TW201111512A

TW201111512A - Improved isoprene production using the DXP and MVA pathway

Info

Publication number: TW201111512A
Application number: TW99119621A
Authority: TW
Inventors: Gopal K Chotani; Joseph C Mcauliffe; Michael Charles Miller; Rachel Erin Muir; Dmitrii V Vaviline; Walter Weyler
Original assignee: Danisco Us Inc; Goodyear Tire & Rubber
Priority date: 2009-06-17
Filing date: 2010-06-15
Publication date: 2011-04-01
Also published as: CA2765805A1; AR077115A1; TW201412988A; SG176936A1; EP2443244A4; CN102753697A; MY158160A; TWI427149B; US20140162337A1; BRPI1014123A2; EP2443244A1; US8507235B2; SG10201403297UA; WO2010148150A1; US20110014672A1

Description

201111512 六、發明說明：【發明所屬之技術領域】本發明大體而言係關於使用DXP途徑及MVA途徑改良自已培養細胞製造異戊二烯之組合物及方法。本申請案主張2009年6月17曰申請之美國臨時專利申請案第61/187,941號、2009年6月17日申請之美國臨時專利申請案第61/187,930號、2010年3月17日申請之美國臨時專利申請案第61/3 14,985號、2010年3月17曰申請之美國臨時專利申請案第61/31 4,979號之優先權，所有此等申請案之揭示内容藉此以全文引用的方式併入本文中。【先如技術】異戊一烯（2 -曱基-1，3-丁二稀）為多種合成聚合物、最特別為合成橡膠之關鍵起始材料。異戊二烯天然地由多種微生物、植物及動物物種製造而成。詳言之，已鑑別兩種生物合成異戊二稀之途徑：甲經戊酸（meval〇nate，mva)途徑及非曱羥戊酸（non_meval〇nate，DXP)途徑（圖19A)。然而’自天然存在之生物體製造異戊二烯之產率在商業上不具吸引力。每年約有800,000噸順式聚異戊二烯藉由異戊二烯聚合製造而成；大多數此聚異戊二烯用於輪胎及橡膠工業中。異戊二烯亦經共聚以用作諸如鞋、機械產品、醫學產品、體育用品及乳膠之其他產品中的合成彈性體。當前’輪胎及橡膠工業係基於天然及合成橡膠之使用。天然橡膠係自非洲雨林中所見之橡膠樹或植物之乳汁獲得。合成橡膠主要基於丁二烯聚合物。對於此等聚合物， 149048.doc 201111512 丁二烯係作為乙烯及丙烯製造之副產物獲得。儘管異戊二烯可由分餾石油獲得’但此材料之純化昂貴且耗時。C5烴流之石油裂化僅製得約15%異戊二烯。因此，製造異戊二烯需要更經濟之方法。詳言之，需要以足以滿足穩健工業化生產過程的要求之速率、力價及純度製造異戍二稀之方法。亦需要自廉價起始材料製造異戊二烯之系綠。【發明内容】本發明特別提供使用各種Dxp途徑基因與多狀及各種 MVA途徑基因與纽、鐵硫鎮相互仙氧化還原基因與多肽異戊一烯合成酶、及視情況選用之各種與Dxp途徑相關之基因與多肽、各種與MVA途徑相關之基因與纽、及 ΠΜ基因與多&，以增加之量製造異戊二烯的組合物及方法。在-態樣中’本發明提供細胞或培養中細胞，其已經工程改造以使用各種Dxp途徑基因與多肽、各種mva途徑基因與多R、鐵硫鎮相互作用氧化還原基因與多肽、異戊烯a成S#基因與多肽、及視情況選用之Dxp途徑相關基因與多肽、MVA途徑相關基因與多肽及mi基因與多肽之組合，以增加之量製造異戊二烯。在二實靶例中，細胞或培養中細胞包含⑴編碼鐵硫簇相互作用氧化還原多肽、Dxp途徑多肽、途彳i多狀及異戊一烯合成酶多肽之異源核酸，及/或（i〇編碼鐵硫簇相互作用氧化還原多肽、Dxp途徑多肽' MVA途徑多狀及異戊二烯合成酶多肽之内源核酸之複本。在一些實施例中， I49048.doc 201111512 細胞或培養中細胞包含⑴編碼鐵硫簇相互作互作用氧化還原多

多肽可操作地連接於啟動子。在一些實施例中，DXP途徑多肽係選自由以下組成之群· DXS(卜去氧-D-木酮糖-5-碟酸合成酶）、dxrq-去氧_ D-木酮糖-5-填酸還原異構酶）、mct(4-二磷酸胞苷-2C-甲基-D-赤藻糖醇合成酶）' CMK(4-二填酸胞苦-2-C-甲基-D_ 赤藻糖醇激酶）、MCS(2C-甲基-D-赤藻糖醇2,4-環二峨酸合成酶）、HDS(1-羥基-2-甲基-2-(E)-丁烯基4-二磷酸合成酶）及HDR(1-羥基-2-甲基-2-(E)-丁烯基4-二磷酸還原酶）。在一些實施例中，DXP途徑多肽為DXS、HDS或HDR。在一些實施例中，細胞進一步包含編碼IDI(異戊烯基-二磷酸 δ-異構酶）多肽之異源核酸、或内源核酸之複本。在一些實施例中，M VA途徑多肽係選自由以下組成之群：乙醯基-CoA乙醯轉移酶（AA-CoA硫解酶）、3-羥基-3-曱基戊二醯基-CoA合成酶（HMG-CoA合成酶）、3-羥基-3-曱基戊二醯基_CoA還原酶（HMG-CoA還原酶）、曱羥戊酸激酶（MVK)、磷酸甲羥戊酸激酶（PMK)、二磷酸甲羥戊酸去羧酶（MVD)、磷酸甲羥戊酸去羧酶（PMDC)及異戊烯基碌酸激酶（IPK)。在一些實施例中，細胞進一步包含編碼 149048.doc 201111512 IDI(異戊烯基-二磷酸δ-異構酶）多肽之異源核酸、或内源核酸之複本。在一實施例中，DXP途徑與河乂八途徑可以任何比率存在以於細胞或培養中細胞中按任何比例自各途徑製造異戊二烯。在另一實施例中，約1 〇%至5〇%之異戊二烯係利用 DXP途徑製造且其餘係利用MVA途徑製造。在另_實施例中，至少約50%之異戊二烯係利用Dxp途徑製造且其餘係利用MVA途徑製造。在一些實施例中，本發明提供製造大於約4〇〇奈莫耳異戊二烯/公克細胞（細胞濕重小時（nm〇1/gwcm/h)之異戊二烯的細胞或培養中細胞。在一些實施例中，細胞或培養中細胞使細胞培養基中超過約0.002%之碳轉化成異戊二稀。在一些實施例中，本發明提供歷經酿酵操作之持續時間，HMBPP及DMAPP之含量維持低於！ mM之細胞或培養中細胞。在其他實施例中，本發明提供在醱酵的指數期期間，HMBPP及DMAPP之含量維持低於j mM之培養中細胞。在其他實施例中’本發明提供晚期DXP途徑酶、尤其 IspG及IspH之含量維持與Dxr之磷酸化程度最低相一致的細胞或培養中細胞。在本發明之任何態樣之一些實施例中，鐵硫鎮相互作用氧化還原多肽包含黃素氧化還原蛋白（flav〇d〇xin)(例如黃素氧化還原蛋白I)、黃素氧化還原蛋白還原酶、鐵氧化還原蛋白（ferredoxin)(例如鐵氧化還原蛋白η、鐵氧化還原蛋白-NADP +氧化還原酶，及編碼其之基因或多肽（例如力^及 I49048.doc 201111512 fid A)- 在些貫鈀例中，細胞或培養中細胞包含⑴編碼鐵氧化還原蛋白多肽、鐵氧化還原蛋白_ΝΑΓ)ι>+氧化還原酶多肽DXP途徑多肽及異戊二烯合成酶多肽之異源核酸，及/ 或（π)編碼鐵氧化還原蛋白多肽、鐵氧化還原蛋白_NADp+ 氧化還原酶多肽、DXP途徑多肽及異戊二烯合成酶多肽之内源核酸之複本。在一些實施例中，細胞或培養中細胞包 φ 含1SpG及fldA。在另一實施例中，細胞或培養中細胞包含 IspG、fldA及IspH。在一些實施例中，鐵氧化還原蛋白多肽、鐵氧化還原蛋白_NADP+氧化還原酶、DXP途徑多肽及異戊二烯合成酶多肽可操作地連接於啟動子。在一些實施例中，細胞進一步包含編碼IDI多肽之異源核酸、或内源核酸之複本。在一些實施例中，培養中細胞包含⑴編碼黃素氧化還原蛋白多肽、DXP途徑多肽、MVA途徑多肽及異戊二烯合成 • 酶多肽之異源核酸，及/或（Π)編碼黃素氧化還原蛋白多肽、DXP途徑多肽、MVA途徑多肽及異戊二烯合成酶多肽之内源核酸之複本。在一些實施例中，黃素氧化還原蛋白多肽、DXP途徑多肽、MVA途徑多肽及異戊二烯合成酶多肽可操作地連接於啟動子。在一些實施例中，細胞進—步包含編碼IDI多肽之異源核酸、或内源核酸之複本。在一些實施例中，在包括碳源之培養基中培養細胞，該奴源為諸如（但不限於）碳水化合物、甘油（glycer〇l)、丙二醇（glycerine)、二羥基丙酮、單碳源（one_carb〇n s〇Urce)、 149048.doc 201111512

母提取物之組分，或前 «仰明、二毆甘油酯、可再生碳源、多 L物蛋白質或肽）、酵母提取物、來自酵或前述兩者或兩者以上之任何組合。在一些實施例中，於限制性葡萄糖條件下培養細胞。在其他態樣中，本發明提供製造異戊二烯之方法，該方法包含（a)在適於製造異戊二烯之培養條件下培養包含以下之細胞：（i)編碼鐵硫簇相互作用氧化還原多肽、Dxp途徑夕肽MVA途徑多肽及異戊二稀合成酶多肽之異源核酸，或（11)編碼鐵硫簇相互作用氧化還原多肽、Dxj>途徑多肽M VA途徑多肽及異戊二稀合成酶多肽之内源核酸之複本；及（b)製造異戊二烯。在一實施例中，細胞進一步包含編碼IDI(異戊烯基-二磷酸δ_異構酶）多肽之異源核酸、或内源核酸之複本。在其他實施例中，培養中細胞製造大於約400 nm〇l/gwem/h之異戊二烯。在其他實施例中，細胞自細胞培養基中消耗之碳有超過約〇.〇2莫耳。/。轉化成異戊二稀。在一態樣中’本發明提供製造異戊二烯之方法，諸如使用本文所述之任何細胞製造異戊二烯之方法。在—些實施例中’該方法包含培養包含以下之細胞：（i)編碼鐵硫鎮相互作用氧化還原多肽、DXP途徑多肽及異戊二烯合成酶多肽之異源核酸’及/或（ii)編碼鐵硫簇相互作用氧化還原多肽、DXP途徑多肽及異戊二烯合成酶多肽之内源核酸之複本。在一些實施例中，於適於製造異戊二稀之培養條件下 149048.doc 201111512 培養細胞，且製造異戊二烯。在一些實施例中，鐵硫簇相互作用氧化還原多肽 '異戊二烯合成酶多肽及DXP途徑多肽可操作地連接於啟動子。在一些實施例中，DXp途徑多肽係選自由以下組成之群：DXS(1_去氧_D木酮糖_5磷酸合成酶）、DXR(i-去氧七_木酮糖_5_磷酸還原異構酶）、 MCT(4-二磷酸胞苷-2C-甲基-D-赤藻糖醇合成酶）、 CMK(4-二磷酸胞苷-2_c_甲基_D_赤藻糖醇激酶）、mcs(2c_ φ 甲基-D-赤藻糖醇2,4-環二磷酸合成酶）、HDS(1-羥基_2_曱基-2-(E)-丁烯基4-二磷酸合成酶）及HDR(1_羥基_2曱基_2_ (E)_ 丁烯基4-二磷酸還原酶）^在一些實施例中，Dxp途徑多肽為DXS、HDS或HDR。在一些實施例中，細胞進一步包含編碼IDI(異戊烯基_二磷酸δ_異構酶）多肽之異源核酸、或内源核酸之複本。在一些實施例中，該方法包含在足以製造大於約400 nmol/gwem/h之異戊二烯之條件下培養 ”田胞。在一些實施例中，該方法包含在足以使細胞培養基 • 中超過約0,002%(m〇l/mol)之碳轉化成異戊二烯的條件下培養細胞。在多個實施例中，在停滞期期間所製造之異戊二烯之量 (諸如所製造之異戊二烯的總量，或1 〇D6Q()每小時每公升土。養液所製造之異戊二烯之量）大於或約為在生長期期間歷經相同持續時間所製造之異戊二烯之量的兩倍或兩倍以上。在—些實施例中，氣相包含大於或約9.5%(體積）之氧氣’且氣相中異戊二烯之濃度低於可燃下限或高於可燃上在特疋貫施例中’（i)氣相中異戊二稀之濃度低於可燃 149048.doc 201111512 及（ii)細胞製造大於約400 nmol/ 下限或高於可燃上限 gwCm/h之異戊二稀。在一些實施例中，μ ^ 僅在停滯期製造異戊二烯。在一些實施例中，在生县发日ώ — 朋與停滯期皆製造異戍二烯。在多個實施例中’在停滯期期門& d d間所製造之異戊二烯之量（諸如所製造之異戍二婦的纟Φ、番，> 、或1 〇〇6〇〇每小時每公升培養液所製造之異戊二稀之晋彳士里J大於或約為在生長期期間歷經相同持續時間所製造之異六-# θ 戍—烯之置的2、3、4、5、10、20、30、 40、50倍或50倍以上。心樣中本發明提供包含異戊二稀之組合物及系統。在-些實施例+，組合物包含大於或約2、5、10、 20、30、40、5〇、6〇、7〇、8〇、9〇、1〇〇、2〇〇、3〇〇、 400、500、600、700、800、900或 1000 mg之異戊二烯。在一些實施例中’組合物包含大於或約2、5、丨〇、2〇、 30、40、50' 60、70、80、9〇、1〇〇 g 之異戊二烯（w/w)，該組合物之揮發性有機部分為異戊二烯。在一些實施例中，以組合物中所有C5烴之總重量計，级合物包含大於或約 99.90、99.92、99.94、99.96、99.98 成 100重量％之異戊二稀。在一些實施例中，以組合物中户斤有C 5煙之總重里计，組合物包含小於或約〇. 12、〇 1 〇、 0.08、0.06、0.04、0.02、〇.〇1、〇.〇〇5、〇〇〇1、〇〇〇〇5、 0.0001 ' 0.00005或0.00001重量％之非異戍二稀之C5烴（諸如1，3 -環戊一烯、順_1，3 -戊二烯、反- i，3_戊二浠、1，4_戌一稀、1-戍快、2-戍块、3 -曱基_1_丁块、戍_4_稀快、 149048.doc -10· 201111512 反-戊-3-稀-1 -炔或順-戊-3 -烯-1 -炔）。在一些實施例中，以組合物中所有C 5烴之總重量計，組合物具有小於或約 0.12 、 0.10 、 0.08 、 0.06 、 0.04 、 0.02 、〇.〇1 、 0.005 、

0.001、0.0005、o.oool、0.00005 或〇.〇〇〇〇1重量％之 ι，3-環戊二烯、反-1,3-戊二晞、順-1，3-戊二稀、1，4-戊二稀、ι_ 戊炔、2-戊炔、3-曱基-1-丁炔、戊-4-烯-1-炔、反-戊-3-烯· 1 -快或順-戊-3-烯-1 -炔。在特定實施例中，組合物具有大於約2 mg之異戊二烯，且以組合物中所有C5烴之總重量計’具有大於或約 99.90、99.92、99·94、99.96、99.98 或 100重量°/。之異戊二烯。在一些實施例中’組合物具有小於或約5〇、4〇、3〇、 20、10、5、1、〇.5、〇.1、〇.05、0.01或〇〇〇5 抑制異戊二烯聚合之化合物（組合物中抑制異戊二烯聚合之任何化合物）。在特定實施例中，組合物亦具有大於約2 mg之異戊二烯。 -----/、μ _岬 < 虱相及（ii)製造大於約400 nmo丨仏㈧⑽仆的異戊二烯之培養中名胞。在-些實施例中’組合物包含封閉系統，且當針對 mL、i 、培養H、時進行校正時，氣相包含大田 5、1。、2。，，、5。、6。、7〇，、9〇、1〇〇離之: 戍一稀些實施例令’組合物包含開放系統，且當, 1 vvm之速率釋氣時，氧相七 ^ 于巩相包含大於或約5、1〇、2〇 40、5:广、7。、8。、9。'1〇〇 _ 之異貫施例t，以揮發性有機部分中所有⑽之總重量計^ 149048.doc • 11 · 201111512 相之揮發性有機部分包含大於或約99.90、99.92、99 %、 99.96、99.98或loo重量％之異戊二稀。在一些實施例中以揮發性有㈣分中所f之㈣量計，氣相之揮發性有機部分包含小於或約〇.12、0.10、0.08、0.06、0.04、 0.02、0.01' 0.005、0·001、0·0〇〇5、〇〇〇〇1'〇〇〇〇·〇〇_重量％之非異戊二烯之㈣（諸如13_環戊二稀-、順-1，3-戊二烯、反]，3_戊二烯、戊二烯、卜戊炔、2 戊炔、3-甲基+ 丁炔、戊稀小块、反-戍·3_稀小

順-戍冬稀小炔）。在—些實施例中，以揮發性有機部分中所有C5經之總重量計，氣相之揮發性有機部分具有小於約〇.12、〇.1〇、〇.08、0.06、0.04、0 〇2、〇〇1、〇〇〇5次〇观、〇._5、0·0001、〇〇〇〇〇5 或〇〇〇〇〇1 重量％之门产戊一烯順-1，3-戊二烯、反.π戊二稀、【，心戊二烯、1 戍块、2-戊炔、3-甲基小丁炔、戊冰婦小块、反_戊3 “快或順-戊-3♦…在特定實施例中，氣 _

部分具有大於約2 mg之異戍二烤，且以揮發㈣ …所有C5 之總重量計，具有大於或約99列、 99.92、99^4' 99.96、99 98或刚重量％之異戊二稀。在一些實施例中’氣相之揮發性有機部分具有小於或約二._抑制異戊二稀聚合之化合物（氣相之揮發性有機 ^抑制.異戊二稀聚合之任何化合物）。在特定實施例乳相之揮發性有機部分亦具有大於約2叫之異戊二 149048.doc •12- 201111512 在本明之任何組合物之一些實施例中，至少一部分異戊二烯處於氣相中。在一些實施例中，至少一部分異戊二烯處於液相（諸如冷凝物）中。在一些實施例中，至少一部刀異戊二烯處於固相中。在一些實施例中，至少一部分異戊二烯吸附於固體支撐物，諸如包括二氧化矽及/或活性石厌之支撐物。在一些實施例中，組合物包括乙醇。在—些貫施例中，組合物包括約75至約90重量％之乙醇，諸如約 75至約80重量％、約8〇至約85重量％或約85至約卯重量％之乙醇。在一些實施例中，組合物包括約4至約丨5重量％之異戊二烯’諸如約4至約8重量％、約8至約12重量。/。或約 12至約15重量％之異戊二烯。在些貫施例中，本發明亦提供包括本文所述之任何細胞及/或組合物之系統。在一些實施例中，系統包括腔室包含製造大於約 400、500、600、700、800、900、 1,000、1，25〇、1，5〇〇、1，750、2,000、2,500、3,0〇〇、 4’〇〇〇、5,000 nmol/gwcm/h 或 5,000 nmol/gwcm/h以上之異戊二稀之培養中細胞的反應器。在一些實施例中，系統並非封閉系統。在一些實施例中，自系統中移出至少一部分異戍二烯。在一些實施例中，系統包括包含異戊二烯之氣相°在多個實施例中，氣相包含本文所述之任何組合物。在一態樣中，本發明提供一種包含聚異戊二烯之輪胎。在一些實施例中’聚異戊二烯係藉由⑴使本文所述之任何組合物中之異戊二烯聚合，或（Π)使自本文所述之任何組合物中回收之異戊二烯聚合來製造。在一些實施例中，聚 149048.doc •13· 201111512 異戊二烯包含順-1，4-聚異戊二烯。在本發明之任何組合物、系統及方法之一些實施例中，於氣相中製造非可燃濃度之異戊二烯。在一些實施例中，氣相包含小於約9.5%(體積）之氧氣。在一些實施例中，氣相包含大於或約9.5%(體積）之氧氣，且氣相中異戊二烯之濃度低於可燃下限或高於可燃上限。在一些實施例中，氣相中非異戊二烯之部分包含約〇%至約i 〇〇%(體積）之氧氣，諸如約10%至約100%(體積）之氧氣。在一些實施例中’氣相中非異戊二烯之部分包含約〇%至約99%(體積）之 II氣。在一些實施例中’氣相中非異戊二烯之部分包含約 1%至約50%(體積）之c〇2。在本發明之任何態樣之一些實施例中，細胞進一步包含編碼DXP途徑相關多肽之異源核酸、或内源核酸之複本。在本發明之任何態樣之一些實施例中，培養中細胞製造大於或約 400、500、600、700、800、900、1，000、 1，250、1，500、1，750、2,000、2,500、3,000、4,000、 5,000 nmol 異戊二烯/gwem/h 或 5,〇〇〇 nm〇i 異戊二烯/gwcm/h 以上之異戊二烯。在本發明之任何態樣之一些實施例中，培養中細胞使細胞培養基中大於或約0.002、0.005、〇.〇1、 0.02 、〇_〇5 、〇.1 、 0.12 、 0.14 、 0.16 、 0.2 、 0.3 、 0.4 、 0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.2、1.4、1.6% 或 1.6% 以上之碳轉化成異戊二烯。在本發明之任何態樣之一些實施例中’培養中細胞製造大於或約1、10、25、50、100、 150 、 200 、 250 、 300 、 400 、 500 、 600 、 700 、 800 、 900 、 149048.doc •14· 201111512 1，000 ' 1,250、1，500、1，750、2,000、2,500、3,000、 4.000、 5，0〇〇、10,000、i〇〇,〇〇〇奈克異戊二烯 / 公克細胞 (細胞濕重）/小時（ng/gwcm/h)或100,000 ng/gwcm/h以上之異戊二烯。在本發明之任何態樣之一些實施例中，培養中細胞製造累積力價（總量）大於或約為i、1〇、25、50、1〇〇、 150 、 200 、 250 ' 300 、 400 、 500 、 600 、 700 、 800 、 900 、 1，〇〇〇、1，250、1，500、1,750、2,000、2,500、3,000、 4.000、 5,0〇〇、1〇,〇〇〇、50,000、100,000毫克異戊二烯/公升培養液（mg/L“ * ’其中培養液體積包括細胞及細胞培養基之體積）或100,000 mg/L培巷液以上之異戊二烯。異戊二烯製造之其他例示性速率及異戊二烯製造之總量揭示於本文中。在本發明之任何態樣之一些實施例中’可使用突變型 DXP途徑多肽及源自其之核酸來進一步增加異戊二烯產量。在一些實施例中，突變型Dxp途徑多肽為移除鐵硫簇調控子（iscR)之HDR多狀。在一些實施例中，突變型DXP 途徑多肽為僅製造DMAPP或相對於ιρρ所製造之dmAPP佔大多數之突變型HDR多肽。在本發明之任何態樣之一些實施例中，可藉由增加通過 DXP途徑及/或MVA途徑之碳通量來進一步增加異戊二烯產量。在一些實施例中，可藉由避免DXp途徑下游之代謝物或/及使用DXP途徑多肽作為受質之其他途徑之中間物對 DXS活性產生任何回饋抑制來增加碳通量。在一些實施例中，使用DXP途徑多肽作為受質（例如DXp)之其他途徑為 149048.doc 15 201111512 硫胺素（thiamine^維生素B丨）或吡n多醛（pyHd〇xai)(維生素 B6)途徑。在-些實施例中，可藉由表現來自不同生物體的不受DXP途徑之下游產物抑制之Dxp途徑多肽來增加碳通量。在-些實施例中’可藉由解除對葡萄糖吸收之控制來增加碳通量。在其他實施例中，可藉由使ϋχρ途徑及/或 MVA途徑所需之前驅物之間的平衡逹到最大來增加碳通量。在-些實施例中，可藉由在獨立地升高或降低丙§同酸或甘油醛-3-磷酸（G-3-P)之作用下使碳通量重定向來達成 DXP途徑前驅物、丙酮酸及〇·3_ρ之平衡。在一些實施例中，可使用CRP(cAMP受體蛋白）缺失之突變體來增加碳通量。在一些貫施例中，可使用含有丙酮酸去氫酶E丨次單位變異體之菌株（含有一或多個Dxp途徑基因或一或多個Dxp途徑與MVA途徑基因）來增加碳通量。在一些實施例中’丙酮酸去氫酶（PDH)E 1次單位變異體具有E63 6(^點突變。在本發明之任何態樣之一些實施例中，可藉由將異源萜類合成酶核酸、或内源莊類合成酶核酸之複本引入細胞中，利用DXP途徑之下游基因或多肽來進一步增加異戊二烯產量，該萜類合成酶核酸包括（但不限於）羅勒烯合成酶 (ocimene synthase)、法呢稀合成酶（farnesene synthase)及青蒿素合成酶（artemesinin synthase)。在本發明之任何態樣之一些實施例中，在一些實施例中，載體包含選擇性標記物，諸如抗生素抗性核酸。在本發明之任何態樣之一些實施例中，異源異戊二烯合 149048.doc 201111512 成酶核酸可操作地連接於T7啟動子，諸如中等複本或高複本質體中所含之Τ7啟動子。在本發明之任何態樣之一些實施例中，異源異戊二稀合成酶核酸可操作地連接於Τα啟動子，諸如中等複本或高複本質體中所含之啟動子。在本發明之任何態樣之一些實施例中，異源異戍二稀合成酶核酸可操作地連接於Lac啟動子，諸如低複本質體中所含之Lac啟動子。在本發明之任何態樣之一些實施例中， φ 異源異戊二烯合成酶核酸可操作地連接於内源啟動子，諸如内源鹼性絲胺酸蛋白酶啟動子。在一些實施例中，異源異戊二烯合成酶核酸整合至不含選擇性標記物之細胞的染色體中。在些貫施例中，鐵硫簇相互作用氧化還原核酸，DXp 途徑、MVA途徑中之任意一或多種核酸，及異戊二烯合成酶核酸置於在停滞期比在生長期更具活性之啟動子或因子的控制下。在一貫施例中，亦包括IDI核酸以供IDI表現， • 從而製造與未使用之情況相比更高量之異戊二烯。舉例而言，一或多種鐵硫簇相互作用氧化還原核酸、Dxp途徑核酸、IDI核酸或異戊二烯合成酶核酸可置於停滯期σ因子（諸如RP〇S)之控制下。在一些實施例中，一或多種鐵硫娱相互作用氧化還原核酸、DXP途徑核酸、MVa途徑核酸、IDI核酸或異戊二烯合成酶核酸置於在停滯期可誘導之啟動子’諸如在停滯期可由反應調控子誘導呈活性之啟動子的控制下。在本發明之任何態樣之一些實施例中，表現鐵硫簇相互 149048.doc •17· 201111512 作用氧化還原多肽、異戊二烯合成酶多肽及Dxp途徑多肽之細胞在非誘導條件下生長。在本發明之任何態樣之一些貫靶例中，表現鐵硫簇相互作用氧化還原多肽、途徑多肽、IDI多肽及異戊二烯合成酶多肽之細胞在非誘導條件下生長。舉例而言’非誘導條件為Trc啟動子調控之基因構築體未進行IPTG誘導之表現。在本發明之任何態樣之一些實施例中，除第一 Dxp途徑多肽以外，細胞亦表現第二DXP途徑多肽，該第一 Dxp途 L夕肽包括DXS(1-去氧_D-木酮糖_5·碟酸合成酶）、 DXR(1·去氧木酮糖_5_磷酸還原異構酶）、mct(4_:磷西文胞苦-2C-曱基-D-赤藻糖醇合成酶）、CMK(4-二磷酸胞芽-2-C-甲基-D-赤藻糖醇激酶）、MCS(2C-甲基-D-赤藻糠醇2,4-環二峨酸合成酶）、hds(1-羥基-2-曱基-2-(E)-丁烯基4_二磷酸合成酶）及HDR(1-羥基-2-曱基-2-(E)-丁烯基4-二磷酸還原酶）。在本發明之任何態樣之一些實施例中，除如上所述之第一 Dxp途徑多肽以外，細胞亦表現兩種或兩種以上DXP途徑多肽。在本發明之任何態樣之一些實施例中’除如上所述之第一 DXP途徑多肽以外，細胞亦表現 2、3、4、5、ό或7種DXP途徑多肽。在本發明之任何態樣之一些實施例中，除第一 MVA途徑多狀以外，細胞亦表現第二MVA途徑多肽，該第一 MVA途徑多肽包括乙醯基_CoA乙醯轉移酶（Aa-CoA硫解酶）、3-經基-3-甲基戊二醯基_c〇A合成酶（HMG_c〇A合成酶）、3-經基-3-曱基戊二醯基_c〇A還原酶（HmG-CoA還原酶）、曱 149048.doc -18- 201111512 羥戊酸激酶（MVK)、磷酸甲羥戊酸激酶（ΡΜΚ)、二磷酸甲羥戊酸去羧酶（MVD)、磷酸曱羥戊酸去羧酶（pMDC)及異戊烯基碌酸激酶（ΙΡΚ)。在本發明之任何態樣之一些實施例中，除如上所述之第一 MVA途徑多肽以外，細胞亦表現兩種或兩種以上MVA途徑多肽。在本發明之任何態樣之一些實施例中，除如上所述之第一 MVA途徑多肽以外，細胞亦表現2、3、4、5、6或7種MVA途徑多肽。在本發明之任何態樣之一些實施例中，至少一部分細胞於連續培養物（諸如未經稀釋之連續培養.物）中歷經至少或約5、1〇、20、40、50、60、65次或65次以上之細胞分裂’維持異源鐵硫簇相互作用氧化還原核酸、Βχρ途徑核酸及異戊二烯合成酶核酸。在本發明之任何態樣之一些實施例中’至少一部分細胞於連續培養物（諸如未經稀釋之連續培養物）中歷經至少或約5、1〇、2〇、40、5〇、6〇、65 次或65次以上之細胞分裂，維持異源鐵硫簇相互作用氧化還原核酸' IDI核酸、DXP途徑核酸及異戍二烯合成酶核酸。在本發明之任何態樣之一些實施例中，至少一部分細胞於連續培養物（諸如未經稀釋之連續培養物）中歷經至少或約5、1〇、20、40、50、60、65次或65次以上之細胞分裂本持異源異戊一稀合成酶核酸、DXS核酸、IDI核酸及if硫簇相互作用氧化還原核酸。在本發明之任何態樣之一些實施例中，包含鐵硫藤相互作用氧化還原核酸、異戊二烯合成酶核酸、DXP途徑核酸及/或取核酸之核酸亦包含選擇性標記物’諸如抗生素抗性核酸。 149048.doc -19- 201111512 在本發明之任何態樣之一些實施例中，異戊二烯合成酶多肽為來自以下植物之多肽：諸如葛屬例如山暮[Pueraria Montana)氣:K % 藤（Pueraria lobata))或橋屬 (户0尸例如美洲山楊（·Popw/ws iremw/oWes)、銀白楊 (Populus alba)、Μ 楊（p〇pUius nigra)、毛果楊（p〇puius ίΗΜοανα)或銀白揚與歐洲山楊雜交種（hybHd，尸叩w/wi alba x Populus tremula)) ° 在本發明之任何態樣之一些實施例中，細胞為細菌細胞’諸如革蘭氏陽性細菌細胞（例如桿菌屬（5acz7/WiS)細胞’諸如枯草桿菌SWMD)細胞；或鏈黴菌屬 (々repM—細胞，諸如青紫鏈黴菌、天藍色鏈黴菌（Sirepiow少cei 或灰色鏈黴菌（汾grbew)細胞）；或藍細菌細胞（例如溫泉菌屬(Thermosyneckococcus)細胞，諸如臺灣溫泉菌 (77zerwc»i；/«ec/7〇coccwi e/ongaies)細胞）。在本發明之任何態樣之一些實施例中’細胞為革蘭氏陰性細菌細胞（例如大腸桿菌屬C^c/zeWc/π’α)細胞’諸如大腸桿菌 co/z_)細胞；或泛菌屬細胞，諸如檸檬泛菌 (Pawioea c/ira)細胞）；或藍細菌細胞（例如溫泉菌細胞，諸如臺灣溫泉菌細胞）。在本發明之任何態樣之一些實施例中，細胞為真菌細胞，諸如絲狀真菌細胞（例如木黴屬 (7WC/2〇Armfl)細胞，諸如里氏木黴（7>z，c/2〇£/er/wa㈣如.）細胞；或麴菌屬細胞，諸如米麴菌〇r_yzae)及黑麴菌⑽_〜)）；或酵母細胞（例如耶 149048.doc •20· 201111512 諸如解脂耶氏酵母（Fiarrowk 氏酵母屬（FarroiWa)細胞 lipolytica)細胞）。在本發明之任何態樣之一些實施例只也例中，微生物多肽碳源包括-或多種來自酵母或細菌之多肽。在本發明之任何態樣之-些實施例中，植物多肽碳源包括_或多種來自大旦、玉米、芥花(Canola)、麻風樹 '棕櫚 '花生、向日

葵、椰子、芥子、油菜籽、棉杆、標摘仁、㈣、紅花、芝麻或亞麻子之多肽。種由本發明之任何組合物或在一態樣中，本發明提供一方法製造之產品。【實施方式】本發明特別提供使用各種Dxp途徑基因與多肽各種 MVA途徑基因與纽、鐵硫鎮相互作用氧化還房、基因與多肽、異戊二烯合成酶基因與多肽、及視情況選用之mI基因與多肽及各種與DXP途徑及/或MVA途徑相關之基因與夕肽，以增加之量製造異戊二烯的組合物及方法。除非另有規定，否則本文中所用之所有技術及科學術語之含義皆為熟習本發明所屬領域之技術者通常所理解之含義。Singleton 等人，Dicti〇nary Microbiology and Molecular Biology，第 2版，j〇hn Wiley and Sons, New York (1994) ’ 及 Hale 與 Marham, The Harper Collins Dictionary of Biology，Harper Perennial，N.Y. (1991)向熟習此項技術者提供本發明中所用之許多術語的通用辭典。應瞭解’本發明並不限於所描述之特定方法、方案及試劑， 149048.doc 201111512 因為其可變化。熟習此項技術者亦應瞭解，類似或等效於本文所述之任何方法及材料亦可用於實施或測試本發明。本文中所提供之標題並不限制本發明之各個態樣或實施例，該等態樣或實施例總體上可參考說明書而獲得。本文中所用之術語「異戊二烯」或「2甲基-丁二烯」（CAS編號78·79_5)係指自3,3_二曱基烯丙基焦磷= (DMAPP)消除焦磷酸而得到之直接及最終揮發性烴產物，且並不涉及一或多種異戊烯基二磷酸（ιρρ)分子與一或多種DMAPP分子之鍵聯或聚合。術語「異戊二烯」'一般不欲受其製造方法限制。本文中所用之片語「各種與Dxp途徑相關之基因及多肽」或「DXP途徑相關核酸或多肽」係指與Dxp途徑多狀或核酸直接或間接地相互作用之任何核酸或多肽，包括 (但不限於)鞋類合成酶(例如羅勒烯合成酶、法呢烯合成酶及青蒿素合成酶）。對於在本文中使用，除非另有明確指示，否則術語「一種（個）」及其類似術語之使用係指一或多種（個）。本文中對「約」某-值或參數之提及情況包括(且描述) 指向彼值或參數本身之實施例。舉例而言，提及「約X」之描述包#「X」之描述。數值範圍包括界定該範圍之數值0 實施例包括「包含態」及「基本上由態樣應獠解’本文所述之本發明態樣及樣及，實施例」、「由態樣及實施例組成及實施例組成」。 149048.doc -22· 201111512 本發明部分地基於以下令人驚訝之發現；鐵硫簇相互作用氧化還原多肽之量增加會增加DXP途徑多肽（諸如hds多肽（GcpE或IspG)或HDR多肽（IspH或LytB))所顯示之活性。在不欲受特定理論約束下，咸信一或多種内源或異源鐵硫相互作用氧化還原核酸或多肽之表現增加會改良含有鐵硫簇之DXP途徑多肽（諸如HDS4HDR)之形成速率及量及/ 或穩定含有鐵硫簇之DXP途徑多肽（諸如HDS或HDR)。此 φ 繼而藉由在DXP途徑中增加HMBPP及/或DMAPP合成且減少cMEPP及HMBPP庫來增加細胞中實現異戊二烯合成之碳通1。舉例而言，在過度表現DXP途徑多肽（DXS)、異戊二烯合成酶多肽及IDI多肽之細胞中過度表現鐵硫簇相互作用氧化還原多肽（黃素氧化還原蛋白υ使得異戊二烯產量與僅過度表現DXP途徑多肽、異戊二烯合成酶多肽及mi 多肽之細胞相比增加約丨_2倍。參見實例8。過度表現一或 ^種鐵硫簇相互作用氧化還原多肽（鐵氧化還原蛋白及鐵 Φ 氧化還原蛋白_NADP+氧化還原酶）、一或多種DXP途徑多肽、異戊二烯合成酶多肽及IDI多肽使得異戊二烯產量增加。參見實例9。因此，在本發明之一態樣中，培養中細胞包含⑴編碼鐵硫簇相互作用氧化還原多肽之異源核酸、編碼Dxp途徑多肽之異源核酸及編碼異戊二烯合成酶之異源核酸，及/或 (Π)編碼鐵硫簇相互作用氧化還原多肽、Dxp途徑多肽及異戊二烯合成酶多肽之内源核酸之複本。在一些實施例中’培養中細胞包含⑴編碼鐵硫簇相互作用氧化還原多狀 149048.doc 23- 201111512 之異源或内源核酸之一或多個複本，（ii)編碼Dxp途徑多肽之異源或内源核酸之一或多個複本，及(出)編碼異：: 烯合成酶多肽之異源或内源核酸之—或多個複本

在本發明之另一態樣中，提供製造異戊二烯之方法。在一實施例中，該方法包含（a)在適於製造異戊二烯之培養條件下培養包含以下之細胞：⑴編碼鐵硫簇相互作用^化還原多肽、DXPit徑多料異戊二稀合成酶多肽之異源核酸，及/或（ii)編碼鐵硫簇相互作用氧化還原多肽、DXp途徑多肽及異戊二烯合成酶多肽之内源核酸之複本；及斤）= 造異戊二稀。 & 本文中所用之鐵硫簇相互作用氧化還原多狀為能夠將電子轉移至含有鐵硫簇之多肽的多肽。鐵硫簇相互作用氧化還原多肽包括（但不限於）黃素氧化還原蛋白（例如黃素氧化還原蛋白I)、黃素氧化還原蛋白還原酶、鐵氧化還原蛋白 (例如鐵氧化還原蛋白υ、鐵氧化還原蛋白_NADP+氧化還原酶，及編碼其之基因或多肽（例如力^或刀…）。舉例而言，DXP途徑多肽HDS(GcpE)為具有[4Fe4s]2+中心之金屬酶且經由在黃素氧化還原蛋白/黃素氧化還原蛋白還原酶存在下還原[4Fe_4S]2+巾，d介導之兩個依序單電子轉移過程而催化cMEPP還原成HMBPP(參見Wolff等人，。"⑽，541:115-12〇 (2〇〇3)，其藉此以全文引用的方式併入）。類似地，DXP途徑多肽HDR(LytB)亦為在黃素氧化還原蛋白/角素氧化還原蛋白還原酶/NADpH系統存在下經由兩個依序單電子轉移過程而催化HMBPP還原成IPP或 149048.doc -24 - 201111512 DMAPP之Fe/S蛋白。參見，例如Seemann, Μ·等人， Agnew. Chem. Int. Ed., 41: 4337-4339 (2002) ； Wolff, 人，Zeiier·?，541: 115-120 (2003)，各藉此以全文引用的方式併入，尤其關於GcpE、LytB及黃素氧化還原蛋白/黃素氧化還原蛋白還原酶/NADPH系統之描述。本文中所用之黃素氧化還原蛋白為能夠轉移電子且含有輔基黃素單核苷酸之蛋白質。在大腸桿菌中，黃素氧化還原蛋白係由//ώΜ基因編碼且由含FAD蛋白NADPH:鐵氧化還原蛋白氧化還原酶還原，且在類異戊二烯生物合成之DXP 途徑中起基本作用（參見，例如Kia-Joo，P.等人，F五 Leiier·?，579: 3802-3806，2005，其藉此以全文引用的方式併入）。本文中所用之鐵氧化還原蛋白為能夠轉移電子且含有等量之鐵及不穩定硫且在類異戊二烯生物合成之DXP途徑中起基本作用的蛋白質。舉例而言，來自植物及藍細菌之 HDS已顯示為鐵氧化還原蛋白依賴性酶，而非黃素氧化還原蛋白依賴性酶（Seemann 等人，尸 £551 580(6):1547- 52 (2006)，其藉此以全文引用的方式併入）。本文中所用之Fpr編碼黃素氧化還原蛋白/鐵氧化還原蛋白NADPH-氧化還原酶且經由FldA向HDS及HDR提供源自 NADPH之必需電子以執行HDS及HDR之催化功能（於以下報導中評述：L. A. Furgerson，77ze

Pathway to Isoprenoid Compounds: Discovery, Elucidation, 2006年 2月 13曰出版，其藉此以 149048.doc -25- 201111512 全文引用的方式併入）。本文中所用之經編碼DXS、DXR、MCT、CMK、MCS、 HDS及HDR多肽為生物合成異戊二烯之DXP途徑之一部分 (圖 19A)。 DXS多肽使丙酮酸及D-甘油醛-3-磷酸轉化成1-去氧-D-木酮糖-5-磷酸（DXP)。在不欲受任何特定理論約束下，咸信增加DXS多肽之量會增加通過DXP途徑之碳流量，從而使得異戊二烯產量較高。 DXR多肽使1-去氧-D-木酮糖5-磷酸（DXP)轉化成2-C-甲基-D-赤藻糖醇4-磷酸（MEP)。在不欲受任何特定理論約束下，咸信增加DXS多肽之量會增加通過DXP途徑之碳流量，從而使得異戊二烯產量較高。 MCT多肽使2-C-甲基-D-赤藻糖醇4-磷酸（MEP)轉化成4-(胞苷5'-二磷酸基）-2-C-曱基-D-赤藻糖醇（CDP-Me)。在不欲受任何特定理論約束下，咸信增加MCT多肽之量會增加通過DXP途徑之碳流量，從而使得異戊二烯產量較高。 CMK多肽使4-(胞苷5’-二磷酸基）-2-C-曱基-D-赤藻糖醇 (CDP-ME)轉化成2-磷酸基-4-(胞苷5'-二磷酸基）-2-C-曱基-D-赤藻糖醇（CDP-MEP)。在不欲受任何特定理論約束下，咸信增加CMK多肽之量會增加通過DXP途徑之碳流量，從而使得異戊二烯產量較高。 MCS多肽使2-磷酸基-4-(胞苷5’-二磷酸基）-2-C-曱基-D-赤藻糖醇（CDP-MEP)轉化成2-C-曱基-D-赤藻糖醇2,4-環二磷酸（ME-CPP或cMEPP) 〇在不欲受任何特定理論約束下， 149048.doc -26- 201111512 咸信增加MCS多肽之量會增加通過DXP途徑之碳流量，從而使得異戊二烯產量較高。 HDS多肽使2-C-甲基、d-赤藻糖醇2,4-環二磷酸（ME-CPP 或cMEPP)轉化成（E)-4、羥基_3_曱基丁 -2-烯-1-基-二磷酸 (HMBPP或HDMAPP)。在不欲受任何特定理論約束下，咸信增加HDS多肽之量會增加通過DXP途徑之碳流量，從而使得異戊二烯產量較高。 HDR多肽使（E)-4-羥基_3_曱基丁 -2-烯-1-基-二磷酸 (HMBPP)轉化成異戊烯基二磷酸（ιρρ)及二曱基烯丙基二磷酸（DMAPP)。在不欲受任何特定理論約束下，咸信增加 HDR多肽之量會增加通過DXP途徑之碳流量，從而使得異戊二烯產量較高。異戊二烯合成酶多肽使二甲基烯丙基二磷酸（DMAPP)轉化成異戊二烯。異源鐵硫簇相互作用氧化還原多肽、DXP途徑多肽及異戊二烯合成酶多肽可於多種宿主細胞，諸如大腸桿菌、檸檬泛菌、枯草桿菌、解脂耶氏酵母及里氏木黴中表現。所有此等細胞比僅天然存在之DXP途徑製造更多異戊二烯。如下文進一步論述，可藉由增加鐵硫簇相互作用氧化還原多肽、DXP途徑多肽及異戊二烯合成酶多肽之表現量來增強細胞製造異戊二烯。DXP途徑多肽包括DXS、DXR、 MCT、CMK、MCS、HDS及HDR。舉例而言，可將一或多種DXP途徑核酸引入細胞中，包括DXS、DXR、MCT、 CMK、MCS、HDS 及 HDR。DXS、DXR、MCT、CMK、 149048.doc 27· 201111512 MCS、HDS或HDR核酸可為異源核酸、或内源核酸之複本。類似地，鐵硫簇相互作用氧化還原核酸可為異源核酸、或内源核酸之複本。類似地，異戊二烯合成酶核酸可為異源核酸、或内源核酸之複本。在一些實施例中，藉由將一或多種内源鐵硫簇相互作用氧化還原啟動子或調控區、一或多種内源 DXS、DXR、MCT、CMK、MCS、HDS 或HDR啟動子或調控區、及異戊二烯合成酶啟動子或調控區置換為增強鐵硫簇相互作用氧化還原核酸、一或多種 DXS、DXR、MCT、CMK、MCS、HDS 或 HDR核酸、及異戊二烯合成酶核酸之轉錄的其他啟動子及/或調控區，來增加 < 或多種鐵硫鎮相互作用氧化還原多肽、一或多種 DXS、DXR、MCT、CMK、MCS、HDS 或 HDR 多肽、及異戊二稀合成酶多肽之量。在一些實施例中，異源或額外内源鐵硫簇相互作用氧化還原核酸、DXP途徑核酸及異戊二烯合成酶核酸之存在使得細胞與僅具有此等異源或額外内源核酸中之一或兩者的相應細胞相比，生長更具再現性及/或保持活力更長時間。在不欲受特定理論約束下，咸信過度表現鐵硫簇相互作用氧化還原多肽可增加一或多種DXP途徑多肽（例如 GcpE及/或LytB)之形成速率或量或穩定一或多種DXP途徑多肽（例如GcpE及/或LytB)，使得一或多種DXP途徑多肽歷經較長時段具有活性，繼而使得含有異源或額外内源鐵硫簇相互作用氧化還原核酸、DXP途徑核酸及異戊二烯合成酶核酸之細胞與僅具有此等異源或額外内源核酸中之一或 149048.doc -28- 201111512 :者的相應細胞減’生長更具再現性及/或保持活力更長時間。舉例而言，含有異源鐵缺η 鐵硫蔟相互作用氧化還原核酉义、游途徑核酸及異戊二稀合成酶核酸之細㈣僅呈有咖途徑核酸、僅具有異源鐵硫簇相互作用氧化、還原核酉义、具有異源鐵硫鎮相互作用氧化還原核酸及⑽途炉校酸、具有鐵㈣相互作用氧化還原核酸及異紅烯合成酶核酸、或具有DXP途徑核酸及異戊二烯合成酶核酸之細胞相比，生長情況更好…大量鐵硫鎮相互作用氧化還原多肽、DXPit徑多肽及異戊二烯合成酶多肽可於細胞中表現’而對細胞不產生過量毒性。在本發明之任何態樣之-些實施例中，除第—Dxp途徑多肽以外，細胞亦表現第二DXP途徑多肽，該第一Dxp途徑多肽包括DXS(1-去氧-D-木酮糖_5_磷酸合成酶）、 DXR(1-去氧①_木酮糖_5_磷酸還原異構酶）、mct(4二磷酸胞苷-2C-曱基-D_赤藻糖醇合成酶）、cmk(4_二磷酸胞苷-2-C-曱基-D-赤藻糖醇激酶）、MCS(2C_甲基_D_赤藻糖醇2,4-環二磷酸合成酶）、HDS〇_羥基·2甲基_2_(E) 丁烯基4-二磷酸合成酶）及HDR(1_羥基_2_曱基_2_(e)_丁烯基4_ 一磷酸還原酶）。在本發明之任何態樣之一些實施例中，除如上所述之第一 DXP途徑多肽以外，細胞亦表現兩種或兩種以上DXP途徑多肽。在本發明之任何態樣之一些實施例中，除如上所述之第一DXP途徑多肽以外，細胞亦表現 2、3、4、5、ό或7種DXP途徑多肽。另外’可藉由增加含有異源鐵硫簇相互作用氧化還原核 -29- 149048.doc 201111512 酸、DXP途徑核酸（例如DXS、DXR、MCT、CMK、 MCS、HDS或HDR)及異戊二烯合成酶核酸之細胞表現之 IDI多肽的量來增強該等細胞製造異戊二烯。在一些實施例中，可藉由增加含有異源鐵硫簇相互作用氧化還原核酸、DXS核酸及異戊二烯合成酶核酸之細胞表現之IDI多肽的量來增強該等細胞製造異戊二烯。在其他實施例中，可藉由增加含有異源鐵硫簇相互作用氧化還原核酸、HDS(IspG或GcpE)及異戊二烯合成酶核酸之細胞表現之IDI多肽的量來增強該等細胞製造異戊二烯。在一些實施例中，細胞包含IspG及fldA。在另一實施例中，細胞包含 IspG、fldA 及 IspH。在一些實施例中，可藉由增加含有異源黃素氧化還原蛋白核酸、DXS核酸及異戊二烯合成酶核酸之細胞表現之 IDI多肽的量來增強該等細胞製造異戊二烯。在其他實施例中，可藉由增加含有異源黃素氧化還原蛋白核酸、 HDS(IspG或GcpE)核酸及異戊二烯合成酶核酸之細胞表現之IDI多肽的量來增強該等細胞製造異戊二烯。在一些實施例中，可藉由增加含有異源鐵氧化還原蛋白核酸、鐵氧化還原蛋白-NADP+氧化還原酶核酸、DXS核酸及異戊二烯合成酶核酸之細胞表現之IDI多肽的量來增強該等細胞製造異戊二烯。在其他實施例中，可藉由增加含有異源鐵氧化還原蛋白核酸、鐵氧化還原蛋白-NADP+ 氧化還原酶核酸、HDS(IspG或GcpE)核酸及異戊二烯合成酶核酸之細胞表現之IDI多肽的量來增強該等細胞製造異 149048.doc -30- 201111512 戊二烯。在一些實施例中，可藉由增加含有異源鐵硫簇相互作用氧化還原核酸、HDR(IspH或LytB)核酸及異戊二烯合成酶核酸之細胞表現之IDI(異戊烯基-二磷酸δ-異構酶）多肽的量來增強該等細胞製造異戊二烯。在一些實施例中，細胞包含IspG及fldA。在另一實施例中，細胞包含IspG、fldA 及 IspH。在一些實施例中，可藉由增加含有異源黃素氧化還原蛋白、HDR(IspH或LytB)及異戊二浠合成酶核酸之細胞表現之IDI(異戊烯基-二磷酸δ-異構酶）多肽的量來增強該等細胞製造異戊二烯。在一些實施例中，可藉由增加含有異源鐵氧化還原蛋白核酸、鐵氧化還原蛋白-NADP+氧化還原酶核酸、 HDR(IspH或LytB)核酸及異戊二烯合成酶核酸之細胞表現之IDI(異戊烯基-二磷酸δ-異構酶）多肽的量來增強該等細胞製造異戊二烯。在一些實施例中，可藉由增加含有異源鐵氧化還原蛋白核酸、鐵氧化還原蛋白-NADP+氧化還原酶核酸、HDS及 HDR核酸、及異戊二烯合成酶核酸之細胞表現之IDI(異戊烯基-二磷酸δ-異構酶）多肽的量來增強該等細胞製造異戊二烯。 IDI多肽催化異戊烯基二磷酸（ΙΡΡ)與二曱基烯丙基二磷酸（DMAPP)相互轉化。在不欲受任何特定理論約束下，咸信增加細胞中IDI多肽之量會增加轉化成DMΑΡΡ(繼而轉化 149048.doc •31 - 201111512 成異戊二烯）之IPP的量（及轉化率）。 IDI核酸可為異源核酸、或内源核酸之複本。在一些實施例中，藉由將内源鐵硫簇相互作用氧化還原啟動子或調控區、一或多種内源DXP途徑啟動子或調控區、及IDI啟動子或調控區置換為增強鐵硫簇相互作用氧化還原核酸、 DXP途徑核酸、異戊二烯合成酶核酸及IDI核酸之轉錄的其他啟動子及/或調控區來增加鐵硫簇相互作用氧化還原多肽、一或多種DXP途徑多肽（例如DXS、DXR、MCT、 CMK、MCS、HDS或HDR)、異戊二烯合成酶多肽及IDI多肽之暈。異源IDI多肽亦可在異戊二烯合成酶存在下於多種宿主細胞，諸如大腸桿菌、檸檬泛菌、枯草桿菌、解脂耶氏酵母及里氏木黴中表現。所有此等細胞與未使用IDI之情況相比製造更多異戊二烯。另外，可藉由增加含有異源鐵硫簇相互作用氧化還原核酸、DXP途徑核酸（例如DXS、DXR、MCT、CMK、 MCS、HDS或HDR)、異戊二烯合成酶核酸及視情況選用之IDI核酸的細胞表現之DXP途徑相關多肽的量來增強該等細胞製造異戊二烯。在本發明之任何態樣之一些實施例中，可使用突變型 DXP途徑多肽或源自其之核酸來進一步增加異戊二烯產量。在一些實施例中，突變型DXP途徑多肽為移除鐵硫簇調控子（iscR)之HDR多肽。在一些實施例中，突變型DXP 途徑多肽為僅製造DMAPP或相對於IPP所製造之DMAPP佔 149048.doc -32- 201111512 大多數之突變型HDR多肽。舉例而言，在DXP途徑介導之異戊二烯製造菌株中使用LytBG120D可唯一產生幾乎完全源自DMAPP之類異戍二烯產物。參見實例18。本文中所用之iscR係由位於緊接編碼大腸桿菌Fe-S簇組裝蛋白之基因上游之處之ORF編碼。在DXP途徑中，將可引導該涉及鐵硫簇組裝之isc操縱子過度表現之基因卡匣引進大腸桿菌菌株中，使該大腸桿菌菌株經工程改造，使以厭氧方式自此菌株中純化之HDR蛋白達至少200倍（GrSwert 等人，《/dm C/zem iSoc. 126(40):12847-55 (2004) ; Schwartz 等人，PNAS, 98(26):14751-3 (2001) ; Akhtar 及 Jones，

Appl. Microbiol. Biotechnol. 78(5):853-62 (2008)，各藉此以全文引用的方式併入）。在本發明之任何態樣之一些實施例中，可藉由增加通過 DXP途徑之碳通量來進一步增加異戊二烯產量。在一些實施例中，可藉由避免DXP途徑下游之代謝物或/及使用DXP 途徑多肽作為受質（例如DXR)之其他途徑之中間物對DXS 活性產生任何回饋抑制來增加碳通量。在一些實施例中，可藉由重新平衡途徑酶且將HMBPP及DMAPP之含量維持在低於1至2 mM DMAPP及1至2 mM HMBPP之濃度下來減少一些DXP途徑多肽（例如DXR)所致之回饋抑制。在一些實施例中，歷經醱酵操作之持續時間，HMBPP及DMAPP 之含量維持低於1 mM。在其他實施例中，在醱酵的指數期期間，HMBPP及DMAPP之含量維持低於1 mM。在其他實施例中，晚期DXP途徑酶、尤其IspG及IspH之含量維持 149048.doc •33· 201111512 與Dxr之磷酸化程度最低相一致。在^些實施例中，使用DXP途徑多肽作為受質（例如 DXP)之其他途杈為硫胺素（維生素βι)或吡哆醛（維生素B6) 途徑。在一些實施例中，可藉由表現來自不同生物體的不受DXP途徑之下游產物抑制之Dxp途徑多肽來增加碳通置。在一些實施例中，可藉由解除對葡萄糖吸收之控制來去'曰加碳通畺在其他實施例中，可藉由使DXP途徑所需之前驅物之間的平衡達到最大來增加碳通量。在-些實施例中可藉由在獨立地升高或降低丙酮酸或甘油搭_3-填酸 (G-3-P)之作用下使碳通量重定向來達成Dxp途徑前驅物、丙酮I及G-3-P之平衡。在—些實施例中，可使用含有丙酮酸去氫酶E1次單位變異體之菌株（含有一或多個Dxp途徑基因或一或多個DXP途徑與MVA途徑基因）來增加碳通里。在一些實施例中，丙酮酸去氫酶（pDH)E丨次單位變異體具有E636Q點突變。在一些實施例中，可使用cRp缺失之大變體來增加碳通量。本文中所用之CRp(c AMp受體蛋白）為由環狀AMP活化之正調控蛋白。RNA聚合酶需要CRp 來引發大腸桿菌之某些（分解代謝物敏感性）操縱子的轉錄。在本發明之任何態樣之一些實施例中，可藉由將異源萜類合成酶核酸、或内源莊類合成酶核酸之複本引入細胞中，利用DXP途徑之下游基因或多肽來進一步增加異戊二烯產量，該萜類合成酶核酸包括（但不限於）羅勒烯合成酶、法呢烯合成酶及青蒿素合成酶。 149048.doc • 34 - 201111512

:貫施例中’使用可再生碳源來製造異戊二稀。在二=中’異戊二稀及任何氧化劑之濃度處於非可燃範圍内以降低或消除在製造或回收異戊二稀期間可能起火之風險。參見，例如美國申請案第61/133,947號其藉此以全文引用的方式併入，尤其關於實例13及彻2咖 003007中異戊二敎可陳模型化及測試。本發明之组合 :及：法為理想的’因為其使每個細胞之異戊二烯產率較同石反產率較馬、異戊二稀純度較高、生產力較高、能量，用!〇、製造成本及投資較低及副反應最少。異戊二烯製”之此有效且大規模的生物合成過程向合成異戊二浠基橡膠提供異戊二烯來源且提供替代使用天然橡膠之理想且低成本的方法。在一些實施例中，至少一部分細胞於連續培養物（諸如未經稀釋之連續培養物）中歷經至少約5、1 〇、20、50、 75、1〇〇、200、300次或300次以上之細胞分裂，維持異源鐵硫簇相互作用氧化還原核酸、Dxp途徑核酸、Dxp途徑相關核酸及異戊二烯合成酶核酸。在一些實施例中，至少一部分細胞於連續培養物（諸如未經稀釋之連續培養物）中歷經至少約 5、10、20、50、75、100、200、300次或 3〇〇次以上之細胞分裂，維持異源鐵硫簇相互作用氧化還原核酸、DXP途徑核酸、DXP途徑相關核酸、異戊二烯合成酶核酸及IDI核酸。在本發明之任何態樣之一些實施例中，包含以下異源核酸、或以下内源核酸之複本的核酸：鐵硫簇相互作用氧化還原核酸、DXP途徑核酸、異戊二烯合成 149048.doc 35- 201111512 酶核酸及/或IDI核酸及DXP途徑相關核酸，亦包含選擇性才木§己物’諸如康黴素（kanamycin)、胺节青徽素 (ampicilHii)、羧苄青黴素（carbeniciUin)、慶大徽素 (gentamicin)、潮黴素（hygromycin)、腐草黴素（phle〇myc⑷、博萊黴素（bleomycin)、新黴素（neomycin)或氣黴素 (chloramphenicol)抗生素抗性核酸。可藉由將酵母提取物添加至細胞培養基中來進—步增加所製造之異戊二稀的量。舉例而言，測試發現所製造之異戊二烯的量與細胞培養基中酵母提取物之量就濃度而言成線性比例關係。在葡萄糖存在下增加酵母提取物之量與在酵母提取物存在下增加葡萄糖之量相比可製造更多異戊二烯。又，增加酵母提取物之量可使細胞歷經較長持續時間製造尚含量之異戊二烯且改良細胞之健康狀況。亦可使用三種類型之水解生質（甜菜渣、玉米乾草及軟木漿）作為碳源來製造異戊二烯。必要時，可在本發明之組合物及方法中使用任何其他生質碳源。生f碳源為理想的，因為其比許多習知細胞培養基便宜，進而有助於經濟地製造異戊二稀。在一些實施例中，細胞培養基中包括油。參見，例如 U.S. 61/134,094 ’其藉此以全文引用的方式併入，尤其關於細胞培養基中所包#之油。在—些實施例中，細胞培養基中包括一種以上油（諸如2、3、4、5種或5種以上油卜在不欲又任何特定理論約束了，咸信⑴油可增加細胞中可用於轉化成異戊一烯之碳的量；（丨〇油可增加細胞中甘油路3_ 149048.doc 201111512 磷酸及/或丙酮酸之量’進而增加通過DXP途徑之碳流量；及/或（ii)油可向細胞提供額外營養素，此為理想的，因為在此類細胞中許多碳轉化成異戊二烯而非其他產物。在— 些實施例中，在含有油之細胞培養基中培養之細胞天然地使用DXP途徑製造異戊二烯’或經遺傳修飾而含有整個 DXP途徑之核酸。在一些實施例中，油在添加至細胞培養基中之前部分或完全水解以有助於宿主細胞使用該油。 $ 例示性多肽與核酸各種鐵硫簇相互作用氧化還原多肽與核酸、DXP途徑多肽與核酸、DXP途徑相關多肽與核酸、異戊二烯合成酶多肽與核酸、及IDI多肽與核酸可用於本發明之組合物及方法中。本文中所用之「多肽」包括多肽、蛋白質、肽、多肽片段及融合多肽。在一些實施例中，融合多肽包括第一多肽 (例如鐵硫簇相互作用氧化還原多肽、DXp途徑多肽、οχρ • 途徑相關多肽、異戊二烯合成酶多肽及IDI多肽，或其催化活性片段）之一部分或全部，且可視情況包括第二多肽 (例如有助於純化或偵測融合多肽之肽，諸如His標籤）之一部分或全部。在一些實施例中，融合多肽具有兩種或兩種以上DXP途徑多肽之活性。在多個實施例中’多肽具有至少或約5〇、1〇〇、15〇、 175、200、250、300、350、400個或 400個以上胺基酸。在些只施例中’多肽片段含有至少或約2 5、5 0、7 5、 1〇〇、150、200、300個或300個以上來自全長多肽之相鄰 U9048.doc -37- 201111512 胺基酸，且具有相應全長多肽之至少或約5%、1〇%、 20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或 100%的活性。在特定實施例中’多肽包括任何天然存在之鐵硫簇相互作用氧化還原多肽、DXP途徑多肽、DXP途徑相關多肽、異戊二烯合成酶多肽或IDI多肽之區段或整個胺基酸序列。在一些實施例中，多肽與野生型鐵硫簇相互作用氧化還原多肽、DXP途徑多肽、DXP途徑相關多肽、異戊一晞合成酶多肽或IDI多肽之序列（亦即，天然存在之序列）相比，具有一或多個突變。在一些實施例中，多肽為分離之多肽。本文中所用之「分離之多肽」並非多肽文庫，諸如2、5、1〇、20、50種或50種以上不同多肽之文庫的一部分，且自與之一起天然存在之至少一種組分分離得到。分離之多肽可例如藉由表現編碼該多肽之重組核酸而獲得。在一些實施例中，多肽為異源多肽。「異源多肽」意謂胺基酸序列與同一宿主細胞中天然表現之另一多肽之胺基酸序列不一致的多肽。詳言之，異源多肽與同一宿主細胞中天然所見之野生型核酸不一致。本文中所用之「核酸」係指兩種或兩種以上呈單股或雙股形式之去氧核糖核苷酸及/或核糖核苷酸。在一些實施例中’核酸為重組核酸。「重組核酸」意謂相關核酸不含一或多種核酸（例如基因），該一或多種核酸在產生相關核酸之生物體的天然存在之基因組中側接相關核酸。因此，該術語包括例如藉此併入載體中、併入自主複製之質體或 149048.doc •38- 201111512

病毒中 '或併入原核細胞或真核細胞之基因組歷中，或 :依賴：其他序列以獨立分子(例如顿、基因組嶋片奴’或藉由PCR或限制性核酸内切酶分解而製造之〇職 ^幻之形式存在的重組DNA。在多個實施例中核酸為核酸。在一些實施例中’鐵硫鎮相互作用氧化還原核酸、DXPit徑㈣、Dxp麵相關核酸、異戊二烯合成酶核酸或取核酸可操作地連接於編碼另—多肽之全部或一部分的另-核酸，使得重組核酸編碼包括鐵硫簇相互作用氧化還原多肽、DXP途徑多肽、Dxp途徑相關多肽、異戊二烯合成酶多肽及/或仙、及另一多肽(例如有助於純化或，測融合多肽之肽，諸如His標籤）之全部或一部分的融合 :肽。在一些實施例中，重組核酸之一部分或全部係以化學方式合成的。應瞭解，包括單一核苷酸突變之突變可在本文所定義之核酸内發生。在一些實施例中，核酸為異源核酸。「異源核酸」意謂核酸序列與同一宿主細胞中天然所見之另一核酸之序列不一致的核酸。在特定實施例中，核酸包括任何天然存在之鐵硫簇相互作用氧化還原核酸、DXP途徑核酸、Dxp途徑相關核酸、異戊二烯合成酶核酸或IDI核酸之區段或整個核酸序列。在一些實施例中，核酸包括至少或約5〇、1〇〇、15〇、 200、300、400、500、600、700、8〇〇個或 8〇〇個以上來自天然存在之鐵硫簇相互作用氧化還原核酸、DXP途徑核酉欠、DXP途徑相關核酸、異戊二烯合成酶核酸或IDI核酸 149048.doc •39· 201111512 之相鄰核Μ。在-些實施例中’核酸與野生型鐵硫鎮相 :作用氧化還原核酸、DXP途徑核酸、Dxp途徑相關核酸、異戊二稀合成酶核酸或IDI核酸之序列（亦即，天然存在之序列)相t匕，具有一或多個突變。在一些實施例中，核酸具有-或多個増加鐵硫簇相互作用氧化還原核酸、 DXP途控核酸、Dxp途㈣關核酸、異戊二豨合成酶核酸或IDI核酸之轉錄或轉譯的突變（例如沉默突變在—些實施例中，核酸為編碼鐵硫鎮相互作用氧化還原多肽、· 途徑多肽、DXP途徑相關多肽、異戊二烯合成酶多肽或 IDI多肽之任何核酸的簡併變異體。「密碼子簡併」係指在不影響經編碼多肽之胺基酸序列的情況下允許核苷酸序列變化之遺傳密碼趨異性 (divergence) ^熟練技術人員充分瞭解使用特定針對既定胺基酸之核苷酸密碼子的特定宿主細胞所展現之「密碼子偏向性（codon-bias)」。因此，當合成使宿主細胞中之表現改良之核酸時，在一些實施例中需要設計該核酸，使得其密碼子使用頻率接近於宿主細胞之較佳密碼子使用之頻率。例示性異戊二烯合成酶及D χ p途徑多肽與核酸之寄存編號列於附錄1中（附錄1及其相應序列之寄存編號以全文引用的方式併入本文中，尤其關於異戊二烯合成酶及/或Dxp 途徑多肽與核酸之胺基酸及核酸序列）^ Kegg資料庫亦含有眾多例示性異戊二烯合成酶及/或DXP途徑多肽與核酸之胺基酸及核酸序列（參見，例如全球資訊網「genome.jp/kegg/pathway/map/map00100.html」及其中之 149048.doc •40- 201111512 序列，各藉此以全文引用的方式併入，尤其關於異戊二烯 S成酶及/或DXP途徑多肽與核酸之胺基酸及核酸序列）。在一些實施例中，異戊二烯合成酶及/或DXP途徑多肽及/ 或核酸中之一或多者的序列與2007年12月12日或2008年9 月14日公開可用之序列，諸如對應於附錄1中之任何寄存編號的任何序列或Kegg資料庫中存在之任何序列一致。其他例示性異戊二烯合成酶及/或DXP途徑多肽與核酸進一步描述於下文中。例示性異戊二烯合成酶多肽與核酸如上所述，異戊二烯合成酶多肽使二甲基烯丙基二磷酸 (DMAPP)轉化成異戊二烯。例示性異戊二浠合成酶多肽包括具有異戊二稀合成酶多肽之至少一種活性的多肽、多肽片段、肽及融合多肽。可使用標準方法，藉由量測多肽於活體外、細胞提取物中或活體内使DMAPP轉化成異戊二烯之能力來判定該多肽是否具有異戊二烯合成酶多肽活性。在例示性檢驗中，如實例1所述，藉由採用震盪燒瓶方法使菌株（例如本文所述之大腸桿菌/pTrcKudzu菌株）生長來製備細胞提取物。誘導完成後，藉由以7000xg離心1〇分鐘使約10 mL細胞集結成粒，且再懸浮於5 ml不含甘油之PEB中。採用標準程序，使用弗氏細胞壓碎器（French Pressure cell)使細胞溶解。或者’在-80°C下冷涞/解；東後，用溶菌酶（Ready-Lyse溶菌酶溶液；Epicentre)處理細胞。細胞提取物中異戊二烯合成酶多肽之活性可例如如 •41 · 149048.doc 201111512

Silver等人，j· Biol. Chem· 270:13010-13016，1995及其中之參考文獻所述來量測，各文獻藉此以全文引用的方式併入’尤其關於異戊二稀合成酶多肽活性之檢驗。將 DMAPP(Sigma)在氮氣流下蒸發至乾燥且於100 mM填酸斜緩衝液（pH 8.2)中再水合至1〇〇 mM濃度，並儲存於_2〇°c 下。為進行檢驗’將5 μΐ^ 1 M MgCl2、1 mM(250 pg/ml) DMAPP、65 pL 植物提取緩衝液(pEB)(50 mM Tris-HCl(pH 8.0)、20 mM MgCl2、5°/。甘油及2 mM DTT)之溶液添加至具有金屬螺旋帽及經鐵氟龍（tefl〇n)塗覆之石夕隔板的2〇 mi 頂部空間小瓶（Agilent Technologies)中之25 pL細胞提取物中’且在37C、於震盈下培養15分鐘。藉由添加200 pL 250 mM EDTA中止反應，且如實例i部分π所述藉由 GC/MS定量。例示性異戊二烯合成酶核酸包括編碼具有異戊二烯合成酶多肽之至少一種活性之多肽、多肽片段、肽或融合多肽的核酸。例示性異戊二烯合成酶多肽與核酸包括來自本文所述之任何源生物體的天然存在之多肽與核酸，以及源自本文所述之任何源生物體的突變型多肽與核酸。在一些實施例中，異戊二烯合成酶多肽或核酸係來自豆科’諸如豆科植物亞科。在一些實施例中，異戊二烯合成扭多肽或核酸為來自山葛（野葛（kudzu))(Sharkey等人，

Plant Physiology 137: 700-712, 2005)、大葛藤、揚屬（諸如銀白楊、黑揚、毛果楊或銀白楊與歐洲山楊雜交種 (CAC35696) ’ Miller等人，Planta 213: 483-487，2001)、山 149048.doc • 42· 201111512 楊屬（諸如美洲山揚，Silver等人，JBC 270(22): 13010-1316，1995)或英國櫟（English 〇ak/0wercWiS r〇hr)(zimmer 等人，WO 98/02550)之多肽或核酸，各文獻藉此以全文引用的方式併入’尤其關於異戊二烯合成酶核酸、及異戊二烯合成酶多肽之表現。適合之異戊二烯合成酶包括（但不限於）根據 Genbank 寄存編號 AY34143 1、AY3 16691、 AY2793 79、ΑΜ5 7070及AY182241所錕別者，各藉此以全 φ 文引用的方式併入，尤其關於異戊二烯合成酶核酸與多肽之序列。在一些實施例中，異戊二烯合成酶多肽或核酸並非來自英國櫟之天然存在之多肽或核酸（亦即，異戊二稀合成酶多肽或核酸為除了來自英國櫟之天然存在之多肽或核酸以外的異戊二烯合成酶多肽或核酸）。在一些實施例中’異戊一烯合成酶核酸或多肽為來自揚屬之天然存在之多肽或核酸。在一些實施例中，異戊二烯合成酶核酸或多狀並非來自楊屬之天然存在之多肽或核酸。 • 例示性DXP途徑多肽與核酸例示性DXP途徑多肽包括（但不限於）以下任何多肽： DXS多肽、DXR多肽、MCT多肽、CMK多肽、Mcs多肽、 HDS多肽、HDR多肽、IDI多肽，及具有一種、兩種或兩種以上DXP途徑多肽之活性的多肽（例如融合多肽）。詳言之，DXP途徑多肽包括具有DXp途徑多肽之至少一種活性的多肽、多肽片段、肽及融合多肽。例示性Dxp途徑核酸包括編碼具有DXP途徑多肽之至少一種活性之多肽、多肽片段、肽或融合多肽的核酸。例示性Dxp途徑多肽與核酸 149048.doc -43· 201111512 包括來自本文所述之任何源生物體的天然存在之多肽與核酸，以及源自本文所述之任何源生物體的突變型多肽與核酸。詳言之，DXS多肽使丙酮酸及D-甘油醛3-磷酸轉化成1-去氧-d-木酮糖5-磷酸（DXP)。可使用標準方法，藉由量測多肽於活體外、細胞提取物中或活體内轉化丙酮酸及D-甘油醛3-磷酸之能力來判定該多肽是否具有DXS多肽活性。 DXR多肽使1-去氧-d-木酮糖5-磷酸（DXP)轉化成2-C-甲基-D-赤藻糖醇4-磷酸（MEPP可使用標準方法，藉由量測多肽於活體外、細胞提取物中或活體内轉化DXP之能力來判定該多肽是否具有DXR多肽活性。 MCT多肽使2-C-曱基-D-赤藻糠醇4-磷酸（MEP)轉化成4-(胞苷5'-二磷酸基）-2-甲基-D-赤藻糖醇（CDP-ME)。可使用標準方法，藉由量測多肽於活體外、細胞提取物中或活體内轉化MEP之能力來判定該多肽是否具有MCT多肽活性。 CMK多肽使4-(胞苷5’-二磷酸基）-2-C-曱基-D-赤藻糖醇 (CDP-ME)轉化成2-磷酸基-4-(胞苷V-二磷酸基）-2-C-甲基-D-赤藻糖醇（CDP-MEP)。可使用標準方法，藉由量測多肽於活體外、細胞提取物中或活體内轉化CDP-ME之能力來判定該多肽是否具有CMK多肽活性。 MCS多肽使2-磷酸基-4-(胞苷5'-二磷酸基）-2-C-曱基-D-赤藻糖醇（CDP-MEP)轉化成2-C-曱基-D-赤藻糠醇2,4-環二磷酸（ME-CPP或cMEPP)。可使用標準方法，藉由量測多肽於活體外、細胞提取物中或活體内轉化CDP-MEP之能力來 149048.doc •44· 201111512 判定該多肽是否具有MCS多肽活性。 1103多肽使2-(：-甲基-0-赤藻糖醇2,4-環二磷酸轉化成 (E)-4-羥基-3-曱基丁 -2-烯-1-基二磷酸（HMBPP或 HDMAPP)。可使用標準方法，藉由量測多肽於活體外、細胞提取物中或活體内轉化ME-CPP之能力來判定該多肽是否具有HDS多肽活性。 HDR多肽使（E)-4-羥基-3-甲基丁 -2-烯-卜基二磷酸轉化成異戊烯基二磷酸（IPP)及二曱基烯丙基二磷酸（DMAPP)。可使用標準方法，藉由量測多肽於活體外、細胞提取物中或活體内轉化HMBPP之能力來判定該多肽是否具有HDR多肽活性。 IDI多肽使異戊烯基二磷酸轉化成二曱基烯丙基二磷酸。可使用標準方法，藉由量測多肽於活體外、細胞提取物中或活體内轉化異戊烯基二磷酸之能力來判定該多肽是否具有IDI多肽活性。例示性MVA途徑多肽與核酸在本發明之一些態樣中，本文所述之任何組合物或方法中所述之細胞包含編碼MVA途徑多肽之核酸。在一些實施例中’ MVA途徑多肽為内源多肽。在一些實施例中，細胞包含編碼MVA途徑多肽之内源核酸之一或多個其他複本。在一些實施例中，編碼MVA途徑多肽之内源核酸可操作地連接於組成性啟動子。在一些實施例中，編碼MVA途徑多肽之内源核酸可操作地連接於組成性啟動子。在一些實施例中，編碼MVA途徑多肽之内源核酸可操作地連接於強啟 149048.doc -45· 201111512 動子。在一特定實施例中，細胞經工程改造以相對於野生型細胞過度表現内源MVA途徑多肽。在一些實施例中，MVA途徑多肽為異源多肽。在一些實施例中，細胞包含編碼MVA途徑多肽之異源核酸之一個以上複本。在一些實施例中，編碼MVA途徑多肽之異源核酸可操作地連接於組成性啟動子。在一些實施例中，編碼 MVA途徑多肽之異源核酸可操作地連接於強啟動子。例示性MVA途徑多肽包括乙酿基-CoA乙醢轉移酶（AA-CoA硫解酶）多肽、3-羥基-3-甲基戊二醯基-CoA合成酶 (HMG-CoA合成酶）多肽、3-羥基-3-曱基戊二醯基_c〇A還原酶（HMG-CoA還原酶）多肽、曱羥戊酸激酶（MVK)多肽、磷酸甲羥戊酸激酶（PMK)多肽、二磷酸曱羥戊酸去羧酶 (MVD)多肽、磷酸曱羥戊酸去羧酶（PMDC)多肽、異戊稀基磷酸激酶（IPK)多肽、IDI多肽，及具有兩種或兩種以上 MVA途徑多肽之活性的多肽（例如融合多肽）。詳言之， MVA途徑多肽包括具有MVA途徑多肽之至少一種活性的多肽、多肽片段、肽及融合多肽。例示性MVA途徑核酸包括編碼具有MVA途徑多肽之至少一種活性之多肽、多肽片段、肽或融合多肽的核酸。例示性MVA途徑多肽與核酸包括來.自本文所述之任何源生物體的天然存在之多肽與核酸。另外，同樣亦可使用提供較佳異戊二稀產量之結果的 MVA途徑多肽變異體。可使用之MVA途徑多肽及/或DXP途徑多肽之類型、及製備編碼MVA途徑多肽及/或DXP途徑多肽之微生物（例如 149048.doc • 46 · 201111512 兼性厭氧菌，諸如大腸桿菌）的方法亦描述於國際專利申請公開案第W02009/076676號；美國專利申請案第 12/496,573 號、第 1 2/560,390 號、第 1 2/560,3 1 7 號、第 12/5 60,3 70號、第 12/5 60,3 05號及第 12/560,366號；及美國臨時專利申請案第61/187,930號、第61/187,934號及第 61/187,959號中。

熟習此項技術者可容易地選擇及/或使用適合之啟動子以使異戊二烯合成酶或/及一或多種MVA途徑多肽及/或一或多種DXP途徑多肽之表現最佳。類似地，熟習此項技術者可容易地選擇及/或使用適合之載體（或轉移運載體）以使異戊一浠合成酶或/及一或多種M VA途徑多肽及/或一或多種DXP途徑多肽之表現最佳。在一些實施例中，載體含有選擇性標記物。可選擇標記物之實例包括（但不限於）抗生素抗性核酸（例如康黴素、胺苄青黴素、羧苄青黴素、慶大黴素、純素、腐草黴素、博萊黴素、新黴素或氯徽素）及/或賦予宿主細胞以代謝優勢（諸如營養優勢）之核酸。在-些實施例中，異戊二烯合成酶或MVA途徑核酸整 &至不含選擇性標記物之細胞的染色體中。例示性鐵硫簇相互作用氧化還原多肽與核酸 :二所述’鐵硫鎮相互作用氧化還原多肽在類異戊二烯 3成之DXP途徑中起基本作用。例示性鐵硫簇相互作 ^化=肽包括具有賴相互作用氧化還原多肽之 Μ/的多狀、多狀片段、狀及融合多肽。可使用不準方法’藉由使用氫化㈣結檢驗量測 I49048.doc -47· 201111512 (metr〇nidazole)[1_(2_羥乙基）_2_甲基_5·硝基咪唑]還原之速率來判定多肽是否具有鐵硫簇相互作用氧化還原多肽活性（Chen 及 Blanchard，Analyticai 則⑽“叫 93 216 (1979) ’其藉此以全文引料方式併人，尤其關於鐵氧化還原蛋白及黃素氧化還原蛋白之氫化酶聯結檢驗）。例不性鐵硫簇相互作用氧化還原多肽核酸包括編碼具有鐵硫簇相互作用氧化還原多肽之至少一種活性之多肽、多肽片段、肽或融合多肽的核酸。例示性鐵硫簇相互作用氧化還原多肽與核酸包括來自本文所述之任何源生物體的天然存在之多肽與核酸，以及源自本文所述之任何源生物體的突變型多肽與核酸。分離核酸之例示性方法鐵硫簇相互作用氧化還原核酸、DXp途徑核酸、途徑相關核酸、異戊二烯合成酶核酸或IDI核酸可使用標準方法分離。自相關源生物體（諸如細菌基因組）獲得所要核酸之方法為常見且在分子生物學領域中熟知的方法（參見，例如WO 2004/033 646及其中所引用之參考文獻，各文獻藉此以全文引用的方式併入，尤其關於相關核酸之分離）。舉例而言，若核酸序列為已知的（諸如本文所述之任何已知核酸）’則可藉由限制性核酸内切酶分解而生成適合之基因組文庫，且可使用與所要核酸序列互補之探針進行篩選。一旦分離出序列，即可使用標準引子引導之擴增方法，諸如聚合酶鏈反應（PCR)(美國專利第4,683,2〇2號，其藉此以全文引用的方式併入，尤其關於pCR方法）來擴增 149048.doc •48· 201111512 DNA，以獲得適於使用適當載體進行轉型之DNA的量。或者，可使用標準方法以化學方式合成鐵硫簇相互作用氧化還原核酸、DXP途徑核酸、DXP途徑相關核酸、異戊二烯合成酶核酸及/或IDI核酸（諸如核酸序列已知之任何異戊二烯合成酶核酸、鐵硫簇相互作用氧化還原核酸、DXP 途徑核酸及/或IDI核酸）。可使用標準方法鑑別可適用於本文所述之組合物及方法的其他鐵硫簇相互作用氧化還原核酸、D XP途徑核酸、 DXP途徑相關核酸、異戊二烯合成酶核酸及/或IDI核酸。舉例而言，可在諸如大腸桿菌之生物體中構築已知天然製造異戊二烯之生物體之染色體DNA的黏質體文庫，接著針對異戊二烯產量進行篩選。詳言之，可生成基因組DNA之大區段（35-45 kb)封裝於載體中且用於轉型適當宿主之黏質體文庫。黏質體載體之獨特點在於能夠容納大量DNA。一般而言，黏質體載體具有封裝異源DNA、隨後使異源 DNA成環所需之cos DNA序列的至少一個複本。除cos序列以外，此等載體亦含有複製起點，諸如ColEI ;及抗藥性標記物，諸如對胺苄青黴素或新黴素具抗性之核酸。使用黏質體載體轉型適合之細菌宿主之方法充分描述於 Sambrook等人，Molecular Cloning: A Laboratory Manual > 第2版’ Cold Spring Harbor, 1989中，該文獻藉此以全文引用的方式併入，尤其關於轉型方法。通常，為選殖黏質體，使用適當限制性核酸内切酶分離異源DNA且使用適當接合酶接合於鄰近黏質體載體之cos 14904B.doc -49- 201111512 區之處《接著使含有線性化異源DNA之黏質體载體與DNa 封裝運載體（諸如噬菌體）反應。在封裝過程中’ c〇s位點裂解且異源DN A封裝於細菌病毒粒子之頭部。此等粒子接著用於轉染適合之宿主細胞，諸如大腸桿菌。一旦注射至細胞中，異源DNA即在cos黏性末端影響下成環。以此方式’可將異源DNA之大區段引入宿主細胞中且於其中表現。獲得鐵硫簇相互作用氧化還原核酸、DXP途徑核酸、 DXP途徑相關核酸、異戊二烯合成酶核酸及/或lm核酸之其他方法包括藉由檢驗（諸如頂部空間檢驗）（參見，例如美國申請案第12/335,071號及PCT/US2008/086809，其藉此以全文引用的方式併入，尤其關於實例1及7中異戊二烯製造之頂部空間檢驗）或藉由使用針對編瑪一定長度之保守胺基酸（例如至少3個保守胺基酸）之核苷酸的引子進行pCR 來筛選多源基因組文庫（metagenoinic library)。保守胺基酸可藉由比對已知鐵硫簇相互作用氧化還原多肽、DXp途徑多肽、DXP途徑相關多肽、異戊二烯合成酶多肽及/或 IDI多肽之胺基酸序列來鑑別。異戊二烯合成酶多肽之保守胺基酸可基於已知異戊二烯合成酶多肽之經比對序列來鑑別。可對據發現天然地製造異戊二稀之生物體進行標準蛋白質純化方法（在此項技術中為熟知的）且可使用標準方法對所得經純化多肽進行定序。其他方法見於文獻中（參見’例如 Julsing等人’却从·

Biotechnol. 75: 1377 84, 2007 ’ Withers 等人’々>/7/ I49048.doc 201111512 73(19): 6277-83，2007，各藉此以全文引用的方式併入，尤其關於與異戊二烯合成有關之核酸的鑑別）。另外’可使用標準序列比對及/或結構預測程式，基於其他DXP途徑多肽與核酸之一級結構及/或預測多肽二級結構與已知DXP途徑多肽與核酸的相似性來鑑別其他dxp途夕肽與核酸。亦可使用標準資料庫，諸如SWiSSpr〇t_ trembl 負料庫（全球資訊網 r eXpaSy.org」，Swiss Institute of Bioinformatics Swiss-Prot group CMU-1 rue Michel Servet CH-1211 Geneva 4，Switzerland)來鑑別異戊二烯合成酶、黃素氧化還原蛋白I、DXP途徑及/或IDI多肽與核 k °可使用標準結構預測程式，諸如predictpr〇tein(63〇

West, 168 Street, BB217, New York, N.Y. 10032, USA)之預 6又足值來預測鐵硫簇相互作用氧化還原多肽、Dxp途徑多肽、DXP途徑相關多肽、異戊二烯合成酶多肽及/或⑴以肽之一級及/或二級結構。或者，可使用標準方法確定鐵硫族相互作用氧化還原多肽、DXp途徑多肽、Dxp途徑相關多肽、異戊二烯合成酶多肽及多肽之實際二級及/ 或三級結構。亦可藉由與自已知鐵硫簇相互作用氧化還原核西夂、DXP途技核酸、Dxp途徑相關核酸、異戊二稀合成酶核酸及/或IDI核酸產生之探針雜交來鑑別其他鐵硫鎮相互作用氧化還原核酸、Dxp途徑核酸、Dxp途徑相關核酸、異戊二烯合成酶核酸及/或IDI核酸。例示性啟動子與載體本文所述之任何鐵疏鎮相互作用氧化還原核酸、DXP途 149048.doc -51 · 201111512 徑核酸、DXP途徑相關核酸、異戊三烯合成酶核酸或IDI 核酸均可包括於-或多種載體中。因&，本發明亦提供具有或夕種 '為瑪本文所述之任何鐵硫箱相互作用氧化還原多肽、DXP途徑多肽、Dxp途徑相關多狀、異戊二稀合成酶多肽及/或IDI多肽之核酸的載體。本文中所用之「載體」意謂能夠傳遞一或多種相關核酸且理想地於宿主細胞中表現°亥《多種相關核酸之構築體。載體之實例包括 (但不限於）：質體、病毒載體、DNA或RNA表現載體、黏

質體及嗤菌體載體。在一些實施例中，載體所含之核酸處於表現控制序列之控制下。本文中所用之「表現控制序列」意謂引導相關核酸轉錄之核酸序列。表現控制序列可為啟動子，諸如組成性或誘導性啟動子；或可為強化子。「誘導性啟動子」為在環境或發育調控下具活性之啟動子。表現控制序列可操作地連接於待轉錄之核酸區段。

在一些實施例中，載體含有選擇性標記物。術語「選擇 I1生私6己物」係指能夠於宿主細胞中表現，使得易於選擇含有所引入之核酸或載體之宿主細胞的核酸。可選擇標記物之貫例包括（但不限於）抗生素抗性核酸（例如康徽素、胺苄月黴素、羧苄青黴素、慶大黴素、潮黴素、腐草黴素、博萊黴素、新黴素或氣黴素）及/或賦予宿主細胞以代謝優勢 (諸如營養優勢）之核酸。例示性營養選擇性標記物包括此項技術中已知之標記物，如㈣dS、ar容B及。適用於供木黴屬轉型用之載體系統中之標記物在此項技術中為已知 H9048.doc -52· 201111512 的（參見，例如 Finkelstein ’ 第 6 章 ’ Biotechnology of

Filamentous Fungi, Finkelstein 等人編’8111^犷\¥〇1*1;11-

Heinemann，Boston, ΜΑ，第 6 章，1992 ;及 Kinghorn 等人，Applied. Molecular Genetics of Filamentous Fungi， Blackie Academic and Professional, Chapman and Hall, London, 1992，各藉此以全文引用的方式併入，尤其關於選擇性標記物）。在一些實施例中，選擇性標記物為awc/S 核酸’其編碼乙醯胺酶，使得經轉型之細胞於乙醯胺氮源上生長。使用小巢狀麴菌似）amdS核酸作為選擇性標記物描述於Kelley等人，五J. 4:475-479，1985及

Penttila等人’ Ge«e 61:155-164，1987中（各文獻藉此以全文引用的方式併入，尤其關於選擇性標記物）。在一些實施例中’異戊二烯合成酶、黃素氧化還原蛋白！、DXP途徑或IDI核酸整合至不含選擇性標記物之細胞的染色體中。適合之載體為與所採用之宿主細胞相容之載載體可源自例如細菌、病毒（諸如噬菌體Τ7或源自μ_13之噬菌體）、黏質體、酵母或植物。獲得及使用該等載體之方案在此項技術中為已知的（參見’例如Sambr〇〇k等人， Molecular Cloning: A Laboratory Manual ^ Cold S—g Harbor，1989,其藉此以全文引用的方式併入，尤其關於載體之使用）。啟動子在此項技術中為熟知的。在宿主細胞中發揮功能之任何啟動子皆可用於鐵硫鎮相互作用氧化還原核酸、 149048.doc •53- 201111512 DXP途徑核酸、DXP途徑相關核酸、異戊二烯合成酶核酸或IDI核酸於宿主細胞中之表現。適用於驅動鐵硫鎮相互作用氧化還原核酸、DXP途徑核酸、DXP途徑相關核酸、異戊二烯合成酶核酸及/或IDI核酸於各種宿主細胞中表現之起始控制區或啟動子為數眾多且為熟習此項技術者所熟知（參見’例如WO 2004/033646及其中所引用之參考文獻，各藉此以全文引用的方式併入’尤其關於供表現相關核酸用之載體）。實際上，能夠驅動此等核酸之任何啟動子皆適於本發明，包括（但不限於）CYC1、HIS3、GAL1、 # galio、ADH1、PGK、PH〇5、GAPDH、ADCI、TRP1、 URA3、LEU2、ENO及TPI(適用於酵母（iSaccW⑽少⑽）中之表現）；AOX1(適用於畢赤酵母•匀中之表現）；及 lae ' Up ' λΡί ' λΡβ、T7、tac及trc(適用於大腸桿菌中之表現）。實施例中，使用葡萄糖異構酶啟動子（參

如美國專利第7，132,527號及其中所引用之參考文獻，各此以全文引用的方式併人，尤其關於供表現相關多狀用啟動子及質體系統所報導之葡萄糖異構酶啟動子突體可用於改變可操作地連接於則萄糖異構酶啟動子之酸：編碼之多肽的表現量(美國專利第7，132,527號)。在個貫施例中，葡萄糖異構酶啟動子含於低複本質體、中複柯體或高複本質體中（美國專利第7，132,527號）。在夕個貫施例中’鐵硫簇相互作用氧化還原核酸、〇途控核酸、咖途徑相關核酸、異戊二稀合成酶核酸 149048.doc •54· 201111512 IDI核酸含於低複本質體(例如維持約i至約4個複本/細胞之質體^等複本質體（例如維持約ι〇至約η個複本/細胞之負體）或同複本質體（例如維持㈣個或洲以上複本/細胞之質體）中。在一此音你办,+ 二貫&例中’異源或額外内源鐵硫簇相互作用氧化還原核酸、Dxp途徑核酸、DXp途徑相關核酉文異戊一烯合成酶核酸或IDI核酸可操作地連接於了7啟動子在些實施例中，可操作地連接於T7啟動子之異源鲁 I頜外内源鐵硫轶相互作用氧化還原核酸、途徑核酉文、DXP途位相關核酸、異戊二烯合成酶核酸或jo〗核酸含於中等複本質體或高複本質體中。在一些實施例中，異源或頜外内源鐵硫簇相互作用氧化還原核酸、Dxp途徑核酸、DXP途徑相關核⑩、異&二稀合成酶核酸或ι〇ι核酸可操作地連接於Trc啟動子。在一些實施例中，可操作地連接於Trc啟動子之異源或額外内源鐵硫簇相互作用氧化還原核酸' DXP途控核酸、DXP途徑相關核酸、異戍二烯 φ 合成酶核酸或IDI核酸含於中等複本質體或高複本質體中。在一些實施例中，異源或額外内源鐵硫簇相互作用氧化還原核酸、DXP途徑核酸、DXP途徑相關核酸、異戊二烯合成酶核酸或IDI核酸可操作地連接於Lac啟動子。在一些實施例中’可操作地連接於Lac啟動子之異源或額外内源鐵硫鎮相互作用氧化還原核酸、DXP途徑核酸、DXP途徑相關核酸、異戊二烯合成酶核酸或IDI核酸含於低複本質體中。在一些實施例中’異源或額外内源鐵硫簇相互作用氧化還原核酸、DXP途徑核酸、DXP途徑相關核酸、異 149048.doc -55- 201111512 戊二烯合成酶核酸或IDI核酸可操作地連接於内源啟動子’諸如内源大腸桿菌屬、泛菌屬、桿菌屬、耶氏酵母屬、緯黴菌屬、木黴屬或溫泉菌屬啟動子，或内源鹼性絲胺酸蛋白酶鐵硫簇相互作用氧化還原啟動子、Dxp途徑啟動子、DXP途徑相關啟動子、異戊二烯合成酶啟動子或 IDI啟動子。在一些實施例中，可操作地連接於内源啟動子之異源或額外内源異戊二烯合成酶核酸、鐵硫簇相互作用氧化還原核酸、DXP途徑核酸、DXP途徑相關核酸及/或 IDI核酸含於尚複本質體中。在一些實施例中載體為不整合至細胞中之染色體中的複製質體。在一些實施例中，載體^_ 一部分或全部整合至細胞中之染色體中。在一些實施例中’載體為當引入真菌宿主細胞中時整合至宿主細胞基因組中且進行複製之任何載體。關於載體之清單’參考 Fungal Genetics Stock Center Catalogue of Strains(FGSC，全球資訊網「fgSc.net」及其中所引用之參考文獻’各藉此以全文引用的方式併入，尤其關於載體）。適合之表現及/或整合載體之其他實例提供於 Sambrook等人，Molecular Cloning: A Laboratory Manual，第 2版 ’ Cold Spring Harbor, 1989，Current Protocols in Molecular Biology(F· M. Ausubel 等人（編）1987，增刊 30, 章節 7.7.18) ; van den Hondel 等人，Bennett及 Lasure (編） More Gene Manipulations in Fungi，Academic Press，第 396-428頁，1991 ;及美國專利第5,874,276號中，各文獻藉此以全文引用的方式併入，尤其關於載體。尤其適用之 149048.doc -56- 201111512 載體包括pFB6、pBR322、PUC18、pUClOO 及 pENTR/D。在一些實施例中，鐵硫簇相互作用氧化還原核酸、Dxp 途徑核酸、DXP途徑相關核酸、異戊二烯合成酶核酸或 IDI核酸可操作地連接於在真菌宿主細胞中顯示轉錄活性之適合啟動子。該啟動子可源自一或多種編碼宿主細胞之内源或異源多肽的核酸。在一些實施例中，啟動子適用於木黴屬宿主。適合啟動子之非限制性實例包括、 • cbh2、egn、egn、pepA、hfM、、巧以反咖^ 在一些實施例中，啟動子為宿主細胞之天然啟動子。舉例而言，在一些實施例中，當里氏木黴（r reeiei·)為宿主時，啟動子為天然里氏木黴啟動子。在一些實施例中，啟動子為里氏木黴，該啟動子為誘導性啟動子且以寄存編號 D86235寄存於GenBank(藉此以全文引用的方式併入，尤其關於啟動子）。在一些實施例中，啟動子為真菌宿主細胞之異源啟動子。適用啟動子之其他實例包括來自泡盛麴 • 菌（儿㈣㈣⑽·）及黑麴菌（1 葡糖澱粉酶之基因 (glaA)的啟動子（Nunberg等人，M〇/ Ce// 价〇/ 4:23〇6_ 2315，1984 及 Boel 等人，◦丄 3:1581-1 585，1984，各藉此以全文引用的方式併入，尤其關於啟動子）；來自黑麴菌α澱粉酶、米麴菌ΤΑΚΑ澱粉酶、里氏木黴及里氏木黴纖維二糖水解酶1之基因的啟動子（Ep 13728〇，其藉此以全文引用的方式併入，尤其關於啟動子）。在一些實施例中，表現載體亦包括終止序列。終止控制區亦可源自宿主細胞之各種天然基因。在一些實施例中， 149048.doc •57- 201111512 終止序列及啟動子序列源自相同來源。在另一實施例中，終止序列對宿主細胞而言為内源的。尤其適合之終止子序列為源自木黴屬菌株（諸如里氏木黴）之d/zl。其他適用之真產止子包括來自黑麵讀或泡盛麵產匍糖殿粉酶核酸之終止子（Nunberg等人，Mo/· CW/价〇/. 4:2306-2315, 1984及 B〇el等人，幻/· 3:1581-1585, 1984，各藉此以全文引用的方式併入’尤其關於真菌終止子）。視情況，可包括終止位點。為有效表現多肽，編碼多肽之DNA經由起始密碼子可細作地連接於所選表現控制區，使得表現會形成適當信使RNA。在一些實施例中’啟動子、編碼區及終止子皆源於待表現之鐵硫簇相互作用氧化還原核酸、Dxp途徑核酸、DXp 途徑相關核酸、異戊二烯合成酶核酸或IDI核酸。在一些貫施例中，將鐵硫簇相互作用氧化還原核酸、Dxp途徑核 @九、ρχρ途徑相關核酸、異戊二烯合成酶核酸或idi核酸之編碼區插入通用表現載體中，使得該編碼區處於表現構築體啟動子及終止子序列之轉錄控制下。在一些實施例中，於強啟動子之下游插入基因或其一部分。可使用標準技術將鐵硫簇相互作用氧化還原核酸、DXp 途t核k DXP途控相關核酸、異戊二烯合成酶核酸或 IDI核酸併入載體（諸如表現載體）中（Sambr〇〇k等人， Μ〇1_ΐ3Γ C1〇ning: A Lab〇ratory Manual，c〇ld Spring Harbor，觸，其藉此以全文引用㈣式併人，尤其關於適當DNA序列之篩選、及載體之構築）。用於接合包含相 149048.doc -58- 201111512 關核0义（諸如鐵硫蔡相互作用氧化還原肖酸、DXP途徑核 δ: DXP途；^相關核酸、異戊二稀合成酶核酸或取核酉文）、啟動子、終止子及其他序列之dna構築體且將其插入適合載體中之方法在此項技術中為熟知的。舉例而言，可使用限㈣酶使鐵硫助互作用氧化還原核酸、DXP途

徑核酸、DXP途徑相關核酸、異戊二婦合成酶核酸或IDI 核酸及載體裂解。接著’可接合裂解之鐵硫鎮相互作用氧化還原核酸、DXP途徑核酸、Dxp途徑相關核酸、異戊二烯合成酶核酸或1〇1核酸及裂解之載體的相容末端。一般藉由在適宜限制性位點處接合而實現連接。若該等位點不存在，則根據習知規範使用合成寡核苷酸連接子（參見 Sambrook等人，Molecular cl〇ning: A Lab〇m〇ry Manuai，第 2 版，Cold Spring Harbor, 1989，及 Bennett 與 Lasure，

More Gene Manipulations in Fungi, Academic Press, San Diego，第70-76頁，1991，各藉此以全文引用的方式併入’尤其關於养核苷酸連接子）^另外，可使用已知重組技術（例如 Invitrogen Life Technologies，Gateway Techn〇1〇gy) 構築載體。在一些實施例中，可能需要以遠遠高於天然存在之細胞中當前所見之量’過度表現鐵硫簇相互作用氧化還原核酸、DXP途徑核酸、DXP途徑相關核酸、異戊二烯合成酶核酸或IDI核酸。可藉由將編碼彼等多肽之核酸選擇性選殖至多複本質體中或將彼等核酸置於強誘導性或組成性啟動子之控制下來達成此結果。過度表現所要多肽之方法為 149048.doc •59· 201111512 常見的且在分子生物學領域中為熟知的，且實例可見於 Sambrook等人，Molecular Cloning: A Laboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbor，1989中，該文獻藉此以全文引用的方式併入，尤其關於選殖技術。以下資源包括根據本發明適用之其他一般方法之描述： Kreigler, Gene Transfer and Expression; A Laboratory Manual，1990 及 Ausubel 等人編，Current Protocols in Molecular Biology, 1994，各藉此以全文引用的方式併入，尤其關於分子生物學及選殖技術。例示性源生物體鐵硫簇相互作用氧化還原核酸、DXP途徑核酸、DXP途徑相關核酸、異戊二烯合成酶核酸或IDI核酸（及其所編碼之多肽）可獲自天然含有鑷硫簇相互作用氧化還原核酸、 DXP填徑核酸、DXP途徑相關核酸、異戊二烯合成酶核酸及/或IDI核酸之任何生物體。如上所述，異戊二烯天然地由多種生物體，諸如細菌、酵母、植物及動物形成。生物體含有用於製造異戊二稀之MVA途徑、DXP途徑、或MVA 途徑與DXP途徑（圖19A)。因此，DXS、DXR、MCT、 CMK、MCS、HDS或HDR核酸可獲自例如含有DXP途徑或含有MVA途徑與DXP途徑之任何生物體。IDI核酸及異戊二烯合成酶核酸可獲自例如含有MVA途徑、DXP途徑、或 MVA途徑與DXP途徑之任何生物體。在一些實施例中，鐵硫簇相互作用氧化還原核酸、DXP 途徑核酸、DXP途徑相關核酸、異戊二烯合成酶核酸或 14904S.doc -60- 201111512 IDI核酸之核酸序列與由以下任何生物體天然地製造之核酸的序列一致。在一些實施例中，鐵硫簇相互作用氧化還原多肽、DXP途徑多肽、DXP途徑相關多肽、異戊二烯合成酶多肽或IDI多肽之胺基酸序列與由以下任何生物體天然地製造之多狀的序列一致。在一些實施例中，鐵硫簇相互作用氧化還原核酸、DXP途徑核酸、Dxp途徑相關核酸、異戊二烯合成酶核酸或IDI核酸或其所編碼之多肽為 φ 源自本文所述之任何生物體之突變型核酸或多肽。本文中所用之「源自」係指引入有一或多個突變之核酸或多肽的來源。舉例而言，「源自植物多肽」之多肽係指藉由將一或多個突變引入野生型植物多肽之序列（亦即’天然存在之序列）中而產生之相關多肽。在一些實施例中，源生物體為真菌，其實例為麴菌屬，諸如米麴菌（A 及黑麴菌；酵母屬，諸如釀酒酵母 (& c㈣;裂殖酵母屬⑼⑽少⑽），諸如 # 粟酒裂殖酵母（& P〇mbe);及木黴屬，諸如里氏木黴。在些貫施例中，源生物體為絲狀真菌細胞。術語「絲狀真菌」係才曰真菌亞門（subdivisi〇n Eumycotina)之所有絲狀形式（參見 Alexopoul〇s，C. j (1962)，intr〇duct〇ry Myc〇i〇gy， WUey，New Y〇rk)。此等真菌之特徵在於具有由甲殼素、纖維素及其他複雜多醣構成之細胞壁的營養菌絲體。絲狀真菌在形態上、生理學上及遺傳學上不同於酵母。絲狀真菌藉由菌絲伸長實現營養生長，且碳分解代謝為專性好氧的。絲狀真菌母細胞可為以下（但不限於以下）屬之細胞： 149048.doc -61 · 201111512 木徽屬（例如里氏木黴，紅褐肉座菌之無性變種’先前分類為長梗木黴（j; 、綠色木黴（TWc/zoderma viride)、康寧木徽（IVichoderma Α;ο«ζ·«尽"）、哈茨木徽（7>z.c/2〇dermi2 /mrzz_a«ww))(Sheir-Neirs 等人，Appl. Microbiol· Biotechnol 20: 46-53，1984 ; ATCC 第56765號及ATCC第26921號）；青徽菌屬 SP_) ·’腐質徽屬（Humicola sp.)(例如特異腐質黴（η 、綿毛狀腐質黴（//· 或灰色腐質黴（尺. gWie<2))，金抱子菌屬)(例如洛克維金抱子菌（C. 黏帚黴屬（G/z.oc/aAwm 印.）；麴菌屬（例如米麴菌、黑麴菌、醬油麴菌（I 、曰本麴菌 (i _/•叩oWcw)、小巢狀麴菌或泡盛麴菌）（Ward等人，Appl.

Microbiol. Biotechnol· 39: 7380743，1993及 Goedegebuur等人，Genet 41: 89-98, 2002);鐮刀菌屬化請印）（例如粉紅鐮刀菌CP. ro卿所）、禾赤鐮刀菌以⑽以聽）、禾榖鐮刀菌（F. cerea/b)、尖孢鐮刀菌（厂〇w〇rM/w)或棉狀嗜熱鐮刀菌（F. v瞻祕謂））；鏈孢黴屬（i^Mr〇ip〇ra卬例如粗糙鏈孢黴（见CMiM));肉座菌屬π );毛黴屬 (MMC〇r (例如米黑毛黴（M. _心〇);根黴屬（肠^^ V );及裸胞殼屬（五merzCe//a印_)(亦參見^“等人，仏. 228: 21-26，1985)。術語「木黴屬（7Wc/z〇G?erwa/rn.c/2〇^^^ 印·/TWc/zoArma πρ·)」係指先前或當前歸類為木黴之任何真菌屬。在一些實施例中，真菌為小巢狀麴菌、泡盛麴菌、米麴 149048.doc -62- 201111512 菌、棘孢麴菌（A 、黑麴菌、曰本麴菌、里氏木黴、綠色木黴（Γ. WrWe)、尖孢鐮刀菌（F或茄腐鐮刀菌（F_ io/am·)。麴菌屬菌株揭示於Ward等人，Appl

Microbiol. Biotechnol. 39:738-743，1993及 Goedegebuur 等人’ CUrr Gene 41:89_98, 2〇〇2中，各文獻藉此以全文引用的方式併入，尤其關於真菌。在特定實施例中，真菌為木黴屬菌株’諸如里氏木黴菌株。里氏木黴菌株為已知的， φ 且非限制性實例包括ATCC第13631號、ATCC第26921號' ATCC 第 56764 號、ATCC 第 56765 號、ATCC 第 56767 號及 NRRL 15709，各藉此以全文引用的方式併入，尤其關於里氏木黴菌株。在一些實施例中，宿主菌株為RL_p37之衍生物。RL-P37揭示於 Sheir-Neiss等人 ’ AppL Micr〇bi〇1 Biotechnology 20:46-53, 1984中，該文獻藉此以全文引用的方式併入’尤其關於里氏木黴菌株。在一些實施例中，源生物體為酵母，諸如酵母屬、裂殖 # 酵母屬、畢赤酵母屬氡假絲酵母屬（Candida sp.)。在一些實施例中，源生物體為細菌，諸如桿菌屬菌株，諸如地衣桿菌（反或枯草桿菌；泛菌屬菌株，諸如檸檬泛菌（户⑸_);假單胞菌屬 (heW⑽細菌株，諸如產鹼假單胞菌（/) 鏈黴菌屬g株，諸如青紫鏈黴菌（5> /zW_)或鏽赤徽鍵徽菌（51. rM如·《⑽WJ);溫泉菌屬菌株，諸如臺灣溫泉菌 e/⑽如;根瘤菌屬（幻如…匕以仏所）菌株，諸如苜蓿根瘤菌（&㈣⑺⑽）；螺旋桿菌屬（价汝以以⑽）菌株，諸如幽門 I49048.doc • 63 - 201111512 螺旋桿菌（//.仰/州’）；土壤桿菌屬（々rc^ac如iww)菌株，諸如根癌土壤桿菌（A. iwme/aciews);奇異球菌屬 (Dez‘《oeoccws)菌株，諸如财輻射奇異球菌（£) rac^〇dwra似）；李氏菌屬（Dierk)菌株，諸如單核球增多性李氏菌（L. monocyiogewe·?);乳桿菌屬（z^cio6acz7/Ms)菌株’諸如乳桿菌（Z. spp);或大腸桿菌屬菌株，諸如大腸桿菌。本文中所用之「桿菌屬」包括如熟習此項技術者已知，屬於「桿菌」屬之所有種類’包括（但不限於）枯草桿菌、地衣桿菌、緩慢桿菌（5. /πίΜ_5)、短桿菌（5 &revzj)、嗜熱脂肪桿菌（5. 、嗜驗桿菌（丑 a/Ara/op/n'/ws)、解殿粉桿菌（_β· amy/o/z·分we/aciews)、克勞氏桿菌（β· c/awsz·/)、而才鹽桿菌（5. /za/oc^Mraws)、巨大桿菌（5 weaierkw)、凝結桿菌（反coagw/a似）、環狀桿菌（5 drcw/a«i)、燦爛桿菌（反/⑽加）及蘇雲金桿菌⑺ 。應瞭解’桿菌屬繼續經歷分類改組。因此，該屬意欲包括已重新分類之種類，包括（但不限於）諸如嗜熱脂肪桿菌之生物體，現稱為「嗜熱脂肪土桿菌 {Geobacillus 」。在氧氣存在下產生抗性内生孢子被視為桿菌屬之特定特徵，不過此特徵亦適用於最新命名之脂環桿菌屬（d//c;；c/〇kcz7/WiS；l、兩性桿菌屬 (Amphibacinus)、嗅熱样菌屬（Aneurinibacillus')、厭氣辑菌屬〇4«似少心以7/即）、短桿菌屬（5Mvz.6aci//w)、菲洛桿菌屬（F"ohc"/Wi)、薄壁桿菌屬（G>acimaci"WiS)、_ 桿菌屬 149048.doc • 64 · 201111512 (仙/m㈣·//㈣、類桿菌屬（以训.0⑽·/z㈣、柳桿菌屬 (心⑽_’//_、熱桿菌屬（r/zerw〇6⑽·z〜）、脲桿菌屬及維京桿菌屬。在-些實施例中，源生物體為革蘭氏陽性細菌。非限制性貫例包括鏈黴菌屬菌株（例如青紫鏈黴菌、天藍色鏈黴菌（51•⑽/ — /叫或灰色鏈黴菌（iS 叫）、桿菌屬菌株、李氏菌屬菌株(例如單核球增多性李氏菌)或乳桿菌屬 • 自株（例如乳桿菌）。在一些實施例中，源生物體為革蘭氏陰性細菌，諸如大腸桿菌、假單胞菌屬或幽門螺旋桿菌。在一些貫施例中，源生物體為植物，諸如豆科（諸如豆科植物亞科）之植物。在一些實施例中，源生物體為野葛、楊屬（諸如銀白楊與歐洲山揚雜交種CaC35696)、山揚屬（諸如美洲山揚）、英國櫟、芥菜屬諸如擬南芥（儿i/m/z•训α))，或玉蜀黍屬（z⑽)（諸如玉蜀黍 # 在一些實施例中’源生物體為藻類，諸如綠藻、紅藻、灰綠藻（glaucophytes)、阿米巴狀藻（chl〇rarachni〇phyteS)、類眼蟲鞭毛藻（euglenids)、原藻（chromista)或渦鞭毛藻 (dinoflagellates)。在一些實施例中，源生物體為藍細菌，諸如基於形態歸類為以下任一組之藍細菌：色球藻目（C/zroococca/ei)、寬珠薄' n (Pleurocapsales)、％蕩 n [Oscillatoriales、、念珠裔目（iVc^ioca/es)或真枝藻目。在一些實施例中’藍細菌為臺灣溫泉菌。 149048.doc -65- 201111512 例示性宿主細胞多種宿主細胞可用於表現鐵硫鎮相互作用氧化還原多肽、DXP途徑多肽、DXP途徑相關多肽、mva途徑多肽、 MVA途徑相關多肽、異戊二婦合成酶多狀或血多狀且用於利用本發明之方法製造異戊二晞。例示性宿主細胞包括來自標題為「例示性源生物體」之先前章節中所列之任何生物體的細胞m胞可為天然地製造異戍二稀之細胞或不會天然地製造異戊二稀之細胞。在—些實施例中，宿主細胞使用DXP途徑及異戊二烯合成酶天然地製造異戊二烯，且添加一或多種DXP途徑多肽及鐵硫簇相互作用氧化還原多肽以增強使用此途徑製造異戊二烯。在一些實施例中’宿主細胞使用DXP途徑及異戊二稀合成酶天然地製造異戊二烯，且添加一或多種1)父1>途徑核酸、一或多種鐵硫簇相互作用氧化還原核酸及IDI以增強使用此途徑製造異戊二稀。 1.例示性轉型方法可使用標準技術將鐵硫簇相互作用氧化還原核酸、Dxp 途徑核酸、DXP途徑相關核酸、異戊二烯合成酶核酸或 IDI核酸或含其之載體插入宿主細胞（例如本文所述之植物細胞、真菌細胞、酵母細胞或細菌細胞）中以供表現所編碼之鐵硫簇相互作用氧化還原多肽、Dxp途徑多肽、Dxp 途徑相關多肽、異戊二烯合成酶多肽及/或Im多肽。可使用以下技術將DNA構築體或載體引入宿主細胞中：諸如轉型、電穿孔、細胞核顯微注射、轉導、轉染（例如脂質體 149048.doc 201111512 轉染介導或DEAE-糊精介導之轉染，或使用重組噬菌體病毒進行轉染）、與鱗酸弼DNA沈澱物一起培育、用經DNA 塗覆之微彈進行高速轟擊’及原生質體融合。一般轉型技術在此項技術中為已知的（參見’例如C u r r e n t P r 〇 t 〇 c ο 1 s i η Molecular Biology(F· M. Ausubel 等人（編），第 9 章， 1987) ’ Sambrook專人 ’ Molecular Cloning: A Laboratory Manual，第 2版，Cold Spring Harbor, 1989 ;及 Campbell 等人’ Cwrr. 16:53-56，1989，各藉此以全文引用的方式併入，尤其關於轉型方法）。異源多肽於木黴中之表現描述於以下文獻中：美國專利第6,022,725號；美國專利第 6,268,328 號；美國專利第 7,262,041 號；WO 2005/ 001036 ; Harkki等人，Microft. rec/zwo/. 13:227-233, 1991 ; Harkki等人，5ζ·ο rec/mo/_ 7:596-603, 1989 ; ΕΡ 244,234，ΕΡ 215,594 ;及 Nevalainen 等人，「77ze

Molecular Biology of Trichoderma and its Application to the Expression of Both Homologous and Heterologous Gewes」，Molecular Industrial Mycology, Leong 及 Berka 編，Marcel Dekker Inc·，NY，第 129-148 頁，1992，各藉此以全文引用的方式併入，尤其關於轉型及表現方法。關於麴菌屬菌株之轉型，亦參考Cao等人，9:991-1001， 2000 ; EP 23 8023 ;及 Yelton 等人，ProceeiZ/wg·?· iVa". Jcai USA 81:1470-1474，1984(各藉此以全文引用的方式併入，尤其關於轉型方法）。所引入之核酸可整合至染色體DNA中或維持染色體外複製序列之形式。 149048.doc -67- 201111512 非中已知之任何方法皆可用於選擇轉型體。在一 =制性貫例中’包括―標記物之 ®㈤个穂疋培養基上、速率較快且在含有乙醯胺之固體上形成輪廓平滑而非粗糙之環形群落。另外，在一 =況下，由以下步驟對穩定性進行進一步測試：使轉型 η固體非選擇性培養基（例如缺乏乙醯胺之培#基）上生長自此培養基收集孢子，且測定隨後在含有乙酿胺之選擇性培養基上發芽並生長之此等炮子的百分比。在-：實施例中，藉由包含原生質體形成及原生質體轉里接著以已知方式再生細胞壁之過程來轉型真菌細胞。在一特定實施财，供轉型用之木黴屬之製備包含自真菌菌絲體製備原生質體（參見Campbell等人，CMrr σ⑼仏 16:53_56, 1989 ’其藉此以全文引用的方式併入，尤其關於轉型方法）。在一些實施例中，自發芽之營養孢子獲得菌絲雔。用分解細胞壁之酶處理菌絲體，從而得到原生質體。接著在滲透壓穩定劑存在下於懸浮培養基中保護原生夤體。此等穩定劑包括山梨糖醇、甘露糖醇、氣化鉀、硫酸鎂及其類似物。通常，此等穩定劑之濃度在〇 8 M與12 Μ之間變化。需要在懸浮培養基中使用約丨2 μ山梨糖醇溶液。 DNA吸收至宿主木黴屬菌株中取決於鈣離子濃度。一般而言’吸收溶液中使用約1〇 mM CaCl2至50 mM CaCl2。吸收溶液中除鈣離子以外，一般包括之其他化合物為緩衝系統’諸如 TE緩衝液（1〇 Mm Tris，pH 7.4 ; 1 mM EDTA)或 10 149048.doc •68- 201111512 mM MOPS(嗎啉丙烷磺酸）緩衝液（pH 6.0)，及聚乙二醇 (PEG)。在不欲受任何特定理論約束下’咸信聚乙二醇起作用而與細胞膜融合，由此使得培養基之内含物傳遞至木黴屬菌株之細胞質中且質體DNA轉移至細胞核。此融合常常留下質體DNA之多個複本整合至宿主染色體中。

通常’使用含有已經歷滲透處理且密度為1〇5至 10 /mL(諸如2X 106/mL)之木黴屬原生質體或細胞的懸浮液進行轉型。將100吣體積之含有此等原生質體或細胞之適虽溶液（例如1 _2 Μ山梨糖醇及50 mM CaCh)與所要DNA混合。一般將高濃度之PEG添加至吸收溶液中。可將〇丨至i 體積之25% PEG 4000添加至原生質體懸浮液中。在一些實施例中，將約0.25體積添加至原生質體懸浮液中。亦可將諸如一甲亞砜、肝素、亞精胺、氯化鉀及其類似物之添加劑添加至吸收溶液中且幫助轉型。類似程序可用於其他真菌伯主細胞（參見，例如美國專利第 6,〇22’725號及第6’268,328號’各藉此以全文引用的方式併入，尤其關於轉型方法）。一般而言，接著在約η：下培養混合物1G至3G分鐘。接著再將PEG添加至混合Μ以進—步增強所要核酸序列之吸收。-般添加體積為轉型混合物體積之5至15倍的训 PEG 4000，然而，可能愛亞去1丄

』犯需要較大及較小體積。25% PEG 4000理想地為轉型混合物體 ^ 脰積之約W倍。添加PEG後，接著在室溫下或於冰上培養轉彻、，曰 I锊型此合物，隨後添加山梨糖醇及CaCh溶液。接著再將原生晳一貝體懸洋液添加至生長培養 149048.doc -69- 201111512 基之溶融等分試樣中。當生長培養基包括生長選擇劑（例如乙醯胺或抗生素）時，其僅允許轉型體生長。可根據習知方法進行細菌細胞之轉型，例如，如

Sambrook等人，Molecular Cloning: A Laboratory Manual， Cold Spring Harbor，1982中所述，該文獻藉此以全文引用的方式併入’尤其關於轉型方法。例示性細胞培養基本發明亦包括一種製造異戊二烯之培養中細胞或細胞群體。「培養中細胞」意謂於允許細胞經歷一或多次細胞分裂之溶液（例如細胞培養基）中之兩個或兩個以上細胞。「培養中細胞」不包括如下植物細胞：其為含有已分化成植物組織之細胞之活的多細胞植物之一部分。在多個實施例中’細胞培養物包括至少或約10、20、50、100、200、 5 00、1，〇〇〇、5,000、10,〇〇〇個或 1〇,〇〇〇個以上細胞。任何碳源皆可用於培養宿主細胞。術語「碳源」係指一或多種能夠由宿主細胞或生物體代謝之含碳化合物。舉例而言，用於培養宿主細胞之細胞培養基可包括適於維持生存力或使宿主細胞生長之任何碳源。在一些實施例中，碳源為碳水化合物（諸如單醣、雙醣、寨醣或多醣）、轉化糖（例如酶促處理之蔗糖糖漿）、甘油、丙三醇（例如生物柴油或製皂製程之丙三醇副產物）、二經基丙酿I、單碳源、油（例如植物油，諸如玉米油、標橺油或大豆油）、動物脂肪、動物油、脂肪酸（例如飽和脂肪酸、不飽和脂肪酸或多元不飽和脂肪酸）、脂質、礙 149048.doc -70- 201111512 脂、甘油脂、I酸甘油酯、二酸甘油酯、三酸甘油酯、多肽(例如微生物或植物蛋白質或肽)、可再生碳源(例如生質碳源’諸如水解之生質碳源）、酵母提取物、㈣酵母提取物之組分、聚合物、酸、醇、路、鋼、胺基酸、丁二酸鹽、乳酸鹽、乙酸鹽、乙醇’或前述兩者或兩者以上之任何組合。在-些實施例中，碳源為光合作用之產物，包括 (但不限於）葡萄糖。

」列示性單畴包括葡萄糖及果糖；例示性寡聽包括乳糖及庶糖；且例示性多膽包括澱粉及纖維素。例示性碳水化合物包括C6糖（例如果糖、甘露糖、半乳糖或葡萄糖）及㈣ (例如木糖或阿拉伯糖）。在—些實施例中，細胞培養基包括碳水化合物、以及非碳水化合物之碳源(例如甘油丙三醇 '二羥基丙酮、單碳源、油、動物脂肪、動物油、脂肪酸、脂質、碟脂、甘油脂、單酸甘油酯、二酸甘油酯、三酸甘油6旨、可再生碳源’或來自酵母提取物之組分）。在些實施例中，細胞培養基包括碳水化合物以及多狀 (例如微生物或植物蛋白質或肽）。在一些實施例中微生物多肽為來自酵母或細菌之多肽。在—些實施例中，植物多肽為來自大豆、玉米、芥花、麻風樹、掠搁、花生、向 :葵、椰子、芥子、油菜籽、棉籽、棕櫚仁、撖欖、紅花、芝麻或亞麻子之多肽。在一些實施例中，碳水化合物之濃度為至少或約5公克/ 公升培養液（g/L’纟中培養液體積包括細胞培養基體積與細胞體積），諸如至少或約10、15、2〇、3〇、4〇、5〇、 149048.doc 71 201111512 H ioo' 150、200、3〇〇、4〇Q ,或4〇〇心以上。在一些實施例中，石炭水化合物之濃度介於約5〇g/L與約彻 g之門諸如約100 g/L與約360 g/L之間，約120 g/L與約 360 g/L之間，或約2〇〇 g/L與約3〇〇 g/L之間。在一些實施例中’此奴水化合物濃度包括在培養宿主細胞之前及，或期間所添加之碳水化合物的總量。在-些實施例中，於限制性葡萄糖條件下培養細胞。限制㈣萄糖條件」意謂所添加之葡萄糖的量小於或約二胞所消耗之葡萄糖之量的1 05%(諸如約i〇〇%)。在特疋貫施例中，添加至培養基中之葡萄糖的量與 :間：胞所消耗之葡萄糖之量大致相同。在一些 :藉由限制所添加之葡萄糖的量來控制細胞生長速率，使付細胞以細胞谇袭其由姑4 也培養基中葡甸糖之量可支持之速率生長。在一些實施例令，菡葙播产,〜 ^ 個眚絲心葡萄糖在細胞培養期間不會積累。在多個貫施例中，於限制性葡葙為卜2、3、5、1〇 s㈣播條件下培養細胞’超過或約 15、20、25、30、35、40、50、6〇弋 70小時。在多個眘姑v丨山 υ 60或固貫施例t，於限制性胞，超過或約為細胞评件下培養細 25、3〇、35、4。、5。=持續時間之5、1〇、15、2〇、不铲戽任付姓— 70、80、90、95或100%。在有利:調控!:理論約束下’咸信限制性葡萄糖條件可更在一些實施例中，於過量葡定實施例中，所添加之葡萄子在下培養細胞。在特胞所消耗之葡萄铋 ·里大於在特定時段期間細之量的約1〇5%或_以上（諸如約為或 149048.doc •72- 201111512 大於、120、150、175、200、250、300、400 或 500°/。）。在一些實施例中，葡萄糖在細胞培養期間積累。例示性脂質為任何含有一或多種飽和、不飽和或分支脂肪酸之物質’該—或多種脂肪酸為C4及C4以上脂肪酸。例示性油為在室溫下呈液體之脂質。在一些實施例中，脂質含有一或多種C4或C4以上脂肪酸（例如含有一或多種具4個或4個以上碳之飽和、不飽和或分支脂肪酸）。在一 φ 些實施例中，油獲自大豆、玉米、芥花、麻風樹、棕櫚、钯生、向日葵、椰子、芥子、油菜籽、棉籽、棕櫊仁、撖欖、紅花、芝麻、亞麻子、油質微生物細胞、烏桕，或前述兩者或兩者以上之任何組合。例示性脂肪酸包括式RCOOH之化合物，其中「R」為經。例示性不飽和脂肪酸包括如下化合物：其中「R」包括至少一個碳碳雙鍵。例示性不飽和脂肪酸包括（但不限於）油酸、十八礙烯酸、亞麻油酸、棕櫚烯酸及花生四烯 • 酸。例示性多元不飽和脂肪酸包括如下化合物：其中「R」包括複數個碳礙雙鍵。例示性飽和脂肪酸包括如下化合物.其中「R」為飽和脂族基團。在一些實施例中，碳源包括一或多種Cu-C22脂肪酸，諸如Cl2飽和脂肪酸、 C〗4飽和脂肪酸、C10飽和脂肪酸、cls飽和脂肪酸、c2〇飽和脂肪酸或C22飽和脂肪酸。在一例示性實施例中，脂肪酸為棕櫚酸。在一些實施例中，碳源為脂肪酸（例如不飽和脂肪酸）之鹽、脂肪酸（例如不飽和脂肪酸）之衍生物，或脂肪酸（例如不飽和脂肪酸）之衍生物之鹽。適合之鹽包括 149048.doc -73· 201111512 (但不限於）鋰鹽、鉀鹽、鈉鹽及其類似鹽。二酸甘油酯及三酸甘油酯為甘油之脂肪酸酯。在一些實施例中’脂質'油、脂肪、脂肪酸、單酸甘油酯、二酸甘油酯或三酸甘油酯之濃度為至少或約丨公克/公升培養液（g/L，其中培養液體積包括細胞培養基體積與細胞體積）’諸如至少或約5、1〇、15、20、30、40、50、 60、80、100、150、200、300、400 g/L 或 400 g/L 以上。在一些貫施例中’脂質、油、脂肪、脂肪酸、單酸甘油醋、二酸甘油酯或三酸甘油酯之濃度介於約丨〇 g/L與約4〇〇 g/L之間，諸如約25 g/L與約300 g/L之間，約60 g/L與約 180 g/L之間，或約75 g/L與約150 g/L之間。在一些實施例中’該濃度包括在培養宿主細胞之前及/或期間所添加之脂質、油、脂肪、脂肪酸、單酸甘油酯、二酸甘油酯或三酸甘油酯的總量。在一些實施例中，碳源包括以下兩者： (1)脂質、油、脂肪、脂肪酸、單酸甘油酯、二酸甘油酯或三酸甘油酯；及（ii)碳水化合物，諸如葡萄糠。在一些實施例中’脂質、油、脂肪、脂肪酸、單酸甘油酯、二酸甘油酯或三酸甘油酯與碳水化合物之比率以碳計為約丨：丨（亦即’碳水化合物中之每個碳對應於脂質、油、脂肪、脂肪酸、早酸甘油g旨、一酸甘油g旨或三酸甘油醋中之一個碳）。在特定實施例中，脂質、油、脂肪、脂肪酸、單酸甘油醋、二酸甘油醋或二酸甘油醋之量介於約6 〇 g/L與1 8 0 g/L之間’且碳水化合物之量介於約12〇 g/L與360 g/L之間。 •74- 149048.doc 201111512 例示〖生彳政生物多肽碳源包括一或多種來自酵母或細菌之多狀。例示性植物多肽碳源包括一或多種來自大豆、玉米、芥花、麻風樹、棕櫚、花生、向日葵、椰子、芥子、油菜籽、棉籽、棕櫚仁、撖欖、紅花、芝麻或亞麻子之多肽。

例示）± 了再生碳源包括乾胳乳清渗透液、玉米滎、甜菜糖蜜大麥芽，及來自前述任一者之組分。例示性可再生碳源亦包括諸如玉米 '柳枝稷、甘蔗之生質中存在的葡萄糖、己醣、戊醣及木糖，醱酵過程之細胞廢物，及研磨大豆、玉米或小麥所產生之蛋白質副產物。在一些實施例中，生質碳源為木質纖維素、半纖維素或纖維素材料，諸如（但不限於）草、小麥、小麥稈、甜菜潰、甘嚴渣、軟木漿玉米玉米穗軸或玉米殼：、玉米粒、玉来粒纖維、玉米乾草、柳枝稷、稻殼產品，或濕式或乾式研磨穀物（例如玉米、高梁、黑麥'黑小麥、大麥、小麥及/或酒糟毅物（distmers grains))所產生之副產物。例示性纖維素材料包括木材、紙張及製漿廢液、草本植物，及果漿。在一些實施例中，碳源包括任何植物部分，諸如莖幹、縠粒、根或塊莖。在—些實施财m下任何植物之整體或- 黑小麥、稻、、馬鈐薯、甘部分作為碳源：玉米、小麥、黑麥、高粱粟、大麥、木薯、豆類（諸如蠶豆及豌豆，碳源為生糖與葡萄糖薯、香煮、甘蔗及/或樹薯。在一些實施财質水解產物，諸如包括木糖與葡萄糖或包括蔗之生質水解產物。 149048.doc

