TW201000118A - Multivalent fibronectin based scaffold domain proteins - Google Patents

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TW201000118A
TW201000118A TW098117110A TW98117110A TW201000118A TW 201000118 A TW201000118 A TW 201000118A TW 098117110 A TW098117110 A TW 098117110A TW 98117110 A TW98117110 A TW 98117110A TW 201000118 A TW201000118 A TW 201000118A
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Ray Camphausen
Eric Furfine
Irvith M Carvajal
Nicholas H Marsh
Marco M Gottardis
Joan Carboni
Ricardo M Attar
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Bristol Myers Squibb Co
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201000118 六、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於用於診斷、研究及治療應用之以多價纖維 連接蛋白為主之架構域。本發明進一步係關於包含該等蛋 白質之細胞、編碼該等蛋白質或其片段之聚核苷酸及包含 編碼該等創新蛋白質之聚核苷酸之載體。 【先前技術】 以纖維連接蛋白為主之架構為能夠演化以結合所關注之 任何化合物的蛋白質家族。一般利用來源於纖維連接蛋白 ΠΙ型（Fn3)或Fn3樣域之架構的此等蛋白質以代表天然或工 程化抗體（亦即，多株、單株或單鏈抗體）特徵之方式起作 用’且此外具有結構優點。特定言之，此等抗體模擬物之 結構經設計以求甚至在通常導致抗體之結構及功能損失的 條件下具有最佳摺疊、穩定性及溶解性。以纖維連接蛋白 為主之架構蛋白質的一實例為AdnectinsTM(Adnexus，百時 施貴寶研發公司（Bristol-Myers Squibb R&D Company))。 纖維連接蛋白為在形成細胞外基質及細胞-細胞相互作 用中起重要作用的大型蛋白質；其由多個三種類型（I型、 Π型及III型）小型域之重複組成（Baron等人，1991)。Fn3自 身為包括細胞黏著分子、細胞表面激素及細胞因子受體、 伴隨蛋白及碳水化合物結合域之部分的大子族之範例。關 於評論參見Bork及Doolittle, Proc Natl Acad Sci U S A. 1992年 10月 1 日；89(19):8990-4 ; Bork等人，J Mol Biol. 1994 年 9 月 30 日；242(4):309-20 ; Campbell 及 Spitzfaden， 140513.doc 201000118
Structure. 1994 年 5 月 15 日；2(5):333-7 ; Harpez及 Chothia, J Mol Biol. 1994年 5 月 13 日；238(4):528-39。 纖維連接蛋白III型（Fn3)域按N-末端至C-末端之順序包 含β或β樣鏈A、環ΑΒ、β或β樣鏈B、環BC、β或β樣鏈C、 環CD、β或β樣鏈D、環DE、β或β樣鏈Ε、環EF、β或β樣鏈 F、環FG及β或β樣鏈G。環ΑΒ、BC、CD、DE、EF及FG中 之任一者或全部可參與目標結合。BC、DE及FG環在結構 及功能上均類似於免疫球蛋白之互補判定區（CDR)。美國 專利第7,115,396號描述使BC、DE及FG環改變產生高親和 力TNFa結合子的Fn3域蛋白質。美國公開案第2007/ 0148126號描述使BC、DE及FG環改變產生高親和力 VEGFR2結合子的Fn3域蛋白質。 獲得經改良之纖維連接蛋白域架構蛋白質對於治療及診 斷之目的將為有利的。本揭示案提供該等改良蛋白質。 【發明内容】 本申請案之一態樣提供包含含有以小於5〇〇 nM之κ〇結 合第一目標分子之第一纖維連接蛋白m型第十域（1〇1?113)的 N-末端域及含有以小於500 nM之Kd結合第二目標分子之 第二〗〇Fn3的C_末端域之多價多肽。在一些實施例中，第 一 1〇Fn3域與第二wFn3域經由多肽連接子連接，該多肽連 接子諸如具有卜1〇〇、1-50、^0、卜1〇、5 5〇、5 2〇、5_ 1〇、1〇-5〇或10-20個胺基酸之多肽。在一些實施 -1QFn3域與第二，n3域經由S自以甘胺酸_絲胺酸為主之 連接子的多肽（諸如，SEQ ID N0: 21及22)連接。在一些實 140513.doc 201000118 施例中’第一 10Fn3域與第二10Fn3域經由SEQ ID NO: 20中 描繪之多肽連接。在一些實施例中，第一 1〇1?113域與第二 〇Fn3域經由選自以甘胺酸_脯胺酸為主之連接子的多肽（諸 如，SEQ ID NO: 32、33及34)連接。在一些實施例中，第 一 Fn3域與第二i〇Fn3域經由選自以脯胺酸丙胺酸為主之 連接子的多肽（諸如，SEQ ID N〇: 60、61及62)連接。
Fn3域各自包含環AB、環Bc、環CD、環DE、環ef及 ❹ 環FG且各自獨立地具有至少一個選自環BC、〇£及17(5的相 對於人類1GFn3域之相應環之序列具有改變之胺基酸序列 的環。1GFn3域各自包含與由SEQ ID NC^ i表示之天然存在 之人類10Fn3域至少50%、6〇%、7〇%或8〇%一致的胺基酸 序列。 在些實施例中，第一 10Fn3域以小於1〇〇 nM之KD結合 第目標分子且第二1〇Fn3域以小於1〇〇 nM2KD結合第二 目標分子。在一些實施例中，第一目標分子與第二目標分 Φ 子相同。在一些貫施例中，第一目標分子與第二目標分子 不同。在一些實施例中，第一目標分子為IGF-IR且第二目 標分子為VEGFR2。在一些實施例中’第一目標分子為 VEGFR2且第二目標分子為IGF_IR。 在—些實施例中，10Fn3域之至少兩個環改變。在一些 實施例中，環BC及環FG相對於人類i«Fn3域之相應環之序 列具有改變之胺基酸序列。在一些實施例中，1GFn3域之 至少三個環改變。在一些實施例中，1GFn3域之至少兩個 裱結合目標分子。在一些實施例中，1Q]Fn3域之三個環結 140513.doc 201000118 合目標分子。 在一些實施例中，第一及/或第二1GFn3域在其C-末端與 選自 SEQ ID NO: 17、18、19、50、51、52、71 或 72 或 E、 El、EID、ES、EC、EGS或EGC之胺基酸序列連接。在一 些實施例中，第一1GFn3域在其C-末端與SEQ ID NO: 19或 50或E、EI或EID之胺基酸序列連接。在一些實施例中，第 二 10Fn3 域在其 C-末端與 SEQ ID NO: 17、18、51、52、71 或72之胺基酸序列連接。 在一些實施例中，提供包含與SEQ ID NO: 8-15、29-31 及 63-70 中之任一者至少 70%、80%、90%、95% 或 100%— 致之胺基酸序列的多價多肽。 在一些實施例中，多價多肽進一步包含一或多個選自以 下之藥物動力學（PK)部分：聚氧伸烷基部分、人類血清白 蛋白結合蛋白、唾液酸、人類血清白蛋白、運鐵蛋白、 IgG、IgG結合蛋白及Fc片段。在一些實施例中，PK部分 為聚氧伸烷基部分且該聚氧伸烷基部分為聚乙二醇 (PEG)。在一些實施例中，PEG部分經由Cys或Lys胺基酸 共價連接至多價多肽。在一些實施例中，PEG介於約0.5 kDa與約100 kDa之間。 在一些實施例中，PK部分改良多肽之一或多種藥物動 力學性質，例如生物可用性、血清半衰期、活體内穩定性 及藥物分布。在一些實施例中，PK部分使多價多肽之血清 半衰期相對於單獨多價多肽增加至少20%、30%、40%、 5 0%、70%、90%、100% > 120%、15 0%、200%、400%、 140513.doc 201000118 600%、800%或800%以上。在一些實施例中，進一步包含 PK部分之多價多肽具有至少1、2、3、4、5、6、7、8、 9、10、11、12、13或14天之血清活體内半衰期。 在一些實施例中，PK部分與1GFn3域經由至少一個雙硫 鍵、肽鍵、多肽、聚合糖或聚乙二醇部分連接。在一些實 施例中，PK部分與1GFn3域經由包含SEQ ID NO: 17、18或 20之胺基酸序列的多肽連接。 在一些實施例中，多價多狀進一步包含結合部分。在一 些實施例中，多價多肽進一步包含抗體部分。在一些實施 例中，抗體部分小於50 kDa。在一些實施例中，抗體部分 小於40 kDa。在一些實施例中，抗體部分為單鏈 Fv(scFv)、Fab片段、Fab·片段、F(ab’）2、雙硫連接型 Fv(sdFv)、Fv、雙功能抗體或全抗體。在一些實施例中， 抗體部分為單域抗體。在一些實施例中，抗體部分結合人 類蛋白質。在一些實施例中，抗體部分結合IGF-IR、 FGFR1、FGFR2、FGFR3、FGFR4、c-Kit、人類 pl85 受體 樣酪胺酸激酶、HER2、HER3、c-Met、葉酸受體、 PDGFR、VEGFR1、VEGFR2、VEGFR3、人類金管内皮生 長因子（VEGF)A、VEGF C、VEGF D、人類 CD20、人類 CD18、人類CDlla、人類細胞凋亡受體-2(Apo-2)、人類 α4β7整合素、人類GPIIb-IIIa整合素、幹細胞因子（SCF)、 EGFR或人類CD3。 在一些實施例中，多價多肽進一步包含脂質運載蛋白 (lipocalin)之衍生物、四聯蛋白（tetranectin)之衍生物、艾 140513.doc 201000118 菲爾親和聚體（avimer)或錫蛋白（ankyrin)之衍生物。在一 些實施例中，多價多肽結合人類蛋白質。在一些實施例 中，多價多肽結合 IGF-IR、FGFR1、FGFR2、FGFR3、 FGFR4、c-Kit、人類pl85受體樣酪胺酸激酶、HER2、 HER3、c-Met、葉酸受體、PDGFR、VEGFR1、VEGFR2、 VEGFR3、人類血管内皮生長因子（VEGF)A、VEGF C、 VEGF D、人類CD20、人類CD18、人類CDlla、人類細胞 凋亡受體-2(Apo-2)、人類α4β7整合素、人類GPIIb-IIIa整 合素、幹細胞因子（SCF)、EGFR或人類CD3。 在一些實施例中，多價多肽進一步包含經由至少一個雙 硫鍵、肽鍵、多肽、聚合糖或聚乙二醇部分（PEG)連接之 結合部分。在一些實施例中，PEG介於約0·5 kDa與約100 kDa之間。在一些實施例中，PEG經由Cys或Lys殘基與多 肽及結合部分接合。 在一態樣中，本申請案提供經去免疫以移除一或多個T 細胞抗原決定基之多價多肽。在一態樣中，本申請案提供 經去免疫以移除一或多個B細胞抗原決定基之多價多肽。 在一態樣中，本申請案提供一種多價多肽，其中1()Fn3 域藉由包含以下步驟之方法來選擇：a)產生一群各自包含 與人類1QFn3域編碼序列不同之候選纖維連接蛋白III型 (1GFn3)域序列的候選核酸分子，該等核酸分子各自包含與 該候選1GFn3域編碼序列可操作連接之轉譯啟始序列及起 始密碼子且各自在3'末端與核酸-噪吟黴素（puromycin)連接 子可操作連接；b)活體外轉譯該等候選1GFn3域編碼序列以 140513.doc 201000118 產生一群候選核酸-^Fn〗融合體；c)使該群候選核酸-1(>Fn3 融合體與目標分子接觸；及d)選擇核酸_1()1?113融合體，該 核酸-1QFn3融合體之蛋白質部分對目標分子具有相對於該 人類1GFn3對該目標分子之結合親和力或特異性經改變的 結合親和力或特異性。在一些實施例中，藉由改變一或多 個核酸殘基且用目標分子再篩檢融合體以選擇經改良之結 合子而進一步優化所選核酸j〇Fn3融合體。在一些實施例 ❿ 中，候選核酸分子為RNA。在一些實施例中，候選核酸分 子為DNA。 在一態樣中，本申請案提供包含多價多肽之醫藥學上可 接焚之組合物。在一些實施例中，組合物基本上不含内毒 素。在一些實施例中，組合物實質上無微生物污染，使得 其適於活體内投藥。組合物可經調配（例如）以用於Ιν、ιρ 或皮下投藥。 在另一態樣中，本申請案提供編碼如本文所述之多價多 〇 肽的核酸。亦包括含有該等蛋白質之聚核苷酸的載體。合 適載體包括（例如）表現載體。本申請案之另一態樣提供包 含編碼多價多肽之聚核苷酸、載體或表現載體的細胞。序 列較佳經優化以使在所用細胞類型中之表現最大化。表現 較佳在大腸桿菌（E. coli)中進行。多價多肽亦可在（例如）真 核微生物（包括酵母（例如，畢赤酵母（pichia)或釀酒酵母 (cerevisiae))或藍綠藻）中表現。酵母細胞可經工程化以產 生所需糖基化。本發明之細胞可為哺乳動物細胞。在一態 樣中’哺乳動物細胞可經工程化以產生所需糖基化。在一 140513.doc 201000118 態樣中，細胞表現以纖維連接蛋白為主之架構蛋白質。在 一態樣中’編碼以纖維連接蛋白為主之架構蛋白質之聚核 苷酸為經優化以供在所選細胞類型中表現之密碼子。亦提 供用於產生如本文所述之多價多肽的方法，其包含培養包 含含有編碼多價多肽之核酸的核酸、載體或表現載體之宿 主細胞，及自該培養物回收所表現之多價多肽。 【實施方式】 定義 「多肽」意謂兩個或兩個以上胺基酸之任何序列，而不 論長度、轉譯後修飾或功能如何。「多肽」、「肽」及「蛋 白質」在本文中可互換使用。多肽可包括天然胺基酸及非 天然胺基酸’諸如以引用的方式併入本文中之美國專利第 6,559,126號中描述的彼等胺基酸。多肽亦可以多種標準化 學方式中之任一者來修飾（例如，胺基酸可經保護基修 飾’可使叛基末端胺基酸轉變成末端醯胺基團；胺基末端 殘基可經基團修飾以（例如）增強親脂性；或多肽可經化學 糖基化或以其他方式修飾以增加穩定性或活體内半衰 期）。多肽修飾可包括使諸如環狀化合物或其他分子之另 一結構連接至該多肽且亦可包括含有一或多個呈改變之構 型（亦即’ R或S ;或L或D)之胺基酸的多肽。 術語「PK」為「藥物動力學」之首字母縮寫且涵蓋包 括（例如）個體的吸收、分布、代謝及消除之化合物性質。 「PK調節蛋白質」或「ρκ部分」係指當與生物活性分子 融合或與生物活性分子一起投與時影響該生物活性分子之 140513.doc •10· 201000118 藥物動力學性質的任何蛋白質、肽或部分β PK調節蛋白質 或ΡΚ部分之實例包括PEG、人類jk清白蛋白（HSA)結合子 (如美國公開案第20050287153號及第20070003549號中所 揭示）、人類血清白蛋白、FC或Fc片段及糖（例如，唾液 酸）。 「功能性F c區」具有天然序列F c區之至少一種「效應功 能」。例示性「效應功能」包括Clq結合、補體依賴性細胞 毒性（CDC)、Fc受體結合、抗體依賴性細胞介導之細胞毒 性（ADCC)、吞嗤作用、細胞表面受體（例如，b細胞受 體；BCR)之下調等。該等效應功能一般需要將Fc區與結 合域（例如，抗體可變域）組合且可使用此項技術中已知用 於評估該等抗體效應功能的各種檢定來評估。 「天然序列Fc區」包含與自然界中存在之Fc區的胺基酸 序列一致之胺基酸序列。 「變異型Fc區」包含由於至少一個胺基酸修飾而與天然 序列Fc區之胺基酸序列不同的胺基酸序列。與天然序列Fc 區或親本多肽之Fc區相比，變異型Fc區較佳在天然序列fc 區或親本多肽之Fc區中具有至少一個胺基酸取代，例如約 1至約10個胺基酸取代，且較佳約1至約5個胺基酸取代。 本文中變異型Fc區將較佳與天然序列Fc區及/及親本多肽 之Fc區具有至少約80%序列一致性，且最佳與其具有至少 約90%序列一致性，更佳與其具有至少約95%序列一致 性。 「抗體依賴性細胞介導之細胞毒性」及「ADCC」係指 140513.doc 201000118 表現Fc受體（FcR)之非特異性細胞毒性細胞（例如’自然殺 傷（NK)細胞、嗜中性白血球及巨噬細胞）識別目標細胞上 之結合抗體且隨後引起目標細胞溶解的細胞介導反應。介 導ADCC之初級細胞NK細胞僅表現FcyRIII，而單核細胞表 現FcyRI、FcyRII及FcyRIII。為評估所關注分子之ADCC活 性，可執行活體外ADCC檢定，諸如美國專利第5,500,362 號或第5,821,337號中所描述之檢定。適用於該等檢定之效 應細胞包括周邊血液單核細胞（PBMC)及自然殺傷（NK)細 胞。或者或另外，可在活體内，例如在諸如揭示於Clynes 等人，PNAS (USA) 95:652-656(1998)中之動物模型中，評 估所關注分子之ADCC活性。 本文中「胺基酸序列一致性百分比（％)」定義為在將序 列比對且必要時引入缺口以實現最大序列一致性百分比且 不將任何保守取代視為序列一致性之部分後，候選序列中 與所選序列中之胺基酸殘基相同之胺基酸殘基的百分比。 出於測定胺基酸序列一致性百分比之目的而進行之比對可 以此項技術範圍内之多種方式來實現，例如使用公開可得 之電腦軟體，諸如 BLAST、BLAST-2、ALIGN、ALIGN-2 或Megalign(DNASTAR)軟體。熟習此項技術者可確定用於 量測比對之適當參數，包括實現所比較之全長序列上的最 大比對所需要之任何演算法。然而，出於本文之目的，如 下所述，藉由使用序列比較電腦程式ALIGN-2獲得％胺基 酸序列一致性之值。ALIGN-2序列比較電腦程式由 Genentech，Inc.創作，已以使用者文件歸播於美國版權局 140513.doc 12 201000118 (U.S. Copyright Office)(Washington D.C.，20559)，其中其 以美國版權註冊編號TXU510087註冊，且可經由 Genentech, Inc.(South San Francisco, Calif)公開獲得。 ALIGN-2程式應經編譯以用於UNIX操作系統，較佳數位 UNIX V4.0D。所有序列比較參數均由ALIGN-2程式設定且 不改變。 出於本文之目的，給定胺基酸序列A對、與或相對於給 定胺基酸序列Bi %胺基酸序列一致性（或者其可表述為給 定胺基酸序列A對、與或相對於給定胺基酸序列B所所具 有或包含之特定％胺基酸序列一致性）計算如下：100乘以 分數X/Y，其中X為由於A與B之程式比對而由序列比對程 式ALIGN-2評為一致匹配的胺基酸殘基數，且其中Y為B中 胺基酸殘基之總數。應瞭解在胺基酸序列A之長度與胺基 酸序列B之長度不等的情況下，A對%胺基酸序列一致 性不等於B對八之％胺基酸序列一致性。 「經分離」多肽為已經鑑別且自其天然環境之組份分離 及/或回收的多肽。其天然環境之污染組份為將干擾多肽 之診斷或治療用途的物質，且可包括酶、激素及其他蛋白 質或非蛋白質溶質。在較佳實施例中，將多肽純化至（1)如 藉由勞立（Lowry)方法所測定高於95重量％之多肽，且最佳 高於99重量％ ; (2)足以藉由使用旋杯式序列分析儀獲得N 末端或内部胺基酸序列之至少1 5個殘基的程度，或（3)使用 考馬斯藍（Coomassie blue)或較佳銀染在還原或非還原條件 下藉由SDS-PAGE測定具均質性。由於多肽天然環境之至 140513.doc -13- 201000118 少一種組份將不存在，所以經分離多肽包括原位處於重組 、’田胞内之多肽。然而，經分離多肽通常將藉由至少一個純 化步驟來製備。 目標亦可為該等目標之片段。因此，目標亦為能夠引起 免疫反應之該目標之片段。目標亦為能夠與針對該全長目 標產生之單域抗體結合的該目標之片段。 如本文所用之片段係指小於序列之100%(99%、9〇%、 80%、70%、60%、50% ' 40%、30%、20%、1〇%等）但包 含5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、 18、19、20、21、22、23、24、25 或 25個以上胺基酸。片 段具有足夠長度以使得所關注之相互作用以丨χ〗〇·6 M或 lxlΟ·6 Μ以上之親和力維持。 如本文所用之片段亦指實質上未改變目標與針對野生型 目標產生之單域抗體結合之能力的一或多個胺基酸之可選 插入、缺失及取代。胺基酸插入、缺失或取代之數目較佳 為至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、1〇、11、12、13、 14、15、16、17、 18、 19 ' 20、21、22、23、 25、 26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、％、”、 38、39、40、41、42、43、44、45、46 ' 47、48、49、 5〇、51、52、53、54、55、56、57、58、59、6〇、61、 62、63、64、65、66、67、68、69 或 70 個胺基酸。 術語「治療有效量」係指有效治療哺乳動物疾病或病症 的藥物量。在癌症狀況下，治療有效量之藥物可減少癌細 胞數目小腫瘤尺寸；抑制（亦即，在某㈣度上減慢 140513.doc -14· 201000118 且較佳停止）癌細胞浸潤至周邊器官；抑制（亦即，在某種 程度上減慢且較佳停止）腫瘤轉移；在某種程度上抑制腫 瘤生長；及/或在某種程度上減輕一或多種與病症有關之 症狀。在藥物可阻止現有癌細胞生長及/或將其殺死的程 度上，其可具有細胞抑制性及/或細胞毒性。對於癌症療 法而言，可（例如）藉由評估疾病進展時間（TTP)及/或測定 反應速率（RR)來量測活體内功效。 胺基酸序列或化合物之半衰期一般可定義為例如由於藉 由天然機制使序列或化合物降解及/或將序列或化合物清 除或隔離而使多肽之血清濃度降低50%所花費的時間。半 衰期可以自身已知之任何方式，諸如藉由藥物動力學分析 來測定。合適技術將為熟習此項技術者所知曉且例如一般 可包含以下步驟：向待治療之靈長類動物適當地投與合適 劑量之胺基酸序列或化合物；定期自該靈長類動物收集血 液樣品或其他樣品；測定該血液樣品中本發明之胺基酸序 列或化合物之含量或濃度；及自由此獲得之資料（之曲線） 計算直至與給藥後的初始含量相比本發明之胺基酸序列或 化合物之含量或濃度降低50%為止的時間。例如參考標準 手冊，諸如 Kenneth, A 等人：Chemical Stability of Pharmaceuticals: A Handbook for Pharmacists 及 Peters 等 人 ，Pharmacokinete analysis: A Practical Approach (1996)。亦參考「Pharmacokinetics」，M Gibaldi 及 D Perron，由 Marcel Dekker 出版，第 2修訂版（1982)。 半衰期可使用諸如tl/2-α、tl/2-β及曲線下面積（AUC)之 140513.doc -15- 201000118 參數表示。名士& 中之任一 =s明書中，「半衰期增加」係指此等參數 者（諸如，此等參數中之任兩個或基本上所有三 個此等參數'r , 數）增加。「半衰期增加」尤其指在u/2_a及/或 或兩者增加或未增加的情況下tl/2-β增力σ。 如本文所用之術語「多價」 物活性區段之重組分子。形成 況可經由多肽連接子連接，該 允許各組成部分獨立起作用。 概述 係指併有兩個或兩個以上生 多價分子之蛋白質片段視情 多肽連接子連接組成部分且 本申叫案提供包含兩個或兩個以上以纖維連接蛋白為主 之架構蛋白質（諸如，Fn3域）的多價多肽。Fn3域可結合相 同目標，由此增加價數且因此增加目標結合之親和力或對 不同目標之親和力，從而顯示多種效應功能。 美國專利第6,818,418號描述可共價或非共價連接之纖維 連接蛋白架構多聚體。本申請案描述經由多肽連接子共價 鍵結從而允許多價多肽以單構築體形式表現之經改良多聚 體。本申請案部分關於以下驚人發現，亦即經由多肽連接 子聯接之Fn3域彼此獨立地正確摺疊’保留高親和力結 合’且各域保留其功能特性。 以織維連接蛋白為主之架構 本申請案之一態樣提供包含至少兩個經由多肽連接之各 自結合目標分子之Fn3域的多肽。各ρη3域包含ab環、BC 環、CD環、DE環、EF環及FG環。 在一些實施例中’ Fn3域為來源於人類纖維連接蛋白之 140513.doc -16· 201000118
Fn3域，尤其如SEQ ID NO: 1中所示之纖維連接蛋白之第 十Fn3域（10Fn3)。已報導多種突變型10Fn3架構。在一態樣 中，Asp 7、Glu 9及Asp 23中之一或多者經另一胺基酸（諸 如，不帶負電之胺基酸殘基（例如，Asn、Lys等））置換。已 報導此等突變具有促進突變型1QFn3在中性pH值下與野生 ' 型开> 式相比具有更高穩定性的作用（參見PCT公開案第 W002/04523號）。已揭示10Fn3架構中有益或中性之多種其 肇 他改變。參見例如Batori等人，Protein Eng. 2002年12月； 15(12):1015-20 ; Koide 等人，Biochemistry 2001 年 8 月 28 曰；40(34):10326-33。 變異型與野生型〗〇Fn3蛋白質兩者之特徵在於相同結 構，亦即7個指定為a至G之β鏈域序列及6個連接該等7個p 鏈域序列之環區域（ΑΒ環、BC環、CD環、DE環、EF環及 FG環）最罪近N-末端及C-末端定位之β鏈在溶液中可採用 β樣構形。在SEQ ID NO: i中，ΑΒ環對應於殘基1516, © BC環對應於殘基21-30，CD環對應於殘基39_45，DE環對 應於殘基51-56，EF環對應於殘基60_66，且FG環對應於殘 土 87(XU專人，Chemistry & Biology 2002 9:933-942)。 BC DE& FG環沿分子之一面排列且AB、cD& EF環沿該 分子之相對面排列。在SEQidn〇: i中，爲鏈八對應於殘基 9-14 ’ β鏈B對應於殘基17_20，0鏈（]對應於殘基31·38，β 鏈ί應於殘基46-50 ’ β鏈E對應於殘基57_59，β鏈F對應 於殘基67-75 ’且0鏈(3對應於殘基88_94。鍵經由相應環彼 連接例如鍵A與B經由環AB連接，從而形成鏈A、環 140513.doc -17- 201000118 AB、鏈B等。參與形成疏水性核心之殘基（「核心胺基酸 殘基」）包括對應於以下SEQ ID NO: 1之胺基酸的胺基 酸：L8、V10、A13、L18、120、W22、Y32、134、Y36、 F48、V50 ' A57、159、L62、Y68、170、V72、A74、 18 8、190及Y92，其中核心胺基酸殘基由單字母胺基酸碼 表示，隨後為其在SEQ ID NO: 1内所處之位置◊參見例如 Dickinson等人，J. Mol. Biol. 236: 1079-1092 (1994)。 在一些實施例中，1GFn3多肽可與SEQ ID NO: 1中所示之 人類 10Fn3 域至少 40%、50%、60%、65%、70%、75%、 80%、85%或90%—致。大部分變異一般發生在一或多個 環中。10Fn3多肽之每一 β或β樣鏈可基本上由與SEQ ID NO: 1之相應β或β樣鏈之序列至少80%、85%、9〇%、95〇/。 或100°/。一致的胺基酸序列組成，其限制條件為該變異不 破壞該多肽在生理條件下的穩定性。 在一些實施例中’本揭示案提供包含第十纖維連接蛋白 III型（lf)Fn3)域之多肽，其中i〇Fn3域包含環ΑΒ、環队、環 CD、環DE、環EF及環FG ;且具有至少一個選自環bc、 DE及FG的相對於人類i〇Fn3域之相應環之序列具有改變之 胺基酸序列的環。在一些實施例中，BC及FG環經改變。 在一些實施例中，BC、DE及FG環經改變，亦即Fn3域包 含非天然存在之環。「改變」意謂相對於模板序列（相應人 類纖維連接蛋白域）之一或多個胺基酸序列改變且包括胺 基酸添加、缺失及取代。改變胺基酸序列可經由一般核酸 編碼序列之有意、無意或自發序列變異來實現且可藉由任 140513.doc 201000118 何技術（例如，PCR、易錯PCR或化學DNA合成）進行。 在一些實施例中，一或多個選自BC、DE及FG之環在長 度上可相對於相應人類纖維連接蛋白環經延長或縮短。在 一些實施例中，環長度可延長2-25個胺基酸。在一些實施
例中，環長度可減少1-11個胺基酸。詳言之，1GFn3之FG -環為12個殘基長，而抗體重鏈中之相應環在4-28個殘基之 範圍内。因此為優化抗原結合，可在長度上以及覆蓋具有
4-28個殘基之CDR3範圍的序列上改變1QFn3之FG環之長 A 度，以獲得抗原結合之最大可能靈活性及親和力。 在一些實施例中，多肽包含含有與SEQ ID NO: 1之非環 區域至少80%、85%、90%、95%、98°/。或100%—致之胺基 酸序列的第一 Fn3域，其中至少一個選自BC、DE及FG之 環經改變。在一些實施例中，多狀包含含有與SEQ ID NO: 1之非環區域至少 80%、85%、90%、95%、98% 或 100%— 致之胺基酸序列的第二Fn3域，其中至少一個選自BC、DE φ 及FG之環經改變。在一些實施例中，經改變之BC環具有 至多10個胺基酸取代、至多4個胺基酸缺失、至多10個胺 基酸插入或其組合。在一些實施例中，經改變之DE環具 有至多6個胺基酸取代、至多4個胺基酸缺失、至多13個胺 基酸插入或其組合。在一些實施例中，FG環具有至多12個 胺基酸取代、至多11個胺基酸缺失、至多25個胺基酸插入 或其組合。 10Fn3域一般以SEQ ID NO: 1之胺基酸編號1開始。然 而，本發明亦包含具有胺基酸缺失之域。在一些實施例 140513.doc -19- 201000118 中，SEQ ID NO: 1之前8個胺基酸缺失。亦可將其他序列 添加至N-末端或C-末端。舉例而言，可將額外MG序列置 於Fn3域之N-末端，尤其第一Fn3域之N-末端。Μ通常將裂 解掉，留下G在Ν-末端。在一些實施例中，可將序列置於 1()?113域之0末端，例如8£()1〇]^0:17、18或19。在其他 實施例中，置於C-末端之序列可為SEQ ID NO: 17、18或 19之C-末端截短片段，包括（例如）以下胺基酸序列（由單字 母胺基酸碼表示）中之一者：E、El、EID、EIDKP(SEQ ID NO: 50)、EIDKPS(SEQ ID NO: 51)或 EIDKPC(SEQ ID NO: 52) ° 在一些實施例中，多肽包含具有胺基酸序列為SEQ ID NO: 2之BC環、胺基酸序列為SEQ ID NO: 3之DE環及胺基 酸序列為SEQ ID NO: 4之FG環的第一及/或第二1GFn3域， 其中該Fn3域結合IGF-IR。在一些實施例中，多肽包含具 有胺基酸序列為SEQ ID NO: 5之BC環、胺基酸序列為SEQ ID NO: 6之DE環及胺基酸序列為SEQ ID NO: 7之FG環的第 一及/或第二1QFn3域，其中該Fn3域結合VEGFR2。在一些 實施例中，多肽包含SEQ ID NO: 8-15、29-31及63-70中任 一者之胺基酸序列。在一些實施例中，多肽包含與SEQ ID NO: 8-15、29-31 及 63-70 中任一者至少 70%、75%、80%、 85%、90%、95%或100%—致之胺基酸序列。 纖維連接蛋白經由其整合素結合基元「精胺酸-甘胺酸-天冬胺酸」（RGD)天然結合某些類型之整合素。在一些實 施例中，多肽包含缺乏（RGD)整合素結合基元之1GFn3域。 140513.doc -20- 201000118 在一實施例中，多價多狀包含具有結構A-B-C之多狀’ 其中A為包含結合VEGFR2之1GFn3域、基本上由結合 VEGFR2之10Fn3域組成或由結合VEGFR2之10Fn3域組成的 多肽，B為多肽連接子，且C為包含結合IGF-IR之1QFn3 域、基本上由結合IGF-IR之1GFn3域組成或由結合IGF-IR之 10；Fn3域組成的多肽。在另一實施例中，多價多肽包含具 有結構A-B-C之多肽，其中A為包含結合IGF-IR之1GFn3 域、基本上由結合IGF-IR之1GFn3域組成或由結合IGF-IR之 10Fn3域組成的多肽，B為多肽連接子，且C為包含結合 VEGFR2之10Fn3域、基本上由結合VEGFR2之10Fn3域組成 或由結合VEGFR2之1GFn3域組成的多肽。具有結構A-B-C 之多價多肽之特定實例為包含以下之多肽：（i)具有SEQ ID NO: 8-15、29-31及63-70中任一者中闡明之胺基酸序列的 多肽，或（ii)包含與 SEQ ID NO: 8-15、29-31 及 63-70 中闡 明之任一胺基酸序列至少85%、90%、95%、97%、98%或 99%—致之胺基酸序列的多肽。 在某些實施例中，A或C區為包含結合VEGFR2之1GFn3域 之多肽’其中該1GFn3域自N-末端至C-末端具有以下結 構·· β鏈A、環AB、β鏈B、環BC、β鏈C、環CD、β鏈D、 環DE、β鏈Ε、環EF、β鏈F、環FG、β鏈G，其中該BC環具 有SEQ ID NO: 5之胺基酸序列，該DE環具有SEQ ID NO: 6 之胺基酸序列，且該FG環具有SEQ ID NO: 7之胺基酸序 列，其中該1GFn3域摺疊成抗體重鏈可變區樣結構，且其 中該多肽以小於100 nM之KD結合VEGFR2。結合VEGFR2 140513.doc -21 - 201000118 之1GFn3域較佳摺疊成7個β鏈分布在兩個彼此抵靠封裝從 而形成穩定核心的β摺疊片之間，且該等β鏈由暴露於溶劑 之6個環連接的結構。在例示性實施例中，1GFn3域長度為 80-150個胺基酸。 在某些實施例中，A或C區為結合VEGFR2之1GFn3域，其 包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 5之BC環、胺基酸序列為 SEQ ID NO: 6之DE環及胺基酸序列為SEQ ID NO: 7之FG 環，其中該10Fn3域以小於100 nM之KD結合VEGFR2。一例 示性VEGFR2結合子由以下序列表示： EVVAATXm SLLIXal SWRHPHFPTRXa7YYRITYGEXn?OEFTVX^ PLOPPTXa4ATI Xn.DYTITVYAVXasTDGRNGRLLSIPXi,JSINYRT(SEO ID NO: 47) ° 在SEQ ID NO: 47中，BC、DE及FG環具有如黑體所示之固 定序列，AB環由Xnl表示，CD由Xn2表示，且EF環由Xn3表 示，且β鏈A-G經加下劃線。X代表任何胺基酸且在X後面 之下標代表胺基酸數目之整數。詳言之，nl可為約1-15、 2-15、1-10、2-10、1-8、2-8、1-5、2-5、1-4、2-4、1-3、 2-3或1-2個胺基酸；n2及n3可各自獨立地為約2-20、2-15、2-10、2-8、5-20、5-15、5-10、5-8、6-20、6-15、6-10、6-8、2-7、5-7或6-7個胺基酸；且al-a6可各自獨立地 包含0-10、0-5、1-10、1-5或2-5個胺基酸。在較佳實施例 中，nl為2個胺基酸，n2為7個胺基酸，n3為7個胺基酸且 al-a6為0個胺基酸。在所有7個架構區中，β鏈之序列相對 於SEQ ID NO: 1中所示之相應胺基酸可具有約0至10、0至 140513.doc -22- 201000118 8、0至6、0至5、0至4、0至3、0至2或0至1個取代、缺失 或添加。在一例示性實施例中，在所有7個架構區中，β鏈 之序列相對於SEQ ID NO: 1中所示之相應胺基酸可具有約 0至10、0至8、0至6、0至5、0至4、0至3、0至2或0至1個 保守取代。在某些實施例中，核心胺基酸殘基固定且任何 取代、保守取代、缺失或添加存在於除核心胺基酸殘基以 外之殘基。在某些實施例中，VEGFR2結合子由以下胺基 ^ 酸序列表示： EVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLOPPTATISGLK PGVDYTITVYAVTDGRNGRLLSIPISINYRT (SEQ ID NO: 40) ° 在SEQ ID NO: 40中，BC、DE及FG環之序列具有如黑體所 示之固定序列（舉例而言，BC環具有SEQ ID NO: 5之胺基 酸序列，DE環具有SEQ ID NO: 6之胺基酸序列，且FG環 具有SEQ ID NO·· 7之胺基酸序列），且加下劃線之其餘序 列（舉例而言，7個β鏈及AB、CD及EF環之序列）相對於 ® SEQ ID NO: 35中所示之相應胺基酸具有約0至20、0至 15、0至10、0至8、0至6、0至5、0至4、0至3、0至2或0至 - 1個取代、保守取代、缺失或添加。在某些實施例中，核 . 心胺基酸殘基固定且任何取代、保守取代、缺失或添加存 在於除核心胺基酸殘基以外之殘基。結合VEGFR2之1QFn3 域視情況可包含長度為1-20、1-15、1-10、1-8、1-5、1-4、1-3、1-2或1個胺基酸之N-末端延伸。例示性N-末端延 伸包括（由單字母胺基酸碼表示）Μ、MG、G、 140513.doc •23- 201000118 MGVSDVPRDL(SEQ ID NO: 45) > VSDVPRDL(SEQ ID NO: 46)及 GVSDVPRDL(SEQ ID NO: 48)或 SEQ ID NO: 45、46 或48中任一者之N-末端截短。其他合適N-末端延伸包括 (例如）XnSDVPRDL(SEQ ID NO: 53)、XnDVPRDL(SEQ ID NO: 54)、XnVPRDL(SEQ ID NO: 55)、XnPRDL(SEQ ID NO: 56)、XnRDL(SEQ ID NO: 57)、XnDL(SEQ ID NO· 58) 或XnL，其中n=0、1或2個胺基酸，其中當n=l時，X為Met 或Gly，且當n=2時，X為Met-Gly。結合VEGFR2之WFd域 視情況可包含C-末端尾。例示性C-末端尾包括長度為1-20、1-15、1-10、1-8、1-5、1-4、1-3、1-2或 1個胺基酸之 多肽。C-末端尾之特定實例包括EIDKPSQ(SEQ ID NO: 17)、EIDKPCQ(SEQ ID NO: 18)及 EIDK(SEQ ID NO: 19)。 在其他實施例中，合適C-末端尾可為SEQ ID NO: 17、18 或19之C末端截短片段，包括（例如）以下胺基酸序列（由單 字母胺基酸碼表示）中之一者：E、El、EID、EIDKP(SEQ ID NO: 50)、EIDKPS(SEQ ID NO: 51)或 EIDKPC(SEQ ID NO: 52)。其他合適C-末端尾包括（例如）ES、EC、EGS、 EGC、EGSGS(SEQ ID NO: 71)或 EGSGC(SEQ ID NO： 72)。在某些實施例中，結合VEGFR2之1GFn3域包含N-末 端延伸與C-末端尾兩者。在例示性實施例中，A區包含以 Gly或Met-Gly開始之N-末端延伸及不含半胱胺酸殘基之C-末端延伸，且B區包含不以Met開始之N-末端延伸及包含 半胱胺酸殘基之C-末端延伸。結合VEGFR2之1GFn3域之特 140513.doc -24· 201000118 定實例為包含以下之多肽：（i)具有SEQ ID NO: 16、28及 40-44中任一者中闡明之胺基酸序列的多肽，或（ii)包含與 SEQ ID NO: 16、28及40-44中任一者中闡明之胺基酸序列 至少85%、90%、95%、97%、98%或99%—致之胺基酸序 列的多肽。 在某些實施例中，A或C區為包含結合IGF-IR之1GFn3域 之多肽，其中該1GFn3域自N-末端至C-末端具有以下結 構：β鏈A、環AB、β鏈B、環BC、β鏈C、環CD、β鏈D、 環DE、β鏈Ε、環EF、β鏈F、環FG、β鏈G，其中該BC環具 有SEQ ID NO: 2之胺基酸序列，該DE環具有SEQ ID NO: 3 之胺基酸序列，且該FG環具有SEQ ID NO: 4之胺基酸序 列，其中該1QFn3域摺疊成抗體重鏈可變區樣結構，且其 中該多肽以小於100 nM之KD結合IGF-IR。結合IGF-IR之 10Fn3域較佳摺疊成7個β鏈分布在兩個彼此抵靠封裝從而 形成穩定核心的β摺疊片之間，且該等β鏈由暴露於溶劑之 φ 6個環連接的結構。在例示性實施例中，1GFn3域長度為80- 150個胺基酸。
