험 케이지에 두고, PCP 시험투여 전 30분 동안 순응시키고; 래트를 PCP 투여 후 추가의 60분 동안 모니터링하였다.
데이터 분석 및 ED50 계산은 그래프패드 프리즘(GraphPad Prism) (미국 캘리포니아주 샌디에고)을 사용하여 수행하였다. 검정력 분석은 치료의 차이를 검출하기 위한 적절한 통계적 검정력을 갖기 위해 그룹당 8-10마리의 래트가 필요한 것으로 결정하였다 (검정력 = 0.8). 사후 던넷 다중 비교 검정과 함께 일원 분산 분석 (ANOVA)을 총 60분 운동 활성에 대해 수행하였다. ED50 계산은 각각의 투여에 대해 역전 변환된 데이터 퍼센트 상에서 비-선형 회귀 곡선 피팅을 사용하여 수행하였다.
실시예 2는 상기와 같이 실질적으로 실행한 본 검정에서 측정하여 1.46 mg/kg (i.p.)의 ED50을 얻었다. 실시예 5 및 6은 상기와 같이 실질적으로 실행한 본 검정에서 측정하여 각각 2.95 mg/kg (p.o.) 및 4.31 mg/kg (p.o.)을 얻었다. 이들 결과는 본 발명의 범주 내의 화합물이 정신분열증 및 양극성 장애에 대해 유용한 의약인 것을 입증하였다.
래트에서의 스트레스-유발 고열의 약화
고열 (심부 체온의 상승)은 인간을 비롯한 많은 포유동물에서 스트레스에 대한 반응으로 확실히 입증된 일반적인 현상이다. 다수의 불안 장애에서, 고열은 병리의 일부로서 발생하고, 질환의 증상으로 여겨진다. 동물에서 스트레스-유발 고열을 약화시키는 화합물은 인간에서 불안 장애를 치료하는데 유용한 것으로 여겨진다. 범불안 장애 및 외상후 스트레스 장애는 이러한 화합물로 치료될 수 있는 장애 중에 있다. 스트레스-유발 고열을 분석하기 위한 통상적인 최소-침습성 방법은 직장 체온계를 통해 체온 및 스트레스-유발 체온 증가를 측정하는 것에 의한 것이다. 체중이 275 - 350 g인 수컷 피셔 F-344 래트 (하를란, 미국 인디애나주 인디애나폴리스)를 시험하였다. 모든 동물을 자유롭게 이용가능한 식품 및 자동화된 물과 함께 개별적으로 거주시키고, 12시간 명/암 주기 상에서 유지하였다 (06:00에 점등). 동물을 실험 전에 대략 12-18시간 동안 금식시키고, 실험을 명 단계 동안 수행하였다. 0.3, 1, 3 및 10 mg/kg 범위의 본 발명의 화합물을 갖는 1 mL/kg의 용량 부피로 래트에게 복강내 (IP) 투여하였다. 비히클은 염수 + NaOH를 첨가하여 5-7의 pH를 달성하였다. 임상전 모델에서 입증된 강력한 항불안-유사 활성을 갖는 mGluR5 길항제 MTEP (3-[(2-메틸-1,3-티아졸-4-일)에티닐]피리딘)을 비교기로서 사용하였다 (5 ㎎/㎏, IP 경로, 물에 용해됨). 투여 직후에, 래트를 그의 홈 케이지로 돌려보내고, 실험자는 전등을 끄고 방을 떠났다. 투여실은 1시간 사전처리 기간의 나머지 동안 어둡게 하였다.
사전처리 기간 후, 환하게 밝혀진 인접한 방에 래트를 개별적으로 넣고, 여기서 미네랄 오일로 윤활된 직장 프로브를 삽입함으로써 기준 체온을 결정하였다. 피지템프(PHYSITEMP) RET-2® 래트 직장 프로브를 갖는 피지템프 BAT-12® 마이크로프로브 온도계 (피지템프 인스트루먼츠 인크.(Physitemp Instruments Inc.), 미국 뉴저지주 클리프톤)를 사용하여 체온을 평가하였다. 심부 체온을 측정하기 위해 프로브를 직장 내로 대략 2 cm 삽입하였다 (이것은 기준 체온 (T1) (섭씨 온도)임). 10분 후, 2차 체온 측정치를 기록하였다 (T2). 체온의 차이 (T2 - T1)를 스트레스-유발 고열 반응으로 규정하였다. 본 발명의 화합물이 비히클 반응과 비교하여 스트레스-유발 고열 반응에서 35% 감소를 일으키는 용량을 T35 용량으로 규정하였다.