-75· S 201111512 在一些實施例中，在將可再生碳源（諸如生質）添加至細胞培養基中之前’對該可再生碳源進行預處理。在一此實施例中，預處理包括酶促預處理、化學預處理、或酶促預處理與化學預處理之組合（參見，例如Farzaneh等人，化以⑽/叹少 96 (18): 2014-2018, 2005 ;美國專利第6，176，176號；美國專利第6，106,888號；各藉此以全文引用的方式併入，尤其關於可再生碳源之預處理）。在一些實施例中，在將可再生碳源添加至細胞培養基中之前，使該可再生碳源部分或完全水解。在一些實施例中，在將可再生碳源（諸如玉米乾草）添加至細胞培養基中之前，對該可再生碳源進行氨纖維膨服 (ammonia fiber expansion，AFEX)預處理（參見，例如 Farzaneh等人，Bi〇resource % (18): 2〇i4 2〇i8, 2005)。在AFEX預處理期間，在中等溫度（諸如約6代至約 l〇〇C)及高壓（諸如約250 psi至約扇psi)下，用無水液態氨處理可再生碳源約5分鐘。接著，快速釋放壓力。在此過程中’纟質素溶解、半纖維素水解、纖維素解晶及表面積增加之化學作用與物理作用之組合能夠使纖維素及半纖維素接近完全地酶促轉化成可_糖。ΑρΕχ預處理之優勢在於接近全部之氨可回收及再使用，而其餘氨充當下游中微生物之氮源。χ，AFEX預處理不需要洗條流。因^，AFEX處理後之乾物时率基本上㈣G%。AFEX 一貝，上為乾式乾式過程。.經處理之可再生碳源長時間穩疋且可以極回固體負載饋入酶促水解或酿酵過程中。纖 M9048.doc -76- 201111512 維素及半纖維素在AFEX過程中保存完好，幾乎不降解。在已經歷AFEX預處理之可再生碳源酶促水解之前，不需要進行中和。經AFEX處理之碳源的酶促水解產生潔淨糖流供後續醱酵使用。在一些實施例中，碳源（例如可再生碳源）之濃度等效於至少或約 WU'1、…2、3、4、5、1G、15、2()、 3+〇、40或50%葡萄糖（w/v)。可使用標準HpLc方法，以葡籲肖糖作為參考來量測碳源所產生之葡萄糖的量，藉此禮定葡萄糖田里數。在一些實施例中，碳源（例如可再生碳源）之濃度等效於約〇.1%至約2〇%葡萄糖，諸如約〇 ι%至約㈣葡萄糖、約〇.5%至約10%葡萄糖、約1%至約⑽葡萄糖、、勺1 /〇至約5 %葡萄糖，或約1 〇/〇至約2 〇/〇葡萄糖。在一些實施例中，碳源包括酵母提取物、或酵母提取物之一或多種組分。在-些實施例中，酵母提取物之濃度為乂 A克酵母提取物/公升培養液（g/L，其中培養液體積 • 包括細胞培養基體積與細胞體積），諸如至少或約5、10、 I5、 2〇、 30、 40、 50、 60、 8〇、 1〇〇、 15〇、 2〇〇、 3〇〇 — 或300 g/L以上。在一些實施例中，酵母提取物之濃度介於、、勺g/L與約300 g/L之間’諸如約！ g/L與約2〇〇 g/L之間，約5 g/L與約200 g/L之間，約5 g/L與約1〇〇 g/L之間，或約 5 g/L與約6〇 g/L之間。在—些實施例中，該濃度包括在培養宿主^胞之前及/或期間所添加之酵母提取物的總量。在一些實施例中，碳源包括酵母提取物（或其一或多種組分）與另一碳源（諸如葡萄糖）。在一些實施例中酵母提取 149048.doc •77- 201111512 物與另一奴源之比率為約1 : 5、約丨：丨〇或約1 : 2〇(w/w)。另外，碳源亦可為單碳受質，諸如二氧化碳或甲醇。關於自單一碳源（例如甲醇、甲醛或甲酸酯）製造甘油，已報導甲基營養型酵母中之情形（Yamada等人，历0/ CTzem” 53(2) 541-543，1989，其藉此以全文引用的方式併入’尤其關於碳源）’及細菌中之情形（Hunter等人， 5/〇〜謂⑻〇;，24, 4148-4155, 1985，其藉此以全文引用的方式併入’尤其關於碳源）。此等生物體可同化呈氧化態介於曱烧至曱酸酯之範圍内的單碳化合物，且製造甘油。石反同化途徑可經由單碟酸核酮糖 '經由絲胺酸或經由單鱗酸木酮糖達成（Gottschalk，Bacterial Metabolism，第 2 版，Springer-Verlag: New York，198ό，其藉此以全文引用的方式併入，尤其關於碳源）。單磷酸核酮糖途徑包含使甲酸酯與核酮糖_ 5 _磷酸縮合形成六碳糖，其變成果糖且最終’交成二碳產物甘油酸_3-墙酸。同樣，絲胺酸途徑經由亞曱基四虱葉酸將单碳化合物同化至醣解途徑中。

除一種及兩種碳受質以外’亦已知甲基營養型生物體利用坪多其他含碳化合物’諸如甲胺、葡糖胺及多種胺基酸來達成代謝活性。舉例而言，已知曱基營養型酵母利用甲胺之碳形成海藻糖或甘油（Bellion等人，G

Cow风，[Int. Symp.]，第 7版，415-32.編輯：Murrell 等人出版者：Intercept, Andover，UK，1993，其藉此以全文引用的方式併入，尤其關於碳源）。類似地，各種假絲酵母屬使丙胺酸或油酸發生代謝（Suiter等人， 149048.doc -78- 201111512

Mz’crMk/. 153(5)，485-9, 1990，其藉此以全文引用的方式併入，尤其關於碳源）。在一些實施例中，於含有生理鹽及營養素之標準培養基中培養細胞（參見，例如P〇urquie，j等人， and Genetics of Cellulose Degradati〇n，Aubert等人編， Academic Press，第71_86頁，等人，办〆心Wr飢 63:1298-1306, 1997,各藉此以全文引 φ 用的方式併入，尤其關於細胞培養基）。例示性生長培養基為常見之商業製備之培養基，諸如魯利亞_貝爾塔尼 (Lima Bertan!，LB)培養液、薩蒲洛氏右旋糖

Dextrose，SD)培養液或酵母培養基（γΜ)培養液。亦可使用其他限定或合成生長培，且供特定宿主細胞生長用之適當培養基為熟習微生物學或醱酵科學技術者所知。除適當碳源以外，細胞培養基理想地含有適合之礦物、鹽、輔因子、緩衝液，及熟習此項技術者已知適於培養物參生長或適於均強異戊一稀製造之其他組分（參見，例如WO 2〇(Μ/033646與其中所引用之參考文獻、及w〇 Μη57%與其中所引用之參考文獻，各藉此以全文引用的方式併入，尤其關於細胞培養基及細胞培養條件）。在一些實施例中，若異戊二烯合成酶核酸、鐵硫簇相互作用氧化還原核 I DXP途徑核酸、Dxp途徑相關核酸或ι〇ι核酸處於誘導 }·生啟動子之控制下，則需要以有效誘導異戊二烯合成酶多肽鐵硫簇相互作用氧化還原多肽、Dxp途徑多肽、DXp 途仏相關多肽或IDI多肽表現之濃度添加誘導劑（例如糖、 14904S.doc -79· 201111512 金屬鹽或抗微生物劑）至培養基中。在—些實施例中，細胞培養基具有對應於具有一或多種異戊二烯合成酶核酸、鐵硫簇相互作用氧化還原核酸、DXP途徑核酸、DXP途徑相關核酸或IDI核酸之載體上之抗生素抗性核酸（諸如康黴素抗性核酸）的抗生素（諸如康黴素）。例示性細胞培養條件適用於細菌培養物之維持與生長之材料及方法在此項技術中為熟知的。例示性技術可見於Manuai 0f Methods for

General Bacteriology，Gerhardt等人編，American Society for Microbiology, Washington, D.C. (1994)或 Brock， Biotechnology： A Textbook of Industrial Microbiology » 第 2版（1989) Sinauer Associates，Inc.，Sunderland，MA 中，各文獻藉此以全文引用的方式併入，尤其關於細胞培養技術。在一些實施例中，在允許由插入宿主細胞中之核酸編碼之一或多種異戊二烯合成酶多肽、鐵硫簇相互作用氧化還原多肽、DXP途徑多肽、；Οχρ途徑相關多肽或IDI多肽表現之條件下，於培養基中培養細胞。可使用標準細胞培養條件培養細胞（參見，例如w〇 2004/033646及其中所引用之參考文獻，各藉此以全文引用的方式併入，尤其關於細胞培養與醱酵條件）。使細胞生長並維持於適當溫度、氣相混合物及pH值（諸如約至約37°C、約6%至約84% C〇2及約5至約9ipH值）下。在一些實施例中，使細胞在35。(：下於適當細胞培養基中生長。在-些實施例中’舉例而言，在約2代下於震盈培養 149048.doc -80. 201111512 器或醱酵槽中之適當培養基中培養培養物，直至達成所要異戊一婦產量為止。在一些實施例中，酸酵之pH值範圍為約pH 5.0至約PH 9.0(諸如約pH 6.0至約pH 8.0，或約6.5至約7·0)。可基於宿主細胞之需求’在好氧、缺氧或厭氧條件下進行反應。既定絲狀真菌之例示性培養條件在此項技術中為已知的’且可見於科學文獻及/或來自真菌來源，諸如美國菌種保存中心（American Type Culture Collection) • 及真菌遺傳保存中心（Fungal Genetics Stock Center)。在多個實施例中，使用任何已知之醱酵模式，諸如分批、批式補料（fed-batch)或連續製程使細胞生長。在一些實施例中’使用分批醱酵方法。經典分批醱酵為封閉系統’其中培養基之組成在醱酵開始時進行設定且在酿酵期間不會作出人工變更。因此，在醱酵開始時，用所要宿主細胞接種細胞培養基且在未向系統中添加任何物質下進行酿酵。然而，「分批」醱酵就添加碳源而言通常為分批 φ 的，且常常試圖控制諸如PH值及氧濃度之因素。在分批系統中’系統之代謝物及生質組成怪定地發生變化直至停止酿酵為止。在分批培養中’細胞平缓經過靜態遲滯期 (static lag phase)至高度生長對數期，且最終到達生長速率減緩或停止之停滞期。在一些實施例中，對數期之細胞負責製造大部分異戊二烯。在一些實施例中，停滯期之細胞製造異戊二烯。在一些實施例中，使用基於標準分批系統之變更，諸如批式補料系統。批式補料醱酵過程包含典型分批系統，但 81 149048.doc 201111512 隨著醱酵之進行，遞增式添加碳源。當分解代謝物抑制作用傾向於抑制細胞代謝時且當細胞培養基中需要具有有限量之碳源時，批式補料系統為適用的。可以有限量或過量之碳源（例如葡萄糖）進行批式補料醱酵。量測批式補料系統中*厌源之貫際濃度較為困難，且因此基於諸如？11值、溶解氧、及廢氣（諸如c〇2)分壓之可量測因素的變化來估算該實際濃度。分批及批式補料醱酵為常見的且在此項技術中為熟知的’且實例可見於Br〇ck，Biotechn〇1〇gy: 4

Textbook of Industrial MiCrobi〇logy，第 2 版（1989)鲁

Sinaner Associates，Inc•，該文獻藉此以全文引用的方式併入’尤其關於細胞培養與醱酵條件。在一些實施例中，使用連續醱酵方法。連續醱酵為開放系、·先其中將Pf<疋酸酵培養基連續添加至生物反應器中，且同夺移除等里條件培養基以供處理。連續醱酵一般將培養物維持在恆定的高密度下，其中細胞主要處於生長對數期。連續酸酵允許調節影響細胞生長或異戊二稀製造之-個鲁因素或夕個因素。舉例而言，一種方法將諸如碳源或氮含量之限制性營養素維持於固定速率下且允許減緩所有其他參數在其他系統中，可連續改變多個影響生長之因素，同寺使、”田胞，辰度（例々口由培養基濁度量度之濃度）保持恆定。連續系統力求維持穩態生長條件。因此，因抽出培養基所致之細胞損失針對賴巾之細胞生長速率達成平衡。調節連續職酵過程之營養素及生長因素之方法以及使產物 149048.doc • 82- 201111512 形成速率最大化之技術在工業微生物學技術中為熟知的，且多種方法係由 Brock，Biotechnology: A Textbook of Industrial Microbiology，第 2版（1989) Sinauer Associates,

Inc_詳述，該文獻藉此以全文引用的方式併入，尤其關於細胞培養與醱酵條件。在一些貫施例中，細胞固定於作為全細胞催化劑之受質上且經受醱酵條件以供製造異戊二烯。

在一些貫施例中，將液體培養瓶置於震盪器中以將氧氣引入液體中且維持培養物之均勻性。在一些實施例中使用培育箱控制培養物生長之溫度、濕度、震盪速度及/或其他條件。最簡單之培育箱為具有可調式加熱器（通常至多升至約65。〇之保溫箱。更精緻之培育箱亦可具有降低溫度（經由致冷）之能力或控制濕度或c〇2含量之能力。最精密之培育箱包括計時器；一些亦可經程式設計以循環通過不同溫度、濕度水準等。培育箱之台面至單元之尺寸、小室之尺寸可改變。必要時，可更換細胞培養基之一部分或全部以補充營養素及/或避免潛在有害之代謝副產物及死細胞積累。在懸洋液培養之狀況下，可藉由離心或過㈣浮液培養物且接著將細胞再懸浮於新鮮培養基h自料基分離細胞。在貼壁培養之狀況下，換。在一些實施例中可藉由抽吸直接移除培養基且加以替，細胞培養基允許至少一部分細胞於，達至少之細胞分連續培養物（諸如未經稀釋之連續培養物）十分裂或約5、10、20、40、5〇、6〇、65次或&次以上 149048.doc •83· 201111512 裂。在一些實施例中，使用組成性啟動子或滲漏啟動子 (leaky promoter)(諸如Trc啟動子），且不添加用以誘導可操作地連接於該啟動子之異戊二烯合成酶核酸、鐵硫簇相互作用氧化還原核酸、DXP途徑核酸、DXP途徑相關核酸或 IDI核酸表現之化合物（諸如IpTG)。在一些實施例中，添加用以誘導可操作地連接於啟動子之異戊二烯合成酶核酸 '鐵硫簇相互作用氧化還原核酸、DXP途徑核酸、DXP 途徑相關核酸或IDI核酸表現之化合物（諸如jptg)。使異4二烯製造與細胞生長相分離之例示性方法本發明特別提供增強已培養細胞製造異戊二烯之組合物及方法。當使用原料時’需要原料中之碳轉化成異戊二烯’而非用於細胞之生長及維持。在一些實施例中，使細胞生長至低OD6〇q至中等〇D6GG，接著開始或增強異戊二烯製造。此策略使得大部分碳轉化成異戊二烯。在一些實施例中，細胞達到使之不再分裂或分裂極其緩慢之光學密度’但繼續製造異戊二烯，持續數小時（諸如約 2、4、6、8、10、15、20、25、30 小時或 30 小時以上）。在一些狀況下，550 nm下之光學密度隨時間降低（諸如在細胞因細胞溶解而不再處於指數生長期之後，光學密度降低）’且細胞繼續製造大量異戊二稀。在一些實施例中，550 nm下細胞之光學密度經某一時段（諸如超過或約 5、10、15、20、25 ' 30、40、5 0或60小時）增加小於或約 50%(諸如小於或約40、30、20、10、5或0%)，且在此時 149048.doc • 84 - 201111512 段期間細胞製造大於或約1、10、25、50、100、150、 200、250、300、400、500、600、700 ' 800、900、 1，000、1，250、1，500、1,750、2,000、2,500、3,000、 4,000、5,000奈莫耳異戊二烯/公克細胞（細胞濕重）/小時 (nmol/gwem/h)或 5,000 nmol/gwern/h以上之異戊二烯。在一些實施例中，異戊二烯之量為約2至約5,000 nmol/gwcm/h，諸如約2至約1〇〇 nm〇l/gwcm/h 、約100至約500 nmol/gwcm/h、約 150至約 500 nmol/gwcni/h、約 500至約 1，000 11111〇1/§心„1/11、約1，000至約 2,000 11111〇1/8〜„1/11、或約 2,000至約5,000 nmol/gwcm/h。在一些實施例中，異戊二烯之量為約 20 至約 5,000 nmol/gwcm/h 、約 100 至約 5,000 nmol/gwem/h、約 200 至約 2,000 nmol/gwcm/h、約 200 至約 1,000 nmol/gwem/h、約 300至約 1,000 nmol/gwcm/h、或約 400 至約 1，000 nmol/gwcm/h。在一些實施例中，550 nm下細胞之光學密度經某一時段 (諸如超過或約5、1〇、15、20、25、30、40、50或60小時）增加小於或約50%(諸如小於或約4〇、3〇、2〇、1〇、5或 0〇/〇) ’且在此時段期間細胞製造累積力價（總量）大於或約為 1、10、25、50、1〇〇、150、200、250、300、400、 500 、 600 、 700 、 800 、 900 、 1，〇〇〇、 1,250 、 1，500 、 1，750、2,000、2,500、3,000、4,〇〇〇、5,000、10,000、 5〇,〇〇〇、ιοο,οοο毫克異戊二烯/公升培養液（mg/L场巷*，其中培養液體積包括細胞及細胞培養基之體積）或1〇〇,〇〇〇 mg/L·培番液以上之異戊二稀。在一些實施例中，異戊二稀之 149048.doc -85- 201111512 置為約2至約5,000 mg/L培*液，諸如約2至約100 mg/L培*液、約100至約500 mg/Li&巷液、約500至約1，〇〇〇 mg/L培巷液、約 1，000至約 2,000 mg/L培*液、或約 2,000至約 5,000 mg/L«*液。在一些實施例中，異戊二烯之量為約20至約5,00〇 mg/L培養液、約100至約5,000 mg/L培巷液、約200至約2,000 mg/L培巷液、約 200至約1，〇〇〇 mg/L培♦液、約300至約l，〇〇〇 mg/Lis養液、或約 400至約1，〇〇〇 mg/L培巷液。在一些實施例中’ 5 5 0 nm下細胞之光學密度經某一時段 (諸如超過或約5、10、15、20、25、30、40、50或60小時）增加小於或約50%(諸如小於或約40、30、20、10、5或〇%)，且在此時段期間細胞使細胞培養基中大於或約 0 0015、0.002、0.005、0.01、〇〇2、〇〇5、〇」、〇 12、、〇·ΐ6、〇.2、〇.3、〇.4、〇 5、〇 6、〇 7、〇 8、〇 9、 1.〇、1.2、1.4、1.6、1.8、2,0、2.5、3.0、3.5、4.0、 5·〇、6.0、7.〇或8.0%之碳轉化成異戊二烯。在一些實施例中，碳轉化成異戊二烯之轉化百分率為諸如約〇〇〇2%至約 4.0%、約 0.002% 至約 3·〇%、約 0.002% 至約 2 〇%、約 0.002% 至約 Κ6%、約 0.002% 至約〇〇〇5%、約〇〇〇5% 至約 0.01%、約〇.〇1。/。至約〇.〇5%、約 0_05%至約〇 15%、〇 15% 至約〇_2%、約0.2%至約〇.3%、約〇.3%至約〇 5%、約〇 = 至約0.8%、約〇,8%至約1.0%、或約1〇%至約丨6%。在一些實施财，碳轉化成異戊二稀之轉化百分率為約〇〇㈣至約 0.4%、0.002% 至約〇.16%、〇〇4% 至約〇 16%、約 0.005%至約〇_3%、約0·01%至約〇.3%、或約〇〇5%至約 149048.doc -86 · 201111512 0.3〇/〇〇在-些實施例中，僅在停滯期製造異戊二埽。在施例中，在生長期與停滞期皆製造異戊n ㈣例中，在停滯期期間所製造之貫方之異戍二烯的總量，戈// 里=如所製造次1 OD6⑽母小時每公升培養液所之異戊二烯之量）大於或約為在生長期期間歷經時間所製造之異戍二稀之量的2、3、4、5、ι〇、2〇:

4〇、5〇倍或5〇倍以上。在多個實施例中，當細胞處於停滯月夺製&大於或約為所製造總量(諸如在醱酵期間焊崾某一時間段（諸如2◦小時）製造之異戊二稀）之5、1〇、二，、 3〇 4〇、5〇、6〇、70、80 ' 90、95、99。/。或 99%以上之異 j一烯。在多個實施例中’當細胞緩慢分裂或不分裂使得550 nm下細胎之止姐+ + Α 先干役度增加小於或約50%(諸如小於或約 40、30、20、ιλ η ' 、5或〇%)時，製造大於或約為所製造總量（諸如在醱酵期間歷經某—日寺間段（諸如2〇小時）製造之: 戊二烯）之 5、10、20、30、40、50、60、70 ' 8〇、9〇、、 95、"％或"％以上之異戍二稀。在-些實施例中，僅在生長期製造異戊二烯。缺在-些實施例中，_或多種異戊二烯合成酶核酸、鐵硫族相互作用氡化還原核酸、DXP途徑核酸、DXP途徑相關核S夂及/或IDI核酸置於在停滯期比在生長期更具活性之啟動子或因子的控制下。舉例而言，-或多種異戊二稀合成酶；L 鐵石’IL簇相互作用氧化還原核酸、DXp途徑核酸、途^相關核酸及/或IDI核酸可置於停滯期σ因子（諸如 149048.doc -87- 201111512

Rp〇s)之控制下。在一些實施例中，一或多種異戊二烯合成酶核酸、鐵硫簇相互作用氧化還原核酸' Dxp途徑核酸、DXP途徑相關核酸及/或1]〇1核酸置於在停滯期可誘導之啟動子，諸如在停滯期可由反應調控子誘導呈活性之啟動子的控制下。在安全操作範圍内製造異戊二稀本發明特別提供增強自已培養細胞製造異戊二烯之組合物及方法。根據異戊二烯之可燃性特徵在安全操作水準下製造異戊二烯簡化了工業化設施之設計與構建大大改良安全操作之能力，且限制起火之可能性。詳言之，異戊二稀製造之最佳範圍處於安全區域内，亦即，異戊二稀濃度之非可燃範圍内。在一此類態樣中，本發明提供一種在異戊二烯濃度之非可燃範圍内（異戊二烯之可燃包絡範圍 (flammability envelope)外）製造異戊二烯之方法。因此，使用電腦模型化及實驗測試來測定異戊二烯（諸如在〇2、N2、C〇2或兩種或兩種以上前.述氣體之任何組合存在下的異戊二烯）之可燃限度以確保製程安全性。可燃包絡範圍之特徵在於可燃下限（LFL)、可燃上限（UFL)、極限氧〗辰度（L0C)及極限溫度。若系統欲可燃，則須在最、少 S之氧化劑（通$為氧氣）存在下含有最少量之燃料（諸如異戊二烯）。LFL為維持燃燒須存在之異戊二烯的最小量，而 UFL為可存在之異戊二烯的最大量。高於此限度時，混合物昌含燃料且氧氣分數過低而使混合物不可燃。L〇c表示亦須存在以使混合物可燃之氧氣的最小分數。極限溫度係 I49048.doc -88- 201111512 基於異戊二烯之閃點且為悔 ώ ^ 勹兵戊一燁燃燒可傳播之最低溫度。此寻限度具體到異六_祕、曲# 卜 / 、戍一烯/辰度、氧化劑類型及濃度、系統中存在之惰性物質、系統溫度及麼力。處於可燃包絡靶圍之限度内的組合物傳播燃燒且在製程設備之設計與操作方面需要其他安全防範。使用電腦模擬與數學分析以及實驗測試來測試以下條件必要時，可使用本文所述之方法來測試其他條件（諸如其他溫度、壓力及永久氣體組成）以測定LFL、UFL及 LOC濃度。

(1)電腦模擬與數學分析測試套件1 : 異戊二稀：〇重量°/。-1 4重量％〇2 : 6重量％_21重量％ N2 : 79重量％-94重量0/〇測試套件2 : 異戊二稀：〇重量°/。_ 14重量°〆。〇2 : 6重量％_21重量％ N2 : 79重量％_94重量〇/〇以H：2〇達到飽和測試套件3 : 異戊一烯：〇重量°/〇 _ 14重量°/〇〇2 : 6重量％_21重量％ N2 : 79重量％_94重量％ C〇2 ·· 5 重量％·3〇重量〇/〇 149048.doc -89· 201111512 (2)最终測定可燃限度之實驗測試測試套件i: 異戊二烯：0重量％-1 4重量％〇2 : 6重量％_21重量％ N2 : 79重量％-94重量％測試套件2 : 異戊二烯：0重量°/〇-14重量％〇2 : 6重量。/。_21重量％ N2 : 79重量％_94重量％以H20達到飽和使用〃模擬軟體得到若干不同測試條件下系統之可燃特徵的估算值。C〇2顯示對系統之可燃限度無顯著影響。藉由實驗測試確認測試套件丨及2。模型化結果與實驗二試=果相一致。在添加水之情況下發現僅稍有變化。赋幻個大氣壓下’異戊二烯、02、NAC02混合物之 LOC據測定為9.5體積％。添加至多鳩不會顯著影響異戊二烯、02及乂混合物之可燃特徵。在無水與以水達二飽#之〆、戊一稀、〇2及N2系統之間顯示可燃特徵僅補有變化。極限溫度為約_5代。低於約At之溫度因過低而不能傳播異戊二烯燃燒。在-些實施例中’視系統,氧氣之量而定，異戊二婦之 LFL在約丨.5體積％至約2謂積％之範_，且異戊二稀之肌在約2.〇體積％至約12•嗜積％之範圍内。在—歧實施例中，咖為約9_5體積％之氧氣。在―些實施例中，當溫 I49048.doc -90· 201111512 度為約25<t至約55。(〕（諸如約40。〇且壓力為約1個大氣壓至 3個大氣壓時，異戊二烯之LFL為約1·5體積％至約2〇體積 %，異戊二烯之UFL為約2.0體積°/。至約12.0體積％，且loc 為約9.5體積％之氧氣。在一些實施例中，在小於約9.5體積％(亦即’低於異戊

二烯混合物可燃所需之LOC)之氧氣存在下製造異戊二烯。在大於或約9.5體積％之氧氣存在下製造異戊二烯之一些實施例中，異戊二烯濃度低於LFL(諸如低於約1 5體積 %)。舉例而言，可藉由用惰性氣體稀釋異戊二烯組合物 (例如，藉由連續或週期性地添加諸如氮氣之惰性氣體以保持異戊二烯組合物低於LFL)來保持異戊二烯之量低於 LFL。在大於或約9.5體積％之氧氣存在下製造異戊二烯之 -些實施例中，異戊二稀濃度高於肌(諸如高於約Η體積 %)。舉例而言’可使用製造濃度高於肌，諸如本文所述之任何細胞培養系統)來保持異== 量高於肌。必要時’可使用相對較低含量之氧氣以使得肌亦相對較低。在此狀況下，需要較低異戊：稀濃度以保持高於UFL。一在大於或約9.5體積％之氧氣存在下製造異戊二稀之一些貫施例中’異戊二烯濃度在可燃包絡範圍内（諸如介於LFL 與肌之間）。在-些實施例中，當異戊二稀濃度可能處於可燃包絡範圍内時’進行一或多個步驟以降低起火或爆炸之可能性。舉例而言，可避開_ $ # # μ A 一、 Ί避開或多個燃燒源（諸如可能產生火花之任何材料）。在一此每Α j在二具靶例中，進行一或多個 149048.doc -91 · 201111512 步驟以知目短異戊一稀激度保持在可燃包絡範圍内之時間段。在一些實施例中，使用感測器偵測異戊二烯濃度何時接近或處於可燃包絡範圍内。必要時，可在細胞培養期間於一或多個時間點量測異戊二烯濃度，且若異戊二烯濃度接近或處於可燃包絡範圍内，則可使用標準方法調整細胞培養條件及/或惰性氣體量。在特定實施例中，調整細胞培養條件（諸如醱酵條件）以使異戊二烯濃度降至LFL以下或使異戊二烯濃度増至UFL以上。在一些實施例中，藉由用惰性氣體稀釋異戊二烯組合物（諸如藉由連續或週期性地添加惰性氣體以保持異戊二烯組合物低於lfl)來保持異戍一細之量低於LFL。在一些實施例中，除異戊二烯以外之可燃性揮發物（諸如一或多種糖）之量比所製造的異戊二烯之量至少約低2、 5、10、50、75或1〇〇倍。在一些實施例中，除異戊二烯氣體以外之氣相部分包含約〇%至約100%(體積）之氧氣，諸如約0。/。至約10%、約10%至約20%、約20%至約30%、約 30%至約40%、約40%至約50%、約50%至約60〇/〇、約60% 至約70。/。、約70%至約80%、約80%至約90%、或約9〇%至約1 00%(體積）之氧氣。在一些實施例中，除異戊二烯氣體以外之氣相部分包含約〇%至約99%(體積）之氮氣，諸如約〇%至約10%、約10%至約20%、約20%至約30%、約30%至約40%、約40%至約50%、約50%至約60%、約60%至約 70%、約70%至約80°/。、約80%至約90%、或約90%至約 99%(體積）之氮氣。 149048.doc •92· 201111512 在一些實施例中，除異戊二烯氣體以外之氣相部分包含約1%至約50%(體積）之C02，諸如約1%至約1〇%、約1〇%至約20%、約20%至约30%、約30%至約40%、或約4〇%至約 50%(體積）之C02。在一些實施例中’異戊二烯組合物亦含有乙醇。舉例而言，可使用乙醇對異戊二烯進行萃取蒸餾，從而得到包括乙醇及異戊二稀之組合物（諸如中間產物流）。理想地，乙鲁醇之量處於乙醇之可燃包絡範圍外。在標準條件，諸如約 1個大氣壓及約60卞下，乙醇之LOC為約8.7體積。/。，且乙醇之LFL為約3.3體積〇/〇(NFPA 69汾训心以训•⑽ iVeve/m•⑽办2008版，其藉此以全文引用的方式併入，尤其關於LOC、LFL及UFL值）。在一些實施例中，在低於乙醇混合物可燃所需之L〇c(諸如小於約8.7體積下製造包括異戊二烯及乙醇之組合物。在高於或約為乙醇混合物可燃所需之LOC下製造包括異戊二烯及乙醇之組合物 φ 的一些實施例中，乙醇濃度低於LFL(諸如小於約3 ·3體積 %) 0 在多個實施例中，氧化劑（諸如氧氣）之量低於系統中任何燃料（諸如異戊二烯或乙醇）之L0C。在多個實施例中，氧化劑（諸如氧氣）之量比異戊二烯或乙醇之L0C約低60、 40 ' 30 ' 20、10或5%。在多個實施例中，氧化劑（諸如氧瑕0之量比異戊二烯或乙醇之1^〇(：至少低2、4、5或5個以上絕對百分點（體積％)。在特定實施例中，氧氣之量比異戊一烯或乙醇之LOC至少低2個絕對百分點（體積％)(諸如 149〇48.doc -93· 201111512 當異戊二烯之LOC為9.5體積％時，氧氣灑舟,* 辰沒小於7.5體積在多個實施例中，燃料（諸如異戊二歸或己醇）之量小於或約為被燃料之]^1^的25、20、15、1〇或57 例示性製造異戊二烯本發明特別提供使用各種DXP途徑酶與鐵_相氧化還原基因或多肽及異戊二烯合成酶基因或多肽、況選用之IDI基因與多肽及Dxp途徑相關基因與多狀視，合來增強自已培養細胞製造異戊二稀之紐合物及二法之： -些實施例中，在允許細胞製造異戊二歸之條件下於於基中培養細胞。「♦值絕對生產力」意謂在歷經特定心 (例如在特定_操作期間培養細胞)期間釋出氣 =戊二稀之最大絕對量。「峰值絕對生產力時間/ 意謂在酸酵操作期間，在歷經特定時段 .·，·」特定酶酵操作期間培養細胞)期間釋出氣。例= 絕對量處於最大值時的時間點。在—些由戊—婦之絕對生產力時間點量測異戊 =& | ’於峰值、π 一娜之里。在—此細胞之峰值絕對生產力約為 ·^施例中，的量。 +文中所揭不之任何異戊二烯「峰值比生產力，音棚+广〜明在歷經特定時段在特定醱酵操作期間培養％ —广培養細胞(例如間每個細胞所製造之| 戍二烯的最大量。「峰值之異定朴以… 生產力時間點」意謂在歷經特疋夺^又培養細胞（例如在 n , A 锊疋醱酵知作期間培養細胞）期間，母個細胞所製造之 * 。期點。如知之里處於最大值時的時間點。如600 nm下之光學密 ™ 又（0〇6〇〇)所測定，藉由用總生產 149048.doc .94· 201111512 力除以細胞量來測定比生產力。在—些實施例中，於峰值比生產力時間點量測異戊二烤之詈。在一些實施例中，細，之峰值比生產力約為本文巾所揭示之任何異戊二稀的置/細胞。「累積總生產力」意謂在歷經特定時段培養細胞（例如在特定酿酵操作期間培養細胞）期間所製造之里戊二稀的累積總量。在-些實施财，量㈣戊二烯之累積總量。在-些實施例中’細胞之累積總生產力約為本文中所揭示之任何異戊二烯的量。「相對偵測器回應值」係、指一種化合物（諸如異戊二稀）之偵測器回應值（諸如GC舰面積）與—或多種化合罐如所有C5烴）之制器回應值（諸如gc/ms面積）之比率。可如本文所述量測備測器回應值，諸如用配備有細邮Hp_ 测⑽⑽管柱⑼―〇㈣；〇.25_膜厚度）之Agilent 6刚GC/MS系統進行⑽⑽分析。必要時，可使用各化。物之回應因子將相對㈣器回應值轉換成重量百分比。此回應因子為針對既定量之特定化合物所產生之信號強弱 (:即，偵測器對特定化合物之敏感程度)的量度。當備測讀相比較之化合物具有不同敏感度時’此回應因子可用作將相對债測器回應值轉換成重量百分比之修正因子。或者可猎由假定相比較之化合物的回應因子相同來近似估計重量百分比。因此，可假定重量百分比與相對偵測器回應值近似相同。 10 在—些實施例_，培養中細胞製造大於或約 H9048.doc -95· 201111512 25 ' 50、100、150、200、250、300、400 ' 500、600、 700、800、900、1,000 ' 1,250、1,500、1,750 ' 2,000、 2,500、3,000、4,000、5,000奈莫耳異戊二烯/公克細胞（細胞濕重）/小時（nmol/gwcm/h)或5,000 nmol/gwcm/h以上之異戊二烯。在一些實施例中，異戊二浠之量為約2至約5,000 nmol/gwcm/h，諸如約 2 至約 100 nmol/gwcm/h、約 100 至約 5 00 nmol/gwcm/h、約 150至約 500 nmol/gwcm/h、約 500至約 1.000 nmol/gwcm/h、約 1,000 至約 2,000 nmol/gwcm/h、或約 2,000至約5,000 nmol/gwcm/h。在一些實施例中，異戊二烯之量為約20至約5,000 nmol/gwcm/h、約100至約5,000 nmol/gwcm/h、約 200 至約 2,000 nmol/gwcm/h、約 200 至約 1.000 nmoI/gwcm/h、約 300至約 1,000 nmol/gwcm/h、或約 400 至約 1,000 nmol/gwcm/h。以iimol/gwcm/h為單位之異戊二烯之量可如美國專利第 5,849,970號中所揭示來量測，該專利藉此以全文引用的方式併入，尤其關於異戊二稀產量之量測。舉例而言，使用標準氣相層析系統，諸如採用正辛烷/多孔矽膠珠C(porasil C)管柱（Alltech Associates，Inc., Deerfield, 111.)以等溫方式 (85°C)操作且耦接至RGD2氧化汞還原氣體偵測器（Trace Analytical，Menlo Park, CA)之系統，分析2 mL頂部空間氣體（headspace)(例如培養物之頂部空間氣體，諸如在密封小瓶中於32°C、以200 rpm震盪下培養約3小時之2 mL培養物之頂部空間氣體）中的異戊二烯（參見，例如Greenberg等 A > Atmos. Environ. 27A: 2689-2692, 1993 i Silver等人， 149048.doc -96- 201111512 P/祕外97:1588_1591，1991，各藉此以全文引用的方式併入，尤其關於異戊二烯產量之量測）。經由標準異戊二烯濃度校準曲線將氣相層析面積單位轉換成異戊二烯奈莫耳數。在一些實施例中，藉由獲得細胞培養物樣品之八6〇〇值’接著基於具有已知值之細胞培養物的濕重之校準曲線將該A_值轉換成細胞公克數來計算細胞公克數之值（細胞濕重）。在一些實施例中，藉由假定A_值為1之 1公升培養液（包括細胞培養基及細胞）的細胞濕重為1公克來估算細胞公克數。亦用該值除以培育培養物已歷經之小時數，諸如3小時。在一些實施例中，培養中細胞製造大於或約1、1 〇、 25、50、100、150、200、250、300、400 ' 500、600、 700、800、900、1，〇〇〇、1，250、1，500、1,750、2,000、 2,500、3,000、4,000、5,000、1〇,〇〇〇、1〇〇,〇〇〇奈克異戊二烯/公克細胞（細胞濕重）/小時（ng/gwcm/h)或1〇〇〇〇〇 ng/gW(：m/h以上之異戍二烯。在一些實施例中，異戊二烯之量為約2至約5,〇〇〇 ng/gwem/h ’諸如約2至約1〇〇 ng/gwcm/h、約 100 至約 500 ng/gwem/h、約 500 至約 1，〇〇〇 ng/gwcm/h、約 1，〇〇〇至約 2,000 ng/gwcm/h、或約 2,000 至約 5,000 ng/gwcm/h。在一些實施例中，異戊二烯之量為約2〇至約 5,000 ng/gwcm/h、約 1〇〇至約 5,000 ng/gwcm/h、約 200至約 2,000 ng/gwcm/h、約 200至約 1，〇〇〇 ng/gwcm/h、約 300至約 1，000 ng/gwcm/h、或約 400 至約 1,000 ng/gwcm/h。以 ng/gwcm/h為单位之異戊二烯的量可藉由用上文所論述之單 149048.doc -97- 201111512 位為11«1〇1仏^111/11之異戊二烯產量值乘以68.1(如以下等式5 所述）來計算。在一些實施例中’培養中細胞製造累積力價（總量）大於或約為 1、10、25、50、100、150、200、250、300、 400、500、600、700、800、900、1,〇〇〇、1，250、1，500、 1，750、2,000、2,500、3,000、4,000、5,000、10,000、 ’(^(^’…(^⑼毫克異戊二稀/公升培養液⑼层/^養液’其中培養液體積包括細胞及細胞培養基之體積）或100,000 mg/L"*以上之異戊二烯。在一些實施例中，異戊二烯之量為約2至約5,000 mg/L培♦液，諸如約2至約100 mg/L“液、約100至約500 mg/L培*液、約500至約i，〇〇〇 mg/L培養液、約 1，〇〇〇至約 2,000 mg/L培“ '或約 2,〇〇〇至約 5,000 mg/L“液。在一些貫施例中’異戊二烯之量為約2〇至約5,〇〇〇 mg/L培養液、約100至約5,〇〇〇 mg/；U養液、約200至約2,000 mg/“養液、约 200至約1，〇〇〇 mg/L"液、約3〇〇至約1〇〇〇 mg/]U養液、或約 4〇〇至約1,000 mg/L培養液。在—些實施例中，培養中細胞製造至少約2 g/L场養液、至少約2.1 g/L_、至少約22 g/L “液、至少約2 3 g/;u “、至少約2.4 g/L培“、至少約2 5 g/u巷液、至少約2 6抑培巷液、至少約2.7 g/L_、至少約2 8 g/L_、至少約2 9 g/w液、至少約3_0 g/L培“、至少約3 2 g/L“ &、至少約3 5 g/““、至少約3.7 g/L“*、或至少約4 〇 g/Ua。來自震盪燒瓶或類似培養器之異戊二烯之比生產力（毫克異戊二烯/公升頂部空間氣體）可藉由自〇D6q0值為約1.0 149048.doc 201111512 =細胞培養物獲取！ m】樣品，將其置於2g虹小瓶中培育财鐘，接著量測頂部空間氣體中異戊二稀之量來量^ (身曰例如實例1部分η所述）。若0D咖值不為】〇，則可藉由用罝測值除以〇〇6〇0值來針對！ 0之〇〇_值進行校正。可藉由用毫克異戊二稀/公升頂部空間氣體之值乘以3 8將其轉換成mg/L…~培養液之〇〇6〇〇。可將以琳培巷液祕〜。為早位之值乘以小時數及OD_值來獲 • 公升培養液為單位之累積力價。醋酵槽t以mg/L埼養液/h為單位之瞬時異戊二烯製造速率可藉由獲取醱酵槽釋出氣體之樣品，如例如實例㈣⑽ 述分：樣品中異戊二烯之量(以諸如毫克異戊二烯/公升氣體為早位）’且冑此值乘以釋出氣體通過每公升培養液之速率（例如1 vvm(空氣體積/培養液體積/分鐘），其為的公升氣體/小時）來量測。因此，！ mg/L㈣之釋出氣體量對應於在1 vvm之空氣流速下6〇之瞬時製造速率。 _ '必要時，可將以mg/L…/h為單位之值除以〇D6。。值來獲得以mg/L,SM/h/〇D為單位之比速率。毫克異戊二烯/公升氣體之平均值可如下轉換成總產物生產力（公克異戊二烯/公升醱酵培養液，mg/“M):將此平均釋出氣體異戊二烯濃度乘以在醱酵期間每公升醱酵培養液釋出之釋出氣體的總量。因此，在1 vvm下經10小時〇 5 mg/L"液^之平均釋出氣體異戊二烯濃度對應於300 mg異戊二烯化^*之總產物濃度。在一些實施例中，培養中細胞使細胞培養基中大於或約 149048.doc -99· 201111512 0.0015、0.002、0.00s、0.01、〇〇2、 °.14、°16、。2、。.3、。.4，、二 …1.2、1.4、1.6………、〗〇·9、 5.〇、一或，。之碳轉化成異戊二稀。在二：卜故轉化成異戍一烯之轉化百分率為〇/〇 ' 約 0.002% 至約 3 〇% .002/。至約中 4热 '約請2%至約3.G%、^=f 0.002% 至約⑽、約〇.〇〇2% ' 2·〇%、約 =。一= 勺。。.勺0.2%至約〇 3%、約〇 3 ° 至約一崎約— 些貫施例中，碳轉化成異戊二烯之轉化 .。在至約0.4%、〇._%至約G l6%、㈣、為約〇遍％ _%至軸 '約〇·〇1%至約〇 3% : ^ 0.3%。或、.勺〇. 0 5 %至約石反轉化成異戍二，说+ # & 由用所製造之！戊〃率（亦稱作碳產率％)可藉數⑷枝補H之衫耳數㈣碳源中之碳莫耳量測。將：數:：酵母提取物中之碳莫耳數)來 :將此數值乘以職以得到百分等式1 二婦中之碳莫耳數）/(碳源中之碳碳產率％=(所製造之異戊莫耳數）Χ100 關於此計算而言，對於實可假定酵母提取物含有50% w/w碳。舉例例7部分vm所述之5叫升，可如等式2所 I49048.doc -J00- 201111512 示計算碳轉化成異戊二烯之轉化百分率。等式2 石反產率 /»-(39.1 g 異戊二稀 χι/68·ι m〇l/gx5 C/mol)/ [(181221 g葡萄糖 xl/180 m〇i/gx6 c/mol) + (17780 g酵母提取物 x〇.5x 1/12 mol/g)]x i〇〇=〇〇42〇/0 對於本文中（實例7部分VII及VIII)所述之兩個500公升醱酵’碳轉化成異戊二烯之轉化百分率為〇〇4_〇〇6%。已使用如本文所述之14公升系統達成〇.i丨_〇1 6〇/。之碳產率。熟習此項技術者可易於將異戊二烯製造速率或所製造之異戊二烯的量轉換成任何其他單位。用於單位之間相互轉換之例示性等式如下文所列。異戊二烯製造速率（總速率及比速率）之單位等式3 1 g異戊二烯/L培養*/h=14.7 mmol異戊二烯/L培《*/h(總體積速率）等式4 1 nmol 異戊二烯/gwcm/h=i nrn〇l 異戊二烯/l 培卷 */h/〇D600(此轉換假定OD^o值為1之1公升培養液的細胞濕重為1公克。）等式5 1 nmol異戊二烯/gwcin/h=681 ng異戊二烯/gwcm/h(給出異戊一稀之分子量）等式6 1 nmol異戊二烯/Lw 〇2/h=90 nmol異戊二烯 /Luift/hi；對於 149048.doc • 101 - 201111512 每公升培養液，〇2流動速率為90 L/h) 等式7 1 Kg異戊二烯/Lu釋出氣體中之異戊二烯=60 pg異戊二烯/ L埼 * 液/h(流動速率為 60 Last/L^*»(l vvm)) 力價（總力價及比力價）之單位等式8 1 nmo丨異戊二烯/mg細胞蛋白質=15〇 nmol異戊二烯/L"a/ 〇D6〇〇(此轉換假定〇D6〇〇值為1之1公升培養液的總細胞蛋白質為約150 mg)(比生產力）等式9 1 g異戊二烯/L〇ft = 14.7 mmol異戊二烯/L培養液（總力價）必要時’可使用等式10將包括細胞濕重之任何單位轉換成包括細胞乾重之相應單位。等式10 細胞乾重=(細胞濕重）/3.3 必要時，可使用等式11在單位ppm與pg/L之間進行轉換。詳言之，「ppm」意謂依pg/g(w/w)定義之百萬分率。氣體濃度亦可以體積計使用依pL/L(體積/體積）定義之「ppmv」（體積百萬分率）來表示。可藉由測定每公升釋出氣體之質量（亦即’氣體密度）將gg/L轉換成ppm(例如微克分析物/公克氣體）。舉例而言，在標準溫度及壓力（STp . 101.3 kPa(l巴）及273.15K)下，1公升空氣之密度為約129 g/L。因此，在STP下，1 ppm(pg/g)之濃度等於i 29 pg/L(等式11)。ppmbg/g)至pg/L之轉換為壓力、溫度與釋 149048.doc -102- 201111512 出氣體之總體組成的函數。等式11 在標準溫度及壓力（STP; 101.3 kPa(l巴）及273.15K)下，1 ppm(pg/g)等於 1.29 pg/L。可使用通用氣體定律（Universal Gas Law)(等式12)將 pg/L轉換成ppmv(例如微升分析物/公升氣體）。舉例而言， 1000 pg/Lw之釋出氣體濃度對應於147 。通用氣體常數為0.082057 L.atm K^mol·1，故使用等式12，在 STP下14.7 μηιοί HG所佔據之體積等於0.329 mL。因此，在 STP下，1〇〇〇 gg/L HG之濃度等於 329 ppmv或 0.0329% (v/v)。等式12 PV=nRT’其中「P」為壓力，「V」為體積，「n」為氣體莫耳數，「R」為通用氣體常數，且「丁」為克耳文（Kelvin) 溫度。異戊二烯組合物中雜質之量在本文中通常以重量/體積 (w/v)計，以諸如gg/L之單位加以量測。必要時，可使用等式13將以pg/L為單位之量測值轉換成單位mg/m3。等式13 1 pg/L=l mg/m3 在本發明所涵蓋之一些實施例中，包含編碼異戊二烯合成酶多肽之異源核酸的細胞所製造之異戊二烯之量至少或約為在基本上相同條件下生長、但不含編碼異戊二烯合成酶多肽之異源核酸的相應細胞所製造之異戊二烯之量的2 149048.doc •103· 201111512 倍、3倍、5俨 1〇倍、伽倍或卿:上\25倍、5〇倍、⑽倍、"Ο倍、2〇0 在本發明所涵f 成酶多肽之異、，貫施例中，包含編碼異戊二稀合、"、核酸及一或多種編碼DXP途徑多肽之異源核S夂的細胞所製衣^之異戊二烯之量至少或約為在基本上同條件下生長、彳θ -不έ異源核酸的相應細胞所製造之里戊二稀之量的2倍、3倍、5倍、1〇倍、25倍、5〇倍、ι〇〇倍、 150倍、200倍、400倍或400倍以上。在些實施例中’以組合物中所有C5烴之總重量計，異戊一稀組合物包含大於或約99 9〇、99 92、99 94、99 96、 99·98或100重量％之異戊二稀。在—些實施例中以組合物中所有C5烴之偵測器回應值計，組合物中異戊二烯之相對债測器回應值大於或約為99.90、99.9 1、99.92、99.93、 99.94、99.95、99.96、99.97、99.98、99.99或 100%。在— 些實施例中，以組合物中所有C5烴之總重量計，異戊二烯組合物包含約99.90至約99.92重量％、約99.92至約99.94重量％、約99.94至約99.96重量％、約99.96至約99_98重量 %、約99.98至100重量％之異戊二烯。在一些實施例中，以組合物中所有C5烴之總重量計，異戊二烯組合物包含小於或約0.12、0.10、0.08、〇.〇6、 0.04、0.02、0.01、0.005、0.001、0.0005、0.00(^、 0.00005或0.00001重量％之非異戊二烯之C5烴（諸如l，3-環戊二烯、反-1,3-戊二烯、順-1，3-戊二烯、1，4-戊二烯、^ 戊块、2-戍炔、3 -曱基-卜丁炔、戊-4-烯-1 -炔、反-戊_3_ 149048.doc -104· 201111512 烯-1-炔或順-戊-3-烯-1-炔）β在一些實施例中，以級入物中所有C5烴之偵測器回應值計，組合物中非異戍二场之 C5烴的相對偵測器回應值小於或約為〇. 1 2、〇·丨〇、〇 % ' 0.06、〇.〇4、〇.〇2、0·01、〇·〇〇5、0.001 ' 〇〇〇〇5、

0.0001、0.00005或〇.〇〇〇01%。在一些實施例中，以組入物中所有C5烴之偵測器回應值計，組合物中1，3-環戊二婦、反-1，3 -戊一烯、順-1，3 -戊二烯、1,4 -戍二烯、1_戊块 2 戊炔、3-曱基-1_ 丁炔、戊-各烯-卜炔、反-戊、3_烯_丨、炔戋順-戊-3-烯-1-炔之相對偵測器回應值小於或約為〇 I〗' 0.10、0.08、〇·〇6、〇·〇4、〇·〇2、0.01 〜、㈠ η ^ 'J 0 1 、 0-0005、o.oooi、0 00005 或o 〇〇〇〇1%。在一些實施例中以組合物中所有C5烴之總重量計，異戊二烯組合物包人約 0.02至約〇·〇4重量％、約〇〇4至約〇〇6重量。/ 約0.06至 0·08重量％、約〇·〇8至〇.1〇重量％或約〇· 10至約〇 * ^ 量之非異戊二烯之C5烴（諸如1，3_環戍二烯、反-丨，戍〜歸、順-1，3-戊二烯、〖，/μ戊二稀、丨戊炔、2_戊块、 ^ Y 基 _ 1 _ 丁炔、戊-4-稀-1-炔、反-戊_3_烯_丨_炔或橫、炔）。 H稀小在—些實施例t，異戊二稀組合物包含小於或心、 30、20、10、5、1、0.5、0.1、0_05、〇〇1 咬〇 ⑼ Pg/L抑制異戊二烯聚合之化合物（組合物中抑制異聚合之任何化合物)。在一些實施例中’異戊二烯組合物匕3、力0.005至約50 pg/L，諸如約〇〇1至約1〇、約〇〇1至約 5約0.01至約】 '約〇〇1至約〇 5或約〇〇1至約〇⑽叩几抑 149048.doc -105· 201111512 制異戊二烯聚合之化合物(組合物中抑制異戊二烯聚合之任何化合物）。在-些實施例中’異戊二烯組合物包含小於或約50 “0、30、20、10、5、1…、。」、^、。… 或0.005 pg/L之非異戊二烯之烴（諸如13_環戊二烯反_ 1，3-戊二烯、順-1，3-戊二烯、M_戊二烯、丨·戊炔、2_戊快、3-甲基小丁炔、戊-4·稀小炔、反_戊_3_稀小块或順_ 戊-3-烯-i-炔)。在一些實施例中，異戊二烯組合物包含約 0.005至約50肫/L，諸如約0.01至約1〇、約〇〇ι至約$、約〇.〇1至約i、約0.01至約0.5或約〇.〇1至約〇〇〇5 _之非異戊二烯之烴。在一些實施例中，異戊二烯組合物包含小於或約 0.005叫/L之蛋白質或脂肪酸（諸如與天然橡膠天然相關之蛋白質或脂肪酸）。在一些貫施例中，異戊二烯組合物包含小於或約1 〇、 5、1、0.8、0.5、0.1、〇.〇5、0^ 或〇〇〇5 ρρπ^α 快煙、間戊二烯、乙腈或丨，3_環戊二烯。在一些實施例中，異戊二稀組合物包含小於或約5、i、〇 5、〇丨、〇〇5、〇〇1或 0.005 ppm之硫或丙二烯。在一些實施例中，異戊二烯組合物包含小於或約30、20、15、10、5、1、0.5、0.1、 0.05、〇.〇1或0.005 ppm之所有炔烴（諸如丨戊炔、2 丁块、 2MB1-3-炔及1-戊炔_4-炔）。在一些實施例中，異戊二烯組合物包含小於或約 2000 ' 1〇〇〇、500、200、1〇()、5〇、 40、30、20、10、5、1、0.5、0.1、〇.〇5、〇.〇1 或 0 〇〇5 ppm之異戊一烯一聚體，諸如環狀異戊二稀二聚體（例如源 149048.doc -106· 201111512 自兩個異戊二烯單元的二聚化之環狀C1 〇化合物）。在一些實施例中’組合物包含大於約2 mg之異戊二烯’ 諸如大於或約 5、10、20、30、40、50、60、70、80、 90、100、200、300、400、500、600、700、800、900 或 1000 mg之異戊二烯。在一些實施例中，組合物包含大於或約 2、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100 g之異戊二烯。在一些實施例中’組合物中異戊二烯之量為約2至約5,000 mg，諸如約2至約1〇〇 mg、約100至約5〇〇 mg、約 500 至約 1,000 mg、約 1〇〇〇至約 2 〇〇〇 mg、或約 2,000至約5,000 mg。在一些實施例中，组合物中異戊二烯之里為約20至約5,000 mg '約1〇〇至約5,〇〇〇 mg、約2〇〇至約 2,000 mg、約 200至約 l，000 mg、約 3〇〇至約 1〇〇〇叫、或約400至約1，000 mg。在一些實施例中，異戊二烯超過或約為組合物之揮發性有機部分的2〇、25、30、40、50、 60、70、80、90 或 95 重量％。在一些貫施例中，組合物包括乙醇。在一些實施例中，組合物包括約75至約90重量％之乙醇，諸如約乃至約肋重量％、約80至約85重量％或約85至約9〇重量％之乙醇。在組合物包括乙醇之一些實施例中，組合物亦包括約4至約 1 5重量。/。之異戊二烯，諸如約4至約8重量％、約8至約12重量％或約12至約1 5重量％之異戊二稀。例示性異戍二烯純化方法在一些實施例中，本文所述之任何方法均進一步包括回收異戊二烯。舉例而言，使用本發明之組合物及方法所製 149048.doc -107- 201111512 造之異戊二嫦可使用標準技術加以回收，諸如氣提、膜增強型分離、分餾、吸附/脫附、滲透蒸發（pervap〇rati〇n)、使異戊二稀自固相熱脫附或真空脫附，或用溶劑萃取固定或吸附於固相之異戊二烯（參見，例如美國專利第 4,7〇3,007號及第4,570,029號，各藉此以全文引用的方式併入，尤其關於異戊二烯回收與純化方法）^在一實施例中，藉由吸附氣提來回收異戊二烯（參見，例如美國申請案61/288，142)。在特定實施例中，用醇（諸如乙醇、曱醇、丙醇或其組合）進行萃取蒸餾來回收異戊二烯。在一些實施例中’異紅烯回收包含讀體形式分離異戊二烯 (諸如異戊二烯之純溶液或異戊二烯於溶劑中之溶液卜氣提包含以連續方式自_釋出氣流中移出異戊二烯蒸氣。 «玄移出可以右干不同方式達成，包括（但不限於）吸附於固相刀配至液相中、或直接冷凝（諸如因與冷凝線圈接觸而冷凝或因壓力増加而冷凝）。在—些實施例中，在稀異戊二烯蒸氣流之露點之上對職氣進行膜富集，從而冷凝传到液體異戊二稀。在—些實施例中對異戊二稀進行壓縮及冷凝。異戊一烯回收可包含一個步驟或多個步驟。在一些實施例中自醋酵釋出氣體巾移出異戊二職氣及使異戊二婦，化成液相係同時進行。舉例而纟，可使異戊二烯自釋出氣机中直接冷凝而形成液體。在—些實施例中自醋酵釋出氣體中移出異Λ _咏甘尸、戍一烯蒸氣及使異戊二烯轉化成液相係依序進行。舉例而言， ° 可使異戊二烯吸附於固相，接著用溶 149048.doc 201111512 劑自固相萃取。在-實施例巾，使用如美國臨時申請案第 6 1 /288,142號所述之吸附氣提來回收異戊二烯。在-些實施例中，本文所述之任何方法均進—步包括純化異戊二稀。舉例而言，使用本發明之組合物及方法所製造之異戊二烯可使用標準技術加以純化。純化係指使異^ ，烯與-或多種在製造異戊二稀時所存在之組分分離的過耘在-些實施例中，以實質上純液體之形式獲得異戍二烯。純化方法之實例包括⑴用液體萃取劑自溶液蒸餾，及 ⑴)層析。本文中所用之「經純化異戊二烯」意謂已與一或多種在製造異戊二烯時所存在之組分分離的異戊二烯。在一些實施例中，至少約20重量％的異戊二烯與在製造異戊二烯時所存在之其他組分分離。在多個實施例中，異戍二烯，純度至少或約為25重量％、3〇重量％、4〇重量％、 5〇重量/〇、60重ϊ%、70重量％、75重量％、8〇重量。重里％、95重量％或99重量。/。。可藉由任何適當方法，例如藉由管柱層#、HPLC分析或GC_MS分析來檢驗純度。在些實施例中，藉由將一或多個移出異戊二稀之回收步驟之後殘留之至少—部分氣相引人用於製造異戊二稀之細胞培養系統（諸如醱酵槽）中使該氣相再循環。在一些實施例中’本文所述之任何方法均進一步包括使異戊二烯聚合。舉例而t ’可使用標準方法，使經純化之異戊一烯聚合形成順式聚異戊二烯或其他下游產物(使用標準方法)。因此，本發明亦提供一種包含自本文所揭示之任何異戊二烯組合物製成之聚異戊二稀（諸如順]，4-聚 149048.doc 201111512 異戊二烯及/或反-1，4-聚異戊二烯）之輪胎。實例 &實例欲僅例示本發明且因此不應視為以任何方式限制本 λ月其亦&述並詳解上文所論述之本發明態樣及實施例。除非另有指示，否則溫度為攝氏度且壓力為大氣壓或接近大氣壓1述實例及詳細描述係作為說明而提供，且 ^非作為限制。本說明書中所引用之所有公開帛、專利申月案及專利皆以引用的方式併人本文中，㈣各個別公開案、專利申請案或專利特定及個別地以引用的方式併入一 _羊。之本文中所引用之所有公開案均係出於描述及响述可能與本發明結合使用之組合物及方法的目的而以引用的方式明確併人本文巾管已出於清楚理解之目的而經由說明及實例略為詳細地描述前述發明内容，但一般技術者鑒於本發明之教示將顯而易#，可在不脫離隨附申請專利範圍之精神或範疇下對其作出某些變化及修改。實例1:在表現重組野葛異戊二烯合成酶之大腸桿菌中製造異戊二烯 I.構築用於在大腸桿菌中表現野葛異戍二烯合成酶之載體野葛（山葛）異戊二烯合成酶基因（IspS)之蛋白質序列獲自GePBank(AAQ84170)。針對大腸桿菌密碼子使用最佳化之野葛異戊一烯合成酶基因購自DNA2.0(SEQ ID ΝΟ:1)。藉由用111/Pwl進行限制性核酸内切酶分解而自供應之質體中移出異戊二烯合成酶基因，經凝膠純化，且接合至已用 iVcoI/ΆίΙ 分解之 pTrcHis2B(Invitrogen)中。設計構 149048.doc •110- 201111512 築體，使得異戊二烯合成酶基因5'之終止密碼子在PWI位點之前。因此，當構築體表現時，His標籤不連接於異戊二烯合成酶蛋白。藉由定序來驗證所得質體PTrcKudzu(圖 2及圖3)。亦將異戊二婦合成酶基因選殖至pET16b(Novagen)中。在此狀況下，將異戊二烯合成酶基因插入pET16b中，使得重組異戊二烯合成酶蛋白含有N端His標籤。藉由使用引子組 pET_His-Kudzu-2F : 5’-CGTGAGATCATATGTGTGCGAC CTCTTCTCAATTTAC(SEQ ID NO:3)及 pET-His-Kudzu-R: 5，-CGGTCGACGGATCCCTGCAGTTAGACATACATCAGCTG (SEQ ID NO:4)進行PCR而自pTrcKudzu擴增異戊二烯合成酶基因。分別在基因之5’末端之WAI位點處及3’末端之 …mHl位點處添加此等引子。使用上述質體pTrcKudzu作為模板DNA，根據製造商之說明書使用Herculase聚合酶 (Stratagene)，且以1 0 pMol之濃度添加引子。以25 μΐ之總體積進行PCR。用分解PCR產物且將其選殖至經相同酶分解之pETl 6b中。將接合混合物轉型至大腸桿菌 Topi O(Invitrogen)中且藉由定序選擇正確純系。所得質體命名為pETNHisKudzu(圖4及圖5)，其中野葛異戊二烯合成酶基因自T7啟動子開始表現。亦將野葛異戊二烯合成酶基因選殖至低複本數質體 pCL1920中。使用引子自上述pTrcKudzu擴增野葛異戊二烯合成酶基因。前置引子將//kdlll位點及大腸桿菌共同RBS 添加至5·末端。户ί/Ι選殖位點已存在於pTrcKudzu中緊鄰終 149048.doc 201111512 止密碼子之3’處，由此構築反置引子以使得最終PCR產物包括 Pstl 位點。引子序列為：HindIII-rbs-Kudzu F : 5，- CATATGAAAGCTTGTATCGATTAAATAAGGAGGAATAAACC(S EQ ID NO:6)及BamHl-Kudzu R : 5，-CGGTCGACGGATCCCTGCAGTTAGACATACATCAGCTG (SEQ ID NO:4)。使用 Herculase聚合酶，以濃度為 10 pmol 之引子及1 ng模板DNA(pTrcKudzu)擴增PCR產物。擴增方案包括30次循環（95°C下持續1分鐘，60°C下持續1分鐘， 72°C下持續2分鐘）。用m«dIII及PWI分解產物且將其接合至亦已用///«dill及hil分解之pCL1920中。將接合混合物轉型至大腸桿菌Top 10中。藉由定序檢查若干轉型體。所得質體命名為pCL-lac-Kudzu(圖6及圖7)。 II.測定異戊二婦產量對於震盪燒瓶培養，將1 ml培養物自震盪燒瓶轉移至20 ml CTC頂部空間小瓶（Agilent小瓶目錄號5188 2753 ;帽目錄號5 188 2759)中。將帽旋緊，且在等效溫度、以250 rpm 震盪下培育小瓶^ 30分鐘後，自培育箱移出小瓶且如下所述進行分析（關於此檢驗之一些實驗值，參見表1)。在測定醱酵槽中異戊二稀產量之狀況下，自醱酵槽之釋出氣體獲取樣品且如下所述直接進行分析（關於此檢驗之一些實驗值，參見表2)。使用與 CTC Analytics(Switzerland)CombiPAL 自動取樣器相接且以頂部空間模式操作之Agilent 6890 GC/MS系統進行分析。使用 Agilent HP-5MS GC/MS 管柱（30 mx〇.25 149048.doc -112- 201111512 mm ’ 〇·25 pm膜厚度）分離分析物。設置取樣器以注射5〇〇叫頂部空間氣體。GC/MS方法利用氦作為載氣，流速為！ ml/min。保持注射口在25(Γ(：τ，分流比為5〇:1。歷經2分 4里之分析持續時間’保持烘箱溫度為37。(：。以m/z為67之單離子監測（SIM)模式操作Agilent 5793N質量選擇偵測益。自1.4分鐘至1.7分鐘切斷偵測器以允許永久氣體溶離。在此等條件下’觀測到異戊二烯（2-曱基_i，3_ 丁二烯） I 在1.78分鐘時溶離。使用校準表來定量異戊二烯之絕對量’且發現自1 pg/L至2000 pg/L呈線性。使用此方法估算偵測限度為50至1〇〇 ng/L。 III·在含有表現重組異戊二烯合成酶之大腸桿菌細胞之震盪燒瓶中製造異戊二烯將上述载體引入大腸桿菌菌株BL2i (Novagen)中以製造菌株 BL21/ptrcKudzu、BL21/pCL-lac-Kudzu 及 BL21/ pETHisKudzu。塗佈菌株使其分離於la(魯利亞瓊脂（Luria φ agar))+羧苄青黴素（5〇 gg/ml)上，且在37。(：下培育隔夜。

將單一群落接種至含有2〇 mi魯利亞-貝爾塔尼培養液（LB) 及緩f青黴素（100 pg/ml)之250 ml擋板式震盪燒瓶中。在 20°C、以200 rpm震盪下使培養物生長隔夜。量測隔夜培養物之OD_，且將培養物稀釋至含有3〇 ml MagicMedia (Invitr〇gen)+羧苄青黴素（100叩/〇11)之25() ml擋板式震盪燒瓶中直至〇D6〇0達到約〇.〇5。在3〇。〇、以200 rpm震盪下培育培養物。當〇D6⑻為約〇.5-〇.8時，添加400 μΜ IPTG，且在30°C、以200 rpm震盪下再培育細胞6小時。在用IPTG 149048.doc 113 201111512 誘導後〇、2、4及6小時，收集培養物之i mi等分試樣，測定OD6〇G，且如上所述量測所製造之異戊二烯之量。結果展示於圖8中。 IV.以Μ公升酸酵自BL2 1 /ptrcKudzu製造異戊二烯自批式補料培養物測定含有重組野葛異戊二烯合成酶基因之大腸桿菌大規模製造之異戊二烯。關於醱酵培養基 (TM2)，每公升醱酵培養基的配方如下：k2hp〇4 13 6 g、 ΚΗ2Ρ〇4 13·6 g、MgS04〔；7H20 2 g、單水合擰檬酸2 g、檸檬酸鐵銨0.3 g、（NH4)2S04 3.2 g、酵母提取物5 g、1〇〇〇χ 改質痕量金屬溶液1 ml。所有組分一起添加且溶解於去離子水（diH2〇)中。用氫氧化鉀（K0H)wpH值調整至68且補足體積。用0.22 μ過濾器（僅採用過濾器，而非高壓滅菌器）對最終產物進行過濾滅菌^ 1 000Χ改質痕量金屬溶液之配方如下：單水合檸檬酸40 g、MnS〇4.H20 30 g、NaCl 10 g、FeS04.7H20 1 g、CoC12.6H20 1 g、ZnS04.7H20 1 g、 CuS04.5H20 100 mg、h3B03 100 mg、NaMo04.2H20 100

mg°將各組分逐一溶解於去離子水中，用HCi/Na〇H將pH 值調整至3.0，接著補足體積，且用0.22 μ過濾器進行過遽滅菌。在14 L生物反應器中進行此實驗以監測在醱酵所要之pH 6.7及溫度34°C下自葡萄糖形成異戊二烯之情況。在大豆月東 (soytone)-酵母提取物-葡萄糖培養基中製備自冷凍小瓶中獲取之大腸桿菌菌株BL21/ptrcKudzu之接種體。在接種體生長至OD55〇=〇.6之後，對兩個600 ml燒瓶進行離心，且使 149048.doc -114· 201111512 内含物再懸浮於70 ml上清液中嘥T U將細胞顆粒（7〇如物 OD 3· 1)轉移至生物反應器在接種後之多個時間，移出樣品且如上所述測定所製造之異紅烯之量。於圖9中。 °饮不中製實例2:在表現重組揚屬異戍_ 叹一稀合成酶之大腸捍菌造異戊二烯

楊屬（銀白楊與歐洲山揚雜交種）異&二媒合成酶之蛋白 f ^^J(Schnitzler, J-Pf Λ，(2〇〇5) Planta 222:777-786)¾ 自GenBank(CAC35696卜針對大腸桿菌進行密碼子最佳化之基因購自DNA2.0(p9796-p〇plar，圖3〇及圖31)。藉由用 evLUllI/Pd進行限制性核酸内切酶分解而自供應之質體中移出異戊二烯合成酶基因，經凝膠純化，且接合至已用 &OI/P川分解ipTrcHis2B*。選殖構築體’使得插入物中之終止密碼子在Pwl位點之前，從而得到His標籤不連接於異戊一烯合成酶蛋白之構築體。藉由定序來驗證所得質體 pTrcPoplar(圖 26及圖 27)。實例3:在表現重組野葛異戊二烯合成酶之檸檬泛菌中製造異戊二烯將實例1所述之pTrcKudzu及pCL-lac Kudzu質體電穿孔至擰檬泛菌中（美國專利第7,241，587號）。分別在含有羧苄青黴素（200 gg/ml)或壯觀黴素（spectinomycin)(50 pg/ml)之 LA上選擇轉型體。如實例1中針對表現重組野葛異戊二烯合成酶之大腸桿菌菌株所述，自震盪燒瓶製造異戊二烯且測定所製造之異戊二烯之量。結果展示於圖10中。 149048.doc -115- 201111512 實例4:在表現重組野葛異戊二烯合成酶之枯草桿菌中製造異戊二稀 I.構築供野葛異戊二烯合成酶表現用之枯草桿菌複製質體在ίφΓ五啟動子控制下，使用複製質體（具有氣黴素抗性卡匣之pBS19)於枯草桿菌ίφΓ五叩菌株 (BG3594comK)中表現野葛異戊二烯合成酶基因。使用PCR 獨立地擴增異戊二稀合成酶基因、flprE：啟動子及轉錄終止子，且將其融合。接著將構築體選殖至pBS19中且轉型至枯草桿菌中。 a) 擴增叩啟動子使用以下引子自枯草桿菌之染色體DNA擴增叩仏啟動子： aprE啟動子Mfel之CF 797 (+)起始端 5'-GACATCAATTGCTCCATTTTCTTCTGCTATC (SEQ ID NO:29) CF 07-43㈠融合aprE啟動子與野葛ispS 5'-ATTGAGAAGAGGTCGCACACACTCTTTACCCTCTCCTTTTA (SEQ ID NO:30) b) 擴增異戊二烯合成酶基因自質體pTrcKudzu(SE.Q ID NO:2)擴增野葛異戊二烯合成酶基因。該基因已針對大腸桿菌進行密碼子最佳化且由 DNA 2.0合成。使用以下引子： CF 07-42 ( + )融合aprE啟動子與野葛異戊二烯合成酶基因 (GTG起始密碼子）

5'-TAAAAGGAGAGGGTAAAGAGTGTGTGCGACCTCTTCTCAAT(SEQ 149048.doc 116 201111512 ID NO:31) CF 07-45 (-)融合野葛異戊二烯合成酶基因之Y末端與終止子 5'-CCAAGGCCGGTTTTTTTTAGACATACATCAGCTGGTTAATC (SEQ ID NO:32) c)擴增轉錄終止子使用以下引子，自先前定序之質體pJHPms3 82擴增解澱粉桿菌的驗性絲胺酸蛋白酶之終止子。 CF 07-44 ( + )融合野葛異戊二烯合成酶之3'末端與終止子 5'-GATTAACCAGCTGATGTATGTCTAAAAAAAACCGGCCTTGG (SEQ IDNO:33) 解澱粉桿菌（5. amjv/kwe/acz'ew)終止子（BamHI)之CF 07-46 (-)末端 5'-GACATGACGGATCCGATTACGAATGCCGTCTC (SEQ ID NO:34) 使用PCR，用以下引子將野葛片段與終止子片段融合： CF 07-42 (+)融合五啟動子與野葛異戊二稀合成酶基因 (GTG起始密碼子） 5'-TAAAAGGAGAGGGTAAAGAGTGTGTGCGACCTCTTCTCAAT(SEQ ID NO:32) 解澱粉桿菌終止子（BamHI)之CF 07-46 (-)末端 5'-GACATGACGGATCCGATTACGAATGCCGTCTC (SEQ IDNO:34) 使用PCR，用以下引子將野葛終止子片段與啟動子片段融合： 149048.doc -117- 201111512 aprE啟動子Mfel之CF 797 (+)起始端 5'-GACATCAATTGCTCCATTTTCTTCTGCTATC (SEQ ID NO:35) 解澱粉桿菌終止子（BamHI)之CF 07-46 (-)末端 5'-GACATGACGGATCCGATTACGAATGCCGTCTC (SEQ ID NO:34) 使用Qiagen套組純化融合PCR片段，且用限制性酶M/el 及BamHI分解。使用Qiagen套組對此經分解之DNA片段進行凝膠純化，且接合至已用五coRI及分解且經凝膠純化之載體（稱為pBS19)。將接合混合物轉型至大腸桿菌Top 10細胞中，且在 LA+50羧苄青黴素板上選擇群落。選擇總共六個群落，且在LB + 50缓苄青黴素中生長隔夜，接著使用Qiagen套組分離質體。用五分解該等質體以檢查插入物，且遞呈三個正確質體以供以下引子定序：叩啟動子之CF 149 (+) EcoRI起始端 5'-GACATGAATTCCTCCATTTTCTTCTGC (SEQ ID NO:36) pXX 049中之CF 847 (+)序列（叩啟動子之末端） 5'-AGGAGAGGGTAAAGAGTGAG (SEQ ID NO:37) CF 07-45 (-)融合野葛異戊二烯合成酶之3'末端與終止子 5'-CCAAGGCCGGTTTTTTTTAGACATACATCAGCTGGTTAATC (SEQ ID NO:32) 野葛異戊二烯合成酶之CF 07-48 (+)定序引子 S'-CTTTTCCATCACCCACCTGAAG (SEQ ID NO:38) 野葛異戊二稀合成酶中之CF 07-49 (+)定序引子 5'-GGCGAAATGGTCCAACAACAAAATTATC (SEQ ID NO:39) 149048.doc •118· 201111512 藉由定序判定命名為pBS Kudzu #2之質體（圖44及圖12) 為正確的，且將其轉型至BG 3594 comK(—種括草桿菌宿主菌株）中。在LA+5氣黴素板上進行選擇。轉型體在LA+5 氯黴素上選擇且導向單一群落，接著於LB+5氣黴素中生長直至其0Ε>6⑽達到I.5為止。在-80°C下，於甘油存在下，將其冷4儲存於小瓶中。所得菌株命名為CF 443。 Π.在含有表現重組異戊二烯合成酶之枯草桿菌細胞之震盪燒瓶中製造異戊二浠用來自LA+氣黴素（Cm，25 pg/ml)之CF 443之單一群落接種隔夜培養物。在3 7°C '以200 rpm震盪下，使培養物於LB Cm中生長。使用此等隔夜培養物（1 ^^1)接種含有25 ml GrantS 11培養基及氣黴素之250 ml擋板式震盪燒瓶，最終濃度為25 pg/mi。Grants π培養基配方為1〇 g大豆脒、3 ml 1 M K2HP〇4、75 g 葡萄糖、3.6 g 尿素、100 ml 1〇χ MOPS，用 Η2〇補足至！ L，ρΗ 7 2 ; 1〇χ M〇PS配方為 83 72 g MOPS 7.17 g二（經曱基）甲基甘胺駿（tricine)、】2 g 〖⑽顆粒、10 ml ο·276 M K2S04溶液、10 ml 0.528 Μ MgCl2浴液、29.22 g NaC卜100 mi ι〇〇χ微量營養素，用 HA補足至1 L ;且1〇〇χ微量營養素配方為丨47 ^

CaCl2.2H20、0.4 g FeS〇4.7H2〇、g MnS〇4.H20、0.1 g

ZnS〇4 H2〇、0 05 g CuC12.2H20、0.1 g CoC12.6H20、0.1 g Na2M〇C>4’2H20 ’用H2〇補足至1 L。在37°c下培育震盪燒瓶’且在18、24及44小時獲取樣品。在18小時，對cF443 及對照菌株之頂部空間氣體進行取樣。此表示異戊二烯之 149048.doc -119· 201111512 1 8小時積累情況。如實例1所述’藉由氣相層析測定異戊二烯之量。異戊二烯產量藉由表現重組異戊二烯合成酶而顯者提南（圖11)。 III.以14 L酿酵由CF443製造異戊二稀自批式補料培養物測定於複製質體上含有重組野葛異戊二烯合成酶基因之枯草桿菌大規模製造之異戊二婦。藉由在含有大豆粉（Cargill)、填酸納及破酸鉀、硫酸鎮、及棒檬酸、氣化鐵及氯化锰之溶液的營養素培養基中進行習知批式補料醱酵來培養表現野葛異戊二烯合成酶基因之桿菌菌株CF 443或不表現野葛異戊二烯合成酶基因之對照菌株。在醋酵之前’使用包括纖維素酶、半纖維素酶及果膠酶之酶混合物浸潰培養基90分鐘（參見WO 95/04134)。用 60°/〇 wt/wt 葡萄糖（Cargill DE99右旋糖、ADM Versadex greens 或 Danisco轉化糖）及 99% wt/wt 油（Western Family 大豆油，其中99% wt/wt為添加至細胞培養基中之前油的濃度）對14 L分批醱酵進行補料。當批料中之葡萄糖不可偵測時，開始補料。補料速率經數小時均勻變化，且加以調整以在等碳基礎上添加油。使用28% w/v氫氧化銨將pH值控制在6.8-7_4。在起泡之狀況下，將消泡劑添加至培養基中。將醱酵溫度控制在3rc且以75〇 rpm攪動醱酵培養物。在整個過程中監測多個其他參數，諸如值、 DO%、氣流及壓力。維持D〇%高於2〇。經％小時時程獲取樣品且分析細胞生長（0〇55〇)及異戊二烯產量。此等實驗之結果呈現於圖45A及圖45B中。 149048.doc -120· 201111512 IV.將野葛異戊二烯合成酶（ispS)整合於枯草桿菌中在apr五啟動子控制下，將野葛異戊二烯合成酶基因選殖於整合質體（pJHIOl-cmpR)中。在測試條件下，未偵測到異戊二烯。實例5 :在木黴屬中製造異戊二烯 I.構築用於在里氏木黴中表現野葛異戊二烯合成酶之載體由DNA 2.0合成針對解脂耶氏酵母進行密碼子最佳化之野葛IS基因（SEQ ID NO:8)(圖13)。此質體充當以下PCR擴增反應之模板：1 μΐ質體模板（20 ng/μΐ)、1 μΐ引子EL-gASCIO pM)5'-GCTTATGGATCCTCTAGACTATTACACGTAC ATCAATTGG(SEQ ID ΝΟ··9)、1 μΐ 引子£1^-965(10 #1^)5，- CACCATGTGTGCAACCTCCTCCCAGTTTAC(SEQ ID NO: 10)、1 μΐ dNTP(10 mM)、5 μΐ l〇x PfuUltra II 融合 HS DNA 聚合酶緩衝液、1 μΐ PfuUltra II融合HS DNA聚合酶、40 μΐ 水，總反應體積為50 μΐ。前置引子之5'末端含有其他4個核苦酸，其不對應於針對解脂耶氏酵母（K 進行密碼子最佳化之野葛異戊二烯合成酶基因，但為選殖至 pENTR/D-TOPO載體中所必需。反置引子之5’末端含有其他2 1個核苷酸，其不對應於針對解脂耶氏酵母進行密碼子最佳化之野葛異戊二烯合成酶基因，但經插入以供選殖至其他載體骨架中。使用MJ Research PTC-200溫度循環器，如下進行PCR反應：95°C下持續2分鐘（僅第一次循環）、 95°C下持續30秒、55°C下持續30秒、72°C下持續30秒（重複 27次循環）、最後一次循環後於72°C下持續1分鐘。在1.2% 149048.doc -121 - 201111512 E-gel上分析PCR產物以確認針對解脂耶氏酵母進行密碼子最佳化之野葛異戊二烯合成酶基因成功擴增。接著遵循製造商之方案，使用以下TOP〇 pENTR/D-TOPO選殖套組選殖PCR產物：1 μΐ PCR反應物、1 μΐ鹽溶液、1 μΐ TOPO pENTR/D-TOPO載體及3 μΐ水，總反應體積為6 μΐ。在室溫下培育反應物5分鐘。將1微升ΤΟΡΟ反應物轉型至ΤΟΡ10化學性勝任大腸桿菌細胞中。在LA+50 gg/ml康黴素板上選擇轉型體。揀選數個群落，且將各群落接種至含有LB + 50 pg/ml康黴素之5 ml管中’且在37°C、以200 rpm震盪下使培養物生長隔夜。遵循製造商之方案，使用QIAprep Spin Miniprep套組自隔夜培養管中分離質體。對數個質體進行定序以驗證DNA序列為正確的。編碼針對解脂耶氏酵母進行密碼子最佳化之野葛異戊二烯合成酶基因之單一 pENTR/D-TOPO質體用於Gateway選殖至定製pTrex3g載體中。pTrex3g之構築描述於WO 2005/001036 A2 中。遵循製造商關於 Gateway LR Clonase II酶混合套組（Invitrogen)之方案進行反應：1 μΐ針對解脂耶氏酵母進行密碼子最佳化之野葛異戊二烯合成酶基因 pENTR/D-TOPO供體載體、1 μΐ pTrex3g 目的載體、6 μΐ ΤΕ緩衝液，pH 8.0，總反應體積為8 μΐ。在室溫下培育反應物1小時，接著添加1 μΐ蛋白酶Κ溶液’且在37°C下繼續培育10分鐘。接著將1 μΐ反應物轉型至TOP10化學性勝任大腸桿菌細胞中。在LA+50 pg/ml羧苄青黴素板上選擇轉型體。揀選數個群落，且將各群落接種至含有LB + 5〇 149048.doc •122· 201111512 pg/ml羧苄青黴素之5 ml管中，且在37°C、以200 rpm震盪下使培養物生長隔夜。遵循製造商之方案，使用QIAprep Spin Miniprep套組（Qiagen，Inc_)自隔夜培養管中分離質體。對數個質體進行定序以驗證DNA序列為正確的。使用基因搶PDS-1000/HE粒子傳遞系統將針對解脂耶氏酵母進行密碼子最佳化之野葛異戊二烯合成酶體（圖14)以基因槍技術轉型至四重缺失之里氏木黴菌株中

(參見WO 2005/001036 A2)。使用專利公開案w〇 2005/ 001036 A2之實例1丨中所列之方案來分離穩定轉型體及評估震盈燒瓶。 Π·在重組里氏木黴菌株中製造異戊二烯將上述異戊二烯合成酶轉型體之丨ml老培養物（15小時及 J時）轉移至項部空間小瓶中。密封小瓶且在3 〇。〇下培月】夺里測頂部空間氣體且由實例1所述之方法鑑別異戊二烯。兩個轉型體顯示痕量異戊二烯。可藉由培育14小 ^力/、戊_稀之1。兩個陽性樣品顯示歷經1 4小時培 "戊—浠之含量為約〇·5 pg/L·。未轉型之對照顯示異戊一烯之含量不可偵測。此實驗顯示當向里氏木黴供給外源異戊二烯合成酶時，其能夠自内源前驅物製造異戊二烯。、實例6.在耶氏酵母屬中製造異戊二烯構築用於在解脂耶氏酵母中表現野葛異戊二烯合成酶之載體構築用於在解脂耶氏酵母中表現野葛異戊二烯合成 149048.doc -123- 201111512 因之載體的起點為載體pSPZl(MAP29Spb)。此載體之完整序列（SEQIDNo:ll)展示於圖15中。藉由使用解脂耶氏酵母菌株GICC 120285之染色體DNA 作為模板進行PCR來擴增以下片段：無啟動子形式之 URA3基因、1 8S核糖體RNA基因之片段、解脂耶氏酵母 XPR2基因之轉錄終止子，及兩個含有XPR2及ICL1基因之啟動子的DNA片段。使用以下PCR引子： ICL1 3 5'- GGTGAATTCAGTCTACTGGGGATTCCCAAATCTATATATACTGCAG GTGAC (SEQ IDNO:40) ICL1 5 5'-GCAGGTGGGAAACTATGCACTCC (SEQ IDNO:41) XPR 3 5'-CCTGAATTCTGTTGGATTGGAGGATTGGATAGTGGG (SEQ ID NO: 42) XPR 5 5'-GGTGTCGACGTACGGTCGAGCTTATTGACC (SEQ ID NO:43) XPRT3 5'- GGTGGGCCCGCATTTTGCCACCTACAAGCCAG (SEQ ID NO:44) XPRT 5 5'-GGTGAATTCTAGAGGATCCCAACGCTGTTGCCTACAACGG (SEQ IDNO:45) Y18S3 149048.doc •124· 201111512 5'-GGTGCGGCCGCTGTCTGGACCTGGTGAGTTTCCCCG (SEQ ID NO:46) Y18S 5 5'-GGTGGGCCCATTAAATCAGTTATCGTTTATTTGATAG (SEQ ID NO:47) YURA3 5'-GGTGACCAGCAAGTCCATGGGTGGTTTGATCATGG (SEQ ID NO:48) YURA 50 5'-GGTGCGGCCGCCTTTGGAGTACGACTCCAACTATG (SEQ ID NO: 49) YURA 51 5'-GCGGCCGCAGACTAAATTTATTTCAGTCTCC (SEQ ID NO:50) 對於PCR擴增，按照製造商之說明書使用PfuUltrall聚合酶（Stratagene)、供應商提供之緩衝液及dNTP、2.5 μΜ引子及指定模板DNA。使用以下循環進行擴增：95°C下持續 1分鐘；34次（95°C下持續30秒；55°C下持續30秒；72°C下持續3分鐘）；及72°C下持續1〇分鐘，接著在下培育。由DNA 2.0獲得編碼針對耶氏酵母中之表現進行密碼子最佳化之野葛異戊二烯合成酶基因的合成DNA分子（圖 16 ; SEQ ID NO:12)。在XPR2及ICL1啟動子控制下載運合成野葛異戊二烯合成酶基因之質體pYLA(KZl)及 pYLI(KZl)之構築流程的全部細節分別呈現於圖1 8中。亦構築對照質體，其中插入交配因子基因（MAP29)來替代異 149048.doc .125- 201111512 戊二烯合成酶基因（圖18E及圖18F)。可使用類似選殖程序表現楊屬（銀白揚與歐洲山楊雜交種）異戊二烯合成酶基因。揚屬異戊二烯之序列描述於 Miller B.等人（2001)尸/αηία 213, 483-487 中，且展示於圖 17中（SEQ ID ΝΟ:13)。產生在XPR2及ICL1啟動子控制下載運合成楊屬異戊二烯合成酶基因之質體pYLA(POPl)及 pYLI(POPl)的構築流程分別呈現於圖18A及圖18B中。 II.由重組解脂耶氏酵母菌株製造異戊二烯用 SacII分解載體pYLA(KZl)、pYLI(KZl)、pYLA(MAP29) 及pYLI(MAP29)，且使用該等載體藉由標準乙酸鋰/聚乙二醇程序將解脂耶氏酵母菌株CLIB 122轉型成尿苷原養型 (uridine prototrophy)。簡言之，藉由離心（4000 rpm，10分鐘）收集於YEPD(1 %酵母提取物、2%蛋白腺、2%葡萄糖）中生長隔夜之酵母細胞，用無菌水洗滌一次，且懸浮於 0.1 Μ乙酸鋰（pH 6.0)中。將細胞懸浮液之200 μΐ等分試樣與線性化質體DNA溶液（10-20 gg)混合，在室溫下培育10 分鐘，且於相同緩衝液中與1 ml 50% PEG 4000混合。在室溫下再培育懸浮液1小時，接著在42°C下熱休克2分鐘。接著將細胞塗於SC his leu板（0.67%酵母氮源、2%葡萄糖、各100 mg/L之白胺酸及組胺酸）上。在30°C下培育3-4 天後，出現轉型體。在30°C、震盪下，使三個來自pYLA(KZl)轉型之分離物、三個來自pYLI(KZl)轉型之分離物、兩個來自 pYLA(MAP29)轉型之分離物及兩個來自pYLI(MAP29)轉型 149048.doc .126- 201111512 之分離物於YEP7培養基（1%酵母提取物、2%蛋白腺，pH 7.0)中生長24小時。藉由離心自10 ml培養物中收集細胞，再懸浮於3 ml新鮮YEP7中，且置於15 ml螺旋帽小瓶中。在室溫、平緩（60 rpm)震盪下，培育小瓶隔夜。如實例1所述，藉由氣相層析，使用質譜肩測器來分析此等小瓶之頂部空間氣體中之異戊二烯含量。以pYLA(KZl)及pYLI (KZ1)獲得之所有轉型體皆製造可易於偵測之量的異戊二烯（0.5 pg/L至1 pg/L，圖20)。在載運植酸酶基因而非異戊二烯合成酶基因之對照菌株的頂部空間氣體中未偵測到異戊二烯。實例7 :在表現野葛異戍二烯合成酶及idi、或dxs、或idi與之大腸桿菌中製造異戊二稀 I.構築編碼野葛異戊二烯合成酶及‘、或办s、或/心與 dxi之載體以供在大腸桿菌中製造異戊二烯 i)構築 pTrcKudzuKan 用賦予康黴素抗性之基因置換pTrcKudzu(實例1所述）之 ό/β基因。為移除ό/α基因，用ΑρΗΙ分解pTrcKudzu，用瑕鹼性磷酸酶（SAP)處理，在65°C下熱滅活，接著用Klenow 片段及dNTP填補末端。由瓊脂糖凝膠純化5 kbp大片段，且使用引子 MCM22 5'-GATCAAGCTTAACCGGAATTGC CAGCTG(SEQ ID NO:14)及 MCM23 5'-GATCCGATCGTC AGAAGAACTCGTCAAGAAGGC(SEQ ID NO:15)將該片段接合於已自pCR-Blunt-II-TOPO進行PCR擴增之kanr基因，用//kdlll及Pvwl分解，且填補末端。在含有50 pg/ml康黴 149048.doc • 127- 201111512 素之LA上選擇載運賦予康黴素抗性之質體（pTrcKudzuKan) 的轉型體。 ii) 構築 pTrcKudzuyIDIKan 用ΡίίΙ分解pTrcKudzuKan，用SAP處理，進行熱滅活及凝膠純化。用合成RBS將其接合於編碼來自釀酒酵母之的PCR產物。PCR之引子為Nsil-YIDI 1 F 5'- CATCAATGCATCGCCCTTAGGAGGTAAAAAAAAATGAC(S EQ ID NO:16)及 Pstl-YIDI 1 R 5，-CCTTCTGCAGGACGCG TTGTTATAGC(SEQ ID NO:17);且模板為釀酒酵母基因組· DNA。PCR產物在接合之前用见sil及PWI分解且經凝膠純化。將接合混合物轉型至化學性勝任TOP 1 0細胞中，且在含有50 pg/ml康黴素之LA上進行選擇。分離數個轉型體且定序，所得質體稱為pTrcKudzu-ylDI(kan)(圖28及圖29)。 iii) 構築 pTrcKudzuDXSKan 用Psil分解質體pTrcKudzuKan，用SAP處理，進行熱滅活及凝膠純化。用合成RBS將其接合於編碼來自大腸桿菌 $ 之办ί的PCR產物。PCR之引子為MCM13 5'-GATCATGC ATTCGCCCTTAGGAGGTAAAAAAACATGAGTTTTGATATT GCCAAATACCCG(SEQ ID ΝΟ:18)及 MCM14 5’-CATGCTGC AGTTATGCCAGCCAGGCCTTGAT(SEQ ID NO:19);且模板為大腸桿菌基因組DNA。PCR產物在接合之前用iVhl及 Ail分解且經凝膠純化。將所得轉型反應物轉型至TOP10 細胞中，且在含有50 pg/ml康黴素之LA上進行選擇。分離數個轉型體且定序，所得質體稱為pTrcKudzu- I49048.doc •128· 201111512 DXS(kan)(圖 30及圖 31)。 iv)構築 pTrcKudzu-yIDI-dxs (kan)

用尸sil分解pTrcKudzu-ylDI(kan)，用SAP處理，進行熱滅活及凝膠純化。用合成RBS將其接合於編碼大腸桿菌之 PCR 產物（引子 MCM13 5'-GATCATGCATTCGCCCTTA

GGAGGTAAAAAAACATGAGTTTTGATATTGCCAAATACC CG(SEQ ID NO:18)及 MCM14 5'-CATGCTGCAGTTATGCC AGCCAGGCCTTGAT(SEQ ID NO:19);模板TOPIO細胞），該PCR產物已用见s/I及Ail分解且經凝膠純化。最終質體稱為 pTrcKudzu-yIDI-dxs (kan)(圖 21 及圖 22)。 v) 構築 pCL PtrcKudzu 使用自pTrcKudzu分解上述實例1之含有啟動子、結構基因及終止子之DNA片段，且進行凝膠純化。將其接合於已用PvwII分解、用SAP處理且經熱滅活之pCL1920。將所得接合混合物轉型至TOP10細胞中，且在含有50 pg/ml 壯觀黴素之LA中進行選擇。分離數個純系且定序，且選擇其中兩者。pCL PtrcKudzu及 pCL PtrcKudzu (A3)具有相反定向之插入物（圖32-35)。

vi) 構築 pCL PtrcKudzu yIDI 將上述（ii)之經分解、經凝膠純化之IDI PCR擴增子接合至已用分解、用SAP處理且經熱滅活之PCL PtrcKudzu中。將接合混合物轉型至TOP 10細胞中，且在含有50 pg/ml壯觀黴素之LA中進行選擇。分離數個純系且定序，所得質體稱為pCL PtrcKudzu yIDI(圖36及圖37)。 149048.doc -】29· 201111512

vii)構築 pCLPtrcKudzuDXS 將上述（iii)之經Α^Ί-PWI分解、經凝膠純化之DXS PCR 擴增子接合至已用尸以分解、用SAP處理且經熱滅活之pCL PtrcKudzu (A3)中。將接合混合物轉型至TOP10細胞中，且在含有50 pg/ml壯觀黴素之LA中進行選擇。分離數個純系且定序，所得質體稱為pCL PtrcKudzu DXS(圖38及圖 39)。 II.量測在不同複本數下表現野葛異戊二烯合成酶、/出及/ 或办j之培養物的頂部空間氣體中之異戊二烯使先前經質體 pTrcKudzu(kan)(A)、pTrcKudzu-yIDI kan(B) ' pTrcKudzu-DXS kan(C) ' pTrcKudzu-yIDI-DXS kan(D)轉型之大腸桿菌BL21〇DE3)之培養物於LB + 50 pg/ml 康黴素中生長。使 pCL PtrcKudzu(E)、pCL PtrcKudzu、pCL PtrcKudzu-ylDI(F)及 pCL PtrcKudzu-DXS(G)之培養物於LB + 50 pg/ml壯觀黴素中生長。在0時 (OD600為約0.5)用400 μΜ IPTG誘導培養物，且獲取樣品以供量測頂部空間氣體中之異戊二烯（參見實例1)。結果展示於圖23A-23G中。藉由轉型將質體pTrcKudzu-yIDI-dxs (kan)引入大腸桿菌菌株BL21中。在20°C下使所得菌株BL21/pTrc Kudzu IDI DXS於含有康黴素（50 pg/ml)之LB中生長隔夜，且用於接種含有 1% 葡萄糖之 TM3(13.6 g Κ2Ρ04、13.6 g KH2P〇4、 2.0 g MgS04.7H20、2.0 g單水合檸檬酸、0.3 g檸檬酸鐵銨、3.2 g (NH4)2S〇4、0.2 g酵母提取物、1_0 ml 1000X改 149048.doc -130- 201111512 質痕量金屬溶液，調整至pH 6.8且用H2〇補足，且經過滤滅菌）之震盪燒瓶。在3〇°C下培育該等燒瓶直至ΟΕ>6〇()達到 0-8為止，接著用4〇〇 μΜ IPTG進行誘導。在誘導後之多個時間獲取樣品，且如實例1所述量測頂部空間氣體中異戍二烯之量。結果展示於圖23Η中。 III.在大腸桿菌/pTrcKudzu yIDI DXS中自生質製造異戍二烯測試菌株BL21 pTrcKudzuIDIDXS自三種類型之生質（甜菜/查、玉米乾草及軟木衆）產生異戊二婦之能力，使用葡萄糖作為對照。藉由酶促水解製備生質之水解產物 (Brown，L·及 Torget，R.，1996, NREL standard assay method

Lap-009 「Enzymatic Saccharification of Lignocellul〇sic

Biomass」），且在基於葡萄糖當量稀釋下使用。在此實例中’葡萄糖當量等於1〇/0葡萄糖。使用來自BL2i⑴以） pTrcKudzu yIDI DXS (kan)之板新鮮轉型細胞之單一群落接種5 ml LB +康黴素（5〇 pg/ml)。在25。〇、震盪下培育培養物隔夜。次日，於25 ml ΤΜ3 + 〇 2% γΕ+1%原料中將隔夜培養物稀釋至叫⑽為㈣5。原料為玉米乾草、甜菜潰或軟木漿。使用葡萄糖作為陽性對照，且不使用葡萄糖作為陰性對照。在3(TC、以18〇 rpm震盈下培育培養物。監測培養物⑽600且當其達到約0.8時，在1小時及3小時二實：1所述分析培養物之異戊二烯產量。培養物未經誘 V 3有所添加之原料的所有培養物所製造之異戊二烤均等同於葡萄糖陽性料077法、生對恥之情况。貫驗一式兩份進行且展示 149048.doc -131 - 201111512 於圖40中。 IV. 在大腸桿菌/pTrcKudzuIDIDXS中自轉化糖製造異戊二烯使用來自 BL2i (mE3)/pTrcKudzu ylDI DXS (kan)之板新鮮轉型細胞之單一群落接種5 ml LB+康黴素（5〇 pg/ml)。在25°C、震盪下培育培養物隔夜。次日，於25 ml TM3 + 0.2/。YE+1%原料中將隔夜培養物稀釋至為 0.05原料為葡萄糖、轉化葡萄糖或玉米乾草。藉由酶促處理蔗糖糖漿製備轉化糖原料（Danisc〇轉化糖）。如下文 (部分v)所述來製備AFEX玉米乾草。使細胞於3〇t下生長’且當培養物之OD^o達到約0.8-1·〇時（〇小時），量測第一樣品。在0小時、1小時及3小時，分析培養物之生長（如由〇〇6〇()量測）及異戊二烯產量（如實例1}。結果展示於圖4 i 中〇 V. 自經AFEX預處理之玉米乾草製備水解產物經AFEX預處理之玉米乾草獲自密西根生物技術研究所 (Michigan Biotechnology Institute)。預處理條件為6〇% 濕度’ 1.1氣負載’及於90C下持續30分鐘，接著空氣乾燥。經AFEX預處理之玉米乾草中之水分含量為21.27°/。。經 AFEX預處理之玉米乾卓中葡聚糖及木聚糖之含量分別為 31.7/0及19.1 %(乾基）。糖化過程如下：將2〇 g經apex預處

理之玉米乾草添加至具有5 ml 1 Μ檸檬酸鈉緩衝液（pH 4·8)、2·25 ml 乙醇纖維素每 l〇〇〇(Accellerase 1000)、〇 1 ml格林酶H121(Grindamyl H121)(來自麵包製造工業用之雾 I49048.doc •132- 201111512 麴菌的Danisco木聚糖酶產品）及72 65…去離子水之5〇〇叫燒瓶中。將該燒瓶置於迴轉式震盪器中且在5〇t：下培育％小時。自震盪器中獲取一個樣品且使用HPLC進行分析。水解產物含有38_5 g/Ι葡萄糖、21.8 g/i木糖，及1〇3的之葡萄糖及/或木糖寡聚物。 VI. 酵母提取物對生長於批式補料培養物中之大腸桿菌之異戊二烯產量的影響 φ 如先刖關於含有上述PTrcKudzu yIDI DXS質體之大腸桿菌細胞所述，以14-L規模進行醱酵。以指數速率補給酵母提取物（Bio Springer, Montreal，Quebec，Canada)。在4〇小時醱酵期間，傳遞至醱酵槽中之酵母提取物之總量在7〇_ 83 0 g之間變化。在550 nm波長下量測醱酵培養液之光學密度。醱酵槽内之最終光學密度與所添加之酵母提取物之量成比例（圖42A)。如先前所述測定醱酵槽之釋出氣體中之異戊一烯含量。異戊二烯力價隨著醱酵過程而増加（圖 # 42B)。所製造之異戊二烯之量與所補給之酵母提取物之量成線性比例關係（圖42C)。 VII. 以pTrcKudzu DXS yIDI之500 L醱酵製造異戊二烯使用具有野葛異戊二烯合成酶、釀酒酵母IDI及大腸桿菌DXS核酸（大腸桿菌BL21 (λΜ3) pTrc Kudzu如_)之大腸桿菌細胞之500公升醱酵來製造異戊二烯。異戊二烯含量經15小時時期自50 pg/L變為300 pg/L。基於平均異戊二稀濃度、通過器件之平均流量及異戍二烯析出 (breakthrough)程度，計算出所收集之異戊二烯之量為約口 149048.doc -133- 201111512 g 〇 VIII·以生長於批式補料培養物中之大腸桿菌之500 L醱酵製造異戊二烯培養基配方（每公升醱酵培養基）： K2HP04 7.5 g、MgS04.7H20 2 g、單水合檸檬酸2 g、檸檬酸鐵敍0·3 g、酵母提取物〇·5 g、1〇〇〇χ改質痕量金屬溶液1 ml。所有組分一起添加且溶解於去離子水中。對此溶液進行高壓滅菌。用氨氣（NH3)將pH值調整至7.0且補足體積。滅菌及調整pH值之後，添加1〇 g葡萄糖、〇」g鹽酸硫胺素、及抗生素。 1000X改質痕量金屬溶液：單水合轉檬酸 40 g、MnS04.H20 30 g、NaCl 10 g、

FeS04.7H20 1 g、CoC12.6H20 1 g、ZnS04.7H20 1 g、 CuS04.5H20 100 mg、H3B03 100 mg、NaMo04.2H20 100

mg。將各組分逐一溶解於去離子水中，用HC1/NaCm將pH 值调整至3.0，接著補足體積，且用〇·22微米過濾器進行過濾滅菌。在500-L生物反應器中用含有pTrcKudzu DXS質體之大腸桿菌細胞進行醱酵。進行此實驗以監測在醱酵所要之PH 7.0及溫度3(TC下自葡萄糖及酵母提取物形成異戊二烯之情況。在大豆脒-酵母提取物_葡萄糖培養基中製備自冷凍小瓶中獲取之大腸桿菌菌株之接種體。在接種體生長至〇D 0.15(在550 nm下所量測）之後，使用2〇 mi接種體接種含有2.5-L大豆脒-酵母提取物-葡萄糖培養基之生物反應 149048.doc •134· 201111512 器。使2.5-L生物反應器物質在3〇t下生長至⑽為^ 〇，且將2.0-L物質轉移至500 L生物反應器中。以指數速率補給酵母提取物(―springer，MontreaI， Quebec，Canada)及葡萄糖。在5〇小時醱酵期間，傳遞至生物反應器中之葡萄糖及酵母提取物之總量分別為“I 2 k 及17.6 kg。生物反應器内隨時間而變之光學密度展示於圖 43A中。如先前所述測定生物反應器之釋出氣體中之異戊 φ 一烯含里。異戊二烯力價隨著醱酵過程而增加（圖43B)。在50小時醱酵期間所製造之異戊二烯之總量為μ」§，且製造時程屐示於圖43C中。實例8 :黃素氧化還原蛋白之過度表現増加過度表現大腸桿菌心、酵母及野葛異戊二烯合成酶之菌株的異戊二烯產量具有pTrcKudzuDXSyIDI之BL21 (DE3)菌株在非誘導條件下與在IPTG誘導條件下相比製造更多異戊二烯，且觀測 # 到積累HMBPP((E)-4-羥基-3-甲基-丁 _2_烯基焦磷酸），即 HDS(GcpE 或 IspG)之受質。使用具有 pTrcKudzuDXSyIDI 之 BL21 (DE3)菌株作為親本宿主菌株，評估引入單獨及與編碼黃素氧化還原蛋白I之//以基因組合之野葛異戊二烯合成酶基因的另一質體來源性複本對非誘導條件下該等菌株相對於空載體對照菌株之異戊二烯產量的影響。此等實驗研究異戊二烯合成酶之另一複本是否改良非誘導條件下具有pTixKudzuDXSyIDI構築體之BL21 (DE3)菌株的異戊二烯產量。在非誘導條件下，異戊二烯合成酶可 149048.doc -135- 201111512 能為有限的且野葛酶之另一複本可能能夠改良菌株產生異戊二烯之比生產力。該等實驗亦研究另一（其他）因素是否促使菌株製造適量之異戊二烯，且之質體來源性複本是否可增加非誘導條件下具有pTrcKudzuDXSyIDI構築體之BL21 (DE3)菌株之異戊二烯產量。//…所編碼之黃素氧化還原蛋白I欲以超過内源//cM基因座所產生之量由 PTrcHgSfldA/pBAD33構築體異位表現。黃素氧化還原蛋白I之量增加可增加DXP途徑酶GcpE(HDS或IspG)及 LytB(HDR或IspH)所顯示之活體内活性，與先前於活體外所見相同（Seemann，M.等人，Jgnew. C/zem. /«ί·五ί/.，41: 4337-4339, 2002 ； Wolff, Μ.^Λ » FEBS Letters, 541: 115-120，2003)，且可能改良相關菌株中實現異戊二烯合成之碳通量，使之超過相當的含pTrcKudzuDXSyIDI之BL21 (DE3)對照菌株。細菌轉型及分子生物學技術係使用標準方案（Sambrook 等人）來執行，該文獻藉此以全文引用的方式併入，尤其關於細菌轉型。大腸桿菌菌株BL21 (DE3)及TOP10獲自 Invitrogen。在製備下文所述之pTrcHgS/pBAD33及 PTrcHgSfldA/pBAD33構築體期間使用TOP10細胞。經由化學轉型將載體構築體移入BL21 (DE3)菌株中以供後續評估異戊，二烯產量。構築體前置引子名稱：51 fldA Nsil Spel rbs 149048.doc -136- 201111512 序列：GG ATGCAT ACTAGT TTCA AGAGG TATTTCACTC ATG(SEQ ID NO:54) 特徵： Nsil Spel rbs start

A__G 與MG1655 基因座同源之區域引子購自 Integrated DNA Technologies(Coralville， Iowa)。根據製造商之說明書，以Herculase II Fusion (Stratagene)進行 PCR反應。

反置引子名稱：3' fldA PstI stop 序列：ATC CTGCAG TCA GGCATTGAGAATTTCGTC(SEO ID NO:55) 特徵： PstI stop T_c 與MG 1655 _/7以基因座同源之區域弓 I 子購自 Integrated DNA Technologies(Coralville, Iowa)。根據製造商之說明書，以Herculase II Fusion (Stratagene)進行 PCR反應。大腸桿菌12 MG1655(全球資訊網genome.wisc.edu/ ^80111^63/3化&〖113.1^111)為用於擴增//<^基因座之基因組模板之來源；使用無菌牙籤將細胞直接添加至PCR反應中。利用MinElute PCR純化套組（Qiagen)清潔/Wd PCR產物。pBAD33描述於例如Luz-Maria， G_等人，乂 77: 4121-4130, 1995 中，該文獻藉此以全文引用的方式併入，尤其關於pBAD33。pTrcKudzu及 149048.doc -137- 201111512 pTrcKudzuDXSyIDI kan描述於例如美國申請案第 12/335,071號及PCT/US2008/086809中，該等文獻藉此以全文引用的方式併入，尤其關於實例1及7。在此，藉由將含有源自pTrcKudzu之野葛異戊二稀合成酶之Trc啟動子區、rbs及編碼序列之Sspl-Pstl(1934 bp)片段選殖至pBAD33之Smal-PstI位點中來構築pTrcHgS/ pBAD33。在此構築卩丁1：(：1^8【1(1八/卩6人033。將包含//^以&1^上游22 bp直至基因之終止密碼子且包括内源rbs的經NsiI-Pstl(1471 bp)分解且經PCR擴增之//心片段選殖至 pTrcHgS/pBAD33中異戊二烯合成酶開放閱讀框架下游緊鄰之PstI位點中。藉由 Sequetech(Mountain View, California)進行定序，藉此驗證構築體。培養條件在25°C及30°C下使細菌於LB 1.5%瓊脂板上及TM3液體培養基中生長（參見TM3之描述，例如美國申請案第 12/335,071號及PCT/US2008/086809，其藉此以全文引用的方式併入，尤其關於TM3液體培養基），該等培養基以 0.1 %酵母提取物及1.0%葡萄糖補充至最終濃度。適當時，分別以50 gg/ml及10 pg/ml將康黴素（Kan)及/或氣黴素 (Cmp)添加至生長培養基中；基於pTrc之構築體編碼KanR 且基於pBAD33之構築體編碼CmpR。由600 nm下所量測之光學密度來監測細菌生長。 149048.doc -138- 201111512 評估異戊二烯產量關於異戊二烯產量之頂部空間檢驗描述於實例丨中。各菌株之比生長力以Hg/L.OD.h形式報導；注意檢驗小瓶中之比率為1900 μΐ頂部空間氣體：1〇〇 μ1培養液。使用

Microsoft Office Excel 2003軟體生成描繪各菌株之生長速率及比生產力之圖。構築BLM (DE3)菌株及評估異戊二烯產量 • 構築以下BL2i (DE3)菌株且評估相對於彼此之異戊二烯產量：具有pTrcKudzuDXSyIDI載體及^空卟八⑽載體（亦稱作「空載體」）；2) pTrcHgS/pBAD33構築體（亦稱作「HgS」）；或3) PTrcHgSfMA/PBAD33構築體（亦稱作 rHgS_ FldA」）之 BL21 (DE3)。全部二種BL21 (DE3)測試菌株皆具且在適當選擇兩種質體構築體下生長。空載體菌株表示親本對照菌株；HgS菌株表示具有野葛異戊二烯合成酶基因之 • 另一質體來源性複本的親本菌株：HgS-FldA菌株表示具有育素氧化還原蛋白I及異戊二烯合成酶基因之其他質體來源性複本的親本菌株。在25°C、震盪（25 0 rpm)下’使細菌菌株於10 mi含有抗生素之補充TM3培養基中生長隔夜；在此及對於以下實驗，生長培養基中存在5〇 gg/m丨康黴素及1〇 pg/ml氣黴素。接著將培養物稀釋至含有抗生素之新鮮補充TM3培養基中以使600 nm下之光學密度達到約〇〇5，且使之在 C 展盈（250 rpm)下於 250 ml Erlenmeyer燒瓶中之 12.5- 149048.doc -139- 201111512 25 ml含有抗生素之補充TM3培養基中生長。通常，一旦 600 nm下培養物之光學密度達到0.4，即評估菌株之異戍二烯產量。在最密集取樣之實驗中，一旦開始異戊二稀量測，即以45分鐘時間間隔監測各培養物之異戊二烯產量。描述空載體（對照）、HgS及HgS-FldA菌株所產生之異戍二烯之生長速率及比生產力的兩個獨立實驗之結果展示於圖 46A-46D中。該等菌株在非誘導條件下生長；意謂Trc啟動子調控之基因構築體未進行IPTG誘導之表現。此處所述之貫驗中所有相關質體來源性基因皆由IPTG誘導性Trc啟動子控管。此項技術中熟知Trc啟動子在不存在IPTg誘導子之情況下具活性。在所測試之非誘導條件下，針對空載體、HgS及HgS_ FldA菌株進行之異戊二烯頂部空間檢驗所獲得之結果指示’ pTrCHgSfldA/pBAD33構築體上所存在之fldA之另一複本實質上增加HgS-FldA菌株之異戊二烯產量，使之超過 HgS與空載體對照菌株所製造之異戊二烯。在兩個獨立實驗中，觀測到經3.75小時及2.5小時時程，HgS_FidA菌株展現出產生異戊二烯之比生產力比增加，分別為對照菌株之 1.5至1.9倍及1.3至1_8倍。所觀測到的對異戊二烯產量之影響似乎特定針對含/7心構築體之存在，此係因為HgS菌株在非誘導條件下製造之異戊二烯之量與空載體對照菌株製造之異戊二烯相當。實例9·在製造異戊二稀之大腸桿菌中表現來自臺灣溫泉菌 BP-1 之替代性 ispG(gcpE 或 HDS)&ispH(丨及 M9048.doc •140- 201111512 其相應還原穿梭系統（reducing shuttle system)以改良異戊二烯產量在此實例中，吾人證實鐵氧化還原蛋白/鐵氧化還原蛋白-NADP氧化還原酶/NADPH還原系統以及來自臺灣溫泉菌之GcpE及LytB酶改良大腸桿菌BL21(DE3)之異戊二烯產量。臺灣溫泉菌如同大腸桿菌一般經由DXP途徑合成類異戊二烯，但不具有編碼黃素氧化還原蛋白之任何基因。先前顯示植物GcpE酶為鐵氧化還原蛋白依賴性酶，且黃素氧化還原蛋白無法支持cMEPP(ME-CPP)經由此酶酶促轉化成 HDMAPP(HMBPP)(參見 Seemann 等人，7^55· Ze"., 580(6): 1547-52 (2006)，其藉此以全文引用的方式併入）。亦於活體外證實，臺灣溫泉菌之GcpE、以及PetF(鐵氧化還原蛋白）、Pet Η(鐵氧化還原蛋白-NADP +氧化還原酶）及NADPH 可使 cMEPP轉化成 HDMAPP(Okada及 Hase，价〇/ C/iem， 280(21):20627-9 (2005)，其藉此以全文引用的方式併入）。在基因組中缺乏除鐵氧化還原蛋白以外之其他小電子載體蛋白之情況下，臺灣溫泉菌之LytB可能亦利用與 GcpE相同之還原穿梭系統。展示在REM23-26中藉由過度表現來自臺灣溫泉菌BP-1 之GcpE、PetF及PetH而使異戊二烯產量增加及cMEPP含量升高。吾人先前已證實，之表現增加會增加表現量增加及變化之製造異戊二烯之大腸桿菌菌株（REM19-22)中通過 149048.doc -141 - 201111512 DXP途徑之通量，該等菌株係藉由將GI 1 ·Χ啟動子系列整合於大腸桿菌BL21(DE3)基因組内緊接办15基因座上游之處構築而成。隨後，藉由用表現及所編碼之臺灣溫泉菌GcpE及其相應還原穿梭系統之質體轉型來產生菌株 REM23-26之測試組。評估親本菌株及測試菌株之生長、異戊二烯產量及DXP途徑代謝物之存在。結果呈現於圖 47-49中。構築 REM19-22 之 MCM16、MCM640、MCM639、MCM641 及親本菌株根據製造商之說明書，使用來自Gene Bridges GmbH之 Red/ET系統進行此實例中所述之GI 1 .X啟動子插入及後續抗生素抗性標記物環出。使用菌株BL21(DE3) (Invit'rogen) 〇引子序列 MCM319:5 丨 ctctctttcggcaacagtcgtaactcctgggtggagtcgaccagtgccagggtcgggtatttggcaatatcaaaactcatatattcc accagctatttgttagtgaataaaagtggttgaattatttgctcaggatgtggcatNgtcaagggctaatacgactcactatagggc tc(SEQIDNO:57)。使N鹼基簡併：A鹼基得到GI 1.6-，T鹼基得到GI 1.5-， G鹼基得到GI1.2-，且C鹼基得到GI 1.0-啟動子。 MCM320: 5'- tcgatacctcggcactggaagcgctagcggactacatcatccagcgtaataaataaacaataagtatta ataggcccctgaattaaccctcactaaagggcgg (SEQ ID NO: 58) ° MCM327: 5'-TTGTAGACATAGTGCAGCGCCA (SEQ ID NO: 59) ° GB-DW: 5'-aaagaccgaccaagcgacgtctga (SEQ ID NO: 60) ° 149048.doc •142- 201111512 產生MCM63 8-641菌株之策略將GI1.X啟動子系列插入办$之前的策略展示於圖5〇中。藉由使用引子組MCM319/MCM320進行PCR來擴增抗生素抗性卡匣GB-NeoR。該等引子含有5〇個與办5編碼區之5，緊接之區域同源的鹼基以允許在pRed_ET質體存在下在PCR 產物電穿孔之後於特定基因座處進行重組。擴增缺失卡匣為擴增GB-NeoR卡匣以緊接加基因座上游插入GI丨X啟動子，設置以下PCR反應： 1 μ1(100 ng GB-NeoR) 10 μΐ fferculasefl缓衝液 0.5 μΐ dNTP(l〇〇 mM) 1.25 μΐ 引子（l〇 μΜ)Μ〇νΐ319 1.25 μΐ 引子（1〇 μΜ)Μ〇ν[320 35 μΐ去離子水 + 1 μΐ來自 Stratagene之//^£?«/似6///1^_〇« 循環參數 95°〇2 分鐘；[95°C><20 秒，55°〇20 秒，72°〇50 秒]χ30 次循環；72°〇3分鐘；4°C直至冷卻（BioRadPCR機器）。在1.2°/〇 E-gel(Invitrogen)上分離所得PCR片段以驗證成功擴增，且根據製造商之說明書使用QIAquick PCR純化套組進行純化。所得儲備物為GB-NeoR-GI l.X-dxs片段。將 GB-NeoR-GI 1 .X-dxs PCR 產物整合至 BL21(DE3)/ pRed-ET菌株中 149048.doc -143- 201111512 藉由電穿孔將pRed-ET載體（Gene Bridges套組）轉型至 BL21(DE3)中，得到菌株MCM327(BL21(DE3)/pRed-ET)。將約500 ng之GB-NeoR-GI 1 .x-dxs PCR片段電穿孔至 MCM327中。在37°C、以200 rpm震盪下於L培養液中回收轉型體1小時，接著塗於含有康黴素（10 pg/ml)之L瓊脂上。藉由使用引子GB-DW/MCM327進行PCR來分析康黴素抗性群落中GB-NeoR卡匣及GI 1.X啟動子之存在。使用 MCM327及GB-DW引子對來自許多轉型體（MCM617-625) 之PCR片段進行定序（Quintara ; Berkeley，CA)，且鑑別多個相關GI 1.X-办ί菌株。正確菌株命名為MCM617(FRT-neo-FRT-GI 1.0-dxs) 、 MCM618(FRT-neo-FRT-GI 1.5- dxs)、MCM623(FRT-neo-FRT-GI 1.2-dxs) &MCM625(FRT-neo-FRT-GI 1.6-dxs)。根據製造商之說明書，使用來自 RED/ΕΤ套組之pCP20使菌株之康黴素抗性卡匣環出。經由康黴素（10 pg/ml)抗性損失、及顯示GB-NeoR卡匣環出之 PCR來驗證轉型體。所得菌株命名為MCM638(BL21(DE3) GI 1.0-dxs) ' MCM639(BL21(DE3) GI 1.5-dxs) ' MCM640 (BL21(DE3) GI 1.2-dxs)及 MCM641 (BL2 1 (DE3) GI 1.6-dxs) o 分別自 MCM638、MCM640、MCM639 及 MCM641 構築親本菌株 REM19-22 使用標準分子生物學技術構築此實例中所述之T7-MEARR alba/pBBRlMCS-5(Sambrook等人，1989，其藉此以全文引用的方式併入）。先前已描述pBBRlMCS-5質體 149048.doc -144- 201111512 (Kovach等人，B/oiec/jm'gwei, 16(5):800-2 (1994)，其藉此以全文引用的方式併入，尤其關於pBBRIMCS之選殖）。說明所得質體構築體之圖展示於圖51中。MCM638-641菌株用於此處所述之轉型。引子序列

5· ΚρηΙ至 lacl MEARR T7片段：5'-GCTGGGTACCCTGCCC GCTTTCCAGTCGGGAAACCT(SEQ ID NO:61)

3' Spel至 T7終止子 MEARR T7 片段：5'-TAGAACTAGTCA AAAAACCCCTCAAGACCCGTTTAG(SEQ ID NO:62) M13前置引子（-20): 5'-GTAAAACGACGGCCAGT(SEQ ID NO:63) EL-1000 ： 5'-GCACTGTCTTTCCGTCTGCTGC(SEQ ID NO: 64) A-rev ： 5'-CTCGTACAGGCTCAGGATAG(SEQ ID NO:65) A-rev2 ： 5'-TTACGTCCCAACGCTCAACT(SEQ ID NO:66) 產生REM19-22菌株之策略將 T7-MEARR alba/pBBRlMCS-5 電穿孔至菌株MCM638-641中。使用具有T7聚合酶控管之MEARR alba對偶基因 MD09-173(未經標記之 BL21(DE3)pLysS，pET24a-P.alba (MEA)(pDu39))之載體構築體作為PCR模板。擴增T7-MEARR alba片段為擴增T7-MEARR alba片段以供選殖至pBBRlMCS-5質體中，進行以下PCR反應： 1 μΐ(約 120 ng MD09-173) 149048.doc -145- 201111512 10 μΐ //ercw/ase//緩衝液 0.5 μΐ dNTP(100 mM) 1.25 μΐ 引子（10 μΜ)5' Kpnl至 lacl MEARR T7 片段 1.25 μΐ 引子（10 μΜ)3' Spel至 T7終止子 MEARR T7 片段 35 μΐ去離子水 + 1 μΐ來自 Stratagene之/〇循環參數： 95°C><2 分鐘；[95°C><30 秒，63°〇30 秒，72°C><3 分鐘]χ29 次循環；72°〇5分鐘； 4°C直至冷卻（Biometra T3000 Combi溫度循環器）。在1.2% E-gel(Invitrogen)上分離所得PCR片段以驗證成功擴增，且根據製造商之說明書使用QIAquick PCR純化套組（Qiagen)進行純化。所得儲備物為T7-MEARR alba片段。將 T7-MEARR alba 片段選殖至 pBBRlMCS-5 中根據製造商之說明書，用&«I及办el(Roche)分解約600 ng T7-MEARR alba片段及 200 ng pBBRlMCS-5 質體。隨後組合分解物，且使用Qiagen QiaQuick凝膠萃取套組進行清潔。根據製造商建議之方案，使用T4 DNA接合酶（New England Biolabs)接合約四分之一至三分之一的經清潔之切斷DNA。使用標準熱休克方案（參見，例如Sambrook等人，1989，其藉此以全文引用的方式併入），以接合反應轉型化學性勝任TOP10細胞（Invitrogen)，在37°C下於L培養液中回收1小時，接著塗於含有慶大徽素（gentamycin) 149048.doc -146- 201111512 (10 pg/ml)及5-溴_4_氯-3-。引哚基-β-D-哌喃半乳糖苷（乂-GAL，40 pg/ml ; Sigma)之Li复脂上。選擇白色慶大徽素抗性群落，於含有慶大黴素（10 pg/ml)之L培養液中生長隔夜，且次日收集以供製備質體。使用Qiagen Qiaprep Spin Miniprep套組分離質體構築體，且首先藉由限制性酶分解及電穿孔（如上所述）分析T7-MEARR alba片段之假定存在。使用引子M13前置引子（-20)、EL-1000、A-rev及A-rev2對相關質體製劑進行定序（Sequetech ; Mountain View, CA)，且鑑別正確 T7-MEARRalba/pBBRlMCS-5純系。將 T7-MEARR alba/pBBRlMCS-5轉型至 MCM638-641 中為構建製造異戊二烯之菌株REM19-22，藉由電穿孔將 T7-MEARR alba/pBBRlMCS-5 質體轉型至 MCM638-641 中。在L培養液中回收轉型體且塗於含有慶大黴素（10 pg/ml)之L瓊脂上。所得菌株指定如下：REM19 (MCM638/ T7-MEARR alba/pBBRlMCS-5) > REM20(MCM640/T7-MEARR alba/pBBRlMCS-5) ' REM2 1 (MCM639/T7-MEARR alba/ pBBRlMCS-5)及 REM22(MCM641/T7-MEARR alba/pBBRlMCS-5)。構築測試菌株REM23-26 藉由將Ptac-gcpE-petF-petH/pK184構築體轉型至 MCM638、MCM640、MCM639及 MCM641 中來構築 REM23-26。由 Gene Oracle, Inc_(Mountain View, CA)藉由對用於在大腸桿菌中表現之gcp五、peiF及pei//進行密碼子最佳化來合成此實例中所述之質體Ptac-gcpE-petF-petH/pKl 84。先 149048.doc -147- 201111512 前已描述Ptac啟動子及終止子序列（Genbank寄存編號分別為E02927及CP001164)。pK184選殖載體已例如由 Jobling及 Holmes，TVwc/ez.c Λα. 18(17):5315-6 (1990) 描述，該文獻藉此以全文引用的方式併入，尤其關於 ρΚ184選殖載體。說明所得質體構築體之圖展示於圖52 中。REM19-22菌株用於本文所述之轉型。產生REM23-26菌株之策略將 Ptac-gcpE-petF-petH/pK184 電穿孔至菌株 REM19-22 中。Ptac-gcpE-petF-petH/pK184之質體製劑由 Gene Oracle， Inc.提供。將 Ptac-gcpE-petF-petH/pK184轉型至 REM19-22 中為構建製造異戊二烯之測試菌株REM23-26，藉由電穿孔將 Ptac-gcpE-petF-petH/pK184 質體轉型至 REM19-22 中。在L培養液中回收轉型體且塗於含有康黴素（10 pg/ml)及慶大黴素（10 gg/ml)之L ί复脂上。所得菌株指定如下： REM23(REM19/Ptac-gcpE-petF-petH/pK184)、REM24(REM20/ Ptac-gcpE-petF-petH/pKl 84)、REM25(REM21/Ptac-gcpE-petF-petH/pKl 84)及 REM26(REM22/Ptac-gcpE-petF-petH/pKl 84)。分析REM19-26之生長、異戊二烯產量及DXP代謝物產生在震盪燒瓶異戊二烯頂部空間檢驗中以及在DXP代謝物測定研究中，將親本菌株REM19-22與測試菌株REM23-26 相比較。表現臺灣溫泉菌GcpE酶在大腸桿菌宿主產生DXP 代謝物及製造異戊二烯方面的益處說明於圖47及圖48中。生長 149048.doc •148· 201111512 在30°C下使菌株REM19-26於TM3液體培養基（13.6 g Κ2Ρ04、13.6 g KH2P〇4、2.0 g MgS04.7H20、2.0 g單水合檸檬酸、0.3 g檸檬酸鐵銨、3.2 g (NH4)2S04、0.2 g酵母提取物、1.0 ml 1000X改質痕量金屬溶液，調整至pH 6.8且用H20補足，且經過濾滅菌）中生長，該培養基以〇. 1 〇/。酵母提取物及1.0%葡萄糖補充至最終濃度且包括康黴素（1〇 pg/ml)及慶大黴素（10 pg/ml)。藉由記錄在600 nm下使用 Eppendorf Biophotometer 光譜儀（Eppendorf)所量測之培養物之各光學密度來週期性地監測生長。異戊二烯產量使用頂部空間檢驗分析異戊二烯產量。對於震盪燒瓶培養’將1 ml培養物自震盪燒瓶轉移至20 ml CTC頂部空間小瓶（Agilent小瓶目錄號51 88 2753 ;帽目錄號5 188 2759) 中。將帽旋緊’且在等效溫度、以250 rpm震盪下培育小瓶。3 0分鐘後，自培育箱中移出小瓶且進行分析。使用與 CTC Analytics(Switzerland)CombiPAL 自動取樣器相接且以頂部空間模式操作之Agilent 6890 GC/MS系統進行分析。使用 Agilent HP-5MS GC/MS 管柱（30 mx〇.25 mm ; 0.25 μιη 膜厚度）分離分析物。設置取樣器以注射500 μΕ頂部空間氣體。GC/MS方法利用氦作為載氣’流速為1 。保持注射口在25(TC下，分流比為50:1。歷經2分鐘之分析持續時間，保持烘箱溫度為37。(：。以m/z為67之單離子監測 (SIM)模式操作Agilent 5793]^質量選擇偵測器。自i 4分鐘至1 ·7分鐘切斷偵測器以允許永久氣體溶離。在此等條件 149048.doc -149- 201111512 下’觀測到異戊二烯（2-曱基-1，3-丁二烯）在1·78分鐘時溶離。使用校準表來定量異戊二烯之絕對量，且發現自1 pg/L至2〇0 pg/L呈線性。使用此方法估算偵測限度為5〇至 100 ng/L。各菌株之比生產力以料/l 〇D h形式報導。注意’在檢驗小瓶中歷經30分鐘培育，1900 μΐ頂部空間氣體：100 μΐ培養液之比率引起微克異戊二烯/公升培養物至比生產力之以下轉換：（由GC-MS測定之異戊二稀/公升）x(3 8)/(培養物之〇d 600 nm)。 DXP代謝物積累分別分離上文所述且圖48中所描繪之製造異戊二烯之親本菌株及測試菌株REM19-22及REM23-26的DXP代謝物，且如下定量：代謝物定量藉由將3_5 mL培養物抽取至填充有3·5 mL乾冰冷卻甲醇之管中而使細胞代謝快速失活。藉由離心使細胞碎片集結成粒，且將上清液負載至含有30 mg%附劑之Strata_x_Aw 陰離子交換管柱（Phenomenex)上。將顆粒再萃取兩次，首先用3 mL含5〇〇/0曱醇之！ mM NH4HC〇3緩衝液（pH=7…萃取，接著用3 mL 75%甲醇/1 mM贿4狀〇3緩衝液⑽=7⑴ 萃m萃取後’藉由離d細胞碎片集結成粒，且將上清液連續負載至同一陰離子交換管柱上。在萃取及離心步驟期f曰卜保持樣品低於+4°C。在代謝物溶離之前，用水及甲醇（各1 mL)絲陰離子交換f柱，且藉由添加 mL濃氨水/甲醇（1:14, v/v)，接著添加〇.35机濃氨水/水/ 149048.doc •150- 201111512 曱醇（1:2:12，v/v/v)混合物來溶離分析物。用30 μ!>冰醋酸中和溶離液，且藉由在微量離心機中離心而使之澄清。代謝物定量

使用 Thermo Scientific TSQ Quantum Access 質譜儀 (Thermo Electron Corporation, San Jose, CA)分析代謝物。使用 XCalibur 及 LCQuan 軟體（Thermo Electron Corp)進行所有系統控制、數據擷取及質譜數據評估。對於LC-ESI-MS/MS方法，以表1所示之移動相梯度（流動速率為0.4 mL/min)溶離配備有CC 8/4 Nucleodex β-ΟΗ保護筒之對掌性 Nucleodex β-ΟΗ 5 μΜ HPLC 管柱（100><2 111111，^13(：116犷67-Nagel, Germany)。樣品注射體積為1 0 μΐ^。表1.用於溶離代謝物之HPLC梯度時間，min 移動相，％ A B C (水） (100 mM碳酸氫銨，ρΗ=8·0) (乙腈) 0.0 0.0 20.0 80.0 0.5 15.0 5.0 80.0 4.5 37.5 12.5 50.0 6.5 37.5 12.5 50.0 7.0 49.5 0.5 50.0 12.0 34.9 0.1 65.0 12.5 0.0 20.0 80.0 13.0 0.0 20.0 80.0 使用負離子模式之電喷霧電離進行質量偵測。選擇母離子之以下m/z值以SRM模式偵測相關代謝物：ΙΡΡ及DMAPP 為 245.0，FPP 為 381.1，DXP 為 213.0，MEP 為 215.0， HDMAPP 為 260.0，及 cMEPP 為 277.0。基於 P03_ 子離子 149048.doc • 151 - 201111512 (m/z=79.0)所產生之峰的積分強度來測定代謝物濃度。藉由注射購自Echelon Biosciences Inc之相應標準物而獲得校準曲線。基於在OD=200之1 mL培養物中所有細胞之積分體積為50 μ；ί之假設，計算細胞内代謝物濃度。展示在REM31及REM29中藉由過度表現臺灣溫泉菌ΒΡ-1 之GcpE、LytB、PetF及PetH而使異戊二烯產量增加吾人已證實，办s之表現增加使得大腸桿菌内通過DXP 途徑之通量增加，而/心基因之額外過度表現顯著增加下游類異戊二烯之產量。為證實表現非黃素氧化還原蛋白依賴性GcpE及LytB酶在通過内源大腸桿菌DXP途徑而合成異戊二烯之碳通量方面的益處，構築組成性表現办及酵母IDI 酶之製造異戊二烯之大腸桿菌菌株BL21(DE3)。 BL21(DE3) GI l_6-dxs菌株MCM641描述於上文。具有酵母 IDI酶之載體構築體pDU9-pET-1 6b rev-yIDI之構築描述於本文中。含異戊二稀合成酶之銀白楊（尸.<3姑α)構築體T7-(-3) alba/pBBRlMCS-5 及 Τ7-ΜΤΕ alba/pBBRlMCS-5 描述於下文。產生一組源自MCM641的製造異戊二烯且過度表現IDI之親本菌株（REM H76及REMH86)，以與新產生之具有臺灣溫泉菌GcpE、LytB及其相應還原穿梭系統（下文所述）之測試組菌株（REM3 1及REM29)相比較。評估親本菌株及測試菌株之生長、異戊二烯產量、及DXP途徑代謝物之存在。結果描繪於圖49中。構築pDU-9

將來自釀酒酵母cerevzWizeXylDI)之 IPP 149048.doc -152- 201111512 異構酶選殖至載體pETl 6b(Invitrogen)中。使用引子組Hg-yIDI-R2/Hg-yIDI-F2以模板 DNA pTrcKudzu yIDI Kan 進行 PCR。PCR循環條件： PCR反應 1 μΐ 模板（pMVKl-菲南多氏模板（Fernando’s template))