在某些實施例中，A或C區為結合IGF-IR之1GFn3域，其 包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 2之BC環、胺基酸序列為 ; SEQ ID NO: 3之DE環及胺基酸序列為SEQ ID NO: 4之FG 環，其中該1GFn3域以小於100 nM之KD結合IGF-IR。一例 示性IGF-IR結合子由以下序列表示： EVVAATXm SLLIX,. SWSARLKVARX^YYRITYGEXn^OEFTVX^PKNVYTX^ATI XniDYTITVYAVX^TRrRDYOPX^ISINYRKSEO ID NO: 49)。 140513.doc •25- 201000118 在SEQ ID NO: 49中’ BC、DE及FG環具有如黑體所示之固 定序列，AB環由χη1表示’ CD由Xu表示，且EF環由又„3表 不’且β鏈A-G經加下劃線。X代表任何胺基酸且在X後面 之下標代表胺基酸數目之整數。詳言之，nl可為約、 2-15、1-10、2-10、1-8、2-8、1-5、2-5、1-4、2-4、1-3、 2-3或1-2個胺基酸；n2及n3可各自獨立地為約2_2〇、2_ 15 ' 2-10 ' 2-8 ' 5-20 > 5-15 ' 5-10 ' 5-8 ' 6-20 ' 6-15 ' 6-10、6-8、2-7、5-7或6-7個胺基酸；且ai-a6可各自獨立地 包含0-10、0-5、1-1〇、丨_5或2_5個胺基酸，在較佳實施例 中’ nl為2個胺基酸，n2為7個胺基酸，n3為7個胺基酸且 al-a6為0個胺基酸。在所有7個架構區中，β鏈之序列相對 於SEQ ID NO: 1中所示之相應胺基酸可具有約〇至1〇、〇至 8、0至6、0至5、〇至4、〇至3、0至2或0至1個取代、缺失 或添加。在一例示性實施例中，在所有7個架構區中，P鏈 之序列相對於SEQ ID NO: 1中所示之相應胺基酸可具有約 0至10、0至8、0至6、〇至5、〇至4、0至3、0至2或0至1個 保守取代。在某些實施例中，核心胺基酸殘基固定且任何 取代、保守取代、缺失或添加存在於除核心胺基酸殘基以 外之殘基。在某些實施例中，IGF-IR結合子由以下胺基酸 序列表示：
EVVAATPTSLUSWSARLKVARYYRlTYGF.TrTGNSPVOEFTVPKNVYTATISGLK PGVDYTITVYAVTRFRDYOPISINYRT (SEQ ID NO: 40) 〇 在SEQ ID NO: 40中，BC、DE及FG環之序列具有如黑體所 示之固定序列（舉例而言，BC環具有SEq ID NO: 2之胺基 140513.doc -26- 201000118 酸序列，DE環具有SEQ ID NO: 3之胺基酸序列，且FG環 具有SEQ ID NO: 4之胺基酸序列），且經加下劃線之其餘 序列（舉例而言，7個β鏈及AB、CD及EF環之序列）相對於 SEQ ID NO: 40中所示之相應胺基酸具有約0至20、0至 15、0至10、〇至8、0至6、0至5、0至4、0至3、0至2或0至 1個取代、保守取代、缺失或添加。在某些實施例中’核 心胺基酸殘基固定且任何取代、保守取代、缺失或添加存 在於除核心胺基酸殘基以外之殘基。結合IGF-IR之1GFn3域 視情況可包含長度為1-20、1-15、1-10、1-8、1-5、1-4、 1-3、1-2或1個胺基酸之N-末端延伸。例示性N-末端延伸 包括（由單字母胺基酸碼表示）M、MG、G、MGVSDVPRDL (SEQ ID NO: 45)、VSDYPRDL(SEQ ID NO: 46)及 GVSDVPRDL(SEQ ID NO: 48)或 SEQ ID NO: 45、46或 48 中任一者之N-末尾截短片段。其他合適N-末端延伸包括 (例如）XnSDVPRDL(SEQ ID NO: 53)、XnDVPRDL(SEQ ID NO: 54)、XnVPRDL(SEQ ID NO: 55)、XnPRDL(SEQ ID NO: 56)、XnRDL(SEQ ID NO: 57)、XnDL(SEQ ID NO: 58) 或XnL，其中n=0、1或2個胺基酸，其中當n=l時，X為Met 或 Gly，且當 n=2 時，X 為 Met-Gly。結合 IGF-IR之 10Fn3 域 視情況可包含C-末端尾。例示性C-末端尾包括長度為1-20、1-15、1-10、1-8、1-5、1-4、1-3、1-2或 1 個胺基酸之 多肽。C-末端尾之特定實例包括EIDKPSQ(SEQ ID NO: 17)、EIDKPCQ(SEQ ID NO: 18)及 EIDK(SEQ ID NO: 19)。 在其他實施例中，合適C-末端尾可為SEQ ID NO: 17、18 140513.doc -27- 201000118 或19之C末端截短片段，包括（例如）以下胺基酸序列（由單 字母胺基酸碼表示）中之一者：E、El、EID、EIDKP(SEQ ID NO: 50)、EIDKPS(SEQ ID NO: 51)或 EIDKPC(SEQ ID NO: 52)。其他合適C-末端尾包括（例如）ES、EC、EGS、 EGC、EGSGS(SEQ ID NO: 71)或 EGSGC(SEQ ID NO: 72)。在某些實施例中，結合IGF-IR之1GFn3域包含N-末端 延伸與C-末端尾兩者。在例示性實施例中，A區包含以Gly 或Met-Gly開始之N-末端延伸及不含半胱胺酸殘基之C-末 端延伸，且B區包含不以Met開始之N-末端延伸及包含半 胱胺酸殘基之C-末端延伸。結合IGF-IR之〗GFn3域之特定實 例為包含以下之多肽：⑴具有SEQ ID NO: 26-27及35-39中 任一者中闡明之胺基酸序列的多肽，或（ii)包含與SEQ ID NO: 26-27及35-39中任一者中闡明之胺基酸序列至少 85%、90%、95%、97%、98°/。或99%—致之胺基酸序列的 多肽。 B區為多肽連接子。例示性多肽連接子包括具有1-20、 1-15、1-10、卜8、1-5、1-4、1-3或1-2個胺基酸之多肽。 合適多肽連接子之特定實例於本文中進一步描述。在某些 實施例中，連接子可為如本文所述之C -末端尾多狀、如本 文所述之N-末端延伸多肽或其組合。 在一實施例中，多價多肽包含具有結構Xi-A-X2-B-X3-C-X4之多肽，其中X1為可選N-末端延伸，A為結合 VEGFR2之10Fn3域，X2為可選C-末端尾，B為多肽連接 子，X3為可選N·末端延伸，C為結合IGF-IR之1GFn3域，且 140513.doc • 28 · 201000118 X4為可選c-末端尾。在另一實施例中，多價多肽包含具有 結構Xi-A-XyB-XyC-X4之多肽，其中&為可選N_末端延
❿ 伸，A為結合IGF_IR之icFn3域，&為可選c·末端尾，b為 多肽連接子，&為可選N-末端延伸，C為結合VEGFR2之 10Fn3域，且X4為可選C_末端尾。合適N_末端延伸及末 端尾之特定實例描述於上文中。在某些實施例中，X丨、 X2、B、X3或χ4中之一或多者可包含適於聚乙二醇化之胺 基酸殘基，諸如半胱胺酸或離胺酸殘I。在例示性實施例 中，Χ4包含至少-個適於聚乙二酵化之胺基酸，諸如半脱 胺酸或離胺酸殘基。合適多肽連接子之特定實例於下文中 進一步描述。具有結構X丨-A_X2_B_X3_C_X4之多價多肽之 特定實例為包含以下之多肽：⑴具有SEQ⑴職8七、 29-31及63-70中任一者 包含與 SEQ ID NO: 8-胺基酸序列至少8 5 %、 中闡明之胺基酸序列的多肽，或（ii) 5 29-31及63-70中任一者中闡明之 90%、95%、97%、98。/❶或 99%—致 之胺基酸序列的多肽。 如本文所定義之X為天然存在之胺 在例示性實施例中 基酸。 多肽連接子 本申清案提供包含至少+血], 主夕兩個經由多肽連接子連接之Fn3 域的多價多肽。該等多妝七人 肽包含含有第一 Fn3域之Ν_末端域 及含有第二Fn3域之C-太袖a _ 末鸲域。第一 Fn3域與第：Fn3域可 直接連接或經由多肽遠拉2 夕狀連接子間接連接。可在第—Fn3域之 C-末端在該Fn3域與多肽連 逆接子之間引入例如SEQ ID NO: 140513.doc -29- 201000118 17、18或19之其他連接子或間隔基。可在第二ρη3域之n末 端在該Fn3域與多肽連接子之間引入其他連接子或間隔 基。 ❹ 用於聯接Fn3域之合適連接子為允許單獨域彼此獨 摺疊，從而形成允許高親和力結合目標分子之三維結構的 彼等連接子。本申請案提供符合此等要求之合適連接子包 含以甘胺酸-絲胺酸為主之連接子、以甘胺酸_脯胺酸為主 之連接子、以脯胺酸-丙胺酸為主之連接子以及連接子SEQ ID NO: 20。本文所述之實例證明經由此等連接子聯接之 Fn3域保留其目標結合功能。在一些實施例中，連接子為 以甘胺酸-絲胺酸為主之連接子。此等連接子包含甘胺酸 及絲胺酸殘基且長度可介於8與5〇、1〇與3〇及1〇與2〇個胺 基酸之間。該等連接子之實例包括SEQ m N〇 : 23、Μ及 乃。在一些實施例中，多肽連接子係選自SEQ m n〇: 21 及22。在一些實施例中，連接子為以甘胺酸·脯胺酸為主 之連接子。此等連接子包含甘胺酸及脯胺酸殘基且長度可 介於3與30、10與30及3與2〇個胺基酸之間。該等連接子之 實例包括剛⑴恥：^似…在一些實施例^連 接子為以甘脯胺酸-丙胺酸為主之連接子。此等連接子包 含脯胺酸及丙胺酸殘基且長度可在3與3〇、1〇與％、3旬〇 及6與18個胺基酸之間。該等連接子之實例包括剛ι〇 N〇·· 60、61及62。預期最佳連接子長度及胺基酸組成可 藉由常規實驗藉由此項技術中熟知之方法測定。在一些實 施例中，多肽連接子為卯(^11)^):2()。 140513.doc -30. 201000118 藥物動力學部分 在一態樣中，本申請案提供進一步包含藥物動力學（PK) 部分之多價多肽。經改良之藥物動力學可根據覺察到之治 療需要來評估。通常需要增強生物可用性及/或增加劑量 之間的時間，可能藉由增加給藥後血清中蛋白質仍保持可 利用之時間。在一些情況下，需要改良蛋白質血清濃度隨 時間之連續性（例如，減小在投藥後不久與在下次投藥前 不久的蛋白質血清濃度之差異）。可將多肽與相對於未經 修飾之多肽將哺乳動物（例如，小鼠、大鼠或人類）中多肽 之清除率降低三倍以上的部分連接。經改良藥物動力學之 其他量度可包括血清半衰期，其通常分成α相及β相。藉由 添加合適之部分，可顯著改良任一相或兩相。 傾向於減緩蛋白質自血液清除之部分（本文中稱為「ΡΚ 部分」）包括聚氧伸烷基部分（例如，聚乙二醇）、糖（例 如，唾液酸）及良好耐受之蛋白質部分（例如，Fc、Fc片 段、運鐵蛋白或血清白蛋白）。可使多肽與如美國公開案 第20070048282號中所述之白蛋白或白蛋白之片段（部分）或 變異體融合。 在一些實施例中，PK部分為血清白蛋白結合蛋白，諸 如美國公開案第2007/0 178082號及第2007/0269422號中所 述之彼等血清白蛋白結合蛋白。 在一些實施例中，PK部分為血清免疫球蛋白結合蛋 白，諸如美國公開案第2007/0178082號中所述之彼等血清 免疫球蛋白結合蛋白。 140513.doc -31 - 201000118 在一些實施例中，多價多肽包含聚乙二醇（PEG)。一或 多個PEG分子可連接於蛋白質上之不同位置，且該連接可 藉由與胺、硫醇或其他合適反應性基團反應來達成。胺部 分可為（例如）存在於多肽N-末端之一級胺或存在於胺基酸 (諸如，離胺酸或精胺酸）中之胺基。在一些實施例中， PEG部分連接於選自由以下組成之群的多肽上之位置： a)N-末端；b)N-末端與最N-末端β鏈或β樣鏈之間；c)位於 多肽中與目標結合位點相對之面上的環；d)C-末端與最C-末端β鏈或β樣鏈之間；及e)C-末端。 聚乙二醇化可藉由定點聚乙二醇化達成，其中將合適反 應性基團引入蛋白質中以產生優先發生聚乙二醇化之位 點。在一些實施例中，蛋白質經修飾以將半胱胺酸殘基引 入所需位置，從而允許在該半胱胺酸上定點聚乙二醇化。 在一些實施例中，多狀包含含有Cys之連接子（諸如，SEQ ID NO: 1 8)，此允許定點聚乙二醇化。在一些實施例中， 將含有Cys之連接子引入第二Fn3域（亦即，多肽中最C-末 端之域）之3'末端。PEG之分子量可廣泛變化，且可為分枝 或線性PEG。 在一些實施例中，多價多肽包含Fn3域及PK部分。在一 些實施例中，Fn3域為1GFn3域。在一些實施例中，PK部分 使多肽之血清半衰期相對於單獨Fn3域增加超過5%、 10%、20%、3 0%、40%、5 0%、60%、70%、80%、90%、 100%、120%、150%、200%、400%、600%、800%、 1000% 或 1000%以上。 140513.doc •32- 201000118 在一些實施例中，pk部分經由至少一個雙硫鍵、肽 鍵、多肽、聚合糖或聚乙二醇部分與Fn3域連接。例示性 多肽連接子包括 PSTSTST(SEQ ID NO: 20)、EIDKPSQ (SEQ ID NO: 17)及 GS 連接子，諸如 GSGSGSGSGS(SEQ ID NO: 21)及其多聚體。在一些實施例中，PK部分為人類血 清白蛋白。在一些實施例中，PK部分為運鐵蛋白。 目標 本申請案提供包含結合第一目標分子之第一 Fn3域及結 合第二目標分子之第二Fn3域的多價多肽。第一目標分子 與第二目標分子可為相同或不同目標分子。當第一目標分 子與第二目標分子相同時，Fn3域（亦即，結合環）可相同 或不同。因此，第一Fn3域與第二Fn3域可結合相同目標但 結合於不同抗原決定基。藉由將序列變異引入環區域，尤 其環BC、DE及FG，可產生可結合幾乎任何目標分子之 Fn3 域。 結合目標分子之多肽可根據平衡常數（例如，解離常數 KD)及根據動力學常數（例如，結合速率常數kQn及解離速率 常數koff)評估。Fn3域一般將以小於500 nM、100 nM、1 nM、500 pM、100 pM或小於100 pM之KD結合目標分子， 不過在koff足夠低或kon足夠局之情況下可容許較ifj Kd值。 在一些實施例中，第一及/或第二Fn3域結合選自以下之 目標：IGF-IR、FGFR、FGFR1、FGFR2、FGFR3、 FGFR4、FGFR5、c-Kit、人類pl85受體樣酪胺酸激酶、 EGFR、HER2、HER3、HER4、c-Met、葉酸受體、 140513.doc -33 - 201000118 PDGFR、VEGFRl、VEGFR2、VEGFR3、人類血管内皮生 長因子（VEGF)-A、VEGF-C、VEGF-D、人類 CD20、人類 CD18、人類CDlla、人類細胞凋亡受體-2(Apo-2)、人類 α4β7整合素、人類GPIIb-IIIa整合素、幹細胞因子（SCF)、 人類CD3、IGF-IR、Angl、Ang2、纖維母細胞生長因子、 表皮生長因子、肝細胞生長因子或Tie2.3。在一些實施例 中，第一 Fn3域處於N-末端位置且結合IGF-IR，且第二Fn3 域結合VEGFR2。在一些實施例中，第一 Fn3域處於N-末端 位置且結合VEGFR2，且第二Fn3域結合IGF-IR。在一些實 施例中，第一 Fn3域處於N-末端位置且結合IGF-1R，且第 二域結合VEGFR2。 在某些實施例中，多價多肽包含結合不同目標之第一 Fn3域及第二Fn3域。在該等實施例中，可能需要調整一 Fn3結合域相對於另一 Fn3結合域之效能。舉例而言，若第 一 Fn3域之結合親和力顯著高於第二Fn3域之結合親和力， 則第一Fn3域之生物作用可壓制第二Fn3域之作用。因此， 在某些實施例中，可能希望多價多肽之第一 Fn3域與第二 Fn3域之結合親和力彼此類似，例如結合親和力彼此在100 倍、30倍、10倍、3倍、1倍、0.3倍或0.1倍以内，或結合 親和力彼此在0.1倍至10倍以内、0.3倍至10倍以内、0.1倍 至3倍以内、0.3倍至3倍以内、0.1倍至1倍以内、0.3倍至1 倍以内、1倍至10倍以内、3倍至10倍以内、3倍至30倍以 内或1倍至3倍以内。 多域實施例 140513.doc -34- 201000118 本申請案之一態樣提供進一步包含結合部分之多價多 肽。在一些實施例中，結合部分以小於i 0-6M、1 0·7Μ、 10·8Μ、l〇-9]V[或10·9Μ之KD結合人類目標蛋白質。 在一些實施例中，結合部分結合腫瘤相關目標或抗原。 '在一些實施例中，抗原靶向將根據組織分布或組織或所需 - 細胞類型中增加之局部濃度影響幫助定位該多價多肽。 在一些實施例中，結合部分結合腫瘤相關目標或抗原， 該腫瘤相關目標或抗原諸如碳酸酐酶IX、A3、對A33抗體 ❼‘ 具特異性之抗原、BrE3-抗原、CD1、CDla、CD3、CD5、 CD15、CD16、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、 CD25、CD30、CD45、CD74、CD79a、CD80、HLA-DR、 NCA95、NCA90、HCG及其次單元、CEA(CEACAM-5)、 CEACAM-6、CSAp、EGFR、EGP-1、EGP-2、Ep-CAM、 Ba 733、HER2/neu、低氧誘導因子（HIF)、KC4-抗原、KS-1-抗原、KS1-4、Le-Y、巨噬細胞抑制因子（MIF)、 參 MAGE、MUC1、MUC2、MUC3、MUC4、PAM-4-抗原、 PSA、PSMA、RS5、S100、TAG-72、p53、肌腱蛋白 (tenascin)、IL-6、IL-8、胰島素生長因子-I(IGF-I)、騰島 '素生長因子-II(IGF-II)、Τη抗原、湯姆遜-弗里德里克抗原 : (Thomson-Friedenreich antigen)、腫瘤壞死抗原、胎盤生 長因子（P1GF)、17-1A-抗原、血管生成標誌物（例如，ED-B纖維連接蛋白）、致癌基因標誌物、致癌基因產物及其他 腫瘤相關抗原。最近關於腫瘤相關抗原之報導包括 Mizukami 等人（2005，Nature Med. 11:992-97); Hatfield 等 140513.doc -35- 201000118 人（2005，Curr. Cancer Drug Targets 5:229-48) ; Vallbohmer 等人（2005，J. Clin. Oncol. 23:3536-44);及 Ren 等人（2005,
Ann. Surg. 242:5 5-63)，各自以引用的方式併入本文中。 在一些實施例中’結合部分係選自抗體部分。 抗體部分係指免疫球蛋白分子及免疫球蛋白分子之免疫 活性部分，亦即含有免疫特異性結合抗原之抗原結合位點 的分子。因而，術語抗體部分不僅涵蓋全抗體分子，且亦 涵蓋抗體多聚體及抗體片段以及抗體、抗體多聚體及抗體 片段之變異體（包括衍生物）。抗體部分之實例包括（但不限 於）單鏈Fv(scFv)、Fab片段、Fab'片段、F(ab')2、雙硫連接 型Fv(sdFv)及Fv。抗體部分可為（例如）單株、嵌合、人類 或人類化抗體。 在一些實施例中，抗體部分係選自：（i)Fab片段，其具 有VL、CL、VH及CH1域；（ii)Fab’片段，其為在CH1域之 C-末端上具有一或多個半胱胺酸殘基之Fab片段；（iii)Fd片 段，其具有VH及CH1域；（iv)Fd1片段，其具有VH及CH1域 且在CH1域之C-末端上具有一或多個半胱胺酸殘基；（v)Fv 片段，其具有抗體單個臂之VL及VH域；（vi)由VH域組成 之 dAb 片段（Ward 等人，Nature 341，544-546 (1989)) ; (vii) 經分離CDR區；（viii)F(ab’）2片段，其為包括兩個由鉸鏈區 處之雙硫橋連接之Fab·片段的二價片段；（ix)單鏈抗體分 子（例如，單鍵Fv ; scFv)(Bird等人 ’ Science 242:423-426 (1988);及 Huston 等人，PNAS (USA) 85:5879-5883 (1988)) ; (x)具有兩個抗原結合位點之「雙功能抗體」，其 140513.doc 36- 201000118 包含與同一多肽鏈中之輕鏈可變域（VL)連接之重鏈可變域 (乂只)（參見例如£?專利公開案第404,097號；貿〇93/11161; 及 Hollinger 等人，Proc·Natl·Acad.Sci·USA，90:6444-6448 (1993));及（xi)「線性抗體」，其包含與互補輕鏈多 肽一起形成抗原結合區對的串聯Fd區段對（VH-CH1-VH-CHl)(Zapata等人，Protein Eng. 8(10):1057-1062 (1995); 及美國專利第5,641,87〇號）。 在一些實施例中，抗體部分為單域抗體。實例包括（但 不限於）重鏈抗體、天然缺乏輕鏈之抗體、來源於習知4-鏈 抗體之單域抗體、工程化抗體及不同於來源於抗體者的單 域架構。單域抗體可來源於任何物種，包括（但不限於）小 鼠、人類、駱駝、美洲駝、山羊、兔、牛。 在一些實施例中，單域抗體為天然存在之單域抗體，諸 如VHH域。VHH為來源於天然缺乏輕鏈之免疫球蛋白的重 鏈可變域，諸如彼等如WO94/04678中所述來源於駱駝科 (Camelidae)(包括駱駝、單峰駱駝、美洲駝、小羊駝、羊 駝及原駝）者。VHH分子比IgG分子小約10倍。因為已知 VHH結合「不常見」抗原決定基，諸如腔穴或凹槽，所以 該等VHH之親和力可更適於治療，PCT公開案第W097/ 49805號。 在一些實施例中，單域抗體為如美國公開案第 20070178082號中所述結合血清蛋白質之VHH。血清蛋白 質可為存在於個體血清中之任何合適蛋白質或其片段。在 一些實施例中，血清蛋白質為血清白蛋白、血清免疫球蛋 140513.doc -37· 201000118 白、甲狀腺素結合蛋白、運鐵蛋白或血纖維蛋白原。 已發展各種技術來產生可用以製備本發明中所用之抗體 片段的抗體片段。此等片段在傳統上經由完整抗體之蛋白 水解消化獲得（參見例如Morimoto等人，journai 〇f
Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992); 及 Brennan等人，Science, 229:81 (1985))。然而，此等片 段現可由重組宿主細胞直接產生。舉例而言，該等抗體片 段可自以上所討論之抗體噬菌體文庫分離。或者，可直接 自大腸桿菌（E. coli)回收Fab'-SH片段且使其化學偶合以形 成 F(ab )2 片段（Carter 等人，Bi〇/Technol〇gy 1〇:163-167 (1992))。根據另一方法，F(ab，）2片段可自重組宿主細胞培 養物直接分離。用於產生抗體片段之其他技術對熟習此項 技術者而言為顯而易見的。在其他實施例中，所選抗體為 單鏈Fv片段（scFv)。參見WO 93/16185 ;美國專利第 5,571，894號；及美國專利第5,587,458號。舉例而言，抗體 片段亦可為「線性抗體」，例如如美國專利第5,641 87〇號 中所述。該等線性抗體片段可為單特異性或雙特異性抗 體。 在一些實施例中，結合部分包含一或多個親和聚體序 列。親和聚體係藉由活體外外顯子改組及噬菌體呈現自 人類細胞外受體域發展而來。（Silvennan等人，2〇〇5，Nat Biotechnol· 23:1493-94 ; Silverman 等人，2〇〇6，Nat
Biotechnol. 24:220)。所得多域蛋白質可包含多個獨立結 合域，該等結合域可展現與單抗原決定基結合蛋白相比經 140513.doc -38. 201000118 改良之親和力（在一些狀況下低於奈莫耳濃度）及特異性。 關於構築方法及親和聚體用途之其他詳情揭示於例如美國 專利公開案第20040175756號、第20050048512號、第 20050053973號、第 20050089932號及第 20050221384號（以 全文引用的方式併入本文中）中。 在一些實施例中，結合部分包含一或多個脂質運載蛋白 相關序列，例如抗運載蛋白（anticalin)或脂質運載蛋白衍 生物。抗運載蛋白或脂質運載蛋白衍生物為一類對包括本 文所述之彼等目標分子的各種目標分子具有親和力及特異 性的結合蛋白。該等蛋白質描述於美國專利公開案第 20060058510號、第 20060088908 號、第 20050106660 號及 PCT公開案第W02006/056464號中。 在一些實施例中5結合部分包含一或多個四聯蛋白C型 凝集素相關序列或三連接素，例如四聯蛋白C型凝集素或 四聯蛋白C型凝集素衍生物。四聯蛋白C型凝集素或四聯 蛋白C型凝集素衍生物為一類對包括本文所述之彼等目標 分子的各種目標分子具有親和力及特異性的結合蛋白。不 同四聯蛋白C型凝集素及相關蛋白質描述於PCT公開案第 W02006/053568 號、第 W02005/080418 號、第 W02004/094478 號、第 W02004/039841 號、第 W02004/005335 號、第 W02002/048189號、第WO9 8/05 6906號及美國專利公開案 第 20050202043號中。 在一些實施例中，結合部分包含一或多個天然錯蛋白重 複序列蛋白質，例如 DARPin(Molecular Partners)。 140513.doc -39- 201000118 在一些實施例中，結合部分包含一或多個 AffibodiesTM。源於葡萄球菌蛋白質A之IgG 結合域。新穎結合性質可藉由改變位於蛋白質A域之結合 表面附近之殘基來達成。 在一些實施例中，結合部分包含一或多個以半胱胺酸結 為主之蛋白質架構，亦即微體（Selecore/NascaCell)。 在一些實施例中，結合部分包含一或多個Trans-bodiesTM。Trans-bodiesTM係基於運鐵蛋白之架構 (BioResis/Pfizer)。 在一些實施例中，結合部分包含以γ-結晶或泛素為主之 結合蛋白。此等所謂AffilinTM(Scil Proteins)分子之特徵在 於該等蛋白質之β摺疊片結構中結合區域之重新設計。 AffilinTM分子已描述於美國公開案第20070248536號中。 接合 多價多肽與結合部分可經由至少一個雙硫鍵、肽鍵、多 肽、聚合糖或PEG部分連接。 在一些實施例中，多價多肽與結合部分經由多肽連接。 在一些實施例中，多肽連接子為SEQ ID NO: 17、18或 20 ° 在一些實施例中，多價多肽與結合部分經由具有可被血 液或目標組織中之蛋白酶裂解之蛋白酶位點的多肽連接子 連接。該等實施例可用於釋放兩種或兩種以上治療蛋白 質，以實現更佳傳遞或治療性質或比分開形成該等蛋白質 具有更高形成效率。 140513.doc •40· 201000118 聚=施：’:):r與結合部分經由生物相容性 —之_解之心::=== 鏗祐；從々1 & 成寺X把例可用於 释放兩種或兩種以上治療 i± W 3¾ fcl· ^ BB ^ 實現更佳傳遞或治療 !·生質或比分開立形成該等蛋白質具有更高形成效率。
早t一些實施例中，多價多肽與結合部分經由聚合物連接 子連接。聚合物連接子可用於最佳改變各蛋白質部分之間 的距離’以產生具有以下一種或多種特徵之蛋白質：1)备 結合所關注蛋白質B夺’ 一或多個蛋白質域結合之位阻減： 或增加；2)在未尋求其他胺基酸取代以增加穩定性或溶解 性的情況下，蛋白質穩定性或溶解性增加（例如，溶解性 為至少約20 mg/ml或至少約5〇 mg/mi) ; 3)在未尋求其他胺 基酸取代以降低穩定性的情況下，蛋白質聚集減少（例 如，如由SEC所量測）；及4)藉由添加其他結合域而使蛋白 質之整體親和性或親和力增加。 在一些實施例中’多價多肽包含含有SEq ID NO: 18之 連接子的第二10Fn3域。使PEG與連接子序列中之半胱胺酸 部分接合且連接多價多肽與結合部分。 聚乙二醇化實施例 本申請案之一態樣提供多價多肽與非蛋白質聚合物之連 接。在一些實施例中，聚合物為聚乙二醇（「PEG」）、聚 丙二醇或聚氧伸烷基，如美國專利第4,640,835號、第 4,496,689 號、第 4,301，144 號、第 4,670,417 號、第 4,791,192號或第4,179,337號中所述。在一些實施例中，多 140513.doc 41- 201000118 價多肽包含Fn3域。在一些實施例中，聚合物為PEG部 分。此外，本申請案提供與抗體部分（例如，駱駝抗體及 其衍生物以及單鏈及單域抗體；及尤其自微生物表現之彼 等抗體部分）及抗體樣部分（例如，脂質運載蛋白之衍生 物、錫蛋白、多Cys-Cys域及四聯蛋白；及尤其自微生物 表現之彼等抗體樣部分）之N或C末端PEG接合。 PEG為熟知水溶性聚合物，其可購得或可根據此項技術 中熟知之方法藉由乙二醇之開環聚合製備（Sandler及Karo, Polymer Synthesis, Academic Press, New York，第 3卷，第 138-1 61頁）。廣泛使用術語「PEG」來涵蓋任何聚乙二醇 分子，而不考慮尺寸或PEG末端之改質，且可由下式表 示：X-OCCHzCP^OViCP^CHjOHCl)，其中 η為 20 至 2300且 X為Η或末端改質，例如CN4烷基。在一實施例中，本發明 之PEG在一末端以羥基或甲氧基終止，亦即X為Η或 CH3(「甲氧基PEG」）。PEG可含有為結合反應所必需、由 分子之化學合成產生或作為間隔基以使分子部分之距離最 佳的其他化學基團。此外，此類PEG可由一或多個連接在 一起之PEG側鏈組成。具有一個以上PEG鏈之PEG稱為多 臂或分枝PEG。分枝PEG可例如藉由添加聚環氧乙烷至各 種多元醇（包括甘油、異戊四醇及山梨糖醇）中來製備。舉 例而言，四臂分枝PEG可自異戊四醇及環氧乙烷製備。分 枝PEG描述於（例如）歐洲公開申請案第473 084A號及美國專 利第5,932,462號中。PEG之一種形式包括經由離胺酸之一 級胺基連接的兩個PEG側鏈（PEG2)(Monfardini, C.等人， 140513.doc -42- 201000118
Bioconjugate Chem. 6 (1995) 62-69)。 PEG與肽或蛋白質之接合一般涉及PEG之活化及使經活 化PEG-中間物與目標蛋白質/肽直接偶合，或與連接子偶 合，隨後將該連接子活化且與目標蛋白質/肽偶合（參見 Abuchowski, Α·等人，/·价〇/· C；2ew.，252，3 57 1 (1977)及 J. C/zem.，252，3582 (1977)，Zalipsky 等人及 Harris 等 人，於 Poly(ethylene glycol) Chemistry: Biotechnical and Biomedical Applications;(J. M. Harris 編）Plenum Press: New York, 1992 ;第21及22章中）。注意到含有PEG分子之 結合多肽亦稱為接合蛋白質，而缺乏經連接PEG分子的蛋 白質可稱為未接合蛋白質。 所用PEG之尺寸將視包括多價多肽之預定用途之若干因 素而定。較大PEG對於增加在體内、jk液、非血液細胞外 液或組織中之半衰期而言較佳。對於活體内細胞活性而 言，約10至60 kDa範圍内之PEG較佳，以及小於約100 kDa 且更佳小於約60 kDa之PEG，不過亦可使用大於約100 kDa 之尺寸。對於活體内成像應用而言，可使用較小PEG，一 般小於約20 kDa，其不如較大PEG—般多地增加半衰期， 以允許更快分布及較小半衰期。可選擇多種分子質量形式 之 PEG，例如約 1，000道爾頓（Dalton)(Da)至 100,000 Da(n 為 20至2300)，以供與本發明之結合多肽接合。針對以道爾 頓描述之分子質量，估計PEG中重複單元的數目「η」。較 佳地，經活化連接子上PEG之組合分子質量適於醫藥用 途。因此，在一實施例中，PEG分子之分子質量不超過 140513.doc -43- 201000118 100.000 Da。舉例而言，若三個PEG分子與連接子連接， 其中各PEG分子具有12,000 Da之相同分子質量（各η為約 270)，則連接子上PEG之總分子質量為約36,000 Da(總η為 約820)。與連接子連接之PEG的分子質量亦可不同，例如 在連接子上之三個分子中，兩個PEG分子可各自為5,000 Da(各η為約110)且一個PEG分子可為12,000 Da(n為約 270)。在一些實施例中，一個PEG部分與多價多肽接合。 在一些實施例中，PEG部分為約20、30、40、50、60、 70、80或90 kDa。在一些實施例中，PEG部分為約40 kDa 〇 在一些實施例中，聚乙二醇化多價多肽含有一個、兩個 或兩個以上PEG部分。在一實施例中，PEG部分與位於蛋 白質表面上及/或遠離與目標配位體接觸之表面的胺基酸 殘基結合。在一實施例中，PEG結合多肽中PEG之組合或 總分子質量為約3,000 Da至60,000 Da或約10,000 Da至 36.000 Da。在一實施例中，聚乙二醇化結合多肽中之PEG 為實質上線性直鏈PEG。 熟習此項技術者可（例如）基於聚乙二醇化結合多肽將如 何在治療上使用、所需劑量、循環時間、對蛋白水解之抗 性、免疫原性及其他考慮因素來為PEG選擇合適分子質 量。關於PEG及其增強蛋白質性質之用途的討論，參見N. V. Katre, Advanced Drug Delivery Reviews 10: 91-114 (1993)。 在一些實施例中，多價多肽共價與一個下式之聚（乙二 140513.doc -44- 201000118 醇）基團連接：-CO-(CH2)x-(OCH2CH2)m-OR，其中聚（乙二 醇）基團之-CO(亦即，羰基）與結合多肽之一個胺基形成醯 胺鍵；R為低碳烷基；X為2或3 ; m為約450至約950;且η 及m經選擇以便減去結合多肽之接合物之分子量為約10至 _ 40 kDa。在一實施例中，結合多肽之離胺酸ε-胺基為可用 ·(游離）胺基。 在一特定實施例中，使用PEG之碳酸酯來形成PEG結合 多肽接合物。碳酸N，N’-二琥珀醯亞胺基酯（DSC)可用於與 PEG之反應中以形成活性混合型PEG-碳酸琥珀醯亞胺基 酯，其隨後可與連接子之親核基團或結合多肽之胺基反應 (參見美國專利第5,281，698號及美國專利第5,932,462號）。 在類似類型之反應中，可使1，Γ-(二苯并三唑基）碳酸酯及 二-(2-吡啶基）碳酸酯與PEG反應以分別形成PEG-苯并三唑 基及PEG-吡啶基混合型碳酸酯（美國專利第5,3 82,657號）。 多價多肽之聚乙二醇化可根據現有技術之方法執行，例 ^ 如藉由使結合多肽與親電活性PEG(供應商：Shearwater