실시예 2는 상기와 같이 실질적으로 실행한 본 검정에서 측정하여 0.57 mg/kg의 T35를 얻었다. 실시예 5는 상기와 같이 실질적으로 실행한 본 검정에서 측정하여 6.4 mg/kg의 T35를 얻었다. 이들 결과는 본 발명의 범주 내의 화합물이 불안 장애에 대해 유용한 의약인 것을 입증하였다. 보다 특히, 본 발명의 범주 내의 화합물은 범불안 장애 및/또는 외상후 스트레스 장애에 대해 유용한 의약일 수 있다.
시험관내 PepT1 GlySar 억제 스크린 및 IC50 결정
PepT1 검정은 전구약물의 장 흡수 수송체 PepT1과 상호작용하는 능력을 조사하기 위해 설정하였다.
인간 장으로부터 유래하는 HeLa 세포 (아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection))를 10% 태아 소 혈청 (FBS), 0.1 mM 비 필수 아미노산 (NEAA) 및 100 유닛/mL 페니실린 + 100 μg/mL 스트렙토마이신을 함유하는 하이클론(Hyclone) 배지 (인비트로젠, Cat# SH30243) 중에서 37℃에서 5% CO2 습윤 분위기에서 성장시켰다. 세포주를 40회 이하의 계대 동안 사용하고, 이어서 폐기하였다. 1 ml 바이알 중의 냉동된 세포를 수조에서 1-2분 동안 해동시키고, 5 mL의 세포 배지에 37℃에서 첨가하였다. 각각의 T-플라스크에 8.5 mL의 새로운 배지 및 1.5 mL의 세포 스톡을 제공하였다. 세포를 1주 동안 2회 계대하였다. 이는 플라스크를 10 mL의 포스페이트 완충 염수-에틸렌 디아민테트라 아세트산 (PBS-EDTA)으로 헹구고, 2 mL의 트립신을 2-5분 동안 첨가하여 세포를 분리시키고, 8 mL의 새로운 배지를 첨가하여 트립신의 추가의 활성을 억제함으로써 달성하였다. 1:6 세포 희석을 수득하기 위해, 각각의 새로운 플라스크에 8.5 mL의 새로운 배지 및 1.5 mL의 세포 스톡의 조합을 제공하였다. 흡수 연구를 위해 준비될 때까지 세포를 37℃에서 인큐베이션하였다.
T-플라스크 내에서 70-80% 전면생장한 세포를 형질감염 절차 1일 전에 플레이팅하였다. 세포 스톡을 함유하는 플라스크를 PBS-EDTA 및 트립신으로 처리하여 세포를 분리하고, 형질감염 배지를 이 시점으로부터 사용하였다. 형질감염 배지는 둘베코 변형 이글 배지 (DMEM) + NEAA로 이루어졌다. 각각의 웰에 0.5 mL의 세포 혼합물을 첨가하고 (1.3x105가 목적하는 세포 농도임), 세포를 37℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 검정 24시간 전, 세포를 PEPT1로 형질감염시켰다. 형질감염 혼합물은 600 μL의 무혈청 형질감염 배지, 18 μL의 FuGene6 (로슈 다이아그노스틱스(Roche Diagnostics)) 및 11 μg의 PepT1 DNA를 혼합함으로써 생성하였다. 형질감염 시약-DNA 복합체를 20분 동안 인큐베이션하고, 24 μL의 시약-DNA 복합체를 각각의 웰에 첨가하였다.