5 μΐ l〇x PfuII Ultra緩衝液 1 μΐ dNTP

秦 1 μΐ 引子（50 pM)Hg-MVK-F2-NdeI 1 μΐ 引子（50 pM)Hg-yIDI-R2 40 μΐ去離子水 + 1 μΐ來自 Stratagene之Ρ/μ t/7/ταΙΙ Fusion DNA聚合酶循環參數： (95°C 2分鐘；95°C 20秒，55°C 20秒，72°C 21 秒，29X ; 72°C 3分鐘；4°C 直至冷卻，使用 Eppendorf Mastercycler 梯度機） φ 根據製造商之建議，使用QiaQuick PCR純化套組純化 PCR產物。使用T4接合酶（NEB)，將5 μΐ^經純化PCR產物之等分試樣接合於先前用分解-用SAP(蝦鹼性磷酸酶）處理之Invitrogen pET-16b載體。在16°C下接合隔夜。將5 pL隔夜接合混合物引入Invitrogen TOP10細胞中，且在含有羧苄青黴素（50 pg/ml)之L瓊脂上選擇轉型體，在 37°C下培育。使用QiaQuick spin Miniprep套組自轉型體分離質體。用T7啟動子及T7終止子對插入物定序（使用 Quintara Bio Sequencing Service)。所得質體 r稱為 pDu-9。 149048.doc -153· 201111512 一旦驗證序列，即根據製造商之方案將1 μΐ質體pDu-9轉型至BL21(DE3) pLysS宿主菌株中。在含有羧苄青黴素（50 pg/ml)之L瓊脂板上選擇轉型體且在37°C下培育。引子序列

Hg-yIDI-R2 5'...cagcagcagGGATCCgacgcgttgttatagca (SEQ ID NO: 111)

Hg-yIDI-F2 5'...cagcagcagCATATGactgccgacaacaatag (SEQ ID NO: 112) 構築 REMD76(MCM641/pDU9-pET-16b rev-yIDI)、 REMH76 及 REMH86(分別為 REMD76/T7-(-3) alba/ # pBBRlMCS-5及 REMD76/T7-MTE alba/pBBRlMCS-5) 產生REMD76之策略將 pDU9-pET-16b rev-yIDI 電穿孔至 MCM641 中。將 pDU9pET-16b rev-yIDI 轉型至 MCM641 中為構建過度表現BL21(DE3) GI 1.6-dxs yIDI之菌株 REMD76，藉由電穿孔將表現酵母IDI (yIDI)對偶基因之 pDU9-pET-16b rev-yIDI 質體轉型至 MCM641 中。在 L培養液中回收轉型體且塗於含有羧苄青黴素（50 pg/ml)之L瓊脂 · 上。選擇羧苄青黴素抗性群落且命名為REMD76。產生親本菌株REMH76及REMH86(分別為REMD76/T7-(-3) alba/pBBRlMCS-5及REMD76/T7-MTE alba/pBBRIMCS-5) 使用標準分子生物學技術構築此實例中所述之T7-(-3) alba/pBBRlMCS-5及 Τ7-ΜΤΕ alba/pBBRlMCS-5構築體（參見，例如Sambrook等人，1989)。先前已描述pBBRlMCS-5 149048.doc -154· 201111512 質體（參見尺ovac/z 等人，Biotechniques, 16(5):800-2 (1994)，其藉此以全文引用的方式併入，尤其關於 pBBRlMCS-5質體）。說明所得質體構築體之圖展示於圖53 中。REMD76菌株用於本文所述之轉型。產生REMH76及REMH86菌株之策略將 T7-(-3) alba/pBBRlMCS-5及 T7-MTE alba/pBBRlMCS-5 電穿孔至菌株REMD76中。使用具有T7聚合酶控管之（-3) 及MTE alba對偶基因（未經標記之pDU47-3-pET24a-P.alba (-3)及 pDU42 pET24a-P.alba-MTE)之載體構築體作為 PCR 模板。引子序列

5' ΚρηΙ 至 lacl MEARR T7 片段：5，-GCTGGGTACCCTGC CCGCTTTCCAGTCGGGAAACCT(SEQ ID NO:67) 3' Spel至 T7終止子 MEARR T7 片段：5，-TAGAACTAGTCA AAAAACCCCTCAAGACCCGTTTAG(SEQ ID NO:68)

M13 前置引子（-20): 5'-GTAAAACGACGGCCAGT(SEQ ID NO:69) EL-1000 ： 5'-GCACTGTCTTTCCGTCTGCTGC(SEQ ID NO: 70) A-rev ： 5'-CTCGTACAGGCTCAGGATAG(SEQ ID NO:71) A-rev2 ： 5'-TTACGTCCCAACGCTCAACT(SEQ ID NO:72) 擴增 T7_(-3)及 T7-MTE alba 片段為擴增T7-(-3)及T7-MTE alba片段以供選殖至 pBBRlMCS-5質體中，進行以下PCR反應：1 μΐ(約100 ng 149048.doc -155- 201111512 未經標記之 pDU47-3-pET24a-P.alba (-3)或 pDU42 pET24a-P.alba-MTE) 10 μΐ //ercw/ase//緩衝液 0.5 μΐ dNTP(100 mM) 1.25 μΐ 引子（10 μΜ)5· Kpnl至 lacl MEARR T7 片段 1.25 μΐ 引子（10 μΜ)3' Spel至 T7 終止子 MEARR T7 片段 35 μΐ去離子水 + 1 μΐ來自 Stratagene之循環參數· 95°〇2 分鐘；[95°C><30 秒，63°C><30 秒，72°C><3 分鐘]x29 次循環；72°〇5分鐘； 4°C直至冷卻（Biometra T3000 Combi溫度循環器）在1.2% E-gel(Invitrogen)上分離所得PCR片段以驗證成功擴增，且根據製造商之說明書使用QIAquick PCR純化套組進行純化。所得儲備物為T7-(-3) alba片段及T7-MTE alba片段。將 T7-(-3) alba 及 T7-MTE alba 片段選殖至 pBBRlMCS-5 中根據製造商之說明書，用來自Roche之Kpnl及Spel分解約 600 ng T7-(-3) alba 片段或 T7-MTE alba 片段及 200 ng pBBRlMCS-5質體。隨後組合分解物，且使用Qiagen QiaQuick凝膠萃取套組進行清潔。根據製造商建議之方案，使用來自New England Biolabs之T4 DNA接合酶接合約四分之一至三分之一的經清潔之切斷DNA。使用標準熱休克方案（Sambrook等人，1989，其藉此以 149048.doc -156- 201111512 全文引用的方式併入）以接合反應轉型化學性勝任丁〇1>1〇細胞（Invitrogen) ’在37〇c下於[培養液中回收1小時，接著塗於含有慶大黴素（1〇 pg/ml)及5_溴_4_氯_3_吲哚基_p_D哌喃半乳糖苷（X-GAL，40 pg/ml ; Sigma)之L瓊脂上。選擇白色慶大黴素抗性群落，於含有慶大黴素（1〇 pg/ml)2L培養液中生長隔夜，且次日收集以供製備質體。使用Qiagen Qiaprep Spin Miniprep套組分離質體構築體，且首先藉由限制酶分解及電穿孔（如上所述）分析T7_(_3) a】ba片段或 T7-MTE alba片段之假定存在。使用引子M13前置引子 (-20)、EL-1000、A-rev及A-rev2對所鑑別之相關質體製劑進行定序（Sequetech ; Mountain View, CA)，且鑑別正確 T7-(-3) alba/pBBRlMCS-5 及 T7-MTE alba/pBBRlMCS-5 純系。構築測試菌株REM31及REM29 為產生菌株 REM3 1 及 29 ’ 將質體 Ptac-gcpE-lytB-petF-petH/pK184轉型至 REMH76及 REMH86 中。由 Gene Oracle，

Inc.(Mopuntain View, CA)合成此實例中所述之Ptac_gcpE_ lytB-petF-petH/pK184且針對大腸桿菌進行密碼子最佳化。先前已描述Ptac啟動子及終止子序列（Genbank寄存編號分別為E02927及CP001164)，且其亦以合成方式構築而成。先前已描述pK184選殖載體（參見jobiing及 Holmes, Nucleic Acids Res. 1 8(1 7):5 3 1 5-6 (1990)，其藉此以全文引用的方式併入，尤其關於pK 184選殖載體）。說明所得質體構築體之圖展示於圖54中。REMH76及REMH86 149048.doc •157· 201111512 菌株用於本文所述之轉型。產生REM31及REM29菌株之策略將 Ptac-gcpE-lytB-petF-petH/pK184 電穿孔至 REMH76 菌株及 REMH86 菌株中：Ptac-gcpE-lytB-petF-petH/pK184 之質體製劑由Gene Oracle，Inc.提供。將 Ptac-gcpE-lytB-petF-petH/pK184 轉型至 REMH76 及 REMH86 中為構建具有臺灣溫泉菌GcpE及LytB酶之製造異戊二烯之測試菌株（REM3 1及REM29)以相對於親本菌株（REMH76 及REMH86)評估在DXP途徑通量及異戊二烯產量方面的益處，藉由電穿孔將Ptac-gcpE-lytB-petF-petH/pK184質體轉型至REMH76及REMH86中。在L培養液中回收轉型體且塗於含有羧苄青黴素（50 pg/ml)、康黴素（10 pg/ml)及慶大黴素（10 gg/ml)之L瓊脂上。所得菌株指定如下：REM31 (REMH76/Ptac-gcpE-lytB-petF-petH/pK184)及 REM29(REMH86/ Ptac-gcpE-lytB-petF-petH/pKl 84) 〇比較REMH76及REMH86與REM31及REM29之生長及異戊二烯產量在震盪燒瓶異戊二烯頂部空間檢驗中以及在DXP代謝物測定研究中，分別將親本菌株REMH76及REMH86與測試菌株,REM3 1及REM29相比較。表現臺灣溫泉菌GcpE及 LytB酶在大腸桿菌宿主製造異戊二烯方面的益處說明於圖 48中。生長 149048.doc -158- 201111512 在30°C下使親本菌株REMH76及REMH86與測試菌株 REM31 及 REM29 於 TM3 液體培養基（13.6 g Κ2Ρ04、13.6 g KH2P〇4、2.0 g MgS04-7H20、2.0 g單水合檸檬酸、0.3 g 檸檬酸鐵銨、3_2 g (NH4)2S04、0_2 g酵母提取物、i.o mi 1000X改質痕量金屬溶液，調整至pH 6.8且用H2〇補足，且經過濾滅菌）中生長，該培養基以0.1%酵母提取物及1.〇0/〇葡萄糖補充至最終濃度且包括羧苄青黴素（5〇 pg/m丨）、康 φ 黴素（10 Kg/ml)及慶大黴素（1〇 pg/ml)。藉由記錄在600 nm 下使用 Eppendorf Biophotometer光譜儀（Eppendorf)所量測之培養物之各光學密度來週期性地監測生長。異戊二稀產量使用頂部空間檢驗分析異戊二稀產量。對於震盪燒瓶培養’將1 ml培養物自震盪燒瓶轉移至2〇 CTC頂部空間小瓶（Agilent小瓶目錄號5188 2753 ;帽目錄號5188 2759) 中將巾自^疋緊’且在專效溫度、以250 rpm震遺下培育小 • 瓶。30分鐘後，自培育箱中移出小瓶且進行分析。使用與 CTC Analytics(SwitZerland)CombiPAL 自動取樣器相接且以頂部空間模式操作之Agilent 6890 GC/MS系統進行分析。使用 Agilent HP-5MS GC/MS 管柱（30 mx0.25 mm ; 〇 25 _ 膜厚度）分離分析物。設置取樣器以注射5〇〇吣頂部空間氣體。GC/MS方法利用氦作為載氣，流速為丨mi/min。保持注射口在25CTC下，分流比為50:1。歷經2分鐘之分析持 β時間，保持烘箱溫度為37。(：。以m/z為67之單離子監測 (SIM)模式操作AgUent 5793N質量選擇偵測器。自】*分鐘 149048.doc -159· 201111512 至1.7分鐘切斷偵測器以允許永久氣體溶離。在此等條件下，觀測到異戊二烯（2-曱基-1，3-丁二烯）在丨.78分鐘時溶離。使用校準表來定量異戊二烯之絕對量，且發現自1 pg/L至200 ng/L呈線性。使用此方法估算偵測限度為5〇至 100 ng/L。各菌株之比生產力以pg/L 〇D h形式報導。在檢驗小瓶中歷經30分鐘培育’ 1900 μι頂部空間氣體：1〇〇 μι培養液之比率引起微克異戊二烯/公升培養物至比生產力之以下轉換：（由GC-MS測定之異戊二烯/公升）χ(38)/(培養物之 OD 600 nm)。 DXP代謝物積累分離上述製造異戊二烯之親本菌株（REMH76及REMH86) 及測試菌株（REM31及REM29)的DXP代謝物，且如下所述進行定量。所得數據論述於圖48之圖例中。代謝物萃取藉由將3.5 mL培養物抽取至填充有35 mL乾冰冷卻甲醇之管中而使細胞代謝快速失活。藉由離心使細胞碎片集結成粒，且將上清液負載至含有3〇 mg吸附劑之Strata_x_Aw 陰離子交換管柱（Phenomenex)i。將顆粒再萃取兩次，首先用3 mL含50%f醇之！ mM Nh4HC〇3緩衝液（pH=7〇)萃取’接著用3 mL 75%甲醇n mM顺4此〇3緩衝液（pH=7 〇) 萃取。每-次萃取後’藉由離心使細胞碎片集結成粒，且將上清液連續負載至同一陰離子交換管柱上。在萃取及離心步驟期間’保持樣品低於+4t。在代謝物溶離之前，用 J49048.doc •160- 201111512 水及甲醇（各i mL)洗滌陰離子交換管柱，且藉由添加〇 35 mL濃氨水/甲醇（i:i4 ’ v/v)，接著添加0.35 mL濃氨水/水/ 曱醇（1:2:12，v/v/v)混合物來溶離分析物。用3 〇 pL冰醋酸中和溶離液’且藉由在微量離心機中離心而使之澄清。代謝物定量使用 Thermo Scientific TSQ Quantum Access 質譜儀 (Thermo Electron Corporation, San Jose, CA)分析代謝物。使用 XCalibur及 LCQuan 軟體（Thermo Electron Corp)進行所有系統控制、數據擷取及質譜數據評估。對於LC-ESI-MS/MS方法’以表1所示之移動相梯度（流動速率為〇 4 mL/min)溶離配備有CC 8/4 Nucleodex β-ΟΗ保護筒之對掌性 Nucleodex β-〇Η 5 μΜ HPLC 管柱（100x2 mm，Macherey-Nagel，Germany)。樣品注射體積為l〇 pL。

使用負離子模式之電喷霧電離進行質量偵測。選擇母離子之以下m/z值以SRM模式偵測相關代謝物：ipp及DMAPP 為 245.0 ’ FPP 為 381.1，DXP 為 213.0，MEP 為 215.0， HDMAPP 為 260.0，及 cMEPP 為 277.0。基於 PCV 子離子 (m/z=79_0)所產生之峰的積分強度來測定代謝物濃度。藉由注射購自Echelon Biosciences Inc之相應標準物而獲得校準曲線。基於在〇D=200之1 mL培養物中所有細胞之積分體積為50 μ]：之假設，計算細胞内代謝物濃度。實例10 :使大腸桿菌BL21(DE3)基因型中之iscR缺失以改良異戊二烯產量先前研究提出，修復GcpE内之受損Fe-S中心及更新或再 149048.doc -161 - 201111512 生GcpE内之活性4Fe-4S中心可部分地造成在經由GcpE進行之催化步驟中在DXP介導之類異戊二烯生物合成方面意識到瓶頸。已自經工程改造而過度表現he操縱子之大腸桿菌獲得較高量之相關酶LytB(GrSwert等人，·/ C/zew 51%. 126(40):12847-55 (2004)，其藉此以全文引用的方式併入）。由大腸桿菌操縱子編碼之酶已顯示在Fe-S鎮生物發生及維持方面起作用（Tokumoto及Takahashi，《/. jBioc/rem.，130: 63-71 (2001) ; Djaman等人，《/·〇/" C/zem，，279(43):44590-44599 (2004)，各藉此以全文引用的方式併入）。在大腸桿菌中過度表現be操縱子以產生較高量之含有諸如GcpE及LytB之酶的活性4Fe-4S鎮之替代性方法為移除抑制kc操縱子表現之IscR轉錄抑制子（Schwartz等尺，PNAS，98(26):14751-3 (2001)，其藉此以全文引用的方式併入）。此類方法最近經證實針對大腸桿菌BL21(DE3) 中表現梭菌氫化酶之群組取得成功（Akhtar及Jones，dpp/. Microfo厂 78(5):853-62 (2008)，其藉此以全文引用的方式併入）。在此實例中，吾人證實自大腸桿菌BL21(DE3)基因組中移除bci?會顯著改良異戊二烯產量，使之超過相應野生型菌株所製造之異戊二烯。使 iscR 自 BL21(DE3)/pRed/ET 中缺失根據製造商之說明書，使用來自Gene Bridges GmbH之 Red/ET系統進行此實例中所述之基因缺失及後續抗生素抗性標記物環出。使用菌株81^21(0£3)(111¥^1'〇§611)。 149048.doc -162- 201111512 所用引子序列頂部 iscR缺失：5.-GGGCGAGTTTGAGGTGAAGTAAGACA TGAGACTGACATCTGAACCCTCACTAAAGGGCGGCCGC(SEQ ID NO:80) 底部 iscR缺失：5'-TTCTTTTTATTAAGCGCGTAACTTAAC GTCGATCGCGTCTTGAAGTTCCTATACTTTCTAGAGAATA GGAACTTCTTACGCCCCGCCCTGCCACTCATCGCA(SEQ ID NO:81) 上 iscR 之 5’上緣：5，-AGCCAGGAGTTGAATATCCTG(SEQ ID NO:82) 下 iscR 之 3,下緣：5，-TGATGGACACGAGGATGGTGT(SEQ ID NO:83) 產生缺失菌株之策略使缺失之策略展示於圖61中。藉由使用引子組頂部 iscR缺失/底部iscR缺失進行PCR來擴增抗生素抗性卡匣 GB-CmR以使bci?基因座缺失。該等引子含有50個與側接基因之區域同源的鹼基以允許在pRed-ET質體存在下在PCR產物電穿孔之後於特定基因座處進行重組。擴增缺失卡匣為擴增GB-CmR卡匣以使缺失，設置以下PCR反應： 1 μ1(100 ng GB-CmR) 10 μΐ 緩衝液 0.5 μΐ dNTP(100 mM) 1·25 μΐ引子（10 μΜ)頂部iscR缺失 149048.doc •163· 201111512 1.25 μΐ引子（10 μΜ)底部iscR缺失 35 μΐ去離子水 +1 μΐ來自 Stratagene之循環參數： 95。〇2分鐘；[95°〇30秒，63°〇30秒，72°〇3 分鐘]χ29次循環；72°〇5分鐘； 4°C直至冷卻（Biometra T3000 Combi溫度循環器）。在1.2% E-gel(Invitrogen)上分離所得PCR片段以驗證成功擴增，且根據製造商之說明書使用QIAquick PCR純化套組進行純化。所得儲備物命名為GB-CmR-bci?片段。將GB-CmR-iscR產物整合至BL21(DE3)基因組中藉由電穿孔將pRed-ET載體（Gene Bridges)轉型至電穿孔勝任 BL21(DE3)(Invitrogen)中，得到菌株 BL21(DE3)/ pRed-ET。將約 500 ng GB-CmR-kci? PCR片段電穿孔至 BL21(DE3)/pRed-ET中。在37°C下於L培養液中回收轉型體 1小時，接著塗於含有氣黴素（10 pg/ml)之L瓊脂上。藉由以GB-CmR-bc/?片段置換be及，使用引子上iscR之5'上緣/ 下iscR之3’下緣進行PCR來分析氣黴素抗性群落。正確純系命名為REM14::CMP。根據製造商之說明書，使用來自 RED/ET套組之pCP20使菌株之氣黴素抗性卡匣環出。經由氣黴素（10 pg/ml)之抗性損失及顯示GB-CmR卡匣環出之 PCR來驗證轉型體。所得菌株命名為REM14。產生菌株REM65-1及REM4(REM12及REM13之親本菌株） 149048.doc •164- 201111512 用T7-MEARR alba/pBBRlMCS-5構築體轉型野生型 BL21(DE3)(Invitrogen)及zlbM菌株REM14以分別產生製造異戊二烯之REM65-1菌株及REM4菌株。含有載體T7-MEARR alba/pBBRlMCS-5之異戊二烯合成酶之圖展示於圖61中。T7-MEARR alba/pBBRlMCS-5之構築描述於以下實例中：在製造異戊二烯之大腸桿菌中表現來自臺灣溫泉菌BP -1之替代性及及其相應還原穿梭系統以改良異戊二烯產量。將 T7-MEARR alba/pBBRlMCS-5 轉型至 BL21(DE3)及 REM14 中為構建製造異戊二烯之REM65-1菌株及REM4菌株，藉由電穿孔將T7-MEARR alba/pBBRlMCS-5質體轉型至 BL21(DE3)(Invitrogen)及REM14中。在L培養液中回收轉型體且塗於含有慶大黴素（10 pg/ml)之L瓊脂上。所得菌株指定如下：REM65-1(BL21(DE3)/T7-MEARR alba/pBBRlMCS-5) 及 REM4(REM14/T7-MEARR alba/pBBRlMCS-5)。構築測試菌株REM12及REM13 由DNA2.0(Menlo Park，CA)合成大腸桿菌之整個DXP途徑且將其選殖至pET24a中（見圖63)。為構建具有較高通量DXP途徑之製造異戊二烯之reM 12 及REM13菌株，藉由電穿孔將DXP操縱子pET24a質體轉型至REM65-1及REM4中。含有載體DXP操縱子pET24a質體之DXP途徑酶之圖展示於圖63中。將DXP操縱子pET24a轉型至REM65-1及REM4中 149048.doc -165· 201111512 為構建測試菌株REM12及REM13菌株，藉由電穿孔將 DXP操縱子pET24a質體轉型至REM65-1及REM4中。在L培養液中回收轉型體且塗於含有慶大黴素（10 pg/ml)及康黴素（10 pg/ml)之L瓊脂上。所得菌株指定如下： REM12(REM65-1/DXP 操縱子 pET24a)及 REM13(REM4" DXP操縱子 pET24a)。分析REM12及REM13之生長及異戊二烯產量在震盪燒瓶異戊二烯頂部空間檢驗中比較野生型菌株 REM12與其他方面同源基因之山菌株rEm13。大腸桿菌宿主中之be/?損失在異戊二烯產量方面之益處及對生長速率之影響說明於圖60中。生長在3 0°(：下使菌株1^]^12及1^厘13於丁]\43液體培養基（13.6 g K2P〇4、13.6 g KH2P〇4、2.0 g MgS04.7H20、2.0 g單水合擰檬酸、0.3 g檸檬酸鐵銨、3.2 g (NH4)2S04、0·2 g酵母提取物、1.0 ml 1000X改質痕量金屬溶液，調整至pH 6,8 且用H2〇補足，且經過濾滅菌）中生長，該培養基以〇丨％酵母提取物及1_〇。/。葡萄糖補充至最終濃度且包括康黴素（1〇 Pg/ml)及慶大黴素（！〇 pg/mi)。藉由記錄在6〇〇 nrn下使用

Eppendorf Biophotometer 光譜儀（Eppendorf)所量測之培養物之各光學密度來週期性地監測生長。將5〇 μΜ異丙基β-D-卜硫代哌喃半乳糖苷（IPtg)添加至培養物中以在零時誘導菌株所具有之異戊二烯合成酶及DXp酶表現，如圖6〇之圖例所指示。 149048.doc -166· 201111512 異戊二烯產量使用頂部空間檢驗分析異戊二烯產量。對於震盈择瓶培養’將1 ml培養物自震盪燒瓶轉移至20 tnl CTC頂部介門小瓶（Agilent小瓶目錄號5188 2753;帽目錄號5188 2759) 中。將帽旋緊，且在等效溫度、以250 rpni震盈下丨立育小瓶。30分鐘後’自培育箱中移出小瓶且進行分析。使用與 CTC Analytics(Switzerland)CombiPAL 自動取樣器相接且以頂部空間模式操作之Agilent 6890 GC/MS系統進行分析。使用 Agilent HP-5MS GC/MS 管柱（30 mx〇.25 mm ; 〇 25 μηι 膜厚度）分離分析物。設置取樣器以注射5〇〇瓜頂部空間氣體。GC/MS方法利用氦作為載氣，流速為丄ml/min。保持注射口在25(TC下’分流比為50:1。歷經2分鐘之分析持續時間，保持烘箱溫度為37°C。以m/z為67之單離子監測 (SIM)模式操作Agilent 5793N質量選擇偵測器。自1 4分鐘至1_7分鐘切斷偵測器以允許永久氣體溶離。在此等條件下，繞測到異戊二烯（2-曱基-1，3- 丁二烯）在1 78分鐘時溶離。使用校準表來定量異戊二烯之絕對量，且發現自i pg/L至200吨/L呈線性。使用此方法估算偵測限度為5〇至 1〇〇 ng/L。各菌株之比生產力以pg/L.QD.h形式報導。注意’在檢驗小瓶中歷經30分鐘培育，19〇〇 μΐ頂部空間氣體：1〇〇 μΐ培養液之比率引起微克異戊二烯/公升培養物至比生產力之以下轉換：（由GC_MS測定之異戊二烯/公升）x(38)/(培養物之 OD 600 nm)。實例 11 :藉由補充BL21(DE3)PL.2 minn>j;/::FRT之山 149048.doc •167- 201111512 及/或山·印丑菌株評估來自不同生物體之替代性及對偶基因吾人構築表現下游曱羥戊酸途徑（來自酵母之曱羥戊酸激酶、磷酸曱羥戊酸激酶、二磷酸甲羥戊酸去羧酶及IPP 異構酶）之大腸桿菌菌株作為基礎菌株以供測試來自異源生物體之DXP途徑酶之功能性。此菌株若在曱羥戊酸存在下生長，則自下游甲羥戊酸途徑製造IPP及DMAPP。可藉由使菌株在曱羥戊酸存在下生長來補救DXP途徑酶之缺失。因此，可在含有下游MVA途徑且在不存在甲羥戊酸之情況下尋求生長之大腸桿菌中表現異源DXP途徑基因之功能性。構築 MD09_170(BL21(DE3)PL.2 mKKDyI::FRT) 引子序列 MCM 161: 5’-CACCATGGTATCCTGTTCTGCG(SEQIDNO:84) MCM1<52: 5，-TTAATCTACTTTCAGACCTTGC (SEQ IDNO:85) MCM143: S'-aggaggtggtctcaaATGACTGCCGACAACAATAGTA (SEQ ID NO:86) MCM144: S'-aggaggtggtctcagcgctctgcagTTATAGCATTCTATGAATTTGCCTG (SEQ ID NO:87) 自]^101^521(61^211^〇-?1^2-11^〖〇71)產生？1口||菌體溶菌液且轉導至BL21(DE3)中（根據程序12-遺傳轉導，使用 Plvir方案）。在含有康黴素（20 pg/ml)之L瓊脂板上選擇轉導體，同時在37°C下培育隔夜。藉由PCR驗證四個群落為正確轉導體。選擇此等群落之一且命名為MD09-169 (BL21(DE3)PL_2 ::Kan)。根據製造商之說明書，使用來自Gene Bridges GmbH之Red/ET系統之pCP20使此菌株之康黴素抗性標記物環出。藉由測試對康黴素（20 149048.doc -168 · 201111512 pg/ml)之敏感性來確認正確環出，接著藉由PCR驗證康黴素抗性卡匣之損失。正確菌株命名為]^〇09-170(BL21(DE3)PL.2 所尺尺办/ ::FRT)。使ispG及ispH自MD09-170中缺失根據製造商之說明書，使用來自Gene Bridges GmbH之

Red/ET系統進行此實例中所述之基因缺失及後續抗生素抗性標記物環出。使用菌株MD09-170。

所用引子序列

MQ09-18F 5'- GAACAATCACCGGCGCAGTAACAGACGGGTAACGCGGGAGATTTTTCATGaatt aaccctcactaaagggcgg (SEQ ID NO:88) MQ09-18R 5'- CGGGAAGCGAGGCGCTTCCCATCACGTTATTATTTTTCAACCTGCTGAACTAA TACGACTCACTATAGGGCTCG (SEQ ID NO:89) MQ09-19F 5' TTTTGATATTGAAGTGCTGGAAATCGATCCGGCACTGGAGGCGTAACATGaatta accctcactaaagggcgg (SEQ ID NO:90) MQ09-19R 5' ATTTTCGCATAACTTAGGCTGCTAATGACTTAATCGACTTCACGAATATCTAA TACGACTCACTATAGGGCTCG (SEQ ID NO:91) MQ09-20F 5'-cggcgcagtaacagacgggtaacgcgggagatttttcatg (SEQ ID NO:92) MQ09-20R 5'-cgcttcccatcacgttattatttttcaacctgctgaac (SEQ ID NO:93) MQ09-21F 5'-gaagtgctggaaatcgatccggcactggaggcgtaacatg (SEQ ID NO:94) MQ09-21R 5'-cttaggctgctaatgacttaatcgacttcacgaatatc (SEQ ID NO：95) 產生缺失菌株之策略使ispG及ispH缺失之策略展示於圖66中。藉由使用分別針對ispG或ispH缺失之引子組MQ09-18F/MQ09-18R或 149048.doc -169- 201111512 MQ09-19F/MQ09-19R進行PCR來擴增抗生素抗性卡匣GB-CmR。該等引子含有50個與側接ispG或ispH基因之區域同源的鹼基以允許在pRed-ET質體存在下在PCR產物電穿孔之後於特定基因座處進行重組。擴增缺失卡匣為擴增GB-CmR卡匣以使或/印丹缺失，設置以下 PCR反應： 2 μ1(100 ng GB-CmR)

10 μΐ //ercw/ase//緩衝液 0.5 μΐ dNTP(100 mM)

1.25 μΐ 引子（10 pM)MQ09-18F/19F

1.25 μΐ 引子（10 pM)MQ09-18R/19R 2 μΐ DMSO 32 μΐ去離子水 +1 μΐ.來自 Stratagene之//ercw/aseTT'/wsz’ow 循環參數： 95。〇2 分鐘；[95。〇20 秒，55。〇20 秒，72〇C ><50 秒]χ29 次循環；72°〇3分鐘； 4 °C 直至冷卻（Epp end or f Master cycler PCR機器）在1.2% E-gel(Invitrogen)上分離所得PCR片段，且根據製造商之說明書使用Qiagen QiaQuick凝膠萃取套組及 QIAquick PCR純化套組進行純化。所得儲備物為：約180 ng/μΐ GB-CmR-bpG 片段（1.593 kb)，及約 165 ng/μΐ GB-CmR-bp//片段（1.593 kb)。 149048.doc -170- 201111512 將 GB-CmR-ispG 或 GB-CmR-ispH PCR產物整合至 MD09-170/pRed-ET菌株中藉由電穿孔將pRed-ET載體（Gene Bridges套組）轉型至厘009-170 中，得到菌株14009-170/?1^£1-丑1'。將約 300-500 ng GB-CmR-b;?C?或 GB-CmR-bp/ί PCR片段電穿孔至 MD09-170/pRed-ET中。在37°C下於含有500 μΜ曱羥戊酸（Sigma) 之L培養液中回收轉型體1小時，接著塗於含有氣黴素（5 pg/ml)及曱羥戊酸（MVA)(500 μΜ)之L瓊脂上。藉由分別使用引子MQ09-20F/MQ09-20R 或MQ09-21F/MQ09-21R 進行 PCR來分析氣黴素抗性群落中GB-CmR卡匣的存在及bpG 或bp//基因的缺乏。正確菌株命名為MD09-209 (BL21(DE3)PL.2 mKKDyI::FRT-心pG.'Cw)及 MD09-210 (BL21(DE3)PL.2 mKKDyI::FRT-山根據製造商之說明書，使用來自RED/ET套組之pCP20使兩個菌株之氣黴素抗性卡匣環出。經由氣黴素（5 gg/ml)之抗性損失及顯示GB-CmR卡匣環出之PCR來驗證轉型體。所得菌株命名為 MD09-219(BL21(DE3)PL.2 FRT-AispG::FRT)及 MD09-220(BL21(DE3)PL.2 mKKDyl:: FRT-AispH::FRT)。用來自臺灣溫泉菌BP-1之對偶基因補充MD09-219及 MD09-220 為測試來自臺灣溫泉菌之gc;?五及炒基因（經註釋）之功能性，藉由電穿孔將表現此等構築體或來自大腸桿菌之及/γβ的以下質體轉型至MD09-219及MD09-220中： 149048.doc -171 - 201111512 1·大腸桿菌：GI 1.6-gcpE-lytB-yidi/pCR-Blunt ΙΙ-ΤΟΡΟ (Kan)(陽性對照） 2·臺灣溫泉菌：Ptac-gcpE-petF-petH/pK184(Kan) 3·臺灣溫泉菌：ptac-gcpE-lytB-petF-petH/pK184(Kan) 在含有MVA(500 μΜ)之L培養液中回收來自1.(大腸桿菌）之轉型體，且塗於含有康黴素（50 pg/ml)之L瓊脂上。所得菌株命名為 MD09-219/GI1.6-gcpE-lytB-yidi/pCRII-TOPO (Kan)。在含有MVA(500 μΜ)及IPTG(200 μΜ)之L培養液中回收來自2.(臺灣溫泉菌）或3.(臺灣溫泉菌）之轉型體，接著塗於含有康黴素（50 pg/ml)及IPTG(200 μΜ)之L瓊脂上。所得菌株分別命名為 MD09-2 1 9/Ptac-gcpE-petF-petH/pKl 84 (Kan) 及 MD09-219/Ptac-gcpE-lytB-petF-petH/pK184 (Kan)。在所有板上均獲得數個轉型體，表明臺灣溫泉菌尽印五及在大腸桿菌中發揮功能。為確認此結果，在存在及不存在IPTG(200 μΜ)之情況下，使轉型體於含有康黴素（50 pg/ml)之L培養液中生長。構築 GI 1.6-gcpE-lytB-yidi/pCR-Blunt II-TOPO 使用標準分子生物學技術構築此實例中所述之GI 1.6-gcpE-lytB-yidi/pCR-Blunt II-TOPO(參見 ’ {列士口 Sambrook 等人，Molecular Cloning: A Laboratory Manual，第 2版’ Cold Spring Harbor, 1989，其藉此以全文引用的方式併入，尤其關於選殖技術）。說明所得質體構築體之圖展示於圖67中。MD09-219及MD09-220菌株用於本文所述之轉 149048.doc -172- 201111512 型。引子序列

5' EcoRI-GI l.X-BamHI gcpE DXP操縱子：5’-GAG GAA TTC GCG AGC CGT CAC GCC CTT GAC NAT GCC ACA

TCC TGA GCA AAT AAT TCA ACC ACT AAA CAA ATC

AAC CGC GTT TCC CGG AGG TAA CCG GAT CCA AGG

AGA TAT ACC ATG CAT AAC CAG GCT CCA ATT CAA • CGT AGA(SEQ ID NO:96)

31 PstI idi DXP操縱子：5'-ATA TCC TGC AGT TAT AGC ATT CTA TGA ATT TGC CTG TC(SEQ ID NO:97) M13 前置引子（-20) : 5'-GTAAAACGACGGCCAGT(SEQ ID NO:98) M13 反置引子（-27) : 5'-CAGGAAACAGCTATGAC(SEQ ID NO:99) 使N鹼基簡併：A鹼基得到GI 1.6-，T鹼基得到GI 1.5-， φ G鹼基得到GI1.2-，且C鹼基得到GI 1.0-啟動子構築 GI 1.6-gcpE_lytB-yidi/pCR-Blunt II-TOPO之策略使用具有T7聚合酶控管之合成DXP操縱子（DXP操縱子 pET24a)之載體構築體作為PCR模板。擴增 GI 1.6-gcpE-lytB-yidi 片段為擴增GI l_6-gcpE-lytB-yidi片段（其他GI 1.X-亦有可能）以供選殖至pCR-Blunt II-TOPO載體中，進行以下PCR反應： 1 μΐ(約 100 ng DXP操縱子 pET24a) 149048.doc -173· 201111512 10 μΐ i/ercw/ase//緩衝液 0.5 μΐ dNTP(100 mM) 1.25 μΐ 引子（10 μΜ)5, EcoRI-GI l.X-BamHI gcpE DXP 操縱子 1.25 μΐ 引子（10 μΜ)3, PstI idi DXP 操縱子 35 μΐ去離子水 + 1 μΐ 來自 Stratagene之循環參數： 95°〇2分鐘；[95°〇30 秒，63°〇30 秒，72°〇3·5 分鐘]χ29 次循環；72°C χ5分鐘； 4°C直至冷卻（Biometra T3000 Combi溫度循環器）。在1.2% E-gel(Invitrogen)上分離所得PCR片段以驗證成功擴增，且根據製造商之說明書使用QIAquick PCR純化套組（Qiagen)進行純化。所得儲備物為gi l.X-gepE-lytB-yidi 片段。將 GI 1.6-gcpE-iytB-yidi 片段選殖至 pCR-Blunt II-TOPO 中採用所建議之方案，使用invitrogen之Zero Blunt⑧ TOPO® PCR選殖套組將GI Ι.Χ-gcpE-lytB-yidi片段選殖至 pCR-Blunt II-TOPO中。使用標準熱休克方案以2 μι接合反應轉型化學性勝任τοριο細胞（invitrogen),且在37t下於 L培養液中回收1小時，接著塗於含有康黴素（1〇 gg/ml)之[ 瓊脂上。選擇所得群落，於含有康黴素（1〇培養液中生長隔夜，且次日收集以供製備質體。使用Qiagen 149048.doc •174- 201111512

Qiaprep Spin Miniprep套組分離質體構築體。使用引子 M13前置引子（-20)及M13反置引子（-27)對許多質體製劑進行定序（Quintara ; Mountain View，CA)，且鑑別正確 GI 1.6-gcpE-lytB-yidi/pCR-Blunt II-TOPO純系。實例12:藉由解除對葡萄糖吸收之控制改良大腸桿菌之異戊二烯產量在大腸桿菌中，使用由PtsHICRR及轉運體PtsG組成之填酸烯醇丙酮酸轉運系統（PTSglc)轉運葡萄糖（參見^^⑶等 A > J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 3(3):329-46 (2001) > Μ. 藉此以全文引用的方式併入）。葡萄糖在轉運至細胞中時經磷酸化，其中磷酸源於磷酸烯醇丙酮酸。所得葡萄糖_6_ 磷酸經由糖酵解而發生代謝，從而再生PEP。葡萄糖轉運繼續通過指數生長期，但當細胞進入停滯期時有所下調。出於商業目的’需要使所要分子之製造時間及產率達到最大，此在原料轉運體下調時難以達成。為解決此問題，藉由使ρίί/7/crr缺失且在一些實施例中使外^缺失而除去 PTSglc系統，且組成性表現分別編碼半乳糖透過酶及葡糖激酶之ga/P及g/A：。半乳糖透過酶轉運葡萄糖而不使之磷酸化，故必需表現葡糖激酶（參見美國專利申請案第 20050079617號，其藉此以全文引用的方式併入）。使用來自Gene Bridges之Red/ET系統使BL2i中之操縱子缺失。用pRed/ET質體轉型電穿孔勝任 BL21(Invitrogen)，且藉由在冰冷去離子水中洗滌3_4次而使所得細胞呈電穿孔勝任。使用具有至少5〇個與丹上游 149048.doc -175- 201111512 緊接或err下游緊接之區域同源之鹼基的前置引子及反置引子擴增GB-cmR卡匣。使用所得pCR產物轉型 BL21/PRED，且將轉型體塗於含有葡萄糖（1%)及氣黴素（5 pg/ml)之MacConkey瓊脂上。已生長且顏色呈白色之轉型體將今正確基因型。使用P1轉導將剔除之轉導至製造異戊二烯之所要宿主中。藉由用至少50個在5,末端及3,末端同源之鹼基對（bp)進行 PCR 而擴增來自菌株 KLpts::gal-trc::Cm 或 KLgalPglk-trc- cat S(參見美國專利申請案第2〇〇5〇〇79617號，其藉此以全文引用的方式併入）之ptrc_galp_cat&Ptrc_glk_cat卡匣，以允許同源重組至具有DXP途徑或M VA途徑或這兩種途徑且表現異戊一烯合成酶（例如來自銀白揚之或其變異體）且缺失及/或沖G之BL21中。使所要菌株能勝任且用pRed/ET質體轉型，且在勝任之後，用galp七c_cat卡匣轉i新函株》在含有1%葡萄糖及氯徽素（5 之

MacConkey瓊脂上選擇轉型體。呈微粉紅色之群落具有正確基因型。此等卡匣中之CAT標記物由/〇χΡ位點側接且可由標準方法環出（palmeros等人，Gene 18;247(1-2):255-64 (2000) ’其藉此以全文引用的方式併入）。接著用glk_trc_ cat卡匿轉型表現來自ptrC2ga/p的菌株，且在含有葡萄糖及氣黴素（5 pg/ml)之MacConkey瓊脂上選擇轉型體。顏色呈深紅色之群落為正確群落。所得菌株具有完整MVA途徑，具有或不具有DXP途徑組成性表現之異戊二嫦合成酶（例如銀白楊或其變異 149048.doc • 176· 201111512 體），缺失pb/Z/crr及/或G，且組成性表現半乳糖透過酶及葡糖激酶。為證實此等菌株與經由PTSglc系統轉運葡萄糖之親本菌株相比異戊二烯產量提高及/或時間延長，在震盪燒瓶（含有1%葡萄糖、0.1%酵母提取物之TM3)、微量醱酵槽（含有1%葡萄糖、0.1%酵母提取物之TM3)中且以14 公升醱酵來測試菌株。亦使用經預處理且經糖化之生質，例如玉米纖維、玉米乾草、柳枝稷、飼用高粱、軟木漿、硬木漿或其他適合生質來測試此等菌株。缺失及/或phG且組成性表現半乳糖透過酶及葡糖激酶之菌株與未缺失/?及/或phG且未組成性表現半乳糖透過酶及葡糖激酶之親本菌株相比，異戊二烯產量提高及/或時間延長。實例13:單萜及倍半萜合成酶之表現與異戊二烯合成酶之表現的組合增加大腸桿菌中異戊二烯之比生產力在大腸桿菌中經由DXP途徑（亦稱為非甲羥戊酸途徑及 MEP途徑）生物合成異戊烯基焦磷酸（IPP)及二曱基烯丙基焦磷酸（DMAPP)。可使IPP與DMAPP縮合形成香葉基焦磷酸（GPP)，隨後經由法呢烯合成酶（IspA)形成法呢基焦磷酸 (FPP)。可藉由用IPP延長FPP而使FPP轉化成八異戊二烯基焦磷酸（OPP)及十一異戊二烯基焦磷酸（UPP)。此等產物在大腸桿菌中發揮多種功能，包括用DMAPP使tRNA(蛋白質合成組分）異戊二烯化、用OPP形成醌（呼吸鏈組分），及用 UPP形成肽聚糖（細胞壁組分）。可藉由製造IPP及DMAPP來調控DXP途徑之產物。因 149048.doc -177- 201111512 此，該實例顯示在大腸桿菌中引入利用DXP途徑下游產物之萜合成酶與異戊二烯合成酶之組合會增加通過DXP途徑之通量且增加異戊二烯之比生產力。方法構築菌株構築以下菌株。將羅勒烯合成酶、法呢烯合成酶及青蒿素合成酶選殖至 pTrchis2A 質體中，得到 pTrcFPP、pTrcAS 或 pTrcOS。在 Ptrc啟動子之控制下，將異戊二烯合成酶（例如來自銀白楊之IspS或其變異體）選殖至pBBR中，得到pBBRPtrcalba。菌株組 l)BL21GI1.6yIDI/pBBRPtrcalba 自身或與 PtrcFPP 或 pTrcAS 或 pTrcOS 組合。菌株組 2)BL21GI1.6yIDIGI1.6DXS/pBBRPtrcalba 自身或與 PtrcFPP 或 pTrcAS 或 pTrcOS 組合。使菌株組1)或2)中之菌株在震盪燒瓶中或在微量醱酵槽中於含有0.1%酵母提取物及1%葡萄糖之TM3中生長。隨時間量測異戊二烯之比生產力。比較菌株組1)中之菌株的異戊二婦比生產力。含有 FPP、OS或AS之菌株的異戊二烯比生產力高於不含FPP、 OS或AS之菌株。比較菌株組2)中之菌株的異戊二浠比生產力。含有 FPP、OS或AS之菌株的異戊二烯比生產力高於不含FPP、 OS或AS之菌株。實例14 :避免或減少碳進入硫胺素及吡哆醇途徑中以減輕 149048.doc -178- 201111512 抑制作用 1-去氧-D-木酮糖-5-磷酸（DXP)為大腸桿菌中三個基本同化途徑（亦即類異戊二烯、硫胺素及吡哆醛合成）中之受質。硫胺素或吡哆醛途徑之任何回饋調控作用均可能接著降低DXP途徑中製造類異戊二烯之通量，故為避免此作用，吾人構建硫胺素及/或吡哆醛途徑中發生突變之菌株。 A :構築硫胺素合成途徑缺失之大腸桿菌菌株數種酶與自DXP生物合成硫胺素有關。ThiG與ThiH組合形成含有鐵硫簇之複合物（Leonardi等人，F 539(1-3):95-9 (2003)，PMID: 12650933，其藉此以全文引用的方式併入）。ThiG與ThiH同時為合成4-曱基-5-(β-羥乙基）噻唑磷酸所需，此合成為硫胺素合成中之限速步驟 (Leonardi等人，J 5z.o/· C/zew. 279(17):17054-62 (2004)， PMID: 14757766 ; Vander等人，J. Bacteriol. 175(4):982-92 (1993)，PMID: 8432721 ;其藉此以全文引用的方式併入）。由於thiG處於限速步驟中，且為1-去氧-D-木酮糖-5-磷酸之後首選的酶，故選擇thiG作為待缺失之基因。使用引子 GB400thiGF(caggagccagaacgcaactgc(SEQ ID N0:100))及 GB400thiGR(CACTTTCGCCTGATGTTCACC (8£(^10>10:101))以及來自〖61〇保存中心之菌株1\¥5 549之基因組DNA獲得PCR產物（Baba等人，Mo/.办β/ο/. 2006.00 8 (2006)，其藉此以全文引用的方式併入）。PCR產物含有置換大多數thiG基因以及thiG基因兩側之約400 bp 149048.doc -179- 201111512 側接區的康黴素卡匣。接著藉由使用上述PCR產物進行Red/ΕΤ重組工程改造 (Gene Bridges，Dresden，Germany)來獲得 BL21(DE3) thiG::Kan突變體。藉由擴增及定序證實該突變體為正確的。該菌株稱為CMP179。 B:構築吡哆醛合成途徑缺失之大腸桿菌菌株 PdxJ催化1-去氧-D-木酮糖-5-磷酸及1-胺基-丙-2-酮-3-磷酸形成吡哆醇-5-填酸（吡哆醛-5-磷酸之前驅物，吡哆醛-5-磷酸繼而形成吡哆醛）。吡哆醇-5-磷酸係由一系列以赤藻糖-4-鱗酸（由D-赤藻糖4-碳酸去氫酶（epd)催化之第一者）起始之反應製得。因此，J與epc?均為用於避免製造吡哆搭之良好候選物。然而，已報導epd並非糖酵解或合成》比哆醛所需（Seta 等人，·/· 179(16):5218-21 (1997)，其藉此以全文引用的方式併入）。因此，選擇p心；《/作為突變標靶。

使用引子 GB400pdxJF(CAT TCA GTC TCT TGC AGG GGT C(SEQ ID (SEQIDNO:103))以及來自Keio保存中心之菌株JW2548之基因組DNA獲得PCR產物（Baba等人，2006)。PCR產物含有置換大多數pdxJ基因以及pdxJ基因兩側之約400 bp側接區的康黴素卡匣。接著藉由使用上述PCR產物進行Red/ET重組工程改造 (Gene Bridges, Dresden, Germany)來獲得 BL21(DE3) pdxJ::Kan突變體。藉由擴增及定序證實該突變體為正確 149048.doc •180· 201111512 的。該菌株稱為CMP180。 C :構築硫胺素及吡哆醛合成途徑缺失之大腸桿菌菌株藉由使用來自 Gene Bridges(Dresden，Germany)之質體 706-Flp進行Flp介導之切除而自€]\4?179及/或〇^卩180中移除康黴素卡匣。接著’使用章節A中所述之PCR產物，經由Red/ET重組工程改造使BL21(DE3) pdxJ突變。 D :在thiG及/或pdxJ突變體中經由DXP途徑製造異戊二烯在增強DXP途徑通量且表現來自銀白楊之IspS(異戊二烯合成酶）之不同構築體’諸如MCM597(BL21(DE3)pLysS pET24(MEA)alba-DXS-yIDI)或 MCM719(BL21 gil.6-yIDI gil.6-dxs，pTrc(MEA)alba)中評估 thiG、pdxJ 或 thiG pdxJ 突變對經由DXP途徑製造異戊二烯之影響。在30°C、200 RPM下，使菌株於HM1培養基（表2)+適當抗生素中生長隔夜。次曰早晨，將其再懸浮於〇D=0.2之新鮮HM1培養基+適當抗生素中。在3(TC、200 RPM下培育燒瓶，且有規律地取樣以供測定OD及異戊二烯生產力。表2 : HM1培養基組成化合物濃度(g/L) k2hpo4 13.6 kh2p〇4 13.6 MgS04-7H2〇 2 單水合檸檬酸 2 擰檬酸鐵銨 0.3 (NH4)2S〇4 3.2 痕量金屬溶液 1ml

當菌株 MCM597 或 MCM719含有 thiG、pdxJ 或 thiG pdxJ 149048.doc -18卜 201111512 突變時’比生產力（pg異戊二烯/〇D.h)增加。實例15 :平衡丙酮酸與G-3-P(甘油醛-3-填酸）以增加異戊一稀產量可藉由使DXP途徑所需之兩種前驅物丙酮酸與G_3_p(甘油醛-3-磷酸）之間的平衡達到最大而積極地影響通

向DXP 途徑之通量（通量增加）以增加異戊二烯產量。因此，調整決定通向糖酵解中、通向磷酸戊糖途徑（ppp)中及通向恩納-杜道夫（Entner-Doudoroff，ED)途徑中之通量之酶的表現里（圖68)。在章節B_D中，同時影響丙酮酸與G_3 p之通里。亦可藉由在獨立地升高或降低丙酮酸或G_3_p之作用下使通里重定向來達成Dxp途徑之兩種前驅物的最佳平衡。章節E展示共同表現甲羥戊酸途徑之此方法。另外提出，藉由選擇原料，例如補給葡萄糖+葡萄糖酸之混合物來達成所要通量平衡；#節A展示此方法。此等方法之組合可證實在達成前驅物平衡以及使異戊二稀產率最大化方面具有相加作用；此在章節F中加以測試。

章節A 用各種碳源補給已藉由習此相關技藝之人士已知且如此申請案中所例示之用以過度表現DXP途徑之程序構築之細胞、或野生型細胞’但更特定言之，肖葡萄糖+葡萄糖酸或單獨葡萄糖_給細胞。對培養物取樣，且分析異戊二烯;析出改良藉由在以不同濃度之碳源培養細胞期間用質"曰儀連續地或在特^時間點監測培養物之頂部空間氣體來完成此分析。 149048.doc 201111512

章節B 對章節A中具有過度表現之Dxp途徑之細胞、或野生型細胞進行遺傳工程改造以過度表現葡萄糖_6_磷酸去氫酶，從而使通向PPP及ED之通量重定向。可藉由量測異戊二烯比生產力來評估此等突變之作用及益處。

章節C 對章節A中具有過度表現之Dxp途徑之細胞、或野生型細胞進行遺傳工程改造以限制葡萄糖_6_磷酸異構酶之表現，從而使通向PPP及ED之通量重定向。可藉由量測異戊二烯比生產力來評估此等突變之作用及益處。

章節D 對章節A中具有過度表現之DXp途徑之細胞、或野生型細胞進行遺傳工程改造以限制葡萄糖酸_6_磷酸去氫酶之表現，從而限制通向磷酸戊糖之通量且使通向之通量達到最大。可藉由量測異戊二稀比生產力來評估此等突變之作用及益處。 jjt，々々τι

早即E 在此早即中，由以丙酮酸為唯一前驅物之甲羥戊酸途徑之表現量調整DXP前驅物㈣酸。構築細胞使其過度表現 DXP途徑酶以及甲經㈣途徑酶，且藉由選擇適當啟動子強度來調整這兩種途徑之表現，使得丙酮酸通量與dp 通量平衡且無前驅物積累於細胞中。類似地，在zwf、gnd 及Pgi突變存在下（單獨或以所有可能的組合存在），該等方法具有改良效能之潛力。 149048.doc •183- 201111512 Λ·Α* τ->

早即F 組合章節Β-Ε中所產生之菌株以分析潛在相加作用。測試得出，在DXP途徑過度表現之菌株中zwf與gnd之組合改良該菌株之效能。類似地，預期pgi與gnd之組合得到類似結果。實例16 :在含有PDH El E636Q次單位變異體之菌株中通過DXP途徑之碳通量得到改良此實例描述構築含有丙酮酸去氫酶E1次單位（PDH)變異體之大腸桿菌BL2 1菌株之方法，該等變異體增加通過DXP 途徑之碳通量。詳言之，此等菌株含有編碼具有E636Q點突變之PDH變異體的突變型aceE基因，該PDH變異體之丙酮酸轉化成乙醯基-CoA之活性降低（野生型PDH活性之 26%)。另外，據信PDH E63 6Q變異體具有類dxs活性，從而經由丙酮酸與甘油醛-3-磷酸之醇醛縮合而製造1 -去氧木酮糖-5-磷酸（DXP)。丙酮酸去氫酶El E636Q突變體之聚醛酶活性已由Nemeria 等人（】.3化1.(：1^〇1.，280(22)，21473-21482 (2005)，其藉此以全文引用的方式併入）報導。淨效應為相對於含有野生型PDH E1活性之菌株，通向DXP途徑中之碳通量增加，且通向乙醯基-Co A之碳通量減少。含有PDH El E636Q突變體之大腸桿菌BL21菌株之構築係如 Sauret-Giieto 等人（FEBS Lett.，580, 736-740 (2006)，其藉此以全文引用的方式併入本文中）所述。簡言之，藉由將含有氣黴素乙醯基轉移酶（CAT)之卡匣插入含有一或多個編碼異源甲羥戊酸途徑（MVA)之質體的大腸桿菌BL2 1 149048.doc -184- 201111512 菌株之dxs基因座中來破壞dxs基因之染色體複本。所得大腸桿菌BL21 MVA+(dxs::CAT)菌株需要曱羥戊酸以供正常生長。當在不存在曱羥戊酸之情況下培養菌株時，抑制突變aceE基因以低頻率至中等頻率出現，其補救來自以其他方式致死之dxs表型的存活純系。進行aceE基因及相關啟動子區之疋序以確認產生PDH E036Q突變體之誤義突變的存在。 φ 用源自大腸桿菌或源自如本文所述之異源來源之dxS基因的一或多個功能複本補充所得大腸桿菌BL21 dxs::CAT PDH El E636Q MVA+菌株。所得菌株相對於不具有pDH El E6 3 6Q變異體之菌株展現通向dxp途徑中之通量改良。另外，可用源自大腸桿菌或源自如本文所述之異源來源之DXP途徑基因、DXP途徑相關基因、鐵硫簇相互作用氧化還原基因（例如fldA或fpr)及/或IDI基因的一或多個功能複本進一步補充所得大腸桿菌BL21 dxs::CAT PDH E1 φ E636QMVA+菌株。亦可用編碼如本文所述之異戊二稀合成酶（例如來自銀白揚之IspS或其變異體）之基因的一或多個複本轉型該等菌株。與不具有PDH E636Q變異體之菌株相比，此等菌株經由DXP途徑與MVA途徑製造異戊二烯，其中相對於MVA途徑’較大比例之異戊二烯源自DXP途徑。使用熟習此項技術者已知之同位素標記技術測定DXP碳通量與MVA碳通量之比率。必要時’可視情況使用熟習此項技術者已知之技術用編 149048.doc -185· 201111512 碼MVA途徑之質體處理菌株（例如CHL18或任何其他MVA 途徑菌株，如美國專利申請案第61/097,186號、第 61/097,189號及第61/125,336號中所述，各文獻藉此以全文引用的方式併入）。實例17 : CRP突變增加通向DXP途徑之通量且增加異戊二烯產量某些碳源會降低敏感性操縱子的轉錄之分解代謝物抑制作用可主要限制DXP途徑中之通量，進而減少可製造之異戊二烯之量。 CRP(cAMP受體蛋白）缺失突變體可自Keio保存中心獲得且可易於評估經由DXP途徑製造異戊二烯。已研究該突變體之整體轉錄調控的影響（Perrenoud及Sauer，*/. Baci. 187:3171-3179 (2005)，其藉此以全文引用的方式併入）。其他類型之CRP突變體亦可對該過程有利。一個此類實例為 Eppler及 Boos(Eppler&Boos，Mo/.Mzcro6io/.33:122K 1231 (1999)，其藉此以全文引用的方式併入）所述之CRP突變體。CRP*為cAMP非依賴性CRP變異體。 A:構築製造異戊二烯之大腸桿菌Crp*突變體藉由在製造異戊二烯之菌株，諸如MCM597 (BL21(DE3)pLysS pET24(MEA)alba-DXS_yIDI)或 MCM719 (BL21 gil.6-yIDI gil.6-dxs，pTrc(MEA)alba)中進行P1 轉導 (自大腸桿菌菌株ET25(獲自W. Boos)製備之溶菌液）而引入 CRP*突變，以分別形成菌株CMP220及CMP221。 B :在大腸桿菌Crp*突變體中經由DXP途徑製造異戍 149048.doc -186 - 201111512 二烯在30°C、200 RPM下，使菌株CMP220與CMP221以及菌株MCM597與MCM719在HM1培養基（表3)+適當抗生素+ 10 g/L葡萄糖+ 1 g/L酵母提取物中生長隔夜。次日早晨，將其再懸浮於OD=0.2之新鮮HM1培養基+適當抗生素+5 g/L葡萄糖+1 g/L酵母提取物中。在30°C、200 RPM下培育燒瓶，且有規律地取樣以供測定OD60()及異戊二烯生產力。

表3 : HM1培養基組成化合物濃度(g/L) K2HP〇4 13.6 KH2P04 13.6 MgS04-7H2〇 2 單水合檸檬酸 2 檸檬酸鐵銨 0.3 (NH4)2S〇4 3.2 痕量金屬溶液 1 ml 菌株CMP220及與菌株MCM597或MCM719相比 CMP221之比生產力（pg異戊二稀/〇D.h)增加。 C :當大腸桿菌Crp*突變體於葡萄糖/木糖混合物上生長時，在該菌株中經由DXP途徑製造異戊二烯經預處理之生質樣品含有葡萄糖、木糖及乙酸鹽之混合物作為主要組分。在葡萄糖存在下通常阻止大腸桿菌消耗木糖。CRP*突變將有助於增強葡萄糖與木糖之共同消耗 (Cirino等人，biotech. Bioeng. 95:1167-1 176 (2006)其藉此以全文引用的方式併入）。在30°C、200 RPM下’使菌株cmp220與CMP221以及菌 149048.doc -187- 201111512 株MCM597與MCM719在HM1培養基（表3)+適當抗生素+10 g/L葡萄糖+ 1 g/L酵母提取物中生長隔夜。次日早晨，將其再懸浮於OD6Q()=0.2之新鮮HM1培養基+適當抗生素+2.5 g/L木糖及2.5 g/L葡萄糖+ 1 g/L酵母提取物中。在30°C、 200 RPM下培育燒瓶，且有規律地取樣以供測定OD6QG、異戊二烯生產力及碳水化合物濃度。藉由HPLC(離子排阻管柱 Aminex HPX-87H，300 mmx7.8 mm，0.005 M H2S04作為移動相，0.6 mL/min)測定碳水化合物濃度。儘管菌株MCM597及MCM719顯示二階段生長曲線，但在菌株CMP220及CMP221中木糖與葡萄糖之共同消耗有所增加。此使得醱酵在較短時間内完成。實例18 :在具有LytBG120D突變之大腸桿菌菌株中異戊二烯產量增加此概念之主要問題涉及突變型DXP途徑酶LytBG120D之生物化學測定以及LytBG 1 0D酶之預期功能是否可參與到標靶DXP途徑菌株之相關態樣中以用於生物異戊二烯製造。在此實例中，所要DXP途徑菌株欲經由二曱基烯丙基焦磷酸（DMAPP)分子製造大多數（若非全部，則儘可能接近全部）異戊二烯，該分子係直接源自（幻-4-羥基-3-曱基丁-2-烯基焦磷酸（HMBPP)之LytBG120D催化；與經由IDI 酶產生之DMAPP形成對比，該IDI酶使異戊烯基焦磷酸 (IPP)異構成 DMAPP。

已報導大腸桿菌之野生型LytB、及許多其他生物體（包括植物及藻類以及其他細菌）所共有之LytB酶製造DMAPP 149048.doc -188- 201111512 與IPP，兩者之比率通常在1:4至1:6(DMAPP:IPP)之範圍内。Kia-Joo Puan 等人（厂五召夕 Letters, 579:3802-3806 (2005)，其藉此以全文引用的方式併入）之工作提供了支持以下假設之活體内數據·· LytBG120D突變型酶可製造 DMAPP，但不能產生足量IPP來支持缺乏IDI之大腸桿菌的生存力。尚無支持所提出之LytBG120D活性的活體外數據引入此領域中。當前，類異戊二烯製造系統自IPP得到其大多數產物。若確定LytBG120D僅產生DMAPP或相對於IPP所產生之 DMAPP佔大多數，則在DXP途徑介導異戊二烯製造之菌株中使用/>^5(7720/)對偶基因可唯一產生幾乎完全源自 DMAPP之類異戊二烯產物。經由基於PCR之方法使用大腸桿菌MG 1655作為模板來產生，且將其選殖至表現載體（PET-I5b)中。為進行比較，將野生型選殖至相同pET-15b表現載體骨架中。一旦構築體之序列已得到驗證，即將各構築體移入 BL21(DE3)或相當的表現宿主中。自表現菌株製造LytB及 LytBG120D，隨後使用標準親和純化程序進行純化。在進行活性評估（方案存在於文獻中）以測定穩固的酶促功能之前，蛋白質可能需要在厭氧條件下重構。LytB為含4Fe-4S 簇之酶且已知對氧敏感。或者，LytB及LytBG120D可能能夠在自細胞溶菌液中純化之前直接進行檢驗，條件為在彼等條件下可支持各酶之足夠活性且可缺乏顯著Idi活性。測定各酶之表現且藉由凝膠電泳及/或免疫墨點法定量。活 149048.doc •189· 201111512 性檢驗描述於文獻中，但簡言之，可包括在包括受質 HMBPP之先前所述緩衝液中且在缺乏Idi活性之情況下培育各酶（經純化或含於細胞提取物中）。在規定時間之後’ 使用HPLC方法測定DMAPP與IPP之比率。所得數據為首次可為吾人所用之關於LytBG120D之活體外結果。若發現LytBG120D僅製造DMAPP ’或至少製造比1?1>多得多的DMAPP，則將/γβσυίλΟ對偶基因之使用併入DXP 途徑異戊二烯製造菌株中。最初，此係藉由在支持通過 DXP途徑至異戊二烯合成酶之碳通量的宿主背景中於異戊二烯製造期中相對於野生型對偶基因過度表現炒β 基因來達成。作為評估特定針對預期伴隨沙過度表現而相對於IPP產生較高DMAPP含量之任何益處的對照，亦構築並評估過度表現野生型沙⑺基因之類似菌株。此等菌株所產生之DMAPP及IPP、以及異戊二烯及其他下游類異戊二烯之量係由HPLC及/或GC-MS方法測定。吾人過去之發現指示，大腸桿菌對較高IPP含量之耐受性不佳。此外，吾人已觀察到，較高IPP含量伴隨Idi之顯著活性會導致合成較大下游類異戊二稀產物，該等產物亦使得生存力顯著下降。由於LytB所製造之ipp相對於 DMAPP佔大多數，且由於大腸桿菌之内源Idi活性極小，又由於DMAPP為異戊二烯合成酶之受質，故吾人當前之 DXP系統依賴於使用源自酵母之HI。在DXP製造菌株中使用LytBGl20消除了吾人當前之系統對酵母Idi之依賴性（條件為確定LytBG120D主要製造DMAPP)。亦預期LytBG120 149048.doc -190- 201111512 之使用會降低下游類里魅m 婦合成之水準，此係因為較大類異戊一知之主要:欠單㈣p無法大量獲得。實例19·改變宿主以減輕㈣途徑之内源調控在大夕數原核生物_製造#自里七__ 強力調控之途徑…二、戍-烯所需之—途徑為田然，DXP途徑為必需的，而且需要少因為其使來自中心代謝中間物甘油Μ·Ρ及丙酮酸之

碳分流。因此，當Dxp途徑與内源基因一起起作用時，里可能難以逃脫調控作用。此問題之解決方法可為使來自-種生物體之整個DXP途徑表現於另—種宿主生物體中，後-種生物體在系統發生树上為近親或遠親。此等宿主生物體包括(但不限於)工業用生物體’諸如大腸桿菌、螢光假單胞卿讀 //worewe似）、運動醱酵單胞菌（办切〇所⑽如、桿菌屬釀酒酵母、梭菌屬（c—謂^ )、麩胺酸棒狀桿菌則·cww)及釀酒酵母。自一種生物體選殖所有與途徑有關之基因的實情保證彼等基因所製造之酶可共同起作用以製造終產物DMAPP。 A.藉由選殖大腸桿菌Dxp基因來構築表現οχρ途徑之質體

將自質體pTrcHis2A(Invitrogen，Carlsbad，CA)進行PCR

擴增之Ptrc啟動子選殖至pBBR1_McS4質體（Kovach等人， Gene，166:175-176 (1995)，其藉此以全文引用的方式併入）中之多選殖位點處，留下啟動子下游之PstI位點。此質體稱為pBBR4Ptrc。使用在上游引子上含有Nsil位點及RBS 】49048.d〇c • 191 - 201111512 且在下游引子上含有PstI位點之引子，自大腸桿菌mg 1655 之基因組DNA擴增大腸桿菌基因yajP(dxs)、ispC(dxr)、 ispD、ispE、ispF、gcpE、lytB 及 idi。將該等基因依次添加至質體中。使用限制酶分解來檢查並選擇具有正確定向之純系。或者，在ispF之後引入終止子，且已在由gcpE、 lytB及idi構成之操縱子之前引入新啟動子（例如Ptrc)。由此產生之質體稱為 pBBR4PtrcDXPc及 pBBR4PtrcDXPc2。 B :藉由合成DNA之合成來構築進行密碼子最佳化之表現DXP途徑之質體類似於上文所述之合成操縱子經設計及定序，針對螢光假單胞菌進行.密碼子最佳化，來自GeneArt(Regensburg, Germany)。將該合成操縱子次選殖於質體pBBR4Ptrc中以產生質體 pBBR4PtrcDXPa。 C :大腸桿菌DXP途徑於螢光假單胞菌中之表現，及其對異戊二烯產量之影響將針對假單胞菌屬（參見其他假單胞菌屬專利實例）進行密碼子最佳化之ispS(來自楊屬之異戊二烯合成酶）基因選殖·至質體pHRP309(慶大黴素抗性）中（Parales及Harwood， Gene 133:23-30 (1993)，其藉此以全文引用的方式併入），且藉由雙親本交配轉型至螢光假單胞菌ATCC 13525中。藉由電穿孔將質體 pBBR4PtrcDXPc、PBBR4PtrcDXPc2 及 pBBR4PtrcDXPa轉型至大腸桿菌S17-1中，且在LB +康黴素 50 pg/ml上選擇轉型體。接著藉由雙親本交配將質體轉型至具有表現IspS之pHRP309之螢光假單胞菌中，且在M9培 149048.doc -192- 201111512 養基+ 16 mM擰檬酸鈉+康黴素50 pg/ml+慶大黴素50 gg/ml 上進行選擇，以分別形成菌株CMP222、CMP223及 CMP224。當使菌株CMP222、CMP223及CMP224於HM1培養基+ 10 g/L葡萄糖中生長時，異戊二烯比生產力高於不含表現 DXP途徑的質體之螢光假單胞菌菌株。實例20 ··鑑別影響經由DXP途徑製造異戊二烯之化合物使用具有一系列不同的碳、氮或磷酸來源之96孔微量滴定板來研究過度表現DXP途徑酶及異戊二烯合成酶之大腸桿菌菌株的異戊二烯產量及生長。令人驚訝的是，鑑別出許多以顯著程度積極地或消極地影響異戊二烯產量之化合物。積極地或消極地影響異戊二烯比生產力之化合物可幫助鑑別影響異戊二烯產量之代謝途徑。該等途徑可直接牽涉於異戊一烯製造中’或其可具有調控作用。可例如藉由遺傳修飾來修飾所鑑別之化合物或代謝途徑以使異戊二烯產量最佳化。亦可將所鑑別之碳、氮或磷酸來源直接補充至培養基中以增加異戊二烯產量。實驗程序： TM3培養基配方（每公升酸酵培養基）： K2HP04 13.6 g、KH2P04 13·ό g、單水合檸檬酸2 g、檸檬酸鐵銨0.3 g、（NH4)2S04 3.2 g、ΐ〇〇〇χ痕量金屬溶液J ml。將所有組分依序溶解於去離子水中。用氫氧化銨 (30〇/。）將pH值調整至6.8且補足體積。用〇22微米過濾器對培養基進行過濾滅菌。使用前，將2 g MgS〇4 7H2〇、〇 2 g 149048.doc -193- 201111512 酵母提取物添加至培養基中。必要時，添加碳源以使最終濃度達到0.5%。滅菌及調整pH值之後，添加所需抗生素。 1000X痕量金屬溶液（每公升醏酵培養基）：單水合檸檬酸 40 g、MnS04，H20 30 g、NaCl 10 g、 FeS04,7H20 1 g、CoC12 6H20 1 g、ZnS04 7H20 1 g、 CuS04.5H20 100 mg、H3B03 100 mg、NaMo04_2H20 100 mg。將各組分逐一溶解於去離子水中，用HCl/NaOH將pH 值調整至3.0,接著補足體積，且用0.22微米過濾器進行過遽滅菌。菌株： MCM597 (i)構築 MCM597(BL21(DE3) pLysS pet24(MEA)albadxsyIDI) 構築pDU-39 引子序列：

Alba TRC(MEA)-NdeI-F 5'-gaaactgaaaccCATATGgaagctcgtcgttctgc (SEQ ID NO: 104)

Alba FLTRC (-) TEV-R 5'-cccgcgcttaCTCGAGgcgttcaaacggcagaatcggttcagtg (SEQ ID NO: 105) 藉由使用引子組Alba TRC(MEA)-NdeI-F/Alba FLTRC(-) TER-R及模板pET24 alba HGS擴增基因來產生銀白楊異戊二烯合成酶之截短型式（描述於美國專利申請案第 12/335,071號之實例10中，該文獻藉此以全文引用的方式併入）。PCR反應設置如下： 1 μ1(ρΕΤ24&-銀白楊） 149048.doc •194· 201111512 5 μΐ l〇x PfuUltrall融合緩衝液 1 μΐ dNTP(10 mM) 1 μΐ引子（50 μΜ)第1組前置引子 1 μΐ引子（5 0 μΜ)第1組反置引子 41 μ丨去離子水 + 1 μΐ來自 Stratagene之II Fusion DNA聚合酶循環參數： φ 95乞 1 分鐘；[95〇C 30秒，55°C 20秒，72°c 25秒]X29次循環；72°C 3分鐘； 4°C 直至冷卻（Eppendorf Mastercycler) 根據製造商之說明書’用iVc/el-ATzoI限制性核酸内切酶 (Roche)分解PCR產物，且使用QiAquick凝膠萃取套組 (Qiagen)進行凝膠純化。使用T4接合酶（New England BioLabs)將3 μΐ經純化產物之等分試樣接合於先前已用 iW/el-XhoI分解、經凝膠純化且用蝦驗性鱗酸酶（SAP，鲁 Roche}處理之pET_24a載體{Invitrogen}。在16。〇下接合隔夜。將5 pL隔夜接合混合物之等分試樣轉型至TOP 1 〇細胞 (Invitrogen)中，且在37°C下於含有康徽素（50 pg/ml)之L瓊脂上選擇轉塑體隔夜。根據製造商之說明書，使用QiaQuick Spin套組（Qiagen) 自數個轉变體中分離質體。藉由限制性核酸内切酶分解驗證插入物’且用市售T7啟動子及T7終止子對純系進行定序（Quintara Bio Sequencing Service, Berkeley， 149048.doc -195- 201111512 CA)。正確質體命名為pDu-39(圖69)。構築MCM597 引子序列 MCM270 5'-GATCGGATCCATTCGCCCTTAGGAGGTAAA (SEQ ID NO: 106) MCM271 5'-GATCGCGGCCGCCAGCTGCAGGACGCGTTGTTATAGCATT (SEQ ID NO: 107) 藉由使用引子MCM270/MCM271及模板pMCM72進行 PCR來擴增DXS-yIDI基因（描述於美國專利申請案第 12/3 3 5,071號之實例7中，該文獻藉此以全文引用的方式併入）。根據製造商關於Herculase II Fusion(Stratagene)之方案，設置兩個相同PCR反應。35 μί水、10 pL緩衝液、 1.25 pL各引子、0.5 pL dNTP、1 μί聚合酶。反應如下循環：95°C 2:00 ； (95〇C 0:15，55〇C 0:15，72〇C 1：45)χ 30 ； 72°C 3:00 ; 4°C 直至冷卻。

用及iVoil(Roche)分解所得PCR片段，接著使用 Roche快速接合套組將其接合至已用相同限制性核酸内切酶分解之pDu39中。設置含有5 μί緩衝液1、1 μ!^載體、3 pL插入物及1 pL接合酶之10 μί接合反應物，且在室溫下培育1小時。將5 μί等分試樣轉型至大腸桿菌ToplO化學性勝任細胞（Invitrogen)中。在37°C下於含有康徽素（50 pg/ml)之L瓊脂上選擇轉型體隔夜。自數個轉型體中純化質體，且使用Herculase II Fusion(Stratagene)針對插入物之存在進行筛選。17.5 μι水、5 pL緩衝液、0.625 pL各引子、0.25 μι dNTP、0.5 μί聚合酶。反應如下循環：95°C 149048.doc •196· 201111512 2:00 ； (95〇C 0:15 > 52〇C 0:15 » 72〇C 0：45)x30 ； 72〇C 3:〇〇； 4 C直至冷卻。對具有接近1.5 kbp之PCR產物之純系進行定序（Quintara Biosciences，Berkeley CA)。正確質體命名為MCM596。接著將質體轉型至電穿孔勝任BL2l (DE3)pLysS細胞（lnvitrogen)中，且在含有康黴素（5〇 Kg/ml)及氯黴素（35 pg/mL)之L瓊脂上選擇轉型體。選擇_ 個群落且命名為MCM597。實驗方案自冷凍小瓶中獲取過度表現來自大腸桿菌之Dxp途徑酶办s及來自釀酒酵母之⑹及來自銀白楊之異戊二烯合成酶的大腸桿菌菌株]VICM597之接種體，且在LB培養液瓊脂板（含抗生素）上劃線培養，且在30°c下培育隔夜。將單一群落接種至含有葡萄糖作為唯一碳源之TM3培養基中，且在3 0 C下生長隔夜。藉由離心洗滌隔夜培養物，且將其再懸浮於不含葡萄糖或酵母提取物之新鮮TM3培養基中。接著將細菌稀釋至20 mL TM3培養基中以使600 nm下所量 /則之光學岔度達到〇〇5。為對不同氮源之作用進行實驗測試’使用Biolog PM3B微量滴定板（Bi〇i〇g，USA)，將細菌稀釋至含有0.5%葡萄糖且不含酵母提取物之培養基中。為對不同碳源之作用進行實驗測試，使用Bi〇i〇g pMl及 PM2A微量滴定板（Bi〇i〇g，USA)，將細菌稀釋至含有〇 2% 酵母提取物且不含或含有〇 5%葡萄糖之培養基中。將總共 120 培養物分配至Biolog板之各孔中，且在3〇它下於迴轉式震盪器（250 rpm)上培育該板。在實驗開始時且此後每 149048.doc •197- 201111512 ί、時’使用384孔微量滴定板讀取器（Molecular Devices, 3?6价3〇13\?1則3 84)在60〇11111下量測各孔中之光學密度，以追蹤細菌生長。發現bi〇l〇g板中無一化合物干擾6〇〇 nm 下之光學密度量測值。在生長四至六小時之後，再次量測光學密度’且兩次將50 μί培養物轉移至兩個96孔石英玻璃碑（Zinsser，Germany)上且用Biomek鋁箔膠帶蓋 (Beckman Coulter, USA)密封。在 3〇°C 下以 450 rpm震盪玻璃磚30分|里，接著在7〇C下熱處理12分鐘。使用GC-MS (GC 7889A^MSD 5975C ； Agilent Technologies, USA)t 測所製造之異戊二烯。鑒於玻璃磚與玻璃磚之間的差異，針對磚平均值對異戊二烯量測值進行校正。藉由用異戊二稀產量除以各孔之光學密度來計算異戊二烯比生產力。一式兩份進行各Biolog實驗。使用統計分析（司徒頓氏丁測試 (students T-test))鑑別微量滴定板中對異戊二烯比生產力具有統計顯著性（p<0.1)影響之化合物。結果影響異戊二稀產量之氮源：當具有DXP途徑及異戊二烯合成酶之大腸桿菌在缺乏酵母提取物之培養基中於作為唯一碳源之〇5%葡萄糖上生長時，發現許多含氮化合物積極地或消極地影響經由Dxp途徑製造異戊二烯。來自Biolog之PM3B板用於此等實驗。使用統計分析鑑別最顯著影響異戊二烯產量之化合物（表 4)。添加亞硝酸鹽、硝酸鹽、氨及尿素並未顯著改變異戊二烯比產量，表明醱酵培養基中之細菌並不直接缺乏氮。 149048.doc 198- 201111512 令人驚f牙的是’增加異戊二烯比產量之化合物包括L_麩胺酸、L-天冬胺酸、嘌呤肌苷及鳥苷、L_蘇胺酸、L_絲胺酸、L-色胺酸及L-天冬醯胺。特定言之，消極地影響異戊二烯比生產力之化合物包括腺嘌呤及L_甲硫胺酸及L_酪胺酸。一些此等化合物牽涉於嘌呤及硫胺素生物合成中，與 DXP途徑相關，且由此可在dxp途徑之調控方面起重要作用。在葡萄糖上生長期間影響異戊二烯產量之碳源：當具有DXP途徑及異戊二烯合成酶之大腸桿菌在含有 0_2%酵母提取物之醱酵培養基中於〇 5%葡萄糖上生長時，發現一系列碳源對經由DXP途徑之異戊二烯比生產力的影響達到令人驚訝的高程度。來自Bi〇i〇g之PM1及PM2A碳源板用於此等實驗。使用統計分析鑑別最顯著影響異戊二烯產量之化合物（表5)。最顯著增加異戊二烯比生產力之化合物包括（但不限於）苯乙胺、丙酸、D_半乳糖醛酸、肌苷、 L-半乳糖酸-γ-内酯、D_阿洛酮糖（D_psic〇se)、葡糖醛醯胺、2-胺基乙醇、D_纖維雙糖、蔗糖、黏液酸、L_蘋曱 S义L-苯丙胺酸、2,3-丁二醇、L-鳥胺酸、D_葡萄糖酸、 D-胺基葡萄糖酸、D-甘露糖。預期將此等化合物添加至葡萄糖補料醱酵中將增加異戊二烯之比生產力。發現一系列其他化合物消極地影響比生產力（表5)。此等作用可由該等化合物或相關代謝途徑之調控作用產生，從而使得此等途徑為遺傳修飾所關注。鑑別適用於製造異戊二烯之碳源： 149048.doc -199- 201111512 當具有DXP途徑及異戊二烯合成酶之大腸桿菌在含有一系列不同碳源之微量滴定板中於含有〇 2%酵母提取物之培養基中生長時，有可能鑑別導致以令人驚訝的高比生產力製造異戊二烯之碳源。來自Bi〇1〇g之1>]^1碳源板用於此等實驗。一系列導致極高異戊二烯比生產力之化合物展示於表6中。最顯著增加異戊二烯比生產力之化合物包括（但不限於）D-半乳糖醛酸、D_海藻糖、N_乙醯基_D_葡糖胺、〇_ 甘露糖醇、D-果糖、D-葡萄糖磷酸、α-D-葡萄糖。於不同化合物上生長之培養物之最終光學密度展示於表6 中。一些此等碳源可用於製造異戊二烯。表4 :影響大腸桿菌中經由Dxp途徑之異戊二烯比產量的氮源。僅展示對異戊二烯比產量具有統計顯著性（ρ<〇 ι)影響之化合物。已包括硝酸鹽、亞硝酸鹽、氨及尿素以說明添加一般氮源不會影響醱酵培養基中異戊二烯之比生產力 (標記為灰色）。化合物針對陰性對照進行校正之異戊二烯產量 P值(T測試） L-麩胺酸 2.13 0.003 Gly-Gln 1.80 0.008 Gly-Glu 1.48 0.008 Ala-Gin L 1.46 0.045 Ala-Glu 1.45 0.030 L-天冬胺酸 1.42 0.007 δ-胺棊-N-戊酸 1.40 0.012 肌苷 1.37 0.013 鳥苷 1.33 0.023 Gly-Asn 1.26 0.092 149048.doc •200· 201111512

L-蘇胺酸 1.22 0.022 乙醇胺 1.22 0.055 L-絲胺酸 1.21 0.059 L-色胺酸 1.21 0.071 Ala-Asp 1.20 0.056 L-天冬醯胺 1.16 0.023 确:酸鹽 1.08 0,360 亞硝酸鹽 J 1.06 0.110 .：： L01 0.837 陰性對照 1.00 1.000 尿素 f 0；99 0；919 D-丙胺酸 0.84 0.046 N-酞醯基-L-麩胺酸 0.81 0.021 N-乙醯基-D-甘露糖胺 0.81 0.091 組織胺 0.80 0.036 D-纈胺酸 0.80 0.061 酪胺 0.76 0.037 Ala-Thr 0.72 0.013 β-苯乙胺 0.70 0.028 L-酪胺酸 0.69 0.012 Gly-Met 0.61 0.011 D，L-ot-胺基-N-丁酸 0.60 0.012 羥胺 0.60 0.010 L-曱硫胺酸 0.56 0.003 Met-Ala 0.55 0.007 α-胺基-N-戍酸 0.52 0.004 腺嘌呤 0.22 0.000 表5 :影響大腸桿菌中在葡萄糖上生長期間經由DXP途徑之異戊二烯比產量的碳源。所有碳源皆針對僅補給葡萄糖之陰性對照進行校正。僅展示對異戊二烯比產量具有統計顯著性（p<0.1)影響之化合物。陰性對照標記為灰色。 149048.doc •20卜 201111512

化合物針對陰性對照進行校正之異戊二烯產量 P值(T測試）苯乙胺 1.74 0.014 丙酸 1.67 0.010 D-半乳糖醛酸 1.60 0.056 肌苷 1.60 0.015 L_半乳糖酸-γ-内酯 1.55 0.059 D-阿洛酮糖 1.53 0.055 葡糖醛醯胺 1.50 0.093 2-胺基乙醇 1.38 0.042 D-纖維雙糖 1.38 0.044 蔗糖 1.37 0.080 黏液酸 1.35 0.095 L-蘋甲酸 1.28 0.086 L-苯丙胺酸 1.23 0.004 2,3-丁二醇 1.22 0.044 L-鳥胺酸 1.21 0.010 D-葡萄糖酸 1.17 0.035 D-蘇胺酸 1.15 0.032 D-乳酸曱酯 1.15 0.011 硫酸軟骨素C 1.15 0.035 L-精胺酸 1.15 0.099 水楊苷 1.13 0.063 Μ-肌醇 1.13 0.033 D-胺棊葡萄糖酸 1.13 0.002 D-甘露糖 1.11 0.036 陰性對照 1.00 1.000 松二糖 0.94 0.042 β-D-阿洛糖 0.92 0.100 L-異白胺酸 0.90 0.040 景天庚醛聚糖 0.89 0.049 D-塔格糖 0.87 0.090 L-阿拉伯糖醇 0.85 0.090 D，L-蘋果酸 0.82 0.031 L-阿拉伯糖 0.82 0.090 a-曱基-D-糖苷 0.82 0.068 水蘇糖 0.82 0.033 149048.doc -202- 201111512 D-葡萄糖-6-磷酸 0.81 0.041 D-核糖 0.74 0.007 D-半乳糖 0.72 0.011 乳糖醇 0.70 0.031 β-曱基-D-半乳糖苷 0.70 0.011 β-曱基-D-木糖苷 0.68 0.085 α-曱基-D-半乳糖苷 0.62 0.062 2,3-丁酮 0.51 0.013 D-蜜二糖 0.49 0.001 D-棉子糖 0.45 0.001 4-羥基苯甲酸 0.41 0.005 山梨酸 0.40 0.052 癸酸 0.35 0.008 二羥基丙酮 0.22 0.002 2-去氧_D-核糖 0.20 0.002 2-羥基苯曱酸 0.18 0.000 己酸 0.18 0.001

表6 :在過度表現DXP途徑酶及異戊二烯合成酶之大腸桿菌中導致高異戊二烯比產量之碳源。異戊二烯比生產力係針對α-D-葡萄糖進行校正。培養物之最終光學密度（OD600) 亦展示於該表中，其指示特定礙源上大腸桿菌之生長。陰性對照未補給任何碳源且標記為灰色。化合物針對a-D-葡萄糖進行校正之異戊二烯產量生長OD600 D-半乳糠酸酸 1.36 0.217 D-海藻糖 1.31 0.243 N-乙醯基-D-葡糖胺 1.17 0.283 D-甘露糖醇 1.16 0.270 D-果糖 ^ 1.09 0.250 D-鉬萄糖-6-填酸 1.09 0.299 α-D-葡萄糖 1.00 0.279 D-葡萄糖酸 1.00 0.276 丙酮酸曱酯 0.99 0.213 -203 - 149048.doc 201111512 丙酮酸 0.95 0.211 肌苷 0.93 0.191 L-絲胺酸 0.92 0.213 D-絲胺酸 0.90 0.221 腺苷 0.88 0.187 L-麩胺酸 0.78 0.194 α-D-乳糖 0.75 0.198 胸苷 0.66 0.202 D-果糖-6-磷酸 0.66 0.172 黏液酸 0.62 0.167 2-去氧腺苦 0.57 0.160 甜醇 0.53 0.182 D-葡萄糖-1-磷酸 0.49 0.167 間羥基苯乙酸 0.48 0.170 丙酸 0.35 0.131 蔗糖 0.31 0.147 M-酒石酸 0.24 0.144 陰性對照 0.17 0.145 實例21 : 之表現增加改良異戊二烯產量在此實例中，吾人證實藉由提供額外之必需輔助因子 Fpr使得DXP途徑之GcpE及LytB酶之活性增強，Fpr已顯示積極地影響該等酶之活體外及活體内活性（Seemann，M.等人，Agnew. Chem. Int. Ed., 41: 4337-4339 (2002) ； Wolff, M.等人，Zeiiers，541: 115-120 (2003)，其藉此以全文引用的方式併入）。Fpr經由向GcpE及LytB提供源自 NADPH之必需電子以執行GcpE及LytB之催化功能（於以下報導中評述：L. A. Furgerson，TTie

Pathway to Isoprenoid Compounds: Discovery, Elucidation, Mec/zam’swi, 2006年 2 月 13日出版，其藉此以 149048.doc -204- 201111512 全文引用的方式併入）。在經工程改造之製造異戍二烯之大腸桿菌菌株中(編碼育素氧化還原蛋白/鐵氧化還原蛋白NADPH-氧化還原酶）之表現增加。吾人先前測試的DXp通量較高之菌株僅製造適置之異戊二烯，且觀測到積累大量cMEPP(2-C-甲基-D-赤藻糖醇_2,4_環二磷酸）與HMBPP((£)-4-羥基-3-曱基丁 -2-烯基二磷酸）。cMEpp及HMBpp DXp中間物分別為

GcpE及LytB之受質。Fpr之量增加可增加Dxp途徑酶GcpE 及LytB所顯示之活性，從而改良相關菌株中實現異戊二烯合成之碳通量，使之超過僅製造内源量之Fpr的相當bl2i (DE3)對照菌株之碳通量。通量改良由異戊二烯力價增加得到證實。由/pr編碼之黃素氧化還原蛋白/鐵氧化還原蛋θΝΑ〇ρΗ· 氧化還原酶欲以較高量自大腸桿菌染色體中表現，此係藉由在伽開放閱讀框架之前併入高活性之組成性〇ιι6_啟動子’同時置換内源啟動子序列而達成。或者，加可由多複本載體構築體異位表現。對於任—種方法，吾人之目標均在於以超過内源仰基因座所產生之量表現並積。吾人之初步qRT_PCR結果表⑽16加比内源基因座產生更多如轉錄物’且由於加訊息之量增加，將可能比對照積累更夕—一旦吾人收到針對FPr之抗體，即藉由免疫墨點法對此進行確認。伯主菌株’相二烯產量之影使用BL21(DE3)高DXP通量菌株作為親對於對照菌株評㈣人上調加基因座對裏 149048.doc •205- 201111512 響。另外，對DXP中間物進行之代謝物研究表明ρρΓ含量增加對GcpE及LytB活性具有有利影響。最初，構築以下BL21 (DE3 )測試菌株且相對於對照評估生長及異戊二稀產 Ϊ · BL21 (DE3) GI 1.6-心^ GI T7-MEARR alba/pBBRlMCS-5。比較此菌株與親本對照菌株（BL21 (DE3) GI lUxs T7-MEARR alba/pBBRlMCS-5) 之生長、異戊二浠產量及DXP代謝物積累。生長在30°C下使菌株於TM3液體培養基（136 g Κ2ρ〇4、136 g ΚΗ2Ρ〇4、2_0 g MgS04.7H20'2.0 g單水合檸檬酸、〇 3 g 擦檬酸鐵銨、3.2 g (NH4)2S04、0.2 g酵母提取物、i.〇 ml 1000X改質痕量金屬溶液，調整至pH 6.8且用H2〇補足，且經過滤滅菌）中生長，該培養基以〇·1%酵母提取物及1 〇〇/〇葡萄糖補充至最終濃度且包括適當抗生素。藉由記錄在 600 nm下使用 Eppend〇rf Bi〇ph〇t〇meter 光譜儀（Eppend〇rf) 所量測之培養物之各光學密度來週期性地監測生長。異戊二稀產量使用頂部空間檢驗分析異戊二烯產量。對於震盪燒瓶培養’將1 ml培養物自震盪燒瓶轉移至2〇 ml CTC頂部空間小瓶（Agilent小瓶目錄號5188 2753 ;帽目錄號5188 2759) 中將幅知緊，且在等效溫度 '以250 rpm震盪下培育小瓶。30分鐘後，自培育箱中移出小瓶且進行分析。使用與 CTC Analytics(Switzerland)c〇mbipAL 自動取樣器相接且以頂部空間模式操作之Agilent 6890 GC/MS系統進行分析。 149048.doc 201111512 使用 Agilent HP-5MS GC/MS 管柱（30 mx0.25 麵；〇 25 _ 膜厚度）分離分析物。設置取樣器以注射5〇〇叫頂部空間氣體。GC/MS方法利用氦作為載氣，流速為 1 ml/min。保持注射口在250。(：下，分流比為5〇:丨。歷經2分鐘之分析持續時間，保持烘箱溫度為37t。以爪^為67之單離子監測 (SIM)模式操作Agilent 5793N質量選擇偵測器。自14分鐘至1.7分鐘切斷偵測器以允許永久氣體溶離。在此等條件下，觀測到異戊二烯（2-曱基_丨，3_ 丁二烯）在178分鐘時溶離。使用校準表來定量異戊二烯之絕對量，且發現自i pg/L至200 pg/L呈線性。使用此方法估算偵測限度為5〇至 1 00 ng/L。各菌株之比生產力以gg/L 〇D h形式報導。在檢驗小瓶中歷經30分鐘培育，19〇〇 μ1頂部空間氣體：i〇〇 y 培養液之比率引起微克異戊二烯/公升培養物至比生產力之以下轉換：（由定之異戊二烯/公升）χ(38叭培養物之 OD 600 nm)。 DXP代謝物積累將分離製造異戊二烯之親本菌株及測試菌株之Dxp代謝物，且如下定量：代謝物萃取藉由將3.5 mL培養物抽取至填充有35 mL乾冰冷卻甲醇之管中而使細胞代謝快速失活。藉由離心使細胞碎片集結成粒，且將上清液負載至含有3〇 mg吸附劑之Strata_x_Aw 陰離子交換管柱（Phenomenex)上。將顆粒再萃取兩次，首先用3 ‘含5〇%甲醇之1 mM NH4HC03緩衝液（PH=7.0)萃 149048.doc -207- 201111512 取，接著用3 mL 75%甲醇/1 mM冊收〇3緩衝液（ρΗ=7·0) 萃取。每一次萃取後，藉由離心使細胞碎片集結成粒且將上清液連續負載至同一陰離子交換管柱上。在萃取及離 ’“步驟期間，保持樣品低於+41：。在代謝物溶離之前，用水及曱醇（各1 mL)洗滌陰離子交換管柱，且藉由添加〇 35 mL濃氨水/曱醇（ι:14，v/v)，接著添加〇 35 mL濃氨水/水/ 甲醇（1:2:12 ’ v/v/v)混合物來溶離分析物。用3〇冰醋酸中和溶離液’且藉由在微量離心機中離心而使之澄清。代謝物定量使用 Thermo Scientific TSQ Quantum Access 質譜儀 (Thermo Electron Corporation, San Jose，CA)分析代謝物。使用 XCalibur及LCQuan軟體（Thermo Electron Corp)進行所有系統控制、數據擷取及質譜數據評估。對於LC-ESI-MS/MS方法’以表7所示之移動相梯度（流動速率為0.4 mL/min)溶離配備有CC 8/4 Nucleodex β-ΟΗ保護筒之對掌性 Nucleodex β-ΟΗ 5 μΜ HPLC 管柱（1〇〇χ2 mm，Macherey-Nagel，Germany)。樣品注射體積為i〇 pL。表7.用於溶離代謝物之HPLC梯度時間，min 移動相，％ 0.0 0.0 0.5 15.0 4.5 37.5 6.5 37.5 149048.doc A B C (水）（100 mM碳酸氫鍵，（乙腈) pH=8.0) 20.0 80.0 5.0 80.0 12.5 50.0 12.5 50.0 -208 - 201111512 7.0 49.5 0.5 50.0 12.0 34.9 0.1 65.0 12.5 0.0 20.0 80.0 13.0 0.0 20.0 80.0 使用負離子模式之電喷霧電離進行質量偵測。選擇母離子之以下m/z值以SRM模式偵測相關代謝物：IPP及DMAPP 為 245.0，FPP 為 381.1，DXP 為 213.0，MEP 為 215.0， HDMAPP 為 260.0，及 cMEPP 為 277.0。基於 Ρ〇3·子離子 (m/z=79.0)所產生之峰的積分強度來測定代謝物濃度。藉由注射購自Echelon Biosciences Inc之相應標準物而獲得校準曲線。基於在〇D = 200之1 mL培養物中所有細胞之積分體積為50 pL之假設，計算細胞内代謝物濃度。實例22 :使用異源DXS改良通向DXP途徑中之碳通量活生物體經由以下兩種不同途徑合成類異戊二烯：曱羥戊酸（MVA)途徑與2-C-曱基-D-赤藻糖醇4-磷酸（MEP)途徑。MEP途徑始於1-去氧-D-木酮糖5-磷酸（DXP)，DXP係藉由丙酮酸與甘油醛-3-磷酸縮合而合成。此反應係由1 -去氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶（DXS)催化。在一些細菌（包括大腸桿菌）中’ DXP不僅用作類異戊二烯之前驅物，而且用於生物合成以下兩個重要辅因子：硫胺素（維生素B1)與磷酸°比哆醇（維生素B6)。在DXS層面上調控大腸桿菌中類異戊二烯之合成速率。此調控之機制之一可包含由MEP途徑下游之代謝物或/及維生素B 1/B6生物合成之中間物對DXS活性產生回饋抑制。因此’可藉由表現來自不同生物體的不受下游產物抑 149048.doc • 209- 201111512 制之酶來增加大腸桿菌中通向mep途徑中之總體通量。異源DXS亦可因為關於丙酮酸或甘油醛_3_磷酸之Km值較低或Kcat值較高而優於天然大腸桿菌dxs。較早研究已顯示，大腸桿菌DXS中之單一 Y392F取代使得活體外酶活性增強兩倍’不過尚未詳細研究經修飾之酶的催化特性。用於在大腸桿菌中異源表現之DXS之來源可基於以下考慮因素（見表8)進行選擇。第一，可選擇具有編碼若干办^ 同源基因之基因組的生物體。此等生物體包括具有兩個或兩個以上办j同源基因之植物（植物中Dxs之不同形式歸類春為DXS1及DXS2)及細菌（例如鏈黴菌屬）。第二，可選擇經由MEP(或DXP)途徑與MVA途徑合成類異戊二烯之細菌。第三，經由MVA途徑合成類異戊二烯，但基因組中含有办·^基因複本之細菌特定需要製造維生素輔因子。此組微生物之DXS序列之特徵在於對應於大腸桿菌Dxs序列之胺基酸203-242之環顯著較短（圖74)。在一組實驗中，將來自多種生物體（實例列於表8中）之 DXS引入過度表現植物異戊二稀合成酶及異戊稀基_二填· 酸δ-異構酶⑽)之大腸桿菌細胞中。（大腸桿菌中之取活性通常極低；因此，必需增強此酶之表現以使得異戊烯基-二磷酸有效轉化成二曱基稀丙基_二碟酸，即里戊二烯合成酶之受質。）測試所得菌株之異戊二稀產量及Dxp途徑中間物之積累’且與含有在與測試突變體相同之情形下表現之天然大腸桿菌DXS的對照菌株進行比較，立中該等中間物包括（但不限於）DXp、MEp、心（胞芽5,_二填酸基） 149048.doc •210· 201111512 2-C-甲基-D-赤藻糖醇、2_磷酸基_4_(胞苷5，_二磷酸基） C-曱基-D-赤藻糖醇、2_c_甲基_D-赤藻糖醇2,4_環二磷酸及1-經基·2·曱基_2_ 丁稀基4•二較。含有異源⑽之突變體中DXP中間物之濃度增加及/或異戊：烯析出之速率提高指示，來自特定生物體之酶在大腸桿菌中具有較高活性且不受積累之產物的回饋抑制。在另一組實驗中，將一組過度表現異源办$基因或來自 φ 大腸桿菌（對照）之办5的突變體引入含有植物異戊二烯合成酶、IDI及若干MVA途徑酶之背景大腸桿菌菌株中，以使彼菌株當於含有外源MVA之培養基中生長時合成過量類異戊二烯。測試此等菌株之特定針對DXP途徑之中間物的積累。如在先前狀況下，與對照相比Dxp中間物之濃度增加顯示，來自特定生物體之DXS在大腸桿菌中相比天然酶具有較高活性且不受異戊烯基-二磷酸及/或下游類異戊二烯產物之回饋抑制。為驗證特定突變體特定地歸因於經修飾鲁之DXS而具有改良之異戊二烯製造速率，在未經標記之 MVA存在下在於13c均勻標記之葡萄糖上生長之細胞中量測異戊二烯製造速率。在此狀況下，由質譜法分析之異戊一烯之13C組成明確指示’此化合物係經由dxp途徑自經標記之葡萄糖合成，而非自未經標記之外源MVA合成。在第三組實驗令，進行實驗以證實在大腸桿菌DXS之位置392處用酪胺酸取代苯丙胺酸使得通向dxp途徑中之通量率相比野生型酶較高。對於此實驗，在含有植物異戊二稀合成酶及IDI之大腸桿菌菌株中過度表現野生型DXS及 149048.doc •211 - 201111512 突變型DXS。比較兩個菌株之異戊二烯製造速率及DXp途徑中間物之積累。在具有經工程改造之酶之較佳特性的菌株中DXP中間物之濃度增加及/或異戊二烯析出之速率提高證實突變型酶之屬性較佳。表8.具有不同於大腸桿函之DXS動力學特性之生物體的實例原因 DXS為合成維生素輔因子所需；類異戊二烯係經由MVA途徑製造生物體黃色黏球菌(场xococcwsxa«认ws) DK 1622 弗斯特革蘭菌(Gramd/fl/cwe叫KT0803 約氏黃桿菌知ZwxsOwz’ae) UW101 約氏乳桿菌NCC 533 格氏乳桿菌 gimm) ATCC 33323 MVA途徑與DXP途徑均存在於此等生物體中生物體具有多個DXS複本乳酸乳球菌乳酸亞種(i^ciococa^ /ac沿 subsp. /flcto) 111403 單核球增多性李氏菌m(?/?c?cj^c?gene*y)EGD-e 植物乳桿菌p/tm 如 rwm) 灰色鏈黴菌如/wjws gr^o/as/wrew·?) MF730-N6 吸水鍵黴菌 CS/re；7icw少ces /y^rasw/ncws) NRRL 3418 渾球鍵黴菌(iSfrej^rowycey sp/ierfHVfes) NCIMB 11891 渾球鏈黴菌NCIMB 11891 灰色鏈黴菌MF730-N6 天藍色鏈黴菌灰色鏈黴菌MF730-N6 來自高等植物之1型及2型實例23 :鑑別增加通過DXP途徑之通量的基因組合、基因表現或突變產生具有高度基因型多樣性之細胞群體以鑑別增加通過 DXP途徑之通量的基因組合、基因表現或突變。在此實例中使用三種不同方法。第一，使用Multisite Gateway (Invitrogen)程序組裝大腸桿菌之内源基因或來自異源生物 149048.doc •212· 201111512 體之基因的組合，且將其引入大腸桿菌篩選菌株中。第二’產生來自大腸桿菌或異源生物體之基因組DNa之文庫，且將其引入大腸桿菌篩選菌株中。第三，引入因内部啟動子指向轉座元件之反向重複序列而可導致基因破壞或活化之轉座子。 A. 產生合成操縱子之Multisite gateway(Invitrogen)程序將大腸桿菌之内源基因或來自異源生物體之基因組裝成合成操縱子’隨後針對通過DXP途徑之通量增加及所得異戊二烯產量進行篩選。Multisite Gateway(Invitrogen)套組提供最多四個離散DNA「元件」，該等元件可一起組裝成一個操縱子。根據製造商之方案，將四個基因個別地選殖至pENTR載體中。舉例而言，藉由以適當⑽重組位點（根據製造商之方案）及可變RBS (參見Yarchuk等人，J My Biol·，226(3):5 81-596 (1992)，其藉此以全文引用的方式併入）進行PCR來擴增DXP途徑中之最後兩個基因&與 ’以產生各基因之表現量不同之質體池。將相同程序應用於電子載體基因與力^，且根據製造商之方案，將四個所付貝體池一起重組至Gateway目的載體（pDEST_ 14(Invitrogen)、PET54-DEST 或 pCOLA-2-DEST(Novagen)) 上。所得質體具有四個基因操縱子，其中各〇RF之表現量不同。接著藉由選擇抗生素抗性標記物（康黴素或胺苄青黴素）將彙集之目的載體引入大腸桿菌菌株中，且藉由Gc_ MS(下文所述）篩選所得池。 B. 產生基因組文庫 149048.doc -213 · 201111512 根據製造商推薦之方案’將大腸桿菌之内源基因組DNA 或來自異源生物體之基因組DNA選殖至pSMART LCKan載體（Lucigen)中（參見 Lynch 等人，Nat. Methods，4(1):87-93 (2007) ’其藉此以全文引用的方式併入）。使用來自大腸桿菌BL21及K12菌株、枯草桿菌、植物乳桿菌⑽ W'沙克乳桿菌（Z6 who、檸檬泛菌、天藍色鏈黴菌、渾球鏈黴菌0印心⑺“以）、單核球增多性李氏菌、根癌土壤桿菌、苜蓿根瘤菌及空腸曲桿菌（c 之DNA產生文庫。接著將尺寸為至多20 kb之基因組DNA 插入物引入大腸桿菌菌株中以供篩選。藉由引入抗生素抗性（康黴素）來選擇陽性轉型體，將其彙集且藉由^^^^進行篩選。 C·轉座子突變誘發與基因活化將因轉座元件中之内源啟動子而可藉由破壞〇RF使基因失活且亦驅動近端基因表現之轉座子引入大腸桿菌中以供篩選。藉由將組成性或誘導性啟動子插入EZ_Tn5轉座子構築载體（Epicentre)之MCS中來產生定製轉座子。内部啟動子之實例包括pT7、Ptrc、ptac、pbad、piac、pL(噬菌體 λ)、gi系列及Ptet。將此等啟動子選殖至轉座元件中，且將所得定製轉座子引人大腸桿菌中。藉由抗生素抗性來鑑別插入轉座子之菌株，將其彙集且藉由gc_ms進行篩選。大腸桿菌菌株與篩選將虞體池或轉座子引入不同大腸桿菌菌株中以供筛選。由位於質體上或轉座元件内之抗生素抗性標記物（通常為 J49048.doc 201111512

Kan或Amp)鑑別陽性轉型體。菌株包括：具有在T7啟動子控制下載運dxs、dxr、idi及IspS(異戊二烯合成酶）之質體的菌株；具有整合及組成性表現之dxs、dxr及idi與亦自質體整合或表現之ispS的菌株；在了7啟動子控制下表現整個 DXP操縱子之菌株；具有用於製造異戊二烯之途徑基

因之當前最佳構形的任何菌株，然而其仍然展現Dxp途徑代謝物（例如HDMAPP)的明顯積累。彙集個別轉型體（每個池有100至1000個個體之組），且在96孔玻璃碑中經由GC_ MS進行篩選。使用與5973 MsLeapcTCCombiPAL自動取樣器相接且以頂部空間模式操作之Agi】ent 689〇 gc/ms* 統進行分析（2虹及96孔板方法）。使用¥咖抓5(5%苯基甲基矽氧烷(15 mx〇.25 mmx〇.25 μΜ))管柱分離分析物。設置取樣器以注射1〇〇卟頂部空間氣體。⑽⑽方法利用氦作為載氣，流速為1 ml/min。保持注射口在25〇。〇下，分流比為50:卜歷經2分鐘之分析持續時間，保持供箱溫度為37 C °以質量為67之單離子監測（SIM)模式操作a扣⑽ _質量選擇偵測器。將债測器自〇〇〇分鐘切換至分鐘以允許永久氣體在〇·44分鐘至㈣分鐘溶離。在此等條件下，觀測到異戊二稀（^基^丁二⑴在…分鐘時溶離。㈣校準表來定量異戊二稀之絕對量，且發現自〇至_呈線性（使用校準氣體）。接著再檢驗陽性池以確認對異戍二浠產量之任何積極影響。鑑別展現異戊一細產量增加之菌株或池中之個別質體或構築體以確定對DXP途徑通量之積極影響的確切性質。 149048.doc •215- 201111512 所檢查生物體之基因檢査包括（但不限於）以下生物體之基因：擬南芥、玉蜀黍（Zea 、空腸曲桿菌 {Campylobacter jejuni) ' 苜稽根瘤菌 me/z7oiz·)、幽門螺旋桿菌（//e"co&acier p/oW)、根癌土壌桿菌tumefaciens) '耐輻射奇異球菌 (Z)ei«ococcwi ra山·〇ί/Μ"α«·5)、枯草桿菌、棒樣泛菌、單核球增多性李氏菌、乳桿菌屬及鏈黴菌屬。材料

Multisite Gateway 套組（Invitrogen)

Lucigen(Clonesmart選殖套組）-文庫構築 EZ-Tn5系統（Epicentre)-基因破壞/活化質體 pET-PT7驅動之完整DXP途徑質體

pET-PT7驅動之 dxs、dxr、idi、ispS pET-用於製造異戊二烯之DXP途徑基因之最佳構形

pBBR-PT7 或 Ptrc ispS pET-54-DEST、pCOLA-DEST載體（Novagen) pDEST14、pDEST15(Invitrogen) 實例24 :藉由在CMP272内過度表現臺灣溫泉菌BP-1之 GcpE、LytB、PetF及PetH而增加REMG39中之異戊二稀產量此實例進一步證實，藉由在CMP272(源自BL21之宿主）内過度表現臺灣溫泉菌BP-1之GcpE、LytB、PetF及PetH而 149048.doc -216- 201111512 增加REMG39中之異戊二烯產量。如下文所述及所示，與酵母⑹·之表現增加均會增加大腸桿菌中通過内源DXP途徑之通量。此領域中之先前工作（參見，例如Chao等人，則oiec/^0/ /^〇尽_，18(2):394-400 (2QQ2)反 Zhang 毒人 ’ pr〇tein Expression and Purification, 29(1): 132-139 (2003年5月））已得出結論：基於T7之表現系統不穩定且當經受1 4 L醱酵條件時其行為不能完全預測。 φ 構築CMP271及後續CMP272菌株以：（1)替代表現源於染色體的酵母Wz·當前由T7控管之基於質體之表現，從而允許使用非基於丁 7之表現菌株進行DXP介導之異戊二稀製造；及/或（2)引入具有下游MVA途徑酶及酵母IDI之基因的經基因組編碼之基因座以提供足量酵母，使得通向異戊二烯合成酶之通量最大。藉由經電穿孔添加具有銀白楊異戊二烯合成酶對偶基因之PDW33將CMP271菌株製成產生異戊二烯之菌株，隨後 φ 得到菌株CMP272。 CMP2 7 2菌株充當基線宿主’其中已糟由添加臺灣溫泉菌IspG(GcpE)及IspH(LytB)編碼基因以及其假定還原穿梭系統（PetF及PetH)而成功改良異戊二稀產量。具有臺灣溫泉菌基因Ptac-gcpE-lytB-petF-petH/pKl 84之構築體已描述於下文利用臺灣溫泉菌之實例中。評估親本CMP272及測試菌株REMG39在下文所述之14-L醱酵條件下的生長、異戊二烯產量、代謝物概況及基於碳之產物產率《結果描繪於圖77中。 149048.doc •217· 201111512 A.構築菌株 CMP271、CMP272及 REMG39 根據製造商之說明書，使用來自Gene Bridges GmbH之 Red/ET系統進行此實例中所述之GI 1 _X啟動子插人及後續抗生素抗性標記物環出。使用菌株BL21(Novagene)。如先前所述進行P1溶菌液之製備與轉導（Thomason等人， 2007) ° 引子 MQ09-10F- 5' ggttaatcatttcactcttcaattatctataatgatgagtgatcagaattacatgtgagaaattaattaaccctcac taaagggcggccgcgaa

MQ09-10R 5' atattccaccagctatttgttagtgaataaaagtggttgaattatttgctcaggatgtggcatNgtcaagggctaatacgactcacta tagggctcgagg *在GI1.6之狀況下，上述引子序列中N=T。 MQ09-11F-

5' gcccttgacNatgccacatcctgagcaaataattcaaccacttttattcactaacaaatagctggtggaatata tgactgccgacaacaatagtatgccc *在GI1.6之狀況下，上述引子序列中N=A。 MQ09-11R- 5' gatgcgtccagtaaaataagcattacgttatgctcataaccccggcaaatgtcggggttttttatagcattctatgaatttg 頂部 Gb's CMP 5' ACTGAAACGTTTTCATCGCTC MQ09-12R- 5' gatgcgtccagtaaaataagcattacgttatgctc galMR 5' gtcaggctggaatactcttcg galMF 5' gacgctttcgccaagtcagg 使用Gene Bridges GmbH方法將GI1 .X-yidi系列插入大腸 149048.doc -218- 201111512 桿菌沾基因座中之策略說明於圖77中。藉由使用引子組 MQ09-10F/MQ09-10R進行PCR來擴増含抗生素抗性卡匣 GB-CMP之片段（片段A)。藉由使用引子組Mq〇9 i 1F/ MQ09 -11R進行PCR來擴增含Gll.X-yidi之片段（片段b)。最後’使用引子 MQ09-10F及 MQ09 -11R產生 GB-CMP-GI1 .X-yidi片段。MQ09-10F及MQ09-11R引子各含有至少5〇個與大腸桿菌ζ·Α·基因座同源之鹼基，其允許在pRed_ET質體存在下在PCR產物電穿孔之後於特定位點處進行重組。擴增 GB-CMP-GIl.X-yidi片段 GB-CmR(片段A)之PCR反應 2 μ1(100 ng GB-CmR) 10 μΐ Herculasell緩衝液 0.5 μΐ dNTP(100 mM)

1.25 μΐ 引子（10 pM)MQ09-10F

1.25 μΐ 引子（10 pM)MQ09-10R 2 μΐ DMSO 32 μΐ去離子水 + 1 μΐ來自 Stratagene之 GB-CmR(片段Β)之PCR反應 2 μ1(100 ng GB-CmR) 10 μΐ Herculasell緩衝液 0.5 μΐ dNTP(100 mM)

1.25 μΐ 引子（10 #M)MQ09-11F

1.25 μΐ 引子（10 pM)MQ09-llR 149048.doc -219- 201111512 2 μΐ DMSO 32 μΐ去離子水 + 1 μΐ來自 Stratagene之//ercw/ase/Z/whon GB-CmR(片段A+B)之PCR反應 1 μΐ(片段A) 1 μΐ(片段B) 10 μΐ Herculasell缓衝液 0.5 μΐ dNTP(100 mM)

1.25 μΐ 引子（10 pM)MQ09-10F

1.25 μΐ 引子（10 pM)MQ09-llR

2 μΐ DMSO 32 μΐ去離子水 +1 μΐ來自 Stratagene之循環參數：

片段A

(95〇C 2分鐘；95°C 20秒，55°C 20秒，72°C 1 分鐘，29X ; 72°C 3分鐘；4°C直至冷卻，使用 EppendorfMastercycler) 片段B

(95。。2分鐘；95〇C 20秒，55°C 20秒，72。。35秒，29X ; 72°C 3分鐘；4°C 直至冷卻，使用 EppendorfMastercycler) 片段A+B (95〇C 2分鐘；95〇C 20秒，55。。20秒，72〇C 1.2分鐘， 29X ; 72°C 3分鐘；4°C直至冷卻，使用Eppendorf

Mastercycler) 149048.doc -220· 201111512 在1.2% E-gel(Invitrogen)上分離所得PCR片段（片段A、B 及A+B)以驗證成功擴增，且根據製造商之說明書使用 QIAquick PCR純化套組進行純化。使用片段A及片段B之經純化儲備物進行上文所述之片段A+B PCR反應。片段 A+B之所得經純化儲備物稱作GB-CMP-GI1 .X-yidi。擴增CMP263之galM基因座將CMP263之一個群落攪拌加入30 μί H20中，接著加熱 $ 至95°C，持續5分鐘。對所得溶液進行短暫離心以使碎片集結成粒，且使用2 pL上清液在以下PCR反應中作為模板：於H20中之2 μΐ群落（見上文） 5 μΐ 緩衝液 1 μΐ dNTP(100 mM) 1 μΐ galMF 引子（10 μΜ) 1 μΐ galMR引子（10 μΜ) • 39.5 μΐ Η20 + 0.5 μΐ來自 Stratagene之 Herculase 聚合酶循環參數： 95°C><2 分鐘；[95。〇30秒，52。。><30 秒，72。(： ><60 秒]><30 次循環；72°C><7分鐘；4°C直至冷卻（來自ThermoHybaid之 PCRExpress溫度循環器）。使用DNA分子量X(Roche)作為標準梯（ladder)，在0.8% E-gel(Invitrogen)上測定所得PCR片段之尺寸；如關於陰性對照所預期，自BL21細胞未獲得相應PCR產物。 149048.doc -221 - 201111512 將 GB-CMP GI l.X-yidi PCR 產物整合至 BL21/pRed-ET 菌株中使用BIO RAD Gene Pulser系統及製造商（BIO RAD)建議之轉型方案，藉由電穿孔將pRed-ET載體（Gene Bridges套組）轉型至 BL21 中，得到菌株 MD08-114(BL21/pRed-ET)。將約400 pg經純化之GB-CMP GI l.X-yidi PCR片段電穿孔至MD08-114中。在L培養液中回收轉型體，接著塗於含有氣黴素（5 pg/ml)之L瓊脂上》藉由使用頂部Gb’s CMP及 MQ09-12R引子進行PCR來分析氯黴素抗性群落中所要基因座處GB-CMP GI l.X-yidi序列的存在。使用MQ09-12R 及頂部GB’s CMP引子（Quintara ; Albany，CA)對來自許多轉型體之PCR片段進行定序，且鑑別多個相關GI 1 .X-jz·山· 菌株。選擇一個具有GI1.6-yidi基因座之氣黴素抗性純系 (BL21 FRT-CmR-FRT GI1.6(A)->>W)且命名為 MD09-211。 B.產生CMP271菌株之策略經由P 1介導之轉導作用將實例9中所述之菌株MCM625 之GI1.6-dxs::kan基因座引入MD09-211中，且所得康徽素與氣黴素抗性菌株稱為MD09-221。根據製造商之說明書 (GeneBridges)，使用來自pRed-ET套組之pCP20，使菌株 MD09-221之抗生素抗性標記物環出。經由氯黴素（5 pg/ml)及康黴素（50 pg/ml)之抗性損失來驗證相關轉型體；選擇一個氣黴素與康黴素敏感性純系且命名為MCM710。藉由P1介導之轉導作用，將美國申請案第61/289,959號中所述之菌株MCM521的FRT-Neo-FRT PL.2 mKKDyl基因座 149048.doc -222 - 201111512 (具有酵母基因之另一複本）移入MCM710中。選擇一個康黴素抗性純系且命名為MCM783。用大腸桿菌K-12 MG1655之P1溶菌液轉導MCM783，且在M9培養基 (Na2HP04 6 g/L ' KH2P04 3 g/L ' NaCl 0.5 g/L ' NH4C1 0.5 g/L、0.1 mM CaCU、2 mM MgS〇4)+0.4% w/v半乳糖上進行選擇。選擇一個利用半乳糖之純系且命名為CMP263。藉由使用引子組galMF/galMR進行PCR來驗證MG1655之 17,257 bp内ga/M基因座的存在，該ga/M基因座對BL21而言並非内源性，但現為CMP263所具有；此PCR反應描述於上文。使用Gene Bridges GmbH方法使菌株CMP263内之康黴素抗性標記物環出。選擇一個康黴素敏感性純系且命名為 CMP271。 C.產生CMP272菌株之策略使用 BIO RAD Gene Pulser 系統（0.1 cm 電擊管（cuvette)，目錄號165-2089)及製造商（BIO RAD)建議之轉型方案，將 pDW33電穿孔至菌株CMP271中。載體構築體具有編碼異戊二烯合成酶之截短形式的PTrc控管之MEARR銀白楊對偶基因。用於構築pDW33之模板EWL230已描述於美國公開案第 2009/0203 102 號及 WO 2009/076676 中。pDW33 載體圖譜之圖呈現於圖78中。構築pDW33 構築pDW33以在Ptrc啟動子控制下產生具有銀白楊異戊二烯合成酶之截短型式（MEA變異體）的製造異戊二烯之大腸桿菌菌株。 149048.doc -223 - 201111512 構築菌株DW194 : 藉由基於模板EWL230(aka pTrc-銀白楊）進行Quikchange PCR突變誘發（Stratagene-參見下文關於引子序列之表格）來構築具有截短的銀白楊異戊二烯合成酶（IspS)之質體。 PCR反應及循環參數描述於下文。藉由凝膠電泳（E-gel， Invitrogen)使PCR產物顯現，接著在37°C下用1 μΐ Dpnl限制性核酸内切酶（Roche)處理3小時。接著使用微透析膜 (MilliP〇re)脫除10 μΐ PCR產物之鹽，且使用標準分子生物學技術將其轉型至電穿孔勝任大腸桿菌菌株MCM531(先前所述）中。在30°C下於1 ml LB培養基中回收細胞1.5小時，將其塗於含有50 pg/ml羧苄青黴素及5 mM甲羥戊酸之LB 固體瓊脂板上，接著在37°C下培育隔夜《次曰，選擇陽性群落（菌株DW1 94之群落，見下文）進行生長及質體純化 (Qiagen)，且最後藉由用下文所列之引子進行DNA定序 (Quintara)加以確認。最終質體P〇W33載運編碼IspS之截短型式（MEA)的開放閱讀框架。引子： QCEWL244MEAF QC EWL244MEAR EL-1006 EL-1000 A-rev A-rev—2 QB1493 MCM66(aka pTrc反置引子) gaggaataaaccatggaagctcgtcgttct agaacgacgagcttccatggtttattcctc gacagcttatcatcgactgcacg gcactgtctttccgtctgctgc ctcgtacaggctcaggatag ttacgtcccaacgctcaact cttcggcaacgcatggaaat ccaggcaaattctgttttatcag -224- 149048.doc 201111512 菌株：菌株背景質體抗性基因型 DW194 MCM531 pDW33 Carb BL21(Novagen)PL.2mKKDyI，+pTrc-銀白楊 (MEA)

QuikChangePCR 反應： 1 μΐ 質體 EWL230(aka pTrc-銀白揚） 5 μΐ l〇x PfuUltra HF緩衝液 1 μΐ dNTP(100 mM)

1 μ1(50 pM)QC EWL244 MEA F

1 μ1(50 pM)QC EWL244 MEA R

2 μΐ DMSO 39 μΐ去離子水 1 μΐ PfuUltra HF 聚合酶（Stratagene) PCR循環參數： 1. 95°C 1 分鐘 2. 95°C 30秒 3. 55°C 1 分鐘 4. 68°C 6分鐘 5. 進入第2步-18次循環

6. 4°C 截短的銀白楊IspS (MEA)之序列 mearrsanyepnswdydyllssdtdesievykdkakkleaevrreinnekaefltllelidnvqrlglgyrfesdirgaldrfvs sggfdavtktslhgtalsfrllrqhgfevsqeafsgfkdqngnflenlkedikailslyeasflalegenildeakvfaishlkelse ekigkelaeqvnhalelplhrrtqrleavwsieayrkkedanqvllelaildynmiqsvyqrdlretsrwwrrvglatklhfar drliesfywavgvafepqysdcrnsvakmfsfvtiiddiydvygtldelelftdaverwdvnaindlpdymklcflalyntin eiaydnlkdkgenilpyltkawadlcnaflqeakwlynkstptfddyfgnawksssgplqlvfayfavvqnikkeeienlqk • 225 - 149048.doc 201111512 yhdtisrpshifrlcndlasasaeiargetansvscymrtkgiseelatesvmnlidetwkkmnkeklggslfakpfvetainl arqshctyhngdahtspdeltrkrvlsvitepilpfer pDW33之序列： gtttgacagcttatcatcgactgcacggtgcaccaatgcttctggcgtcaggcagccatcggaagctgtggtatggctgtgcagg tcgtaaatcactgcataattcgtgtcgctcaaggcgcactcccgttctggataatgttttttgcgccgacatcataacggttctggca aatattctgaaatgagctgttgacaattaatcatccggctcgtataatgtgtggaattgtgagcggataacaatttcacacaggaaac agcgccgctgagaaaaagcgaagcggcactgctctttaacaatttatcagacaatctgtgtgggcactcgaccggaattatcgat taactttattattaaaaattaaagaggtatatattaatgtatcgattaaataaggaggaataaaccatggaagctcgtcgttctgcgaa ctacgaacctaacagctgggactatgattacctgctgtcctccgacacggacgagtccatcgaagtatacaaagacaaagcgaa aaagctggaagccgaagttcgtcgcgagattaataacgaaaaagcagaatttctgaccctgctggaactgattgacaacgtcca gcgcctgggcctgggttaccgtttcgagtctgatatccgtggtgcgctggatcgcttcgtttcctccggcggcttcgatgcggtaa ccaagacttccctgcacggtacggcactgtctttccgtctgctgcgtcaacacggttttgaggtttctcaggaagcgttcagcggct tcaaagaccaaaacggcaacttcctggagaacctgaaggaagatatcaaagctatcctgagcctgtacgaggccagcttcctgg ctctggaaggcgaaaacatcctggacgaggcgaaggttttcgcaatctctcatctgaaagaactgtctgaagaaaagatcggtaa agagctggcagaacaggtgaaccatgcactggaactgccactgcatcgccgtactcagcgtctggaagcagtatggtctatcga ggcctaccgtaaaaaggaggacgcgaatcaggttctgctggagctggcaattctggattacaacatgatccagtctgtataccag cgtgatctgcgtgaaacgtcccgttggtggcgtcgtgtgggtctggcgaccaaactgcactttgctcgtgaccgcctgattgaga gcttctactgggccgtgggtgtagcattcgaaccgcaatactccgactgccgtaactccgtcgcaaaaatgttttctttcgtaaccat tatcgacgatatctacgatgtatacggcaccctggacgaactggagctgtttactgatgcagttgagcgttgggacgtaaacgcc atcaacgacctgccggattacatgaaactgtgctttctggctctgtataacactattaacgaaatcgcctacgacaacctgaaagat aaaggtgagaacatcctgccgtatctgaccaaagcctgggctgacctgtgcaacgctttcctgcaagaagccaagtggctgtac aacaaatctactccgacctttgacgactacttcggcaacgcatggaaatcctcttctggcccgctgcaactggtgttcgcttacttc gctgtcgtgcagaacattaaaaaggaagagatcgaaaacctgcaaaaataccatgacaccatctctcgtccttcccatatcttccg tctgtgcaatgacctggctagcgcgtctgcggaaattgcgcgtggtgaaaccgcaaatagcgtttcttgttacatgcgcactaaag gtatctccgaagaactggctaccgaaagcgtgatgaatctgatcgatgaaacctggaaaaagatgaacaaggaaaaactgggt ggtagcctgttcgcgaaaccgttcgtggaaaccgcgatcaacctggcacgtcaatctcactgcacttatcataacggcgacgcg catacctctccggatgagctgacccgcaaacgcgttctgtctgtaatcactgaaccgattctgccgtttgaacgctaactgcagct ggtaccatatgggaattcgaagctttctagaacaaaaactcatctcagaagaggatctgaatagcgccgtcgaccatcatcatcat catcattgagtttaaacggtctccagcttggctgttttggcggatgagagaagattttcagcctgatacagattaaatcagaacgca gaagcggtctgataaaacagaatttgcctggcggcagtagcgcggtggtcccacctgaccccatgccgaactcagaagtgaaa cgccgtagcgccgatggtagtgtggggtctccccatgcgagagtagggaactgccaggcatcaaataaaacgaaaggctcag tcgaaagactgggcctttcgttttatctgttgtttgtcggtgaacgctctcctgagtaggacaaatccgccgggagcggatttgaac gttgcgaagcaacggcccggagggtggcgggcaggacgcccgccataaactgccaggcatcaaattaagcagaaggccatc ctgacggatggcctttttgcgtttctacaaactctttttgtttatttttctaaatacattcaaatatgtatccgctcatgagacaataaccct gataaatgcttcaataatattgaaaaaggaagagtatgagtattcaacatttccgtgtcgcccttattcccttttttgcggcattttgcct tcctgtttttgctcacccagaaacgctggtgaaagtaaaagatgctgaagatcagttgggtgcacgagtgggttacatcgaactgg atctcaacagcggtaagatccttgagagttttcgccccgaagaacgttttccaatgatgagcacttttaaagttctgctatgtggcgc ggtattatcccgtgttgacgccgggcaagagcaactcggtcgccgcatacactattctcagaatgacttggttgagtactcaccag •226 -

149048.doc 201111512 tcacagaaaagcatcttacggatggcatgacagtaagagaattatgcagtgctgccataaccatgagtgataacactgcggcca acttacttctgacaacgatcggaggaccgaaggagctaaccgcttttttgcacaacatgggggatcatgtaactcgccttgatcgtt gggaaccggagctgaatgaagccataccaaacgacgagcgtgacaccacgatgcctgtagcaatggcaacaacgttgcgca aactattaactggcgaactacttactctagcttcccggcaacaattaatagactggatggaggcggataaagttgcaggaccactt ctgcgctcggcccttccggctggctggtttattgctgataaatctggagccggtgagcgtgggtctcgcggtatcattgcagcact ggggccagatggtaagccctcccgtatcgtagttatctacacgacggggagtcaggcaactatggatgaacgaaatagacaga tcgctgegataggtgcctcactgattaagcattggtaactgtcagaccaagtttactcatatatactttagattgatttaaaacttcattt ttaatttaaaaggatctaggtgaagatcctttttgataatctcatgaccaaaatcccttaacgtgagttttcgttecactgagcgtcaga ccccgtagaaaagatcaaaggatcttcttgagatcctttttttctgcgcgtaatctgctgcttgcaaacaaaaaaaccaccgctacc agcggtggtttgtttgccggatcaagagctaccaactctttttccgiiaggtaactggcttcagcagagcgcagataccaaatactg tcettetagtgtagccgtagttaggccaccacttcaagaactctgtagcaccgcctacatacctcgctctgctaatcctgttaccagt ggctgctgccagtggcgataagtcgtgtcttaccgggttggactcaagacgatagttaccggataaggcgcagcggtcgggct

gaacggggggttcgtgcacacagcccagcttggagcgaacgacctacaccgaactgagatacctacagcgtgagctatgaga aagcgccacgcttcccgaagggagaaaggcggacaggtatccggtaagcggcagggtcggaacaggagagcgcacgagg gagcttccagggggaaacgcctggtatctttatagtcctgtcgggtttcgccacctctgacttgagcgtcgatttttgtgatgctcgt caggggggcggagcctatggaaaaacgccagcaacgcggcctttttacggttcctggccttttgctggccttttgctcacatgttc tttcctgcgttatcccctgattctgtggataaccgtattaccgcctttgagtgagctgataccgctcgccgcagccgaacgaccgag cgcagcgagtcagtgagcgaggaagcggaagagcgcctgatgcggtattttctccttacgcatctgtgcggtatttcacaccgc atatggtgcactctcagtacaatctgctctgatgccgcatagttaagccagtatacactccgctatcgctacgtgactgggtcatgg ctgcgccccgacacccgccaacacccgctgacgcgccctgacgggcttgtctgctcccggcatccgcttacagacaagctgtg accgtctcegggagctgcatgtgtcagaggttttcaccgtcatcaccgaaacgcgcgaggcagcagatcaattcgcgcgcgaa ggcgaagcggcatgcatttacgttgacaccatcgaatggtgcaaaacctttcgcggtatggcatgatagcgcccggaagagagt caattcagggtggtgaatgtgaaaccagtaacgttatacgatgtcgcagagtatgccggtgtctcttatcagaccgtttcccgcgtg gtgaaccaggccagccacgtttctgcgaaaacgcgggaaaaagtggaagcggcgatggcggagctgaattacattcccaacc gcgtggcacaacaactggcgggcaaacagtcgttgctgattggcgttgccacctccagtctggccctgcacgcgccgtcgcaa attgtcgcggcgattaaatctcgcgccgatcaactgggtgccagcgtggtggtgtcgatggtagaacgaagcggcgtcgaagc ctgtaaagcggcggtgcacaatcttctcgcgcaacgcgtcagtgggctgatcattaactatccgctggatgaccaggatgccatt gctgtggaagctgcctgcactaatgttccggcgttatttcttgatgtctctgaccagacacccatcaacagtattattttctcccatga agacggtacgcgactgggcgtggagcatctggtcgcattgggtcaccagcaaatcgcgctgttagcgggcccattaagttctgt ctcggcgcgtctgcgtctggctggctggcataaatatctcactcgcaatcaaattcagccgatagcggaacgggaaggcgactg gagtgccatgtccggttttcaacaaaccatgcaaatgctgaatgagggcatcgttcccactgcgatgctggttgccaacgatcag atggcgctgggcgcaatgcgcgccattaccgagtccgggctgcgcgttggtgcggatatctcggtagtgggatacgacgatac cgaagacagctcatgttatatcccgccgtcaaccaccatcaaacaggattttcgcctgctggggcaaaccagcgtggaccgctt gctgcaactctctcagggccaggcggtgaagggcaatcagctgttgcccgtctcactggtgaaaagaaaaaccaccctggcgc ccaatacgcaaaccgcctctccccgcgcgttggccgattcattaatgcagctggcacgacaggtttcccgactggaaagcggg cagtgagcgcaacgcaattaatgtgagttagcgcgaattgatctg 將pDW33轉型至CMP271中藉由經電穿孔將pDW33質體轉型至CMP271中來完成此 149048.doc - 227- 201111512 步驟以構建製造異戊二烯之菌株CMP272。在L培養液中回收轉型體且塗於含有叛苄青黴素（50 pg/ml)之Li复脂上。所得菌株命名為CMP272。 D. 產生REMG39菌株之策略使用BIO RAD Gene Pulser系統（0.1 cm電擊管，目錄號 165_2〇89)及製造商（BIO RAD)建議之轉型方案，將Ptac-gcpE-lytB-petF-petH/pK184 電穿孔至菌株 CMP272 中。Ptac-gcpE-lytB-petF-petH/pK184之質體製劑由 Gene Oracle，Inc. 提供。Ptac-gcpE-lytB-petF-petH/pK184 已描述於下文（參見，例如實例11)。為構建REMG39測試菌株，藉由電穿孔將Ptac-gcpE-lytB-petF-petH/pK184轉型至CMP272中。在L培養液中回收轉型體且塗於含有羧苄青黴素（50 pg/ml)及康黴素（50 pg/ml)之L瓊脂上。所得菌株命名為REMG39。 E. 比較CMP272與REMG39在14-L醱酵期間之生長、異戊二烯產量、DXP代謝物概況及基於碳之產物產率在14-L醱酵條件下比較親本菌株CMP272與測試菌株 REMG39。臺灣溫泉菌IspG(GcpE)及IspH(LytB)活性在大腸桿菌之異戊二烯產量及通過其他方面内源之DXP途徑之總體通量方面的益處分別說明於圖79及圖80A-B中。臺灣溫泉菌基因之表現改良異戊二烯產量，使之為親本菌株 CMP272之異戊二烯產量的約2.7倍。儘管在初始10小時期間觀測到REM G39菌株中cMEPP之量較高，但在稍後段醱 149048.doc -228- 201111512 酵期間REMG39菌株與親本菌株相比積累較少量之cmepp 中間物’此觀測結果與在後指數生長與最大Cer生長期間比生產力增加相關聯（見圖3B-D)。 F.菌株CMP272之大規模撥酵由在1 5 L規模下於批式補料培養物中生長之表現來自 DXP途徑及異戊二烯合成酶之基因的大腸桿菌製造異戊二稀。培養基配方（每公升醱酵培養基）： K2HP04 7.5 g、MgS04.7H20 2 g、單水合檸檬酸2 g、擰榡酸鐵銨0.3 g、酵母提取物5 g、丨〇〇〇χ改質痕量金屬溶液 1 ml。所有組分一起添加且溶解於去離子水中。對此溶液進行熱滅菌（123 C下持續20分鐘）。用氫氧化銨（28%)將pji 值調整至7.0且補足體積。滅菌及調整pH值之後，添加i 〇 g葡萄糖、8 mL汞維生素溶液、及抗生素。 1000X改質痕量金屬溶液（每公升）：單水合檸檬酸 40 g、MnS04.H20 30 g、NaCl 10 g、 FeS04.7H20 1 g、CoC12.6H20 1 g、ZnS04.7H20 1 g、 CuS04.5H20 100 mg、H3B〇3 100 mg、NaMo04.2H20 100 mg。將各組分逐一溶解於去離子水中，用HC1/Na〇HWpH 值調整至3.0，接著補足溶液體積，且用〇 22微米過濾器進行過渡滅菌。汞維生素溶液（每公升）：鹽酸硫胺素1.0 g、D-(+)-生物素1.0 g、菸鹼酸丨〇 g、D_ 泛酸4.8 g、鹽酸吡哆醇4.0 g。將各組分逐一溶解於去離子 149048.doc -229- 201111512 水中，用HCl/NaOH將PH值調整至3.0，接著補足溶液體積’且用〇 · 2 2微米過據器進行過渡滅菌。補料溶液（每公斤）：葡萄糖0.57 kg、去離子水0.38 kg、K2HP〇4 7.5 g及 100% Poamblast 10 g ^將所有組分混合在一起且進行高壓滅菌°溶液已冷卻至25。(：之後，添加6.7 mL汞維生素溶液。在15 L生物反應器中，以過度表現dXp途徑中之第一個酶（GI1.6-dxs)、DXP途徑中之最後一個酶（GI1.6y-IDI)、下游MVA途徑（PL.2-mKKDyI)及來自銀白楊（pDW33)之截短的異戊二烯合成酶且含有源自MG1655(菌株名稱CMP272) 之經恢復之17,257 bp含ga/M染色體區域的大腸桿菌BL21 細胞進行醱酵。進行此實驗以監測在醱酵所要之pH 7 〇及溫度34。〇：下自葡萄糖形成異戊二烯之情況。解凍大腸桿菌菌株之冷凍小瓶，且接種至生物反應器之胰蛋白腺-酵母提取物培養基中。接種體生長至550 nm下所量測之光學密度（OE^g)為1.〇之後，使用5〇〇 mL接種體接種15 [生物反應器且使初始槽體積達到5 L。以指數速率補給補料溶液，直至最高補料速率達到4_8 g/min為止。此後’以小於或等於48 g/min之速率補給葡萄糖補料以滿足代謝要求。在45小時醱酵期間傳遞至生物反應器之葡萄糖的總量為5.6 kg。藉由添加異丙基十七] 硫代哌喃半乳糖普（IPTG)達成誘導。當細胞之〇〇為8時，_ 添加單份IPTG至槽中以使濃度達到2〇〇 μΜ。使用Hiden質譜儀測定生物反應器之釋出氣體中之異戊 149048.doc •230- 201111512 二烯含量。異戊二烯力價隨著醱酵過程而增加，在45小時之時達到0.97 g/L之最大值。 s十算異戊一烯力價之等式：丨(瞬時異戊二烯製造速率， g/L/h)dt(t=0-45小時）[=]g/L培養液

