MX2014008598A - Agonistas de mglu 2/3. - Google Patents

Agonistas de mglu 2/3.

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Lourdes Prieto
Stephen Richard Baker
Christopher David Beadle
Barry Peter Clark
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Abstract

La presente invención se refiere a nuevos agonistas de mGlu2/3 de fórmula (I) útiles en el tratamiento de trastornos neurológicos o psiquiátricos.(ver Fórmula).

Description

AGON ISTAS DE MG LU 2/3 La presente invención se refiere a agonistas de mGlu2/3, más específicamente, a un nuevo biciclo[3.1 .0]hexano 4-sustituido y profármacos del mismo, composiciones farmacéuticas del mismo, y usos terapéuticos del mismo.
El L-Glutamato es el principal neurotransmisor excitatorio en el sistema nervioso central y es referido como un aminoácido excitatorio. Los receptores de glutamato metabotrópico (mGlu) son receptores acoplados a la proteína G que modulan la excitabilidad neuronal. El tratamiento de trastornos neurológicos o psiquiátricos ha sido unido a activación selectiva de receptores de aminoácido excitatorios mGlu. Más particularmente, estudios han demostrado que los agonistas de mGlu2/3 tienen propiedades analgésicas, antipsicóticas, ansiolíticas, antidepresivas y neuroprotectoras. Por lo tanto, estas propiedades de agonistas de mGlu2/3 pueden ser útiles en el tratamiento de trastornos neurológicos, tal como condiciones de dolor crónico o trastornos psiquiátricos, tales como esquizofrenia, trastorno bipolar, también conocido como trastorno maniacodepresivo, trastorno de ansiedad generalizada y trastorno de estrés post-traumático.
El documento W09717952 describe ciertos compuestos biciclo[3. 1 .OJhexano 4-sustituido que se afirman que son antagonistas del receptor de aminoácido excitatorio.
El tono glutamatérgico excesivo se ha implicado en muchos estados de enfermedad del sistema nervioso central; sin embargo, los agentes efectivos para corregir estos estados están carentes en la práctica clínica. En particular, la aplicación clínica no ha sido realizada debido a una carencia de antagonistas de mGlu2/3 con propiedades similares al fármaco apropiadas. Así, aún existe una necesidad para antagonistas de mGlu2/3 eficaces, potentes. La presente invención proporciona un nuevo biciclo[3.1 .0]hexano 4-sustituido, y profármacos del mismo, que son agonistas de mGlu2/3 potentes y efectivos. Profármacos particulares dentro del alcance de la presente invención son bien absorbidos después de la administración oral y subsecuentemente hidrolizados para liberar el metabolito activo en la circulación sistémica y, por lo tanto, son adecuados para desarrollo clínico. Estos nuevos compuestos de la presente invención pueden dirigir la necesidad para tratamientos potentes, efectivos de trastornos neurológicos, tal como condiciones de dolor crónico que incluye dolor persistente, dolor neuropático, dolor inflamatorio crónico o dolor visceral, o trastornos psiquiátricos, tales como esquizofrenia, trastorno bipolar, trastorno de ansiedad generalizada o trastorno de estrés post-traumático.
La presente invención proporciona un compuesto de fórmula I Formula I en donde R1 es hidrógeno, R2 es hidrógeno, y R3 es hidrógeno; R1 es hidrógeno, R2 es (2S)-2-aminopropanoilo, y R3 es hidrógeno; R es hidrógeno, R2 es (2S)-2-amino-4-metilsulfanil-butanoilo, y R3 es hidrógeno; R1 es hidrógeno, R2 es 2-aminoacetilo, y R3 es hidrógeno; R1 es bencilo, R2 es hidrógeno, y R3 es bencilo; o R es (2-fluorofenil)metilo, R2 es hidrógeno, y R3 es (2-fluorofenil)metilo; o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable.
La presente invención proporciona ácido {1S, 2S, 5R, 6S)-2-aminoespiro[biciclo[3.1.0]hexano-4,1 '-ciclopropano]-2,6-dicarboxílico, o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable.
Como una modalidad particular, la presente invención proporciona ácido (7S,2S,5R,6S)-2-aminoespiro[biciclo[3.1.0]hexano-4,1 '-ciclopropano]-2,6-dicarboxílico.
Como una modalidad particular, la presente invención proporciona la sal de ácido clorhídrico de ácido (1S, 2S, 5R, 6S)-2-aminoespiro[biciclo[3.1.0] hexano-4, 1 '-ciclopropano]-2,6-dicarboxílico.
La presente invención proporciona ácido {1S, 2S, 5R, 6S)-2- [[(2S)-2-aminopropanoil]amino]espiro[biciclo[3.1.0]hexano-4, 1 '-ciclopropano]-2,6-dicarboxíl¡co, o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable.
Como una modalidad particular, la presente invención proporciona clorhidrato del ácido (1 S,2S,5R,6S)-2-[[{2S)-2- aminopropanoil]amino]espiro[biciclo[3.1.0]hexano-4, 1 '-ciclopropano]-2,6-dicarboxilico.
Como una modalidad particular, la presente invención proporciona ácido (1S,2S,5R,6S)-2-[[{2S)-2-aminopropanoil]amino]espiro[biciclo[3.1.0]hexano-4, 1'-ciclopropano]-2,6-dicarboxílico; 1,4-dioxano (1:0.5); clorhidrato.
La presente invención proporciona ácido (1S.2S, 5R,6S)-2-[[(2S)-2-amino-4-metilsulfanil-butano¡l]amino]espiro[biciclo[3.1.OJhexano-4,1'-ciclopropano]-2,6-dicarboxílico, o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable.
Como una modalidad particular, la presente invención proporciona clorhidrato del ácido (íS,2S,5ft,6S)-2-[[(2S)-2-amino-4-metilsulfanil-butanoil]amino]espiro[biciclo[3.1.0]hexano-4, 1 '-ciclopropano]-2,6-dicarboxílico.
La presente invención proporciona ácido {1S.2S, 5R, 6S)-2- [(2-aminoacetil)amino]espiro[biciclo[3.1.0]hexano-4, 1 '-ciclopropano]-2,6-dicarboxílico, o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable.
Como una modalidad particular, la presente invención proporciona clorhidrato del ácido (f S,2S,5f?,6S)-2-[(2-aminoacetil)amino]espiro[biciclo[3.1.0]hexano-4, 1 '-ciclopropanoj^.e-dicarboxílico.
La presente invención proporciona (7S,2S,5f?,6S)-2-aminoespiro[biciclo[3.1.0]hexano-4, 1 '-ciclopropano]-2,6-dicarboxilato de dibencilo, o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable.
Como una modalidad particular, la presente invención proporciona clorhidrato (1 S,2S,5R,6S)-2-aminoespiro[biciclo[3.1.0]hexano-4,1'-ciclopropano]-2,6-dicarboxilato; 1,4-dioxano de dibencilo.
La presente invención proporciona bis[(2-fluorofenil)metil](VS,2S,5R,6S)-2-aminoespiro[biciclo[3.1.0]hexano-4,1'-ciclopropano]-2,6-dicarboxilato, o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable.
Como una modalidad particular, la presente invención proporciona clorhidrato de bis[(2-fluorofenil)metil] (1 S,2S,5R,6S)-2-aminoespiro[biciclo[3.1.0]hexano-4,1 '-ciclopropano]-2,6-dicarboxilato.
La presente invención proporciona una composición farmacéutica que comprende ácido (1 S,2S,5R,6S)-2-aminoespiro[biciclo[3.1.0]hexano-4,1'-ciclopropano]-2,6-dicarboxílico, o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable, ácido {1 S,2S,5R,6S)-2-[[(2S)-2-aminopropanoil]amino]espiro[biciclo[3.1.0]hexano-4, 1 '-ciclopropano]-2,6-dicarboxílico, o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable, ácido ( 1 S.2S.5R, 6S)-2-[[(2S)-2-amino-4-metilsulfanil-butanoil]amino]espiro[biciclo[3.1 0]hexano-4, 1 '-ciclopropano]-2,6-dicarboxílico, o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable, ácido ( 1 S, 2S, 5R, 6S)-2-[(2-am inoacetil)amino]espiro[biciclo[3.1.0]hexano-4, 1 '-ciclopropano]-2,6-dicarboxílico, o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable, ( 1 S, 2S, 5R, 6S)-2-am inoespiro[biciclo[3.1.0]hexano-4, 1 '-ciclopropano]-2,6-dicarboxilato de dibencilo, o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable, o bis[(2-fluorofenil)metil] {1 S,2S,5R,6S)-2-aminoespiro[biciclo[3.1.0]hexano-4,1'-ciclopropano]-2,6-dicarboxilato, o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable, junto con un portador farmacéuticamente aceptable y opcionalmente otros ingredientes terapéuticos.
La presente invención proporciona una composición farmacéutica que comprende ácido (1S, 2S, 5R, 6S)-2-aminoespiro[biciclo[3.1.0]hexano-4, 1 '-ciclo pro pano]-2,6-dicarboxíl ico, o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable, ácido (1S,2S,5R, 6S)-2-[[(2 S)-2-am i nopropanoil]am i no]es pi ro[biciclo[3.1.0] hexano-4,1 '-ciclopropano]-2,6-dicarboxílico, o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable, ácido (íS,2S,5R,6S)-2-[[(2S)-2-am¡no-4-met¡lsulfan¡l-butanoil]amino]espiro[biciclo[3.1.0]hexano-4, 1 '-ciclopropano]-2,6-dicarboxílico, o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable, ácido (íS,2S,5f?,6S)-2-[(2-aminoacetil)amino]espiro[biciclo[3.1.0]hexano-4,1 '-ciclopropano]-2,6-dicarboxílico, o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable, (ÍS,2S,5f?,6S)-2-aminoespiro[biciclo[3.1.0]hexano-4, 1 '-ciclopropano]-2,6-dicarboxilato de dibencilo, o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable, o bis[(2-fluorofenil)metil] (1 S,2S,5R,6S)-2-aminoespiro[biciclo[3.1 0]hexano-4, 1 '-cid opropano]-2,6-dicarbox¡ lato, o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable, y un portador, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable.
La presente invención proporciona un método para tratar un trastorno neurológico o psiquiátrico, que comprende administrar a un paciente en necesidad del mismo una cantidad efectiva de ácido (1S.2S, 5R, 6S)-2-aminoespiro[biciclo[3.1.0]hexano-4, 1 '-ciclopropano]-2,6-dicarboxílico, o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable, ácido (1S,2S,5R,6S)-2-[[(2S)-2-aminopropanoil]amino]espiro[biciclo[3.1 ,0]hexano-4,1'-ciclopropano]-2,6-dicarboxílico, o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable, ácido (7S.2S, 5R,6S)-2-[[(2S)-2-amino-4-metilsulfanil-butanoil]amino]espiro[biciclo[3.1.0]hexano-4, 1 '-ciclopropano]-2,6-dicarboxílico, o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable, ácido ( 1S,2S, 5R, 6S)-2-[(2-am inoacetil)amino]espiro[biciclo[3.1.0]hexano-4, 1'-ciclopropano]-2,6-dicarboxílico, o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable, (1S, 2S.5R, 6S)-2-aminoespiro[biciclo[3.1.0]hexano-4,1'-ciclopropano]-2,6-dicarboxilato de dibencilo, o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable, o bis[(2-fluorofenil)metil] (1 S,2S,5R,6S)-2-aminoespiro[biciclo[3.1.0]hexano-4, 1 '-ciclopropano]-2,6-dicarboxilato, o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable.
La presente invención proporciona el uso de ácido (1S, 2S, 5R, 6S)-2-aminoespiro[biciclo[3.1.0] exano-4, 1 '-ciclopropano]- 2,6-dicarboxílico, o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable, ácido (1S,2S,5R,6S)-2-[[(2S)-2-aminopropanoil]amino]espiro[biciclo[3.1.0]hexano-4,1'-ciclopropano]-2,6-dicarboxílico, o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable, ácido (íS,2S,5R,6S)-2-[[(2S)-2-amino-4-metilsulfanil-butanoil]amino]espiro[biciclo[3.1.0]hexano-4, 1 '-ciclopropano]-2,6-dicarboxílico, o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable, ácido (íS,2S,5f?,6S)-2-[(2-aminoacetil)amino]espiro[biciclo[3.1.0]hexano-4,1'-ciclopropano]-2,6-dicarboxílico, o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable, ( 1 S, 2S, 5R, 6S)-2-aminoespiro[biciclo[3.1.0]hexano-4, 1'- ciclopropano]-2,6-d¡carboxilato de dibencilo, o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable, o bis[(2-fluorofenil)metil] (1S,2S, 5R.6S)-2-aminoespiro[biciclo[3.1.0]hexano-4, 1 '-ciclopropano]-2,6-dicarboxilato, o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable, para la elaboración de un medicamento para el tratamiento de un trastorno neurológico o psiquiátrico.
La presente invención proporciona ácido {1S.2S, 5R, 6S)-2-aminoespiro[biciclo[3.1.0]hexano-4, 1 '-ciclopropano]-2,6-dicarboxílico, o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable, ácido {1 S,2S,5R,6S)-2-[[(2S)-2-aminopropanoil]amino]espiro[biciclo[3.1.0]hexano-4,1'-ciclopropano]-2,6-dicarboxílico, o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable, ácido (f S,2S,5R,6S)-2-[[(2S)-2-amino-4-metilsulfanil-butanoil]amino]espiro[biciclo[3.1.0]hexano-4, 1 '-ciclopropano]-2,6-dicarboxílico, o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable, ácido (íS,2S,5R,6S)-2-[(2-aminoacetil)amino]espiro[biciclo[3.1.0]hexano-4,1'-ciclopropano]-2,6-dicarboxílico, o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable, (f S,2S,5R,6S)-2-aminoespiro[biciclo[3.1.0]hexano-4, 1 '-ciclopropano]-2,6-dicarboxilato de dibencilo, o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable, o bis[(2-fluorofenil)metil] (1 S,2S,5R,6S)-2-a m i noespi ro[bici clo[3.1.0]hexan o-4,1 '-ciclopropano]-2,6-dicarboxi lato, o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable, para uso en terapia. La presente invención también proporciona ácido (1 S,2S,5R,6S)-2-aminoespiro[biciclo[3.1.0]hexano-4, 1 '-ciclopropano]-2,6-dicarboxílico, o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable, ácido (1 S,2S,5R,6S)-2-[[(2S)-2-aminopropanoil]amino]espiro[biciclo[3.1.0]hexano-4, 1'- c¡clopropano]-2,6-dicarboxílico, o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable, ácido ( 1 S,2S,5R, 6S)-2-[[(2S)-2-amino-4-meti Isu Ifanil-butanoil]amino]espiro[biciclo[3.1.0]hexano-4,1 '-ciclopropano]-2,6-dicarboxílico, o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable, ácido ( 1 S,2S,5R, 6S)-2-[(2-aminoacetil)amino]espiro[biciclo[3.1.0]hexano-4,1'-ciclopropano]-2,6-dicarboxílico, o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable, (f S,2S,5fi,6S)-2-am¡noespiro[b¡ciclo[3.1.0]hexano-4,1'-ciclopropano]-2,6-dicarboxilato de dibencilo, o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable, o bis[(2-fluorofenil)metil] (1 S,2S,5R,6S)-2-aminoespiro[biciclo[3.1 0]hexano-4,1'-ciclopropano]-2,6-dicarboxilato, o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable, para uso en el tratamiento de un trastorno neurológico o psiquiátrico.
Además, la presente invención proporciona modalidades preferidas de los métodos y usos como se describe en la presente, en la cual el trastorno neurológico se selecciona del grupo que consiste de dolor persistente, dolor neuropático, dolor inflamatorio crónico, y dolor visceral, y el trastorno psiquiátrico se selecciona del grupo que consiste de esquizofrenia, trastorno bipolar, trastorno de ansiedad generalizada, y trastorno de estrés post-traumático.
Como se usa anteriormente, y a través de la descripción de la invención, los términos siguientes, a menos que se indique de otra forma, se debe entender que tiene los siguientes significados: "Compuesto(s) de la invención" y "compuesto(s) de la presente invención" incluyen profármacos, compuestos activos, y/o metabolitos activos. Un "profármaco" es una clase de fármacos, inicialmente en forma inactiva que es convertido a forma activa en el cuerpo por procesos metabólicos normales, en donde al menos uno de R1 , R2, y R3 en la Fórmula I es diferente que hidrógeno (por ejemplo, R1 es hidrógeno, R2 es (2S)-2-aminopropanoilo, y R3 es hidrógeno; R1 es hidrógeno, R2 es (2S)-2-amino-4-metilsulfanil-butanoilo, y R3 es hidrógeno; R1 es hidrógeno, R2 es 2-aminoacetilo, y R3 es hidrógeno; R es bencilo, R2 es hidrógeno, y R3 es bencilo; o R1 es (2-fluorofenil)metilo, R2 es hidrógeno, y R3 es (2-fluorofenil)metilo). Un "compuesto activo" o "activo" es otro nombre para una forma activa administrada al cuerpo, por ejemplo, intravenosamente o intraperitonealmente, en donde R1 , R2, y R3 en la Fórmula I son hidrógeno. Un "metabolito activo" es otro nombre para una forma activa que resulta de esta conversión de un profármaco en el cuerpo por procesos metabólicos normales, en donde R\ R2, y R3 en la Fórmula I son hidrógeno.
Un "portador, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable" es un medio generalmente aceptado en la técnica para el suministro de agentes biológicamente activos a mamíferos, por ejemplo, humanos.
"Sales farmacéuticamente aceptables" se refiere a las sales orgánicas e inorgánicas, relativamente no tóxicas de compuestos de la presente invención.
"Cantidad terapéuticamente efectiva" o "cantidad efectiva" se refiere a la cantidad del compuesto, o sal del mismo farmacéuticamente aceptable, de la presente invención o composición farmacéutica que contiene un compuesto, o sal del mismo farmacéuticamente aceptable, de la presente invención que provocará la respuesta biológica o médica de un efecto terapéutico deseado en un tejido, sistema, animal, mamífero o humano que está siendo buscado por el investigador, veterinario, doctor médico u otro especialista.
Los términos "tratamiento," "trata," "tratar," y similares, están significando incluir reducir o revertir el progreso de un trastorno. Estos términos también incluyen aliviar, aminorar, atenuar, eliminar o reducir uno o más síntomas de un trastorno o condición, aún si el trastorno o condición no es actualmente eliminado y aún si el progreso del trastorno o condición no es el mismo retardado o revertido.