PEPT1-매개 [글리실-1-2-14C]글리실사르코신 (GlySar) 흡수 활성의 억제는 이전에 공개된 바와 같이 24-웰 플레이트에서 형질감염 후 24-시간으로 배양된 세포에서 측정하였다 (문헌 [Zhang et al. 2004. J. Pharm. Exper Ther. 310:437-445]). [14C]Gly-Sar의 흡수를 억제하는 본 발명의 화합물의 능력을 측정하기 위해, 전구약물을 5 μM [14C]Gly-Sar (모라벡 바이오케미칼스(Moravek Biochemicals)) 및 20 μM 차가운 Gly-Sar의 존재 하에 pH 6.0 흡수 배지 중에서 5 mM에서 80 내지 90% 전면생장한 PepT1 일시적 형질감염된 HeLa 세포와 함께 인큐베이션하였다. 흡수 배지는 140 mM NaCl, 5.4 mM KCl, 1.8 mM CaCl2, 0.8 mM MgSO4, 5 mM 글루코스, 25 mM 트리스(히드록시메틸)아미노메탄 완충제 (트리스(TRIS))로 이루어졌다. 이어서, 2-(N-모르폴리노)에탄술폰산을 사용하여 용액을 pH 6.0으로 만들었다. 인큐베이션 부피는 500 μL였고, 실온에서 3분 동안 수행하였다. 인큐베이션 시간의 종료시 흡수를 중단하기 위해, 흡수 배지를 세포 단층으로부터 흡인 제거하고, 500 μL의 빙냉 PBS를 웰에 첨가하였다. 세포를 Ca+2 및 Mg+2가 없는 500 μL의 실온 PBS로 3회 세척하였다. 이어서, 세포를 300 μL의 1% 트리톤(Triton) X100 H2O 용액으로 용해시켰다. 200 μL 분취액을 취하고, 방사능을 액체 섬광 계수에 의해 결정하여 각각의 인큐베이션 웰에 존재하는 [14C]Gly-Sar을 측정하였다. 억제제가 없는 대조군을 설정하고, 각각의 전구약물의 억제 퍼센트를 상기 대조군에 대해 계산하였다. 음성 대조군 (글리신) 및 2개의 양성 대조군 (세파드록실 및 세팔렉신)을 각각의 실험과 병행 수행하여 검정 시스템의 타당성을 입증하였다. 세팔렉신과 동등하거나 또는 이보다 더 우수한 GlySar 흡수 억제를 갖는 전구약물을 허용가능한 것으로 간주하였다. 평균값±표준 편차는 글리신의 경우 10.1±9.5% (n=19)이었고, 세파드록실의 경우 53.2 ± 13.2% (n=19)이었고, 세팔렉신의 경우 37.5±14.7% (n=18)이었다.
PepT IC50 검정의 경우에, 전구약물을 5 μM [14C]Gly-Sar 및 20 μM 차가운 Gly-Sar의 존재 하에 농도 범위 (0.0625 내지 25 mM)에서 인큐베이션하였다. 인큐베이션 및 샘플링 절차는 상기 기재된 PepT1 스크린과 정확하게 동일하였다. [14C]Gly-Sar 흡수 데이터를 전구약물 농도 각각에 대해 평가하고, IC50 값을 계산하였다.
실시예 5, 6 및 7은 상기와 같이 실질적으로 실행한 본 검정에서 측정하여 5mM에서 각각 89%, 87% 및 78%의 hPepT1 [3H]Gly-Sar 흡수 억제를 얻었다. 실시예 5 및 6은 상기와 같이 실질적으로 실행한 본 검정에서 측정하여 각각 1.98 mM 및 0.25 mM의 hPepT1 [3H]Gly-Sar 흡수 억제 IC50을 얻었다. 이들 결과는 본 발명의 범주 내의 화합물이 PepT1 수송체를 통해 경구 흡수되는 것을 입증하였다.
시험관내 장 전구약물 가수분해 검정
냉동 인간 십이지장 균질물 (100 mM 트리스 포스페이트 완충제, pH 7.4를 사용하여 1:2 조직:완충제 비)을 셀시우스 인 비트로 테크놀로지스(Celsius In Vitro Technologies) (메릴랜드주 볼티모어)로부터 입수하였으며, 이는 페닐메틸술포닐플루오라이드 (PMSF) 및 EDTA를 둘 다 함유하지 않았다.
인간 십이지장의 각각의 로트는 단일 공여자로부터 수득하였으며, 장을 스크래핑하고, 절편을 별도로 냉동시켰다. 모든 초기 조직 수집은 4℃에서 수행하였고, -70℃에서 즉시 냉동시켰다. 인간 장 균질물을 해동시키고, 100 mM PBS 완충제, pH 7.4 중에 0.5 mg/mL의 최종 단백질 농도로 희석한 직후에 인큐베이션하였다.