Corp·，USA, www.shearwatercorp.com)反應。本發明之較 佳PEG試劑為（例如）丙酸N-羥基琥珀醯亞胺基酯（PEG-SPA)、丁酸N-羥基琥珀醯亞胺基酯（PEG-SBA)、PEG-丙酸 琥珀醯亞胺基酯或分枝N-羥基琥珀醯亞胺（諸如，mPEG2-NHS)(Monfardini，C.等人，Bioconjugate Chem. 6 (1995) 62-69)。可使用該等方法來使結合多肽離胺酸之ε-胺基或 結合多肽之Ν-末端胺基聚乙二醇化。 在另一實施例中，可使PEG分子與結合多肽上之硫氫基 140513.doc -45- 201000118 偶合（Sartore，L_ 等人，Appl. Biochem. Biotechnol.，27，45 (1991) ; Morpurgo 等人，Biocon. Chem.，7，363-368 (1996) ; Goodson等人，Bio/Technology (1990) 8，343 ;美 國專利第5,766,897號）。美國專利第6,610,281號及第 5，766,897號描述可與硫氫基偶合之例示性反應性PEG種 類。 在一些實施例中’藉由定點聚乙二醇化，尤其藉由peg 與N-末端或C-末端上之半胱胺酸部分接合，產生聚乙二醇 化多價多肽。在一些實施例中，多價多肽為與peg部分共 價結合之Fn3域，其中該Fn3域之至少一個環參與目標結 合。可藉由定點聚乙二醇化（諸如，藉由與Cys殘基連接） 使PEG部分與Fn3多肽連接，其中Cys殘基可位於Fn3多肽 之N-末端或N-末端與最N_末端β或p樣鏈之間或Fn3多肽之 c-末端或c-末端與最c-末端β或β樣鏈之間。Cys殘基亦可 位於其他位置，尤其不參與目標結合之任何環。pEQ部分 亦可藉由其他化學過程，包括藉由與胺接合來連接。 在PEG分子與結合多肽上之半胱胺酸殘基接合的一些實 施例中，半胱胺酸殘基為結合多肽之原生殘基’而在其他 實施例中，一或多個半胱胺酸殘基係經工程化至結合多肽 中。可將突變引入結合多肽編碼序列中以產生半胱胺酸殘 基。此可例如藉由使-或多個胺基酸殘基突變為半耽胺酸 來達成。對突變為半胱胺酸殘基而言較佳之胺基酸包括絲 胺酸、穌、㈣酸及其他親水性殘基。㈣變為半脱 胺酸之殘基較佳為表面暴露殘基。此項技術巾熟知基於一 140513.doc * 46 · 201000118 級序列或蛋白質來預測殘基之表面可達性的演算法。或 者，假定設計及演化結合多肽所根據之構架的晶體結構已 解決（參見 Himanen 等人，Nature. (2001) 20-27;414 (6 866):933-8)，則可藉由比較結合多肽之胺基酸序列來預 '測表面殘基，且因此鑑別表面暴露殘基。在一實施例中， 將半胱胺酸殘基引入結合多肽之N-末端及/或C-末端或N- 末端及/或C-末端附近或環區域内。半胱胺酸殘基之聚乙 二醇化可使用（例如）PEG-順丁烯二醯亞胺、PEG-乙烯基 參 磯、PEG-碘乙醯胺或PEG-鄰吡啶基二硫醚來進行。 在一些實施例中，聚乙二醇化結合多肽包含與N-末端胺 基酸之a胺基共價連接之PEG分子。位點特異性N-末端還 原胺化描述於Pepinsky等人，（2001) JPET, 297,1059及美國 專利第5,824,784號中。使用PEG-醛以便利用其他可用親 核胺基來使蛋白質還原胺化描述於美國專利第4,002,53 1 號、Wieder 等人，（1979) J. Biol. Chem. 254,12579 及 瘳 Chamow等人，（1994) Bioconjugate Chem. 5，133 中。 在另一實施例中，聚乙二醇化結合多肽包含一或多個與 連接子共價連接之PEG分子，該連接子又與結合多肽N-末 '端之胺基酸殘基的胺基連接。該方法揭示於美國公開案第 2002/0044921號及 PCT公開案第 WO94/01451號中。 在一實施例中，結合多肽在C-末端經聚乙二醇化。在一 特定實施例中，藉由引入C-末端疊氮基曱硫胺酸且隨後經 由施陶丁格反應（Staudinger reaction)接合甲基-PEG-三芳 基膦化合物，使蛋白質在C-末端經聚乙二醇化。此C-末端 140513.doc •47- 201000118 接合方法描述於 Cazalis 等人，C-Terminal Site-Specific PEGylation of a Truncated Thrombomodulin Mutant with Retention of Full Bioactivity, Bioconjug Chem. 2004; 15 (5):1005-1009 中。 可使用此項技術中已知之習知分離及純化技術來純化聚 乙二醇化結合多肽，諸如尺寸排阻（例如，凝膠過濾）及離 子交換層析。亦可使用SDS-PAGE來分離產物。可分離之 產物包括單聚乙二醇化、二聚乙二醇化、三聚乙二醇化、 多聚乙二醇化及未聚乙二醇化結合多肽以及游離PEG。可 藉由將溶離峰周圍之較寬溶離份彙集以增加單-PEG在組成 中之百分比’來控制單-PEG接合物之百分比《約90%單-PEG接合物表示產率與活性之良好平衡。接合物之（例如） 至少92%或至少96%為單-PEG物質之組成可為合乎需要 的。在本發明之一實施例中，單-PEG接合物之百分比為 90%至 96%。 在本發明之一實施例中，使用羥基胺檢定（例如，450 mM羥基胺（pH 6.5)在室溫下經8至16小時）未使聚乙二醇化 多價多肽中之PEG自聚乙二醇化胺基酸殘基水解，且因此 為穩定的。在一實施例中’組成中80%以上為穩定單-PEG-結合多肽，更佳至少90%且最佳至少95% 〇 在另一實施例中’聚乙二醇化多肽將較佳保留與未經修 飾蛋白質有關之生物活性的至少約25%、50°/。、60%、 70%、80%、85%、90%、95%或 1〇〇%。在一實施例中，生 物活性係指如藉由KD、让⑽或keff所評估其結合目標分子之 140513.doc -48- 201000118 能力。在一特定實施例中，聚乙二醇化結合多肽蛋白質展 示相對於未聚乙二醇化結合多肽與目標分子之結合增加。 相對於未經修飾結合多肽之清除率，經PEG修飾之多肽 之血清清除率可降低約10%、20%、30%、40%、50%、 60%、70%、80%或甚至90%。經PEG修飾之多肽可具有相 對於未經修飾蛋白質之半衰期增加的半衰期（t1/2)。PEG-結 合多肽之半衰期相對於未經修飾結合多肽之半衰期可增加 至少 10%、20%、3 0%、40%、50%、60%、70%、80%、 90% > 100% ' 125%、15 0%、175%、200% ' 25 0% > 3 00%、400%或500%或甚至1000%。在一些實施例中，在 活體外（諸如，在緩衝鹽水溶液或血清中）測定蛋白質半衰 期。在其他實施例中，蛋白質半衰期為活體内半衰期，諸 如蛋白質在動物之血清或其他體液中之半衰期。 多償多肽之去免疫 在一態樣中，本申請案提供去免疫多價多肽。在一些實 施例中，多價多肽之序列經改變以消除一或多個B細胞或T 細胞抗原決定基。 多價多肽可經去免疫以使其對給定物種無免疫原性，或 具有較低免疫原性。去免疫可經由對多肽進行結構改變來 達成。可採用熟習此項技術者已知之任何去免疫技術。舉 例而言，用於使蛋白質去免疫之一種適用技術描述於揭示 内容全部併入本文中之WO 00/34317中。概言之，其中描 述之通用方法内的典型方案包括以下步驟： 1.測定多肽之胺基酸序列； 140513.doc -49- 201000118 2. 藉由包括以下步驟之任何方法鑑別多肽之胺基酸序列内 的潛在T細胞抗原決定基：測定肽與MHC分子之結合；測 定肽：HLA複合物與來自接收治療蛋白質之物種之T細胞受 體的結合；使用具有接收治療蛋白質之該物種之HLA分子 的轉殖基因動物測試多肽或其部分；或測試用來自接收治 療蛋白質之該物種之免疫系統細胞重構的該等轉殖基因動 物；及 3. 藉由基因工程或用於產生經修飾多肽之其他方法，改變 多肽以移除一或多個潛在T細胞抗原決定基且產生該經改 變多肽以供測試。 在一實施例中，可分析多肽序列中MHC II類結合基元之 存在。舉例而言，可例如藉由在全球資訊網 sitewehil.wehi.edu.au上搜索「基元」資料庫，來進行與 MHC結合基元之資料庫的比較。或者，可使用計算穿線法 (諸如，由Altuvia等人設計之彼等方法（J. Mol. Biol. 249 244-250 (1995)))鑑別MHC II類結合肽，藉此測試來自該 多肽之連續重疊肽與MHC II類蛋白質之結合能。計算結合 預測演算法包括 iTopeTM、Tepitope、SYFPEITHI、 EpiMatrix(EpiVax)及 MHCpred。為幫助鑑別 MHC II類結合 肽，可搜尋與成功呈現之肽有關的相關序列特徵（諸如， 兩性及Rothbard基元）及組織蛋白酶B及其他加工酶之裂解 位點。 已鑑別出潛在（例如，人類）T細胞抗原決定基後，接著 如消除Τ細胞抗原決定基所需，藉由改變一或多個胺基酸 140513.doc -50- 201000118 來消除此等抗原決定基。通常，此將涉及改變τ細胞抗原 決定基自身内之一或多個胺基酸。此可涉及改變根據蛋白 質之一級結構與抗原決定基相鄰的胺基酸或在一級結構中 不相鄰但在該分子之二級結構中相鄰的胺基酸。雖然所預 期之常見改變將為胺基酸取代，但在某些情況下有可能胺 基酸添加或缺失將為合適的。所有改變可藉由重組Dn a技 術來實現，以便最終分子可藉由自重組宿主表現，例如藉 馨 由充分確立之方法來製備，但亦可使用蛋白質化學或分子 改變之任何其他方法的用途。 一旦移除所鑑別出之T細胞抗原決定基，則可再次分析 經去免疫序列以確保新的T細胞抗原決定基尚未產生且若 已產生，則可將抗原決定基去除。 並非所有計算鑑別出之τ細胞抗原決定基皆需移除。熟 習此項技術者應瞭解特定抗原決定基之「強度」或確切而' 言潛在免疫原性的重要性。各種計算方法產生潛在抗原決 ❿ 定基之評分。熟習此項技術者將認識到僅高評分抗原決定 基可能需要移除。熟習此項技術者亦認識到移除潛在抗原 決定基與維持多肽之結合親和力之間的平衡。因此，一種 t略為將取代連續引人多肽中且接著測試抗原結合及免疫 ，原性。 在一態樣中，經去免疫多肽比人類個體中之原始多狀的 免疫原性低（確切言之’引起減弱之HAMA反應）。測定免 疫原性之檢定為熟習此項技術者所熟知。可執行測定免疫 反應之業内公認方法以監測特定個體中或臨床試驗期間之 140513.doc -51 . 201000118 HAMA反應。可在該療法開始時及投與該療法之整個過程 中對投與去免疫多肽之個體給與免疫原性評估。例如藉由 使用熟習此項技術者已知之方法（包括表面電漿共振技術 (BIACORE)及/或固相ELISA分析）偵測來自個體之血清樣 品中針對去免疫多肽之抗體，量測HAMA反應。或者，經 設計用來量測T細胞活化事件之活體外檢定亦指示免疫原 性。 其他修飾 在一些實施例中，多價多肽經糖基化。Fn3域通常不含 糖基化位點，然而，可將該糖基化工程化至蛋白質中。 蛋白質之糖基化通常為N-連接型或〇-連接型。N-連接型 係指碳水化合物部分與天冬醯胺殘基之侧鏈連接。三肽序 列天冬醯胺-X-絲胺酸及天冬醯胺_χ_蘇胺酸（其中χ為除脯 胺酸以外之任何胺基酸）為使碳水化合物部分與天冬醯胺 侧鍵酶促連接的識別序列。可將其工程化至本發明之蛋白 質中，尤其以纖維連接蛋白為主之架構蛋白質及其相應聚 核苷酸。因此，多肽中此等三肽序列中任一者之存在產生 潛在糖基化位點。〇-連接型糖基化係指糖Ν_乙醯基半乳糖 胺、半乳糖或木糖中之一者與羥基胺基酸，最常見絲胺酸 或蘇胺酸連接，不過亦可使用5_羥基脯胺酸或5_羥基離胺 酸。 將糖基化位點添加至蛋白質便利地藉由改變胺基酸序列 以使得其含有上述二肽序列中之一或多者來實現（針對Ν_ 連接型糖基化位點）。該改變亦可藉由向原始抗體之序列 140513.doc -52- 201000118 添加一或多個絲胺酸或蘇胺酸殘基或用一或多個絲胺酸或
I 蘇胺酸殘基取代來實現（針對〇-連接型糖基化位點）。 在一些實施例中，多價多肽經修飾以增強抗原依賴性細 胞介導之細胞毒性（ADCC)及/或補體依賴性細胞毒性 (CDC)。在一些實施例中，多價多肽為進一步包含Fc區之 Fn3域。在一些實施例中，Fc區為增強ADCC或CDC之變異 體。Fc區變異體可包含在一或多個胺基酸位置包含胺基酸 修飾（例如，取代）之人類Fc區序列（例如，人類IgGl、 IgG2、IgG3 或 IgG4 Fc 區）。 在一實施例中，變異型Fc區在人類效應細胞存在下可更 有效地介導抗體依賴性細胞介導之細胞毒性（ADCC)，或 以比天然序列Fc區更佳之親和力結合Fcy受體（FcyR)。該 等Fc區變異體可在Fc區之位置256、290、298、312、 326、330、333、334、360、378 或 430 中任一或多者處包 含胺基酸修飾，其中Fc區中之殘基編號為如Kabat中EU索 引之編號。 核酸·蛋白質《合技術 在一態樣中，本申請案提供包含結合人類目標（諸如， EGFR、VEGFR2、IGF-IR或其他蛋白質）之纖維連接蛋白 III型域的多價多肽。快速製備及測試具有特異性結合性質 之Fn3域的一種方式為Adnexus(百時施貴寶研發公司）之核 酸-蛋白質融合技術。本揭示案描述使用該活體外表現及 標記技術，稱為PR〇fusionTM ’該技術採用核酸_蛋白質融 合體（RNA-蛋白質及DNA-蛋白質融合體）來鑑別對結合蛋 140513.doc •53- 201000118 白質而言重要的新穎多肽及胺基酸基元。核酸-蛋白質融 合技術為一種使蛋白質與其編碼遺傳資訊共價偶合之技 術。關於RNA-蛋白質融合技術及以纖維連接蛋白為主之 架構蛋白質文庫篩檢法的詳細描述參見以引用的方式併入 本文中之Szostak等人，美國專利第6,258,558號、第 6,261，804 號、第 6,214,553 號、第 6,281,344 號、第 6,207,446 號、第 6,518,018 號；PCT 公開案第 WOOO/34784 號、第 WO01/64942 號、第 WO02/032925 號；及 Roberts 及 Szostak, Proc Natl. Acad. Sci. 94:12297-12302, 1997。對核 酸-蛋白質融合技術之進一步討論可見於本申請案之實例 及材料及方法部分中。 載《及聚核苷酸實施例 編碼本文中所揭示之各種蛋白質或多肽中之任一者的核 酸可化學合成。可選擇密碼子使用率以便改良在細胞中之 表現。該密碼子使用率將視所選細胞類型而定。已發展出 專用於大腸桿菌及其他細菌以及哺乳動物細胞、植物細 胞、酵母細胞及昆蟲細胞的密碼子使用模式。參見例如： Mayfield等人，Proc Natl Acad Sci U S A. 2003年 1 月 21 曰；100(2):438-42 ; Sinclair等人，Protein Expr Purif. 2002 年 10 月；26(1):96-105 ; Connell ND. Curr Opin Biotechnol. 2001 年 10 月；12(5):446-9 ; Makrides 等人，Microbiol Rev. 1996 年 9 月；60(3):512-38 ;及 Sharp 等人，Yeast. 1991 年 10 月；7(7):657-78。 核酸操縱之通用技術例如描述於Sambrook等人， 140513.doc • 54- 201000118
Molecular Cloning: A Laboratory Manual，第 1-3卷，Cold Spring Harbor Laboratory Press，第 2版，1989 或 F. Ausubel 專人 ’ Current Protocols in Molecular Biology (Green
Publishing and Wiley-Interscience: New York, 1987)及定期
修δΤ (以引用的方式併入本文中）中。可使編碼多肽之DNA 與來源於哺乳動物、病毒或昆蟲基因之合適轉錄或轉譯調 節元件可操作連接。該等調節元件包括轉錄啟動子、控制 ❹ 轉錄之可選操縱基因、編碼合適mRNA核糖體結合位點之 序列及控制轉錄及轉譯終止的序列。此外，併入通常由複 製起點賦予之在宿主中複製之能力及便於識別轉型體之選 擇基因。 本文所述之蛋白質不僅可直接重組產生，且亦可作為與 異源多肽之融合多肽產生，該異源多肽較佳為信號序列或 在成熟蛋白質或多肽之N_末端具有特定裂解位點之其他多 肽。所選異源信號序列較佳為由宿主細胞識別及加工（亦 φ 即’由信號肽酶裂解）之信號序列。對於不識別及加工天 然信號序列之原核宿主細胞而言，將信號序列以（例如）選 自以下之群之原核信號序列取代：驗性鱗酸酶、青徽素酶 (penicillinase)、lpp或熱穩定腸毒素II前導序列。對於酵母 分泌而言’可將天然信號序列用以下各物取代：例如酵母 轉化酶前導序列、α因子前導序列（包括酵母 (Saccharomyces)及克魯維酵母（Kluyveromyces)a 因子前導 序列）或酸性磷酸酶前導序列、白色念珠菌（C· albicans)葡 糖殿粉酶前導序列或PCT公開案第90/13646號中所述之信 140513.doc -55· 201000118 號序列。在哺乳動物細胞表現中，可使用哺乳動物信號序 列以及病毒分泌前導序列（例如，單純疮療gD信號）。該等 前驅區域之DNA可在閱讀框架令與編碼蛋白質之DNA接 合。 表現載體與選殖載體均含有使載體能夠在一或多種所選 值主細胞中複製的核酸序列。一般而言，在選殖載體中， 此序列為使載體能夠獨立於宿主染色體DNA複製之序列且 包括複製起點或自主複製序列。熟知多種細菌、酵母及病 毒之此類序列。來自質體pBR322之複製起點適於大部分 革蘭氏陰性（Gram-negative)細菌，2微米質體起點適於酵 母，且各種病毒起點（SV40、多形瘤、腺病毒、vsv或 BPV)適用於哺乳動物細胞中之選殖載體。一般而言，哺乳 動物表現載體無需複製起點組份（僅因SV4〇起點含有早期 啟動子’故通常可使用該起點）。 表現及選殖載體可含有選擇基因，亦稱為可選擇標誌。 典型選擇基因編碼具有以下作用之蛋白質：（a)賦予對抗生 素或其他毒素（例如，胺苄西林（ampiciUin)、新黴素 (ne〇mycin)、甲胺喋呤（meth〇trexate)或四環素 ⑼ 之抗性；（b)補充營養缺陷型不足；或（c)供應不可自複合 培養基獲得之關鍵營養物，例如對芽孢桿菌（BacilH)而言 編碼D·丙胺酸消旋酶之基因。 用於酵母之合適選擇基因為存在於酵母質體YRp7中之 trpl 基因（stincheomb 等人，Nature, 282:39 (1979))。trpl 基 因為缺乏在色胺酸中生長之能力的酵母突變型菌株（例 140513.doc •56- 201000118
如，ATCC第44076號或卿叫提供選擇標誌。j_s， Genetics，85:12 (1977)。酵母宿主細胞基因組中損傷之 存在隨後為偵測藉由在缺乏色胺酸之情況下生長的轉型作 用提供有效環境。類似地，Leu2^陷型酵母菌株（ATCC 20,622或38,626)由帶有Leu2基因之已知質體補充。 - 表現及選殖載體通常含有由宿主生物體識別且可操作連 接於編碼本發明蛋白質（例如，以纖維連接蛋白為主之架 φ 構蛋白質）之核酸的啟動子。適用於原核宿主之啟動子包 括phoA啟動子、β_内醢胺酶及乳糖啟動子系統、鹼性磷酸 酶、色胺酸_啟動子系統及雜合啟動子，諸如⑽啟動 子。然而，其他已知細菌啟動子為合適的。用於細菌系統 之啟動子亦將含有與編碼本發明蛋白質之A可操作連接 的 Shine-Dalgarno(S.D.)序列。 已知真核生物之啟動子序列。幾乎所有真核基因均具有 定位於轉錄啟始位點上游約25至3〇個鹼基處之AT富集區。 參 在許多基因轉錄起點上游7〇至80個鹼基處發現的另一序列 為CNCAAT區，其中N可為任何核苷酸。在大部分真核基 因之31末端具有AATAAA序列，其可為用於將聚腺苷酸尾 (poly A tail)添加至編碼序列之3,末端的信號。所有此等序 •'列均適於插入真核表現載體中。 用於酵母宿主之合適啟動序列之實例包括3_磷酸甘油酸 激酶或其他醣解酶（諸如，烯醇酶、甘油醛_3_磷酸脫氫 酶、己醣激酶、丙酮酸脫羧酶、磷酸果糖激酶、葡糖_6_磷 酸異構酶、3-磷酸甘油酸變旋酶、丙酮酸激酶、磷酸丙醣 140513.doc -57- 201000118 異構酶、磷酸葡糖異構酶及葡萄糖激酶）之啟動子。 為具有受生長條件控制之轉錄之額外優勢的誘導性啟動 子之其他酵母啟動子為醇脫氫酶2、異細胞色素 C(isocytochrome C)、酸性磷酸酶、與氮代謝有關之降解 酶、金屬硫蛋白、甘油醛-3-磷酸脫氫酶及負責麥芽糖及半 乳糖利用之酶的啟動子區域。用於酵母表現之合適載體及 啟動子進一步描述於EP專利公開案第73,657號中。酵母增 強子亦有利地與酵母啟動子一起使用。 在哺乳動物宿主細胞中自載體轉錄可（例如）由自病毒（諸 如’多瘤病毒、禽痘病秦、腺病毒（諸如，腺病毒2)、牛乳 頭狀瘤病毒、禽肉瘤病毒、細胞巨大病毒、逆轉錄病毒、 B型肝炎病毒及最佳猿病毒4〇(SV40))之基因組、自異源哺 乳動物啟動子（例如’肌動蛋白啟動子或免疫球蛋白啟動 子）、自熱休克啟動子獲得之啟動子控制，其限制條件為 該等啟動子與宿主細胞系統相容。 SV40病毒之早期及晚期啟動子可以亦含有δv4〇病毒複 製起點之SV40限制性片段形式便利地獲得。人類細胞巨大 病毒之極早期啟動子可以Hindlll E限制性片段形式便利地 獲得。使用牛乳頭狀瘤病毒作為載體在哺乳動物宿主中表 現DNA之系統揭示於美國專利第斗/丨9,4^號中。此系統之 修改描述於美國專利第4,601，978號中。關於人類p_干擾素 cDNA在小鼠細胞中在來自單純疱疹病毒之胸苷激酶啟動 子控制下的表現，亦參見Reyes等人，Nature 297:598 6〇1 (1982)。或者，可使用勞斯肉瘤病毒長末端重複序列（r〇us 140513.doc -58- 201000118
Sarcoma Virus long terminal repeat)作為啟動子 〇
❹ 用南級真核細胞來轉錄編碼本發明蛋白質之DNA通常藉 由將增強子序列插入載體中來增強。現已知許多來自哺乳 動物基因（血球蛋白、彈性蛋白酶、白蛋白、α_胎蛋白 (alpha-fetoprotein)及胰島素）之增強子序列。然而，通常 將使用來自真核細胞病毒之增強子。實例包括在複製起點 之晚期側的SV40增強子（bp 100-270)、細胞巨大病毒早期 啟動子增強子、複製起點之晚期侧的多形瘤增強子及腺病 毒增強子。關於用於活化真核啟動子之增強元件亦參見 Yaniv，Nature 297:17-18 (1982)。雖然可將增強子拼接至載 體中的多價抗體編碼序列之5,或3,位置，但較佳定位於啟 動子之5W立點。 用於真核宿主細胞（例如，酵母、真菌、昆蟲、植物、 動物、人類或來自其他多細胞生物體之有核細胞）之表現 載體亦將含有終止轉錄及使mRNA穩定所必需之序列。該 等序列通常可自真核或病毒DNA4cDNAi5，及偶爾自3，之 非轉譯區獲得。此等區域含有轉錄為編碼多價抗體之 mRNA之非轉譯部分中的聚料酸化片段的料酸區段。 -種適用轉錄終止组份為牛生長激素聚腺㈣化區域。參 見WO94/11026及其中所揭示之表現載體。 重組舰亦可包括可用於純化蛋白質之任何類型蛋白質 :籤序列。蛋白質標籤之實例包括(但不限於)組胺酸標 鐵FLAG&籤、mye標藏、Ha標藏或標藏。供_ 菌、真菌、酵母及哺敎叙私^ + L動物細胞伯主使用之合適選殖及表 140513.doc -59- 201000118 現載體可見於 Cloning Vectors: A Laboratory Manual， (Elsevier，New York, 1985)(其相關揭示内容以引用的方式 併入本文中）中。 如對熟習此項技術者將顯而易見，使用適合於宿主細胞 之方法將表現構築體引入宿主細胞中。此項技術中已知用 於將核酸引入宿主細胞中之多種方法’包括（但不限於）電 穿孔；採用氯化躬、氣化铷、構酸妈、DEAE-葡聚糖或其 他物質之轉染，微粒轟擊；脂質轉染；及感染（其中載體 為感染劑）。 合適宿主細胞包括原核生物、酵母、哺乳動物細胞或細 菌細胞。合適細菌包括革蘭氏陰性或革蘭氏陽性生物體， 例如大腸桿菌或芽孢桿菌屬。較佳來自酵母菌種之酵母 (諸如’酿酒酵母（S. cerevisiae))亦可用於多肽之產生。亦 可採用各種哺乳動物或昆蟲細胞培養系統來表現重組蛋白 質。用於在昆蟲細胞中產生異源蛋白質之桿狀病毒系統由
Luckow 及 Summers，（Bi〇/Technology，6:47，1988)評述。合 適哺乳動物宿主細胞株之實例包括内皮細胞、C〇S_7猴腎 細胞、CV-1、L細胞、C127、3T3、中國倉鼠卵巢（CHO)、 人類胚腎細胞、HeLa、293、293T及BHK細胞株。藉由培 養合適宿主/載體系統以表現重組蛋白質來製備純化多 肽。對於許多應用而言，本文中所揭示之許多多肽的小尺 寸將使在大腸桿菌中表現為較佳表現方法。接著自培養基 或細胞萃取物純化蛋白質。 用於表現本發明之糖基化蛋白質之合適宿主細胞來源於 140513.doc -60- 201000118 多細胞生物體。無脊椎動物細胞之實例包括植物及昆蟲細 胞。已鐘別出來自諸如草地黏蟲（Spod〇ptera frugiperda)(毛蟲）、埃及伊蚊（Aedes aegypti)(坆子）、白紋 伊蚊（Aedes albopictus)(蚊子）、黑腹果蠅（Dr〇s〇phUa melanogaster)(果蠅）及家蠶（Bombyx mod)之宿主的大量桿 狀病毒株及變異體及相應許可昆蟲宿主細胞。用於轉染之 多種病毒株公開可得，例如苜蓿丫紋夜峨（Aut〇grapha californica)NPV之L-1變異體及家蠶NPV之Bm-5病毒株， 且根據本發明該等病毒可用作本文中之病毒，尤其用於轉 染草地黏蟲細胞。 在一些情況下’希望在脊椎動物細胞中產生蛋白質諸 如用於糖基化，且在培養物（組織培養物）中繁殖脊椎動物 細胞已成為常規程序。適用哺乳動物宿主細胞株之實例為 經SV40轉型之猴腎CV1細胞株（COS-7，ATCC CRL 1 65 1);人類胚胎腎細胞株（293細胞或經次選殖以供在懸浮 培養物中生長之293細胞，Graham等人，Gen Virol. 36:59 (1977));幼倉鼠腎細胞（ΒΗΚ，ATCC CCL 10)、中 國倉鼠卵巢細胞/-DHFR(CHO，Urlaub 等人，Proc.Natl· Acad. Sci. USA 77:4216 (1980));小鼠足細胞（TM4， Mather，Biol. Reprod. 23:243-251 (1980));狼腎細胞（CV1 ATCC CCL 70);非洲綠猴腎細胞（VERO-76, ATCC CRL-15 87);人類子宮頸癌細胞（HELA，ATCC CCL 2);犬腎細 胞（MDCK，ATCC CCL 34);布法羅大鼠（buffalo rat)肝細 r
胞（BRL 3A，ATCC CRL 1442);人類肺細胞（W138，ATCC 140513.doc -61- 201000118 CCL 75);人類肝細胞（Hep G2，HB 8065);小鼠乳房瘤 (MMT 060562，ATCC CCL51) ; TRI 細胞（Mather 等人， Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)) ; MRC 5細胞； FS4細胞；人類肝細胞瘤細胞株（Hep G2);及骨髓瘤或淋 巴瘤細胞（例如，Y0、J558L、P3及NS0細胞）（參見美國專 利第5,807,715號）。棉花、玉米、馬鈴薯、大豆、矮牵 牛、番蘇及於草之植物細胞培養物亦可用作宿主。 蛋白質產生 用本文所述之用於蛋白質產生之表現或選殖載體轉型宿 主細胞，且將其在適當時經改質以供誘導啟動子、選擇轉 型體或擴增編碼所需序列之基因的習知營養培養基中培 養。在此處所示之實例中，用於高產量蛋白質產生（HTPP) 及中等規模產生之宿主細胞為HMS 1 74-菌株。 用以產生本發明蛋白質之宿主細胞可在多種培養基中培 養。諸如Ham's FlO(Sigma)、最低必需培養基（(MEM)， (Sigma))、RPMI-1640(Sigma)及杜氏改良伊格爾培養基 (Dulbecco's Modified Eagle's Medium)((DMEM) 5 (Sigma)) 之市售培養基適於培養該等宿主細胞。此外，描述於Ham 等人，Meth. Enz. 58:44 (1979)、Barnes 等人，Anal. Biochem.102:255 (1980)、美國專利第 4,767,704 號、第 4,657,866 號、第 4,927,762 號、第 4,560,655 號或第 5，122,469號、W090/03430、W087/00195或美國專利第 Re· 30,985號中之任何培養基可用作宿主細胞之培養基。此等 培養基中之任一者均可在必要時補充激素及/或其他生長 140513.doc -62- 201000118 因子（諸如，胰島素、運鐵蛋白或表皮生長因子）、鹽（諸 如，氯化鈉、鈣、鎂及磷酸鹽）、緩衝劑（諸如，HEPEs)、 核苷酸（諸如，腺苷及胸苷）、抗生素（諸如， GENTAMYCINtm藥物）、微量元素（定義為通常以在微莫耳 濃度範圍内之最終濃度存在的無機化合物）及葡萄糖或等 - 效能量來源。亦可包括熟習此項技術者已知之合適濃度的 任何其他必需補充劑。培養條件（諸如，溫度、pH值及其 Φ 類似條件）為先前選用於表現之宿主細胞所用的條件，且 對一般技術者而言將顯而易見。 本文中所揭示之蛋白質亦可使用細胞轉譯系統產生。出 於該等目的，須修飾編碼多肽之核酸以允許活體外轉錄來 產生mRNA且允許在所用特定無細胞系統（真核，諸如無哺 乳動物或酵母細胞之轉課系統；或原核，諸如無細菌細胞 之轉譯系統）中無細胞轉譯mRNA。 本發明之蛋白質亦可藉由化學合成（例如，藉由8〇加 參 抑咖 PePtide Synthesis，第 2 版，1984，The …似
Chemical Co.，Rockf〇rd，IL中描述之方法）產生。對蛋白質 之修飾亦可藉由化學合成產生。 本發明之蛋白質可藉由在蛋白質化學領域中普遍已知之 蛋白質分離/純化方法來純化。非限制性實例包括萃取、 再結晶、鹽析(例如，使用硫酸銨或硫酸鈉）、離心、透 析、超遽、吸附層析、離子交換層析、疏水性層析、正相 層析、反相層析、凝膠過攄、凝膠滲透層析、親和力層 析、電泳、逆流分布或其任何組合。純化後，可將多狀更 140513.doc -63· 201000118 換至不同緩衝液中及/或藉由此項技術中已知之多種方法 中之任一者，包括（但不限於）過濾及透析加以濃縮。 經純化多肽較佳至少85%純，更佳至少95%純，且最佳 至y 9 8 /ό純。無論純度之精確數值如何，該多肽對於用作 醫樂產品而言足夠純。 成像、診斯及其他應用 在一態樣中，本申請案提供以可偵測部分標記之多價多 肽。該等多肽可用於多種診斷應用。該可偵測部分可為任 何能夠直接或間接產生可偵測信號之部分。舉例而言，可 偵測部分可為放射性同位素，諸如H3、〇14或l3、p32、 S35或1131，螢光或化學發光化合物，諸如異硫氰酸螢光 素、若丹明（rhodamine)或蟲螢光素；或酶，諸如鹼性磷酸 酶、β-半乳糖苷酶或辣根過氧化物酶。 可採用此項技術中已知用於使蛋白質與可偵測部分接合 的任何方法，包括 Hunter 等人，Nature 144:945 (1962);
David等人，Biochemistry 13:1〇14 (i974); pain等人，j Immunol. Meth. 4〇:219 〇981);及外仍〇,】出_“ and Cytochem· 30:407(1982)所述之彼等方法。活體外方法 包括此項技術中熟知之接合化學，包括與蛋白質相容之化 學，諸如針對特定胺基酸（諸如，Cys&Lys)之化學。為將 邛刀（諸如’ PEG)與本發明之蛋白質連接，使用鍵聯基團 或反應性基團。合適鍵聯基團在此項技術中熟知，且包括 雙硫基、硫喊基、酸不穩定性基團、光不穩定性基團、狀 酶不穩定性基團及S旨酶不穩定性基團。視應用而定，較佳 140513.doc 201000118 鍵聯基團為雙硫基及硫醚基。對於無Cys胺基酸之多肽而 a，可將Cys工程化於一位置以允許在產生用於接合之位 置時蛋白質活性亦存在。
連接有可债測部分之多價結合多肽亦適用於活體内成 像。可將多肽與造影劑或放射性同位素連接，向個體投 與，較佳投至血流中，且檢定個體中經標記蛋白質之存在 及位置。此成像技術適用於惡性腫瘤之分期及治療。蛋白 質可經在個體中無論藉由核磁共振、放射學抑或此項技術 中已知之其他彳貞測方式均可谓測之任何部分標記。 多價多肽亦可用作親和力純化劑。在此過程中，使用此 項技術中熟知之方法，將多肽固定於諸如Sephadex樹脂或 濾紙之合適支撐物上。 —多價多肽可用於任何已知較方法巾，諸如競爭結合檢 定、直接及間接夾心檢定及免疫沈澱檢定（ζ_ Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques，% Ul[ 158 頁（CRC Press，Inc” 1987))。 在某些態樣中，本揭示案提供偵測樣品中目標分子之方 法。一方法可包含使樣品與本文所述之多價多狀接觸，直 中該接觸係在允許多肽·目標複合物形成的條件 :、 及债測該複合物’由此㈣該樣品中之該目標。偵测吏 用此項技術巾e知之任何技術進行，諸如放射攝影術 疫檢定、螢光偵測、質譜分析或表面電漿 為生物樣品，諸如活組織檢查， x ’时通常 且疋具為腫瘤'疑似脯 之活組織檢查。樣品可來自人類或其他哺乳動物。多= 140513.doc -65· 201000118 顯色部分、化學發光 可將多價多肽固定在 肽可經諸如放射性部分、螢光部分 部分或半抗原部分之標記部分標記 固體支撐物上。 醫療/活饉内用途 在一態樣中’本申請幸裎也 ^ k適用於治療病症之多價多 狀。本申请案亦提供向個體於I夕μ # 镀扠與多價多肽之方法。在一此 實施例中’個體為人類。在—些實施例中，多價多狀㈣ 乳動物(尤其人類)而言為醫藥學上可接「醫藥學 受」多肽係指向動物投與而無顯著不利醫學後果的多狀。 醫藥學上可接受之多價多肽之實例包括缺乏整合素結合域 (RGD)之1〇Fn3域及基本上無内毒素或具有極低内毒辛含臺 之10Fn3域。 每案3量 多價多肽尤其適用於諸如癌症之病症。在—例示性實施 例中，多價多肽包含結合兩個不同目標之以3域。兩個目 標可在同一信號傳輸途徑内或在兩個獨立信號傳輸途徑 内。該等目標分子中之一者可將多價多肽「募集」至特定 位點，诸如癌細胞，而與弟二目標分子結合可影響特定作 號傳輸途徑。 本申凊案之一態樣知·供乾向一或多種腫瘤生物學中所涉 及之蛋白質（諸如’ VEGFR2、IGF-IR及EGFR)的多價多 肽。在一些實施例中’投與多價多肽抑制活體内腫瘤細胞 生長。腫瘤細胞可來源於任何細胞類型，包括（但不限於） 表皮、上皮、内皮、白血病、肉瘤、多發性骨髓瘤或中表 層細胞。用於異種移植腫瘤研究之常見腫瘤細胞株之實例 140513.doc • 66 - 201000118 包括A549(非小細胞肺癌）細胞、DU-145(前列腺）細胞、 MCF-7(乳房）細胞、Colo 205(結腸）細胞、3T3/]GF-IR(小 鼠纖維母細胞）細胞、NCI H441細胞、HEP G2(肝細胞瘤） 細胞、MDAMB 231(乳房）細胞、HT-29(結腸）細胞、MDA-MB-435(乳房）細胞、U266細胞、SH-SY5Y細胞、Sk-Mel-2 * 細胞、NCI-H929、RPM1 8226及A43 1細胞。在一些實施例 中，相對於未經治療動物中腫瘤之生長，多肽抑制腫瘤細 胞生長。在一些實施例中’相對於未經治療動物中腫瘤之 馨 生長’多肽對腫瘤細胞生長抑制50%、60%、70%、80%或 80%以上。在一些實施例中，對腫瘤細胞生長之抑制係在 動物已開始用多肽治療後至少7天或至少14天量測。在一 些實施例中，將另一抗腫瘤劑與多肽一起投與動物。 在某些態樣中，本揭示案提供投與多價多肽以治療及/ 或預防腫瘤及/或腫瘤轉移的方法，其中該腫瘤尤其較佳 選自（但不限於）由以下組成之群：腦腫瘤、泌尿生殖道腫 φ 瘤、淋巴系統腫瘤、胃腫瘤、喉腫瘤、單核細胞白血病、 肺腺癌、小細胞肺癌、胰腺癌、神經膠母細胞瘤及乳癌。 在某些態樣中，本揭示案提供投與多價多肽以治療選自 由以下組成之癌症疾病之群的疾病之方法：鱗狀細胞癌、 膀胱癌、胃癌、肝癌、腎癌、結腸直腸癌、乳癌、頭癌、 頸癌、食道癌、婦科癌症、甲狀腺癌、淋巴瘤、慢性白血 病及急性白血病。 可舆本發明t合適實施例一《使用之其他藥劑 本發明之一態樣提供與細胞毒性劑連接之多價多肽。視 140513.doc -67- 201000118 情況而定，該等實施例可藉由活體外或活體内方法製備。 活體外方法包括此項技術中熟知之接合化學，包括與蛋白 質相容之化學，諸如針對特定胺基酸（諸如，Cys及Lys)之 化學。為使細胞毒性劑與多肽連接，使用鍵聯基團或反應 性基團。合適鍵聯基團在此項技術中熟知，且包括雙硫 基、硫醚基、酸不穩定性基團、光不穩定性基團、肽酶不 穩定性基團及酯酶不穩定性基團。較佳鍵聯基團為雙硫基 及硫醚基。舉例而言’接合物可使用雙硫交換反應或藉由 在抗體與細胞毒性劑之間形成硫醚鍵來構築。較佳細胞毒 性劑為類美登素（maytansinoid)、紫杉烷（taxane)及CC- 1 0 6 5類似物。 在一些實施例中’使多價多肽與細菌毒素、植物毒素、 篦麻毒素、相思子毒素、核糖核酸酶（RNase)、DNase I、 蛋白酶、葡萄球菌腸毒素-A、美洲商陸抗病毒蛋白 (pokeweed antiviral protein)、白樹素（gel〇nin)、白喉毒 素、假單胞菌外毒素、假單胞菌内毒素、 Ranpimase(Rap)、Rap(N69Q)、酶或螢光蛋白質連接。 在一些實施例中’使多價多肽與類美登素或美登素類類 似物連接。適合類美登素之實例包括美登醇及美登醇類似 物。合適類美登素揭示於美國專利第4,424,219號、第 4,256,746 號、第 4,294,757 號、第 4,307,016 號、第 4,313,946 號、第 4,315,929 號、第 4,331，598 號、第 4,361，650 號、第 4,362,663 號、第 4,364,866 號、第 4,450,254 號、第 4,322,348 號、第 4,371，533 號、第 140513.doc -68· 201000118 6,333,410 號、第 5,475,092 號、第 5 585,499 號及第 5,846,545號中 ° 在一些實施例中’使多價多肽與紫杉烷連接。適用於本 發明中之紫杉烷揭示於美國專利第6,372,738號及第 ' 6,340,701號中。 在一些實施例中’使多價多肽與CC-1065或其類似物連 接。cc-i〇65及其類似物揭示於美國專利第6,372,738號、 _ 第 6,340,701號、第 5,846,545號及第 5,585,499號中。 用於製備該等細胞毒性接合物之有吸引力之候選物為 CC-1065 ’其為自澤耳鍵徽菌（streptomyces zelensis)之培 養肉湯中分離之有效抗腫瘤抗生素。CC-1 065在活體外比 常用抗癌症藥物（諸如多柔比星（d〇xorubicin)、甲胺喋吟及 長春新鹼（vincristine))效力高約1〇〇〇倍（Β. κ· Bhuyan等 人，Cancer Res” 42, 3532-3537 (1982))。 諸如曱胺嗓呤、道諾黴素（daunorubicin)、多柔比星、長 ❹ 春新鹼、長春花鹼（vinblastine)、美法侖（melphalan)、絲 裂黴素C(mitomycin 〇、苯丁酸氮芥（chl〇rambucil)及刺孢 黴素（calicheamicin)之細胞毒性藥物亦適於製備本發明之 Γ 接合物’且該等藥物分子亦可經由中間載體分子（諸如， 血清白蛋白）連接至多價多肽。 在其他治療性治療或組合物中，將多價多肽與一或多種 '、他/α療劑一起共投與或連續投與。合適治療劑包括（但 不限於）靶向治療劑、其他靶向生物製劑及細胞毒性劑或 細胞生長抑制劑。在一些情況下，較佳自固持液體調配物 140513.doc -69· 201000118 之同一或獨立的治療上可接受之 裝置投與藥劑。 小觀、 注射器或其他投藥 細胞生長同時對患者具