計算比生產力水準之等式：（mg異戊二婦心異戍二稀^/ [(OD550txL 培養液 t-〇D55〇t()XL 培養液 “)/(2 7 〇DxL/g 細胞）]/(t-t〇) [=] mg異戊二烯/g細胞/h G.菌株REMG39之大規模酸酵由在15 L規模下於批式補料培養物中生長之表現來自 DXP途徑及異戊二烯合成酶之基因的大腸桿菌製造異戊二稀。培養基配方（每公升醱酵培養基）： K2HP〇4 7_5 g、MgS04.7H20 2 g、單水合擰檬酸2 g、檸檬酸鐵銨0.3 g、酵母提取物〇.5 g、1〇〇〇乂改質痕量金屬溶液1 ml。所有組分一起添加且溶解於去離子水中。對此溶液進行熱滅菌（123°C下持續20分鐘）。用氫氧化銨（28%)將 pH值調整至7_0且補足體積。滅菌及調整pH值之後，添加 10 g葡萄糖、8 mL汞維生素溶液、及抗生素。 1000X改質痕量金屬溶液（每公升）：单水合擇檬酸 4〇 g、MnS〇4.H2() 3() g、Na(：丨 1Q ^、

FeS04 7H20 1 g . CoC12-6H20 l g . ZnS04-7H20 1 g ' CuS04-5H20 100 mg. h3B〇3 1〇〇 NaM〇〇4.2H2〇 1〇〇 mg。將各組分逐一溶解於去離子水中，用將值凋1至3.0，接著補足溶液體積，且用〇 22微米過濾器進 149048.doc -231 - 201111512 行過滤·滅菌。汞維生素溶液（每公升）：鹽酸硫胺素1 ·〇 g、D-( + )-生物素1.0 g、於驗酸1 ·〇 g、D-泛酸4.8 g、鹽酸吡哆醇4.〇 g。將各組分逐一溶解於去離子水中，用HCl/NaOH將pH值調整至3.0，接著補足溶液體積’且用0.22微米過濾器進行過濾滅菌。補料溶液（每公斤）：葡萄糖0.57 kg、去離子水 0.38 kg、K2HP〇4 7.5 g及 1〇〇〇/0 Foamblast 1 〇 g。將所有組分混合在一起且進行高壓滅菌。溶液已冷卻至25°C之後，添加3.4 mL Macro鹽溶液、 0.8 ml 1000X改質痕量金屬溶液及6 7 mL汞維生素溶液。 Macro鹽溶液（每公升）：

MgS0v7H20 296 g、單水合檸檬酸296 g、檸檬酸鐵銨 49.6 g。將所有組分溶解於水中’補足體積且用〇 22微米過濾器進行過濾滅菌。在15 L生物反應器中，以過度表現dxp途徑中之第一個酶（GIl_6-dxs)、DXP途徑中之最後一個酶（GI1.6-ylDI)、下游MVA途徑（PL.2-mKKDyI)、來自臺灣溫泉菌（Ptac_gcpE-lytB-petF-petH/pK184)之DXP途徑之多種其他基因及來自銀白楊（pDW33)之截短的異戊二烯合成酶且含有源自 MG1655(菌株名稱REMG39)之經恢復之17,257 bp含染色體區域的大腸桿菌B L 21細胞進行醋酵。進行此實驗以監測在醱酵所要之pH 7.0及溫度34。(：下自葡萄糖形成異戊二烯之情況。解凍大腸桿菌菌株之冷凍小瓶，且接種至生物 149048.doc -232- 201111512 反應器之胰蛋白腺-酵母提取物培養基中。接種體生長至 550 nm下所量測之光學密度（〇〇55〇)為1〇之後，使用 mL接種體接種15 L生物反應器且使初始槽體積達到$ l。以指數速率補給補料溶液，直至最高補料速率達到4 8 g/mm為止。此後，以小於或等於4 8 g/min之速率補給葡萄糖補料以滿足代謝要求。在56小時酿酵期間傳遞至生物反應器之葡萄糖的總量為7.0 kg。藉由添加異丙基ΙΑ」— • 硫代哌喃半乳糖苷（IPTG)達成誘導。當細胞之〇〇為5時，添加單份IPTG至槽中以使濃度達到3〇〇 μΜ。在％小時操作時間之後，週期性地抽出整個培養液（包括細胞塊）以防止生物反應器溢流。使用Hiden質譜儀測定生物反應器之釋出氣體中之異戊二烯含量。異戊二烯力價隨著醱酵過程而增加，在56小時之時達到2.7 g/L之最大值，計算異戊二烯力價之等式：丨(瞬時異戊二烯製造速率’ φ g/L/h)dt(t=0-56小時）[=]g/L培養液计算比生產力水準之等式：（mg異戊二烯广11^異戊二烯jZ [(OD550txL 培養液 t_OD550t〇xL 培養液 t〇)/(2 7 〇DxL/_ 胞）]/ (t-t〇) [=] mg異戊二烯/g細胞/h 實例25 : DXP代謝物測定 A.代謝物萃取：處理14 L醱酵槽樣品藉由將數毫升酸酵槽培養物抽取至填充有9 〇 mL乾冰冷卻曱醇之預稱重管中而使細胞代謝快速失活。再次稱重所知樣品以計算所抽取之細胞培養物之量，接著置於_ 8 〇 149048.doc •233 · 201111512 下儲存直至進一步分析。為萃取代謝物，藉由在-9°C下以 450〇xg離心4分鐘對500 pL經曱醇淬滅之醱酵樣品進行短暫離心。接著將顆粒再萃取兩次，首先用350 pL以5 mM 乙酸銨水溶液（pH=7.0)緩衝之85%曱醇萃取，接著用350 pL含5 0%曱醇之乙酸敍緩衝液萃取。每一次萃取後，藉由離心使細胞碎片集結成粒，且將全部三份上清液彙集在一起以供進一步分析。代謝物定量藉由在Quantum三重四極桿質譜儀（Thermo Electron Corporation, San Jose, CA)上進行 LC-ESI-MS/MS來分析所萃取之代謝物。使用XCalibur及LCQuan軟體（Thermo Electron Corp)進行系統控制、數據擷取及質譜數據評估。在0.4 mL/min之流動速率及40°C之管柱溫度下，於Synergi 45 μΜ Hydro-RP HPLC管柱（15〇x2 mm，Phenomenex，USA) 上進行LC分離。LC梯度為i=0 min，12% B ; i=5 min， 12% B i t=9 min » 23% B ； t=20 min 5 99% B ； t=23 min > 99% B ; i=24 min，12% B ; i=29 min，12% B，其中溶劑 A 為1 0 mM三丁胺/1 5 mM乙酸之水溶液且溶劑B為LCMS級曱醇。樣品注射體積為1 0 pL。使用負離子模式之電喷霧電離進行質量偵測。選擇母離子之以下m/z值以SRM模式偵測相關代謝物：DXP為 213.0，MEP 為 215.0，IPP及 DMAPP 為 245.0，HDMAPP 為 260.0，及 cMEPP 為 277.0，FPP 為 381.1，CDP-ME 為 520.1，CDP-MEP 為 600.0。基於 Ρ03·子離子（m/z=79.0)所產 149048.doc -234- 201111512 生之峰的積分強度，使用藉由注射相應標準物（Echelon Bi〇sciences Inc)而獲得之校準曲線來測定代謝物濃度。由於商用標準不可用，故CDP — MEP之濃度以任意單位表示。基於在OD=200之1 mL培養物中所有細胞之積分體積為5〇 μί之標準假設，計算細胞内代謝物濃度。實例26 : IspG活性增強之結果此貫例證實當在不存在FldA表現增加之情況下出現IspG 活性增強時，其可對異戊二烯產量不利。使用14 L REMG39所獲得之數據指示，儘管REMG39中之異戊二烯產量增加’但該菌株仍因IspG活性而受限；此係由以下表明：在醱酵大半過程中rEMG39菌株維持約19 mM之cMEPP含量（見圖80B)。一種改良ispG活性之方式為增加其表現，如菌株REM E7一12中所觀測（圖85B)。然而’與親本菌株CMP272相比，增加測試菌株REM E7_12 中IspG之活性證實對異戊二烯產量不利（圖9A)。增加自 CMP272菌株背景產生之IspG活性的替代方法為增加/7cU表現（測試菌株REM C9_12 ;圖85B)。在小規模下IspG活性與内源IspH活性增強以及CMP272背景之異戊二烯產量改良所確定之最大益處在於共同過度表現刀丄4與測試菌株REM D6 —12 ;圖 85)。 A·構築測試菌株 REM C9_12、REM D6_12及 REM E7—12 使用標準分子生物學技術構築GI1.6 fldA/pCL、GI1.6 fldA-ispG/pCL及 GI1.6 ispG/pCL(Sambrook等人，1989)。 pCL1920(pCL)選殖載體已描述於公開案中，參見，例如 149048.doc -235 - 201111512 'LerneT，C.G.專尺，Nucleic Acids Research，第 \名卷·· 4631(1990)。圖82-84描繪所得質體構築體。CMP272菌株用於下文所述之轉型。使用來自菌株REM 16_4之染色體DNA作為PCR模板來產生具有GI1.6 fldA之PCR片段，該片段用於產生GI1.6 fldA/pCL。菌株REM 16_4之產生描述於下文。使用最終源自DXP操縱子pET24a質體（參見，例如實例11)之DNA作為 PCR模板來產生具有ispG之PCR片段與具有GI1.6 ispG之 PCR片段，該等片段分別用於產生GI1.6 fldA-ispG/pCL及 GI1.6 ispG/pCL。所利用之DXP操縱子pET24a質體及GI1.6 gcpE-lytB-yidi pCR Blunt II TOPO 載體 PCR 模板先前已有所描述（參見，例如實例11)。 B.產生 REMI6_4，GI1.6fldA/pCL之前驅物根據製造商之說明書，使用來自Gene Bridges GmbH之 Red/ET系統進行此實例中所述之GI 1 _X啟動子插人及後續抗生素抗性標記物環出。使用菌株BL21(DE3) (Invitrogen)。BIO RAD Gene Pulser 系統（0.1 cm電擊管，目錄號165-2089)及製造商（BIO RAD)建議之轉型方案用於所述電穿孔。引子 fldA confirm-F 51 tgattccgcaagactgcctgt fldA confirm-R 51 ttcggtattaccggtgtcgct fldA cmpGILX-F 5' ctatgattgc ctttatccgt gggcaatttt ccacccccat aattaaccctcactaaagggcggccgc 149048.doc -236* 201111512 fldA cmpGIl.X-R 5' aagatgccagtgatagccatgagtgaaataacctcttgaa ggttacctccgggaaacgcggttgatttgtttagtggttgaattatttgctcaggatgtggcatngtcaagggcgtgacggctcgc taatacgactcactatagggctcgag *在GI1.6 fldA之狀況下，上述引子序列中N=T。頂部 Gb's CMP 5’ actgaaacgttttcatcgctc 底部 Pgb2 5' ggtttagttcctcaccttgtc

使用Gene Bridges GmbH方法在内源編碼區上游引入之GI1.X啟動子說明於圖81中。藉由使用引子組fldA cmpGIl.X-F/fldA cmpGIl.X-R進行PCR來擴增抗生素抗性卡匣GB-CMP。該等引子含有40個與編碼區之5'緊接之區域同源的鹼基以允許在pRed-ET質體存在下在PCR產物電穿孔之後於特定基因座處進行重組。在翻轉酶（Flipase) 介導抗生素標記物切除之後所殘留之FRT「疤痕（scar)」序列亦描繪於圖中。擴增GB-CmpR-fldA片段為擴增GB-CmpR卡匣以緊接//心基因座上游插入GI 1.X 啟動子，設置以下PCR反應： 1 μΐ模板（100 ng GB-CmpR) 10 μΐ 緩衝液 0.5 μΐ dNTP(100 mM)

1.25 μΐ引子（10 pM)fldA cmpGIl.X-F 1.25 μΐ引子（10 pM)fldA cmpGIl.X-R 35 μΐ去離子水 + 1 μΐ來自 Stratagene之/fercM/aseiT/Msion 149048.doc -237- 201111512 循環參數： 95°〇2 分鐘；（95°〇30 秒，63°〇30 秒，72°〇2 分鐘）χ29 次循環；72°C><5分鐘； 4°C直至冷卻（Biometra T3000 Combi溫度循環器）

在0.8% E-gel(Invitrogen)上分離所得PCR片段以驗證成功擴增，且根據製造商之說明書使用QIAquick PCR純化套組（Qiagen)進行純化。所得儲備物為GB-CmpR-GI l.X-fldA 片段。將 GB-CmpR-GI l.X-fldA PCR產物整合至BL21(DE3)/pRed- ET菌株中藉由電穿孔將pRed-ET載體（Gene Bridges套組）轉型至 BL21(DE3)中，得到菌株 DW30(BL21(DE3)/pRed-ET)。將經純化之GB-CmpR-GI l.X-fldA PCR片段電穿孔至DW30 中。在L培養液中回收轉型體，接著塗於含有氣黴素（10 pg/ml)之L瓊脂上。藉由使用引子fldA confirm-F、fldA confirm-R、頂部GB's CMP及底部Pgb2進行PCR來分析氣黴素抗性群落中GB-CmpR卡匣及GI l.X啟動子的存在。使用 fldA confirm-R 及頂部 GB's CMP 弓| 子（Sequetech ; Mountain View，CA)對來自許多轉型體之PCR片段進行定序，且鑑別多個相關GI 1 .Χ-//βΜ菌株。氯黴素抗性菌株 BL21(DE3) CMP::GI1.6/7cL4命名為 REM 16、4。 C.產生REMC9_12之策略使用BIO RAD Gene Pulser系統（0.1 cm電擊管，目錄號 165-2089)及製造商（BIO RAD)建議之轉型方案，將GI1.6 149048.doc •238· 201111512 fldA/pCL電穿孔至CMP272中。使用編碼GI1.6 //ί/Ζ之菌株 REM 16_4之細胞作為PCR模板以供構築載體。引子序列 5' Sail GI1.X-5' cgag gtcgac gcgagccgtcacgcccttgac 3' NruI/SacII fldA stop-V 5' gctc tcgcga gage ccgcgg tcaggcattgagaatttcgtcgag Ml3 (-20) 5' GTAAAACGACGGCCAGT M13反置引子 5' CAGGAAACAGCTATGAC 擴增Gil.6 fldA片段為擴增GI1.6 fldA片段以將Gn.6/7^片段插入pCL中，設置以下PCR反應： 1 μΐ模板（約1 μΐ體積之16_4細胞） 10 μΐ 缓衝液 0.5 μΐ dNTP(100 mM)

1.25 μΐ 引子（10 μΜ)5’ Sail GI1.X 1·25 μΐ 引子（10 μΜ)3' NruI/SacII fldA stop 35 μΐ去離子水 +1 μΐ來自 Stratagene之循環參數： 95°〇2 分鐘；[95°〇30 秒，60°〇30 秒，72°〇3 分鐘]χ29 次循環；72t：x5分鐘； 4°C直至冷卻（Biometra T3000 Combi溫度循環器）在1.2% E-gel(Invitrogen)上分離所得PCR片段以驗證成功擴增，且根據製造商之說明書使用QIAquick PCR純化套組進行純化。所得儲備物為GI 1.6-fldA片段。 149048.doc -239- 201111512 將GI1.6 fldA片段選殖至pCL中根據製造商之說明書用Sa/RRoche)分解約600 ng GI1.6 fldA片段’且根據製造商之說明書用[及分解約200 ng PCL質體。隨後組合分解物，且使用Qiagen QiaQuick凝膠萃取套組進行清潔》根據製造商建議之方案’使用來自New England Biolabs之T4 DNA接合酶接合約一半經清潔之切斷DNA。使用標準熱休克方案 (Sambrook等人，1989)以接合反應轉型化學性勝任TOP10 細胞（Invitrogen)，在37°C下於L培養液中回收1小時，接著塗於含有壯觀黴素（50 pg/ml)及5-溴-4-氣-3-°引哚基-β-D-哌喃半乳糖苷（X-GAL，40 pg/ml ; Sigma)之L瓊脂上。選擇白色壯觀黴素抗性群落’於含有壯觀黴素（50 pg/ml)之L培養液中生長隔夜，且加以收集以供隨後製備質體。使用 Qiagen Qiaprep Spin Miniprep套組分離質體構築體。使用引子M13 (-20)及M13反置引子對相關質體製劑進行定序 (Sequetech ; Mountain View, CA)，且鑑別正確 GI 1,6 fldA/pCL純系，其已命名為菌株REM A1_11(T〇P1〇 w/GIl_6 fldA/pCL ; 5' Sal 1-3’ SacII/NruI 未切斷（鈍 3，）末端 PCR 片段進入 pCL之 5’ SalI-3, Sma I中）。GI1.6 fldA/pCL載體圖譜之圖呈現於圖82中。將 GI.1 ·6 fldA/pCL轉型至 CMP271 中為構建製造異戊二烯之測試菌株REM C9一12，藉由電穿孔將GI1.6 fldA/pCL質體轉型至CMP272中。在L培養液中回收轉型體且塗於含有壯觀黴素（50 pg/ml)及羧苄青黴素 149048.doc .240· 201111512 (5 0 pg/ml)之L瓊脂上。所得菌株命名為REM C9_12。產生REM D6_12之策略使用BIO RAD Gene Pulser系統（0.1 cm電擊管，目錄號 165-2089)及製造商（BIO RAD)建議之轉型方案，將GI1.6 fldA-ispG/pCL電穿孔至CMP272中。使用DXP操縱子 pET24a質體作為PCR模板以供構築載體。引子序列

5' SacII Ec ispG w/ rbs - 5' tcca ccgcgg gctc gaa ggag atatacc atg cat aac cag get cca att caa 3' Nrul Ec ispG stop-V 5' gctc tegega tta ttt ttc aac ctg ctg aac gtc M13For-V 5' gttgtaaaacgacggccagt 5' BamHI Ec ispG w/ rbs-V 5' tacg ggatcc atttga ggag taagee atg cat aac cag get cca att caa 3' SacI Ec ispG w/ stop-V 5' getg gagctc cac tta ttt ttc aac ctg ctg aac gtc pRA42 -5' gatgatcaacatgacgcatggc pRA43 -5' cattccgatccgtattggcg 擴增 5* SacII-ispG-3’ Nrul 片段為擴增ispG片段以供插入GI1.6 fldA/pCL中，設置以下 PCR反應： 1 μΐ模板（約1 μΐ體積之16_4細胞） 10 μΐ 緩衝液 0.5 μΐ dNTP(100 mM) 1.25 μΐ 引子（10 μΜ)5' SacII Ec ispG w/rbs 1.25 μΐ 引子（10 μΜ)3' Nrul Ec ispG stop 35 μΐ去離子水 + 1 μΐΐ 自 149048.doc -241 - 201111512 循環參數： 95°〇2分鐘；[95°Cx30秒，60。〇30秒，72。〇2分鐘]χ29次循環；72°〇5分鐘； 4°C直至冷卻（Biometra T3000 Combi溫度循環器）在1.20/〇 E-gel(Invitrogen)上分離所得PCR片段以驗證成功擴增’且根據製造商之說明書使用QIAquick PCR純化套組進行純化。所得儲備物為5, SacII-ispG-3' Nrul片段。將GI1.6 HdA片段選殖至PCL中

根據製造商之說明書用Sac II(New England BioLabs)分解約600 ng 5’ SacII-ispG-31 NrnI片段，且根據製造商之說明書用 SacII 及 NruI(New England BioLabs)分解約 200 ng

GI1.6 fldA/CL質體。隨後組合分解物，且使用Qiagen QiaQuick凝膠萃取套組進行清潔。根據製造商建議之方案，使用T4 DNA接合酶（New England Biolabs)接合約一半經清潔之切斷DNA。使用標準熱休克方案（(Sambr〇〇k等人’ 1989)以接合反應轉型化學性勝任τ〇Ρ10細胞 (Invitr〇gen) ’在37°C下於L培養液中回收1小時，接著塗灰含有壯觀黴素（50 pg/ml)之L瓊脂上。選擇一些壯觀黴素拍性群落，於含有壯觀黴素（5〇 Kg/ml)之L培養液中生長夜且加以收集以供隨後製備質體。使用Qiagen Qiaprej Spin Miniprep套組分離質體構築體。使用引子5，SacII & ispG、3’ Nrul Ec ispG stop、M13F〇r、5, BamHI Ec isp( w/rbs、3' SacI Ec ispG w/stop、pRA42及 pRA43 對相關質體製劑進行定序（Sequetech ;

Mountain View, CA)，且鑑別 149048.doc •242- 201111512 正確GI1.6fldA-ispG/pCL純系，其已命名為菌株REM D9_11(TOP10 w/GIl.6 fldA-ispG/pCL ; 5' Sac 11-3' Nrul未切斷（鈍3’末端）PCR片段進入pCL之5' SacII-3，Nrul中）。 GI1.6 fldA-ispG/pCL載體圖譜之圖呈現於圖83中。將 GI1.6 fldA-ispG/pCL轉型至 CMP271 中為構建製造異戊二烯之測試菌株REM D6_l 2，藉由電穿孔將GI1.6 fldA-ispG/pCL質體轉型至CMP272中。在L培養液中回收轉型體且塗於含有壯觀黴素（50 pg/ml)及羧苄青黴素（5〇 pg/ml)之L瓊脂上。所得菌株命名為REM D6_12。 E.產生REME7_12之策略使用BIO RAD Gene Pulser系統（0.1 cm電擊管，目錄號 165-2089)及製造商（BIO RAD)建議之轉型方案，將GI1.6 ispG/pCL電穿孔至CMP272 中。使用 GI1.6 gcpE-lytB-yidi pCR Blunt II TOPO載體作為PCR模板以供構築載體。引子序列 5* Sail Gil.X-5' cgag gtcgac gcgagccgtcacgcccttgac 31 SacI Ec ispG w/ stop j V 5' gctg gagctc cac tta ttt ttc aac ctg ctg aac gtc M13For 5* gttgtaaaacgacggccagt M13Rev 5' tcacacaggaaacagctatga 擴增GI1.6 ispG片段為擴增GI1.6 ispG片段以供插入pCL中，設置以下PCR反應： 1 μΐ模板（約1 μΐ體積之16_4細胞） 10 μΐ ZfercM/ase//缓衝液 149048.doc -243 · 201111512 0.5 μΐ dNTP(100 mM)

1.25 μΐ 引子（10 μΜ)5, Sail GI1.X 1.25 μΐ 引子（10 μΜ)3' SacI Ec ispG w/stop 3S μΐ去離子水 + 1 μΐ來自 Stratagene之/ 循環參數： 95°C><2 分鐘；[95°〇30 秒，60°C><30 秒，72°C><2 分鐘]x29 次循環；72°C><5分鐘； 4°C直至冷卻（Biometra T3000 Combi溫度循環器）在1.2% E-gel(Invitrogen)上分離所得PCR片段以驗證成功擴增，且根據製造商之說明書使用QIAquick PCR純化套組進行純化。所得儲備物為GI1.6 ispG片段。將GI1.6 ispG片段選殖至pCL中根據製造商之說明書，用Sail及SacI(Roche)分解約600 ng GI1.6 ispG片段及200 ng PCL載體。隨後組合分解物，且使用Qiagen QiaQuick凝膠萃取套組進行清潔。根據製造商建議之方案，使用T4 DNA接合酶（New England Biolabs) 接合約一半經清潔之切斷DMA。使用標準熱休克方案 (Sambrook等人，1989)以接合反應轉型化學性勝任丁〇1>1〇細胞（Invitrogen)，在37。〇下於L培養液中回收i小時，接著塗於含有壯觀黴素（50 μ§/Γη1)及5_溴_4_氯_3_。引哚基卜心哌南半乳糖普（X-GAL，40 pg/ml ; Sigma)之L壤脂上。選擇白色壯觀黴素抗性群落，於含有壯觀黴素（5〇 4§/1111)之1培養液中生長隔夜，且加以收集以供隨後製備質體。使用 149048.doc -244- 201111512

Qiagen Qiaprep Spin Miniprep套組分離質體構築體。使用引子 3’ SacI Ec ispG w/stop、M13For及 M13 Rev對相關質體製劑進行定序（Sequetech ; Mountain View, CA) ’且鑑別正確GI1.6 ispG/pCL純系，其已命名為菌株REM H5_11(TOP10 w/GI1.6 ispG/pCL ; 5, SalI-3' SacI PCR片段進入 pCL之5’ SalI-3· SacI中）°GI1.6 ispG/pCL 載體圖譜之圖呈現於圖84中。將 GI 1.6 ispG/pCL轉型至 CMP271 中為構建製造異戊二烯之測試菌株REM E7_12，藉由電穿孔將GI1.6 ispG/pCL質體轉型至CMP272中。在L培養液中回收轉型體且塗於含有壯觀黴素（50 pg/ml)及羧苄青黴素 (5 0 pg/ml)之L瓊脂上。所得菌株命名為REM E7_12。 F.分析測試菌株REM C9_12、REM D6_12 及 REM E7_12 與親本菌株CMP272之生長、異戊二烯產量及DXP代謝物積累

在圖85A及圖85B之震盪燒瓶檢驗以及DXP代謝物測定研究中，分別將親本菌株CMP272與測試菌株（REM C9_12、 REM D6—12及REM E7_12)相比較。圖85A中展示在 CMP272背景（菌株REM E7_12)内單獨表現z•印夕使得異戊二烯產量不利地降低約20%。圖85 A中亦描繪小規模共同表現/7以以及bpG與單獨表現//cM或相比，自CMP272宿主製造異戊二烯方面之益處增加。觀測到rEM D6_l 2菌株相對於親本對照菌株CMP272，異戊二烯產量改良1.4倍。增加//…表現量在菌株REM C9_12中大腸桿菌IspG及IspH 149048.doc •245- 201111512 活性之内源水準以及改良UpG過度表現菌株REM D6_12内 IspH之活性方面的益處係由圖85B中所述之代謝物概況指示。更特定言之，相對於親本菌株CMP272，菌株REM C9_12中之額外FldA分別降低IspG與IspH受質（cMEPP與 HDMAPP)之含量（cMEPP，降低 17% ; HDMAPP，降低 16%);而與僅過度表現!之REM E7_12菌株相比，發現共同過度表現與bpG)菌株REM D6_12内之額外FldA 使HDMAPP降低至約 23°/。（1/4.3)。生長在 30°C 下使菌株 CMP272、REM C9_12、REM D6_12及 REM E7_12以2-5 ml培養物形式於TM3液體培養基（13.6 g Κ2Ρ04、13.6 g KH2P〇4、2.0 g MgS04-7H20、2.0 g單水合檸檬酸、0.3 g檸檬酸鐵銨、3.2 g (NH4)2S04、0·2 g酵母提取物、1.0 ml 1000X改質痕量金屬溶液，調整至pH 6.8且用H20補足，且經過濾滅菌）中生長，該培養基以0.1%酵母提取物及1.0%葡萄糖補充至最終濃度且包括壯觀黴素（50 pg/ml)及缓苄青黴素（50 pg/ml)。藉由添加異丙基-β-D-l-硫代哌喃半乳糖苷（IPTG)使濃度達到600 μΜ來誘導LacI調控之基因表現。藉由記錄在600 nm下使用Eppendorf Biophotometer光譜儀（Eppendorf)所量測之培養物之各光學密度來週期性地監測生長。異戊二烯產量使用頂部空間檢驗分析異戊二烯產量。對於震盪燒瓶培養’將200 μΐ培養物自震盪燒瓶轉移至2 ml CTC頂部空間 149048.doc •246· 201111512 小瓶（SUN-SRI 2 mL HS小瓶，VWR# 66020-950 ;及帽， VWR# 66008-170)中。將帽旋緊，且在等效溫度、以250 rpm震盪下培育小瓶。30分鐘後，自培育箱中移出少瓶且進行分析。使用與CTC Analytics(Switzerland)CombiPAL自動取樣器相接且以頂部空間模式操作之Agilent 6890 GC/MS系統進行分析。使用Agilent HP-5MS GC/MS管柱 (15 mx〇.25 mm; 0.25 μιη膜厚度）分離分析物。設置取樣器以注射1 00 pL頂部空間氣體。GC/MS方法利用氦作為載氣，流速為1 ml/min。保持注射口在250°C下，分流比為 50:1。歷經0.6分鐘之分析持續時間，保持烘箱溫度為 37°C。以m/z為67之單離子監測（SIM)模式操作Agilent 5793N質量選擇偵測器。自0分鐘至0·42分鐘切斷偵測器以允許永久氣體溶離。在此等條件下，觀測到異戊二烯（2-曱基-1,3-丁二烯）在約0.49分鐘時溶離。使用校準表來定量異戊二烯之絕對量，且發現自1 pg/L至5000 pg/L呈線性。使用此方法估算偵測限度為50至100 ng/L。各菌株之比生產力以pg/L，OD.h形式報導。注意，在檢驗小瓶中歷經30分鐘培育，1900 μΐ頂部空間氣體：100 μΐ培養液之比率引起微克異戊二烯/公升培養物至比生產力之以下轉換：（由 GC-MS測定之異戊二烯/公升）χ(38)/(培養物之OD 600 nm) ° DXP代謝物積累分別分離上文所述且圖85B中所描繪之製造異戊二烯之親本菌株及測試菌株CMP272與REM C9 12、REM D6 12 149048.doc - 247- 201111512 及REME7_12的DXP代謝物，且如下定量：代謝物萃取：處理小規模實驗之樣品為量測小規模實驗中代謝物之積累，在_9t下以75〇〇χ§ 對0.4至1.5 mL細胞培養物離心3分鐘。離心後即刻將上清液抽吸至清潔管中以供分析所分泌之代謝物，且將ι〇〇吣乾冰冷卻曱醇添加至集結絲之細月包中。㈣將所得樣品儲存於-80 °C下直至進一步處理。為測定所分泌之代謝物之濃度，將5〇〇曱醇添加至 3〇〇 μΧ上清液中，且在4。(：下以20000xg對所得混合物離心 10分鐘以移除不溶性物質，隨後進行1<(：1^8分析。為自顆粒中萃取代謝物（另稱作細胞内代謝物），將i 〇 pL 水添加至含曱醇樣品中，將顆粒再懸浮於所得甲醇/水混合物中，且藉由以450〇xg離心4分鐘對細胞碎片進行短暫離心。將顆粒再萃取兩次，首先用10〇 1 乙酸錢水溶液（pH=8.0)缓衝之75%曱醇萃取，接著用9〇吣含5〇0/〇曱醇之乙酸敍緩衝液萃取。每一次萃取後，藉由離心使細胞碎片集結成粒’且合併來自全部三次萃取之上清液並藉由LCMS進行分析。在萃取程序期間，儘可能使樣品保持於冰上或冷凍離心機中以使代謝物降解減至最少。代謝物定量藉由在Quantum三重四極桿質譜儀（Thermo Electron Corporation, San Jose，CA)上進行 LC-ESI-MS/MS 來分析所萃取之代謝物。使用XCalibur及LCQuan軟體（Thermo Electron Corp)進行系統控制、數據擷取及質譜數據評估。 149048.doc -248- 201111512 在0.4 mL/min之流動速率及40°C之管柱溫度下，於Synergi 45 μΜ Hydro-RP HPLC管柱（15〇x2 mm，Phenomenex，USA) 上進行LC分離。LC梯度為i=0 min，12% B ; /=5 min， 12% B ； t=9 min 5 23% B ； t=20 min > 99% B ； t=23 min 5 99% B ; i=24 min，12% B ·’ i=29 min，12% B，其中溶劑 A 為10 mM三丁胺/15 mM乙酸之水溶液且溶劑B為LCMS級甲醇。樣品注射體積為1 0 μί。使用負離子模式之電噴霧電離進行質量偵測。選擇母離子之以下m/z值以SRM模式偵測相關代謝物：DXP為 213.0，MEP 為 215.0，IPP及 DMAPP 為 245.0，HDMAPP 為 260.0，及 CMEPP 為 277.0 ’ FPP 為 381.1，CDP-ME 為 520.1，CDP-MEP 為 600.0。基於 P〇3-子離子（m/z=79.0)所產生之峰的積分強度’使用藉由注射相應標準物（Echel〇n Biosciences Inc)而獲得之校準曲線來測定代謝物濃度。由於商用標準不可用，故CDP-MEP之濃度以任意單位表示。基於在OD=200之1 mL培養物中所有細胞之積分體積為5〇 pL之標準假設，計算細胞内代謝物濃度。實例27 : IspG活性增強之影響此實例證實IspG活性增強可因菌株REM G4_ll内IspH之活性不足而對異戊二烯產量不利。如上述實例中所述’ CMP272菌株背景内單獨或與組合之刀以表現增加會改良異戊二烯產量（圖85)。將此等認知應用於菌株REMG39，因為總體目標在於改良此（基準）菌株背景内IspG之活性。應重申，REMG39菌株展現如 149048.doc •249- 201111512 下特徵：在通過DXP途徑製造異戊二烯之通量令在ispG活性方面意識到瓶頸（參見14 L REMG39實例）。在圖86A 中，小規模增加REM G4_ll菌株内之IspG活性之益處變得明顯（異戊二烯產量相比親本對照增加35%);然而，如圖 79及圖80中所示，此益處並未轉移至大規模醱酵中。圖80 中所呈現之大規模醱酵之結果指示，IspH活性增強為REM G4_l 1菌株所需；此係由以下表明：在REM G4_l之指數期生長期間觀測到高的（>15 mM)HDMAPP含量（圖80C)。 A. 構築測試菌株REMG2_11及REMG4_11 為進一步改良REMG39菌株背景所產生之IspG活性，分別將載體構築體 GI1.6 fldA/pCL 及 GI1.6 fldA-ispG/pCL 引入該菌株中，隨後產生測試菌株REM G2_ll及REM G4_ll 。 B. 產生REMG2_11及REMG4_11之策略使用BIO RAD Gene Pulser系統及製造商（BIO RAD)建議之轉型方案，將GI1.6 fldA/pCL 及 GI1.6 fldA-ispG/pCL 電穿孔至REMG39中。使用自菌株REM Al_ll產生之GI1.6 fldA/pCL及自菌株REM D9—11 產生之GI1.6 fldA-ispG/pCL 的質體製劑；此等菌株及構築體描述於上文。將 GI1.6 fldA/pCL及 GI1.6 fldA-ispG/pCL轉型至 CMP271 中為構建製造異戊二烯之測試菌株REM G2_l 1及REM G4_ll，藉由電穿孔分別將GI1.6 fldA/pCL 及 GI1.6 fldA-ispG/pCL質體轉型至REMG39中。在L培養液中回收轉型體且塗於含有壯觀徽素（50 pg/ml)、康黴素（50 pg/ml)及羧 149048.doc • 250· 201111512 苄青黴素（50 pg/ml)之L瓊脂上。所得菌株分別命名為REM G211 及 REM G411。 C·分析測試菌株REM G2_ll、REM G4_ll及親本菌株 REMG39之生長、異戊二烯產量及DXP代謝物積累在震盪燒瓶檢驗中以及在DXP代謝物測定研究中，將親本菌株REMG39與測試菌株（REM G2_ll、及REM G4_ll) 相比較。圖86A中描繪在REMG39背景内GI1.6 fldA/pCL及 011.6£>1£^-丨3口0/?0^之存在使異戊二烯產量增加。在3.5小時時間點，測試菌株REM G4_l 1所製造之異戊二烯約為親本對照菌株REMG39之1.35倍；而在3.5小時時間點，REM G2_ll所產生之異戊二烯約為親本對照之丨.25倍。如圖86B 中所見，在3.5小時時間點，發現兩種測試菌株REM G2_ll與REM G4_l 1相比親本菌株REMG39積累較少IspG 受質cMEPP(REMG2_ll之cMEPP含量約為親本對照之 66% ;且REM G4_l 1之cMEPP含量約為親本對照之9%)。然而，REM G4_ll菌株積累之HDMAPP(IspH之受質）之含量為親本對照與測試菌株REM G2_l 1之5.4倍（圖86B)。生長在 3 0°C 下使菌株REMG39、REM G2_ll 及REM G4_ll 以 2-5 ml培養物形式於TM3液體培養基（13.6 g Κ2Ρ04、13.6 g KH2P〇4、2.0 g MgS04.7H20、2.0 g單水合檸檬酸、0.3 g 檸檬酸鐵銨、3.2 g (NH4)2S04、0.2 g酵母提取物、1.0 ml 1000X改質痕量金屬溶液，調整至pH 6.8且用H20補足，且經過濾滅菌）中生長，該培養基以0.1%酵母提取物及1.0% 149048.doc -251 - 201111512 葡萄糖補充至最終濃度且包括壯觀黴素（50 pg/ml)及羧苄青黴素（50 pg/ml)。藉由添加異丙基-β-D-1 -硫代旅喃半乳糖苷（IPTG)使濃度達到400 μΜ來誘導LacI調控之基因表現。藉由記錄在600 nm下使用Eppendorf Biophotometer光譜儀（Eppendorf)所量測之培養物之各光學密度來週期性地監測生長。異戊二烯產量使用頂部空間檢驗分析異戊二烯產量。對於震盪燒瓶培養，將200 μΐ培養物自震盪燒瓶轉移至2 ml CTC頂部空間小瓶（SUN-SRI 2 mL HS小瓶，VWR# 66020-950 ;及帽， VWR# 66008-170)中。將帽旋緊，且在等效溫度、以250 rpm震盪下培育小瓶。30分鐘後，自培育箱中移出小瓶且進行分析。使用與CTC Analytics(Switzerland)CombiPAL自動取樣器相接且以頂部空間模式操作之Agilent 6890 GC/MS系統進行分析。使用Agilent HP-5MS GC/MS管柱 (15 mx〇.25 mm ; 0.25 μηι膜厚度）分離分析物。設置取樣器以注射100 μί頂部空間氣體。GC/MS方法利用氦作為載氣，流速為1 ml/min。保持注射口在250°C下，分流比為 50:1。歷經0.6分鐘之分析持續時間，保持烘箱溫度為 37°C。以m/z為67之單離子監測（SIM)模式操作Agilent 5793N質量選擇偵測器。自0分鐘至0·42分鐘切斷偵測器以允許永久氣體溶離。在此等條件下，觀測到異戊二烯（2-曱基-1,3-丁二烯）在約0.49分鐘時溶離。使用校準表來定量異戊二烯之絕對量，且發現自1 pg/L至5000 pg/L呈線性。使 149048.doc -252- 201111512 用此方法估算偵測限度為50至1 00 ng/L。各菌株之比生產力以pg/L.OD.h形式報導。注意，在檢驗小瓶中歷經30分鐘培育，1900 μΐ頂部空間氣體：1〇〇 μι培養液之比率引起微克異戊二烯/公升培養物至比生產力之以下轉換：（由 GC-MS測定之異戊二烯/公升）χ(38)/(培養物之OD 600 nm) ° DXP代謝物積累分別分離上文所述且圖10B令所描繪之製造異戊二烯之親本菌株及測試菌株REMG39及REM G2_ll與REM G4_ll 的DXP代謝物，且如下定量：代謝物萃取：處理小規模實驗之樣品為置測小規模實驗中代謝物之積累，在_9〇c下以75〇〇xg 對0.4至1 _ 5 mL細胞培養物離心3分鐘。離心後即刻將上清液抽吸至清潔管中以供分析所分泌之代謝物，且將1〇〇吣軋冰冷卻甲醇添加至集結成粒之細胞中。接著將所得樣品儲存於-80°C下直至進一步處理。為測定所分泌之代謝物之濃度，將5〇〇甲醇添加至 μί上β液中，且在4 c下以20000xg對所得混合物離心 10分鐘以移除不溶性物質，隨後進SLCMs分析。為自顆粒中萃取代謝物（另稱作細胞内代謝物），將1 〇叫 X添加至έ甲醇樣品中，將顆粒再懸浮於所得甲醇/水混合物中，且藉由以4500xg離心4分鐘對細胞碎片進行短暫離心。將顆粒再萃取兩：欠，首先用1〇〇 μΙ^祕乙酸敍水溶液（ΡΗ=8·〇)緩衝之75%曱醇萃取，接著用如叫含慨 149048.doc •253 · 201111512 甲醇之乙酸銨緩衝液萃取。每一次萃取後，藉由離心使細胞碎片集結成粒，且合併來自全部三次萃取之上清液並藉由LCMS進行分析。在萃取程序期間，儘可能使樣品保持於冰上或冷凍離心機中以使代謝物降解減至最少。代謝物定量藉由在Quantum三重四極桿質譜儀（Thermo Electron Corporation, San Jose, CA)上進行 LC-ESI-MS/MS 來分析所萃取之代謝物。使用XCalibur及LCQuan軟體（Thermo Electron Corp)進行系統控制、數據擷取及質譜數據評估。在0.4 mL/min之流動速率及40°C之管柱溫度下，於Synergi 45 μΜ Hydro-RP HPLC 管柱（15〇x2 mm, Phenomenex, USA) 上進行LC分離。LC梯度為i=0 min，12% B ; i=5 min， 12% B ； t=9 min > 23% B ； t=20 min > 99% B ； t=23 min > 99% B ; /=24 min，12% B ; i=29 min，12% B，其中溶劑 A 為10 mM三丁胺/15 mM乙酸之水溶液且溶劑B為LCMS級曱醇。樣品注射體積為10 pL。使用負離子模式之電喷霧電離進行質量偵測。選擇母離子之以下m/z值以SRM模式偵測相關代謝物：DXP為 213.0，MEP 為 215.0，IPP及 DMAPP 為 245.0，HDMAPP 為 260.0，及 cMEPP 為 277.0，FPP 為 381.1，CDP-ME 為 520.1，CDP-MEP 為 600.0。基於 P03_ 子離子（m/z=79.0)所產生之峰的積分強度，使用藉由注射相應標準物（Echelon Biosciences Inc)而獲得之校準曲線來測定代謝物濃度。由於商用標準不可用，故CDP-MEP之濃度以任意單位表示。 I49048.doc -254· 201111512 基於在OD=200之1 mL培養物中所有細胞之積分體積為50 pL之標準假設，計算細胞内代謝物濃度。 D. 分析在大規模下測試菌株REM G4_ll之生長、異戊二烯產量及DXP代謝物積累 REM G4_ll細胞中存在之HDMAPP的增加程度高於親本對照菌株；然而，在REM G4_l 1細胞中所量測之平均0.63 mM之細胞内HDMAPP濃度顯著低於> 1 0 mM之細胞内 HDMAPP含量，該含量已與細胞生長較差及異戊二烯產量較低相關聯（見圖10B)。然而，令人驚言牙的是，在14 L醋酵槽規模下，菌株REM G4_ll表現較差且製造之異戊二烯約為親本對照之1/3 (圖3)。已發現，在小規模下所觀測到之REM G4_ll細胞中出現之HDMAPP的適度積累會在大規模醱酵條件下過度放大，使得細胞内HDMAPP含量>20 mM(圖4C)。相對於親本對照菌株REMG39所觀測到的REM G4_ll菌株之cMEPP減少及相應HDMAPP增加強有力地表明： 1) IspG活性在REM G4 — 11菌株内已有改良。 2) DXP通量中之瓶頸現在REM G4_ll菌株中之IspH活性方面出現。 E. 菌株REMG4_11之大規模醱酵親本菌株REMG39之大規模醱酵描述於上文。由在15 L 規模下於批式補料培養物中生長之表現來自DXP途徑及異戊二烯合成酶之基因的大腸桿菌製造異戊二烯。培養基配方（每公升醱酵培養基）： 149048.doc •255 - 201111512 Κ2ΗΡ〇4 7.5 g、MgS〇4.7H2〇 2 g、單水合檸檬酸2 g、檸檬酸鐵銨0_3 g、酵母提取物〇5 g、1〇〇〇χ改質痕量金屬溶液1 ml。所有組分一起添加且溶解於去離子水中。對此溶液進行熱滅菌（1231：下持續20分鐘）。用氫氧化銨（28%)將 pH值调整至7.0且補足體積。滅菌及調整pH值之後，添加 10 g葡萄糖、8 mL汞維生素溶液、及抗生素。 1000X改質痕量金屬溶液（每公升）：單水合檸檬酸 40 g、MnS〇4.H2() 3〇 g、Naa 1() g、

FeS04.7H20 1 g、c〇C12.6H2〇 1 g、ZnS04.7H20 1 g、

CuS04.5H20 100 mg、H3B03 100 mg、NaM〇〇4.2H2〇 i〇〇

mg。將各組分逐一溶解於去離子水中，用HCi/Na〇HMpH 值调整至3.0，接著補足溶液體積，且用〇 22微米過濾器進行過濾滅菌。汞維生素溶液（每公升）：鹽I硫胺素1.0 g、D-(+)_生物素i 〇 g、菸鹼酸1〇 g、D_ 泛酸4.8 g、鹽酸吡哆醇4 〇 g。將各組分逐一溶解於去離子水中，用HCl/NaOH將PH值調整至3.〇，接著補足溶液體積’且用0.2 2微米過滤器進行過遽滅菌。補料溶液（每公斤）：葡萄糖0.57 kg、去離子水〇_38 kg、K2hP〇4 7 5 &及1〇〇% Foamblast 10 g。將所有組分混合在一起且進行高壓滅菌。溶液已冷卻至25°C之後，添加3.4 mL· Macro鹽溶液、 0.8 ml 1000X改質痕量金屬溶液及6 7爪£汞維生素溶液。 Macro鹽溶液（每公升）： 149048.doc -256· 201111512

MgS04.7H20 296 g、單水合檸檬酸296 g、檸檬酸鐵銨 49.6 g。將所有組分溶解於水中，補足體積且用0.22微米過濾器進行過濾滅菌。在1 5 L生物反應器中，以過度表現dxp途徑中之第一個酶（GI1.6-dxs)、DXP途徑中之最後一個酶（GI1.6-yIDI)、下游MVA途徑（PL.2-mKKDyI)、來自臺灣溫泉菌（Ptac-gcpE-lytB-petF-petH/pK184)之DXP途徑之多種其他基因、大腸桿菌却G及//cM基因（GI1.6 fldA-ispG/pCL)及來自銀白楊 (pDW33)之截短的異戊二烯合成酶且含有源自MG1655(菌株名稱REM G4_ll)之經恢復之17,257 bp含卯/M染色體區域的大腸桿菌BL2 1細胞進行醱酵。進行此實驗以監測在醋酵所要之pH 7.0及溫度34°C下自葡萄糖形成異戊二烯之情況。解；東大腸桿_菌株之冷;東小瓶，且接種至生物反應器之胰蛋白腺-酵母提取物培養基中。接種體生長至55〇 nm 下所量測之光學密度（OD55。）為1.0之後，使用500 mL接種體接種15 L生物反應器且使初始槽體積達到5 £。以指數速率補給補料溶液，直至最高補料速率達到4 9 g/min為止。此後，以小於或等於4.9 g/min之速率補給葡萄糖補料以滿足代謝要求。在44小時醱酵期間傳遞至生物反應器之葡萄糖的總量為3 ·〇 kg。藉由添加異丙基_β_〇_ i _ 硫代哌喃半乳糖苷（IPTG)達成誘導。當對槽進行首次接種時，初始IPTG濃度為50 μΜ。當細胞之（^別為1〇時，接著經5小時添加數份5 0 μΜ IPTG以使IPTG濃度達到3 5〇 μΜ。使用Hiden質譜儀測定生物反應器之釋出氣體中之異戊 149048.doc -257- 201111512 二烯含量。異戊二稀力價隨著醱酵過程而增加，在44小時之時達到0.98 g/L之最大值。計异異戊二烯力價之等式：丨(瞬時異戊二烯製造速率， g/L/h)dt(t=0-44小時）[=]g/L培養液計算比生產力水準之等式：（mg異戊二烯「〇^異戊二烯t。)/ [(OD550txL 培養液 t-〇D550t()xL 培養液 tC))/(2.7 ODxL/g 細胞）]/ (t-tQ) [=] mg異戊二烯/g細胞/h 實例28 : DXP代謝物測定 A. 代謝物萃取：處理14 L醱酵槽樣品藉由將數毫升醱酵槽培養物抽取至填充有9.〇 1T1L乾冰冷卻曱醇之預稱重管中而使細胞代謝快速失活。再次稱重所得樣品以計算所抽取之細胞培養物之量，接著置於-8〇。〇下儲存直至進一步分析。為萃取代謝物，藉由在_9。(：下以 450〇xg離心4分鐘對500 pL經曱醇淬滅之酿酵樣品進行短暫離心。接著將顆粒再萃取兩次，首先用350 pL以5 mM 乙酸銨水溶液（ρΗ=7·0)緩衝之85%甲醇萃取，接著用350 pL含50%甲醇之乙酸銨緩衝液萃取。每一次萃取後，藉由離心使細胞碎片集結成粒，且將全部三份上清液彙集在一起以供進一步分析。 B. 代謝物定量藉由在Quantum三重四極桿質譜儀（Thermo Electron Corporation, San Jose，CA)上進行LC-ESI-MS/MS來分析所萃取之代謝物。使用XCalibur及LCQuan軟體（Thermo Electron C〇rp)進行系統控制、數據擷取及質譜數據評估。 149048.doc -258- 201111512 在0.4 mL/min之流動速率及40°C之管柱温度下，於Synergi 45 μΜ Hydro-RP HPLC管柱（150x2 mm，Phenomenex，USA) 上進行LC分離。LC梯度為i=0 min，12% B ; /=5 min， 12% B ; i=9 min，23% B ; i=20 min，99% B ; i=23 min， 99% B ; i=24 min，12% B ; /=29 min，12% B，其中溶劑 A 為10 mM三丁胺/15 mM乙酸之水溶液且溶劑B為LCMS級曱醇。樣品注射體積為1 0 μί。使用負離子模式之電喷霧電離進行質量偵測。選擇母離子之以下m/z值以SRM模式偵測相關代謝物：DXP為 213.0，MEP 為 215.0，IPP及 DMAPP 為 245.0，HDMAPP 為 260.0，及 cMEPP 為 277.0，FPP 為 381.1，CDP-ME 為 520.1，CDP-MEP 為 600.0。基於 Ρ03·子離子（m/z=79.0)所產生之峰的積分強度，使用藉由注射相應標準物（Echelon Biosciences Inc)而獲得之校準曲線來測定代謝物濃度。由於商用標準不可用，故CDP-MEP之濃度以任意單位表示。基於在OD=200之1 mL培養物中所有細胞之積分體積為50 pL之標準假設，計算細胞内代謝物濃度。實例29 :藉由表現IspH酶增加異戊二烯產量且同時證實維持較高DXP代謝物含量之積累此實例證實藉由在菌株REM H8_12中表現來自念珠藻屬 sp.)PCC7120之IspH酶增加異戊二稀產量且同時證實在展現IspG活性增強之REM H8_12菌株中維持較高 DXP代謝物含量之積累。上述實例中以測試菌株G4_l 1產生之資料指示，DXP通 149048.doc - 259- 201111512 量增強之菌株内IspG活性增強需要與足夠IspH活性相平衡以避免在14 L醱酵期間出現高HDMAPP含量之積累。細胞内HDMAPP(IspH之受質）含量超過1〇 mM已與小規模及大規模實驗中細胞生長較差、通過DXP途徑之通量降低、隨後自異戊二烯製造菌株產生之異戊二烯減少相關聯。因此，藉由過度表現念珠藻屬PCC7120之bp//對偶基因來達成DXP途徑增強之菌株（REM 17_11 ;下文所述）内IspH活性增強，從而產生測試菌株REM H8_l 2。圖89中展示藉由表現念珠藻屬PCC7120之IpsH所提供之IspH活性增強在測試菌株REM H8_l 2製造異戊二烯方面的小規模益處。在14 L規模下，測試菌株REM H8_12產生針對展現GI1.6 fldA-ispG/pCL所提供之IspG活性增強之菌株所記錄的最高（2.6 g/L)異戊二烯力價（圖90A)。此外，不同於14 L規模下REM G4_ll菌株，菌株REM H8_12能夠維持通過DXP途徑之通量，如MEPP及cMEPP中間物之積累得以維持所指示（比較圖80C與圖90C)。 A.構築測試菌株REMH8_12及親本菌株REMI7_11 REM 17—11 及 REM H8_12 為 WW119 之衍生物。此 WW119 菌株係藉由用質體pDW33對菌株WW103進行電穿孔來構築（關於WW119之構築，參見實例30)。WW119展現DXP通量改良，但產生類似於先前親本菌株CMP272之異戊二烯含量；此可能歸因於通量中在IspG方面之瓶頸。WW119具有兩處優於CMP272菌株之改良。此等有利修飾包括办s表現增加及办〃表現增加，且描述於下文。藉由將GI1.6 fldA- 149048.doc -260- 201111512 ispG/pCL弓I入WWl 19中而產生REM 17_11且藉由將Ptac念珠藻屬ispH aspA終止子/pEWL454移入REM 17_11中而製成REM H8_12 ;經由電穿孔轉型方法將兩種質體併入其相應宿主菌株中。引子

5' Asel F-pgl pET-15b 5' cagtct ATTAAT atgAAGCAAACAGTTTATATC

3' BamHI R-pgl pET-15b 5' TAGCAGCC GGATCC TTAGTGTGCGTTAACCACCAC

EL-1098: 5'

TAACTTTAAGGAGGTATACATATGGAGCTCACGCGTGCGGCCGC CTCGAGCTGCAGTACAAATAAAAAAGGCACGTCAG EL-1099: 5'

GGATCCGTAATCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACAC

ATTATACGAGCCGATGATTAATTGTCAACAGAATTCCTTTC

CAGTCGGGAAACCTGTCG

EL-1100 : 5' CGTCGTTTTACAACGTCGTG

EL-1101 : 5' GAACTCCAAGACGAGGCAGC

EL-1102 : 5' GTGATATTGCTGAAGAGCTTGG

EL-1103 : 5' GGACTCAAGACGATAGTTACC EL-1104 : 5' CACGACAGGTTTCCCGACTGG EL-1150 5' GAGCGCCCAATACGCAAACC Neo.21 5' GGCGATAGAAGGCGATGC 擴增REM 119之pgl基因座為驗證/擴增REM Il_9之pg/基因座，設置以下PCR反應· 149048.doc -261 · 201111512 1 μΐ模板（約1 μΐ體積之11_9細胞） 1 0 μΐ fferculaselJ緩衝液 0.5 μΐ dNTP(100 mM) 1.25 μΐ 引子（10 μΜ)5’ Asel F-pgl pET-15b 1.25 μΐ 引子（10 μΜ)3' BamHI R-pgl pET-15b 35 μΐ去離子水 + 1 μΐ來自 Stratagene之循環參數： 95°〇2分鐘；[95°〇30秒，55°〇30秒，72°Cx2分鐘]χ29次循環；72°〇5分鐘； 4°C直至冷卻（Biometra T3000 Combi溫度循環器）在1.2% E-gel(Invitrogen)上分離所得PCR片段以驗證成功擴增。經pg/ +驗證之純系選作REM 11 _9。擴增PEWL454片段為產生pEWL454，設置以下PCR反應： 1 μΐ模板（約1 μΐ體積之pKl 84 w/aspA終止子載體（Gene Oracle, Inc.)) 5 μΐ 1 0x P/w // FwsDNA聚合酶 2.5 μΐ dNTP(10 mM) 1.0 引子（10 pM)EL-1098 1.0 引子（10 μΜ)Εί-1099 39.5 μΐ去離子水 + 1 μΐ來自 Stratagene之P/w DNA聚合酶循環參數： 149048.doc -262· 201111512 95°〇2 分鐘；[95°CX30 秒，60°〇30 秒，72。〇52 秒]χ29 次循環；72°C><3分鐘； 4°C 直至冷卻（MJ Research PTC-200 Peltier溫度循環器）在1.2% E-gel(Invitrogen)上分離所得PCR片段以驗證成功擴增。菌株REM II 9描述

菌株REM 11_9用於選殖已針對大腸桿菌（由Gene Oracle, Inc.提供）中之表現進行密碼子最佳化之念珠藻屬Pcc7120 對偶基因。令人驚言牙的是，Gene Oracle, Inc.不能提供具有所要純系之大腸桿菌菌株。因此，使用菌株REM 11 _9 作為宿主以使用基於存活之策略獲得相關Ptac念珠藻屬 ispH aspA終止子 /pEWL454純系。菌株 REM 11_9源自 MD09-220(BL21(DE3)PL.2 mOTi)；；/:: FRT-AispH::FRT)且先前已有所描述。經由標準ρι溶菌液/ P1轉導方案（Thomason等人，2007)將菌株MCM625之FRT-neo-FRT-GIl ·6-ί/Λ：ί基因座轉導至md〇9-220之基因組中，且所得康黴素抗性菌株稱為REM C5_9。使用Gene Bridge's GmbH方法，使抗生素標記物環出，從而產生菌株REM H5_9。隨後，使用標準ρι溶菌液/ρι轉導方案 (Thomason等人，2007)將1^(}1655之；^/及^2/戶區域轉導至菌株REM H5_9中’且選擇細胞在含有〇半乳糖及 500 μΜ甲經戊酸之]yj9績0匕μ /τ χτ

〜嗄月曰（6 g/L Na2HP04、3 g/L

KH2P〇4、0.5 g/L NaCl、η ς /T XTTY ^ iNa^l 0.5 g/L NH4C1 ' 0.1 mM CaCl2 ^ 2 mM MgS〇4、1.5°/。瓊脂 1 4 且 , α Α曰）上生長。藉由PCR(見上文）驗證利 149048.doc -263 - 201111512 用半乳糖、依賴於曱羥戊酸、對康黴素敏感之細胞中；?g/ 基因座的存在，且將一個純系選作REM I1_9(BL21(DE3) PL.2 mKKDyI: :¥RT-AispH: :¥RT pgl+FRT: :GI 1.6-dxs) ° 將念珠藻屬PCC7120 ispH對偶基因選殖至pEWL454中根據製造商建議之方案，使用T4 DNA接合酶（New England Biolabs)將約90 ng具有針對大腸桿菌（由Gene Oracle，Inc.提供）中之表現進行密碼子最佳化之念珠藻屬 PCC7120 bp//對偶基因的預切割5’ BamHI-3，PstI純化之 DNA片段接合於在源自pK184(Jobling及Holmes, 1990)之質體内具有由多選殖位點（MCS)分開之tac啟動子及aspA終止子序列的預切割5’ BamHI-3' PstI純化之DNA載體骨架 pEWL454(由 Gene Oracle，Inc.提供）。pEWL454 中戶斤存在之 aspA終止子序列係由Gene Oracle, Inc.合成。使用上文概述之PCR方法移除pKl 84中所存在之lac啟動子序列，且使用上文詳述之寡核苷酸技術（〇lig〇s)(Integrated DNA Technologies)插入pEWL454内所具有之tac啟動子及MCS。根據製造商建議之方案，使用來自New England Biolabs之 T4 DNA接合酶接合所得PCR片段。使用標準熱休克方案 (Sambrook等人，1989)以接合反應轉型化學性勝任TOP10 細胞（Invitrogen)，在37°C下於L培養液中回收1小時，接著塗於含有康黴素（50 pg/ml)之L瓊脂上。選擇康黴素抗性純系，於含有康黴素（50 pg/ml)之L培養液中生長隔夜，且加以收集以供隨後製備質體。使用Qiagen Qiaprep Spin Miniprep套組分離質體構築體。使用引子EL-1100、EL- 149048.doc -264 - 201111512 1101、EL-1102、EL-1103及EL-1104對相關質體製劑進行定序（Quintara ; Albany，CA)，且鑑別正破 p:EWL454純系，其已命名為菌株EWL454(TOP10 w/pEWL454 ;具有Ptac-RBS-Ndel-SacI-MluI-Notl-XhoI-Pstl-aspA 終止子之源自 pK184之選殖載體）。說明pEWL454之圖展示於圖87中。使用BIO RAD Gene Pulser系統（0.1 cm電擊管，目錄號 165-2089)及製造商（BIO RAD)建議之轉型方案，經由電穿孔以接合反應轉型經水洗之REM 11_9細胞。在37°C下於L 培養液+500 μΜ甲經戊酸（可購自例如Sigma-Aldrich)中回收細胞1小時，接著塗於含有康黴素（50 gg/ml)之L瓊脂上。選擇在不存在曱羥戊酸之情況下生長之康黴素抗性群落，於含有康黴素（50 pg/ml)之L培養液中生長隔夜，且加以收集以供隨後製備質體；念珠藻屬bp//對偶基因的存在解除了細胞生長對曱經戊酸之依賴性。使用Qiagen Qiaprep Spin Miniprep套組分離質體構築體。使用引子EL-1105及Neo.21對相關質體製劑進行定序（Sequetech ; Mountain View, CA)，且鑑別正確 Ptac念珠藻屬 ispH aspA 終止子/pEWL454純系，其已命名為菌株REM F5_12(REM Il_9 w/Ptac 念珠藻屬 ispH aspA 終止子 /pEWL454 ; 51 BamHI-3，PstI合成片段進入pEWL454 之5，BamHI-3，PstI 中）。所得Ptac念珠藻屬ispH aspA終止子/pEWL454構築體之圖展示於圖88中。 B.產生REM 17—11及REM H8_12之策略

藉由將GI1.6 fldA-ispG/pCL轉型至WW119中來構築REM 149048.doc -265 · 201111512 17_11。使用 BIO RAD Gene Pulser 系統（0.1 cm電擊管’目錄號165-2089)及製造商（BIO RAD)建議之轉型方案，藉由電穿孔進行轉型。使用自菌株REM D9_ll產生之GI1.6 fldA-ispG/pCL之質體製劑；此菌株及相應質體構築體描述於下文。藉由使Ptac念珠藻屬ispH aspA終止子/pEWL454轉型來構築 REM H8_12。使用 BIO RAD Gene Pulser 系統（0.1 cm 電擊管，目錄號165-2089)及製造商（BIO RAD)建議之轉型方案，藉由電穿孔進行轉型。自菌株REM F5_12製成Ptac 念珠藻屬ispH aspA終止子/pEWL454之質體製劑。將GI1.6 fldA-ispG/pCL轉型至WW119中且將Ptac念珠藻屬 ispH aspA終止子 /pEWL454轉型至 REM I7_l 1 中為構建製造異戊二烯之親本菌株REM 17_11(測試菌株 REM H8_12源自於其），藉由電穿孔將GI1.6 fldA-ispG/pCL 質體轉型至WW119中。在L培養液中回收轉型體且塗於含有壯觀黴素（50 pg/ml)及羧苄青黴素（50 gg/ml)之L瓊脂上。所得菌株命名為REM I7_l 1。接著藉由用Ptac念珠蕩屬ispH aspA終止子/pEWL45 4進行電穿孔使REM I7_l 1轉型。在L培養液中回收轉型體且塗於含有壯觀黴素（50 gg/ml)、康黴素（50 pg/ml)及羧苄青黴素（5 0 pg/ml)之L瓊脂上。所得菌株命名為REM H8_l 2。 C·分析在小規模下測試菌株REM H8_12及親本菌株REM 17_11之生長、異戊二烯產量及DXP代謝物積累在震盪燒瓶檢驗中以及在DXP代謝物測定研究中，將親 149048.doc -266- 201111512 本菌株REM I7_l 1與測試菌株REM Η8_12相比較。圖89中描繪具有Ptac念珠藻屬ispH aspA終止子/pEWL454構築體之REM H8_l2菌株相比親本對照菌株REM 17—11在異戊二烯產量方面之益處增加。與親本菌株REM I7_l 1相比， REM H8_ 12菌株中所存在之IspH活性增強係由歷經3小時及3.75小時時間點1^厘八？？平均減少1〇倍來反映（圖89)。此藉由表現念珠藻屬PCC7120 hp/i對偶基因提供2IspH活性提高使得REM H8_12測試菌株之異戊二烯產量相比親本對照增加2.1倍至3.2倍（圖89)。REM H8_12測試菌株之生長情況相比親本菌株REM 17—11亦適度較佳（生長約快 20%) 〇生長在30°C下使菌株REM 17_11及REM H8 — 12以2-5 ml培養物形式於TM3液體培養基（13.6 g K2P〇4、13.6 g Κϋ2Ρ〇4、 2.0 g MgS04,7H20、2.0 g單水合檸檬酸、〇 3 §檸檬酸鐵錢、3.2 g (NH4)2S04、0.2 g酵母提取物、i 〇 ml 1〇〇〇χ改質痕量金屬溶液，調整至pH 6.8且用出0補足，且經過濾滅菌）中生長，该培養基以〇·丨％酵母提取物及丨〇〇/。葡萄糖補充至最終濃度且包括壯觀黴素（5〇 ^/ml)及羧苄青黴素 (50 pg/mi)。藉由添加異丙基_0_〇小硫代哌喃半乳糖苦 (IPTG)使濃度達到500 μΜ來誘導。。調控之基因表現。藉由記錄在600 nm下使用Eppend〇rf Bi〇ph〇t〇meter光譜儀 (Eppend。續量測之培養物之各光學密度來週期性地監測生長。 149048.doc -267- 201111512 異戍二烤產量使用頂β空間檢驗分析異戊二稀產量。對於震盪燒瓶培養，將200 μΙ培養物自震盪燒瓶轉移至2 μ ctc頂部空間小瓶（SUN-SM 2 mL HS 小瓶，ν·# 66〇2〇_95〇 ;及帽， VWR# 66008-170)中。將帽旋緊，且在等效溫度、以25〇 rPm震盪下培育小瓶。3〇分鐘後，自培育箱中移出小瓶且進行分析。使用與CTC Analytics(Switzerland)c〇mbipAL自動取樣器相接且以頂部空間模式操作之八叫咖689〇 GC/MS系統進行分析。使肖八扣邮Hp_5Ms 管柱 (15 mx〇.25 mm ; 0.25 μιη膜厚度）分離分析物。設置取樣器以注射1〇〇吣頂部空間氣體。GC/MS方法利用氦作為載氣，流速為1 ml/min。保持注射口在25〇〇c下，分流比為 50:1。歷經0.6分鐘之分析持續時間，保持烘箱溫度為 37°C。以m/z為67之單離子監測（SIM)模式操作AgUent 5793N質買選擇偵測器。自〇分鐘至〇·42分鐘切斷偵測器以允許永久氣體溶離。在此等條件下，觀測到異戊二烯（2_曱基-1，3-丁二烯）在約0.49分鐘時溶離。使用校準表來定量異戊二烯之絕對量，且發現自！叫化至5〇〇〇 pg/L呈線性。使用此方法估算偵測限度為5〇至1〇〇 ng/L。各菌株之比生產力以pg/L’OD.h形式報導。注意，在檢驗小瓶中歷經3〇分鐘培育’ 1900 μΐ頂部空間氣體：1〇〇 μ1培養液之比率引起微克異戊二烯/公升培養物至比生產力之以下轉換：（由 GC-MS測定之異戊二烯/公升）χ(38)/(培養物之〇d 600 nm) 〇 149048.doc -268- 201111512 DXP代謝物積累分離上文所述且圖89中所描繪之製造異戊二烯之親本菌株REM 17_11及測試菌株REM H8_12之DXP代謝物，且如下定量：代謝物萃取：處理小規模實驗之樣品為量測小規模實驗中代謝物之積累，在_9〇c下以75〇〇Xg 對0.4至1.5 mL細胞培養物離心3分鐘。離心後即刻將上清 $ 液抽吸至清潔管中以供分析所分泌之代謝物，且將丨〇〇 0 乾冰冷卻甲醇添加至集結成粒之細胞中。接著將所得樣品儲存於-80°C下直至進一步處理。為測定所分泌之代謝物之濃度，將5〇〇曱醇添加至 300 μ]：上清液中，且在4艺下以20〇〇〇xg對所得混合物離心 1 〇分鐘以移除不溶性物質’隨後進行LCMS分析。為自顆粒中萃取代謝物（另稱作細胞内代謝物），將丨〇叫水添加至含曱醇樣品中，將顆粒再懸浮於所得曱醇/水混 • 合物中，且藉由以C〇〇xg離心4分鐘對細胞碎片進行短暫離心。將顆粒再萃取兩次，首先用100 μι以1 mM乙酸銨水溶液（ΡΗ=8·0)緩衝之75%甲醇萃取，接著用9〇吣含5〇% 甲醇之乙酸銨緩衝液萃取。每一次萃取後，藉由離心使細胞碎片集結成粒，且合併來自全部三次萃取之上清液並藉由LCMS進行分析。在萃取程序期間，儘可能使樣品保持於冰上或冷凍離心機中以使代謝物降解減至最少。代謝物定量藉由在Quantum三重四極桿質譜儀（Therm() mectr〇n 149048.doc -269- 201111512

Corporation，San Jose，CA)上進行LC-ESI-MS/MS來分析所萃取之代謝物。使用XCalibur及LCQuan軟體（Thermo Electron Corp)進行系統控制、數據擷取及質譜數據評估。在0.4 mL/min之流動速率及40°C之管柱溫度下，於Synergi 45 μΜ Hydro-RP HPLC 管柱（150x2 mm, Phenomenex，USA) 上進行LC分離。LC梯度為/=〇 min，12% B ; i=5 min， 12% B ; i=9 min，23% B ; ί=20 min，99% B ; i=23 min， 99% B ; i=24 min，12% B ; i=29 min，12% B，其中溶劑 A 為10 mM三丁胺/15 mM乙酸之水溶液且溶劑B為LCMS級曱醇。樣品注射體積為10 pL。使用負離子模式之電喷霧電離進行質量偵測。選擇母離子之以下m/z值以SRM模式偵測相關代謝物：DXP為 213.0，MEP 為 215.0，IPP及 DMAPP 為 245.0，HDMAPP 為 260.0，及 cMEPP 為 277.0，FPP 為 381.1 ，CDP-ME 為 520.1，CDP-MEP 為 600.0。基於 Ρ03·子離子（m/z=79.0)所產生之峰的積分強度，使用藉由注射相應標準物（Echelon Biosciences Inc)而獲得之校準曲線來測定代謝物濃度。由於商用標準不可用，故CDP-MEP之濃度以任意單位表示。基於在OD=200之1 mL培養物中所有細胞之積分體積為50 μί之標準假設，計算細胞内代謝物濃度。 D.分析在14 L醱酵規模下測試菌株REM Η8_12之生長、異戊二烯產量及DXP代謝物積累 REM_H8_12以14 L醱酵製造2.6 g/L之異戊二烯（圖 14A)。除異戊二烯增加以外，在整個14 L醱酵過程中，與 I49048.doc -270- 201111512 先前關於含GI1.6 fldA-ispG/pCL之菌株REM G4_u所觀測到的情況相比，REM H8—12測試菌株維持約2倍含量之 MEP代謝物（DXR之產物）及高於15倍含量之cMEpp(ispG2 受質）（比較圖80C與圖90C)。 E.菌株REM H8一12之大規模醱酵由在15 L規模下於批式補料培養物中生長之表現來自 DXP途徑及異戊二烯合成酶之基因的大腸桿菌製造異戊二稀。 1000X改質痕量金屬溶液（每公升）：單水合擰檬酸40 g、MnS04.H2〇 30 g、Naei 1〇 g、 FeS04.7H20 1 g、CoC12.6H20 1 g、ZnS〇4.7H2〇丨 g、 CuS04-5H20 100 mg' H3B03 l〇〇 mg , NaMo04-2H20 100 mg。將各組分逐一溶解於去離子水中，用Η(：1/Ν&〇Η* 值5周整至3.0，接著補足溶液體積，且用〇 22微米過濾器進行過滤滅菌。汞維生素溶液（每公升）：鹽酸硫胺素1.0 g、D-(+)-生物素！·〇 g、菸鹼酸1〇 g、D_ 泛酸4.8 g、鹽酸吡哆醇4·〇 g。將各組分逐一溶解於去離子水中，用HCl/NaOH將pH值調整至3·〇，接著補足溶液體積’且用0.22微米過濾器進行過濾滅菌。補料溶液（每公斤）：葡萄糖0.57 1^、去離子水0.3 8让经、1<：21^04 7.5 §及1〇〇〇/0 Foamblast 10 g。將所有組分混合在一起且進行高壓滅菌。溶液已冷卻至25°C之後，添加3.4 mL Macro鹽溶液、 149048.doc • 271 · 201111512 0.8 ml 1000X改質痕量金屬溶液及6.7 mL汞維生素溶液。 Macro鹽溶液（每公升）：

MgSCV7H2〇 296 g、單水合檸檬酸296 g、檸檬酸鐵銨 49.6 g ^將所有組分溶解於水中，補足體積且用〇22微米過濾器進行過濾滅菌。在15 L生物反應器中，以過度表現dxp途徑中之第一個酶（GIl，6-dxs)、DXP途徑中之最後一個酶（GI1 6_yim)、下游MVA途徑（PL.2-mKKDyI)、來自臺灣溫泉菌（ptac_gCpE_ lytB-PetF-petH/PK184)之DXP途徑之多種其他基因、大腸桿菌叩(?及//心基因（GI1.6 fldA-ispG/pCL)及來自銀白楊 (pDW3 3)之截短的異戊二烯合成酶且含有源自mgi655(菌株名稱REM H8—12)之經恢復之17,257 bp含ga/M染色體區域的大腸桿菌BL2 1細胞進行醱酵。進行此實驗以監測在醱酵所要之pH 7.0及溫度34°C下自葡萄糖形成異戊二烯之情況。解凍大腸桿菌菌株之冷凍小瓶，且接種至生物反應器之胰蛋白腺-酵母提取物培養基中。接種體生長至55〇 nm 下所量測之光學密度（ODwo)為1·〇之後，使用500 mL接種體接種15 L生物反應器且使初始槽體積達到5 l。以指數速率補給補料溶液’直至最高補料速率達到5 8 g/min為止。此後，以小於或等於5 8 g/min之速率補給葡萄糖補料以滿足代謝要求。在44小時醱酵期間傳遞至生物反應器之葡萄糖的總量為4.4 kg。藉由添加異丙基_β_〇_ι_ 硫代派喃半乳糖苷（IPTG)達成誘導。當細胞之01)55()為7 時’添加單份IPTG至槽中以使濃度達到3〇〇 μΜ。 149048.doc •272· 201111512 使用Hiden質譜儀測定生物反應器之釋出氣體中之里戊二稀含量。異戊二烯力價隨著醱酵過程而增加，在44:時之時達到2.6 g/L之最大值。 3十鼻異戍—稀力價之等式：（V睡Hi s 〇·、丨只 < 专八._)(瞬時異戊二烯製造速率， g/L/h)dt(t=0-84小時）[=]g/L培養液 F.DXP代謝物測定代謝物萃取：處理14L撥酵槽樣品 φ #由將㈣升酸酵槽培養物抽取至填充有9.0 mL乾冰冷卻曱醇之預稱重管中而使細胞代謝快速失活。再次稱重所得樣品以計算所抽取之細胞培養物之量，接著置於_8〇它下儲存直至進一步分析。為萃取代謝物，藉由在—9C下以 4500xg離心4分鐘對500吣經甲醇淬滅之醱酵樣品進行短暫離心。接著將顆粒再萃取兩次，首先用35〇叫以5 乙酸铵水溶液（pH=7.0)緩衝之85%甲醇萃取，接著用35〇 μΕ含50%曱醇之乙酸錄緩衝液萃取。每一次萃取後，藉由 • 離心使細胞碎片集結成粒，且將全部三份上清液彙集在一起以供進一步分析。代謝物定量藉由在Quantum三重四極桿質譜儀（丁herm〇 Electron

Corporation，San Jose，CA)上進行 LC-ESI-MS/MS 來分析所萃取之代謝物。使用XCalibur及LCQuan軟體（Thermo Electron Corp)進行系統控制、數據擷取及質譜數據評估。在〇_4 mL/min之流動速率及4(TC之管柱溫度下，於Synergi 45 μΜ Hydro-RP HPLC管柱（15〇χ2 mm，Phenomenex, USA) 149048.doc •273 · 201111512 上進行LC分離。LC梯度為戶〇 min，12% b ;户5 min，

12/〇 B，ί-9 min，23% B，ί=2〇 min，99% B ; i=23 min， 99% B ’ i=24 min ’ 12% B ; i=29 min，12% B，其中溶劑 A 為10 mM三丁胺/15 mM乙酸之水溶液且溶劑b為LCMS級曱醇。樣品注射體積為1 〇 pL。使用負離子模式之電喷霧電離進行質量偵測。選擇母離子之以下m/z值以SRM模式偵測相關代謝物：DXP為 213.0 ’ MEP 為 215.0，IPP及 DMAPP 為 245.0，HDMAPP 為 260.0 ’ 及 CMEPP 為 277.0，FPP 為 381.1，CDP-ME 為 520.1 ’ CDP-MEP 為 600.0。基於 p〇3-子離子（m/z=79.0)所產生之峰的積分強度，使用藉由注射相應標準物（Echelon Biosciences Inc)而獲得之校準曲線來測定代謝物濃度。由於商用標準不可用，故CDP-MEP之濃度以任意單位表示。基於在OD=200之1 mL培養物中所有細胞之積分體積為5〇 μί之標準假設，計算細胞内代謝物濃度。實例30 :發現Dxr之表觀生物化學回饋抑制及減少其消極作用吾人驚訝地觀測到，在DXP菌株中，異戊二烯製造停止’而細胞仍處於旺盛生長期中。除此等情況以外，細胞亦積累1 -去氧木酮糖-5-碟酸（Dxr之受質）。在不受理論約束下，解釋此觀測結果之一種可能性假設為該途徑在遺傳層面上或在生物化學層面上經受調控。Jawaid等人，尸ZoS 〇«e，4(12):e8288 (2009)報導’一小部分來自土拉文氏桿菌之Dxr蛋白當於大腸桿菌中過度 149048.doc -274- 201111512 表現時在serl77處發生磷酸化。基於S177D及S177E突變導致蛋白質失活之觀測結果’推測此磷酸化使蛋白質失活。吾人隨後顯示，自大腸桿菌中純化之Dxr當與二曱基烯丙基二磷酸（DMAPP)或卜羥基-2-甲基-2-(E)-丁烯基4-二磷酸 (HMBPP) —起培育時失活。另外，去氧木酮糖磷酸（DXP) 途徑經遺傳修飾之大腸桿菌菌株顯示所積累之DMAPP及/ 或HMBPP之量高於野生型中所觀測之量。在不受理論約束下，基於在經工程改造之DXP途徑菌株中所觀測到之活體外Dxr失活及活體内代謝物積累之結果，吾人假定該途徑關閉及1 -去氧木酮糖-5-磷酸積累係歸因於在經工程改造之菌株中發生活體内Dxr失活。吾人發現，藉由重新平衡途徑酶且將HDMAPP及DMAPP之含量維持在低於1至2 mM DMAPP及1至2 mM HDMAPP之濃度下來阻止經工程改造之菌株中該途徑關閉。此等觀測結果例示於圖90中。圖 90A展示菌株REM H8_12之異戊二烯產量，該菌株與DXP 途徑平衡較差之菌株REMG4_11相比DXP途徑有所改良，如藉由持續異戊二烯產量及達到2.6 g/:L之力價所判定。 REM H8_12之生長展示於圖90之B圖中，而REMG4—11之生長展示於圖79C中（灰色三角形）。REM H8 —12之相應代謝物含量展示於圖90C中。至8小時之時，HDMAPP含量低於1至2 mM，且異戊二烯產量維持30小時或30小時以上（圖 90A，空心正方形）。與之相比，圖80C展示REM G4_l 1之代謝物含量。HDMAPP含量歷經10-12小時顯著高於1至2 mM，且異戊二烯產量僅維持約1 0至1 5小時，比預期短1 5 149048.doc • 275 - 201111512 至20小時（圖90A，空心圓圈）。此菌株之最終力價為0.98 g/L。 A.方法菌株描述 REM I7_ll —此菌株係藉由對下文詳述之CMP271進行修飾而產生。用如下文所述而獲得之P1溶菌液MCM754轉導 CMP271，該MCM754具有置換加基因之前的天然啟動子之經修飾PL.6啟動子（DNA序號1)。在dxs.gb DNA序號1序列處整合之FRT-neo-FRT PL.x(經 ® 修整）包括在dxs上游且包括ATG之FRT。 cgcgaagttcctattctctagaaagtataggaacttcattctaccgggtaggggaggcgcttttcccaaggcagtct ggagcatgcgctttagcagccccgctgggcacttggcgctacacaagtggcctctggcctcgcacacattccacatccaccggt aggcgccaaccggctccgttctttggtggccccttcgcgccaccttccactcctcccctagtcaggaagttcccccccgccccgc agctcgcgtcgtgcaggacgtgacaaatggaagtagcacgtctcactagtctcgtgcagatggacagcaccgctgagcaatgg aagcgggtaggcctttggggcagcggccaatagcagctttgctccttcgctttctgggctcagaggctgggaaggggtgggtcc gggggcgggctcaggggcgggctcaggggcggggcgggcgcccgaaggtcctccggaggcccggcattctgcacgcttc aaaagcgcacgtctgccgcgctgttctcctcttcctcatctccgggcctttcgacctgcagcagcacgtgttgacaattaatcatcg gcatagtatatcggcatagtataatacgacaaggtgaggaactaaaccatgggatcggccattgaacaagatggattgcacgca

ggttctccggccgcttgggtggagaggctattcggctatgactgggcacaacagacgatcggctgctctgatgccgccgtgttc cggctgtcagcgcaggggcgcccggttctttttgtcaagaccgacctgtccggtgccctgaatgaactgcaggacgaggcagc gcggctatcgtggctggccacgacgggcgttccttgcgcagctgtgctcgacgttgtcactgaagcgggaagggactggctgc tattgggcgaagtgccggggcaggatctcctgtcatctcaccttgctcctgccgagaaagtatccatcatggctgatgcaatgcg gcggctgcatacgcttgatccggctacctgcccattcgaccaccaagcgaaacatcgcatcgagcgagcacgtactcggatgg aagccggtcttgtcgatcaggatgatctggacgaagagcatcaggggctcgcgccagccgaactgttcgccaggctcaaggc gcgcatgcccgacggcgaggatctcgtcgtgacccatggcgatgcctgcttgccgaatatcatggtggaaaatggccgcttttct ggattcatcgactgtggccggctgggtgtggcggaccgctatcaggacatagcgttggctacccgtgatattgctgaagagcttg gcggcgaatgggctgaccgcttcctcgtgctttacggtatcgccgctcccgattcgcagcgcatcgccttctatcgccttcttgac gagttcttctgagcgggactctggggttcgaataaagaccgaccaagcgacgtctgagagctccctggcgaattcggtaccaat aaaagagctttattttcatgatctgtgtgttggtttttgtgtgcggcgcggaagttcctattctctagaaagtataggaacttcctcgag ccctatagtgagtcgtattaagataaccatctgcggtgataaattatctctggcggtgttgacntaaataccactggcggtgatactg agcacatcagcaggacgcactgcaaaggaggtaaaaaaacatg -276- 149048.doc 201111512 根據Gene Bridges之說明書使相關抗生素標記物環出，得到菌株WW102。另外，用具有稱為gil.6(DNA序號2)之啟動子的P1溶菌液MCM75 5轉導此菌株。 FRT-neo-FRT-gil.x-dxr 區域 BL21.gb DNA序號 2序列包括在dxr上游且包括ATG之FRT。 actaaagggcggccgcgaagttcctattctctagaaagtataggaacttcattctaccgggtaggggaggcgctttt cccaaggcagtctggagcatgcgctttagcagccccgctgggcacttggcgctacacaagtggcctctggcctcgcacacattc cacatccaccggtaggcgccaaccggctccgttctttggtggccccttcgcgccaccttccactcctcccctagtcaggaagttc

ccccccgccccgcagctcgcgtcgtgcaggacgtgacaaatggaagtagcacgtctcactagtctcgtgcagatggacagcac cgctgagcaatggaagcgggtaggcctttggggcagcggccaatagcagctttgctccttcgctttctgggctcagaggctggg aaggggtgggtccgggggcgggctcaggggcgggctcaggggcggggcgggcgcccgaaggtcctccggaggcccgg cattctgcacgcttcaaaagcgcacgtctgccgcgctgttctcctcttcctcatctccgggcctttcgacctgcagcagcacgtgtt gacaattaatcatcggcatagtatatcggcatagtataatacgacaaggtgaggaactaaaccatgggatcggccattgaacaag atggattgcacgcaggttctccggccgcttgggtggagaggctattcggctatgactgggcacaacagacgatcggctgctctg atgccgccgtgttccggctgtcagcgcaggggcgcccggttctttttgtcaagaccgacctgtccggtgccctgaatgaactgca ggacgaggcagcgcggctatcgtggctggccacgacgggcgttccttgcgcagctgtgctcgacgttgtcactgaagcggga agggactggctgctattgggcgaagtgccggggcaggatctcctgtcatctcaccttgctcctgccgagaaagtatccatcatgg ctgatgcaatgcggcggctgcatacgcttgatccggctacctgcccattcgaccaccaagcgaaacatcgcatcgagcgagca cgtactcggatggaagccggtcttgtcgatcaggatgatctggacgaagagcatcaggggctcgcgccagccgaactgttcgc caggctcaaggcgcgcatgcccgacggcgaggatctcgtcgtgacccatggcgatgcctgcttgccgaatatcatggtggaaa atggccgcttttctggattcatcgactgtggccggctgggtgtggcggaccgctatcaggacatagcgttggctacccgtgatatt gctgaagagcttggcggcgaatgggctgaccgcttcctcgtgctttacggtatcgccgctcccgattcgcagcgcatcgccttct atcgccttcttgacgagttcttctgagcgggactctggggttcgaataaagaccgaccaagcgacgtctgagagctccctggcga attcggtaccaataaaagagctttattttcatgatctgtgtgttggtttttgtgtgcggcgcggaagttcctattctctagaaagtatag gaacttcctcgagccctatagtgagtcgtattagcccttgacnatgccacatcctgagcaaataattcaaccacttttattcactaac aaatagctggtggaatatatg 起向此啟動子以置換基因之天然啟動子。根據Gene Bridges之說明書使抗生素標記物環出，得到菌株 WW103。藉由用質體pDW33進行電穿孔來轉型菌株 WW103(實例24部分C)，得到異戊二烯合成酶表現卡匣 ispS，且所得菌株命名為WW119。 B.詳細菌株構築方案 -277 - H9048.doc 5 201111512 構築菌株CMP271 構築菌株 P1溶菌液MCM754及MCM755之構築詳述於下文：引子（由 Integrated DNA Technologies 提供；Coralville，

Iowa USA) 5'- MCM3 tcgatacctcggcactggaagcgctagcggactacatcatccagcgtaataaataaacaataa 20 gtattaataggcccctgaattaaccctcactaaagggcgg MCM3 5'-

21 tgttcgggattatggcgcaccacgtccagcgtgctgcaaccaatcgagccggtcgagcccag aatggtgagttgcttcatatattccaccagctatttgttagtgaataaaagtggttgaattatttgctc aggatgtggcatNgtcaagggctaatacgactcactatagggctcg 5，- MCM3 acaaaaacgccgctcagtagatccttgcggatcggctggcggcgttttgctttttattctgtctca 37 actctggatgtttcaattaaccctcactaaagggcgg 5'- aacagtcgtaactcctgggtggagtcgaccagtgccagggtcgggtatttggcaatatcaaaa ctcatgtttttttacctcctttgcagtgcgtcctgctgatgtgctcagtatcaccgccagtggtattta MCM3 Ngtcaacaccgccagagataatttatcaccgcagatggttatcttaatacgactcactataggg 47 ctcg MCM3 27 5 '-ttgtagacatagtgcagcgcca

MCM3 5'-ccctgttgctgtagcatcgttt GB- DW 5'-aaagaccgaccaagcgacgtctga C.產生供啟動子整合用之擴增子 PL.6(修整）_心cs 使用 Herculase II Fusion套組（Stratagene)，一式四份進行PCR反應。 3 5 μί再蒸餾水（ddH20) 10 μΐ^ 5χ緩衝液 149048.doc -278· 201111512 1.25 pL 10 μΜ引子MCM320(經凝膠純化） 1.25 pL 10 μΜ引子MCM347(經凝膠純化）

0.5 μί dNTP 1 pL聚合酶 1 pL FRT-PGK-gb2-neo-FRT模板DNA，GeneBridges 目錄號 K006 反應如下循環： 95°〇2分鐘，繼之以（95°〇15 秒；55°〇15 秒；72°〇1 分

鐘）χ30次循環，72°〇3分30秒，4°C直至冷卻。 gil .6-dxr 使用 Herculase II Fusion套組（Stratagene)進行四個 PCR反應。反應不同之處為存在或不存在2 μί DMSO，且黏接溫度為55°C或60°C。 35 pL再蒸餾水 1 0 pL 5 X緩衝液 1.25 μί 10 μΜ 引子 MCM321，IDT(經凝膠純化） 1.25 pL 10 μΜ 引子 MCM337, IDT(經凝膠純化）

0.5 μί dNTP 1 μίν聚合酶 1 pL FRT-PGK-gb2-neo-FRT 模板 DNA，GeneBridges 目錄號 K006 +/- 2 μί DMSO 反應如下循環： 95°〇2分鐘，繼之以（95°〇20 秒；55°C 或 60°C><20 秒； 149048.doc •279· 201111512 72〇1分鐘）><30次循環，72。(^><3分鐘，4。〇直至。對於各擴增子，彙集四個反應物，且藉由使用 PCR、..屯化套、，且（Qiagen)pcR管柱，於％叫EB中溶離來進行純化。 D.將擴增子整合至染色體上在 3〇C 下使載運 pRedET-carb(GeneBridges)之菌株 MCM327(BL21)於含有羧苄青黴素（5〇 μ§/πιι)之[培養液 (LB)中生長隔仪，接著以1:1〇〇稀釋至新鮮中且在30t下培養2小時。添加13〇 1〇%阿拉伯糖，且在 37 C下培養細胞約2小時。藉由在一半培養物體積之冰冷再蒸餾水中洗滌3次來製備用於電穿孔之細胞，且再懸浮於1 /1 0培養物體積之冰冷再蒸餾水中。將丨〇〇 #細胞懸浮液與3 pL DNA擴增子合併於2 mm電穿孔電擊管中，以25 pFD、200 歐姆（〇hm)、2.5 kV 進行電穿孔（Gene Pulser MXcell ; BioRad) ’且即刻用5〇〇吣LB淬滅。在37。〇、震盪下回收細胞丨-3小時，接著在37t下於含有康黴素（1〇 gg/ml)之L·瓊脂（LA)板上選擇轉型體隔夜。將以各DNA擴增子轉型所產生之單一群落貼於lA+ kaMO上，且在37cC下生長隔夜。將純系接種至5 mL LB+kanlO中，生長至0D咖約為i，接著藉由將i mL 5〇% 甘油與0·5 mL培養物混合、置於乾冰上直至呈固體、接著儲存於-80 C下使其冷凍。此等操作得到菌株MCM754 [PL.6(修整）dxs]及菌株MCM755(gil.6 dja·)。擴增經整合之啟動子以藉由使用Herculase n Fusi〇n套組 149048.doc -280- 201111512 (Stratagene)進行群落PCR來定序。 3 5 pL再蒸館水 10 pL 5x緩衝液

1.25 μί 10 μΜ引子 GB-DW 1.25 μΐ： 10 μΜ引子 MCM327(dxs)或 MCM330(dxr)

0.5 pL dNTP 1 pL聚合酶群落刮下 I 反應如下循環： 95°C下持續2分鐘；（95°C下持續20秒；55°C下持續20秒； 72°C下持續30秒）><30次循環；72°C下持續3分鐘；4°C直至冷卻在由ExoSAP處理後，對PCR產物進行定序（Quintara Biosciences) ° 用引子GB-DW及MCM327對含有PL.6-dxs之P1溶菌液 φ MCM754進行定序。 5，-

Aaagaccgaccaagcgacgtctgagagctccctggcgaattcggtaccaataaaagagctttattttcatgatctgtgtgttggttt ttgtgtgcggcgcggaagttcctattctctagaaagtataggaacttcctcgagccctatagtgagtcgtattaagataaccatctgc ggtgataaattatctctggcggtgttgacataaataccactggcggtgatactgagcacatcagcaggacgcactgcaaaggag gtaaaaaaacatgagttttgatattgccaaatacccgaccctggcactggtcgactccacccaggagttacgactgtt 用引子GB-DW及MCM330對含有gil.6-dxr之PI溶菌液 MCM755進行定序。 S^aagaccgaccaagcgacgtctgagagctccctggcgaattcggtaccaataaaagagctttattttcatgatctgtgtgttggtttt tgtgtgcggcgcggaagttcctattctctagaaagtataggaacttcctcgagccctatagtgagtcgtattagcccttgacaatgc cacatcctgagcaaataattcaaccacttttattcactaacaaatagctggtggaatatatgaagcaactcaccattctgggctcgac •28卜 149048.doc 201111512 cggctcgattggttgcagcacgctggacgtggtgcgccataatcccgaacacttccgcgtagttgcgctggtggcaggcaaaaa tgtcactcgcatggtagaacagtgcctggaattctctccccgctatgccgtaatggacgatgaagcgagtgcgaaacttcttaaaa cgatgctacagcaacaggg E.自菌株MCM754及MCM755製備PI溶菌液將100 μι各別隔夜培養物（LB + kanlO)稀釋至10 mL LB + 0.2% 葡萄糖+5 mM CaCl2 中，且在 37°C、以 250 rpm 震盪下生長。30分鐘後，添加100 kL來自MG1655之通用P1 溶菌液，且使培養物返回震盪器中，維持約3小時。將溶解之培養物轉移至15 mL管中，添加200 pL氣仿，且使其渦旋30秒。將樣品以4500 g離心10分鐘，接著將含水上清液轉移至新的1 5 mL管中。添加200 pL氣仿，且將溶菌液儲存於4°C下。 F. 選殖及純化酶選殖來自大腸桿菌之Dxr，且由熟習此項技術者熟知之方法進行純化。如供應商所述將該基因插入pET 15b載體中以包括N端His標籤序列（Invitrogen, Carlsbad，CA)。收集具有質體且表現該蛋白質之BL21QDE3)大腸桿菌培養物，在弗氏細胞壓碎器中使細胞顆粒溶解，且遵循製造商（GE Healthcare, Pittsburg, PA)推薦之方案使用Ni-NTA管柱純化蛋白質。 G. 藉由與DMAPP及HDMAPP—起培育而使Dxr失活在 37°C 下，在由 1〇〇 mM Tris、100 mM NaCl(pH 8)、5 mM MgCh、0.2 mM NADPH、0.2 mM DXP及 250 nM DXR. D組成之緩衝液中，於數種濃度之DMAPP或HMBPP (Echelon Bioscience，Salt Lake City，Utah)下培育 5 μΜ經純 149048.doc -282- 201111512 化之蛋白質2小時，總體積為50 pL。根據標準檢驗（參見 > ^'J Koppisch ^ A ? Biochemistry, 41:236-43 (2002))，以失活反應混合物之20倍稀釋液週期性地量測Dxr活性。在類似條件下，在不存在DMAPP或HMBPP之情況下，於失活反應中進行酶之對照培育及檢驗。適當時，在20倍稀釋濃度之失活劑（DMAPP或HMBPP)存在下進行其他對照活性檢驗。用DMAPP以類似方式使酶之較大等分試樣（約400 Kg)失活以藉由質譜分析來驗證預期胺基酸殘基修飾。如圖92中所示，在失活培育期間酶活性下降，且失活半衰期為0.72小時。實例31:在大腸桿菌中共同表現用於製造異戊二烯之DXP 及MVA途徑 DXP途徑與MVA途徑之能量學及碳利用效率的比較揭示，DXP途徑相比MVA途徑在碳利用方面較高效，但在氧化還原平衡方面較低效。當葡萄糖為碳源時，DXP途徑之基於碳之化學計量產率為約85%(每公克所利用之葡萄糖製造之異戊二烯的公克數）。DXP途徑相比MVA途徑在能量平衡方面較低效。對於葡萄糖經由DXP製造異戊二烯，形成每莫耳異戊二烯有3莫耳NAD(P)H短缺，且缺少2莫耳 ATP。對於葡萄糖經由MVA製造異戊二烯之類似比較，此途徑製造過量4莫耳之NAD(P)H ; ATP達到平衡，然而，碳利用效率僅為約5 5 %。在不受理論約束下，可藉由在單一宿主中組合兩種途徑以使氧化還原化學及碳利用效率最佳化而製成更加平衡且更加有效之製造宿主。 149048.doc -283 - 201111512 在此實例中，吾人提供之證據與以下相一致：實務上可在單一伯主中建立兩種途徑之組合。兩種途徑之組合應得到改良之製程。將一系列包含上述兩個菌株REM H8_i2& REM 17—11之培養物置於48孔深孔板（目錄號]?_5]^1^48{_

S ; Axygen Scientific，California，USA)中，各孔提供 2 mL 培養物。稱為TM3之培養基描述於下文。在3(rc、25〇 rpm 下，使兩個菌株於補充有1 〇/〇葡萄糖及〇丨0/。酵母提取物之 TM3培養基中生長隔夜。至早晨，將兩個菌株一式兩份接種至48孔深孔板中。對丁]^3培養基補充1% [u—ucp葡萄糖及0.1%酵母提取物。在3〇。〇下以600叩111震盪培養物（81161-Lab Inc. SI6R型冷凍震盪培育箱；〇reg〇n，uSA)。兩小時後測定培養物0D，接著以定時時間間隔測定至4 25小時。在生長兩小時之時’藉由添加4〇〇 μΜ IPTG誘導培養物。誘導一小時後’各菌株之培養物亦接受〇至8 mM (R)-曱羥戊酸[目錄號Sigma M4667]。以定時時間間隔，將各培養物之100 μί等分試樣轉移至98孔深孔玻璃磚（目錄號 3 600600 Zinsser ; North America)中，即刻用不透性黏著鋁膜密封且在Eppendorf恆溫混勻器（Eppendorf; North America)上以450 rmp震盪下培育30分鐘。藉由在70°C下於第二Eppendorf恆溫混勻器上加熱7分鐘使培養物滅活。將玻璃磚轉移至附接於Agilent 5973 MS且配備有LEAP CTC CombiPAL自動取樣器以供頂部空間分析之Agilent 6890 GC中。管柱為Agilent HP-5(5%苯基曱基矽氧烷（15 mx〇.25 mmx〇.25 μηι))。將100 μΐ^體積之氣體注射於管柱上。其他 149048.doc •284· 201111512 料如下。烘箱溫度：3rc(保持等溫並持續〇 6分鐘广载軋.氦（流速-1 mL/min),在25〇。(：下注射口處之分流比為 50:1，質量為67或73之單離子監測模式（SIM);偵測器切斷·：〇.〇〇分鐘-0.42分H則器開通：〇42分鐘、_〇6°〇分鐘’異戊二烯（2_甲基+3-丁二烯）之溶離時間為約〇的分鐘，總分析時間為0.6分鐘。纟熟習此項技術者熟知之方法進行儀器校準。

由培養物OD^q對異戊二烯頂部空間量測值進行校正以得到單位為gg/L/H/OD之異戊二烯比產量量度。所有反應 =進行4小時。圖92A及圖92B展示此實驗之結果。自 13C]_葡萄糖（圖92,⑽）以及自曱經戊酸（圖92, a圖）同時製造異戊二烯。資料指示’兩個菌株中自[uJ3c]_葡萄糖製造異戊二烯獨立於自曱羥戊酸製造異戊二烯。圖％之B 圖進一步展示，在〇至8 mM範圍内之曱羥戊酸濃度下自 [U-i3C]_葡萄糖得到之異戊二烯比生產力對兩個菌株而言為相同的。此等量測在m/z為73下進行，指示⑴/以·葡萄糖利用。同時，在相同濃度範圍Θ，異紅烯比生產力隨著甲羥戊酸濃度增加而增加。此量測在m/z為以下進行，指不甲經戊酸（所有％利用。此實驗之總體結論為經由 DXP途徑製造異戊二稀不受經由下游MVA途徑自甲經戊酸製造異戊二烯影響。 TM3(每公升曝酵培養基）： K2HP04 13.6 g、ΚΗ2ρ〇4 13·6 g、MgS〇4 7H2〇 2 g 單水合檸檬酸2 g、擰檬酸鐵銨ο」g、酵母提取物丄〇 149048.doc •285- 201111512 文·資痕量金屬儲備溶液1 ml。所有組分一起添加且浴解於去離子水中。用NH4〇H將pH值調整至6.8 ,且經 0.22微米膜對溶液進行過濾滅菌。滅菌後，視需要添加抗生素。滅菌後，按指示添加葡萄糖及[R]_甲羥戊酸。 1000X改質痕量金屬儲備溶液（每公升）：單水合# 檬酸 40 g、MnS04.H20 30 g、NaCl 1〇 g、

FeS04-7H2〇 i g . C〇Cl2-6H2〇 1 g > ZnS04-7H20 1 g .

CuS04 5H20 100 mg ^ h3B03 100 mg ' NaMo04-2H20 100 mg。將各組分逐一溶解於去離子水中，用HCi/Na〇H將值調整至3·〇，接著補足溶液體積，且用0.22微米過濾器進行過填滅菌。實例V :展示菌株只£河Λ2_17經由雙重類異戊二烯生物合成途徑產生異戊二烯此處描述具有外源MVA類異戊二烯生物合成途徑與增強之DXP生物合成途徑的製造異戊二烯之大腸桿菌菌株的構築。此處呈現之資料指示，菌株REM A2_17所製造之異戊二烯同時源自兩種類型之類異戊二烯生物合成途徑。對於此特定實例，觀測到對異戊二烯製造之MVA通量貢獻：DXP通量貢獻為約3:2至1:ι ;見圖96-1〇2。構築菌株REM A2_17 根據製造商之說明書，使用來自Gene Bridges GmbH之 Red/ET系統進行此實例中所述之基因組插入。使用菌株 BL21(Novagene)。如先前所述進行耵溶菌液之製備與轉導 149048.doc -286· 201111512 (Thomason等人，2007)。pBBRlMCS-5載體已有所描述 (Kovach等人，1994)，載體構築體 MCM82、pMCM296、 pDW34、pDW33、GI1.6 fldA-ispG/pCL 及 Ptac 念珠藻屬 ispH aspA終止子/pEWL454亦有所描述（參見，例如上述實例29及WO 2009/076676)。MCM82含有編碼糞腸球菌（五. faecalis)mva.E 及 mvaS 之 pCL Ptrc 上游途徑 (UpperPathway)。Trc啟動子、Trp啟動子及aspA終止子序列獲自 NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)及 EcoCyc(http: //ecocyc.org/)所提供之資訊。構築pDWl 5(pBBRlMCS-5上之Ptrc上游MVA途徑）為將上游MVA途徑插入pBBRlMCS-5載體上，藉由使用引子上游5'XhoI及上游IXbal自MCM82進行PCR來擴增含有Ptrc、mvaE、mvaS及rrn終止子之整個表現卡匣。參見下文關於PCR引子序列（表9)、反應及循環參數之描述。根據製造商推薦之方案，藉由凝膠電泳（E-Gel，Invitrogen)確認約4.2 kb PCR產物，接著使用QiaQuick純化管柱 (Qiagen)進行純化。接著，在37°C下用Xbal及Xhol限制性核酸内切酶處理經純化之PCR產物及pBBRlMCS-5載體隔夜。參見下文關於反應條件之描述。次日，將反應物加熱至65°C以使限制性酶失活，隨後進行接合。在4°C下進行接合反應（參見下文關於條件之描述）隔夜。根據製造商推薦之方案，將約5 μΐ接合反應物轉型至化學性勝任大腸桿菌ΤΟΡ10細胞（Invitrogen)中，在37°C下於LB中回收1小時，接著塗於含有X-gal及10 pg/ml慶大黴素之LB板上。選 149048.doc •287· 201111512 擇不展示β-半乳糖苷酶活性之群落用於藉由使用引子M13 反置引子及MCM163進行PCR而作進一步分析以確認插入物之存在。對來自此等群落之一的質體進行純化（Qiagen) 且完全定序（Qumtara Biosciences ;關於引子序列，參見表 9)以驗證其含有正確定向之完整上游MVA途徑表現卡匣。 pDW 1 5之序列及圖譜分別列於下文及圖93中。 PCR反應與循環參數： 1 μΐ MCM82(約 30 ng) 10 μΐ 5x Herculase緩衝液（Stratagene) # 0. 5.μΐ dNTP(100 mM) 1 μΐ上游 5，XhoI(20 μΜ) 1 μΐ上游 3，XbaI(20 μΜ) 35.5 μΐ去離子水 1 μΐ Herculase DNA 聚合酶（Stratagene) 1. 95°C 4分鐘 2. 95°C 20分鐘，52°C 20秒，72°C 4分鐘，5x 3. 95°C 20分鐘，55°C 20秒，72°C 4分鐘，25x ® 4. 72°C 10分鐘 5. 4°C直至冷卻 DNA分解： 6 μΐ去離子水 2 μΐ l〇x緩衝液H(Roche) 10 μΐ DNA(pBBRlMCS-5 或 PCR 插入物） 1 μΐ XhoI(Roche) 149048.doc -288- 201111512 1 μΐ Xbal(Roche) 1. 37°C隔夜 2. 65°C 20分鐘（熱滅活）接合： 2 μΐ去離子水 1 μΐ l〇x接合酶缓衝液（ΝΕΒ) 1 μΐ T4 DNA接合酶（NEB)

2 μΐ 載體（pBBRlMCS-5) 4 μΐ插入物（上游MVA表現卡匣） 1. 4°C隔夜 2. 微透析（Millipore)並轉型琴勝任大腸桿菌（Invitrogen) 中表9. PCR及定序引子上游YXhoI atgctcgagctgttgacaattaatcatccggctc 上游3'XbaI cgatctagaaaggcccagtctttcgactgagcc MCM163 CF07-58 atgaaaacagtagttattattgatgc CF07-59 cttaaatcatttaaaatagc CF07-82 atgacaattgggattgataaaattag CF07-86 gaaatagccccattagaagtatc CF07-87 ttgccaatcatatgattgaaaatc CF07-88 gctatgcttcattagatccttatcg CF07-89 gaaacctacatccaatcttttgccc pDW15之序列 accttcgggagcgcctgaagcccgttctggacgccctggggccgttgaatcgggatatgcaggccaaggccgccgcgatcat caaggccgtgggcgaaaagctgctgacggaacagcgggaagtccagcgccagaaacaggcccagcgccagcaggaacgc gggcgcgcacatttccccgaaaagtgccacctggcggcgttgtgacaatttaccgaacaactccgcggccgggaagccgatct -289- 149048.doc 201111512 cggcttgaacgaattgttaggtggcggtacttgggtcgatatcaaagtgcatcacttcttcccgtatgcccaactttgtatagagag ccactgcgggatcgtcaccgtaatctgcttgcacgtagatcacataagcaccaagcgcgttggcctcatgcttgaggagattgat gagcgcggtggcaatgccctgcctccggtgctcgccggagactgcgagatcatagatatagatctcactacgcggctgctcaa acctgggcagaacgtaagccgcgagagcgccaacaaccgcttcttggtcgaaggcagcaagcgcgatgaatgtcttactacg gagcaagttcccgaggtaatcggagtccggctgatgttgggagtaggtggctacgtctccgaactcacgaccgaaaagatcaa gagcagcccgcatggatttgacttggtcagggccgagcctacatgtgcgaatgatgcccatacttgagccacctaactttgtttta gggcgactgccctgctgcgtaacatcgttgctgctgcgtaacatcgttgctgctccataacatcaaacatcgacccacggcgtaa cgcgcttgctgcttggatgcccgaggcatagactgtacaaaaaaacagtcataacaagccatgaaaaccgccactgcgccgtta ccaccgctgcgttcggtcaaggttctggaccagttgcgtgagcgcatacgctacttgcattacagtttacgaaccgaacaggctta tgtcaactgggttcgtgccttcatccgtttccacggtgtgcgtccatgggcaaatattatacgcaaggcgacaaggtgctgatgcc gctggcgattcaggttcatcatgccgtttgtgatggcttccatgtcggcagaatgcttaatgaattacaacagtttttatgcatgcgcc caatacgcaaaccgcctctccccgcgcgttggccgattcattaatgcagctggcacgacaggtttcccgactggaaagcgggc agtgagcgcaacgcaattaatgtgagttagctcactcattaggcaccccaggctttacactttatgcttccggctcgtatgttgtgtg gaattgtgagcggataacaatttcacacaggaaacagctatgaccatgattacgccaagcgcgcaattaaccctcactaaaggg aacaaaagctgggtaccgggccccccctcgagctgttgacaattaatcatccggctcgtataatgtgtggaattgtgagcggata acaatttcacacaggaaacagcgccgctgagaaaaagcgaagcggcactgctctttaacaatttatcagacaatctgtgtgggca ctcgaccggaattatcgattaactttattattaaaaattaaagaggtatatattaatgtatcgattaaataaggaggaataaaccatgg atccgagctcaggaggtaaaaaaacatgaaaacagtagttattattgatgcattacgaacaccaattggaaaatataaaggcagct taagtcaagtaagtgccgtagacttaggaacacatgttacaacacaacttttaaaaagacattccactatttctgaagaaattgatca agtaatctttggaaatgttttacaagctggaaatggccaaaatcccgcacgacaaatagcaataaacagcggtttgtctcatgaaat tcccgcaatgacggttaatgaggtctgcggatcaggaatgaaggccgttattttggcgaaacaattgattcaattaggagaagcg gaagttttaattgctggcgggattgagaatatgtcccaagcacctaaattacaacgttttaattacgaaacagaaagctacgatgcg cctttttctagtatgatgtatgatggattaacggatgcctttagtggtcaggcaatgggcttaactgctgaaaatgtggccgaaaagt atcatgtaactagagaagagcaagatcaattttctgtacattcacaattaaaagcagctcaagcacaagcagaagggatattcgct gacgaaatagccccattagaagtatcaggaacgcttgtggagaaagatgaagggattcgccctaattcgagcgttgagaagcta ggaacgcttaaaacagtttttaaagaagacggtactgtaacagcagggaatgcatcaaccattaatgatggggcttctgctttgatt attgcttcacaagaatatgccgaagcacacggtcttccttatttagctattattcgagacagtgtggaagtcggtattgatccagcct atatgggaatttcgccgattaaagccattcaaaaactgttagcgcgcaatcaacttactacggaagaaattgatctgtatgaaatca acgaagcatttgcagcaacttcaatcgtggtccaaagagaactggctttaccagaggaaaaggtcaacatttatggtggcggtatt tcattaggtcatgcgattggtgccacaggtgctcgtttattaacgagtttaagttatcaattaaatcaaaaagaaaagaaatatggag tggcttctttatgtatcggcggtggcttaggactcgctatgctactagagagacctcagcaaaaaaaaaacagccgattttatcaaa tgagtcctgaggaacgcctggcttctcttcttaatgaaggccagatttctgctgatacaaaaaaagaatttgaaaatacggctttatc ttcgcagattgccaatcatatgattgaaaatcaaatcagtgaaacagaagtgccgatgggcgttggcttacatttaacagtggacg aaactgattatttggtaccaatggcgacagaagagccctcagttattgcggctttgagtaatggtgcaaaaatagcacaaggattta aaacagtgaatcaacaacgcttaatgcgtggacaaatcgttttttacgatgttgcagatcccgagtcattgattgataaactacaagt aagagaagcggaagtttttcaacaagcagagttaagttatccatctatcgttaaacggggcggcggcttaagagatttgcaatatc gtacttttgatgaatcatttgtatctgtcgactttttagtagatgttaaggatgcaatgggggcaaatatcgttaacgctatgttggaag gtgtggccgagttgttccgtgaatggtttgcggagcaaaagattttattcagtattttaagtaattatgccacggagtcggttgttacg atgaaaacggctattccagtttcacgtttaagtaaggggagcaatggccgggaaattgctgaaaaaattgttttagcttcacgctat -290-

149048.doc 201111512 gcttcattagatccttatcgggcagtcacgcataacaaaggaatcatgaatggcattgaagctgtagttttagctacaggaaatgat acacgcgctgttagcgcttcttgtcatgcttttgcggtgaaggaaggtcgctaccaaggcttgactagttggacgctggatggcga acaactaattggtgaaatttcagttccgcttgctttagccacggttggcggtgccacaaaagtcttacctaaatctcaagcagctgct gatttgttagcagtgacggatgcaaaagaactaagtcgagtagtagcggctgttggtttggcacaaaatttagcggcgttacggg ccttagtctctgaaggaattcaaaaaggacacatggctctacaagcacgttctttagcgatgacggtcggagctactggtaaaga agttgaggcagtcgctcaacaattaaaacgtcaaaaaacgatgaaccaagaccgagccatggctattttaaatgatttaagaaaa caataaaggaggtaaaaaaacatgacaattgggattgataaaattagtttttttgtgcccccttattatattgatatgacggcactggc tgaagccagaaatgtagaccctggaaaatttcatattggtattgggcaagaccaaatggcggtgaacccaatcagccaagatatt gtgacatttgcagccaatgccgcagaagcgatcttgaccaaagaagataaagaggccattgatatggtgattgtcgggactgagt ccagtatcgatgagtcaaaagcggccgcagttgtcttacatcgtttaatggggattcaacctttcgctcgctctttcgaaatcaagg aagcttgttacggagcaacagcaggcttacagttagctaagaatcacgtagccttacatccagataaaaaagtcttggtcgtagcg gcagatattgcaaaatatggcttaaattctggcggtgagcctacacaaggagctggggcggttgcaatgttagttgctagtgaacc

gcgcattttggctttaaaagaggataatgtgatgctgacgcaagatatctatgacttttggcgtccaacaggccacccgtatcctat ggtcgatggtcctttgtcaaacgaaacctacatccaatcttttgcccaagtctgggatgaacataaaaaacgaaccggtcttgatttt gcagattatgatgctttagcgttccatattccttacacaaaaatgggcaaaaaagccttattagcaaaaatctccgaccaaactgaa gcagaacaggaacgaattttagcccgttatgaagaaagtatcgtctatagtcgtcgcgtaggaaacttgtatacgggttcactttat ctgggactcatttcccttttagaaaatgcaacgactttaaccgcaggcaatcaaattggtttattcagttatggttctggtgctgtcgct gaatttttcactggtgaattagtagctggttatcaaaatcatttacaaaaagaaactcatttagcactgctggataatcggacagaact ttctatcgctgaatatgaagccatgtttgcagaaactttagacacagacattgatcaaacgttagaagatgaattaaaatatagtattt ctgctattaataataccgttcgttcttatcgaaactaaagatctgcagctggtaccatatgggaattcgaagcttgggcccgaacaa aaactcatctcagaagaggatctgaatagcgccgtcgaccatcatcatcatcatcattgagtttaaacggtctccagcttggctgttt tggcggatgagagaagattttcagcctgatacagattaaatcagaacgcagaagcggtctgataaaacagaatttgcctggcgg cagtagcgcggtggtcccacctgaccccatgccgaactcagaagtgaaacgccgtagcgccgatggtagtgtggggtctcccc atgcgagagtagggaactgccaggcatcaaataaaacgaaaggctcagtcgaaagactgggcctttctagagcggccgccac cgcggtggagctccaattcgccctatagtgagtcgtattacgcgcgctcactggccgtcgttttacaacgtcgtgactgggaaaa ccctggcgttacccaacttaatcgccttgcagcacatccccctttcgccagctggcgtaatagcgaagaggcccgcaccgatcg cccttcccaacagttgcgeagcctgaatggcgaatggaaattgtaagcgttaatattttgttaaaattcgcgttaaatttttgttaaate agctcattttttaaccaataggccgactgcgatgagtggcagggcggggcgtaatttttttaaggcagttattggtgcccttaaacg cctggtgctacgcctgaataagtgataataagcggatgaatggcagaaattcgaaagcaaattcgacccggtcgtcggttcagg gcagggtcgttaaatagccgcttatgtctattgctggtttaccggtttattgactaccggaagcagtgtgaccgtgtgcttctcaaat gcctgaggccagtttgctcaggctctccccgtggaggtaataattgacgatatgatcatttattctgcctcccagagcctgataaaa acggtgaatccgttagcgaggtgccgccggcttccattcaggtcgaggtggcccggctccatgcaccgcgacgcaacgcggg gaggcagacaaggtatagggcggcgaggcggctacagccgatagtctggaacagcgcacttacgggttgctgcgcaaccca agtgctaccggcgcggcagcgtgacccgtgtcggcggctccaacggctcgccatcgtccagaaaacacggctcatcgggcat cggcaggcgctgctgcccgcgccgttcccattcctccgtttcggtcaaggctggcaggtctggttceatgcccggaatgccggg ctggctgggcggctcctcgccggggccggtcggtagttgctgctcgcccggatacagggtcgggatgcggcgcaggtcgcc atgccccaacagcgattcgtcctggtcgtcgtgatcaaccaccacggcggcactgaacaccgacaggcgcaactggtcgcgg ggctggccccacgccacgcggtcattgaccacgtaggccgacacggtgccggggccgttgagcttcacgacggagatccag cgctcggccaccaagtccttgactgcgtattggaccgtccgcaaagaacgtccgatgagcttggaaagtgtcttctggctgacca -291 - 149048.doc 201111512 ccacggcgttctggtggcccatctgcgccacgaggtgatgcagcagcattgccgccgtgggtttcctcgcaataagcccggcc cacgcctcatgcgctttgcgttccgtttgcacccagtgaccgggcttgttcttggcttgaatgccgatttctctggactgcgtggcca tgcttatctccatgcggtagggtgccgcacggttgcggcaccatgcgcaatcagctgcaacttttcggcagcgcgacaacaatta tgcgttgcgtaaaagtggcagtcaattacagattttctttaacctacgcaatgagctattgcggggggtgccgcaatgagctgttgc gtaccccccttttttaagttgttgatttttaagtctttcgcatttcgccctatatctagttctttggtgcccaaagaagggcacccctgcg gggttcccccacgccttcggcgcggctccccctccggcaaaaagtggcccctccggggcttgttgatcgactgcgcggccttc ggccttgcccaaggtggcgctgcccccttggaacccccgcactcgccgccgtgaggctcggggggcaggcgggcgggcttc gccttcgactgcccccactcgcataggcttgggtcgttccaggcgcgtcaaggccaagccgctgcgcggtcgctgcgcgagc cttgacccgccttccacttggtgtccaaccggcaagcgaagcgcgcaggccgcaggccggaggcttttccccagagaaaatta aaaaaattgatggggcaaggccgcaggccgcgcagttggagccggtgggtatgtggtcgaaggctgggtagccggtgggca atccctgtggtcaagctcgtgggcaggcgcagcctgtccatcagcttgtccagcagggttgtccacgggccgagcgaagcgag ccagccggtggccgctcgcggccatcgtccacatatccacgggctggcaagggagcgcagcgaccgcgcagggcgaagcc cggagagcaagcccgtagggcgccgcagccgccgtaggcggtcacgactttgcgaagcaaagtctagtgagtatactcaagc attgagtggcccgccggaggcaccgccttgcgctgcccccgtcgagccggttggacaccaaaagggaggggcaggcatgg cggcatacgcgatcatgcgatgcaagaagctggcgaaaatgggcaacgtggcggccagtctcaagcacgcctaccgcgagc gcgagacgcccaacgctgacgccagcaggacgccagagaacgagcactgggcggccagcagcaccgatgaagcgatgg gccgactgcgcgagttgctgccagagaagcggcgcaaggacgctgtgttggcggtcgagtacgtcatgacggccagcccgg aatggtggaagtcggccagccaagaacagcaggcggcgttcttcgagaaggcgcacaagtggctggcggacaagtacggg gcggatcgcatcgtgacggccagcatccaccgtgacgaaaccagcccgcacatgaccgcgttcgtggtgccgctgacgcag gacggcaggctgtcggccaaggagttcatcggcaacaaagcgcagatgacccgcgaccagaccacgtttgcggccgctgtg gccgatctagggctgcaacggggcatcgagggcagcaaggcacgtcacacgcgcattcaggcgttctacgaggccctggag cggccaccagtgggccacgtcaccatcagcccgcaagcggtcgagccacgcgcctatgcaccgcagggattggccgaaaa gctgggaatctcaaagcgcgttgagacgccggaagccgtggccgaccggctgacaaaagcggttcggcaggggtatgagcc tgccctacaggccgccgcaggagcgcgtgagatgcgcaagaaggccgatcaagcccaagagacggcccgag 構築 PTrp mMVK/pDW15 引子 *引子經5'磷酸化修飾

*5* phos Ptrp 5' mMVK 5'-TGGCAAATATTCTGAAATGA GCTGTTGACAATTAATCATCGAACTAGTTAACTAGTACGC AAGTTCACGTAAAAAGGGTATCGACATGGTATCCTGTTC TGCGCCGGGTAAGA *3’ phos aspA 終止子 3’ mMVK 5，-CAAGAAAAAAGGCAC

GTCATCTGACGTGCCTTTTTTATTTGTATTAATCTACTTTC •292·

149048.doc 201111512

AGACCTTGCTCGGTCGG

5· mMVK序列弓I 子 5，-GATACGTATGTTTCTACCTTC 3* mMVK序列引子 5'-GAAGGTAGAAACATACGTATC

EL1003 5'-GATAGTAACGGCTGCGCTGCTACC

MCM 177 5'-GGGCCCGTTTAAACTTTAACTAGACTTTAAT CTACTTTCAGACCTTGC 擴增PTrp mMVK片段 PTrp mMVK之PCR反應

0.5 μΐ載體模板pDW34 10 μΐ Herculasell緩衝液 0.5 μΐ dNTP(100 mM)

1.25 μΐ 引子（10 μΜ)5' phos Ptrp 5' mMVK 1.25 μΐ 引子（10 μΜ)3' phos aspA終止子 3' mMVK 36 μΐ去離子水 + 0.5 μΐ 來自循環參數： 95°C><2分鐘；[95°〇30秒，60°〇30秒，72°〇2分鐘]χ29次循環；72°〇5分鐘； 4°C直至冷卻（Biometra T3 000 Combi溫度循環器）在0.8〇/〇 E-gel(Invitrogen)上分離所得PCR片段以驗證成功擴增，且根據製造商之說明書使用QIAquick PCR純化套組（Qiagen)進行純化。所得經純化儲備物稱作PTrp mMVK ;注意，所用引子含有5’磷酸化末端。將PTrp mMVK片段選殖至pDW15中 149048.doc •293 · 201111512 根據製造商之說明書，用SfoI(New England Biolabs)分解約500 ng pDW15質體。接著根據製造商建議之方案，使用rAPpid鹼性磷酸酶（R〇ch6)脫除Sfol切割載體之磷酸《使用Qiagen QiaQuick凝膠萃取套組清潔經分解/脫除磷酸之 DNA，隨後進行接合。根據製造商建議之方案，使用來自 New England Biolabs 之 T4 DNA 接合酶將一部分 PTrp mMVK片段（51末端經磷酸化）接合於經清潔/Sfol切割/脫除磷酸之pDW15質體。使用標準熱休克方案（Sambrook等人，1989)以接合反應轉型化學性勝任TOP10細胞 (Invitrogen)，在37°C下於L培養液中回收1小時，接著塗於含有慶大黴素（10 pg/ml)之Li复脂上。選擇慶大黴素抗性群落，於含有慶大黴素（1〇 Mg/ml)之L培養液中生長隔夜，且加以收集以供隨後製備質體。使用Qiagen Qiaprep Spin Miniprep套組分離質體構築體。使用引子5’ mMVK序列引子、3, mMVK序列引子、ELI003及MCM 177對相關質體製劑進行定序（Sequetech ; Mountain View，CA) ’且鑑別正確 PTrp mMVK/pDW15純系；所得相關純系已命名為菌株 REM H9_14(TOP10 w/PTrp mMVK/pDW15 ;經 PTrp mMVK 破壞之Sfol位點以如構築體中所存在之Ptrc mvaE-mvaS操縱子之定向插入；見圖94)。 PTrp mMVK/pDW15之序列 accttcgggagcgcctgaagcccgttctggacgccctggggccgttgaatcgggatatgcaggccaaggccgccgcgatcat caaggccgtgggcgaaaagctgctgacggaacagcgggaagtccagcgccagaaacaggcccagcgccagcaggaacgc gggcgcgcacatttccccgaaaagtgccacctggcggcgttgtgacaatttaccgaacaactccgcggccgggaagccgatct cggcttgaacgaattgttaggtggcggtacttgggtcgatatcaaagtgcatcacttcttcccgtatgcccaactttgtatagagag ccactgcgggatcgtcaccgtaatctgcttgcacgtagatcacataagcaccaagcgcgttggcctcatgcttgaggagattgat 149048.doc -294- 201111512 gagcgcggtggcaatgccctgcctccggtgctcgccggagactgcgagatcatagatatagatctcactacgcggctgctcaa acctgggcagaacgtaagccgcgagagcgccaacaaccgcttcttggtcgaaggcagcaagcgcgatgaatgtcttactacg gagcaagttcccgaggtaatcggagtccggctgatgttgggagtaggtggctacgtctccgaactcacgaccgaaaagatcaa gagcagcccgcatggatttgacttggtcagggccgagcctacatgtgcgaatgatgcccatacttgagccacctaactttgtttta gggcgactgccctgctgcgtaacatcgttgctgctgcgtaacatcgttgctgctccataacatcaaacatcgacccacggcgtaa cgcgcttgctgcttggatgcccgaggcatagactgtacaaaaaaacagtcataacaagccatgaaaaccgccactgcgccgtta ccaccgctgcgttcggtcaaggttctggaccagttgcgtgagcgcatacgctacttgcattacagtttacgaaccgaacaggctta tgtcaactgggttcgtgccttcatccgtttccacggtgtgcgtccatgggcaaatattatacgcaaggcgacaaggtgctgatgcc gctggcgattcaggttcatcatgccgtttgtgatggcttccatgtcggcagaatgcttaatgaattacaacagtttttatgcatgcgcc caatacgcaaaccgcctctccccgcgcgttggccgattcattaatgcagctggcacgacaggtttcccgactggaaagcgggc agtgagcgcaacgcaattaatgtgagttagetcactcattaggcaccccaggctttacactttatgcttccggctcgtatgttgtgtg gaattgtgagcggataacaatttcacacaggaaacagctatgaccatgattacgccaagcgcgcaattaaccctcactaaaggg aacaaaagctgggtaccgggccccccctcgagctgttgacaattaatcatccggctcgtataatgtgtggaattgtgagcggata

