ES2592166T3

ES2592166T3 - Agonistas de mGLU2/3

Info

Publication number: ES2592166T3
Application number: ES13702872.6T
Authority: ES
Inventors: Stephen Richard Baker; Christopher David Beadle; Barry Peter Clark; James Allen Monn; Lourdes Prieto
Original assignee: Eli Lilly and Co
Current assignee: Eli Lilly and Co
Priority date: 2012-02-01
Filing date: 2013-01-29
Publication date: 2016-11-28
Anticipated expiration: 2033-01-29
Also published as: EA201491291A1; JP5755821B2; EP2809647A1; CL2014001928A1; IL233732A0; CA2863085A1; AR089718A1; PT2809647T; AP2014007821A0; SI2809647T1; CN104093703B; AU2013215396A1; PE20141680A1; MX2014008598A; AU2013215396B2; AU2013215396A8; CO7020921A2; DK2809647T3; MA35884B1; US20130197079A1

Abstract

Un compuesto de fórmula I:**Fórmula** en la que R1 es hidrógeno, R2 es hidrógeno y R3 es hidrógeno; R1 es hidrógeno, R2 es (2S)-2-aminopropanoílo y R3 es hidrógeno; R1 es hidrógeno, R2 es (2S)-2-amino-4-metilsulfanil-butanoílo y R3 es hidrógeno; R1 es hidrógeno, R2 es 2-aminoacetilo y R3 es hidrógeno; R1 es bencilo, R2 es hidrógeno y R3 es bencilo; o R1 es (2-fluorofenil)metilo, R2 es hidrógeno y R3 es (2-fluorofenil)metilo; o una de sus sales farmacéuticamente aceptables.

Description

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solución se añade una mezcla de éter monoetílico de dietilenglicol (4 ml) y éter dietílico (2,4 ml). Se disuelve N-metilN'-nitro-N-nitrosoguanidina (1 g, 6,8 mmol) en una mezcla de éter dietílico (13 ml) y éter monoetílico de dietilenglicol (4 ml). Se coloca esta solución en un embudo de adición con uniones de vidrio suaves y se ajusta al aparato mini-Diazald. Se calienta la solución de hidróxido potásico en un baño de agua mantenido a 70 ºC, asegurándose de que el matraz colector y un burbujeador lleno con éter dietílico en la salida del aparato están ambos enfriados en un bañode hielo seco/iso-propanol. Se deja que la solución de N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina sea añadida a una velocidad igual a la de la destilación resultante. Una vez completada la destilación, se añade más éter dietílico gota agota a través de un embudo de adición hasta que el condensado del colector frío es incoloro. Se almacena la solución resultante en un baño de hielo seco/iso-propanol hasta que es necesario. Se suspende acetato de paladio (17,2 mg; 76,5 µmol) en éter dietílico (10 ml). Se decanta y se filtra la solución marrón pálido resultante y se añade cuidadosamente a una mezcla de la solución en diazometano de (1S,2S,5R,6S)-2-(terc-butoxicarbonilamino)-4metileno-biciclo[3.1.0]hexano-2,6-dicarboxilato de di-terc-butilo (330 mg, 765,5 µmol) y éter dietílico (10 ml) a la que se había dejado alcanzar la temperatura ambiente. Una vez ha cesado la generación de gas, se filtra la suspensión resultante y se concentra a presión reducida proporcionando 260 mg de una mezcla de (1S,2S,5R,6S)-2-(tercbutoxicarbonilamino)-4-metileno-biciclo[3.1.0]hexano-2,6-dicarboxilato de di-terc-butilo sin reaccionar y compuesto del título.

Se prepara una solución exenta de etanol de diazometano en éter dietílico a partir de una solución de hidróxido de potasio (2,5 g, 44,6 mmol) en agua (4 ml), éter monoetílico de dietilenglicol (14 ml) y éter dietílico (8 ml) y N-metil-N'nitro-N-nitrosoguanidina (4 g, 27,2 mmol) en una mezcla de éter dietílico (30 ml) y éter monoetílico de dietilenglicol (15 ml). Se toma la solución resultante de diazometano y se añade la misma en varias porciones durante 30 minutos a una suspensión de acetato de paladio (20 mg, 89,1 µmol) en una solución de la mezcla preparada anteriormente del (1S,2S,5R,6S)-2-(terc-butoxicarbonilamino)-4-metileno-biciclo[3.1.0]hexano-2,6-dicarboxilato de diterc-butilo sin reaccionar y de compuesto del título (260 mg) en éter dietílico (3 ml). Una vez ha cesado la generación de gas, se deja reposar durante la noche, luego se filtra a través de una frita de separación de fases y se concentra a presión reducida proporcionando un aceite oscuro. Se purifica por cromatografía ultrarrápida eluyendo con acetato de etilo: iso-hexano (0:100 hasta 75:25) proporcionando 185 mg de una mezcla de (1S,2S,5R,6S)-2-(tercbutoxicarbonilamino)-4-metileno-biciclo[3.1.0]hexano-2,6-dicarboxilato de di-terc-butilo sin reaccionar y compuesto del título.

Se prepara una solución exenta en etanol de diazometano en éter dietílico a partir de una solución de hidróxido de potasio (3,2 g, 57 mmol) en agua (5 ml), éter monoetílico de dietilenglicol (4 ml) y éter dietílico (10 ml) y N-metil-N'nitro-N-nitrosoguanidina (5 g, 34 mmol) en una mezcla de éter dietílico (35 ml) y éter monoetílico de dietilenglicol (15 ml). Se toma la solución resultante de diazometano y se añade la misma en porciones durante 60 minutos a una suspensión de acetato de paladio (20 mg, 89,1 µmol) en una solución de la mezcla recién preparada de (1S,2S,5R,6S)-2-(terc-butoxicarbonilamino)-4-metileno-biciclo[3.1.0]hexano-2,6-dicarboxilato de diterc-butilo sin reaccionar y compuesto del título (185 mg) en éter dietílico (2 ml). Una vez ha cesado la generación de gas, se deja reposar durante 30 minutos, se filtra y se concentra a presión reducida proporcionando un aceite amarillo. Se purificapor HPLC guiada por masas (TR = 6,4 minutos (UV), 6,37 minutos (EM); Columna de CL: Waters XBridge™ 30 mm x 100 mm 5 µm; agua con ácido fórmico al 0,1 %; gradiente: acetonitrilo al 28-62 % con ácido fórmico al 0,1 % en 1,35 minutos luego 62-95 % en 6,65 minutos, luego mantenida a 95 % durante 3,55 minutos. Temperatura de la columna: ambiente; caudal: 45 ml/minuto) proporcionando el compuesto del título como un aceite incoloro (55,3 mg, 130,6 µmol). EM (m/z): 446 (M+23).

Preparación 3

(1S,2S,5R,6R)-2-Amino-4-oxo-biciclo[3.1.0]hexano-2,6-dicarboxilato de dietilo.