格拉司瓊（granisetron HC1)，·雄激素抑制劑， 諸如乙酸亮 丙立德（leuprolide acetate);抗生素，諸如多柔比星；抗雌 激素，諸如他莫昔芬（tamoxifen);抗代謝物，諸如干擾素 a-2a;細胞毒性劑，諸如紫杉酚（tax〇1);酶抑制劑，諸如 ras法呢基轉移酶抑制劑；免疫調節劑，諸如阿地白介素 (aldesleukin);及氮芥衍生物，諸如鹽酸美法侖，及其類 癌症’α療劑為設法殺死或限制癌 有最小影響之彼等藥劑。因此，誃 似物。 可與多價多肽組合以改良抗癌功效的治療劑包括用於腫 瘤學實踐中之多種藥劑（參見：Cancer，Principles & Practice of Oncology, DeVita, V. T., Heilman, S.5 Rosenberg, S. A.，第 6版，Lippincott-Raven，Philadelphia， 2001) ’諸如多稀紫杉醇（docetaxel)、太平洋紫杉醇 (paclitaxel)、多柔比星、表柔比星（epirubicin)、環碌醯胺 (cyclophosphamide) ' 曲妥珠單抗（trastuzumab)、卡西他賓 (capecitabine)、他莫昔芬（tamoxifen)、托瑞米芬 140513.doc •70· 201000118 (toremifene)、來曲0坐（letrozole)、安美達疑（anastrozole)、 敗維司群（fulvestrant)、依西美坦（exemestane)、戈舍瑞林 (goserelin)、奥赛力舶（oxaliplatin)、卡 # (carboplatin)、順 在白（cisplatin)、地塞米松（dexamethasone)、抗排卵肽 (antide)、貝伐單抗（bevacizumab)、5-氟尿 °密 °定（5-fluorouracil)、亞葉酸（leucovorin)、左旋0米 口坐 (levamisole)、伊立替康（irinotecan)、依託泊苷 (etoposide)、 拓朴替康（topotecan)、 吉西他賓 (gemcitabine)、長春瑞賓（vinorelbine)、雌莫司 ί丁 (estramustine)、米托蒽酿（mitoxantrone)、阿巴瑞克 (abarelix)、α坐來膦酸鹽（zoledronate)、鏈腺徽素 (streptozocin)、利妥昔單抗（rituximab)、黃膽素 (idarubicin)、白消安（busulfan)、苯丁 酸氮芬 (chlorambucil)、氣達拉濱（fludarabine)、伊馬替尼 (imatinib)、阿糖胞苦（cytarabine)、替伊莫單抗 (ibritumomab)、托西莫單抗（tositumomab)、干擾素 a-2b、 美法舍、蝴替佐米（bortezomib)、六甲密胺（altretamine)、 天冬醯胺酶（asparaginase)、吉非替尼（gefitinib)、埃羅替 尼（erlonitib)、抗EGF受體抗體（例如，西妥昔單抗 (cetuximab)或帕尼圖單抗（panitumab))、伊沙匹隆 (ixabepilone)、埃坡黴素（epothilones)或其衍生物，及細胞 毒性藥物與抗細胞表面受體之抗體的接合物。較佳治療劑 為鉑劑（諸如，卡鉑、奥赛力鉑、順鉑）、紫杉烷（諸如，太 平洋紫杉醇、多烯紫杉醇）、吉西他賓及喜樹鹼 140513.doc 201000118 (camptothecin)。 項技術者應瞭解對於各治療劑而言 抗體、抗體片段或接合物之間的時 調》及投藥 該或該等其他治療劑可在多 時或在多價多肽之後投與。熟 治療劑而言，特定投藥順序可 價多肽之前、與多價多肽同 習此項技術者應瞭解對於各 為有利的。類似地，熟習此 ，投與藥劑及本發明之 間長度將變化。 本申凊案it步提供包含本文所述之多價多肽的醫藥學 上可接受之組合物，其中該組合物基本上不含内毒素。包 含多價多肽之治療龍物係藉由將具有所要純度之所述蛋 白質與可選生理學卜01*垃 字上了接又之載劑、賦形劑或穩定劑 (Remington's Pharmaceutical Sciences^ 16J& * Osol, A. Ed. (1980))此σ以水溶液、凍乾或其他乾燥調配物之形式製 備以供儲存。可接受之載劑、賦形劑或穩定劑在所採用之 劑量及濃度下對接受者無毒’且包括緩衝劑，諸如麟酸 鹽、檸檬酸鹽及其他有機酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸及 甲硫胺酸，防腐劑（諸如，氣化十八烷基二曱基苄基銨； 氣化六羥季銨；氣化苯甲烴銨；苄索氣銨；苯酚、丁醇或 苄醇，對羥基苯曱酸烷基酯，諸如對羥基苯曱酸甲酯或對 羥基苯甲酸丙酯；兒茶酚；間苯二酚；環己醇；3_戊醇； 及間甲盼）’低分子量（少於約1〇個殘基）多肽；蛋白質，諸 如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，諸如 聚乙烯吡咯啶酮；胺基酸，諸如甘胺酸、麩醯胺酸、天冬 醯胺、組胺酸、精胺酸或離胺酸；單醣、雙醣及其他碳水 140513.doc -72· 201000118 化口物’包括葡萄糖、甘露糖或葡聚糖；螯合劑，諸如 EDTA ’糖’諸如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨糖醇； 成皿平衡離子，諸如鈉；金屬錯合物(例如，z卜蛋白質錯 合物）’及/或非離子型界面活性劑，諸如TWEENtm、 PLUR0NICSTM或聚乙二醇（PEG)。
如為所/〇療之特定適應症所必需，本文之調配物亦可含 有種以上活性化合物，較佳為具有不會不利地彼此影響 之互補活性的活性化合物。活性化合物組合之實例提供於 本文中。料分子適當地以有效達成預$目的之量組合存 在。 亦可將活性成份截留於（例如）藉由凝聚技術或藉由界面 聚合製備之微膠囊（例如，分別為羥甲基纖維素或明膠-微 膠囊及聚（甲基丙烯酸甲酯）微膠囊）、膠狀藥物傳遞系統 (例如，脂質體、白蛋白微球體、微乳液、奈米顆粒及奈 米膠囊）或巨乳液中。該等技術揭示於Remingt〇n,s Pharmaceutical Sciences 第 16版，〇s〇i，a. Ed (198〇)中。 待用於活體内投藥之調配物必須無菌。此易於藉由用無 菌過濾膜過濾來實現。 可製備持續釋放製劑。持續釋放製劑之合適實例包括含 有本發明蛋白質的固體疏水性聚合物之半透性基質，該等 基質呈成形物件形式，例如薄膜或微膠囊。持續釋放基質 之實例包括聚酯、水凝膠（例如’聚（2-羥乙基-甲基丙烯酸 酯）或聚（乙烯醇））、聚交酯（美國專利第3,773,919號）、L-麵 胺酸與γ乙基-L-越胺酸醋之共聚物、不可降解乙烯-乙酸乙 140513.doc •73· 201000118 烯醋、jr降解乳酸-乙醇酸共聚物（諸如，lupr〇n DEPOT，由乳酸_乙醇酸共聚物㈣^ 可注射微球體）及聚_D_(朴經基丁酸。雖然聚合物（諸 如，乙嫦-乙酸乙稀醋及乳酸、乙醇酸）使分子能夠釋放歷時 超過⑽天，但某些水凝膠釋放蛋白質歷時較短時間。合 =發明之囊封蛋白質可長時間保留於體内時，其可能由於 在37C下曝露於水分而變性或聚集，導致生物活性損失且 免疫原性可能改變。視所涉及之機制而定，可設古卜 ❹ 略以求穩定。舉例而言’若發現聚集機制為經由硫V二
疏化物互變而形成分子間S — S鍵，則料可藉由 Z ^基制自酸性溶液滚乾、控制水分含量、使用合適添加劑 及研製特定聚合物基質組合物來達成。 雖然熟習此項技術者應瞭解各治療劑之劑量將視 ^而定，但較佳劑量可在約1〇毫克/平方公尺至約2_ 毫克/平方公尺、更佳⑽毫克/平方公尺至約_ 方公尺之範圍内。 卞 ❹ 對於治療應用而言，向個體投與呈醫藥學上可接受 ^多價多肽。其可以快速注射形式或藉由經—段時間二 續輸液靜脈内投與’藉由肌肉内、皮下、關節内 内、鞘内、經口、局部或吸入途徑投與。蛋白質亦可二由 腫瘤内、腫瘤周邊、病灶内或病灶周邊途徑投與以發 部以及全身性治療效應。合適醫藥學上可接受之載劑、稀 釋劑及賦形劑為熟知的且可由熟習此項技術者按照臨 況批准來確定。合適載劑、稀釋劑及/_形劑之實^ 140513.doc -74- 201000118 括：（1)杜氏磷酸鹽緩衝生理食鹽水’ pH值為約7.4，含有 約1111§/1111至25 111§/1111人類血清白蛋白；（2)0.9%生理食鹽 水（0.9% w/v NaCl);及（3)5%(w/v)右旋糖。本發明之方法 可在活體外、活體内或離體實施。 無論為共同投藥抑或依序投藥，多價多肽及一或多種其 他治療劑之投藥均可如上文針對治療應用所述進行。熟習 此項技術者應瞭解用於共同投藥的合適醫藥學上可接受之 載劑、稀釋劑及賦形劑視所共同投與之特定治療劑之特性 而定。 當以水溶液劑型而非凍乾劑型存在時，蛋白質通常將以 約0.1 mg/ml至100 mg/ml之濃度調配，不過允許在此等範 圍外廣泛變化。為治療疾病，多價多肽之合適劑量將視如 上文所定義待治療疾病之類型、疾病之嚴重程度及病程、 抗體係出於預防抑或治療之目的而投與、先前療法之過 程、患者之臨床病史及對抗體之反應以及主治醫師之判斷 而定。適當地一次或經一系列治療向患者投予蛋白質。 其他專利參考文獻 以下其他專利申請案及專利中描述之方法及組合物亦包 括在本揭不案内. 美國公開案第20050186203號、第20050084906號、第 20050008642號、第 20040202655號、第 20040132028號、 第 20030211078號、第 20060083683號、第 20060099205 號、第20060228355 號、第20040081648號、第 20040081647 號、第20050074865號、第20040259155號、第 20050038229 140513.doc -75- 201000118 號、第20050255548號、第20060246059號；及美國專利第 5,707,632號、第 6,818,418 號及第 7，115,396號；及 PCT 國際 申請公開案第 W02005/085430 號、第 W02004/019878 號、 第 W02004/029224號、第 W02005/056764號、第 W02001/ 064942號及第 W02002/032925號。 以引用的方式併入 本文所述之所有文獻及參考文獻（包括專利文件及網站） 以引用的方式個別地併入本文件中，其程度如同在本文件 中全文或部分書寫一般。 序列表 10Fn3，其中BC、DE及FG環經加下劃線（SEQ ID NO: 1)
VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAYTVRYYRITYGETGGNSPVOEFTVPGSKSTATI
SGLKPGVDYTITVYAVTGRGDSPASSKPISINYRT 385A08 BC環（SEQ ID NO: 2)
SWSARLKVAR 385A08 DE環（SEQ ID NO: 3)
PKNVYT 385A08 FG環（SEQ ID NO: 4)
TRFRDYQP V2B BC環（SEQ ID NO: 5)
SWRHPHFPTR V2B DE環（SEQ ID NO: 6)
PLQPPT V2B FG環（SEQ ID NO: 7)
TDGRNGRLLSIP 385A08-Fn-V2B(Ser尾）（SEQ ID NO: 8)
MGVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWSARLKVARYYRITYGETGGNSPVQEFTVPK 140513.doc 76· 201000118
NVYTATISGLKPGVDYTITVYAVTRFRDYQPISINYRTEIDKPSTSTSTVSDYPRD
LEVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISGLKP
GVDYTITVYAYTDGRNGRLLSIPISINYRTEIDKPSQ 385A08-Fn-V2B(Cys尾）（SEQ ID NO: 9)
MGVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWSARLKVARYYRITYGETGGNSPVQEFTVPK
NVYTATISGLKPGVDYTITVYAVTRFRDYQPISINYRTEIDKPSTSTSTVSDVPRDL
EVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISGLKP
GVDYTITVYAVTDGRNGRLLSIPISINYRTEIDKPCQ 385A08-GS5(SEQ ID NO: 21)-V2B(Ser尾）（SEQ ID NO: 10)
MGVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWSARLKVARYYRITYGETGGNSPVQEFTVPKN
VYTATISGLKPGVDYTITVYAVTRFRDYQPISINYRTEIDKGSGSGSGSGSVSDV
PRDLEVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATIS
GLKPGVDYTITVYAVTDGRNGRLLSIPISINYRTEIDKPSQ 0 385 A08-GS10(SEQ ID NO: 22)-V2B(Ser尾）（SEQ ID NO: 11)
MGVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWSARLKVARYYRITYGETGGNSPVQEFTVPK
NVYTATISGLKPGVDYTITVYAVTRFRDYQPISINYRTEIDKGSGSGSGSGSGSGS
GSGSGSVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFT
VPLQPPTATISGLKPGVDYTITVYAVTDGRNGRLLSIPISINYRTEIDKPSQ V2B-Fn-385A08(Ser尾）（SEQ ID NO: 12) MGVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQ PPTATISGLKPGVDYTITVYAVTDGRNGRLLSIPISINYRTEIDKPSTSTSTVSDVPR DLEVVAATPTSLLISWSARLKVARYYRITYGETGGNSPVQEFTVPKNYYTATIS GLKPGVDYTITVYAVTRFRDYQPISINYRTEIDKPSQ (SEQ ID NO: 2) V2B-Fn-385A08(Cys尾）（SEQ ID NO: 13)
^ MGVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQ
9 PPTATISGLKPGVDYTITVYAVTDGRNGRLLSIPISINYRTEIDKPSTSTSTVSDVPR
DLEVVAATPTSLLISWSARLKVARYYRITYGETGGNSPVQEFTVPKNVYTATISG LKPGVDYTITVYAVTRFRDYQPISINYRTEIDKPCQ V2B-GS5(SEQ ID NO: 21)-385A08(Ser尾）(SEQ ID NO: 14)
MGVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQ
PPTATISGLKPGVDYTITVYAVTDGRNGRLLSIPISINYRTEIDKGSGSGSGSGSVS
DVPRDLEVYAATPTSLLISWSARLKVARYYRITYGETGGNSPVQEFTVPKNVYT
ATISGLKPGVDYTITVYAVTRFRDYQPISINYRTEIDKPSQ V2B-GS10(SEQ ID NO: 22)-385A08(Ser尾）（SEQ ID NO: 15)
MGVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQ
PPTATISGLKPGVDYTITYYAVTDGRNGRLLSIPISINYRTEIDKGSGSGSGSGSGS
GSGSGSGSVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWSARLKVARYYRITYGETGGNSPVQE
FTVPKNVYTATISGLKPGYDYTITVYAVTRFRDYQPISINYRTEIDKPSQ 140513.doc -77- 201000118 V2B(Ser尾）(SEQ ID NO: 16)
MGVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQ
PPTATISGLKPGVDYTITVYAVTDGRNGRLLSIPISINYRTEIDKPSQ
Ser尾（SEQ ID NO: 17)
EIDKPSQ
Cys尾（SEQ ID NO: 18)
EIDKPCQ
Short尾（SEQ ID NO: 19)
EIDK 以Fn為主之連接子（SEQ ID NO: 20)
PSTSTST GS5 連接子（SEQ ID NO: 21)
GSGSGSGSGS GS,。連接子（SEQ ID NO: 22)
GSGSGSGSGSGSGSGSGSGS (GGGGS)3(SEQ ID NO: 23)
GGGGS GGGGS GGGGS (GGGGS)5(SEQ ID NO: 24)
GGGGS GGGGS GGGGS GGGGS GGGGS G4SG4SG3SG(SEQ ID NO: 25)
GGGGSGGGGSGGGSG AT577(SEQ ID NO: 26)
MGVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWSARLKVARYYRITYGETGGNSPVQEFTVPK
NYYTATISGLKPGVDYTITVYAVTRFRDYQPISINYRTEIDKPSQ AT580(SEQ ID NO: 27)
MGVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWSARLKVARYYRITYGETGGNSPVQEFTVPK
NVYTATISGLKPGVDYTITVYAVTRFRDYQPISINYRTEIDKPCQ V2Bshort(SEQ ID NO: 28)
GEVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISGLK
PGVDYTITVYAVTDGRNGRLLSIPISINYRTEIDKPCQ 385A08-GPG(SEQ ID NO: 32)-V2B(SEQ ID NO: 29)
MGVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWSARLKVARYYRITYGETGGNSPVQEFTVPK
NVYTATISGLKPGVDYTITVYAVTRFRDYQPISINYRTGPGVSDVPRDLEVVAAT 140513.doc -78- 201000118
PTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISGLKPGVDYTIT
VYAVTDGRNGRLLSIPISINYRT 385A08-GPGPGPG(SEQ ID NO: 33)-V2B(SEQ ID NO: 30)
MGVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWSARLKVARYYRITYGETGGNSPYQEFTVPK
NVYTATISGLKPGVDYTITVYAVTRFRDYQPISINYRTGPGPGPGVSDVPRDLEV
VAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISGLKPGV
DYTITVYAVTDGRNGRLLSIPISINYRT 385A08-GPGPGPGPGPG(SEQ ID NO: 34)-V2B(SEQ ID NO: 31)
• MGVSDVPRDLEWAATPTSLLISWSARLKVARYYRITYGETGGNSPVQEFTVPK NVYTATISGLKPGVDYTITVYAVTRFRDYQPISINYRTGPGPGPGPGPGVSDVPRD LEVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISGLKP GVDYTITVYAVTDGRNGRLLSIPISINYRT φ GPG(SEQIDNO:32) GPGPGPG (SEQ ID NO: 33) GPGPGPGPGPG (SEQ ID NO: 34) 385A08核心（SEQ ID NO: 35)
EVVAATPTSLLISWSARLKVARYYRITYGETGGNSPVQEFTVPKNVYTATISGLK
PGVDYTITVYAVTRFRDYQPISINYRT 具有完整N-末端延伸（加下劃線）之385A08核心（SEQ ID NO: 36)
MGVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWSARLKVARYYRITYGETGGNSPVOEFTVPK
NVYTATISGLKPGVDYTITVYAVTRFRDYQPISINYRT ’ 具有完整N-末端延伸（加下劃線）及Short尾（加下劃線）之 385A08核心（SEQ ID NO: 37)
MGVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWSARLKVARYYRITYGETGGNSPYOEFTVPK
NYYTATISGLKPGVDYTITVYAVTRFRDYOPISINYRTEIDK 具有N-末端延伸（加下劃線）及Ser尾（加下劃線）之385A08核 • 心（SEQ ID NO: 38)
VSDVPRDLEWAATPTSLLISWSARLKVARYYRITYGETGGNSPVOEFTVPKNVY
TATISGLKPGVDYTITVYAYTRFRDYOPISINYRTEIDKPSO 具有N-末端延伸（加下劃線）及Cys尾（加下劃線）之385A08核 心（SEQ ID NO: 39)
VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWSARLKVARYYRITYGETGGNSPVOEFTVPKNVY
TAnSGLKPGVDYTITVYAVTRFRDYQPISINYRTEIDKPCO 140513.doc -79- 201000118 V2B核心（SEQ ID NO: 40)
EVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISGLKP
GVDYTITVYAVTDGRNGRLLSIPISINYRT 具有N-末端延伸（加下劃線）之V2B核心（SEQ ID NO: 41)
VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVOEFTVPLOPPT
ATISGLKPGVDYTITVYAVTDGRNGRLLSIPISINYRT 具有完整N-末端延伸（加下劃線）及Short尾（加下劃線）之 V2B核心（SEQ ID NO: 42)
MGVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVOEFTVPLO PPTATISGLKPGVDYTITVYAVTDGRNGRLLSIPISINYRTEIDK 具有完整N-末端延伸（加下劃線）及Ser尾（加下劃線）之V2B 核心（SEQ ID NO: 43)
VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPYOEFTVPLOPPT
ATISGLKPGVDYTITVYAVTDGRNGRLLSIPISINYRTEIDKPSQ 具有完整N-末端延伸（加下劃線）及Cys尾（加下劃線）之V2B 核心（SEQ ID NO: 44)
VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVOEFTVPLOPPT
ATISGLKPGVDYTITVYAVTDGRNGRLLSIPISINYRTEIDKPCO 完整N-末端延伸（SEQ ID NO: 45)
MGVSDVPRDL N-末端延伸（SEQ ID NO: 46)
VSDVPRDL N-末端延伸（SEQ ID NO: 48)
GVSDVPRDL PA3連接子（SEQ ID NO: 60)
PAPAPA PA6 連接子（SEQ ID NO: 61)
PAPAPAPAPAPA PA9 連接子（SEQ ID NO: 62)
PAPAPAPAPAPAPAPAPA
385A08-Fn-V2B(經修飾 Ser尾）（SEQ ID NO: 63) MGVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWSARLKVARYYRITYGETGGNSPVQEFTYPK NVYTATISGLKPGVDYTITYYAVTRFRDYQPISINYRTEPSTSTSTVSDVPRDLEV VAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISGLKPGV 140513.doc -80- 201000118
DYTITVYAVTDGRNGRLLSIPISINYRTEGSGS 385A08-Fn-V2B(經修飾 Cys尾）（SEQ ID NO: 64)
MGVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWSARLKVARYYRITYGETGGNSPVQEFTVPK
NVYTATISGLKPGVDYTITVYAVTRFRDYQPISINYRTEPSTSTSTVSDVPRDLEV
VAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISGLKPGV
DYTITVYAVTDGRNGRLLSIPISINYRTEGSGC 385A08-PA3(SEQ ID NO: 60)-V2B(經修飾 Ser尾）（SEQ ID NO: 65)
MGVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWSARLKVARYYRITYGETGGNSPVQEFTVPK
NVYTATISGLKPGVDYTITVYAVTRFRDYQPISINYRTEPAPAPAVSDVPRDLEVV
AATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPYQEFTVPLQPPTATISGLKPGVD
YTITVYAVTDGRNGRLLSIPISINYRTEGSGS
385A08-PA3(SEQ ID NO: 60)-V2B(經修飾 Cys 尾）（SEQ ID NO: 66)
MGVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWSARLKVARYYRITYGETGGNSPVQEFTVPK
NVYTATISGLKPGVDYTITVYAVTRFRDYQPISINYRTEPAPAPAVSDVPRDLEVV
AATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPYQEFTVPLQPPTATISGLKPGVD YTITVYAVTDGRNGRLLSIPISINYRTEGSGC 385A08-PA6(SEQ ID NO: 61)-V2B(經修飾 Ser尾）（SEQ ID NO: 67)
MGVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWSARLKVARYYRITYGETGGNSPVQEFTVPK
NVYTATISGLKPGVDYTITVYAVTRFRDYQPISINYRTEPAPAPAPAPAPAVSDVP
RDLEVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISG LKPGVDYTITVYAVTDGRNGRLLSIPISINYRTEGSGS 385A08-PA6(SEQ ID NO: 61 )-V2B(經修飾 Cys尾）（SEQ ID NO: 68)
MGVSDVPRDLEWAATPTSLIiSWSARLKVARYYRITYGETGGNSPVQEFTVPK
NVYTATISGLKPGVDYTITVYAVTRFRDYQPISINYRTEPAPAPAPAPAPAVSDVP
RDLEVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISG LKPGVDYTITVYAVTDGRNGRLLSIPISINYRTEGSGC 385A08-PA9(SEQ ID NO: 62)-V2B(經修飾 Ser尾）（SEQ ID NO: 69) Μσν8ϋνΡΚΒ[ΕννΑΑΤΡΤ3ΙΧΙ3\^ΑΙΙίΚνΑΙΙΥΥΚΐτΥΟΕτ(3σΝ8Ρν(5ΕΡΤνΡΚ
NVYTATISGLKPGVDYTITVYAVTRFRDYQPISINYRTEPAPAPAPAPAPAPAPAP
AVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPP
TATISGLKPGVDYTITVYAVTDGRNGRLLSIPISINYRTEGSGS 385A08-PA9(SEQ ID NO: 62)-V2B(經修飾 Cys尾）（SEQ ID NO: 70)
MGVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWSARLKVARYYRITYGETGGNSPVQEFTVPK
NVYTATISGLKPGVDYTITVYAVTRFRDYQPISINYRTEPAPAPAPAPAPAPAPAP 140513.doc -81 - 201000118
AVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPP
TATISGLKPGVDYTITVYAVTDGRNGRLLSIPISINYRTEGSGC 經修飾 Ser尾（SEQ ID NO: 71)
EGSGS 經修飾 Cys尾（SEQ ID NO·· 72)
EGSGC 實例 現參考以下實例來描述本發明，該等實例僅具例示性， 且不欲限制本發明。雖然已詳細且參考本發明之特定實施 例來描述本發明，但對熟習此項技術者將顯而易見，在不 偏離本發明之精神及範疇的情況下可進行各種變化及修 改。 實例1.包括若干V/I以10Fn3為主之結合子的多償鐵維連接 蛋白架構域蛋白質。 產生多價纖維連接蛋白架構域蛋白質之各種構築體。下 表描繪本文所述之構築體及其SEQ ID NO。 構築tt 描述 SEQ ID NO: 385A08-Fn-V2B 具有結構(SEQ ID NO: 37)-(SEQ ID NO: 20)-(SEQ ID NO: 43)之二價I/V構築體 8 385A08-Fn-V2B-Cys 具有結構(SEQ ID NO: 37)-(SEQ ID NO: 20)-(SEQ ID NO: 44)之二價I/V構築體 9 385A08-GS5(SEQ ID NO: 21)-V2B 具有結構(SEQ ID NO: 37)-(SEQ ID NO: 21)-(SEQ ID NO: 43)之二價I/V構築體 10 385A08-GS10(SEQ ID NO: 22)-V2B 具有結構(SEQ ID NO: 37)-(SEQ ID NO: 22)-(SEQ ID NO: 43)之二價I/V構築體 11 V2B-Fn-385A08 具有結構(SEQ ID NO: 42)-(SEQ ID NO: 20)- (SEQ ID NO·· 38)之二價V/I構築體 12 V2B-Fn-385A08-Cys 具有結構(SEQ ID NO: 42)-(SEQ Π) NO: 20)-(SEQ ID NO·· 39)之二價 V/I構築體 13 V2B-GS5(SEQ ID NO: 21)-385A08 具有結構(SEQ ID NO: 42)-(SEQ ID NO: 21). (SEQ ID NO: 38)之二價V/I構築體 14 V2B-GS10(SEQ ID NO: 22)-385A08 具有結構(SEQ ID NO: 42)-(SEQ ID NO: 22)- (SEQ ID NO: 38)之二價 V/I構築體 15 140513.doc • 82- 201000118