인큐베이션은 96-웰 플레이트 중에서 수행하였고, 모든 전구약물을 매일 2중으로 실행하였다. 스톡 전구약물 용액을 물 중에 1 mM의 농도로 제조하였다. 0.5 mg/mL 장 균질물의 200 μL 분취액 및 196 μL의 100 mM PBS 완충제를 37℃ 수조 내의 96-웰 플레이트에 두었다. 96-웰 피펫터를 사용하여 4 μL의 1 mM 전구약물 용액을 균질물 내로 옮겼다. 전구약물의 첨가 직후 (시간 0) 및 1시간 인큐베이션 후에, 자동화 1회용 동시 96 웰 피펫터를 사용하여 인큐베이션 혼합물의 50 μL 샘플을 제거하고, 100 ng/mL의 내부 표준물을 함유하는 200 μL의 메탄올 켄칭 용액에 직접 첨가하였다. 이어서, 샘플을 10℃에서 5분 동안 3500 rpm에서 원심분리하였다. 상청액 (200 μL)을 최종 96 웰 PCR 플레이트로 옮기고, LC/MS/MS에 의한 분석을 위해 밀봉하였다.
인큐베이션 혼합물 중의 가수분해된 활성 대사물의 농도는 애널리스트(Analyst) 버전 1.4.2, 터보이온스프레이(TurboIonSpray), 양성 이온화 및 선택 반응 모니터링 (SRM)을 갖는 사이엑스(Sciex) API 4000 사극자 질량 분광기 상에서 LC/MS/MS 검출을 사용하여 결정하였다. 워터스 아틀란티스(Waters Atlantis)® T3 (20 x 2.1 mm, 5 μM) HPLC 칼럼을 주위 온도에서 1.0 mL/분의 유량으로 및 0.1% 이동상 A → 99% 이동상 A의 이동상 구배로 사용하였다. 이동상 A는 1000:5 물:헵타플루오로부테르산이었고, 이동상 B는 1:1 메탄올:빙초산이었다.
장 인큐베이션 혼합물 중의 가수분해된 활성 대사물의 농도는 100 mM PBS pH 7.4 중에서 10 μM에서 출발하여 반복 2배 희석에 의해 생성된 표준 곡선으로부터 결정하고, 후속적으로 샘플과 동일한 메탄올-내부 표준 용액으로 켄칭하였다. 평균 및 표준 편차는 마이크로소프트(Microsoft)® 오피스 엑셀(Office Excel)® 2007을 이용하여 계산하였다. 가수분해의 양은 첨가한 전구약물 농도와 비교하여 형성된 활성 대사물의 몰 백분율로서 결정하였다. 양성 대조군인 내부 전구약물 A의 내부 활성 대사물 약물 A로의 가수분해는 매 배치마다 평균 75.3% (n=20)로 실행하였다. 이어서, 최종 값을 내부 활성 대사물 약물 A의 형성에 대해 정규화하였다.
실시예 5, 6 및 7은 상기와 같이 실질적으로 실행한 본 검정에서 측정하여 내부 전구약물 A와 비교하여 각각 36% (n=3, SD = 2.7), 44% (n=3, SD = 4.1) 및 34% (n=1)의 인간 장 가수분해를 얻었다. 이들 결과는 본 발명의 범주 내의 화합물이 인간 장에서 가수분해되는 것을 입증하였다.
시험관내 인간 간 S-9 균질물 가수분해 검정
간 S9 분획은 제노테크 LLC(Xenotech LLC) (미주리주 레넥사)로부터 입수하였다. 로트는 남성 1명 및 여성 1명인 2명의 공여자의 풀로부터의 것이었다. 간 S9 분획을 제조하고, EDTA를 함유하지 않는 4℃에서의 50mM 트리스, pH 7.4 및 150mM 염화칼륨으로 이루어진 균질화 완충제를 사용하여 희석하였다. 전구약물을 37℃에서 2시간 동안 간 균질물 내에서 인큐베이션한 후에, 활성 대사물의 농도를 LC/MS/MS에 의해 결정하였다. 클로피도그렐의 클로피도그렐 카르복실산으로의 가수분해를 검정 양성 대조군으로서 이용하였다.
인큐베이션은 96-웰 포맷으로 수행하고, 모든 전구약물을 매일 2중으로 실행하였다. 스톡 전구약물 용액을 물 중에 1 mM의 농도로 제조하였다. 인간 간 S9 분획을 100mM PBS 완충제, pH 7.4 중에 0.5mg/ml의 최종 단백질 농도로 희석하였다.