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Se carga un matraz de tres bocas de 500 ml equipado con un condensador, entrada de nitrógeno y un termómetro con (1S,2S,5R,6R)-2-(terc-butoxicarbonilamino)-4-oxo-biciclo[3.1.0]hexano-2,6-dicarboxilato de di-terc-butilo (15 g, 36,4 mmol) en etanol (365 ml). Se añade cloruro de tionilo (13,3 ml, 182,3 mmol) a una solución agitada a temperatura ambiente mediante jeringa (pequeña exotermia) y luego se calienta hasta reflujo. Después de 24 horasse enfría la reacción hasta temperatura ambiente y se concentra al vacío. Se disuelve el residuo en diclorometano (50 ml) y luego se concentra en un evaporador rotatorio (repetir 3 veces). Se reparte el residuo entre acetato de etilo (200 ml) e hidrógenocarbonato sódico saturado (150 ml). Se lava la fase orgánica con salmuera (150 ml), se seca sobre sulfato sódico, se filtra y luego se concentra hasta sequedad dando el compuesto del título como un aceite(8,24 g, 32,3 mmol). EM (m/z): 256 (M+1).

Preparación 4

(1S,2S,5R,6R)-2-Acetamido-4-oxo-biciclo[3.1.0]hexano-2,6-dicarboxilato de dietilo.

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Se añade anhídrido del ácido acético (5 ml, 50,8 mmol) a una solución agitada de (1S,2S,5R,6R)-2-amino-4-oxobiciclo[3.1.0]hexano-2,6-dicarboxilato de dietilo (7,2 g, 28,2 mmol) y trietilamina (7,9 ml, 56,4 mmol) en diclorometano seco (72 ml) a temperatura ambiente. Después de 2 horas, se inactiva con agua (100 ml) y se agita intensamente durante 20 minutos. Se separa la fase de diclorometano mediante una frita hidrófoba y se evapora hasta un aceite marrón claro (9,6 g). Se purifica por cromatografía ultrarrápida eluyendo con acetato de etilo: iso-hexano (70:30 hasta 90:10) dando el compuesto del título como un vidrio amarillo pálido que se espumó al secar (6,53 g, 22 mmol). EM (m/z): 298 (M+1), 320 (M+23), 617 (2M+23).

Preparación 5

(1S,2S,5R,6S)-2-Acetamido-4-metileno-biciclo[3.1.0]hexano-2,6-dicarboxilato de dietilo.

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OO H

O NH

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Se carga un matraz de fondo redondo de 250 ml secado al horno con bromuro de (metil)trifenilfosfonio (9,72 g, 26,7 mmol) y tetrahidrofurano seco (122 ml). Se enfría la suspensión hasta 0 a-5 ºC y se trata con bis(trimetilsilil)amida de sodio 2M en tetrahidrofurano (13,3 ml, 26,7 mmol) gota a gota. Se agita la mezcla amarillo brillante resultante a 0 ºCdurante 20 minutos y luego se trata con una solución de (1S,2S,5R,6R)-2-acetamido-4-oxo-biciclo[3.1.0]hexano-2,6dicarboxilato de dietilo (6,1 g, 20,5 mmol) en tetrahidrofurano (30 ml). Se deja calentar la reacción lentamente hastatemperatura ambiente durante 3 horas. Después de agitar durante 20 horas a temperatura ambiente se inactiva con agua helada (200 ml) y se extrae con acetato de etilo (200 ml). Se lavan los extractos con agua (100 ml), salmuera (100 ml), se secan, se filtran y se evaporan hasta un aceite marrón oscuro. Se añade éter dietílico (70 ml) e isohexano (20 ml) y se siembra la solución con óxido de trifenilfosfina. Se deja reposar durante 2 horas, se decanta la solución, se añade sílice y se concentra al vacío. Se purifica por cromatografía ultrarrápida eluyendo con acetato de etilo: iso-hexano (60:40 hasta 80:20) dando un aceite rosa (6,81 g) contaminado con óxido de trifenilfosfina. Se vuelve a purificar por cromatografía ultrarrápida eluyendo con acetato de etilo: iso-hexano (60:40) dando el compuesto del título como un aceite amarillo viscoso (3,98 g, 13,5 mmol). EM (m/z): 296 (M+1), 318 (M+23), 613 (2M+23).

Preparación 6

(1S,2S,5R,6S)-2-Acetamidoespiro[biciclo[3.1.0]hexano-4,1'-ciclopropano]-2,6-dicarboxilato de dietilo

H O

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O H

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En atmósfera de nitrógeno, se añade una solución de ácido trifluoracético (1,9 ml, 25 mmol) en diclorometano (12,5 ml) gota a gota muy lentamente a una solución agitada y enfriada (baño de hielo) de dietil cinc (1M en heptanos) (25ml, 25 mmol) en diclorometano (12,5 ml). Después de 10 minutos, se añade una solución de diyodometano (2,01 ml, 25 mmol) en diclorometano (12,5 ml). Después de 10 minutos, se añade una solución de (1S,2S,5R,6S)-2acetamido-4-metileno-biciclo[3.1.0]hexano-2,6-dicarboxilato de dietilo (2,46 g, 8,3 mmol) en diclorometano (12,5 ml). Después de 60 minutos se retira el baño de hielo y se deja la mezcla de reacción agitar durante la noche a temperatura ambiente. Se inactiva la reacción transparente mediante la adición gota a gota de la mezcla de reacción a ácido clorhídrico acuoso 0,2 M (200 ml) con agitación intensa. Después de 1 hora se separa la fase de diclorometano, se lava con salmuera, se seca sobre sulfato de magnesio, se filtra y se concentra al vacío proporcionando el producto deseado contaminado con material de partida sin reaccionar (4,4 g). Se purifica por cromatografía ultrarrápida eluyendo con acetato de etilo: ciclohexano (50:50 hasta 100:0) dando un aceite incoloro (3,1 g). Se purifica por SFC (TR = 2,48 minutos (UV, 200 nm); Columna HPLC: AD-H 30 mm x 250 mm 5 µm; gradiente de CO2: alcohol iso-propílico al 5 % con dimetilamina al 0,2 % durante 0,5 minutos, luego 5 %-27 % en 2,2 minutos. Temperatura de la columna: 35 ºC; presión: 100000 kPa; caudal: 210 ml/minuto) proporcionando (1S,2S,5R,6S)-2-acetamido-4-metileno-biciclo[3.1.0]hexano-2,6-dicarboxilato de dietilo sin reaccionar. (580 mg, 2,0 mmol) y compuesto del título (1,82 g, 5,9 mmol). EM (m/z): 310 (M+1), 332 (M+23).

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a través de una almohadilla de tierra de diatomeas para retirar el catalizador, se lava con etanol y se evapora hasta un aceite incoloro como el compuesto del título (2,23 g, 93 %). EM (m/z): 268 (M+1).