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MVD-ylDI 構築整合構築體PMCM900 - 297- 149048.doc 201111512 用氯黴素抗性卡匣及Trc啟動子置換pMCM296之GI1.6啟動子及酵母MVK基因。藉由使用引子MCM127及MCM375 自pMCM883(GeneBridges cmR卡匣）擴增而產生cmR抗性卡匣-Ptrc片段。2，根據製造商關於含有35 μ：ί水、10 μΐ^缓衝液、0·5 pL dNTP、1.25 pL各引子（10 μΜ)、1 μί質體模板、1 μίν 聚合酶之 Herculase II Fusion(Agilent #600679)之方案產生50 μί反應物。反應如下循環：95°C 2:00 ; 3〇x(95〇C 0:20，55°C 0:20，72°C 1:00) ； 72〇C 3:00 ； 4°C Jl 至冷卻。在 37°C 下，於含有 5 μί DNA、1 gL EcoRV、1 pL Notl(擴增子）或 1 pL StuI(pMCM296)、1 pL Roche 緩衝液 H 及2 μί再蒸餾水之10 μί反應物中分解約1.6 kb擴增子及質體pMCM296(下文所述），持續2小時。在65°C下將反應物熱滅活2小時，接著在Qiagen PCR管柱上純化經分解之 DNA並於30 μί EB中溶離。在室溫下，於含有1 pL pMCM296、3 μΐ切割擴增子、5 μ!^緩衝液3及1 μί接合酶之10 μί Roche快速接合套組反應物中接合經溶離之 DNA。將經接合之DNA轉型至Invitrogen Pirl化學性勝任細胞中，在37°C下回收1小時，塗於LB/cmp(25 gg/mL) 上，接著在37°C下生長隔夜。純化所得質體且在整個啟動子區上進行定序。冷凍第四純系，稱為PMCM900 ;見圖 95 ° 將cmR-Ptrc-KDyl整合至宿主BL21 t pgl中以產生 MCM928 149048.doc •298 - 201111512 菌株 MCM865 為菌株 MD253(BL21 t pgl pRedET-carb)之等分試樣。在30°C下使MCM865於LB+carb50.中生長隔夜，接著以1:100稀釋至新鮮LB+carb50中且在30°C下培養2小時。添加130 μί 1 0%阿拉伯糖，且在37°C下培養細胞約2 小時。藉由在一半培養物體積之冰冷再蒸餾水中洗滌3次來製備用於電穿孔之細胞，且再懸浮於1/1〇培養物體積之冰冷再蒸餾水中。將100 #細胞懸浮液與1 μι pMCM900 DNA合併於2 mm電穿孔電擊管中，以25 pFD、200歐姆、 2.5 kV進行電穿孔’且即刻用5〇〇 pL LB淬滅。在37°C、震盪下回收細胞1-3小時，接著在37°C下於LB cmp5板上選擇轉型體隔夜。在LB cmp5上再劃線培養後，測試轉型體於LB cmp5、 LB kanlO及LB carb50上之生長。冷洗cmpR/carbS/kanS純系，稱為MCM928。引子 MCM139 ttttgcggccgcaattaaccctcactaaagggcgg MCM375 gatcgatatccctgcaggaaattgttatccgctcacaattccacacattatacgagccggatgattaattgtcaaca gctaatacgactcactatagggctcg

PMCM900之序列 caagaaaaatgccccgcttacgcagggcatccatttattactcaaccgtaaccgattttgccaggttacgcggctggtcaacgtcggtgcctttgat cagcgcgacatggtaagccagcagctgcagcggaacggtgtagaagatcggtgcaatcacctcttccacatgcggcatctcgatgatgtgcat gttatcgctacttacaaaacccgcatcctgatcggcgaagacatacaactgaccgccacgcgcgcgaacttcttcaatgttggatttcagtttttcca gcaattcgttgttcggtgcaacaacaataaccggcatatcggcatcaattagcgccagcggaccgtgtttcagttcgccagcagcgtaggcttca gcgtgaatgtaagagatctctttcaacttcaatgcgccttccagcgcgattgggtactgatcgccacggcccaggaacagcgcgtgatgtttgtca gagaaatcttctgccagcgcttcaatgcgtttgtcctgagacagcatctgctcaatacggctcggcagcgcctgcagaccatgcacgatgtcatgt tcaatggaggcatccagacctttcaggcgagacagcttcgccaccagcatcaacagcacagttaactgagtggtgaatgctttagtggatgccac gccgatttctgtacccgcgttggtcattagcgccagatcggattcgcgcaccagagaagaacxcggaacgttacagattgccagtgaaccaagg taacccagctctttcgacagacgcaggccagccagggtatccgcggtttcgccagactgtgacacgatcgcccttcccaacagttgcgcagcct 149048.doc -299- 201111512 atacgtacggcagtttaaggtttacacctataaaagagagagccgttatcgtctgtttgtggatgtacagagtgatattattgacacgccggggcga cggatggtgatccccctggccagtgcacgtctgctgtcagataaagtctcccgtgaactttacccggtggtgcatatcggggatgaaagctggcg catgatgaccaccgatatggccagtgtgccggtctccgttatcggggaagaagtggctgatctcagccaccgcgaaaatgacatcaaaaacgc cattaacctgatgttctggggaatataaatgtcaggcatgagattatcaaaaaggatcttcacctagatccttttcacgtagaaagccagtccgcag aaacggtgctgaccccggatgaatgtcagctactgggctatctggacaagggaaaacgcaagcgcaaagagaaagcaggtagcttgcagtgg gcttacatggcgatagctagactgggcggttttatggacagcaagcgaaccggaattgccagctggggcgccctctggtaaggttgggaagcc ctgcaaagiaaactggatggctttctcgccgccaaggatctgatggcgcaggggatcaagetctgatcaagagacaggatgaggatcgtttcgc atgattgaacaagatggattgcacgcaggttctccggccgcttgggtggagaggctattcggctatgactgggcacaacagacaatcggctgct ctgatgccgccgtgttocggctgtcagcgcaggggcgcccggttctttttgtcaagaccgacctgtccggtgccctgaatgaactgcaagacga ggcagcgcggctatcgtggctggccacgacgggcgttccttgcgcagctgtgctcgacgttgtcactgaagcgggaagggactggctgctatt gggcgaagtgccggggcaggatctcctgtcatctcaccttgctcctgccgagaaagtatccatcatggctgatgcaatgcggcggctgcatacg cttgatccggctacctgcccattcgaccaccaagcgaaacatcgcatcgagcgagcacgtactcggatggaagccggtcttgtcgatcaggatg atctggacgaagagcatcaggggctcgcgccagccgaactgttcgccaggctcaaggcgagcatgcccgacggcgaggatctcgtcgtgac ccatggcgatgcctgcttgccgaatatcatggtggaaaatggccgcttttctggattcatcgactgtggccggctgggtgtggcggaccgctatca^ ggacatagcgttggctacccgtgatattgctgaagagcttggcggcgaatgggctgaccgcttcctcgtgctttacggtatcgccgctcccgattc gcagcgcatcgccttctatcgccttcttgacgagttcttctgaattattaacgcttacaatttcctgatgcggtattttctccttacgcatctgtgcggtat ttcacaccgcatacaggtggcacttttcggggaaatgtgcgcggaacccctatttgtttatttttctaaatacattcaaatatgtatccgctcatgagac aataaccctgataaatgcttcaataatagcacgtgaggagggccaccatggccaagttgaccagtgccgttccggtgctcaccgcgcgcgacgt cgccggagcggtcgagttctggaccgaccggctcgggttctcccctagtaacggccgccagtgtgctggaattcaggcagttcaacctgttgat agtacgtactaagctctcatgtttcacgtactaagctctcatgtttaacgtactaagctctcatgtttaacgaactaaaccctcatggctaacgtactaa gctctcatggctaacgtactaagctctcatgtttcacgtactaagctctcatgtttgaacaataaaattaatataaatcagcaacttaaatagcctctaa ggttttaagttttataagaaaaaaaagaatatataaggcttttaaagcttttaaggtttaacggttgtggacaacaagccagggatgtaacgcactga gaagcccttagagcctctcaaagcaattttcagtgacacaggaacacttaacggctgacagcctgaattctgcagatatctgtttttccactcttcgtt cactttcgccaggtagctggtgaagacgaaggaagtcccggagccatctgcgcggcgtactacagcaatgttttgtgaaggcagtttcagaccc ggattcagtttggcgatggcttcatcatcccacttcttgattttgcccaggtagatgtcgccgagggttttaccatccagcaccagttcgccagacttc agccctggaatgttaaccgccagcaccacgccgccaatcacggtcgggaactggaacagaccttcctgagccagtttttcgtcagacagcggc gcgtcagaggcaccaaaatcaacggtattagcgataatctgttttacgccaccggaagaaccgataccctggtagttaactttattaccggtttcttt( ctggtaagtgtcagcccatttggcatacaccggcgcagggaaggttgcacctgcacctgtcaggcttgcttctgcaaacacagagaaagcactc atcgataaggtcgcggcgacaacagttgcgacggtggtacgcataactttcataatgtctcctgggaggattcataaagcattgtttgttggctacg agaagcaaaataggacaaacaggtgacagttatatgtaaggaatatgacagttttatgacagagagataaagtcttcagtctgatttaaataagcgt tgatattcagtcaattacaaacattaataacgaagagatgacagaaaaattttcattctgtgacagagaaaaagtagccgaagatgacggtttgtca catggagttggcaggatgtttgattaaaagcggccgcgaagttcctattctctagaaagtataggaacttcattctaccgggtaggggaggcgcttt tcccaaggcagtctggagcatgcgctttagcagccccgctgggcacttggcgctacacaagtggcctctggcctcgcacacattccacatccac cggtaggcgccaaccggctccgttctttggtggccccttcgcgccaccttccactcctcccctagtcaggaagttcccccccgccccgcagctcg cgtcgtgGaggacgtgacaaatggaagtagcacgtctcactagtctcgtgcagatggacagcaccgctgagcaatggaagcgggtaggccttt ggggcagcggccaatagcagctttgctccttcgctttctgggctcagaggctgggaaggggtgggtccgggggcgggctcaggggcgggct caggggGggggcgggcgcccgaaggtcctccggaggcccggcattctgcacgcttcaaaagcgcacgtctgccgcgctgttctcctcttcctc atctccgggcctttcgacctgcagcagcacgtgttgacaattaatcatcggcatagtatatcggcatagtataatacgacaaggtgaggaactaaa ccatggagaaaaaaatcactggatataccaccgttgatatatcccaatggcatcgtaaagaacattttgaggcatttcagtcagttgctcaatgtacc 149048.doc - 300- 201111512 tataaccagaccgttcagctggatattacggcctttttaaagaccgtaaagaaaaataagcacaagttttatccggcctttattcacattcttgcccgc ctgatgaatgctcatccggaattccgtatggcaatgaaagacggtgagctggtgatatgggategtgttcacccttgttacaccgttttccatgagc aaactgaaacgttttcatcgctctggagtgaataccacgacgatttccggcagtttctacacatatattcgcaagatgtggcgtgttacggtgaaaac ctggcctatttocctaaagggtttattgagaatatgtttttcgtctcagccaatccctgggtgagtttcaccagttttgatttaaacgtggccaatatgga caacttcttcgcccccgttttcaccatgggcaaatattatacgcaaggcgacaaggtgctgatgccgctggcgattcaggttcatcatgccgtttgt gatggcttccatgtcggcagaatgcttaatgaattacaacagtactgcgatgagtggcagggcggggcgtaagcgggactctggggttcgaata aagaccgaccaagcgacgtctgagagctccctggcgaattcggtaccaataaaagagctttattttcatgatctgtgtgttggtttttgtgtgcggcg cggaagttcctattctctagaaagtataggaacttcctcgagccctatagtgagtcgtattagctgttgacaattaatcatccggctcgtataatgtgt ggaattgtgagcggataacaatttcctgcagggatcctgcacccttaaggaggaaaaaaacatgtcagagttgagagccttcagtgccccaggg aaagcgttactagctggtggatatttagttttagatacaaaatatgaagcatttgtagtcggattatcggcaagaatgcatgctgtagcccatccttac ggttcattgcaagggtctgataagtttgaagtgcgtgtgaaaagtaaacaatttaaagatggggagtggctgtaccatataagtcctaaaagtggct tcattcctgtttcgataggcggatctaagaaccctttcattgaaaaagttatcgctaacgtatttagctactttaaacctaacatggacgactactgcaa

tagaaacttgttcgttattgatattttctctgatgatgcctaccattctcaggaggatagcgttaccgaacatcgtggcaacagaagattgagttttcatt cgcacagaattgaagaagttcccaaaacagggctgggctcctcggcaggtttagtcacagttttaactacagctttggcctccttttttgtatcggac ctggaaaataatgtagacaaatatagagaagttattcataatttagcacaagttgctcattgtcaagctcagggtaaaattggaagcgggtttgatgt agcggcggcagcatatggatctatcagatatagaagattcccacccgcattaatctctaatttgccagatattggaagtgctacttacggcagtaaa ctggcgcatttggttgatgaagaagactggaatattacgattaaaagtaaccatttaccttcgggattaactttatggatgggcgatattaagaatggt tcegaaacagtaaaactggtccagaaggtaaaaaattggtatgattcgcatatgccagaaagcttgaaaatatatacagaactcgatcatgcaaatt ctagatttatggatggactatctaaactagatcgcttacacgagactcatgacgattacagcgatcagatatttgagtctcttgagaggaatgactgt acctgtcaaaagtatcctgaaatcacagaagttagagatgcagttgccacaattagacgttcctttagaaaaataactaaagaatctggtgccgata tcgaacctcccgtacaaactagcttattggatgattgccagaccttaaaaggagttcttacttgcttaatacctggtgctggtggttatgacgccattg cagtgattactaagcaagatgttgatcttagggctcaaaccgctaatgacaaaagattttctaaggttcaatggctggatgtaactcaggctgactg gggtgttaggaaagaaaaagatccggaaacttatcttgataaataacttaaggtagctgcatgcagaattcgcccttaaggaggaaaaaaaaatg accgtttacacagcatccgttaccgcacccgtcaacatcgcaacccttaagtattgggggaaaagggacacgaagttgaatctgcccaccaattc gtccatatcagtgactttatcgcaagatgacctcagaacgttgacctctgcggctactgcacctgagtttgaacgcgacactttgtggttaaatgga gaaccacacagcatcgacaatgaaagaactcaaaattgtctgcgcgacctacgccaattaagaaaggaaatggaatcgaaggacgcctcattg cccacattatctcaatggaaactccacattgtctccgaaaataactttcctacagcagctggtttagcttcctccgctgctggctttgctgcattggtct ctgcaattgctaagttataccaattaccacagtcaacttcagaaatatctagaatagcaagaaaggggtctggttcagcttgtagatcgttgtttggc ggatacgtggcctgggaaatgggaaaagctgaagatggtcatgattccatggcagtacaaatcgcagacagctctgactggcctcagatgaaa gcttgtgtcctagttgtcagcgatattaaaaaggatgtgagttccactcagggtatgcaattgaccgtggcaacctccgaactatttaaagaaagaa ttgaacatgtcgtaccaaagagatttgaagtcatgcgtaaagccattgttgaaaaagatttcgccacctttgcaaaggaaacaatgatggattccaa ctctttccatgccacatgtttggactctttccctccaatattctacatgaatgacacttccaagcgtatcatcagttggtgccacaccattaatcagtttta cggagaaacaatcgttgcatacacgtttgatgcaggtccaaatgctgtgttgtactacttagctgaaaatgagtogaaactctttgcatttatctataa attgtttggctctgttcctggatgggacaagaaatttactactgagcagcttgaggctttcaaccatcaatttgaatcatctaactttactgcacgtgaa ttggatcttgagttgcaaaaggatgttgccagagtgattttaactcaagtcggttcaggcccacaagaaacaaacgaatctttgattgacgcaaaga ctggtctaccaaaggaataagatcaattcgctgcatcgcccttaggaggtaaaaaaaaatgactgccgacaacaatagtatgccccatggtgcag tatctagttacgccaaattagtgcaaaaccaaacacctgaagacattttggaagagtttcctgaaattattccattacaacaaagacctaatacccga tctagtgagacgtcaaatgacgaaagcggagaaacatgtttttctggtcatgatgaggagcaaattaagttaatgaatgaaaattgtattgttttggat tgggacgataatgctattggtgccggtaccaagaaagtttgtcatttaatggaaaatattgaaaagggtttactacatcgtgcattctccgtctttatttt -301- 149048.doc 201111512 caatgaacaaggtgaattacttttacaacaaagagccactgaaaaaataactttccctgatctttggactaacacatgctgctctcatccactatgtat tgatgacgaattaggtttgaagggtaagctagacgataagattaagggcgctattactgcggcggtgagaaaactagatcatgaattaggtattcc agaagatgaaactaagacaaggggtaagtttcactttttaaacagaatccattacatggcaccaagcaatgaaccatggggtgaacatgaaattg attacatcctattttataagatcaacgctaaagaaaacttgactgtcaacccaaacgtcaatgaagttagagacttcaaatgggtttcaccaaatgatt tgaaaactatgtttgctgacccaagttacaagtttacgccttggtttaagattafflgcgagaattacttattcaactggtgggagcaattagatgacctt tctgaagtggaaaatgacaggcaaattcatagaatgctataacaacgcgtctacaaataaaaaaggcacgtcagatgacgtgccttttttcttggg gcc 構築KEMH4_15，菌株REMA2_17之親本背景經由PI介導之轉導將上述菌株MCM928之氣黴素標記 PTrc PMK-MVD-yIDI基因座引入菌株WW103中（參見，例如實例29及30)。所得氣黴素抗性菌株稱為REM H4_15(BL21 pgl+ PL.6-dxs, GI1.6-dxr, GI1.6 yIDI, CMP:: PTrc PMK-MVD-yIDI)。產生REM A2_17之策略藉由 pDW33、PTrp mMVK/pDW15、Ptac念珠藻屬 ispH aspA終止子/pEWL454及最後GI1.6 :0〇1八-丨8口0/卩(1^(最初進入菌株REM H4_15中）之後續質體轉型來產生REM A2_17。使用BIO RAD Gene Pulser系統（0.1 cm電擊管，目錄號 165-2089)及製造商（BIO RAD)建議之轉型方案，經由電穿孔以pDW33轉型經水洗之REM H4_15細胞。在37。(：下於L 培養液中回收細胞1小時’接著塗於含有羧苄青黴素（50 pg/ml)之L瓊脂上。選擇一個羧苄青黴素抗性群落，稱為 REM A4_16，隨後經由所述方法以PTrp mMVK/pDW15進行轉型；在此狀況下’使用含有羧苄青黴素（50 pg/ml)及慶大黴素（10 pg/ml)之L瓊脂作為選擇劑，得到羧苄青黴素及慶大黴素抗性菌株REM 14_16。類似地，以ptac念珠藻 -302- 149048.doc 201111512 屬ispH aspA終止子/pEWL454轉型REM I4_16，得到叛节青徽素（50 μ§/ιη1)、慶大黴素（l〇 Kg/tnl)及康黴素（5〇 pg/ml)抗性菌株 REM C5_16。最後，以 GI1.6 fldA_ ispG/pCL轉型菌株REM C5_16，得到羧苄青黴素（5〇、慶大黴素（10 Pg/ml)、康黴素（50 pg/ml)及壯觀黴素（50 pg/ml)抗性菌株 reM A2_17。實例33 :使用未經標記、經標記或經3_i3c標記之葡萄糖作為唯一碳源來分析在存在及不存在膦胺黴素 (fosmidomycin)之情況下菌株rem A2_17之生長、異戊二烯產量及DXP與MVA代謝物積累先前確定，將1 mM膦胺黴素添加至具有與REM A2 17 菌株共有之GI1.6-dxr基因座的大腸桿菌BL21菌株之生長培養基十可抑制異戊二浠產量至不可彳貞測之水準。膦胺黴素抑制執行内源大腸桿菌DXP途徑之關鍵步驟之DXr酶的活性（KUzuyama等人，1998)。此外，發現將1 mM膦胺黴素添加至具有REM A2_ 17中所存在之相同異源MVA類異戊二稀生物合成途徑酶之無dxr大腸桿菌BL21菌株的生長培養基中會維持與不存在膦胺黴素之情況下生長時相同水準之異戊二烯產量。此資料指示，DXR抑制劑（膦胺黴素）不會不利地影響通過MVA類異戊二烯生物合成途徑之活體内通量。由REM A2_17菌株產生之異戊二烯之比生產力在小規模頂部空間檢驗及相應DXP與MVA代謝物測定研究中使用2 mM膦胺黴素與1-13C葡萄糖（Isotec)或3_nc葡萄 149048.doc - 303- 201111512 糖（Omicron Biochemicals，Inc)之組合’以展示經由於REm A2—丨7内表現之雙重MVA與Dxp類異戊二烯生物合成途徑通向異戊二烯之並行通量。參見下文關於使用葡萄糖及3-13C葡萄糖產生源自Dxp途徑之經獨特標記之異戊二烯 (可與經由MVA途徑產生之異戊二烯加以區分）之基本原理的描述。圖98及圖99中展示利用經及3_i3c標記之葡萄糖之頂部空間檢驗的結果，其指示對菌株11£1^ A2—17產生之異戊二烯之MVA通量貢獻為57-58%且DXP通量貢獻為 42 43 /〇，如由異戊一稀比生產力所確定。此等結果與圖％中所示之未經標δ己葡萄糖貫驗中所觀測之結果（58% Μ乂八及41% DXP)幾乎一致。有趣的是，圖1〇1及圖1〇2中所描繪的自REM A2—17所製造之異戊二烯中存在之各種丨2C及 13C同位素比率之Gc/MS分析獲得之結果表明，對所產生之異戊二烯之MVA通量貢獻及DXP通量貢獻分別為58_62% 及42-38%。此數據與由異戊二烯比生產力測定所測定之數據一致。藉由使用色胺酸抑制與MVA途徑共有之MVK酶之表現來進一步支持通向異戊二烯之雙重碳通量下調REM A2_l 7 所具有之MVA及DXP類異戊二烯生物合成途徑（關於含 PTrp，MVK載體之說明’參見圖94)。[色胺酸啟動子PTrp控管REM A2一17中MVK之表現；Trp抑制子當結合於色胺酸時抑制Trp啟動子之活性；請參見關於經EcoCyc可得之trp 操縱子之資訊（http://ecocyc.org/)]。圖98中之數據指示，當REM A2_17在50 μΜ色胺酸存在下生長時，通向異戊二 149048.doc •304· 201111512 烯之MVA通量之比例降低約8%，使得菌株中對異戊二烯之MVA通量貢獻：DXP通量貢獻接近1:1。 DXP及MVA途徑代謝物於REM 8A2_17菌株中之積累圖97比較在存在及不存在膦胺黴素之情況下生長之REM A2_l 7菌株中DXP及MVA途徑代謝物之積累。經偵測且藉由LC-MS/MS定量之代謝物中有甲羥戊酸（MVA途徑中間物）、DXP、MEP、CDP-ME、cMEPP、HDMAPP(DXP途徑中間物），及IPP與DMAPP(DXP與MVA途徑之中間物）。在 • 抑制DXP轉化成MEP之膦胺黴素存在下生長之細胞中， DXP濃度顯著增加且MEP、CDP-ME及cMEPP濃度下降，但MVA濃度不變。在經膦胺黴素處理之樣品中所觀測到之 HDMAPP減少程度明顯小於其他DXP途徑代謝物（諸如 MEP、CDP-ME及cMEPP)之減少程度，此可能歸因於LC-MS/MS方法對HDMAPP之敏感度較差及與HDMAPP量測相關之誤差較大。在膦胺黴素存在下IPP及DMAPP之累積量 φ 平均減少55%，此與異戊二烯製造速率下降41%相關聯。總而言之，此等數據證實DXP與MVA途徑在REM A2_17菌株中均發揮功能且與兩種途徑促成在無膦胺黴素之情況下生長之細胞中製造異戊二烯的觀點相一致。使用經標記之葡萄糖量測DXP及MVA途徑對異戊二烯製造之貢獻的基本原理為證實在REM A2_17菌株中異戊二烯係經由同時起作用之DXP與M VA途徑製造，使上述菌株在特定位置處含有 13C同位素之葡萄糖上生長。如圖1 00中所說明，當細胞於 I49048.doc - 305 - 201111512 i-13c葡萄糖上生長時，預期經由MVA路徑合成之異戊二烯分子相比經由DXP路徑合成之分子富集nc之程度較咼，而當細胞於3-13C葡萄糖上生長時，經由MVA路徑合成之異戊二烯分子相比經由Dxp路徑製成之異戊二烯分子應含有較少13c，此係因為當丙酮酸轉化成乙醯基_c〇a 時，經13C標記之碳以13c〇2形式釋放。當兩種途徑同時起作用時，細胞放出之異戊二烯之nc標記模式應由兩種路徑中每一者所製造之異戊二烯分子之標記模式的疊加來表示0 異戊二烯標記實驗圖101展不於A)l-13c葡萄糖或B)3_nc葡萄糖上生長之 REM A2_l 7菌株所製造之cMEpp及異戊二烯同位素標記異構體組（cumomer)(累積同位素異構體）之相對豐度計算值。 cMEPP及異戊二烯之同位素標記異構體組豐度可直接地彼此相比較，因為該兩種化合物在其分子中均含有五個碳原子，而0、P及Η原子之數目的差異因除i6〇、3ip及ιΗ以外之同位素的天然豐度極低而可忽略。所量測之cMEpp同位素標s己異構體組豐度之分佈應等同於經由Dxp途徑專製之異戊一烯之同位素標記異構體組分佈，且明顯不同於在不存在膦胺黴素之情況下生長之細胞的異戊二烯同位素標記異構體組之計算分佈（比較圖1〇1Α及叩中「異戊二烯 (-FM)」與cMEPP(-FM)條之幅度），指示1)；?(1)與MVA途徑一起促成REMA2一17菌株合成異戊二烯。

藉由S測在2 mM膦胺黴素存在下放出之異戊二烯之GC 149048.doc • 306 · 201111512 光譜來估計於l-〗3c葡萄糖或3_13C葡萄糖上生長之REM A2_l7細胞經由MVA途徑專製之異戊二烯的同位素標記異構體組分佈（圖101及圖102)，且藉由使具有係數fMVA&fDxp 之「異戊二烯（+FM)」與cMEpp同位素標記異構體組光譜疊加以擬合「異戊二烯（_FM)」光譜來計算Dxp及mva途徑對總異戊二烯產量之相對貢獻，如「方法」章節中所述。基於此等計算，DXP途徑對總異戊二烯產量之相對貢獻對於採用l-13c葡萄糖及3-13C葡萄糖之實驗據估算分別為42%及38%。此等數值接近於自膦胺黴素對總異戊二烯製造速率之抑制分別估算之42%及43%之DXP途徑貢獻。方法生長在34°C下使菌株rEM A2_17於TM3液體培養基（136 g K2PO4、13.6 g KH2P〇4、2.0 g MgS04-7H20、2·0 g單水合檸檬酸、〇·3 g檸檬酸鐵銨、3.2 g (NH4)2S04、1.0 mi 1000X改質痕量金屬溶液，調整至pH 6.8且用H20補足，且經過渡滅菌）中生長’該培養基以1%未經標記之葡萄糖及 0.1%酵母提取物補充至最終濃度（圖96及圖97之實驗）；或以1 °/〇未經標記之葡萄糖補充至最終濃度，不含酵母提取物且不含色胺酸；以1.0% 1-13C葡萄糖（Isotec)補充至最終濃度’不含酵母提取物，且含有或不含50 μΜ色胺酸（圖98 及圖 101);或以 1〇% 3-"c 葡萄糖（〇inicr〇n Biocheniicals，

Inc.)補充至最終濃度，且不含酵母提取物（圖99及圖1〇)。所有生長培養基均亦含有羧苄青黴素（5〇 Ag/ml)、慶大黴 149048.doc -307- 201111512 素（10 pg/ml)、康黴素（50 pg/ml)及壯觀黴素（50 pg/ml)。用400 μΜ IPTG誘導培養物，隨後藉由添加2 mM膦胺黴素 (Invitrogen)使培養物之DXP通量抑制一半。藉由記錄在 600 nm下使用 Eppendorf Biophotometer 光譜儀（Eppendorf) 所量測之培養物之各光學密度來週期性地監測生長。異戊二烯之GC量測使用頂部空間檢驗分析異戊二烯產量。對於頂部空間培養，將100 μΐ至200 μΐ培養物自震盪燒瓶轉移至2 ml CTC 頂部空間小瓶（SUN-SRI 2 mL HS小瓶，VWR# 66020-950 ;及帽，VWR# 66008-170)中。將帽旋緊，且在等效溫度、以25 0 rpm震盪下培育小瓶。約30分鐘至1小時後，自培育箱中移出小瓶，在7〇°C下熱滅活7分鐘且進行分析。使用與 CTC Analytics(Switzerland)CombiPAL 自動取樣器相接且以頂部空間模式操作之Agilent 6890 GC/MS系統進行分析。•使用 Agilent HP-5MS GC/MS 管柱（15 mx〇.25 mm; 0.25 μιη膜厚度）分離分析物。設置取樣器以注射100 μί頂部空間氣體。GC/MS方法利用氦作為載氣，流速為1 ml/min。保持注射口在250°C下，分流比為50:1。歷經0.6 分鐘之分析持續時間，保持烘箱溫度為37°C。以m/z為67 之單離子監測（SIM)模式或以覆蓋m/z 25至80之全掃描模式操作Agilent 5793N質量選擇偵測器。自0分鐘至0.42分鐘切斷偵測器以允許永久氣體溶離。在此等條件下，觀測到異戊二烯（2-甲基-1,3- 丁二烯）標準物（SCOTTY® Analyzed Gases)在約0.49分鐘時溶離。使用校準表來定量 149048.doc - 308 - 201111512 異戍'—稀之絕對量，且典Ϊ目ib 1 /τ 現自1 Pg/L至5 000 pg/L呈線性。使用此方法估算偵測限度為5〇至1〇〇 ng/L。各菌株之比生產力以^L.〇D.h形式報導。注意，在檢驗小瓶中歷⑽小時培育，1800 μ1頂部空間氣體：2〇〇 μΐ培養液之比率引起微克異戊二烯/公升培養物至比生產力之以下轉換：（由 GC-MS測定之異戊二稀/公升）χ(9)/(培養物之㈤6〇〇㈣。為定量自13C標記之葡萄糖製造之異戊二稀之量，用基於 φ 未經標記之標準物的校準曲線獲得之濃度乘以轉換因子K 以補償同位素效應。轉換因子計算如下： Κ=(Σ (Α〇/Α67)/(Σ (Ρ〇/Ρ67), (方程 1} 其中Ai為3C富集之異戊二烯所產生之Gc峰的強度量測值，且Pi為異戊一烯標準物所產生之GC峰的強度量測值 (下標i=60…72表示相應峰之m/z值，包括峰A”及p67)。對於本文獻中所提及之實驗，將轉換因子2· 9〇1及33 69分別應用於在無膦胺黴素條件下及在2 mM膦胺黴素條件下於1 · 鲁 13c葡萄糖上生長之細胞，且將因子丨476及丨315分別應用於在無膦胺黴素條件下及在2 mM膦胺黴素條件下於3-nC 葡萄糖上生長之細胞。細胞代謝物之LC-MS/MS分析對於代謝物分析’藉由離心對1 ·5至5 mL細胞培養物進行短暫離心’且在離心後將1 0 0或1 5 0 pL乾冰冷卻曱醇添加至集結成粒之細胞中。接著將所得樣品儲存於_8〇。〇下直至進一步處理。為萃取細胞代謝物，將1 〇或1 5 pL水添加至含甲醇樣品中，將顆粒再懸浮於所得f醇/水混合物 149048.doc • 309· 201111512 中，接著以450〇xg對細胞碎片短暫離心4分鐘。將顆粒再萃取兩次，首先用90 pL以1 mM乙酸銨水溶液（pH=8.0)緩衝之75%曱醇萃取，接著用100 μί含50 %甲醇之乙酸铵缓衝液萃取。每一次萃取後，藉由離心對細胞碎片進行短暫離心，且合併來自全部三次萃取之上清液。在萃取程序中，儘可能使樣品保持於冰上或冷凍離心機中以使代謝物降解減至最少。藉由在TSQ Quantum三重四極桿質譜儀（Thermo Electron Corporation, San Jose，CA)上使用負離子模式之電喷霧電離進行LC-MS/MS來分析萃取物。使用XCalibur及LCQuan 軟體（Thermo Electron Corp)進行系統控制、數據擷取及質言眷數據評估。在0.4 mL/min之流動速率及40°C之管柱溫度下，於 Synergi 45 μΜ Hydro-RP HPLC 管柱（15〇x2 mm， Phenomenex, USA)上進行 LC 分離。LC梯度為 /=0 min， 12% B ； t=5 min，12% B ； t=9 min > 23% B ； t=2Q min 5 99% B ; i=23 min，99% B ; i=24 min，12% B ; i=29 min，12% B，其中溶劑A為1 0 mM三丁胺/1 5 mM乙酸之水溶液且溶劑B為LCMS級曱醇。樣品注射體積為10至25 pL。使用負離子模式之電噴霧電離進行質量偵測。選擇以下 MS/MS轉變來偵測相關代謝物：DXP為213今79，MEP為 215 — 79，IPP及 DMAPP 為 245 — 79，HDMAPP 為 261 今79， cMEPP 為 277今79 ， CDP-ME 為 520.1->79 ， MVP 為 227 + 79，MVPP 為 3 07 + 79 ,及 MVA 為 147 今 59 〇使其他質 149048.doc •310- 201111512 譜設定最佳化以使用購自Echelon Biosciences Inc.或自身合成之相應標準物獲得最高敏感度。為定量細胞代謝物之絕對濃度，藉由注射已知量之此等標準物構建校準表。注意，用於代謝物分析之LC-MS/MS方法並不區分結構上類似之IPP及DMAPP，因此，樣品中IPP及DMAPP之量係以該兩種化合物之濃度總和來確定。藉由計算對應於cMEPP之MO、M+1、M+2、M+3、M+4 及M+5同位素標記異構體組的277 + 79、278 + 79、 2794 79、280~>79、28 1479及 2824 79 MS/MS轉變所產生之峰的相對強度來分析此代謝物之同位素標記異構體組分佈。在獨立實驗中，已驗證在t約為14.3分鐘（cMEPP之滯留時間）時自常規葡萄糖上生長之大腸桿菌細胞獲得之萃取物在 MS/MS 轉變 272今79、273->79、274 + 79、 275 + 79、276 + 79下不產生可偵測之峰。此等對照量測排除了可能與cMEPP共同溶離但具有稍低分子量之化合物對細胞於13C富集之葡萄糖上生長時由cMEPP產生之MS/MS 峰有貢獻的可能性。經13C標記之異戊二烯之同位素標記異構體組分析為量測於13c-葡萄糖上生長之細胞放出之異戊二烯的13c 富集度，自m/z 5 8至m/z 68監測GC光譜，亦即，在可源於五碳異戊二烯衍生物之質荷比的整個範圍内監測。圖102 展示含有13C天然豐度之合成異戊二烯以及由3-13C葡萄糖上生長之REM A2_17菌株放出且因此富集13C之異戊二烯的典型GC光譜。 149048.doc -311 - 201111512 使用圖102 Α中所示之數據，根據以下線性方程組計算不含13C同位素之異戊二烯（所有η。異戊二烯）之理論gc光譜： Ρβο = 1.000〇〇χΛ6〇 Ρ6ΐ=〇.05561χΑ：6〇+1.00000x^6, ?64 P65 ?66 Ρ67 Ρ68 Ρ69 Ρ 70 P62=0.0123 8 χ λβο + 0.0 5561 xA：6 i + l.ooo 〇〇 χΛ；62 P63= 0.01238 46丨+0.05561 χ 众62 + i. 〇〇〇〇〇x 允63 0.01238 χΛ：62+〇.05561 χΛ63 + ΐ.〇〇〇〇〇χΛ64 0.01238χ^63+0.05561χ^64+ι.〇〇〇〇〇xA：65 (方程 2) 0.01238 χΛ：64+〇.〇 5561 xA：6s + i.〇〇〇〇〇 x^66 0.01238 xA：65 + 〇. 05561 χ^66+ι. 〇〇〇〇〇 χλ；67 0.01238 xA:66 + 〇.〇5561xA:67 + 1. 〇〇〇〇〇 xyt68 0.01238 x A：67 + 0.05561 xA68 + l. 0 〇〇〇〇 xA：69 0.01238 x A：68+〇. 05561 xfc69+l. 〇〇〇〇〇 χλ：7〇其中PeoM.PM為異戊二稀標準物所產生之Gc♦的強度量測值（下標表示相應峰之m/z值），心❶.心❹為所有異戊二烯應產生之GC峰的強度計算值（下標表示相應峰之m/z 值）’且係數1.00000、0.05561及0.05 561為每個分子含有〇、1或2個13C同位素之三種C5同位素標記異構體組之相對豐度估算值’其中假定此Cs化合物具有等於1丨％之〗3C同位素天然豐度。（注意，在吾人對所有異戊二烯光譜之計算中’假定氘之天然豐度過小而不會影響最終結果。）使用 lsqlin s〇lver(MAT£AB 7_0, MathWorks)獲得灸6〇"為〇之正值。灸69及ho之計算值有效地為零，指示所有i2C5異戊二稀之GC光譜在m/z=69及更高質荷比下不應具有任何峰。基於如上所述而獲得之免62…^；68之值’根據以下線性方私組分析經標記之異戊二烯樣品之同位素標記異構體組分 M9048.doc • 312· 201111512 佈： Α67=々67χΧ M0+免66χΧ Μ+1+々65χΧ M+2+灸64χΧ Μ+3+^63χΧ M+4+灸62χΧ M+5 Α68=々68ΧΧ Μ0+々67χΧ Μ+1+^6χΧ M+r*^65xX Μ+3+^64χΧ Μ+4+灸63χΧ Μ+5 Α69= Α7〇= Α7〇= α71= Α72- ^68χΧ Μ+1+^67χΧ Μ+2+Λ：66χΧ Μ+3+^65χΧ Μ+4+^64χΧ Μ+5 ^68χΧ Μ+2+^67χΧ Μ+3"*"^66χΧ Μ+4+^65χΧ Μ+5 (方程 3 ) Α：68χΧ Μ+3+^67χΧ Μ+4+Λ：66χΧ Μ+5 Λ：68χΧ Μ+4+^67χΧ Μ+5 灸68 χΧ Μ+5 其中人67-入72為13C富集之異戊二烯所產生之GC峰的強度量測值（下標表示相應峰之m/z值），且X Μ〇···Χ M+5為具有0 至5個13C原子之異戊二浠同位素標記異構體組之相對豐度 (X mo對應於所有碳原子皆由同位素12C表示之異戊二烯分子）。使用 lsqlin solver(MATLAB 7.0, MathWorks)獲得

測定DXP及MVA途徑對異戊二烯產量之相對貢獻藉由在MATLAB(MathWorks)中求解以下線性方程超定系統來估算DXP及MVA途徑對總異戊二烯產量之相對貢獻 (分別為fDXP及fMVA):

(方程4)

為根據方程3計算之含有0至4個13C原子之異戊二烯同位素標記異構體組的相對豐度（下標「Isp+FM」及「Isp-FM」表示分別針對在存在及不存在膦胺黴素之情況下培育之細 149048.doc •313· 201111512 胞進行計算）’ x M0，cMEPP.._x M+4，cMEPP為如上所述由Lc_ MS/MS量測之相應cMEPP同位素標記異構體組的相對雙度。實例34 :測定通過MVA及MEP途徑得到BioIsopreneTM產物之碳通量的13C NMR方法由13C NMR光譜法測定REM A2 一 17雙重途徑菌株中兩種類異戊二烯前驅物途徑MVA及MEP(DXP)途徑對異戊二婦產量之相對貢獻，且使用所得資訊計算MVA/MEp碳比率。類似技術已用於測定MVA及MEP途徑對生物合成聚類異戊二烯（Skorupinska-Tudek，K.等人（2008) 乂出〇/. ， 283(30) ’ 第 21024-21035 頁）及異戊二烯（Wagner，w p.， Helmig，D.及 Fall, R. (2000) #如· /VW” 63，第 37_4〇頁）之各別貢獻。源自13C富集之葡萄糖標記之異戊二烯的標記模式因將碳自受質引導至產物所用之途徑不同而不同。此等模式展示於圖100A(關於葡萄糖受質）及圖 100B(關於[3-13C]-D-葡萄糖受質）中。如自圖100A可見’異戊二烯之碳#3(C_3)不會自始於 13 C]-E>-葡萄糖受質之任一途徑富集，nc相對於之富集程度等於1.1 %之天然豐度。相比之下，c_5在兩種狀況下均經標記，由此c_5/c_3之富集度可確定標記併入之總程度。在源自[1-丨3(2]-〇-葡萄糖之出080卩代1161^產物之〇5 處13C之最大可能富集度為50%，若氧化性磷酸戊糖途徑相對於糖酵解以較大通量起作用，則富集度更小。藉由比較 c-1相對於C-2及C-4之富集度來確定MVA/MEP途徑之比 149048.doc -314- 201111512 率。此展示於圖103中。在通過MVA與MEP途徑之碳通量相等（mVA/ΜΕΡ比率為 1:1)之狀況下’在Bioisoprene™產物令c-l相對於C-2及C-4 處之標記程度亦等同，最大富集度為25%。當MVA/MEP比率為9:1時’ C-1之富集程度僅為5%，而C-2及C-4之富集程度為4 5 %。開發小規模產生、收集及分析經13C標記之

Biolsoprene™產物之方法以確定在菌株reM A2_17中MVA 及MEP(DXP)途徑對異戊二烯產量之相對貢獻。在攪拌瓶格局中使菌株於含有[1-13C]-D-葡萄糖（1〇 mg/mL)作為唯一碳源之HM-1培養基中生長，且使所得Bi〇IsopreneTM產物吸附於由200 mg活性碳（Koby filters, MA)裝填至具有棉賊 (Scheme xx-1)之玻璃巴氏吸液管（giass Pasteur pipeUe)中所組成的小型碳濾器。在34°C下生長隔夜後，移出碳渡器’且直接脫附至具有CDC13(1 mL)之玻璃NMR管中。藉

由將異戊二烯標準物（5 pL)(Sigma-Aldrich)稀釋至0.75 mL 氘代氯仿（CDCI3)中且擷取13C NMR光譜來獲得未經標記之異戊二烯之參考光譜。藉由13C核磁共振光譜法（13C-NMR)測定對應於異戊二稀之各碳原子之信號的相對強度且將此等值與來自未經標兮己 (天然C豐度）之異戊二稀之碳信號的相對強度作比較，拜此確定異戊二稀之各碳原子處之相對13C富集度。^、 125.7 MHz操作之Varian 500 MHz VNMRS系統上碑得 13c NMR 光譜。擷取參數為 sw=3〇487，at=1.3 sec，dl=1 149048.doc -315- 201111512 nt=10000 > dn=Hl dm=yyy，dmm=w , dpr=42，dmf= 12600由峰向度及積分峰面積測定13c信號強度。未經標記之異戊二烯（％ 13c=i.i%)之13c-nmr光譜展示於圖105 中。奴1-4之峰高度為類似的，脂族C-5展示更強信號。源自雙重途徑菌株REM A2 17之BioIs〇preneTM產物之丨3Γ 魏光譜展示於圖爾。_2 顯可見’而C-3信號等於或小於、或等於雜訊水準。c-l、 C-2及C-4之相對峰高度指示MVA/MEp途徑通量之比率大於I:1且小於2:1。C-l、C-2及C-4相對於C-3及C-5之富集度指示MVA與MEP途徑在菌株REM A2—17中均起作用，且促進通向異戊二烯之總體碳通量。

實例 35 : fkpB-ispH iscR 在此實例中’吾人展示當啟動子PL.6置換菌株WW119中之操縱子fkpB-ispH之天然啟動子以產生菌株rEm D8_15 時’異戊二烯產量自菌株WW119中所見之約500至600 pg/L/H/OD(見圖1〇8)降至菌株REM D8_15中之約50 pg/L/H/OD(見圖1〇8)。添加j化户及至WW119中顯示異戊二烯比生產力有小幅降低。將PL.6 fkpB-ispH引入WW119中所觀測到的結果未曾預期。吾人假設較多ispH將得到較高異戊二烯力價。吾人進一步展示，當使鐵硫簇調控基因心i?自後一種菌株rem D8_15中缺失以產生菌株REM D6_15時，AiscR突變實質上恢復菌株REM D6_15之異戍二烯產量。此等觀測結果表明，zibc及與fkpB-ispH之間的有利相互作用可改良經由DXP途徑製造異戊二烯之過程。 149048.doc •316- 201111512 構築此實例之菌株產生PL.6-fkpB基因座在大腸桿菌BL21基因組内，基因位於緊接基因之下游之處，該/知5基因編碼FKBP型肽基-脯胺醯基順反異構酶。有趣的是，大腸桿菌IspH酶之結構展示該蛋白質具有2個異構北脯胺酸殘基（Grawert，T.等人，2009)。FkpB 可與IspH功能有關之觀點亦可由以下實情反映：orf 與bp好orf恰好由一個核苷酸分開且合在一起已顯示轉錄成5-墓因操縱子之最末2個基因 (參見 http://ecocyc.org/) ° 此外，使J之終止密碼子與/红>5之起始密碼子分開之 125個鹼基的BLAST分析揭示在整個大腸桿菌基因組中多次出現之高度保守序列。此常見序列為： AATCGTAGGCCGGATAAGGCGTTTACGCCGCATCCGGC AA。此序列具有轉錄終止子之特徵，包括可能形成莖環。可能雜交在一起形成莖環之鹼基在上文以粗體及下劃線文字突出顯示（粗體黏接於粗體；下劃線黏接於下劃線）。在所觀測之各種情況下，始終發現此重複序列之位置緊鄰單一基因之3'末端之下游或朝向彼此轉錄之2個基因之3’末端之下游。在所分析之超過40個區域之編碼區内未發現重複序列。總之，此資訊表明序列發揮轉錄終止子之功能且暗示 /灸/?5及可能轉錄成獨立的雙基因操縱子。吾人自身對BL21 14 L醱酵之轉錄分析顯示kp//轉錄物 149048.doc -317- 201111512 以幾乎不可偵測之含量存在；結果與此領域中先前所報導一致。類似地，在此等細胞及小規模生長細胞内，IspH蛋白質之含量積累至較低程度（關於小規模結果，參見圖 1〇8)。内源BL21 bp//之表現增加及其對異戊二烯產量之影響為此處所述工作之目標。先前所述之PL.6啟動子為所選用於上調bp//表現之強組成性啟動子。基於FkpB與IspH 以及/知5與以尸//可能分別共有功能關係及轉錄關係之推測 (上文所述），緊接/知召orf上游插入PL.6啟動子。根據製造商之說明書，使用來自Gene Bridges GmbH之 Red/ET系統進行此實例中所述之pl_6啟動子插人及後續氯黴素抗性標記物環出。使用菌株BL21 (Novagen)。如先前所述進行P1溶菌液之製備與轉導（Thomason等人，2007)。使用BIO RAD Gene Pulser系統（0.1 cm電擊管，目錄號 165-2089)及製造商（BIO RAD)建議之轉型方案進行所述電穿孔。引子 fkpB之 5* CMP::80bp up

5'-AGATTGCTGCGAAATCGTAGGCCGGATAAGGCGTTTACGC

CGCATCCGGCAAAAATCCTTAAATATAAGAGCAAACCTGCAA

TTAACCCTCACTAAAGGGCGGCCGC

3? C]MP：：PL.6-fkpB

5'-AGCGTGAAGTGCACCAGGACGGCGCTATTGCTCTGTACAGATTCAGA

CATGTTTTTACCTCCTTTGCAGTGCGTCCTGCTGATGTGCTCAGTATCA

CCGCCAGTGGTATTTATGTCAACACCGCCAGAGATAATTTATCACCGCA

GATGGTTATCTTAATACGACTCACTATAGGGCTCGAG fkpB之5* confirm CMP::80bp up 149048.doc •318· 201111512

5'-ACGCATCTTA TCCGGCCTACA 3' confirm CMP: :PL.6-fkpB

5'-ACCGTTGTTGCGGGTAGACTC PL.6之5’引子

5'-AGATAACCATCTGCGGTGATAAATTATCTCTGGCGGTG 頂部GVs CMP 5'-ACTGAAACGTTTTCATCGCTC 底部Pgb2

5'-GGTTTAGTTCCTCACCTTGTC

使用Gene Bridges GmbH方法在内源編碼區上游引入之PL_6-啟動子說明於圖107中。藉由使用引子組之 5’ CMP::80bp up及 3’ CMP::PL.6-fkpB 進行 PCR 來擴增抗生素抗性卡匣GB-CMP。fkpB之5’ CMP::80bp up引子含有8〇個與/05編碼區之5’緊接之區域同源的驗基且 CMP::PL.6-fkpB引子含有50個與orf(開放閱讀框架）之 5'區域同源之驗基以允許在pRed-ET質體存在下在PCR產物電穿孔之後於特定基因座處進行重組。在翻轉酶介導抗生素標記物切除之後所殘留之FRT(翻轉酶識別標i >「广痕」序列亦描繪於圖中。擴增 CMP::PL.6 fkpB 片段為擴增GB-CmpR卡匣以緊接/知β基因座上游插入6 啟動子，設置以下PCR反應： 1 μΐ模板（100 ng GB-CmpR) 10 μΐ i/ercw/ase//緩衝液 0.5 μΐ dNTP(100 mM) 149048.doc •319· 201111512 1.25 μΐ 引子（10 pM)fkpB之 5, CMP::80bp up

1.25 μΐ 引子（10 μΜ)3’ CMP::PL.6-fkpB 35 μΐ去離子水 + 1 μΐ來自循環參數： 95°〇2 分鐘；[95°〇30 秒，60°〇30 秒，72°〇3 分鐘]Χ29 次循環；72°〇5分鐘； 4°C直至冷卻（Biometra T3000 Combi溫度循環器）在0_8〇/〇 E-gel(Invitrogen)上分離所得PCR片段以驗證成功擴增，且根據製造商之說明書使用QIAquick PCR純化套組（Qiagen)進行純化。所得儲備物為CMP::PL.6 fkpB片段。將CMP::PL.6 fkpB 片段 PCR產物整合至BL21/pRed-ET 菌株中藉由電穿孔將pRed-ET載體（Gene Bridges套組）轉型至 BL21(Novagen)中，得到菌株 REM F7—13(BL21/pRed-ET)。將經純化之CMP::PL.6 fkpB PCR片段電穿孔至REM F7_13中。在L培養液中回收轉型體，接著塗於含有氣黴素 (10 pg/ml)之L瓊脂上。藉由使用引子fkpB之5，confirm CMP.:80bp up與底部 Pgb2以及 3' confirm CMP.，_PL_6-fkpB 與頂部Gb’s CMP進行PCR來分析氣黴素抗性群落中GB-(：1^11卡匣、及/7：；^上游之？1_6-啟動子的存在。使用3· confirm CMP::PL.6-fkpB及頂部 GB’s CMP 引子（Sequetech ; Mountain View, C A)對來自許多轉型體之PCR片段進行定 149048.doc -320- 201111512 序，且鑑別相關PL.6 /05菌株。氯黴素抗性菌株BL2 1 CMP::PL_6 /05命名為 REM A4_14。產生REM Dl_14之策略驗證REM Dl_14内PL.6 fkpB之存在為驗證REM Dl_14菌株具有PL.6 fkp基因座，設置以下 PCR反應：

約0·5 μΐ來自群落之細胞 5 μΐ //ercw/ase//緩衝液 0.25 μΐ dNTP(100 mM) 0.625 μΐ 弓I 子（10 μΜ)ΡΕ.6之 5'弓I 子

0_625 μΐ 弓| 子（10 μΜ)3' confirm CMP::PL.6-fkpB 17.5 μΐ去離子水 + 0.5 μΐ 來自 Stratagene之/wsz.ow 循環參數： 95°〇2分鐘；[95°C><30秒，60°C><30秒，72°C><2分鐘]χ29次循環；72°〇5分鐘； 4°C直至冷卻（Biometra Τ3 000 Combi溫度循環器）在2% E-gel(Invitrogen)上分離所得PCR片段以驗證成功擴增。經由P1介導之轉導將上文所述之菌株REM A4_14之氣黴素標記PL.6 基因座引入菌株WW103中。所得氯黴素抗性菌株稱為REM A9_l 4。在翻轉酶介導抗生素卡匣切除之後，所得氯黴素敏感性菌株命名為REM D1_14(BL21 pgl+PL.6-dxs, GIl_6-dxr, GI1.6 yIDI, ?!^.2下游]\/1¥八途徑， 149048.doc -321 - 201111512 CMP::PL.6 fkpB)。藉由使用上文所述之引子PL_6之5'引子及 3，confirm CMP::PL.6-fkpB 進行 PCR 來驗證 REM Dl_14 内/灸/?5上游PL.6啟動子之存在。產生REM A8_15之策略經由P1介導之轉導將先前所述之菌株REM14::CMP之氯黴素標記」be/?基因座引入菌株WW103中。'所得氣黴素抗性菌株稱為REM A5_15。在翻轉酶介導抗生素卡匣切除之後，所得氣黴素敏感性菌株命名為REM A8_15(BL21 pgl + PL.6-dxs, GI1.6-dxr，GI1.6 yIDI，PL.2 下游 MVA 途徑， △ iscR) 〇產生REM A7_15之策略經由PI介導之轉導將菌株REM14::CMP之氣黴素標記 AscT?基因座引入菌株REM Dl_14中。所得氣黴素抗性菌株稱為REM A2_l 5。在翻轉酶介導抗生素卡匣切除之後，所得氣黴素敏感性菌株命名為1^?^八7_15(31^21?§1+?[.6-dxs，GIl_6-dxr，GI1.6 yIDI, PL.2 下游 MVA 途徑，CMP::PL.6 fkpB，AiscR)。驗證REM D1_14&REM A7_15内IspH之積累增多西方墨點法使 REM Dl_14、REM A7_15、REM A8_15及 WW103 細胞於TM3培養基（1%葡萄糖、0.1%酵母提取物）中生長至限制性OD，且藉由離心收集細胞並將顆粒儲存於-80°C下直至分析。為進行分析，將培養物顆粒再懸浮於〇.〇5 Μ磷酸納、0.3 Μ 氣化納、0.02 Μ °米。坐（pH 8)以及 0.2 mg/ml 149048.doc -322- 201111512 DNasel中，達到100 〇D/ml。藉由反覆通過弗氏壓碎器使細胞破裂。接著藉由以5〇,〇〇〇 rpm超速離心3〇分鐘使8 Μ 各溶菌液澄清。移除可溶性物質，且將不溶性顆粒再懸浮於8 ml之0.05 Μ磷酸鈉、〇·3 Μ氯化鈉、〇.〇2 Μ咪唑緩衝液 (pH 8)中。如及WesternBreeze®使用者手冊中所述，遵循Invitrogen推薦之轉移與顯影技術，使用硝化纖維素西方墨點法分析大腸桿菌ispH表現。使用針對p⑺ φ Inc之於兔中經純化之大腸桿菌ispH製造之一次多株抗體探測西方墨點。彳貞測使用來自Invitr〇gen之螢光二次抗體， Alexa Fluor® 488山羊抗兔1§(} (H+L)。原始數據展示於圖 109中。使用ImageQuant 5·2軟體進行樣品定量，且結果呈現於圖110中。藉由經西方墨點法量測IspH積累程度間接地評估位於菌株REM D1 —14及REM A7—1 5之/灸/?5-冲// 2基因操縱子上游之PL.6-啟動子所驅動之_开表現相對於菌株rEM A8_〗5及 • WW103中的增加（見圖109及圖110)。測得具有pl.6 /知β之鹵株REM Dl_14及REM Α7_15之可溶性IspH含量相對於具有内源野生型咖//基因座之REM A8_15及WW103菌株增加約5倍。產生 REM D8一15、REM D7_15 及 REM D6_15 之策略藉由分別將pDW33轉型至WW103、REM Dl_14、REM A8_15及REM A7一15(上文所述之菌株）中來產生菌株 WW119、REM D8 — 15、REM D7_15及 REM D6_15。使用BIO RAD Gene Pulser系統（0.1 cm電擊管，目錄號 149048.doc -323 - 201111512 165-2089)及製造商（BIO RAD)建議之轉型方案，經由電穿孔以pDW33轉型經水洗之REM Dl_14、REM A8_15及REM A7_l 5細胞《在37°C下於L培養液中回收細胞1小時，接著塗於含有羧苄青黴素（50 pg/ml)之L瓊脂上。針對各菌株選擇一個羧苄青黴素抗性群落。所得羧苄青黴素抗性菌株命名如下： REM D8_15(BL21 pgl+PL.6-dxs, GI1.6-dxr, Gil.6 yIDI, PL.2 下游 MVA 途徑，PL.6 fkpB，及 pDW33); REM D7_15(BL21 pgl+PL.6-dxs, GI1.6-dxr, GI1.6 yIDI, PL.2 下游 MVA 途徑，AiscR，及 pDW33); REM D6_15 15(BL21 pgl+ PL.6-dxs, GI1.6-dxr, GI1.6 yIDI，PL_2下游 MVA途徑，PL.6 fkpB，AiscR，及 pDW33)。異戊二烯製造及ispH定量之方法章節異戊二烯量測。將用以量測異戊二烯產量之培養物置於 48 孔深孔板（目錄號 P-5ML-48-C-S ; Axygen Scientific， California，USA)中，各孔提供2 mL培養物。稱為TM3之培養基描述於下文。在30°C、250 rpm下，使待比較之菌株於補充有1%葡萄糖及0.1 %酵母提取物之TM3培養基中生長隔夜（o/n)。至早晨，將菌株以ι:ι〇0接種於48孔深孔板中之一式四組孔中。以「Breath Easier」TM膜（Electron Microscopy Sciences，目錄號70536-10)覆蓋培養物，且在 600 rpm及30°C下連續震盪（Shel-Lab Inc. SI6R型冷凍震盪培育箱；Oregon，USA)。兩小時後測定培養物OD，接著以定時時間間隔測定至6小時。生長兩小時後，藉由將50、 149048.doc • 324· 201111512 100、200及400 μΜ IPTG添加至一式四組孔（1至4)中而用 IPTG進行誘導。誘導後兩小時及此後每小時一次至六小時，對此等培養物進行取樣以如下進行異戊二烯產量檢

驗：將各培養物之1〇〇 gL等分試樣轉移 (目錄號3600600 Zinsser; North America)中，即刻用不透性黏者紹膜密封且在E p p e n d 〇 r f恨溫混勻器（e p p e n d 〇 r f; North America)上以45〇 rmp震盪下培育3〇分鐘。藉由在 70°C下於第二Eppendorf恆溫混勻器上加熱7分鐘使異戊二烯檢驗培養物滅活。將玻璃磚轉移至附接於AgUent 5973 MS且配備有LEAP CTC CombiPAL自動取樣器以供頂部空間分析之Agilent 6890 GC中。管柱為AgUent Hp_5(5%苯基曱基矽氧烷（15 mx〇.25 mmx〇.25 μηι))。將100吣體積之氣體注射於管柱上。其他條件如下。烘箱溫度：37t (保持等溫〇.6分鐘）；載氣：氦（流速」mL/min)，在25〇它下於注射口處之分流比為50:1 ;質量為67之單離子監測模式 (sim)h貞測器切斷：請分鐘_Q42分鐘；偵測器開通：〇.42分鐘-0.60分鐘；異戊二稀（2_甲基丁二稀）之溶離時間為約0·49分鐘，總分析時間為以分鐘。由此項技術中之專業人士熟知之方法進行儀器校準。由培養物OD6〇0對異戊二烯頂邱 p d 邱頂二間$測值進行校正以付到皁位為μβ/]ι/Η/0]：)之異戊比& —, 、戍—烯比產量量度。所有反應二進仃4至8小時。此實驗產生驚人結果：當細突變盥 :广-一之染色體突變組合時，異戊二烯活性得二恢復。此結果與以下相 '致：過度表現之响背景中之 149048.doc -325 - 201111512 iscR對通過DXP途徑之通量起調控作用或至少干擾通過徑之通量》對於高通量，ispH需要過度表現，且在此等條件下，預期AiscR對過程有利。由西方墨點法驗證ispH表現量增加。預期PL6啟動子取代fkpB-ispH操縱子之天然啟動子會提高ispH之含量。在菌株REM A7_15、REMD1_14中，藉由以如所述針對此酶製備之多株抗體進行西方墨點法而與對照菌株REM八8_15及 WW103相比較，由此確認ispH之含量提高；啟動子交換使得可溶性ispH增加5倍。使細胞於TM3培養基（1%葡萄糖、 0.1%酵母提取物）中生長至限制性〇D，藉由離心加以收集並將顆粒儲存於-80t下至次日。為進行分析，將顆粒再懸浮於0.05 Μ磷酸鈉、0.3 Μ氣化鈉、〇.02 M咪唑（pH 8)以及〇_2 mg/ml DNasel中’達到1〇〇〇D/ml。藉由反覆通過弗氏壓碎器使細胞破裂。藉由以l〇〇,〇〇〇Xg超速離心3〇分鐘使8 ml各溶菌液澄清。移除上清液，且將顆粒再懸浮於8 ml之〇.〇5 Μί||酸鈉、0.3 Μ氣化納、〇.〇2 Μ咪唾緩衝液（pH 8)中。如 iBlot®及WesternBreeze®使用者手冊（Vitrogen)中所述進行西方墨點法。一次多株抗體係針對pr〇Sci Inc(P0way，CA)之於大腸桿菌中過度表現且在兔中產生之經純化之大腸桿菌IspH。為進行偵測，使用來自

Invitrogen之螢光二次抗體（Alexa Fluor® 488山羊抗兔igG 幵+1〇。原始數據展示於圖1〇9中。使用1111&§6()1131115.2軟體進行樣品定量，且結果呈現於圖110中。 TM3(每公升醱酵培養基）： 149048.doc -326- 201111512 K2=〇4 13.6 g、KH2p〇4 13 6 g、MgS(V7H2〇 2 g、單水合擰檬酸2 g、檸檬酸鐵銨0.3 g、酵母提取物I』g、麵X改質痕量金屬儲備溶液！ m卜所有組分一起添加\ 溶解於去離子水中。用NH4〇H將pH值調整至6 8，且經 0·22微米膜對溶液進行過滤滅菌。通常添加1%葡萄糖，且通常增添G,1%酵母提取物。滅菌後，視需要添加抗生素 (有時所製備之TM3培養基不含任何_〇4，因為此吨++ 導致隨時間發生沈澱。在此狀況下，在臨用前添加i Μ MgS04無菌溶液）β 1000Χ改質痕量金屬儲備溶液（每公升）：單水合檸檬酸 40 g、MnS04.H20 30 g、NaCl 10 g、 FeS04.7H20 1 g、c〇C12.6H2〇 1 g、znS04.7H20 1 g、

CuS04-5H20 100 mg . H3B03 l〇〇 mg , NaMo04'2H20 100 mg。將各組分逐一溶解於去離子水中，用HC丨/NaC>I^^ pH 值調整至3.0，接著補足溶液體積，且用〇 22微米過濾器進行過滤、滅菌。 149048.doc 327- 201111512 附錄1 例示性1-去氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶核酸與多肽 ATH: AT3G21500(DXPS1) ECM: EcSMS35_0456(dxs) AT4G15560(CLA1) AT5G11380(DXPS3) ECL: EcolC_3213 OSA: 4338768(0s05g0408900) STY: STY0461(dxs) 4340090(0s06g0142900) STT: t2441(dxs) 4342614(0s07g0190000) SPT: SPA2301(dxs) PPP: PHYPADRAFT_105028(DXS1) SPQ: SPAB_03161 PHYPADRAFT」37710 SEC: SC0463(dxs) PH YPADRAFT_175220 SEH: SeHA_C0524(dxs) PHYPADRAFT_73475 SEE: SNSL254_A0469(dxs) OLU: OSTLU_48774(DXS) SEW: SeSA_A0482(dxs) CRE: CHLREDRAFT_196568(DXS1) SES: SARI_02505 CME: CMF089C STM: STM0422(dxs) PFA: MALI 3P1.186 YPE: YP03177(dxs) PFD: PFDG_00954 YPK: yl008(dxs) PFH: PFHG_02940 YPM: YP_0754(dxs) PYO: PY04970 YPA: YPA_2671 TAN: TA20470 YPN: YPN_0911 TPV: TP01_0516 YPP: YPDSF 2812 ECO: b0420(dxs) YPG: YpAngola_A3074(dxs) ECJ: JW0410(dxs) YPS: YPTB0939(dxs) ECD: ECDH10B_0376(dxs) YPI: YpsIP31758_3112(dxs) ECE: Z0523(dxs) YPY: YPK_3253 ECS: ECs0474 YPB: YPTS_0980 ECC: c0531(dxs) YEN: YE3155(b0420) ECI: UTI89_C0443(dxs) SFL: SF0357(dxs) ECP: ECP_0479 SFX: S0365(dxs) ECV: APECOl_1590(dxs) SFV: SFV_0385(dxs) ECW: EcE24377A_0451(dxs) SSN: SSON_0397(dxs) ECX: EcHS_A0491(dxs) SBO: SBO_0314(dxs)

149048.doc •328· 201111512 SBC: SbBS512_E0341(dxs) XFN: XfasM23_1378 SDY: SDY_0310(dxs) XCC: XCC2434(dxs) EC A: ECA1131(dxs) XCB:XC_1678 ETA: ETA_25270(dxs) XCV: XCV2764(dxs) PLU: plu3887(dxs) XAC: XAC2565(dxs) BUC: BU464(dxs) XOO: XOO2017(dxs) BAS: BUsg448(dxs) XOM: XOO_1900(X001900) WBR: WGLpl44(dxs) SML: Smlt3355(dxs) SGL: SG0656 SMT: Smal_2779 ENT: Ent638_0887 VCH: VC0889 ESA: ESA_02882 VCO: VC0395—A0412(dxs) KPN: KPN_00372(dxs) VVU:VV 1—0315 CKO: CKO—02741 VVY: VV0868 SPE: Spro—1078 VPA: VP0686 BFL: Bfl238(dxs) VFI: VF0711 BPN: BPEN_244(dxs) VHA: VIBHAR_01173 HIN: HI1439(dxs) PPR: PBPRA0805 HIT: NTHI1691(dxs) PAE: PA4044(dxs) HIP: CGSHiEE_04795 PAU:PA14_11550(dxs) HIQ: CGSHiGG_01080 PAP: PSPA7_1057(dxs) HDU: HD0441(dxs) PPU: PP_0527(dxs) HSO: HS_0905(dxs) PPF: Pput_0561 HSM: HSM_1383 PPG: PputGB 1—0572 PMU: PM0532(dxs) PPW: PputW619_0579 MSU:MS1059(dxs) PST: PSPTO_0698(dxs) APL: APL_0207(dxs) PSB: Psyr_0604 APJ: APJL_0208(dxs) PSP: PSPPH_0599(dxs) APA: APP7_0210 PFL: PFL_5510(dxs) ASU:Asuc_1372 PFO: Pfl01_5007 XFA: XF2249 PEN: PSEEN0600(dxs) XFT: PD1293(dxs) PMY: Pmen—3844 XFM: Xfasml2_1447 PSA: PST_3706(dxs) 149048.doc -329- 201111512 CJA: CJA_3336(dxs) PAR: Psyc_0221(dxs) PCR: Pcryo_0245 PRW: PsycPRwf_0411 ACI: ACIAD3247(dxs) ACB: A1SJ106 ABM: ABSDF0389(dxs) ABY: ABAYE0381 ABC: ACICU_03307 SON: SO_1525(dxs) SDN: Sden—2571 SFR: Sfri_2790 SAZ: Sama_2436 SBL: Sbal一1357 SBM: Shewl85_1343 SBN: Sbal 195—1382 SLO: Shew_2771 SPC: Sputcn32_1275 SSE: Ssed_3329 SPL: Spea，2991 SHE: Shewmr4_2731 SHM: Shewmr7_2804 SHN: Shewana3_2901 SHW: Sputw3181_2831 SHL: Shal—3080 SWD: Swoo_3478 ILO: IL2138(dxs) CPS: CPS_1088(dxs) PHA: PSHAa2366(dxs) PAT: Patl_1319 SDE: SdeJ381 MAQ: Maqu_2438 AMC: MADE—01425 PIN: Ping_2240 MCA: MCA0817(dxs) FTU: FTT1018c(dxs) FTF: FTF1018c(dxs) FTW: FTW_0925(dxs) FTL: FTL_1072 FTH: FTH_1047(dxs) FTA: FTA_1131(dxs) FTN: FTN_0896(dxs) FTM: FTM_0932(dxs) FPH: Fphi_1718 NOC: Noc_1743 AEH:Mlg_1381 HHA: Hhal_0983 HCH: HCH_05866(dxs) CSA: Csal_0099 ABO: ABO_2166(dxs) MMW: Mmwyll_1145 AHA: AHA_3321(dxs) ASA: ASA_0990(dxs) BCI: BCI_0275(dxs) RMA: Rmag_0386 VOK: COSY_0360(dxs) NME: NMB1867(dxs) NMA: NMA0589(dxs) NMC: NMC0352(dxs) NMN: NMCC_0354 NGO: NG00036 NGK: NGK_0044 CVI: CV_2692(dxs) RSO: RSc2221(dxs)

149048.doc -330- 201111512 REU: Reut_A0882 PNA: Pnap_1501 REH: H16_A2732(dxs) AAV: Aave—2015 RME: Rmet_2615 AJS:Ajs_1038 BMA: BMAA0330(dxs) VEI: Veis_3283 BMV: BMASAVPl_1512(dxs) DAC: Daci_2242 BML: BMA10229_1706(dxs) MPT: Mpe_A2631 BMN: BMA10247_A0364(dxs) HAR: HEAR0279(dxs) BXE: Bxe_B2827 MMS: mma_0331 BVI:Bcepl808_4257 LCH: Lcho_3373 BUR: Bcepl8194_B2211 NEU:NE1161(dxs) BCN: Bcen_4486 NET: Neut—1501 BCH: Bcen2424_3879 NMU: Nmul_A0236 BCM: Bcenmc03_3648 EBA: ebA4439(dxs) BAM: Bamb_3250 AZO: azoll98(dxs) BAC: BamMC406_3776 DAR: Daro—3061 BMU: Bmul一4820 TBD: Tbd_0879 BMJ: BMULJ_03696(dxs) MFA: Mfla_2133 BPS:BPSS1762(dxs) HPY: HP0354 BPM: BURPS 1710b_A0842(dxs) HPJ:jhp0328(dxs) BPL: BURPS 1106A_A2392(dxs) HPA: HPAG1—0349 BPD: BURPS668_A2534(dxs) HPS: HPSH_01830 BTE: BTH_lI0614(dxs) HHE: HH0608(dxs) BPH: Bphy_3948 HAC: Hac_0968(dxs) PNU: Pnuc_1704 WSU: WS1996 PNE: Pnec_1422 TDN: Suden_0475 BPE: BP2798(dxs) CJE: Cj0321(dxs) BPA: BPP2464(dxs) CJR: CJE0366(dxs) BBR: BB1912(dxs) CJJ: CJJ81176_0343(dxs) BPT: Bpet3060(dxs) CJU: C8J_0298(dxs) BAV: BAV2177(dxs) CJD: JJD26997j642(dxs) RFR: Rfer_2875 CFF: CFF8240_0264(dxs) POL: Bpro_1747 CCV: CCV52592_1671(dxs) 149048.doc -331 · 201111512 CHA: CHAB381_1297(dxs) CCO: CCC13826_1594(dxs) ABU: Abu_2139(dxs) NIS: NIS_0391(dxs) SUN: SUN_2055(dxs) GSU: GSU0686(dxs-l) GSU1764(dxs-2) GME: Gmet_1934 Gmet_2822 GUR: Gura—1018 Gura_2175 GLO: Glov_2182 Glov_2235 PCA: Pcar_1667(dxs) PPD: Ppro_1191 Ppro_2403 DVU: DVU1350(dxs) DVL: Dvul_1718 DDE: Dde—2200 LIP: LI0408(dsx) DPS: DP2700 DOL: Dole_1662 ADE:Adeh一1097 AFW: Anael09_1136 MXA: MXAN_4643(dxs) SAT: SYN_02456 SFU: Sfum—1418 PUB: SARI 1—0611 (dxs) MLO: mlr7474 MES: Meso_0735 PLA: Plav_0781 SME: SMc00972(dxs) SMD: Smed_0492 ATU: Atu0745(dxs) ATC:AGR_C_1351 RET: RHE_CH00913(dxs) REC: RHECIAT_CH0001005(dxs) RLE: RL0973(dxs) BME: BMEI1498 BMF: BABl_0462(dxs) BMB: BruAbl_0458(dxs) BMC: BAbS 19—104270 BMS: BR0436(dxs) BMT: BSUIS_A0462(dxs) BOY: BOV_0443(dxs) BCS: BCAN_A0440(dxs) OAN: Oant_0547 BJA: b!12651(dxs) BRA: BRAD02161(dxs) BBT: BBta_2479(dxs) RPA: RPA0952(dxs) RPB: RPB_4460 RPC: RPC—1149 RPD: RPD一4305 RPE: RPE_1067 RPT: Rpal_1022 NWI: Nwi_0633 NHA: Nham_0778 BHE: BH04350(dxs) BQU: BQ03540(dxs) BBK: BARBAKC583_0400(dxs) BTR: Btr_0649 XAU: Xaut_4733 AZC: AZC_3111 MEX: Mext—1939 Mext—4309 MRD: Mrad2831_3459 Mrad2831_3992 MET: M446_6352 M446_6391 BID: Bind—1811 CCR: CC 2068

149048.doc 332 · 201111512 CAK: Caul_3314 BAA: BA_4853 SIL: SPO0247(dxs) BAT: BAS4081 SIT: TM1040_2920 BCE: BC4176 RSP: RSP_0254(dxsA) RSP_1134(dxs) BCA: BCE_4249(dxs) RSH: Rsphl7029_1897 Rsphl7029_2795 BCZ: BCZK3930(dxs) RSQ: Rsphl7025—2027 Rsphl7025_2792 BCY: Bcer98_2870 JAN: Jann_0088 Jann_0170 BTK: BT9727_3919(dxs) RDE: RDl_0101(dxs) RDl_0548(dxs) BTL: BALH_3785(dxs) PDE: Pden_0400 BWE: BcerKBAB4_4029 DSH: Dshi_3294 Dshi_3526 BLI: BL01523(dxs) MMR: Mmarl0_0849 BLD: BLi02598(dxs) HNE: HNE_1838(dxs) BCL: ABC2462(dxs) ZMO: ZM01234(dxs) ZM01598(dxs) BAY: RBAM_022600 NAR: Saro_0161 BPU: BPUM_2159 SAL: Sala_2354 GKA: GK2392 SWI: Swit_1461 GTN: GTNG_2322 ELI: ELI—l2520 LSP: Bsph_3509 GOX: GOX0252 ESI: Exig_0908 GBE: GbCGDNIHl_0221 LMO: lmol365(tktB) GbCGDNIHl—2404 LMF: LMOf2365_1382(dxs) ACR: Acry—1833 LIN: lin 1402 GDI: GDI1860(dxs) LWE: lwel380(tktB) RRU: Rru_A0054 Rru_A2619 LLA: L108911(dxsA) L123365(dxsB) MAG: amb2904 LLC: LACR—1572 LACR_1843 MGM: Mmcl—1048 LLM: llmg_0749(dxsB) SUS:Acid_1783 SAK: SAK—0263 SWO: Swol_0582 LPL: lp_2610(dxs) CSC: Csac_1853 LJO: LJ0406 BSU: BSU24270(dxs) LAC: LBA0356 BHA: BH2779 LSL: LSL_0209(dxs) BAN: BA4400(dxs) LGA: LGAS_0350 BAR: GBAA4400(dxs) LRE: Lreu_0958 149048.doc - 333 - 201111512 LRF: LAR_0902 LFE: LAF_1005 STH: STH1842 CAC: CAC2077 CA_P0106(dxs) CPE: CPE1819 CPF: CPF_2073(dxs) CPR: CPR_1787(dxs) CTC: CTC01575 CNO:NT01CX_1983 CTH: Cthe_0828 CDF: CD1207(dxs) CBO: CB01881(dxs) CBA: CLB_1818(dxs) CBH: CLC_1825(dxs) CBL: CLK—1271(dxs) CBK: CLL_A1441 CLL_A2401(dxs) CBB: CLD_2756(dxs) CBF: CLI_1945(dxs) CBE: Cbei_1706 CKL: CKL_1231(dxs) CPY: Cphy_2511 AMT: Amet_2508 AOE: Clos_1607 CHY: CHY_1985(dxs) DSY: DSY2348 DRM: Dred_1078 PTH: PTH_1196(dxs) DAU: Daud_1027 HMO: HMl_0295(dxs) TTE: TTE1298(dxs) TEX: Teth514_1540 TPD:Teth39 1103 MTA: Moth_1511 MPE: MYPE730 MGA: MGA_1268(dxs) MTU: Rv2682c(dxsl) Rv3379c(dxs2) MTC: MT2756(dxs) MRA: MRA_2710(dxsl) MRA_3419(dxs2) MTF: TBFG_12697 TBFG—13415 MBO: Mb2701c(dxsl) Mb3413c(dxs2) MBB: BCG_2695c(dxsl) BCG_3450c(dxs2) MLE: ML1038(dxs) MPA: MAP2803c(dxs) MAV: MAV_3577(dxs) MSM: MSMEG_2776(dxs) MUL: MUL_3319(dxsl) MVA: Mvan—2477 MGI: Mflv一3923 MAB: MAB_2990c MMC: Mmcs_2208 MKM: Mkms_2254 MJL: Mjls_2197 MMI: MMAR_0276(dxs2) MMAR_2032(dxsl) CGL: NCgll827(cgll902) CGB: cg2083(dxs) CGT: cgR_1731 CEF: CE1796 CDI: DIP1397(dxs) CJK:jkl078(dxs) CUR: cu0909 NFA: nfa37410(dxs) RHA:RHA1 ro06843 149048.doc -334- 201111512

SCO: SC06013(SC1C3.01) SC06768(SC6A5.17) SMA: SAV1646(dxsl) SAV2244(dxs2) SGR: SGR_1495(dxs) TWH: TWT484 TWS: TW280(Dxs) LXX: Lxxl0450(dxs) CMI: CMM_1660(dxsA) AAU: AAur_1790(dxs) RSA: RSal33209_2392 KRH: KRH_14140(dxs) PAC:PPA1062 NCA: Noca_2859 TFU:Tfu_1917 FRA: Francci3_1326 FRE: Franeaiil_5184 FAL: FRAAL2088(dxs) ACE:Acel_1393 KRA: Krad_1452 Krad_1578 SEN: SACE_1815(dxs) STP: Strop—1489 SAQ: Sare一 1454 BLO: BL1132(dxs) BLJ: BLD_0889(dxs) BAD: BAD—0513(dxs) FNU: FN1208 FN1464 RBA: RB2143(dxs) OTE: Oter_2780 MIN: Minf_1537(dxs) AMU: Amuc—0315 CTR: CT331(dxs) CTA: CTA_0359(dxs) CTB: CTL0585 CTL: CTLon一0582(dxs) CMU: TC0608(dxs) CPN: CPnl060(tktB_2) CPA: CP0790 CPJ: CPjl060(tktB_2) CPT: CpB1102 CCA: CCA00304(dxs) CAB: CAB301(dxs) CFE: CF0699(dxs) PCU: pc0619(dxs) ΤΡΑ: TP0824 TPP: TPASS_0824(dxs) TDE: TDE1910(dxs) LIL: LA3285(dxs) LIC: LIC10863(dxs) LBJ: LBJ_0917(dxs) LBL: LBL_0932(dxs) LBI: LEPBI_I2605(dxs) LBF: LBF_2525(dxs) SYN: slll945(dxs) SYW: SYNW1292(Dxs) SYC: sycl087_c(dxs) SYF: Synpcc7942_0430 SYD: Syncc9605_1430 SYE: Syncc9902_1069 SYG: sync_1410(dxs) SYR： SynRCC307_1390(dxs) SYX: SynWH7803_1223(dxs) SYP: SYNPCC7002_A1172(dxs) CYA: CYA_1701(dxs) CYB: CYB_1983(dxs) 149048.doc -335- 201111512 TEL: tll0623 MAR: MAE_62650 CYT: cce_1401(dxs) GVI: gll0194 ANA: alr0599 NPU: Npun_F5466 AVA: Ava_4532 PMA: Pro0928(dxs) PMM: PMM0907(Dxs) PMT: PMT0685(dxs) PMN: PMN2A_0300 PMI: PMT9312_0893 PMB:A9601_09541(dxs) PMC: P9515—0990l(dxs) PMF: P9303_15371(dxs) PMG: P9301—0952 l(dxs) PMH: P9215_09851 PMJ:P9211_08521 PME: NATL1—09721 (dxs) TER: Tery_3042 AMR: AMl_5186(dxs) BTH: BT—1403 BT_4099 BFR: BF0873 BF4306 BFS: BF0796(dxs) BF4114 BVU: BVU_1763 BVU_3090 PGI: PG2217(dxs) PGN: PGN_2081 PDI: BDI‘2664 CHU: CHU_3643(dxs) GFO: GFO_3470(dxs) FJO: Fjoh_1523 FPS: FP0279(dxs) CTE: CT0337(dxs) CPC: Cpar_1696 CPH: Cpha266_0671 CPB: Cphamnl_1826 PVI: Cvib_0498 PLT: Plut_0450 PPH: Ppha_2222 CTS: Ctha—0174 PAA: Paes一1686 DET: DET0745(dxs) DEH: cbdb_A720(dxs) DEB: DehaBAVl_0675 EMI: Emin_0268 DRA: DR—1475 DGE: Dgeo_0994 TTH:TTC1614 TTJ: TTHA0006 AAE: aq_881 HYA: HY04AAS1_1061 SUL: SYO3AOP1—0652 TMA: TM1770 TPT: Tpet_1058 TLE: Tlet—2013 TRQ: TRQ2_1054 TME: Tmel一0252 FNO: Fnod_1517 PMO:Pmob 1001

149048.doc •336- 201111512 例示性1-去氧-D-木酮糖-5-磷酸還原異構酶核酸與多肽 STT: t0221(dxr) SPT: SPA0227(dxr) SPQ: SPAB_00282 SEC: SC0220(dxr) SEH: SeHA_C0258(dxr) SEE: SNSL254_A0242(dxr) SEW: SeSA_A0245(dxr) SES: SARI_02782 STM: STM0220(dxr) YPE: YPO1048(dxr) YPK: y3131 YPM: YP_2802(dxr) YPA: YPA 0524 YPN: YPN_2952 YPP: YPDSF_1664 YPG: YpAngola_A343 l(dxr) YPS: YPTB2999(dxr) YPI: YpsIP31758_1017(dxr) YPY: YPK1070 YPB: YPTS_3119 YEN: YE3280(b0173) SFL: SF0163(yaeM) SFX: S0166(yaeM) SFV: SFV_0156(yaeM) SSN: SSON_0185(yaeM) ATH: AT5G62790(DXR) OSA: 4326153(0s01g0106900) PPP: PHYPADRAFT_127023 PHYPADRAFT—128953 OLU: OSTLU_31255(DXR) CRE: CHLREDRAFT_196606(DXR1) CME: CMG148C Φ PFA: PF14_0641 PFD: PFDG_00980 PYO: PY05578 TAN: TA14290 TPV: TP02_0073 ECO: b0173(dxr) ECJ: JW0168(dxr) ECD: ECDH10B_0153(dxr) ECE: Z0184(yaeM) ^ ECS: ECs0175 ECI: UTI89_C0188(dxr) ECP: ECP_0181 ECV:APEC01_1814(dxr) ECW: EcE24377A_0177(dxr) ECX: EcHS_A0175(dxr) ECM: EcSMS35_0184(dxr) ECL: EcolC_3487 STY: STY0243(dxr) 149048.doc 337 - 201111512 SBO: SBO_0161(yaeM) SBC: SbBS512_E0166(dxr) SDY: SDY_0189(yaeM) EGA: ECA1035(dxr) ETA: ETAJ)8940(dxr) PLU: plu0676(dxr) BUC: BU235(dxr) BAS: BUsg229(dxr) WBR: WGLp388(yaeM) SGL: SG1939 ENT: Ent638_0711 ESA: ESA_03169 KPN: KPN_00186(ispC) CKO: CKO_03194 SPE: Spro_3786 BFL: Bfl275(dxr) BPN: BPEN_283(dxr) HIN: HI0807 HIT: NTHI0971(dxr) HIP: CGSHiEE_08025 HIQ: CGSHiGG_07530 HDU:HD1186(dxr) HSO: HS_0985(dxr) HSM: HSM—1463 PMU: PM1988(dxr) MSU:MS1928(dxr) APL: APL_0406(dxr) APJ: APJL_0428(dxr) APA: APP7 0430 ASU: Asuc_0657 XFA:XF1048 XFT: PD0328(dxr) XFM: Xfasml2_0359 XFN: XfasM23_0324 XCC: XCC1367(dxr) XCB: XC_2871 XCV: XCV1472(dxr) XAC:XAC1415(dxr) XOO: XOO1970(dxr) XOM: XOO_1860(XOO1860) SML: Smltl500(dxr) SMT: Smal一 1259 VCH: VC2254 VCO: VC0395_A1845(dxr) VVU: VV1—1866 YVY: VV2551 VPA: VP2312 VFI:VF1956 VHA: VIBHAR_03231 PPR: PBPRA2962 PAE: PA3650(dxr) PAU: PA14_17130(dxr) PAP: PSPA7_1489(dxr) PPU: PP_1597(dxr)

149048.doc -338 - 201111512

PPF: Pput_4180 PPG: PputGBl__1152 PPW: PputW619_4076 PST: PSPTO_1540(dxr) PSB: Psyr_1349 PSP: PSPPH_3834(dxr) PFL: PFL_1182(dxr) PFO: PflOl_1107 PEN: PSEEN4214(dxr) PMY: Pmen_3047 PSA: PST_1543(dxr) CJA: CJA_1118(dxr) PAR: Psyc一1531(dxr) PCR: Pcryo_1710 PRW: PsycPRwf—1798 ACI:ACIAD1376(dxr) ACB: A1S_1971 ABM:ABSDF1684(dxr) ABY: ABAYE1581 ABC: ACICU_02094 SON: SO_1635(dxr) SDN: Sden_1560 SFR: Sfri—1276 SAZ: Sama_1145 SBL: Sbal_1456 SBM: Shewl85_1451 SBN:Sball95 1487 SLO: Shew_2629 SPC: Sputcn32_1354 SSE: Ssed—3155 SPL: Spea—2879 SHE: Shewmr4—2635 SHM: Shewmr7_2702 SHN: Shewana3_2809 SHW: Sputw3181—2749 SHL: Shal_2975 SWD: Swoo_3275 ILO: IL0839 CPS:CPS_1559(dxr) PHA: PSHAa2030(dxr) PAT: Patl—1255 SDE: Sde_2591 MAQ: Maqu_2542 AMC: MADE一01379 PIN: Ping_2970 MCA: MCA0573(dxr) FTU: FTT1574c(dxr) FTF: FTF1574c(dxr) FTW: FTW_0352(dxr) FTL: FTL_0534 FTH: FTH_0536(dxr) FTA: FTA_0567(dxr) FTN: FTN_1483(dxr) FTM: FTM_0324(dxr) 149048.doc - 339- 201111512 FPH:Fphi_1195 NOC:Noc_0814 AEH: Mlg_1857 HHA: Hhal—1460 HCH: HCH_05246(dxr) CSA: Csal—0569 ABO: ABO_1149(dxr) MMW: Mmwyll一1278 AHA: AHA_1179(dxr) ASA:ASAJ154(dxr) BCI: BCI_0531(dxr) RMA: Rmag_0025 VOK: COSY_0025(dxr) NME: NMB〇184(dxr) NMA: NMA0083(dxr) NMC:NMC0175(dxr) NMN: NMCC_1968 NGO: NG01799 NGK: NGK_2475 CVI: CV_2202(dxr) RSO: RScl410(dxr) REU: Reut_A1875 REH: H16_A2049(dxp) RME: Rmet_1441 BMA: BMA1549(dxr) BMV: BMASAVPl_A2050(dxr) BML: BMA10229_A3261(dxr) BMN: BMA10247_1322(dxr) BXE: Bxe_A1688 BVI: Bcepl808_1919 BUR: Bcepl8194_A5323 BCN: Bcen—6064 BCH: Bcen2424_2013 BCM: Bcenmc03_2033 BAM: Bamb_2046 BAC:BamMC406_1915 BMU:Bmul_1263 BMJ: BMULJ_01984(dxr) BPS: BPSL2153(dxr) BPM: BURPS 1710b_2577(dxr) BPL: BURPS 1106A_2487(dxr) BPD: BURPS668_2431(dxr) BTE: BTH_I2033(dxr) BPH: Bphy_1332 PNU: Pnuc_1445 PNE: Pnec—0513 BPE: BP1425(dxr) BPA: BPP1533(dxr) BBR: BB2611(dxr) BPT: Bpet2529(dxr) BAY: BAV1740(dxr) RFR: Rfer_1994 POL: Bpro_2689 PNA: Pnap_1764 149048.doc •340- 201111512

HHE: HH0524(dxr) HAC: Hac_1502(dxr_fragment_2) AAV: Aave_1829 AJS: Ajs_2579 VEI: Veis_1444 DAC: Daci 4942 MPT: Mpe_A1973 HAR: HEAR 1341 (dxr) MMS: mma_2052 LCH: Lcho 2844 NEU:NE1712(dxr) NET: Neut_2029 NMU: Nmul—A0663 EBA: ebA5994(dxr) AZO: azol903(dxr) DAR:Daro 1748 TBD: Tbd_0791 MFA: Mfla—1524 HPY:HP0216 HPJ:jhp0202 HPA:HPAG1 0217 HPS:HPSH_01115

Hac_l 503(dxr_fragment_l) WSU: WS0812 TDN: Suden—0126 CJE: Cjl346c(dxr) CJR: CJE1535(dxr) CJJ: CJJ81176_1345(dxr) CJU: C8J一1262(dxr) CJD: JJD26997_0364(dxr) CFF: CFF8240_0210(dxr) CCV: CCV52592—0594(dxr) CHA: CHAB381_0121(dxr) CCO: CCC13826一0420(dxr) ABU: Abu_0161(dxr) NIS:NIS_1666(ispC) SUN: SUN—0144 GSU: GSU1915(dxr) GME: Gmet—1256 GUR: Gura_3727 GLO: Glov_2714 PCA: Pcar_1915(dxr) PPD: Ppro_2050 DVU: DVU0866(dxr) DVL: Dvul_2116 DDE: Dde—1123 LIP: LI0386(dxr) DPS:DP1160 DOL: Dole_0480 ADE: Adeh一3583 AFW: Anael09_3704 SAT: SYN_00916 SFU: Sfum_1784 WOL: WD0992(dxr) 149048.doc -341 - 201111512 WBM: Wbm0179 WPI: WP0113(dxr) AMA: AM743(dxr) APH: APH_0440(dxr) ERU: Erum4750(dxr) ERW: ERWE—CDS_04970(dxr) ERG: ERGA_CDS_04870(dxr) ECN: Ecaj_0473 ECH: ECH_0557(dxr) NSE: NSE_0443(dxr) PUB: SARI 1—0912(yaeM) PLA: Plav_3190 SME: SMc03105(dxr) SMD: Smed_2879 ATU: Atu2612(dxr) ATC: AGR一 C 一4736 RET: RHE，CH03839(dxr) REC: RHECIAT_CH0004120(dxr) RLE: RL4372(dxr) BJA: bll4855(dxr) BRA: BRAD04134(dxr) BBT: BBta_4511(dxr) RPA: RPA2916(dxr) RPB: RPB 2822 RPC: RPC_2442 RPD: RPD_2851 RPE: RPE_2559 RPT: Rpal_3262 NWI: Nwi_1853 NHA: Nham_1700 XAU: Xaut_4433 AZC:AZC_1699 MEX: Mext_2083 MRD: Mrad2831—3444 MET: M446—0636 BID: Bind_0297 CCR: CC—1917 CAK: Caul一2799 SIL: SP01667(dxr) SIT: TM1040_1410 RSP: RSP_2709(dxr) RSH:Rsphl7029_1366 RSQ: Rsphl7025_2149 JAN: Jann_2455 RDE: RDl_2590(dxr) PDE: Pden_3997 DSH: Dshi—1497 MMR: MmarlO—1386 HNE: HNE_1774(dxr) ZMO: ZMO1150(dxr) NAR: Saro_1375 SAL: Sala_1954 SWI: Swit_0466 ELI: ELI_03805

149048.doc -342 - 201111512

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149048.doc - 344- 201111512 PAC: PPA1510 CPJ: CPj0344(yaeM) NCA: Noca_3204 CPT: CpB0352 TFU: Τίυ_0747 CCA: CCA00441(dxr) FRA: Francci3_3575 CAB: CAB427(dxr) FRE: Franeanl_1168 CFE: CF0566(yaeM) FAL: FRAAL5774(dxr) PCU: pc0260(dxr) ACE: Acel—1524 ΤΡΑ: TP0601 KRA: Krad_1427 Krad_4655 TPP: TPASS_0601(dxr) SEN: SACE_5994(dxr) TDE: TDE2342(dxr) STP: Strop」350 LIL: LA3292(dxr) SAQ: Sare_1302 LIC: LIC10856(dxr) BLO: BL0097(ispC) LBJ: LBJ_0910(dxr) BLJ:BLD_0115(dxr) LBL: LBL_0925(dxr) BAD: BAD一 1158(ispC) LBI: LEPBI_I2611(dxr) RXY: Rxyl_1404 LBF: LBF_2531(dxr) FNU: FN1324 SYN: s!10019(dxr) RBA: RB5568(dxr) SYW: SYNW0698(dxr) OTE: Oter_4632 SYC: syc2498_d(dxr) MIN: Minf_1972(dxr) SYF: Synpcc7942」513 AMU: Amuc—1737 SYD: Syncc9605_1970 CTR: CT071(yaeM) SYE: Syncc9902_0689 CTA: CTA_0076(dxr) SYG: sync_0920(dxr) CTB: CTL0327 SYR: SynRCC307_1674(dxr) CTL: CTLon_0322(dxr) SYX: SynWH7803_1622(dxr) CMU: TC0343(dxr) SYP: SYNPCC7002_A0818(dxr) CPN: CPn0345(yaeM) CYA: CYA_0193(dxr) CPA: CP0415 CYB: CYB_1233(dxr) 149048.doc -345 - 201111512 TEL: tlr 1040 MAR: MAE_50310 CYT: cce_2124(dxr) GVI: gll2252 ANA: alr4351 NPU: Npun_R5970 AVA: Ava_1300 PMA: Prol236(dxr) PMM:PMM1142(dxr) PMT: PMT1161(dxr) PMN: PMN2A_0751 PMI:PMT9312—1238 PMB: A9601_13171(dxr) PMC:P9515_13061(dxr) PMF:P9303_08651(dxr) PMG: P9301_13311(dxr) PMH: P9215_13461 PMJ:P9211_12161 PME: NATLl_15911(dxr) TER: Tery_0416 AMR: AMl_0563(dxr) BTH: BT—2002 BFR: BF3699 BFS: BF3492 BVU: BVU_1651 PGI: PG1364(dxr) PGN: PGN_1151 PDI: BDI_0480 SRU: SRU_1849(dxr) CHU: CHU_2996(dxr) CTE: CT0125(dxr) CPC: Cpar_0071 CCH: Cag_0008 CPH: Cpha266_2680 CPB: Cphaninl_0098 PVI: Cvib_0138 PLT: Plut_0077 PPH: Ppha_0080 CTS: Ctha_1044 PAA: Paes—0121 DET: DET0371(dxr) DEH: cbdb_A314(dxr) DEB: DehaBAVl_0353 EMI: Emin_0690 DRA: DR_1508 DGE: Dgeo_1044 TTH: TTC0504 TTJ: TTHA0856 AAE: aq_404 HYA: HY04AAS1—0095 SUL: SYO3AOP1—0479 TMA: TM0889 TPT: Tpet—0038 TLE: Tlet_0658 149048.doc -346 - 201111512 TRQ: TRQ2_0038 TME: Tmel_0037 FNO: Fnod_0950 PMO: Pmob—1939

149048.doc -347 201111512 例示性4-二磷酸胞苷-2C-甲基-D-赤藻糖醇合成酶核酸與多肽 ATH: AT2G02500(ISPD) STM: STM2930(ispD) OSA: 4324893(0s01g0887100) YPE: YP03361(ispD) OLU: OSTLU_24843(CMS) YPK: y0828(ispD) CRE: CHLREDRAFT_196604(CMS) YPM: YP_0326(ispD) CME: CMH115C YPA: YPA_2782(ispD) TAN: TA02505 YPN: YPN_0732(ispD) TPV: TP03_0057 YPP: YPDSF_2999(ispD) ECO: b2747(ispD) YPG: YpAngola_A0964(ispD) ECJ: JW2717(ispD) YPS: YPTB0770(ispD) ECD: ECDH10B_2915(ispD) YPI: YpsIP31758_3299(ispD) ECE: Z4055(ispD) YPY: YPK_3431 ECS: ECs3601(ispD) YPB: YPTS_0804 ECC: c3314(ispD) YEN: YE0769(ispD) ECI: UTI89_C3118(ispD) SFL: SF2770(ispD) ECP: ECP_2729(ispD) SFX: S2963(ispD) ECV: APEC01_3776(ispD) SFV: SFV_2751(ispD) ECW: EcE24377A_3048(ispD) SSN: SSON_2895(ispD) ECX: EcHS_A2885(ispD) ECM: EcSMS35_2872(ispD) SBO: SBO_2773(ispD) SBC: SbBS512_E3127(ispD) ECL: EcolC_0965 SDY: SDY_2946(ispD) STY: STY3055(ispD) ECA: ECA3535(ispD) STT: t2831(ispD) ETA: ETA_27010(ispD) SPT: SPA2786(ispD) PLU: plu0713(ispD) SPQ: SPAB—03644 BUC: BU420(ygbP) SEC: SC2862(ispD) BAS: BUsg405(ygbP) SEH: SeHA_C3120(ispD) WBR: WGLp532(ygbP) SEE: SNSL254_A3136(ispD) SGL: SG0526 SEW: SeSA_A3081(ispD) ENT: Ent638_3218(ispD) SES: SARI 00026 ESA: ESA_00544 149048.doc •348 - 201111512 KPN: KPN_03109(ispD) VVY: VV2816(ispD) CKO: CKO—04108 VPA: VP 1320 VP2559(ispD) SPE: Spro_0826 VFI: VF2073(ispD) BPN: BPEN_171(ispD) VHA: VIBHAR一03523 HIN: HI0672(ispD) PPR: PBPRA3077 HIT: NTHI0794(ispD) PAE: PA3633(ispD) HIP: CGSHiEE_08815(ispD) PAU: PA14_17340(ispD) HIQ: CGSHiGG_06635(ispD) PAP: PSPA7_1506(ispD) HDU: HD1329(ispD) PPU: PP_1614(ispD) HSO: HS_1496(ispD) PPF: Pput_4163(ispD) HSM: HSM一0505 PPG: PputGBl_1168 PMU: PM1608(ispD) PPW: PputW619—4061 MSU: MS2275(ispD) PST: PSPTO_1556(ispD) APL: APL_0802(ispD) PSB: Psyr_1365(ispD) APJ: APJL_0807(ispD) PSP: PSPPH_3818(ispD) APA: APP7 0861 PFL: PFL_1198(ispD) ASU: Asuc—2032 PFO: Pfl01_1123(ispD) XFA: XF1293(ispD) PEN: PSEEN4198(ispD) XFT: PD0545(ispD) PMY: Pmen一3031(ispD) XFM:Xfasml2_0618 PSA: PST_1559(ispD) XFN: XfasM23—0570 CJA: CJA_2223(ispD) XCC: XCC1702(ispD) PAR: Psyc—1634 XCB: XC_2529(ispD) PCR: Pcryo l 868 XCV: XCV1754(ispD) PRW: PsycPRwf_1662 XAC:XAC1721(ispD) ACI: ACIAD1999(ispD) XOO: X002961(ispD) ACB: A1S_1895 XOM: XOO_2812(ispD) ABM: ABSDF2025(ispD) SML: Smltl717(ispD) ABY: ABAYE1672 SMT: Smal—1454 ABC: ACICU_02004 VCH: VC0528(ispD) SON: SO_3438(ispD) VCO: VC0395—A0056(ispD) SDN·· Sden—1198 VVU: VVl_1582(ispD) SFR: Sfri_1054 149048.doc •349- 201111512 SAZ: Sama—1038 SBL: Sbal_3125 SBM: Shewl85—3134 SBN: Sball95_3277 SLO: Shew_1207 SPC: Sputcn32_2755 SSE: Ssed一 1292 SPL: Spea_1187 SHE: Shewmr4_1117 SHM: Shewmr7_1188 SHN: Shewana3_l 118 SHW: Sputw3181_1257 SHL: Shal_1224 SWD: Swoo_3348 ILO: IL0752(ispD) CPS: CPS_1072(ispD) PHA: PSHAa0684(ispD) PAT: Patl—3857 SDE: Sde一 1247 MAQ: Maqu_0923 AMC: MADE—03721 PIN: Ping_0672 MCA: MCA2517(ispD) FTU:FTT0711(ispD) FTF: FTF0711(ispD) FTW: FTW_1530(ispD) FTL: FTL—1525 FTH: FTH_1475(ispD) FTA: FTA_1609(ispD) FTN: FTN_0623(ispD) FTM: FTM_1371(ispD) FPH: Fphi_0219 NOC: Noc一0854 AEH: Mlg_1837 HHA: Hhal—1435 HCH: HCH_01869(ispD) CSA: Csal_2638 ABO: ABO_1166(ispD) MMW: Mmwyll—1301 AHA: AHA_0823(ispD) ASA: ASA—3473(ispD) BCI: BCI_0211(ispD) RMA: Rmag 0755 VOK: COSY—0697(ispD) NME: NMB1513 NMA:NMA1713 NMC-.NMC1442 NMN:NMCC_1418 NGO: NGO0972 NGK: NGK_0824 CVI: CV_1258(ispD) RSO: RScl643(ispD) REU: Reut_A1361(ispD) REH: H16_A1456(ispD) RME: Rmet_1954(ispD) BMA: BMA1490(ispD) BMV: BMASAVPl_A1987(ispD) BML: BMA10229一A3319(ispD) BMN: BMA10247_1259(ispD) BXE: Bxe_A2312(ispD) BVI: Bcepl808_1870(ispD) BUR: Bcepl8194_A5254(ispD) BCN: Bcen_6136(ispD) BCH: Bcen2424_1943(ispD)

149048.doc 350- 201111512 BCM: Bcenmc03_1967 EBA: ebA6543(ispD) BAM: Bamb_1931(ispD) AZO: azol682 BAC: BamMC406_1858 DAR: Daro_1973 BMU: Bmul_1328 TBD: Tbd_1003 BMJ: BMULJ_01918(ispD) MFA: Mila—1116 BPS: BPSL2099(ispD) HPY: HP1020(ispDF) BPM: BURPS1710b_2512(ispD) HPJ:jhp0404(ispDF) BPL: BURPS 1106A_2401 (ispD) HPA: HPAGl_0427(ispDF) BPD: BURPS668_2358(ispD) HHE: HH1582(ispDF) BTE: BTH_I2089(ispD) HAC: Hac_1124(ispDF) BPH: Bphy—0998 WSU: WS1940(ispDF) PNU: Pnuc—0930 TDN: Suden一1487(ispDF) PNE:Pnec_0911 CJE: Cjl607(ispDF) BPE: BP0865(ispD) CJR: CJE1779(ispDF) BPA: BPP3366(ispD) CJJ: CJJ81176_1594(ispDF) BBR: BB3817(ispD) CFF: CFF8240_0409(ispDF) BPT: Bpetl695(ispD) GSU: GSU3368(ispD) BAV: BAV1060(ispD) GME: Gmet_0060 RFR: Rfer_1332 GUR: Gura_4163 POL: Bpro_2716 GLO: Glov—0872 PNA: Pnap_2549 PCA: Pcar_0103(ispD) AAV: Aave一1581 PPD: Ppro—2969 AJS:Ajs_3156 DVU: DVU1454(ispD) VEI: Veis_4360 DVL: Dvul_1625 DAC: Daci_2849 DDE: Dde_1726 MPT: Mpe_A 1570 LIP: LI0446 HAR: HEAR1912(ispD) DPS: DP0257 MMS: mma_1409 DOL: Dole—2147 LCH: Lcho_2295 ADE: Adeh—1272 NEU-.NE1412 SAT: SYN_01401 NET: Neut_1525 SFU: Sfum—1637 NMU:Nmul A2127 WOL: WD1143 149048.doc •351 · 201111512 WBM: Wbm0409 AMA:AM1357(ispD) APH: APH_1277(ispD) ERU: Eruml030(ispD) ERW: ERWE_CDS_01000(ispD) ERG: ERGA_CDS_00960(ispD) ECN: Ecaj_0103 ECH: ECH_0157(ispD) BQU: BQ04980(ispDF) BBK: BARBAKC583_0540(ispDF) BTR: Btr_0870 CCR: CC_1738(ispDF) SIL: SP02090(ispDF) SIT: TM1040_1364 RSP: RSP_2835(ispD) RSQ:Rsphl7025_1485 PUB: SARI 1 0945(ispD) NSE: NSE_0178 MLO: mll0395(ispDF) MES: Meso_1621(ispDF) SME: SMc01040(ispDF) ATU: Atul443(ispF) ATC: AGR_C_2659 RET: RHE_CH01945(ispDF) RXE: RL2254(ispDF) BME: BMEI0863(ispDF) BMF:BABl_1143(ispDF) BMB: BruAbl_1126(ispDF) BMS:BR1120(ispDF) BJA: bll4485 BRA: BRAD03869(ispDF) BBT: BBta_4067(ispDF) RPA: RPA2590(ispD) RPB: RPB_2885 RPC: RPC_2575 RPD: RPD_2587 RPE: RPE_2755 NWI: Nwi_1442 NHA: Nham_1834 BHE: BH05820 RDE: RDl_2766(ispD) PDE: Pden_3667 MMR: Mmarl0_1439 HNE: HNE_2014(ispDF) ZMO: ZM01128(ispDF) NAR: Saro_1925(ispDF) SAL: Sala_1278 ELI: ELI_06290(ispDF) GOX: GOX1669 GBE: GbCGDNIHl—1019 ACR: Acry_0551 RRU:Rru_A1674 MAG: amb2363 MGM: Mmcl_2672 ABA: Acid345_0188 SWO: Swol_2361 CSC: Csac_2198 BSU: BSU00900(ispD) BHA:BH0107(ispD) BAN: BA0084(ispD) BAR: GBAA0084(ispD) BAA: BA_0674 BAT: BAS0085(ispD) BCE: BC0106(ispD) 149048.doc • 352 - 201111512

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149048.doc - 356 - 201111512 例示性4-二磷酸胞苷-2-C-甲基-D-赤藻糖醇激酶核酸與多肽 ATH: AT2G26930(ATCDPMEK) OS A: 4327968(0s01g0802100) PPP: PHYPADRAFT_190580 OLU: OSTLU_4287(CMK) CRE: CHLREDRAFT_137673(CMK1) CME: CMS444C PFA: PFE0150c PFD: PFDG_01632 PFH: PFHG_02738 PYO: PY04665 ECO: bl208(ispE) ECJ: JW1199(ispE) ECD: ECDH10B」261(ispE) ECE: Z1979(ychB) ECS:ECsl713

ECC: cl666(ispE) _ ECI: UTI89_C1402(ychB) ECP:ECP_1256 ECV: APEC01_324(ychB) ECW: EcE24377A_1356(ispE) ECX: EcHS_A1313(ispE) ECM: EcSMS35_1934(ispE) ECL: EcolC_2418 STY: STY1905(ipk) STT: tl097(ipk) SPT: SPA1094(ipk) SPQ: SPAB_01449 SEC: SC1773(ipk) SEH: SeHA_C1975(ispE) SEE: SNSL254_A1911(ispE) SEW: SeSA_A1917(ispE) SES: SARI_01174 STM: STM1779(ipk) YPE: YPO2014(ipk) YPK: y2293 YPM: YP_1862(ipk) YPA: YPAJ398 YPN: YPN一1496 YPP.YPDSFJ104 YPG: YpAngola_A2463(ispE) YPS: YPTB2002(ipk) YPI: YpsIP31758_2069(ispE) YPY: YPK_2182 YPB: YPTS_2060 YEN: YE2434(ipk) SFL: SF1211(ychB) SFX: S1295(ychB) SFV: SFV_1222(ychB) SSN: SSON_1970(ychB) SBO: SBO_1859(ychB) SBC: SbBS512_E1372(ispE) SDY: SDY_1257(ychB) 149048.doc -357 - 201111512 ECA: ECA2187(ispE) ETA: ETA_18820(ispE) PLU: plu2067(ispE) BUC:BU170(ychB) BAS: BUsgl64(ipk) WBR: WGLp348(ychB) SGL: SGI879 ENT: Ent638_2340 ESA: ESAJ) 1495 KPN: KPN_02237(ispE) CKO: CKO_01272 SPE: Spro—1987 BFL: Bfl347(ipk) BPN: BPEN_357(ispE) HIN: HI1608 HIT: NTHI1434(ispE) HIP: CGSHiEE_05690 HIQ: CGSHiGG_10080 HDU: HD1628(ispE) HSO: HS_0997(ispE) HSM: HSM_1475 PMU: PM0245 MSU: MS1535(ispE) APL: APL_0776(ispE) APJ: APJL_0779(ispE) APA: APP7_0837 ASU:Asuc_1751 XFA: XF2645 XFT: PD2018(ispE) XFM: Xfasml2_2208 XFN:XfasM23_2119 XCC: XCC0871(ipk) XCB: XC_3359 XCV: XCV0979(ispE) XAC: XAC0948(ipk) XOO: XOO3604(ipk) XOM: XOO_3406(XOO3406) SML: Smlt0874(ipk) SMT: Smal_0725 VCH: VC2182 VCO: VC0395_A1759 VVU: VV1—0256 VVY: VV0928 VPA: VP0740 VFI: VF0765 VHA: VIBHAR_01247 PPR: PBPRA2848 PAE: PA4669(ipk) PAU: PA14_61750(ipk) PAP: PSPA7_5318(ispE) PPU: PP_0723(ipk) PPF: Pput_0757(ipk) PPG: PputGB 1—0767 PPW: PputW619_4460 PST: PSPTO_1105(ispE) PSB: Psyr_0945(ipk) PSP: PSPPH_0993(ipk) PFL: PFL_5163(ipk)

149048.doc -358- 201111512

PFO: PflOl一4752(ipk) PEN: PSEEN0858(ipk) PMY: Pmen_1056(ipk) PSA: PST_3186(ipk) CJA: CJA_0646(ispE) PAR: Psyc_0173(ispE) PCR: Pcryo_0186 PRW: PsycPRwf—2104 ACI: ACIAD2903(ispE) ACB: A1S_0834 ABC: ACICU_00788 SON: SO_3836(ispE) SDN: Sden_0917 SFR: Sfri_0720 SAZ: Sama_2569 SBL: Sbal_0693 SBM: Shewl85_3617 SBN: Sball95_3740 SLO: Shew—2915 SPC: Sputcn32_0798 SSE: Ssed—3462 SPL: Spea_3129 SHE: Shewmr4_3172 SHM: Shewmr7_0794 SHN: Shewana3_0766 SHW: Sputw3181_3377 SHL: Shal_3214 SWD: Swoo一3688 ILO: IL0928(ispE) CPS: CPS_3556(ispE) PHA: PSHAal055(ispE) PAT: Patl_2566 SDE: Sde一3255 MAQ: Maqu_2364 AMC: MADE—02576 PIN: Ping一0912 MCA:MCA1055(ispE) FTU: FTT0271(ispE) FTF: FTF0271(ispE) FTW: FTW_1830(ispE) FTL:FTL_0151 FTH: FTH_0144(ispE) FTA: FTA_0164(ispE) FTN: FTN_0146(ispE) FTM: FTM_1592(ispE) FPH: Fphi—0678 NOC:Noc_0513 AEH: Mlg_0282 HHA: Hhal_0990 HCH: HCH_01727(ispE) CSA: Csal_1525 ABO: ABO_0519(ispE) MMW: Mmwyll—3603 AHA:AHA_3152(ispE) ASA: ASA_1172(ispE) BCI: BCI_0292(ispE) RMA: Rmag_0110 VOK: COSY_0115(ispE) I49048.doc -359- 201111512 NME: NMB0874 NMA: NMA1092 NMC:NMC0815 NMN: NMCC_0833 NGO: NG00440 NGK: NGK—0610 CVI: CV_4059(ispE) RSO: RSc0396(ipk) REU: Reut_A0343 REH: H16—A0374 RME: Rmet_0290 CTI: RALTA_A0318(ispE) BMA: BMA3118(ispE) BMV: BMASAVPl_A0086(ispE) BML: BMA10229_A1504(ispE) BMN: BMA10247_2932(ispE) BXE: Bxe_A4132 BVI: Bcepl808_2906 BUR: Bcepl8194_A6131 BCN: Been—2187 BCH: Bcen2424_2801 BCM: Bcenmc03_2812 BAM: Bamb_2861 BAC: BamMC406_2719 BMU: Bmul—0514 BMJ: BMULJ_02745(ispE) BPS: BPSL0523 BPM: BURPS1710b_0755(ispE) BPL: BURPS 1106A_0587(ispE) BPD: BURPS668_0571(ispE) BTE: BTH_I0476(ispE) BPH: Bphy_0316 PNU: Pnuc—1919 PNE: Pnec_1624 BPE: BP3126(ispE) BPA: BPP0816(ispE) BBR: BB0900(ispE) BPT: Bpet4003(ispE) BAV: BAV0536(ispE) RFR: Rfer_1659 POL: Bpro_1294 PNA: Pnap_0900 AAV: Aave_3609 AJS: Ajs_0896 VEI: Veis一0952 DAC: Daci_5432 MPT: Mpe_A3230 HAR: HEAR2892(ispE) MMS: mma_3127 LCH: Lcho_3497 NEU:NE1827(ipk) NET: Neut_1139 NMU: Nmul_A0588 EBA: ebA1405(ispE) AZO: azo0756(ispE) DAR: Daro_3729 TBD: Tbd_0386 MFA: Mfla—0679

149048.doc -360- 201111512

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149048.doc • 362- 201111512 CSC: Csac_2225 BSU: BSU00460(ispE) BHA: BH0061 BAN: BA0043(ispE) BAR: GBAA0043(ispE) BAA: BA_0633 BAT: BAS0044 BCE: BC0050

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149048.doc -376- 201111512 例示性1-羥基-2-甲基-2-(E)-丁烯基4-二磷酸合成酶核睃與多肽 ATH: AT5G60600(GcpE) OSA: 4329911(0s02g0603800) PPP: PHYPADRAFT_130936(HDS3) PHYPADRAFT_55802 OLU: OSTLU_12863(HDS) CRE: CHLREDRAFT_55268(HDS1)

CME: CML284C PFA: PF10_0221 PFH: PFHG_04116 PYO: PY01664 TAN: TA14455 TPV: TP02_0667 ECO:b2515(ispG) ECJ: JW2499(ispG) ECD: ECDH10B_2681(ispG) ECE: Z3778(ispG) ECS: ECs3377(ispG) ECC: c3037(ispG) ECI: UTI89_C2836(ispG) ECP: ECP_2520 ECV: APEC01_4009(ispG) ECW: EcE24377A_2799(ispG) ECX: EcHS_A2666(ispG) ECM: EcSMS35_2667(ispG) ECL: EcolC—1162 STY: STY2768(ispG) STT: t0333(ispG) SPT: SPA0344(ispG) SPQ: SPAB_00417 SEC: SC2520(ispG) SEH: SeHA_C2781(ispG) SEE: SNSL254_A2718(ispG) SEW: SeSA—A2762(ispG) SES: SARI_00355 STM: STM2523(ispG) YPE: YP02879(ispG) YPK: yl353(ispG) YPM: YP_2745(ispG) YPA: YPA_2319(ispG) YPN: YPN1259 YPP: YPDSF—2224(ispG) YPG: YpAngoIa_A0418(ispG) YPS: YPTB2841(ispG) YPI: YpsIP31758_1186(ispG) YPY: YPK_1293 YPB: YPTS_2950 YEN: YE1073(ispG) SFL: SF2561(ispG) SFX: S2733(ispG) SFV: SFV_2562(ispG) SSN: SSON_2597(ispG) SBO: SBO_2539(ispG) SBC: SbBS512_E2890(ispG) SDY: SDY_2711(ispG) ECA: ECA3220(ispG) ETA: ETA_10280(ispG) PLU: plul376(ispG) BUC: BU287(gcpE) 149048.doc - 377- 201111512 BAS: BUsg276(gcpE) WBR: WGLp573(gcpE) SGL: SG1760(ispG) ENT: Ent638_3009(ispG) ESA: ESA_00745 KPN: KPN_02845(ispG) CKO: CKO_00270 SPE: Spro_3609 BPN: BPEN_551(ispG) HIN: HI0368(ispG) HIT: NTHI0488(ispG) HIP: CGSHiEE_01170 SML: Smltl786 SMT: Smal—1524 VCH: VC0759(ispG) VCO: VC0395_A0288(ispG) VVU: VVl_0427(ispG) VVY: VV0766(ispG) VPA: YP0608(ispG) VFI: VF0629(ispG) VHA: YIBHAR_01067 PPR: PBPRA0763(ispG) PAE: PA3803(ispG) PAU: PA14_14880(ispG) HIQ: CGSHiGG_04650(ispG) PAP: PSPA7_1311(ispG) HDU: HD1037(ispG) PPU: PP_0853(ispG) HSO: HS_0404(ispG) PPF: Pput_0883(ispG) HSM: HSM一0729 PPG: PputGBl_0896 PMU: PM2010(ispG) PPW: PputW619_4325 MSU: MS1919(ispG) PST: PSPTO_1434(ispG) APL:APL_1176(ispG) PSB: Psyr_1248(ispG) APJ: APJL^1198(ispG) PSP: PSPPH_1320(ispG) APA: APP7_1235 PFL: PFL_4954(ispG) ASU: Asuc_2027 PFO: PflO 1—4601 (ispG) XFA: XF2575(ispG) PEN: PSEEN1021(ispG) XFT: PD1956(ispG) PMY: Pmen_3500 XFM: Xfasml2_2147 PSA: PST_3031(ispG) XFN: XfasM23—2062 CJA: CJA_1481(ispG) XCC:XCC1781(ispG) PAR: Psyc_0682(gcpE) XCB: XC_2455(ispG) PCR: Pcryo_0652 XCV: XCV1829(ispG) PRW: PsycPRwf_1902 XAC: XAC1799(ispG) ACI:ACIAD0561(ispG) XOO: X002229(ispG) ACB: A1S_0502 XOM: XOO_2095(ispG) ABM:ABSDF3001(ispG) 149048.doc -378 -

201111512 ΑΒΥ: ΑΒΑΥΕ3263 FTH: FTH_0861(ispG) ABC: ACICU_00511 FTA: FTA_0926(ispG) SON: SO_3312(ispG) FTN: FTN_1076(ispG) SDN: Sden_1256(ispG) FTM: FTM_0682(ispG) SFR: Sfri_1116(ispG) FPH: Fphi_0034 SAZ: Sama_2365(ispG) NOC:Noc_1749 SBL: Sbal—2990 AEH: Mlg_1461(ispG) SBM: Shewl85_3005 HHA: Hhal_0132(ispG) SBN: Shall95_3148 HCH: HCH_04456(ispG) SLO: Shew—1290 CSA: Csal_2854(ispG) SPC: Sputcn32_2652(ispG) ABO: ABO_1860(ispG) SSE: Ssed_1432 MMW: Mmwyll_1356 SPL: Spea_1305 AHA: AHA_1759(ispG) SHE: Shewmr4_1228(ispG) ASA: ASA_2599(ispG) SHM: Shewmr7_1299(ispG) BCI: BCI_0008(ispG) SHN: Shewana3_1229(ispG) RMA: Rmag_0384 SHW: Sputw3181—1355 VOK: COSY_0358(ispG) SHL: Shal_1367 NME: NMB1310(ispG) SWD: Swoo_1544 NMA: NMA1524(ispG) ILO: IL2034(ispG) NMC: NMC1247(ispG) CPS: CPS_4252(ispG) NMN: NMCC_1223 PHA: PSHAb0138(ispG) NGO: NGO0594(ispG) PAT; Patl_3126 NGK: NGK_1324 SDE: Sde_1434(ispG) CVI: CV_3538(ispG) MAQ: Maqu_1127(ispG) RSO:RScl215(ispG) AMC: MADE_02981 REU: Reut_A2086(ispG) PIN: Ping_1168 REH: H16_A2364(ispG) MCA: MCA2483(ispG) RME: Rmet_2106(ispG) FTU: FTT0607(ispG) BMA: BMA1345(ispG) FTF: FTF0607(ispG) BMV: BMASAVP1—A1835(ispG) FTW: FTW_1121(ispG) BML: BMA10229_A0062(ispG) FTL: FTL_0875(ispG) BMN: BMA10247_1107(ispG) 149048.doc -379- 201111512 BXE: Bxe_A1594(ispG) BVI:Bcepl808_1739 BUR: Bcepl8194_A5113(ispG) BCN: Bcen_6267(ispG) BCH: Bcen2424_1812 BCM: Bcenmc03_1836 BAM:Bamb_1750(ispG) BAC: BamMC406_1723 BMU: Bmul_1463 BMJ: BMULJ_01780(gcpE) BPS:BPSL1513(ispG) BPM: BURPS1710b_2355(ispG) BPL: BURPS 1106A_2228(ispG) BPD: BURPS668_2190(ispG) BTE: BTH_I2234(ispG) BPH: Bphy_1420 PNU: Pnuc，1291(ispG) PNE: Pnec_0664 BPE: BP2199(ispG) BPA: BPP2855(ispG) BBR: BB3176(ispG) BPT: Bpet2019(ispG) BAV: BAV2344(gcpE) RFR: Rfer，2307 POL: Bpro_2608(ispG) PNA: Pnap_l 872(ispG) AAV: Aave_1424(ispG) AJS: Ajs_1170(ispG) VEI: Veis_0080(ispG) DAC: Daci—5019 MPT: Mpe_A1996(ispG) HAR: HEAR1264(ispG) MMS: mma_2127 LCH: Lcho_2868 NEU:NE0148NE0149 NET: Neut_2168(ispG) NMU: Nmul_A2377 EBA:ebA1261(ispG) AZO: azo0927(ispG) DAR: Daro_2985(ispG) TBD: Tbd_0594(ispG) MFA: Mfla_1620(ispG) HPY: HP0625(ispG) HPJ:jhp0569(ispG) HPA: HPAGl_0608(ispG) HPS: HPSH_03735(ispG) HHE: HH0807(ispG) HAC: Hac_0735(ispG) WSU: WS1302(ispG) TDN: Suden_0376(ispG) CJE: Cj0686(ispG) CJR: CJE0785(ispG) CJJ: CJJ81176_0709(ispG) CJU: C8J_0654(ispG) CJD: JJD26997_1321(ispG) CFF: CFF8240_0983(ispG) CCV: CCV52592_0322(ispG) CHA: CHAB381_0996(ispG) CCO: CCC13826_0680(ispG) ABU: Abu_0656(ispG) NIS: NIS_0337(ispG) SUN: SUN_2134(ispG) GSU: GSU1459(ispG) GME: Gmet_1353

149048.doc •380 - 201111512 GUR: Gura_2799 ATC: AGR_C_4936 GLO: Glov_1907 RET: RHE_CH04009(ispG) PCA: Pcar_2368(ispG) REC: RHECIAT_CH0004297(gcpE) PPD: Ppro_1751 RLE: RL4630(ispG) DVU: DVU1344(ispG) BME: BMEI0269(ispG) DVL: Dvul_1724 BMF: BABl_1788(ispG) DDE: Dde_2207 BMB: BruAbl__1761(ispG) LIP: LI0024(gcpE) BMC: BAbS19_I16710 DPS:DP1163 BMS: BR1778(ispG) DOL: Dole_2059 BMT: BSUIS_B1254(ispG) ADE: Adeh_3949 BOV: BOV_1713(ispG) AFW: Anael09_0476 BCS: BCAN_A1816(ispG) SAT: SYN_00906 OAN: Oant_1123 SFU: Sfum_2112 BJA: blr0936(ispG) WOL: WD0116(ispG) BRA: BRADO0546(ispG) WBM: Wbm0782(ispG) BBT: BBta_7633(ispG) WPI: WP0196(ispG) RPA: RPA0519(ispG) AMA: AM741(ispG) RPB: RPB_0522(ispG) APH: APH_0442(ispG) RPC: RPC_0491(ispG) ERU: Erum4730(ispG) RPD: RPD_0317(ispG) ERW: ERWE_CDS_04950(ispG) RPE: RPE_0183(ispG) ERG: ERGA_CDS_04850(ispG) RPT: Rpal_0520 ECN: Ecaj_0471(ispG) NWI: Nwi_0494(ispG) ECH: ECH_0559(ispG) NHA: Nham_0620(ispG) NSE: NSE_0799(ispG) BHE: BH15270(ispG) PUB: SARI l_0517(ispG) BQU: BQ12180(ispG) MLO: mll3792(ispG) BBK: BARBAKC583_0119(ispG) MES: Meso_3337(ispG) BTR: Btr_2457(gcpE) PLA: Plav—1746 XAU: Xaut_1889 SME: SMc03888(ispG) AZC:AZC_4581 SMD: Smed_3133(ispG) MEX: Mext_1597 ATU: Atu2723(gcpE) MRD: Mrad2831_3931 149048.doc -381 - 201111512 MET: M446_5049 BID: Bind_0434 CCR: CC_0851 CAK: Caul_0957 SIL: SP02594(ispG) SIT: TM1040_0862(ispG) RSP: RSP_2982(ispG) RSH: Rsphl7029_1628 RSQ:Rsphl7025_1861 JAN: Jann_1935(ispG) RDE: RDl_2825(ispG) PDE: Pden_1820(ispG) DSH:Dshi_1184 MMR: MmarlO_2256(ispG) HNE: HNE_0621(ispG) ZMO: ZMO0180(ispG) NAR: Saro_0417 SAL: Sala_1848(ispG) SWI: Swit—2126 ELI: ELI_10365(ispG) GOX: GOX0034(ispG) GBE: GbCGDNIHl_0604(ispG) ACR: Acry_1012(ispG) GDI: GDI1913(ispG) RRU: Rru_A0747(ispG) MAG: ambl616(ispG) MGM: Mmcl_3591 ABA: Acid345_1423(ispG) SUS:Acid_1193 SWO: Swol_0891 CSC: Csac_2351 BSU: BSU25070(ispG) BHA: BH1401(ispG) BAN: BA4502(ispG) BAR: GBAA4502(ispG) BAA: BA 4950 BAT: BAS4180(ispG) BCE: BC4276(ispG) BCA: BCE_4358(ispG) BCZ: BCZK4028(ispG) BCY: Bcer98_3006 BTK: BT9727_4018(ispG) BTL: BALH_3871(ispG) BWE: BcerKBAB4_4131 BLI: BL03725(ispG) BLD: BLi02683(ispG) BCL: ABC1708(ispG) BAY: RBAM_023380 BPU: BPUM—2235 GKA: GK2466(ispG) GTN: GTNG_2403(ispG) LSP: Bsph_3646 ESI: Exig_0854 LMO: lmol441(ispG) LMF: LMOf2365_1460(ispG) STH: STH1501 CAC: CAC1797(gcpE) CPE: CPE1692(ispG) CPF: CPF_1946(ispG) CPR: CPR_1664(ispG) CTC: CTC01270(gcpE) CNO: ΝΤΟ 1 CX_2141 (ispG) CTH: Cthe_0997 CDF: CD2128(ispG)

149048.doc 382 - 201111512 CBO: CB02424(ispG) MPA: MAP2938c(ispG) CBA: CLB_2288(gcpE) MAV: MAV_3725(ispG) CBH: CLC_2271(gcpE) MSM: MSMEG_2580(ispG) CBL: CLK_1800(gcpE) MUL: MUL_2087(ispG) CBK: CLL_A1267(ispG) MVA: Mvan_2262 CBB: CLD_2216(gcpE) MGI: Mflv_4081(ispG) CBF: CLI_2480(gcpE) MAB: MAB_3169c CBE: Cbei_1197(ispG) MMC: Mmcs_2044(ispG) CKL: CKL_1425(ispG) MKM: Mkms_2090(ispG) CPY: Cphy_2620 MJL: Mjls_2027(ispG) AMT: Amet_2680 MMI: MMAR_0275(gcpE_2) AOE: Clos_1521 MMAR_1838(ispG) CHY: CHY_1776(ispG) CGL: NCgll938(ispG) DSY: DSY2537 CGB: cg2206(ispG) DRM: Dred—1968 CGT: cgR_1842(ispG) PTH: PTH_1262(gcpE) CEF: CE1903(ispG) DAU: Daud—0617 CDI: DIP1498(ispG) HMO: HMl_2266(ispG) CJK:jkll65(ispG) FMA: FMG_0730 CUR: cu0833 TTE: TTE1400(ispG) NFA: nfa41180(ispG) TEX:Teth514_1652 RHA: RHAl_ro06590(ispG) TPD: Teth39_1216 SCO: SC05696(ispG) SC06767(ispG) MTA: Moth_1043 SMA: SAV1647(ispG) SAV2561(ispG) MPE: MYPE9400 SGR: SGR_1821(gcpE) MGA: MGA_1156 TWH: TWT186(ispG) MTU: Rv2868c(ispG) TWS: TW586(ispG) MTC: MT2936(ispG) LXX: Lxxl2200(ispG) MRA: MRA_2893(ispG) CMI: CMM_2156(ispG) MTF: TBFG_12884(ispG) ART: Arth_1404(ispG) MBO: Mb2893c(ispG) AAU: AAur_1546(ispG) MBB: BCG_2890c(ispG) RSA: RSal33209_0641 MLE: ML1581(ispG) KRH: KRH_16120(ispG) 149048.doc -383 - 201111512 PAC: PPA1506(ispG) PCU: pc0740(gcpE) NCA: Noca_3202 ΤΡΑ: TP0446 TFU: Tfu_0749(ispG) TPP: TPASS_0446(gcpE) FRA: Francci3_3573(ispG) TDE: TDE1265(ispG) FRE: Franeanl_1170 LIL: LA3160(gcpE) FAL: FRAAL5772(ispG) LIC: LIC10955(gcpE) ACE: Acel_l 522 LBJ: LBJ_0737(gcpE) KRA: Krad_1429 LBL: LBL_2341(gcpE) SEN: SACE_5992(ispG) LBI: LEPBI_I1285(ispG) STP: Strop_1352(ispG) LBF: LBF_1231(gcpE) SAQ: Sare—1304 SYN: slr2136(gcpE) BLO: BL0098(ispG) SYW: SYNW1174(ispG) BLJ: BLD_0116(gcpE) SYC: syc0817_d(ispG) BAD: BAD_1157(ispG) SYF: Synpcc7942_0713(ispG) RXY: Rxyl_1406 SYD: Syncc9605_1298(ispG) FNU: FN0478 SYE: Syncc9902_1179(ispG) RBA: RB2118(gcpE) SYG: sync_1674(ispG) OTE: Oter_4634 SYR: SynRCC307_1462(ispG) MIN: Minf_1968(gcpE) SYX: SynWH7803_1475(ispG) AMU: Amuc_1388 SYP: SYNPCC7002_A0743(ispG) CTR: CT057(gcpE) CYA: CYA_2387(ispG) CTA: CTA^_0061(gcpE) CYB: CYB_0121(ispG) CTB: CTL0313(gcpE) TEL: tlr0996 CTL: CTLon_0308(gcpE) MAR: MAE_28180 CMU: TC0327(gcpE) CYT: cce_2312(ispG) CPN: CPn0373(gcpE) GVI: gll3622 CPA: CP0383 ANA: all2501 CPJ: CPj〇373(gcpE) NPU: Npun_F5054 CPT: CpB0385(aarC) AVA: Ava_0433(ispG) CCA: CCA00423(gcpE) PMA: Prol015(ispG) CAB: CAB409 PMM: PMM0676(ispG) CFE: CF0584(gcpE) PMT: PMT0777(ispG) 149048.doc -384- 201111512 PMN: PMN2A_0109(ispG) PMI: PMT9312_0676(ispG) PMB: A9601_07311(ispG) PMC: P9515_07491(ispG) PMF: P9303_14341(ispG) PMG: P9301_07291(ispG) PMH: P9215_07611(gcpE) PMJ: P9211_07901(gcpE) PME: NATLl_07341(ispG) TER: Tery_4522(ispG) φ AMR: AMl_0149(ispG) BTH: BT—2517 BFR: BF4365 BFS: BF4164