0.5mg/mL 인간 간 S-9 균질물의 200 μL 분취액 및 196μL의 100 mM PBS 완충제를 37℃ 수조 내의 96-웰 플레이트에 두었다. 96-웰 피펫터를 사용하여 4μL의 1 mM 전구약물 용액을 균질물 내로 옮겼다. 가수분해가 화학적 불안정성으로 인한 것이 아닌 것을 확실히 하기 위해, 전구약물을 또한 간 S-9 없이 단독으로 PBS 완충제와 함께 인큐베이션하였다. 전구약물의 첨가 직후 (시간 0) 및 1시간 인큐베이션 후에, 자동화 1회용 동시 96-웰 피펫터를 사용하여 인큐베이션 혼합물의 50 μL 샘플을 제거하고, 100 ng/mL의 내부 표준물을 함유하는 200 μL의 메탄올 켄칭 용액에 직접 첨가하였다. 이어서, 샘플을 3500 rpm에서 5분 동안 10℃에서 원심분리하였다. 상청액 (200uL)을 최종 96 웰 PCR 플레이트로 옮기고, LC/MS/MS에 의한 분석을 위해 밀봉하였다.
배양 동안에 형성된 활성 대사물의 LC/MS/MS 정량화는 사이엑스 API 4000 (애널리스트 버전 1.4.2, 터보이온스프레이, 양성 이온화 및 선택 반응 모니터링 (SRM)) 상에서 수행하였다. 사용한 HPLC 칼럼은 주위 온도에서 1.0 mL/분의 이동상 유량의 워터스 아틀란티스® T3 (20 x 2.1 mm, 5μm)이었다. 이동상 A는 1000:5 물:헵타플루오로부테르산이고, 이동상 B는 1:1 메탄올:빙초산이었다. 99.9/0.1의 이동상 비 A/B에서 출발하여 1/99에서 종료하는 이동상 구배를 이용하였다.
인큐베이션 혼합물 중의 가수분해된 활성 대사물의 농도는 100 mM PBS pH 7.4 중에서 10μM에서 출발하여 반복 2배 희석에 의해 생성된 표준 곡선으로부터 결정하고, 후속적으로 샘플과 동일한 메탄올-내부 표준 용액으로 켄칭하였다. 평균 및 표준 편차는 마이크로소프트® 오피스 엑셀® 2007을 이용하여 계산하였다. 최종 값은 첨가한 전구약물 농도와 비교하여 형성된 활성 대사물의 몰 백분율로서 나타내었다. 클로피도그렐의 클로피도그렐 카르복실산으로의 가수분해를 양성 대조군으로서 사용하였고, 평균은 73.0% (n=27)였다.
실시예 8 및 9는 상기와 같이 실질적으로 실행한 본 검정에서 측정하여 각각 23% 및 59.3%의 인간 간 S9 가수분해를 얻었다. 이들 결과는 본 발명의 범주 내의 화합물이 인간 간에서 가수분해되는 것을 입증하였다.
데이터는 예시된 아미노산 전구약물이 세파드록실 및 세팔렉신 (Zhang et al., 2004. JPET 310:437-445)만큼 우수하거나 또는 그보다 더 우수하게 PepT1 기질 GlySar의 흡수를 억제하는 것을 입증하였으며, 이는 PepT1 수송체를 통한 인간 경구 흡수에 대한 가능성을 시사하였다. 전구약물 흡수 이외에도, 체내로 유입시, 활성 대사물을 수득하기 위해서는 전구약물 가수분해가 필수적이다. 본 발명의 시험관내 가수분해 연구는 예시된 아미노산 전구약물이 인간 장에 의해 가수분해될 수 있는 것을 시사하였다. 예시된 디에스테르 전구약물의 가수분해는 인간 간 균질물 내에서 발생하였으며, 이는 예시된 디에스테르 전구약물이 경구 노출 후에 인간 내에서 가수분해될 가능성을 시사하였다. 이들 데이터는 함께 예시된 아미노산 전구약물 및 예시된 디에스테르 전구약물이 인간 내에서 가수분해되어 활성 대사물을 방출할 가능성을 나타내었다.