Preparación 14

(1S,2S,5R,6S)-2-[[(2S)-2-(terc-Butoxicarbonilamino)propanoil]amino]espiro[biciclo[3.1.0]hexano-4,1'ciclopropano]-2,6-dicarboxilato de dietilo

H O O

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H

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HN

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N HO

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Se combina (1S,2S,5R,6S)-2-aminoespiro[biciclo[3.1.0]hexano-4,1’-ciclopropano]-2,6-dicarboxilato de dietilo (1,92 g, 7,17 mmol), ácido (2S)-2-(terc-butoxicarbonilamino)propanoico (1,92 g, 10 mmol), 4-dimetilaminopiridina (9 mg, 717 µmol) y 1-hidroxibenzotriazol (1,36 g, 10 mmol) en diclorometano (48 ml). Se añade trietilamina (1,5 ml, 10,8 mmol) y 10 clorhidrato de 1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida (1,92 g, 10 mmol) y se agita durante 2 horas a temperatura ambiente en una atmósfera de nitrógeno. Se diluye la reacción con acetato de etilo (200 ml), agua (50 ml) y salmuera (50 ml). Se agita intensamente y luego se separa la fase de acetato de etilo, se lava con ácido clorhídrico 0,2M (50 ml), agua (50 ml), hidrógenocarbonato sódico saturado (50 ml) y salmuera (50 ml). Se seca, se filtra y se concentra la solución dando un aceite amarillo (3,48 g). Se purifica por cromatografía ultrarrápida eluyendo con

15 acetato de etilo: iso-hexano (15:85 hasta 25:75) luego (25:75 hasta 40:60) dando el material como un aceite. Se vuelve a disolver en diclorometano, se concentra y se seca al vacío dando el compuesto del título como un material espumado blanco (3,05 g, 6,95 mmol). EM (m/z): 461 (M+23).

Los siguientes compuestos se preparan básicamente por el procedimiento de la Preparación 14.

N.º de prep.: Nombre químico Estructura Datos físicos

15: (1S,2S,5R,6S)-2-[[(2S)-2-(terc-Butoxicarbonilamino)-4metilsulfanil-butanoil]amino]espiro[biciclo[3.1.0]hexano-4,1'ciclopropano]-2,6-dicarboxilato de dietilo H O O H O OHN N H O O O S EM (m/z):499 (M+1),521 (M+23)

16: (1S,2S,5R,6S)-2-[[2-(tercButoxicarbonilamino)acetil]amino]espiro[biciclo[3.1.0]hexano4,1’-ciclopropano]-2,6-dicarboxilato de dietilo H O O H O OHN N H O O O EM (m/z):447 (M+23).

20 Preparación 17

Ácido (1S,2S,5R,6S)-2-[[(2S)-2-(terc-butoxicarbonilamino)propanoil]amino]espiro[biciclo[3.1.0]hexano-4,1’ciclopropano]-2,6-dicarboxílico

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Ejemplo 1

Clorhidrato de ácido (1S,2S,5R,6S)-2-aminoespiro[biciclo[3.1.0]hexano-4,1'-ciclopropano]-2,6-dicarboxílico

H2N

HCl

Se carga un ReactiVial de 5 ml con (1S,2S,5R,6S)-2-(terc-butoxicarbonilamino)espiro[biciclo[3.1.0]hexano-4,1'ciclopropano]-2,6-dicarboxilato de di-terc-butilo (55 mg, 129,8 µmol). A este se añade una solución acuosa de ácidoclorhídrico 5N (3 ml; 20,8 mmol) y 1,4-dioxano (1 ml). Se agita la mezcla a 90 ºC durante una hora. Se sella el ReactiVial y se continúa agitando a 90 ºC durante 3 horas. Se enfría hasta temperatura ambiente y se deja en reposo durante 3 días. Se concentra a presión reducida hasta un sólido oscuro. Se prepara un cartucho Oasis® HLBWaters (1 g) lavando con 2 volúmenes de columna de metanol, seguido por 6 volúmenes de columna de agua. Se disuelve el sólido oscuro en agua y se carga en el cartucho. Se lava el cartucho con agua (2 volúmenes de columna)y se recoge el eluyente. Se liofiliza la solución proporcionando el compuesto del título (16,1 mg, 65 µmol). EM (m/z): 212 (M+1). RMN de 1H (D2O)  0,45 (m, 1H), 0,53 (m, 1H), 0,64 (m, 1H), 0,74 (m, 1H), 1,72-1,78 (m, 2H) 1,86 (d, J = 14,2 Hz, 1H), 2,07 (m, 1H), 2,37 (m, 1H).

Ejemplo 2

Ácido (1S,2S,5R,6S)-2-aminoespiro[biciclo[3.1.0]hexano-4,1'-ciclopropano]-2,6-dicarboxílico

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Se añade hidróxido sódico 2M (11,5 ml, 23,1 mmol) con (1S,2S,5R,6S)-2-acetamidoespiro[biciclo[3.1.0]hexano-4,1'ciclopropano]-2,6-dicarboxilato de dietilo (1,19 g, 3,8 mmol). Tras la adición se calienta la mezcla de reacción hasta reflujo en una capa de nitrógeno. Después de 21 horas se añade exceso de hidróxido sódico 2M (5,8 ml, 11,5 mmol) y se vuelve a calentar durante 120 horas. Se purifica por cromatografía de intercambio catiónico (Dowex™ 50X8100) como sigue. Se filtran cualesquiera partículas insolubles y se aclaran con agua de calidad HPLC. Se concentra la solución a la mitad. Se carga la solución sobre la resina, dejando fluir a través de la columna a una velocidad de goteo de aproximadamente 1 gota cada 1-2 segundos. Después de que el volumen de carga inicial ha caído hasta la superficie de la resina, se aclara la resina con agua de calidad HPLC (~ 1 a 2 volúmenes de columna) y se repite 3 veces. Se monitoriza el pH del efluente y se continúa aclarando con agua de calidad HPLC hasta la completa aplicación (se retorna el pH de nuevo hasta pH = 7). Una vez que se observa que se ha completado el ciclo de pH y el efluente ha vuelto a pH = 7, se lava la columna con al menos un volumen de columna cada uno de agua de calidad HPLC, agua de calidad HPLC: tetrahidrofurano (1:1), luego agua de calidad HPLC. Se desplaza el producto desde la resina con piridina al 10 %: agua de calidad HPLC y elución continua con piridina al 10 %: agua de calidad HPLC hasta que no se detectó producto adicional por TLC. Se combinan las fracciones que contienen el material deseado, se concentran hasta sequedad dando un sólido blanco. Se liofilizan proporcionando el compuesto del título(795 mg, 3,8 mmol). EM (m/z): 212 (M+1). RMN de 1H (D2O + d5-piridina al 5 %)  0,38 (m, 1H), 0,45 (m, 1H), 0,55 (m, 1H), 0,69 (m, 1H), 1,50 (dd, J = 2,9 Hz, 1H), 1,62 (d, J = 13,7 Hz, 1H), 1,78 (m, 2H), 2,11 (dd, J = 2,9 Hz, 1H).