Bajo nomenclatura estándar usada a través de esta descripción, la porción terminal de la cadena lateral designada es descrita primero, seguida por la funcionalidad adyacente hacia el punto de unión. Por ejemplo, un sustituyente metilsulfonilo es equivalente a CH3-S02-.
Los compuestos de la presente invención son capaces de reaccionar, por ejemplo, con un número de ácidos inorgánicos y orgánicos para formar sales de adición básica o sales de adición de ácido farmacéuticamente aceptables. Tales sales farmacéuticamente aceptables y metodología común para prepararlas son bien conocidas en la técnica. Véase, por ejemplo, P. Stahl, et al., HANDBOOK OF PHARMACEUTICAL SALTS: PROPERTIES, SELECTION AND USE, (VCHA/Wiley-VCH, 2002); S.M. Berge, et al., "Pharmaceutical Salts, "Journal of Pharmaceutical Sciences, Vol 66, No. 1, Enero 1977.
Los compuestos de la presente invención son preferiblemente formulados como composiciones farmacéuticas usando un portador, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable, y administrados por una variedad de rutas. Preferiblemente, tales composiciones son para administración oral o intravenosa. Tales composiciones farmacéuticas y procesos para prepararlas son bien conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Remington: The Science and Practice of Pharmacy (A. Gennaro, et al., eds., 21a ed., Mack Publishing Co., 2005).
El compuesto de la presente invención actualmente administrado será determinado por un especialista bajo las circunstancias relevantes, incluyendo la condición a ser tratada, la ruta elegida de administración, el compuesto o compuestos actuales de la presente invención administrados, la edad, peso y respuesta del paciente individual, la severidad de los síntomas del paciente. Las dosificaciones por día normalmente caerán dentro del intervalo de aproximadamente 0.1 hasta aproximadamente 300 mg. En algunos casos los niveles de dosificación por debajo del límite superior del intervalo mencionado antes pueden ser más que adecuados, mientras en otros casos dosis todavía más grandes pueden ser empleadas.
Los compuestos de la presente invención, o sales farmacéuticamente aceptables de los mismos, pueden ser preparados por una variedad de procedimientos conocidos en la técnica, así como también aquellos descritos en las Preparaciones y Ejemplos abajo. Las etapas sintéticas específicas para cada una de las rutas descritas pueden ser combinadas en diferentes formas para preparar los compuestos de la invención, o sales farmacéuticamente aceptables de los mismos.
Los sustituyentes, a menos que se indique de otra forma, son como se definen previamente. Los reactivos y materiales de partida son en general fácilmente disponibles para uno de habilidad ordinaria en la técnica. Otros pueden ser elaborados por técnicas estándares de química orgánica y heterocíciica, técnicas las cuales son análogas a las síntesis de compuestos activos conocidos estructuralmente similares y profármacos, y los procedimientos descritos en las Preparaciones y Ejemplos los cuales singuen que incluyen algunos procedim ientos novedosos. La denominación de las siguientes Preparaciones y Ejemplos se hace usando Symyx Draw 3.1 .
Como se usa en la presente, los términos siguientes tienen los significados indicados: "HPLC" se refiere a cromatografía líquida de alta presión; "LC" se refiere a cromatografía l íquida; "MS (ES+)" se refiere a espectroscopia de masas usando ionización por electro-rocío; "MS" se refiere a espectroscopia de masas; "SFC" se refiere a cromatografía de fluido supercrítico; "NMR" se refiere a resonancia magnética nuclear; "TLC" se refiere a cromatografía de capa delgada; "RT" se refiere a tiempo de retención; "UV" se refiere a ultravioleta; "EDTA" se refiere a ácido etilendiaminatetraacético; "PBS" se refiere a salina amortiguada de fosfato; "PCR" se refiere a la reacción en cadena de la polimerasa; "SCX" se refiere al intercambio catiónico fuerte; y "HLB" se refiere al Balance Hidrof ílico-Lipofílico.
Preparación 1 ( 1 S,2S,5R, 6S)-2-(fer-butoxicarbonilamino)-4-metilen- biciclo[3.1.0]hexano-2,6-dicarboxilato de d/íer-butilo Se cargó un matraz de fondo redondo de 250 mi secado en horno con bromuro de metiltrifenilf osf on'to (5.41 g, 14.9 mmol) y tetrahidrofurano (93 ml_). Se enfrió la suspensión a 0°C y se agregó por goteo solución 1 M de bis(trimetilsilil)amida de sodio en tetrahidrofurano (16.08 mL, 16.08 mmol). Se agitó la mezcla amarillo brilloso resultante a 0°C por 20 minutos antes de agregar una solución de {1 S,2S,5R,6R)-2-(rer-butoxicarbonilamino)-4-oxo-biciclo[3.1.0]hexano-2,6-dicarboxilato de d/fer-butilo (5.09 g, 12.4 mmol, véase documento WO03/104217/A2 para detalles de síntesis) en tetrahidrofurano (31 mL). La reacción se dejó calentar a temperatura ambiente y se agitó por 16 horas. La mezcla se dividió entre acetato de etilo (500 mL) y agua (350 mL). Se desechó lo acuoso y la fase orgánica se lavó con salmuera (200 mL). La fase orgánica se secó sobre sulfato de magnesio, se filtró y concentró bajo presión reducida. Se purificó por cromatografía instantánea eluyendo con acetato de etilo: /so-hexano (5:95 a 20:80) para proporcionar el compuesto del título como un sólido blanco (4.84 g, 11.2 mmol). 1H NMR (CDCIj) d 1.45 (m, 27H), 1.87 (t, J=2.9 Hz, 1H), 1.98 (m, 1H), 2.43 (m, 2H), 3.07 (br m, 1H), 4.86 (br s, 1H), 5.03 (d, J=2 Hz, 1H), 5.1-5.3 (br s, 1H).
Preparación 2 {1S, 2S, 5R, 6S)-2-(rer-butoxicarbonilamino)espiro[biciclo[3.1.OJhexano- 4,1'-ciclopropano]-2,6-dicarboxilato de d/fer-butilo Se preparó una solución libre de etanol de diazometano en éter dietílico cargando el dedo frío de un aparato mini-Diazald Aldrich con cardice e iso-propanol rellenándolo a una tercera parte. En la porción de reacción del aparato se colocó una solución de hidróxido de potasio (740 mg, 13.2 mmol) en agua (1.5 mL). A esta solución se agregó una mezcla de monoetil éter de dietilen glicol (4 mL) y éter dietílico (2.4 mL). Se disolvió -metil- /'-nitro-//-nitrosoguanidina (1 g, 6.8 mmol) en una mezcla de éter dietílico (13 mL) y monoetil éter de dietilen glicol (4 mL). Esta solución se colocó en un embudo de goteo con articulaciones de cristal liso y se ajustó al aparato mini-Diazald. Se calentó la solución de hidróxido de potasio en un baño de agua mantenido a 70°C, asegurando que el matraz de recolección y un burbujeador rellenado con éter dietílico a la salida del aparato ambos sean enfriados en un baño de cardice//so-propanol. Se permitió que la solución de /V-metil-A/'-nitro-W-nitrosoguanidina se agregara a una velocidad igual a la de la destilación resultante. Una vez que la destilación se completó, se agregó por goteo éter dietílico adicional a través del embudo de goteo hasta que lo condensado en el dedo frío se volvió incoloro. Se almacenó la solución resultante en un baño cardice//'so-propanol hasta que se necesite. Se suspendió acetato de paladio (17.2 mg; 76.5 µ?t???) en éter dietílico (10 ml_). Se decantó y filtró la solución marrón pálido resultante y se agregó cuidadosamente a una mezcla de la solución diazometano de (1S, 2S,5R,6S)-2-(ter-butoxicarbonilamino)-4-metilen-biciclo[3.1.0]hexano-2,6-dicarboxilato de d/'fer-butilo (330 mg, 765.5 pinol) y éter dietílico (10 mL) el cual se ha permitido llegar a temperatura ambiente. Una vez que la evolución de gas terminó, se filtró la suspensión resultante y se concentró bajo presión reducida para proporcionar 260 mg de una mezcla sin reaccionar de (1S,2S, 5f?,6S)-2-(rer-butoxicarbonilamino)-4-metilen-biciclo[3.1.0]hexano-2,6-dicarboxilato de d/'fer-butilo y compuesto del título.
Se preparó una solución libre de etanol de diazometano en éter dietílico a partir de una solución de hidróxido de potasio (2.5 g, 44.6 mmol) en agua (4 mL), monoetil éter de dietilen glicol (14 mL) y éter dietílico (8 mL) y A/-metil-A/'-nitro-A/-nitrosoguanidina (4 g, 27.2 mmol) en una mezcla de éter dietílico (30 mL) y monoetil éter de dietilen glicol (15 mL). Se recuperó la solución resultante de diazometano y se agregó en porciones durante 30 minutos a una suspensión de acetato de paladio (20 mg, 89.1 µp???) en una solución de la mezcla sin reaccionar previamente preparada de (7S,2S,5f?,6S)-2-(fer-butoxicarbonilamino)-4- metilen-b¡ciclo[3.1.0]hexano-2,6-dicarboxilato de oVfer-butilo y compuesto del título (260 mg) en éter dietílico (3 mL). Una vez que la evolución de gas ha terminado, se dejó reposar durante la noche, entonces se filtró a través de una frita separadora de fase y se concentró bajo presión reducida para proporcionar un aceite oscuro. Se purificó por cromatografía instantánea eluyendo con acetato de etilo:/'so-hexano (0:100 a 75:25) para proporcionar 185 mg de una mezcla sin reaccionar de ( 1S, 2S, 5R, 6S)-2-(rer-butoxicarbon i la mino)-4-metilen-biciclo[3.1.0]hexano-2,6-dicarboxilato de tí/rer-butilo y compuesto del título.
Se preparó una solución libre de etanol de diazometano en éter dietílico a partir de una solución de hidróxido de potasio (3.2 g, 57 mmol) en agua (5 mL), monoetil éter de dietilen glicol (4 mL) y éter dietílico (10 mL) y /V-metil-/V'-nitro-A/-nitrosoguanidina (5 g, 34 mmoles) en una mezcla de éter dietílico (35 mL) y monoetil éter de dietilen glicol (15 mL). Se recuperó la solución resultante de diazometano y se agregó en porciones durante 60 minutos a una suspensión de acetato de paladio (20 mg, 89.1 pmol) en una solución de la mezcla previamente preparada sin reaccionar de (7S,2S,5ft,6S)-2-(fer-butoxicarbonilamino)-4-metilen-biciclo[3.1.0]hexano-2,6-dicarboxilato de d/'rer-butilo y compuesto del título (185 mg) en éter dietílico (2 mL). Una vez que la evolución de gas ha terminado, se dejó reposar por 30 minutos, se filtró y concentró bajo presión reducida para proporcionar un aceite amarillo. Se purificó por HPLC de masa guiada (RT = 6.4 minutos (UV), 6.37 minutos (MS); Columna LC: Waters XBridge™ 30mm x 100mm 5µ??; agua p/0.1% ácido fórmico; gradiente: 28-62% acetonitrilo p/0.1% ácido fórmico en 1.35 minutos después 62-95% en 6.65 minutos, después mantenido a 95% por 3.55 minutos. Temperatura de columna: ambiente; velocidad de flujo: 45 mL/minuto) para proporcionar el compuesto del título como un aceite incoloro (55.3 mg, 130.6 µ?t???). MS (m/z): 446 (M+23).
Preparación 3 ( 1 S, 2S, 5R, 6f?)-2-am¡ no-4-oxo-biciclo[3.1.0]hexano-2,6-dicarboxi lato de dietilo Se cargó un matraz de tres cuellos de 500 mi equipado con un condensador, entrada de nitrógeno y un termómetro con (1S,2S,5R, 6f?J-2-(fer-butoxicarbonilamino)-4-oxo-biciclo[3.1.Ojhexano-2,6-dicarboxilato de d/íer-butilo (15 g, 36.4 mmol) en etanol (365 mL). Se agregó cloruro de tionilo (13.3 mL, 182.3 mmol) a una solución agitada a temperatura ambiente por medio de jeringa (exoterma pequeña) después se calentó a reflujo. Después de 24 horas, se enfrió la reacción a temperatura ambiente y se concentró in vacuo. Se disolvió el residuo en diclorometano (50 mL) entonces se concentró en un evaporador rotatorio (repetición 3 veces). Se dividió el residuo entre acetato de etilo (200 mL) y carbonato hidrogenado de sodio saturado (150 mL). La fase orgánica se lavó con salmuera (150 mL), se secó 1 sobre sulfato de sodio, se filtró entonces se concentró a sequedad para dar el compuesto del título como un aceite (8.24 g, 32.3 mmol). MS (m/z): 256 (M+1).
Preparación 4 ( 1 S,2S,5R, 6f?)-2-acetam ido-4-oxo-biciclo[3.1.0]hexano-2,6-dicarboxilato de dietilo Se agregó anhídrido de ácido acético (5 mL, 50.8 mmol) a una solución agitada de (f S,2S,5R,6R)-2-amino-4-oxo-biciclo[3.1.0]hexano-2,6-dicarboxilato de dietilo (7.2 g, 28.2 mmol) y trietilamina (7.9 mL, 56.4 mmol) en diclorometano seco (72 mL) a temperatura ambiente. Después de 2 horas, se apagó con agua (100 mL) y se agitó vigorosamente por 20 minutos. Se separó la capa de diclorometano por medio de una frita hidrofobica y se evaporó a un aceite marrón ligero (9.6 g). Se purificó por cromatografía instantánea eluyendo con acetato de etilo:/'so-hexano (70:30 a 90:10) para dar el compuesto del título como una espuma cristalina amarillo pálido en secado (6.53 g, 22 mmol). MS (m/z): 298 (M + 1), 320 (M+23), 617 (2M+23).
Preparación 5 (7S,2S,5 6S)-2-acetamido-4-metilen-biciclo[3.1.0]hexano-2,6- dicarboxilato de dietilo Se cargó un matraz de fondo redondo de 250 mi secado en horno con bromuro de (metil)trifenilfosfonio (9.72 g, 26.7 mmol) y tetrahidrofurano seco (122 mL). Se enfrió la suspensión a 0 hasta -5°C y se trató con bis(trimetilsilil)amida de sodio 2M en tetrahidrofurano (13.3 mL, 26.7 mmol) en una manera por goteo. Se agitó la mezcla amarillo brilloso resultante a 0°C por 20 minutos después se trató con una solución de ( 1 S, 2S, 5R, 6R)-2-acetam ido-4-oxo-biciclo[3.1.0]hexano-2, 6-dicarboxilato de dietilo (6.1 g, 20.5 mmol) en tetrahidrofurano (30 mL). La reacción se dejó calentar lentamente a temperatura ambiente durante 3 horas. Después de la agitación por 20 horas a temperatura ambiente se apagó con agua helada (200 mL) y se extrajo con acetato de etilo (200 mL). Se lavaron los extractos con agua (100 mL), salmuera (100 mL), se secaron, se filtraron y se evaporaron a aceite marrón oscuro. Se agregó éter dietílico (70 mL) e iso-hexano (20 mL) y se sembró la solución con óxido de trifenilfosfina. Se permitió reposar por 2 horas, se decantó la solución, se agregó sílice y se concentró bajo vacío. Se purificó por cromatografía instantánea eluyendo con acetato de etilo: so-hexano (60:40 a 80:20) para dar un aceite rosado (6.81 g) contaminado con óxido de trifenilfosfina. Se purificó nuevamente por cromatografía instantánea eluyendo con acetato de etilo: /so-hexano (60:40) para dar el compuesto del título como un aceite amarillo viscoso (3.98 g, 13.5 mmol). MS (m/z): 296 (M + 1), 318 (M+23), 613 (2M+23).
Preparación 6 (7 S,2S,5R, 6S)-2-acetamidoespiro[biciclo[3.1.Ojhexano- ciclopropano]-2,6-dicarboxilato de dietilo Bajo nitrógeno, se agregó una solución de ácido trifluoroacético (1.9 mL, 25 mmol) en diclorometano (12.5 mL) por goteo muy lentamente a una solución de dietilzinc enfriada (baño de hielo) agitada (1M en heptanos) (25 mL, 25 mmol) en diclorometano (12.5 mL). Después de 10 minutos, se agregó una solución de diyodometano (2.01 mL, 25 mmol) en diclorometano (12.5 mL). Después de 10 minutos, se agregó una solución de (iS,2S,5R,6S)-2-acetamido-4-metilen-biciclo[3.1.0]hexano-2,6-dicarboxilato de dietilo (2.46 g, 8.3 mmol) en diclorometano (12.5 mL). Después de 60 minutos se removió el baño de hielo y se dejó que la mezcla de reacción se agitara durante la noche a temperatura ambiente. Se apagó la solución de reacción clara por adición por goteo de la mezcla de reacción a ácido clorhídrico acuoso 0.2M (200 mL) bajo agitación vigorosa. Después de 1 hora se separó la capa de diclorometano, se lavó con salmuera, se secó sobre sulfato de magnesio, se filtró y concentró a vacío para proporcionar el producto requerido contaminado con material de partida sin reaccionar (4.4 g). Se purificó por cromatografía instantánea eluyendo con acetato de etilo: ciclohexano (50:50 a 100:0) para dar un aceite incoloro (3.1 g). Se purificó por SFC (RT = 2.48 minutos (UV, 200 nm); HP Columna LC: AD-H 30 mm x 250 mm 5 µ?t?; gradiente C02: 5% alcohol /so-propílico p/0.2% dimetiletilamina por 0.5 minutos, después 5%-27% en 2.2 minutos. Temperatura de columna: 35°C; presión: 100000 kPa; velocidad de flujo: 210 mL/minuto) para proporcionar (7S,2S,5R,6S)-2-acetamido-4-metilen-biciclo[3.1.0]hexano-2,6-dicarboxilato de dietilo sin reaccionar. (580 mg, 2.0 mmol) y compuesto del título (1.82 g, 5.9 mmol). S (m/z): 310 (M+1), 332 (M+23).