構築tt 描述 SEQ ID NO: 385A08-GPG(SEQ ID NO: 32)-V2B 具有結構(SEQ ID NO: 36)-(SEQ ID NO: 32)-(SEQ ID NO: 41)之二價I/V構築體 29 385A08- GPGPGPG(SEQ ID NO: 33)-V2B 具有結構(SEQ ID NO: 36)-(SEQ ID NO: 33)-(SEQ ID NO: 41)之二價I/V構築體 30 385A08- GPGPGPGPGPG(SEQ ID NO: 34)-V2B 具有結構(SEQ ID NO: 36)-(SEQ ID NO: 34)-(SEQ ID NO: 41)之二價I/V構築體 31 V2BShort 具有V2B核心以及N末端之Gly及Cys尾的 VEGFR2結合子；結構為Gly-(SEQ ID NO: 40)-(SE〇IDNO: 18) 28 Peg-V2Bshort 在位置93處經聚乙二醇化之V2B Short 28 V2B(Ser 尾） 莫有V2B核心以及完整N-末端延伸及Ser尾的 VEGFR2結合子；結構為(SEQIDNO:45)-(SEQ ID NO: 40)-(SEQ ID NO: 17) 16 AT577 具有385A08核心以及完整N-末端延伸及Ser尾 的IGF-IR結合子；結構為(8丑(5 10 1^0:45)-(SEQ ID NO: 35)-(SEQ ID NO: 17) 26 AT580 *有385A〇8核心以及完整N-末端延伸及Cys尾 的IGF-IR結合子；結構為(3丑(^10>10:45)-(SE〇 ID NO: 35)-(SEQ ID NO: 18) 27 AT580-PEG40 在位置98處經40 kDa PEG聚乙二醇化的AT580 27 AT580-PEG20-AT580 具有兩個經由20 kDa PEG分子在各分子之位 置98處連接之AT580分子的二價I/Ι構築體 27 385A08核心 3 85A08為例示性IGF-IR結合子 35 具有385A08核心以及完整N-末端延伸的IGF-IR結合子；結構為(SEQ ID NO: 35)-(SEQ ID NO: 45) 36 具有385A08核心以及完整N-末端延伸及Short 尾的IGFR-IR結合子；結構為(SEQ ID NO: 45)-(SE〇 ID NO: 35)-(SE〇 ID NO: 19) 37 具有385A08核心以及N-末端延伸及Ser尾的 IGFR-IR結合子；結構為(8£〇1〇]^0:46)-(SEQ ID NO: 35)-(SEQ ID NO: 17) 38 具有3 85A08核心以及N-末端延伸及Ser尾的 IGFR-IR結合子；結構為(8£(^!〇]^0:46)-(SE〇 ID NO: 35)-(SEQ ID NO: m 39 V2B核心 V2B為例示性VEGFR2結合子 40 具有V2B核心以及N-末端延伸的VEGFR2結合 子；結構為(SEQ ID NO: 46)-(SEQ ID NO: 40Ί 41 具有V2B核心以及完整N-末端延伸及Short尾 的VEGFR2結合子；結構為(SEQIDNO:45)-(SE〇 ID NO: 40)-(SE〇 ID NO: 19^ ~42 具有V2B核心以及完整N-末端延伸及Ser尾的 VEGFR2結合子；結構為(3丑(5 1〇>}〇:45)-(SE〇 ID NO: 40)-(SEQ ID NO: m 43 140513.doc •83- 201000118 構築tt 描述 SEQ ID NO: 具有V2B核心以及完整N-末端延伸及Cys尾的 VEGFR2結合子；結構為(SEQIDNO:45)-(SEQ ID NO: 40)-(SEQ ID NO： 18) 44 385A08-Fn-V2B(經修 飾Ser尾） 具有結構(8£(51〇^^〇:36)-£-(8£(^1〇1^〇:20)-(SEQ ID NO: 41)-(SEQ Π) NO: 71)之二價I/V構 築體 63 385A08-Fn-V2B(經修 飾Cys尾） 具有結構(8£〇10从)：36)玉-(8£(^101^0:20)-(SEQ ID NO: 41)-(SEQ ID NO: 72)之二價I/V構 築體 64 385A08-PA3(SEQ ID NO: 60)-V2B(經修飾 Ser 尾） 具有結構(8£(31〇1'1〇:36)疋-(8£()1〇^[〇:60)-(SEQ ID NO: 41)-(SEQ ID NO: 71)之二價I/V構 築體 65 385A08-PA3(SEQ ID NO: 60)-V2B(經修飾 Cys 尾） 具有結構(8丑卩1〇>^〇:36)疋-(8£(51〇]^〇:60)-(SEQ ID NO: 41)-(SEQ ID NO: 72)之二價I/V構 築體 66 385A08-PA6(SEQ ID NO: 61)-V2B(經修飾 Ser 尾） 具有結構(SEQIDNO:36)-E-(SEQIDNO:61)-(SEQ ID NO: 41)-(SEQ ID NO: 71)之二價I/V構 築體 67 385A08-PA6(SEQ ID NO: 61)-V2B(經修飾 Cys 尾） 具有結構(3£(^10从)：36)-£-(3丑(310从)：61)· (SEQ ID NO: 41)-(SEQ ID NO: 72)之二價I/V構 築體 68 385A08-PA9(SEQ ID NO: 62)-V2B(經修飾 Ser 尾） 具有結構(8£(^10^[0:36)-£-(8£(5101^0:62)-(SEQ ID NO: 41)-(SEQ ID NO: 71)之二價I/V構 築體 69 385A08-PA9(SEQ ID NO: 62)-V2B(經修飾 Cys 尾） 具有結構(3丑<3101^0:36)-£-(8£(5101^0:62)-(SEQ ID NO: 41)-(SEQ ID NO·· 72)之二價I/V構 築體 70 385A08為一例示性iGF-IR結合子。V2B為一例示性 VEGFR2結合子。兩個域藉由以甘胺酸-絲胺酸為主之連接 子（例如，GS5，SEQ ID NO: 21 ;及 GS10，SEQ ID NO: 22)或連接第一人類ρη3域與第二人類Fn3域之經修飾胺基 酸序列（SEQ ID NO: 20)連接。此等V/I以1GFn3為主之結合 子可以不同方式取向-例如，V2B域在N-末端或IGF-IR域在 N-末端。Peg-V2Bshort為缺乏V2B之以纖維連接蛋白為主 之架構域的前8個胺基酸的構築體且在其單個半胱胺酸殘 基經聚乙二醇化。AT577為具有SEQ ID NO: 17之C-末端尾 140513.doc • 84- 201000118 的IGF-IR結合子。AT580為具有SEQ ID NO: 18之C-末端尾 的IGF-IR結合子。特定言之，AT580由SEQ ID NO: 27表 示。AT580-Peg20-AT580為經由具有PEG鍵聯之單個半胱 胺酸殘基連接之兩個IGF-IR結合子。AT580-PEG40為經40 KD peg連接之IGF-IR結合子（SEQ ID NO·· 27)。以下實驗中 所用之多價構築體一般含有C-末端His6標籤（SEQ ID NO: 59) ° 實例2· V/I以1GFn3為主之結合子的表現 ® 如下文材料與方法部分中所述，使用高產量蛋白質產生 方法（HTPP)純化某些V/I以1GFn3為主之結合子。圖1描繪來 自若干V/I以1GFn3為主之結合子的一例示性SDS-PAGE分 析，包括由Fn連接子、GS5連接子（SEQ ID NO: 21)及GS10 連接子（SEQ ID NO: 22)連接之彼等結合子。圖1顯示所測 試之多個構築體的可接受之表現量。此外，亦使用涵蓋不 可溶結合子之純化的中等規模純化方法來純化選擇純系。 φ 亦可使用替代性方法，其涵蓋可溶性結合子之純化。在下 文材料與方法部分中描述此等中等規模純化方法。亦使用 在下文材料與方法部分中描述的大規模純化方法來純化一 些特定純系。 實例3. V/I以10Fn3為主之結合子的生物物理學表徵 對某些經HTPP、中等規模及大規模純化之V/I以1GFn3為 主之結合子執行標準尺寸排阻層析（SEC)。亦對某些自中 等規模及大規模方法純化之此等構築體執行質譜分析（LC-MS)及差示掃描熱量測定（DSC)分析。在下文材料與方法 140513.doc -85 - 201000118 部分中描述此等分析方法中之每一者。 經HTPP純化之構築體的SEC結果視串聯内385A08(IGF-IR域）或V2B(VEGFR-2域）次單元之取向而變化。如圖2中 所示，在385A08次單元位於N-末端側的情況下（亦即，具 有his標籤之385A08-Fn-V2B)，SEC展示主要為單體蛋白質 (與球狀分子量標準對比，在23 kDa範圍中溶離）。另一方 面，如圖3中所示，當V2B次單元位於N-末端侧時（亦即， 具有 his標籤之V2B-Fn-385A08，SEQ ID NO: 8)，此舉產 生單體（23 kDa)與二聚體（與球狀分子量標準對比，46 kDa)之混合物。對使用GS5(SEQ ID NO: 21)或GS10連接子 (SEQ ID NO: 22)替代Fn連接子之構築體進行的SEC分析展 示類似結果，視385 A08及V2B次單元之取向而定。 亦評估經中等規模純化之構築體385A08-Fn-V2B(SEQ ID NO: 8)及 385A08-Fn-V2B-cys(SEQ ID NO: 9)之 SEC。對 於經中等規模純化之構築體385A08-Fn-V2B(其具有his標 籤且包括天然存在於C-末端之絲胺酸）而言，SEC概況主要 為單體，其中以球狀分子量標準計大致在23 kDa之範圍中 溶離。然而，對於此構築體之半胱胺酸型式（具有his標籤 之385A08-Fn-V2B-cys)而言，SEC顯示單體與二聚體蛋白 質之混合物。應注意半胱胺酸型式通常出於聚乙二醇化之 目的而產生。對於可溶表現且經純化之385A08-Fn-VB2(具 有his標籤）及以不可溶形式表現且再摺疊之物質，觀測到 同等結果。 由LC-MS對所選中等規模構築體進行進一步分析。由 140513.doc -86- 201000118 LC-MS所量測385A08-Fn-V2B(具有his標籤）之分子量為 23,260道爾頓，其與由串聯之胺基酸組成計算之「desMet 形式」（第一曱硫胺酸經裂解掉之串聯型式）的分子量相匹 配。由LC-MS所量測385A08-Fn-V2B-Cys(具有his標籤）之 分子量為23,581道爾頓，其比基於串聯之胺基酸組成的理 論計算分子量多174道爾頓，指示很可能Cys殘基經轉譯後 修飾。此外，385A08-GS10(SEQ ID NO: 22)-V2B(具有 his 標籤，SEQ ID NO: 11)之LC-MS為24,040，與此構築體之 理論分子量相匹配。參見圖4。 此外，對兩個經中等規模純化之構築體執行差示掃描熱 量測定（DSC)分析。於50 mM NaOAc、150 mM NaCl(pH 4.5)中的385A08-Fn-V2B(具有his標籤）之實驗測定Tm等於 51.49°C。於 50 mM NaOAc、150 mM NaCl(pH 4.5)中的 385A08-Fn-V2B-Cys(具有 his標籤）之 DSC展示 46.77°C 及 55.52°C之兩個轉變狀態，此有可能歸因於由於兩個串聯之 間形成雙硫鍵而導致存在二聚體（參見圖4)。 亦對經大規模純化之聚乙二醇化385A08-Fn-V2B-cys(無 his標籤，SEQ ID NO: 9)執行SEC。如圖5中所示，此構築 體之SEC顯示物質中95.1%為單體。此外，對此相同構築 體進行之DSC分析顯示其在56°C之溫度下展開一半（參見圖 6)，而在至多45°C下未偵側到展開。 實例4.聚乙二醇化對以纖維連接蛋白為主之多價蛋白質 的影響 以纖維連接蛋白為主之架構蛋白質可根據下文所述之方 140513.doc -87 - 201000118 法聚乙二醇化。可使用各種類型之PEG(諸如，線性或分枝 PEG)及各種尺寸peg。詳言之，將構築體385八〇81?11_乂26_ Cys(SEQ ID NO: 9)之中等規模及大規模純化型式用4〇 kD 線性及40 kD分枝PEG聚乙二醇化。 在小鼠中歷經120小時時期進行藥物濃度分析揭示具有 分枝PEG之經his標記385A08_Fn_V2B_Cys顯示14 6小時之 半衰期，而此構築體（具有his標籤）之線性聚乙二醇化型式 顯示10.5小時之半衰期（圖7)。下文材料與方法部分中描述 給藥時程及半衰期計算的詳情。此處及該文件之其餘部分 中所報導之黏附素之所有濃度均基於該蛋白質而非化合物 之PEG部分。 實例5.對以織維連接蛋白為主之多價蛋白質使用表面電 漿共振（BIAcore)分析來測定結合親和力 使用如下文材料與方法部分中所述之表面電漿共振，評 估所選經HTPP純化之以纖維連接蛋白為主之架構蛋白質 (包括若干V/I以10Fn3為主之結合子）對iGF_ir的動力學行 為。此等純系之解離常數反0展示於圖8之第一欄中。 亦評估串聯構築體385A08-Fn-V2B(未聚乙二醇化、經 his標記之型式，SEq ID N〇: 8)之中等規模純化的濃度系 列。如下文材料與方法部分中所述，評估此構築體之各域 (尤其V2B域及IGF-IR域）之功能。關於V2B域，385A08· FH-V2B對於VEGFR2-FC之KD為約0.3 nM，其中平均結合 速率為1.4x106 M·1 sec·1，平均解離速率為45><1〇-4 sec-i。 關於 IGF-IR 域，385A08-Fn-V2B 對於 IGF-IR-Fc 之 KD 為約 20 H0513.doc -88· 201000118 pM，其中結合速率為Ι.ΙχΙίΓΜ'βςΓ1且解離速率為 1.7x10-Sec'V為 1)。 亦收集串聯 385A08-GS10(SEQ ID NO: 22)-V2B(SEQ ID NO: 11)及 V2B-GS10(SEQ ID NO: 22)-385A08(SEQ ID NO: 15)之經中等規模純化物質的資料。兩個構築體均包括his 標籤。IGF-IR域之KD分別為40 pM及50 pM。V2B域之KD 分別為0.5 nM及0.6 nM。收集構築體385A08-Fn-V2B-cys(SEQ ID NO: 9)之線性聚乙二醇化經his標記之中等規 模純化型式的其他資料。IGF-IR域之KD為1.2 nM。V2B域 之KD為14nM。此等資料展示於圖9中。 亦自中等規模及大規模物質，量測串聯構築體385入08-Fn-V2B-cys(SEQ ID NO: 9，具有及無his標籤）之聚乙二醇 化型式的親和力資料。用於此等計算之特定材料及方法在 下文中描述。結果展示所測試之各種構築體以3.15E+05 M-1s-1+/- 0.94E+05 ΜΛ·1 之平均結合速率及 2.47E-04 s-1+/-0.18E-04s_1之平均解離速率結合IGFIR-Fc。對於VEGFR2-Fc而言，所量測之平均結合速率為1.15E+04 Μ·、·、/-0.62Ε+04 Μ、·1，且解離速率為 1.02Ε-04 s-1+/- 0.21Ε-04 s·1。 此等資料展示於圖10中。使用此實驗格式得到的VEGFR2 及IGF1R之平均計算親和力分別為10.5±0.48 nM及 0.84±0·22 nM ° 實例6·鼓爭性IGF1R及妩爭性VEGFR-2阻断檢定 評估某些串聯構築體活體外與單特異性IGF-IR及 VEGFR-2結合子競爭的能力。詳言之，展示構築體 140513.doc -89- 201000118 385A08-Fn-V2B-cys(SEQ ID NO: 9)之經聚乙二醇化經his 標記型式破壞單特異性IGF-IR以1GFn3為主之結合子 (AT580-PEG40 ’ SEQ ID NO: 27)與細胞表面 IGF-IR的相互 作用。使用過度表現IGF-IR之細胞株R+，展示對於經聚乙 二醇化經1^標記3 85八08-?11-¥28-〇73而言，阻斷以1(^113為 主之高親和力二價IGF1R結合子（AT580-PEG20-AT580， SEQ ID NO: 27)之相互作用的IC50為900 nM，而對於 AT5 80-PEG40而言其為600 nM。此表明經聚乙二醇化經his 標記 385A08-Fn-V2B-cys 具有類似於 AT580-PEG40 的 IGF-IR親和力。圖11顯示此資料。 類似地’經聚乙二醇化經his標記構築體385A08-Fn-V2B-cys能夠阻斷以1QFn3為主之單特異性VEGFR-2結合子 (Peg-V2Bshort，SEQ ID NO: 28)與存在於 293:KDR 細胞上 之VEGFR-2的相互作用。來自293 :KDR檢定之結果顯示對 於經聚乙二醇化經his標記構築體385A08-Fn-V2B-cys而 言 ’ IC5〇 為約 140 nM ’ 而 Peg-V2Bshort 之 IC50 為約 20 nM(參見圖12)。Peg-V2Bshort與經聚乙二醇化經his標記構 築體385A08-Fn-V2B-cys之間的7倍活性差異與385A08-Fn-V2B-cys之VEGFR-2結合部分對於VEGFR-2相比於Peg-V2Bshort具有低約5倍之親和力的事實一致，詳言之，在 Ba/F3檢定（下文所述）中’單體、未聚乙二醇化VEGFR2結 合子 V2Bshort(SEQ ID NO: 28)之 IC5〇為約 0.1-3 nM，而具 有SEQ ID NO: 44之單體、未聚乙二醇化VEGFR2結合子 (例如，具有N-末端延伸）的ic50為約8-13 nM。因此，串聯 140513.doc •90- 201000118 構築體中所包括之VEGFR2結合子的型式（例如，具有包括 N-末端延伸之SEQ ID NO: 44)對於VEGFR2相比於此檢定 中所用之單體VEGFR2結合子（例如，具有SEQ ID NO: 28) 低約5倍之親和力。下文材料與方法部分中詳細描述基於 R+與293:KDR細胞之競爭性阻斷檢定。 實例7.活髖外增殖檢定 在基於Ba/F3及Rh41細胞之檢定中評估某些經純化構築 體（包括若干V/I以1GFn3為主之結合子）以證實活性。圖8中 描繪IC5〇(第2欄、第3欄）。此外，在Rh41及HMVEC-L增殖 檢定（亦描述於下文材料與方法部分中）中評估某些經純化 構築體。將此等構築體與針對IGF1R之單特異性抗體 (MAB391)、針對VEGF之單特異性抗體（貝伐單抗）、另一 以10Fn3為主之單特異性IGF1R結合子（AT-577，SEQ ID NO: 26)、以1GFn3為主之單特異性VEGFR-2結合子（卩6§-V2Bshort，SEQ ID NO: 28)及不結合目標的野生型以丨0Fn3 為主之蛋白質（SGE)相比較。資料顯示串聯取向（例如，無 論I部分抑或V部分位於N-末端）與連接子之選擇皆不影響 結果。此資料概述於圖13中。此外，執行Ba/F3及NCI-H929細胞增殖檢定以比較聚乙二酵化構築體385A08-Fn-V2B-Cys(SEQ ID NO: 9)之某些his標籤與無his標籤型式。 將此等構築體與MAB391、以1GFn3為主之單特異性IGF-IR 結合子 AT580-PEG40(SEQ ID NO: 27)及以 i〇Fn3 為主之單 特異性 VEGFR2 結合子 Peg-V2Bshort(SEQ ID NO: 28)相比 較。此等資料概述於圖14中。 140513.doc •91· 201000118 實例8.在基於細胞之檢定中以讖維連接蛋白為主之多償 蛋白質之活化及信號傳輸活性 篩檢所選V/I以1GFn3為主之結合子直接干擾配位體刺激 之VEGFR2及IGF-IR活化及下游MAP激酶信號傳輸的能 力。將HEK/293細胞及豬主動脈内皮（PAE)細胞以VEGFR2 轉染。以VEGF刺激誘發兩種細胞類型中之VEGFR磷酸化 及下游信號傳輸。以IGF 1刺激誘發兩種細胞類型中之IGF-IR磷酸化及下游信號傳輸，參見圖15。關於PAE及 HEK/293檢定之其体詳情在下文材料與方法部分中進行討 論。 圖16描繪各種多價蛋白質對HEK/293細胞之作用。包含 結合IGF-IR之纖維連接蛋白架構域的所有多價蛋白質均使 磷酸化IGF-IR含量降至與單一結合IGF-IR之纖維連接蛋白 架構域蛋白質（AT577)相比類似之含量。包含結合VEGFR2 之纖維連接蛋白架構域的所有多價蛋白質均使磷酸化 VEGFR含量降至與單一結合VEGFR2之纖維連接蛋白架構 域蛋白質（Peg-V2Bshort)相比類似之含量。在暴露於各種 構築體後藉由[3H]-胸苷併入法評估細胞增殖。 圖17描繪各種多價蛋白質對PAE細胞之作用。包含結合 IGF-IR之纖維連接蛋白架構域的所有多價蛋白質均使磷酸 化IGF-IR含量降至與單一結合IGF-IR之纖維連接蛋白架構 域蛋白質（AT577)相比類似之含量。包含結合VEGFR2之纖 維連接蛋白架構域的所有多價蛋白質均使磷酸化VEGFR含 量降至與單一結合VEGFR2之纖維連接蛋白架構域蛋白質 140513.doc -92- 201000118 (Peg-V2Bshort)相比類似之含量。在暴露於各種構築體後 藉由[3H]-胸苷併入法評估細胞增殖。 此等結果證明例示性多肽連接子能夠以使纖維連接蛋白 架構域與配位體結合的取向連接纖維連接蛋白架構域，且 因此保留其抑制受體信號傳輸之能力。 在來自肺之初級人類微血管内皮細胞（HMVEC-L)中進行 關於特定種類之串聯構築體385A08-Fn-V2B-cys(SEQ ID NO: 9，具有及無PEG ;具有及無his標籤）的其他研究。在 HMVEC-L中進行量測以下之檢定：細胞增殖、對配位體 誘導之VEGFR-2及IGF-1R活性的抑制（經由西方墨點分 析）、内皮細胞中細胞内辦之動員（Ca2 +通量）及抑制初生毛 細血管樣結構（稱為管）形成的能力。經由西方墨點分析量 測對配位體誘導之VEGFR-2及IGF-1R活性之抑制的另一研 究亦在Rh41細胞中進行。在下文材料與方法部分中進一步 詳細地描述此等檢定中之每一者。 來自細胞增殖檢定之結果展示特定種類之385A08-Fn-V2B-cys構築體以介於90 nM與167 nM之間的範圍内之IC50 抑制HMVEC-L細胞之增殖（參見圖18)。在一實例中，此構 築體之經聚乙二醇化、無his標籤型式以約167 nM之IC50抑 制HMVEC-L細胞之增殖，而以1GFn3為主之單特異性 VEGFR-2結合子（Peg-V2Bshort，SEQ ID NO: 28)具有約 47 nM之 IC50。 為評估 385A08-Fn-V2B-cys構築體抑制 IGF-1R及 VEGFR-2之能力，進行西方墨點分析以藉由在測試化合物存在或 140513.doc -93 - 201000118 不存在情況下的自體磷酸化來量測HMVEC-L細胞中配位 體誘導之VEGFR-2及IGF-1R活性的活性。合適對照包括以 10Fn3為主之單特異性VEGFR-2結合子（Peg-V2Bshort，SEQ ID NO: 28)及以1GFn3為主之單特異性IGF-IR結合子 (AT580-PEG40，SEQ ID NO·· 27)。該等構築體一般抑制 pVEGFR-2(pVEGFR-2 為構酸化 VEGFR-2 ;亦稱為 p-Flk-1)、pIGF-lR及 ρΑΚΤ活性（參見圖 19)。385A08-Fn-V2B-cys 構築體之經聚乙二醇化、無his標籤型式顯示以始於10 nM 之劑量反應抑制pVEGFR-2活性，其中在100 nM下實現近 乎完全抑制。如與抑制之IC5〇為100 nM的AT580-PEG40相 比，此同一化合物亦在1 nM與10 nM之間有效地抑制pIGF-1R活性。 為評估特定種類之385A08-Fn-V2B-cys構築體抑制IGF-1R驅動之腫瘤細胞株中IGF-1R之能力，進行西方墨點分析 以藉由在測試化合物存在或不存在情況下的自體磷酸化來 量測Rh41細胞中配位體誘導之IGF-1R活性的活性。一般對 100 nM劑量下之所有385A08-Fn-V2B-cys構築體均觀測到 pIGF_lR活性之抑制。對所測試之所有385A08-Fn-V2B-cys 構築體均觀測到不同程度之ρΑΚΤ抑制。在一實例中， 385A08-Fn-V2B-cys構築體之經聚乙二醇化、無his標籤型 式顯示以約1-10 nM範圍内的劑量反應開始對pIGF-lR活性 產生抑制，且在1 00 nM下抑制近乎完全。此等資料概述於 圖20中。 因為VEGF刺激内皮細胞中細胞内鈣之動員（如Ku, D.D. 140513.doc • 94- 201000118 等人，Vascular endothelial growth factor induces EDRF-dependent relaxation in coronary arteries. Am J Physiol, 1993. 265(2 Pt 2):第 H586-92 頁中所述），所以對 VEGFR-2 抑制劑而言抑制鈣釋放（Ca2+)的能力為基於細胞之信號傳 輸的另一量測。在量測HMVEC-L細胞中鈣釋放之檢定 中，特定種類之385A08_Fn-V2B-cys構築體顯示以4-10 nM 之IC5Q抑制Ca2+釋放。對於以1GFn3為主之單特異性 VEGFR-2結合子（Peg-V2Bshort，SEQ ID NO: 28)而言，顯 示類似程度之抑制。此研究結果概述於圖21中。 實例9.關於以纖維連接蛋白為主之多價蛋白質的腫瘤異 種移植功效研究 在使用RH-41人類橫紋肌肉瘤模型、A549人類肺模型、 GEO結腸腫瘤異種移植模型及A673尤文氏肉瘤（Ewing Sarcoma)異種移植腫瘤模型之多個腫瘤研究中評估構築體 385A08-Fn-V2B-Cys之經聚乙二醇化經his標記型式。選擇 RH-41及A673用於關於385A08-Fn-V2B-Cys之活體内測 試，因為兩種模型先前已展示對IGF-1R抑制之敏感性。選 擇對IGF1R抑制不同樣敏感的A549及GEO來比較如與單體 VEGFR2抑制劑 PEG-V2B-short(SEQ ID NO: 28，其中 PEG 連接於單個半胱胺酸殘基）相比較多價構築體抑制VEGFR2 之效能。在下文材料與方法部分中更詳細地描述此等模 型。 RH-41腫瘤異種移植模型已顯示對IGF-IR抑制敏感。使 用100 mg/kg之單一劑量含量，以3χ週之時程投與經聚乙 140513.doc -95· 201000118 二醇化經his標記385A08-Fn-V2B-Cys。如圖22部分A中所 說明，當使用此方案給藥3週時，經聚乙二醇化經his標記 385A08-Fn-V2B-Cys有效誘發腫瘤生長延遲。當與對 IGFR-1及VEGFR-2應產生相當化學計量之目標結合的以 10Fn3為主之單特異性VEGFR-2結合子（Peg-V2Bshort，SEQ ID NO: 28)與以1QFn3為主之單特異性IGF-IR結合子 (AT580-PEG40，SEQ ID NO: 27)的組合相比較時，經聚乙 二醇化經his標記385A08-Fn-V2B-Cys產生類似抗腫瘤活 性。此外，基於腫瘤生長抑制百分比（％ TGI)，使用多價 構築體所達成之抗腫瘤活性優於當個別地給與此等藥劑時 所觀測到之抗腫瘤活性。對此等藥劑中之任一者未觀測到 如由發病率、行為變化或顯著體重減輕（例如，>5%)所定 義之明顯毒性。如圖22部分B中所概述，所有此等藥劑有 效產生>50% TGI，然而，AT580-PEG40、Peg-V2Bshort之 組合以及單獨經聚乙二醇化經his標記385A08-Fn-V2B-Cys 兩者在與各單獨藥劑相比較時均引起％ TGI增加。 385A08-Fn-V2B-cys(具有Peg)構築體以比其結合小鼠 IGF1R之親和力高得多的親和力結合人類IGF1R。詳言 之，385A08-Fn-V2B-cys(具有 Peg)以 277 pM 之 Kd 結合人類 IGF1R，以 213 pM 之 Kd 結合猴 IGF1R，以 92,000 pM 之 Kd 結合大鼠IGF1R，且以86,000 pM之Kd結合小鼠IGF1R。用 於此研究中之腫瘤異種移植模型包含呈現人類IGF 1R之人 類腫瘤且亦包含表現小鼠IGF1R之小鼠内皮細胞。因為 385A08-Fn-V2B-cys(具有Peg)對小鼠IGF1R之結合親和力 140513.doc -96· 201000118 比對人類IGF 1R之結合親和力低得多，所以此模型中所見 之作用可能低估385A08-Fn-V2B-cys(具有Peg)對腫瘤抑制 之作用。詳言之，若對表現於内皮細胞上之IGF 1R的結合 親和力較高，則腫瘤生長抑制可更為顯著。 在使用RH-41腫瘤異種移植模型之第二研究中，在包括 5 0 mg/kg、100 mg/kg及200 mg/kg之若干劑量含量範圍内 評估經聚乙二醇化經his標記385A08-Fn-V2B-Cys。亦將此 等含量與個別靶向單特異性結合子（例如，以1GFn3為主之 單特異性VEGFR-2結合子（Peg-V2Bshort，SEQ ID NO: 28) 及以1GFn3為主之單特異性IGF-IR結合子（AT580-PEG40， SEQ ID NO·· 27))中之每一者的組合等效API(活性醫藥成 份）劑量含量相比較。圖23中說明此研究之結果，其中出 於清楚之目的，將經聚乙二醇化經his標記385A08-Fn-V2B-Cys的各劑量含量與個別AT580-PEG40與Peg-V2B short之相應組合劑量含量相比較個別地展示。有利地 將AT5 80-PEG40與Peg-V2Bshort之組合與聚乙二醇化經his 標記385A08-Fn-V2B-Cys相比較，產生類似％ TGI。此 外，所有劑量含量之經聚乙二醇化經his標記385A08-Fn-V2B-Cys產生類似抗腫瘤活性（如圖23部分D中所說明），其 在75-83% TGI範圍内。因此，需要在較低劑量含量之經聚 乙二醇化經his標記385A08-Fn-V2B-Cys下進一步滴定以產 生明確抗腫瘤劑量反應曲線且測定此腫瘤模型中的最小有 效劑量含量。 亦在A549腫瘤模型中評估經聚乙二醇化經his標記 140513.doc -97- 201000118 385A08-Fn-V2B-Cys之抗腫瘤活性，與以10Fn3為主之單特 異性 VEGFR-2結合子（Peg-V2Bshort，SEQ ID NO: 28)及以 10Fn3為主之單特異性IGF-IR結合子（AT580-PEG40，SEQ ID NO: 27)以及用此兩個單特異性結合子之組合治療相比 較（參見圖24)。假定在所測試之兩個劑量含量下缺乏對 AT5 80-PEG40的抗腫瘤反應（圖26部分A及C)且基於小於 50% TGI(圖26部分B及D)，此模型似乎對IGF-1R之抑制不 敏感。此外，當與單獨給與在所測試之兩種劑量含量下均 具活性的 Peg-V2Bshort 相比時，AT580-PEG40 與 Peg-V2Bshort之組合未引起抗腫瘤活性增強。使用經聚乙二醇 化經his標記385A08-Fn-V2B-Cys所達成之腫瘤生長抑制程 度與單獨給與Peg-V2Bshort所見之腫瘤生長抑制程度相當 的觀測結果表明，在此模型中觀測到之抗腫瘤活性似乎伴 隨經聚乙二醇化經his標記385A08-Fn-V2B-Cys及Peg-V2Bshort之抗VEGFR-2活性存在。 當在亦似乎對IGF-1R之抑制不敏感的GE〇人類結腸異種 移植模型中評估此等藥劑時，亦獲得相當結果（圖25)。在 此模型中，經聚乙二醇化經his標記385A08-Fn-V2B-Cys在 100 mg/kg下無活性（圖27部分a及B)且以1C)Fn3為主之單特 異性 IGF-IR結合子（AT580-PEG40，SEQ ID NO: 27)在所測 試之兩種劑量含量下均無活性（圖25部分A、B、C及D)。 在200 mg/kg之較高劑量含量下，經聚乙二醇化經his標記 385A08-Fn-V2B-Cys具有活性且顯示基於>50% TGI之抗腫 瘤活性（圖25部分c及D)。類似於使用A549模型產生的觀測 140513.doc -98- 201000118 結果，以1GFn3為主之單特異性VEGFR-2結合子（？6§-V2Bshort，SEQ ID NO: 28)對GEO模型具活性，表明此模 型中使用經聚乙二醇化經his標記385A08-Fn-V2B-Cys所觀 測到之抗腫瘤活性可僅取決於抗VEGFR-2組份且GEO模型 對IGF-IR抑制不敏感。此模型中使用Peg-V2Bshort所觀測 到增強之抗腫瘤活性（如與經聚乙二醇化經his標記385 A08-Fn-V2B-Cys相比較）（在圖25部分A及B中說明）可能反映如 與包括在經聚乙二醇化經his標記385A08-Fn_V2B-Cys構築 體内的VEGFR2結合次單元相比，單體Peg-V2Bshort對 VEGFR-2具有較高結合親和力（參見上文實例6)。 如圖26中所示，在A673尤文氏肉瘤異種移植模型中，經 聚乙二醇化經his標記 3 85A08-Fn-V2B-Cys展示比以1()Fn3為 主之單特異性VEGFR-2結合子（Peg-V2Bshort，SEQ ID NO: 28)稍弱之抗腫瘤活性（分別TGI=72.4%及82%)。此可 能為如與Peg-V2Bshort相比經聚乙二醇化經his標記 385A08-Fn-V2B-Cys之抗VEGFR2域親和力較低（低約4-5 倍）的結果（參見上文實例6)。另一方面，組合組中之抗腫 瘤活性與Peg-V2Bshort之抗腫瘤活性相當（分別TGI=80.2% 及82%)，表明A673尤文氏肉瘤異種移植模型對IGF-IR抑 制不敏感，因為如對投與以1GFn3為主之單特異性IGF-IR結 合子（AT580-PEG40，SEQ ID NCh 27)之反應（TGI=24.7%) 所證明，IGF-IR抑制對總體抗腫瘤活性之貢獻相當小。來 自 100 mg/kg經聚乙二醇化經 his標記 385A08-Fn-V2B-Cys 以及 Peg-V2Bshort 及 Peg-V2Bshort+ AT580-PEG40 之組合的 140513.doc -99- 201000118 抗腫瘤活性與媒義著不同。此外，雖然似乎在研究結束 時（第18天，分別TG卜56.8%及72.4%)針對經聚乙二醇化經 h1S標記385A08-Fn-V2B-Cys所測試之兩個不同劑量（5〇及 100 mg/kg)之間存在劑量反應，但在該兩個劑量之間的差 異未達到統計顯著性（圖26)。 亦在A673尤文氏肉瘤模型中評估經聚乙二醇化經his標 記385A08-Fn-V2B-CyS劑量反應。比較2〇叫/4與2〇〇 mg/kg之間的劑量之抗腫瘤活性；選擇此劑量範圍以使區 分最小有效劑量與最大有效劑量的可能性最大。不同劑量 之經聚乙二醇化經his標記385A08-Fn-V2B-Cys未顯示劑量 依賴性抗腫瘤反應。實際上，20 ' 6〇及1〇〇 mg/kg之劑量 彼此不可區分（分別TGI = 58.3、67.1、63.1)且200 mg/kg具 有最大抑制活性（TGI = 80.5%)。 實例10.關於以鐵維連接蛋白為主之多償蛋白質之PK/PD 研究 小鼠中使用經his標記385A08-Fn-V2B-cys之單劑量藥物 動力學研究 圖27概述小鼠中經his標記385A08-Fn-V2B-cys之藥物動 力學參數。在單次靜脈内給與5或50 mg/kg後，經his標記 3 85A08-Fn-V2B-Cys血清濃度展現略微雙指數衰減。經his 標記 385A08-Fn-V2B-Cys之 CLTp 為 0.11-0.12 mL/min/kg。 Vss((Kl〇-〇.i2 L/kg)大於血漿容量，但低於細胞外液容量 (〇·2 L/kg)。經 his 標記 385A08-Fn-V2B-Cys 之 MRT 及 T1/2 分 別為 15.2-16.8 及 13.0-21.4小時。 140513.doc -100- 201000118 在單次腹膜内給與5或50 mg/kg後，經his標記385A08-Fn-V2B-Cys快速吸收（Tmax=l .4-3.0小時），其中血清濃度-時間曲線與IV給藥後之血清濃度-時間曲線平行。吸收近 乎完全，其中絕對IP生物可用性為83.1-105.8%。在5及50 mg/kg下之平均Cmax分別為1.5及14.4 μΜ。 帶有Rh41腫瘤之裸小鼠中經his標記385A08-Fn-V2B-cys 之單劑量藥物動力學/藥效學研究 在向帶有Rh41腫瘤之裸小鼠腹膜内給與20及200 mg/kg 之經his標記385A08-Fn-V2B-cys後，mVEGF-A含量展示在 血漿中隨劑量及時間而增加（圖28)。使用間接反應PD模 型，藉由阻斷mVEGF-A與VEGFR-2結合而抑制mVEGF-A 自血漿清除的經his標記385A08-Fn-V2B-Cys之血漿IC50經 估算在200 mg/kg下為 13.8 μΜ。在20 mg/kg下，mVEGF-A 濃度之動態範圍可能過低而無法產生PD參數之有意義估算 值。 帶有A673腫瘤之裸小鼠中385A08-Fn-V2B-cys(未經his 標記）之單劑量藥物動力學/藥效學研究 與在帶有Rh41腫瘤之裸小鼠中觀測到之研究結果一致， mVEGF-A含量展示在向帶有A673腫瘤之裸小鼠腹膜内給 與 20及 2〇0 mg/kg之 3 85A〇8-Fn-V2B-Cys(未經 his標記）後在 血漿中隨劑量及時間而增加，圖29。使用間接反應PD模 型，藉由阻斷mVEGF-A與VEGFR-2結合而抑制mVEGF-A 自血漿清除的385A08-Fn-V2B-Cys(未經his標記）之血漿 IC5G 經估算在 200 mg/kg 下為 7.0 μΜ。在 20 mg/kg 下， 140513.doc -101 - 201000118 mVEGF-A濃度之動態範圍可能過低而無法產生PD參數之 有意義估算值。 猴中經his標記385A08-Fn-V2B-Cys之單劑量藥物動力 學/藥效學研究 圖30概述在單次靜脈0給與3或30 mg/kg後猴中經his標 記385A08-Fn-V2B-Cys之藥物動力學參數。經His標記 3 85A08-Fn-V2B-Cys血漿濃度展現在靜脈内給藥後單指數 或雙指數衰減，其中在末期濃度顯著下降。經his標記 3 85A08-Fn-V2B-Cys的血漿濃度下降可能歸因於在該研究 之血漿樣品中偵側到之中和抗體的形成。因此，最後時間 點之血漿濃度不包括在該非隔室分析内。 在狼中’經his標記385A08-Fn-V2B-Cys展現在3 mg/kg 與30 mg/kg之間藥物動力學之微小劑量依賴性。3 mg/kg及 30 mg/kg 下 CLTp 分別為 0.029 mL/min/kg 及 0.023 1111^/111111/1<;§。\^8在 0.05 6至 0.078 1^/1<：8之範圍内，大於血聚 容量。30 mg/kg 下經 his 標記 385A08-Fn-V2B-Cys 之 MRT 及 T1/2分別為57.9小時及42.7小時，稍長於3 mg/kg下觀測到 之MRT及Tl/2(分別為34.5小時及23.2小時）。 進行PK/PD模型化以瞭解經his標記385A08-Fn-V2B-Cys 之血漿濃度與循環hVEGF-A含量升高之間的關係。為擬合 經his標記3 85A08-Fn-V2B-Cys之血漿濃度在末期的下降， PK模型中包括歸因於中和抗體之附加清除機制。擬合及觀 測之PK概況展示於圖31中。藉由阻斷hVEGF-A與VEGFR-2結合而抑制hVEGF-A自血聚清除的經his標記385A08-Fn- 1405I3.doc -102- 201000118 V2B-Cys之血漿IC50經估算在猴中為77-349 nM，其中總體 平均值為228 nM。 猴中385A08-Fn-V2B(未經his標記）之單劑量藥物動力學/ 藥效學研究 圖32概述在在靜脈内給與3 mg/kg以及向同一猴再次給 與相同劑量後猴中385A08-Fn-V2B(未經his標記）之藥物動 力學參數。類似於經his標記385A08-Fn-V2B-Cys，在第一 次給藥後在末期存在385A08-Fn-V2B(未經his標記）之血漿 濃度下降。因此，最後時間點之血漿濃度不包括在該非隔 室分析内。然而，當向同一猴再次給與385A08-Fn-V2B(未 經his標記）時，抗體對385A08-Fn-V2B(未經his標記）之藥 物動力學的作用似乎不顯著（圖32)。此外，在猴中 385A08-Fn-V2B(未經his標記）之藥物動力學與經his標記 385A08-Fn-V2B-Cys相當。 類似於對經his標記385八08-?11-¥26-€73進行之？^：/?〇模 型化，亦進行PK/PD模型化以瞭解385A08-Fn-V2B(未經his 標記）之血漿濃度與循環hVEGF-A含量升高之間的關係。 擬合及觀測之PK概況展示於圖33中。藉由阻斷hVEGF-A 與VEGFR-2結合而抑制hVEGF-A自血漿清除的385A08-Fn-V2B(未經his標記）之血漿IC50經估算在猴中為68-23 1 nM， 其中總體平均值為159 nM。此等結果與在經his標記 3 85A08-Fn-V2B-Cys情況下所觀測到之結果一致。 材料及方法
高產量蛋白質產生（HTPP)。將含有His6標籤（SEQ ID 140513.doc -103- 201000118 NO: 59)之所選結合子選殖至pET9d載體中，轉型至大腸桿 菌HMS174細胞中’接種至於24孔格式中含有50 pg/mL康 黴素（kanamycin)之5 ml LB培養基中，且在37°C下生長隔 夜。藉由自隔夜培養物吸出200 μΐ且將其分配至合適孔 中，製備用於誘導型表現之新鮮5 ml LB培養基（50 pg/mL 康黴素）。使培養物在37°C下生長，直至A6(m為0.6-0.9。在 用1 mM異丙基-β-硫代半乳糖苷（IPTG)誘導後，使培養物 在3 0°C下表現6小時且藉由在4°C下以2,75〇xg離心10分鐘來 收穫。將細胞小球在-80°C下冷凍。 將細胞小球（於24孔格式中）藉由再懸浮於450 μΐ溶解緩 衝液（50 mM NaH2P04、0.5 M NaCl、lxComplete™蛋白酶 抑制劑混合物-不含 EDTA(Roche)、1 mM PMSF、10 mM CHAPS、40 mM咪唑、1 mg/ml溶菌酶、3〇 pg/ml DNAse、
2 pg/ml抑肽酶（aprotonin)，pH 8.0)中來溶解且在室溫下震 盪1 -3小時。將溶胞物淨化且藉由轉移至裴有96孔1.2 mL 捕捉板且藉由正壓過濾之96孔Whatman GF/D Unifilter中 而再置於96孔格式中。將經淨化之溶胞物轉移至已用平衡 緩衝液（50 mM NaH2P〇4、〇_5 M NaCl、40 mM咪唑，pH