Ejemplo 3

Ácido (1S,2S,5R,6S)-2-[[(2S)-2-aminopropanoil]amino]espiro[biciclo[3.1.0]hexano-4,1'-ciclopropano]-2,6dicarboxílico; 1,4-dioxano (1: 0,5); clorhidrato.

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Se añade una solución de cloruro de hidrógeno 4M en 1,4-dioxano (1,57 ml, 6,3 mmol) a una suspensión agitada de ácido (1S,2S,5R,6S)-2-[[(2S)-2-(terc-butoxicarbonilamino)propanoil]amino]espiro[biciclo[3.1.0]hexano-4,1'ciclopropano]-2,6-dicarboxílico (0,16 g, 418,4 µmol) en 1,4-dioxano (1,6 ml) a temperatura ambiente en atmósfera de nitrógeno. Después de 16 horas se filtra un sólido blanco, se lava con 1,4-dioxano, se seca al vacío a 60 ºC durante la noche proporcionando el compuesto del título (0,14 g): EM (m/z): 283 (M+1). RMN de 1H (D2O)  0,46 (m, 1H),

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Ejemplo 10

Ácido (1S,2S,5R,6S)-2-[[(2S)-2-aminopropanoil]amino]espiro[biciclo[3.1.0]hexano-4,1'-ciclopropano]-2,6dicarboxílico dihidratado

OH

 2 H2O

NH2

Etapa 1: clorhidrato de (1S,2S,5R,6R)-2-amino-4-oxo-biciclo[3.1.0]hexano-2,6-dicarboxilato de dietilo

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En una atmósfera de nitrógeno, se añade cloruro de acetilo (86,5 ml, 1,2 mol) a etanol absoluto (1,0 l, 17,2 mol) gota a gota manteniendo la temperatura interna de reacción por debajo de 30 ºC. Se agita la mezcla resultante durante 15 minutos y se añade (1S,2S,5R,6R)-2-(terc-butoxicarbonilamino)-4-oxo-biciclo[3.1.0]hexano-2,6-dicarboxilato de di-tbutilo (100 g, 0,24 mol) en una porción. Se calienta la mezcla resultante hasta reflujo durante 16-20 horas. Se concentra la mezcla de reacción hasta un aceite a presión reducida. Se disuelve el producto en bruto en cloruro de metileno (250 ml) y se concentra al vacío. Se repite el proceso de concentración con cloruro de metileno proporcionando una espuma blanca. Se añade acetato de etilo (150 ml) y se calienta la mezcla hasta 65 ºC. Se añade metil t-butil éter (100 ml) y se agita la mezcla a 65 ºC durante 15 minutos. Se añade metil t-butil éter (300 ml) durante 15 minutos, se agita a 65 ºC durante 15 minutos, luego se interrumpe el calentamiento y se deja enfriar la suspensión hasta temperatura ambiente. Se filtra la mezcla y se lava la torta del filtro con metil t-butil éter (150 ml). Se transfiere la torta a un horno de vacío y se seca durante la noche a 25 ºC proporcionando el producto en bruto (67,5 g). Se transfieren los sólidos a un matraz de fondo redondo, se diluye con acetato de etilo (170 ml) y se calienta la mezcla hasta 65 ºC. Se agita la mezcla durante 1 hora, se añade tetrahidrofurano (68 ml) y etanol (3 ml). Se interrumpe la fuente de calor y se añade metil t-butil éter (272 ml) durante 20 minutos, dejando que la mezcla se enfríe hasta temperatura ambiente. Se filtra la suspensión, se lava la torta con metil t-butil éter/acetato de etilo 95/5 (2 x 75 ml) y se secan adicionalmente los sólidos en un horno de vacío durante la noche a 25 ºC proporcionando el compuesto del título como un sólido blanco (60,0 g, 98,0 %). EM (m/z): 256 (M+1).

Etapa 2: (1S,2S,5R,6R)-2-benciloxicarbonilamino-4-oxo-biciclo[3.1.0]hexano-2,6-dicarboxilato de dietilo

O

H O

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Se suspende clorhidrato de (1S,2S,5R,6R)-2-amino-4-oxo-biciclo[3.1.0]hexano-2,6-dicarboxilato de dietilo (55,0 g, 188,5 mmol) en tetrahidrofurano (220 ml), luego se añade agua (220 ml) y carbonato potásico (92,1 g, 659,9 mmol).Se agita la mezcla resultante durante 30 minutos. Se añade cloroformiato de bencilo (26,7 ml, 175,3 mmol) a la mezcla durante 45 minutos, manteniendo la temperatura de reacción por debajo de 25 ºC. Se agita la mezcla de reacción durante 30 minutos, luego se diluye con acetato de etilo (550 ml) y agua (275 ml). Se separan las fases y se vuelve a extraer la fase acuosa con acetato de etilo (250 ml). Se combinan los productos orgánicos y se lavan secuencialmente con HCl acuoso (0,5N, 100 ml), NaHCO3 saturado (100 ml) y salmuera (100 ml). Se seca la solución orgánica sobre Na2SO4, se filtra y se concentra al vacío proporcionando el compuesto del título como un aceite transparente (67,6 g, 92,1 %). RMN de 1H (CDCl3)  1,24-1,26 (m, 6H), 2,36 (s ancho, 1H), 2,47(dd, 1H), 2,78 (dd, 1H), 2,90 (dd, 1H), 4,09-4,19 (m, 4H), 5,08 (s, 2H), 5,73 (s, 1H), 7,24-7,36 (m, 5H).

Etapa 3: (1S,2S,5R,6S)-2-benciloxicarbonilamino-4-metileno-biciclo[3.1.0]hexano-2,6-dicarboxilato de dietilo

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Pico: Ángulo (º 2-teta) Intensidad (%)

4: 13,09 24,1

5: 15,75 45,9

6: 16,80 56,4

7: 20,49 15,3

8: 21,06 79,3

9: 23,58 96

10: 26,44 20,9

Los receptores mGlu son receptores acoplados a proteínas G que modulan la excitabilidad neuronal. Más particularmente, la neurotransmisión de glutamato alterada se ha relacionado con trastornos neurológicos tales comoafecciones de dolor crónico incluyendo dolor persistente, dolor neuropático, dolor inflamatorio crónico, o dolor visceral; trastornos psiquiátricos, tales como esquizofrenia, trastorno bipolar, trastorno de ansiedad generalizada o trastorno de estrés postraumático; o trastornos neurodegenerativos.

Dado que los compuestos de la presente invención son agonistas de mGlu2/3, pueden ser adecuados para el tratamiento de las afecciones mencionadas anteriormente.