Preparación 7 ( 1 S, 2S, 5R, 6S)-2-amino-4-metilen-biciclo[3.1.0]hexano-2,6-dicarboxilato de dietilo Método 1 : Se preparó una solución de aproximadamente 1M de cloruro de hidrógeno en etanol por adición por goteo de cloruro de trimetilsililo (13.8 mL, 108 mmol) a etanol (110 mL). Se disolvió {1 S,2S,5R,6S)-2- (ter-butoxicarbonilamino)-4-metilen-biciclo[3.1.0]hexano-2,6-dicarboxilato de d/ier-butilo (7.4 g, 18.1 mmol) en esta solución acida y se calentó a 60°C por 16 horas. Se evaporó a un aceite amarillo viscoso, se disolvió nuevamente en agua (50 mL) y se filtró la solución turbia para remover restos insolubles. Se neutralizó la solución acida acuosa con bicarbonato de sodio (8.4 g, 0.1 mol) y se extrajo con diclorometano (2 x 100 mL). Se secaron las soluciones de diclorometano combinadas por medio de una frita hidrofóbica y se evaporó a un líquido amarillo pálido (4.14 g). Se purificó por cromatografía en sílice unido a amino eluyendo con acetato de etilo: /so-hexano (20:80 a 80:20) para dar un líquido incoloro (3.6 g). Se purificó nuevamente por cromatografía en sílice unido a amino eluyendo con acetato de etilo: /so-hexano (20:80) para dar un líquido incoloro del producto del título (2.81 g, 61%). MS (m/z): 254 (M+1).
Método 2: Se secó monohidrato ácido de p-toluensulfónico (6.97 g, 36.6 mmol) ¡n vacuo a 50°C por 3 días. Se agregó a una solución agitada de (íS,2S,5f?,6S)-2-(rer-butoxicarbonilamino)-4-metilen-biciclo[3.1.0]hexano-2,6-dicarboxilato de cf rer-butilo (5.0 g, 12.2 mmol) en etanol (35.5 mL) y se calentó a 60°C por 3 días. Se removió el solvente bajo presión reducida para dar un residuo. Se recuperó el residuo en agua (100 mL), se volvió básico usando bicarbonato de sodio y se extrajo con diclorometano (3 x 100 mL). Se secaron los extractos sobre sulfato de sodio, se filtraron y entonces se concentraron bajo presión reducida para dar un residuo anaranjado del compuesto del título (1.52 g, 51%). MS (m/z): 254 (M+1).
Preparación 8 (?S,2S,5R,6S)-2-(9H-fluoren-9-ilmetoxicarbonilamino)-4-met¡len- biciclo[3.1.0]hexano-2,6-dicarboxilato de dietilo Se agregó cloroformiato de 9-fluorenilmetilo sólido (3.15 g, 12.2 mmol) en porciones durante 5 minutos a una solución agitada de (íS,2S)5f?,6S)-2-amino-4-metilen-biciclo[3.1.0]hexano-2,6-dicarboxilato de dietilo (2.8 g, 11.1 mmol) y bicarbonato de sodio (2.04 g, 24.3 mmol) en tetrahidrofurano (28 mL) y agua (8.4 mL) enfriada a 0-5°C. Después de 1 hora, se agregó agua (10 mL) y se extrajo con acetato de etilo (50 mL). Se lavó lo extraído con solución de salmuera (20 mL), se secó, se filtró y se evaporó a un aceite amarillo pálido (6.5 g). Se purificó por cromatografía instantánea eluyendo con acetato de etilo: so-hexano (10:90 a 20:80) para dar un aceite incoloro viscoso (4.58 g). Se purificó nuevamente por cromatografía instantánea eluyendo con acetato de etilo: /so-hexano (20:80) para dar una espuma semi-sólida blanca del compuesto del título (4.22 g, 80%). MS (m/z): 476 (M + 1).
Preparación 9 (¦/S,2S,5 ,6S)-2-(9H-fluoren-9-ilmetoxicarbon ¡lamino) espiro[biciclo[3.1.0]hexano-4,1'-ciclopropano]-2,6-dicarboxilato de dietilo Se agregó una solución de ácido trifluoroacético (2.66 g, 23.3 mmol) en diclorometano (11.7 mL) por goteo durante 5 minutos a una solución agitada de dietil zinc 1M en heptanos (23.3 mL, 23.3 mmol) en diclorometano (11.7 mL) enfriada a 0-5°C bajo nitrógeno (reacción exotérmica). Después de 10 minutos, se agregó una solución de diyodometano (6.25 g, 23.3 mmol) en diclorometano (11.7 mL). Después de 10 minutos, se agregó una solución de (7S,2S,5?,6S)-2-(9H-fluoren- 9-ilmetoxicarbonilamino)-4-metilen-biciclo[3.1.0]hexano-2,6-dicarboxilato de dietilo (3.70 g, 7.8 mmol) en diclorometano (11.7 mL). Después de 2 horas a 0°C, se permitió que se calentara a temperatura ambiente y se agitó por 16 horas. Se apagó la mezcla de reacción con ácido clorhídrico 0.5M frío (50 mL) y diclorometano (20 mL) y se agitó vigorosamente. Se separó la capa de diclorometano por medio de una frita hidrofóbica y después se evaporó a un aceite amarillo pálido. Se purificó por cromatografía instantánea eluyendo con acetato de etilo: /so-hexano (10:90 a 20:80) para dar un aceite incoloro (3.49 g). Se purificó nuevamente por cromatografía instantánea eluyendo con acetato de etilo: /so-hexano (20:80) tomando las fracciones de corte central para dar una espuma incolora de compuesto del título (2.12 g, 56%). MS (m/z): 490 (M+1). Un segundo lote del producto de las fracciones menos puras se obtiene por cromatografía repetida (363 mg, 9% adicional).
Preparación 10 (1S,2S, 5R, 6R)-2-benciloxicarbonilam¡no-4-oxo-biciclo[3.1.0]hexano-2,6- dicarboxilato de dietilo Método 1 : Se agregó dicarbonato de dibencilo (18.6 mL, 76.1 mmol) a una solución de (1 S,2S,5R,6R)-2-amino-4-oxo-biciclo[3.1 0]hexano-2,6-dicarboxilato de dietilo (16.2 g, 63.5 mmol) en diclorometano (500 mL) entonces se agregó por goteo trietilamina (10.6 mL, 76.1 mmol). Se agitó la mezcla de reacción por 30 minutos antes del lavado con ácido clorhídrico 1N (200 mL). Se lavó la fase de diclorometano con salmuera, se separó y se concentró in vacuo. Se purificó por cromatografía instantánea eluyendo con acetato de etilo: /so-hexano (0:100 a 75:25) para proporcionar el compuesto del título (11.6 g, 47%). MS (m/z): 388 (M + 1), 410 (M+23).
Método 2: Se agregó a un matraz de fondo redondo clorhidrato (1S,2S,5R,6R)-2-amino-4-oxo-biciclo[3.1.0]hexano-2,6-dicarboxilato de dietilo (226.86 g, 777.65 mmol), agua (1.13 L) y tetrahidrofurano (1.13 L). Se agregó lentamente bicarbonato de sodio (143.72 g, 1.71 mol) en 5 porciones (observando evolución de C02 y temperatura interna de 31°C a 25°C). Se agregó después una solución de cloroformiato de bencilo (120.6 mL, 855.42 mmol) en tetrahidrofurano (226.9 mL) y manteniendo la temperatura interna por debajo de 28°C (10 minutos) con agitación de la reacción a 25°C por 1 hora. Se vertió la mezcla en éter metil-t-butílico (1.25 L). Se separaron las capas, se extrajo lo acuoso con acetato de etilo (750 mi) y se desechó la fase acuosa. Se lavó la mezcla con salmuera, se secó sobre sulfato de magnesio, se filtró y concentró a sequedad para dar el compuesto del título como un aceite incoloro (302.82 g, 777.65 mmol). MS (m/z): 388 (M + 1).
Preparación 11 ( 1 S, 2S, 5R, 6S)-2-benciloxicarbonilamino-4-metilen-biciclo[3.1.Ojhexano- 2,6-dicarboxilato de dietilo Método 1 : Se cargó un matraz de fondo redondo de 500 mi secado en horno con bromuro de (metil)trifenilfosfonio ( 1 5.4 g, 43.1 mmol) y tetrahidrofurano seco (1 12 mL). Se enfrió la suspensión a 0 hasta -5°C y se trató con bis(trimetilsilil)am¡da de sodio 2M en tetrahidrofurano (23 mL, 46 mmol) en una manera por goteo. Se agitó la suspensión amarillo brilloso resultante a 0°C por 30 minutos después se trató con una solución de (1 S,2S, 5R,6R)-2-benciloxicarbonilamino-4-oxo-biciclo[3.1 .0]hexano-2,6-dicarbox¡lato de dietilo (1.1 .2 g, 28.8 mmol) en tetrahidrofurano (22.4 mL). Se permitió que la reacción lentamente se calentara a temperatura ambiente. Después de 4 horas, se apagó con hielo ( 120 g), salmuera (120 mL) y se extrajo con acetato de etilo (250 mL). Se lavaron los extractos con salmuera (2 x 100 mL), se secaron, se filtraron y se evaporaron a un aceite rojo. Se disolvió nuevamente en éter dietílico ( 100 mL) y se agregó /'so-hexano (80 mL) lentamente en porciones a óxido de trifenilfosfina precipitado como un semi-sólido rojo (5.2 g). Se trató la solución con sílice seco (-50 g) y se concentró a sequedad. Se purificó por cromatografía instantánea eluyendo con acetato de etilo: /'so-hexano (20:80) para dar el compuesto del título como un aceite viscoso incoloro (7.37 g, 66%). MS (m/z): 388 (M+1), 410 (M+23).
Método 2: Se agregó /er-butóxido de potasio (104.72 g, 933.18 mmol) a una suspensión de bromuro de (metil)trifenilfosfonio (340.16 g, 933.18 mmol) en tetrahidrofurano (1.82 L) a temperatura ambiente (sin cambio en temperatura interna). Entonces se agregó una solución de (1 S,2S,5R,6R)-2-benciloxicarbonilamino-4-oxo-biciclo[3.1.0]hexano-2,6-dicarboxilato de dietilo (302.82 g, 777.65 mmol) en tetrahidrofurano (1.82 L) manteniendo la temperatura a 24°C. Se agitó la mezcla a 50°C por 3 horas. Se diluyó la reacción con acetato de etilo (1.5 L), se lavó con agua (2 x 3 L) y salmuera. La fase orgánica se secó sobre sulfato de magnesio, se filtró y concentró para proporcionar un aceite marrón oscuro. Se purificó por cromatografía instantánea eluyendo con acetato de etilo: hexanos (9:1) para dar el compuesto del título como un aceite incoloro (183.35 g, 473.25 mmol). MS (m/z). 388 (M+1), 410 (M+23).
Preparación 12 (1S, 2S, 5R, 6S)-2-benciloxicarbonilaminoespiro[biciclo[3.1.0]hexano-4, 1 '- ciclopropano]-2,6-dicarboxilato de dietilo Método 1 : Se agregó una solución de dietilzinc 1 M en heptanos (64.1 m L, 64.1 mmol) en diclorometano (14.6 mL) por goteo lentamente durante 1 0 minutos a una solución agitada de ácido trifluoroacético (4.27 mL, 56.5 mmol) en diclorometano (73 mL) enfriada a 0-5°C bajo nitrógeno. Después de 10 minutos, se agregó una solución de diyodometano (4.6 mL, 56.5 mmol) en diclorometano (14.6 mL). Después de 10 minutos, se agregó una solución de (1 S,2S, 5R,6S)-2-benciloxicarbonilamino-4-metilen-biciclo[3.1 .0]hexano-2,6-dicarboxilato de dietilo (7.3 g, 1 8.8 mmol) en diclorometano ( 14.6 mL) . Después de 1 hora, se removió el baño de hielo y la solución turbia se dejó agitar por 20 horas a temperatura ambiente. Después de 24 horas, se apagó la mezcla de reacción con ácido clorhídrico acuoso 0.5M congelado (160 mL, 80 mmol) y diclorometano (200 mL) y se agitó la mezcla vigorosamente. Se separó la capa de diclorometano y después se secó la fase de diclorometano por filtración a través de 2 fritas hidrofóbicas. Se evaporó a un aceite amarillo pálido volviéndose marrón durante la noche. Se purificó por cromatografía instantánea eluyendo con acetato de etilo: /so-hexano (20:80) para dar el compuesto del título como una mezcla con (1 S,2S,5R,6S)-2-benciloxicarbonilamino-4-metilen-biciclo[3.1.0]hexano-2,6-dicarboxilato de dietilo sin reaccionar como un aceite incoloro (5.1 g).
Se agregó una solución de ácido trifluoroacético (2.93 mL, 38.7 mmol) en diclorometano (10 mL) por goteo lentamente durante 10 minutos a una solución agitada de dietilzinc 1M en heptanos (38.7 mL, 38.7 mmol), en diclorometano (50 mL) enfriada a 0-5°C bajo nitrógeno. Después de 10 minutos, se agregó una solución de diyodometano (3.12 mL, 38.7 mmol) en diclorometano (10 mL) a la mezcla de reacción. Después de 10 minutos, se agregó una solución de la mezcla de (1S,2S, 5R, 6S)-2-benciloxicarbonilaminoespiro[biciclo[3.1.0]hexano-4, 1 '-ciclopropano]-2,6-dicarboxilato de olefina y dietilo (5 g, 12.9 mmol) en diclorometano (10 mL). Después de 1 hora se removió el baño de hielo y la solución turbia se dejó agitar por 16 horas a temperatura ambiente. Después de 20 horas, se apagó la mezcla de reacción con cloruro de hidrógeno 0.5M congelado (140 mL, 70 mmol) y diclorometano (160 mL) y se agitó la mezcla vigorosamente. Se lavó la capa de diclorometano con ácido clorhídrico acuoso 0.5M (100 mL), se secó sobre sulfato de sodio y entonces se filtró a través de 2 fritas hidrofóbicas. Se evaporó a un aceite amarillo pálido (5.89 g). Se purificó por cromatografía instantánea eluyendo con acetato de etilo: /'so-hexano (15:85 a 25:75) para dar el compuesto del título como un aceite incoloro (4.28 g) contaminado con una cantidad pequeña del reactivo.
Se disolvió nuevamente en acetona (40 mL), agua (20 mL), bicarbonato de sodio (0.54 g, 6.45 mmol) y sulfato de magnesio (0.78 g, 6.45 mmol). Se enfrió a 0°C y se agregó permanganato de potasio (0.2 g , 1 .29 mmol) para dar una mezcla púrpura brillosa. Después de 3 horas a temperatura ambiente, se apagó con tiosulfato de sodio pentahidratado sólido (0.32 g , 1 .29 mmol) y se filtró la suspensión a través de una almohadilla de tierra diatomácea, con lavado a través de acetona. Se evaporó a un volumen pequeño, se diluyó con agua (20 m L) y se extrajo con acetato de etilo (60 mL). Se lavaron los extractos con salmuera, se secaron, se filtraron y se evaporaron a un aceite. Se purificó por cromatografía instantánea eluyendo con acetato de etilo: /so-hexano (1 5:85 a 25:75) para dar el compuesto del título como un aceite incoloro (3.62 g, 70%). MS (m/z): 402 (M + 1 ) .
Método 2: Se agregó una solución de dietilzinc 1 M en heptanos ( 1 .6 L, 1 .6 mol) por medio de cánula a diclorometano (870.9 mL) a 0°C (temperatura del baño -5°C), entonces se agregó lentamente una solución de ácido trifluoroacético (121 .02 mL, 1 .6 mol) en diclorometano (870.9 mL) manteniendo la temperatura por debajo de 3°C. Después de 1 hora de adición se agitó la mezcla por 5 minutos, entonces se agregó diyodometano (1 30.3 mL, 1 .6 mol) en una porción y se agitó por 1 5 minutos. Se agregó una solución de ( 1 S,2S,5R,6S)-2-benciloxicarbonilamino-4-metilen-biciclo[3.1 .0]hexano-2,6-dícarboxilato de dietilo ( 1 83.35 g , 449.58 mmol) en diclorometano (348.4 m L) durante 1 0 minutos y se agitó la mezcla a temperatura ambiente durante la noche. Se enfrió a 0°C, se apagó con ácido clorhídrico 0.5M (1 .5 L) y se agitó la mezcla vigorosamente. Se separó la capa orgánica, se lavó con salmuera y se concentró a sequedad. Se disolvió en agua (733.4 mL) y acetona (733.4 mL), se enfrió a 0°C entonces se agregó sulfato de magnesio (81.17 g, 674.37 mmol), bicarbonato de sodio (56.65 g, 674.37 mmol) seguido por permanganato de potasio (28.42 g, 179.83 mmol). Se agitó la mezcla a temperatura ambiente. Después de 30 minutos se agregó tiosulfato de sodio pentahidratado (197.10 g, 311.03 mmol) seguido por tierra diatomácea (100 g). Se agitó por 30 minutos y se filtró a través de una almohadilla de tierra diatomácea. Se lavó la almohadilla con éter metil-t-butílico y se extrajo la capa acuosa con éter metil-t-butílico. Se secó la capa orgánica sobre sulfato de magnesio, se filtró y concentró in vacuo. Se purificó por cromatografía instantánea eluyendo con hexanos: éter metil-t-butílico (10:90 a 50:50) para proporcionar el compuesto del título como un aceite incoloro (92.67 g, 51%). 1H NMR (CDCI3) d: 0.39-0.52 (m, 1H), 0.55-0.78 (m, 3H), 1.25 (amplio t, J= 7.1 Hz, 6H), 1.58 (amplio dd, J=2.9 y 6.3 Hz, 1H), 1.64-1.73 (m, 1H), 1.95 (amplio t, J=2.9 Hz, 1H), 2.03-2.17 (m, 1H), 2.52 (dd, J= 2.7 y 6.3 Hz, 1H), 4.09 (q, J= 7.1 Hz, 2H), 4.16-4.32 (m, 2H), 5.08 (amplio s, 2H), 5.44 (amplio s, 1H), 7.28-7.41 (m, 5H).
También se obtuvo {1 S,2S,5R,6S)-2- (benciloxicarbonit(metil)amino)espiro[biciclo[3.1.0]hexano-4, 1 '-ciclopropano]-2,6-dicarboxilato de dietilo como un derivado (22.67 g, 5.46 mmol). 1H NMR (CDCI3) d: 0.37-0.52 (m, 1H), 0.54-0.80 (m, 3H), 1.26 (amplio t, J= 7.1 Hz, 6H), 1.55-1.68 (m, 1H), 1.64-1.73 (m, 1H), 1.70-1.80 (m, 1H), 1.97 (amplio t, J=3.1 Hz, 1H), 2.30 (dd, J= 3.1 y 6.3 Hz, 1H), 3.16 (s, 3H), 3.99-4.29 (m, 4H), 5.09 (amplio s, 2H), 7.38-7.62 (m, 5H).