8.0) 平衡之96孔鎳螯合盤中，且培育5 min。藉由真空移除 未結合之物質。將樹脂用洗滌緩衝液#1(50 mM NaH2P04、0.5 M NaCl、5 mM CHAPS、40 mM咪唑，pH 8.0) 以2x〇.3毫升/孔洗滌，其中各洗滌液藉由真空移除。 接著將樹脂用PBS以3x0.3毫升/孔洗滌，其中藉由真空移 除各洗滌液步驟。在溶離之前，將各孔以50 μΐ溶離缓衝液 140513.doc -104· 201000118 (PBS+20 mM EDTA)洗滌，培育5 min且藉由真空棄去洗滌 液。藉由再將100 μΐ溶離緩衝液施用於各孔，溶離蛋白 質。在室溫下培育30分鐘後，將培養盤以200 g離心5分 鐘。在含有5 μΐ於溶離之前添加至溶離捕捉板之底部的0.5 M MgCl2之96孔捕捉板中收集經溶離蛋白質。使用BCA檢 定定量所溶離蛋白質，其中SGE作為蛋白質標準。 不可溶型以纖維連接蛋白為主之架構蛋白質結合子的中 等規模表現及純化。出於表現目的，相繼將所選純系及 His6標籤（SEQ ID NO: 59)選殖至 pET9d(EMD Biosciences, San Diego, CA)載體中且在大腸桿菌HMS174(DE3)細胞中 表現。使用20 ml接種培養物（由單個塗鋪菌落產生）來接種 含有50 pg/mL康黴素之1公升LB培養基。使培養物在37°C 下生長，直至A600為0.6-1.0。在用1 mM異丙基-β-硫代半 乳糖苷（IPTG)誘導後，使培養物在30°C下生長6小時且藉 由在4°C下以21〇,〇〇〇 g離心30分鐘來收穫。將細胞小球於 -80°C下冷象。使用Ultra-turrax勻化器（IKA works)於冰上 將細胞小球再懸浮於25 mL溶解緩衝液（20 mM NaH2P04、 0.5 M NaCl、1 xComplete™蛋白酶抑制劑混合物-不含 EDTA(Roche)、1 mM PMSF，pH 7.4)中。使用 M-110S型微 射流儀（Microfluidics)藉由高壓勻化（218,000 psi)實現細胞 溶解。藉由在4°C下以23,30〇xg離心30分鐘，分離不可溶 部份。將自溶胞物之離心回收之不可溶離心塊以20 mM磷 酸鈉/500 mM NaCl(pH 7.4)洗滌。使用超音波處理將離心 塊再溶解於20 mM磷酸鈉/500 mM NaCl(pH 7.4)中之6.0 Μ 140513.doc -105- 201000118 鹽酸胍中，接著在37°C下培育1-2小時。將再溶解之離心 塊過遽至0.45 μιη，且負載於以20 mM填酸納/500 mM NaCl/6.0M胍（pH7.4)緩衝液平衡之HisTrap管柱上。負載 後，用20管柱體積（CV)之平衡緩衝液洗滌管柱至基線UV A280吸光度，接著再用25 CV相同緩衝液洗滌。將結合蛋 白質以於20 mM磷酸鈉/500 mM NaCl/6.0 Μ鹽酸胍（pH 7.4) 中之500 mM咪0坐溶離。藉由以50 mM乙酸納/150 mM NaCl(pH 4.5)透析，使經純化蛋白質再摺疊。 可溶型以纖維連接蛋白為主之架構蛋白質結合子的中等 規模表現及純化。作為不可溶結合子之純化的替代形式， 亦可使用可溶結合子之純化。出於表現目的，相繼將所選 純系及 His6 標蕺（SEQ ID NO: 59)選殖至 pET9d(EMD Biosciences, San Diego, CA)載體中且在大腸桿菌 HMS174(DE3)細胞中表現。使用20 ml接種培養物（由單個 塗鋪菌落產生）來接種含有50 pg/mL康黴素之1公升LB培養 基。使培養物在37°C下生長，直至A60〇為0.6-1.0。在用1 mM異丙基-β-硫代半乳糖苷（IPTG)誘導後，使培養物在 30°C下生長6小時且藉由在4°C下以2l〇,〇〇〇xg離心30分鐘來 收穫。將細胞小球於- 80°C下冷柬。使用Ultra-turrax勻化 器（ΙΚΛ works)於冰上將細胞小球再懸浮於25 mL·溶解緩衝 液（20 mM NaH2P04、0.5 M NaCM、1><(：〇111?16161^蛋白酶抑 制劑混合物-不含 EDTA(Roche)、1 mM PMSF，pH 7·4) 中。使用M-110S型微射流儀（Microfluidics)藉由高壓勻化 (218,000 psi)實現細胞溶解。 140513.doc -106- 201000118 藉由在4°C下以23，300 g離心30分鐘，分離可溶部份。經 由0.45 μιη過濾器淨化上清液。將經淨化溶胞物負載於經 20 mM NaH2P04、〇·5 M NaCl(pH 7.4)預先平衡之 HisTrap 管柱（GE)上。接著將管柱以25管柱體積之20 mM &112?〇4、0.5]\4&(：1(?117.4)洗滌，接著以20管柱體積之 20 mM NaH2P04、0.5 M NaC卜 25 mM咪唑（pH 7.4)洗滌， 且接著以35管柱體積之20 mM NaH2P04、0.5 M NaC卜40 mM咪唑（pH 7.4)洗滌。將蛋白質以15管柱體積之2〇 mM NaH2P04、0·5 M NaCl、500 mM咪唑（pH 7.4)溶離，基於 在A28G下之吸光度彙集溶離份且以ixPBS、50 mM Tris、 150mMNaCl(pH8.5)4 50mMNaOAc、150mMNaCl(pH 4.5)透析。藉由在0.22 μιη下過濾來移除任何沈澱。 亦使用以纖維連接蛋白為主之架構蛋白質結合子的大規 模表現及純化。除所產生之數量外，此方法實質上類似於 不可溶中等規模純化方法。 以鐵维連接蛋白為主之架構蛋白質結合子的生物物理學 表徵 尺寸排阻層析法（SEC) »對自ΗΤΡΡ、中等規模方法及大 規模方法純化之蛋白質（對於HTPP而言，為0.1至1 pg蛋白 質；且對於中等規模而言，為10-50 pg蛋白質）執行標準尺 寸排阻層析法（SEC)。使用Superdex 200 5/150管柱（GE Healthcare)或對於中等規模物質而言在Superdex 200 10/30 管柱（GE Healthcare)上以 Agilent 1100 或 1200 HPLC 系統通 過在A214 nm及A28。nm下進行UV偵測且以螢光偵測（激發 140513.doc •107- 201000118 =280 nm，發射=350 nm)執行來源於HTPP之物質的SEC。 採用SEC管柱之合適流動速率的1〇〇 mM硫酸鈉、1〇〇 mM 磷酸鈉、150 mM氣化鈉（pH 6.8)之緩衝液。使用凝膠過濾 標準（Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA)來進行分子量校 正0 質譜分析。藉由LC-MS(與Waters Q-TOF API質譜儀 (Waters Corporation, Milford, ΜΑ)偶聯的 Water之 2695 液相 層析HPLC系統）進一步分析中等規模及大規模純化之以 10Fn3為主之結合子。將樣品用HPLC級水稀釋至約0.5 mg/ml。將約5 μΐ經稀釋樣品注射至Jupiter C18管柱（目錄 編號 00G-4053-80，Phenomenex)上。緩衝液A :於HPLC 級 水中之0.02% TFA+ 0.08%曱酸。緩衝液B :於HPLC級乙腈 中之0.02% TFA+ 0.08%曱酸。將樣品以流動速率為0.2毫 升/分鐘之梯度（表1)溶離。 差示掃描熱量測定（DSC)。執行中等規模及大規模純化 之以1QFn3為主之結合子的差示掃描熱量測定（DSC)分析以 測定Tm。藉由在3 atm壓力下以每分鐘1°C之速率使溫度自 5°C逐漸上升至95°C，在N-DSC II量熱計（Calorimetry Sciences Corp)中掃描1 mg/ml溶液。使用Origin軟體 (OriginLab Corp)使用最佳擬合將資料與合適缓衝液之對 照執行進行對比分析。 使用表面電漿共振（BIAcore)分析來測定結合親和力 使用表面電漿共振，評估所選經HTPP純化之以纖維連 接蛋白為主之架構蛋白質及所選中等規模及大規模型式之 140513.doc -108 - 201000118 串聯構築體385A08-Fn-V2B(經聚乙二醇化及未經聚乙二醇 化型式；經his標記及未經his標記型式）對IGF-IR的動力學 行為。利用人類IGF-IR-Fc融合體發展捕捉檢定。類似試 劑已由 Forbes 等人描述（Forbes 等人，2002, European J. Biochemistry, 269，961-968)。將人類 IGF-IR之胞外域（aa 1-932)選殖至含有人類IgGl之鉸鏈區及恆定區的哺乳動物 表現載體中。質體之瞬時轉染產生如下所述之融合蛋白 IGF-IR-Fc。293T細胞（表現SV40大T抗原之人類胚腎細胞 株）係自Genehunter(Nashville，TN)獲得且根據製造商之說 明維持。簡言之，將12x106個細胞接種於T175燒瓶 (Falcon)中，以用合適DNA製劑（Qiagen, Valencia, CA)及 Lipofectamine 2000(Invitrogen, Carlsbad, CA)及 Optimem (Invitrogen, Carlsbad, CA)轉染。在第72小時收集經調節之 培養基且藉由西方墨點法使用抗人類IgG-HRP(Pierce, Rockford，IL)及抗 IGF-IR 多株抗體（R&D Systems, Minneapolis，MN)驗證表現。隨後藉由蛋白質A層析純化此 IGF-IR-Fc融合蛋白。 用於經HTPP純化之構築體（未經聚乙二醇化經his標記型 式）的獲得動力學量測之一種方法為將IGF-IR-Fc捕獲於藉 由胺偶合固定於Biacore CM5晶片（GE, Piscataway，NJ)上 之蛋白質A/G上。該動力學分析涉及將IGF-IR-Fc捕獲於蛋 白質A/G上，接著注射一系列濃度呈溶解狀態的以纖維連 接蛋白為主之架構蛋白質，且以甘胺酸（pH 2.0)使蛋白質 A/G表面再生。來自HTPP物質之蛋白質濃度為近似值，因 140513.doc -109- 201000118 此kd測定亦為近似值。獲得各濃度下之感應圖，且經由 Biaevaluation擬合以測定速率常數ka(kon)及KJkoff)。解離 常數KD由速率常數koff/kon2比率計算出。 一替代性方法為將IGF-IR-Fc捕獲於蛋白質A上。此方法 係用於計算來自中等規模及大規模物質之某些型式之構築 體3 85A08-Fn-V2B-cys(經聚乙二醇化與未經聚乙二醇化且 具有his標籤或無his標籤）的親和力及動力學。特定言之， 將IGF-IR-Fc捕獲於藉由胺偶合固定於Biacore CM5感應器 晶片上的蛋白質A上。VEGFR2-FC係藉由胺偶合直接固定 在CM5晶片上。親和力及動力學分析涉及將IGF-IR-Fc捕 捉於蛋白質A上，接著將呈溶解狀態之串聯黏附素注射於 IGF-IR-Fc及VEGFR2-FC上方。在樣品之間，用甘胺酸（pH 1.5)使分析表面再生。獲得各濃度下之感應圖，且使用 Biacore T100評估軟體對其進行評估以測定速率常數 ka(kon)及 Kd(koff)。 評估IGF-IR域之功能性的另一方法為將IGF-IR-Fc捕獲 於抗人類IgG(GE，Piscataway, NJ)上。此係用於如上文實 例5中所述之經中等規模純化之構築體385A08-Fn-V2B(未 經聚乙二醇化、經his標記）。根據製造商之說明，將抗人 類IgG固定在CM5晶片表面之流槽1及2上。將100 nM人類 IGF-IR-Fc以10 μΐ/min在流槽2上注射2分鐘。隨後，將一 系列濃度之中等規模製劑以50 μΐ/min注射跨過兩個流槽表 面。使用50 mM甘胺酸（pH 1.7)之兩次注射使表面再生。 藉由評估一系列濃度經中等規模及大規模純化之_聯構 140513.doc 110· 201000118 築體385A08-Fn-V2B(經聚乙二醇化及未經聚乙二醇化型 式，經his標記及未經his標記型式）與直接固定在CM5晶片 表面（GE, Piscataway，NJ)上的 VEGFR2-FC，評估 V2B 域之 功能性。將 VEGFR2-Fc(R&D Systems, MN)在 50 mM 乙酸 鹽（pH 5·0)中稀釋至12 pg/mL，以達到約13 00 RU之固定含 量。監測50 pL/min之流動速率下不同濃度之於溶液相中 之3 85A08-Fn-V2B的結合（2分鐘）及解離（10分鐘）動力學。 使用50 mM甘胺酸（pH 1.7)之兩次30秒注射使表面再生。 聚乙二醇化 以纖維連接蛋白為主之多價架構蛋白質（諸如，V/I以 1GFn3為主之結合子）可用各種尺寸及類型之PEG聚乙二醇 化。為允許聚乙二醇化，通常在C-末端附近藉由將胺基 酸、通常絲胺酸單點突變為半胱胺酸來修飾該蛋白質。藉 由接合各種順丁烯二醯亞胺衍生之PEG形式，將PEG試劑 與蛋白質溶液組合且培育來實現該蛋白質之單個半胱胺酸 殘基之聚乙二醇化。蛋白質之聚乙二醇化的確認可藉由 SDS-Page及/或SE-HPLC方法證實，該等方法可將未經聚 乙二醇化蛋白質與經聚乙二醇化蛋白質分離。 舉例而言，藉由以半胱胺酸置換位置203處之絲胺酸， 將構築體385A08-Fn-V2B聚乙二醇化。接著將所得構築體 385A08-Fn-V2B-Cys 與 40 kD PEG 接合。將 PEG 試劑與呈溶 解狀態之蛋白質構築體（385A08-Fn-V2B-Cys)混合且培 育。如以上段落中所述，亦進行證實聚乙二醇化之研究。 亦對具有線性PEG之串聯構築體進行研究。此外，此類型 140513.doc • 111 - 201000118 之聚乙二醇化亦可用經his標記蛋白質進行。 此外，使用構築體385A08-Fn-V2B-Cys之線性及分枝聚 乙二醇化型式在小鼠中進行某些藥物動力學研究以評估線 性PEG與分枝PEG之間的差異。兩者均為4〇 kD pEG，且此 構病體之線性型式亦包括his標籤。 亦可使用替代性方法將V/Ux i〇Fn3為主之結合子聚乙二 醇化。自單個塗鋪菌落產生5 ml含有編碼V/I以i〇Fn3為主 之結合子之T7聚合酶驅動pET29質體的BL21(DE3)大腸桿 菌細胞之接種培養物，且使用該培養物來接種含有5〇 pg/mL康黴素之1公升自誘導培養基（「one」培養基， EMD Biosciences，San Diego，CA)。在 37°C下初始生長後 在18°C下進行表現，且藉由在4。〇下以約10 000xg離心1〇分 鐘收穫。在-80°C下冷凍細胞小球。將該細胞小球再懸浮
於 10 mL溶解緩衝液（20 mM NaH2P04、0.5 M NaC卜 5 mM 味唾，pH 7_4)中且使用Avestin勻化器機械溶解。藉由在 4°C下以23,30〇xg離心15分鐘，將可溶部份分離。傾析上 清液且將離心塊溶解於補充有4 Μ至6 Μ鹽酸脈（GdnHCl) 之溶解緩衝液（上文）中。接著以經補充有GdnHCL之溶解 緩衝液預先平衡的合適尺寸NiNTA管柱（Qiagen，lnc.)純化 所溶解蛋白質。接著將管柱以5至10管柱體積之相同緩衝 液洗務，接著以補充有300 mM咪嗤之相同緩衝液溶離。 將含有所關注蛋白質的溶離出管柱之溶離份稀釋至2_3 mg/mL蛋白質且接著與i .2_15莫耳過量之固體nem_ PEG(40 kDa分枝或其他）組合。使混合物在室溫下反應3〇 140513.doc -112- 201000118 分鐘或直至反應完成。接著將全部反應體積置放於透析袋 (5,000 Da分子量截斷）中且使混合物經受透析再摺疊過 程。來自此程序之透析物含有適當摺疊之經聚乙二醇化物 質加上過量反應物。將來自聚乙二醇化反應之產物與過量 反應物之混合物經由離心或過濾淨化，接著將其負載至陽 離子交換層析管柱（SP Sepharose或Resource S, GE Healthcare)上。以於NaOAc背景緩衝液中之150 mM至1 Μ NaCl梯度走柱。如上所述進行證實聚乙二醇化之研究。 ❿ 胃嬈爭性阻斷檢定 R+競爭性阻斷檢定。R+(來自Renato Baserga(Thomas Jefferson University，Philadelphia, PA)之禮物）為在缺失小 鼠IGF-IR基因之情形下過度表現人類IGF-IR的小鼠胚胎纖 維母細胞。將細胞於含有5%小牛血清（Hyclone，Logan， UT)之 DMEM(Invitrogen，Carlsbad，CA)中以每孔 20,000 個 細胞之濃度塗鋪於96孔盤中。第二天，將細胞在含有0.1% 籲 BSA之無血清 DMEM(Invitrogen，Carlsbad, CA)中洗務兩 次。洗滌之後，將細胞在含有遞增濃度之IGF-IR拮抗劑或 對照之結合緩衝液（無血清DMEM+ 0.1% BSA)中於4°C下培 '' 育10分鐘。典型對照包括以1QFn3為主之單特異性IGF-IR結 合子（AT580-PEG40，SEQ ID NO: 27)(陽性對照）或以丨0Fn3 為主之單特異性VEGFR2結合子（Peg-V2Bshort，SEQ ID NO: 28)(陰性對照）。在此短暫暴露於拮抗劑後’根據製造 商之說明（Li-Cor Biosciences，Lincoln, NE)將R+細胞再暴 露於200 nM經IRDye 800CW標記之以1GFn3為主之二價 140513.doc -113- 201000118 IGF-IR結合子（AT580-PEG20-AT580，SEQ ID NO: 27)。在 4°C下培育4小時後，將細胞在結合緩衝液中洗滌兩次且在 Odyssey紅外成像系統（Li-Cor Biosciences，Lincoln, NE)上 觀測。使用 GraphPad Prism(GraphPad Software, La Jolla, CA)分析所得資料。 293:KDR競爭性阻斷檢定。將293:KDR(Sibtech， Brookfield, CT)於含有10% 胎牛血清（Hyclone，Logan, UT) 之 DMEM(Invitrogen，Carlsbad，CA)中以每孔 25,000個細胞 之濃度塗鋪於96孔盤中。第二天，將細胞在含有0.1%BSA 之無血清DMEM(Invitrogen，Carlsbad, CA)中洗務兩次。洗 滌之後，將細胞在含有遞增濃度之VEGFR-2拮抗劑或對照 之結合緩衝液（無血清DMEM+ 0.1% BSA)中於4°C下培育10 分鐘。典型對照包括以1QFn3為主之單特異性VEGFR2結合 子（Peg_V2Bshort，SEQ ID NO·· 28)(陽性對照）或以 1GFn3 為 主之單特異性IGF-IR結合子（AT580-PEG40，SEQ ID NO: 27)(陰性對照）。在此短暫暴露於拮抗劑後，根據製造商之 說明（Li-Cor Biosciences，Lincoln, NE)將 293 :KDR細胞再暴 露於 200 nM經 IRDye 800CW標記之 Peg-V2Bshort。在 4°C 下 培育4小時後，將細胞在結合緩衝液中洗滌兩次且在 Odyssey紅外成像系統（Li-Cor Biosciences，Lincoln, NE)上 觀測。使用 GraphPad Prism(GraphPad Software，La Jolla, CA)分析所得資料。 活«外增殖檢定 RH41。使RH41細胞生長於補充有10%胎牛血清、10 140513.doc -114- 201000118 mM Hepes、glutamax、盤尼西林（penicillin)及鏈黴素之 RPMI培養基中。藉由[3H]-胸苷併入法或比色法評估細胞 增殖。為評估[3H]·胸苷併入，將細胞以最佳密度（4K個細 胞/孔）塗鋪於96孔盤中，在37°C下培育隔夜，接著暴露於 以纖維連接蛋白為主之架構蛋白質的連續稀釋液。培育72 小時後，將細胞以4 pCi/ml [3H]-胸苷（Amersham Pharmacia Biotech，UK)脈衝3小時，胰蛋白酶消化，收集 於 UniFilter-96 GF/B培養盤（PerkinElmer, Boston，MA)上， 且在TopCount NXT(Packard, CT)上量測閃爍數。結果表示 為IC5Q，IC5G為與未經處理之對照細胞相比抑制細胞增殖 達50%所需的藥物濃度。自針對各細胞株之多個測試計算 出平均IC5〇及標準偏差。為進行比色評估，將細胞於90微 升 / 孔含有 10% 胎牛血清（Hyclone，Logan，UT) 2RPMI-glutamax(Invitrogen，Carlsbad, CA)中以每孔 5,000個細胞 之濃度塗鋪於96孔盤中，且在37°C、5% C02下培育24小 時。將10 μΐ 10X濃度之以1GFn3為主之IGF-IR拮抗劑添加 至該等孔中且在37°C、5% C02下培育72小時。增殖期後， 將細胞暴露於Cell Titer 96增殖試劑水溶液（Promega， Madison, WI)且再培育 4 小時。在 Spectramax Plus 384(Molecular Devices，Sunnyvale, CA)上量測 490 nm下之 吸光度，且使用 Softmax Pro 5 軟體（Molecular Devices， Sunnyvale, CA)分析所得資料。
Ba/F3。將穩定表現VEGFR2融合蛋白（包含hVEGFR2之 胞外域及hEpoR之胞内域）之鼠類Ba/F3細胞於90 μι含有15 140513.doc -115- 201000118 ng/mL VEGF-Α之生長培養基中以25,000個細胞/孔塗鋪於 96孔盤中。製備1〇χ最終濃度之纖維連接蛋白架構域蛋白 質之連續稀釋液，且將1〇 μ!^蛋白質添加至各孔中。將培 養盤在37°C/5% C02下培育48-72小時。將細胞增殖檢定試 劑（CellTiter 96，Promega)添加至各孔（20微升/孔）中，且 將培養盤再培育3-4小時。在培育期結束時，在96孔盤讀 取器中讀取吸光度（A490)。 HMVEC-L。來自肺之初級人類微血管内皮細胞 (HMVEC-L)係購自 Lonza(目錄號 CC-2527 ; Walkersville， MD)且維持在EGM-2 MV Singlequots(Lonza，目錄號CC-3202)中，接著轉換至補充有2%熱滅活胎牛血清（FCS)、10 mM Hepes、15 ng/ml 重組人類 VEGF(Biosource)及 50 ng/ml 重組人類IGF-l(PeproTech)的 RPMI-1640+ Glutamax中，以 供生長檢定。在10%胎牛血清（FCS)存在下使細胞暴露於化 合物後，藉由使[3H]·胸苷併入DNA中來評估增殖。典型對 照包括以下各物：IGF-IR單株抗體mAB391(R&D Systems， Minneapolis, MN)、以1GFn3為主之單特異性IGF-IR結合子 (AT580-PEG40，SEQ ID NO: 27)、以 10Fn3 為主之單特異 性 VEGFR-2結合子（Peg-V2Bshort，SEQ ID NO: 28)及不與 目標結合的以1GFn3為主之野生型蛋白質（SGE)。將 HMVEC-L細胞以1，500個細胞/孔塗鋪於96孔微量滴定 Falcon盤中（對於此細胞類型將細胞密度優化）。在37°C下 培育72小時後，將細胞以4 pCi/ml [3H]-胸苷脈衝3小時， 胰蛋白酶消化，收集於UniFilter-96 GF/B培養盤 1405I3.doc -116- 201000118 (PerkinElmer, Boston, MA)上，且在 TopCount NXT (Packard，CT)上量測閃爍數。結果表示為相對於未經處理 之對照細胞之細胞增殖抑制使細胞增殖抑制達50%所需的 藥物濃度（IC50)。 NCI-H929。將 NCI-H929(ATCC，Manassas, VA)(—種 IGF 依賴性人類漿細胞瘤細胞株）在IGF-IR拮抗劑或對照存在 下於含有1 〇%胎牛血清（Hyclone, Logan, UT)之DMEM (Invitrogen, Carlsbad，CA)中以每孑匕25,000個細胞之濃度塗 於96孔盤中。典型對照包括以下各物：IGF-IR單株抗體 MAB391(R&D Systems, Minneapolis, MN)、以 10Fn3為主之 單特異性IGF-IR結合子（AT580-PEG40，SEQ ID NO: 27)、 以1GFn3為主之單特異性VEGFR-2結合子（Peg-V2Bshort， SEQ ID NO: 28)及不與目標結合的以1GFn3為主之野生型蛋 白質（SGE)。使細胞在37°C、5% C02下增殖72小時。增殖 期後，將細胞暴露於Cell Titer 96增殖試劑水溶液 (Promega，Madison, WI)且再培育 4 小時。在 Spectramax Plus 384(Molecular Devices，Sunnyvale，CA)上量測 490 nm 下之吸光度，且使用 GraphPad Prism(GraphPad Software， La Jolla，CA)分析所得資料。 基於細胞之信號轉導檢定 HEK293/KDR及 PAE/KDR檢定。將 HEK293/KDR及 PAE/ KDR 細胞（Sibtech，Inc)培養於具有 GlutaMAX™-l(Gibco, Carlsbad, CA)之含有10%胎牛血清（FBS)、盤尼西林、鏈黴 素、HEPES及嘌呤黴素的DMEM中且長至約70%融合。在 140513.doc -117- 201000118 37°C下將細胞置放於饑餓培養基（DMEM-GlutaMAX、0.5% FBS、盤尼西林、鏈黴素、HEPES及嘌呤黴素）中隔夜，接 著在 37°C 下用 VEGF 或 IGF-1(50 ng/ml，PeproTech，Rocky Hill，NJ)刺激10 min。包括未經刺激之細胞作為對照。於 冰上將細胞以冰冷PBS清洗兩次，且在TTG溶解緩衝液（1% Triton X-100、5%甘油、0.15 M NaC卜 20 mM Tris-HCl pH 7.6、成品鍵劑（Complete tablet)(Roche，Indianapolis, IN) 及填酸酶抑制劑混合物2(Sigma, Milwaukee，WI))中製備萃 取物。使用BCA檢定套組（Pierce, Rockford, IL)來測定總細 胞溶胞物之蛋白質濃度。將溶胞物（30 pg)藉由SDS-PAGE (In vitro gen, Carlsbad, CA)解析，轉移至确酸纖維素 膜（Bio-Rad Laboratories，Hercules, CA)，且在具有 0.1% Tween 20 之 Odyssey 阻斷緩衝液（Li-Cor Biosciences， Lincoln，NB)中用針對填酸化 VEGFR(Tyr 996)(Santa Cruz Biotechnology, Carlsbad, CA)、磷酸化 IGF1R/IR (Tyrll35/1 136)/胰島素受體（Tyrll50/1151)、磷酸化 Akt (Ser 473)、磷酸化 p44/42 MAPK(Thr202/Tyr204)(Cell Signaling Technology，Beverly, MA)或總肌動蛋白 (Chemicon International, Temecula, CA)的抗體進行免疫墨 點分析。將膜用來自 Rockland Immunochemicals, Inc.(Gilbertsville，PA)及 Molecular Probes(Carlsbad, CA)之 合適經紅外標記二次抗體培育。使用Li-Cor Biosciences Odyssey紅外成像系統執行蛋白質觀測。
如上所述培養HEK293/KDR 細胞（Sibtech，Inc)。在 37°C 140513.doc -118 - 201000118 下將VEGFR-IGF-IR多價纖維連接蛋白架構域在饑餓培養 基中稀釋且以100及10 nM之最終濃度添加至細胞中，歷時 1小時。在37°C下將細胞用VEGF-IGF-1配位體組合（均為50 ng/ml最終濃度，PeproTech，Rocky Hill，NJ)刺激 10 min。 包括未經刺激之細胞作為對照。如上所述製備細胞溶胞 物。將溶胞物（30 pg)藉由 SDS-PAGE(Invitrogen，Carlsbad, CA)解析，轉移至琐酸纖維素膜（Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA)，且用針對總 VEGFR、填酸化 VEGFR(Tyr 996)、總 IGF-lR(Santa Cruz Biotechnology, Carlsbad, CA)、磷酸化 IGFlR/IR(Tyrll35/1 136)/ 胰島素受體 (Tyrll50/1151)、總 Akt、磷酸化 Akt(Ser 473)、總 ΜΑΡΚ、 磷酸化44/42 MAPK(Thr202/Tyr204)(Cell Signaling Technology, Beverly, MA)或肌動蛋白（Chemicon International， Temecula, C A)的抗體探測。在用經紅外標記之二次抗體培 育後使用Li-Cor Biosciences Odyssey紅外成像系統偵測抗 體。 如上所述培養PAE/KDR細胞（Sibtech, Inc)。在37°C下將 VEGFR-IGF-IR多價纖維連接蛋白架構域在饑餓培養基中 稀釋且以100及10 nM之最終濃度添加至細胞中，歷時1小 時。在37°C下將細胞用VEGF-IGF-1配位體組合（均為50 ng/ml最終濃度 ’ PeproTech，Rocky Hill, NJ)刺激 10 min。 包括未經刺激之細胞作為對照。如上所述製備細胞溶胞 物。將溶胞物（30 μβ)藉由 sDS-PAGE(Invitrogen，Carlsbad， CA)解析’轉移至確酸纖維素膜（Bi〇-Rad Laboratories, 140513.doc •119- 201000118
Hercules, CA)，且用針對總 VEGFR、磷酸化 VEGFR(Tyr 996)、總 IGF-lR(Santa Cruz Biotechnology, Carlsbad, CA)、磷酸化 IGFlR/IR(Tyrll35/1136)/ 胰島素受體 (Tyrll50/1151)、總 Akt、磷酸化 Akt(Ser 473)、總 ΜΑΡΚ、 磷酸化 44/42 MAPK(Thr202/Tyr204)(Cell Signaling Technology, Beverly, MA)或肌動蛋白（Chemicon International，Temecula, CA)的抗體探測。在用經紅外標記 之二次抗體培育後使用Li-Cor Biosciences Odyssey紅外成 像系統偵測抗體。 董測HMVEC-L細胞或Rh41細胞中受抑制之信號傳輸途徑 的西方墨點分析 將HMVEC-L細胞培養於EGM-2MV Singlequots完全培養 基（Lonza，目錄號CC-3202)中，且生長至約70%融合。將 細胞置於37°C、5% C02下之饑餓培養基（基礎EBM-2培養 基、0.3% BSA)中6小時。將測試試劑在饑餓培養基中稀釋 且在37°C下以1 00 nM之最終濃度添加至細胞中，歷時1小 時。在37°C下將細胞用VEGF與IGF-1配位體（各為5 0 ng/ml) 之組合（VEGF : R&D Systems，#293-VE/CF ; IGF1 : PeproTech，Rocky Hill, NJ，#100-11)刺激 10 min。未經刺 激之細胞用作對照。 將Rh41細胞培養於含有10%胎牛血清（FCS)、盤尼西 林、鏈黴素及 HEPES 之 RPMI(Invitrogen, Carlsbad, CA) 中，且生長至約70%融合。Rh41為人類橫紋肌肉瘤腫瘤細 胞株，其係自Lee Helman博士（NIH)獲得且在10% FCS、10 140513.doc 120- 201000118 mM HEPES存在下維持於RPMI-1640+ Glutamax 中；Rh41 細胞具IGF依賴性且對IGF-1R拮抗劑（亦即小分子、單連接 素（mononectin)及mAB3 91)之抑制非常敏感。將Rh41細胞 置放於饑餓培養基（RPMI、0.3% BSA)中於3 7°C下隔夜。將 測試試劑在饑餓培養基中稀釋且在37°C下以100 nM之最終 濃度添加至細胞中，歷時1小時。在37°C下將細胞用VEGF 與IGF-1配位體（各為50 ng/ml)之組合刺激10 min。典型對 照包括以下各物：未經刺激之細胞、IGF-1R單株抗體 mAB391(R & D Systems，Minneapolis，MN)、以 10Fn3為主 之單特異性IGF-IR結合子（AT580-PEG40，SEQ ID NO: 27)、以10Fn3為主之單特異性VEGFR-2結合子（peg_ V2Bshort，SEQ ID NO: 28)。 於冰上將HMVEC-L或Rh41細胞以冰冷PB S清洗兩次，且 在 TTG 溶解緩衝液（1% Triton X-100、5% 甘油、0.15 Μ NaCl、20 mM Tris-HCl pH 7.6、成品旋劑（R〇che， Indianapolis, IN)及填酸酶抑制劑混合物2(Sigma, Milwaukee, WI))中製備萃取物。使用BCA檢定套組（Pierce， Rockford，IL)測定總細胞溶胞物之蛋白質濃度。將來自各 溶胞物之等量蛋白質（40 pg)添加至凝膠（NuPAGE 4-12% Bis-Tris凝勝，Invitrogen，Carlsbad, CA)之各孔中。在 NuPAGE凝膠上分離蛋白質，轉移至硝酸纖維素膜（Bio-Rad Laboratories， Hercules， CA)且在室 溫下在Odyssey 阻斷 緩衝液（Li-Cor Biosciences)中培育1小時。藉由在室溫下在 具有 0.1% Tween 20 之 Odyssey 阻斷緩衝液（Li-Cor 140513.doc • 121 - 201000118
Biosciences，Lincoln, NB)中用對 IGF-1R(填酸化 IGF-lRP(Tyrll35/1136)/IR、（Tyrll50/1151)(19H7)抗體，（Cell Signaling #3024)) ' IGF-lRP(Santa Cruz Biotechnology, Inc· sc-713)、Akt(pAkt(Ser 473)(Cell Signaling #4051))、 Akt(Cell Signaling #9272) > MAPK(p-p44/42) ' MAPK (Thr202/Tyr2040)(E10)(Cell Signaling #9106) ' MAPK(Cell Signaling #9102)及 VEGFR-2(pFlk-l)(Tyr996)-R、（Santa Cruz Biotechnology, Inc. sc-16629R)、VEGFR-2(Flk-l)(C-1158) (Santa Cruz Biotechnology，Inc. sc-504)、總 GAPDH(Cell Signaling #2118)具特異性之抗體探測西方墨 點歷時3小時，來量測對磷酸化之抑制。將膜在具有0.1% Tween-20之TBS中洗務3次，且接著在室溫下用經紅外標 記之二次抗體培育1小時。利用Odyssey紅外成像系統（Li-Cor Biosciences)執行蛋白質分析，該系統能夠同時及獨立 地偵測螢光信號。
Ca2+通董檢定 將HMVEC-L細胞於EGM2-MV Singlequots完全培養基 (Lonza，目錄號CC-3202)中以2.5><104個細胞/孔塗鋪於經 聚D-離胺酸塗布之96孔盤（Falcon #356640)上。將細胞在 基礎EBM培養基（Lonza)中饑餓隔夜。在檢定當天，將測 試試劑在 HHP緩衝液（於 HBSS [GibcoBRL #14025-076] + 0.1% BSA 中之 10 mM HEPES、2.5 mM丙磺舒（probenecid) [Sigma #P8761])中連續稀釋且在吸出EBM培養基後添加至 細胞中。同時添加約-4染料套組（Molecular Devices, 140513.doc -122- 201000118 #R8142)作為HHP緩衝液，且將細胞在37°C下培育1小時。 藉由添加 50 ng/ml VEGF(Invitrogen #PHG0145)觸發 Ca2 + 釋放。藉由在FLIPR(Molecular Devices)上量測來監測 Ca2 +通量。 人類微血管内皮細跑管形成 藉由將MatrigelTM(BD Biosciences，#356237)在4°C下融 解隔夜來製備。將MatrigelTM(300微升/孔）添 加至24孔盤中且隨後在37°C下培育30分鐘以使凝膠聚合。 將HMVEC-L細胞培養於EGM-2MV完全培養基（Lonza，目 錄號CC-3202)中，且生長至約70%融合。在存在測試化合 物（100 nM)或無化合物情況下將細胞再懸浮（lx 105個細胞/ 毫升）於EGM-2MV完全培養基中。將1 mL細胞懸浮液添加 至各孔中。在5% C02中於37°C下將培養盤培育12小時。吸 出生長培養基且在室溫下將1 ml 0.3%戊二醛（VWR， #GX015305-1)添加至各孔中，歷時30分鐘。吸出培養基且 以1 ml洗滌緩衝液（細胞展布試劑套組（Cell Spreading Reagent Kit)，Pierce, #K0600011)洗蘇細胞。添加 500 μΐ 滲 透溶液，接著在室溫下培育15分鐘。吸出培養基且以1 ml 洗滌緩衝液洗滌細胞。將500 μΐ染色溶液添加至各孔中且 在黑暗中於室溫下培育1小時。將溶液藉由抽吸移除且以 洗滌緩衝液洗滌3次。將盤密封，且在ArrayScan HCS讀取 器上成像。自動計算各孔之血管生成指數（其為由微血管 佔據之成像面積的量度）且加以報導。