Ensayo de FLIPR de los agonistas de mGlu2 y mGlu3 humanos

Para estos estudios se usan líneas celulares AV-12, derivadas de fibroblastos de hámster sirio y que expresan de forma estable los receptores mGlu2 o mGlu3 humanos y cotransfectadas con el transportador de glutamato EAAT 1(transportador de aminoácidos excitadores 1) de rata y la subunidad Gα15. La expresión de Gα15 permite que los receptores acoplados a Gi señalicen a través de la ruta de la fosfolipasa C, dando como resultado la capacidad paramedir la activación del receptor mediante un ensayo fluorimétrico de respuesta a calcio. Las líneas celulares se mantienen mediante cultivo en medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) con glucosa alta y clorhidrato de piridoxina suplementado con suero bovino fetal dializado al 5 %, piruvato sódico 1 mM, HEPES 10 mM (ácido 4-(2hidroxietil)-1-piperazinaetanosulfónico), L-glutamina 1 mM y 5 µg/ml de blasticidina (todos los medios se adquirieron de Invitrogen). Los cultivos confluentes se pasan bisemanalmente usando una solución de disociación libre de enzimas (Chemicon S-004-B). Las células se recogen 24 horas antes del ensayo y se dispensan usando un sembrador de células Matrix Well-Mate a 85.000 (mGlu2) o 115.000 (mGlu3) células por pocillo en placas de 96 pocillos, de paredes negras, recubiertas con poli-D-lisina (BD BioCoat n.º: 354640) en medio que contiene solo Lglutamina 250 (mGlu2) o 125 (mGlu3) µM (recién añadida). Los niveles de calcio intracelular se monitorizan antes ydespués de la adición de compuestos usando un lector de placas de imágenes fluorimétricas (FLIPR, Molecular Devices). El tampón de ensayo se compone de solución salina tamponada de Hank (HBSS; Sigma) suplementada con HEPES 20 mM. Se retira el medio y las células se incuban con Fluo-3AM 8 µM (Molecular Probes, F-1241; 50 µl por pocillo) en tampón de ensayo durante 90 minutos (mGlu2) o 120 minutos (mGlu3) a 25 ºC. Se retira la solución de tinción y se sustituye con tampón de ensayo recién preparado (50 µl por pocillo). Se lleva a cabo un ensayo de FLIPR de adición única que genera una curva de respuesta a concentración de 11 puntos (diluciones 3X partiendo de 10 µM) para el glutamato agonista (Fisher A125-100) antes de cada experimento para confirmar la respuesta CE50 típica. Los resultados se analizan usando Prism v4.03 (GraphPad Software). Se someten a prueba los compuestos de la invención en un ensayo de FLIPR de adición única usando un perfil de respuesta a concentración de 10 puntos usando diluciones 3X que parten de una concentración final de 25 µM. Los compuestos de la invención se solubilizan como reservas 10 mM en NaOH 0,1 N y se almacenan a -20 ºC. Se diluyen a través de una serie de diluciones triples en tampón de ensayo. Después de tomar una lectura de fluorescencia inicial de 5 segundos en el instrumento FLIPR, se añade un compuesto de la invención a la placa de células (50 µl por pocillo). Con el fin de detectar la actividad agonista se recogen los datos cada segundo durante los primeros 30 segundos y después cada3 segundos durante un total de 90 segundos. La respuesta máxima se define como la inducida por la CEmax (100 µM de glutamato). Se mide el efecto del compuesto como la altura de pico máxima menos la mínima en unidades de fluorescencia relativas (UFR) corregidas para la fluorescencia basal medida en ausencia de glutamato. Las determinaciones se llevan a cabo usando placas únicas. Los efectos agonistas se cuantifican como el porcentaje de estimulación inducida por el compuesto solo en relación con la respuesta a glutamato máxima. Se calculan todos losdatos como valores relativos de CE50 usando un programa de ajuste de curvas logísticas de cuatro parámetros (ActivityBase v5.3.1.22).

El ejemplo 2 se mide en el ensayo de FLIPR de hmGlu2 sustancialmente como antes para tener una CE50 de 39,0 nM ± 5,9 (n = 3, error calculado como EEM). El ejemplo 2 también se mide en el ensayo de FLIPR de hmGlu3 sustancialmente como antes para tener una CE50 de 285 nM ± 52,5 (n = 8, error calculado como EEM). Estos resultados demuestran que el ejemplo 2 es un agonista de mGlu2 y mGlu3 potente.

Reversión del dolor persistente inducido por inyección de formalina

La administración de formalina en la superficie plantar de la zarpa trasera de la rata da como resultado dos fases de comportamiento nocifensor (tales como lamer, morder y sacudir la zarpa inyectada): una fase temprana durante aproximadamente los 5 minutos posteriores a la administración de formalina y una fase tardía desde aproximadamente el minuto 10 hasta el minuto 60 posteriores a la inyección de formalina. Un periodo de inactividad

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horas después de la dosificación. La significación estadística se define como un valor de p < 0,05 en un análisis de covarianza seguido de una prueba de Dunnett a posteriori para cada punto temporal. La tabla 2 siguiente proporciona los resultados estadísticamente significativos para el ejemplo 10 realizado sustancialmente como antes. Estos resultados demuestran que los compuestos dentro del ámbito de la presente invención son medicaciones útiles para afecciones de dolor inflamatorio crónico tales como la osteoartritis o la artritis reumatoide.

Tabla 2

Umbral de retirada de la zarpa (gramos, fuerza)

Valor de referencia (Antes de ACF): 24 horas (después deACF) Una hora (después de ladosificación) Dos horas (después de ladosificación)

Vehículo (HEC al 1 %): 236 ± 7 112 ± 9 98 ± 7 109 ± 14

1,5 mg/kg p.o. del ejemplo 10: 243 ± 5 113 ± 8 180 ± 14* 186 ± 19*

4,5 mg/kg p.o. del ejemplo 10: 221 ± 10 114 ± 9 153 ± 20* 221 ± 20*

15 mg/kg p.o. del ejemplo 10: 244 ± 4 108 ± 12 250 ± 0* 232 ± 15*

Los valores son la media ± EEM para N = 8-10 por grupo. * Valor de p < 0,05 frente a vehículo en el mismo punto temporal (ANOVA y prueba t de Dunnett)

Reversión de comportamientos de dolor inducidos por distensión colorrectal.