Preparación 13 ( 1 S, 2S, 5R, 6S)-2-aminoespiro[biciclo[3.1.0]hexano-4,1 '-ciclopropano]- 2,6-dicarboxilato de dietilo Método 1 : Se agregó piridina (3.16 g, 37.2 mmol) a una solución agitada de (7S,2S,5R,6S)-2-(9H-fluoren-9-ilmetox¡carbonilamino)espiro[biciclo[3.1.0]hexano-4, 1'-ciclopropano]2,6-dicarboxilato de dietilo (2.10 g, 4.29 mmol) en diclorometano (10.5 ml_) a temperatura ambiente. Después de 30 minutos, se evaporó a un sólido amarillo. Se purificó por cromatografía instantánea eluyendo con acetato de etilo: /'so-hexano (30:70 a 80:20) para primero eluir 1 -(9H-fluoren-9-ilmeti l)-piridina y después para eluir un líquido amarillo pálido del compuesto del título (1.07 g, 93%). MS (m/z): 268 ( +1).
Método 2: Se disolvió (1S,2S,5R,6S)-2-benciloxicarbonilaminoespiro[biciclo[3.1.0]hexano-4, 1 '-ciclopropano]-2,6-dicarboxilato de dietilo (3.62 g, 9 mmol) en etanol (54 mL) y se agregó solución a paladio en carbono 10% (Degussa tipo E 101 NE/W, 0.18 g, 0.17 mmol). Se hidrogenó en equipamiento Parr por 4 horas a 345 kPa. Se filtró la reacción a través de una almohadilla de tierra diatomácea para remover el catalizador, se lavó con etanol y se evaporó a un aceite incoloro como el compuesto del título (2.23 g, 93%). MS (m/z): 268 (M + 1).
Preparación 14 (1S,2S,5R,6S)-2-[[(2S)-2-{ter- butoxicarbonilamino)propanoil]amino]espiro[biciclo[3.1.OJhexan o-4,1 '- ciclopropano]-2,6-dicarboxilato de dietilo Se combinó (1 S,2S,5R,6S)-2-aminoespiro[biciclo[3.1.0]hexano-4, 1 '-ciclopropano]-2,6-dicarboxilato de dietilo (1.92 g, 7.17 mmol), ácido (2S)-2-(ter-butoxicarbonilamino)propanoico (1.92 g, 10 mmol), 4-dimetilaminopiridina (9 mg, 717 pmol) y 1 -hidroxibenzotriazol (1.36 g, 10 mmol) en diclorometano (48 mL). Se agregó trietilamina (1.5 mL, 10.8 mmol) y clorhidrato de 1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida (1.92 g, 10 mmol) y se agitó por 2 horas a temperatura ambiente bajo una atmósfera de nitrógeno. Se diluyó la reacción con acetato de etilo (200 mL), agua (50 mL) y salmuera (50 mL). Se agitó vigorosamente entonces se separó la capa de acetato de etilo, se lavó con ácido clorhídrico 0.2M (50 mL), agua (50 mL) , carbonato hidrógeno de sodio saturado (50 mL) y salmuera (50 mL) . Se secó, se filtró y concentró la solución para dar un aceite amarillo (3.48 g) . Se purificó por cromatografía instantánea eluyendo con acetato de etilo: /so-hexano ( 1 5:85 a 25:75) después (25:75 a 40:60) para dar el material como un aceite. Se disolvió nuevamente en diclorometano, se concentró y se secó bajo vacío para dar el compuesto del título como un material espumoso blanco (3.05 g , 6.95 mmol) . MS (m/z): 461 (M+23).
Los siguientes compuestos se prepararon esencialmente por el método de la preparación 14.
Preparación 17 ácido ( 1S, 2S, 5R, 6S)-2-[[(2S)-2-(ter- Butoxicarbonilamino)propanoil]amino] espiro[biciclo[3.1.0]hexano-4, 1 '- ciclopropano]-2,6-dicarboxílico Método 1 : Se agregó una solución de hidróxido de litio 2M en agua (27.8 mL, 55.6 mmol) a una solución agitada fría de {1S,2S,5R,6S)-2-[[(2S)-2-(íer-butoxicarbonilamino)propanoil]amino]espiro[biciclo[3.1.0]hexano-4,1 '-ciclopropano]-2,6-dicarboxilato de dietilo (3.05 g, 6.9 mmol) en tetrahidrofurano (36 mL) bajo nitrógeno. Se agitó la solución bicapa a temperatura ambiente por 20 horas. Se acidificó con ácido clorhídrico 2M (29 mL), hielo (~20 g) y se extrajo con acetato de etilo (100 mL). Se lavaron los extractos con salmuera (50 mL), se secaron en sulfato de sodio, se filtraron y se evaporaron a una espuma semi-sólida blanca. Se disolvió nuevamente el material en acetato de etilo caliente (15 mL). Se filtró y se secó el material bajo vacío para dar el compuesto del título como un sólido blanco (2.06 g, 5.4 mmol). MS (m/z): 405 (M+23).
Método 2: Se disolvió (1S,2S,5R,6S)-2-benciloxicarbonilaminoespiro[biciclo[3.1.0]hexano-4, 1 '-ciclopropano]-2,6-dicarboxilato de dietilo (159 g, 396.05 mmol) en etanol (792.1 mL), y se agregó paladio en carbono 10% (15.9 g, 14.94 mmol) seguido por una solución de ácido clorhídrico a 37.5%p/p en agua (6.62 ml_, 79.21 mmol). Se hidrogenó en un equipamiento Parr 2 L a 413 kPa a temperatura ambiente. Después de 4 horas se filtró la mezcla a través de tierra diatomácea y un filtro de microfibra de vidrio (Whatman) y se concentró in vacuo. Lo crudo disuelto en tetrahidrofurano (396 ml_), se agregó clorodimetoxitriazina (74.50 g, 415.86 mmol) y ácido (2S)-2-(fer-butoxicarbonilamino)propanoico (79.88 g 415.86 mmol). Se enfrió esta mezcla a 0°C y se agregó /V-metilmorfolina (131.06 mL, 1.19 mol). Se agitó la mezcla a temperatura ambiente. Después de 5 horas se filtró lo crudo a través de tierra diatomácea y se lavó la torta con tetrahidrofurano (200 mL). Se removió el solvente parcialmente bajo vacío y se enfrió la solución anaranjada resultante a 0°C. Se agregó hidróxido de sodio 2M en agua (792.1 mL, 1.58 mol) por goteo. Se agitó la mezcla durante la noche, dejando que la reacción alcance la temperatura ambiente. Se agregó diclorometano (1 L) y se separaron las fases. Se lavó la capa orgánica con más agua (300 mL). Se acidificaron las capas acuosas combinadas a pH=2-3 con sulfato hidrógeno de potasio 1N y después se extrajo con acetato de etilo. Se secó la capa orgánica sobre sulfato de magnesio, se filtró y se evaporó bajo vacío. Se disolvió lo crudo en tetrahidrofurano (600 mL) y se calentó a reflujo. Se agregó heptano (2.1 L) y se enfrió la solución. Se filtró lo sólido y se secó bajo vacío para dar el compuesto del título como un sólido blanco (149 g, 98%). S (m/z): 405 (M+23).
Los siguientes compuestos se prepararon esencialmente por el método 1 de la preparación 17.
Preparación 20 (iS,2S,5f?,6S)-2-(fer-butoxicarbonilamino)espiro[biciclo[3.1.0]hexano- 4,1 '-ciclopropano]-2,6-dicarboxilato de dietilo Método 1 : A una solución de (1 S,2S,5R,6S)-2- aminoespiro[biciclo[3.1.0]hexano-4, 1 '-ciclopropano]-2,6-d¡carbox¡lato de dietilo (0.47 g, 722.38 pmol) en diclorometano (5 mL) se agregó di-iso-propil-etilamina soportada por polímero (1.02 g, 3.61 mmol) seguido por di-f-butildicarbonato (0.41 g, 1.88 mmoles) en diclorometano (6.00 mL) y se agitó la mezcla de reacción a temperatura ambiente durante la noche. Se agregó di-f-butildicarbonato adicional (0.32 g, 1.36 mmole) se agitó por 2 horas adicionales. Se diluyó con etanol (20 mL) y se purificó por cartucho de resina de intercambio iónico SCX-2 (10 g) pretratado con 2 volúmenes en columna de etanol. Después de la carga, el cartucho se lavó con 4 volúmenes en columna de etanol antes de concentrar el eluyente in vacuo para proporcionar el producto crudo (808 mg). Se purificó el material crudo por cromatografía instantánea eluyendo con acetato de etilo: ciclohexano (0:100 a 40:60) para proporcionar el material deseado (100 mg). Se lavó a chorro el cartucho con 2 volúmenes en columna de amoníaco 3M en metanol para proporcionar un sólido amarillo (430 mg) de (1 S,2S,5R,6S)-2-aminoespiro[biciclo[3.1.0]hexano-4, 1 '-cid opropano]-2,6-dicarboxi lato de dietilo crudo sin reaccionar. Se agregó di-f-butildicarbonato (0.32 g, 1.44 mmol) al (7 S,2S,5f?,6S)-2-aminoespiro[biciclo[3.1.0]hexano-4, 1 '-ciclopropano]-2,6-dicarboxilato de dietilo recuperado en tetrahidrofurano (20 mL), se agitó a temperatura ambiente durante la noche. Se agregó después trietilamina (201.37 pL, 1.44 mmol) y di-f-butildicarbonato adicional (0.32 g, 1.44 mmol) y manteniendo la agitación por 72 horas. Se agregó trietilamina en exceso (201.37 pL, 1.44 mmol), di-f-butildicarbonato (0.32 g, 1.44 mmol) y ?/,/V-dimetil 4-aminopiridina catalítica (40.93 µ?t???) y se agitó durante la noche. Se diluyó con etanol (30 mL) y se purificó la solución por cartucho de resina de intercambio iónico SCX-2 (10 g) pretratado con 2 volúmenes en columna de etanol. Se lavó con 4 volúmenes en columna de etanol y se concentró la solución in vacuo para proporcionar 757 mg del producto deseado crudo. Se purificó por cromatografía instantánea eluyendo con acetato de etilo: ciclohexano (0:100 a 40:60) para proporcionar una segunda fracción del producto del título deseado (24 mg). Se combinaron ambas fracciones para proporcionar el compuesto del título (337.47 µp???, 47%). S (m/z): 390 (M+23), 757 (2M+23).
Método 2: Se agregó di-f-butildicarbonato (0.88 g, 4.01 mmol) a una solución de ( 1 S, 2S, 5R, 6S)-2-aminoespiro[biciclo[3.1.0]hexano-4,1'-ciclopropano]-2,6-dicarboxilato de dietilo (1.4 g, 5.24 mmol) en tetrahidrofurano (30 mL) y se agitó la mezcla de reacción a temperatura ambiente durante la noche bajo nitrógeno. Se filtró a través de una frita hidrofóbica, se lavó gel incoloro, con acetato de etilo. Se concentraron las capas orgánicas combinadas in vacuo para dar un aceite incoloro. Se purificó por cromatografía instantánea eluyendo con acetato de etilo: /so-hexano (0:100 a 30:70) para proporcionar 1.82 g de aceite. Se secó adicionalmente bajo alto vacío para proporcionar el compuesto del título (1.79 g, 93%). MS (m/z): 390 (M + 23), 757 (2M + 23).
Preparación 21 ácido (1S,2S,5R,6S)-2-(ter- Butoxicarbonilamino)espiro[biciclo[3.1.0]hexano-4,1'-ciclopropano]-2,6- dicarboxílico Se agregó {1 S,2S,5R,6S)-2-(ter-butoxicarbonilamino)espiro[biciclo[3.1.0]hexano-4,1'-ciclopropano]-2,6-dicarboxilato de dietilo (1.79g, 4.87 mmol) en tetrahidrofurano (29.2 mL) a una solución recientemente preparada de monohidrato hidróxido de litio (1.64 g, 38.97 mmol) en agua (19.5 mL) y se agitó durante la noche a 60°C. Se diluyó con agua (30 mL), se extrajo con acetato de etilo (2 x 50 mL). Se separaron las capas acuosa y orgánica. Se lavó la capa orgánica con ácido clorhídrico 2M. Se lavó la capa acuosa con ácido clorhídrico 2M (25 mL) después se extrajo con acetato de etilo (2 x 50 mL). Se combinaron las capas orgánicas y se lavaron con salmuera (15 mL). Se secaron en sulfato de magnesio, se filtraron y concentraron a sequedad. Se disolvió nuevamente en diclorometano y se concentró a sequedad para dar el compuesto del título (1.49 g, 98%). MS (miz): 334 (M+23).
Preparación 22 (íS,2S,5R,6S)-2-(íer-butoxicarbonilamino)espiro[biciclo[3.1.0]hexano- clopropano]-2,6-dicarboxilato de dibencilo Se agregó carbonato de cesio (0.24 g, 730.7 µp???) y bromuro de bencilo (87.16 µ?_, 730.7 µp???) a una solución de ácido (1S,2S,5R, 6S)-2-(íer-butoxi carbón ¡larri i no)espiro[bi ciclo[3.1.OJhexano-4,1'-ciclopropano]-2,6-dicarboxílico (0.09 g, 292.29 µ?t???) en N,N-dimetilformamida (2 ml_). Se agitó a temperatura ambiente por 1.5 horas bajo nitrógeno. Se apagó con agua y se extrajo con acetato de etilo. Se separaron las capas y se filtraron los orgánicos a través de una frita hidrofóbica antes de la concentración a sequedad para proporcionar el producto crudo (134 mg). Se purificó por cromatografía instantánea eluyendo con acetato de etilo: /'so-hexano (1:99 a 25:75) para dar a aceite claro. Se purificó adicionalmente por cromatografía instantánea eluyendo con acetato de etilo: /so-hexano (1:99 10:90) para proporcionar el producto del título (105 mg, 68%) como un aceite claro. MS (m/z): 514 (M+23).
El siguiente compuesto se preparó esencialmente por el método de la preparación 22.
Ejemplo 1 clorhidrato del ácido (7S,2S,5f?,6S)-2-Aminoespiro[biciclo[3.1.0]h 4,1'-ciclopropano]-2,6-dicarboxílico Se cargó un ReactiVial de 5 mL con (1 S,2S,5R,6S)-2-(ter- butoxicarbonilamino)espiro[biciclo[3.1 ,0]hexano-4, 1 '-ciclopropano]-2,6- dicarboxilato de o7fer-butilo (55 mg, 129.8 pmol). A esto se agregó una solución de ácido clorhídrico acuoso 5N (3 mL; 20.8 mmol) y 1,4-dioxano (1 mL). Se agitó la mezcla a 90°C por una hora. Se selló el ReactiVial y la agitación se continúo a 90°C por 3 horas. Se enfrió a temperatura ambiente y se dejó reposar por 3 días. Se concentró bajo presión reducida a un sólido oscuro. Se preparó un cartucho HLB Waters (1 g) Oasis® con lavado de 2 volúmenes en columna de metanol, seguido por 6 volúmenes en columna de agua. Se disolvió lo sólido oscuro en agua y se cargó en el cartucho. Se lavó el cartucho con agua (2 volúmenes en columna) y se recolectó el eluyente. Se liofilizó la solución para proporcionar compuesto del título (16.1 mg, 65 µ????). MS (m/z): 212 (M + 1). 1H NMR (D20) d 0.45 (m, 1H), 0.53 (m, 1H), 0.64 (m, 1H), 0.74 (m, 1H), 1.72-1.78 (m, 2H) 1.86 (d, J= 4.2 Hz, 1H), 2.07 (m, 1H), 2.37 (m, 1H).
Ejemplo 2 ácido ( 1 S, 2S, 5R, 6S)-2-Aminoespiro[biciclo[3.1.0]hexano-4, 1 '- ciclopropano]-2,6-dicarboxílico Se agregó hidróxido de sodio 2 (11.5 mL, 23.1 mmol) con (7S,2S,5fí,6S)-2-acetamidoesp¡ro[bic¡clo[3.1.0]hexano-4, 1 '-ciclopropano]-2,6-dicarboxilato de dietilo (1.19 g, 3.8 mmol). Bajo calentamiento adicional de la mezcla de reacción a reflujo bajo un blanco de nitrógeno. Después de 21 horas se agregó exceso de hidróxido de sodio 2M (5.8 mL, 11.5 mmol) y se reanudo el calentamiento por 120 horas. Se purificó por cromatografía de intercambio catiónico (Dowex™ 50X8-100) como sigue. Se filtró cualquier partícula insoluble y enjuagó con agua de grado HPLC. Se concentró la solución a la mitad. Se cargó la solución en la resina, dejando que fluya a través de la columna a una velocidad de goteo de aproximadamente 1 gota cada 1-2 segundos. Después que el volumen de carga inicial ha goteado a la superficie de resina, se enjuagó la resina con agua de grado HPLC (~ 1 a 2 volúmenes en columna) y repetición 3 veces. Se monitoreó el pH del eluyente se consiguió enjuagar con Agua de grado HPLC hasta que se completó la aplicación (regreso de pH nuevamente a pH=7.). Una vez que el ciclo de pH completo se ha observado y el efluente ha regresado a pH=7, se lavó la columna con al menos un volumen de columna cada una de Agua de grado HPLC, Agua de grado HPLC: tetrahidrofurano (1:1), después Agua de grado HPLC. Se desplazó el producto de la resina con 10% de piridina: Agua de grado HPLC y se continuó la elución con 10% de piridina: Agua de grado HPLC hasta que no se detectó producto adicional por TLC. Se combinaron las fracciones que contienen el material deseado, se concentraron a sequedad para dar un sólido blanco. Se secó por congelamiento para proporcionar el compuesto del título (795 mg, 3.8 mmol). MS (m/z): 212 (M + 1). 1H NMR (D20 + 5% d5-piridina) d 0.38 (m, 1H), 0.45 (m, 1H), 0.55 (m, 1H), 0.69 (m, 1H), 1.50 (dd, =2.9 Hz, 1H), 1.62 (d, J=13.7 Hz, 1H), 1.78 (m, 2H), 2.11 (dd, J=2.9 Hz, 1H).