약동학 검정
표준 교차 설계 (N=3, 래트는 각각 정맥내 및 경구 용량을 둘 다 받음)에서, 금식한 수컷 스프라그 돌리 래트에게 실시예 2를 1 mg/kg으로 정맥내 또는 실시예 5를 7.5 mg/kg (실시예 2의 5 mg/kg 몰 당량과 동등함)의 용량으로 경구 위관영양에 의해 투여하였다. 정맥내 투여를 위해, 실시예 2를 물 중에 용해시키고, 경구 용량을 위해 실시예 5를 히드록시에틸셀룰로스 (1%), 폴리소르베이트 80 (0.25%) 및 소포제 1510-US (0.05%)의 수성 비히클 내에 제조하였다. 캐뉼라를 외과적으로 이식하여 일련의 혈액 수집을 용이하게 하였다. 혈액을 투여 후 0-24시간의 기간에 걸쳐 EDTA 튜브 내에 수집하고, 원심분리하고, 혈장을 분석시까지 냉동 저장하였다.
혈장 샘플을 해동하고, 50 μL 분취액을 96-웰 플레이트로 옮기고, 50 μL의 내부 표준 용액을 첨가하고, 샘플을 혼합하였다. 이어서, 300 μL의 아세토니트릴을 첨가하고, 샘플을 3분 동안 볼텍싱하고, 원심분리하였다. 상청액의 300 μL 분취액을 별도의 플레이트로 옮기고, 40℃에서 질소 하에 증발시켰다. 잔류물을 물 중의 0.5% 헵타플루오로부티르산 100 μL 중에 재구성하고, 볼텍싱하고, 원심분리하였다. 20 μL 분취액을 후속적으로 시마즈(Shimadzu) 오토샘플러를 사용한 LC/MS/MS, 및 양성 이온 터보스프레이 모드 하에 AB 사이엑스 4000 질량 분광계와 상호접촉된 HPLC 시스템에 의해 분석하였다. MS/MS 전이는 전구약물 실시예 5에 대하여 283.2→44.2 amu 및 활성 실시예 2에 대하여 212.1→103.1 amu이었다. 아틀란티스 T3, 50 x 2.1 mm, 1.0 mL/분의 이동상 유량 및 (A) 물 중의 0.2% 포름산 및 (B) 아세토니트릴-물 (1:1,v/v)의 이원 이동상에서의 5 마이크로미터 HPLC 칼럼, 및 0.8분에 걸친 2% B → 98%B의 구배를 이용하였다. 실시예 2의 체류 시간은 대략 0.53분이었다.
약동학 파라미터는 윈도우즈용 왓슨(Watson) (써모 사이언티픽(Thermo Scientific))을 사용하여 혈장 농도 데이터로부터 계산하였다. 상대 경구 생체이용률은 정맥내 투여 후의 활성 실시예 2의 혈장 농도 시간 곡선하 면적 (AUC)을 전구약물 실시예 5의 경구 투여 후의 활성 대사물의 AUC와 비교함으로써 결정하였다.
성공적인 전구약물은 경구 투여 후에 잘 흡수되고 또한 후속적으로 가수분해되어 활성 대사물을 체순환 내로 방출하여야 한다. 상대 생체이용률은 전구약물의 경구 투여 후의 활성 대사물의 AUC를 활성 화합물의 정맥내 투여 후의 활성의 AUC와 비교함으로써 파라미터 둘 다를 포함하였다. 수컷 래트에서, 상기와 같이 실질적으로 실행한 본 검정에서 측정된 바와 같이, 전구약물 실시예 5의 경구 투여 후의 활성 대사물의 상대 생체이용률은 60 ± 14% (평균 ± 표준 편차)였고, 이는 전구약물 실시예 5가 잘 흡수되고 또한 광범위하게 가수분해되어 생체내 활성 대사물을 생성한 것을 입증하였다.

Claims (27)

  1. 하기 화학식 I의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염.
    <화학식 I>
    Figure 112014071781979-pct00085

    상기 식에서,
    R1은 수소이고, R2는 수소이고, R3은 수소이거나;
    R1은 수소이고, R2는 (2S)-2-아미노프로파노일이고, R3은 수소이거나;
    R1은 수소이고, R2는 (2S)-2-아미노-4-메틸술파닐-부타노일이고, R3은 수소이거나;
    R1은 수소이고, R2는 2-아미노아세틸이고, R3은 수소이거나;
    R1은 벤질이고, R2는 수소이고, R3은 벤질이거나; 또는
    R1은 (2-플루오로페닐)메틸이고, R2는 수소이고, R3은 (2-플루오로페닐)메틸이다.