Se puede inducir el dolor visceral en ratas por distensión de la cavidad colorrectal y se puede monitorizar el dolor

10 accediendo a la contracción refleja de los músculos abdominales. Se realiza la medida de las contracciones reflejas de los músculos abdominales con dolor provocado por distensión colorrectal en la rata sustancialmente como se describe por Fioramonti y col. Neurogastroenterology and Motility (2003) 15, 363-369 y Urban et al. J. of Pharmacology and Exp. Ther. (1999) 290, 207-213. A ratas Sprague Dawley macho se les implantanquirúrgicamente electrodos electromiográficos (EMG) en el músculo abdominal oblicuo y se deja que se recuperen

15 durante una semana, durante la que los animales se aclimatan a la manipulación y a restricción parcial para minimizar los efectos del estrés. Se recogen las medidas de los EMG de referencia y se registran después de la inserción en el recto (8 cm) de un balón de látex lubricado unido a un monitor/regulador de presión para variar la presión entre 20, 40 y 60 mm Hg durante una duración de 20 segundos con un periodo de reposo de 3 minutos entreensayos. Se registra un conjunto de tres exposiciones en cada presión antes de variar la presión hasta el siguiente

20 nivel. Los datos se recogen como el área bajo la curva para la lectura de EMG (µvoltios por segundo) durante las estimulaciones de presión y se realiza el promedio sobre los tres ensayos. Se dosifica por vía oral un compuesto deprueba (profármaco) dentro de un intervalo de 1,5 a 17 mg/kg, 90 minutos antes del comienzo de la distensión colorrectal. La significación estadística se define como un valor de p < 0,05 en un análisis de covarianza seguido de una prueba de Dunnett a posteriori. La tabla 3 siguiente proporciona los resultados estadísticamente significativos

25 para el ejemplo 10 realizado sustancialmente como antes. Estos resultados demuestran que los compuestos dentro del alcance de la presente invención son medicaciones útiles para afecciones de dolor visceral.

Tabla 3

AUC de la lectura de los EMG para músculo abdominal (µV/s) con 60 mm Hg de presión colorrectal

AUC de la lectura de los EMG para músculo abdominal (µV/s) con 60 mm Hg de presión colorrectal: Valor de referencia (antes de la dosificación) 90 minutos (después de la dosificación)

Vehículo (HEC al 1 %): 813 ± 101 849 ± 65

1,5 mg/kg p.o. del ejemplo 10: 853 ± 142 618 ± 92

4,5 mg/kg p.o. del ejemplo 10: 887 ± 152 531 ± 99*

17 mg/kg p.o. del ejemplo 10: 773 ± 134 266 ± 87*

Los valores son la media ± EEM para N = 8-16 por grupo. * Valor de p > 0,05 frente a vehículo en el mismo punto temporal (ANOVA y prueba de la t de Dunnett)

Reversión de la actividad hiperlocomotora inducida por fenciclidina (PCP) en ratas

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La administración de antagonistas del receptor de NMDA, tales como cetamina o fenciclidina (PCP), produce efectosde tipo psicotomimético en seres humanos que son similares a los síntomas observados en pacientes con esquizofrenia. La capacidad de los agentes para revertir los efectos de estimulación locomotora de los antagonistas de NMDA se usan a menudo como un modelo animal de psicosis, demostrando una buena validez predictiva para detectar la eficacia clínica de medicaciones para la esquizofrenia y el trastorno bipolar.

Se monitoriza la actividad motora colocando ratas Sprague-Dawley macho (Harlan, Indianápolis, IN) individuales en cajas tipo caja de zapatos de plástico, transparentes, de dimensiones 45 x 25 x 20 cm, con 1 cm de profundidad de virutas de madera como lecho y una rejilla metálica en la parte superior de la caja. Los monitores de actividad motora (Kinder Scientific) consisten en una gradilla rectangular de 12 haces de luz dispuestos en una formación de 8x 4, (o una agrupación de alta densidad de 22 en un patrón de 15x7) a una altura de 5 cm, con una segunda gradilla (para medir comportamientos de cría) a una altura de 15 cm. Se sitúa la caja de tipo caja de zapatos dentro de estasgradillas, con las gradillas sobre un tablero de 3 pies (91,4 cm) de alto en una sala aislada. Se dosifica (vía intraperitoneal) un compuesto de la invención (activo) dentro de un intervalo de 0,3-10 mg/kg, 30 minutos antes de una dosis de exposición de 5 mg/kg de fenciclidina (PCP). Se dosifica por vía oral un compuesto de la invención (profármaco) dentro de un intervalo de 0,3-30 mg/kg en ratas sometidas a ayuno durante la noche, 4 horas antes de una dosis de exposición de 5 mg/kg de PCP. El día de la prueba, se sitúan las ratas en la caja de prueba y se deja que se aclimaten durante 30 minutos antes de la exposición a PCP; se monitorizan las ratas durante 60 minutos adicionales después de administración de PCP.

Se realizan los análisis de datos y los cálculos de DE50 usando GraphPad Prism (San Diego, CA. EE.UU.). Los análisis de poder han determinado que se necesitan 8-10 ratas por grupo para tener un poder estadístico apropiado para detectar diferencias de tratamientos (poder = 0,8). Se lleva a cabo un análisis de varianza de una vía (ANOVA) con una prueba de comparación múltiple de Dunnett a posteriori sobre el total de 60 minutos de actividad locomotora. Se realizan los cálculos de DE50 usando un ajuste de curva de regresión no lineal sobre los datos transformados de reversión en porcentaje para cada dosis.

En este ensayo se mide el ejemplo 2 realizándolo sustancialmente como antes para tener una DE50 de 1,46 mg/kg (i.p.). En este ensayo se miden los ejemplos 5 y 6 realizándolos sustancialmente como antes para tener 2,95 mg/kg(p.o.) y 4,31 mg/kg (p.o.), respectivamente. Estos resultados demuestran que los compuestos dentro del alcance de la presente invención son medicaciones útiles para la esquizofrenia y el trastorno bipolar.

Atenuación de la hipertermia inducida por estrés en ratas

La hipertermia, un aumento de la temperatura corporal central, es un fenómeno general que se ha demostrado de forma fiable en muchos mamíferos, incluyendo seres humanos, en respuesta al estrés. En muchos trastornos de ansiedad, la hipertermia se produce como parte de la patología y se considera un síntoma de la enfermedad. Se cree que los compuestos que atenúan la hipertermia inducida por estrés en animales son útiles en el tratamiento de trastornos de ansiedad en seres humanos. El trastorno de ansiedad generalizada y el trastorno de estrés postraumático están entre los trastornos que se pueden tratar con estos compuestos. El procedimiento convencionaly mínimamente invasivo para analizar la hipertermia inducida por estrés se realiza midiendo la temperatura corporaly los incrementos inducidos por estrés en la temperatura corporal, por medio de un termómetro rectal. Se someten a prueba ratas Fisher F-344 macho (Harlan, Indianápolis, IN, EE.UU.) con un peso de entre 275–350 g. Se alojan de forma individual todos los animales con alimento y agua automatizada disponibles a voluntad y se mantienen en un ciclo de 12 h de luz/oscuridad (las luces se encienden a las 6:00). Se someten a ayuno los animales duranteaproximadamente 12-18 horas antes del experimento, lo que se lleva a cabo durante la fase de luz. Se dosifica a las ratas por vía intraperitoneal (IP) a un volumen de dosis de 1 ml/kg con compuestos de la invención en el intervalo de 0,3, 1, 3 y 10 mg/kg. El vehículo es solución salina + NaOH añadido hasta lograr un pH de 5-7. Se usa el antagonista de mGluR5 MTEP (3-[(2-metil-1,3-tiazol-4-il)etinil]piridina), que ha demostrado una actividad de tipo ansiolítico fuerteen modelos preclínicos, como comparador (5 mg/kg, por vía i.p., disuelto en agua). Inmediatamente después de la dosificación, se devuelven las ratas a su caja de origen y el experimentador apaga las luces y sale de la sala. La sala de dosificación se oscurece durante el resto del periodo de pretratamiento de 1 h.