Ejemplo 3 ácido (1S,2S,5R,6S)-2-[[(2S)-2-Aminopropanol]amino]espiro[biciclo[3.1.0]hexano-4, 1'-ciclopropano]-2,6- dicarboxilico; 1,4-dioxano (1: 0.5); clorhidrato Se agregó una solución de cloruro de hidrógeno 4M en 1,4-dioxano (1.57 mL, 6.3 mmol) a una suspensión agitada de ácido (1S,2S, 5fi,6S)-2-[[(2S)-2-(/er-butoxicarbonilamino) propanol]amino]espiro[biciclo[3.1.0]hexano-4,1 '-ciclopro ano]-2,6-dicarboxílico (0.16 g, 418.4 µ mol) en 1,4-dioxano (1.6 mL) a temperatura ambiente bajo nitrógeno. Después de 16 horas se filtró un sólido blanco, se lavó con 1,4-dioxano, se secó a vacío a 60°C durante la noche para proporcionar el compuesto del título (0.14 g): MS (m/z): 283 (M + 1). 1H NMR (D20) d 0.46 (m, 1H), 0.65 (m, 1H), 1.47 (d, J=7 Hz, 3H), 1.70 (dd, J=2.7 Hz, 1H), 1.81 (q, J=15 Hz, 2H), 1.87 (amplio t, J=2.7 y 2.9 Hz, 1H), 2.65 (dd, J=2.7 y 2.9 Hz, 1H), 3.68 (s, 4H), 4.00 (q, J= 7 Hz, 1H), 4.70 (m, 2H). emplo 4 ácido (1S,2S,5R,6S)-2-[[(2S)-2- Aminopropanol]amino]espiro[biciclo[3.1.0] hexano-4, 1 '-ciclopropano]- 2,6-dicarboxílico Se agregó ácido clorhídrico concentrado (36.94 mL, 430.11 mmol) a una solución de ácido (1 S,2S,5R,6S)-2-[[(2S)-2-(ter-butoxicarbonilamino)propanol]amino] espiro[biciclo[3.1.0]hexano-4, 1 '-ciclopropano]-2,6-dicarboxílico (82.24 g, 215.06 mmol) en acetona (822.4 mL), y se agitó la mezcla a 50°C. Después de 1.5 horas se enfrió la mezcla a 0°C y se agregó 50% de hidróxido de sodio en agua a pH=3.6-3.8. Se agitó el sólido obtenido por 1 hora, se filtró y se lavó con agua. Se secó bajo vacío por 48 horas para proporcionar el compuesto del título como un sólido blanco (36 g, 127.53 mmol). MS (m/z): 283 (M + 1).
Ejemplo 5 clorhidrato del ácido {1 S,2S,5R,6S)-2-[[(2S)-2- Aminopropanoil]amino]espiro[biciclo[3.1.0] hexano-4,1 '-ciclo propano]- 2,6-dicarboxílico Se agregó cloruro de hidrógeno 4M en 1,4-dioxano (20 ml_, 80 mmol) a una suspensión agitada de ácido (1 S,2S,5R,6S)-2-[[(2S)-2-(fer-butoxicarboni lamino) propanoil]amino]espiro[biciclo[3.1.0]hexano-4,1'-c¡clopropano]-2,6-dicarboxílico (2.06 g, 5.4 mmol) en 1,4-dioxano (21 ml_) a temperatura ambiente bajo nitrógeno. Se sónico la mezcla de reacción algunos minutos y después se mantuvo agitando 16 horas. Se filtró el sólido, se lavó con 1,4-dioxano, se secó a vacío a 60°C por 6 horas para dar 2.2 g de sólido blanco. Se disolvió nuevamente el material en agua de grado HPLC (20 ml_), se filtró para remover algunas partículas insolubles y secó por congelamiento lo filtrado para proporcionar compuesto del título (1.51 g, 4.75 mmol). MS (m/z): 283 (M + 1). 1H NMR (D20) d 0.46 (m, 1H), 0.65 (m, 1H), 1.46 (d, J=7.1 Hz, 3H), 1.69 (dd, J=2.9 Hz, 1H), 1.81 (q, J=14.3 Hz, 2H), 1.87 (amplío t, J= 2.9 Hz, 1H), 2.65 (dd, J= 2.9 Hz, 1H), 4.00 (q, J= 7.02 Hz, 1H), 4.70 (m, 2H).
Los siguientes compuestos se prepararon esencialmente por el método del Ejemplo 4.
Ejemplo 8 clorhidrato de ( 1 S, 2S, 5R, 6S)-2-aminoespiro[biciclo[3.1.0]hexano-4, ciclopropano]-2,6-dicarboxilato de dibencilo; 1,4-dioxano; Se agregó cloruro de hidrógeno 4M en 1,4-dioxano (493.30 µ?_, 1.97 mmol) a una suspensión agitada de (7 S,2S,5R,6S)-2-(ter-butoxicarbonilamino)espiro[biciclo[3.1.0]hexano-4,1'-ciclopropano]-2,6- dicarboxilato de dibencilo (0.1 g, 0.2 mmol) en 1,4-dioxano (970 µ?.) a temperatura ambiente bajo nitrógeno y se agitó por 20 horas. Se agregó solución en exceso de cloruro de hidrógeno 4 en 1,4-dioxano (493.30 µ?, 1.97 mmol) y se calentó a 80°C. Se concentró a sequedad, trituró con acetonitrilo y secó por congelamiento la suspensión para dar el compuesto del título como un sólido blanco (89.9 mg, 88%) como un aducto (1:1) con 1,4-dioxano. MS (m/z): 392 (M+ ).
Ejemplo 9 clorhidrato de Bis[(2-fluorofenil)metil](íS,2S,5R,6S)-2- aminoespiro[biciclo[3.1.0]hexano-4, 1 '-ciclopropano]-2,6-dicarboxilato Se agregó en 1,4-dioxano (4.64 mL, 18.58 mmol) a una solución agitada de bis[(2-fluorofenil)metil]( 1 S,2S,5R, 6S)-2-(ter-butoxicarbonilamino)espiro[biciclo[3.1.0]hexano-4,1'-ciclopropano]-2,6-dicarboxilato (0.98 g, 1.86 mmol) en 1,4-dioxano (4.64 mL) a temperatura ambiente bajo nitrógeno y se agitó la solución por 20 horas. Se concentró in vacuo para dar un aceite (0.93 g). Se disolvió en una mezcla de acetonitrilo (10 mL), agua (30 mL) y se secó por congelamiento durante el fin de semana para dar un sólido blanco (820 mg) como una mezcla de compuesto del título contaminado con ácido (1S,2S,5R,6S)-2-a \no-2-[{2-fluorofenil)methoxicarbonil]espiro[b¡c¡clo[3.1.0]hexano-4,1'-ciclopropano]-6-carboxílico (-7-10%). MS (m/z): 320 (M+H). Se disolvió el sólido blanco en acetonitrilo (8 mL) para proporcionar una solución translúcida. Se permitió reposar por 1 hora, antes de la filtración. Se concentró lo filtrado in vacuo para proporcionar una espuma viscosa. Se disolvió nuevamente en acetato de etilo, se lavó con una solución saturada de carbonato hidrógeno de sodio, se secó sobre sulfato de magnesio, se filtró y concentró in vacuo para proporcionar 774 mg. Se disolvió nuevamente en éter dietílico (11 mL), se agregó cloruro de hidrógeno 1M en éter dietílico (1.86 mL, 1.86 mmol), se concentró in vacuo para proporcionar una espuma blanca sólida. Se secó además durante la noche in vacuo a 50°C para proporcionar el compuesto del título (0.74 g, 85%). MS (m/z): 428 (M+1), 450 (M+23).
Ejemplo 10 Dihidrato de ácido (1 S,2S,5R,6S)-2-[[(2S)-2- Aminopropanoil]amino]espiro[biciclo[3.1.0] hexano-4, 1 '-ciclopropano]- 2,6-dicarboxílico Etapa 1: clorhidrato de (1 S,2S,5R, 6R)-2-amino-4-oxo- biciclo[3.1.0]hexano-2,6-dicarbox¡lato de dietilo Bajo una atmósfera de nitrógeno, se agregó cloruro de acetilo (86.5 mL, 1.2 mol) a etanol absoluto (1.0 L, 17.2 mol) por goteo mientras se mantiene la temperatura de reacción interna por debajo de 30 °C. Se agitó la mezcla resultante por 15 minutos y se agregó ( 1 S,2S,5R, 6f?)-2-(fer-butoxicarbonilamino)-4-oxo-biciclo[3.1.0]hexano- 2,6-dicarboxilato de d/'-í-buti lo (100 g, 0.24 mol) en una porción. Se calentó la mezcla resultante a reflujo por 16-20 horas. Se concentró la mezcla de reacción a un aceite bajo presión reducida. Se disolvió el producto crudo en cloruro de metileno (250 mL) y se concentró in vacuo. Se repitió el proceso de concentración/cloruro de metileno para proporcionar una espuma blanca. Se agregó acetato de etilo (150 mL) y se calentó la mezcla a 65 °C. Se agregó t-butil éter metílico (100 mL) y se agitó la mezcla a 65 °C por 15 minutos. Se agregó t-butil éter metílico (300 mL) durante 15 minutos, se agitó a 65 °C por 15 minutos, después se cerró el calor y se permitió que la suspensión se enfriara a temperatura ambiente. Se filtró la mezcla y se lavó la torta de filtro con t-butil éter metílico (150 mL). Se transfirió la torta a un horno de vacío y se secó durante la noche a 25 °C para proporcionar el producto crudo (67.5 g). Se transfirieron los sólidos a un matraz de fondo redondo, se diluyó con acetato de etilo (170 mL) y se calentó la mezcla a 65 °C. Se agitó la mezcla por 1 hora, se agregó tetrahidrofurano (68 mL) y etanol (3 mL). Se cerró la fuente de calor y se agregó t-butil éter metílico (272 mL) durante 20 minutos, se dejó enfriar la mezcla a temperatura ambiente. Se filtró la suspensión, se lavó la torta con 95/5 de t-butil éter metílico/acetato de etilo (2 x 75 mL) y además se secaron los sólidos en un horno a vacío durante la noche a 25 °C para proporcionar el compuesto del título como un sólido blanco (60. Og, 98.0%). MS (m/z): 256 (M+1).
Etapa 2: (7S,2S,5R,6R)-2-benciloxicarbonilamino-4-oxo-biciclo[3.1.0]hexano-2,6-dicarboxilato de dietilo Se suspendió (íS,2S,5R,6f?)-2-amino-4-oxo-biciclo[3.1 0]hexano-2,6-dicarboxilato-clorhidrato de dietilo (55.0 g, 188.5 mmol) en tetrahidrofurano (220 mL), entonces se agregó agua (220 mL) y carbonato de potasio (92.1 g, 659.9 mmol). Se agitó la mezcla resultante por 30 minutos. Se agregó cloroformiato de bencilo (26.7 mL, 175.3 mmol) a la mezcla durante 45 minutos, se mantuvo la temperatura de reacción por debajo de 25 °C. Se agitó la mezcla de reacción por 30 minutos, después se diluyó con acetato de etilo (550 mL) y agua (275 mL). Se separaron las fases y nuevamente se extrajo la capa acuosa con acetato de etilo (250 mL). Se combinaron los orgánicos y se lavaron secuencialmente con HCI acuoso (0.5N, 100 mL), NaHC03 saturado (100 mL) y salmuera (100 mL). Se secó la solución orgánica sobre Na2S04, se filtró y concentró in vacuo para proporcionar el compuesto del título como un aceite claro (67.6 g, 92.1%). 1H NMR (CDCI3) d 1.24-1.26 (m, 6H), 2.36 (bs, 1H), 2.47(dd, 1H), 2.78 (dd, 1H), 2.90 (dd, 1H), 4.09-4.19 (m, 4H), 5.08 (s, 2H), 5.73 (s, 1H), 7.24-7.36 (m, 5H).
Etapa 3: (7S,2S,5f?,6S)-2-benciloxicarbonilamino-4-metilen-biciclo[3.1.0]hexano-2,6-dicarboxilato de dietilo Bajo una atmósfera de nitrógeno, se combinó bromuro de metil-trifenilfosfonio (67.4 g, 184.9 mmol) y tetrahidrofurano (300 mL) con agitación. Se agregó una solución de rer-butóxido de potasio (1M) en tetrahidrofurano, 184.9 mL, 184.9 mmol) a la mezcla de reacción durante 15 minutos y se agitó la suspensión resultante a temperatura ambiente por 3 horas. Se disolvió {1 S,2S,5R,6R)-2-benciloxicarbonilamino-4-oxo-biciclo[3.1.0]hexano-2,6-dicarboxilato de dietilo (12.3 kg, 31.6 mol) en tetrahidrofurano (120 mL) y se agregó a la mezcla de reacción durante 1 hora, manteniendo la temperatura de reacción por debajo de 30 °C. Se agitó la suspensión resultante durante la noche a temperatura ambiente, después se diluyó con acetato de etilo (600 mL) y se apagó con agua (300 mL). Después de la agitación de la mezcla bifásica por 30 minutos, se separaron las capas y se lavaron los orgánicos con agua (300 mL) seguido por 0.25M HCI (300 mL). Se secaron los orgánicos sobre Na2S04, filtraron, y se concentró in vacuo (45 °C) para proporcionar el producto crudo como un aceite oscuro (111.0 g). Se purificó el material por cromatografía de obturador de gel de sílice (1 Kg Kieselgel-60, 4 L 15% de EtOAc en heptanos, después 10 L 30% de EtOAc en heptanos) para proporcionar el compuesto del título como un aceite claro (37.3 g, 87.9% potencia, 54.9%). MS (m/z): 388 (M + 1).
Etapa 4: (1 S,2S,5R,6S)-2-benciloxicarbonilaminoespiro[biciclo[3.1.0]hexano-4, 1 '-ciclopropano]-2,6-dicarboxilato de dietilo A un matraz de reacción enchaquetado conectado a una unidad enfriadora, se agregó solución de dietilzinc (157.2 mL, 157.2 mmol, 1M en heptanos) bajo una atmósfera de nitrógeno. Se enfrió la solución a -15 °C y se diluyó con dicloroetano seco (157.2 mL) frío (-15 °C). Se disolvió ácido trifluoroacético (11.1 mL, 146.7 mmol) en dicloroetano (11.1 mL) y se agregó al recipiente de reacción durante 50 minutos, se mantuvo la presión interna por debajo de -10 °C. Se agitó la suspensión resultante de -10 a -15 °C por 30 minutos. Se disolvió diyodometano (12.7 mL, 42.1 g, 157.2 mmol) en dicloroetano (12.7 mL) y se agregó a la mezcla de reacción durante 50 minutos, se mantuvo la presión interna por debajo de -10 °C. Se agitó la suspensión blanca resultante, delgada de -10 a -15 °C por 30 minutos. Se disolvió (1 S,2S,5R,6S)-2-benciloxicarbonilamino-4-metilen-biciclo[3.1.OJhexano-2,6-dicarboxilato de dietilo (20.3 g, 87.9% potencia, 46.0 mmol) en dicloroetano (30.4 mL) y se agregó a la mezcla de reacción durante 10 minutos, se mantuvo la presión interna por debajo de -10 °C. Se agitó la solución amarillo pálida, clara de -10 °C por 5 minutos y monitoreó para exotermas latentes. Se cambio el punto de ajuste en el enfriador a 0 °C y se agitó la mezcla de reacción a tal temperatura por 48 horas. Se apagó la mezcla de reacción por adición de HCI 5N (62.9 mL, 314.4 mmol) durante 15 minutos, se mantuvo la presión interna por debajo de 6 °C. Se agitó la mezcla resultante a 0-5 °C por 20 minutos, después se transfirió a un embudo y se separaron las capas. Se lavó la capa orgánica con HCI 1N (2 x 50 mL) seguido por 1:1 de NaHC03 saturado/H20 (60 mL), 1:1 de Na2C03 saturado/H20 (60 mL) y agua (50 mL). Se secaron los orgánicos sobre Na2S04 y se concentraron in vacuo para proporcionar el compuesto del título como un aceite amarillo pálido (19.6 g, 60.3% potente, 63.9% de rendimiento corregido). ?? NMR (DMSO-d6) d 0.37 (m, 2H), 0.52-0.55 (dm, 2H), 1.13-1.17 (m, 6H), 1.49-1.50 (m, 1H), 1.51-1.56 (m, 1H), 1.60-1.79 (m, 2H), 3.97-4.10 (m, 5H), 5.00 (s, 2H), 7.29-7.34 (m, 5H), 8.04 (s, 1H).
Etapa 5: (7S,2S,5R,6S)-2-aminoespiro[biciclo[3.1.0]hexano-4,1'-ciclopropano]-2,6-dicarboxilato clorhidrato de dietilo HCI Se cargó etanol absoluto (100 mL, 10 volúmenes), concentrado. HCI (2.1 mL, 1.0 N) y ( s,2S,5R,6S)-2-benciloxicarbonilaminoespiro[biciclo[3.1.0]hexano-4,1'-ciclopropano]-2,6-dicarboxilato de dietilo (9-79. 24 6 mmol) a un reactor de HEL seguido por Pd negro (3.9 g, 40 % en peso). Se purgó el reactor tres veces con nitrógeno seguido por tres purgas de hidrógeno y presurización a 40 psi de hidrógeno. Se permitió que la reacción se agitara entre 20-30°C por al menos dos horas hasta la terminación de la reacción monitoreada por HPLC. Se filtró la suspensión resultante a través de una almohadilla de Hyflo Super Cel® y se lavó la torta húmeda con etanol absoluto (2 x 30 mL, 3 volúmenes). Se transfirió lo filtrado a un reactor limpio y desplazó el etanol con acetato de isopropilo por aproximadamente 5 volúmenes con base en el rendimiento del producto in situ de la curva de calibración. Se enfrió la suspensión resultante a 0-5°C durante al menos 3 horas. Se filtró la suspensión resultante y se lavó la torta húmeda lavada con acetato de isopropilo frío (3 x 5 mL, 0.5 volúmenes). Se secó bajo presión reducida a 30°C por al menos 12 horas para proporcionar el compuesto del título (4.66 g, 15.34 mmol. 63.5%) 1H NMR (DMSO-d6, 400 MHz): d 8.84 (s, 3H), 4.31-4.15 (m, 2H), 4.03 (q, J = 7.0, 2H), 2.42 (dd, J = 3.1, 2.6, 1H), 2.24 (dd, J = 6.2, 2.6, 1H), 1.94 (d, J = 14.1, 1H), 1.68 (d, J = 14.1, 1H), 1.63 (dd, J = 6.6, 3.1, 1H), 1.25 (t, J = 7.0, 3H), 1.17 (t, J = 7.0, 3H), 0.77-0.71 (m, 1H), 0.65-0.59 (m, 1H), 0.56-0.51 (m, 1H), 0.50-0.44 (m, 1H).