小良中之單齊I量PK 140513.doc -123- 201000118 在小鼠中研究經40 kD線性或40 kD分枝PEG聚乙二醇化 的 385A08-Fn-V2B-Cys(SEQ ID NO: 9)之藥物動力學。兩 組未禁食動物（每組N=3-4，20-25 g)經由尾靜脈接收黏附 素作為靜脈内（IV)快速注射劑量（5 mL/kg)。劑量為50 mg/kg。給藥之前，將化合物在鱗酸鹽緩衝生理食鹽水 (PBS)中自儲備溶液稀釋成合適給藥溶液濃度。藉由切開 側尾靜脈獲得連續血液樣品（約〇.〇5 mL)。對於IV途徑而 言，取樣時間點為給藥後0.08、0.5、1、2、6、12、24、 48、96及171小時。藉由以1:1比率將血液樣品稀釋於擰檬 酸磷酸右旋糖溶液中來收穫血漿樣品且將其儲存於-20°C 下，直至分析。 接種Rh41踵瘸之小鼠中的單劑董PK/PD研究 在單次給與相同劑量（25+25、50 + 50、100+100)的構築 體385A08-Fn0V2B-Cys之經聚乙二醇化經his標記型式 (50、100、200 mpk)或以1()Fn3為主之單特異性IGF-IR結合 子（AT580-PEG40，SEQ ID NO: 27)及以 10Fn3 為主之單特 異性 VEGFR-2 結合子（Peg-V2Bshort，SEQ ID NO: 28)後， 使用遞增濃度在接種Rh41腫瘤之小鼠中進行藥效學研究。 在給藥後1、6及24小時收穫腫瘤且進行處理。將來自各腫 瘤溶胞物之等量蛋白質（60 pg)添加至凝膠（NuPAGE 4-12% Bis-Tris 凝膠，Invitrogen， Carlsbad, CA)各孑L 中。在 NuPAGE凝膠上分離蛋白質，轉移至硝酸纖維素膜（Bio-Rad Laboratories, Hercules， CA)且在室 溫下在Odyssey 阻斷 緩衝液（Li-Cor Bio sciences)中培育1小時。藉由以如上所述 140513.doc -124- 201000118 之磷酸化特異性抗體探測西方墨點來量測對蛋白質磷酸化 之抑制。 小鼠中RH-41、A549及GEO之腫瘤異種移植研究 自 Harlan Sprague-Dawley Co.(Indianapolis，IN)購得 5-6 週大之雌性Balb/c無胸腺小鼠（nu/nu)。在無氨及病原體之 環境中供養動物且無限制地給其飼餵水及食物。將小鼠隔 離供養7天，接著植入腫瘤及進行功效測試。在BMS動物 關懷與使用委員會（BMS Animal Care and Use committee) 批准下且根據美國實驗動物評估認證協會（American Association for Accreditation of Laboratory Animal Care 5 AAALAC)執行所有動物研究。 使用16 g套管針將人類腫瘤Rh-41(橫紋肌肉瘤）、 A549(肺）及GEO(結腸）以一般不超過0.1至0.2 mm3之小碎 片形式皮下（sc)植入。在開始治療之前，使所評估之所有 腫瘤長至約125 mm3之尺寸。治療及對照組規模由6-8隻小 鼠組成。每週量測腫瘤尺寸兩次。藉由使用游標尺測徑規 量測垂直腫瘤直徑且使用以下用於橢球之公式來計算腫瘤 體積：1/2(長度χ(寬度）2)。若腫瘤尺寸超過1,500 mm3，若 動物體重減輕超過開始體重之20%或若出現廣泛腫瘤壞 死，則對小鼠實施安樂死。所有化合物在内部獲得且藉由 使用25 g無菌皮下注射針腹膜内（i.p.)傳遞來給藥。媒劑對 照溶液一般為磷酸鹽緩衝生理食鹽水（PBS)，而以1QFn3為 主之單特異性VEGFR-2結合子（Peg-V2Bshort，SEQ ID NO: 28)以於 10 mM 乙酸鈉、150 mM NaCl(pH 4.5)中之調 140513.doc -125- 201000118 配物給藥；以1GFn3為主之單特異性IGF-IR結合子（八丁580-PEG40，SEQ ID NO: 27)調配於PBS中，且經聚乙二醇化 經 his 標記構築體 385A08-Fn-V2B-cys(SEQ ID NO: 9)調配 於 50 mM 乙酸鈉、150 mM NaCl(pH 4·5)中。 抗腫瘤功效表示為腫瘤生長抑制百分比（％ TGI)且計算 如下： % TGI={l-[(Tt-T〇)/(Ct-C〇)]}xl00 其中Ct=媒劑對照（C)小鼠在t時刻之中值腫瘤體積（mm3); Tt=經治療小鼠（T)在t時刻之中值腫瘤體積（mm3) ; CG=媒劑 對照（C)小鼠在0時刻之中值腫瘤體積（mm3) ; T〇=經治療小 鼠（Τ)在0時刻之中值腫瘤體積（mm3)。認為在腫瘤體積倍 增時間（TVDT)期間大於或等於50% TGI為有效抗腫瘤反 應。在一般介於250 mm3 -1 0 0 0 mm3腫瘤尺寸之間的腫瘤線 性增長範圍内量測TVDT。 A673模型中之腫瘤異種移植研究 (1) 腫瘤細胞株。根據ATCC推薦之說明培養人類A673尤 文氏肉瘤細胞（CRL-1598)。簡言之，在37°C下5% C02氣氛 下將細胞供養於補充有1 0%胎牛血清（Invitrogen, Carlsbad, CA)的基礎培養基杜氏改良伊格爾培養基（Invitrogen， Carlsbad, CA)中。 (2) 異種移植模型。將再懸浮於0·1 ml PBS中之ΙΟχΙΟ6個 細胞皮下注射至7至8週大的雌性無胸腺NCr裸小鼠 (Taconic Farms, Hudson，NY)之後腰區域中。將小氣圈養 於處於經HEPA過濾之空氣及溫度受控之障壁齒條下方的 140513.doc -126- 201000118 微隔離籠中。將其維持於12小時明亮/黑暗循環，無限制 飼喂可獲得之經輻射照射食品及高壓滅菌水，且使其適應 其新環境。使用無菌方案操縱小鼠且腫瘤研究之所有實驗 程序及終點均根據慣例準則。使用測徑規量測法監測腫瘤 植入以在隨機化之前建立腫瘤生長速率且當腫瘤達到平均 15 0-200 mm3時將小鼠隨機化。當腫瘤達到3,000 mm3體積 時，對小鼠實施安樂死。 (3)治療。將來自各研究之小鼠分配給下文所述之治療 組且接收下文所指示之方案的腹膜内投藥。媒劑組接收於 重構缓衝液（10 mM乙酸鈉、150 mM NaCl，pH 4.5)中之以 10Fn3為主之單特異性VEGFR-2結合子（Peg-V2Bshort，SEQ ID NO: 28)。將以1GFn3為主之單特異性IGF-IR結合子 (AT580-PEG40，SEQ ID NO: 27)調配於PBS中且將經聚乙 二醇化經his標記 385A08-Fn-V2B-cys(SEQ ID NO: 9)調配 於50 mM乙酸鈉、150 mM NaCl(pH 4.5)中。對於圖26中所 述之研究而言，存在6個治療組，每一組由9隻小鼠組成， 以一週3次（TIW)之時程給與該等小鼠媒劑、50 mg/kg (mpk)Peg-V2Bshort、50 mpk AT580-PEG40、50 mpk經聚 乙二醇化經 his標記 385A08-Fn-V2B-cys、100 mpk經聚乙 二醇化經his標記385A08-Fn-V2B-cys或共同給與50 mpk AT5 80-PEG40與50 mpk Peg-V2Bshort。在以上戶斤討論之劑 量反應研究（資料未圖示）中，存在5個治療組，每一組由9 隻小鼠組成，以TIW時程給與該等小鼠媒劑或20、60、 100或200 mpk經聚乙二醇化經his標記385A08-Fn-V2B- 140513.doc -127- 201000118 cys 〇 (4) 腫瘤體積量測。每週兩次使用游標尺測徑規進行腫 瘤體積量測且使用橢球公式[π/6 (LxW2)]計算腫瘤體積 (mm3)，其中L表示最大腫瘤直徑（mm)且W表示最小腫瘤直 徑（mm)。應注意腫瘤量測值為絕對值。在實驗過程中每週 兩次記錄動物體重。 (5) 脸瘤生長抑制（TGI)。TGI計算為經治療（T)組自對照 組（媒劑，C)之腫瘤生長百分比。藉由自實驗結束時之最 終腫瘤體積減去初始腫瘤體積（0天時）計算腫瘤生長。 TGI=(l-[T-T〇]/[C-C〇])*100。 小鼠及猴模型之PK/PD研究方法 血清或血漿中濃度之測定 發展定量電致化學發光檢定以偵測血清或血漿樣品中 385A08-Fn-V2B-Cys(具有及無his標籤）之濃度。在此檢定 中’在4°C下使對分子之VEGFR2部分具特異性之小鼠單株 抗體吸附至標準Meso Scale Discovery盤隔夜以捕獲黏附 素。將血清/血漿樣品添加至培養盤中，在室温下培育1小 時。藉由對黏附素之架構區具特異性之兔多株抗體偵測所 捕獲之黏附素，該兔多株抗體係與同SULFO-TAG連接之 山羊抗兔抗體共同混合且同時添加至培養盤。在洗滌以移 除任何未結合SULFO-TAG試劑後，將讀取緩衝液添加至 各孔中’且使用電致化學發光偵測來偵測結合事件。基於 與3 85A08-Fn-V2B-Cys(具有及無his標籤）之標準曲線之4參 數擬合相比較之樣品之信號，計算樣品中385A08-Fn-V2B. 140513.doc 201000118
Cys(具有及無his標籤）血漿/血清濃度。 小鼠及猴中VEGF-A濃度之測定 根據製造商之說明，採用來自Meso Scale Discovery (Gaithersburg, MD)之針對人類及鼠類VEGF-A的定量電致 化學發光檢定來偵側VEGF-A血漿濃度。將特異性抗 VEGF-A單株抗體預塗在 Meso Scale Discovery(MSD)盤 上。將培養盤在4°C下阻斷隔夜且在2小時培育步驟期間藉 由固定抗體捕獲標準、QC及樣品中存在之VEGF-A。在洗 去任何未結合物質之後，將SULFO-TAG連接之多株偵測 抗體添加至孔中，歷時2小時。在洗滌以移除任何未結合 SULFO-TAG試劑後，將讀取緩衝液添加至各孔中，且使 用電致化學發光偵測來偵測結合事件。基於與標準曲線之 4參數擬合相比較之樣品之信號，計算樣品中之血漿 VEGF-A濃度。 活體内方法-小鼠 小鼠中之單劑量藥物動力學。在裸小鼠中研究385A08-Fn-V2B-Cys之經his標記型式之藥物動力學。四組未禁食 動物（每組N=3-4，20-25 g)接收呈經由尾靜脈投與之靜脈 内（IV)快速注射劑量（5 mL/kg)或腹膜内（IP)劑量（10 mL/kg) 形式的385A08-Fn-V2B-Cys之經his標記型式。對於兩種途 徑而言，劑量為5及50 mg/kg。給藥之前，將化合物在鱗 酸鹽緩衝生理食鹽水（PBS)中自儲備溶液稀釋成合適給藥 溶液濃度。藉由切開側尾靜脈獲得連續血液樣品（約0.05 mL)。對於IV途徑而言，取樣時間點為給藥後0.08、0.5、 140513.doc -129- 201000118 1、2、6、12、24、48、96及171小時。對於IP途控而言’ 取樣時間點為給藥後0.5、1、2、6、12、24、48、96、 124及171小時。藉由以1:1比率將血液樣品稀釋至捧檬酸 碌酸右旋糖溶液中來收集血漿樣品且將其儲存於_2〇。〇 下，直至分析。 帶有Rh41腫瘤之裸小鼠中的單劑量藥物動力學/藥效學 研究。以2〇及200 mg/kg之劑量向帶有Rh41腫瘤之未禁食 裸小鼠（20-25 g)以及媒劑組腹膜内給與385A08-Fn-V2B-
Cys之經His標記型式。給藥之前，將藥物候選物在磷酸鹽 缓衝生理食鹽水（PBS)中自儲備溶液稀釋成合適給藥溶液 濃度。藉由在經藥物治療之組中給藥後1、3、6、16、 24、32、48及SO小時及媒劑組中給藥後丨、24及36小時進 行心臟穿刺來獲得血液樣品。凝固後獲得血清樣品且將其 儲存在-20°C下，直至進行藥物及VEGF-A濃度之分析。
帶有A673腫瘤之裸小鼠中的單劑量藥物動力學/藥效學 研究。以20及200 mg/kg之劑量向帶有A673腫瘤之未禁食 裸小鼠（20-25 g)腹膜内給與385A08-Fn-V2B-Cys(未經His 標記）。給藥之前，將藥物候選物在PBS中自儲備溶液稀釋 成合適給藥溶液濃度。藉由在給藥後1、3、6、16、24、 32、48、72、96及120小時進行心臟穿刺至經肝素鈉塗布 之BD真空採血管（vacutainer)中來收集血液樣品且將其儲 存在-20°C下’直至進行藥物及VEGF-Α濃度之分析。 活體内方法-猴 猴中之單劑量藥物動力學/藥效學研究。在雄性食蟹缑 140513.doc -130- 201000118 中評估385A08-Fn-V2B-Cys之經his標記型式之藥物動力 學。禁食隔夜後’ 2隻動物（約4 kg)藉由經由股靜脈恒定速 率IV輸液（5 mL/kg)10分鐘來接收3及30 mg/kg劑量的 385A08-Fn-V2B-Cys之經his標記型式。給藥之前，將藥物 候選物在PBS中自儲備溶液稀釋成合適給藥溶液濃度。在 給藥前及在給藥後0.17、0.25、0.5、1、2、4、6、8、 24、30、54、72(第 3 天）、96(第 4 天）、168(第 7天）、216(第 9天）、264(第 11天）、336(第 14天）、384(第 16天）、432(第 1 8天）、5 04小時（第2 1天）自股動脈收集血液樣品（約1 mL) 至hEDTA管中。在4°C下離心（1500-2000xg)後獲得血漿樣 品且將其儲存在-2〇°C下直至進行藥物及VEGF-Α濃度之分 析。 使用相同研究設計，研究在以3 mg/kg向雄性食蟹猴 (N=3 ’ 約4 kg)IV 投藥後的 385A08-Fn-V2B-Cys(未經 his 標 記）。3週研究及另外3週洗滌週期後，向同一猴再給與相 φ 同劑量之385A08_Fn-V2B-Cys(未經his標記），其中在給藥 後至多一週收集血液樣品。 資料分析 資料表示為平均值±標準偏差（SD)。 ’’ 藉由血聚（血清）濃度與時間資料之非隔室分析 (KINETICA™ 軟體，4.2 版，InnaPhase Corporation, Philadelphia，PA)，獲得 385A〇8_Fn_V2B_Cys(經 his標記及 未經his標記）之藥物動力學參數。直接自實驗觀測結果記 錄峰值濃度（Cmax)及Cmax之時刻。使用線性及1〇g梯形求 140513.doc -131 · 201000118 和之組合，計算自〇時刻至最後取樣時刻之曲線下面積 (AUC(O-T))及自0時刻至無限遠之曲線下面積 (AUC(INF))。在IV投藥後估算總體血漿清除率（CLTp)、穩 態分布體積（Vss)、終末半衰期（T1/2)及平均滯留時間 (MRT) 〇使用最少3個具有可量化濃度之時間點估算AUC及 T1/2。 使用SAAM 11(1.2.1版，Seattle，WA)將小鼠及猴中產生 之385A08-Fn-V2B-Cys(經his標記及未經his標記）之藥物動 力學（PK)及藥效學（PD)資料模型化。對於在IV及IP給與5 及50 mg/kg後獲得之小鼠PK資料而言，使用聯合一級吸收 動力學之雙隔室模型同時擬合原始彙集血清濃度-時間資 料。 使用間接反應模型將量測為血漿或血清中之mVEGF-A 或hVEGF-A濃度之PD反應模型化，其中假定在385A08-Fn-V2B-Cys(經his標記及未經his標記）存在下VEGF-A之產生 未改變且作為VEGF-A主要清除途徑的VEGF-A與VEGFR-2 之結合由 385A08-Fn-V2B-Cys(經his標記及未經his標記）阻 斷。 【圖式簡单說明】 圖1各種HTPP純化之V/I以1QFn3為主之結合子顯示類似 表現概況。如所示：「GS5」（SEQ ID NO: 21)及「GS10」 (SEQ ID NO: 22)； 圖2 HTPP純化之構築體385A08-Fn-V2B之SEC顯示主要 單體蛋白質； 140513.doc -132- 201000118 圖3 HTPP純化之構築體V2B-Fn-385A08之SEC顯示單體 蛋白質與二聚體蛋白質之混合物； 圖4某些V/I以1GFn3為主之結合子的如藉由LC-MS量測之 分子量及藉由DSC測定之Tm。如所示：「GS10」（SEQ ID NO: 22)； 圖 5 385A08-Fn-V2B-cys(聚乙二醇化，無 his標籤）之 SEC 顯示此蛋白質中95.1 %為單體； 圖 6 385A08-Fn-V2B-cys(聚乙二醇化，無 his標籤）之 DSC 分析顯示該蛋白質在56°C下展開一半，且至多45°C下未偵 測到展開； 圖7給與構築體385A08-Fn-V2B-Cys之40 KD分枝或線性 聚乙二醇化型式的小鼠顯示分枝半衰期為14.6小時且相對 而言線性半衰期為10.5小時。如圖中所指示，向若干個別 小鼠給與構築體之分枝或線性聚乙二醇化型式； 圖8 VEGFR2/IGF-IR串聯在細胞中等效於VEGFR2或 IGF-IR個別結合子。在Biacore檢定中測試構築體與IGF-IR 之結合，且在Ba/F3及Rh41檢定中測試構築體以測定 IC50(參見實例5及7)。分子形式之序列描述於實例1中。如 所示：rGS5」（SEQ ID NO: 21)及「GS10」（SEQ ID NO: 22)； 圖9評估某些V/I以1GFn3為主之結合子對於IGF-IR及 VEGFR2之動力學行為。如所示：「GS10」（SEQ ID NO: 22)； 圖10評估聚乙二醇化構築體385A08-Fn-V2B-cys之His標 140513.doc -133- 201000118 藏及無his標籤型式對於IGF-IR及VEGFR2之動力學行為； 圖 11 以細胞株 293:KDR評估 Peg-V2BShort及 385A08-Fn-V2B-cys(具有PEG及his標籤）與經標記之Peg-V2BShort競爭 細胞結合之VEGFR-2的相對能力； 圖 12 以細胞株 R+評估 AT580-PEG40 及 385A08-Fn-V2B-cys(具有PEG及his標籤）與經標記之AT580-PEG20-AT580競 爭細胞結合之IGF-IR的相對能力； 圖13在基於細胞之檢定Rh41及HMVEC-L中評估V/I以 10Fn3為主之結合子。如所示：「GS5」（SEQ ID NO: 21)及 「GS10」（SEQ ID NO: 22); 圖14在基於細胞之檢定NCI-H929及Ba/F3中，與對照相 比較，評估所選構築體（包括his標籤及無his標籤之聚乙二 酵化構築體385A98-Fn-V2B-Cys)的活性； 圖 15 HEK293/KDR 及 PAE/KDR 細胞表現 VEGFR2 及 IGF-IR且兩種受體在其同源配位體存在下活化。將經KDR (VEGFR2)轉染之HEK293及PAE細胞用VEGF、IGF1或兩種 因子（VEGF/IGF1)刺激。探測細胞溶胞物中磷酸化 VEGFR(p-Flk-l/Tyr996)、磷酸化IGF-IR、磷酸化 Akt、磷 酸化MAPK或總肌動蛋白之西方墨點； 圖16以纖維連接蛋白為主之架構多聚體阻斷VEGFR2及 IGF-IR配位體誘導之磷酸化且抑制HEK293/KDR細胞之增 殖。如實例8中所述，將細胞用VEGF及IGF1(「-」指示未 經刺激之對照）及纖維連接蛋白架構域蛋白質處理。探測 細胞溶胞物中磷酸化VEGFR(p-Flk-l/Tyr996)、總 140513.doc -134- 201000118 VEGFR(Flk-l)、填酸化 IGF-IR、總 IGF-IR、磷酸化 Akt、 總Akt、磷酸化ΜΑΡΚ、總MAPK或總肌動蛋白之西方墨 點。在暴露於各種構築體後藉由[3η]-胸苷併入法評估細胞 增殖，且結果以IC5〇形式報導。如所示：「GS5」（SEQ ID NO: 21)及「GS10」（SEQ ID NO: 22); 圖17以纖維連接蛋白為主之架構多聚體阻斷VEGFR2及 IGF-IR配位體誘導之填酸化且抑制HEK293/KDR細胞之增 殖。如實例8中所述，將細胞用VEGF及IGF 1及纖維連接蛋 白架構域蛋白質處理。探測細胞溶胞物中磷酸化 VEGFR(p-Flk-l/Tyr996)、總 VEGFR(Flk-l)、磷酸化IGF-IR、總IGF-IR、磷酸化Akt、總Akt、磷酸化MAPK、總 MAPK或總肌動蛋白之西方墨點。在暴露於各種構築體後 藉由[3H]-胸苷併入法評估細胞增殖，且結果以IC5Q形式報 導。如所示：「GS5」（SEQ ID NO: 21)及「GS10」（SEQ ID NO: 22)； 圖18細胞增殖檢定：在暴露72小時後各種V/I以1GFn3為 主之結合子在HMVEC細胞中之作用； 圖19西方墨點分析：將HMVEC-L細胞暴露於遞增濃度 之各種構築體1小時，接著在37°C下用VEGF/IGF-1配位體 (均為50 ng/ml最終濃度）活化10 min，接著溶解。藉由比較 未經處理之樣品與經處理樣品中磷酸信號之比率且在正規 化為用作内對照之GAPDH後，量測對pIGF-lR、pAkt及 ρΜΑΡΚ活性之抑制； 圖20西方墨點分析：將Rh41細胞暴露於遞增濃度之化合 140513.doc -135- 201000118 物η、時，接著在37t下用配位體（5〇 ng/mi)活化ι〇 mm，接著溶解。藉由比較未經處理之樣品與經處理樣品 中磷酸信號之比率且在正規化為用作内對照之GAPDH 後’量測pIGF-lR及pAkt活性； 圖21在暴露1小時後各種構築體對HMVec_l細胞中鈣釋 放之作用。將細胞在EBM培養基中血清饑餓隔夜且接著在 遞增里之各種構築體存在下培育丨小時。將該等細胞用％ ng/ml VEGF配位體刺激。在添加配位體6〇秒後量測（^2+通 量； 圖22 RH-41腫瘤異種移植模型中單劑量含量下經聚乙二 醇化經his標s己385A08-Fn-V2B-cys的抗腫瘤活性。a 3χ週 x3方案後的生長曲線。β.顯示當與經媒劑處理之組相比較 時在一個TVDT内TGI高於50〇/。的。/。生長抑制曲線圖。（▼) 指示給藥方案； 圖23 RH-41腫瘤異種移植模型中多次劑量含量下經聚乙 二醇化經his標記385A08-Fn-V2B-cys的抗腫瘤活性。Α、 Β、C及D列出各藥劑之指定劑量含量。（▼)指示給藥方 案； 圖24 Α549腫瘤異種移植肺模型中多次劑量含量下經聚 乙二醇化經his標記385A08-Fn-V2B-cys的抗腫瘤活性。指 定劑量含量展示於A及C中，其中相應。/〇 TGI展示於3及〇 中。（▼)指示給藥方案； 圖25 GEO腫瘤異種移植結腸模型中多次劑量含量下經 聚乙二醇化經his標記385A08-Fn-V2B-cys的抗腫瘤活性。 140513.doc .136- 201000118 指定劑量含量展示於A及C中，其中相應％ TGI展示於B及 D中。（▼)指示給藥方案； 圖26 A673尤文氏肉瘤異種移植腫瘤中經聚乙二醇化經 his標記385A08-Fn-V2B-cys介導之腫瘤生長抑制可與單連 接素PEG-V2B-short(—種聚乙二醇化抗VEGFR-2黏附素）相 當； 圖27 3 85A08-Fn-V2B-cys(具有his)之藥物動力學參數； 圖28在向帶有A673腫瘤之裸小鼠腹膜内投與20及200 mg/kg 後 3 85 A08-Fn-V2B-cys(具有 his)及 mVEGF-Α 之擬合 與觀測之血漿濃度-時間曲線； 圖29在向帶有A673腫瘤之裸小鼠腹膜内投與20及200 mg/kg 後 3 85A08-Fn-V2B-cys(無 his)及 mVEGF-A 之擬合與 觀測之血漿濃度-時間曲線； 圖30猴中385A08-Fn-V2B-cys(具有his)之藥物動力學參 數； φ 圖31在向猴靜脈内投與3及30 mg/kg後385A08-Fn-V2B- cys(具有his)及hVEGF-A之擬合與觀測之血漿濃度-時間曲 線， 圖32猴中385A08-Fn-V2B-cys(無his標籤）之藥物動力學 參數；及 圖33在向猴靜脈内投與3 mg/kg(第一劑）後385A08-Fn-V2B-cys(無his)及hVEGF-A之擬合與觀測之血漿濃度-時間 曲線。 140513.doc •137- 201000118 序列表 <110>美商必治妥美雅史谷比公司 <no>以多價纖維連接蛋白為主之架構域蛋白質 <130> C0TH-525-W01 <140> 098117110 <141> 2009-05-22 <150〉 61/128,651 <151> 2008-05-22 <160> 72 <170> Patentln version 3.5
<210> 1 <211> 94 <212〉 PRT <213>人工序列 <220> <221> source <223>註釋=「人工序歹之描述：合成多肽」 <400> 1
Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr 15 10 15
Ser Leu Leu lie Ser Trp Asp Ala Pro Ala Val Thr Val Arg Tyr Tyr 20 25 30
Arg lie Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gin ΰΐυ Phe 35 40 45
Thr Val Pro Gly Ser Lys Ser Thr Ala Thr He Ser Gly Leu Lys Pro 50 55 60
Gly Val Asp Tyr Thr lie Thr Val Tyr Ala Val Thr Gly Arg Gly Asp 65 70 75 80
Ser Pro Ala Ser Ser Lys Pro He Ser lie Asn Tyr Arg Thr 85 90 <210> 2 <211> 10 <212> PRT <213>人工序列 <220> <221〉 source <223>註釋=「人工序列之描述：合成多肽」 <400> 2 140513-序列表.doc 201000118
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Thr Arg Phe Arg Asp Tyr Gin Pro 1 5 <210> 5 <211> 10 <212> PRT <213>人工序歹 <220> <221> source <223>註釋=「人工序列之描述：合成肽」 <400> 5
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Tyr Tyr Arg lie Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gin 35 40 45
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Arg Asp Tyr Gin Pro lie Ser lie Asn Tyr Arg Thr Glu lie Asp Lys 85 90 95
Pro Ser Thr Ser Thr Ser Thr Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu 100 105 110
Val Val Ala Ala Thr Pro Thr Ser Leu Leu lie Ser Trp Arg His Pro 115 120 125
His Phe Pro Thr Arg Tyr Tyr Arg lie Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly 130 135 140
Asn Ser Pro Val Gin Glu Phe Thr Val Pro Leu Gin Pro Pro Thr Ala 145 150 155 160 140513·序列表.doc 201000118
Thr He Ser Gly Leu Lys Pro Gly Val Asp Tyr Thr lie Thr Val Tyr 165 170 175
Ala Val Thr Asp Gly Arg Asn Gly Arg Leu Leu Ser lie Pro lie Ser 180 185 190 lie Asn Tyr Arg Thr Glu lie Asp Lys Pro Ser Gin 195 200 <210> 9 <211> 204 <212> PRT <213>人工序列 <220> <221> source <223>註釋=「人工序列之描述：合成多肽」 <400> 9
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Pro Ser Thr Ser Thr Ser Thr Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu 100 105 110
Val Val Ala Ala Thr Pro Thr Ser Leu Leu lie Ser Trp Arg His Pro 115 120 125
His Phe Pro Thr Arg Tyr Tyr Arg lie Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly 130 135 140
Asn Ser Pro Val Gin Glu Phe Thr Val Pro Leu Gin Pro Pro Thr Ala 145 150 155 160 -4- 140513·序列表.doc 201000118
Thr lie Ser Gly Leu Lys Pro Gly Val Asp Tyr Thr lie Thr Val Tyr 165 170 175
Ala Val Thr Asp Gly Arg Asn Gly Arg Leu Leu Ser lie Pro lie Ser 180 185 190 lie Asn Tyr Arg Thr Glu lie Asp Lys Pro Cys Gin 195 200 <210> 10 <211> 207 <212> PRT <213>人工序列 <220> <221> source <223>註釋=「人工序列之描述：合成多肽」
<400> 10
Met Gly Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr 1 5 10 15
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Pro Thr Ala Thr lie Ser Gly Leu Lys Pro Gly Vai Asp Tyr Thr lie 165 170 175
Thr Val Tyr Ala Val Thr Asp Gly Arg Asn Gly Arg Leu Leu Ser lie 180 185 190
Pro lie Ser lie Asn Tyr Arg Thr Glu lie Asp Lys Pro Ser Gin 195 200 205 <210> 11 <211> 217 <212> PRT <213>人工序列 <220> <221> source <223>註釋=「人卫序列之描述：合成多肽」 <400> 11
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Pro Thr Ser Leu Leu lie Ser Trp Ser Ala Arg Leu Lys Val Ala Arg 20 25 30
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Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr Ser Leu Leu lie Ser Trp Ser Ala 130 135 140
Arg Leu Lys Val Ala Arg Tyr Tyr Arg lie Thr Tyr Gly Glu Thr Gly 145 150 155 160
Gly Asn Ser Pro Val Gin Glu Phe Thr Val Pro Lys Asn Val Tyr Thr 140513-序列表.doc - 10- 201000118 165 170 175
Ala Thr lie Ser Gly Leu Lys Pro Gly Val Asp Tyr Thr lie Thr Val 180 185 190
Tyr Ala Val Thr Arg Phe Arg Asp Tyr Gin Pro lie Ser lie Asn Tyr 195 200 205
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Pro Cys Gin
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Gly Pro Gly Pro Gly Pro Gly Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu 100 105 110
Val Val Ala Ala Thr Pro Thr Ser Leu Leu lie Ser Trp Arg His Pro 115 120 125
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<400> 34
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Arg Leu Lys Val Ala Arg Tyr Tyr Arg lie Thr Tyr Gly Glu Thr Gly 20 25 30
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Met Gly Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr 15 10 15
Pro Thr Ser Leu Leu lie Ser Trp Ser Ala Arg Leu Lys Val Ala Arg 20 25 30
Tyr Tyr Arg lie Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gin 35 40 45
Glu Phe Thr Val Pro Lys Asn Val Tyr Thr Ala Thr lie Ser Gly Leu 50 55 60
Lys Pro Gly Val Asp Tyr Thr lie Thr Val Tyr Ala Val Thr Arg Phe 65 70 75 SO
Arg Asp Tyr Gin Pro lie Ser lie Asn Tyr Arg Thr 85 90 <210> 37 <211> 96 <212> PRT <213>人工序列 <220> <221> source <223>註釋=「人工序列之描述：合成多肽」 <400> 37
Met Gly Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr 1 5 10 15
Pro Thr Ser Leu Leu lie Ser Trp Ser Ala Arg Leu Lys Val Ala Arg 20 25 30
Tyr Tyr Arg lie Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gin 35 40 45
Glu Phe Thr Val Pro Lys Asn Val Tyr Thr Ala Thr lie Ser Gly Leu 50 55 60
Lys Pro Gly Val Asp Tyr Thr lie Thr Val Tyr Ala Val Thr Arg Phe 65 70 75 80 -20- 140513-序列表.doc 201000118 rvi g, rvay
Tyr Gin Pro lie Ser lie Asn Tyr Arg Thr Glu lie Asp Lys 85 90 95 <210> 3B <211> 97 <212> PRT <213>人工序列 <220> <221> source <223>註釋=「人工序列之描述：合成多肽」 <400> 38
Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Va] Val Ma Ala Thr Pro Thr 1 5 ' 10 15
Ser Leu Leu lie Ser Trp Ser Ala Arg Leu Lys Val Ala Arg Tyr Tyr 20 25 30
Arg lie Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gin Glu Phe 35 40 45
Thr Val Pro Lys Asn Val Tyr Thr Ala Thr lie Ser Gly Leu Lys Pro 50 55 60
Gly Val Asp Tyr Thr lie Thr Val Tyr Ala Val Thr Arg Phe Arg Asp 65 70 75 80
Tyr Gin Pro He Ser lie Asn Tyr Arg Thr Glu lie Asp Lys Pto Ser 85 90 95
Gin
<210> 39 <211> 97 <212> PRT <213>人工序列 <220> <221> source <223>註釋=「人工序列之描述：合成多肽」 <400> 39
Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr 1 5 10 15
Ser Leu Leu lie Ser Trp Ser Ala Arg Leu Lys Val Ala Arg Tyr Tyr 20 25 30
Arg lie Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gin Glu Phe •21 · 140513-序列表.doc 201000118 35 40 45
Thr Val Pro Lys Asn Val Tyr Thr Ala Thr lie Ser Gly Leu Lys Pro 50 55 60
Gly Val Asp Tyr Thr lie Thr Val Tyr Ala Val Thr Arg Phe Arg Asp 65 70 75 80
Tyr Gin Pro He Ser He Asn Tyr Arg Thr Glu lie Asp Lys Pro Cys 85 90 95
Gin 歹 序T工 4086PR人 0>1>2>3> 1*·,*ΊΑ | · 2 2 <220> <221> source <223>註釋=「人工序列之描述：合成多肽」 <400> 40
Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr Ser Leu Leu lie Ser Trp Arg His 15 10 15
Pro His Phe Pro Thr Arg Tyr Tyr Arg lie Thr Tyr Gly Glu Thr Gly 20 25 30
Gly Asn Ser Pro Val Gin Glu Phe Thr Val Pro Leu Gin Pro Pro Thr 35 40 45
Ala Thr lie Ser Gly Leu Lys Pro Gly Val Asp Tyr Thr He Thr Val 50 55 60
Tyr Ala Val Thr Asp Gly Arg Asn Gly Arg Leu Leu Ser lie Pro He 65 70 75 80
Ser lie Asn Tyr Arg Thr 85 <210> 41 <21i> 94 <212> PRT <213>人工序列 <220> <22】> source <2幻> 註釋=「人工序列之描述：合成多肽」 -22· 140513-序列表.doc 201000118 CWV>