Después del periodo de pretratamiento, se llevan las ratas de forma individual a una sala adyacente bien iluminada en la que se determinan las temperaturas corporales de referencia por inserción de una sonda rectal lubricada con aceite mineral. Se evalúa la temperatura corporal usando un termómetro de microsonda PHYSITEMP BAT-12 con una sonda rectal para ratas PHYSITEMP RET-2 (Physitemp Instruments Inc., Clifton, NJ, EE.UU.). Se inserta la sonda aproximadamente 2 cm en el recto, para medir la temperatura corporal central (esta es la temperatura corporal de referencia, T1, en grados Celsius). Diez minutos después, se registra una segunda medida de la temperatura corporal (T2). La diferencia en la temperatura corporal (T2 -T1) se define como la respuesta hipertérmica inducida por estrés. La dosis a la que un compuesto de la invención produce una reducción de un 35 % en la respuesta hipertérmica inducida por estrés, con relación a la respuesta del vehículo, se define como la dosis T35.

En este ensayo se mide el ejemplo 2 realizándolo sustancialmente como antes para tener una T35 de 0,57 mg/kg. Eneste ensayo se mide el ejemplo 5 realizándolo sustancialmente como antes para tener una T35 de 6,4 mg/kg. Estosresultados demuestran que los compuestos dentro del alcance de la presente invención son medicaciones útiles para trastornos de ansiedad. Más en particular, los compuestos dentro del alcance de la presente invención puedenser medicaciones útiles para el trastorno de ansiedad generalizada y/o el trastorno de estrés postraumático.

Análisis de la inhibición de PepT1 GlySar in vitro y determinación de CI50

Se establecen ensayos de PepT1 para examinar la capacidad de los profármacos para interaccionar con el transportador en la absorción intestinal PepT1.

Se hacen crecer células HeLa, derivadas de intestino humano, (American Type Culture Collection) en medio Hyclone

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(Invitrogen, n.º de cat. SH30243) que contiene suero fetal bovino al 10 % (FBS), aminoácidos no esenciales (NEAA) 0,1 mM y 100 unidades/ml de penicilina con 100 µg/ml de estreptomicina a 37 ºC en una atmósfera humidificada de CO2 al 5 %. Se usa la línea celular durante hasta 40 pasajes y después se descarta. Se descongelan células congeladas en viales de 1 ml en un baño de agua durante 1-2 minutos y se añaden a 5 ml de medio celular a 37 ºC. Cada uno de los matraces T está provisto con 8,5 ml de medio recién preparado y 1,5 ml de reserva de células. Sepasan las células dos veces durante una semana. Esto se logra aclarando los matraces con 10 ml de solución salina tamponada con fosfato-ácido etilen-diaminotetraacético (PBS-EDTA), añadiendo 2 ml de tripsina durante 2-5 minutos, para separar las células y añadiendo 8 ml de medio recién preparado para inhibir la actividad adicional de tripsina. Cada nuevo matraz recibe una combinación de 8,5 ml de medio recién preparado y 1,5 ml de reserva de células, para obtener una dilución de células de 1:6. Se incuban las células a 37ºC, hasta que estén preparadas parael estudio de incorporación.

Se plaquean las células que son confluentes en un 70-80 % en los matraces T 1 día antes del procedimiento de transfección. Se trata el matraz con la reserva de células con PBS-EDTA y tripsina para separar las células y se usa medio de transfección a partir de este punto. El medio de transfección consiste en medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) + NEAA. A cada pocillo, se añaden 0,5 ml de la mezcla de células (1,3 x 105 es la concentración de células deseada) y se incuban las células a 37ºC durante la noche. Veinticuatro horas antes del ensayo, se transfectan las células con PEPT1. Se prepara la mezcla de transfección mezclando 600 µl de medio de transfección libre de suero, 18 µl de FuGene6 (Roche Diagnostics) y 11 µg del ADN de PepT1. Se incuba el complejo de reactivo de transfección-ADN durante 20 minutos y se añaden 24 µl del complejo reactivo-ADN a cada pocillo.

Se mide la inhibición de la actividad de incorporación de [glicil-1-2-14C]Glicilsarcosina (GlySar) mediada por PEPT1 en las células cultivadas en las placas de 24 pocillos 24 horas después de la transfección, como se publicópreviamente (Zhang y col. 2004. J. Pharm. Exper Ther. 310:437-445). Para medir la capacidad de un compuesto dela invención para inhibir la incorporación de [14C]Gly-Sar, se incuban profármacos con células HeLa transfectadas de forma transitoria con PepT1 con una confluencia de un 80 a un 90 % a 5 mM en medio de incorporación a pH 6,0 en presencia de [14C]Gly-Sar (Moravek Biochemicals) 5 µM y Gly-Sar fría 20 µM. El medio de incorporación consiste en NaCl 140 mM, KCl 5,4 mM, CaCl2 1,8 mM, MgSO4 0,8 mM, glucosa 5 mM, tampón tris(hidroximetil)aminometano (TRIS) 25 mM. Después, se lleva la solución hasta pH 6,0 usando ácido 2-(N-morfolino)etanosulfónico. El volumen de incubación es de 500 µl y se realiza a temperatura ambiente durante 3 minutos. Para detener la incorporación al concluir el tiempo de incubación, se extrae por aspiración el medio de incorporación de la monocapa de células y se añaden 500 µl de PBS enfriado en hielo al pocillo. Se lavan las células 3 veces con 500 µl de PBS a temperatura ambiente sin Ca+2 ni Mg+2. Después se lisan las células con 300 µl de solución al 1 % de Triton X100 H2O. Se retira una alícuota de 200 µl y se determina la radioactividad por recuento de centelleo líquido para medir la [14C]Gly-Sar presente en cada uno de los pocillos de incubación. Se establece un control sin inhibidor y se calcula el porcentaje de inhibición de cada profármaco con respecto a este control. Se realizan un control negativo (glicina) y dos controles positivos (cefadroxilo y cefalexina) en paralelo con cada experimento para demostrar la viabilidad del sistema de ensayo. Los profármacos con inhibición de la incorporación de GlySar igual o mejor que cefalexina se consideran aceptables. Los valores medios ± la desviación estándar son 10,1 ± 9,5 % (n = 19) para glicina, 53,2 ± 13,2 % (n = 19) para cefadroxilo y 37,5 ± 14,7 % (n = 18) para cefalexina.