Etapa 6: (1 S,2S,5R,6S)-2-[[(2S)-2-(ter-butoxicarbonilamino)propanoil]amino]espiro[biciclo[3.1.0]hexano-4,1 '-ciclopropano]-2,6-dicarboxilato de dietilo Se cargó tetrahidrofurano (45 mL, 10 volúmenes) y ácido (2S)-2-(ter-butoxicarbonilamino)propano¡co (3.4 g, 1.2 equivalentes) a un reactor seguido por /V-metilmorfolina (1.96 mL, 1.2 equivalentes) y 2-cloro-4,6-dimethoxi-1 ,3,5-triazina (3.12 g, 1.2 equivalentes). Se agitó la suspensión delgada resultante entre 20-25°C por al menos 3 horas hasta que la reacción es completa por HPLC. Se cargó clorhidrato de (1 S,2S,5R,6S)-2-aminoespiro[biciclo[3.1.0]hexano-4,1 '-ciclopropano]-2,6-dicarboxilato de dietilo (4.55 g, 14.81 mmol) en una porción entre 20-25°C seguido por /V-metilmorfolina (1.63 ml_, 1.0 equivalentes) durante al menos 10 minutos se mantuvo la temperatura entre 20-25°C. Se agitó la suspensión resultante entre 20-25°C por al menos 2 horas hasta que la reacción se completa por HPLC. Se filtraron los sólidos resultantes y se lavó la torta húmeda con tetrahidrofurano (2 x 10 mL, 2.2 volúmenes) para proporcionar el compuesto del título asumiendo 100% de rendimiento. Se usó la solución ámbar pálida de tetrahidrofurano del compuesto del título sin purificación adicional asumiendo un 100% de rendimiento. 1H NMR (DMSO-cf6, 400 MHz): d 8.46 (s, 1H), 6.72 (d, J = 7.9, 1H), 4.08-3.92 (m, 5H), 2.42-2.37 (m, 1H), 1.81-1.64 (m, 3H), 1.47 (dd, J = 6.6, 3.1, 1H), 1.34 (s, 9H), 1.18-1.08 (m, 9H), 0.66-0.59 (m, 1H), 0.57-0.52 (m, 1H), 0.46-0.36 (m, 2H).
Etapa 7: ácido (1 S,2S,5R,6S)-2-[[(2S)-2-(ter- Butoxicarbonilamino)propanoil]amino] espiro[biciclo[3.1 ,0]hexano-4, 1 '-ciclopropano]-2,6-dicarboxílico Se cargó NaOH 2 N (37 ml_, 5.0 equivalentes) y (1S,2S,5R,6S)-2-[[(2S)-2-(ter-butoxicarbonilamino)propanoil]amino]espiro[biciclo[3.1.0]hexano-4,1 '-ciclopropano]-2,6-dicarboxilato de dietilo (6.50 g, 14.81 mmol) a un reactor y se permitió agitar por al menos 12 horas entre 20-30°C hasta que la reacción se completa por HPLC. Se transfirió la reacción a un embudo separador y se permitió que sedimentara por al menos 10 minutos. Se separaron las fases y regresó la capa acuosa inferior al reactor. Se agregó acetato de etilo (90 mL, 13.8 volúmenes) a la mezcla, y después se agregó NaHS04 1N hasta que el pH alcanza 2 a 2.5. Se separaron las capas y se lavó la orgánica con agua (45 mL, 6.9 volúmenes). Se removió el agua en la destilación atmosférica de la fase orgánica con acetato de etilo para remover el agua residual. Se enfrió la suspensión resultante entre 20-30°C durante al menos 2 horas y se dejó granular a tal temperatura por al menos 90 minutos. Se filtraron los sólidos resultantes y se lavó la torta húmeda con acetato de etilo (3 x 15 mL, 2.3 volúmenes). Se secó bajo presión reducida a 45°C para proporcionar el compuesto del título como un sólido blanco (4.45 g, 11.64 mmol, 78.6%) H NMR (D SO-c/6, 400 MHz, 50°C): d 12.01 (s, 2H), 8.22 (s, 1H), 6.49 (bs, 1H), 4.00 (bs, 1H), 2.43 (dd, J = 6.5, 2.8, 1H), 1.83 (d, J = 14.0, 1H), 1.68-1.62 (m, 2H), 1.42 (dd, J = 6.5, 2.8, 1H), 1.36 (s, 9H), 1.15 (d, J = 7.1, 3H), 0.67-0.61 (m, 1H), 0.56-0.51 (m, 1H), 0.46-0.36 (m, 2H).
Etapa 8: dihidrato de ácido (1 S,2S,5R,6S)-2-[[(2S)-2- Aminopropanoil]amino]espiro[biciclo[3.1.0] hexano-4, 1 '-ciclopropano]-2,6-dicarboxilico Se cargó agua (32 ml_, 8 volúmenes) y ácido (1S,2S,5R,6S)-2-[[(2S)-2-(rer-butoxicarbonilamino)propanoil]amino] espiro[biciclo[3.1.0]hexano-4,1'-ciclopropano]-2,6-dicarboxílico (3.99 g, 10.4 mmol) a un reactor seguido por HCI concentrado (1.80 ml_, 2.0 equivalentes) y después se calentó la reacción a 45-55°C hasta que la reacción se completa (monitoreada por HPLC). Se enfrió la mezcla de reacción a 20-30°C y se ajustó el pH a aproximadamente 3.6 con NaOH 5N. Se agregó etanol absoluto (15 ml_, 3.75 volúmenes) durante al menos 30 minutos entre 20-30°C a la suspensión resultante. Se permitió que la suspensión resultante granulara entre 20-30°C por al menos 12 horas. Se enfrió la mezcla entre -5-5°C y se permitió que granulara por al menos 60 minutos. Se filtraron los sólidos resultantes y se lavó la torta con 30% de etanol absoluto en agua (2 x 9 mL, 2.25 volúmenes). Se secaron los sólidos bajo presión reducida a 35°C por al menos 12 horas, y después se permitió que los sólidos resultantes permanecieran en el balance hasta que no hay cambio de peso adicional por al menos 2 horas para proporcionar el compuesto del título como un sólido blanco (2.71 g, 8.51 mmol, 81.6%). 1H NMR (D20, 400 MHz): d 3.90 (q, J = 7.2, 1H), 2.56 (dd, J = 6.5, 2.9, 1H), 1.74-1.66 (m, 2H), 1.62-1.54 (m, 2H), 1.39 (d, J = 7.1, 3H), 0.61-0.56 (m, 1H), 0.55-0.49 (m, 1H), 0.40-0.30 (m, 2H).
Los patrones de difracción en polvo de rayos-X (XRD) de sólidos cristalinos se obtienen en un difractrometro de polvo de rayos-X Bruker D4 Endeavor, equipado con una fuente CuKa (? = 1.54060 A) y un detector Vantec, que opera a 35 kV y 50 mA. La muestra es barrida entre 4 y 40° en 2T, con un tamaño de etapa de 0.0087° en 2T y una velocidad de barrido de 0.5 segundos/etapa, y con divergencia de 0.6 mm, anti-dispersor fijo de 5.28 mm, y ranuras detectoras de 9.5 mm. El polvo seco es envasado en un retenedor de muestra de cuarzo y se obtiene una superficie lisa usando una laminilla de vidrio. Los patrones de difracción se ajustaron con base en picos estándares NIST 675 a 8.85 y 26.77 grados 2-theta. Es bien conocido en la técnica de cristalografía que, para cualquier forma de cristal dada, las intensidades relativas de los picos de difracción pueden variar debido a la orientación preferida que resulta de factores, tales como hábito de cristal, y las posiciones pico angulares pueden variar ligeramente. Por ejemplo, las posiciones pico pueden cambiar debido a una variación en la temperatura o humedad en la cual una muestra es analizada, desplazamiento de muestra. En el presente caso, una variabilidad de posición pico de ± 0.2 en 2T tomará en consideración estas variaciones potenciales sin obstaculizar la identificación inequívoca de la forma de cristal indicada. La confirmación de una forma de cristal puede hacerse con base en cualquier combinación única de picos distinguibles (en unidades de 0 2T), típicamente los picos más prominentes. Los patrones de difracción en forma de cristal son recolectados a temperatura amiente y humedad relativa.
De este modo, una muestra preparada del Ejemplo 10 es caracterizada por un patrón de XRD usando radiación de CuK1 ya que tiene picos de difracción (valores 2-theta) como se describe en la Tabla 1 abajo. Específicamente el patrón contiene un pico a 5.20 en combinación con uno o más de los picos seleccionados a partir del grupo que consiste de 1 0.45, 1 1 .70, 1 5.75, 21 .06 y 23.59 con una tolerancia para los ángulos de difracción de 0.2 grados.
Tabla 1 : Picos de difracción en polvo de rayos-X del Ejemplo Los receptores de mGlu son receptores acoplados a la proteína-G que modulan la excitabilidad neuronal. Más particularmente, la neurotransmisión del glutamato alterado ha sido ligada a trastornos neurológicos tales como condiciones de dolor crónico que incluyen dolor persistente, dolor neuropático, dolor inflamatorio crónico, o dolor visceral; trastornos psiquiátricos, tales como esquizofrenia, trastorno bipolar, trastorno de ansiedad generalizada, o trastorno de estrés post-traumático; o trastornos neurodegenerativos.
Puesto que los compuestos de la presente invención son agonistas de mGlu2/3, pueden ser adecuados para tratar las condiciones mencionadas anteriormente.
Ensayo FLI PR Agonista de mGlu2 y mGlu3 humano Líneas de células AV-12, derivadas de fibroblastos de Hámster Sirio y que expresan establemente el receptor mGlu2 o mGlu3 humano y co-transfectadas con el transportador de glutamato de rata EAAT 1 (Transportador de Aminoácido Excitatorio 1 ) y la subunidad Ga15, son usadas para estos estudios. La expresión de Ga1 5 permite a los receptores acoplados a Gi la señal a través de la trayectoria de fosfolipasa C, resultando en la capacidad para medir la activación del receptor por un ensayo fluorométrico de respuesta de calcio. Las líneas celulares son mantenidas por cultivo en Medio de Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM) con alta glucosa y clorhidrato de piridoxina suplementado con 5% de suero bovino fetal dializado, 1 mM de piruvato de sodio, 1 0 mM de H EPES (ácido 4-(2-hidroxietil)-1 -piperazinetansulfónico), 1 mM de L-glutamina, y 5 pg/mL de blasticidina (todos los medios son adquiridos de I nvitrogen). Los cultivos confluentes son pasados cada dos semanas usando una solución de disociación libre de enzima (Chemicon S-004-B). Las células son recolectadas 24 horas previo al ensayo y dispensadas usando una sembradora celular de Matrix Well-Mate a 85,000 (mGlu2) o 115,000 (mGlu3) células por cavidad en placas recubiertas con poli-D-lisina, de pared negra, de 96 cavidades (BD BioCoat #354640) en medio que contiene solamente 250 (mGlu2) o 125 (mGlu3) µ? de L-glutamina (recientemente agregada). Los niveles de calcio intracelular son monitoreados antes y después de la adición de compuestos usando un Lector de Placa de Formación de Imágenes Fluorométricas (FLIPR, Molecular Devices). El amortiguador de ensayo está comprendido de Solución de Sal Amortiguada de Hank (HBSS; Sigma) suplementado con 20 mM de HEPES. El medio es removido y las células son incubadas con 8 µ? de Fluo-3AM (Molecular Probes, F-1241; 50 µ? por cavidad) en amortiguador de ensayo por 90 minutos (mGlu2) ó 120 minutos (mGlu3) a 25°C. La solución de tinte es removida y colocada con amortiguador de ensayo fresco (50 µ? por cavidad). Se conduce un ensayo FLIPR de adición única que genera una curva de respuesta de concentración de 11 puntos (diluciones 3X partiendo a 10uM) para el glutamato agonista (Fisher A125-100) previo a cada experimento para confirmar la respuesta EC50 típica. Los resultados son analizados usando Prism v4.03 (Software GraphPad). Los compuestos de la invención son probados en un ensayo FLIPR de adición única usando un perfil de respuesta de concentración de 10 puntos usando diluciones 3X partiendo a una concentración final de 25 µ?. Los compuestos de la invención son solubilizados como soluciones base de 10 mM en NaOH 0.1N y almacenados a -20C. Son diluidos a través de una serie de dilución de tres partes en amortiguador de ensayo. Después de tomar una lectura fluorescente de 5-segundos inicial en el instrumento FLI PR, un compuesto de la invención es agregado a la placa celular (50 pL por cavidad). Los datos son recolectados cada segundo por los primeros 30 segundos y después cada 3 segundos para un total de 90 segundos para detectar actividad agonista. La respuesta máxima es definida como aquella inducida por ECmax (1 00 µ? de glutamato). El efecto del compuesto es medido como alturas de pico máximas menos mínimas en unidades fluorescentes relativas (RFUs) correlacionadas para fluorescencia basal medida en la ausencia de glutamato. Se llevaron a cabo determinaciones usando las placas individuales. Los efectos agonistas son cuantificados como porcentaje de estimulación inducido por el compuesto solo con relación a la respuesta de glutamato máxima. Todos los datos son calculados como valores EC50 relativos usando un programa de ajuste de curva logística de cuatro parámetros (ActivityBase V5.3.1 .22).
El Ejemplo 2 es medido en el ensayo FLI PR de hmGlu2 corrido sustancialmente como anteriormente para tener un EC50 de 39.0 nM ± 5.9 (n = 3, error calculado como SEM). El Ejemplo 2 es también medido en el ensayo FLIPR de hmGlu3 corrido esencialmente como anteriormente para tener un EC5o de 285 nM ± 52.5 (n = 8, error calculado como SEM). Estos resultados demostraron que el Ejemplo 2 es un agonista mGlu 2 y mGlu3 potente.
Reversión de Dolor persistente Inducido por Inyección de Formalina La administración de formalina en la superficie plantar de la pata trasera de la rata en dos fases de comportamiento nocifensivo (tal como lamer, morder, y estremecimiento de la pata inyectada): una fase temprana que dura aproximadamente los 5 minutos después de la administración de formalina y una fase tardía desde aproximadamente el minuto 10 hasta el minuto 60 después de la inyección de formalina. Un periodo quiescente de aproximadamente el minuto 5 al minuto 10 separa las dos fases. El registro de estos comportamientos inducidos por formalina puede ser automatizado usando cámaras de sobresalto (SR-Lab, San Diego Instruments, San Diego, CA) las cuales detectan movimientos de las ratas por medio de un acelerómetro. Un compuesto de prueba (activo) es dosificado (ruta intraperitoneal) en ratas Sprague-Dawley no ayunadas dentro de un rango de 0.3 - 10 mg/kg 1 horas previo a la inyección de formalina intraplantar. Las ratas son individualmente colocadas en cilindros dentro de las cámaras de prueba para aclimatación. Un compuesto de prueba (profármaco) es oralmente dosificado dentro de un rango de 0.45 - 15 mg/kg, en ratas Sprague-Dawley macho no ayunadas dos horas previo a la inyección de formalina intraplantar. Las ratas son entonces colocadas individualmente en cilindros dentro de las cámaras de prueba para aclimatación. En puntos de tiempo especificados, las ratas son removidas de los cilindros y administradas con formalina (50 µ? de una solución al 5% en salina) subcutáneamente en la superficie plantar de la pata trasera derecha e inmediatamente colocada nuevamente en los cilindros. Los cilindros son posicionados en las celdas de carga del sistema de detección dentro de las cámaras de prueba, de este modo permitiendo ser monitoreada la respuesta continuamente por 60 minutos en recipientes de 1 segundo. El número de eventos nocifensivos [el número de recipientes de 1 segundo con >20 unidades de carga] es totalizado en intervalos de 5 minutos. El umbral de unidad de 20-carga es bastante grande para eliminar la inclusión de eventos fisiológicos normales tales como respiración o inhalación, pero de una magnitud significante para detectar eventos nocifensivos. Los datos son convertidos determinando el número de eventos sobre el umbral (20 unidades de carga) en cada recipiente de tiempo de 1 segundo sobre los 60 minutos de recolección de datos. El registro de la fase temprana es la suma de eventos mayores de 20 unidades de carga del Tiempo 0 a 5 minutos. El registro de fase tardía se obtiene agregando el número total de eventos mayores de 20 unidades de carga desde el Minuto 1 1 al Minuto 40 del periodo de recolección de datos. Los datos de formalina son evaluados por análisis de una vía de varianza (ANOVA) y los contrastes apropiados analizados por la prueba "t" de Dunnett para comparación de dos lados usando el programa de análisis estadístico JMP (v 6.0.2) (SAS I nstitute Inc, Cary, NC). Las diferencias son consideradas por ser significantes si el valor-p es menos de 0.05. Los cálculos de ED50 se realizan usando ajuste de curva de regresión no lineal en porcentaje de reversión de datos transformados para cada dosis.
El Ejemplo 2 es medido en este ensayo, corrido sustancialmente como anteriormente, para tener un ED50 de 0.7 mg/kg (i p.). El Ejemplo 1 0 es medido en este ensayo, corrido sustancialmente como anteriormente , para tener un ED50 de 4.8 mg/kg (p.o . ) . Estos resu ltados demuestran que los compuestos dentro del alcance de la presente invención son medicaciones útiles para dolor persistente.
Reversión de Ligación del Nervio L5/L6 I nducida por Alodinia Táctil La ligación unilateral de nervios q ue inervan la región de la pierna trasera resultará en un dolor persistente crónico manifestado como alodinia tácti l en ratas. Se realiza la l igación del nervio L5/L6 (Kim et al. Pain ( 1 992) 50, 355-363) . La lesión neuropática es producida ligando apretadamente los nervios espinales izquierdos L5 y L6 bajo anestesia gaseosa con una mezcla de isoflurano (3% para inducción y 2% para mantenim iento) y oxígeno. Después de un m ínimo de 14 d ías después de la cirugía , la alod inia táctil es eval uada m idiendo la sensibilidad táctil de la pata lesionada a filamentos von Frey con fuerzas de flexión increméntales (0.3 a 1 5 g) (Chaplan et al. J. of Neuroscience Methods ( 1 994) 53 , 55-63) . Las ratas son consideradas por ser hipersensitivas cuando demuestran alodinia táctil (retiro de la pata en respuesta a la apl icación de una fuerza de flexión de menos de 2 gramos) . Los valores de l ínea base son determinados inmediatamente previo a la valoración del compuesto de prueba . Un compuesto de prueba (profármaco) es dosificado oralmente a 1 5 mg/kg y el umbral táctil para el retiro de la pata se m ide a 1 , 2 y 4 horas posteriores a la dosificación. Los datos son expresados como umbral de respuesta en gramos (g) y los valores con errores estándares de medias (+SE media) para cada punto de tiem po. Los datos son analizados usando un análisis de varianza seguido por análisis post-hoc de Dunnett y representan un cambio absoluto en el umbral de dolor (Cmax = Respuesta de línea base máxima) y expresado como Media [log (respuesta máxima) - registro de predosis log)] (g).