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BML: BMA10229_1267(ispH) BAV: BAV2403(ispH) BMA10229_A 1018(ispH) RFR: Rfer—3248 BMN: BMA10247_2097(ispH) POL: Bpro_0951 BMA10247_A2242(ispH) PNA: Pnap_3337 BXE: Bxe_A0820(ispH) Bxe_B0018(ispH) AAV: Aave_3771 BVI: Bcepl808_2577 Bcepl808_3716 AJS: Ajs_3448 BUR: Bcepl8194_A5831(ispH) VEI: Veis_1652 Bcepl8194_B0106(ispH) DAC: Daci一 1906 BCN: Bcen_1888(ispH) Bcen_5308(ispH) MPT: Mpe_A2693 BCH: Bcen2424_2499 Bcen2424_5552 HAR: HEAR2466(ispH) BCM: Bcenmc03_2524 Bcenmc03_4720 MMS: mma_2549 BAM: Bamb_2546(ispH) Bamb_4876(ispH) LCH: Lcho_0693 BAC: BamMC406_2417 BamMC406_5423 NEU: NE0649(lytB) BMU: Bmul_0795 Bmul_3253 NET: Neut一 1903 BMJ: BMULJ_02464(lytB) NMU: Nmul_A0089 BMULJ_05272(lytB) EBA: ebA4444(ispH) BPS: BPSL0919(ispH) BPSS2168(ispH) AZO: azol202(ispH) BPM: BURPS1710b_1141(ispH) DAR: Daro—3043 BURPS 1710b_A 1285(ispH) TBD: Tbd_1860 BPL: BURPS 1106A_0986(ispH) MFA: Mfla_2431 BURPS 1106A_A2929(ispH) HPY: HP0400(ispH) BPD: BURPS668_0981(ispH) HPJ:jhp0981(ispH) BURPS668_A3054(ispH) HPA: HPAGl_0992(ispH) BTE: BTH_I0783(ispH-l) HPS: HPSH_05405(ispH) BTH_II2243(ispH-2) HHE: HH0138(ispH) BPH: Bphy—0587 Bphy—4130 HAC: Hac_0458(ispH) PNU: Pnuc_1731 WSU:WS1310(ispH) PNE: Pnec—1449 TDN: Suden_0872(ispH) BPE: BP1237(ispH) CJE: Cj0894c(ispH) BPA: BPP1852(ispH) CJR: CJE0973(ispH) BBR: BB3256(ispH) CJJ: CJJ81176_0903(ispH) BPT: Bpet3147(lytB) CJU: C8J_0831(lytB) 149048.doc -389· 201111512 CJD: JJD26997_0919(ispH) CFF: CFF8240_1251(ispH) CCV: CCV52592_0515(ispH) CHA: CHAB381_0483(ispH) CCO: CCC13826_1566(ispH) ABU: Abu_2050(ispH) NIS: NIS^0662(ispH) SUN: SUN_0548(ispH) GSU: GSU2604(lytB) GME: Gmet—0866 GUR: Gura_1466 GLO: Glov_2146 PCA: Pcar_1883(lytB) PPD: Ppro_1349 DVU: DVU0055(ispH) DVL: Dvul_2906 DDE: Dde_0390 LIP: LI0728(lytB) DPS: DP2166 DOL: Dole—0383 ADE: Adeh_1519 AFW: Anael09_2302 SAT: SYN_02454 SFU: Sfum—1812 WOL: WD1274(ispH) WBM: Wbm0046(ispH) WPI: WP0811(lytB) AMA: AM804(ispH) APH: APH_0380(ispH) ERU: Erum5180(ispH) ERW: ERWE_CDS_05430(ispH) ERG: ERGA_CDS_05330(ispH) ECN: Ecaj_0526(ispH) ECH: ECH_0502(ispH) NSE: NSE_0438(ispH) PUB: SARll_0124(lytB) MLO: mlr7502(ispH) MES: Meso_0748(ispH) PLA: Plav_0686 SME: SMc00016(ispH) SMD: Smed_0527(ispH) ATU: Atu0774(lytB) ATC: AGR_C_1414(lytB) RET: RHE_CH00961(ispH) REC: RHECIAT_CH0001056(ispH) RLE: RL1030(ispH) BME: BMEI1459(ispH) BMF: BABl_0501(ispH) BMB: BruAbl_0497(ispH) BMC: BAbS19_I04640 BMS: BR0475(ispH) BMT: BSUIS_A0502(ispH) BOV: BOV_0480(ispH) BCS: BCAN_A0482(ispH) OAN: Oant_0589 BJA: bll3007(ispH) blrl314 BRA: BRAD02632(ispH) BRAD06588(ispHl) BBT: BBta_0948(ispHl) BBta_2972(ispH) RPA: RPA3734(ispH) RPA4271(lytB2) RPB: RPB_1340 RPB_1729(ispH) RPC: RPC_1726(ispH) RPC_4078 RPD: RPD_3570(ispH) RPD_4030 RPE: RPE_1816(ispH) RPE_4130

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BLJ: BLD_0227(lytB) BAD: BAD_1081(ispH) RXY: Rxyl—2212 RBA: RB9288(lytB) OTE: Oter_3652 MIN: Minf_2119(lytB) AMU: Amuc_1646 CTR: CT859(ispH) CTA: CTA_0937(ispH) CTB: CTL0234 φ CTL: CTLon_0234(ispH) CMU: TC0249(ispH) CPN: CPnl017(ispH) CPA: CP0836(ispH) CPJ: CPjl017(ispH) CPT: CpB1055(ispH) CCA: CCA00744(ispH) CAB: CAB711(ispH) CFE: CF0272(ispH) PCU: pcl078(ispH) ΤΡΑ: TP0547 TPP: TPASS_0547(lytB) TDE: TDE1096(ispH) LIL: LA2420(lytB) LIC:LIC11529(lytB) LBJ: LBJ_1807(lytB) LBL: LBL_1476(lytB) LBI: LEPBI_I1588(ispH) LBF: LBF_1537(lytB) SYN: slr0348 SYW: SYNW0252(lytB) SYC: sycl431_d(lytB) SYF: Synpcc7942_0073 SYD: Syncc9605_0246 SYE: Syncc9902_0275 SYG: sync_0292(ispH) SYR: SynRCC307_2319(lytB) SYX: SynWH7803_0296(lytB) SYP: SYNPCC7002_A0517(ispH) CYA: CYA_1148(ispH) CYB: CYB_2643(ispH) TEL: tlr 1041 MAR: MAE—16190 CYT: cce_1108 GVI: glr3299 ANA: all0985 NPU: Npun一R3286 AVA: Ava_2949 PMA: Pro0296(lytB) PMM: PMM0264(lytB) PMT: PMT1854(lytB) PMN: PMN2A_1630 PMI: PMT9312_0266 PMB:A9601_02861(lytB) PMC: P9515_02971(lytB) PMF:P9303_24821(lytB) PMG: P9301_02871(lytB) PMH: P9215—02881 (lytB) PMJ:P9211_02911(lytB) PME: NATLl_03421(lytB) TER: Tery_4479 AMR: AMl_4950(ispH) BTH: BT_2061(ispH) BFR: BF3748(ispH) 149048.doc - 393 - 201111512 BFS: BF3536(ispH) PMO: Pmob_1619 BVU: BVU_1936 PGI: PG0604(ispH) PGN: PGN一0647 PDI: BDI_3740(ispH) SRU: SRU_1880(ispH) CHU: CHU_0087(ispH) CTE: CT0283(ispH) CPC: Cpar—1751 CCH: Cag_0579(ispH)

CPH: Cpha266_0414(ispH) CPB: Cphamnl_0456 PVI: Cvib_1518(ispH) PLT: Plut_1736(ispH) PPH: Ppha_0448 CTS: Ctha_0114 PAA: Paes_0419 DET: DET1344(ispH) DEH: cbdb_A1294(ispH)

DEB:DehaBAVl_1155 EMI·· Emin—0409 DRA: DR_2164 DGE: Dgeo lOlO TTH:TTC1983(lytB) TTJ: TTHA0015 AAE: aq_1739(lytB) HYA: HY04AAS1_1048 SUL: SY03A0P1_1148 TMA: TM1444 TPT: Tpet_1350 TLE: Tlet_1650 IRQ: TRQ2_1336 149048.doc - 394 - 201111512 例示性異戊烯基-二磷酸δ -異構酶核酸與多肽 HSA: 3422(IDI1) 91734(IDI2) PPP: PHYPADRAFT_56143 PTR: 450262(IDI2) 450263(IDI1) OLU: OSTLU—13493 MCC: 710052(LOC710052) CRE: CHLREDRAFT_24471(IDI1) 721730(LOC721730) CME: CMB062C MMU: 319554(Idil) SCE: YPL117C(IDI1) RNO: 89784(Idil) AGO: AGOS 一ADL268C BTA: 514293(IDI1) KLA: KLLA0F0O924g MDO: 100021550(LOC100021550) DHA: DEHA0G20009g φ 100021613(LOC 100021613) PIC: PICST_68990(IDI1) 100021638(LOC 10002163 8) VPO: Kpol_479p9 OAA: 100080658(LOC 100080658) CGR: CAGL0J06952g GGA: 420459(IDI1) YLI: YALI0F04015g XLA: 494671(LOC494671) SPO: SPBC106.15(idil) XTR: 496783(idi2) NCR: NCU07719 SPU: 586184(LOC586184) PAN: PODANSg7228 NVE: MGR: MGG_07125 NEMVE_vl gl21175(NEMVEDRAFT_vl gl FGR: FG09722.1 21175) ANI: AN0579.2 • DME: Dmel_CG5919(CG5919) AFM-_AFUA一6G11160 DPO: Dpse_GA19228 AOR: A00900230005⑻ AGA: AgaP_AGAP001704 ANG: An08g07570 AAG: AaeL_AAEL006144 CNE: CNA02550 TCA: 660176(LOC660176) CNB: CNBA2380 CEL: K06H7.9(idi-l) LBC: LACBIDRAFT_291469 CBR: CBG22969 UMA: UM04838.1 BMY:Bml_16940 MGL: MGL_1929 ATH: AT3G02780(IDI2/IPIAT1/IPP2) ECU: ECU02—0230 AT5G16440(IPP1) MBR: MONBRDRAFT 34433 OSA: 4338791(0s05g0413400) GLA: GL50803—6335 4343523(0s07g0546000) DDI: DDB_0191342(ipi) 149048.doc 395 - 201111512 TET: TTHERM_00237280 TTHERM_00438860 PTM: GSPATT00007643001 GSPATT00011951001 TBR:Tb09.211.0700 TCR: 408799.19 51043 U0 LMA: LmjF35.5330 EHI: EHI_194410 TVA: TVAG_116230 TVAG_495540 ECO: b2889(idi) ECJ: JW2857(idi) ECD: ECDH10B_3063(idi) ECE: Z4227 ECS: ECs3761 ECC: c3467 ECI: UTI89_C3274 ECP: ECP—2882 ECV:APEC01一3638 ECW: EcE24377A_3215(idi) ECX: EcHS_A3048(idi) ECM: EcSMS35_3022(idi) ECL: EcolC_0820 STY:STY3195 STT: t2957 SPT: SPA2907(idi) SPQ: SPAB_03786 SEC: SC2979(idi) SEH: SeHA_C3270(idi) SEE: SNSL254_A3273(idi) SEW: SeSA_A3207(idi) SES: SARI_04611 STM: STM3039(idi) SFL: SF2875 SFX: S3074 SFV: SFV_2937 SSN: SSONJ042 SSON_3489(yhfK) SBO: SBO_3103 SBC: SbBS512_E3308(idi) SDY: SDY_3193 ECA: ECA2789 ETA: ETA_22390(idi) PLU: plu3987 ENT: Ent638_3307 ESA: ESA_00346 KPN: KPN_03317(idi) CKO: CKO_04250 SPE: Spro_2201 VPA: VPA0278 VFI: VF0403 VHA: VIBHAR_04924 PPR: PBPRA0469 PEN: PSEEN4850 PSA: PST_3876 CBU: CBU_0607(mvaD) CBS: COXBURSA331—A0720(mvaD) CBD: CBUD_0619(mvaD) LPN: lpg2051 LPF: lpl2029 LPP: lpp2034 LPC: LPC_1537(fni) TCX:Tcr_1718 HHA: Hhal_1623 DNO: DNO—0798 EBA: ebA5678 p2A143

149048.doc -396- 201111512 DVU: DVU1679(idi) BSU: BSU22870(ypgA) DDE:Dde_1991 BAN: BA 1520 LIP: LI1134 BAR: GBAA1520 BBA: Bdl626 BAA: BA_2041 AFW: Anae 109—4082 BAT: BAS 1409 MXA: MXAN_5021(fni) BCE: BC1499 SCL: scel761(idi) BCA: BCE_1626 RPR: RP452 BCZ: BCZK1380(fni) RTY: RT0439(idi) BCY: Bcer98一 1222 RCO: RC0744 BTK: BT9727—1381(fni) RFE: RF_0785(fni) BTL: BALH—1354 RBE: RBE_0731(fni) BWE: BcerKBAB4_1422 RBO:A1I_04760 BLI: BL02217(fni) RAK: A1C_04195 BLD: BLi02426 RCM: A1E_02555 BAY: RBAM_021020(fni) RRI: A1G_04195 BPU: BPUM_2020(fni) RRJ: RrIowa—0882 OIH: OB0537 RMS: RMA_0766(fni) SAU: SA2136(fni) MLO: mlr6371 SAV: SAV2346(fni) MES: Meso_4299 SAW: SAHV_2330(fni) RET: RHE_PD00245(ypd00046) SAM: MW2267(fni) REC: RHECIAT_PB0000285 SAR: SAR2431(fni) XAU: Xaut_4134 SAS: SAS2237 SIL: SPO0131 SAC: SACOL2341(fni) SIT: TM1040J442 SAB: SAB2225c(fni) RSP: RSP—0276 SAA: SAUSA300—2292(fni) RSH: Rsphl7029_1919 SAX: USA300HOU—2327 RSQ: Rsphl7025_1019 SAO: SAOUHSC_02623 JAN: Jann_0168 SAJ: SaurJH9_2370 RDE: RDl_0147(idi) SAH: SaurJHl_2416 DSH: Dshi—3527 SAE: NWMN_2247(idi) SWO: Swol_1341 SEP: SE1925 149048.doc -397- 201111512 SER: SERP1937(fni-2) SHA: SH0712(fni) SSP: SSP0556 LMO:lmol383 LMF: LMOf2365_1402(fni) LIN: linl420 LWE: lwel399(fni) LLA: L11083(yebB) LLC: LACR_0457 LLM: llmg_0428(fni) SPY: SPy_0879 SPZ: M5005_Spy_0685 SPM: spyM18_0940 SPG: SpyM3_0598 SPS: SPsl255 SPH: MGAS10270_Spy0743 SPI: MGAS10750_Spy0777 SPJ: MGAS2096_Spy0756 SPK: MGAS9429_Spy0740 SPF: SpyM51123(fni) SPA: M6_Spy0702 SPB: M28_Spy0665 SPN: SP—0384 SPR: spr0341(fni) SPD: SPD_0349(fni) SPV: SPH_0491(fni) SPW: SPCG_0379(fni) SPX: SPG_0349 SAG: SAG1323 SAN: gbsl393 SAK: SAK_1354(fni) SMU: SMU.939 STC: str0562(idi) STL: stu0562(idi) STE: STER_0601 SSA: SSA—0336 SSU: SSU05_0292 SSV: SSU98_0288 SGO: SGO—0242 SEZ: Sez—1081 LPL: lp_1732(idil) LJO: LJ1208 LAC: LBA1171 LSA: LSA0905(idi) LSL: LSL_0682 LDB: Ldb0996(fni) LBU: LBUL_0903 LBR: LVIS_0861 LCA: LSEI_1493 LCB: LCABL_17150(fni) LGA: LGAS_1036 LRE: Lreu_0912 LRF: LAR_0859 LHE: lhv_1278 LFE:LAF_1195 EFA: EF0901 OOE: OEOE_1103 LME: LEUM_1388 LCI: LCK_00620 STH: STH1674 DRM: Dred_0474 HMO: HMl_1981(fni) FMA: FMG_1144 MTA: Moth 1328

149048.doc - 398 - 201111512 ACL: ACL_0797(idi) PAC:PPA2115 MTU: Rvl745c(idi) FRA: Francci3_4188 MTC: MT1787(idi) FRE: Franeanl_5570 MRA: MRA_1756(idi) FAL: FRAAL6504(idi) MTF: TBFG_11763 KRA: Krad_3991 MBO: Mbl774c(idi) SEN: SACE_2627(idiB_2) SACE_5210(idi) MBB: BCG_1784c(idi) STP: Strop_4438 MPA: MAP3079c SAQ: Sare_4564 Sare_4928 MAV: MAV_3894(fni) RXY: Rxyl_0400 MSM: MSMEG_1057(fni) MSMEG_2337(fni)BBU: BB0684 MUL: MUL_0380(idi2) BGA: BG0707 MVA: Mvan一1582 Mvan—2176 BTU: BT0684 MGI: Mflv_1842 Mflv_4187 SYN: sill556 MAB: MAB_3242 SYC: syc2161_c MMC: Mmcs_1954 SYF: Synpcc7942_1933 MKM: Mkms_2000 SYP: SYNPCC7002_A1132(fni) MJL: Mjls_1934 CYA: CYA_2395(fni) MMI: MMAR_3218(idi) MMAR_4812(idi2) CYB: CYB_2691(fni) CGL: NCgl2223(cgl2305) TEL: til 1403 CGB: cg2531(idi) MAR: MAE_56570 CGT: cgR_2177 CYT: cce_1202 CEF: CE2207 ANA: all4591 CDI: DIP1730(idi) NPU: Npun_R1243 NFA: nfal9790 nfa22100 AVA: Ava_2461 Ava_B0346 RHA: RHAl_ro00239 TER: Tery—1589 SCO: SCO6750(SC5F2A.33c) AMR: AMl_4374(fni) SMA: SAV1663(idi) SRU: SRU_1900(idi) SGR: SGR_977 CHU: CHU_0674(idi) LXX: Lxx23810(idi) GFO: GFO_2363(idi) CMI: CMM_2889(idiA) FJO: Fjoh_0269 AAU: AAur_0321(idi) FPS: FP1792(idi) KRH: KRH_03040(idi) CTE: CT0257 149048.doc -399- 201111512 CPC: Cpar，1777 CCH: Cag_1445 CPH: Cpha266_0385 CPB: Cphamnl_0417 PVI: Cvib_1545 PLT: Plut_1764 PPH: Ppha_0414 CTS: Ctha_0403 PAA: Paes—0384 RRS: RoseRS一2437 RCA: Reas—2215 CAU: CaurJ877 HAU: Haur_4687 DRA: DR_1087 DGE:Dge〇一1381 TTH: TT_P0067 TTJ: TTHB110 MJA: MJ0862 MMP: MMP0043 MMQ: MmarC5_1637 MMX: MmarC6_0906 MMZ: MmarC7_1040 MAE: Maeo_1184 MVN: Mevan_1058 MAC: MA0604(idi) MBA: Mbar_A1419 MMA:MM_1764 MBU: Mbur_2397 MTP: Mthe_0474 MHU: Mhun_2888 MLA: Mlab_0683 Mlab_1665 MEM: Memar_1814 MBN: Mboo—2211 MTH: MTH48 MST: Msp_0856(fni) MSI: Msm_1441 MKA: MK0776(lldD) AFU: AF2287 HAL: YNG1818G(idi) VNG6081G(crt_l) YNG6445G(crt_2) VNG7060 VNG7149 HSL: OE3560F(idiA) OE6213R(idiB2) OE7093R(idiBl) HMA: rmAC3484(idi) HWA: HQ2772A(idiA) HQ2847A(idiB) NPH: NP0360A(idiB_l) NP4826A(idiA) NP5124A(idiB_2) TAC: Ta0102 TVO: TVN0179 PTO: PTO0496 PHO: PH1202 PAB: ΡΑΒΙ662 PFU: PF0856 TKO: TK1470 RCI: LRC397(fni) APE: APE_1765.1(fni) SMR: Smar_0822 IHO: Igni_0804 HBU: Hbut_0539 SSO: SS00063 STO: ST2059 SAI: Saci_0091 MSE: Msed—2136 PAI: PAE0801 PIS: Pisl_1093 149048.doc • 400- 201111512 PCL: Pcal_0017 PAS: Pars—0051 CMA: Cmaq_0231 Cmaq_1145 TNE: Tneu_0048 TPE: Tpen_0272 NMR: Nmar_0313 KCR: Kcr_1016

149048.doc -401 · 201111512 例示性異戊二烯合成酶核酸與多肽

Genbank寄存編號 AY341431 AY316691 AY279379 AJ457070 AY182241 【圖式簡單說明】圖1為針對大腸桿菌中之表現進行密碼子最佳化之野葛異戊二烯合成酶基因的核苷酸序列（SEQ ID ΝΟ:1)。atg起始密碼子為斜體，終止密碼子為粗體，且添加之Psil位點加下劃線；圖2為pTrcKudzu之圖譜；圖3為pTrcKudzu之核苷酸序列（SEQ ID NO:2)。RBS加下劃線，野葛異戊二烯合成酶起始密碼子為粗體大寫字母，且終止密碼子為粗體、大寫、斜體字母。載體骨架為 pTrcHis2B ; 圖4為pETNHisKudzu之圖譜；圖 5為 pETNHisKudzu之核苷酸序列（SEQ ID NO:5); 圖6為pCL-lac-Kudzu之圖譜；圖 7為 pCL-lac-Kudzu之核苷酸序列（SEQ ID NO:7); 圖8A為展示不含載體之大腸桿菌BL21細胞中異戊二烯產量之圖；圖8B為展示含有pCL-lac-Kudzu之大腸桿菌BL2 1細胞中異戊二烯產量之圖； 149048.doc -402 - 201111512 圖8C為展示含有pTrcKudzu之大腸桿菌BL2 1細胞中異戊二稀產量之圖；圖8D為展示含有pETN-HisKudzu之大腸桿菌BL21細胞中異戊二烯產量之圖；圖9A為展示在14公升批式補料醱酵中大腸桿菌 BL21/pTrcKudzu之OD隨醱酵時間而變之圖；圖9B為展示在14公升批式補料醱酵中大腸桿菌 BL21/pTrcKudzu之異戍二烯產量隨醱酵時間而變之圖；圖10A為展示檸檬泛菌中之異戊二烯產量之圖；不含重組野葛異戊二烯合成酶之對照細胞。灰色菱形表示異戊二烯合成，黑色正方形表示〇D6q 圖10B為展示表現pCL_lae Kudzu2檸檬泛菌中之異戊二烯產里之圖，灰色菱形表示異戊二烯合成黑色正方形表不 OD600 ; 圖10C為展示表現pTrcKudzu之檸檬泛菌中之異戊二烯產量之圖；灰色菱形表示異戊二烯合成，黑色正方形表示〇〇600 * 圖11為，現重組異戊二稀合成酶之枯草桿菌中之異戊烯產董之圖，BG3594comK為不含質體之枯草桿菌菌株（天然異戊二烯製造）。CF443-BG3594c〇mK為含有 pBSKudzu之枯草桿菌菌株（重組異戊二μ造上之 IS表示異戊二烯；圖 12 為 pBS Kudzu 夕吐 r** 之核#酸序列（SEQ ID NO:5 6); 圖1 3為針對耶氏酵母屬蜀r之表現進行密碼子最佳化之野 149048.doc -403 - 201111512 葛異戊二烯合成酶的核苷酸序列（SEQ ID NO:8); 圖1 4為包含針對耶氏酵母屬中之表現進行密碼子最佳化之野葛異戊二烯合成酶基因之pTrex3g的圖譜；圖15為載體pSPZl(MAP29Spb)之核苷酸序列（SEQ ID ΝΟ:11)；圖1 6為針對耶氏酵母屬中之表現進行密碼子最佳化之合成野葛（山葛）異戊二烯基因的核苷酸序列（SEQ ID NO:12)；圖17為合成雜交楊屬（銀白楊與歐洲山楊雜交種）異戊二烯合成酶基因之核苷酸序列（SEQ ID NO: 13)。ATG起始密碼子為粗體，且終止密碼子加下劃線；圖18A展示概述載體pYLA 1、pYLl及pYL2之構造的示意圖；圖18B展示概述載體pYLA(POPl)之構造的示意圖；圖18C展示概述載體pYLA(KZl)之構造的示意圖；圖18D展示概述載體pYLI(KZl)之構造的示意圖；圖18E展示概述載體pYLI(MAP29)之構造的示意圖；圖1 8F展示概述載體pYLA(MAP29)之構造的示意圖；圖19A展示異戊二烯之MVA及DXP代謝途徑（基於F. Bouvier等人，Progress in Lipid Res. 44: 357-429，2005)。以下描述包括途徑中各多肽之替代性名稱及揭示用於量測指定多肽之活性之檢驗的參考文獻（此等參考文獻中之每一者各藉此以全文引用的方式併入，尤其關於針對MVA及 DXP途徑中之多肽的多肽活性之檢驗）。曱羥戊酸途徑： 149048.doc -404· 201111512

AACT ;乙醯基-CoA乙醯轉移酶，MvaE，EC 2.3.1.9。檢驗·· J. Bacteriol·，184: 2116-2122，2002 ; HMGS ;羥曱基戊二醯基-CoA合成酶，MvaS，EC 2.3.3.10。檢驗：J. Bacteriol·，184: 4065-4070，2002 ; HMGR ; 3-羥基-3-曱基戊二醯基-CoA 還原酶，MvaE，EC 1.1.1.34。檢驗：J_ Bacteriol·, 184: 2116-2122, 2002 ; MVK ;曱羥戊酸激酶’ ERG12，EC 2.7.1.36。檢驗：Curr Genet 19: 9-14，1991 ° PMK ;磷酸甲羥戊酸激酶，ERG8，EC 2.7.4.2。檢驗： Mol Cell Biol·，1 1: 620-63 1，1991 ; DPMDC ;二磷酸曱羥戊酸去羧酶，MVD1 ’ EC 4.1.1.33。檢驗：Biochemistry， 33: 13355-133 62，1994 ; IDI ;異戊烯基-二磷酸 δ-異構酶，IDI1，EC 5.3.3.2。檢驗：J. Biol. Chem. 264: 19169-19175, 1989。DXP途徑：DXS ; 1-去氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶，dxs ’ EC 2.2.1.7。檢驗· PNAS, 94: 12857-62, 1997 ; DXR ; 1-去氧-D-木酮糖5-磷酸還原異構酶，dxr， EC 2.2.1.7。檢驗：Eur. J. Biochem. 269: 4446-4457, 2002 ; MCT ; 4-二磷酸胞苷_2C_甲基-D-赤藻糖醇合成酶 ’ IspD，EC 2.7.7.60。檢驗：PNAS，97: 6451-6456, 2000 ; CMK ; 4-二填酸胞苷-2-C-曱基-D-赤藻糖醇激酶， IspE，EC 2.7.1.148。檢驗：PNAS，97: ^62-1067, 2000 ; MCS ; 2C-曱基-D-赤藻糠醇2,4_環二麟酸合成酶，IspF ’ EC 4.6.1.12。檢驗：PNAS，96: 11758-11763, 1999 ; HDS ; 1-羥基-2-曱基-2-(E)_ 丁烯基4-二磷酸合成酶， ispG，GcpE，EC 1.17·4·3。檢驗：J· Org. Chem.，70: 149048.doc • 405· 201111512 9168-9174，2005 ; HDR ; 1-羥基-2-甲基-2-(E)-丁烯基 4-二填酸還原酶，IspH，LytB，EC 1.17.1.2。檢驗：JACS， 126:12847-12855, 2004 ；圖20展示描繪不含（左圖）或含有（右圖）野葛異戊二烯合成酶基因之重組解脂耶氏酵母菌株之異戊二烯產量之GC-MS分析結果的圖；箭頭表示可靠異戊二烯標準物之溶離時間；圖 21 為 pTrcKudzu yIDI DXS Kan之圖譜；圖 22為 pTrcKudzu yIDI DXS Kan之核皆酸序列（SEQ ID NO:20)；圖23A為展示在BL2 1/pTrcKudzukan中自葡萄糖製造異戊二稀又情況之圖；〇時為用IPTG(400 μηιοί)誘導之時間。x 軸為誘導後時間；y軸為〇D6〇Q，且y2抽為異戊二稀總生產力（pg/L頂部空間氣體）或比生產力hg/L頂部空間氣體/ OD)。菱形表示OD6G〇，圓圈表示異戊二稀總生產力 (pg/L)，且正方形表示異戊二烯比生產力（pg/L/OD); 圖23B為展示在BL21 /pTrcKudzu yIDI kan中自葡萄糖製造異戊二稀之情況之圖；0時為用IPTG(400 μηιοί)誘導之時間。X軸為誘導後時間；y軸為OD6()()，且y2軸為異戊二烯總生產力（Kg/L頂部空間氣體）或比生產力（pg/L頂部空間氣體/OD)。菱形表示OD6〇〇，圓圈表示異戊二烯總生產力 (pg/L)，且正方形表示異戊二稀比生產力（pg/L/OD); 圖23C為展示在BL21/pTrcKudzu DXS kan中自葡萄糖製造異戊二烯之情況之圖；0時為用IPTG(400 μηιοί)誘導之 149048.doc • 406- 201111512 時間。X軸為誘導後時間；y軸為〇D6()()，且y2軸為異戊二稀總生產力bg/L頂部空間氣體）或比生產力（pg/L頂部空間氣體/OD)。菱形表示〇d6()()，圓圈表示異戊二烯總生產力 (Kg/L) ’且正方形表示異戊二烯比生產力bg/L/〇D); 圖23D為展示在BL21/pTrcKudzu yIDI DXS kan中自葡萄糖製造異戊二烯之情況之圖；〇時為用IPTG(400 μηιοί)誘導之時間。Χ軸為誘導後時間；y軸為〇D6()()，且y2軸為異戊二烯總生產力（pg/L頂部空間氣體）或比生產力hg/L頂部空間氣體/OD)。菱形表示〇d60()，圓圈表示異戊二烯總生產力（pg/L)，且正方形表示異戊二烯比生產力bg/L/〇D); 圖23E為展示在BL21/pCL PtrcKudzu中自葡萄糖製造異戊二烯之情況之圖；〇時為用IPTG(400 μιηοΐ)誘導之時間。X軸為誘導後時間；y軸為〇D6()()，且y2軸為異戊二烯總生產力（gg/L頂部空間氣體）或比生產力bg/L頂部空間氣體/OD)。菱形表示OD6〇()，圓圈表示異戊二烯總生產力 (gg/L) ’且正方形表示異戊二烯比生產力（pg/L/OD); 圖23F為展示在BL21/pCL PtrcKudzu yIDI中自葡萄糖製造異戊二烯之情況之圖；〇時為用IPTG(400 μηιοί)誘導之時間。X轴為誘導後時間；y軸為0D6Q(3，且y2軸為異戊二烯總生產力（pg/L頂部空間氣體）或比生產力（pg/L頂部空間氣體/OD) ^菱形表示〇d6()()，圓圈表示異戊二烯總生產力 (pg/L)，且正方形表示異戊二烯比生產力（pg/L/OD); 圖23G為展示在BL21/pCL PtrcKudzu DXS中自葡萄糖製造異戊二烯之情況之圖；0時為用IPTG(400 μηιοί)誘導之 149048.doc -407- 201111512 時間。χ轴為誘導後時間；y轴為O D 6 〇〇 *且y 2轴為異戍二烯總生產力（pg/L頂部空間氣體）或比生產力（pg/L頂部空間氣體/OD)。菱形表示O.D6()()，圓圈表示異戊二烯總生產力 (pg/L)，且正方形表示異戊二烯比生產力（pg/L/OD); 圖23H為展示在BL21/pTrcKudzuIDIDXSkan中自葡萄糖製造異戊二烯之情況之圖；箭頭表示用IPTG(400 μιηοΐ)誘導之時間。X轴為誘導後時間，y轴為OD6〇〇，且y2轴為異戊二烯總生產力（pg/L頂部空間氣體）或比生產力（pg/L頂部空間氣體/OD)。黑色菱形表示OD6〇()，黑色三角形表示異戊二烯生產力（pg/L)，且白色正方形表示異戊二烯比生產力（pg/L/OD); 圖24為p9796-poplar之圖譜；圖 25 為 p9796-poplar之核苷酸序列（SEQ ID NO:21); 圖26為pTrcPoplar之圖譜；圖 27為 pTrcPoplar之核苷酸序列（SEQ ID NO:22); 圖 28為 pTrcKudzu yIDI Kan之圖譜；圖 29為 pTrcKudzu yIDI Kan之核苷酸序列（SEQ ID NO: 23) ；圖 30為 pTrcKudzuDXS Kan之圖譜；圖 31 為 pTrcKudzuDXS Kan之核苷酸序列（SEQ ID NO: 24) ；圖32為pCL PtrcKudzu之圖譜；圖 33 為 pCL PtrcKudzu之核苷酸序列（SEQ ID NO:25); 圖 34為 pCL PtrcKudzu A3之圖譜； 149048.doc -408 - 201111512 圖 35為 pCL PtrcKudzu A3之核苷酸序列（SEQ ID NO: 26)；圖 36為 pCL PtrcKudzu yIDI之圖譜；圖 37為 pCL PtrcKudzu yIDI之核苷酸序列（SEQ ID NO: 27) ；圖 38為 pCL PtrcKudzu DXS之圖譜；圖 39 為 pCL PtrcKudzu DXS之核苷酸序列（SEQ ID NO: 28) ；圖40展示描繪自生質原料而得之異戊二烯產量之圖；a 圖展示自玉米乾草而得之異戊二稀產量，B圖展示自甜菜渣而得之異戊二烯產量，C圖展示自軟木漿而得之異戊二烯產量，D圖展示自葡萄糖而得之異戊二浠產量，且e圖展不自不含其他原料之細胞而得之異戊二稀產量。灰色正方形表示在接種後指定時間培養物之0D6Q()量測值，且黑色三角形表示在接種後指定時間之異戊二烯產量；圖41A展示描緣在未添加葡萄糖之培養物中由BL21 (λϋΕ3) pTrcKudzu yIDI DXS (kan)而得之異戊二烯產量之圖；正方形表示〇D6()()，且三角形表示所製造之異戊二烯 (pg/ml);

圖 41B展示描繪由 BL21 (λϋΕ3) pTrcKudzu yIDI DXS (kan)自1 °/〇葡萄糖原料轉化糖而得之異戊二烯產量之圖；正方形表示〇D6QQ，且三角形表示所製造之異戊二烯 (pg/ml);

圖 41C展示描繪由 BL21 (λϋΕ3) pTrcKudzu yIDI DXS 149048.doc •409- 201111512 (kan)自1%轉化糖原料而表〜且三角形表示所::::广：圖；正方形圖41D展示描繪由BL21 }，

)pTrcKudzu yIDI DXS 自WAFEX^乾草料正方形表示〇〇6。。，且=角形表_:::-席產量之圖； (,g/mi)； -角…所製造之異戊二烯圖42展示顯示酵母提取物對異戊二烯產量之影· A圖展示在以不同量之酵 ^ ，學密度之時程4圖展示在以不=仃補料之輯槽内光固辰不在U不同量之酵母楛料之醱酵槽内異戊-烯力進仃補製造之異戊二2;=:每公升_培養液所 >+ ^ ^ . 貝C圖展不酵母提取物對生長於批式補料培養物中響；養物中之大腸㈣之異戊二烯產量的影二二!顯示在500 L生物反應器中含有pm— ^㈣貝體之大腸桿菌細胞之異紅稀產量之圖；八圖 ==萄糖及酵母提取物進行補料之5。“生物反應 : '干在度之時程。B圖展示在以葡萄糖及酵母提取物進行補料之5〇0 L生物反應器内異戊二稀力價之時程。每公升酿酵培養液所製造之異戊二婦之量即定為力價。c圖萄糖及酵母提取物進行補料之5〇0 L生物反應器中所製之總異戊二烯之時程；圖44為pBS Kudzu #2之圖譜；圖45A為展示在14公升批式補料潑酵中表現重組野葛異戊二稀合成酶之桿菌屬在酸酵時間期間之生長的圖；黑色 149048.doc •410- 201111512 菱形表示不含重組異戊二烯合成酶之對照菌株 (BG3 594comK)(天然異戊二烯製造），且灰色三角形表示含有pBSKudzu之桿菌屬（重組異戊二浠製造）；圖45B為展示在1 4公升批式補料醱酵中表現重組野葛異戊二烯合成酶之桿菌屬在醱酵時間期間之異戊二烯產量的圖；黑色菱形表示不含重組異戊二烯合成酶之對照菌株 (BG3 594comK)(天然異戊二烯製造），且灰色三角形表示含有pBSKudzu之桿菌屬（重組異戊二烯製造）；圖46A-D描繪空載體（對照）、HgS及HgS-FldA菌株產生之異戊二烯之生長速率及比生產力；圖46E為pBAD33之圖譜；圖46F及圖46G為pBAD33之核苷酸序列（SEQ ID NO:51)；圖 46H為 pTrcHgS-pBAD33之圖譜；圖461及圖46J為pTrcHgS-pBAD33之核苷酸序列（SEQ ID NO:52)；圖 46K為 pTrcHgSfldA-pBAD33之圖譜；圖46L及圖46M為pTrcHgSfldA-pBAD33之核苷酸序列 (SEQ ID NO:53)；圖47展示菌株REM19-22相比REM23-26之生長及異戊二烯產量。當培養物之〇〇λ600ηηι為約0.2-0.25時，於0時用200 μΜ IPTG誘導兩組菌株中異戊二烯合成酶之表現及測試組菌株中臺灣溫泉菌基因之表現。圖中所示之數據為將IPTG 添加至培養物中之後4小時所獲得之數據。在30°C、震盪 149048.doc -411 - 201111512 下使細胞於TM3中生長。親本菌株與測試組菌株之比較指示，GIl.O-c/xs、GIU-c/ji:·?、及 GI-1.6-dxi 測試菌株之異戊二烯產量相比親本菌株分別增加10%、20%、 30%及 80% ; 圖48展示較高量之GcpE產物HDMAPP積累於菌株 REM23-2中。在5小時IPTG誘導期中，測定REM19-26(x軸上所指示之菌株）之DXP代謝物及較大類異戊二浠分子之濃度。圖例中指示所量測之DXP代謝物及類異戊二烯； DXP，1-去氧-D-木酮糖5-磷酸；MEP，2-C-甲基-D-赤藻糖醇4-磷酸；cMEPP，2-C-甲基-D-赤藻糖醇-2,4-環二磷酸；HDMAPP，（五)-4-羥基-3-甲基丁 -2-烯基二磷酸； DMAPP，二曱基烯丙基二磷酸；IPP，異戊烯基二磷酸； FPP，法呢基焦磷酸；圖49展示菌株REM29相比REMH86之異戊二烯製造之比生產力；圖50描繪使用RED/ET系統在i/xs之前插入GI 1.X啟動子系列所使用之策略的動晝表示圖；在整個3小時震盪燒瓶醱酵中，每隔30分鐘檢驗REM29(藍色）及REMH86(黃色）之生長速率（菌株生長情況相當）及異戊二烯產量。在0時，用 400 μΜ IPTG誘導兩種培養物。在誘導後第一時間點開始之醱酵過程中，測試菌株所製造之異戊二烯的含量比親本菌株約高16% ; 圖 51 為 T7-MEARR alba/pBBRlMCS-5之圖譜；圖 52 為用於產生菌株 REM23-26 之 Ptac-gcpE-petF-petH/ 149048.doc •412· 201111512 ρΚ184構築體之圖譜；圖53展示用於產生菌株REMH76及REMH86之Τ7-(-3) alba/pBBRlMCS-5(上圖）及 Τ7-ΜΤΕ alba/pBBRiMCS-5(下圖）構築體之動畫表示圖；圖54為用於產生菌株REM31及REM29之Ptac-gcpE-lytB-petF-petH/pK184構築體之圖譜；

圖 55A-5 5C 為 T7-MEARR alba/pBBRlMCS-5 之核苷酸序列（SEQ ID NO:73); 圖 56A-56B 為 Ptac-gcpE-petF-petH/pK184 之核苷酸序列 (SEQ ID NO:74)；圖 57A-57C 為 T7-(-3)_alba/pBBRlMCS-5 之核苷酸序列 (SEQ ID NO:75)；圖 58A-58C為 T7-MTE alba/pBBRlMCS-5之核苷酸序列 (SEQ ID NO:76)；圖 59A-59B 為 Ptab-gcpE-LytB-petF-petH/pK184之核苦酸序列（SEQ ID NO:77); 圖60展示BL21(DE3)支持異戊二烯產量增加。圖 60A展示REM12相比其他方面同源基因之」菌株REM13 之比生產力。在誘導該等菌株所具有之IPTG誘導性異戊二烯合成酶及DXP酶之後4.5小時及8小時測定異戊二烯含量。展示來自各菌株之三個生物重複樣品之三個組（A-C) 的數據。誤差槓描繪在各組之生物重複樣品之間存在的標準差。由此數據確定，在4.5小時及8小時時間點，自」菌株產生之異戊二烯的含量比野生型菌株所製造之異戊二 149048.doc -413- 201111512 烯的含量分別平均高40%及73%。圖60B展示製造異戊二烯之菌株REM12及REM13之生長速率。在8小時實驗過程中，藉由週期性量測600 nm下培養物之光學密度來監測A 圖中所描繪之相同菌株之生長速率。〇時對應於將50 μΜ IPTG添加至培養物中之時間。在30°C、震盪下使細胞於 TM3中生長。製造較多異戊二烯之菌株」bc7?(REM13)相對於製造較少異戊二烯之野生型（REM12)菌株以較低速率生長；圖61為使用RED/ET系統使bci?基因座缺失所使用之策略的動畫表示圖；圖 62為 T7-MEARR alba/pBBRlMCS-5之動晝表示圖；圖63為DXP操縱子pET24a之動畫表示圖；圖 64A-64C為 T7-MEARR alba/pBBRlMCS-5之核苷酸序列（SEQ ID NO:78); 圖65A-65D為DXP操縱子pETt24a之核苷酸序列（SEQ ID NO:79)；圖66為使用RED/ET系統使ivG及bp孖缺失所使用之策略的動晝表示圖；圖 67 為用於產生菌株 MD09-219/GI1.6-gcpE-lytB-yidi/ pCRII-TOPO (Kan)之 GI 1.6-gcpE-lytB-yidi/pCR-Blunt II-TOPO構築體之動晝表示圖；圖68描繪磷酸戊糖（ΡΡΡ)及恩納-杜道夫（Entner-Doudoroff，ED)途徑（Fraenkel，·/. Bact. 95:1267-1271 (1965)，其藉此以全文引用的方式併入）； 149048.doc • 414- 201111512 圖69為pDu-39之圖譜；圖 70為 pMCM596 pET24(MEA)alba-dxs-yIDI之圖譜；圖 71A-71B為 pDu-39之核苷酸序列（SEQ ID NO:108); 圖 72A-72C為 MCM596之核苷酸序列（SEQ ID NO:109); 圖 73A-C為 pMCM5 96之核苷酸序列（SEQ ID NO:110); 圖74展示經由DXP途徑合成類異戊二烯之微生物（大腸桿菌、綠疏菌（Chlorobium w)TLS、聚球蕩屬 _ (办sp.)PCC6803、無類囊體藍藻（G7oeo6acier violaceus)VCC 7421、肉毒梭菌（C/oWrz.c/iww Z?oiw/z.«wm)B 1 str. Okra、結核分枝桿菌tuberculosis) CDC1551)與經由MVA途徑合成類異戊二烯之微生物（黃色黏球菌DK 1622、弗斯特革蘭菌KT0803、約氏黃桿菌 UW101、約氏乳桿菌NCC 533、格氏乳桿菌ATCC 33323及乳酸乳球菌乳酸亞種111 403)中之DXS序列之比較。注意兩組微生物中位置200-260處胺基酸序列之差異； % 圖75A及圖75B為pDU-9之核苷酸序列；圖 76為 pDu9-pET-16brev-yIDI之圖譜；圖77描繪GB-CMP-GIl.X-yidi構築體設計。最終構築體由片段A與片段B融合而組成以產生轉錄上游具有氯黴素抗生素抗性標記物之ylDI且側接與染色體上所要整合位點同源之50 bp區域的GI1.X啟動子文庫；圖78描繪pDW33之質體圖譜；pBR322-質體複製起點； laclq-lac抑制子；Ptrc-trc啟動子；lac操縱子-lac抑制子結合位點；銀白楊IspS (MEA)-編碼異戊二烯合成酶之基 5 149048.doc -415- 201111512 因；rrn終止子-轉錄終止子；bla-β内醯胺酶基因；圖79(包括五幅圖：圖79A、圖79B、圖79C、圖79D及圖 79E)展示在15^L規模醱酵中菌株CMP272、REMG39及REM H8_l 2之生長、異戊二烯產量及基於碳之產物產率的比較結果。（A)圖：異戊二烯力價（g/L培養液）；（B)圖：產生異戊二烯之培養物之比生產力；（C)圖：由光學密度（550 nm) 描繪之細胞生長；（D)圖：由呼吸（碳析出速率，CER)展示之細胞生長；（E)圖：自碳而得之產物之總產率百分比（異戊二烯重量（公克）/饋入之碳重量（公克）x 1〇〇)。醱酵條件描述於實例24章節F(CMP272)、章節G(REMG39)及實例29章節 E(REM H8_12)中；圖80(包括三幅圖，80A、80B及80C)展示在大規模醱酵中菌株CMP272、REMG39及REM H8_12之DXP代謝物的比較結果。（A-C)圖：此處呈現圖79中所述之相同細胞。在各圖底部展示描述代謝物概況之圖例。DXP ’ 1 -去氧-D-木酮糖5-磷酸；MEP，2-C-曱基-D-赤藻糖醇4-磷酸；CDP-ME，4-(胞苷5·-二磷酸基）-2-C-甲基-D-赤藻糖醇；CDP-MEP，2-磷酸基-4-(胞苷5’-二磷酸基）-2-C-曱基-D-赤藻糖醇；cMEPP，2-C-曱基-D-赤藻糖醇-2,4-環二磷酸； HDMAPP，1-羥基-2-甲基-2- 丁烯-4-基4-二磷酸； DMAPP，二甲基烯丙基二磷酸；IPP，異戊烯基二磷酸； FPP，法呢基焦磷酸；圖81(包括兩幅圖：圖81八及圖818)描繪一種將〇11_乂 fldA插入BL21(DE3)染色體中之策略。（A)圖：展示内源 149048.doc -416- 201111512 150 bp BL21(DE3) 基因座。GIl.X fldA PCR片段内與染色體上所要5’及3'整合位點同源之區域以灰色區塊箭頭描繪。半箭頭線展示使用PCR引子驗證構築體黏接於染色體之地點。展示核糖體結合位點（RBS)、經編碼之/7丄4 mRNA之起始密碼子、及欲由GI1.X啟動子系列置換之之上游内源DNA。（B)圖：展示經由Gene Bridges方法產生之 313 bp BL21(DE3) GI1.X 區域（菌株 REM 16_4 之 GI1.6 /7^4)。所插入之GI1.X啟動子序列以黑色區塊箭頭說明；指示因使用Gene Bridges插入方法而產生之FTR症痕序列之置換；圖82描繪GI1.6fldA/pCL之質體圖譜；repA-質體複製蛋白；aad-胺基醣苷腺苷酸轉移酶；M13 for及M13 rev-各別引子之結合位點；RBS-核糖體結合位點；fldA-大腸桿菌基因；圖83描繪GI1.6fldA-IspG/pCL之質體圖譜；與圖82中相同之質體鹼基：FldA-大腸桿菌//丄4基因；IspG-大腸桿菌 z、p 基因；圖84描繪GI1.6IspG/pCL之質體圖譜；與圖82及圖83中相同之質體驗基：IspG-大腸桿菌bpG基因；圖85(包括兩幅圖，圖85A及圖85B)描繪菌株 REMC912、REME7 — 12 及 REMD6_12 之小規模比較。（A) 圖：異戊二烯產量相對於生長之比生產力（SP)。yl軸，異戍二稀產量之比生產力（pg/L/OD/h) ; y2轴，細胞密度 (OD60〇)。比生產力（實心條）與OD6〇〇(菱形）。在誘導（600 149048.doc •417· 201111512 μΜ IPTG)後3小時及4.5小時，自至少2個生物重複樣品獲取量測值。（B)圖：細胞内代謝物濃度。cMEPP-2-C-曱基-D-赤藻糖醇2,4-環二磷酸；HDMAPP-羥基二甲基烯丙基二磷酸；DMAPP-二甲基烯丙基二磷酸；IPP-異戊烯基二磷酸。丫軸：代謝物濃度（1111^)。在誘導（60〇4]^1?丁0)後3.75 小時獲取所示量測值；與（A)之實驗樣品分開；重複樣品產生類似結果。圖86(包括兩幅圖：圖86A及圖86B)展示菌株REMG2_ 11、REMG4_11及REMG39之小規模比較之結果。（A)圖：異戊二烯產量相對於生長之比生產力。yl軸，異戊二稀產量之比生產力（pg/L/OD/h) ; y2軸，細胞密度（OD6〇〇)。比生產力（實心條）與〇D6〇〇(菱形）。展示在誘導（400 μΜ IPTG) 後1小時及3.5小時自至少2個生物重複樣品所得之量測值。（Β)圖：菌株之細胞内代謝物濃度。y軸為代謝物濃度 (mM)。cMEPP-2-C-曱基-D-赤藻糖醇2,4-環二磷酸； HDMAPP-羥基二甲基烯丙基二磷酸。展示在誘導（400 μΜ IPTG)後3.5小時自（A)之樣品所得之量測值；重複樣品產生類似結果（1-3 列：REM G2_ll ; 4-6 列：REM G4_ll ; 7-9列：REMG39); 圖87描繪pEWL454之質體圖譜；質體鹼基為PK184。 pl5A ori-質體複製起點；RBS-核糖體結合位點；kan-康黴素抗生素抗性標記物；圖88描繪Ptac念珠藻屬AspA終止子/pEWL454之質體圖譜；此為與圖87中相同之質體鹼基。念珠藻屬IspH-編碼 149048.doc -418- 201111512 來自念珠藻屬之IspH酶之基因；圖89描繪菌株REMI7_11及REMH8_12之異戊二烯產量之比生產力及細胞内代謝物。在誘導（5〇〇 μΜ IPTG)後3小時及3.75小時比較兩個菌株。展示至少2個生物重複樣品之異戊二烯量測值；未展示重複樣品之代謝物數據，但其產生類似結果；圖90(包括三幅圖：圖90Α、圖90Β及圖90C)描繪菌株 REM Η8—12及REM G4_11(A)之15-L規模醱酵之結果。（Α) 圖：REMH 8_12(空心正方形）及REM G4_ll(空心圓圈）之異戊二烯力價（g/L培養液）；（B)圖：由光學密度（550 nm) 描繪之細胞生長；（C)圖：DXP代謝物^ (C)底部展示描述代謝物概況之圖例；關於代謝物描述，參見圖80 ; 圖91描繪在製備規模下由DMAPP使Dxr失活之結果；圖92(包括兩幅圖：92A及92B)描繪具有經工程改造之 DXP途徑及下游MVA途徑之菌株REM H8_12及REM 17 11 的異戊二烯產量。上圖展示特定歸因於MVA以指定遭度饋入生長於[U-13C]-葡萄糖上之培養物中之異戊二烯產量。下圖展示特定由[U-13C]-葡萄糖產生之異戊二烯產量。在用IP T G誘導培養物之後於指疋時間獲取異戍二稀量測值。藉由GC-MS ’在m/z=67以及m/z=73下偵測來監測析出之異戊二烯。m/z=67對來自MVA(所有12〇之異戊二稀進行報導’而m/z=73對源自[U-13C]-葡萄糖之異戊二稀進行報導；圖93描繪pDW15之質體圖譜；mob-質體移動區； 149048.doc • 419- 201111512

AacCl (Gent抗性）-胺基醣苷乙醯轉移酶慶大黴素抗性基因；M13反置引子及M13前置引子-各別引子之結合位點； Ptrc-Trc啟動子；mvaE及mvaS-分別編碼乙醢乙醢基-輔酶 A硫解酶/3-羥基-3-曱基戊二醯基-輔酶A還原酶及3-羥基-3-曱基戊二醯基-輔酶A合成酶之糞腸球菌基因；RepA-質體複製蛋白；圖94描繪PTrp mMVK/pDW15之質體圖譜；與1)中相同之質體鹼基：Trp啟動子；經編碼之馬氏甲烷球菌（M. maze/)MVK-編碼曱經戊酸激酶之馬氏曱烧球菌基因； aspA終止子；圖95描繪pMCM900之質體圖譜；FRT-Flip重組酶標靶位點；核心Trc啟動子-RNA聚合酶結合位點；lac操縱子-LacI 結合位點；PMK orf-酵母磷酸曱羥戊酸激酶編碼序列； MVD orf-酵母二磷酸曱羥戊酸去羧酶編碼序列；yIDI-酵母異戊烯基二碟酸異構酶編碼序列；aspA終止子- aspA轉錄終止子；attTn7下游-glmS-下游重組靶向序列；KanR-康黴素抗性基因；R6K ori-質體複製起點；attTn7上游（pstS)-上游重組乾向序列；圖96描繪測定生長於未經標記葡萄糖上之菌株REM A2_l 7在存在及不存在膦胺黴素之情況下之比生產力相對於培養物密度之實驗的結果。yl軸，異戊二烯產量之比生產力（pg/L OD h) ; y2軸’細胞密度（OD6〇〇nm)。比生產力 (實心條）與細胞密度（菱形）。在引入0 mM或2 mM膦胺黴素之後約45分鐘獲取量測值；均在用400 μΜ IPTG誘導之後 149048.doc -420- 201111512 約3小時進行。所呈現之數據為3個生物樣品之平均值；展示比生產力及細胞密度值之誤差槓。數據表明經由MVA途控及DXP途徑產生異戊二烯之貢獻分別約為洲及㈣；由在與膦胺黴素接觸期間所製造之異戊二烯相對於不存在該抑制劑之情況下所製造之異戊二烯之量的分數來^定 MVA通量；圖97描繪測定在REM A2」7菌株中膦胺徵素對Dxp及 • MVA途徑代謝物之積累以及異戊二烯放出速率之影響之實驗的結果。在存在及不存在2 mM膦胺黴素（分別為「+FM」及「-FM」）之情況下在45分鐘培育結束時，於培養物中罝測集結成粒之細胞（圖96中所描繪之相同細胞）中之代謝物濃度及異戊二烯放出速率。結果以所獲得之濃度與三個不同培養物中所量測之速率的平均比率表示；圖98描繪測定生長於未經標記及經標記之葡萄糖上之菌株REM A2_l 7在存在及不存在膦胺黴素之情況下之比 • 生產力相對於培養物密度之實驗的結果。"軸，異戊二烯產置之比生產力（pg/L 〇D h) ; y2軸，細胞密度（0D_nm)。比生產力（實心條）與細胞密度（菱形）。泳道丨：不含色胺酸且不含膦胺黴素之未經標記培養物；泳道2 :不含色胺酸且不含膦胺黴素之1_13C葡萄糖培養物；泳道3 :含有5〇 μΜ色胺酸且不含膦胺黴素之ijsc葡萄糖培養物；泳道4: 不含色胺酸且含有2 mM膦胺黴素之未經標記培養物；泳道5 :含有50 μΜ色胺酸且含有2 mM膦胺黴素之葡萄糖培養物；泳道6 :含有50 μΜ色胺酸且含有2 mM膦胺黴 149048.doc -421 - 201111512 素之1 - c葡萄糖培養物。在引入0 mM或2 mM膦胺黴素之後約45分鐘獲取量測值；均在用4〇〇 μΜ iptg誘導之後約3 】時進行。所呈現之數據為2個技術重複樣品之平均值；展不比生產力值之誤差槓。數據表明對於未經標記之培養物經由MVA途徑及DXP途徑產生異戊二烯之貢獻分別約為52 /〇及48%。類似地，數據顯示通量/DXp通量對不含及含有50 μΜ色胺酸之…义葡萄糖培養物產生異戊二烯之貢獻分別為57。/。/43%及49%/51%。生長培養基中色胺酸之存在所介導的泳道3及6表示之培養物中Μνκ酶之表現受抑制係由與不將色胺酸添加至生長培養基中之情況下生長之培養物相比總體通量之數據降低24%至34%來反映。對於各特定培養物類型，由在與膦胺黴素接觸期間所製造之異戊—烯相對於不存在該抑制劑之情況下所製造之異戊二烯之量的分數來確定MVA通量；圖99描繪測定生長於3_13c葡萄糖上之菌株REM Α2—丨了在存在及不存在膦胺黴素之情況下之比生產力相對於培養物密度之實驗的結果。"軸，異戊二烯產量之比生產力 (Hg/L 〇D h) ; y2軸，細胞密度（〇〇6⑼nm)。比生產力（實心條）與細胞密度（菱形）。在引入〇 mM或2 mM膦胺黴素之後、勺1小時獲取量測值；均在用4〇〇 μΜ IPTG誘導之後約3小時進行。所呈現之數據為2個技術重複樣品之平均值；展不比生產力值之誤差槓。數據表明經由MVA途徑及途搜產生異戊二烯之貢獻分別約為58%及42% ;由在與膦胺黴素接觸期間所製造之異戊二稀相對於不存在該抑制劑之 149048.doc -422- 201111512 情況下所製造之異戊二烯之量的分數來確定MVA通量；圖100(A圖及B圖）描繪由A)1」3C葡萄糖及B)3-13C葡萄糖經由糖酵解分解代謝而產生之異戊二烯之Dxp及MVA途徑特異性標記模式。黑色圓圈表示在特定位置處13C原子之豐度為100%。半黑圓圈表示在空心圓圈所示之葡萄糖位置處13C之豐度為5〇%，其餘50%為原子；圖101 (A圖及B圖）描繪在存在或不存在膦胺黴素（分別為 • +FM&_FM)之情況下在生長於A)1-13C葡萄糖或B)3-13C葡萄糖上之REM A2_17菌株中異戊二烯及cMEPP同位素標記異構體組的計算分佈；圖1〇2(Α圖及B圖）描繪A)具有13C天然豐度之未經標記 (合成）異戍二烯標準物及B)由生長於3J3C葡萄糖上之rEm A2_17菌株製造之異戊二烯的gc-MS光譜；注意，REM A2_17菌株中m/z 68、69及70峰相對於m/z 67峰之強度因 13C富集而高於異戊二稀標準物； • 圖103描繪隨MVA/MEP途徑比率而變之異戊二烯13c同位素富集之結果；圖104描繪產生、收集及分析Bi〇is〇preneTM產物之例示性裝置；圖105描繪展示具有天然13C豐度之異戊二烯之13C NMR 光譜的結果；

圖106描繪展示源自mva/ΜΕΡ雙重途徑菌株之異戊二烯之13C NMR光譜的結果；c-1與C-2/C-4相對於信號強度等於或小於雜訊水準之C-3均富集13C，證實在此菌株中MVA 149048.doc -423 - 201111512 與MEP途徑均對異戊二烯合成有貢獻；圖107描繪一部分pl.6 /知5基因座之圖；圖中所描繪之區域之核苷酸序列由該圖下方所列之3 23個鹼基表示。用於整合/知5上游之PL.6啟動子之5,及3,同源區域以灰色展示。以黑色粗體文字突出顯示之序列表示在Gene Bridges 氣黴素抗性卡匣（圖中稱作Gene Bridges苑痕）環出之後保留於區域中之外源序列，其中剩餘FRT(翻轉酶識別標靶）位點加下劃線；PL_6啟動子序列以常規黑色文字展示。圖中指示-35、-10及RBS(核糖體結合位點）位置；圖108(A圖、B圖、C圖、D圖）描繪4個菌株之異戊二烯生產力之比較。A圖，在200 μΜ IPTG下兩個時間點處菌株WW119(Β圖及C圖中之菌株的親本菌株）之典型異戊二烯生產力。此實驗如針對Β圖及C圖中之菌株之文字所述來進行，但異戊二烯監測限於2小時及4小時。在整個培養時段中以一小時時間間隔監測所有菌株之〇D6〇0。Β圖展示在若干 IPTG濃度下菌株REM 6_15(PL.6 fkpB-ispH 之異戊二烯比生產力。C圖展示在若干IPTG濃度下菌株REM D8_15(PL.6 fkpB-ispH)之異戊二烯比生產力。數據與 zhsc/J補救引入所致之異戊二稀生產力損失相一致。D圖展示在若干IPTG濃度下菌株REM D7_ 15之異戊二稀比生產力；圖109展示大腸桿菌ispH西方墨點之影像。泳道描述如下：泳道 1，SeeBlue® Plus2預染色標準物，invitr〇gen ; 泳道2，大腸桿菌ispH經純化標準物（0.4 μβ);泳道3， 149048.doc -424- 201111512 REM A7一1 5可浴性部分，冰道4，rem A7 1 5不溶性部分·’泳道5 ’ REM A8—15可溶性部分；泳道6，REM A8 1 5 不溶性部分；泳道7，REM Dl__i4可溶性部分；泳道8 ’ REM Dl_14不溶性部分；泳道9，wwl〇3可溶性部分；及泳道10，WW103不溶性部分。顯影方法：以1:1〇〇〇〇稀釋之l0Ab抗兔大腸桿菌iSpH，20Ab Alexa Fluor® 488山羊抗兔IgG (H+L) ’ Invitr〇gen ’ 1:1，〇〇〇稀釋；參見關於其他細節之文字。凝膠為Novagen 4%至12% BT凝膠。針對相等〇〇_對負載進行校正。pe卜顆粒；sup，懸浮液；及圖110展示大腸桿菌ispH西方墨點定量。由ImageQuant 5 ^(Molecular Dynamics)定量西方墨點數據。亮陰影條表示可溶性部分中所存在之ispH之量。暗陰影條表示不溶性部分t所存在之ispH之量。

149048.doc 425 - 201111512 序列表 <11办美商戴尼斯科美國公司 <120>使用DXP及MVA途徑之改良之異戊二烯製造 <130> 643842001141 <140> 099119621 <141> 2010-06-15 <150> 61/187,941 <151> 2009-06-17 <150> 61/187,930 <151> 2009-06-17 <150> 61/314,985 <151> 2010-03-17 <15〇> 61/314,979 <151> 2010-03-17

<160> 193 <]?0> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <2il> 1692 <2i2> t>NA <213>人工序列 <220> <223>合成構築體 <400> 1 aigtgtgcga cclcttctca atttactcag attaccgagc ataattcccg tcgttccgca 60 aacratcagc caaacctgtg gaatucgaa ttcctgcaat ccctggagaa cgacctgaaa 120 gtggaaaagc tggaggagaa agcgacxaaa ctggaggaag aagttcgctg catgatcaac 丨80 cgtgtag£ca cccagccgct gtccctgctg gagctgatcg acgatgtgca gcgcctgggt 240 ctgacctaca aatttgaaaa agacatcatt aaagccctgg aaaacatcgt actgciggac 300 gaaaacaaaa agaacaaatc tgacct£cac gcaaccgctc tgtctttccg tctgctgcgt 360 cagcacggtt tcgaggtttc tcaggargtt tttgagcgtt tcaaggataa agaaggtggt 420 ttcagcggtg aactgaaagg tgacgtccaa ggcctgctga gcctgtatga agcgtcitac 480 ctgggtttcg agggtgagaa cctgctggag gaggcgcgta ccttuccat cacccacctg S4〇 aagaacaacc tgaaagaagg cattaatacc aaggttgcag aacaagtgag ccacgccctg 600 gaactgccat atcaccagcg tctgcaccgt ciggaggcac guggttcct ggataaatac 660 gaaccgaaag aaccgcatca ccafictgctg ctggagctgg cgaagctgga ttttaacatg 720 gtacagaccc tgcaccagaa agagctgcaa gatctgtccc gctggtggac cgagatgggc 780 ctggctagca aactggattt igtacgcgac cgcctgatgg aagtttattt ctgggcactg S40 ggtatggcfic cagacccgca stttfigtgaa tgtcgcaaag ctgttactaa aatgtttggt 900 ctggtgacga tcatcgatga cgtgtatgac glttatggca ctctggacga actgcaactg 960 ttxaccgatg ctglagagcg ctgggacglt aacgctatta acaccctgcc gguctatatg 丨020 aaactgtgtt tcclfigcact gtacaacacc gttaacgaca cgtcctattc tattctgaaa 1080 gagaaaggtc ataacaacct gtccUtctg acgaaaagct ggcgtgaact gigcaaagcc 1140 tttct£caag aggcgaaatg gtccaacaac aaaattatcc cggctttctc caagtacctg 1200 gaaaacgcca gcgtitcctc ctccggtgta gcgctgctgg cgccgtctta ctittccgta 1260 tgcca^cagc aggaagacat ctccgaccac gcgctgcgtt ccctgaccga cttccatggt 1320 ctggtgcgu clagctgcgt tatcttccgc ctgtgcaacg atctggccac ctctgcggcg 1380 gagctggaac gtggcgagac taccaattct atcattagct acatgcacga aaacgatggl 1440 accagcgagg aacaggcccg cgaagaactg cgtaaactga tcgacgccga atggaaaaag 1500 aigaaicgtg aacgcgttag cgactccacc ctgctgccta aagcgttcat ggaaatcgca 1560 gttaacatgg cacgtgtltc ccactgcacc taccagtatg gcgatggtct gggtcgccca 1620 gactacgcga ctgaaaaccg catcaaactg ctgcigattg accctttccc gattaaccag 1680 cigaigtatg tc 1692 <210> 2 <211> 6080 <212> Dm <2]3>人工序列 <223>合成構築體 <400> 2 gtttgacagc ttatcatcga ctgcacggtg caccaatgct tctggcgtca ggcagccatc 60 ggaagcigtg gtatggctgE gcaggtcgta aalcactgca taattcgtgt cgctcaaggc 120 gcactcccgt rctggataat gttttttgcg ccgacatcat aacggttctg gcaaatattc 180 tgaaatgagc igitgacaat taatcatccg gctcgtataa tgtgtggaat tgtgagcgga 240 149048-序列表.doc 201111512 taacaattic acacaggaaa cagcgccgct gagaaaaagc gaagcgscac tgctctttaa 300 caatttatca gataatctgt gtgggcactc gaccggaatt atcgatiaac tttattatfa 360 auaattaaag aggtatatat taatgtatcg atcaaataag gaggaataaa ccatgtgtgc 420 gacctcttct caatttactc agattaccga gcataattcc cgtcgttccg caaactatca 480 gccaaacctg Iggaaillcg aaitcctgca atccctggag aacgaccrga aagtggaaaa 540 gctggaggag aaagcgacca aactggagga agaagttcgc tgcatgatca accgtgtaga 600 cacccagccg ctetccctgc tggagctgat cgacgatgtg cagcgcccgg gtctgaccta 660 caaatUfiaa aaagacatca ttaaagccct ggaaaacatc gtactgctgg acgaaaacaa 720 aaagaacaaa tc'igacctgc acgcaaccgc tctgtcttic cgtctgctgc gicagcacgg 780 tttcgaggit tctcaggatg tttttgagcg tttcaaggat aaagaaggtg gtttcagcgg 840 tcaactgaaa ggtgacgtcc aaggcctgct gagcctgtat gaagcgtctt acctgggttl 900 cnagggtgag aacctgctgg aggaggcgcg uccttttcc atcacccacc tgaagaacaa 960 cctgaaagaa ggcattaata ccaaggttgc agaacaagtg agccacgccc tggaactficc J020 atatcaccag cgtctgcacc gictggaggc acgttggilc ctggataaat acgaaccgaa 1080 agaaccgcat caccagcigc tgctggagct ggcgaagcig gamtaaca tggtacagac 1140 cctgcaccag aaagagctgc aagatctgtc ccgctggtgg accgagatgg gcctggctag 1200 caaactggat tttgtacgcg accgccigat ggaagtttat Uctgggcac lgsgtatggc 】260 gccagacccg cafitttggtg aatgtcgcaa agctgttact aaaatgtttg gtctggtgac 1320 gatcatcgat gacgtgtatg acgtttatgg cactctggac gaactgcaac tgttcaccga 1380 tgctgtagag cgctggEacg ttaacgctat taacaccctg ccggactata tgaaactgtg 1440 tttcctggca ctgtacaaca ccgttaacga cacgtcctat tcUttctga aagagaaagg 1500 tcataacaac ctgtcctatc tgacgaaaag ctEgcglgaa ctgtgcaaag cctttctgca 1560 agaggcgaaa iggtccaaca acaaaattat cccggctttc tccaaglacc tggaaaacgc 1620 cagcgtltcc tcctccgglg tagcgctgct ggcgccgtct tacttttccg tatgccagca 1680 gcaggaagac atctccgacc acgcgcigcg ttccctgacc gacilccatg gtciggtgcg J740 1tctagctgc gtlatcttcc gcctgtgcaa cgatclggcc acctctgcgg cggagctgga 1800 ccgtggcgag aclaccaatt ctatcattag ctacatgcac gaaaacgatg gtaccagcga 1860 ^gaacaggcc cgcgaagaac tgcgtaaact gatcgacgcc gaatggaaaa agatgaatcg 1920 igaacgcgtt agcgactcca cccigctgcc taaagcgitc atggaaatcg cagttaacat 1980 fgcacgtgtt tcccactgca cctaccagta tggcgatggt ctgggtcgcc cagactacgc 2040 ^actgaaaac cgcatcaaac tgcl£ctgat tgaccctttc ccgattaacc agctgatgta 2100

Igtctaactg cagciggtac catatgggaa ttcgaagctt tctagaacaa aaactcatct 2160 cagaagagga Ictgaatagc gccgtcgacc atcatcatca tcatcattga gtttaaacgg 2220 tctccagctt ggctgnttg gcggatgaga gaagattttc agcctgatac agattaaatc 2280 agaacgcaga agcggtctga taaaacagaa tttgcctggc ggcagtagcg cggtggtccc 2340 acctgacccc atgccgaact cagaagtgaa acgccglagc gccgatggta gtgtggggtc 2400 tccccalgcg agagtaggga actgccaggc atcaaataaa acgaaaggct caglcgaaag 2460 actgggcctl tcgttttatc tgttgtttgt cggtgaacgc tctcctgagt aggacaaatc 2520 cgccgggafic ggatttgaac gttgcgaagc aacgficccgg agggtggcgg gcaggacscc 2580 cgccataaac tgccaggcat caaattaagc agaaggccat cctgacggat ggcctttttg 2640 cgtttctaca aactcltut gtttattttt ctaaatacat tcaaatatgt atccgctcat 2700

Ijagacaaiaa ccctgataaa tgcttcaata atattgaaaa aggaagagta tgagtattca 2760 acatttccgt gtcgccctta ttcccttttt tgcggcattt tgccttcctg tttttgctca 2820 cccagaaacg ctggtgaaag taaaagatgc tgaagatcag ttgggtgcac gagtgggUa 2880 catcgaaclg gatctcaaca gcggtaagat cctlgagagt tttcgccccg aagaacgttt 2940 tccaatgatg agcactttta aagttctgct atgtggcgcg gtattatccc gtgttgacgc 3000 cgggcaagag caactcggtc gccgcataca ctatictcag aalgacUgg tigagtactc 3060 accagtcaca gaaaagcatc ttacggatgg catgacagta agagaattat gcafitgctgc 3120 calaaccatg agtgataaca ctgcggccaa cttacttctg acaacgatcg gaggaccgaa 3180 ggagctaacc gcttttttgc acaacatggg ggatcatgta actcgcctls atcgttggga 3240 accggagctg datgaagcca taccaaacga cgagcgtgac accacgatgc ctgtagcaat 3300 ggcaacaacg ttgcgcaaac tattaactgg cgaactactt actctagctt cccggcaaca 3360 attaatagac tggatsgagg cggataaagt tgcaggacca cttctgcgct cggcccttcc 3420

Efictggcigg tuattgctg ataaatctgg ugccggtgag cgtgggtctc gcggtatcat 3480 tgcagcactg gggccafiatg gtaagccctc ccgtalcgta gttatctaca cgacggggag 3540 tcaggcaact atggatgaac gaaatagaca gatcgctgag ataggtgcct cactgattaa 3600 gcattgstaa ctgtcagacc aagUtactc atatatactt tagattgatt taaaacttca 3660 tttttaattt aaaaggatct aggtgaagat cctttttgat aatctcatga ccaaaatccc 3720 tcaacgtgag ttttcgttcc actgagcgtc agaccccgta gaaaagatca aagEatcttc 3780 tcgagatcct ttttttctgc gcglaatclg ctgcttgcaa acaaaaaaac caccgctacc 3840 agcggtggtt tgtttgccgg atcaagagct accaactctt tttccgaagg taaclggctt 3900 cagcagagcg cagataccaa aiactglcct tctagtgtag ccgtagttag gccaccactt 3960 caagaactct gtagcaccgc ctacatacct cgctctgcta atcctgttac cagtggctgc 4020 igccagtggc gataagtcgt gtcttaccgg gttggactca agacgatagt taccggataa 4080 ggcgcagcgg tcgggctgaa cggggggttc gtgcacacag cccagcttgg agcgaacgac 4140 ctacaccgaa ctgagatacc tacagcgtga gciatgagaa agcgccacgc ttcccgaagg 4200 gagaaaggcg gacaggtatc cggtaagcgg cagggtcgga acaggagagc gcacgaggga 4260 gcttccaggg ggaaacgcct ggtatcttta tagtcctgtc gggtttcgcc acctctgact 4320 tgagcgtcga tuttgtgat gctcgtcagg ggggcggagc ctatggaaaa acgccagcaa 4380 cgcggccttt ttacggttcc tggccitttg ctggccttu gctcacalgt tctttcctgc 4440 gttatcccct fiattctgtgg ataaccgtat taccgcctu gagtgagctg ataccgctcg 4500 ccgcagccga acgaccgagc gcagcgagtc agtgagcgag gaagcggaag agcgcctgat 4560 gcggtatttt ctccttacgc atctgtgcgg tatttcacac cgcatatggt gcactctcag 4620 tacaatcigc tctgatgccg catagttaag ccagtaiaca ctccgctatc gctacgtgac 4680 tgggtcatgg ctgcgccccg acacccgcca acacccgctg acgcgccctg acgggcttgt 4740 ctgctcccgg catccgctta cagacaagct gtgaccgtct ccgggagctg catgtgtcag 4800 aggltttcac cgtcaicacc gaaacgcgcg aggcagcaga tcaattcgcg cgcgaaggcg 4860 aagcggcatg catEtacglt gacaccatcg aatggtgcaa aacctttcgc ggtatggcat 4920 gatagcgccc ssaagagagt caaitcaggg tgglgaatgt gaaaccagta acgttatacg 4980 aigtcgcaga gtatgccggt gtctcltatc agaccgtttc ccgcglggtg aaccaggcca 5040 gccacgtllc tgcgaaaacg cgggaaaaag tggaagcggc gatggcggag ctgaattaca 5100 ttcccaaccg cgtggcacaa caactggcgg gcaaacagtc gttgctgatt ggcgttgcca 5160 cctccagtct ggccctgcac gcgccgtcgc aaattgtcgc ggcgattaaa tctcgcgccg 5220 atcaactggg tgccagcgtg Btggtgtcga tggtagaacg aagcggcgtc gaagcctgta 5280 aagcg^cggi gcacaatcti ctcgcgcaac gcgtcagtgg gctgatcatt aactatccgc 5340 tggalgacca ggalgccatt gctgtggaag ctgcctgcac taatgttccg gcgttatttc 5400 ttgatgtclc tgaccagaca cccatcaaca gtattatttt·ctcccatgaa gacggtacgc 5460 149048-序列表.doc 201111512 gactgggcgt ggagcatctg gtcgcattgg gtcaccagca aatcgcgctg tlagcgggcc 5520 caltaagttc tgtctcgscg cgtctgcgtc tggctggctg gcataaatat ctcactcgca 5580 arcaaaiica gccgatagcg gaacgggaag gcgactggag tgccatgtcc ggttttcaac 5640 aaaccatgca aatgctgaat gagggcatcg ttcccacfgc gatgctggtt gccaacgatc 5700 agaiggcgct gggcgcaatg cgcgccatta ccgagtccgg gctgcgcgtt ggtgcggata 5760 【ctcggtagt gggaucgac gataccgaag acagcuaig uatatcccg ccgtcaacca 5820 ccatcaaaca ggauttcgc ctgctggggc aaaccagcgt ggaccgcttg ctgcaactct 5880 clcagggcca ggcggtgaag ggcaatcagc tgttgcccgt ctcactggtg aaaagaaaaa 5940 ccaccctggc gcccaatacg caaaccgcct ctccccgcgc guggccgat tcauaatgc 60(X) agciggcacg acaggtttcc cgactggaaa gcgggcagtg agcgcaacgc aattaatgrg 6060 agttagcgcg aattgatctg 6080 <2I0> 3 <2U> 37 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>合成構築體 <4〇0> 3 37 38 cgtgagatca tatgigtgcg acctcttctc aatttac

<210> 4 <211> 38 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>合成構築體 <400> 4 cggtcgacgg atccctgcag Uagacatac atcagctg <210> 5 <211> 7404 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>合成構築體 <400> 5 ttctcatgtt tgacagclta tcatcgataa gctltaatgc ggtagtttat cacagltaaa 60 ttgctaacgc agtcaggcac cgtgtatgaa atctaacaat gcgctcatcg tcatcctcgg 120 caccgtcacc ctggatgctg taggcatagg citggttatg ccggtactgc cgggcctctt 180 gcgggatatc cggatatagt tcctcctttc agcaaaaaac ccctcaagac ccgtltagag 240 gccccaaggg gttatgctae ttattgctca gcggrggcag cagccaactc agcucctu 300 cgggctttgt tagcagccgg atccctgcag ttagacatac atcagctggt taatcgggaa 360 agggtcaatc agcagcagtt tgatgcggtt ttcagtcgcg tagtctgggc gacccagacc 420 atcgccatac tggtaggtgc agtgggaaac acglgccatg ttaactgcga tttccatgaa 4S0 cgctttaggc agcagggigg agtcgctaac gcgttcacga ttcatcmt tccattcggc 540 gtcgatcagt ttacgcagtt cttcgcgggc ctgttcctcg ctggtaccat cgttttcgtg 600 catgtagcta atgatagaat tggtagtctc gccacgttcc agctccgccg cagaggiggc 660 cagatcgttg cacaggcgga agataacgca gctagaacgc accagaccat ggaaguggt 720 cagggaacgc agcgcgtggt cggagatgtc ttcctgctgc tggcatacgg aaaagtaaga 780 cggcgccagc agcgctacac cggaggagga aacectggcg ttttccaggt acttggagaa 840 agccgggata attttgttgt tggaccartt cgcctcttgc agaaaggctt tgcacagttc 900 acgccagctt ttcgtcagat aggacaggtc gttatgacct ttctctttca- gaatagaata 960 ggacgtgtcg uaacESigt tgtacagtgc caggaaacac agtttcatat agtccggcag 1020 ggtgttaata gcgttaacgi cccagcgctc tacagcatcg gtgaacagtt gcagttcgtc 1080 cagagtgcca taaacgtcat acacgtcatc gatgatcgtc accagaccaa acattttagt 1140 aacagctttg cgacattcac caaactgcgg gtctggcgcc atacccagtg cccagaaata 1200 aacttccatc aggcggtcgc gEacaaaatc cagtttgcta gccaggccca tctcggtcca 1260 ccagcgggac agatcttgca gctctttctg gtgcagggtc tgtaccatgt taaaatccag 1320 cttcgccagc tccagcagca gctggtgatg cggttctttc ggttcgtatt tatccaggaa 1380 ccaacgtgcc tccagacggt gcagacgctg gtgatatggc agttccaggg cgtggctcac 1440 ttEttctgca accttggtat taatgccttc utcaggttg ttcttcaggt gggtgatgga 1500 aaaggtacgc gcctcctcca gcaggttctc accctcgaaa cccaggtaag acgcttcata 1560 caggctcEgc aggccttgga cgtcacctti cagttcECcg ctgaaaccac cltcutatc 1620 cttgaaacgc tcaaaaacat cctgagaaac ctcgaaaccg tgctgacgca gcagacggaa 1680 agacagagcg gttgcgtgca ggtcagartt gttctttttg ttttcgtcca gcagtacgat 1740 gttttccagg ecttiaaiga tgtctttttc aaatttgtag gicagaccca ggcgctgcac 1800 atcgtcgatc agctccagca gggacagcgg dgggtgtct acacggttga tcatgcagcg I860 aacttcucc tccagtttgg tcgcttictc ctccagcttl tccactttca ggtcgltcic 1920 cagggattgc sggaattcga aattccacag gtttggctga tagtttgcgg aacgacggga 1980 attatgctcg gtaatctgag taaaftgaga agaggtcgca cacatatgac gaccttcgat 2040 atggccgctg cigtgatgai gatgatgatg atgatgatga tegcccatgg tatatctcct 2100 tcttaaagtt aaacaaaatt atltctagag gggaattgtt atccgctcac aaitccccta 2160 tagtgagtcg tattaatttc gcgggatcga gatctcgatc ctctacgccg gacgcatcgt 2220

ggccggcatc accggcgcca caggtgcggt tgctggcgcc tatatcgccg acatcaccga 22SO tgggg2agat cfiggctcgcc acitcgggct catgagcgct tgtttcggcg tgggtatggt 2340 ggcaggcccc gtggccgggg gactgttgfig cgccatclcc Uficatgcac cattccttfic 2400 fificggcggig ctcaacggcc tcaacctact actgggctgc ttcctaatgc aggagtcgca 2460

Uagggagag cgtcgagatc ccggacacca tcgaaiggcg caaaaccttt cgcggtatgg 2520 149048-序列表.doc 201111512 catgatagcg cccggaagag agtcaattca gggtggtgaa tgtgaaacca gtaacgltat 2580 acgatgtcgc agagtatgcc ggtgtctctt a*cagaccgt itcccgcgtg gtgaaccagg 2640 ccagccacgt ttctgcgaaa acgcgggaaa aaglggaagc ggcgatggcg gagctgaatt 2700 acattcccaa ccgcgtggca caacaactgg cgggcaaaca gtcgltgctg altggcgttg 2760 ccacctccag tctggccctg cacgcgccgt cgcaaaftgt cgcggcgatt aaatclcgcg 2820 ccgatcaact gggtgccagc gtggtggtgt cgatggtaga acgaagcggc gtcgaagcci 2S80 gtaaagcggc ggtgcacaat cttctcgcgc aacgcgtcag tgggctgatc attaactatc 2940 cgctggatga ccaggatgcc attgctgtgg aagctgccig cactaatgtt ccggcgttat 3000 ttcttgargt ctctgaccag acacccatca acagtattat tttctcccat gaagacggta 3060 cgcgactggg cgtggagcat clgglcgcat igggtcacca gcaaatcgcg ctgttagcgg 3120 gcccattaag ttctgtctcg gcgcgtcigc gtciggctgg ciggcataaa tatctcactc 3180 gcaatcaaar tcagccgata gcggaacggg aaggcgactg gagtgccatg tccggttltc 3240 aacaaaccat gcoaalgctg aatgagggca tcgttcccac tgcgatgctg gttgccaacg 3300 atcagatggc ectgggcgca atgcgcgcca ttaccgagtc cgggctgcgc BttggLgcgg 3360 atatctcggt agigggaiac gacgataccg aagacagcic afgttatatc ccgccgttaa 3420 ccaccaicaa aCaggatttt cgcctgctgg ggcaaaccag cgtggaccgc ttgctgcaac 3480 tctctcaggg ccaggcgetg aagggcaatc agctgttgcc cgtctcactg gtgaaaagaa 3540 saaccaccct ggcgcccaat acacaaaccg cctclccccg cgcgttggcc gattcattaa 3600 tgcagctggc acgacaggtt tcccgactgg aaagcgggca gtgagcgcaa cgcaatlaat 3660 etaagttagc tcactcatta ggcaccggsa ictcgaccga tgcccttgag agccttcaac 3720 ccagtcagct ccttccggtg ggcgcggggc atgactatcg tcgccgcact tatgactgtc 3780 ttctltatca tgcaactcgt aggacaggtg ccggcagcgc tctgggtcat tttcggcgag 3840 gaccgcittc ^tggagcgc gacgatgaic ggcclgtcgc 丨tgcggtatt cggaatcttg 3900 cacgccctcg ctcaagcctt cgtcactggt cccgccacca aacgtftcgg cgagaagcag 3960 iiccattatcg cCggcarggc ggccgacgcg cigggciacg tcttgcrggc gilcgcgacg 4020 cgaggcigga tggccttccc cattatgatt cttctcgctt ccggcggcat cgggatgccc 4080 f.cgttgcagg ccatgctgtc caggcaggta gatgacgacc atcagggaca gcttcaagga 4140 tcgctcgcgg ctcttaccag cctaactlcg atcactggac cgctgatcgt cacggc&alt 4200 tatgccgcct cggcgagcac atggaacggg 丨tggcatgga ttgtaggcgc cgccctatac 4260 ctigtctgcc tccccgcgtt gcgicgcgst gcatggagcc gggccacctc gacctgaatg 4320 Raagccggcg gcacctcgct aacggattca ccactccaag aattggagcc aalcaattct 43S0 tgcggagaac tgtgaatgcg caaaccaacc cttggcagaa calaiccutc gcgiccgcca 4440 tctccagcag ccgcacgcgg cgcaiclcgg acagcgtlgg gtcctggcca cgggrgcgca 4500 tgatcgtgct cctgtcgttg aggacccggc 〖aggctggcg gggugcctt actggttagc 4560 agaaigaatc accgaiacgc gagcgaacg! 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】49048-序列表.doc 201111512 <212> 腕 <213>人工序列瑟5合成構築體 <400> 6 catatgaaag cttgtatcga ttaaataagg aggaataaac c 41 <210> 7 <211> 6266 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>合成構築體 <400> 7 cccgtcttac tglcgggaat rcgcgttggc cgattcalla aigcagctgg cacgacaggt 60 ticccgactg gaaagcgggc agtgagcgca acgcaattaa tgtgagltag ctcactcatt 120 aggcacccca ggcittacac tttatgcuc cggctcgtat gttgtgtgga atigtgagcg 1¾) gaiaacaatl tcacacagga aacagctatg accatgatta cgccaagctt gtatcgatta 240 aataaggagg aataaaccal gtgtgcgacc tcttctcaai ttaclcagat taccgagcal 300 aattcccgtc gttccgcaaa ctatcagcca aacctgtgga atttcgaatt ccrgcaatcc 360 ctggagaacg acctgaaagt ggaaaagctg gaggiigaaag cgaccaaac丨 ggaggaagaa 420 gltcgctgca tgatcaaccg tgtagacacc cagccgctgi ccctgctgga gctgatcgac480 gatgtgcagc gcctgggtct gacctacaaa tttgaaaaag acatcattaa agccctggaa 540 aacatcgtac tgctggacga aaacaaaaag aacaaatctg acctgcacgc aaccgctctg 600

tetttccgtc tgctgcglca gcacggtUc gaggtuctc aggatglttl tgagcgutc aaggataaag aaggtggttt cagcggtgaa ctgaaaggtg acgtccaagg cctgctgagc 720 ctgtatgaag cgtcttacct gggtttcgag ggtgagaacc tgctggagga ggcgcgtacc 780 ttttccatca cccacct^aa gaacaacctg aaagaaggca ttaataccaa ggttgcagaa 840 caagtgagcc acgccct^ga actgccatat caccagcgtc tgcaccgtct ggaggcacgt 900 tggttcctgg ataaatacga accgaaagaa ccgcatcacc agctgctgct ggagctggcg 960 aagctggati ttaacatsgt acagaccctg caccagaaag agctgcaaga ictgtcccgc 1020 iggtggaccg agatgggcct ggctagcaaa ctggattttg tacgcgaccg cctgatggaa 1080 gtttatttci gggcactggg tatggcgcca gacccgcagt Uggtgaatg tcgcaaagci 1140 gttactaaaa tgtttggtct ggtgacgatc atcgatgacg tgtatgacgt ttatggcact 1200 ctggacgaac igcaactgtt caccgatgct gtagagcgct gggacgttaa cgctattaac 1260 accctgccgg actatatgaa actgtgtttc ctggcactgt acaacaccgt taacgacacg 1320 tcctatlcta ttclgaaaga gaaagglcat aacaacctgt cctatcigac gaaaagctgg 1380 cgigaactgt gcaaagcctt tctgcaagag gcgaaatggt ccaacaacaa aattatcccg 1440 gctticlcca agtacctgga aaacgccagc gtttcctcct ccggtgtagc gclgctggcg 1500 ccgtcttact tttccgtstg ccagcagcag gaagacatct ccgaccacgc gctgcgttcc 1560 ctgaccgact tccatggtcl ggtgcgttct agctgcBtta tcticcgcct gtgcaacgat 1620 ciggccacct ctgcggcgga gctggaacgt ggcgagacia ccaattctai caitagctac 1680 atgcacgaaa acgatggtac cagcgaggaa caggcccgcg aagaactgcg taaactgatc 1740 gacgccgaat ggaaaaagat gaatcgtgaa cgcgttagcg actccaccct gctgcctaaa 1800 gcgttcatgg aaatcgcagt taacatggca cgtgtttccc actgcaccta ccagtatggc 1860 gatggtctgg gtcgcccaga ctacgcgact gaaaaccgca tcaaactgct gctgattgac 1920 cctttcccga ttaaccagct gatgtatgtc taactgcagg tcgactctag aggatccccg 1980 ggtaccgagc tcgaattcac tggccgtcgi tttacaacgt cetgactgeg aaaaccctfig 2040 cgttacccaa cttaatcgcc Etgcagcaca tcccccEttc gccagctggc gtaatagcga 2100 agaggcccgc accgatcgcc cttcccaaca gtigcgcagc ctgaatygcg aatggcgcct 2160 gatgcggtat tttctcctta cEcatctgtg cggiaitlca caccgcatat ggtgcactct 2220 cagtacaatc tgctctgatg ccgcatagtt aagccagccc cgacacccgc caacacccgc 2280 tgacgagctt agtaaagccc tcgclagatt Uaatgcgga tgllgcgau acltcgccaa 2340 ctattgcgat aacaagaaaa agccagccti tcatgatata tctcccaatt tgigtagggc 2400 11attatgca cgcttaaaaa caataaaagc agacttgacc tgatagtttg gctgtgagca 2460 attatgtgct tagtgcalct aacgcttgag ttaagccgcg ccgcgaagcg gcgtcggcit 2520 gaacgaattg ttagacatta tttgccgact accttgEtga tctcgcctti cacgtagtgg 2580 acaaattctt ccaactgaU【gcgcgcgag gccaagcgat cttcttcttg tccaagaUa 2640 gcctgtctag cttcaagtat fiacgggctga tactgggccg gcaggcgctc cattgcccag 2700 tcggcagcga catccitcgg cgcgattttg ccggtiactg cgctgtacca aatgcgggac 2760 aacgtaagca ctacatttcg ctcatcgcca gcccagtcgg gcggcgagtt ccatagcgtt 2820 aaggtttcat ttagcgcctc aaatagatcc tgitcaggaa ccggatcaaa gagitcctcc 2880 gccgctggac ctaccaaggc aacgctatgt tcicttgctt \tgtcagcaa galagccaga 2940 tcaatgicga tc£tggctgg ctcgaagata cctgcaagaa tgtcattgcg ctgccattct 3000 ccaaattgca gttcgcgcit agctggataa cgccacggaa tgatgtcgtc gtgcacaaca 3060 atggtgactt ctacagcgcg gagaatctcg ctcEctccag gggaagccga agtttccaaa 3120 aggtc&ttga tcaaagctcg ccgcgttgtt tcatcaagcc ttacggtcac cgtaaccagc 3180 aaatcaatat cactgtgtgg cttcaggccg ccatccactg cggagccgta caaatgtacg 3240 gccagcaacg tcggttcgag atggcgctcg atgacgccaa ctacctctga Eagttgagtc 3300 gatacltcgg cgatcaccgc ttccctcatg atgtttaact ttgttttagg gcgactgccc 3360 tgctgcgiaa catcgttgct gctccataac atcaaacatc gacccacggc gtaacgcgct 3420 tgctgcttgg atgcccgagg catagactgt accccaaaaa aacagtcata acaagccatg 3480 aaaaccgcca ctgcgccgtt accaccgctg cgttcggtca aggttctgga ccagttgcgt 3540 gagcgcatac gctacttgca ttacagctta cgaaccgaac aggcttatgt ccactgggtt 3600 cgtgccttca tccgtttcca cggtgtgcgt cacccggcaa ccngggcag cagcgaagtc 3660 gaggcatttc tgtcctggct ggcgaacgag cgcaaggttt cggtctccac gcatcgicag 3720 gcattggcgg ccttgctgtt cttctacggc aaggtgctgt gcacggatct gccctggctt 3780 caggagaicg gaagacctcg gccgtcgcgg cgcttgccgg tggigctgac c'ccggatgaa 3S40 gtggttcgca tcctcggttt tctggaaggc gagcatcglt tgttcgccca gcttctgtat 3900 ggaacgggca tgcggatcag tgagggtttg caactgcggg tcaaggatct ggatttcgat 3960 cacggcacga tcatcgtgcg ggagggcaag ggctccaagg atcgggcctt gatgtiaccc 4020 gagegcttgg cacccagcct gcgcgagcag gggaaitaai tcccacgg&t utgctgccc 4080 gcaaacgggc 丨gt【ctgg【g ttgctagttt gttatcagaa tcgcagatcc ggcucagcc 4M0 149048-序列表.doc

S 201111512 ggtttgccgg ctgaaagcgc tatttcttcc agaattgcca tgattttttc cccaceegafi 4200 gcgtcactgg ctcccgtgu gtcggcagct ttgattcgat aagcagcatc gcct&tttca 4%0 ggcigtciai gigtgactgt tgagctgtaa caagttgict caggtgitca atttcatgtt 4320 ctagttgctt Lgttltactg gtttcacctg ttctattagg tgttacatgc tgttcatctg 4380 tucattgtc gatctgUca tggigaacag ctUgaatgc accaaaaacl cgtaaaagct 4h〇 ctgatgtatc tatctttttt acaccglttt catctgtgca tatggacagt tttccctttg 4500 atatgtaacg gtgaacagtt gUctacttt ictttfittag tcttgatgct tcactgatag 4560 atacaagagc cataagaacc Icagatcctt ccgtatttag ccagtatgtt ctctagtgtg 4620 gUcgttgtt utgcgtgag ccatgagaac gaaccattga eatcatactt actttgcatg 4680 tcactcaaaa attttgcctc aaaaclggtg agclgaatlt tlgcagttaa agcatcgtgt 4740 agtgttutc Etaatccgtt atetagglag gaatclgatg taatggtlgt tggtattttg 4SOO tcaccattca tmtatctg gttgttctca agttcggtta cgagatccat ttgtctatct 4860 agttcaactt ggaaaatcaa cfitatcaglc gggcggcclc gcttatcaac caccaatttc 4920 ataltgctgt aagtgtttaa atctttactt attggtttca aaacccattg gttaagcctt 4980 ttaaactcat ggtagttatt ttcaagcau aacatgaact laaattcatc aaggctaatc 5040 tctatatttg cctlgtgagt ittcttttgt gttagttctt ttaataacca ctcataaatc 5100 ctcatagagt attlgttttc aaaagactta acatgttcca gattatattt talgaatttt 5160 tttaactgga aaagataagg caatatctct tcactaaaaa ctaaitctaa tttttcgctt 5220 gagaacttgg catagtttgt ccactggaaa atctcaaagc ctttaaccaa aggattcctg 5280 autccacag ttctcgtcat cagctctctg gitgctttag claatacacc ataagcattt 5340 tccctactga tgttcatcat ctgagcgiat tggttataag tgaacgatac cgtccgttct 5400 ttccttgtag ggttttcaat cgtEgggttg agtagtgcca cacagcataa aattagcttg 5460 gmcatgct ccgttaagtc atagcgacta alcgclagU caiugcUl gaaaacaact 5520 aattcagaca tacatctcaa uggtclagg igattttaat cactatacca attgagatgg 5580 gctagtcaat gataattact agtccttltc clttgagttg tgggtatctg taaattctgc 5640 tagacctttg ciggaaaact tgtaaattct gclagaccci clglaaattc cgciagaccE 5700 ttgtgtgttt tttttgttta tattcaagts gttataattt atagaataaa gaaagaataa 5760 aaaaagataa aaagaataga tcccagccct gtgtataact cactacttta gtcagttccg 5S20 cagtattaca aaaggatgtc gcaaacgctg uigclcctc tacaaaacag accttaaaac 5880 cctaaaggct taagtagcac cclcgcaagc icgggcaaat cgctgaatat tccttttgtc 5940 tccgaccatc agecacciga gtcgctgtcl ttttcgtuac altcagttcg ctficgctcac 6000 ggctctggca gtgaatgggg gtaaatggca ctacaggcgc citttatgga Ucaigcaag 6060 gaaactaccc ataatacaag aaaagcccgt cacgggciIc tcagggcgtI ttatggcggg 6120 tctgciatgt ggtgcutct gacuutgc tgticagcag uccigccct ctgattucc 6180 agtctgacca cttcggatta tcccgtgaca gglcattcag actggctaat gcacccagta 6240 aggcagcggt atcatcaaca ggctta 6266 <210> 8 <211> 1695 <212> DNA <213>人工序列 <223>合成構築體 <400> 8 atglgtgcaa cctcctccca gt t iactcag at taccgagc aiaat tctcg acgaictgct 60 aactaccagc cgaacctttg gaactttgag ittctccagt ctctcgaaaa tgacctgaag 120 gtggaaaagc tcgaggagaa ggcgaccaaa ctcgaggagg aggtgcgatg tatgatcaac 180 agagttgaca cccaacccct gtctttgctg gagctgatcg acgatgtgca gcggttgggt 240 ttgacttata aattcgagaa ggacattatc aaggcactgg agaacattgt gctcctcgac 300 gagaacaaga agaacaagtc tgatcttcac gciaccgctc tctctttccg acttcttcga 360 caacacggct tcEaggtgtc gcaggacgtc ttcgagagat ttaaggacaa ggagggagga 420 lllagcggcg afictgaaggg agacgttcag ggtcttctct ccttgtacga ggcgtcctac 480 ctgggattcB agggagagaa cctcctggag gaagcicgta catttlccat cactcacctt 540 aagaataacc ttaaggaggg aattaacacc aaggtggccg agcaggtttc tcacgcccig 600

Bagctcccd accaccaacg gctccataga ciggaggctc gttggttcct ggacaaatat 660 gagccaaagg agcctcatca tcagttgctg Uggagttgg ccaagctgga citcaatatg 720 gttcagacec tgcaccaaaa ggaettgcag gacctgtctc gatggtggac cgagatggga 780 tiggcctcga agctggattt tgtccgtgac cgacttatgg aggtctattt ttgggccctt 840 ggaatggcgc ctgaccccca gttcggagag tgccggaagg cggtgacgaa gatgttcggt 900 cttglgactd icatcgacga cgtciacgat fitctacggca cactcgacga gttgcagctg 960 ttcactgacg ccgtcgagcg atggfiatgtg aacgccatla atactctccc tgactatatg 1020 aagctgtgcl tcctggctct gtacaacact gtcaacgata cctcgtactc tatcctcaag 1080 gagaagggac acaacaatct ctcctacttg accaaatcct ggcga^aact gtgcaaggct 1140 ttlc丨gcagg aggclaaatg gtccaataac aagatcattc ctgctttttc taaatacclg 1200 gaaaatgcct cggtgtcgag ctctggcgic gcccttcigg ccccttccla cttctccgtc 1260 tgccagcagc aggaggatat ttccgatcat gctctiagat cgctgaccga ttttcacggc 1320 clcgtgcgai cttcctgcgt gatttttcgg ttgtgtaatg accltgcgac ctctgctgct 1380 gagctggaac gaggcgagac tacaaattcc attatitctt acatgcacga aaacgatgga 1440 acatctgaag aacaggctag agaggaactg cgaaagUga tcgacgccga gtggaagaag 1500 atgaacagag agcgggrgtc cgactctacc ctgcttccca aggccttcal £gagatcgcc 1560 gtgaacatgg ctcgagcttc ccattgtaci laccagtacg fitgacegcct eegtcfitccg 1620 gactacgcta cagagaaccg aatcaagctg ctgclcatcg accccttccc tatcaaccaa 1680 ttgatgtacg tgtaa 1695 <2}〇> 9 <211> 40 <212> m <2〖3>人工序列 <220> <223>合成構築體 <400> 9 6·

149048-序列表.doc 201111512 gcttatggat cctctagact attacacgta catcaaitgg 40 <210> 10 <211> 30 <212> DNA <2Π>人工序列 <220> <223>合成構築體 <400> 10 caccatgtgt gcaacctcct cccagtUac 30 <210> 11 <211> 8191 <212> im <2】3>人工序列 <220> <223>合成構築體 <40〇> 11 tcgaccggtg agaagaacag catcgggaca agggaaggaa gaacaaagac aaagaaaaca 60 aaagaaagca attgaaaaca aaacaaaaca attttcattc cttctcttat cattcctm 120 cuttctitt ctctcattca acgcactcca tcgtatccgt attcctctta ttttttctct 1 哀0 ttctctaiat ccamcttt ctctctaget gtgtcctctc tctctcttca atttctctac 240 tccgcaticc aacgcatcct tcccccaacc tcccatttcc tccttacggc ccgatagcga 300

tcglctttcc ctcgctatca ctcgctaccg gccccicctc tgcaccgtaa cctccEacgt 360 arttaccata tcaiaaagtt uttccgacg cttatcgctg accccctgtc gccctcctat 420 tggcttccgg attatcttct tgtccataag gtgatccatg cttcctgaag attcccgaaa 480 tgtgtccact ttggcgggga atcattccat ccacttctit ctctctcgct ttcctcattc 540 ggcgctcccc ttccgcgict cattggtcu ccgciccgtt titgctttgc cgatgttact 600 tggggagagg tgcgataatc ctttcgcaaa aactcggut gacgcctccc atggtataaa 660 tagtgggtgg tggacaggtg ccttcgcitt uttuagca agagaatccc attgicttga 720 ctatcacgaa ttcacataca ttatgaagat caccgctgtc attgcccttt tattctcact 7吾0 tgctgctgcc tcacctattc cagttgccga tcctggtgtg gutcagtta gcaagtcata 840 igctgatttc cttcgtgtu accaaagitg gaacactttl gctaatcctg atagacccaa 900 ccttaagaag agaaatgata cacctgcaag tggatatcaa gttgaaaaag tcgtaatttt 960 gtcacgtcac ggtgtiaggg cccctacaaa aatgactcaa accatgcgtg atgtcactcc 1020 raatacatgg ccagaatggc ccgttaaatt aggatatatt acaccaagag gtgaacactt 1080 gatatcactl atgggcggtt inaccgtca aaaattccag caacaaggaa tccttictca 1140 gggctcctgt cctactccia actccatata tgtctgggct gacgtcgatc agcgtactit 1200 aaaaactggt gaagcattcc ttgctggttt ggcaccacaa tgtggcttga caattcatca 1260 ccaacaaaal cttgagaaag ctgatcctct ttttcatccc gtcaaagctg gaacctgctc 1320 tatggataaa aclcaagttc aacaagctgt tgagaaggag gcacaaactc ctatagataa 1380 tttgaatcaa cattacatcc cctttttagc tttaatgaat acaacattaa attttagtac 1440 vtctgcctgg tgccaaaaac actctgctga taaatcctgt gacctaggtt tatccatgcc 1500 ttctaaatlg tccataaaag ataatggtaa caaggtcgca ttggatggag ctatiggtct 1560 atcctctact ttggccgaga tttttcttct tgaatatgct caaggcatgc ctcaagctgc 1620

Mggggtaac alccactcag agcaagagtg ggcticcUg claaagllgc ataatgltea 1^80 attcgatttg atggcccgaa caccttatat tgctcgacal aacggtactc etttaugea 1740 agetatatea aatgccctta alcccaacgc cactgaatca aaacltccag atatttcacc ΙδΟΟ tgataacaaa atattgttca Ugcaggtcii tgacacaaal attgctaala tageeggeat 1860 gt taaatatg cgt tggacat taccaggtca accagataat actcctccag gtggtgccct 1920 agtatttgaa cgtcttgctg ataaaagtgg aaaacaatat gtllctglat ctatggttta 1980 tcaaacacta gaacaacttc gatcacagac tcccctttct ctaaatcagc ctgccggatc 2040 tgttcaactt aaaattccag gttgcaaiga tcaaacagcc gagggttact gtcctctttc 2100 cactttraca agagttgttt cccaatctgt tgaacctgga tgccaacttc aataatgagg 2160 atccaagtaa gggaatgaga atgtgatcca elUtaatte ctaatgaata catgcciata 2220 gttccutct tttgttcm atgtcgmt tcgatggtac ggccgttgtc aatctcagtt 2280 igigigcug gttgeagett ggtttcaaat ctgttcatct catgaaictt ttaccarttc 2340 accacacgtt tataccattc tctcatagaa tcttcatcaa accatctcgg ggttagagtg 2400 gaaagaaagt cttgttcttt tatttccttt utccatcH caaggclltt ctttlcttcc 2460 tccicctcgi tcauttgag gtttgacgtg tctgtttaga atutgaget gttgeageat 2520 cttattitit gtmgcgaa aaegaagege tuactcict tcatcagttg gacgaUgta 2580 cctugaaaa ccaactactt tEgcatgttl tgtatagaaa lcaaigalat lagaatccca 2640 icctttaatt tctrrcaaag tagttgaget atagttaagt giaagggccc tactgcgaaa 2700 gcatttgcca aggatgtm cattaatc-aa gaacgaaagt taggggatcg aagaegatea 2760 gataccgtcg tagtcttaac cataaactat gccgactagg galcgggcaa tgittcam 2820 alcgactrgc tcggcaccu aegagaaate aaagufttg ggttccgggg ggagtaiggt 2880 cgcaaggctg aaacttaaag gaattgaegg aagggcacca caatggagtg gagcctgcgg 2940 cilaalttga ctcaacacgg ggaaactcac caggtccaga catagtaagg attgacagat 3000 tgagagetet Ucttgatlc tatgggtggt ggigcatggc cgucuagt iggtggagtg 3060 atttgtctgc ttaattgega taaegaaega gaccttaacc tgctaaatag ccggatcagc 3120 catmggct gatcattage Itettagagg gactattgge ataaagccaa tggaagtttg 3180 aggcaataac aggtctgtga igcccttaga tgtlctggec cgcacgcgcg ctacactgac 3240 ggagccaacg agttgaaaaa aatcttttga ttttttatcc ttggccggaa ggtctgggta 3300 atettfittaa actccgtcgt gctggggm gageattgea attattgegg ccgctcctca 3360 attcgatgtt gcagatttta caagttttta aaatgtattt cattattact ttttatatgc 3420 ctaataaaaa agccatagtt taatetatag ataacttttl ttccagtgca etaaeggaeg 3480 ttacattccc atacaaaact gcgtagttaa agetaaggaa aagttaatat catgttaatt 3540 aaaiacgcta tttacaataa gacattgaac tcatttatat cgttgaatat gaataaccaa 3600 tttcsgcgaa tttltaacaa acatcgttca cctcgtttaa ggatatcttg tgtatggggt 3660 gttgacttgc tttatcgaat aattaccgta cctetaattg gcttgctgga tatagcggta 3720 gtetaatate tagcaaaaat cttttgggtg aaaaggcttg caatttcacg acaccgaact 3780 aittfitcatt ttttaataag gaagttucc ataaancct gtaacteteg gtigatctaa 3840 ttgaaaagag tagttttgca teaegatgag gagggctttt gtagaaagaa ataegaaega 3900 149048-序列表.doc 201111512

nacgaaaatc agcgttgcca tcgctttgga caaagctccc Itacctgaag agtcgaaut 3960 lattgatgaa cttataactt ccaagcatgc aaaccaaaag ggagaacaag taatccaagt 4020 agacacggga attggattct tggatcacat gtatcatgca ctggctaaac atgcaggctg 4080 Bagcuacga ctttacicaa gaggigattt aaicatcgat gaicatcaca ctgcagaaga 4140 lactgctait gcacttggta ltgcattcaa gcaggctatg ggtaactttg ccggcgttaa 4200 nagatttgga catgcttatt gtccacttga cgaagctctt tctagaagcg tagttgaclt 4260 Rtcgggacgg ccctatgctg italCEattl gggattaaag cgtgaaaagg ttggggaatl 4320 gicctgtgaa aigatccctc actiactata ttccmtcg gtagcagctg gaattactit 4380 Bcatgttacc tgcttatatg gtagtaatga ccatcalcgt gcigaaagcg citllaaau； 4440 tctggctglt gccatgcgcg cggctactag tcttactgga agltclgaag icccaagcac 4500 gaagggagtg ttgtaaagat gaattggatt atgtcaggaa aagaacgaca attLtgcatc 4560 caaattgtct aaattttaga gttgcUgaa aacaatagaa ccttacttgc tttataatta 4620 cgltaattag aagcgttatc tcgtgaagga atatagtacg tagccgtata aattgaattg 4680 aatgttcagc Uatagaata gagacacttt gctgttcaat gcgtcgtcac ttaccatacl 4740 cactuatta 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ctcatalata ctttagattg atttaaaact 7320 tcatttttaa tltaaaagga tctaggtgaa gatccttttt gataatctca tgaccaaaat 7380 cccttaacgt gagttttcgt tccactgagc glcagacccc gtagaaaaga tcaaaggatc 7440 ttcttgagat ccutttttc tgcgcgtaat ctgctgcttg caaacaaaaa aaccaccgct 7500 accagcggig guiglitgc cggaicaaga gctaccaact ctttttccga agfitaactgg 7560 citcagcaga gcgcagatac caaatactgt ccttclaglg tagccgtagt taggccacca 7620 cttcaagaac tctgtagcac cgcctacata cctcgctctg claalcctgt taccagtggc 7680 tgctgccagt ggcgataagt cgtgtcttac cgggtlggac icaagacgat agttaccgga 7740 taaggcgcag cggtcgggcl gaacgggggg ttcgtgcaca cagcccagct tgfiagcgaac 7S00 gacctacacc gaactgagat acctacagcg tyagcaltga gaaagcgcca cgcttcccga 7860 agggagaaag gcggacaggt aiccggtaag cggcagggtc ggaacaggag agcgcacgag 7920 ggagcttcca gggggaaacg cctggtatct ttatagtcct gtcgggtttc gccacctctg 7980 acltgagcgt cgatttttgt gatgctcgtc aggggggcgg agcctalgga aaaacgccag 8040 caacgcggcc ttttucggt tcctggcctt ttgctggcct ittgctcaca tgttctttcc 8100 tgcgttatcc cctgattctg tggataaccg 丨attaccgcc ttlgaglgag ctgataccgc 8160 tcgccgcagc cgaacgaccg agcgcagcga g 8191 <210> 12 <211> 1724 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>合成構築體 <400> 12 gaattcaaaa caaaatgtgt gcaacctcct cccagtttac tcagatiacc gagcataatt 60 ctcgacgatc igctaactac cagccgaacc tuggaacu tgagtuctc cagtctctcg 120 aaaatgacct gaaggtggaa aagctcgagg agaaggcgac caaactcgag gaggaggtgc 180 149048·序列表.doc 201111512 gatgtatgat caacagagtt gacacccaac ccctgtcttt gctggagctg atcgacgatg 240 tgcagcggtt gggtttgact lataaattcg agaaggacal tatcaaggca ctggagaaca 300 ttgtgctcct cgacgagaac aagaagaaca agtcigatct ccacgctacc gctctctctt 360 tccgacttct Ecgacaacac ggctlcgagg tgtcgcagga cgtcttcgag agatttaagg 420 acaaggaggg aggaittagc ggcgagctga agggagacgt tcagggtctt ctctccttgt 480 acgaggcgtc ctacctggga ttcgagggag agaacctcct ggaggaagct cgtacatttt 540 ccatcactca ccttaagaat aaccttsagg agggaattaa caccaaggtg gccgagcagg 600 tttctcacgc cctggagctc ccctaccacc aacggctcca tagactggag gctcgttggt 660 tcctggacaa ataigagcca aaggagccic atcaicagtt gctgttggag ttggccaagc 720 tggacttcaa tatggttcag acgctgcacc aaaaggagtt gcaggacctg tctcgatggt 780 ggaccgagat gggattggcc tcgaaectgg atutgtccg tgaccgactt atggaggtct 840 autttgggc ccttggaatg gcgcctgacc cccagttcgg aeagtgccgg aaggcggtga 900 cgaagatfitt cggtcUgtg actatcaicg acgacgtcta cgatgtctac ggcacactcg 960 acgagttgca gctgttcact gacgccgtcg agcgatggga tgtgaacgcc attaatacic 1020 tccctgacla tatgaagctg tgcUcctgg ctctgtacaa cactgtcaac gatacctcgt 1080 actctatcct caaggagaag ggacacaaca aictctccta cltgaccaaa tcctggcgag Π40 aactgtgcaa ggcttttctg caggaggcta aatggtccaa taacaagatc attcctgctt 1200 tttctaaata cctggaaaat gcctcggigt cgagctctgg cgtcgcccit ctggcccctt 1260 cctacttcic cgtctgccag cagcaggagg atatttccga tcatgctctt agatcgctga 1320 ccgattttca cggcctcgtg cgatcttcct gcgtgatttt tcggttgtgt aatgaccttg 1380 cgacctclgc tgctgagctg gaacgaggcg agactacaaa ttccattatt tcttacatgc 1440 acgaaaacga tggaacatct gaagaacagg clagagagga actgcgaaag ttgatcgacg 1500 ccgagtggaa gaagatgaac agagagcggg tgtccgactc taccctgctt cccaaggcct 1560 tcatggagai cgccgtgaac atggctcgag tttcccattg tacttaccag Eacggtgacg 1620 gcctgggtcg tccggactac gctacagaga accgaatcaa gctgctgctc atcgacccct 1680 tccctatcaa ccaattgatg tacgtgtaat agtctagagg atcc 1724

<2I0> 13 <211> 1701 <212> DNA <213>人工序列 <220> ' <223>合成構築體 <400> 13 gaattcaaca aaaatgtgct ctgtttccac igagaacgtg tcctttactg agactgagac 60 tgaagcacgt agaagcgcca aciacgaacc caactcctgg gattatgact rtctgcigic 120 ttctgacacc gacgagtcga tcgaggttta taaggataag gccaagaaac ttgaggccga 180 ggtcagacga gagattaaca acgagaaggc cgagttcctg acccttcttg agctgatcga 240 caacgttcaa cgacttggtc ttggttaccg tticgaatcc gatatccgac gigcattgga 300 tcgatttgtc tcgtccggag gtttcgatgg tgtgactaag acgtcgctgc acgccacagc 360 tctttccttc agactgttgc ggcagcatgg atctgaggtt tcccaggaag ccttttctgg 420 tticaaggat cagaacggaa acttttigga gaatctcaag gaggacacca aggccatcct 480 etcgttgtat gaggcctcgt tcctggctct tgagggcgag aatattctgg atgaggclcg 540 ggttctcgct autcgcacc tgaaggagtt gtcggaggaa aagatcggaa aggaactggc 600 cgagcagglc aaccatgcac ttgaacttcc cctgcatcga cgtacccagc gaclggaggc 660 cgtgtggagc atcgaggcgt acagaaaaaa ggaggalgct aatcaggttc tgctcgaaci 720 cgctatccEc gactataaca tgattcagag cgtgtaccag cgtgacttgc gagagacaag 780 ccggtggtgg cgacggmgg gactggccac gaagctccac tttgctaaag atcgattgat 840 tgagtcgttc tactgggcag tgggtgtggc ctitgagcct cagtaciccg actgccgaaa 900 ctccgttgca aagatgttu cttttgtcac tatcatcgac gacatctacg atgtttacgg 960 cactctcgat gaactcgaac lettcacgga cgctgtcgaa cgatgggatg tgaatgccat 1020 iaatgatctg ccagattaia tgaagttgtg tttcttggcg ctctacaaca caaltaatga 1080 aaugcctac gacaacctca aggacaaggg agagaacatt ctgccctacc ttactaaagc 1】40 ctfiggccgac ctgtgtaacg cctttttgca ggaagccaag tggetetata acaaatctac 1200

EcciacatEt gatgactact tcggcaacgc Uggaagtet tccagcggcc ctctccagtt 1260 gatetteget tactttgcag tggtccagaa catcaagaaa gaggagattg agaacctcca 1320 gaagtatcac gacatcatct cccgaccttc gcacatcttt cgactgtgca atgaccttgc 1380 ctccgcatcc gctgagattg cccgaggaga aacagccaat tctgtgtcgt gttacatgcg 1440 tacaaagggc alctccgagg agctggctac cgagtctgtg atgaacctga tcgatgaaac 1500 ctgtaagaag atgaacaaag agaaactggg cggttctctg ttcgccaaac catttgttga 1560 aaccgcgatc aatclggctc gteagtetea ttgtacttac cataacggtg acgcgcacac 1620 ttcgccggac gaattgaccc gtaagcgtgt gctttcggtg attaccgagc cgatcctgcc 1680 gttcgaaaga taataggatc c 170] <210> 14 <211> 28 <212> DNA <21办人工序列 <220> <223>合成構築體 <400> 14 gaicaagctt aaccggaatt gccagctg 28 <2t0> 15 <211> 33 <212> DNA <213>人工序列 <220> 合成構築體 <400> 15 gatccgatcg tcagaagaac tcgtcaagaa ggc 33 149048-序列表.doc 38 201111512 <210> 16 <2Π> 38 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>合成構築體 <400> 16 catcaatgca tcgcccttag gag£taaaaa aaaatgac <210> 17 <2H> 26 <212> DNA <2】3>人工序列 <220> <223>合成構築體 <400> 17 26 ccttctgcag gacgcgttgt tatagc <210> 18 <211> 60 <212> DMA <213>人工序列 <220>

<223>合成構築體 <400> 18 gatcatgcat tcgcccttag gaggtaaaaa aacatgagtt Ugatattgc caaatacccg 60 <210> 19 <211> 31 <212> DNA <21>人工序列 <220> <223>合成楢築體 <400> 19 caigctgcag Itatgccagc caggccttga t 31 <2\0> 20 <211> 8804 <212> DNA <2丨3>人工序列 <220〉 <223>合成構築體 <400> 20 gctggtacca taigggaatt cgaagcttic tagaacaaaa acicatctca gaagagEatc 60 igaatagcgc cgtcgaccat catcatcatc aLcaugagt itaaacugtc tccagctlgg 120 ctgiuiggc ggatgagaga agattucag cctgatacag atlaaatcag aacgcagaag 180

cggtctgata aaacagaatt tgcctggcgg cagtagcgcg Etggtcccac ctgaccccat 240 gccgaactca gaagtgaaac gccgtagcgc cgatgglagt gtggggtctc cccatgcgag 300 agtagggaac tgccaggcal caaataaaac gaaaggctca gtcgaaagac tgggccttlc 360 gtttialctg ttgtttgtcg gtgaacgctc tccteagtag tjacaaatccg ccgggagcgg 420 atttgaacgt tgcgaagcaa cggcccggag ggtggcgggc aggacgcccg ccataaactg 480 ccaggcatca aatlaagcag aaggccatcc tgacggatgg cctttttgcg tttctacaaa 540 cicittttgt ttamttct aaatacattc aaatatgtat ccgcttaacc ggaattgcca 600 fiCtggBgcgc cctctggtaa gfittgggaag ccctgcaaag taaactggat ggctttctcg 660 ccgccaagga tctgaiggcg caggggatca agctctgatc aagagacagg algaggatcg 720 mcgcatga ttgaacaaga tggattgcac gcaggttclc cegccgcttg ggtggagagg 7S0 ctattcggct aigactgggc acaacagaca atcggctgct ct^atgccgc cgtgttccgg S40 ctgtcagcgc aggggcgccc ggttctttu gtcaagaccg acctgtccgg tgccctgaat 900 gaactgcaag acgaggcagc gcggctatcg tggctggcca cgacgggcgt tccttgcgca 960 gctgtgctcg acgttgtcac tgaagcggga agggactggc tgctattggg cgaagtgccg 1020 gggcaggatc tcctgtcatc tcaccttgct cctgccgaga aagtatccat catggctgat 丨080 gcaatgcssc ggctgcatac gctigatccg gctacctgcc cattcgacca ccaagcgaaa 1140 catcgcatcg agcgagcacg tactcggatg gaagccggtc tigtcgatca ggatgatctg 1200 gacgaagagc atcagggact cgcgccagcc gaactgttcg ccaggctcaa ggcgagcatg 1260 cccfiacggcg .aggatctcgt cgtgacccat ggcgatgcct gcttgccgaa tatcatggtg 1320 gaaaatggcc gcttttctgg attcatcgac tgtggccggc tgggtgtggc ggaccgctat 1380 cag&acatag cgttggctac ccgtgatatt gctgaagagc ttggcggcga atgggctgac 1440 cgcttcctcg tgctuacgg latcgccgci cccgattcgc agcgcatcgc cttctaicgc 1500 cttcttgacg agucttctg acatgaccaa aatcccttaa cgtgagtttt cgttccactg 1560 agcgtcagac cccgtagaaa agatcaaagg atcttcttga gatccttttt ttctgcgcgt 1620 aatctgctgc Ugcaaacaa aaaaaccacc gctaccagcg gtggtitgtt tgccggatca 1680 agagctacca(aclctttttc cgaaggtaac tggcttcagc agagcgcaga taccaaatac 1740 tgtccttcta gtgtagccgt agttaggcca ccacttcaag aactctgtag caccgcctac 1800 atacctcgct ctectaatcc tgttaccagt ggctgctgcc agtggcgata agtcgtgtct I860 taccgfigttg gactcaagac gatagttacc ggataaggcg cagcggtcgg gctgaacggg 1920 10· 149048-序列表.doc 201111512

gggttcgtgc acacagccca gcttggagcg aacgacctac accgaactga gatacctaca 1980 gcgtgagcta tgagaaagcg ccacgcttcc cgaagggaga aaggcggaca ggiatccggt 2040 aagcggcagg gtcggaacag gagagcgcac gagggagctt ccagggggaa acgcctggta 2100 tctitatagc cctgtcgggc ttcgccacct ctgacttgag cgtcgatttt tgtgatgctc 2160 gtcagggggg cggagcctat ggaaaaacgc cagcaacgcg gcctttttac ggttcctggc 2220 citttgctgg ccttttgctc acatgttctt tcctgcgtta tcccctgatt ctgtggataa 2280 ccgtattacc gcctttgagc gagctgatac cgcrcgccgc agccgaacga ccgagcgcag 2340 cgagtcagtg agcgaggaag cggaagagcg cctgatgcgg tauuctcc ttacgcatct 2400 gtgcggtatt tcacaccgca tatggtgcac ictcagtaca atctgctctg atgccgcata 2460 gttaagccag tatacactcc gctaicgcia cgtgactggg tcatggctgc gccccgacac 2520 ccgccaacac ccgctgacgc gccctgacgg gcttgtctgc tcccggcatc cgcttacaga 2580 caagctgtga ccgtctccgg gagctgcatg igtcagaggt tttcaccgtc atcaccgaaa 2640 cgcgcgaggc agcagatcaa ncgcgcgcg aaggcgaagc ggcatgcatt tacgttgaca 27CX) ccaic^aaig gtgcaaaacc titcgcggta iggcatgara gcgcccggaa gagagtcaat 2760 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ccgaagacag ctcatgtlat aicccgccgt caaccaccal caaacaggat tttcgcctgc 3660 tggggcaaac cagcgtggac cgcttgctgc aactcictca gggccaggcg gtgaagggca 3720 atcagctgtt gcccgtctca ctggtgaaaa gaaaaaccac cctggcgccc aatacgcaaa 3780 ccgcctctcc ccgcgcgttg gccgattcat taatgcagct ggcacgacag gtttcccgac 3840 tggaaagcgg gcagtgagcg caacgcaatt aatgtgagtt agcgcgaatt gatctggitt 3900 gacagcttat catcgactgc acggtgcacc aatgcttctg gcgtcaggca gccatcggaa 3960 gctgtggtat ggctgtgcag gtcgtaaatc actgcataat tcgtgtcgct caaggcgcac 4020 tcccguctg gataatgtvt ttlgagccga catcataacg gitctggcaa atattctgaa 4080 atgagctgtt. gacaattaat catccggctc gtataatgtg tggaattgtg agcggaraac 4140 aatttcacac aggaaacagc gccgctgaga aaaagcgaag cggcactgct cttlaacaat 4200 ttaicagaca atctgtgtgg gcactcgacc ggaattatcg attaacttta ttattaaaaa 4260 ttaaagaggt. atatattaat gtatcgatta aataaggagg aataaaccat gtgtgcgacc 4320 tcttctcaat ttaclcagat taccgagcat aattcccgtc gttccgcaaa ctatcagcca 4380 aacctgtgga alltcgaatt cctgcaatcc ctggagaacg acclgaaagt ggaaaagctg 4440 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149048-序列表.doc 201111512 aacgtgtact gtctgttatc accgaaccga ttcigccgtt cgaacgttaa ctgcagcgtc 2880 aatcgaaagg gcgacacaaa atttattcta aalgcataat aaatactgat aacatcttat 2940 agtttgtatt atauttgta ttatcgttga caigtataal tttgatatca aaaactgatt 3000 ttccctttat tattttcgag atttattttc ttaattctct ttaacaaact agaaatattg 3060 tatatacaaa aaatcataaa taatagatga atagttlaat tatagglgtt catcaatcga 3120 aaaagcaacg tatcttattl aaagigcgtt gcuttttct calttataag gttaaataat 3180 tctcatatat caagcaaagt gacaggcgcc ctlaaatatt clgacaaatg cictuccct 3240 aaactccccc cataaaaaaa cccgccgaag ceggtltita cettatttgc ggattaacga 3300 ttactcgtta icagaaccgc ccagggggcc cgagcttaag aciggccgtc gtitlacaac 3360 acagaaagag 11tgtagaaa cgcaaaaagg ccatccglca ggggccttct gcttagtttg 3420 atgcctggca gticcctact ctcficcltcc gcticctcgc tcsctgactc gctgcgctcg 3480 Btcgttcggc tgcggcgagc ggtatcagct cactcaaagg cggtaatacg gUaiccaca 3540 gaatcagggg ataacgcagg aaagaacatg tgagcaaaag gccagc-aaaa ggccaggaac 3600 cgiaaaaagg ccgcgttgct ggcgittltc cataggctcc gcccccctga cgagcatcac 3660 aaaastcgac gctcaagtca gaggtggcga aacccgacag gactataaag ataccaggcg 3720 Utccccclg gaagctccct cgtgcgctct cctgttccga ccctgccgct taccggatac 3780 ctgtccgcct ttclcccttc Efifiaagcgtg gcgctttctc atagctcacg ctgtaggtat 3840 ctcagttcgg tgtaggtcgt tcgctccaag ctgggctgtg tgcacgaacc ccccgttcag 3900 cccgaccgct gcgccttatc cggtaactat cgtcttgagt ccaacccggt aagacacgac 3960 ttatcgccac tggcagcagc cactggtaac aggattagca gagcgaggta tgtaggcggt 4020 gctacagagt tcttgaagtg gtgggctaac tacggciaca clagaagaac agtatttggt 4080 atctgcgctc tgctgaagcc afittaccttc ggaaaaagag uggtagctc ttgatccggc 4140 aaacaaacca ccgclggtag cggtggtttt tttgtttgca agcagcagat tacgcgcaga 4200 aaaaaaggat ctcaagaaga tcctttgatc ttttctacgg ggtctgacgc tcagtggaac 4260 gacgcgcgcg taactcacgt taagggattt tggtcatgag cttgcgccgt cccgtcaagt 4320 cagcgtaatg ctctgcttt 4339

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Uacaatttc acacsggaaa cagcgccgc〖 gagaaaaagc gaagcggcac tgctctuaa 300 caatttatca gacastctgt gteggcactc gaccggaatt atcgattaac tttattatta 360 aaaattaaag aggtatatat taatgtatcg attaaataag gaggaataaa ccatgtgctc 420 tgtttctacc gagaacgitt cctlcactga gacggaaacc gaggcacgtc gtagcgcgaa 4S0 ctacgagccg aatagctggg actacgattt cctgctgtct tccgatactg acgaatctat 540 tgaggtgtac aaagacaaag caaagaaact ggaggctgaa gtgcgccgcg aaattaacaa 600 cgagaaagct gaattcctga ctctgctgga gctgatcgat aacgtacagc gcctgggtct 660 g£gttaccgc Ucgaatctg atatccgtcg cgcactggat cgtttcgtaa gcagcggcgg 720 tttcgatggc gtgaccaaaa cgagcctgca cgctaccgcg ctgtcctlcc gtctgcigcg 780 tcagcacggc ttcgaagttt ctcaggaagc attctccggt ttcaaagatc aaaacggtaa S40 cttcctggaa aacctgaaag aagacactaa ggcgaEcctg agcctgtatg aggcaagctt 900 tctggccctg gagggtgaga acatcctgga tgaggcgcgc gtattcgcca tctcccatct 960 gaaagagctg tctgaagaga aaatcggtaa ggaactggca gagcaggtta atcacgcact 1020 ggaactgccg ctgcatcgtc gtacccagcg tctggaggcg g丨ttggtcca tcgaagcgta 1080 ccgcaaaaag gaggatgcla accaggttct gctggaactg gccatcctgg actacaacat 1140 garccagtcc gtttaccagc gtgatctgcg tgaaaccrcc cgttggtggc gccgtgiggg 1200 cctggcgacc aaactgcact tcgctaagga ccgcctgatt gagtctittt actgggcagt 1260 cggcgttgcg ttcgaacctc agtattctga ctgccgtaac agcgttgcga aaatgitcag 1320 cttcgaaci auatcgacg acaiciacga cguucggi actctggacg agctggaact 13S0 gmaccgac gctgtcgaac gttgggatgt taacgccatc aacgatctgc ctgactacat 〗440 gaaactgtgc Ucctggcac tgtalaacac gatcaacfiaa attgcatacg acaacctgaa 1500 agacaaaggt gaaaacatcc tgccgtacct gactaaagcg tgggcggatc tgtgtaacgc 1560 ttttctgcaa gaagcgaaat ggctgtataa caaatccaci ccgaccttrg acgattattt 1620 cggcaatgcc iggaaatcca gctctggccc gctgcaactg atcttcgctt attttgcggt 1680

Efitccaaaac atcaaaaagg aggaaattga aaacctgcaa aaataccacg atatcattag 】740 ccgiccttct catatctttc gcctgtgcaa cgacctggca agcgcgtccg cagagaicgc )800 acgtggcgaa accgciaact ctgtttcctg ctacatgcgc accaagggca tttccgaaga 1860 gctggcaacc gagagcgtaa tgaatctgat cgacgaaacc tgtaagaaaa tgaacaaaga 1920 aaaactgggi ggctccctgt tcgctaaacc gttcgtagag actgctatta acctggcacg 1980 tcagagccac tgcacctacc acaatggtga cgcacatact agcccggatg aactgactcg 2040 taaacgtgta ctgtclgtta icaccgaacc gauclgccg ttcgaacgtt aactgcagct 2100 ggtaccatat gggaat tcga agctttciafi aacaaaaact catcicagaa gaggatctga 2160 atagcgccgt cgaccatcat catcatcatc attgagttta aacggtctcc agcttggctg 2220 ttttggcgga tgagagaaga ttticagcct gatacagatt aaatcagaac gcagaagcgg 2280 tctgataaaa cagaatttgc clggcggcag tagcgcggtg gtcccacctg accccalgcc 2340 gaactcagaa gtgaaacgcc gtagcgccga tggtagtgtg gggictcccc atgcgagagt 2400 agggaacigc caggcaicaa ataaaacgaa aggctcagtc gaaagactgg gcctttcgtt 2460 ttatctgttg Utgtcggtg aacgctctcc tgagtaggac aaatccgccg ggagcggatt 2520 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201111512

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149048-序列表.doc 201111512

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Ictaattttt cgcttgagaa cttggcatag utgtccact ggaaaatcic aaagccma 31S0 nccaaaggat tcctgailtc cacagttcic gicaicagci cictggttgc tnagctaat 3240 ncaccataag cattttcccl actgatgUc atcatctgag cgtattggtt ataagtgaac 3300 galaccgtcc gttctttcct tgtagfigtu tcaatcBtgg ggttgagtag tgccacacag 3360 cataaaatta gctlgglttc atgctccgtt aagtcatagc gactaatcgc tagttcattt 3420