Para el ensayo de CI50 de PepT, se incuban los profármacos en un intervalo de concentraciones (de 0,0625 a 25 mM) en presencia de [14C]Gly-Sar 5 µM y Gly-Sar fría 20 µM. Los procedimientos de incubación y muestreo son exactamente los mismos que el análisis de PepT1 descrito anteriormente. Se evalúan los datos de incorporación de[14C]Gly-Sar para cada una de las concentraciones de profármaco y se calculan los valores de CI50.

En este ensayo se miden los ejemplos 5, 6 y 7 realizándolos sustancialmente como antes para tener una inhibición de la incorporación de [3H]Gly-Sar de hPepT1 a 5 mM de un 89 %, 87 % y 78 %, respectivamente. En este ensayo se miden los ejemplos 5 y 6 realizándolos sustancialmente como antes para tener una CI50 de inhibición de la incorporación de [3H]Gly-Sar de hPepT1 de 1,98 mM y 0,25 mM, respectivamente. Estos resultados demuestran que los compuestos dentro del alcance de la presente invención se absorben por vía oral a través del transportador PepT1.

Ensayo de hidrólisis de profármaco intestinal in vitro

Se obtienen homogeneizados intestinales de duodeno humano congelados (proporción tejido:tampón de 1:2, usandotampón Tris fosfato 100 mM, pH 7,4) de Celsius In Vitro Technologies (Baltimore, MD) que estaban libres tanto de fenilmetilsulfonilfluoruro (PMSF) como de EDTA.

Se obtiene cada lote de duodeno humano a partir de un único donante y se raspa el intestino y se congelan las secciones por separado. Se realizan todas las recogidas de tejido original a 4ºC y se congelan inmediatamente a -70ºC. Se descongelan los homogeneizados intestinales humanos y se diluyen hasta una concentración de proteína final de 0,5 mg/ml en tampón de PBS 100 mM, pH 7,4 inmediatamente antes de las incubaciones.

Se llevan a cabo incubaciones en placas de 96 pocillos y se realiza el ensayo con todos los profármacos por duplicado cada día. Se preparan soluciones de reserva de profármaco en agua a una concentración de 1 mM. Se sitúan una alícuota de 200 l de 0,5 mg/ml de homogeneizado intestinal y 196 l de tampón PBS 100 mM en una placa de 96 pocillos en un baño de agua a 37 ºC. Usando un pipeteador de 96 pocillos, se transfieren 4 l de la solución de profármaco 1 mM al homogeneizado. Inmediatamente después de la adición del profármaco (tiempo cero) y después de 1 hora de incubación, se retiran muestras de 50 l de la mezcla de incubación usando un pipeteador de 96 pocillos simultáneo desechable automático y se añaden directamente a 200 l de solución de desactivación de metanol que contenía 100 ng/ml de estándar interno. Después se centrifugan las muestras a 3500rpm durante 5 minutos a 10 ºC. Se transfiere el sobrenadante (200 l) a una placa de PCR de 96 pocillos final y se sella para análisis por CL/EM/EM.

Se determinan las concentraciones del metabolito activo hidrolizado en las mezclas de incubación usando detección

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Se administra a ratas Sprague Dawley macho, sometidas a ayuno, el ejemplo 2 por vía intravenosa a 1 mg/kg o el ejemplo 5 por sonda nasogástrica oral a una dosis de 7,5 mg/kg (igual a 5 mg/kg de equivalentes molares del ejemplo 2) en un diseño cruzado estándar (N = 3 recibiendo cada rata tanto dosis intravenosa como oral). Para administración intravenosa, se disuelve el ejemplo 2 en agua y para la dosis oral se prepara el ejemplo 5 en un vehículo acuoso de hidroxietilcelulosa (1 %), polisorbato 80 (0,25 %) y antiespumante 1510-US (0,05 %). Se implantan quirúrgicamente cánulas para facilitar la recogida de sangre en serie. Se recoge la sangre en tubos de EDTA durante un periodo de 0-24 horas después de la dosificación, se centrifuga y se almacena el plasma congelado hasta el momento del análisis.

Se descongelan las muestras de plasma, se transfieren alícuotas de 50 µl a una placa de 96 pocillos, se añaden 50 µl de solución de estándar interno y se mezclan las muestras. Después se añaden trescientos µl de acetonitrilo, se agitan con vórtex las muestras durante 3 minutos y se centrifugan. Se transfiere una alícuota de 300 µl del sobrenadante a una placa separada y se evapora en atmósfera de nitrógeno a 40 grados C. Se reconstituye el residuo en 100 µl de ácido heptafluorobutírico al 0,5 % en agua, se agita con vórtex y se centrifuga. Se analiza posteriormente una alícuota de 20 µl por CL/EM/EM usando un muestreador automático Shimadzu y un sistema de HPLC integrado con un espectrómetro de masas AB Sciex 4000 en modo Turbospray de iones positivos. Las transiciones EM/EM son 283,2→44,2 uma para el ejemplo de profármaco 5 y 212,1→103,1 uma para el ejemplo 2de producto activo. Se utiliza una columna de HPLC de 5 micrómetros Atlantis T3, 50 x 2,1 mm a un caudal de fase móvil de 1,0 ml/minuto y fase móvil binaria de (A) ácido fórmico al 0,2 % en agua y (B) acetonitrilo-agua (1:1, v/v) y un gradiente de un 2 % de B a un 98 % de B durante 0,8 minutos. El tiempo de retención del ejemplo 2 es aproximadamente de 0,53 minutos.

Se calculan los parámetros farmacocinéticos a partir de los datos de concentración de plasma usando Watson para Windows (Thermo Scientific). Se determina la biodisponibilidad oral relativa comparando el área bajo la curva (AUC) de concentración de plasma con el tiempo del ejemplo 2 de producto activo después de administración por vía intravenosa con el AUC del metabolito activo después de la administración oral del ejemplo 5 de profármaco.

Un profármaco exitoso debe tanto absorberse bien después de la administración oral como hidrolizarse posteriormente para liberar el metabolito activo en la circulación sistémica. La biodisponibilidad relativa incluyeambos parámetros comparando el AUC del metabolito activo después de la administración oral de profármaco con el AUC del producto activo después de la administración intravenosa del compuesto activo. En ratas macho, la biodisponibilidad relativa de metabolito activo después de la administración oral de profármaco del ejemplo 5 como se mide en este ensayo realizándose sustancialmente como antes es del 60 ± 14 % (media ± desviación estándar) demostrando que el ejemplo 5 de profármaco tanto se absorbe bien como se hidroliza ampliamente para proporcionar el metabolito activo in vivo.

Claims

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