El Ejemplo 10 dosificado oralmente a 15 mg/kg (en donde n=8; error calculado como SEM) es medido en este ensayo, corrido sustancialmente como anteriormente, para tener umbral mecánico significantemente incrementado a una, dos y cuatro horas: 9.06 ± 2.26, 12.31 ± 1.86 y 8.63 ± 1.98, respectivamente, comparado con los valores correspondientes después del tratamiento con vehículo: 1.50 ± 0.60, 1.34 ± 0.75, y 2.35 ± 0.62 a una, dos y cuatro horas respectivamente. Estos resultados demuestran que los compuestos dentro del alcance de la presente invención son medicaciones útiles para condiciones de dolor neuropático.
Reversión de Hiperalgesia Mecánica Inducida por CFA La inducción de inflamación local en la pata trasera de la rata causará una hiperalgesia mecánica persistente que puede ser medida determinando el umbral al estímulo de presión para dar una respuesta dolorosa. El método para hiperalgesia mecánica inducida por adyuvante Freund completo (CFA) en ratas es ampliamente descrito ladarola et al. Brain Res. (1988) 455, 205-212. Las ratas son colocadas bajo anestesia de isoflurano mientras la pata derecha es inyectada con 50 µ? de CFA (Sigma C5881, 1 mg/ml de extracto de micobateria en 85% de aceite de parafina, 15% de monoleato de manuro) intraplantar. Los animales son dejados recuperar en jaulas de lecho blando y los cambios de hiperalgesia mecánica medidos 24 horas post-inyección de CFA. La hiperalgesia mecánica (Prueba de Randall Sellito) es determinada restringiendo suavemente a la rata y colocando la pata entre el plinto y empujador (medidor Ugo Basile Analgesy). La fuerza en gramos cuando el animal retira la pata es registrada. Una fuerza máxima de no más de 250 gramos es aplicada y si la rata no retira la pata, se registra un valor de 250 gramos.
Las ratas son probadas por respuesta a línea base previo a la inyección de CFA. La respuesta post-CFA es probada la siguiente mañana (aproximadamente 24 horas post-inyección de CFA). Las ratas son aleatorizadas con base en la respuesta post-CFA con cualquier rata que muestra un registro de > 1 50 gramos excluida de pruebas adicionales. Un compuesto de prueba (profármaco) es oralmente dosificado dentro de un rango de 1 .5 a 1 5 mg/kg y el umbral mecánico para el retiro de pata es medido a 1 y 2 horas post-dosificación. La significancia estadística es definida como un valor p < 0.05 en un análisis de covarianza seguido por prueba post-hoc de Dunnett para cada punto de tiem po. La Tabla 2 abajo proporciona los resultados estadísticamente significantes para el Ejemplo 10 corrido sustancialmente como anteriormente. Estos resultados demuestran que los compuestos dentro del alcance de la presente invención son medicaciones útiles para condiciones de dolor inflamatorio crónico tales como osteoartritis o artritis reumatoide.
Tabla 2 Los valores son la media ± SE para un N = 8-1 0 por grupo. * valor p < 0.05 vs. Veh ículo al m ismo punto de tiempo (ANOVA y prueba t de Dunnett) Reversión de Com portamientos de Dolor I nducidos por Distensión Colorrectal El dolor visceral en ratas puede ser inducido por distensión de la cavidad colorrectal y dolor monitoreado accesando a la contracción reflejo de los músculos abdomina les. La medición de contracciones reflejo del m úsculo abdominal con dolor causado por distensión colorrectal en la rata es realizada sustancialmente como se describe por Fioramonti ef al. Neurogastroenterology and Motility (2003) 1 5, 363-369 y Urban ef al. J. of Pharmacology and Exp. Ther. ( 1 999) 290, 207-21 3.
Ratas macho Sprague Dawley son quirúrgicamente implantadas con electrodos electromiográficos (EMG) en el músculo abdominal oblicuo y dejadas recuperar por una semana, durante la cual los animales son aclimatados al manejo y restricción parcial para minimizar los efectos de estrés. Las mediciones de EMG de línea base son recolectadas y registradas después de la inserción en el recto (8 cm) de un balón de látex lubricado unido a un monitor de presión/regulador con el paso de la presión entre 20, 40, y 60 mm de Hg por una duración de 20 segundos con un periodo de reposo de 3 minutos entre ensayos. Una serie de tres exposiciones en cada presión es registrada antes de pasar la presión al siguiente nivel. Los datos son recolectados como el área bajo la curva para lecturas de EMG (pvolts por segundo) durante las estimulaciones de presión, y promediados durante los tres ensayos. Un compuesto de prueba (profármaco) es oralmente dosificado dentro de un rango de 1 .5 a 1 7 mg/kg 90 minutos previo al comienzo de la distensión colorrectal. La significancia estadística es definida como un valor p < 0.05 en un análisis de covarianza seguido por una prueba post-hoc de Dunnett. La Tabla 3 abajo proporciona los resultados estadísticamente significantes para el Ejemplo 10 corrido sustancialmente como anteriormente. Estos resultados demuestran que los compuestos dentro del alcance de la presente invención son medicaciones útiles para condiciones de dolor visceral.
Tabla 3 Los valores son la media ± SEM para un N = 8-16 por grupo. * valor p < 0.05 vs. Veh ículo al mismo punto de tiempo (ANOVA y prueba t de Dunnett) Reversión de Actividad Hiperlocomotora Inducida por Fenciclidina (PCP) en Ratas La administración de agonistas del receptor NMDA, tales como cetamina o fenciclidina (PCP), produce efectos similares psicotomiméticos en humanos que son similares a aquellos síntomas observados en pacientes con esquizofrenia. La capacidad de los agentes para revertir los efectos estimulantes locomotores de antagonistas de NMDA son a menudo usados como un modelo animal de psicosis, demostrando buena validez predictiva para detectar eficacia clínica de medicaciones para esquizofrenia y trastorno bipolar.
La actividad motora es monitoreada colocando ratas macho Sprague-Dawley individuales (Harían, Indianápolis, I N) en jaulas de cajas de zapato de plástico, transparentes, de las dimensiones 45 x 25 x 20cm , con 1 cm de profundidad de virutas de madera como cama, y una rejilla de metal en la parte superior de la jaula. Los monitores motores (Kinder Scientific) consisten de un bastidor rectangular de 1 2 fotohaces arreglados en una formación 8 x 4, (o una agrupamiento de alta densidad de 22 en un patrón 1 5x7) a una altura de 5 cm, con un segundo bastidor (para medir los comportamientos de crianza) a una altura de 1 5 cm . La jaula de caja de zapatos es colocada dentro de estos bastidores, con los bastidores en la parte superior de la mesa de 91 cms (3 pies) de alto en un cuarto aislado. U n compuesto de la invención (activo) es dosificado (ruta intraperitoneal) dentro de un rango de 0.3 - 10 mg/kg, 30 minutos previo a una dosis de estimulación de 5 mg/kg de feniciclidina (PCP). Un compuesto de la invención (profármaco) es oralmente dosificado dentro de un intervalo de 0.3 - 30 mg/kg , en ratas ayunadas durante la noche, 4 horas previo a una dosis de estimulación de 5 mg/kg de PCP. En el día de la prueba, las ratas son colocadas en la jaula de prueba y dejadas para aclimatarse por 30 minutos previo a la estimulación de PCP; las ratas son monitoreadas por unos 60 minutos adicionales después de la administración de PCP.
Los análisis de datos y cálculos de ED50 se conducen usando GraphPad Prism (San Diego, CA. USA). Los análisis de potencia han determinado que 8-1 0 ratas por grupo son necesarias para tener una potencia estadística apropiada para detectar diferencias de tratamiento (potencia = 0.8). Un análisis de varianza de una vía (ANOVA) con una prueba de comparación múltiple de Dunnett post-hoc se conduce en la actividad locomotora de 60 minutos totales. Los cálculos de ED50 se realizan usando ajuste de curva de regresión no lineal en el porcentaje de reversión de datos transformados para cada dosis.
El Ejemplo 2 es medido en este ensayo corrido sustancialmente como anteriormente para tener un ED50 de 1 .46 mg/kg (i p ). Los Ejemplos 5 y 6 son medidos en este ensayo corrido sustancialmente como anteriormente para tener 2.95 mg/kg (p.o. ) y 4.31 mg/kg (p.o.), respectivamente. Estos resultados demuestran que los compuestos dentro del alcance de la presente invención son medicaciones útiles para esquizofrenia y trastorno bipolar.
Atenuación de Hipertermia I nducida por Estrés en Ratas La hipertermia, una elevación en la temperatura corporal nuclear, es un fenómeno natural que ha sido confiablemente demostrado en muchos mamíferos, incluyendo humanos, en respuesta al estrés. En muchos trastornos de ansiedad, la hipertermia ocurre como parte de la patolog ía y es considerada un síntoma de la enfermedad . Los compuestos los cuales atenúan la hipertermia inducida por estrés en animales se cree son útiles en el tratamiento de trastornos de ansiedad en humanos. El trastorno de ansiedad generalizada y trastorno de estrés post-traumático están entre los trastornos que pueden ser tratados con tales compuestos. El método mínimamente invasivo y convencional para analizar hipotermia inducida por estrés es midiendo la temperatura corporal, e incrementos inducidos por estrés en la temperatura corporal vía termómetro rectal. Ratas macho Fischer F-344 (Harían, Indianápolis, IN, USA) que pesan entre 275 - 350 g son probadas. Todos los animales son individualmente alojados con alimento y agua automatizados disponibles opcional (ad libitum), y mantenidos en un ciclo de 12 h de luz/oscuridad (luces a las 06:00). Los animales son ayunados por aproximadamente 12-18 horas antes del experimento, el cual es conducido durante la fase de luz. Las ratas son dosificadas intraperitonealmente (IP) en un volumen de dosis de 1 mL/kg con los compuestos de la invención en el rango de 0.3, 1, 3, y 10, mg/kg. El vehículo es salina + NaOH agregado para lograr un pH de 5-7. El antagonista de mGluR5 MTEP (3-[(2-metil-1 ,3-tiazol-4-il)etinil]piridina), el cual ha demostrado actividad similar ansiolítica robusta en modelos preclínicos, es usado como un comparador (5 mg/kg, ruta IP, disuelto en agua). Inmediatamente después de la dosificación, las ratas son regresadas a su jaula, y el experimento apaga las luces y deja el cuarto. El cuarto de dosificación es oscurecido por el resto del periodo de tratamiento de 1 hora.
Después del periodo de tratamiento, las ratas son tomadas individualmente a una sala adyacente brillantemente iluminada donde las temperaturas corporales de línea base son determinadas por inserción de una sonda rectal lubricada con aceite mineral. La temperatura corporal es valorada usando un Termómetro Microprobe PHYSITEMP BAT-12® con una sonda rectal para rata PHYSITEMP RET-2® (Physitemp Instruments Inc., Clifton, NJ, USA). La sonda es insertada aproximadamente 2 cm en el recto, para medir la temperatura corporal nuclear (esta es la temperatura corporal de línea base, T1, en grados Celsius). Diez minutos después se registra una segunda medición de temperatura corporal (T2). La diferencia en temperatura corporal (T2 -T1) es definida como la respuesta hipertérmica inducida por estrés. La dosis en la cual un compuesto de la invención produce una reducción del 35% en respuesta hipertérmica inducida por estrés, con relación a la respuesta del vehículo, es definida como la dosis T35.
El Ejemplo 2 es medido en este ensayo corrido sustancialmente como anteriormente para tener un T35 de 0.57 mg/kg. El Ejemplo 5 es medido en este ensayo corrido sustancialmente como anteriormente para tener un T35 de 6.4 mg/kg. Estos resultados demuestran que los compuestos dentro del alcance de la presente invención son medicaciones útiles para trastornos de la ansiedad. Más particularmente, los compuestos dentro del alcance de la presente invención pueden ser medicaciones útiles para trastorno de ansiedad generalizada y/o trastorno de estrés post-traumático.
Tamiz de Inhibición de GlySar PepT1 in vitro y Determinación de IC50 Se establecieron ensayos de PepT1 para examinar la capacidad de los profármacos para interactuar con el transportador de la absorción intestinal PepT1.
Células HeLa, derivadas de intestino humano, (American Type Culture Collection) se hicieron crecer en medio Hyclone (Invitrogen, Cat# SH30243) que contiene 10% de suero bovino fetal (FBS), 0.1 mM de aminoácidos no esenciales (NEAA), y 100 unidades/mL de penicilina con 100 [ig/mL de estreptomicina a 37°C en una atmósfera al 5% humidificada de C02. La línea celular es usada por hasta 40 pasajes y después desechada. Células congeladas en viales de 1 mi son descongeladas en baño maría por 1-2 minutos y agregadas a 5 mL de medio celular a 37°C. Cada uno de los matraces-T es proporcionado con 8.5 mL del medio fresco y 1.5 mL de la solución base celular. Las células son pasadas dos veces durante una semana. Esto se logra enjuagando los matraces con 10 mL de salina amortiguada con fosfato-ácido etilendiaminatetraacético (PBS-EDTA), agregando 2 mL de tripsina por 2-5 minutos, para separar las células y agregar 8 mL de medio fresco para inhibir la actividad adicional de tripsina. Cada nuevo matraz recibe una combinación de 8.5 mL de medio fresco y 1.5 mL de solución base celular, para obtener una dilución celular 1:6. Las células son incubadas a 37°C, hasta la lectura para el estudio de absorción.
Las células que son 70-80% confluentes en los matraces-T son plaqueadas 1 día previo al procedimiento de transfección. El matraz con la solución base celular es tratado con PBS-EDTA y tripsina para separar las células, y el medio de transfección es usado a partir de este punto. El medio de transfección consiste de Medio Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM) + NEAA. A cada cavidad, se agregaron 0.5 mL de mezcla celular (1.3x105 es la concentración celular deseada) y las células son incubadas a 37°C durante la noche. Veinticuatro horas antes del ensayo, las células son transfectadas con PEPT1. La mezcla de transfeccion es preparada mezclando 600 µ?_ de medio de transfeccion libre de suero, 18 µ?. de FuGene6 (Roche Diagnostics), y 11 del DNA de PepT1. El complejo de reactivo de transfección-DNA es incubado por 20 minutos y se agregan 24 µ? del complejo de reactivo-DNA a cada cavidad.
La inhibición de la actividad de absorción de [glicil-1-2-14C]Gliclisarcosina (GlySar) mediada por PEPT1 es medida en las células cultivadas en las placas de 24 cavidades 24 horas post-transfeccion como se publica previamente (Zhang et al. 2004. J. Pharm. Exper Ther. 310:437-445). Para medir la capacidad de un compuesto de la invención para inhibir la absorción de [14C]Gly-Sar, los profármacos son incubados con 80 a 90% de células HeLa temporalmente transfectadas con PePT1 confluentes a 5 mM en pH 6.0 de medio de absorción en la presencia de 5 µ? de [1 C]Gly-Sar (Moravek Biochemicals) y 20 µ? de Gly-Sar frío. El medio de absorción consiste de 140 mM de NaCI, 5.4 mM de KCI, 1.8 mM de CaCI2, 0.8 mM de MgS04, 5 mM de Glucosa, 25 mM de amortiguador tris(hidroximetil)aminometano (TRIS). La solución es entonces llevada a pH 6.0 usando ácido 2-(N-morfolino)etansulfónico. El volumen de incubación es 500 µ? y es realizado a temperatura ambiente por 3 minutos. Para detener la absorción en la conclusión del tiempo de incubación, el medio de absorción es aspirado de la monocapa celular y 500 [il de PBS enfriado en hielo se agregan a la cavidad. Las células son lavadas 3 veces con 500 µ? de PBS a temperatura ambiente sin Ca+2 y Mg+2. Las células son entonces Usadas con 300 µ?_ de 1% de solución de H20 de Tritón X100. Una alícuota de 200 µ?_ es removida y la radioactividad se determina por conteo de escintilación líquida para medir el [ 4C]Gly-Sar presente en cada una de las cavidades de incubación. Un control sin inhibidor es establecido y el porcentaje de inhibición de cada profármaco es calculado con respecto a este control. Un control negativo (Glicina) y dos controles positivos (Cefadroxil y Cefalexina) se realizan en paralelo en cada experimento para demostrar la viabilidad del sistema de ensayo. Los profármacos con inhibición de absorción GlySar igual o mejor que Cefalexina son considerados aceptables. Los valores medios ± desviación estándar son 10.1 ±9.5% (n = 19) para Glicina, 53.2 ± 13.2 % (n = 19) para Cefadroxil, y 37.5±14.7% (n = 18) para Cefalexina.
Para el ensayo de IC50 de PepT, los profármacos son incubados a un rango de concentraciones (0.0625 a 25 mM) en la presencia de 5 µ? de [14C]Gly-Sar y 20 µ? de Gly-Sar frío. Los procedimientos de muestreo e incubación son exactamente los mismos como para el tamiz PepT1 descrito anteriormente. Los datos de absorción de [ C]Gly-Sar son evaluados para cada una de las concentraciones de profármacos y los valores IC50 son calculados.
Los Ejemplos 5, 6, y 7 son medidos en este ensayo corrido sustancialmente como anteriormente para tener inhibición de absorción de [3H]Gly-Sar de hPepTI a 5mM de 89%, 87%, y 78%, respectivamente. Los Ejemplos 5 y 6 son medidos en este ensayo corrido sustancialmente como anteriormente para tener IC50 de inhibición de absorción de [3H]Gly-Sar de hPepTI de 1.98 mM y 0.25 mM, respectivamente. Estos resultados demuestran que los compuestos dentro del alcance de la presente invención son oralmente absorbidos vía el transportador PepT1.
Ensayo de Hidrólisis de Profármaco Intestinal in vitro Homogenados intestinales de duodeno humano congelados (relación de tejido:amortiguador 1:2 usando 100 mM de amortiguador de Fosfato Tris, pH 7.4) se obtienen de Tecnologías Celsius In Vitro (Baltimore, MD) que fueron libres tanto de fenilmetilsulfonilf luoruro (PMSF) como EDTA.