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149048-序列表.doc 201111512 ctaaagcgtt catggaaatc gcagttaaca tggciicgtgt ttcccactgc acclaccagt 6060 atggcgatgg tctgggtcgc ccagactacg cgactgaaaa ccgcatcaaa ctgctgctga 6120 ttgacccttt cccgattaac cagctgatgt aigtctaaci gcagctggta ccatatggga 6180 attcgaagct ttctagaaca aaaactcatc tcagaagagg atctgaatag cgccgtcgac 6240 catcatcatc atcatcattg agtttaaacg gtctccagci tggcigtttt ggcggatgag 6300 agaagatttt cagcctgata cagattaaat cagaacgcag aagcggtctg ataaaacaga 6360 atttgcctgg cggcagtagc gcggtggtcc cacctgaccc catgccgaac icaEaagtga 6420 aacgccgtag cgccgatggt aglgtggggt ctccccutgc gagagtagg£ aactgccagg 6480 catcaaataa aacgaaaggc tcagtcgaaa gactgggcct tEcgitttat ctgttgtttg 6540 tcgglgaacg ctctcctgag taggacaaat ccgccgggag cggatttgaa cgttgcgaag 6600 caacggcccg gagggtggcg ggcaggacgc ccgccataaa ctgccaggca tcaaattaag 6660 cagaaggcca tcctgacgga tggcctlttt gcgtttctac aaacictttt tgtttattu 6720 tctaaataca ttcaaatatg tatccgctca tgagacaaia accctgataa atgcltcaat 6780 aat 6783 <210> 26 <21]> 6783 <212> m <213>人工序列 <220> <223>合成構築體 <400> 26 cccgtcttac tgtcgggaat tcgcgttggc cgaticatta aigcaaatta ttgaagcatt 60

tatcagggu attgictcat gagcggatac atatttgaat giatttagaa aaataaacaa 120 aaagagittg tagaaacgca aaaaggccat ccgtcaggat ggccttctgc ttaatttgat 180 gcctggcagt ttatggcggg cgtcctgccc gccaccctcc gggccgttgc ttcgcaacgt 240 tcaaatccgc icccggcgga UtgtccUc tcaggagagc gttcaccgac aaacaacaga 300 taaaacgaaa ggcccagtct ttcgactgag cctttcgttt tatttgatgc ctggcagttc 360 cctactctcg catggggaga ccccacacta ccalcggcgc tacggcgm cacttctgag 420 itcggcatgg ggtcaggtgg gaccaccgcg clactgccgc caggcaaatt ctgttltatc 480 agaccgcttc tgcgttctga tttaatctgt atcaggctga aaatcttctc tcatccgcca 540 aaacagccaa gctggagacc gtttaaactc aatgatgatg atgatgatgg tcgacggcgc 600 tattcagatc ctcttctgag atgagtttit gttctagaaa gcttcgaatt cccatatggi 660 accagctgca gttagacata catcagctgg ttaatcggga aagggtcaat cagcagcagt 720 ttgatgcggt ttlcagtcgc glagtctggg cgacccagac calcgccata ctggtaggtg 780 cagtgggaaa cacgtgccat gttaactgcg atttccatga acgctttagg cagcagggtg 840 gagtcgctaa cgcgttcacg attcatcttt ttccattcgg cgtcgatcag tttacgcagt 900 tcttcgcggg cctgttcctc gctggtacca tcgttttcgt gcatgtagct aatgatagaa 960 ttggtagtct cgccacgttc cagctccgcc gcagaggtgg ccagatcgtt gcacaggcgg 1020 aagataacgc agctagaacg caccagacca tggaagtcgg tcagggaacg cagcgcgtgg 1080 tcggagatgt cttcctgctg ctggcatacg gaaaagtaag acggcgccag cagcgctaca 1140 ccggaggagg aaacgctggc gttttccagfi lacttggaga aagccgggat aattttgttg 1200 ttggaccati tcgcctcttg cagaaaggct ttgcacagtt cacgccagct tttcgtcaga 1260 taggacaggt tgttatgacc tUctctttc agaatagaat aggacgtgic gttaacggtg 1320 tlgtacagtg ccaggaaaca cagtttcata tagtccggca gggtgttaat agcgttaacg 1380 tcccagcgct ctacagcalc ggtgaacagt tgcagtlcgt ccagagtgcc ataaacgtca 1440 racacgicat cgaigatcgt caccagacca aacatucag laacagcm gcgacattca 1500 ccaaactgcg ggtctggcgc catacccagt gcccagaaat aaacttccat caggcggtcg 1560 cgtacaaaat ccagtttgci agccaggccc atctcggrcc accagcggga cagatcttgc 1620 agcictltct ggtgcagggt cigtaccatg ttaaaatcca gcttcgccag ctccagcagc 1680

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63(X) cagccctgtg tataactcac tactttagtc agttccgcag tatlacaaaa ggaigtcgca 6360 aacgctgt11 gctcctctac aaaacagacc ttaaaaccct aaaggctiaa gtagcaccct 6420 cgcaagctcg ggcaaalcgc tgaatattcc ttttgtctcc gaccatcagg cacctgagtc 6480 gctgtctut tcgtgacatt cagttcgctg cgctcacggc tctggcagtg aatgggggta 6540 aatggcacia caggcgcctt ttatggattc atgcaaggaa actacccau aucaagaaa 6600 agcccgtcac gggctlctca figgcgtma tBgcgggtct gctalgtggt gctatctgac 6660 tttttgctgt tcagcagttc clgccclctfi attttccagt ctgaccactt cggattatcc 6720 cgtgacaggt cattcagact ggctaatgca cccagtaagg cagcggtatc atcaacaggc 6780 it a 6783 <210> 27 <211> 7687 <212> DNA <2】3>人工序列 <220> ' <223>合成構築體 <400> 27 ctggcgtaat agcgaagagg cccgcaccga tcgcccttcc caacagttgc gcagcctgaa 60 iggcgaatgg cgcctgatgc ggtattttci ccttacgcat ctgtgcggta 丨ttcacaccg 120 catatggtgc actctcagta caatctgctc tgatgccgca tagttaagcc agccccgaca 180 cccgccaacafcccgctgacg agcttagtaa agccctcgct agattttaat gcggatgtig 240 cgaltacltc gccaactatt gcgataacaa gaaaaagcca gcctttcatg ataiatctcc 300 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gtacggccag caacgtcggt tcgagaiggc gctcgatgac gccaactacc 1200 ictgatagtt gagtcgatac ttcgficgatc accgcttccc tcalgatgtt taactttgtt 1260 ttagggcgac tgccctgctg cgtaacatcg tigclgctcc ataacatcaa acalcgaccc 1320 -20- 149048 -序列表.d oc 201111512

acggcgtaac gcgcttgctg cttggatgcc cgaggcatag actgtacccc aaaaaaacag 1380 tcataacaag ccatgaaaac cgccactgcg ccgttaccac cgctgcgttc ggtcaaggtt 1440 ctggaccafit tgcgtgagcg catacgctac ttgcattaca gcttacgaac cgaacaggct 1500 tatgtccact gggttcgtgc cttcatccgt itccacggtg tgcgtcaccc ggcaaccitg 1560 ggcagcagcg aagtcgaggc atttctgtcc tggctggcga acgagcgcaa ggttlcggtc 1620 tccacgcatc gtcaggcatt EEcggccttg ctgttcttct acggcaaggt gctgtgcacg 1680 Eatctgccct ggcttcagga gatcggaaga cctcggccgt cgcggcgctt gccggtggtg 1740 ctgaccccsg atgaagtggt tcgcatcctc ggttttctgg aaggcgagca tcgtttgttc 1800 gcccagcttc tgtatggaac gggcatgcgg atcagtgagg gtLigcaact gcgggtcaag 1860 gatctggati tcgatcacgg cacgatcatc glgcgggagg gcaagggctc caaggatcgs 1920 gcct tgatgt tacccgagag cttggcaccc agccigcgcg agcaggggaa ttaat tccca 1980 cgggttttgc tgcccgcaaa cgggctgttc tgatgttgct agtUgUat cagaatcgca 2040 gatccggctt cagccggttt gccggctgaa agcgctattt cttccagaat tgccatgatt 2100 tlttccccac gggaggcgtc actggctccc gtgtlgicgg cagctttgat tcgataagca 2160 gcatcgcctg Utcaggctg tctatglgtg aclgltgagc tgtaacaagt tgtcicaggt 2220 gttcaatitc atgtictagt tgctngttt lactggtuc acctgttcta ttaggtgtta 2280 catgctgitc atctgttaca tigtcgatct gttcatggtg aacagctttg aatgcaccaa 2340 aaactcgtaa aagcictgat gtatctatct tttttacacc gitttcatct gtgcaiatgg 2400 acagttucc ctttgatatg taacgglgaa cagitgttct acttttgttt gttagtcttg 2460 atgcttcact aatagataca agagccataa gaacctcaga tccttccgta tttagccagt 2520 atgttctcta gtgtggttcg ttgttttigc gtgagccatg agaacgaacc attgagatca 2580 tacttacttt gcatgtcact caaaaatttt gcctcaaaac tggtgagctg aatttttgca 2640 &ttaaagcat cglgtagtgt ttttcUagt ccgttatgta ggiaggaatc tgatgtaatg 2700 gttgttggta ttttgtcacc attcattttt atctggltgt tctcaagtlc ggttacgaga 2760 tccatttgtc tatctagttc aacttggaaa atcaacgtat cagtcgggcg gcctcgctta 2820 icaaccacca atttcatatt gctgtaagtg tttaaatctt tacttattgg tttcaaaacc 2S80 cattggttaa gccttttaaa ctcatgglag ttattttcaa gcattaacat gaacttaaat 2940 tcatcaaggc taatctctat atttgccttg tgagtlttct tttgtgttag ttcttttaat 3000 aaccactcai aaatcctcat agagtatttg tmcaaaag acttaacatg ttccagatta 3060 tamtatga atttitttaa ctggaaaaga taaggcaata tctcttcact aaaaactaat 3120 tctaatutt cgcttgagaa cttggcatag tttgtccacl ggaaaatctc aaagccttta 3180 accaaaggat tcctgatttc cacagttctc gtcatcagct clctggUgc Utagctaat 3240 acaccataag cattttccct actgatgttc atcatctgag cgtaitggtt ataagigaac 3300 gataccgtcc gttctttcct tgtagggttt tcaatcgtgg ggttgagtag tgccacacag 3360 cataaaatta gcttggtttc atgctccgtt aagtcatBgc gactaatcgc tagttcattt 3420 gctttgaaaa caactaattc agacatacat ctcaattggt ctaggtgatt uaatcacta 3480 laccaattga gatgggcug tcaatgataa ttactagtcc ttttcctttg agttgtgggt 3540 atctgtaaat tctgctagac ctttgctgga aaacttgtaa attctgctag accctctgta 3600 aattccgcta gaccttigtg tgtttttttt gtttatatic aastagttat aatttataga 3660 ataaagaaag aataaaaaaa gataaaaaga atagatccca sccctgtgta taactcacta 3720 ctttagtcag ttccgcagta ttacaaaagg atgtcgcaaa cgctgtttgc tcctctacaa 3780 aacagacctt aaaaccctaa aggcttaagt agcaccctcg caagcEcggg caaatcgctg 3840 aatattcctt ttgtctccga ccatcaggca cctgagtcgc tgtctttttc gtgacattca 3900 gttcgctgcg ctcacggctc tggcagtgaa tgggggtaaa tggcactaca ggcgcctttt 3960 atggattcat gcaaggaaac tacccataat acaagaaaag cccgtcacgg gcttctcagg 4020 gcgttttatg gcgggtctgc iatgtggtgc tatctgactt ttigctgttc agcagttcct 4080 gccctctgat tttccagtct gaccacttcg gattatcccg tgacaggtca ucagactgg 4140 ctaatgcacc cagtaaggca gcggtatcat caacaggctt acccgtctta ctgtcgggaa 4200 ttcgcgttgg ccgattcatt aatgcagatt ctgaaatgag ctgttgacaa ttaatcatcc 4260 ggctcgtata atgtgtggaa ttgtgagcgg ataacaattt cBcacaggaa acagcgccgc 4320 igagaaaaag cgaagcggca ctgcicttta acaatttatc agacaatctg tgtgggcact 43S0 cgaccggaat tatcgattaa cmattatr aaaaattaaa gaggtataia ttaatgtatc 4440 gattaaataa ggaggaataa accaigtgtg cgacctcttc tcaatttact cagatiaccg 4500 agcafaattc ccgtcgttcc gcaaactatc agccaaacct gtggaatttc gaattcctgc 4560 aatccctgga gaacgacctg aaagtggaaa agctggagga gaaagcgacc aaactggagg 4620 aagaagttcg ctgcatgatc aaccgtgtag acacccagcc gctgtccctg ctggagctga 4680 tcgacgatgt gcagcgcctg ggtctgacct acaaatttga aaaagacatc attaaagccc 4740 tggaaaacat cgtactgctg gacgaaaaca aaaagaacaa atctgacctg cacgcaaccg 4800 ctctgtcttt ccgtctgctg cgtcagcacg gtttcgaggt uctcaggat gmugagc 4-860 gtttcaagga taaagaaggt ggttccagcg gtgaactgaa aggtgacgtc caaggcctgc 4920 tgagcctgta tgaagcgici tacctgggtt 【cgagggiga gaacctgctg gaggaggcgc 4980 gtaccttttc catcacccac ctgaagaaca acctgaaaga aggcattaat accaaggttg 5040 cagaacaagt gagccacgcc ctggaactgc catatcacca gcgtclgcac cgtctggagg 5100 cacguggtt cctggataaa iacgaaccga aagaaccgca tcaccagcig ctgctggagc 5160 tggcgaagct ggattttaac atggtacaga ccctgcacca gaaagagctg caagatctgi 5220 cccgctggtg gaccgagatg ggcctggcta gcaaactgga tutgtacgc gaccgcctga 5280 tggaagttta tuctgggca ctgggtatgg cgccagaccc gcagtttggt gaatgtcgca 5340 aagctgttac taaaatgttt ggtctggtga cgatcatcga tgacgtgtat gacgtttatg 5400 gcactctgga cgaactgcaa ctgttcaccg atgctgtaga gcgctgggac gttaacgcta 5460 ttaacaccct gccggactat atgaaactgt gtttcctggc actgtacaac accgttaacg 5520 acacgtccta uctattctg aaagagaaag 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ttaatgaatg aaaattgtat tgttttggat 6420 tgggacgata atgctattgg tgccggtacc aagaaagttt gicatttaat ggaaaatatt 6480 gaaaagggtt tactacatcg tgcattctcc gtctttattt tcaatgaaca aggtgaatta 6540 -21 - 149048-序列表.doc 201111512 cttttacaac aaagagccac tgaaaaaata actttccctg atctttggac taacacatgc 6600 t£ctctcatc cattatgtal 丨gatgacuaa Uaggtttga agggtaagct agacgataag 6660 attaagggcg ctnUactgc ggcggtgaga aaactagatc atgaattagg tattccagaa 6720 gatgaaacta agacaagggg taagtttcac tttttaaaca gaatccatta cat£ficacca 6780 a^caatgaac caiggggtga acatgaaatl gatlacatcc tattttataa gatcaacgct 6840 aaagaaaact tgacti>tcaa cccaaacgtc aatsaagtta gagacttcaa atgggtttca 6900 ccaaatgatt tgaaaactal gntgctgac ccaagttaca afittlacgcc Ugfitttaag 6960 attatttgcg agaattactt attcaactgg tgggagcaat tagatgacct ttctgaagtg 7020 gaaaatguca ggcaaauca tagaatgcta taacgacgcg tcctgcagct ggtaccatat 7080 g^gaattcga agctttctag aacgaaaact catctcagaa saggaLctga atagcgccgt 7140 cgaccatcat catcatcatc aiigagttta aacggictcc agcttggctg itUggcgga 7200 tgagngaaga 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ggcccagict ttcgactgag cclttcfittt talltgatgc ctggcagtEc 360 cctactctcg catggggaga ccccacacta ccatcggcgc tacggcgttt cacttctgag 420 ttcggcatgg ggtcaggtgg gaccaccgcg ctactgccgc caggcaaatt ctgttttatc 480 agaccgcttc tgcgitctga tttaatotgt atcaggctga aaatcttctc tcatccecca 540 aaacagccaa gctggagacc gtttaaactc aatgatgatg atgatgatgg tcgacggcgc 600 taltcagatc ctcttctgag aigagtlttt gttctafiaaa gcttcgaatt cccaiatggt 660 accagctgca gttatgccag ccaggccttg attttggctt ccataccagc ggcatcgagg 720 ccgasttcgg qgcgcalttc ttcctgagU ccUgcggaa laaagaagtc cggcaggcca 780 atgttcagca cgggtactgg tttacgatgg gccatcagca cucgttcac gccgctgcct 840 gcgccgccca taatggcgtt ucttctacg gtgaccagcg cttcatggct ggcsgccatt 900 tccagaatta acgcttcatc aagcggtttc acaaaacgca tatcgaccag cgtggcgttc 960 agcgattcgg cgactttcgc cgcttctggc atcagcgtac caaagttaag gatcgccagt 1020 ttctcgccac gacgcUcac aatgccttlg ccaattggta gtttttccag cggcgtcagt 1080 tccacgccga ccgcgttgcc acgcgggtag cgcaccgctg acgggccatc gt tatagiga 1140 tagccggtat agagcatctg gcgacattcg ttttcatcgc tcggggtcat aatgaccatt 1200 tccggtatgc agcgcaggta agagagatca aaagcaccct Eaigggtttg accgtcagca 1260 ccaacaatgc ccgcgcggtc gaiggcgaac aggaccggaa gcttttgaat cgccacgtca 1320 tgcagcacct gatcataggc gcgttgcagg aaagtggagt aaatcgcgac aatgggtttg 1380 tacccaccaa tcgccagacc cgcaecaaag gtcaccgcgt gttgctcggc aattgccacg 1440 tcgaagtagc gatccgggaa tttacgtgaa aactcgacca tgccggaacc ttcacgcatc 1500 gccggagtaa icgccatcag cltgttgtct ttcgctgccB lUcgcacaa ccagtcgcca 1560 aagatttttg aatagctcgE caaaccgccg ctacttttcg gcaaacaacc gctggaggga 1620 tcaaatttag gcacggcgtg gaaagtgatc gggtcttttt ctgccgfittc ataaccacga 1680 cctttfttgg tcatgatatg caggaaclEC gggcclttca gEtcgcacat gttctttago 1740 gtggtgataa gccccagcac atcglgaccg tccaccgggc cgatgtagtt aaagcccagc 1S00

Icttcaaaca acgtgccagg cactaccatg cctttaatat gttcttcggt gcstttgagc I860 agctctttaa ttggcggcac gccagagaaa actiliucc ceccttcgcg cagtgaagag 1920 taaagcttac cggaaagcag clglgccaga tggttgttga gcgcgccgac attttcggaa 1980 atcgacattt caugtcgtt gagaatcacc agcatatcag gacfigatatc gcccgcgtga 2040 ttcatcgctt caaacgccat gcctgcggta atcgcgccat cgccaatgac acagacggtg 2100 cggcgaltti tgccttcttt Itcggcagca accgcaatac caattccggc actgatggag 2160 gttgatgaat gcccgacgct taatacgtca tattcgcttt cgccgcgcca cggeaacggg 2220 tgcagaccgc ctttctgacg gatggtgccg attttgtcgc ggcgtccggt caaaatttta 2280 tficggataag cclgatgccc cacatcccaa atcaaitggt caaacggggt gttgtagaca 2340 tagtgcagcg ccacggtcag ttcgaccgtg cccagcccgg aggcgaagtg cccgclggaa 2400 cggctcacgc tgtcgagtaa atagcggcgc agttcgtcgc agagltlcgg taaactctct 2460 ttcggcaaca gtcgtaactc ctgggtggag icgaccagtg ccagggtcgs gutttggca 2520 atatcaaaac tcatgttttt ttacctcctii agggcgaatg cagttagaca tacatcagct 2580 ggitaatcgg gaaagggtca atcagcagca gtttgatgcg gttttcagtc gcgtagtctg 2640 ggcgacccag accatcgcca uctggtagg tgcagtggga aacacgtgcc atgttaactg 2700 cgalttccat gaacgcltia ggcagcaggg tggagtcgct aacgcgttca cgattcatct 2760 ituccauc ggcgtcgatc agtttacgca gitctlcgcg ggcctgttcc tcgctggtac 2820 catcgttttc gtgcatgtag ctaaigatag aattggtagt ctcgccacgt tccagctccg 2880 ccgcagaggt ggccagatcg ttgcacaggc ggaagalaac gcagciagaa cgcaccagac 2940 catggaagtcigglcagggaa cgcagcgcgt ggtcggagat gtcrtcctgc tgctggcata 3000 cggaaaagta agacggcgcc agcagcgcta caccggagga ggaaacgctg gcgttttcca 3060 ggtacttgga gaaagccggg aiaatmgt tgttggacca ttlcgcclcl tgcagaaagg 3120 ctttgc2cag ttcacgccag cttttcgica gaiaggacag gltgttatga cctttctctt 3180 tcagaataga ataggacgtg tcgttaacgg 〖gttgtacag tgccaggaaa cacagtttca 3240 tatagtcceg cagggtgtta atagcgttaa cgtcccagcg ctctacagca tcggtgaaca 3300 22- 149048·序列表.doc 201111512

gtigcagttc gtccagagtg ccataaacgt catacacgcc atcgatgatc gtcaccagac 3360 caaacatttt agtaacagct ttgcgacatt caccaaactg cgggtctggc gccataccca 3420 gigcccagaa ataaacttcc atcaggcggt cgcgEacaaa atccagtttg clagccaggc 3480 ccatctcggt ccaccagcgg gacagatctt gcagctcttt ctggrgcagg gtctgtacca 3540 tgttaaaatc cagcttcgcc agctccagca gcagctggtg atgcggttci ttcggttcgt 3600 amatccag gaaccaacgt gcctccagac ggtgcagacg ctggtgatat ggcagucca 3660 gggcgtggct cacttgnci gcaaccttgg tattaatgcc ttctttcagg ttgttcitca 3720 ggigSfitgat ggaaaaggta cgcgcctcct ccagcaggtt ctcacccicg aaacccaggt. 3780 aagacgcttc atacaggcic ugcaggccU ggacglcacc tttcagttca ccgctgaaac >840 caccucut aiccugaaa cgcicaaaaa catcctgaga aacctcgaaa ccgtgctgac 3900 gcagcagacg gaaagacaga gcggttgcgt gcagglcaga tugttcttt ttgttttcgt 3960 ccagcagtac gatgmtcc agggctttaa tgatgtctlt ttcaaatttg taggtcagac 4020 ccaggcgctg cacatcgtcg atcagctcca gcagggacag cggctgggtg tctacacggt 4080 tgatcatgca gcgaacttct tcctccagtt tggtcgcttl ctcctccagc ttttccactt 4140 tcaggtcgu ctccagggat tgcaggaatt cgaaattcca caggttiggc tgatagtttg 4200 cggaacgacg ggaattatgc tcggtaatct gagtaaatte agaagaugtc gcacacatgg 4260 tttattcctc cttatttaat cgatacatta atatatacct cxttaatttt taataataaa 4320 gttaatcgat aattccggtc gagtgcccac acagatvgic tgataaattg ttaaagagca 43S0 gtgccgcttc gcttttictc agcggcgcig utcctgtgi gaaattEUa tccgctcaca 4440 attccacaca ttatacgagc cggatgatta attgtcaaca gctcatttca gaatctggcg 4500 taatagcgaa gaggcccgca ccgatcgccc ttcccaacag tigcgcagcc tgaatggcga 4560 atggcgcctg atgcggtait ttctccttac gcatctgtgc ggtatttcac accgcatatg 4620 gtgcactctc agtacaatct gctctgalgc cgcatagua agccagcccc gacacccgcc 4680 aacacccgct gacgagctta giaaagccct cgctagattt taatgcggat gttgcgatta 4740 cttcgccaac taltgcgata acaagaaaaa gccagccttt catgatatat ctcccaattl 4800 gtgtagggct lattatgcac gcttaaaaat aataaaagca gacttgacct gatagittgg 4860 ctgtgagcaa ttatgtgctt agtgcatcta acgcttgagt taagccgcgc cgcgaagcgg 4920 cgtcggcttg aacgaattgt tagacattat ttEccgacta ccttggtgat ctcgcctttc 4980 acgtagtgga caaallcitc caactgatct gcgcgcgagg ccaagcgatc ttcttctigl 5040 ccaagataag cctgictagc ttcaagtatg acgggctgat actgggccgg caggcectcc 5100 attgcccagt cggcagcgac atccttcggc gcgaitttgc cggttactgc gctgtaccaa 5160 atgcgggaca acgiaagcac lacattlcgc icatcgccag cccagtcggg cggcgagttc 5220 catagcgtta aggtttcatt tagcgcctca aatagatcct gucaggaac cggatcaaag 5280 agltcctccg ccgctggacc taccaaggca acgciatgtt ctcttgcttt tgtcagcaag 5340 aiagccagat caatgtcgat cgtggctggc 〖cgaagatac ctgcaagaat gtcattgcgc 4〇0 tgccaitctc caaattgcag ttcgcgctta gctggataac gccacggaat gatgtcgtcg 5460 tgcacaacaa tggtgactlc tacagcgcgg agaatctcEC tctctccagg ggaagccgaa 5520 gittccaaaa ggtcgttgat caaagctcgc cgcgitgttt catcaagcct tacggtcacc 5580 gtaaccagca aatcaatatc actgtgtggc ttcaggccgc catccacigc ggagccgtac 5640 aaatgtacgg ccagcaacgt cggttcgaga tggcgctcga tgacgccaac tacctctgat 5700 agttgagtcg atacitcggc gatcaccgct tccctcatga tgttlaactt tguttaggg 5760 cgactgccct gctgcgtaac aicgttgctg ctccataaca tcaaacatcg acccacggcg 5820 taacgcgcu gctgcttgga tgcccgaggc atagacigta ccccaaaaaa acagtcataa 5880 caagccatga aaaccgccac tgcgccgtta ccaccgctgc gUcggtcaa ggttctggac 5940 cagttgcgtg agcgcatacg ctactrgcat tacagcttac gaaccgaaca ggcttatgtc 6000 cactgggttc gtgccttcat ccgtttccac ggtgtgcgtc acccggcaac ctrgggcagc 6060 agcgaagtcg aggcatttct gtcctggctg gcgaacgagc gcaaggtttc ggtctccacg 6120 catcgtcagg cattggcggc cttgctgttc ttctacggca aggtgctgtg cacggatctg 6180 ccclggcuc aggagatcgg aagacctcgg ccgtcgcggc gcttgccggt ggtgctgacc 6240 ccggaigaag tggttcgcat cctcggttu ctggaasgcg agcatcgUt gttcgcccag 6300 cltctgtatg gaacgggcat gcggatcagt gagggtttgc aactgcgggt caaggatctg 6360 gatttcgatc acggcacgat catcgtgcgg gagggcaagg gctccaagga tcgggccttg 6420 atgttacccg agagcttggc acccagcctg cgcgagcagg ggaattaatt cccacgggtt 6480 ttgctgcccg c-aaacgggct guclgglgt tgctagtttg ttatcagaat cgcagatccg 6540 gcttcagccg gutgccggc tgaaagcgct atttcttcca gaattgccat gattttticc 6600 ccacgggagg cfitcactggc tcccgtgug tcggcagctt tgattcgata agcagcatcg 6660 cctgtttcag gctgtctatg tgtgactgtt gagctgtaac aagttgtctc agfitgttcaa 6720 tticatgttc tafittgctU ettttactgg titcacctgt tctattaggt gttacatgct 6780 gtlcatctgt tacattgtcg atctgttcat gglgaacagc tttgaatgca ccaaaaactc 6840 glaaaagctc igatgtatct atctttttta caccgtttu atctgtecat atggacagtt 6900 ttccctUga tatguacgg tgaacagttg 〖tctactttt gtitguagl cttgatgctt 6960 cactgaiaga tacaagagcc ataagaacct cagatccuc cgtatttagc cagutgttc 7020 tctagtgtgg ttcgttgttt ugcgtgagc catgagaacg aaccattgag atcatactta 7080 ctttgcatgt cactcaaaaa tutgcctca aaactggtga gctgaatttt tgcagttaaa 7140 gcatcgtgta gtgttttict tagtccgtta tgtaggtagg aatctgatgt aatggttgtt 7200 ggtalttigt caccattcat ttttatctgg ttgttctcaa gttcggttac gagatccatt 7260 tglct:atcta gttcaacttg gaaaatcaac gtatcagtcg ggcggcctcg cttatcaacc 7320 accaitttca tattgctgta agtgtttaaa tctUactta uggtttcaa aacccattgg 7380 ttaagccut taaactcatg giagttam tcaagcatta acatgaactt aaattcatca 7440 aggctaaict ctautttgc cltgtgagtt ttctiugtg 丨tagucttt taataaccac 7500 tcataaatcc tcatagagta tugttttca aaagacttaa catgttccag 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tgcgctcacg gctctggcag tgaatggggg (aaatggcac tacaggcgcc uttatggat 8460 tcatgcaagg aaactaccca taatacaaga aaagcccgtc acgggcttct cagggcgttt 8520 149048-序列表.doc 23- f*·. 5 201111512 tatggcgggt ctgctatgig gtgctatctg actttltECt gttcagcagt Icclgccctc 8580 igatmcca gtcigaccac itcggaitai cccgtgacag gtcaticaga ciggciaatg S640 cacccagtaa ggcagcggta tcatcaacag gctta 8675 <210> 29 <21t> 31 <212> m <213>人工序列 <220> <223>合成構築體 <400> 29 gacalcaatt gctccatttt cttctgctat c <210> 30 <21!> 41 <212> 腕 <213>人工序列 <220> <223>合成構築體 <400> 30 augagaaga 目£tcgcacac actctttacc ctctccmt a <2I0> 31 <211> 41 <212> m <2】3>人工序列 <220> <223>合成構築體 <400> 31 taaaaggaga gggeaaagag tgtgtgcgac ctcttctcaa t <210> 32 <211> 41 <212> DNA <213>人工序列 <220><223>合成構築體 <Ί00> 32 ccaaggccgg tutltliag acatacatca gciggltaat c <210> 33 <211> 41 <212> DNA<213>人工序列 <220> <223>合成構築體 <400> 33 galtaaccae ctgatgtatg tctaaaaaaa accggccttg g <210> 34 <211> 32 <212> DNA<213>人工序列 <220><2U>合成構築體 <400> 34 gacatgacgg atccgattac gaatgccgtc 1c <210> 35 <211> 31 <212> DNA<213>人工序列 <220><223>合成構築體 <400> 35 gacatcaatt gctccatttt cltcigclat c 31 41 41 41 41 32

<210> 36 <211> 27 <212> DNA人工序列 149048-序列表.doc 24- 31 27201111512

<220> <223>合成構築體 <400> 36 gacatgaat t cctccat 111 citcigc <210> 37 <2U> 20 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>合成構築體 <400> 37 aggagagggt aaagagtgag <210> 38 <211> 22 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>合成構築體 <4〇fe 38 cttttccatc acccacctga ag <210> 39 <211> 28 <212> DNA <213>人工序列 <220> 合成構築體 <400> 39 ggcgaaatgg tccaacaaca aaattatc 20 22 <210> 40 <21)> 51 <212> DNA <2]3>人工序列 <220><〇合成構築體 <400> 40 ggtgaattca gtctactggg gattcccaaa tctatatata ctgcaggtga c 51 <210> 4i <2U> 23 <212> DNA <213>人工序列

<220〉 <223>合成構築體

<400> 41 gcaggtggga aactatgcac tcc <210> 42 <211> 36 <212> DNA <2I3>人工序列 <220> <223>合成構築體 <400> 42 cctgaattct gitggattgg aggatrggat agtggg <210> 43 <21l> 30 <212> OiA <213>人工序列 <220> <223>合成構築體 <400> 43 ggtgtcgacg tacggtcgag cttattgacc <210> 44 <211> 32 <212> DNA 23 36 149048-序列表.doc 25- 30 201111512 <:213>人工序列 <220> <223>合成構築體 <400> 44 E£t£££cccg cattttgcca cctacaagcc ag 32

<210> 45 <21i> 40 <212> DNA u135·人工序列 <220> <223>合成構築體 <400> 45

Hgtgaatict agaggatccc aacgctgttg cctacaacgg 4〇 <210> 46 <211〉 36

<212> DNA <213>人工序列 <220> <223>合成構築體 <400> 46

Sgigcggccg ctgtctggac ctggtgagtt tccccg 36 <210> 47 <21i> 37

<212> DKA <213>人工序列 <220> <223>合成構築體 <400> 47 figtgggccca ttaaalcagt tatcgtttat ttgatag 37

<210> 48 <211> 35 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>合成構築體 <400> 48 ggtgaccagc aagtccatgg gtggttigat catgg 35

<210> 49 <21l> 35 <212> DNA <2l3>人工序列合成構築體 <400> 49 fifitgcgsccg cctttggagt acgactccaa clatg 35 <210> 50 <21i> 31 <212> cm <213>人工序列 <220> <223>合成構築體 <400> 50 £c£gccgcagiactaaattla tttcagtctc c 31 <210> 51 <211> 5356 <212> DNA <213>人工序列 =¾合成構築體 <400> 51 tctataatca cggcagaaaa gtccacattg attatttgca cggcglcaca ctttgctatg 60 ccatagcali tttatccata agattagcgg aicctacctg acgctittia tcgcaactct 120 ctaclgtttc tccalacccg tttimggg ctagcgaau cgagctcggt acccggggat 180 cctctagagt cgacctgcag gcatgcaagc ttggcrgttt tggcggatga gagaagattt 240 26-

149048-序列表.doc 201111512 tcagcctgat acagattaaa tcagaacgca gaagcggtct gataaaacag aatttgcctg 300 gcggcagtag cgcggtggtc ccacctgacc ccaigccgaa cicagaagtg aaacgccgca 360 gcgccgatgg taglgtgggg tctccccalg cgagaglagg gaactgccag gcaicaaata 420 aaacgaaagg ctcagtcgaa agacrgggcc tttcgtttta tctgngttt gtcggtgaac 480 gctctcctga giaggacaaa tccgccggga gcggatttga acgltgcgaa gcaacggccc 540 ggagggtggc gggcaggacg cccgccataa acigccaggc atcaaattaa gcagaaggcc 600 atcctgacgg atggccnti tgcgtucta caaactctu tgttumt tctaaataca 660 ttcaaatatg tatccgctca tgagacaata accctgataa atgcttcaat aatattgaaa 720 aaggaagagl atgagtattc aacatttccg tgtcgccctt attccctttt ttgcggcstt 780 ngccttccl gutitgctc acccagaaac gctggtgaaa glaaaagatg cigaagalca 840 gttgggtgca gcaaactatt aactggcgaa ctacttactc tagcttcccg gcaacaatta 900 atagaclgga tggaggcgga taaagttgca ggaccacltc tgcgctcggc ccttccggct 960 gsctggttta Ugctgataa atctggagcc ggtgagcgtg ggtctcgcgg tatcattgca 1020 gcsctgeggc cagatggtaa gccctcccgt atcgtagtta tctacacgac ggegagtcag 1080 gcaactatgg atgaacgaaa tagacagatc gctgagatag gtgcctcact gattaagcat 1140 tggtaactgt cagaccaagt ttactcatat atactttaga ttgatttacg cgccctgtag 1200 cggcgcaita agcgcggcgg gtgtggtggt tacgcgcagc glgaccgcta cacttgccag 1260 cgccctagcg cccgctcctt tcgctttctt cccttccttt ctcgccacgt tcgccggctt 1320 tccccgtcaa gctctaaatc gggggctccc utaggguc cgatttagtg ctttacggca 1380 cctcgacccc aaaaaacttg atttgggtga tggttcacgt agtgggccat cgccctgata 1440 gacggttttt cgccctttga cgttggagtc cacgttcttt aatagtggac tcttgttcca 1500 aacttgaaca acactcaacc ctatctcggg ctattctllt gattlataag ggattttgcc 1560 gatttcggcc taitggttaa aaaatgagct galttaacaa aaatuaacg cgaattttaa 1620 caaaatatla acgtttacaa tttaaaagga tctaggtgaa gatccttttt gataatctca 1680 tgaccaaaat cccttaacgt gagttttcgE tccactgagc gtcagacccc glagaaaaga 1740 tcaaaggatc ttcttgagat ccEUEtttc tgcgcgtaat ctgctgcttg caaacaaaaa 1800 aaccaccgct accagcggtg gtttgtttgc cggatcaaga gctaccaact ctttltccga 1860

aggtaacigg cltcagcaga gcgcagatac caaatactgt ccttctagtg tagccgtagt 1920 taggccacca cttcaagaac tctgtagcac cgcctscala cctcgctcig ctaatcctgt 1980 taccagtcag gcatltgaga agcacacggt cacactgctt ccggtagtca ataaaccggt 2040 aaaccagcaa tagacataag cggctattta acgaccctgc cctgaaccga cgaccgggtc 2100 gaatttgctt tcgaatnci gccattcatc cgcttattat cacttattca ggcgtagcac 2160 caggcgltta agggcaccaa iaactgcclt aaaaaaaUa cgccccgccc tgccactcai 2220 cgcagtactg ttgtaattca ttaagcattc t.gccgacatg gaagccatca cagacggcat 2280 gatgaacctg aatcgccagc ggcatcagca ccttgtcgcc ttgcgtataa tatttgccca 2340 tggtgaaaac gggggcgaag aagttgtcca tauggccac gttiaaatca aaactggtga 2400 aactcaccca gggatiggct gagacgaaaa acatattctc aaiaaaccct ttagfigaaat 2460 aggccaggtt ttcaccgtaa cacgccacat cttgcgaata tatgtgtaga aactgccgga 2520 aatcgtcgig gtaltcactc cagagcgatg aaaacgtttc agtttgctca Eggaaaacgg 2580 tgtaacaagg gtgaacacta tcccatatca ccagctcacc &tctttcatt gccatacgga 2640 aticcggatg agcattcatc aggcgggcaa gaatgtgaat aaaggccgga taaaacttgt 2700 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149048-序列表.doc 201111512 gctatgccat agcattttta iccataagat tagcggatcc tacctgacgc ttlttatcgc 4620 aactctctac tglttctcca tacccgttti tttgggctag cgaattcgag ctcgguccc cccattctga aatgagctg! tgacaattaa icaiccggct cgtaiaatgt gtggaattgt 4740 gagcggataa caatttcaca caggaaacag cgccgctgag aaaaagcgaa gcggcactgc 4800 tctUaacaa tttatcagac aatctgtgtg ggcactcgac cggaaitatc gattaacttt 4860 attattaaaa attaaagagg tatatattaa tgtatcgatt aaataaggag gaataaacca 4920 tst£tgcgac ctcttctcaa tttactcaga Uaccgagca taattcccgt cgttccgcaa 4980 actatcagcc aaacctgtgg aatttcgaat tcctgcaatc cctggagaac Bacctgaaag 5040 tggaaaagct ggaggagaaa gcgaccaaac tggaggaaga agttcgctgc atgatcaacc 5100 gtgtagacac cca£ccgctg tccctgctgg agctgatcga cgatgtgcag cgcctgggtc 5160 tgacctacaa atttgaaaaa gacatcatia aagcccigga aaacatcgla ctgciggacg 5220 aaaacaaaaa gaacaaatct gacctgcacg caa'ccgctct gtclttccgt ctgctgcgtc 5280 agcacggttt cgaggtttct caggatgUt ttgagcgtu caaggataaa gaaggtggtt 5340

Ecagcggtga actgaaaggt gacgtccaag gcctgctgag cclgtatgaa gcgtcttacc 5400 igfigtucga figatgagaac ctgctggagg aggcgcgtac cttttccatc accc-acctga 5460 agaacaacct gaaagaaggc attaatacca aggttgcaga acaagtgagc cacgccctgg 5520 aactgccata tcaccagcgt ctgcaccgtc tggaggcacg ttggttcctg gataaatacg 5580 aaccgaaaga accgcatcac cagctgctgc tggagctggc gaagctggat tttaacatgg 5640 tacagaccct gcaccagaaa gagcigcaag atctgtcccg ciggtggacc gagatgggcc 5700 cggctagcaa actggatttt gtacgcgacc gcctgacgga agtuatttc tgggcactgg 5760 gtalggcgcc agacccgcag ttiggtgaac gtcgcaaagc tgttactaaa atgtttggtc 5820 tggtgacgat catcgatgac gtgtatgacg tttatggcac tctggacgaa ctEcaactgt 5880 tcaccgatgc tgtagagcgc tgggacgtta acgctattaa caccctgccg gactatatga 5940 aactgtgttt cctggcactg tacaacaccg ttaacgacac gtcctattct attctgaaag 6000 agaaaggtca taacaacctg tcctatctga cgaaaagctg gcgtgaactg tgcaaagcct 6060 ttctgcaaga ggcgaaatgg tccaacaaca aaattatccc ggctttctcc aagtacctgg 6120 aaaacgccag cglttccicc tccggtgtag cgctgctggc gccgtcttac ttttccgtat 6180

gccagcagca ggaagacatc tccgaccacg cgctgcgttc cctgaccgac ttccatggtc 6240 tggtgcgEtc tagctgcgtt atcttccgcc tgtgcaacga tctggccacc tctgcggcgg 6300 agctggaacg tggcgagact accaattcta tcattagcta catgcacgaa aacgatggta 6360 ccagcgagga acaggcccgc gaagaacigc gtaaactgat cgacgccgaa tggaaaaaga 6420 tgaalcgtga acgcgttagc gactccaccc tgctgcctaa agcgttcatg gaaatcgcag 6480 ttaacatggc acgigtttcc cactgcacct accagtatgg cgaiggtctg ggtcgcccag 6540 actacgcgac tgaaaaccgc atcaaactgc tgctgattga ccctttcccg attaaccagc 6600 tgatgtatgr ctaactgcag ggcatgcaag cttggctgit Uggcggatg agaeaagatt 6660

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Sgcggcagta gcgcggtagt cccacctgac cccatgccga actcagaagt gaaacgccgt 6780 agcgccualg gtagtgiggg gtctccccal gcgagagtag ggaactgcca ggcatcaaat 6840 aaaacgaaag gctcagtcga aagactgggc ctttcgttti atctgttgtt tgtcggtgaa 6900 cgctctcctg agtaggacaa atccgccsgg agcggatttg aacgttgcga agcaacggcc 6960 cggagggtgg cgggcaggac gcccgccata aactgccagg catcaaatta agcagaaggc 7020 catcctgacg gatggccttt ttgcgUtct acaaactctt ttgtttattt ttctaaatac 7080 attcaaatat gtatccgctc atgagacaat aaccctgata aatgcttcaa taatattgaa 7140 aaaggaagag ratgagtatt caacatttcc gtgtcgccct tattccctit tttgcggcat 7200 tttgccttcc tgtttttgct cacccagaaa cgctggtgaa agtaaaagat gctgaagatc 7260 agttgggtgc a 7271 <210> 53 <211> 7833 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>合成構築體 <400> 53 , gcaaactatt aactggcgaa ctactiactc tagcttcccg gcaacaatta atagactgga 60 tg&aggcgga taaagttgca ggaccacltc igcgclcggc ccttccggct ggctggttta 120 ttgctgataa atctggagcc ggtgagcgtg ggtctcgcgg tatcattgca gcactggggc 180 cagatggtaa gcccicccgt atcgtaglia tctacacgac ggggagtcag gcaactatgg 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glgcgctctc 2760 ctgltcctgc ctttcggttt accggtgtca ttccgctgtt atggccgcgt ttgtctcait 2820 ccacgcctga cactcagttc cgggtaggca gttcgctcca agctggactg tatgcacgaa 2880 ccccccgltc agtccgaccg ctgcgcctta tccggtaact atcgtcttga gtccaacccg 2940 gaaagacatg caaaagcacc actggcagca gccaciggta attgatttag aggagttagt 3000 cttgaagtca tgceccgglt aaggctaaac tgaaaggaca agttttggtg actgcgctcc 3060 tccaagccag uacctcggt tcaaagagtt ggtagctcae agaaccttce aaaaaccgcc 3120 ctgcaaggcg gttttttcgt tttcagagca agagattacg cgcagaccaa aacgatctca 3J80 agaagatcal cttattaatc agataaaata itlgctcatg agcccgaagt ggcgagcccg 3240 atcltcccca tcggtgatgt cggcgatata ggcgccagca accgcacctg tggceccggt 3300 galgccggcc acgatgcgtc cggcgtagag gatclgctca tgtttgacag cttatcaicg 3360 atgcataatg tgcctgtcaa atggacgaag cagggattct gcaaacccta tgctactccg 3420 tcaagccgtc aattgtctga ttcgttacca attatgacaa cttgacggct acatcattca 3480 cttttrcttc acaaccggca cggaactcgc tcgggctggc cccggtgcat UUtaaata 3540 cccgcgagaa atagagttga tcgtcaaaac caacattgcg accgacggtg gcgataggca 3占00 tccgggtggt gcicaaaagc agct tcgcct ggctgalacg ttggtcctcg cgccagctta 3660 agacgctaat ccctaactgc tggcggaaaa gatgtgacae acgcgacggc gacaagcaaa 3720 catgctgtgc g9cgctggcg atatcaaaat lgctglctgc caggtgatcg ctgatgtacl 3780 Eacaagccic gcgtacccga ttatccatcg gtggatggag cgaclcgtla atcgcttcca 3840 igcgccgcsg taacaatigc icaagcagat Uatcgccag cagclccgaa 〖agcgccctt 3900 ccccttgccc ggcgttaatg atttgcccaa acaggtcgct gaaatgcggc tggtgcgctt 3960 caiccegficg aaagaacccc gtattggcaa atattgacgg ccagttaagc cattcatgcc 4020 agtaggcgcg cggacgaaag taaacccact ggtgalacca ttcgcgaacc tccggatgac 4080 paccgtagtg atgaatctct cctggcggga acagcaaaat atcacccggt cggcaaacaa 4140 attctcgtcc ctgatttltc accaccccct gaccgcgaat ggtgagattg agaatataac 4200 ciucaitcc cagcggicgg icgataaaaa aatcgagala accgttgscc tcaatcggcg 4260 ttaaacccgc caccagatgg gcattaaacg agtatcccgg cagcagggga tcattttgcg 4320 cttcagccat acttttcata ctcccgccat tcagagaaga aaccaattgt ccatattgca 4380 tcagacatlg ccgtcactgc gtcmtact ggctcltctc gctaaccaaa ccggtaaccc 4440 cgcttattaa aagcattctg taacaaagcg ggaccaaagc catgacaaaa acgcgtaaca 4500 uaagtgtcta taatcacggc ag&aaagtcc acattgatta tttgcacggc gtcacacitt 4560 yctatgccat agcattuta tccauagat tagcggatcc lacctgacgc tttttatcgc 4620 aactctctac tgtltclcca 丨acccgtut ittgggctag cgaaticgag ctcggtaccc 4680 cccattctga aatgagctgt tgacaatlaa tcatccggct cgtataatgt gtggaattgt 4740 BBgcggataa caatttcaca caggaaacag cgccgctgag aaaaagcgaa gcggcactgc 4SOO tctttaacaa tttatcagac aatclglgtg ggcactcgac cggaattatc gattaacttt 4860 attattaaaa attaaagagg tatatattaa tgtatcgatt aaataaggag gaataaacca 4020 tstfitscgac ctcttctcaa tttactcafia ttaccgagca taattcccgt cgttccgcaa 49S0 actatcagcc aaacctfitgg aalttcgaat tcctgcaatc cctggagaac gacctgaaag 5040 tEgaaaagct ggaggagaaa gcgaccaaac tggaggaaga agtlcgctgc atgatcaacc 5100 gtgtagacac ccagccgctg iccctgctgg agctgatcga cgatgtgcag cgcctgggtc 5160 tgacctacaa atttgaaaaa gacatcatta aagccctgga aaacatcgta ctgctggacg 5220 aaaacaaaaa gaacaaatct gacctgcacg caaccgctct gtcttlccgt clgctgcgtc 5280 agcacggUt cgaggtttct caggatgttt ttgagcgt丨i caaggauaa gaaggiggtt 5340 tcagcggtga actgaaaggt gacgtccaag gcctgctgag cctgtatgaa gcgtcttacc 5400 tgggtttcga gfigteagaac ctgctggagg aggcgcgtac cttttccatc acccacciga 5460 agaacaycct gaaagaaggc attaatacca aggttgcaga acaagigagc cacgccctgg 5520 aactgccata tcaccagcgt ctgcaccgtc tggaggcacg ttggttcctg gataaatacg 5580 aaccgaaa£a accgcatcac cagctgctgc tggagctggc gaagctggat tttaacatgg 5640 tacagaccct gcaccagaaa gagctgcaag alctgtcccg ctggtggacc gagatgggcc 5700 tgectagcaa actggatttt gtacgcgacc gcctgatgga agtttatttc tgggcactgg 5760 gtatggcgcc ?gacccgcag tttggtgaat gtcgcaaagc tgttactaaa atgUtggtc 5820 tggtgacgat catcgatgac gtgtatgacg tttatggcac tctggacgaa ctgcaactgt 5880 tcaccgatgc tglagagcgc tgggacgtta acgctattaa caccctgccg gactatatga 5940 aactgtgttt cctggcactg tacaacaccg Uaacgacac gtcctattct attctgaaag 6000 agaaaggtca 〖aacaacctg tccutctga cgaaaagctg gcgtgaactg tgcaaagcct 6060 ttctgcaaga ggcgaaatgg iccaacaaca aaattatccc ggctttctcc aagtacctgg 6120 aaaacgccag cgtttcctcc iccggtgtag cgctgctggc gccgtcttac ttttccgtat 6180 gccagcagca ggaagacatc tccgaccacg cgctgcgttc cctgaccgac ttccatggtc 6240 tggtgcgtic tagctgcgtt atcttccgcc igtgcaacga tclggccacc tcigcggcgg 6300 agctggaacg tggcgagact accaattcta tcattagcta catgcacgaa aacgatggta 6360 ccagcgagga acaggcccgc gaagaactgc gtaaactgat cgacgccgaa tggaaaaaga 6420 tgaatcgtga acgcgttagc gactccaccc tfictgcctaa agcgttcatg gaaatcgcag 64S0 ttaacatggc acgtgtttcc cactgcacct acoagtatgg cgatggtctg ggtcgcccag 6540 actacgcgac tgaaaaccgc atcaaactgc igctgatiga ccclttcccg altaaccagc 6600 tgatgtatgt ctaactgcat actagtttca aga^gtattt cactcatggc tatcaciggc 6660 atctttttcg gcagcgacac cggtaatacc gaaaatatcg caaaaatgat tcaaaaacag 6720 cttggtaaag acgltgccga tgtccatgac attgcaaaaa gcagcaaaga agatctggaa 67S0 gcuatgaca ttctgctgct gggcaiccca acctggtatt acggcgaagc gcagtgtgac 6840 tgggatgact tcttcccgac tctcgaagag altgatttca acggcaaact ggttgcgctg 6900 ittggttgtg glgaccagga agattacgcc gaatatttct gcgacgcatt gg^caccaic 6960 30-

149048-序列表.doc 201111512 cgcgacatca ttgaaccgcg cggtgcaacc atcgttggtc actggccaac tgcgggctat 7020 catttcgaag catcaaaagg ictggcagat gacgaccac丨 ttgtcggl.cl ggctatcgac 7080 gaagaccgtc agccggaact gaccgctgaa cgigtagaaa aatgggttaa acagatuct 7140 gaagagttgc atctcgacga aattctcaat gcctgactgc agggcaigca agcttggctg 7200 ttttggcgga tgagagaaga ttttcagcct gatacagatt aaatcagaac gcagaagcgg 7260 tctgataaaa cagaatttgc ctggcggcag tagcgcggig gtcccacctg accccaigcc 7320 gaactcagaa gigaaacgcc gtagcgccga tggtagtgtg gggtcrcccc atgcgagagt 7380 agggaactgc caggcatcaa ataaaacgaa aggclcagtc gaaagactgg gcctttcgtt 7440 ttatctgttg ntgicggtg aacgctctcc tgagtaggac aaatccgccg ggagcggatt 7500 tgaacgttgc gaagcaacgg cccggagggt ggcgggcagg acgcccgcca taaactgcca 7560 ggcatcaaat t.aagcagaag gccaicciga cggaiggcct mtgcgttt ctacaaactc 7620 tu^gutat mtctaaat acaitcaaat atgtatccgc tcatgagaca ataaccctga 7680 taaatgcttc aataatattg aaaaaggaag agtatgagta ttcaacam ccgigtcgcc 7740 cttattccct tttttgcggc attttgcctt cctgtttttg ctcacccaga aacgctggtg 7800 aaagtaaaag atgctgaaga tcagttgggt yea 7833 <2!0> 54 <21ϊ> 36 <2!2> m <2里3>人工序列 <220> <223>合成構築體 <400> 54 ggatgcatac taetltcaag aggtatttca ctcatg 36

<210> 55 <21I> 30 <2i2> IM <2丨3>人工序列 <220> <223>合成構築體 <400> 55 atcctgcagt caggcattga gaatrtcgtc 30 <210> 56 <211> 6592 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>合成構築體 <400> 56 gaattgctcc anttcctct gctatcaaaa uacagacrc gtgattttcc aaaegagett 60 tcaaaaaagc cutgcccct tgcaaatcgg atgcctgtct aiaaaaitcc cgatattggt 120

taaacagcgg cgcaatggcg gccgcatctg atgtetuge ttggcgaatg ttcatcttat ISO ttcttcctcc ctctcaataa tttttrcatt ctatcccttt tctgtaaagt ttatttttca 240 gaatactttt atcaicatgc utgaaaaaa tatcacgata atatccattg ttctcacgga 300 agcacacgca ggtcatttga acgaattttc tcgacaggaa tttgccggga ctcaggagca 360 tttaacctaa aaaagcatga catttcagca taatgaacat ttactcatgt ctattttcgt 420 tcEtttctgt atgaaaatag Uatttcgag tetetaegga aatagegaga gatgatatac 480 ctaaatagag ataaaaccat ctcaaaaaaa teestctact aaaatattat tccatctatt 540 acaataaatt cacagaatag tcttttaagt aagtctactc tgaatttttt taaaaggaga 600 gggtaaagag igtgtgcgac ctcttctcaa tttactcaga ttaccgagca taattcccgt 660 cgUccgcaa actatcagcc aaaccrgtgg aatttcgaat tcctgcaatc cctggagaac 720 gacccgaaag iggaaaagct ggaggagaaa gcgaccaaac tggaggaaga agttcgctgc 7S0 aEgatcaacc gtgtagacac ccagccgctg tccctgctgg agetgatega cgatgtgcag 840 cgcctgggtc tgacctacaa atttgaaaaa gacatcatta aagccctgga aaacatcgia 900 cfgctggacg aaaacaaaaa gaacaaatct gacctgcacg caaccgctct gtcutccgt 960 ctgctgcgtc agcacggtti cgaggtttct caggatgttt ttgagcgttt caaggataaa 1020 gaaggtggtt icagcggtga actgaaaggt gacgcccaag gcctgctgag cctgtatgaa 1080 gcgtcrtacc tgggtttcga gggtgagaac ctgctggagg aggcgcgtac cttttccatc 1140 acccacctga agaacaacct gaaagaaggc attaatacca aggttgcaga acaagtgagc 1200 cacgccctgg aactgccata uaccagcgt ctgcaccgtc tggaggcacg UggUccig 1260 gataaatacg aaccgaaaga accgcatcac cagctgctgc tggagctggc gaagctggat 1320 maacatgg tacagaccct gcaccagaaa gagctgcaag arctgtcccg ctggtggacc 1380 gagatgggcc iggctagcaa actggatttt gtacgcgacc gcctgatgga agUtatttc 1440 tgggcactgg gtatggcgcc agacccgcag tttggEgaat gtcgcaaagc tgttactaaa 1500 atgtttggtc tggtgacgat catcgatgac gtfitalgacg tttatggcac tctggacgaa 1560 ctgcaactgt tcaccgatgc igtagagege tgggacgtta aegetattaa caccctgccg 1620 gactatatga aactgtgttt cctggcactg tacaacaccg ttaacgacac gtcctattct 1680 attctgaaag agaaaggtca taacaacctg tcctatctga c£aaaagclg gcgigaactg 1740 tgcaaagcct ttctgcaaga ggcgaaatgg tccaacaaca aaattatccc ggctttctcc 1800 aagiaccigg aaaacgccag cgtttcetcc tccggtgtag cgctgctggc gccgtctlac 1860 ttticcgtat gccagcagca ggaagacatc tccgaccacg cgctgcgttc cctgaccgac 1920 ttccatggtc lEEtgcgltc tagctgcgtt aicltccgcc tgige-aaega tctggccacc 1980 ictgcggcgg ageiggaaeg tggcgagact accaattcta tcattagcta catgcacgaa 2040 aacgatggta ccagcgagga acaggcccgc gaagaactgc gtaaacigat cgacgccgaa 2100 lggaaaaaga tgaatcgtga aegegttage gactccaccc tgctgcctaa agcgucatg 2160 gaaatCBcag ttaacalggc acgtgtttcc cactgcacct accagtaigg cgatggtctg 2220 ggtcgcccag aclacgcgac tgaaaaccgc atcaaactgc tgctgattga ccctUcccg 22S0 •31 · 149048-序列表.doc 201111512 attaaccagc tgatgtatgt ctaaaaaaaa ccggccttgg ccccgccggt tuttattai 2340 Itttcltcct ccgcatgttc aatccgctcc ataatcgacg gatggctccc tctgaaaatt 2400 ttaacgagaa acggcgggtt gacccggctc agtcccgtaa cggccaagtc ctgaaacgtc 2460 tcaatcgccg cttcccggU tccggtcagc tcaatgccgt aacggtcggc ggcgttttcc 2520 tgataccggg agacggcatt cgtaatcgga tcctctagag tcgacctgca ggcatgcaag 2580 ctttgcctcg cpcgtttcgg tgatgacggt gaaaacctct gacacatgca gctcccggag 2640 acggtcacag cttgtctgta agcggatgcc gggagcagac aagcccgtca gggcgcgtca 2700 ncmtgttg gcgggtfitcg gggcgcagcc atgacccagt cacgtagcga tagcgaagtg 2760 tatactggct taactatgcg gcatcagagc agattgtact gagagtgcac catatgcggt 2820 p.tgaaatacc gcacagatgc gtaaggagaa aataccgcat caggcgctct tccgcttcct 2880 cgctcactga ctcfictgcgc tcggtcgttc gEdgcggcg agcggtatca gctcactcaa 2940 nggcggtaat acggttatcc acagaatcag gggataacgc aggaaagaac atgtgagcaa 3000 aaggccagca aaaggccagg aaccgtaaaa aggccscgtt gctggcgttt ttccataggc 3060 tccgcccccc tgacgagcat cacaaaaatc gacgctcaag tcagaggtgg cgaaacccga 3120 caggactata aagataccag gcgtucccc ccggaagctc cctcgtgcgc tctcctgttc 3180 cgaccctgcc gettaccgga tacctgtccg cclttctccc ttcgggaagc gtggcgcttt 3240 ctcaatgccc acgctgtagg tatclcagit CEStgtaggt cgttcgctcc aagcigggct 3300 gtgtficacga accccccgtt cagcccgaco gctgcgcctt atccggtaac EategteUg 3360 agtccaaccc ggtaagacac gaettatege cactggcagc agccactggi aacaggatta 3420 gcagagcgag gtatgtaggc ggtgctacag agttcttgaa stggtggcct aactacggct 3480 acactagaag gacafitattt ggtatctgcg ctctgctgaa gccagttacc ttcggaaaaa 3540 gagtlggtaE ctcttgatcc ggcaaacaaa ccaccgctgs tagcggtggt ttttttgttt 3600 gcaagcagca gattaegege agaaaaaaag gatctcaaga agatcctttg atcttttcta 3660 cggggtctga Ggctcagtgg aacgaaaact cacgttaagg gattttggtc atgagattat 3720 caaaaaggat egaagteggt tcagaaaaag aag^atatgg atctggagct staaiataaa 3780 aaccttcttc aactaacggg gcaggttagt gacattagaa aaccgactgt aaaaagtaca 3840 gteggeatu tctcatatta taaaagccag teattaggee tatctgacaa ttcctgaata 3900 gagttcalaa acaalcctgc atgataacca tcacaaacag aatgatgtac ctgtaaagat 3960 agcggtaaat atattgaatt acctttatta atgaatutc ctgctgtaat aatgggtaga 4020 aggtaaltac tattattatt gatatltaag ttaaacccag taaatgaagt ccalggaata 4080 atagaaagag aaaaagcatt ttcaggtata ggtgUttgg gaaacaattt aaaagaacca 4140 ttatatttct ctacatcaga aaggtataaa tcataaaaci ctttgaagtc attctttaca 4200 ggagiccaaa laccagagaa tgltnagat acaccatcaa aaattgtala aagtsgctct 4260 aacitatccc aataacctaa ctctccgtcg ctattgtaac cagttctaaa agctgtattt 4320 gagtttatca cccttgtcac taagaaaata aatBcaegiit aaaatttata tccttcttgi 43S0 tttatglttc ggtataaaac actaatatca atttctgtgg Uatactaaa agtcgtttgt 4440 tggttcaaat aatgattaaa tatctcltu ctcttccaat tgtctaaatc aattttatta 4500 aagttcattt galatgcctc ctaaattttt atctaaagtg aatttaggag gettaettgt 4560 ctgctttcu cattagaatc aatccUttt taaagtcaat attactgtaa cataaatata 4620 tattttaaaa atatcccact ttatccaatt ttcgtttgtt gaactaatgg gtgetttagt 46S0 tgaagaataa agaccacait aaaaaatgtg gtcttttgtg utttttaaa ggatttgagc 4740 gtacgcgaaa aatccttttc tttctttctt atettgataa taagggtaac tattgeeggt 4800 tgtccattca tggctgaact ctgcttcctc tgttgacatg acacacatca tcicaatatc 4860 egaataggge cca【cagtct gacgaccaag agagccataa acaccaatag ccttaacatc 4920 atccccatat ttatccaata ttcgUccti aatttcatga acaatcttca ttctttcttc 4980 tetagteatt attattggtc cattcactat tctcattccc ttttcagata attttagatt 5040 tgcttttcta aataagaaia tttggagagc accgttctta ttcagctait aataactcgt 5100 cttcctaagc atccUcaat cctttiaata acaattatag catctaatct tcaacaaact 5160 ggcccgt t Ig t tgaactaci ct ttaaraaa ataauutc cgttcccaat iccacatigc 5220 aataatagaa aatccatctt catcggcttt ttegteatea tctgtatgaa tcaaatcgcc 5280 ttcttctgtg tcatcaaggt ttaattttti atgtatttct tttaacaaac caccatagga 5340 gattaacctt ttacfifitgta aaccttcctc caaatcagac aaacgtttca aaUemte 5400 ttcatcaicg gtcataaaat ccgtatcctt tacaggatat Htgcagttt cgtcaattgc 5460 egattgtata teegatuat atttattttt eggtegaate aUtgaaclt ttacalttgg 5520 atcatagict aalttcaitg cctttttcca aaattgaatc cattgttttt gattcacgia 5580 gttttctgtt attctaaaat aagttggttc cacacatacc attacatgca tgtgctgatt 5640 ataagaaita tetttaitat itatrgtcac atccgttgca cgcataaaac caacaagatt 5700 tttattaatt tttttaiatt gcatcattcg gcgaaatcct igagecatat ctgtcaaact 5760 cttatttaat tcttcgccat cataaacatt tttaactgtt aatgtgagaa acaaccaacg 5S20 aactgttggc ttttgtttaa taacttcagc aacaaccttt tgigactgaa tgccatgttt 5880 cattgctctc ctccagttgc acatiggaca aagcctggat itgcaaaacc acacrcgata 5940 ccactcrctt tcgcctgttt cacgattttg tttatactct aatatttcag cacaatcm 6000 tactctttca gcctttuaa attcaagaar atgeagaagt tcaaagtaat caacatiagc 6060 gattttcttt tctctccatg gictcacttt tccacitttt gtcttgtcca ctaaaaccct 6120 tgatttttca tctgaataaa tgctactait aggacacata atattaaaag aaacccccat 6180 ctatttagtt atttgttlag teaettataa cittaacaga tggggttttt ctgtgcaacc 6240 aattttaagg gltttcaata clttaaaaca catacatacc aacacttcaa cgcaccttic 6300 agcaactaaa ataaaaatga esttatttet aUtgtatca agataagaaa gaacaagttc 6360 aaaaccatca aaaaaagaca ccuttcagg igcttttttt attttataaa cleattccct 6420 gatctcgact tcgttcutt tilacctctc ggttatgagt tagtlcaaat legttetut 6480 laggttctaa atcgtgtttt tettggaatt gigctgtttt atcctttacc ttgictacaa 6540 accccttaaa aacgttttta aaggctttta agccgtctgt acgttcctta ag 6592 <210> 57 <211> 176 <212> DNA <213>人工序列 <220> 合成構築體 <220> <221> misc.feature <222> 144

<223>n = A、T、C*G 32-

149048·序列表.doc 201111512 <400> 57 ctctcittcg gcaacagtcg taactcclgjg gtggagtcga ccagtgccag ggtcgggtat 60 ttggcaatat caaaactcat atattccacc agctatttgt tagtgaataa aagtggttga 120 attatttgct caggatgtgg catngtcaag ggctaatacg acicactata gggctc 176 <2I0> 58 <211> 103 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>合成構築體 <400> 5S tcgataccic ggcactggaa ecgctagcgg actacaicat ccagcgtaat aaataaacaa 60 taagtattaa taggcccctg aattaaccct cactaaaggg egg 103 <210> 59 <211> 22 <212> DNA <213>人工序列

<223>合成構築體 <400> 59 ttgiagacat agtgcagcgc ca 22 <210> 60 <211> 24 <212> m <213>人工序列 <220> <W3>合成構築體 <400> 60 aaagaccgac caagcgacgt ctga 24 <210> 61 <211> 36 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>合成構築體 <400> 61 gctgggtacc ctgcccgctt tccagtcggg aaacct 36

<210> 62 <211> 36 <212> DNA <”3>人工序列 <220> <&>合成構築體 <400> 62 tagaactagt caaaaaaccc ctcaagaccc gtttag <210> 63 <211> 17 <212> DNA <213〉人工序列 <220> <223>合成構築體 <400> 63 giaaaacgac ggccagt <210> 64 <21!> 22 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>合成構築體 <400> 64 gcactgut丨 tccgtctgct gc <210> 65 <211> 20 <212> DNA 36 17 149048-序列表.doc 33- 22 20201111512 <213>人工序列合成構築體 <4〇0> 65 ctcgtacagg ctcaggatag <210> 66 <211> 20 <2i2> DNA <213>人工序列 <220> <223>合成構築體 <400> 66 ttacgtccca acgctcaact <210> 67 <211> 36 <2I2> m <2n>人工序列 <220><22>合成構築體 <400> 67 gctgggtacc ctgcccgctt tccaglcggg aaacct <210> 68 <211> 36 <212> K^JA <213>人工序列 <220> <223>合成構築體 <400> 68 tagaaciagt caaaaaaccc ctcaagaccc gttiag <210> 69 <211> 17 <212> m <213>人工序列 <220> <223>合成構築體 <400> 69 glaaaacgac ggccagt <210> 70 <211> 22 <2I.2> m <213>人工序列 <220> <223>合成構築體 <400> 70 gcactgtctt tccfiictgct gc <2I0> 71 <211> 20 <212> DNA <213>人工序列 <220><223>合成構築體 <400> 71 ctcgtacagg ctcaggalag <2I0> 72 <211> 20 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>合成構築體 <400> 72 uacgtccca acgctcaact <210> 73 <2ll> S069 20 36 36 17 22 20

149048-序列表.doc 34- 20 201111512 <23 2> IM <213>人工序列 <220> <〇合成構築體 <400> 73 accttcggga gcgcctgaag cccgttctgg acgccctggg gccgttgaat cgggatatgc 60 aggccaaggc cgccgcgaic alcaaggccg tgggcgaaaa gctgctgacg gaacagcggg 120 aagtccagcg ccagaaacag gcccagcgcc agcaggaacg cgggcgcgca catttccccg 180 aaaagtgcca cctggcggcg ttglgacaat lUccgaaca actccgcggc cgggaagccg 240 atcicggctt gaacgaattg Uaggtggcg gtacttgggt cgatatcaaa gtgcatcact 300 tcUcccgta tgcccaactt tgtatagaga gccactgcgg galcgtcacc gtaatctgct 360 tgcacgtaga tcacataagc accaagcgcg ttggcctcat gcUgaggag attgatgagc 420 gcggtggcaa tgccctgcct ccggtgctcg ccggagactg cgagatcata gatatagatc 480 tcactacgcg gctgctcaaa cctgggcaga acgtaagccg cgagagcgcc aacaaccgct 540 tcttggtcga aggcagcaag cgcgatgaat gtcttactac ggagcaagtt cccgsggtaa 600 tcggaglccg gclgatgttg ggagtagglg gctacgtctc cgaactcacg accgaaaaga 660 tcaagagcag cccgcatgga tttgacttgg tcagggccga gcctacatgt gcgaatgatg 720 cccatacttg agccacctaa ctttgtttta gggcgactgc cctgctgcgt aacatcgttg 780 ctgctgcgta acatcgttgc tgctccataa catcaaacal cgacccacgg cgtaacgcgc 840 ttgctgctig gatgcccgag gcatagactg tacaaaaaaa cagtcataac aagccargaa 900 aaccgccact gcgccgttac caccgctgcg ucggtcaag gttctggacc agttgcgtga 960 gcgcatacgc tacttgcait acagtttacg aaccgaacag gcttatgtca actgggttcg 1020 tgccttcaic cgtrtccacg gtgtgcgtcc aigggcaaat attatacgca aggcgacaag 1080 gtgctgargc cgctggcgat tcaggttcat catgccgttt gtgatggctt ccatgtcggc 1140 agaatgctta atgaattaca acagttttta tgcatgcgcc caatacgcaa accgcctctc 1200 cccgcgcgtt ggccgattca ttaatgcagc tggcacgaca ggtttcccga ctggaaagcg 1260

ggcagtgagc gcaacgcaat taatgtgagt tagctcacic attaggcacc ccaggcttta 1320 cactttatgc ttccggctcg tatgttgtgt ggaattgtga gcggataaca atttcacaca 1380 ggaaacagct atgaccatga ttacgccaag cgcgcaatta accctcacta aagggaacaa 1440 aagctgggta ccctgcccgc tttccagtcg ggaaacctgt cgtgccagct gcaitaaiga 1500 atcggccaac gcgcggggag aggcggtttg cgtattgggc gccagggtgg tttttctttt 1560 caccagtgag acafigcaaca gctgattgcc cttcaccgcc tggccctgag agagttgcag 1620 caagcggtcc acgctggttt gccccagcag gcgaaaatcc tgtttgatgg tggtcaacgg 1680 cgggatataa catgagctgt cttcggtatc gtcgtatccc actaccgaga tatccgcacc 1740 aacgcgcagc ccggacicgg uatggcgcg cattgcgccc agcgccatci gatcgttggc 1800 aaccagcatc gcagtgggaa cgatgccctc attcagcatt tgcatggttt gttgaaaacc i860 ggacatggca ctccagtcgc cttcccgttc cgctatcggc tgaatttgat tgcgagtgag 1920 atatttatgc cagccagcca gacgcagacg cgccgagaca gaacttaatg ggcccgctaa 1980 cagcgcgatt tgctggtgac ccaatgcgac cagatgctcc acgcccagtc gcgiaccgtc 2040 ttcargggag aaaataatac tgttgatggg tgtctggtca gagacatcaa gaaataacgc 2100 cggaacatta gtgcaggcag cttccacagc aatggcatcc tggtcatcca ecggatagtt 2160 aatgatcagc ccactgacgc gtlgcgcgag aagattgtgc accgccgctt tacaggcttc 2220 gacgccgcit cgitctacca tcgacaccac cacgctggca cccagttgat cggcgcgaga 2280 tttaatcgcc gcgacaattt gcgacggcgc gtgcagggcc agactgga^g tggcaacgcc 2340 aatcagcaac gactgtttgc ccgccagttg ttgtgccacg cggttgggaa tgtaaticag 2400 ctccgccatc gccgcttcca cttittcccg cgttttcgca gaaacgtggc tggcctggit 2460 caccacgcgg gaaacggtct gataagagac accggcatac tctgcgacat cgtataacgt 2520 tactggtttc acattcacca ccctgaattg acLctcllcc gggcgclatc algccatacc 2580 gcgaaaggtt ttgcgccatt cgatggtgtc cgggatctcg acgctctccc ttatgcgact 2640 ccEgcatiag gaagcagccc agtagtaggt tgaggccgtt gagcaccgcc gccgcaagga 2700 atggtgcatg caaggagatg gcgcccaaca gtcccccggc cac-ggggcct gccaccatac 2760 ccacgccgaa acaagcgctc atgagcccga agtggcgagc ccgatcitcc ccaicggtga 2S20 tgtcggcgat ataggcgcca gcaaccgcac ctgtggcgcc ggtgatgccg gccacgaigc 2880 gtccggcgta gaggatcgag atctcgaicc cgcgaaalta atacgactca ctatagggga 2940 attgtgagcg gataacaatt cccctciaga aatoattttg tttaacUta agaaggagat 3000 atacatatgg aagctcgtcg ttctgcgaac tacgaaccia acagctgg^a ctatgatlac 3060 ctgctgtcct ccgacacgga cgagtccatc gaagiataca aagacaaagc gaaaaagcig 3120 gaagccgaag ttcgtcgcga gattaataac gaaaaagcag aatttctgac cctgciggaa 3180 ctgattgaca acgtccagcg cctg'ggcctg ggttaccgtt tcgagtct^a tatccgtggt 3240 gcgctggatc gcttcgttlc ctccggcggc ucgatgcgg taaccaagac ttccctgcac 3300

Egtacggcac tgtctttccg tctgcrgcgt caacacggtt Ugaggtttc tcaggaagcg 3360 itcagcggct tcaaagacca aaacggcaac ttcctggaga acctgaagga agatatcaaa 3420

gctatcctga gcctgtacga ggccagcttc ctggctctgg aaggcgaaaa catcctggac 34SO gaggcgaagg ttttcgcaat ctctcatctg aaagai^ctgt ctgaagaaaa gatcggiaaa 3540 gagctggcag aacaggtgaa ccatgcactg gaactgccac tgcatcgccg tactcagcgt 3600 ctggaagcag tatggtctai cgaggcctac cgtaaaaagg aggacgcgaa tcaggttctg 3660 ctggagctgg caattctgga ttacaacatg atccagtctg lataccagcg tgatctgcgt 3720 gaa2cgtccc gttggtggcg tcgtgtgggt ctggcgacca aactgcactt tgctcgtgac 3780 cgcctgattg agagcttcta ctgggccgtg ggtgtagcat tcgaaccgca atactccfiac 3S40 tgccgtaact ccgtcgcaaa aatgtttrct ttcgtaacca uatcgacga tat'ctacgat 3900 gtatacggca ccctggacga actggagctg tttactgatg cagttgagcg ttgggacgta 3960 aacgccatca acgacctgcc ggattacatg aaactgtgct ttctggctqt gtataacact 4020 attaacgaaa tcgcctacga caacctgaaa gataaaggtg agaacatcct gccgtatcig 4080 accaaagcct gggctgacct gtgcaacgct ttcctgcaag aagccaagtg gctgtacaac 4140 aaatctactc cgacctUga cgactacttc ggcaacgcat ggaaatcctc ttctggcccg 4200 ctgcaactgg tgtlcgctta cttcgctgtc gtgcagaaca ttaaaaagga agagatcgaa 4260 aacctgcaaa aataccatga caccatctct cgtccttccc atatcttccg tctgtgcaat 4320 gacctggcta gcgcgtctgc ggaaattgcg cgtggtgaaa ccgcaaatag cgtttctlgt 4380 tacatgcgca ctaaaggtat ctccgaagaa ctggctaccg aaagcgtgat gaatctgatc 4440 gatgaaacct ggaaaaagat gaacaaggaa aaactgggtg gtagcctgtt cgcgaaaccg 4500 ttcgtggaaa ccgcgatcaa cctggcacgt c3atctcact gcacttatca taacggcgac 4560 gcgcatacct ctccggatga gctgacccgc aaacgcgttc tgtctgtaat cactgaaccg 4620 attctgccgt ttgaacgcta aggatccgaa ticgagctcc glcgacaagc ttgcggccgc 4680 actcgagcac caccaccacc accactgaga tccggctgct aacaaagccc gaaaggaagc 4740 tgagttggct gctgccaccg ctgagcaata actagcataa ccccttg&gg cctctaaacg 4800 -35 - 149048-序列表.doc 201111512 ggtcttgagg ggttitttga ctagttctag agcggccgcc accgcggtgg agctccaatt 4860 cgccctatag tgqgtcgtat tacgcgcgct cactggccgt cgttttacaa cgtcg【gac〖 4920 gggaaaaccc tggcgttacc caacttaatc gccttgcagc acatccccct ttcgccagct 4980 ggcgtaatag cgaagaggcc cgcaccgatc gcccttccca acagttgcgc agccigaatg 5040 gcgaatggaa att£taagcg itaatatttt gtraaaattc gcgttaaatt tttgitaaat 5100 cagctcattt iitaaccaat aggccgactg cgatgagtgg cagggcgggg cgtaatttu 5160 ttaaggcagt tattggtgcc cttaaacgcc tggtgctacg ccigaaiaag Igataataag 5220 cggatgaatg gcagaaauc gaaagcaaat tcgacccggt cgtcggttca gggcagggtc 5280 gttaaatagc cgcttatgtc tattgctggt ttaccggttt attgactacc ggaaficagtg 5340 tgaccgtgtg cuctcaaat gcclgaggcc agtttgctca ggctctcccc gtggaggtaa 5400 taattgacga ta^gatcatl tattctgccr cccagagcct gataaaaacg gtgaaiccgt 5460 tagcgaggtg ccgccggctt ccattcaggt cgaggtggcc cggctccatg caccgcgacg 5520 caacgcgggg aggcagacaa ggtaragggc ggcgaggcgg ctacagccga tagtctggaa 5580 cagcgcactt acgggt tgct gcgcaaccca agtgctaccg gcgcggcagc gtgacccgtg 5640 tcggcggctc caicggctcg ccatcgtcca gaaaacacgg ctcatcgggc atcggcaggc 5700 gctgclgccc gcECCgttcc cattcctccg tttcggtcaa ggctggcagg tctggttcca 5760 tgcccggaat gccgggctgg ctgggcggct cctcgccggg gccggtcggt agttgctgci 5820 cgcccggata cagggtcggg algcggcgca ggtcgccatg ccccaacagc gattc£icct 5880 gntcgtcgtg atcaaccacc acggcggcac tgaacaccga caggcgcaac tggtcgcggg 5940 gctggcccca cgccacgcgg tcattgacca cgtaggccga cacggtgccg gggccgttga 6000 gcttcacgac ggagatccag cgctcggcca ccaagtcctt gactgcgtat tggaccgtcc 6060 gcaaagaacg tccgatgagc ttggaaagtg tcttctggct gaccaccacg gc&ttctggt 6120 gncccatciE cgccacgags tgalgcagca gcattgccgc cgtgggtttc ctcgcaataa 6180 gcccggccca cgcctcatgc gctttgcgtl ccgtttgcac ccagtgaccg ggcttgtici 6240 tfigcttgaat gccfiatttcl ctggactgcg tggccatgct tatctccatg cggtagggtg 6300 ccgcacgett ficggcaccat gcgcaatcag ctgcaacttt tcggcagcgc gacaacaatt 6360 atgcgtlgcg taaaagtggc agtcaattac agatutclt taacctacgc aalgagctai 6420 tRCggggggt gccgcaatga gctgltgcg丨 accccccttt tttaagilgt tgatttttaa 6480 gtcttlcgca tttcgcccta taLctagttc tttggtgccc aaagaagggc acccctgcgg 6540 ggttccccca cgccttcggc gcggctcccc ctccggcaaa aagtggcccc tccggggcit 6600 gttgatcgac tgcgcggcct tcggccttgc ccaaggtggc gctgccccct tggaaccccc 6660 gcactcgccg ccgtgaggc丨 cggggggcag gcgggcgggc ttcgccttcg aclgccccca 6720 clcgcatagg ctlgggtcgt tccaggcgcg tcaaggccaa gccgctgcgc gglcgctgcg 6780 cgagccttga cccgccttcc acttggtgtc caaccggcaa gcgaagcgcg caggccgcag 6840 gccggaggct tUccccaga Eaaaattaaa aaaattgatg gggcaaggcc gcaggccgcg 6900 cagttggagc cggtgggtat gtggtcgaag gctgEstagc cggtggscaa tccctgtggt 6960 caagctcgtg ggcaggcgca gcctgtccat cagcttgtcc agcagggttg tccacgggcc 7020 gagcgaagcg agccagccgfi tggccgctcg cfigccatcgt ccacatatcc acgggctggc 7080 aagggagcgc agcgaccgcg cagggcgaag cccggagagc aagcccgtag ggcgccgcag 7140 ccgccgtagg cgglcacgac 〖itgcgaagc aaagtctagt gagtatactc aagcattgag 7200 Iggcccgccg gaggcaccgc cttgcgclgc ccccgtcgag ccggttggac accaaaaggg 7260 agggscaggc atggcggcal acgcgatcat gcgatgcaag aagctggcga aaatgggcaa 7320 cgtggcggcc agtctcaagc acgcctaccg cgagcgcgag acgcccaacg ctgacgccag 7380 caggacgcca 抑gaacgagc actgggcggc cagcagcacc gatgaagcga tgggccgact 7440 ^cgcfiagttfi cigccagaga agcgscgcaa ggacgctgtg ttggcsgtcg agtacgtcat 7500 pacggccagc ccggaatggt ggaagtcggc cagccaagaa cagcaggcgg cgttcitcga 7560 faaggcgcac aagtggctgg cggacaagta cggggcggat cgcatcgtga cggccagcat 7620 ccaccgtgac gaaaccagcc cgcacalgac cgcgltcglg stgccgatga cgcaggacgg 7680 caggctgtcg gccaaggagt tcatcggcaa caaagcgcag atgacccgcg accagaccac 7740 ftttgcggcc gctgiggccg atciagggct gcaacggggc atcgagggca gcaaggcacg 7800 icacacgcgc attcaggcgt tctacgaggc cctEgagcgg ccaccagtgg gccacgtcac 7860 catcagcccg caagcgglcg agccacgcgc ctatgcaccg cagggaUEg ccgaaaagct 7920 Rggaatctca aagcgcgttg agacgccgga agccgtggcc gaccggctga caaaagcggt 7980 tcggcagggg tatgagcctg ccctacaggc cgccgcagga gcgcgtgaga tgcgcaagaa 8040 f^gccgatcaa gcccaagaga cggcccgag 8069 <210> 74 <21l> 5270 <212> DNA <213>人工序列 <220> 合成構築體 <400> 74 cgataagcta gcttcacgct gccRcaagca ctcagggcgc aagggctgct aaaggaagcg 60 gaacacgtag aaagccagtc cgcagaaacg gtgctgaccc cggatgaatg tcagctactg 120 ggctatctgg acaagggaaa acgcaagcgc naagagaaag caggtagctt gcagtgggct 180 tacaiggcga (agctagac丨 gggcggtin atggacagca agcgaaccgg aattgccagc 240 tggfigcgccc ictggtaagg tigggaagcc ctgcaaagta aactggatgg ctttc丨tgcc 300 gccaaggatc tgatggcgca geggatcaag atctgatcaa gagacaggat gaggatcgtt 360

tcgcatgatt gaacaagatg gattgcacgc aggUctccg gccgcttggg tggagaggct 42D attcgsctat ^acUfigcac aacagacaat cggctgcict eatgccgccg tgitccggct 480 gtcagcgcag gggcgcccgg ticitmgt caagaccgac ctgtccggtg ccctgaatga 540 actccaagac gaggcagcgc ggctatcgtg gctggccacg acgggcgttc cttgcgcagc 600

Igtgctcgac ^Igtcactg aagcgggaag ggactggctg ctattgggcg aagtgccggg 660 gcaggatctc ctgtcatctc accltgctcc tgccgagaaa gtatccatca tggctgatgc 720 aat£CEBCSS ctgcatacgc 丨tgatccggc tacctgccca ttcgaccacc aagcgaaaca 780 tcgcatcgag cgagcacgta ctcggat&ga agccggictt gtcgatcagg aigatctfiga 840 cgaagagcat caggggctcg cgccagccga actgttcgcc aggctcaagg cgcggatgcc 900 cgacggcgag gatctcgtcg tgacccatgg cgatgcctgc ttgccgaata tcatggtgga 960 aaatggccgc ttttctggat tcatcgactg tggccggctg ggtgcggcgg accgctatca 1020 ggacatagcg ttggctaccc gtgataUgc tgaagagctt ggcggcgaat gggctgaccg 1080 cttcctcgtg ctttacgfita tcgccfictcc cgattcgcag cgcatcgcct tctatcgcct 1140 tcitgacgag ttcttctgag cggsaclctg gggttcgcea tgataagctg tcaaacatga 1200 36- 149048·序列表.doc 201111512

gaattacaac uatatcgia iggggctgac ttcaggtgct acatttgaag agataaattg 1260 cacEgaaatc tagaaatatt ttatctgatt aataagatga tcttcttgag atcgttUgg 1320 tctgcgcgta atctcttgct ctgaaaacga aaaaaccgcc ttgcagggcg gtttttcgaa 1380 ggttctctga gctaccaaci ctttgaaccg aggtaactgg cttggaggag cgcagtcacc 丨440 aaaacttgtc ctttcagttt agccttaacc ggcgcatgac ltcaagacta actcctctaa 1500 atcaat tacc agtggctgct gccagtggtg cttttgcatg tct t cccggg ttggactcaa 1560 gacgatagtt accggataag gcgcagcggt cggactgaac gggfiggttcg tgcaiacagt 1620 ccagcttgga gcgaactgcc tacccggaac tgagigtcag gcgtggaatg agacaaacgc 1680 ggccataaca gcggaatgac accggtaaac c-gaaaggcag gaacaggaga gcgcacgagg 1740 gagccgccag gggaaacgcc tggtatcttt ataaicctgt cgggutcgc caccactgat 1800 ttgagcgtca gacttcgtga tgcttgtcag gggggcggag cciaiggaaa aacggctttg 1860 ccttctUcc tgcgttatcc cctgattctg tggataaccg tattaccgcc tttgagtgag 1920 ctgaiaccgc tcgccgcagc cgaacgaccg agcgcagcga gtcagtgagc gaggaagcgg 1980 aagagcgccc aatacgcaaa ccgcctctcc ccgcgcgttg gccgattcat taatgcagct 2040 ggcacgacag gtttcccgac tggaaagcgg gcagtgagcg caacgcaatt aatgtgagtt 2100 agctcactca ttaggcaccc caggctttac aciltatgct tccggctcgt atgttgtgtg 2160 gaattgtgag cggataacaa tttcacacag gaaacagcta tgaccatgat tacgaattct 2220 gtlgacaatt aatcatcggc tcgtataatg tgtggaatig tgagcggata acaatttcac 2280 acaggaaaca gattacggat ccatttgagg agtaagccat gcaaacgttg ccaagcccag 2340 ttcaagctac accaacggaa acagciattg tiagacgcaa aacccgcccg gttccgatag 2400 gctccgttgt tattggtggc gficcatcccg tggctgttca gtcaatgatt aacgasgaca 2460 ctctggatat cgaaggttct giigctgcaa ttcggcgctt acacgagatc ggttgcgaga 2520 tcgtacgtgt gactfitacci tcauagcac acgcgaaagc aatggaagag attcgggatc 2580 ggctttataa aacgtacaaa ccggtccoct tagttgccga cgtgcatcat aacggaatga 2640 aaatcgcgit agaggttgcc aagtacgtgg acaargtgcg cattaatcct ggattatacg 2700 tgtctgagaa gccaaaacca aatcgcacgg agtacacica agcxgaattt gacgagattg 2760 gcgcgaaaat ccgtgaaacg ttggaaccac tggtaatttc actgcgggat cagggaaagt 2S20 cgatgcgcat tggcgttaat catggcagtc tggcggaacg gatgctgm acctatggcg 2880 ataccccaga gggtatggta gagagtgcac ttgaguut acgcatctgt gaaagtctca 2940 actreiaraa ctfagaaatl tcccttaaag ctagccgcgt cccgguatg atagccgcca 3000 atcggcttat ggttaagcgc alggacgagc tgggiatgga ttatccgttg catctcggag 3060 tgactgaggc asgtgatggt gaatatggcc gtattaaaag cacagcaggc attgcaacac 3120 tgctfigcgga aggaattgga gacacaaicc gtgtltcatt gactgaagct ccggaaaagg 3180 aaatccccgt gtgctatggc atccttcaag ccctcggtct ccgccgcacc atggtagaat 3240 atgtagctlg cccgtcgtgt ggtcggacat tgtttaacct ggaagaggtt ctgcacaagg 3300 tgagagaagc ^aciaaacac ctgacgggac tgaatattgc ggttatggga tgtattgtaa 3360 atggaccigg cgaaatggcc gatgcagact acggctatgt aggtaaacag ccgggatata 3420 taagtcttta ccgcggccgg gaagaagtca agaaagtgcc cgaggccgag ggcgttgcag 3480 ctctggtcga actgataaaa gcggatggta gatgggtaga tccataagtg gagctccccg 3540 gtaccgtgga cgaggtttaa tatggcgacg tatasagtca cactggtccg tccggacggc 3600 agcgaaacga ccatcgaigt tccggaggac gaatacatac tggatgtcgc cgaagaacaa 3660 gEtctggatc tcccgitttc ttgtcgcgcc ggtgcctgct ctacctgtgc tggcaaattg 3720 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tgggcgaaaa gctgctgacg gaacagcggg 120 aagtccagcg ccagaaacag gcccagcgcc agcaggaacg cgggcgcgca catttccccg 180 aaaagtgcca cctggcggcg ttgtgacaat ttaccgaaca actccgcggc cgggaagccg 240 atctcggctt gaacgaattg ttaggtggcg gtacttgggt cgatatcaaa gtgcatcact 300 tcttcccgta tgcccaactt tgtatagaga gccactgcgg gatcgtcacc gtaatctgct 360 tgcacgtaga tcacataagc accaagcgcg ttggcctcat gcugaggag.attgatgagc 420 37- 149048-序列表.doc 201111512 gcggtggcaa tgccctgcct ccgglgctcg ccggagactg cgagatcata gatatagatc 480 tcaciacgcf gcigclcaaa cctgggcaga acgiaagccg cgagagcgcc aacaaccgci 540 tcttggtcga aggcagcaag cgcgatgaat gtcttactac ggagcaagtt ccceagslaa 600 icggagtccg gclgatgttg ggagtaggtg gctacgtctc cgaactcacg accgaaaaga 660 tcaagagcag cccgcatgga tttgactlgg icaeggccga gcctacatgt gcgaatgatg 720 cccatacttg agccacctaa cttlgutta £ggcgaclgc cctgctgcgt aacatcgttg 780 cigctecgta acatcgttgc tgctccataa catcaaacat cgacccacgg cgtaacgcgc 840

Ugctgcttg gatgcccgag gcatagactg tacaaaaaaa cagtcataac aagccatgaa 900 aaccgccact gcgccfittac caccEcucg Ucggtcaag gttctggacc agttgcgtga 960 gcgcatacgc tacttgcatt acagtttacg aaccgaacag gcttatgica actgggttcg 1020 tgccltcatc cgiticcacg gtgtgcgtcc atgegcaaat attatacgca aggcgacaag 1080 gtgctgatgc cgctEBCgat tcagyilcat catgccgttt gtgatggctt ccatgtcggc 1140 anaatgclla atgaattaca acagttttta tgcatgcgcc caatacgcaa accgcctctc 1200 cccgcgcgtt ggccgattea tlaatgcagc iggcacgaca ggUtcccsa ctggaaagcg 1260 gacagtgagc gcaacgcaat taatgtgagt (agctcactc attaggcacc ccaggcttta 1320 cactltatgc ttccggctcg tatgttgtgt ggaattgtga gcggataaca atttcacaca 1380 ggaaacagct atgaccaiga ttacgccaag cgcgcaatta accctcacta aagggaacaa 1440 aagctgggta ccctgcccgc tttccagtcg ggaaacctgt cgtgccagct gcattaatga 1500 atcggccaac gcgcggggag aggcggtttg cgtattgggc gccagggtgg tirtictitt 1560 caccagtgag acgggcaaca getgaUgee cttcaccgcc Ifigccctgag agagttgcag 1620 caagcggtcc acgctggttt gccccagcag gcgaaaatcc tgtttgatgg tggttaacgg 1680 cgggatataa catgagctgi etteggtate gtcglaiccc actaccgaga tatccgcacc 1740 aacgcgcagc ccggactcgg mtggcgcg cattgcgccc agcgccatct gatcgtlggc 1800 aaccagcatc gcagtgggaa cgatgccctc attcagcatt tgcatggttt gttgaaaacc 1860 ggacatggca ctccagtcgc cucccguc cgcUtcggc 丨gaatUgat【gegagtgag 1920 atat t tatgc cagccagcca gacgcagacg cgccgagaca gaacttaatg ggcccgctaa 1980 cagcgcgatt tgctggtgac ccaatgcgac cagatgctcc acgcccagtc gcgtaccgtc 2040 ttcatgggag aaaataatac tgttgatggg tgtctggtca gagacatcaa gaaaUacgc 2100 cggaacatta gigeaggeag cttccacagc aatggcatcc tggtcatcca geggatagtt 2160 aatgatcagc ccactgacgc gugegegag aagattglgc accgccgctt tacaggcttc 2220 gacgccgctt cgttctacca tcgacaccac cacgctggca cccagttBat eggegegaga 2280 tttaategee gcgacaattt gcgacggcgc gtgcagggcc agaerggagg tgscaacgcc 2340 eatcagcaac gactgttigc ccgccagug ttgtgccacg cggltgggaa iglaaticag 2400 ctccgccaic gccgcttcca cmtlcccg cgtttlcgca gaaacgtggc tggcctgfitt 2460 caccacgcgg gaaacggtct gaiaagagac accggcatac tctgcgacat cgtataacgt 2520 lactggtttc acaticacca ccctgaattg actctcttcc gggcgclatc atgccatacc 2580 gcgaaaggtt ttgcgccati cgatggtgtc cgggalctcg acgctctccc ttatgcgact 2640 cctgcattag gaagcagccc agtagtaggi tgaggccgtt gagcaccgcc gcc£caagga 2700 atggtgcatg caaggagatg gcgcccaaca gtcccccggc cacggggcct gccaccalac 2760 ccacgccgaa acaagcgctc atgagcccga agtggcgagc ccgatcttcc ccatcggtga 2820 tEtegseeat ataggcgcca gcaaccgcac ctgtggcgcc ggtgatgccg gccacgatgc 2880

Rtccggcgta gaggategag atctcgatcc cgcgaaalta atacgactca ctatagggga 2940 iittgtgagcg gataacaatt cccctctaga aataattttg ittaacUla agaaggagat 3000 atacatatga ccgaagctcg tcgUctgcg aactacgaac ctaacagctg ggactatgat 3060 tacctgctgt cctccgacac ggacgagicc ategaagtat acaaagacaa agcgaaaaag 3120 ctggaagccg aagttcgtcg egagattaat aacgaaaaag cagaatttct gaccctgctg 3180 eaactgattg acaacgtcca gcgcctgggc ctgggltacc gttlcgaEtc tgatatccgt 3240

Ggtgcgctgg atcficltcgt ttcctccggc ggcttcgatg cggtaaccaa gacttccctg 3300 cacggiacgg cactgtctU ccgtctgctg cgtcaacacg gtmgaggt tlctcaggaa 3360 ecgttcagcg gcttcaaaga ccaaaacggc aacttcctgg agaacctgaa ggaagatatc 3420 aaagctatcc tgagcclgta cgaggccagc ttcctggctc tggaaggega aaacatcctg M80

Baegaggega agsttltcgc aatctctcat ctgaaagaac tgtctgaaga aaagalcggt 3540 aaagagctgg cagaacaggt gaaccatgca ctggaactgc cactgcatcg ccgtactcag 3600 cgtctgeaag cagtatggtc tategaggee laccgtaaaa aggaggaege gaatcaggtt 3660 ctectggagc tggcaattct ggattacaac atgatccagt clgtatacca gcgtgatctg 3720 cgtgaaacgt cccgttggtg gcgtcgtgtg ggtctggcga ccaaactgca ctttgctcgt 3780 gaccEcctga tlgagagctt ctactgggcc gtgggtgtag cattcgaacc gcaatactcc 3S40 gactgccgta actccgtcgc aaaaatgtit temegiaa ccaitatcga cgaiatcrac 3900 gatgtatacg ecaccctgga cgaactggag ctgtttactg atgeagitga gcgttgggac 3960 gtaaacticca Icaacgacct gccggattac atgaaactgt gctttctggc tctgtataac 4020 actattaacg aaalcgccta cgacaacctg aaagataaag gtgagaacat cctgccgtat 4080 cigaccaaag ccigsectga ccigtgcaac gctttcctgc aagaagccaa gtggcigtac 4J40 aacaaatcta ctccgacctt tgacgactac ttcggcaacg catggaaatc ctctrctggc 4200 ccgctgcaac tgBlfittcgc ttacucgct gtcgtgcaga acattaaaaa ggaagagatc 4260 gaaaacctgc aaaaatacca tgacaccatc tctcgtccit cccatatctt ccgtcigtgc 4320 aatgaccteg ctagcgcgtc tffcggaaatt gcgcgtggtg aaaccgcaaa tagcgtttct 4380 tgttacaigc gcaciaaagg tatctccgaa gaactggcta ccgaaagcgt gatgaatetg 4440 ategatgaaa cctggaaaaa gatgaacaag gaaaaaclgg gtggtagcct gttcgcgaaa 4500 ccgttcgtgg ?aaccgcgat caacctggca cgtcaatctc acigcactta teataaegge 4560 gacgcgcata cctciccgga tgagctgacc cgcaaacgcg ttctgtctgt aatcaclgaa 4620 ccgattctgc cgtttgaacg ctaaggatcc gaattegage tccglcgaca agettgegge 4680 cgcactcgag caccaccacc accaccaclg agatccggct gctaacaaag cccgaaagga 4740 agctgagitg gctgctgcca ccgctgagca ataacta^ca laacccctig gggcctctaa 4800 acgggtcttg aggggttitt tgactagttc tagageggee gccaccgcgg tggagctcca 4860 attcgcccta tagtgagteg taitaegege gcicactggc cgtcgtttta caacgtcgtg 4920 actgggaaaa ccciggcgtt acccaactta atcgcctlgc agcacatccc cctticgcca 4980 gctggcgtaa tagegaagag gcccgcaccg atcgcccttc ccaacagttg cgcagcctga 5040 atggcgaatg gaaattglaa gegttaatat 丨ttgttaaaa ucgcguaa atttugtta 5100 astcagctca trttttaacc aalaggccga ctgcgatgag iggcagfiscc gfigegtaatt 5160 tttitaaggc agttattggt gcccttaaac gcctggtgct acgcctgaat aagtgataat 5220 aagcggatga atggcagaaa ttcgaaagca aattcgaccc ggtcgtcggt teagggeagg 5280 gtCBttaaat ageegettat gtciattgct gglttaccgg itlattgact accggaagca 5340 gtgtgaccgt gtgettetea aatgcctgag gccagtttgc tcaggctctc cccgtggagg 5400 taataattga egatatgate attlattctg ccicccagag ccigataaaa acggtgaaic 5460 cgltagcgag gtgccgccgg cttccattca ggtcgaggtg gcccggctcc atgcaccgcg 5520 acgcaacgcg gggaggeaga caag^tatag ggeggegagg cggctacagc egatagtetg 5580 gaacagcgca cttacgggtt gctgcgcaac ccaagtgcta ccggcgcggc agcgtgaccc 5640 38-

149048·序列表.doc 201111512 gtgtcggcgg clccaacggc tcgccatcgt ccagaaaaca cggctcatcg ggcatcggca 5700 ggcgctgctg cccgcgccgt tcccattcct ccgtttcggt caaggctugc aggtxlggu S760 ccatgcccgg aatgccgggc tggctgggcg gctcctcgcc ggggccggtc ggtagttgct 5820 gctcgcccgg atacagggtc gggatgcggc gcaggtcgcc atgccccaac agcgattcgt 5880 cctggtcgtc gtgatcaacc accacggcgs cactfiaacac cgacaggcgc aactggtcgc 5940 mgctggcc ccacgccacg cggtcattga ccacgtaggc cgacacggtg ccggggccgt 6000 tgagcttcac gacggagatc cagcgctcgg ccaccaagtc cttgactgcg tatlggaccg 6060

Iccgcaaaga acgtccgatg agctlggaaa gtgtcttctg gclgaccacc acggcgttct 6120 ggtggcccat cigcgccacg aggtgatgca gcagcattgc cgccgtgggt ttcctcgcaa &忌6 taagcccggc ccacgcctca tgcgctttgc gttccgtttg cacccagtga ccgggcttgt 6240 tcttggcttg aatgccgatt tctciggaci gcgtggccat gcttatclcc atgcggtagg 6300 gtgccgcacg gttgcggcac catgcgcaai cagctgcaac ttttcggcag cgcgacaaca 6360 attatgcgtt gcgtaaaagt ggcagtcaat tacagaittt ctttaaccta cgcaatgagc 6420 taltgcgggg ggtgccgcaa tgagctgttg cgtacccccc tmttaagt tgttgatttt 6480 caag'tctttc gcatttcgcc ctaiatctag ttctttggtg cccaaagaag ggcacccctg 6540 cggggttccc ccacgccttc ggcgcggctc cccctccggc aaaaagtggc ccctccgggg 6600 citgttgalc gaclgcgcgg ccttcggcct tgcccaaggt ggcgctgccc ccttggaacc 6以0 cccgcactcg ccgccgtgag gctcgggggg caggcgggcg ggcttcgcct tcgactgccc 6720 ccactcgcat aggcugggt cgttccaggc gcgtcaaggc caagccgclg cgcggtcgct 6780 gcgcgagcct tgacccgcct tccacttggt gtccaaccgg caagcgaagc gcgcaggccg 6840 caggccggag gcttticccc agagaaaatl aaaaaaattg atggggcaag gccgcaggcc 6900 gcgcagttgg agccggtggg tatgtggtcg aaggctgggl agccggtggg caatccctgt 6960 ggtcaagctc gtgggcaggc gcagcctgtc catcagcttg tccagcaggg ttgtccacgg 7020 gccgagcgaa gcgagccagc cggtggccgc tcgcggccat cgtccacata tccacgggct 7080 ggcaagggag cgcagcgacc gcgcagEgcg aagcccggag agcaagcccg tagggcgccg 7140 cagccgccgt aggcggtcac gactttgcga agcaaagtct agtgagrata ctcaagcatt 7200 gagtggcccg ccggaggcac cgccttgcgc tgcccccgtc gagccggttg gacaccaaaa gggaggggca ggcatggcgg caiacgcgat catgcgatgc aagaagctgg cgaaaatggg 7320

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149048·序列表.doc 201111512 tgcccccgtc gagccggttg gacaccaaaa gggaggggca ggcatggcgg catacgcgal 7320 caigcgaigc aagaagctgg cgaaaatggg caacgiggcg gccagtctca agcacgccta 7380 ccgcgagcgc gagacgccca acgctgacgc cagcaggacg ccagagaacg agcactgggc 7440 ggccagcagc accgatgaag cgatgggccg acigcgcgag ttgctgccag agaagcggcg 7500 caaggacgct gtgitggcgg tcgagtacgt catgacggcc agcccggaat ggtggaagtc 7560 ggccagccaa gaacagcagg cggcgttctt cgagaaggcg cacaagtggc tggcggacaa 7620 gtacggggcg gatcgcatcg tgacggccag catccaccgt gacgaaacca gcccgcacat 7680 gaccgcgltc gtggtgccgc tgacgcagga cggcaggctg tcggccaagg agttcatcgg 7740 caacaaagcg cagatgaccc gcgaccagac cacgtttgcg gccgctgtgg ccgatctagg 7800 gctgcaacgg ggcatcgagg gcagcaaggc acgtcacacg cgcattcagg cgttctacga 7860 ggccctggag cggccaccag tgggccacgl caccatcagc ccgcaagcgg tcgagccacg 7920 cgcctaigca ccgcagggat tggccgaaaa gctgggaatc tcaaagcgcg ttgagacgcc 7980 ggaagccgtg gccgaccggc tgacaaaagc ggttcggcag gggtatgagc ctgccctaca 8040 ggccgccgca ggagcgcgtg agatgcgcaa gaaggccgat caagcccaag agacggcccg 8100 ag S102 <210> 77 <211> 6511 <212> <2i3>人工序列 <220> <223>合成構築體 <400> 77

cgataageia gcttcacgct gccgcaagca ctcagggcgc aagggctgct aaaggaagcg 6G gaacacgtag aaagccagic cgcagaaacg gtgcigaccc cggatgaatg tcagctactg 120 ggctatcigg acaagggaaa acgcaagcgc aaagagaaag caggtagctt gcagtgggct 180 tacalggcga tagclagact gggcggtltt utggacagca agcgaaccgg aallgccagc 240 tggggcgccc 丨ctggtaagg ttgggaagcc ctgcaaagta aactggatgg ctTtcttgcc 300 gccaaggatc Igatggcgca ggggatcaag atctgalcaa gagacaggal gaggatcgtt 360 tcgcatgatt gaacaagatg gattgcacEc aggltctccg accgcttggg tggagaggct 420 sttcggctat gactgggcac aacagacaat cggctgctct gatgccgccg tgttccggct 480 gtcagcgcag gggcgcccgg ttctttttgt caagaccgac ctgtccggtg ccctgaacga 540 actccaagac gaggcagcgc ggctatcgtg gctggccacg acgggcgttc cttgcgcagc 600 tgtgctcgac gttglcactg aagcgggaag ggactggcte ctattgggcg aagtgccggg 660 gcaggatctc ctgtcatctc accttgctcc tgccgagaaa gtatccatca tggctgatgc 720 aatgcggcgg ctgcatacgc ttgalccggc lacctgccca ttcgaccacc aagcgaaaca 780 tcgcatcgag cgagcacgta ctcggatgga agccggtctt gtcgatcagg atgatctgga 840 cgaagagcat caggggctcg cgccagccga actgttcgcc aggctcaagg cgcsgatgcc 900 cgacggcgag gatctcgtcg tgacccatgg cgatgcctgc ttgccgaata tcatggtgga 960 aaatEgccgc UUctggat tcatcgacte Vggccggcig gBtgtfigcEE accgctatca 1020 ggacatagcg ttggctaccc gtgatattgc tgaagagctt ggcggcgaat gggctgaccg 1080 cttcctcgtg clttacggta tcgccgctcc cgattcgcag cgcatcgcct tctatcgcct 1140 tctigacgag ttcttctgag cgggactctg gggttcgcga tgataagctg tcaaacatga 1200 gaattacaac ttatatcgta tggggctgac ttcaggtgct acatttgaag agataaattg 1260 cactgaaatc tagaaatatt itatctgatt aataagatga tcttcttgag atcsUttgg 1320 tctgcgcgta atctcttgct cigaaaacga aaaaaccgcc Ugcagggcg gtttttcgaa 1380 ggttctctga gctaccaact ctitgaaccg aggtaactgg cttggaggag cgcagtcacc 1440 aaaacttgtc ctttcagttt agccttaacc ggcgcatgac ttcaagacta actccictaa 1500 atcaattacc agtggctgct gccagtggtg cttttgcatg tcittccegg ttggactcaa 1560 gacgatagtt accggataag gcgcagcggt cggactgaac ggggggttcg tgcatacagt 1620 ccagcttgga gcgaactgcc tacccggaac tgagtgtcag gcgtggaatg agacaaacgc 1680 gsccataaca gcegaatgac accggtaaac 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149048·序列表.doc 201111512

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gcgctggatc gcttcgtttc ctccggcggc ttcgatgcgg taaccaagac ttccctgcac 3300 ggiacggcac tgtctttccg tctgctgcgt caacacggtt ttgaggtttc tcaggaagcg 3360 ttcagcggct tcaaagacca aaacggcaac ttcctggaga acctgaagga agatatcaaa 3420 gctaicctga gcctgtacga ggccagcuc ctggcictgg aaggcgaaaa catcctggac 3480 gaggcgaagg tutcgcaat ctctcatctg aaagaactgt ctgaagaaaa gatcggtaaa 3540 gagctggcag aacaggtgaa ccatgcactg gaactgccac tgcatcgccg tactcagcgt 3600 ctggaagcag tatggtctat cgaggcctac cglaaaaagg aggacgcgaa tcaggttctg 3660 ctggagctgg caattctgga Uacaacwg atccagtctg tataccagcg tgatctgcgt 3720 gaaacgtccc gttggtggcg tcgtgtgggt ctggcgacca aactgcactt tgctcgtgac 3780 cgcctgattg agagcttcta ctgggccgtg ggtgtagcac tcgaaccgca ataciccgac 3S40 tgccgtaact ccgtcgcaaa aatgttttct ttcgtaacca ttalcgacga latciacgat 3900 giatacggca ccctggacga actggagctg tttactgatg cagtlgagcg ttgggacgta 3960 aacgccatca acgacctgcc ggattacatg aaactgtgct ttctggctct gtataacact 4020 attaacgaaa tcgcctacga caacctgaaa gataaaggtg agaacatcct gccgiatctg 4080 accaaagcct gggctgacct gtgcaacgct ttcctgcaag aagccaagtg gctgtacaac 4140 aaatctactc cgacctttga cgactacttc ggcaacgcat ggaaatcctc ttctggcccg 4200 ctBcaactgg tgitcgctta cttcgcigtc gtgcagaaca ttaaaaagga iigagatcgaa 4260 aacctgcaaa aataccatga caccatclct cgtccttccc atatcttccg tctgtgcaat 4320 gacctggcta gcgcgtctgc ggaaattgcg cgtggtgaaa ccgcaaatag cgtttcttgt 4380 lacatgcgca ctaaagfitat ctccgaagaa ctggctaccg aaaficgtgat gaatctfiatc 4440 gatgaaacct ggaaaaagat gaacaaggaa aaactgggtg gtagcctgtt cgcgaaaccg 4500 ttcgtggaaa ccgcgatcaa cctggcacgt caatctcact gcacttatca taacggcgac 4560 gcgcaiacct ciccggatga gctgacccgc aaacgcgttc tgtctgtaat cactgaaccg 4620 altctgccgt ttgaacgcta aggatccgaa ttcgagctcc gtcgacaagc ttgcggccgc 4680 actcgagcac caccaccacc accactgaga tccggctgct aacaaagccc gaaaggaagc 4740 tgagttggct gctEccaccg ctgagcaata actagcataa ccccitgggg cctctaaacg 4800 ggtcttgagg ggtttttlga ctagttctag agcggccgcc accgcggtgg agctccaatt 4860 cgccctatag tgagtcgtat tacgcgcgct caclggccgt cgttttacaa cgtcgtgact 4920 gggaaaaccc 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Btccaacatc aatacaacct attaatttcc cctcgtcaaa aataaggtta tcaagtgaga 780 aatcaccatg agtgacgact gaatccggtg agaatggcaa aagtttaigc atttctttcc 840 ogacttgttc aacaggccag ccattacgct cgtcatcaaa atcactcgca tcaaccaaac 900 cgttattcat tcgtgattgc gcctgagcga gacgaaatac gcgatcgctg ttaaaaggac 960 aattacaaac aggaatcgaa tgcaaccggc gcaggaacac tgccagcgca tcaacaatat 1020

Utcacctga aicaggatat tcttctaaLa cciggaatgc tgtlLlccci； gggalcgcag 1080 iggifiagtaa ccatgcatca tcaggagtac ggataaaatg cttgatggtc ggaagaggca 1140 taaattccgt cagccagttt agtctgacca tctcaicigt aacatcattg gcaacgctac 1200 ctttgccatg tttcagaaac aactctggcg catcgggctt cccatacaat cgatagat【2 】260 tcgcacctga ttgcccgaca ttatcgcgag cccatttata cccatataaa tcagcatcca 1320 tgttggaatt taatcgcggc ctagagcaag acgtttcccg itgaatatgg cicataacac 1380 cccttgtatt actgtttatg taagcagaca gttuaugi 丨catgaccaa aaicccttaa 1440 cgtgagtttt cgttccactg agcgtcagac cccglagaaa agatcaaagg atcttcitga 1500 gatccttttt ttctgcgcgt aatctgcigc ttgcaaacaa aaaaaccacc gctaccagcg 1560 gtggtttgtt tgccggatca agagctacca actcmttc cgaaggtaac tggcttcagc 1620 agagcgcaga taccaaatac tgtccttcia glgtagccgt aguaggcca ccacttcaag 16S0 aactctgtag eaccgcctac aiacctcgct ctgctaatcc tgttaccagt Efictgcigcc 1740 agtggcgata agtcgtgtct laccgggttg gactcaagac gatagttacc ggataaggcg 1800 cagcggtcgg gctgaacggg gggttcgtgc acacagccca gcitggagcg aacgacctac I860 accgaactga gatacctaca gcgtgagcta tgagaaagcg ccacgcttcc cgaagggaga 1920 aaggcggaca ggiatccggt aagcggcagg gtcggaacag gagagcgcac gagggagcit 19S0 ccagggggaa acgcctggta tcttiatagt ccigtceggi itcgccacct cigacttgag 2040 cgtcgatttt tgtgatgctc gtcagggfigg cggagcciat ggaaaaacgc cagcaacgcg 2100 gcctttttac ggttcctggc cttttgctgg ccttitgctc acatgtictt tcctgcgtta 2160 tcccctgatt ctgtggataa ccgtaitacc gcctttBagt gagcigatac cgctcgccgc 2220 agccgaacga ccsagcgcag cgagtcagtg agcgsggaag cggaagagcg cctgatgcgg 2280 taUttctcc uacgcatct gtgcggtatt icacaccgca tatatggtgc actctcagta 2340 caatctgcic tgatgccgca tagttaascc agtatacact ccgctatcgc tacgtgactg 2400 ggtcatggct gcgccccgac acccgccaac acccgctgac gcgccctgac gggcttgtct 2460

Bclcccggca tccgcttaca gacaagctgt gaccgtctcc gggagctgca tgtgtcagag 2520 gltttcaccg tcatcaccga aacgcgcgag gcagctgcgg laaagctcat cagcgtggtc 2580 gtgaagcgat icacacaigt cigcctgttc alccgcgtcc agcicgttga gtttctccag 2640 aagcsttaal gictggctic tgataaagcg ggccatgtta agEgcggttt tttcctgttt 2700 ggtcactgal gcctccgtgt aaggg£gatt 丨ctgUcaig ggggtaatga taccgatgaa 2760 acgagagagg atgctcacga lacgggttac tgatgatgaa catgcccgst tactggaacg 2820 ttgtgagggt aaacaactgg cggtatggat gcggceggac cagagaaaaa tcactcagsg 2880 tcaatgccag cgcttcgtta atacagat〇t aggtgttcca cagggtagcc agcagcatcc 2940 tgcgatgcag atccggaaca taatggtgca gggcgctgac ttccgcgttt ccagacttta 3000 cgaaacacgg aaaccgaaga ccatlcatgt tgttgctcag gtcgcagacg ttttgcagca 3060 gcaglcgcll cacgttcgct cgcgtatcgg tgattcattc tgctaaccag taaggcaacc 3120 ccgccagcct agcc£gfitcc icaacgacag gagcacgatc atgcgcaccc gtggggccgc 3180 44·

M9048-序列表.doc 201111512

catgccggcg ataatggcct gcttctcgcc gaaacgtttg gtggcgggac cagtgacgaa 3240 ggcttgagcg agggcgtgca agattccgaa taccgcaagc gacaggccga tcatcgtcgc 3300 gctccagcga aagcggtcct cgccgaaaat gacccagagc gctgccggca cctgtcctac 3360 gagttgcatg ataaagaaga cafitcataag tgcggcgacg atagtcatgc cccgcgccca 3420 ccggaaggag ctgaclgggt tgaaggctcl caagggcatc ggtcgagatc ccggtgccta 3480 atgagigagc taacttacat taattgcgtt gcgctcactg cccgctttcc agtcgggaaa 3540 ccigtcgtgc cagctgcatt aatgaatcgg ccaacgcgcg gggagaggcfi gltigcfitat 3600 tgggcgccag ggtggttut cttttcacca gigagacggg caacagctga ttgcccttca 3660 ccgcctggcc ctgagagagt tgcagcaagc ggtccacgct ggtttgcccc agcaggcgaa 3720 aatcctgut gatggtggtt aacggcggga tataacatga gctgicttcg gtatcgtcgt 3780 atcccactac cgagatalcc gcaccaacgc gcagcccgga ctcyglaatg gcgcgcalig 3840 cgcccagcgc catctgatcg ttggcaacca gcatcgcagt gggaacgatg ccctcattca 3900 gcatttgcat ggtttgttga aaaccggaca tggcactcca gtcgccttcc cgttccgcta 3960 tcfigctgaat ttgattgcga gtgagatatt tatgccagcc agccagacgc agacgcgccg 4020 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cgagcccgat cttccccatc ggtgatgtcg gcgatatagg cgccagcaac cgcacctgtg 4920 gcgccggtga tgccggccac fiatgcgtccg gcgtagagga tcgagatctc gatcccgcga 4980 aattaaiacg actcactata ggggaattgt gagcggataa caattcccct ctagaaataa 5040 ttttgtttaa ctttaagaag gagatataca tatgagtut gatattgcca aatacccgac 5100 cctggcactg gttgactcca cccaggagtt acgactgttg ccgaaagaga gtttaccgaa 5160 actctgcgac gaactgcgcc gctatttact cgacagcgtg agccgtlcca gcgggcactt 5220 cgcctccggg ctgggcacgg tcgaactgac cgtggcgctg cactatgxct acaacacccc 52S0 gtttgaccaa ttgatttggg atgtggggca tcaggcttat ccgcataaaa ttttgaccgfi 5340 acgccgcgac aaaatcggca ccatccgtca gaaaggcggt ctgcacccgt tcccgtggcg 5400 cggcgaaagc gaatatgacg tattaagcgt cgggcattca tcaacctcca tcagtgccgg 5460 aatEggtatt gcggttgctg ccgaaaaaga aggcaaaaat cgccgcaccg tctgtgtcat 5520 tggCBatggc gcganaccg caggcatggc gtttgaagcg aigaatcacg cgggcgatat 5580 ccgtcctgat atgctggtga ttctcaacga caatgaaatg tcgatttccg aaaatgtcgg 5640 cgcgctcaac aaccatctgg cacagctgct ttccggtaag ctgtactctt cactgcgcga 5700 aggcgggaaa aaagtttlct crggcglgcc gccaattaaa gagctgctca aacgcaccga 5760 agaacatatt aaaggcatgg tagtgcctgg cacgttgttt gaagagctgg gctttaacta 5820 catcggcccg gtggacggtc acgatgtgct ggggcttatc accacgctaa agaacatgcg 5880 cgacctgaaa ggcccgcagt rcctgcatat catgaccaaa aaaggtcgtg gttatgaacc 5940 ggcagaaaaa gacccgatca ctttccacgc cgtgccuaa tttgatccct ccagcggttg 6000 tttgccgaaa agtagcggcg gtttgccgag ctattcaaaa atctttggcg actggttgtg 6060 cgaaacggca gcgaaagaca acaagctga: ggcgattact ccggcgatgc gtgaaggttc 6120 cggcatggtc gagtutcac gtaaallccc ggatcgctac ttcgacgtgg caattgccga 61SO gcaacacgcg gtgacctttg ctgcgggtci ggcgattggt gggtacaaac ccattgtcgc 6240 gatttactcc actttcctgc aacgcgccta tgatcaggtg ctgcatgacg tggcgaitca 6300 aaaacttccg gtcctgrtcg ccaicgaccg cgcgggcatt gttggtgctg acggtcaaac 6360 ccatcagggt gcttngatc tctcttacct gcgctgcata ccggaaatgg tcattatgac 6420 cccgagcgat gaaaacgaat gtcgccagat gctctatacc ggctatcact ataacgalgg 6480 cccgtcagcg gigcgctacc cgcgtggcaa cgcggtcggc gtggaaciga cgccgctgga 6540 aaaactacca anggcaaag gcattgrgaa gcgrcgtggc gagaaactgg cgaiccttaa 6600 ctttggtacg ctgatgccag aagcggcgaa agtcgccgaa tcgctgaacg ccacgctggt 6660 cgatatgcgt titgtgaaac cgcttgatga agcgttaatt clggaaatgg ccgccagcca 6720 tgaagcgctg gicaccgtag aagaaaacgc cattargggc ggcgcaggca gcggcgtgaa 6780 cgaagtgctg atggcccatc gtaaaccagt acccgtgctg aacattggcc igccggacti 6840 ctttattccg caaggaactc aggaagaaat gcgcgccgaa ctcggcctcg atgccgclgg 6900 tatggaagcc aaaatcaagg cctggctggc ataagccttc itaaggtagc tgcigacaga 6960 tamcgccc Itaaagcttt acaaggagga aaaaaacatg aagc&actca ccattctggg 7020 ctcgaccggc tcgattggtt gcagcacgct ggacgtggtg cgccataatc ccgaacacit 70SO ccgcgtagtt gcgctggtgg caggcaaaaa tgtcactcgc atggtagaac agtgcctgga 7140 attttctccc cgctatgccg taatggacga tgaagcgagt gcgaaacttc ttaaaacgat 7200 gctacagcaa cagggtagcc gcaccgaagi cttaagtggg caacaagccg cttgcgatat 7260 ggcagcgctl gaggatgltg atcaggtgat ggcagccait gttggcgctg ctgggctgtt 7320 acctacgctt gctgcgatcc gcgcgggtaa aaccattttg ctggccaata aagaatcact 7380 ggttacctgc ggacgtctgt ttatggacgc cgtaaagcag agcaaagcgc aattgttacc 7440 ggtcgatagc gaacataacg ccatttttca gagtttaccg caacctatcc agcataatct 7500 gggatacgct gaccttgagc aaaatggcgt ggtgtccatt ttacttaccg ggtctggtgg 7560 ccctEtccgl gagacgccat tgcgcgattt ggcaacaalg acgccggatc aagcctgccg 7620 tcaiccgaac tggtcgatgg ggcgtaaaat ttctBtcg2t tcggctacca Egatgaacaa 7680 aggictggaa tacattgaag cgcgttggct gtttaacgcc agcgccagcc agatggaagt 7740 gctgattcac ccgcagtcag tgattcactc aatggtgcgc tatcaggacg gcagtgttct 7800 Egcgcagctg ggggaaccgg atatgcgtac gccaattgcc cacacgatgg catggccgaa 7860 tcgcgtgaac tctggcgtga agccgctcga tttttgcaaa ctaagtgcgt tgacatttgc 7920 cgcaq.cggat Ulgatcgtt atccatgcct gaaactggcg atggaggcgt tcgaacaagg 7980 ccaggcagcg acgacagcat tgaatgccgc aaacgaaatc accgttgctg cmtcttgc 8040 gcaacaaatc cgctttacgg atatcgctgc gttgaattta tccgtactgg aaaaaatgga 8100 tatgcgcgaa ccacaatgtg tggacgatgt gttatctgtt gatgcgaacg cgcgtgaagt 8160 cgccagaaaa gaggtgatgc gtctcgcaag ctgagtccga cttlgcgata ggcctgcacc 8220 cttaacgtcg acacgtaagg aggaaaaaaa catggcaacc actcatttgg atgtttgcgc 8280 cgtg£ttccg gcggccggat tEggccgrcg aatgcaaacE gaatgtccta agcaatatct 8340 ctcaatcggi aatcaaacca ttcttgaaca ctcggtgcat gcgctgctgg cgcatccccg 8400 45- 149048-序列表.doc 201111512 t^tgaaacgt gtcgtcattg ccataaglcc iggcgatagc cgltugcac aacttcctct 8460 ggcgaatcat ccgcaaatca ccgttgtaga tggcggtgat gagcgigccg attccgtgct S520 gijcaggtctg aaagccgctg gcgacgcgca gtgggtattg gtgcatgacg ccgctcgtcc 85S0 ttgtttgcal caggatgacc icgcgCEatt EUggcstU agcgaaacca gccgcacggg 8640 gsgcatcctc gccgcaccag tgcgcgatac tatgaaacgt gccgaaccgg gcaaaaatgc 8700 cattgctcat accgttgatc gcaacggctt atggcacgcg ctgacgccgc aatttltccc 8760 tcgtgagctg tiacatgact gtctgacgcg cgctctaaat gaagecgcga ctattaccga 8820 cp.aagcctcg gcgctggaat attgcggatt ccatcctcag ttggtcgaag gccgtgcgga 8880 taacattaaa gtcacgcgcc cggaagattt ggcactfigcc eagttttacc tcacccgaac 8940 catccatcag gagaatacat aatttcggat gcttatacac gccagatatt tcattacgga 9000 gctcatacaa ggaggaaaaa aacatgcgga cacagtggcc ctctccggca aaacttaatc 9060 tgtttttata cattaccggt cagcglECgg atgettacca cacgctgcaa acgctgtttc 9120 aatttcilga ttacggcgac accatcagca ttgagcttcg tgacgatggg gatattcgtc 9180 tgttaacgcc cgttgaaggc gtggaacatg aagataacct gatcgltcgc Bcagcgcgat 9240 tgttgatgaa aactgcggca gacagcgggc gtcttccgac gggaagcggt gcgaatatca 9300 gcattgacaa gcgtttgccg atgggcggcg gictcggcgg tggttcatcc aatgccgcga 9360 cggtcctggt ggcattaaat catctctggc aatecgggct aagcatggal gagcifigcgg 9420 aaatggggct gacgctgggc gcagatgttc ctgtctttgt tcgggggcat gccgcgtttg 9480 ccgaaggcgt tggtgaaata ctaacgccgg tggacccgcc agagaagtgg tatctggtgg 9540 cgcaccctgg tgtaagtatt ccgactccgg tgatttttaa agatcctgaa ctcccgcgca 9600 atacgccaaa aaggtcaata gaaacgttgc taaaatgtga atttagcaat gattgcgagg 9660 ttaicgcaag aaaacgtttt cgcgaggttg atgcggtgct ttcctggcig 〖tagaaiacg 9720 ccccgtcgcg cctgactggg acaggggcct gtgtctttgc tgaatttgat acagaglctg 9780 aagcccgcca ggtgctagag caagccccgg aatggctcaa tggctttgtg gcgaaaggcg 9840 ctaatctttc cccattgcac agagccatgc tttaatttgc gattgagatc cggcctgcac 9900 ccttaaccgg atccgattca aggaggaaaa aaacatgcga attggacacg gtttlgacgl 9960 acatgccttt ggcggtgaag gcccaattat cattggtggc gtacgcattc cttacgaaaa 10020 aggattgctg gcgcauctg atggcgacgt ggcgctccat gcgttgaccg atgcattgct 10080 igficgcggcg gcgctggggg atatcggcaa gctgtlcccg gataccgatc cg^calltaa 10140 aggtgccgat agccgcgagc tgctacgcga agcctggcgt cgtattcagg cgaagggtta 10200 tacccttggc aacgtcgatg tcactatcat cgctcaggca ccgaagatgt igccgcacai 10260 tccacaaatg cgcgtgttta itgccgaaga 丨ttgggctgc cacatggatg atgtiaacgt 10320 p.aaagccact actacggaaa aactgggatt laccggacgt ggggaaggga ttgcctgtga 1D380 agcggtggcg ctactcaita aggcaacaaa atgatttacc giattattct ttagacaacg 10440 nattaagcta gcacataagg aggaaaaaaa catgcataac caggciccaa ttcaacgtag 10500 aaaatcaaca cgtamacg ugggaatgt gccgauggc gatggigctc ccatcgccgt 10560 acagtccatg accaatacgc gtacgacaga cgtcgaagca acggtcaatc aaatcaaggc 10620 nctggaacgc gitggcgctg atatcgtccg tgtatccgta ccgacgalgg acgcggcaga 10680 agcgttcaaa ctcatcaaac agcagguaa cgtgccgctg gtggcigaca tccacttcga 10740 ctatcgcatt gcgctgaaag ugcggaata cggcgtcgat tgtctgcgta ttaaccctgg 10800 caatatcggt aatgaagagc gtattcgcat figtggltgac tgtgcgcgcg ataaaaacat 10860 tccgatccgi aUggcgtta acgccggatc gctggaaaaa gatttgcaag aaaagtatgg 〗0920 cgaaccgacg ccgcaggcgt tgctggaatc tgccatgcgt catgttgatc atctcgatcg 109S0 cctgaacttc gatcagttca aagtcagcgt gaaagcgtct gacgtcttcc tcgctgttga 11040

Stcttatcgt Ugctggcaa aacagatcga tcagccgttg catctgggga tcaccgaagc 11100 cggtggtgcg cgcagcggg£ cagtaaaatc cgccattggt ttaggtctgc tgctgtctga 11160 aggcatcggc gacacgctgc gcgtatcgct figcggccgat ccggtcgaag agatcaaagt 11220 cggtttcgal attttgaaat cgctgcgtat ccgttcgcga gggatcaact 丨catcgcctg 11280 cccgacctgt tcgcgtcagg aatngatgt tatcggcacg gttaacgcgc tggagcaacg 11340 cctggaagat atcatcactc cgatggacgt ttcgattatc ggctgcgtgg tgaatggccc 11400 agfifgaggcg ctggittcta cactcggcgt caccggcggc aacaagaaaa gcggcclcta J1460 tgaagaiggc gtgcgcaaag accgtctgga caacaacgat atgatcgacc agctggaagc 11520 acgcatlcgt gc&aaagcca gtcagctgga cgaagcgcgt cgaattgacg ttcagcaggt 11580 tgaaaaaUa ttacaagtaa atgattcagg ttataactac gttgcggccg caaggaggaa 11640 aaaaacatgc afiatcctgtt ggccaacccg cstggttttt gtgccggggt agaccgcgct 11700 atcagcattg ttgaaaacgc gctgeccatt tacggcgcac cfiatatatgt ccgtcacgaa 11760 gtggtacata accgctatgt gfitceatagc ttgcgtgagc gtggggctat ctttattgag 11820 cagattagcg aaglaccgga cggcgcgatc cigattttct ccgcacacgg tgtttctcag 11880 gcggtacgla acgaagcaaa aagtcgcgat ttgacggtgt ttgatgccac ctgtccgctg 11940 gigaccaaag tgcacatgga agtcgcccgc sccagtcgcc gtggcgaaga atctattclc 12000 atcggtcacg ccgggcaccc ggaagtggaa £ggacaatgg gccagtacag taacccggaa 12060 gggggaatgt atctggtcga atcgccggac ^atetgtgga aactgacggt caaaaacgaa 12120 gagaagctct cctttatgac ccagaccacg ctgtcggtgg atgacacgtc tgatgtgaic 12180 gacgcgctgc gtaaacgctt cccgaaaatt ^tcggtccgc gcaaagatga catctgctac 12240 gccacgacta accgtcagga agcggtacgc gccctggcag aacaggcgga agUfilgUfi 12300 gtggtcggtt cgaaaaactc ctccaactcc aaccgtctgg cggagctegc ccagcgtatg 12360 ggcaaacgcg cgttutgat tEacgaigcg aaagacatcc aggaagagtg ggtgaaagag 12420 gttaaatgcg tcggcgtgac tgcggscgca tcggctccgg atattctggt gcagaatgtg 12480 gtggcacgtt tgcagcagct gggcggtggt gaagccattc cgctggaagg ccgtgaagaa 12540 aacaltgttt tcgaagtgcc Eaaafiagctg cgtgtcgata ttcgtgaagt cgattaattt 12600 gcattagcta ttacgtaatt cgtatagtcg gtaccactaa ggaggaaaaa aacatgactg 12660 ccgacaacaa tagtatgccg catggtgcag tatctagtta cgccaaatta gtgcaaaacc 12720 aaacacctga agacattttg gaagagitrc ctgaaattat tccattacaa caaagaccta 12780 atacccgatc .tagtgagacg tcaaatgacg aaagcggaga aacatgtttt tctggtcatg 12840 atgaggagca aattaagtta atgaatgaaa attgtattgt tttggattgg gacgataatg 12900 ctattggtgc cggcaccaag aaagtttgtc atttaatgga aaatattgaa aagggtttac 12960 tacatcgtgc attctccgtc Utattttca atgaacaagg tgaaUacit uacaaeaaa 13020 gagccactga aaaaataact ttccctgatc tttggactaa cacatgctgc tctcatccac 13080 tatgtattga tgacgaatta ggtttgaagg gtaagctaga cgataagatt aagggcgcta 13140 ttactgcggc ggtgagaaaa ctagatcatg aartagglat iccagaagat gaaactaaga 13200 caaggggtaa gtttcacttt uaaacagaa 丨ccattacat ggcaccaagc aatgaaccgt Π260 ggggtgaaca tgaaattgat tacatcctat tttataagat caacgctaaa gaaaacttga 13320 ctgtcaaccc aaacgtcaat gaagttagag acttcaaatg ggtttcacca aatgatttga 13380 aaactatgtt tgctgaccca agttacaagt uacgccttg gUtaagatt atttgcgaga 13440 attacttatt caactggtgg gagcaattag atgacctttc tgaagtggaa aatgacaggc 13500 aaattcatag aatgctataa gaattcctcg agcaccacca ccaccaccac tgagatccgg 13560 ctgctaacaa agcccgaaag gaagctgagt iggctgctgc caccgctgag caaiaactiig 13620 -46- 149048-序列表.doc 201111512 13661 cataacccct tggggcctct aaacgggtct igaggggttt t <210> 80 <211> 64 <212> mh <213>人工序列 <220> <223>合成構築體 <400> 80 gggcgagttt gaggtgaafit aagacatgag actgacatct gaaccctcac taaagggcgg 60 ccgc 64 <210> 81 <211> 102 <212> DNA <213>人工序列 <220> 合成構築體 <400> 81 itctttttat taagcgcgta acttaacgtc gstcgcgtct tgaagttcct atactttcta 60

gagaatagga act let tacg ccccgccctg ccactcatcg ca 102 <210> 82 <211> 21 <21'2> m <213>人工序列 <220> <223>合成構築體 <4〇〇> 82 agccaggagt tgaalatcct g 21 <210> 83 <2U> 21 <212> DHA <213>人工序列 <220> 合成構築體 <400> 83 tgatggacac gaggatggtg t 21 <210> 84 <21l> 22 <212> C^A <2【3>人工序列 <22ϋ> <223>合成構築體 <400> 84 caccatggta tcctgttctg eg 22 <210> 85 <211> 22 <2ί2> DNA <213>人工序列 <220> <223>合成構築體 <40Q> 85