  2. 제1항에 있어서, (1S,2S,5R,6S)-2-아미노스피로[비시클로[3.1.0]헥산-4,1'-시클로프로판]-2,6-디카르복실산인 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염.
  3. 제1항에 있어서, (1S,2S,5R,6S)-2-아미노스피로[비시클로[3.1.0]헥산-4,1'-시클로프로판]-2,6-디카르복실산 히드로클로라이드인 화합물.
  4. 제1항에 있어서, (1S,2S,5R,6S)-2-[[(2S)-2-아미노프로파노일]아미노]스피로[비시클로[3.1.0]헥산-4,1'-시클로프로판]-2,6-디카르복실산인 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염.
  5. 제1항에 있어서, (1S,2S,5R,6S)-2-[[(2S)-2-아미노프로파노일]아미노]스피로[비시클로[3.1.0]헥산-4,1'-시클로프로판]-2,6-디카르복실산 히드로클로라이드인 화합물.
  6. 제1항에 있어서, (1S,2S,5R,6S)-2-[[(2S)-2-아미노프로파노일]아미노]스피로[비시클로[3.1.0]헥산-4,1'-시클로프로판]-2,6-디카르복실산 2수화물인 화합물.
  7. 제1항에 있어서, (1S,2S,5R,6S)-2-[[(2S)-2-아미노프로파노일]아미노]스피로[비시클로[3.1.0]헥산-4,1'-시클로프로판]-2,6-디카르복실산; 1,4-디옥산 (1: 0.5); 히드로클로라이드인 화합물.
  8. 제1항에 있어서, (1S,2S,5R,6S)-2-[[(2S)-2-아미노-4-메틸술파닐-부타노일]아미노]스피로[비시클로[3.1.0]헥산-4,1'-시클로프로판]-2,6-디카르복실산인 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염.
  9. 제1항에 있어서, (1S,2S,5R,6S)-2-[[(2S)-2-아미노-4-메틸술파닐-부타노일]아미노]스피로[비시클로[3.1.0]헥산-4,1'-시클로프로판]-2,6-디카르복실산 히드로클로라이드인 화합물.
  10. 제1항에 있어서, (1S,2S,5R,6S)-2-[(2-아미노아세틸)아미노]스피로[비시클로[3.1.0]헥산-4,1'-시클로프로판]-2,6-디카르복실산인 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염.
  11. 제1항에 있어서, (1S,2S,5R,6S)-2-[(2-아미노아세틸)아미노]스피로[비시클로[3.1.0]헥산-4,1'-시클로프로판]-2,6-디카르복실산 히드로클로라이드인 화합물.
  12. 제1항에 있어서, 디벤질 (1S,2S,5R,6S)-2-아미노스피로[비시클로[3.1.0]헥산-4,1'-시클로프로판]-2,6-디카르복실레이트인 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염.
  13. 제1항에 있어서, 디벤질 (1S,2S,5R,6S)-2-아미노스피로[비시클로[3.1.0]헥산-4,1'-시클로프로판]-2,6-디카르복실레이트; 1,4-디옥산; 히드로클로라이드인 화합물.
  14. 제1항에 있어서, 비스[(2-플루오로페닐)메틸] (1S,2S,5R,6S)-2-아미노스피로[비시클로[3.1.0]헥산-4,1'-시클로프로판]-2,6-디카르복실레이트인 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염.
  15. 제1항에 있어서, 비스[(2-플루오로페닐)메틸] (1S,2S,5R,6S)-2-아미노스피로[비시클로[3.1.0]헥산-4,1'-시클로프로판]-2,6-디카르복실레이트 히드로클로라이드인 화합물.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항의 화합물 또는 염 및 제약상 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는, 지속성 통증, 신경병증성 통증, 만성 염증성 통증 및 내장통으로 이루어진 군으로부터 선택된 신경계 장애의 치료에 사용하기 위한 제약 조성물.
  17. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항의 화합물 또는 염 및 제약상 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는, 정신분열증, 양극성 장애, 범불안 장애 및 외상후 스트레스 장애로 이루어진 군으로부터 선택된 정신 장애의 치료에 사용하기 위한 제약 조성물.
  18. 삭제
  19. 삭제
  20. 삭제
  21. 삭제
  22. 삭제
  23. 삭제
  24. 삭제
  25. 삭제
  26. 삭제
  27. 삭제
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