Cada lote de duodeno humano se obtiene de un donador único y el intestino es raspado y las secciones son congeladas separadas. Todas las recolecciones de tejido original son realizadas a 4°C e inmediatamente congeladas a -70°C. Los homogenados intestinales humanos son descongelados y diluidos a una concentración de proteína final de 0.5 mg/mL en 100 mM de amortiguador PBS, pH 7.4 inmediatamente previo a las incubaciones.
Las incubaciones son conducidas en placas de 96 cavidades y todos los profármacos son corridos en duplicados en cada día. Las soluciones base de profármacos son preparadas en agua a una concentración de 1 mM. Una alícuota de 200 pL de 0.5 mg/mL de homogenado intestinal y 196 pL de 100 mM de amortiguador de PBS son colocadas en una placa de 96 cavidades a baño maría a 37°C. Usando un pipeteador de 96 cavidades, se transfieren 4 µ? de 1 mM de solución de profármaco en el homogenado. Inmediatamente después de la adición del profármaco (tiempo cero) y después de 1 hora de incubación, 50 µ? de las muestras de la mezcla de incubación son removidas usando un pipeteador de 96 cavidades simultáneo desechable automatizado y agregadas directamente a 200 pL de metanol de solución de apagado que contiene 100 ng/mL de Estándar Interno. Las muestras son entonces centrifugadas a 3500 rpm por 5 minutos a 10 °C. El sobrenadante (200 pL) es transferido a una placa final de PCR de 96 cavidades y sellada para análisis por LC/MS/MS.
Las concentraciones de metabolito activo hidrolizado en las mezclas de incubación son determinadas usando detección de LC/MS/MS en un espectrómetro de masas cuádruplo Sciex API 4000 con Analyst versión 1.4.2, TurbolonSpray, ionización positiva, y Monitoreo de Reacción Seleccionada (SRM). Una columna de HPLC Waters Atlantis® T3 (20 x 2.1 mm, 5 µ?) se usa a temperatura ambiente con una velocidad de flujo de 1.0 mL/min y un gradiente de fase móvil desde 0.1% de fase móvil A hasta 99% de fase móvil A. La fase móvil A es 1000:5 agua: ácido heptafluorobutérico y la fase móvil B es 1:1 metanol:ácido acético helado.
Las concentraciones de metabolito activo hidrolizado en las mezclas de incubación intestinal son determinadas de curvas estándares preparadas por réplicas de dilución de dos partes partiendo a 10 µ? en 100 mM de PBS pH 7.4 y subsecuentemente apagadas con solución estándar interna-metanol idénticas a las muestras. Los promedios y desviaciones estándares son calculados usando Microsoft® Office Excel® 2007. La cantidad de hidrólisis es determinada como un porcentaje molar de metabolito activo formado con relación a la concentración de profármaco agregado. La hidrólisis del control positivo, Profármaco Interno A al Metabolito Activo Interno de Fármaco A, corrida en cada lote promedió 75.3% (n=20). Los valores finales son entonces normalizados con relación a la formación del Metabolito Activo Interno de Fármaco A.
Los Ejemplos 5, 6, y 7 son medidos en este ensayo corrido sustancialmente como anteriormente para tener hidrólisis intestinal humana con relación al Profármaco Intestinal A de 36% (n=3, SD = 2.7), 44% (n=3, SD = 4.1), y 34% (n = 1), respectivamente. Estos resultados demuestran que los compuestos dentro del alcance de la presente invención son hidrolizados en el intestino humano.
Ensayo de Hidrólisis de Homogenado S-9 de Hígado Humano in vitro Se obtuvieron fracciones S9 de hígado de Xenotech LLC (Lenexa, MO). El lote es de una combinación de dos donadores, uno masculino y uno femenino. La fracción S9 de hígado es preparada y diluida usando un amortiguador de homogenización que consiste de 50mM de Tris, pH 7.4 a 4°C y 150mM de cloruro de potasio sin EDTA. Los profármacos son incubados en el homogenado de hígado por 2 horas a 37°C, después de lo cual la concentración de metabolito activo es determinada por LC/MS/MS. La hidrólisis de Clopidogrel a Ácido Carboxílico de Clopidogrel es utilizada como un control positivo de ensayo.
Las incubaciones se conducen en un formato de 96 cavidades y todos los profármacos se corren por duplicado cada día. Las soluciones base de profármaco son preparadas en agua a una concentración de 1 mM. La fracción S9 de hígado humano es diluida a una concentración final de proteína de 0.5mg/ml en 100mM de amortiguador de PBS, pH 7.4.
Una alícuota de 200 ? de 0.5mg/mL de homogenado S-9 de hígado humano y 196 µ? de 100 mM de amortiguador de PBS son colocadas en una placa de 96 cavidades en baño maría a 37°C. Usando un pipeteador de 96 cavidades, se transfieren 4 pL de la solución de profármaco de 1 mM en el homogenado. Para asegurar que la hidrólisis no es debida a la inestabilidad química, los profármacos son también incubados con amortiguador de PBS solo sin S-9 de hígado. Inmediatamente después de la adición del profármaco (tiempo cero) y después de 1 hora de incubación, se remueven 50 µ? de muestra de la mezcla de incubación usando un pipeteador de 96 cavidades simultáneo desechable automatizado y se agregan directamente a 200 L de metanol de solución de apagado que contiene 100 ng/mL de Estándar Interno. Las muestras son centrifugadas a 3500 rpm por 5 minutos a 10°C. El sobrenadante (200 uL) es transferido a una placa final de PCR de 96 cavidades y sellado para análisis por LC/MS/MS.
La cuantificación de LC/MS/MS del metabolito activo formado durante la incubación se realiza en un Sciex API 4000, Analyst versión 1.4.2, TurbolonSpray, ionización positiva, y Monitoreo de Reacción Seleccionada (SRM). La columna de HPLC usada es una Waters Atlantis® T3 (20 x 2.1 mm, 5µp?) a temperatura ambiente con una velocidad de flujo de fase móvil de 1.0 mL/min. La fase móvil A es 1000:5 agua: ácido heptafluorobutérico y la fase móvil B es 1:1 metanol/ácido acético helado. Se utiliza un gradiente de fase móvil partiendo a la relación de fase móvil A/B de 99.9/0.1 y terminando a 1/99.
Las concentraciones de metabolito activo hidrolizado en las mezclas de incubación se determinan de curvas estándares preparadas por replicas de dilución de dos partes partiendo a 10 µ? en 100 mM de PBS pH 7.4 y subsecuentemente apagadas con solución de estándar interno-metanol idéntica a las muestras. Los promedios y desviaciones estándares son calculados usando Microsoft® Office Excel® 2007. Los valores finales son presentados como un porcentaje molar de metabolito activo formado con relación a la concentración de profármaco agregado. La hidrólisis de Clopidogrel a Ácido Carboxílico de Clopidogrel se usa como el control positivo y promedia 73.0% (n=27).
Los Ejemplos 8 y 9 son medidos en este ensayo corrido sustancialmente como anteriormente para tener hidrólisis de S9 en el hígado humano de 23% y 59.3%, respectivamente. Estos resultados demuestran que los compuestos dentro del alcance de la presente invención son hidrolizados en el hígado humano.
Los datos demuestran que los profármacos de aminoácido ejemplificados inhiben la absorción del GlySar del sustrato PepT1 tan buenos o mejores que cefadroxil y cefalexina (Zhang et al., 2004. JPET 310:437-445), sugiriendo potencial para la absorción oral humana vía el transportador PepT1. Además de la absorción del profármaco, después de entrar al cuerpo, la hidrólisis del profármaco para proporcionar el metabolito activo es esencial. Los presentes estudios de hidrólisis in \/¡tro sugieren que los profármacos de aminoácido ejemplificados pueden ser hidrolizados por el intestino humano. La hidrólisis de los profármacos de diéster ejemplificados ocurre en homogenados de hígado humano sugiriendo el potencial para los profármacos de diéster ejemplificados para tener hidrólisis en humanos después de la exposición oral. En conjunto estos datos indican el potencial para los profármacos de aminoácido ejemplificados y profármacos de diéster ejemplificados para ser hidrolizados en humanos para liberar el metabolito activo.
Ensayo de Farmacocinética Ratas macho Sprague-Dawley ayunadas, son administradas intravenosamente con el Ejemplo 2 a 1 mg/kg o Ejemplo 5 por alimentación forzada oral a una dosis de 7.5 mg/kg (igual a 5 mg/kg de equivalentes molares del Ejemplo 2) en un diseño cruzado estándar (N=3 con cada rata que recibe tanto dosis oral como intravenosa). Para administración intravenosa, el Ejemplo 2 es disuelto en agua y para la dosis oral el Ejemplo 5 es preparado en vehículo acuoso de hidroxietilcelulosa (1%), polisorbato 80 (0.25%) y antiespuma 1510-US (0.05%). Las cánulas son quirúrgicamente implantadas para facilitar la recolección serial de sangre. La sangre es recolectada en tubos EDTA durante un periodo de 0-24 horas post-dosificación, centrifugada y el plasma es almacenado congelado hasta el tiempo del análisis. Las muestras de plasma son descongeladas, se transfieren alícuotas de 50 µ?_ a una placa de 96 cavidades, se agregan 50 µ?_ de solución de estándar interno, y las muestras se mezclan. Trescientos µ?_ de acetonitrilo se agregan entonces, las muestras son sometidas a vórtices por 3 minutos y centrifugadas. Una alícuota de 300 pl_ del sobrenadante es transferida a una placa separada y evaporada bajo nitrógeno a 40°C. El residuo es reconstituido en 100 pL de 0.5 % de ácido heptafluorobutírico en agua, sometido a vórtices y centrifugado. Una al ícuota de 20 µ?_ es subsecuentemente analizada por LC/MS/MS usando un automuestreador Shimadzu y sistema HPLC de interfaz con un espectrómetro de masas AB Sciex 4000 bajo modo de turbo-rocío de ión positivo. Las transiciones de MS/MS son 283.2->44.2 amu para el profármaco del Ejemplo 5 y 212.1 -> 103.1 amu para el activo del Ejemplo 2. Se utiliza una columna de HPLC de 5 mieras, Atlantis T3, 50 x 2.1 mm, a una velocidad de flujo de fase móvil de 1 .0 mL/minuto y una fase móvil binaria de (A) 0.2% de ácido fórmico en agua y (B) acetonitrilo-agua ( 1 : 1 , v/v) y un gradiente de 2% B a 98%B durante 0.8 minutos. El tiempo de retención del Ejemplo 2 es aproximadamente 0.53 minutos.
Son calculados parámetros de farmacocinética a partir de los datos de concentración de plasma usando Watson para Windows (Thermo Scientific). La biodisponibilidad oral relativa es determinada comparando el área bajo la curva de tiempo de concentración de plasma (AUC) del activo del Ejemplo 2 después de la administración intravenosa con el AUC del metabolito activo después de la administración oral del profármaco del Ejem plo 5.
Un profármaco exitoso debe ser tanto bien absorbido después de la adm inistración oral como subsecuentemente hidrolizado para liberar el metabolito activo en la circulación sistémica. La biodisponibilidad relativa incluye ambos parámetros comparando el AUC del metabolito activo después de la ad ministración oral del profármaco al AUC del activo después de la administración intravenosa del compuesto activo. En ratas macho, la biodisponibilidad relativa del metabolito activo después de la adm inistración oral del profármaco del Ejemplo 5 como se m ide en este ensayo corrido sustancialmente como anteriormente es 60 ± 14% (media ± desviación estándar) demostrando q ue el profármaco del Ejemplo 5 es tanto bien absorbido como extensivamente hidrolizado para proporcionar el metabol ito activo in vivo.

Claims (27)

REIVINDICACIONES
1. A compuesto de fórmula I Formula I caracterizado porque R1 es hidrógeno, R2 es hidrógeno, y R3 es hidrógeno; R1 es hidrógeno, R2 es (2S)-2-aminopropanoilo, y R3 es hidrógeno; R es hidrógeno, R2 es (2S)-2-amino-4-metilsulfanil-butanoil, y R3 es hidrógeno; R es hidrógeno, R2 es 2-aminoacetilo, y R3 es hidrógeno; R1 es bencilo, R2 es hidrógeno, y R3 es bencilo; o R1 es (2-fluorofenil)metilo, R2 es hidrógeno, y R3 es (2-fluorofenil)metilo; o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable.
2. El compuesto de conformidad con la Reivindicación 1, caracterizado porque es ácido ( 1 S, 2S, 5R, 6S)-2-aminoespiro[biciclo[3.1.0]hexano-4, 1 '-cid opropano]-2,6-dicarbox Mico, o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable.
3. El compuesto de conformidad con la Reivindicación 1, caracterizado porque es clorhidrato del ácido (1 S,2S,5R,6S)-2-aminoespiro[biciclo[3.1.0]hexano-4,1 '-ciclopropano]-2,6-dicarboxílico.
4. El compuesto de conformidad con la Reivindicación 1, caracterizado porque es ácido (1 S,2S,5R,6S)-2-[[(2S)-2-aminopropanoil]amino]espiro[biciclo[3.1.0]hexano-4, 1 '-ciclopropano]-2,6-dicarboxílico, o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable.
5. El compuesto de conformidad con la Reivindicación 1, caracterizado porque es clorhidrato del ácido (1 S,2S,5R,6S)-2-[[(2S)-2-aminopropanoil]amino]espiro[biciclo[3.1.0]hexano-4, 1 '-ciclopropano]-2,6-dicarboxílico.
6. El compuesto de conformidad con la Reivindicación 1, caracterizado porque es dihidrato del ácido (1 S,2S,5R,6S)-2-[[(2S)-2-aminopropanoil]amino]espiro[biciclo[3.1.0]hexano-4, 1'-ciclopropano]-2,6-dicarboxílico.
7. El Compuesto de conformidad con la Reivindicación 1, caracterizado porque es ácido (1 S,2S,5R,6S)-2-[[(2S)-2-aminopropanoil]amino]espiro[biciclo[3.1.0]hexano-4,1'-ciclopropano]-2,6-dicarboxílico; 1,4-dioxano (1:0.5); clorhidrato.
8. El compuesto de conformidad con la Reivindicación 1, caracterizado porque es ácido ( 1S, 2S, 5R, 6S)-2-[[(2S)-2-amino-4-metilsulfanil-butanoil]amino]espiro[biciclo[3.1.0]hexano-4, 1 '-ciclopropano]-2,6-dicarboxílico, o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable.
9. El compuesto de conformidad con la Reivindicación 1, caracterizado porque es clorhidrato del ácido {1 S,2S,5R,6S)-2-[[(2S)-2- amino-4-metilsulfanil-butanoil]amino]espiro[biciclo[3.1.0]hexano-4,1 '-ciclopropano]-2,6-dicarboxíl¡co.
10. El compuesto de conformidad con la Reivindicación 1, caracterizado porque es ácido {1 S,2S,5R,6S)-2-[(2-aminoacetil)amino]espiro[biciclo[3.1.0]hexano-4,1'-ciclopropano]-2,6-dicarboxílico, o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable.
11. El compuesto de conformidad con la Reivindicación 1, caracterizado porque es clorhidrato del ácido {1 S,2S,5R,6S)-2-[(2-aminoacetil)amino]espiro[biciclo[3.1.0]hexano-4,1 '-ciclopropanoJ-2,6-dicarboxílico.
12. El compuesto de conformidad con la Reivindicación 1, caracterizado porque es (1 S,2S,5R,6S)-2-aminoespiro[biciclo[3.1.0]hexano-4, 1 '-ciclopropano]-2,6-dicarboxilato de dibencilo, o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable.
13. El compuesto de conformidad con la Reivindicación 1, caracterizado porque es (1 S,2S,5R,6S)-2-aminoespiro[biciclo[3.1.0]hexano-4,1 '-ciclopropano]-2,6-dicarboxilato de dibencilo; 1,4-dioxano; clorhidrato.
14. El compuesto de conformidad con la Reivindicación 1, caracterizado porque es bis[(2-fluorofenil)metil](ÍS,2S,5ft,6S)-2-aminoespiro[biciclo[3.1.0]hexano-4, 1 '-ciclopropano]-2,6-dicarboxilato, o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable.
15. El compuesto de conformidad con la Reivindicación 1, caracterizado porque es bis[(2-fluorofenil)metil](ÍS,2S,5R,6S)-2-aminoespiro[biciclo[3.1.0]hexano-4,1'-ciclopropano]-2,6-dicarboxilato clorhidrato.
16. Una composición farmacéutica caracterizada porque comprende el compuesto o sal de conformidad con cualquiera de las Reivindicaciones 1 -15 y un portador, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable.
17. El compuesto o sal de conformidad con cualquiera de las Reivindicaciones 1 -1 5, para uso en terapia.
18. El compuesto o sal de conformidad con cualquiera de las Reivindicaciones 1 -1 5, para uso en el tratamiento de un trastorno neurológico seleccionado del grupo que consiste de dolor persistente, dolor neuropático, dolor inflamatorio crónico, y dolor visceral .
19. El compuesto o sal para uso de conformidad con la Reivindicación 18, en donde el trastorno neurológico es dolor persistente.
20. El compuesto o sal para uso de conformidad con la Reivindicación 1 8, en donde el trastorno neurológico es dolor neuropático.
21 . El compuesto o sal para uso de conformidad con la Reivindicación 18, en donde el trastorno neurológico es dolor inflamatorio crónico.
22. El compuesto o sal para uso de conformidad con la Reivindicación 18, en donde el trastorno neurológico es dolor visceral .
23. El compuesto o sal de conformidad con cualquiera de las Reivindicaciones 1 -15, para uso en el tratamiento de un trastorno psiquiátrico seleccionado del grupo que consiste de esquizofrenia, trastorno bipolar, trastorno de ansiedad generalizada, y trastorno de estrés post-traumático.
24. El compuesto o sal para uso de conformidad con la Reivindicación 23, en donde el trastorno psiquiátrico es esquizofrenia.
25. El compuesto o sal para uso de conformidad con la Reivindicación 23, en donde el trastorno psiquiátrico es trastorno bipolar.
26. El compuesto o sal para uso de conformidad con la Reivindicación 23, en donde el trastorno psiquiátrico es trastorno de ansiedad generalizada.
27. El compuesto o sal para uso de conformidad con la Reivindicación 23, en donde el trastorno psiquiátrico es trastorno de estrés post-traumático. RES UM EN La presente invención se refiere a nuevos agonistas de mGlu2/3 de fórmula (I) útiles en el tratamiento de trastornos neurológicos o psiquiátricos. (I)
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