Uaatctact ttcagacctt gc 22 <210> 86 <211> 37 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>合成構築體 <400> 86 aggaggtggt ctca^atgac tgccgacaac aatagta 37

<2t0> 87 <211> 50 <212> DNA <2l3>人工序列 47- 149048-序列表.doc 201111512 合成構築體 <400> 87 aggaggtggt ctcagcgctc tgcagttata gcaitctaig aatttgcctg 50 <210> 88 <211> 73 <212> DNA <2Π>人工序列 <220> <223>合成構築體 <400> 88 gaacaatcac cggcgcagta acagacgggt aacgcgggag atttttcatg aattaaccci 60 cactaaaggg egg 73 <2i0> 89 <211> 74 <212> m <213>人工序列 <220> <223>合成構築體 <400> 89 egggaagega ggegettccc atcacgliat tatttttcaa ccigctgaac laatacgact 60 cactataggg ctcg 74 <210> 90 <211> 73 <212> DNA <213>人工序列 <220> ⑩合成構築體 <400> 90 tlttfiatatt gaagtgctgg aaatcgatcc ggcactggag gcgtaacatg aatlaacccl 60 cactaaaggg egg 73 <210〉 91 <211> 74 <212> DNA <2丨3>人工序列 <220> <223>合成構築體 <400> 91 alUtcgcat aaettagget gctaatgact taategaett cacgaatatc taatacgact 60 cactatafigg ctce 74 <2I0> 92 <211> 40 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>合成構築體 <400> 92 40 cggcgcagta acagacgggt aaegemag atttttcatg <210> 93 <r2tl> 38 <212> DNA <2丨3>人工序列 <220> <223>合成構築體 <400> 93 38 cgcttcccat cacgltatta utttcaacc tgctgaac <210> 94 <211> 40 <212> DNA <213>人工序列 <220> <2〗3>合成構築體 <400> 94 gaagtgctgg aaatcgatcc ggcactggag gcgtaacalg .48- 149048·序列表.doc 40 201111512 <210> 95 <211> 38 <212> m\ <213>人工序列 <220> <223>合成構築體 <400> 95 cttaggctgc taatgactta atcgacttca cgaatatc 38 <210> 96 <211> 144 <212> im <213>人工序列 <220> <223>合成構築體 <220> <221> misc feature <222> 31

<223> n=A、T、C或G <400> 96 gaggaaitcg cgagccglca cgccctigac nalgccacal cctgagcaaa laatlcaacc 60 actaaacaaa tcaaccgcgt t tcccggagg taaccggatc caaggagata taccatgcat 120

aaccaggctc caattcaacg taga \44 <210> 97 <211> 38 <212> 0ΝΛ <2】3>人工序列 <220> <223>合成構築體 <400> 97 atatcctgca guatagcat tciatgaatt igcclgtc 38

<210> 98 <2U> 17 <2i2> DMA 人工序列 <220> <223>合成構築體 <400> 98 gtaaaacgac ggccagt 17 <210> 99 <2il> 17 <212> QK\ <213>人工序列 <220> 合成構築體 <400> 99 caggaaacag ctatgac Π <210> 1D0 <211> 21 <212> Dm <213>人工序列 <220> <223>合成構築體 <400> 100 caggagccag aacgcaactg c 21 <2!0> 101 <2H> 21 <212> DNA <2丨3>人工序列 <220> 合成構築體 <400> 101 cactticgcc tgaigttcac c 21 <2!0> 102 <211> 22 49· 149048-序列表.doc 201111512 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>合成構築體 <400> 102 caitcagtct cttgcagggg tc 22 <210> 103 <2H> 21 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>合成構築體 <400> 103 gcatagtgcc gctcatctgc c 21 <210> 104 <21l> 35 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>合成構築體 <400> 104

Baaaclgaaa cccatatBga agctcgtcgt tctgc 35 <210> 105 <211> 44 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>合成構築體 <400> 105 cccgcgctta ctcgaggcgt icaaacggca gaatcggttc agtg 44 <2I0> 106 <21i> 30 <212> DNA <213>人工序列 <220> 合成構築體 <400> 106 gatcggatcc attcgccctt aggaggtaaa 30 <210> 107 <21l> 40 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>合成構築體 <400> 107

Eaicgcggcc gccagcigca ggacgcgttg tiatagcatt 40 <210> 108 <211> 6909 <212> DNA <213>人工#列 <220> <%>合成構築體 <400> 108 tggcgaatgg .gacgcgccct gtagcggcgc attaagcgcg gcgggtgtgg tgguacgcg 60 cagcgtgacc gciacacng ccagcgccct agcgcccgct cclttcgcil tcttcccuc J20 ctttctcgcc acgttcgccg gctttccccg tcaagclcta aatcgggggc tccctttagg 180 gttccgattt agtgcttlac ggcacclcga ccccaaaaaa cttgattagg gtgatggttc 240 acgtagtggg ccatcgccct &atagacggt tlttcgccct ttgacgttgg agtccacgtt 300 ctttaatagt ggactcttgt tccaaaclgg aacaacactc aaccctatct cggtctartc 360 tttt^attta taagggattt tgccgatttc ggcctattgg ttaaaaaatg agctgattta 420 acaaaaattt aacgcgaatt ttaacaaaat attaacgttt acaatttcag gtggcacttt 480 tcggggaaal gtgcgcggaa cccctalttg tttatttttc taaatacatt caaatatgta 540 tccgctcatg aattaattct tagaaaaact catcgagcat caaatgaaac tgcaatttat 600 tcataicagg attatcaata ccatattttt gaaaaagccg tttctgtaat gaaggagaaa 660 actcaccgag gcagttccat aggatggcaa gatcctggta tcggtctgcg attccgactc 720 gtccaacatc aatacaacct atlaatttcc cctcgtcaaa aataaggtta tcaagtgaga 780 aatcaccatg agtgacgact gaatccggtg agaatggcaa aagtttacgc aittcntcc 840 50- 149048-序列表.doc 201111512 agacttgttc aacaggccag ccattacgct cgtcatcaaa arcacccgca tcaaccaaac 900 cgttattcat tcylgaltgc gcctgagcga gacgaaatac gcgatcgclg ttaaaaggac 960 aattacaaac aggaatcgaa tgcaaccggc gcaggaacac tgccagcgca tcaacaatat 1020 tttcacctga atcaggatat tcttctaata cctggaatgc tgttttcccg gggatcgcag 1080 tegtgagtaa ccatgcatca tcaggagtac ggataaaatg cttgatggtc ggaagaggca 1140 taaattccgt cagccagtit agtctgacca tctcatctfit aacaicattg gcaacgctac 1200 ctttgccatg tttcagaaac aactctggcg catcgggctt cccatacaat cgatagattg 1260 tcgcacctga ttgcccgaca ttalcgcgag cccatttata cccatataaa tcagcatcca 1320 tgllggaatt taaEcgcggc ctagagcaag acgtttcccg ttgaatatgg ctcataacac 1380 cccttgratt actgtttatg taagcagaca gttttattgt tcatgaccaa aatcccttaa 1440 cgtgagtttt cgttccacig agcgtcagac cccgtagaaa agatcaaagg atcttcttga 1500 gatccntit ttctgcgcgt aatctgctgc ttgcaaacaa aaaaaccacc gctaccagcg ί5έ0 gtggutgtt tgccggatca agagctacca actcutttc cgaaggtaac tggcucagc 1620 agagcgcaga taccaaatac tgiccttcta gtgtagccgt agttaggcca ccacttcaag 1680 aactctgtag caccgcctac atacctcgct ctgctaatcc igttaccagt ggctgctgcc 1740 agtggcgau agicgtgtct taccgggttg gactcaagac gaugnacc ggaiaaggcg 1800 cagcggtcgg gctgaacggg gggttcgtgc acacagccca gctlggagcg aacgacctac I860 accgaaciga gatacctaca gcgtgagcta tgagaaagcg ccacgcttcc cgaagggaga 1920 aaggCEgaca ggtatccggt aagcggcagg gtcggaacag gagagcgcac gagggagctt 1980 ccagggggaa acgcctggta tcttiatagt cctgtcgggt ttcgccacct ctgacttgag 2040 cgtcgatitt tgtgatgctc gtcagggggg cggagcctat ggaaaaacgc cagcaacgcg 2100 gcctttUac ggttcctggc cttttgctgg ccttttgctc acatgttctt tcctgcgtta 2160 tcccctgatt ctgtggataa ccgtattacc gccttigagt gagctgatac cgctcgccgc 2220 agccgaacga ccgagcgcag cgagtcagtg agcgaggaag cggaagagcg cctgatgcgg 2280 tattttctcc ttacgcatct gtgcggtatt tcacacceca tatatggtgc actctcagta 2340 caaictgctc tgatgccgca tagttaagcc agtatacact ccgctatcgc tacgtgactg 2400 ggtcalggct gcgcccceac acccgccaac acccgctgac gcgccctgac gggcttgtct 2460 gctcccggca tccgcttaca gacaagctgt gaccglcicc gggagctgca tgtgtcagag 2520

guttcaccg tcatcaccga aacgcgcgag gcagctgcgg taaagctcat cagcgtggtc 2580 gtgaagcgat tcacagatgt ctgcctgttc atccgcgtcc agctcgttga gttlctccag 2640 aagcgltaat gtctggcttc tgataaagcg ggccaigtta agggcggttt tttcctgttt 2700 ggtcaclgat gcctccgtfit aag£eggait tctgttcatE gggglaatga taccgatgaa 2760 acgagagagg atgctcacga tacgggttac tgaigatgaa catgcccggt tactggaacg 2820 ttgtgagggt aaacaactgg cggtatggat gcggcgggac cagagaaaaa tcactcaggg 2880 tcaatgccag cgcttcgtla atacagatgt agglgitcca cagggtaBcc agcagcatcc 2940 tgcgaigcag atccggaaca taatggtgca gggcgcigac ttccgcgtti ccagacttia 3000 cgaaacacgg aaaccgaaga ccattcatgt t&ttgctcag gtcgc-agacg ttttgcagca 3060 gcagtcgctt cacgttcgct cgcgtatcgg tgattcattc tgctaaccag taaggcaacc 3120 ccgccagcct agccgggtcc tcaacgacag gagcacgatc atgcgcaccc gtggggccgc 3180 catgccggcg ataatggcct gcttctcgcc gaaacgtitg gtggcgggac cagtgacgaa 3240 ggcltgagcg agggcgtgca agattccgaa taccgcaagc gacaggccga tcatcgtcgc 3300 gclccagcga aagcggtcct cgccgaaaat gacccagagc gclgccggca cctglcctac 3360 gagttgcatg ataa.ngaaga cagtcataag tgcggcgacg atagtcatgc cccgcgccca 3420 ccggaaggag ctgactgggt tgaaggctct caagggcatc ggtcgagatc ccggtgccta 3480 atgagtgagc taacltacat taattgcgu gcgctcactg cccgctttcc agtcgggaaa 3540 ccigicgtgc cagctgcatt aatgaatcgg ccaacgcgcg gggagaggcg gtttgcgtat 36£X) tgggcgccag ggtggttttt cttttcacca gtgagacggg caacagctga ttgcccttca 3660 ccgcclggcc ctgagagagt tgcagcaagc ggtccacgci ggtttgcccc agcaggcgaa 3720 aatcctgut gatggtggtt aacggcggga lataacatga gctgtcttcg gtatcgtcgt 3780 atcccactac cgagatatcc gcaccaacgc gcagcccgga ctcggtaatg gcgcgcattg 3S40 cgcccagcgc catctgalcg ttggGaacca gcatcgcagt gggaacgatg ccctcattca 3900 gcatugcat ggtttgttga aaaccggaca tggcactcca gtcgccttcc cgttccgcta 3960

Uggctgaat ttgattgcga gtgagatait tatgccagcc agccagacgc agacgcgccg 4020 agacagaact taatgggccc gctaacagcg cgatttgctg gtgacccaat gcgaccagat 4080 gctccacgcc cagtcgcgta ccgtcttcat gggagaaaat aaiactgttg atgggtgtct 4140 ggtcagagac atcaagaaat aacgccggaa cattagtgca ggcagcttcc acagcaatgg 4200 catcctggtc atccagcgga tagttaatga tcagcccact gacgcgttgc gcgagaagat 4260 tetgcaccgc cgctttacag gcttcgacgc cgcttcgttc taccatcgac accaccacgc 4320 tggcacccag ttgatcggcg cgagatttaa tcgccgcgac aatttgcgac ggcgcgtgca 4380 gggccagact ggaggtggca acgccaatca gcaacgactg ttigcccgcc agttgttgtg 4440 ccacficggtt gggaatgtaa ttcagctccg ccatcgccgc ttccactttt tcccgcgttt 4500 tcgcagaaac gtggctggcc tggttcacca cgcgggaaac ggtctgataa gagacaccgg 4560 catactctgc gacatcgtat aacgttactg gtttcacatt caccaccctg aattgactct 4620 cttccgggcg ctatcatgcc ataccgcgaa aggttttgcg ccattcgatg gtgtccggga 4680 tctcgacgct ctcccttatg cgactcctgc attaggaagc agcccagtag taggttgagg 4740 ccgttgagca ccgccgccgc aaggaatggt gcatgcaagg agatggcgcc caacagtccc 4800 ccggccacgg ggcctgccac catacccacg ccgaaacaag c-gctcatgag cccgaagtgg 4860 cgagcccgai cttccccatc ggtgatgtcg gcgatatagg cgccagcaac cgcacctgtg 4920 gcgccggtga tgccggccac gatgcgtccg gcgtagagga tcgagatctc gatcccgcga 4980 aattaatacg actcactata ggggaatigt gagcggataa caattcccct ctagaaataa 5040 ttttgtttaa ctttaagaag gagatataca tatggaagct cgtcgttctg cgaactacga 5100 acctaacagc tgggactatg attacctgct gtcctccgac acggacgagt ccatcgaagt 5!60 atacaaagac aaagcgaaaa agctggaagc cgaagttcgt cgcgagatta ataacgaaaa 5220 agcagiiattt cigaccctgc tggaactgai 丨gacaacgic cagcgccigg gcctgggtta ccgtttcgag tctgatatcc gtggtgcgct ggalcgcttc gtttcctccg gcggcttcga 5340 tgcggtaacc aagacttccc tgcacggtac ggcactfitct ticcgtctgc tgcgtcaaca 5400 cggtttigag gtttctcagg aagcgttcag cggcttcaaa gaccaaaacg gcaacttcct 5460 ggagaaccig aaggaagata tcaaagctai cctgagcctg tacgaggcca gcttcctggc 5520 tctggaaggc gaaaacatcc tggacgaggc gaaggttttc gcaatctctc atctgaaaga 5580 actgtctgaa gaaaagatcg gtaaagagct ggcagaacag gtgaaccatg cactggaact 5640 gccactgcat cgccgtactc agcgtctgga agcagiatfig tctatcgagg cctaccgiaa 5700 aaaggaggac gcgaatcagg ttctgctgga gctggcaatt ctggattaca acatgatcca 5760 gtctgtatac cagcgtgatc Igcgtgaaac gtcccgttgg tggcgtcgtg tgfigtctggc 5820 gaccaaactg cactttgctc gigaccgcct gattgagagc 1tctactggg ccgtgggtgt 5880 agcaticgaa ccgcaatact ccgactgccg taactccgtc gcaaaaatgt tttctttcgt 5940 aaccattatc gacgatatct acgatgtala cggcaccctE gacgaactgg agctgtttac 6000 tgatgcagtt gagcgttggg acgtaaacgc catcaacgac ctgccggatt acatgaaact 6060 -51 - 149048-序列表.doc 201111512 glgctttcig gctctgtata acactattaa cgaaatcgcc tacgacaacc tgaaagataa 6120 aggtgagaac atcctgccgt atctgaccaa agcctgggct gacctgtgca acgctlicet 6180 gcaagaagcc aagtggctgl acaacanatc tactccgacc tttgacgact aetteggeaa 6240 egeatfigaaa rcctcttctg gcccgctgca actggtgilc gctlacttcg ctgtcgtgca 6300 gaacattaaa aaggaagaga tcgaaaacct gcaaaaaiac catgacacca tctctcgtcc 6360 ttcccatatc ttccgtctgt gcaatgacct ggctagcgcg tctgcggaaa ttgcgcgtgg 6420 tgaaaccgca aatagcgttt cttgttacat gcgcactaaa 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1200 etttgccatg tttcagaaac aactctggcg catcgggctt cccatacaat egatagattg 1260 tcgcacctga ttgcccgaca ttategegag cccatttata cccatataaa tcagcatcca 1320 tgrtggaim Laategegge ctagagcaag acgtitcccg ttgaataigg ctcataacac 】380 ccctigtatt actgtttatg taagcagaca gtttiattgt tcatgaccaa aatcccttaa 1440 cgtgagtut cgltccactg agegteagae cccgtagaaa agatcaaagg atettettga 1500 gatccmu ttctgcgcgt aatct£ctgc ttgcaaacaa aaaaaccacc gctaccagcg 1560 gtggUtgtt tgccggalca agagctacca sctctttttc cgaaggtaac tggcttcagc 1620 agagcgcaga taccaaatac igtcctlcta gtgtagccgt agttaggcca ccacttcaag 1680 aactctgtag caccgcctac atacctcgct ctgctaatcc tgttaccagt ggctgctgcc 1740 agtggcgata agtcgtgtct taccgggttg gactcaagac gatagttacc ss^taaggeg 1800 cagcggtcgg gctgaacggg gggttcgtgc acacagccca gcttggagcg aacgacctac 1860 accgaactga gatucctaca gegtgageta tgagaaagcg ccacgcttcc egaagggaea 1920 aaggcggaca ggtatccggt aageygeagg gtcggaacas fiagagcucac fiauggagett 1980 ccagggggaa acgcctggta tctttatagt cctgtcgggt ttcgccacct ctgacttgag 2040 egtegatm tgtgalgctc gtcagggggg cggagcctat ggaaaaacgc cagcaacgcg 2100 gccntttac ggttcciggc cttltgctgg ccttttgctc acatgttctt tcctecgtta 2360 tcccctgatt ctgtggataa ccgtaiiacc ficctttgagt gagcigatac cgctcgccgc 2220 ageegaaega ccgagcgcag egagteagtg agegaggaag eggaagageg cctgatgcgg 2280 uttitctcc Uacgcatct gtgcggtatt tcacaccgca tatatggtgc actctcagta 2340 caatctgctc igatgeegea tagttaagee agtatacact ccgciatcgc tacgtgactg 2400 ggtcatggct gcgccccgac acccgccaac acccgctgac gcgccctgac gggcttgtct 2460 gctcccggca tccgcttaca gacaagctgt gaccgtcicc gfigagctgca tfitgtcagag 2520 gttttcaccg tcatcaccga aaegegegag gcagctgcgg taaagctcat cagcgtggtc 2580 gtgaagegat tcacagatgt ctgcctgttc atccgcgtcc agctcgttga gtttctccag 2640 aagcgttaat gtetfigette tgataaagcg ggccatgtta agggcggttt tttcctgttt 2700 ggtcactgat gcctccgtgl aagggggart ictgttcatg ggggtaatga taccgatgaa 2760 aegagagagg atgctcacga tacgggUac tgatgatgaa catgcccggt tactggaacg 2820 ttgtgagggt aaacaactgg CEgtatggat gegeegggae cagagaaaaa tcacicaggg 2880 tcaatgccag cgcttcgtla atacagatgt aggtgttcca cagggtagcc agcagcatcc 2940 tgcgatgcag atccggaaca laatggtgca gggcgctgac ttccgcgttt ccagacUta 3000 cgaaacacgg aaaccgaaga ccattcatgt 丨gttgctcag gtcgcagacg tmgeagea 3060 gcagtcgctt cacgttcgct egegtategg igattcattc tgctaaccag taaggcaacc 3120 ccgccagcct agccgggtcc tcaacgacag gageaegate atgcgcaccc gtggggccgc 3180 catgccggcg ataatggcct gcttctcgcc gaaacgutg glggcgggac cagtgacgaa 3240 ggcttgagcg agggcgtgca agattccgaa taccgcaagc gacaggccga 丨catcgicgc 3300 gctccagcga aagcggtcct cgccgaaaat gacccagagc gctgccggca cctgtcctac 3360 gagUgcatg aUaagaaga cagtcataag tgcggcgacg a丨aglcatgc cccgcgccca 3420 ccggaaggag ctgactgggt Lgaaggetet caagggcatc ggtegagate ccggtgccta 34S0 atgagtgage taacttacat taangcgtt gcgctcactg cccgctttcc agtcgggaaa 3540 cctgtcgtgc cagctgcatt aatgaategg ccaacgcgcg gggagaggcg gtttgcgtat 3600 52·

149048-序列表.doc 201111512

tgggcgccag ggtggttttt cttttcacca gtgagacggg caacagctga ttgcccttca 3660 ccgcctggcc ctgagagagt tgcagcaagc ggtccacgct ggtttgcccc agcaggcgaa 3720 aatcctgttt gatggtggtt aacggcggga tataacatga gctgtcttcg gtatcgtcgt 3780 atcccactac cgagatatcc gcaccaacgc gcagcccgga crcggtaatg gcgcgcatig 3840 cgcccagcgc catctgatcg ttggcaacca gcatcgcagt gggaacgatg ccctcattca 3900 gcamgcat ggtttgttga aaaccggaca tggcactcca gtcgccttcc cgttccgcta 3960 tcggctgaat ttgattgcga gtgagatatt taigccagcc agccagacgc agacgcgccg 4020 agacagaact iaaigggccc gctaacagcg cgatttgctg gtgacccaat gcgaccagat 4080 gctccacgcc cagtcgcgta ccgtcttcat gggagaaaat aatacigttg atgggtgtct 4140 ggtcagagac atcaagaaat aacgccggaa catugtgca ggcagcttcc acagcaatgg 4200 catccrggtc atccagcgga tagttaatga tcagcccact gacgcgttgc gcgagaagat 4260 tgtgcaccgc cgctitacag gcttcgacgc cgcitcgttc iaccatcgac accaccacgc 4320 tggcacccag ttgatcggcg cgagarttaa icgccgcgac aatttgcgac ggcgcgtgca 4380 Bggccagact ggaggtggca acgccaalca gcaacgacig tttgcccgcc agttgugtg 4440 ccacgcggtt 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tctgatatcc gtggtgcgct ggatcgcttc gutcctccg gcggcttcga 5340 Igcggtaacc aagacttccc tgcacggtac ggcactgtct ttccgtctgc tgcgtcaaca 5400 cggttttgag gtttcrcagg aagcgttcag cggcttcaaa gaccaaaacg gcaacttcct 5460 ggagaacct.g aaggaagata rcaaagctat cctgagccig tacgaggcca gctlcctggc 5520 tctggaaggc gaaaacatcc tggacgaggc gaaggitttc gcaatctctc atctgaaaga 55SO actgtctgaa gaaaagatcg gtaaagagct ggcagaacag gtgaaccatg cactggaact 5640 gccactgcat cgccgtacic agcgtctgga agcagtatgg tctatcgagg cctaccgtaa 5700 aaaggaggac gcgaatcagg ttctgctgga gciggcaalt Qtggattaca acatgatcca 5760 gtctgtatac cagcgtgatc tgcgtgaaac gtcccgttgg tggcgtcgtg tgggtctggc 5820 gaccaaactg cactttgctc gtgaccgcct gattgagagc ttctactggg ccgtgggtgt 5880 agcattcgaa ccgcaatact ccgactgccg taactccgtc gcaaaaatgt tttctttcgt 5940 aaccattaic gacgatatct acgatgtata cggcaccctg gacgaactgg agctgutac 6000 tgatgcagtt gagcgttggg acgtaaacgc catcaacgac ctgccggatt acatgaaact 6060 gtgctttctg gctctgtata acactauaa cgaaatcgcc 丨ac邱caacc tgaaagataa 6120 aggtgagaac 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attcccggat cgctacttcg acgtggcaat tgccgagcaa cacgcggtga 7860 ccttlgctgc gggtctggcg attggtgggt acaaacccat tgtcgcgatt tactccactt 7920 tcctgcaacg cgcctatgat caggtgctgc atgacgtggc gattcaaaag cttccggtcc 7980 tgttcgccat cgaccgcgcg ggcattgttg gtgctgacgg tcaaacccaE cagggtgctt 8040 ugatcictc ttacctgcgc Egcataccgg aaatggtcai tatgaccccg agcgatgaaa 8100 acgaatgtcg ccagatgctc Eataccggct atcactataa cgatggcccg tcagcggtgc 8160 gctacccgcg tggcaacgcg gtcggcgtgg aactgacgcc gctggaaaaa ctaccaattg S220 gcaaaggcat tgtgaagcgt cgtggcgaga aactggcgat cctiaacttt ggtacgctga 8230 tgcca-gaagc ggcgaaagtc gccgaatcgc tgaacgccac gctggtcgat atgc-gttttg 8340 tgaaaccgct tgatgaagcg ttaattctgg aaatggccgc cagccatgaa gcgctggtca S400 ccgtagaaga aaacgccatt atgggcggcg caggcagcgg cgtgaacgaa gtgctgatgg 8460 cccatcgtaa accagtaccc gtgctgaaca ttggcctgcc ggacucttt auccgcaag 8520 gaactcagga agaaatgcgc gccgaactcg gcctcgatgc cgctggtatg gaagccaaaa 8580 tcaaggcctg gctggcataa ctgcatcgcc cttaggaggt aaaaaaaaat gactgccgac S640 aacaatagta 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cut^gaatgc tataacaacg cgtcctgcag ctggcggccs cactcgagca ccaccaccac 9540 caccactgag atccggctgc taacaaagcc cgaaaggaag ctgagttggc tgctgccacc 9600 gcigagcaat aactagcata accccttggg gccictaaac gggtcttgag gEgttttttg 9660 ctgaaaggag gaactatatc cggat 9685 <210> 110 <211> 9685 <212> I>NA <213>人工序列 <220> <2心合成構築體 <400> 110 tggcgaatgg gacgcgccct gtagcggcgc attaagcgcg gcgggtgtgg tggttacgcg 60 cagcgtgacc gctacacttg ccagcgccct agcgcccgct cctttcgctt icttcccttc 120 cttlctcgcc acgtlcgccg gctttccccg tcaagctcia aarcgggggc tccctttagg 180 gttccgattt agtgctitac ggcaccicga ccccaaaaaa citgaltagg glgatggtlc 240 acgtagtggg ccatcgccct gatagacggt tHtcgccct itgacgttgg agtccacgtt 300 ctuaatagt ggactcugi iccaaacigg aacaacactc aaccctatct cggtctattc 360 ttttgattta laagggattt tgccgatttc ggcctattgg ttaaaaaatg agctgattta 420 acaaaaaut aacgcgaau Uaacaaaat atuacgut acaatucag gtggcacitt 480 tcggggaaat gtgcgcggaa cccctatttg tttatttttc taaatacatt caaatatgta 540 tccgctcatg aattaattct tagaaaaact catcgagcat caaatgaaac tgcaatttat 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Icgcacctga ttgcccgaca ttatcgcgag cccatttata cccatataaa tcagcatcca 1320 tgttggaatt taatcgcggc ciagagcaag acgttlcccg ttgaatatgg ctcataacac 1380 cccttglatl actgtttatg taagcagaca ettttattgt tcatgaccaa aatcccttaa 1440 cgtgagtttt cgttccactg agcgtcagac cccgtagaaa agatcaaag£ atcttcttga 1500

Satccttttt tictgcgcgt aatctgctgc ilgcaaacaa aaaaaccacc gctaccagcg 1560 gtggtttgtt Igccggatca agagctacca actctltttc cgaaggtaac tggcttcagc 1620 agagcgcaga taccaaatac tgtccttcta gtgtagccgt agttaggcca ccacttcaafl 1680 aactctgtag caccgcctac atacctcgct ciEcUatcc Igttaccagt ggctgclgcc 1740 ugtggcgaia agtcgtgtct laccggeitg gactcaagac gatagttacc ggataaggcg 1800 cagcggtcgg gctgaacggg gggttcglgc acacagccca gcttggagcg aacgacctac 1860 accgaactga gatacctaca gcgtgagcta igagaaa^cg ccacgcttcc cgaagggaga 1920 aaggcggaca ggtatccggt aagcggcagg glcggaacag gagagcgcac gagggagclt 1980 ccagEBggaa acgcctggta tctttatagt cctBtcgggt tlcgccacct clgacttgag 2040 cgtcgatttt tgtgatgc丨c gtcagggggg cg£agccu〖 Egaaaaacgc cagcaacgcg 2100 gccltlttac ggltcctggc citttgcigg ccttttgctc acatgttctt tcctgcgtta 2160 tcccctgau ctgtggataa ccgtattacc gcclttgagt gagctgatac cgctcgccgc 2220 agccgaacga ccgagcgcag cgagtcaglg agcgaggaag cegaagagcg cclgatgcgg 2280 latlltctcc Uacgcatct gtgcgglatt tcacaccgca lalatggtgc actctcagta 2340 caatctgctc tgatgccgca tagttaagcc agtatacact ccgctatcgc tacglgactg 2400 ggtcatggct gcficcccgac acccgccaac acccgctgac gcgccctgac sggctIgtct 2460 gctcccggca tccgcttaca gacaagctgt gacxgtctcc gggagctgca tgtgtcagag 2520 gttttcaccg tcatcaccga aacgcgcgag gcagctgcgg taaagctcai cagcgtggtc 2580 gtgaagcgat tcacagatgt ctgcctgttc atccgcgtcc agctcgttga gtttctccag 2640 aagcgttaat gtctggcttc tgataaagcg ggccatgtta agggcggttt tttcctgttt 27CX) ggtcactgai gcctccgtgt aagggggatl tctgttcatg ggggtaatga taccgatgaa 2760 acgagagagg aigctcacga tacgggttac tsalgatgaa catgcccggi tactggaacg 2820 ttgtgagggt aaacaactgg cggtatggat gcggcgggao cagagaaaaa Ecactcaggg 2S80 tcaatgccag cgcttcgtta atacagatgt aggtgttcca cagggtagcc agcagcatcc 2940 tgcgalgcag atccggaaca taatggtgca gggcgctgac ttccgcgtlt ccagacttta 3000 cgaaacacgg aaaccgaaga ccaucatgt tgitgctcag gtcgcagacg tftfgcagca 3060 gcagtcgcu cacgttcgct cgcgtatcgg tgattcattc tgctaaccag taaggcaacc 3120 ccBCcagcct agccgggtcc tcaacgacag gagcacgatc atgcgcaccc grggggccgc 3180 catgccggcg ataatggcct gcttcicgcc gaaacgtttg gtggcgggac cagtgacgaa 3240 ggcttgagcg agggcgtgca agattccgaa taccgcaagc gacaggccga tcatcgtcgc 3300 gctccagcga aagcggtcct cgccgaaaat gacccagagc gctgccggca cctgtcctac 3360 gagttgcatg ataaagaaga cagtcataag tgcggcgacg atagtcatgc cccgcgccca 3420 ccggaaggag ctgactgggt tgaaggctct caagggcatc ggtcgagatc ccggtgccta 3480 atgagtgagc (aacitacat taattgcgtl gcgcicactg cccgctlicc agrcgggaaa 3540 cctgtcgtgc cagctgcatt aatgaatcgg ccaacgcgcg gggagaggcg gtttgcgtat 3600 54·

149048-序列表.doc 201111512

Uggcgccag ggtggttltt cltttcacca gtgagacggg caacagctga ttgcccttca 3660 ccgcctggcc ctgagagagt tgcagcaagc ggtccacgct ggtttgcccc agcaggcgaa 3720 aatcctgtti gatggtggtt aacggcggga tataacatga gctgtcttcg gtatcgtcgt 3780 aicccactac cgagatatcc gcaccaacgc gcagcccgga ctcggtaatg gcgcgcattg 3840 cgcccagcgc catctgatcg ttggcaacca gcatcgcagt £&&aacgatg ccctcattca 3900 gcattigcat ggtttgUga aaaccg^aca Iggcactcca gtcgccttcc cgttccgcta 3960 tcggctgaat ttgattgcga gtgagatatt tatgccagcc agccagacgc agacgcgccg agacagaaci taatgggccc gctaacagcg cgatttgctg gtgacccaat gcgaccagat 4080 gciccacgcc cagtcgcgta ccgtcttcat gggagaaaat aatactgttg atgggtgtct 4140 ggtcagagac atcaagaaat aacgccggaa cattagtgca g^cagctlcc acagcaatgg 4200 catcctggtc atccagcgga tagrtaatga tcagcccact gacgcgttgc gcgagaagat 4260 igigcaccgc cgctltacag gcttcgacsc cgcttcgttc taccatcgac accaccacgc 4320 tggcacccag ttgatcggcg cgagatttaa tcgccgcgac aatttgcgac ggcgcgtgca 4380 gggccagact ggaggiggca acgccaalca gcaacgactg tttgcccgcc agttgttgtg 4440 ccacgcggtt gggaatgtaa ttcagctccg ccatcgccgc ttccacutt tcccgcgttt 4500 tcgcagaaac gtggctggcc iggttcacca cgcgggaaac ggtctgataa gagacaccgg 4560 catactctgc gacatcgtat aacgttacig gutcacau caccaccctg aattgactct 4620 cttccgggcg ctatcatgcc ataccgcgaa aggttttgcg ccattcgatg gtgtccggga 4680 tctcgacgct ctcccttatg cgactccigc atiaggaagc agcccagtag taggttgagg 4740 ccgtigagca ccgccgccgc aaggaaiggt gcaigcaagg agatggcgcc caacagtccc 4800 ccggccacgg ggcctaccac catacccacg ccgaaacaag cgctcaigag cccgaagtgg 4860 cgagcccgat cttccccatc ggtgatgtcg gcgatatagg cgc-cagcaac cgcacctgts 4920 gcgccggtga tgccggccac gatgcgtccg gcgtagagga tcgagatctc gatcccgcga 4980 aattaatacg actcactata ggggaattgt gagcggataa caattcccct ctagaaataa 5040

Etttglttaa ctttaagaag gagatataca iatggaagct cgtcgttctg cgaactacga 5100 acctaacafic tgggactatg attacctgct gtcctccsac acgfiacgaat ccatcgaagt 5160 atacaaagac aaagcgaaaa agctggaagc cgaagttcgt cgcgagatta ataacgaaaa 5220 agcagaattt ctgaccctgc tggaactgac tgacaacglc cagcgcctgg gcctgggtta 5280

ccgtttcgag ictgataicc gtggtgcgct ggatcgcttc gtttcctccg gcggcttcga 5340 tgcggtaacc aagacttccc tgcacggtac ggcactgtct Itccgtcigc tgcgtcaaca 5400 cggttitgag gtttctcagg aagcgttcag cggcltcaaa gaccaaaacg gcaactrcct 5460 ggagaacctg aaggaagata tcaaagctat cctgagcctg tacgaggcca gcttcctggc 5520 tctggaaggc gaaaacatcc tggacgaeec gaageUttc gcaatclclc atctgaaaga 5580 aclgtctgaa gaaaagatcg gtaaagagct ggcagaacag gigaaccatg cactggaact 5640 gccactgcat cgccgEactc agcgtctgga agcagtatgg tctatcgagg cctaccgtaa 5700 aaaggaggac gcgaatcagg Uctgctgga gctggcaau ctEgattaca acatgatcca 5760 gtctgtatac cagcgtgatc tgcgtgaaac gtcccgttgg tggcgtcgtg tgggtctggc 5820 gaccaaactg cactttgctc gtgaccgcct gattgagagc ttctactggg ccgtgggtgt 5880 agcattcgaa ccgcaatact ccgacEgccg taactccgtc gcaaaaatgt Utctticgt 5940 aaccattatc gacgatatct acgatgtata cggcaccctg gacgaactgg agctgtttac 6000 tgatgcagtt gagcgttggg acgtaaacgc catcaacgac ctgccggatt acatgaaact 6060 gtgctuctg gctctgtata acactattaa cgaaatcgcc tacgacaacc tgaaagataa 6120 aggtgagaac 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aitcccgfial cgctactlcg acglggcaat tgccgagcaa cacgcggtga 7S60 cctttgctgc gggtctggcg attggtgggt acaaacccat tgtcgcgatt tactccacit 700 tcctgcaacg cgcctatgat caggtgctgc atgacgtggc gattcaaaag cttccggtcc 7980 tgttcgccat cgaccgcgcg ggcattgitg gtgctgacgg tcaaacccat cagggtgctt 8040 ttgatcictc ttacctgcgc tgcataccgg aaatggtcat tatgaccccg agcgatgaaa 8100 acgaaigtcg ccagatgctc tataccggct atcactataa cgatggcccg Ecagcggtgc 8160 gclacccgcg ugcaacgcg gtcggcetgE aactgacgcc gctggaaaaa ctaccaattg 8220 gcaaaggcat tgtgaaecgt cgtggcgaga aactggcgat ccttaacttt ggtacgctga 8280 tgccagaagc ggcgaaagtc gccgaatcgc tgaacgccac gctggtcgat atgcgitUg 8340 tgaaaccgct tgatgaagcg ttaattcigg aaatggccgc cagccatgaa gcgctggtca 8400 ccgtagaaga aaacgccatt atgggcggcg caggcagcgg cgtgaacgaa gtgctgatgg 8460 cccatcglaa accagtaccc glgctgaaca Uggcctgcc ggacttcttt attccgcaag 8520 gaactcagga agaaatgcgc gccgaactcg gcctcgatgc cgctggtatg gaagccaaaa 8580 tcaaggcctg gctggcataa ctgcatcgcc cttaggaggt aaaaaaaaat eactgccgac 8640 aacaatagta tgccccateg tgcagtatct agttacgcca aattagtgca aaaccaaaca 8700 cctgaagaca UUggaaga gtucctgaa attattccat tacaacaaag acctaatacc 8760 cgatcUgig agacgtcaaa tgac'gaaagc ggagaaacal gmttclgg tcatgatg战 8820 55- 149048·序列表.doc 201111512 gugcaaatta agttaatgaa tgaaaattgt attgttttgg attgggacga taatgctatt 8880 名Gtgccggu ccaagaaag〖 itgtcattta atggaaaata ttgaaaaggg tttactacat 的40 cjjtgcattci ccgtctUat tttcaaigaa caaggtgaat tacttttaca acaaagagcc 9000 actgaaaaaa taacttlccc tgatctttgg actaacacat gctgctctca tccactatgt 9060 attgatgacg aaltagglU gaagegiaag ctagacgata agattaaggg cgctattact 9120 gcggcggtga gaaaactaga tcalgaatta ggtattccag aagatgaaac taagacaagg 9180 ggtaagtttc actttttaaa cagaatccal tacatggcac caagcaatga accatggggt 9240 gaacatgaaa Ugaltacat cctattttat aagatcaacg ctaaagaaaa cttgactgtc 9300 aacccaaacg tcaatgaagt tagagacttc aaatgggttt caccaaatga tttgaaaact 9360 atgtttgctg acccaagtta caagltlacg cctlgEttta agattatttg cgagaattac 9420 ttattcaact ggtgggagca attagatgac ctltctgaag tggaaaatga caggcaaatt 9480 catagaatgc tataacaacg cgtcctgcag ctggcggccg cactcgagca ccaccaccac 9540 caccactgag atccggctfic taacaaagcc cgaaaggaag ctgagttggc tgctgccacc 9600 Ectgagcaat aactagcata accccttggg gcctctaaac gggtcttgag gggtttittg 9660 ctgaaaggag gaactatatc cggat 9685

<210> 111 <21l> 32 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>合成構築體 <4〇o> in cagcagcagg gatccgacgc gttgttatag ca <210> 112 <2li> 32 <212> DNA <213>人工序列 <220><223>合成構築體 <400> 112 cagcagcagc atatgacigc cgacaacaat ag <210> 113 <211> 25 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>合成構築體 <400> 113 gaaacctaca tccaatctlt tgccc <210> 114 <211> 25 <2i2> DNA <213>人工序列 <220>合成構築體 <400> 114 gctatgcttc attagatcct latcg <210> 115 <2U> 24 <212> DNA <2丨3>人工序列 <220><223>合成構築體 <400> 115 Ugccaaica tatgattgaa aatc <210> 116 <211> 23 <212> DNA <213>人工序列 <220><2❿合成構築體 <400> 116 gaaatagccc cattagaagt ate <2)0> 117 <211> 26 <212> DNA 32 32 25 25 24 149048·序列表.doc 56- 23 201111512 <2!3>人工序列 <220> <223>合成構築體 <400> 117 atgacaattg ggaugalaa aattag 26

<210> 118 <2Π> 20 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>合成構築體 <400> 118 cttaaatcat ttaaaaugc <210> 119 <211> 26 <2i2> DMA <2!3>人工序列 <220> <223>合成構築體 <400> 119 atgaaaacag tagitattat tgatgc <210> 120 <21l> 33 <212> DNA 人工序列 <220> <223>合成構築體 <400> 120 cgatctagas aggcccagtc tttcgactga gcc <210> 12i <2!1> 34 ,<212> DNA <213>人工序列 <220> <223>合成構築體 <400> 121 atgctcgagc tgttgacaat taatcatccg gctc <210> 122 <211> 452 <212> m <2丨3>人工序列 <220> <223>合成構築體 20 26 33 34 <400> 122 aaagaccgac caagcgacgt ctgagagctc cctggcgaat tcggtaccaa taaaagagct 60 itattttcat gaictgtgtg ttggtttttg tEtficggcgc ggaagttcct atlctctaga 120 aagtatagga acttcctcga gccctatagt gagtcgtatt agcccttgac aatgccacat 180 cctgagcaaa taattcaacc acttttattc actaacaaat agctggtgga atatatgaag 240 caactcacca ttctgggctc gaccggcicg attggttgca gcacgctgga cglggtgcgc 300 cataatcccg aacactlccg cgiagttgcg ctggtgEcag gcaaaaatgt cactcgcatg 360 gEagaacagt gcctggaatt ctctccccgc tatgccgtaa tggacgatga agcgagtgcg 420 aaacttctta aaacgatgct acagcaacag gg 452 <210> 123 <211> 337 <212> DNA <213〉人工序列 <220> 合成構築體 <400> 123 aaagaccgac caagcgacgt ctgagagctc cctggcgaat tcggtaccaa taaaagagct 60 icartttcat gaictgtglg ttggtttag rgtgcggcgc ggaagttcct artciciaga 120 aagtatagga acucctcga gccctatagt gagtcglatt aagataacca tctgcggtga 180 taaattatct ctggcggtgt igacataaat accactggcg gtgatactga gcacstcagc 240 aggacgcact gcaaaggagg taaaaaaaca tgagttttga tattgccaaa tacccgaccc 300 tggcaciggt cgactccacc caggagttac gactgtt 337 <210> 124 57· 149048-序列表.doc 201111512 <21!> 22 <212> m <2】3>人工序列 <220> <223>合成構築體 <400> 124 ccctgttect gtagcatcgt tt <210> 125 <2Π> 200 <212> DNA <213>人工序列 <220> <U3>合成構築體 <220> <221> misc feature <222> 133

<223> n = A、T、C或G <400> 125 aacagtcgta actcctgggt ggagtcgacc agtgccaggg tcgggtattt gRcaatatca aaacrcatgl ttttttacct cctttgcagt gcgicctECt galgtgctca Etatcaccgc cagtggtatt tangtcaaca ccgccagaga taatttatca ccgcagatgg ttatcttaat acgactcact atagggctcg <210> 126 <2))> 103 <212> DNA <213>人工序列 <220> <22>合成構築體 <400> 126 acaaaaacgc cfictcagtag atccttgcgg atcggctggc ggcgttttgc tttttattct Hlclcaactc tggatgtnc aattaaccct cactaaaggg egg <210> 127 <211> 177 <212> DMA <213>人工序列 <220> <223>合成構築體 <220> <22】> misc-feature <222> 144 "

<223> n = A、T、C或G <400> 127 tgttcgggai tatggcgcac cacgtccagc glgctgcaac caatcgagcc ggtcgagccc agaatggtga gttgcttcat atattccacc agctatttgt tagtgaataa aagtggttga aitatttgct caggatgtgg camglcaag ggctaalacg aclcactata gggeteg <210> 128 <2H> 103 <2)2> DNA <2】3>人工序列 <220> <223>合成構築體 <400> 128 tcgatacctc ggcactggaa gegetagegg actacatcat ccagcgtaat aaataaacaa taagtattaa laggcccctg aattaaccct cactaaaggs egg

<210> 129 <211> 1702 <212> DNA <2】3>人工序列 <220> <223>合成構築體 <220> <221> misc^fcaturc <222> 1636 <223> n = A、T、C或G <400> 129 aelaaaggge ggeegegaag ttcctattci ctagaaagia taggaaette atvctaccgg gtaggggagg cgctutccc aaggcaglct ggagcatgcg ctttascagc cccgctgggc 58- 149048-序列表.doc 201111512 acttggcgct acacaagtgg cctctggcct cgcacacatt ccacatccac cggtaggcgc 180 caaccggcic cgttcittgg tggccccttc gcgccaccrt ccactcctcc cctagtcagg 240 aagttccccc ccgccccgca gctcgcgtcg tgcaggacgt gacaaatgga agtagcacgt 300 ctcactagtc tcgtgcagat ggacagcacc gctgagcaat ggaagcgggt aggcctttgg 360 ggcaecggcc aatagcagct ttgctccttc gctttctggg ctcagaggct gggaaggggt 420 gggtccgggg gcgggctcag gggcgggctc aggggcgggg cgggcgcccg aaggtcctcc 480 ggaggcccgg cattctgcac gcttcaaaag cgcacgtcig ccgcgctgtt ctcctcttcc 540 tcatctccgg gcctttcgac ctgcagcagc acgtgttgac aattaatcat cggcatagta 600 tatcggcata gtaraatacg acaaggrgag gaactaaacc atgggatcgg ccattgaaca 660 agatggattg cacgcaggtt ctccggccgc ttgggtggag aggctattcg gctatgactg 720 ggcacaacag acgatcggct gctctgatgc cgccgtgttc cggctgtcag cgcaggggcg 780 cccggttcti titgtcaaga ccgacccgic cggigccctg aatgaactgc aggacgaggc 840 agcgcggcta tcgtggctgg ccacgacggg cgttccttgc gcagctgtgc tcgacgttgt 900 cactgaagcg ggaagggact ggctgctatt gggcgaagtg ccggggcagg atctcctgtc 960 alctcacctt gctccigccg agaaagtalc catcatggct gatgcaatgc ggcggctgca 1020 tacgcttgat ccggctacct gcccattcga ccaccaagcg aaacatcgca tcgagcgagc 1080 acgtactcgg atggaagccg gtcEtgtcga tcaggatgat ctggacgaag agcatcaggg 1140 gctcgcgcca gccgaactgt tcgccaggct caaggcgcgc aigcccgacg gcgaggatct 1200 cgtcgtgacc catggcgaig cctgcttgcc gaaialcatg gtggaaaatg gccgcttttc 1260 tggaticatc gactgtggcc ggcigggigt ggcggaccgc tatca&gaca tagcgttggc 1320 tacccgtgat atigctgaag agcttggcgg cgaatgggct gaccgcttcc tcgtgcttta 1380 cggtatcgcc gctcccgatt cgcagcgcat cgccttctat cgccttcitg acgagttctt 1440 ctgagcggga ctctggggtt cgaataaaga ccgaccaagc gacgtctgag agctccctgg 1500 cgaattcggt accaataaaa gagctttatt ucalgatct glgtgttggt ttttgtgtgc 1560 ggcgcggaag ttcctattct ctagaaagta taggaacttc ctcgagccct atagtgagtc 1620 gtaUagccc ttgacnatgc cacatcctga gcaaataatt caaccacttt tattcactaa caaatagctg gtggaatata tg 1702

<2]〇> 130 <211> 1724 <2i2> m <2】3>人工序列 <220> <223>合成構築體 <220> <22J> misc feature <222> 1657

<223> n = A、T、C或G <400> 130 cgcgaagttc ciattctcta gaaagtatag gaacttcatt ciaccgggta ggggaggcgc 60 mtcccaag gcagtctgfia gcatgcgcit lagcagcccc gcigggcact tggcgctaca 120 caagtggcct ctggcctcgc acacattcca catccaccgg taggcgccaa ccggctccgt 180 ictttggtgg ccccitcgcg ccaccttcca clcctcccct agtcaggaag ttcccccccg 240 ccccgcagct cgcgtcgtgc aggacgtgac aaatggaag丨 agcacgtctc actagtctcg 300 tgcagatgga cagcaccgct gagcaatgga agcgggtagg cctttggggc agcggccaat 360 agcagclttg ctccttcgct ttctfiggctc agaggctggg aagfiggtggg tccgggegcg 420 ggctcagggg cgggctcagg ggcggggcgg gcgcccgaag gtcctccgga ggcccggcat 480 tctgcacgct tcaaaagcgc acgtctgccg cgctgttclc ctctlcclca tctccgggcc 540 tttcgacctg cagcagcacg tgEtgacaat taatcatcgg catagtatat cggcatagta 600 taalacgaca aggtgaggaa ctaaaccatg ggatcggcca ttgaacaaga tggattgcac 660 gcaggttctc cggccgcUg ggtggagagg clattcggct atgactgggc acaacagacg 720 atcggctgct ctgatgccgc cgtgttccgg ctgtcagcgc aggggcgccc ggttcttttt 780 gtcaagaccg acctgtccgg tgccctgaat gaactgcagg acgaggcagc gcggctatcg 840 tggctggcca cgacgggcgt tccttgcgca gctgtgctcg acgtlgtcac tgaagcggga 900 agggactggc tgctattggg cgaagtgccg gggcaggatc tcctgtcatc tcaccttgct 960 cctficcgaga aagtatccat catgactgat gcaatgcggc ggctgcatac gcttgatccg 1020 gctacctgcc catlcgacca ccaagcgaaa catcgcatcg agcgagcacg iactcggatg 1080 gaagccggtc Ugtcgatca ggatgatctg gacgaagagc atcaggggct cgcgccagcc 丨1的

gaaclgttcg ccaggctcaa ggcgcficatg cccgacggcg aggalctcgt cgtgacccat 12QQ ggcgatgcct gcttgccgaa tatcatggtg gaaaatggcc gcttttctgg attcatcgac 1260 tgtggccggc tgggtgtggc ggaccgclat caggacatag cgttggctac ccgtgatatt 1320 gctgaagagc ttggcggcga atgggctgac cgcttcctcg tgctltacgg tatcgccgct 1380 cccgattcgc agcgcatcgc cttctatcgc cttcttgacg agltcltctB agcgggactc 1440 tggggttcga ataaagaccg accaagcgac gtctgagagc iccctggcga attcggtacc 1500 aalaaaagag ctttattttc atgatctgtg tgttggtttt Igtgtgcggc gcggaagttc 1560 ctattctcta gaaagtatag gaacttcctc gagccctala gtgaglcgta ttaagataac 1620 catctgcggt gataaattat ctctggcggt gttgacotaa ataccactgg cggtgatact 1680 gagcacatca gcaggacgca ctgcaaagga ggtaaaaaaa catg 1724 <210> 131 <2!1> 18 <212> DNA <213>人工序列 <220> 合成構築體 <4〇〇> 131 ggcgatagaa ggcgatgc 18 <210> 132 <211> 20 <212> DNA <213:>人工序列 59- 149048-序列表.doc 201111512 <220> <223>合成構築體 <40Q> 132 gagcgcccaa tacgcaaacc 20 <210> 133 <2I1> 21 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>合成構築體 <400> 133 cacrgacagg丨 ttcccgactg g 21 <210> 134 <2ll> 21 <212> DNA <213>人工序列 <220> 合成構築體 <400> 134 ggadcaaga cgatagttac c 21 <210> 135 <211> 22 <2)2> DNA <213>人工序列 <220> <223>合成構築體 <400> 135 fitgatattgc tgaagagctt gg 22 <210> 136 <211> 20 <212> DNA <2丨3>人工序列 <220> <2B>合成構築體 <400> 136 gaactccaag acgaggcagc 20 <210> 137 <211> 20 <2i2> m <213>人工序列 <220> 合成構築體 <400> 137 cgtcgtttla caacgtcgtg 20 <210> 138 <211> 112 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>合成構築體 <400> 138 figatccgtaa tctgtttcct gtgtgaaatt gttatccsct cacaattcca cacattatac 60 gagccgatga ttaattgtca acagaattcc tttccagtcg ggaaacctgt eg 112

<210> 139 <211> 79 <212> DNA 人工序列 <220> <223>合成構築體 <400> 139 taactttaag gaggtataca tatggagctc acficgtgcge ccgcctcgag ctgcagtaca 60 aataaaaaag gcacgtcag 79 <210> 140 60·

149048·序列表.doc 201111512 <211> 94 <212> DNA <2!3>人工序列 <220> <223>合成構築體 <400> 140 ggttaatcat ttcactcttc aattatctat aatgatgagt gatcagaatt acalgtgaga 60 aattaattaa ccctcactaa ngggcggccg cgaa 94 <2I0> 141 <211) 100 <212> ONA <213>人工序列 <220> <223>合成構築體 <220> <22l> misc_feature <222> 64

<223>n = A、T、C^G <400> 141 aiaEtccacc agctatttgt tagtgaataa aagtggrtga attatttgct caggatgtgg 60 catngtcaag ggctaatacg actcactata gggctcgagg 100

<210> M2 <2ll> 100 <212> DNA <213>人工序列 <220> 合成構築體 <220> <221> misc feature <222> 10

<223> n = A、T、C或G <400> 142 gcccttgacn atgccacatc ctgagcaaat aattcaacca cttttattca ctaacaaata 60 gctggtggaa tatatgactg ccgacaacaa tagtatgccc 100 <210> 143 <21l> 82 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>合成構築體 <400> 143 gatgcgtcca gtaaaataag catracgita tgcrcataac cccggcaaat gtcggggut 60 tctatagcat tctatgaatt tg 82 <2lO> 144 <211> 21 <212> DNA <2丨3>人工序列 <220> <223>合成構築體 <400> 144 actgaaacgt utcatcgci c 21 <210> 145 <2U> 35 <2I2> m <2〇>人工序列 <220> 423¾合成構築體 <4〇〇> 145 gatgcgtcca gtaaaataag cattacgtta tgctc 35 <210> 146 <21l> 21 <2i2> DNA <2〇人工序列 <220> <223>合成構築體 -61 - 149048-序列表.doc 21201111512 <m> 146 fitcaggctgg aatactcttc g <210> 147 <2il> 20 <212> DNA <2〇>人工序列 <220> <223>合成構築體 <400> 147 eacgctttcg ccaagtcagg <210> 148 <2U> 30 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>合成構築體 <400> 148 gaggaataaa ccaiggaagc tcgtcgttct <210> 149 <21l> 30 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>合成構築體 <400> 149 agaacgacga gcttccalgg Utattcctc <210> 150 <21l> 23 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>合成構築體 <400> 150 gacagcttat catcgaclgc acg <210> 151 <2ll> 22 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>合成構築體 <400> 151 gcactfitctt tccgtctgct gc <210> 152 <21l> 20 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>合成構築體 <400> 152 ctcgtacagg ctcaggatag <210> 153 <211> 20 <212> DNA <213>人工序列 <220><223>合成構築體 <400> 153 uacgtccca acfictcaact <210> 154 <211> 20 <212> m<213>人工序列 <220>合成構築體 20 30 30 23 22 20

149048-序列表.doc -62- 20 201111512 <4〇α> 154 cttcggcaac gcatggaaat 20 <210> 155 <211> 23 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>合成構築體 <400> 155 cciiggc-aaat tctgt11tat cag 23 <210> 156 <211> 544 <212> PRT <213>人工序列 <220> <U3>合成構築體 <400> 156

Met Glu Ala Arg Arg Ser Ala Asn Tyr Glu Pro Asn Ser Trp Asp Tyr 1 5 10 Ϊ5

Asp Tyr Leu Leu Scr Ser Asp Thr Asp Glu Ser He Glu Val Tyr Lys 20 25 30

Asp Lys Ala Lys Lys Leu Glu Ala Glu Val Arg Arg Glu lie Asn Asn 35 40 45

Glu Lys Ala Glu Phe Leu Thr Leu Leu Glu Leu He Asp Asn Val Gin 50 55 60

Arg Leu Gly Leu Gly Tyr Arg Phe Glu Ser Asp He Arg Gly Ala Leu 65 , 70. 75 80

Asp Arg Phe Val Ser Ser Gly Gly Phe Asp Ala Val Thr Lys Hir Ser 85 90 95

Leu His Gly Thr Ala Leu Ser Phe Arg Leu Leu Arg Gin His Gly Phe 100 105 no

Glu Val Ser Gin Glu Ala Phe Ser Gly Phe Lys Asp Gin Asn Gly Asn 115 120 325

Phe Leu Glu Asn Leu Lys Glu Asp lie Lys Ala He Leu Ser Leu Tyr 130 135 140

Glu Ala Ser Phe Leu Ala Leu Glu Gly Glu Asn lie Leu Asp Giu Ala 145 150 155 160

Lys Val Phe Ala lie Ser His Leu Lys Glu Leu Scr Glu Glu Lys lie 165 170 175

Gly Lys Glu Leu Ala Glu Gin Val Asn His Ala Leu Glu Leu Pro Leu 180 185 190

His Arg Arg Thr Gin Arg Leu Glu Ala Val Trp Scr He Glu Ala Tyr 195 200 205

Arg Lys Lys Glu Asp Ala Asn G!n Val Leu Leu Glu Leu Ala lie Leu 210 215 220

Asp Tyr Asn Met lie Gin Ser Val Tyr Gin Arg Asp Leu Arg Glu Thr 225 230 235 240

Scr Arg Trp Trp Arg Arg Val Gly Leu Ala Thr Lys Leu His Phe Ala 245 250 255

Arg Asp Arg Leu lie Glu Ser Phe Tyr Trp Ala Val Gly Val Ala Phe 260 265 270

Glu Pro Gin Tyr Ser Asp Cys Arg Asn Ser Val Ala Lys Met Phe Scr 275 280 285

Pbe Val Thr lie lie Asp Asp lie Tyr Asp Val Tyr Gly Thr Leu Asp 290 295 300

Glu Leu Glu Leu Phe Thr Asp Ala Vai Glu Arg trp Asp Val Asn Ala 305 310 315 320 lie Asn Asp Leu Pro Asp Tyr Met Lys Leu Cys Phe Leu Ala Leu Tyr 325 330 335

Asn Thr lie Asn Glu lie Ala Tyr Asp Asn Leu Lys Asp Lys Gly Glu 340 345 350

Asn lie Leu Pro Tyr Leu Thr Lys Ala Trp Ala Asp Leu Cys Asn Ala 355 360 365

Phe Leu Gin Glu Ala Lys Trp Leu Tyr Asn Lys Ser Thr Pro Thr Phe 370 375 380

Asp Asp Tyr Phe Gly Asn Ala Trp Lys Ser Scr Ser Gly Pro Leu Gin 385 390 395 400

Leu Val Fhe Ala Tyr Phe Ala Val Val Gin Asn lie Lys Lys Glu Glu 405 410 415 lie Glu Asn Leu Gin Lys Tyr His Asp Thr lie Ser Arg Pro Ser His 420 425 430

He Phe Arg Leu Cys Asn Asp Leu Ala Ser A)a Ser Ala Glu lie Ala 435 440 445

Arg Gly Glu Thr Ala Asn Ser Val Ser Cys Tyr Met Arg Thr Lys Gly 450 455 460 lie Ser Glu Glu Leu Ala Thr Glu Ser Val Met Asn Leu lie Asp Glu 465 470 475 480

Thr Trp Lys Lys Met Asn Lys Glu Lys Leu Gly Gly Ser Leu Phe Ala 485 490 495

Lys Pro Phe Val Glu Thr Ala He Asn Leu Ala Arg Gin vSer His Cys -63- 149048-序列表.doc 201111512 500 505 510

Thr Tyr His Asn Gly Asp Ala His Thr Ser Pro Asp Clu Leu Thr Arg 515 520 525

Lys Arg Val Leu Ser Val lie Thr Glu Pro lie Leu Pro Phe Glu Arg 530 535 540 <210> 157 <2U> 6020 <212> DMA <213>人工序列 <220> <223>合成構築體 <400> 157 gtttgacagc ttatcatcga ctgcacggtg caccaatgct tctggcgtca ggcagccatc 60 ggaagctgtg gtatggctgt gcaggtcgta aatcactgca taattcgtgt cgctcaaggc 120 gcactcccgt tctgsataat gttttttgcg ccgacatcat aacggttctg gcaaatattc 180 igaaatgage tgttgacaat taatcatccg getegtataa tgtgtggaat tgtfiagcgga 240 taacaatttc acacaggaaa cagcgccgct gagaaaaagc gaageggeae tgctctttaa 300 caatUatca gacaatctgt gtgggcactc gaccggaatt atcgattaac tttattatta 360 aaaattaaag aggtatatat taatgtatcg attaaataag gaggaataaa ccatggaagc 420 tegtegttet gcgaactacg aaccuacag ctgggactat gattacctgc tgtcctccga 480 cacggacgag tccatcgaag tatacaaaga caaagcgaaa aagctggaag ccgaagttcg 540 tegegagati aa丨aacgaaa aageagaait tcigaccctg ctggaactga Ugacaacgt 600 ccagcgcctg ggcctgggtt accgutcga gtctgatatc cgtggtgcgc tggateget! 660 cglttcctcc ggeggetteg atgcggtaac caagacttee ctgcacggta cggcactgtc 720 tttccgtctg ctgcgtcaac acggttttga ggtttctcag gaagcgttca gcggcttcaa 7S0 agaccaaaac ggcaacttcc tggagaacct gaaggaagat atcaaagcta tcctgagcct 840 ftaegaggee agcttcctgg ctctg£aagg cgaaaacatc ctggacgagg cgaaggtttl 900 cgcaatctct catctgaaag aactgictga agaaaagatc gglaaagagc iggcagaaca 960 ggtgaaccat gcactggaac tgccactgca tcgccgtact cagcgtctgg aagcagtatg 1020 ftetategag gcctaccgta aaaaggagga cgcgastcag gttctgctgg agctggcaat 1080 tctggattac aacatgatcc agtctgtata ccagcgtgat ctgcgtgaaa cgtcccgttg 】140 P>t28cgtcgt gigggtctgg cgaccaaact gcactttgct cgtgaccgcc tgattgagag 1200 cttctactgg gccgtgggtg tagealtega accgcaatac iccgactgcc gtaaciccgt 1260 cgcaaaaatg ttttctttcg taaccattat cgacgataic taegatgtat acggcaccct 1320 p.gacgaacrg gagctgttta ctgatgcagt tgagcgttgg gacgtaaacg ccatcaacga 1380 cctgccggat tacatgaaac tgtgctltct ggctctgtat ascactatta aegaaatege 1440 ctacgacaac ctgaaagata aaggtgagaa catcctgccg tatctgacca aagcctgggc 1500 tgacctgtgc aacgctttcc tgcaagaagc caagtggclg tacaacaaat cractccgac 1560 etttgaegae taetteggea acgcaiggaa atcctcttct ggcccgctgc aactggtgtt 1620 cgcttacttc gctgtcgtgc agaacattaa aaaggaagag atcgaaaacc tgcaaaaata 3680 ccatgacacc atcicicgtc cttcccatat cttccgictg igcaatgacc iggctagcgc 1740 gtctgcggaa attgegegtg gigaaaccgc aaatagcgtt 【cttgttaca tgcgcactaa 1800 aggtatclcc gaagaactgg ctaccgaaag cgtgatgaat ctgatcgatg aaacctggaa 1860 aaagatgaac aaggaaaaac tgggtggtag cctgttcgcg aaaccgttcg tggaaaccgc 1920 gatcaacctg gcacgtcaat ctcactgcac ttatcataac ggcgacgcgc atacctctcc 1980 ggatgagctg acccgcaaac gcgttctgtc tgtaatcact gaaccgattc tgccgtttga 2040 acgctaactg cagctggtac catatgggaa ttegaagett tctagaacaa aaactcatct 2100 cagaagagga tclgaatagc gccgtc^acc atcatcatca tcatcattga gtttaaacgg 2160 tctccagcti ggcigitltg geggatgaga gaagattnc agcdgatac agattaaaic 2220 agaacgcaga agcggtctga taaaacagaa tttgcctggc figeagtageg cggtggtccc 2280 acctgacccc atgccgaact cagaagtgaa acgccgtagc gccgatggta gtgtggggtc 2340 tccccatgcg agagtaggga actgccaggc atcaaataaa aegaaagget cagtcgaaag 2400 actgggcctt tcgttttatc tgttgtttgt esgtsaaege tctcctgagt aggacaaatc 2460 cgccsggafic ggatugaac gtigcgaagc aacggcccgg amtfifiegg gcaggacgcc 2520 cgccataaac igccaggcat caaattaage agaaggccat cctgacggat ggccttutg 2580 cglttctaca aactcttttt gUtattttt ctaaatacal tcaaatatgt atccgctcat 2640 gagacaataa ccctgataaa tgcttcaata atattgaaaa aggaagagta tgagtattca 2700 acatttccgt gtcgcccua Ucccttttt tgcggcatlt tgccttcctg tttttgctca 2760 cccagaaacg ctggtgaaag taaaagatgc tgaagatcag ltgggtgcac gagtgggUa 2820 catcgaactg gatctcaaca geggtaagat ccttgagagt tttcgccccg aagaaegitt 2880 tccaatgatg agcactttta aagttctgct atgtggcgcg gtattatccc gtgttgacgc 2940 cgggcaagag caactcggtc gccgcataca clattctcaE aatgacttgg ttgagtactc 3000 accagtcaca gaaaagcatc ttacggalgB catgacagta agagaaltat gcagtgctgc 3060 cataaccatg agigataaca ctgcggccaa ettaettetg acaacgatcg gaggacegaa 3120 ggagctaacc geiiittige acaacatg£g ggatcaigra actcgcctig alcgitggga 3180 accggagctg aatgaagcca uccaaacga egagegtgae accacgatgc cigtagcaat 3240 ggcaacaacg Ugcgcaaac uuaactgg cgaactactt actctagctt cccggcaaca 3300 attaatagac tggatggagg cggataaagt tgcaggacca cttctgcgct cggcccttcc 3360 ggctggctgg tllattgctg ataaatctgg agccggtgag cgtgggtctc gcggtatcat 3420 tgcagcactg gggccagatfi gtaagccctc ccgtatcgta gttatctaca cgacggggag 3480 tcaggcaact aiggatgaac gaaatagaca gategetgag ataggtgcct cactgatlaa 3540 gcattggtaa ctgtcagacc aaglltactc atstataett tagattgatt taaaacttca 3600 tttttaam aaaaggatct agBtgaagat cctttttgat aaictcatga ccaaaaiccc 3660 ttaacgtgag ttttcgttcc actgagcgtc agaccccgia gaaaagatca aaggatette 3720 ttgagatcct ttttttctsc gegtaatetg ctgcttgcaa acaaaaaaac caccgctacc 3780 ascggtggct tgtttgccgg alcaagagct accaactctt tttccgaagg taactggctt 3840 cagcagagcg cagataccaa atactgtcct tctaglgtag ccgtagttag gccaccactt 3900 caagaactct gtagcaccgc ctacatacci cgctclgcia atcctgttac cagtggclgc 3960 tgccaglggc gataagtcgl gtcuaccgg gttggaclca agaegatagt taccggalaa 4020

Egcgcagcgg tcgggctgaa cggaggguc gtgcacacag cccagcttgg agegaaegae 4080 ctacaccgaa cigagatacc tacagcgiga gcrargagaa agcgccacgc Ucccgaagg 4140 gagaaaggcg gacagglatc eggtaagegg cagggtcgga acaggagagc gcacgaggga 4200 gcttccaggg ggaaacgcct ggtatcttta lagtcctgu gggtttcgcc acctctgact 4260 64-

149048-序列表.doc 201111512

tgagcgtcga tttltgtgal gctcgtcagg ggggcggagc ctatggaaaa acgccagcaa 4320 cgcggccttt ttacggttcc tggcctttig ctggccttit gctcacatgt tctttcctgc 4380 gttalcccct gattctgigg ataaccgtat taccgcctit gagtgagctg ataccgctcg 4440 ccgcagccga acgaccgagc gcagcgagtc agtgagcgag gaagcggaag agcgcctgat 4500 gcggtattrt ctccttacgc atcrgtgcgg tatttcacac cgcatatggt gcactctcag 4560 lacaatctgc tctgatgccg catagttaag ccagtataca ctccgctaic gctacgtgac 4620 tgggtcatgg ctgcgccccg acacccgcca acacccgctg acgcgccctg acgggcttgt 4680 cigctcccgg catccgcrta cagacaagct gtgaccgtct ccgggagct£ catgtgrcag 4740 aggttttcac cgtcatcacc gaaacgcgcg aggcagcaga tcaattcgcg cgcgaaggcg 4800 aagcggcatg catttacgtt gacaccatcg aatggtgcaa aacctttcgc ggtatggcat 4860 gatagcgccc ggaagagagi caaticaggg iggtgaatgt gaaaccagta acguatacg 4920 atgtcgcaga gtatgccggt gtctctiatc agaccgtttc ccgcgtggtg aaccaggcca 4980 gccacgtttc tgcgaaaacg cgggaaaaag tggaagcggc gatggcggag ctgaattaca 5040 ttcccaaccg cgtggcacaa caactggcgg gcaaacagtc gttgctgatt ggcgitgcca 5100 cctccagtct ggccctgcac gcgccgtcgc aaattgtcgc ggcgattaaa tctcgcgccg 5160 atcaactggg tgccagcgtg gtggtgtcga tggtagaacg aagcggcgtc gaagcctgta 5220 aagcggcggt gcacaatctt ctcgcgcaac ficgtcagtgg gctgatcatt aactatccgc 5280 tggatgacca ggatgccatt gctgtggaag ctgcctgcac taatgttccg gcgttatttc 5340 ttgatgtctc tgaccagaca cccatcaaca gtattaitu clcccatgaa gacggtacgc 5400 gactgggcgt ggagcatctg gtcgcattgg gtcaccagca aatcgcgctg ttagcgggcc 5460 cattaagtic tgtctcggcg cgtctgcgtc tggclggctg gcataaatat ctcactcgca 5520 atcaaattca gccgatagcg gaacgggaag gcgactggag tgccatgtcc ggitttcaac 5580 aaaccatgca aatgctgaat gagggcatcg ttcccactgc gatgctggtt gccaacgatc 5640 agatgecect gggcgcaatg cgcgccatta ccgagtccgg gctgcgcgtl ggtgcggaia 5700 tctcggtagt gggatacgac gataccgaag acagctcatg itatatcccg ccgtcaacca 5760 ccatcaaaca ggattttcgc ctgctgg£gc aaaccagcgt ggaccgcttg ctgcaactct 5820 c-tcagggcca ggcggtgaag ggcaatcagc tgttgcccgt ctcaciggtg aaaagaaaaa 5S80 ccaccctggc gcccaatacg caaaccgcct ctccccgcgc gUggccgat tcattaatgc 5940 agctggcacg acaggtttcc cg2ctggaaa gcgggcagtg agcgcaacgc aattaatgtg 6000 agttagcgcg aattgatctg 6020 <210> 158 <2ll> 21 <212> DNA <2丨3>人工序列 <220> <223>合成構築體 <400> 158 tgattccgca agacigcctg t 2】 <210> 159 <2ll> 21 <212> m\ <213^人工序列 <220> <223>合成構築體 <400> 159 ttcggtatta ccggtgtcgc t 21 <210> 160 <211> 67 <212> DNA <213>人工序列 <223>合成構築體 <40tt> 160 ctatgattgc cttiatccgt gggcaaittt ccacccccat aattaaccct cactaaaggg 60 cggcc^c 67 <210> 161 <211> 152 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>合成構築體 <220> <221> misc^feature <222> 105 <223> n = A、T、C或G <400> 16! aagatgccag tgatagccat gagtgaaata acctcttgaa ggttacctcc gggaaacgcg 60 gttgatttgt ttagiggttg aatiatttgc Icaggatgtg gcatngtcaa gggcgtgacg 120 gctcgctaat acgactcacl atagggctcg ag 152 <2I0> 162 <211> 38 -65- 149048-序列表.doc 201111512 <212> DNA <2丨3>人工序列 <220> <223>合成構築體 <400> 162 agataaccat ctgcggtgat aaattatctc tggcggtg 38 <210> 163 <21l> 21 <212> DMA <213>人工序列 <220> <223>合成構築體 <400> 163 jigtttagttc ctcaccttgt c 2] <210> 164 <2ll> 31 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>合成構築體 <400> 164 cgaggtcgac gcgagccgtc acgcccttga c 31 <210> 165 <21l> 44 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>合成構築體 <400> 165 gctctcgcga gagcccgcgg tcaggcattg agaatttcgt cgag 44 <210> 166 <2U> 52 <212> DNA <213>人工序列 <220> <2!3>合成構築體 <400> 166 tccaccgcgg gctcgaagga gatataccat gcataaccag gctccaattc aa 52 <210> 167 <21i> 34 <212> DNA <2丨3>人工序列 <220> <223>合成構築體 <400> 167 gctctcgcga ttatuilca acctgctgaa cgtc 34 <210> 168 <2il> 20 <212> DNA <2丨3>人工序列 <220> <223>合成構築體 <400> 168 gttgtaaaac gacggccagt 20 <210> 169 <211> 50 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>合成構築體 <400> 169 tacgggatcc atttgaggag taagccatgc ataaccaggc tccaaitcaa 50 <210> 170 66- 149048-序列表.doc 201111512 <211> 37 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>合成構築體 <400> 170 gctggagctc cacuaun tcaacctgct gaacgtc 37 <210> 171 <2Π> 22 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>合成構築體 <400> 171 gatgatcaac atgacgcatg gc 71 <210> 172 <211> 20 <212> <2]3>人工序列 <220>

<223>合成構築體 <40D> 172 cattccgatc cgtattggcg 20 <210> 173 <211> 21 <212> DNA <2]3>人工序列 <220> <M>合成構築體 <400> 173 tcacacagga aacagctatg a 21 <210> 174 <211> 33 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>合成構築體 <400> 174 cagtctatta atatgaagca aacagtttat ate 33 <210> 175 <211> 35 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>合成構築體 <400> 175 tageageegg atccttagtg tgcgttaacc accac 35 <210> 176 <211> 8911 <212> DNA <213>人工序列 <220> <2攻合成構築體 <400> 176 accttcggga gcgcctgaag cccgttctgg acgccciggg gccgttgaat cgggaiaigc 60 aggccaaggc cgccgcgatc atcaaggccg tgggcgaaaa gctgct&acg gaacagcggg 120 aagtccagcg ccagaaacag gcccagcgcc ageaggaaeg cgggcgcgca catttccccg 180 aaaagtgcca cctggcggcg uglgacaat ttaccgaaca actccgcggc cgggaagccg 240 atctcggcit gaacgaattg ttaggtggcg gtacttgggt cgatatcaaa gtgcatcact 300 icttcccgta tgcccaactt igtatagaga gccactgcgg gatcgtcacc gtaalctgct 360 tgeaegtaga tcacataagc aecaagcgcg tt找cctcat gettgaggag attgatgage 420 gcggtggcaa igccctgccl ccggtgctcg ccggagactg cgagatcata gatatagatc 4S0 icactacgcg gctgctcaaa cctgggcaga aegtaageeg cgagagcgcc aacaaccgct 540 icttggtcga aggcagcaag egegatgaat gtcttactac ggagcaagtt cccgaggtaa 600 tcggaglccg gctgatgttg ggagtaggtg gctacgtctc cgaactcacg accgaaaaga 660 icaagagcag cccgcatgga tttgactt'gg teagggeega gcctacatgt gegaatgatg 720 cccaiacttg agccacctaa ctttgtttta gggcgactgc cctgcigcst aac-atcgttg 780 67· 149048-序列表.doe 201111512 ctgctgcgta acatcgttgc tgctccataa catcaaacat cgacccacgg cgtaacgcgc 840 ttgctgcttg gatgcccgag gcatagactg tiicaaaaaaa cagtcataac aagccatgaa §00 aaccgccact gcgccgttac caccgctgcg Itcggtcaag gtictggacc agttgcgtga 960 gcgcatacgc tacUgcatt acagtttacg aaccgaacag gcltatgtca aclgggttcg ]〇20 igccttcatc cgtttccacg gigtgcgtcc algggcaaat attatacgca aggcgacaag 1080 gtgctgatgc cgctggcgat tcaggttcat calgccgttt gtgatggctl ccatgtcggc 1140 agaatgcrta aigaattaca acagttttta tgcatgcgcc caatacgcaa accgcctctc 1200 cccgcgcgil ggccgattca tt&atgcagc tggcacgaca ggtttcccga ctggaaagcg 1260 ggcagigagc gpaacgcaat tastgtgagt tagctcactc atUggcacc ccaggcltu 1320 cacmatgc ttccggctcg tatgttgtgt ggaattgtga gcggataaca atttcacaca 1380 ggaaacagct atgaccatga llacgccaag cgcgcaatta accctcacta aag&gaacaa 1440 r.aectgggta ccgggccccc cctcgagctg ttgacaatta alcatccggc tcgtataatg 1500 tgtggaattg tgagcggata acaatttcac acaggaanca gcficcgctga gaaaaagcga 1560 «gcggcactg ctctttaaca atttatcaga caatctgtgt gggcactcga ccggaattat 1620 cgattaacu tattattaaa astlaaagag gtatatatta atgtatcgat laaataagga 1680 ^g&ataaacc atggatccga gctcaggagg laaaaaaaca teaaaacagt agttattatt 1740 ^atgcattac gaacaccaai tggaaaatat aaaggcagct laagtcaagt aagtgccgta 1800

Hacttaggaa cacatgmc aacacaactt ttaaaaagac attccactat ttcigaagaa 1860 attgatcaag taatctttgg aaatgtttta caagctggaa atggccaaaa tcccgcacga 1920 caaatagcaa Uaacagcgg tttgtctcat gaaatlcccg caatgacggt taatgaggtc tgcggatcag gaatgaaggc cgttaitttg gcgaaacaat tgattcaatt agfiagaagcg 2040 caagttttaa ttgctggcgg gattgagaai atgtcccaag cacctaaatt acaacgtttt 2100 aattacgaaa cagaaagcta cgatgcgcct ttttctagta tgatgtatga tggattaacg 2160 gatgccttta gtggtcaggc aatgggctta actgctgaaa atgiggccga aaagtatcat 2220 gtaactagag aagagcaaga icaattllct gtacattcac aatraaaagc agctcaagca 2280 caascagaag geatattcgc tgacgaaata gccccattag aagtatcagg aacgcttgtg 2340 gagaaagatg aagggattcg ccctaattcg agcgttgaga agciaggaac gcttaaaaca 2400 gtttttaaag aagacggtac tgtaacagca gggaatgcat caaccattaa tgatggggct 2460 tclgctltga itattgcttc acaagaatat gccgaagcac acggtcttcc ttatttagct 2520 attattcgag acagLglgga agtcggtatt gatccagcct atatgggaat ttcgccgatt 2S80 aaagccattc aaaaactgtt agcgcgcaat caacttacta cegaagaaat tgatctgtat 2640 gaaatcaacg aagcatttgc agcaacttca atcgtggtcc aaagagaact ggcttucca 27(X) gaggaaaagg tcaacattta tggtggcggt atttcattag gtcatgcgat tggtgccaca 2760 ggtgctcgtt tattaacgag tttaagttat caaitaaatc aaaaagaaaa gaaatatgga 2820 gtggcttctt tatgtatcgg cggtggctta ggactcgcta tgctactaga gagacclcag 2880 caaaaaaaaa acaeccgatt ttatcaaatg agtcctgagg aacgcctggc ttctcttcu 2940 aatgaaggcc agatttctgc tgatacaaaa aaagaatttg aaaatacggc tttatcttcg 3000 cafiattgcca atcatatgat tgaaaatcaa alcagtgaaa cagaaglgcc gatgggcgtt 3060 ggcttacatt taacagtgga cgaaactgat tatttggiac caatggcgac agaagagccc 3120 tcagttattg cggctttgag taatggtgca aaaatagcac aaggatttaa aacagtgaat 3180 caacaacgct taatgcgigg acaaatcgtt ttttacgatg ttgcagatcc cgagtcattg 3240 attgataaac tacaagtaag agaagcggaa gtimcaac aagcagagtt aaguatcca 3300 tctatcgtta aacggggcgg cggcttaaga gaittgcaat atcgtacttt tgatgaatca 3360 tttgtatctg tcgacttttt agiagatgu aaggatgcaa tgggggcaaa tatcfittaac 3420 gctatgttgg aaggtgtggc cgagttgltc cgtgaat&gt tigcggagca aaagatttla 3480 ttcagtatti taagtaatta tgccacggag tcggttgtta cgatgaaaac ggctattcca 3540 gtttcacgtt taagtaaggg gagcaatgec cgEgaaattg ctgaaaaaat tgttttagct 3600 tcacgctatg cttcattaga tccttatcgg gcagtcacgc ataacaaagg aatcatgaat 3660 ggcattgaag ctgtagtttt agctacagea aatgatacac gcgctgttag cgcttcltgt 3720 catgctutg cggtgaagga aggtcgctac caaggcttga ctagttggac gctggatggc 3780 gaacaaclaa Ctggtgaaat ttcagtlccg cttgctltag ccacggttgg cggtgccaca 3840 aaagtcttac ctaaatctca agcagctgct gattlgttag cagtgacgga tgcaaaagaa 3900 ctaagtcgag tagtagcggc tgttggtttg gcacaaaalt tagcggcgtt acgggcctla 3960 gtclctgaag gaattcaaaa aggacac&tg gctctacaag cacgttcttt agcgatgacg 4020 gtcggagcta ctggtaaaga agugaggca gtcgctcaac aattaaaacg tcaaaaaacg 4080 atgaaccaag accgagccat ggctat11Ib aatgatttaa gaaaacaata aaggaggtaa aaaaacatga caattgggat tg3taaaatt aettttlUg tgccccctta ttatattgat 4200 atgacggcac Cggctgaagc cagaaaigta gaccctggaa aatttcatat tggtattggg 4260 caagaccaaa tggcggtgaa cccaatcagc caagatattg tgacatttgc agccaatgcc 4320 gcagaagcga tcttgaccaa agaagata3a gaggccaitg atatggtgat tgtcgggact 4380 gagtccagta tcgaigagtc aaaagcggcc Ecagttgtct tacatcgtlt aatggggatt 4Φ10 caacctttcg ctcgctcttt cgaaatcaag gaagctlgtt acggagcaac agcaggctta 4500 cagnagcta agaatcacgt agccttacat ccagataaaa aagtcttggt cgtagcggca 4560 gataligcaa aataiggclt aaaltctggc 2Ei£a£ccta cacaaggagc tggggcggtt 4620 gcaatgttag Ugciagtga accgcgcaU ttggcutaa aagaggataa tgtgatgctg 4680 acgcaagafa Ictatgacii liggcgrcca acaggccacc cgtaicclal ggtcgatggt 4740 ccmgtcaa ac-gaaaccta catccaatct ttlgcccaag tctgESatga acataaaaaa 4800 cgaaccggtc ttgattttgc agattatgat gctttsgcgt tccatattcc ttacacaaaa 4860 atgggcaaaa aagcctiatt agcaaaaatc tccgaccaaa cigaagcaga acaggaacga 4920 aitttagccc gttatgaaga aagtatcgtc tatagtcgtc gcgtaggaaa cttgtatacg 4980 ggttcacttt atctgggact catticcctt ttagaaaatg caacgacttt aaccgcaggc 5040 aalcaaattg gtttatlcag ttatggttct ggtgctgtcg ctgaattttt cactgetgaa 5100 ttagtagctg gttatcaaaa tcatttacaa aaagaaactc atttagcact gctggataat 5160 cggacagaac tttctalcgc tgaatatgaa gccatgtttg c&gaaacttt agacacagac 5220 attgatcaaa cgtlagaaga tgaattaaaa iatagtattt cigctattaa iaataccgtt 5280 cgttcttatc gaaactaaag atctgcagct ggtaccalat figgaattcga agcttgggcc 5340 cgaacaaaaa clcatctcag aagaggatct gaatagcgcc gtcgaccatc atcatcatca 5400 tcaugagtl taaacggtct ccagcttggc igttttggcg gatgagagaa gattttcagc 5460 ctgatacaga ttaaatcaga acgcagaagc ggtctgataa aacagaattt gcctggcggc 5520 aglagcgcgg tggtcccacc tgaccccatg ccgaactcag aagtgaaacg ccgtagcgcc 5580 gatggtagtg tggggtctcc ccatgcgaga gtagggaact gccaggcatc aaataaaacg 5640 aaaggctcag tcgaaagact gggcctttct agagcggccg ccaccgcggt ggagctccaa 5700 tlcgccctat agtgagtcgt attacgcgcg ctcactggcc gtcgttttac aacgtcgtga 5760 ctgggaaaac cctegcfiUa cccaacttaa tcgccttgca gcacatcccc ctucgccag 5820 ctescgtaat agcgaasagg cccgcaccga tcgcccttcc caacagttgc gcagcctgaa 5880 tfigcfiaatgg aaattgtaag cgttaatau ugttaaaat tcgcgttaaa tuttgttaa 5940 atcagctcat tttttaacca ataggccgac tgcgatgagt ggcagggcgg ggcgtaattt 6000 68-

149048·序列表.doc 201111512

ttttaaggca gttattggtg cccttaaacg cctggtgcta cgcctgaata agtgataata 6060 agcggatgaa tggcagaaat tcgaaagcaa attcgacccg gtcgtcggtt cagggcaggg 6120 tcgttaaata gccgcttatg tctattgctg gtttaccggt itattgacta ccggaagcag 6180 tgtgaccgtg tgcttctcaa atgcctgagg ccagtttgct caggcictcc ccgtggaggt 6240 aaiaattgac gatatgatca tttaitctgc ctcccagagc ctgataaaaa cggtgaatcc 6300 gttagcgagg tgccgccggc ttccattcag gtcgaggtgg cccggctcca tgcaccgcga 6360 cgcaacgcgg ggaggcagac aaggtatagg gcggcgaggc ggctacagcc gataEtctgg 6420 aacagcgcac ttacgggttg ctgcgcaacc caagt^ctac cggcgcggca gcgtgacccg 6480 tgtcggcgsc tccaacggct cgccatcgtc cagaaaacac ggctcatcgg gcatcggcag 6540 gcgctgctfic ccgcgccgtt cccattcctc cgttlcggtc aaggctgtjca ggtctggttc 6600 catgcccgga aigccgggct ggctgggcgg ctcctcgccg gggccggtcg gtagttgctg 6660 ctcgcccgga tacagggtcg ggaigcggcg caggtcgcca tgccccaaca gcgattcgtc 6720 ctggtcgtcg tgatcaacca ccacggcggc actgaacacc gacaggcgca actggtcgcg 6780 gggctggccc cacgccacgc ggtcattgac cacgtaggcc gacacggtgc cggggccgtt 6840 gagcttcacg acggagaicc agcgctcggc caccaagtcc ttgactgcgt attggaccgt 6900 ccgcaaagaa cgtccgatga gcuggaaag tgtcUctgg ctgaccacca cggcgttctg 6960 gtggcccatc tgcficcacga ggtgatgcag cagcaugcc gccgtgggtt tcctcgcaat 7020 aagcccggcc cacgcctcat gcgcittgcg itccglttgc acccagtgac cgggcttgtt 7080 cttggcttga atgccgattt ctctggactg cgtggccatg citatctcca tgcgglaggg 7140 tgccgcacgg Ugcggcacc atgcgcaatc agclgcaact tttcggcagc gcgacaacaa 7200 ttatgcgttg cgtaaaagtg gcagtcaat! acagatttic 〖naacctac gcaaigagct 7260 attgcggggg gtgccgcaat gagctgttgc gtacccccct tttttaagtt gttgattttt 7320 aagtctttcg catttcgccc tatatctagt letttgglgc ccaaagaagg gcacccctgc 7380 ggggttcccc cacgccttcg gcgcggctcc ccctccggca aaaagtggcc cctccggggc 7440 ttgttgatcg actgcgcggc cttcggcctt gcccaaggtg gcgctgcccc cttggaaccc 7500 ccgcactcgc egeegtgagg ctcggggggc aggegggegg gcttcgcctt cgactgcccc 7560 cactcgcaia ggctigggic giiccaggcg cgtcaaggcc aagccgctgc gcggtcgctg 7620 cgcgagcctt gacccgcctt ccacttggtg tccaaccggc aagcgaagcg cgcaggccgc 76S0 aggeeggagg ctittcccca gagaaaatta aaaaaattga tggggcaagg ccgcaggccg 7740 cgcagttgga gccggtgggt atgtggtcga aggeigggia gccggtgggc aatccctgtg 7800 gtcaagctcg tgggcaggcg cagcctgtcc atcagcttgt ccagcagggt tgtccacggg 7860 ccgagcgaag cgagccagcc ggtggccgct cgcagccatc gtccacatat ccacgggctg 7920 gcaagggagc gcagcgaccg egeagggega agcccggaga gcaagcccgt agggcgccgc 7980 agccgccgta ggcggtcacg actttgcgaa gcaaagtcxa gtgagtatac tcaagcattg 8040 agtggcccgc cggaggcacc gccttgcgct gcccccgtcg agccggttgg acaccaaaag 8100 ggaggg&cag gcatggcggc ataegegate atgegatgea agaagctggc gaaaatgggc 8160 aac&tggcgg ccagtctcaa gcacgcctac cgcgagcgcg agacgcccaa cgctgacgcc 8220 ageaggaege cagagaacga gcactgggcg gccagcagca ccgatgaagc gatgggccga 8280 ctgcgcgagt tgctgccaga gaageggege aaggacgctg tgllggcggt egagtaegte 8340 atgacggcca gcccggaatg gtggaagtcg gccagccaag aacagcaggc ggcgttcttc 8400 gagaaggege acaagtggcr ggcggacaag tacggggcgg atcgcatcgt gacggccagc 8460 atccaccgtg acgaaaccag cccgcacatg accgcgtteg tggtgccgct gacgcaggac 8520 ggcaggctgt cggccaagga gttcatcggc aacaaagcgc agatgacccg cgaccagacc 8580 acgtttgcgg ccgctgtggc egatetaggg ctgcaacggg gcatcgaggg cagcaaggca 8640 cgfcacacgc gcattcaggc gttetaegag gccclggagc ggccaccagt gggccacgtc 8700 accatcagcc cgcaagcggt cgaeccacgc gcciatgcac egeagggatt ggccgaaaag 8760 ctgggaatct caaagcgcgt tgagacgccg gaagccgtgg ccgaccggct gacaaaagcg 8820 gtteggeagg ggtatgagee tgccctacag gccgccgcag gagegegiga gatgcgcaag 8880 aaggeegate aagcccaaga gacggcccga g 8911 <210> 177 <2Π> 113 <212> DNA <2]3>人工序列 <220> 合成構築體 <400> 177 tggcaaatat tctgaaatga gctgttgaca attaatcatc gaactagtta actagtacgc 60 aagttcacgt aaaaagggta tcgacatggt atcctgttct gcgccgggta aga 113 <210> 178 <211> 73 <212> DNA <213>人工序列 <220> <U3>合成構築體 <400> 178 caagaaaaaa ggeaegteat ctgacgtgcc ttttttattt gtattaatet actttcagac 60 ettgeteggt egg 73 <210> 179 <211> 21 <212> DMA <213>人工序列 <220> 合成構築體 <400> 179 gatacgiatg tttctacctl c 21 69- 149048-序列表.doc 201111512 <210> 180 <211> 21 <212> DNA <213>人工序列 <220> 合成構築體 <400> 180 gaaggtagaa acatacgtai c 21 <2iO> 181 <21l> 24 <212> DNA <2丨3>人工序列 <220> 合成構築體 <400> 181 gatagiaacg gctgcgctgc tacc 24 <210> 182 <21l> 48 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>合成構築體 <4〇〇> 182 gggcccEttt aaacttlaac tagactttaa tclactttca gaccttsc 48 <210> 183 <211> 9945 <212> DNA <213>人工序列 <220> <2S3>合成構築體 <400> 183 accttcggga gcgcctgaag cccgtictgg acgcccigge gccgttgaat cgggatatgc 60 aggccaaggc cgccgcgaic atcaaggccg tgSficgaaaa gctgctgacg gaacagcggg 120 aagtccagcg ccagaaacag gcccagcgcc agcaggaacg cgggcgcgca catttccccg ]80 aaaagtgcca cctggcggcg ttgtgacaat uaccgaaca actccgcggc cgggaagccg 240 atctcggctt gaacgaattg ttaggtggcg glacttgggt cgatatcaaa gtgcatcact 300 icttcccgta igcccaactt tgtatagaga gccactgcgg gatcgtcacc gtaatclccl 360 tgcacgtaga icacataagc accaagcgcg Uggcctcat gcttgaggag attgatgagc 420 ficggtggcaa tgccctgcct ccggtgctcg ccggagactg cgagatcata gatatagatc 480 tcactacgcg gctgctcaaa cctgggcaga acgtaagccg cgagagcgcc aacaaccgci 540 tcttggtcga aggcagcaag cgcgatgaal gtcltactac ggagcaagtt cccgaggtaa 600 tcggagtccg gctgatgttg ggagtaggtg gctacgtctc cgaactcacg accgaaaaga 660 rcaagaacag cccgcatgga tttgacttgg tcagggccga gcctacatgt gcgaatgatg 720 cccatacttg agccacctaa ctttgtttta gggcgactgc cctgclgcgt aacatcgttg 780 ctgctgcgia acatcgttgc tgctccataa catcaaacat cgacccacgg cgtaacgcgc 840 ttgctgcttg gatgcccgag gcatagactg tacaaaaaaa cagtcataac aagccatgaa 900 aaccgccact gcgccgttac caccgcigcg ttcggtcaae 2ttct2Bacc a£ttEcgtga 960 gcgcatacgc 丨actigcatt acagiuacg aaccgaacag gcttatgtca actgggttcg 1020 tgccttcaic cgtnccacg fitgtgcgtcc atgggcaaat attalacgca aggcgacaag 1080 gtgctgatgc cgctggcgal tcaggttcat catgccgttt gtgalggctt ccatglcggc 1140 agaatgctta atgaaltaca acagttttta 丨gcatgcgcc caatacgcaa accgcctctc 〗200 cccgcgcgtt ggccgauca ttaaigcagc tggcacgaca ggtttcccga ctggaaagcg 12έ0 ggcagtgagc bcaacgcaat t邸igtgagt 丨agctcacic aliaggcacc ccaggcUta 1320 cactuatgc ttccggacg taigugtgt ggaattgtga gcgptaaca atucacaca 1380 ggaaacagct aigaccatga itacgccaag cgcgcaatta accctcacta aagggaacaa 1440 aagctgggta ccgggccccc cctcgagctg ttgacaatta aicatccggc tcgtataatg 1500 tgtggaattg tgagcggata acaatttcac acaegaaaca gcgccgctga gaaaaagcga 1560 agcggcactg ctctltaaca attiatcaga caatctgtgt gggcactcga ccggaattat 1620 cgattaactt tattattaaa aattaaagag gtatatatta atgtatcgat taaataagga 1680 ggaataaacc atggatccga gctcaggagg laaaaaaaca tgaaaacagt agttattatt 1740 gatgcattac gaacaccaat tggaaaatat aaaggcagct taagtcaagt aagtgccgta 1S00 gacltaggaa cacatgttac aacacaactt ttaaaaagac attccactat tlctgaagaa 1沾0 attgarcaag taatctttgg aaatgtma caagct£gaa atggccaaaa tcccgcacga 1920 caaatagcaa taaacagcgg tttgtctcat gaaattcccg caatgacggt taatgaggtc 1980 tgcggatcag gaatgaaggc cgttatutg gcgaaacaat tgattcaau aggagaagcg 2040 gaagttttaa ttgctggcgg gattgagaat atgtcccaag cacctaaatt acaacgtttt 2100 aattacgaaa caEaaagcta cgatgcBcct ttttctagta tgatgtatga tggattaacg 2160 gatgccttta gtggtcaggc aatgggctta actgctgaaa atgtggccga aaagtatcat 2220 gtaactagag aagagcaaga tcaattttct gtacattcac aattaaaagc agctcaagca 2280 caagcagaae £gatattcgc tgacgaaata gccccattag aagtatcagg aacgcttgts 2340 gagaaagatg aagggattcg ccctaattcg agcgttgaga agctaggaac gcttaaaaca 2400 gtttttaaag aagacggtac tgtaacagca eggaatgcat caaccattaa tgatggggci 2460 tctgctttga ttattecttc acaagaatat gccgaagcac acggtcttcc ttatuagct 2520 attattcgag acagtgtgfia agtcggtatt gatccagcct atatgggaat ttcgccgatt 2580 aaagccattc aaaaactgtt agcgcgcaat caacttacta cggaagaaat tgatctgtat 2640 gaaatcaacg aagciitUgc agcaacttca atcgtggtcc aaagagaact ggctttacca 2700 70·

149048-序列表.doc 201111512

gaggaaaagg tcaacattta tggiggcggt atttcattag gtcatgcgat tggtgccaca 2760 ggtgctcglt tatiaacgag Lllaagttal caattaaatc aaaaagaaaa gaaatatgga 2820 giggct tct t tatgtatcgg cggtggctta ggactcgcta tgclactaga gagacctcag 2880 caa^aaaaaa acagccgatt ttalcaaatg agtcctgagg aacgcctggc ttctcttctt 2940 aatgaaggcc agaLttctgc tgatacaaaa aaagaatttg aaaatacggc tttatcttcg 3000 cagattgcca atcatatgat tgaaaatcaa atcagtgaaa cagaagtgcc gatgggcgtt 3060 ggcttacatt taacagtgga cgaaactgat tatttggtac caatggcgac agaagagccc 3120 tcagttattg cggctitgag taatggtgca aaaatagcac aaggatttaa aacagtgaat 3180 caacaacgct taatgcgtgg acaaatcgtt ttttacgaig ttgcagatcc cgagtcattg 3240 attgataaac tacaagtaag agaagcggaa gtttitcaac aagcagagti aagttatcca 3300 tctatcgita aacggggcgg cggcttaaga gatitgcaat atcgtacttt tgatgaatca 3360 tttgtatctg tcgacrtitt agiagatgii aaggaigcaa tgggggcaaa taicgltaac 3420 gctatgttgg aaggigtggc cgagttguc cgtgaatg&t Ugcggagca aaagatuu 3480 ttcagtaitt taagtaatta tgccacggag tcggttgtta cgatgaaaac ggciattcca 3540 gUtcacgti taagtaaggg gagcaatggc cgggaaattg ctgaaaaaat tgttttagct 3600 vcacgctatg cttcattaga iccttatcgg gcagicacgc ataacaaagg aatcatgaat 3660 ggcattgaag ctgiagtttt agctacagga aatgatacac gCEctguag cgctrcttgt 3720 calgctutg cggtgaagga aggtcgctac caaggcttga ctagttggac gctggatggc 3780 Eaacaactaa ttggtgaaat ucagttccg citgcmag ccacggttgg cggtgccaca 3840 aaagtcttac ciaaatctca agcagctgct gatiigttag cagtgacgga tgcaaaagaa 3900 ctaagtcgag tagtagcggc igttggtttg gcacaaaati ugcggcgtt acgggcctta 3960 gtctctgaag gaattcaaaa aggacacatg gctclacaag cacgttcttt agcgatgacg 4020 gtcggagcta ctggtaaaga agttgaggca gtcgctcaac aattaaaacg tcaaaaaacg 4080 atgaaccaag accgagccat ggctatitta aatgaittaa gaaaacaata aaggaggtaa 4140 aaaaacarga caattgggat tgataaaatt agtttttttg tgocccctta ttatattgat 4200 atgacggcac tggctgaagc cagaaatgta gaccctggaa aat ttcatat tggtattggg ^1260 caagaccaaa tggcggigaa cccaatcagc caagatattg igacatttgc agccaatgcc 4320 gcagaagcga tcttgaccaa agaagataaa gaggccattg atatggtgat tgtcgggact 4380 gagtccagta 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gccggtgggt atgtggtcga aggctgggta gccggtgggc aatccctgtg 7800 gtcaagctcg tgggcaggcg cagcctgtcc atcagcttgt ccagcagggt tgtccacggg 7860 ccgagcgaag cgagccagcc gglggccgct cgcggccatc gtccacatat ccacgggctg 7920 -71 - 149048-序列表.doc 201111512

Bcaagggagc gcagcgaccg cgcagggcga agcccggaga gcaagcccgt agggclggca 7980 aatattctga aatgagctgt tgacaattaa tcatcgaact agttaactag tacgcaagtt 8040 cacgtaaaaa gggtatcgac atggtatcct gttctgcgcc gggtaagatt tacctgltcg 8100 gtgaacacgc cgtagtttat ggcgaaactg caattgcgtg tgcggtggaa ctgcgtaccc 8160 Btgttcgcgc ggaactcaat gactctatca clattcagag ccagatcggc cgcaccfigtc 8220 tggatttcga aaagcaccct tatgtgtctg cggtaattga gaaaatgcgc aaatctattc 8280 ctaltaacgg igttttcltg accgtcgatt ccgacatccc ggtggectcc ggtctgggta 8340 Rcagcgcagc cgttactatc BCfilctattg gtgcgctgaa cgagctgttc ggctttggcc 8400 tcagcctgca agaaatcgct aaactgggcc acfiaaatcga aattaaagta cagggtgccg 8460 cgtccccaac cgatacgtat gtttctacct icggcggcgt ggttaccatc ccggaacgtc 85元 ecaaactgaa aactccg£ac tgcggcattg tgattggcga taccggcgtt ttctcctcca 8580 ccaaagagtt agtagctaac gtacgtcagc tgcgcgaaag ctacccggat itgatcgaac 8640 cgctgatgac cutattg£c aaaatctctc gtatcggcga acaactggll ctgtctggcg 8700 actacgcatc c.atcggccgc ctgatgaacg tcaaccaggg tctcctggac gccctgggcg 8760 ttaacatctt agaactgagc cagctgatct attccgctcg igcggcaggt gcgttlggcg 8820 ctaaaatcac Eggcgctggc ggcggtggct etatggligc gctgaccgct ccggaaaaat 8880 scaaccaagt ggcagaagcg gtagcaggcg ciggcggtaa agtgactatc aciaaaccga 8940 ccgagcaagg tctgaaagta gattaaiaca aataaaaaag gcacgtcaga tgacgtEcct 9000 tttttcttgg ccgcagccgc cgtaggcggt cacgactttg cgaagcaaag tctagtgagt 9060 aiactcaagc altgagtggc ccgccggagg caccgccttg cgctgccccc gtcgagccgg 9)20 ttggacacca aaagggaggg gcaggcatgg cggcatacgc gatcatgcga tgcaagaagc 9180 tggcgaaaal gggcaacgtg gcggccagtc tcaagcacgc ctaccgcgag cgcgagacgc 9240 ccaacgctga cgccagcagg acgccagaga acgagcactg ggcggccagc agcaccgatg 9300 aagcgatggg ccgacigcgc ga^ttgctgc cagagaaecg ccficaaggac gctgtgttgg 9360 cggtcgagta cgtcatgacg gccagcccgg aatggtggaa gtcggccagc caagaacagc 9420 aggcggcgtt citcgagaag gcgcacaagt ggctggcgga caagiacggg gcggatcgca 9480 tcgtgacggc cagcatccac cgigacgaaa ccagcccgca catgaccgcg Ucfilggtgc 9540 cgclgacgca ggacggcagg ctgtcggcca aggagttcat cggcaacaaa gcgcagatga 9600 cccgcgacca gaccacgttt gcggccgctg Iggccgatct agggctgcaa cggggcatcg 9660 agggcagcaa ggcacgtcac acgcgcatlc aggcgltcta cgaggccctg gagcggccac 9720 caglgggcca cgtcaccatc agcccgcaag cggtcgagcc acgcgcctat gcaccgcagg 9780 gaUggccga aaagctggga aictcaaagc gcgttgagac gccggaagcc gtggccgacc 9840 ggctgacaaa agcggttcgg caggggtatg aecctcccct acaggccgcc gcaggagcgc 9900 gtgagatgcg caagaaggcc gatcaagccc aagagacggc ccgag 9945 <210> 184 <21i> 35 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>合成構築體 <400> 184 ttttgcggcc gcaat taacc ctcactaaag ggcgg 35 <2ϊ0> 185 <211> 103 <2I2> DNA <213>人工序列 <220> 合成構築體 <400> 185 gatcgatatc cclgcaggaa attgttatcc gctcacaatt ccacacana tacgagccgg 60 atgattaalt gtcaacagct aatacgactc actatagggc teg 103 <210> 186 <211> 8983 <212> DNA <2I3>人工序列 <220> <223>合成構築體 <400> 186 caagaaaaat gccccgctta egeagggeat ccatttatta ctcaaccgta accgatctlg 60 ccaggttacg cggctggtca acgtcggtgc cutgatcag cgcgacaigg laagccagca 120 getgeagegg aacggtgtag aagatcggtg caatcacctc Uccacalgc ggeatetega 180 tgatgtgcat gttategeta cttacaaaac ccgcalcctg ateggegaag acatacaact 240 gaccgccacg cgcgcgaact lettcaalgt tggatitcag titttccagc aattcgttgt 300 tcggtgcaac aacaataacc ggeatategg catcaatlag cgccagcgga ccgtgtttca 360 gttcgccagc iigcglaggct tcagcglgaa tgiaagagat clctttcaac ttcaatgcgc 420 cttccagcgc gattgggtac Igalcgccac ggcccaggaa cagcgcgtga tgtttgtcag 480 agaaatcitc tgccagcgct tcaatgCBtt tfiicclgafia cagcatctgc tcaatacggc 540 tcggcagcgc ctgcagacca ucacgatgt catgttcaat ggaggcatcc agacctttca 600 ggcgagacag cttcgccacc agcatcaaca gcacagttaa ctgagtggtg aatgctttag 660 tggatgccac geegautet glacccgcgt tggtcatlas ceccagatcg gattegegea 720 ccagagaaga acccggaacg itacagatts ccagtgaacc aaggtaaccc agetettteg 780 acagacgcag gccagccagg gtatccgcgg tttcgccaga ct£t£acacfi atcgcccltc 00 ccaacagttg cgcagcctat aegtaeggea giUaagiMt lacacctaU aaagagagag 900 ccgttatcgt CtgtttgEgg atgtacagag tgatattatt gacacgccgg ggegaeggat 960 gglgatcccc ctggccagtg cacgtcigct gtcagataaa gtctcccgtE aactttaccc 1020 ggtggtgcat atcggggatg aaagctggcg catgaigacc accgatatgg ccagtgtgcc 1080 72-

149048-序列表.doc 201111512

ggtctccgtt atcggfigaag aagtggctga tctcagccac cgcgaaaatg acatcaaaaa 1140 cgccattaac cigatfittct ggggaatata aatgtcaggc atgagattat caaaaaggat 1200 cttcacctag atccttttca cgtagaaagc cagtccgcag aaacggtgct gaccccggat 1260 gaatgtcagc tactgggcta tctggacaag ggaaaacgca agcgcaaaga gaaagcaggt 1320 agcugcagt gggcttacat ggcgatagct agactgggcg gitttatgga cagcaagcga 〖380 accggaattg ccagctgggg cgccctctgg taaggttggg aagccctgca aagtaaactg 1440 gatggctttc tcgccgccaa ggatctgatg gcgcagggga tcaagctctg atcaagagac 1500 aggatgagga tcgtttcgca tgattgaaca agalggattg cacgcaggtt ctccggccgc 1560 ttgggtggag agsctattcg gciatgactg ggcacaacag acaatcggct gctctgatgc 1620 cgccgtgttc cggctgtcag cgcaggggcg cccggttctt tugtcaaga ccgacctgtc 丨680 cggtgccctg aatgaactgc aafiacgaggc agcgcggcta tcgtfiEctgg ccacgacggg 1740 cgttccttgc gcagctgtgc tcgacgttgt cacigaagcg ggaagggact ggctgctatt 1800 gggcgaagtg ccggggcagg atctcctgic atcicacctt gctccigccg agaaagtatc I860 catcatggct gatgcaatgc ggcggctgca tacgcttgat ccggctacct gcccattcga 1920 ccaccaagcg aaacatcgca tcgagcgagc acgiactcgg atggaagccg gicttgtcga 1980 tcaggatgat ctggacgaag agcatcaggg gctcgcgcca gccgaactgt tcgccaggct 2040 caaggcgagc atgcccgacg gcgaggatct cgtcgigacc catggcgatg cctgcttgcc 2100 gaatatcatg gtggaaaatg gccgcttttc tggaticatc gactgtggcc ggctgggtgt 2160 ggcggaccgc tatcaggaca tagcgttggc tacccgtgat attgctgaag agcttggcgg 2220 cgaatgggct gaccgcttcc tcgtgcttta cggtatcgcc gctcccgatt cgcagcgcat 2280 cgccttctat cgccttcttg acgagtcctt ctgaatiati aacgcttaca atttcctgat 2340 gcggtattit ctccttacgc atctgigcgg 〖atttcacac cgcatacagg tggcactttt 2400 cggggaaatg tgcgcggaac ccctatUgt ttattttlct aaatacaltc aaatalgtat 2460 ccgcicatga gacaataacc ctgataaaig cttcaataal agcacglgag gagggccacc 2520 atggccaagt tgaccagtgc cgttccggtg ctcaccgcgc gcgacgtcgc cggagcggtc 2580 gagttctgga ccgaccggct cgggttctcc cctagtaacg gccgccagtg tgctggaatt 2640 caggcagttc aacctgttga tagtacgtac taagctctca tgtltcacgt actaagctc-t 2700 catgtuaac gcacraagct ctcatgttta acgaactaaa ccctcatggc taacgtacta 2760 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ttctctagaa agtataggaa cttcctcgag ccctalaglg agtegtatia gctgttgaca 5340 attaatcatc eggetegtat aatgtgtgga attgtgagcg gataacaatt tcctgcaggg 5400 atccigcacc ettaaggagg aaaaaaacat gtcagagttg agageettea gtgccccagg 5460 gaaagcgtta ctagctggtg gatatltagt utagalaca aaatatgaag catttgtafit 5520 eggattateg gcaagaatgc atgctgtagc ccatccttac ggttcattgc aagggtctga 5580 taagtttgaa gtgcgtgtga aaagtaaaca atttaaagat ggggagtggc tgtaccatat 5640 aagtcctaaa agtggcttca ttcctgUtc gataggegga tctaagaacc ctttcaitga 5700 aaaagttatc getaaegtat ttagetaett taaacctaac atggacgact actgcaatag 5760 aaacttgttc guaitgata tttictctga tgatgcctac cattctcagg aggatagegt 5820 taccgaacat cgtgecaaca gaagattgag ttticaticg cacagaattg aagaagttcc 5880 caaaacaggg ctgggcicct cggcaggttt agtcacaglt tlaactacag cUtggcctc 5940 cttttttgta tcggacctgg aaaataatgt agacaaatat agagaagtta ttcataattt 6000 agcacaagit actcattgtc aagctcaggg taaaattgga agcgggtttg atgtagegge 6060 ggeageatat ggatetatea gatatagaag attcccaccc gcattaatct etaatttgee 6120 agatattgga agtsetaett aeggeagtaa actggcgcat UggUgalg aagaagactg 6180 gaatattacg attaaaagta accatttacc ttcgggatta actttatgga tgggcgatat 6240 taagaatggt tcagaaacag taaaactggt ccagaaggta aaaaattggt atgattcgca 6300 •73· 149048-序列表.doc 201111512 talgccagaa agcttgaaaa tatalacaga actcgatcat gcaaattcta gauutg^a 6360 tggaclatci aaaciagatc gcttacacga gactcatgac gattacagcg atcagatatt 6420 tgagictctt gagaggaaig actgtacctg tcaaaagtat cctgaaatca cagaagttag 6480 agatgcagu gqcacaatla gacgUccU tagaaaaa丨a actaaagaat ctggtgccga 6540 laicgaacct cccgtacaaa ctagcttatt ggatgatlgc cagaccttaa aaggagltct 6600 tacttgctta ajaccteglg ctggtEBtta tgacgccatt gcagteatta ctaagcaaga 6660 tgttgatctt agggctcaaa ccectaatga caaaagattt tctaaggttc aatggctgga 6720 tglaactcag gctgactggg gtgttaEgaa agaaaaagat ccggaaactt atcttgataa 6780 ataacttaag gtagctgcat gcagaattcg cccttaagga gfiaaaaaaaa aigacciittt 6840 acacagcatc cgttaccgca cccgtcaaca tcgcaaccct taagtattgg gggaaaaggg 6900 acacgaagtt gaatclgccc accaattcgt ccatatcagt gactttatcg caagatgacc 6960 icagaacgtt gacctctficg gctactgcac ctgagtttga acgcgacact ttgtggttaa 7020 atggagaacc acacagcatc gacaatgaaa gaactcaaaa ttgtclgcgc gacctacgcc 7080 aattaagaaa ggaaatggaa tcgaaggacg cctcattgcc cacattatct caatggaaac 7140 tccacattg\ ciccgaaaal aacUtccta cagcagctgg tttagcttcc tccgctgctg 7200 gctllgctgc attggtctct gcaattgcta agltatacca attaccacag tcaacttcag 7260 aaatatctag aatagcaaga aamstcig gticagcttg tagatcgtig tttggcggat 7320 acgtggcctg ggaaatggga aaagctgaag atggtcatga ttccatggca gtacaaatcg 7380 cagacagctc tgactggcct cagatgaaag cttgtgtcct agttgtcagc gatattaaaa 7440 Eggatgtgag ttccactcag ggtatgcaat tgaccglggc aacctccgaa ctatttaaag 7500 aaagaattga acatgtcgta ccaaagagat ttgaagtcat gcgtaaagcc attgttgaaa 7560 sagatttcgc cacctttgca aaggaaacaa igatggaltc caactctttc catgccacat 7620 gtttggactc tttccctcca atattctaca tgaatgacac ttccaagcgt atcatcagtt 7680 Sgtgccacac cattaatcag ttttacggag aaacaatcgt tgcatacacg tttgatgcag 7%0 Etccaaatgc tgtgttgtac tacttagctg aaaatgagtc gaaactctu gcatttatct 7800 staaattgtt tggctctgtt cctggatggg acaagaaalt taciaclgag cagcttgagg 7δ60 ctttcaacca tcaatttgaa tcatctaact ttactgcacg tgaattggal cttgagttgc 7920 taaaggatgt tgccagagtg attttaactc aagtcggltc aggcccacaa gaaacaaacg 7980 r,atctttgat tgacgcaaag actggtctac caaaggaala agaicaattc gctgcatcgc 8040 ccUaggagg taaaaaaaaa tgactgccga caacaatagt aigccccatg gtgcagtatc 8100 lagtlacgcc aaattagtgc aaaaccaaac acctgaagac attltggaag agtttcctga 8160 nattattcca ttacaacaaa gacctaatac ccgatctagt gagacgtcaa atgacgaaag 8220 cggagaaaca tgttmctg gicatgatga ggagcaaati aagttaatga atgaaaattg 8280 tattguttg gattgggacg ataaigctat tggigccggt accaagaaag tttgtcattt 8340 aatggaaaat attgaaaagg gtttaclaca tcgtgcallc tccgtcma tttlcaaiBa 8400 acaaggtgaa ttacttttac aacaaagagc cactgaaaaa ataactttcc ctgatctttg 8460 p.actaacaca igctgcictc atccactatg tattgatgac gaattaggtt tgaagggtaa 8520 GCtagacgat aagattaagg gcgcuuac igcggcggtg agaaaactag atcatgaatt 沾80 oggtattcca gaagatgaaa claagacaag gggiaagttt cactuitaa acagaatcca 8640 ttacaiggca ccaagcaatg aaccatgggg tgaacatgaa attgattaca tcctatttta 8700 taagatcaac gctaaagaaa acttgactgt caacccaaac gtcaatgaag ttagagactt 8760 caaatgggtt【caccaaatg autgaaaac utgtttact gaeccaagtt acaagtuac 各8扣 nccttggm aagaitam gcgagaatta cttattcaac tggigggagc aaltagatga 8880 cctttctgaa gtggaaaatg acaggcaaat tcatagaatg ctataacaac gcgtctacaa 8940 ntaaaaaagg cacgtcagat gacgtgcctt UttcUggg gcc 8983 <210> 187 <211> 40 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>合成構築體 <Ί00> 187 aalcgtaggc cugataaggc gtttacgccg catccggcaa 40 <210> 188 <21I> 107 <212> DKA <2]3>人工序列 <220> <223>合成構築體 <400> 188 agattgctgc gaaatcgtag gccggataag gcgtttacgc cgcatccggc aaaaatcctt 60 aaatataaga gcaaacctgc aattaaccct cactaaaggg cggccgc 107 <210> 189 <211> 182 <212> DNA <213>人工序列 <220> 合成構築體 <40Q> 189 agcgtgaagt gcaccaggac ggcgctaitg ctctgtacag attcagacat gtttttacct 60 cctugcagt gcgtcctgct gatgtgctca gtatcaccgc caglggtatt talgtcaaca 120 ccgccagaga taacttatca ccgcagatgg ttatcttaat acgactcact atagggctcg 180 ag 182 <2\0> 190 <211> 21 74·

149048-序列表.doc 201111512

<212> DNA <2丨3>人工序列 <220> 合成構築體 <4〇0> 190 acgcatctta tccggcctac a 21 <2J0> 191 <211> 21 <212> DNA <2】3>人工序列 <220> <223>合成構築體 <400> 191 accgttgttg cgggtagact c 21 <210> 192 <2!i> 657S <r212> DNA <2*3>人工序列 <220>

合成構築體 <400> 192 ttcttgaaga cgaaagggcc tcgtgatacg cctattttta taggttaatg tcatgataat 60 aatggtttct tagacgtcag gtggcacm tcggggaaat gtgcgcggaa cccctatttg 120 tttatttttc laaatacati caaatatgta tccgctcatg agacaataac cctgaiaaat 180 gcttcaataa tattgaaaaa ggaagagtat gagtattcaa catuccgtg tcgcccttat 240 tccctttttt gcggcatm gccttcctgt tlttgclcac ccagaaacgc tggtgaaagt 300 aaaagatgcc gaagatcagt tgggtgcacg agtggguac atcgaacigg acctcaacag 360 cggtaagatc cttgagagtt ttcgccccga agaacgtttt ccaatgatga gcacttttaa 420 agttctgcta tgtggcgcgg 【attatcccg tgttgacgcc gggcaagagc aaclcggtcg 480 ccgcatacac tattctcaga atgacttggt tgagtactca ccagtcacag aaaagcatct 540 tacggatggc atgacagtaa gagaattatg cagtgctgcx ataaccatga gtgataacac 600 tgcggccaac ttacttctga caacgatcgg aggaccgaag gagctaaccg cEtttttgca 660 caacatgggg gatcatgUa ctcgccttga tcgttgggaa ccggagctga atgaagccat 720 accaaacgac gagcgtgaca ccacgatgcc tgcagcaatg gcaacaacgt tgcgcaaacl 780 attaactggc gaactactta ctctagcttc ccggcaacaa ttaatagact ggatggaggc 840 ggataaagtt gcaggaccac tictgcgctc ggcccttccg gctggctggt ttattgctga 900 taaatctgga gccggtgagc gtgggtctcg cggtatcatt gcagcactgg ggccagatgg 960 taagccctcc cgtatcgtag ttatctacac gacggggagt caggcaacta tggatgaacg 1020 aaatagacag atcgctgaga taggtgcctc actgattaag cattggtaac tgtcagacca 1080 agtttatcat atatacttta gattgattta aaacttcatt tttaatttaa aaggatctag 1140 gtgaagalcc tttttgataa tctcatgacc aaaatccclt aacgtgagtt ttcgticcac 12(M) tgagcgtcag accccgtaga aaagatcaaa ggatcttctt gagatccttt itttctgcgc 1260 gtaatclgct gcttgcaaac aaaaaaacca ccgctaccag cEEiggttig tttgccggat 1320 caagagctac caaclctttt tccgaaggta actggcttca gcagagcgca galaccaaat 1380 actgtccttc tagtgtagcc gtagttaggc caccacttca agaactctgt agcaccgcct 1440 acatacctcg ctclgclaat cctgttacca gtggctgctg ccagtggcga taagtcgtgt 1500 cttaccgggt tggactcaag acgatagtta ccggataagg cgcagcggtc gggctgaacg 1560 gggggttcgt gcacacagcc cagcttggag cgaacgacct acaccgaact gagataccta 1620 cagcglgagc tatgagaaag cgccacgctt cccgaaggga gaaaggcgga caggtatccg 1680 gtaagcggca gggtcggaac aggagagcgc acgagggagc ttccaggggg aaacgcctgg 1740 tatctitata gtcctgtcgg gittcgccac ctctgacttg agcgtcgatt tttgtgatgc L800 tcgtcagggg ggcggagcct atggaaaaac gccagcaacg cggcctttlt acggttcctg 1860 gccttttgct ggccttttgc tcacatgttc tttcctgcgt tatcccctga ttctgtggat 1920 aaccgtatta ccgcctttga gtgagctgaE accgctcgcc gcagccgaac gaccgagcgc 1980 agcgagtcag tgagcgagga agcggaagag cgcctgatgc ggtattttct ccttacgcat 2040 ctgtgcggta mcacaccg catatatggt gcactctcag lacaatctgc Utgatgccg 2100 catagttaag ccagtataca ctccgctatc gctacgtgac tgggtcatgg ctgcgccccg 2160 acacccgcca acacccgctg acgcgccctg acgggcttgt ctgctcccgg catccgctta 2220 cagacaagct gtgaccgtct ccgggagctg catgtgtcag aEgttttcac cgtcatcacc 2280 gaaacgcgcg aggcagctgc ggtaaagctc atcagcgtgg icgtgaagcg attcacagat 2340 gtctgcctgt tcatccgcgt ccagctcgtt gagtttctcc agaagcglta atgtctggct 2400 ictgataaag cgggccatgt taagggcggt tttttcctgt ttggtcactg atgcctccgt 2460 gtaaggegga tticigltca tgggggtaat gataccgatg aaacgagaga ggatgctcac 2520 gatacgggtt actgatgatg aacatgcccg gttactggaa cgttgtgagg gtaaacaact 2580 ggcggtatgg atgcggcggg accagagaaa aatcactcag ggtcaatgcc agcgcitcgt 2640 taatacagai gtaggtgttc cacagggtag ccagcagcat cctgcgatgc agatccggaa 2700 cataatggtg cagggcgctg acttccgcgt ttccagactt tacgaaacac ggaaaccgaa 2760 gaccattcat gttgttgctc aggtcgcaga cgttttgcag cagcagtcgc ttcacgttcg 2820 clcgcgtatc ggtgattcat tctgctaacc agtaaggcaa ccccgccagc ctagccgggt 2880 cctcaacgac aggagcacga tcaigcgcac ccgtggccag gacccaacgc igcccgagat 2940 gcgccgcgtg cggctgctgg agaTggcgga cgcgatgga丨 atgttctgcc aag&gttggt 3000 ttgcgcattc acagttctcc gcaagaattg attggctcca attcttggag tggtgaatcc 3060 gllagcgagg tgccgccggc ttccattcag gtcgaggtgg cccg^ctcca tgcaccgcga 3120 cgcaacgcgg ggaggcagac aaggtatagg gcggcgccta caatccatgc caacccgttc 3180 catgtgctcg ccgaggcggc ataaatcgcc gtgacgatca gcggtccagt gatcgaagtt 3240 aggctggtaa gagccgcgag cgatccttga agctgtccct gatggtcgtc atcucctgc 3300 ctggacagca tggcctgcaa cgcgggcatc ccgatgccgc cggaagcgag aagaatcata 3360 atggggaagg ccatccagcc tcgcgtcgcg aacgccagca agacgtagcc cagcgcgtcg 3420 gccgccatgc cggcgataat ggcctgcttc tcgccgaaac gtttggtggc gggaccagtg 3480 •75- 149048-序列表.doc 201111512

acgaaggctt gagcgagggc gtgcaagatt ccgaataccs caagcgacag gccgatcatc 3540 ptcgcgctcc agcgaaagcg gtcclcgccg aaaatgaccc agagcgctgc cggcacctgt 3600 cctacgagtt gcatgataaa gaagacagtc ataagtgcgg cgacgatagt catgccccgc 3660 gcccaccgga aggagctgac tgggttgaag gclctcaagg gcatcggtcg agatcccegt 3720 ncclaaUag tgagctaact tacattaalt gcgttgcgct cactgcccgc tttccagtcg 3780 FBaaacctgt cglgccagct gcattaaiga atcggccaac gcgcggggag aggcggtttg 3840 cgtatteggc gccagggtgg tttttctttt caccagtgag acgggcaaca gctgattgcc 3900 cltcaccgcc tggccctgag agagttgcag caagcggtcc acgctggttt gccccagcag 3960 Scgaaaatcc tgtttgatgg tggttaacgg cgggataiaa catgagctgt citcggtatc 4020 Rtcgtatccc actaccgaga tatccgcacc aacgcgcagc ccggactcgg taatggcgcg 4080 cattgcgccc agcgccatct gatcgtiggc aaccagcstc gcagtgggaa cgatgccctc 4140 nttcagcatt tgcatggttt gttgaaaacc ggacatggca ctccagtcgc cttc-ccgttc 4200 cgctatcggc tgaatttgat tgcgagtgag atatttatgc cagccagcca gacgcagacg 4260 cgccgagaca gaacttaatg ggcccgciaa cagcgcgatt tgctggtgac ccaatgcgac 4320 cagatgctcc acgcccagtc gcgtaccgtc ttcalgggag aaaataatac tgttgatggg 43S0 tgtctggtca gagacatcaa gaaataacgc cggaacaua glgcaggcag cilccacagc 4440 aatggcatcc tggtcatcca gcggatagtt aatgatcagc ccactgacgc gttgcgcgag 4500 aagattgtgc accgccgctt tacaggctlc gacgccgctt cgttctacca tcgacaccac 4%0 cacgctggca cccagugat cggcgcgaga ttlaatcgcc gcgacaattt gcgacggcgc 4620 RUcagggcc agactggagg tggcaacgcc aatcagcaac gactBtttgc ccgccagttg 4680 ttgtgccacg cggllgggaa igtaaitcag ctccgccatc gccgcttcca ctttttcccg 4740 cgUUcgca gaaacgtggc vggcctgglt caccacgcgg gaaacggtct gataagagac 4800 accggcacac tctgcgacat cgtataacgt tactggtttc acattcacca ccctgaattg 4860 actctcttcc £££cectalc atficcatacc gcgaaacEtt itgcgccaU cgatgglgtc 4920 cfiEEatctcg acgctciccc Itatgcgact cctgcattag gaagcagccc agtagtaggt 4980 tfiaggccglt gagcaccgcc gccgcaagga atggtEcatg caaggagatg gcgcccaaca 5040 gtcccccggc cacggggcct gccaccaiac ccacgccgaa acaagcgctc atgagcccga 5100 agtggcgagc ccgalcttcc ccatcggtga tgtcggcgat ataggcgcca gcaaccgcac 5160 ctgtggcgcc ggtgatgccg gccacgatgc gtccggcgta gaggatcgag atctcgatcc 5220 cgcgaaatta atacgactca ctatagggga attglgagcg gataacaau cccclclaga 5280 aataattttg tttaaciua agaaEgagat ataccatggg ccatcatcat catcatcatc 5340 utcatcatca cagcagcggc catatcgaag gtcfitcatat gacigccgac aacaatagta 5400 tgccccatgg igcagtatct agttacgcca aattagtfica aaaccaaaca cctgaagaca 5460 ttttggaaga gtttcctgaa altatlccat tacaacaaag acctaatacc cgatctagtg 5520 agacgtcaaa tgacgaaagc ggagaaacat gtttMctgg tcatgatgag gagcaaatta 5580 agttaatgaa tgaaaaugt attgttttgg attgggacga laatgctaU ggtgccggta ^640 ccaagaaagt ttgtcatUa atggaaaata ttgaaaaggg tttactacat cgtgcattct 5700 ccgtctttat tttcaatgaa caaggtgaat tacttttaca acaaagagcc actgaaaaaa 5760 taactttccc tgatctitgg actaacacal gclectctca tccactatgt attgatgacg 5820 aattaggttt gaaggfitaag ctagacgata agattaaggg cgctatlaci gcggcggtga 5880 gaaaactaga tcatgaatta ggtattccag aagatgaaac taagacaagg egtaagtilc 5940 actttttaaa cagaatccat tacatggcac caagcaatga accatggggt gaacatgaaa 6000 Ugattacat cctattttat aagatcaacg ctaaagaaaa cttgactgtc aacccaaacg 6060 tcaatgaagt tagagacttc aaatgggtlt caccaaatga tttgaaiiact atgttlgctg 6120 acccaagtta caagtuacg ccttggttta agaltatttg cgagaattac tiattcaact 6180 ggtgggagca attagatgac ctttctgaag tggaaaatga caggcaaatt catagaalgc 6240 tataacaacg cglcggatcc ggctgctaac aaagcccgaa aggaagctga gttggctgct 6300 gccaccgctg agcaataact agcataaccc cttggggcct ctaaacgggt cttgagg^gt 6360 tttttgctga gaggaggaac latatccgga 丨aicccgcaa gaggcccggc agtaccgsca 6420 taaccaagcc tatgcclaca gcatccaggg tgacggtgcc gaggatgacg atgagcgcat 6480 tgttagaUt catacacggt gcctgactgc gttaecaatt laactgtgat aaactaccgc 6540 attaaagctt atcgatgata agctgtcaaa catgagaa 6578

<210> 193 <2)1> 323 <212> DNA <213>人工序列 <220> 卻> 合成構築體 <400> 193 agattgctgc aaatataaga tctagaaagt cggtgataaa atcagcagga gccgtcctgg gaaatcgtag gccggataag gcgtttacgc cgcalccggc aaaaatcctt 60 gcaaacctgc aattaaccct caciaaaggg cggccgcgaa gucctatic 120 ataggaactt cctcgagccc latagtgagl cgtattaaga taaccatctg 180 itatctctgg cggtgttgac ataaatacca ctggcggtga tactgagcac 240 cgcaclgcaa aggaggtaaa aacatgtctg aatctglaca gagcaatagc 300 igcacttcac get 323 76- 149048-序列表.doc

Claims

201111512 七、申請專利範圍： 1. 一種細胞，其包含⑴編碼鐵硫簇相互作用氧化還原多肽、DXP途徑多肽、MVA途徑多肽及異戊二烯合成酶多肽之異源核酸’或（Π)編碼鐵硫簇相互作用氧化還原多肽、DXP途徑多肽、MVA途徑多.肽及異戊二烯合成酶多肽之内源核酸之複本。 2_如請求項1之細胞，其中該等細胞進一步包含編碼IDI(異戊烯基-二磷酸δ-異構酶）多肽之異源核酸、或内源核酸之複本。 3·如請求項1或2之細胞，其中培養中之該等細胞製造大於約 400 nmol/gwcm/h之異戊二烯。

如請求項1或2之細胞，其中該等細胞自細胞培養基中消耗之碳有超過約0.02莫耳％轉化成異戊二烯/ 一種製造異戊二烯之方法，該方法包括： (a) 在適於製造異戊二烯之培養條件下培養包含以下之細胞：⑴編碼鐵硫簇相互作用氧化還原多肽、Dxp途徑多肽、MVA途徑多肽及異戊二稀合成酶多肽之異源核酸，或（ii)編碼鐵硫簇相互作用氧化還原多肽、Dxp途徑夕肽MVAjt徑乡肽及異戊二烯合成酶彡肽之内源核酸之複本；及 (b) 製造異戊二稀。 6.如請求項5之方法，盆ψ兮笙八〒遠專細胞進一步包含編碼im(異戊烯基-二磷酸δ_異禮共稱姆）多肽之異源核酸、或内源核酸之複本。 149048.doc 201111512 7. 如請求項5或6之方法，其中培養中之該等細胞製造大於約 400 nmol/gwem/h之異戊二稀。 8. 如請求項5或6之方法，其中該等細胞自細胞培養基中消耗之碳有超過約0.02莫耳％轉化成異戍二烯。

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