Val Set Asp Val Pto Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr 15 10 15
Ser Leu Leu lie Ser Trp Arg His Pro His Phe Pro Thr Arg Tyr Tyr 20 25 30
Arg lie Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gin Glu Phe 35 40 45
Thr Val Pro Leu Gin Pro Pro Thr Ala Thr lie Ser Gly Leu Lys Pro 50 55 60
Gly Val Asp Tyr Thr lie Thr Val Tyr Ala Val Thr Asp Gly Arg Asn 65 70 75 80
Gly Arg Leu Leu Ser lie Pro lie Ser lie Asn Tyr Arg Thr _ 85 90 <210> 42 <211> 100 <212> PRT <213>人工序列 <220> <221> source <223>註釋=「人工序列之描述：合成多肽」 <_> 42
Met Gly Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr 15 10 15
Pro Thr Ser Leu Leu lie Ser Trp Arg His Pro His Phe Pro Thr Arg 20 25 30
Tyr Tyr Arg lie Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gin 35 40 45
Glu Phe Thr Val Pro Leu Gin Pro Pro Thr Ala Thr lie Ser Gly Leu 50 55 60
Lys Pro Gly Val i\sp Tyr Thr lie Thr Val Tyr Ala Val Thr Asp Gly 65 70 75 80
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Glu lie Asp Lys 100 •23- 140513-序列表.doc 201000118 <21ϋ> 43 <211> 101 <212> PRT <213>人工序列 <220> <221> source <223>註釋=「人工序歹之描述：合成多肽」 <400> 43
Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr 15 10 15
Ser Leu Leu He Ser Trp Arg His Pro His Phe Pro Thr Arg Tyr Tyr 20 25 30
Arg lie Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gin Glu Phe 35 40 45
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Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr 15 10 15
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Arg lie Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gin Glu Phe 35 40 45
Thr Val Pro Leu Gin Pro Pro Thr Ala Tlir lie Ser Gly Leu Lys Pro 50 55 60 • 24- 140513-序列表.doc 201000118 65 sp Tyr Thr lie Thr Val Tyr 70
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<210> 45 <211> 10 <212> PRT - <2D>人工序列 <220> <221> source <223>註釋=「人工序列之描述：合成肽」 參 <400> 45
Met Gly Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu 1 5 10 <210> 46 <2I1> 8 <2i2> PRT <213>人工序列 <220> <221〉 source <223>註釋=「人工序歹ij之描述：合成肽」 <400> 46
Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu
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Glu Val Val Ala Ala Thr Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 15 10 15
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Asn Gly Arg Leu Leu Ser He Pro Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 165 170 175
Xaa Xaa lie Ser lie Asn Tyr Arg Thr 180 185 •27 140513-序列表.doc 201000118 <210> 48 <211> 9 <212> PRT <213>人工序列 <220> <221> source <223>註釋=「人工序列之描述：合成肽」 <400> 48
Giy Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu 1 5 <210> 49 <211> 181 <212> PRT <213>人工序列 <220> <221> source <223>註釋=「人工序列之描述：合成多肽」 <220> <221> MOD一 RES <222> (7).,(21) <223>任何胺基酸 <220〉 <221> VARIANT <222> (7)..(21) <223> 置換=“，， <220> <221> ®D_RES <222> (26)..(35) <223>任何胺基酸 <220> <221> VARIANT <222> (26)..(35) <223> 置換=“” <220> <221> M0D—RES <222> (46)..(55) <223>任何胺基酸 <220> <221> VARIANT <222> (46)..(55) <223> 置备=“” <220> <221> M0D.RES <222> (64)..(83) <223>任何胺基酸 <220> -28- 140513·序列表.doc 201000118 <221> VARIANT <222> (64)..(83) <223> 置換=“，， <220> <221> MOD_RES <222> (89)..(98) <223>任何胺基酸 <220> <221> VARIANT <222> (89)..(98) <223> 置換=“，’ <220> <221> MOD_RES <222> (105)..(114) <223>任何胺基酸 <220> <221> VARIAKT <222> (105)..(114) <223〉 置換 Ο <220> <221> M0D„RES <222> (118).,(137) <223>任何胺基酸 <220> <221> VARIANT <222> (118)..(137) <223> 置換= <220> <221> MOD一RES <222> (147).,(156) <223>任何胺基酸 <220〉
©<221> VARIANT <222> (147).,(156) <223> 皇择= <220> <221> MOD一RES <222> (165)..(174) * <223>任何胺基酸 <220> <221> VARIANT <222> (165)..(174) <223> 置換= <400> 49
Glu Val Val Ala Ala Thr Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 15 10 15
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ser Leu Leu lie Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 20 25 30
Xaa Xaa Xaa Ser Trp Ser Ala Arg Leu Lys Val Ala Arg Xaa Xaa Xaa -29- 140513-序列表.doc 201000118 35 40 45
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Tyr Arg lie Thr Tyr Gly Glu Xaa 50 55 60
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 65 70 75 80
Xaa Xaa Xaa Gin Glu Phe Thr Val Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 85 90 95
Xaa Xaa Pro Lys Asn Val Tyr Thr Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 100 105 110
Xaa Xaa Ala Thr lie Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 115 120 125
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Asp Tyr Thr lie Thr Val Tyr 130 135 140
Ala Val Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Thr Arg Phe Arg 145 150 155 160
Asp Tyr Gin Pro Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa lie Ser 165 170 175 lie Asn Tyr Arg Thr 180 <210> 50 <21I> 5 <212> PRT <213〉人工序歹 <220> <221> source <223>註釋=「人工序列之描述：合成肽」 <400> 50
Glu He Asp Lys Pro 1 s <210> 51 <211> 6 <212> PRT <213>人工序列 <220> <221> source <223>註釋=「人工序列之描述：合成肽」 140513-序列表.d〇e -30- 201000118 <400> 51
Glu lie Asp Lys Pro Ser 1 5 <210> 52 <211> 6 <212> PRT <2】3>人工序列 <220> <221> source <223>註釋==「人工序列之描述：合成肽」 <400> 52
Giu lie Asp Lys Pro Cys
<210> 53 <211> 9 <212> PRT <213>人工序列 <220> <221> source <223〉註釋=「人工序歹*J之描述：合成肽」 <220>
<221〉VARIANT <222> (1)..(2) <223> 置換= <220> <221> misc_feature <222> (1)..(2) <223>註釋=「序列中給出之殘基並不優先於註解中該 m 等位置之彼等殘基」 W <400> 53
Met Gly Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu I 5 <210> 54 <211> 8 <212> <213>人工序列 <220> <221> source <223>註釋=「人工序列之描述：合成肽」 <220>
<221〉 VARIANT <222> (1)..(2) <223> 置換= <220> 140513-序列表.doc -31 - 201000118 <221> misc一feature <222> (1)..(2) <2W>註釋=「序列中給出之殘基並不優先於註解中 該等位置之彼等殘基 <400> 54
Met Gly Asp Vai Pro Arg Asp Leu 1 5 <210> 55 <21i> 7 <212> PRT <213>人工序列 <220> <221> source <223>註釋=「人工序列之描述：合成肽」 <220> <221> VARIANT <222> (1)..(2) <223> 置換= <220> <221> misc_feature <222> (1).,(2) <223>註釋=「序列中給出之殘基並不優先於註解中 該等位置之彼等殘基」 <400> 55
Met Gly Val Pro Arg Asp Leu 1 5 <210> 56 <211> 6 <212> PRT <213>人工序列 <220> <221> source <223>註釋=「人工序列之描述：合成狀」 <220> <221> VARIANT <222> (1)..(2) <223>置換= <220> <221> misc feature <222> (1).7(2) <223> <400> 56 基並不優先於註解中
Met Gly Pro Arg Asp Leu 140513-序列表.doc •32· 201000118 <210> 57 <211> 5 <212> PRT <213>人工序列 <220> <221> source<223>註釋= 人工序列之描述：合成肽 參 <220> <221> VARIANT <222> (1)..(2)<223> 置換=“，， <220> <221> misc_feature <222> {1)..(2)從3〉註釋=「序列中給出之殘其該等位置之彼等殘基土優先於註解中’ <400> 57 」 Met Gly Arg Asp Leu 1 ς <210> 58 <211> 4 <2I2> PRT <213>人工序列 <220> <221> source <223> 註#= 人工序列之描述··合成肽」 <220> <221> VARIAOT A <222> (1)..(2) <223> 置換=“，， <220> <221> raise,feature <222> (1)..(2) , <223> t給A之魅並不航於註解中 <400>f等位置之彼等殘基」
Met Gly Asp Leu 1 <210> 59 <211> 6 <212> PRT <213>人工序列 <220> <221> source 籤. <223>註釋=「人卫序狀描述··減祕s標 140513-序列表.doc -33- 201000118 <400> 59
His His His His His His <210〉 60 <211> 6 <212> PRT <213>人工序列 <220〉 <22】> source <223>註釋=「人工序列之描述：合成肽」 <400> 60
Pro Ala Pro Ala Pro Ala 1 5 <210> 61 <211> 12 <212> PRT <213>人工序列 <220> <221> source <223>註釋=「人工序列之描述：合成肽」 <400> 61
Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala 1 5 10 <210> 62 <211> IS <212> PRT <213>人工序列 <220> <221> source .. <223>註釋=「人工序列之描述：合成肽」 <400> 62
Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala 15 10 15
Pro Ala <210> 63 <211> 199 <212> PRT <213>人工序列 <220> <221> source <223>註釋=「人工序列之描述：合成多肽」 • 34· 140513-序列表.doc 201000118
Met Gly Va] Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr 15 10 15
Pro Thr Ser Leu Leu lie Ser Trp Ser Ala Arg Leu Lys Val Ala Arg 20 25 30
Tyr Tyr Arg He Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gin 35 40 45
Glu Phe Thr Val Pro Lys Asn Val Tyr Thr Ala Thr lie Ser Gly Leu 50 55 60
Lys Pro Gly Val Asp Tyr Thr He Thr Val Tyr Ala Val Thr Arg Phe 65 70 75 SO
Arg Asp Tyr Gin Pro lie Ser He Asn Tyr Arg Thr Glu Pro Ser Thr φ 85 90 95
Ser Thr Ser Thr Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala 100 105 110
Ala Thr Pro Thr Ser Leu Leu lie Ser Trp Arg His Pro His Phe Pro 115 120 125
Thr Arg Tyr Tyr Arg lie Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro 130 135 140
Val Gin Glu Phe Thr Val Pro Leu Gin Pro Pro Thr Ala Thr lie Ser 145 150 155 160
Gly Leu Lys Pro Giy Val Asp Tyr Thr lie Thr Val Tyr Ala Val Thr 165 170 175
Asp Gly Arg Asn Gly Arg Leu Leu Ser lie Pro lie Ser lie Asn Tyr 180 185 190
Arg Thr Glu Gly Ser Gly Ser 195 <210> 64 <211> 199 <212> PRT <213>人工序列 <220> <221> source <223>註釋=「人工序列之描述：合成多肽」 <400> 64 -35- 140513-序列表.doc 201000118
Met Gly Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr 15 10 15
Pro Thr Ser Leu Leu lie Ser Trp Ser Ala Arg Leu Lys Val Ala Arg 20 25 30
Tyr Tyr Arg lie Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gin 35 40 45
Glu Phe Thr Val Pro Lys Asn Val Tyr Thr Ala Thr lie Ser Gly Leu 50 55 60
Lys Pro Gly Val Asp Tyr Thr lie Thr Val Tyr Ala Val Thr Arg Phe 65 70 75 80
Arg Asp Tyr Gin Pro lie Ser lie Asn Tyr Arg Thr Glu Pro Ser Thr 85 90 95
Ser Thr Ser Thr Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala 100 105 110
Ala Thr Pro Thr Ser Leu Leu lie Ser Trp Arg His Pro His Phe Pro 115 120 125
Thr Arg Tyr Tyr Arg lie Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro 130 135 140
Val Gin Glu Phe Thr Val Pro Leu Gin Pro Pro Thr Ala Thr lie Ser 145 150 155 160 G]y Leu Lys Pro Gly Val Asp Tyr Thr lie Thr Val Tyr Ala Val Thr 165 170 175
Asp Gly Arg Asn Gly Arg Leu Leu Ser lie Pro lie Ser lie Asn Tyr 180 185 190
Arg Thr Glu Gly Ser Gly Cys 195 <210> 65 <211> 198 <212> PRT <213>人工序列 <220> <221> source <223>註釋=「人工序列之描述：合成多肽」 <400> 65
Met Gly Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr -36- 140513·序列表.doc 201000118 5 10 15
Pro Thr Ser Leu Leu lie Ser Trp Ser Ala Arg Leu Lys Val Ala Arg 20 25 30
Tyr Tyr Arg lie Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gin 35 40 45
Glu Phe Thr Val Pro Lys Asn Val Tyr Thr Ala Thr lie Ser Gly Leu 50 55 60
Lys Pro Gly Val Asp Tyr Thr lie Thr Val Tyr Ala Val Thr Arg Phe 65 70 75 80
Arg Asp Tyr Gin Pro lie Ser lie Asn Tyr Arg Thr Glu Pro Ala Pro 85 90 95
Ala Pro Ala Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala 100 105 110
Thr Pro Thr Ser Leu Leu lie Ser Trp Arg His Pro His Phe Pro Thr 115 120 125
Arg Tyr Tyr Arg He Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val 130 135 140
Gin Glu Phe Thr Val Pro Leu Gin Pro Pro Thr Ala Thr lie Ser Gly 145 150 155 160
Leu Lys Pro Gly Val Asp Tyr Thr lie Thr Val Tyr Ala Val Thr Asp 165 170 175
Gly Arg Asn Gly Arg Leu Leu Ser lie Pro lie Ser lie Asn Tyr Arg 180 185 190
Thr Glu Gly Ser Gly Ser 195 <2i0> 66 <211> 198 <212> PRT <213>人工序列 <220> <221> source <223>註釋=「人工序列之描述：合成多肽」 <400> 66
Met Gly Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr 1 5 10 15 140513-序列表.doc -37- 201000118
Pro Thr Ser Leu Leu lie Ser Trp Ser Ala Arg Leu Lys Val Ala Arg 20 25 30
Tyr Tyr Arg lie Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gin 35 40 45
Glu Phe Thr Vai Pro Lys Asn Val Tyr Thr Ala Thr lie Ser Gly Leu 50 55 60
Lys Pro Gly Val Asp Tyr Thr lie Thr Val Tyr Ala Val Thr Arg Phe 65 70 75 80
Arg Asp Tyr Gin Pro lie Ser lie Asn Tyr Arg Thr Glu Pro Ala Pro 85 90 95
Ala Pro Ala Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala 100 105 110
Thr Pro Thr Ser Leu Leu lie Ser Trp Arg His Pro His Phe Pro Thr 115 120 125
Arg Tyr Tyr Arg lie Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val 130 135 140
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Leu Lys Pro Gly Val Asp Tyr Thr lie Thr Val Tyr Ala Val Thr Asp 165 170 175
Gly Arg Asn Gly Arg Leu Leu Ser lie Pro lie Ser lie Asn Tyr Arg 180 185 190
Thr Glu Gly Ser Gly Cys 195 列序 4 τ ^ 6720PR人 0>1>2>3> 11 11 11 1 <2<2<2<2 <220> <221> source <223>註釋=「人工序列之描述：合成多肽」 <400> 67
Met Gly Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr 15 10 15 -38- 140513-序列表.doc 201000118
Pro Thr Ser Leu Leu lie Ser Trp Ser Ala Arg Leu Lys Val Ala Arg 20 25 30
Tyr Tyr Arg lie Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gin 35 40 45
Glu Phe Thr Val Pro Lys Asn Val Tyr Thr Ala Thr lie Ser Gly Leu 50 55 60
Lys Pro Gly Val Asp Tyr Thr lie Thr Val Tyr Ala Val Thr Arg Phe 65 70 75 80
Arg Asp Tyr Gin Pro lie Ser lie Asn Tyr Arg Thr Glu Pro Ala Pro 85 90 95
Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Val Ser Asp Val Pro Arg Asp 100 105 110
Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr Ser Leu Leu lie Ser Trp Arg 115 120 125
His Pro His Phe Pro Thr Arg Tyr Tyr Arg lie Thr Tyr Gly Glu Thr 130 135 140
Gly Gly Asn Ser Pro Va] Gin Glu Phe Thr Val Pro Leu Gin Pro Pro 145 150 155 160
Thr Ala Thr lie Ser Gly Leu Lys Pro Gly Val Asp Tyr Thr lie Thr 165 170 175
Val Tyr Ala Val Thr Asp Gly Arg Asn Gly Arg Leu Leu Ser lie Pro 180 185 190 lie Ser lie Asn Tyr Arg Thr Glu Gly Ser Gly Ser 195 200 <210> 68 <21!> 204 <212> PRT <213>人工序列 <220> <221> source <223>註釋= 「人工序列之描述：合成多肽」 <400> 68
Met Gly Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr 15 10 15 -39- 140513-序列表.doc 201000118
Pro Thr Ser Leu Leu lie Ser Trp Ser Ala Arg Leu Lys Val Ala Arg 20 25 30
Tyr Tyr Arg lie Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gin 35 40 45
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Lys Pro Gly Val Asp Tyr Thr lie Thr Val Tyr Ala Val Thr Arg Phe 65 70 75 80
Arg Asp Tyr Gin Pro lie Ser lie Asn Tyr Arg Thr Glu Pro Ala Pro 85 90 95
Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Val Ser Asp Val Pro Arg Asp 100 105 110
Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr Ser Leu Leu lie Scr Trp Arg 115 120 125
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Met Gly Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr 15 10 15
Pro Thr Ser Leu Leu He Ser Trp Ser Ala Arg Leu Lys Val Ala Arg -40- 140513·序列表.doc 201000118 20 25 30
Tyr Tyr Arg lie Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gin 35 40 45
Glu Phe Thr Val Pro Lys Asn Val Tyr Thr Ala Thr He Ser Gly Leu 50 55 60
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Scr Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr Ser 115 120 125
Leu Leu lie Ser Trp Arg His Pro His Phe Pro Thr Arg Tyr Tyr Arg 130 135 140 lie Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gin Glu Phe Thr 145 150 155 160
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Met Gly Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr 1 5 10 15 -41 - 140513-序列表.doc 201000118
Pro Thr Ser Leu Leu lie Ser Trp Ser Ala Arg Leu Lys Val Ala Arg 20 25 30
Tyr Tyr Arg lie Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gin 35 40 45
Glu Phe Thr Val Pro Lys Asn Val Tyr Thr Ala Thr lie Ser Gly Leu 50 55 60
Lys Pro Gly Val Asp Tyr Thr lie Thr Val Tyr Ala Val Thr Arg Phe 65 70 75 80
Arg Asp Tyr Gin Pro lie Ser lie Asn Tyr Arg Thr Glu Pro Ala Pro 85 90 95
Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Val 100 105 110
Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr Ser 115 120 125
Leu Leu lie Ser Trp Arg His Pro His Phe Pro Thr Arg Tyr Tyr Arg 130 135 140 lie Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gin Glu Phe Thr 145 150 155 160
Val Pro Leu Gin Pro Pro Thr Ala Thr lie Ser Gly Leu Lys Pro Gly 165 170 175
Val Asp Tyr Thr lie Thr Val Tyr Ala Val Thr Asp Gly Arg Asn Gly 180 185 190
Arg Leu Leu Ser lie Pro lie Ser lie Asn Tyr Arg Thr Glu Gly Ser 195 200 205
Gly Cys 210 <210> 71 <211> 5 <212> PRT <213>人工序列 <220> <221> source <223>註釋=「人工序列之描述：合成肽」 -42- 140513·序列表.doc 201000118 <4υυ> η
Glu Gly Ser Gly Ser 1 5 <210> 72 <211> 5 <212> PRT <213>人工序列 <220> <221> source <2Μ>註釋=「人工序列之描述：合成肽」 <400> 72
Glu Gly Ser Gly Cys
43- 140513-序列表.doc

Claims (1)

  1. 201000118 七、申請專利範圍： 1. 一種多肽，其包含： (a) 包3第—纖維連接蛋白III型第十域（10Fn3)之N-末端 域其中》玄Fn3域⑴包含環AB、環BC、環CD、環 DE、環EF及環FG ’（ii)具有至少一個選自環Bc、DE及 • FG的相對於人類1GFn3域之相應環之序列具有改變之胺 基西夂序列的環，（lu)包含與SEQ ID n〇:丄至少一致之 胺基酸序列，及㈣以小於5〇〇 niy[之KD結合第-目標分 9 子； (b) 包含第二纖維連接蛋白ΙΠ型第十域（10Fn3)之C-末端 域其中該Fn3域⑴包含環AB、環BC、環CD、環 DE環抑及’（Π)具有至少一個選自環bc、DE及 FG的相對於該人類i〇Fn3域之該相應環之該序列具有改 變之胺基酸序列的環’（iii)包含與SEq ID NO: 1之該胺 基酸序列至少60% —致之胺基酸序列，及（iv)以小於5〇〇 φ nM之KD結合第二目標分子； 其中=亥第一 Fn3與該第二10ρ·η3域經由選自以甘胺酸_ 絲胺酸為主之連接子、以甘胺酸_脯胺酸為主之連接子或 SEQ ID NO: 20之胺基酸序列的多肽連接。 * 2.如請求項1之多肽，其中該第一 1〇Fn3域以小於10〇 nM之 kd結合第一目標分子且該第二丨〇Fn3域以小於1〇〇 nM之 KD結合第二目標分子。 3.如請求項1或2之多肽，其中該第—1〇Fn3及該第二、^ 域之該環BC及該環FG相對於該人類i〇Fn3域之該相應環 140513.doc 201000118 之該序列具有改變的胺基酸序列。 4. 如請求項1或2之多肽，其中該第一 1GFn3域在其C-末端與 SEQ ID NO: 19之胺基酸序列連接。 5. 如請求項1或2之多肽，其中該第二1GFn3域在其C-末端與 SEQ ID NO: 17或18之胺基酸序列連接。 6. 如請求項1之多肽，其係選自： (i) 包含SEQ ID NO: 8-15及29-31中任一者之胺基酸序 列的多肽；及 (ii) 包含與SEQ ID NO·· 8-15及29-31中任一者之胺基酸 序列至少80% —致之胺基酸序列的多肽。 7. 如請求項1、2及6中任一項之多肽，其進一步包含一或 多個選自以下之藥物動力學（PK)部分：聚氧伸烷基部 分、人類血清白蛋白結合蛋白、唾液酸、人類血清白蛋 白、IgG、IgG結合蛋白、運鐵蛋白及Fc片段。 8·如請求項7之多肽’其中該PK部分為該聚氧伸烷基部分 且該聚氧伸烷基部分為聚乙二醇。 9. 如請求項7之多肽，其中該ρκ部分與該多肽經由至少一 個雙硫鍵、肽鍵、多肽、聚合糖或聚乙二醇部分進行連 接。 10. 如請求項丨或2之多肽，其中該第一目標分子與該第二目 標分子相同。 11·如請求項1、2及6中任一項之多肽，其中該第一目標分 子與該第二目標分子不同。 12·如請求項1、2及6中任一項之多肽，其中該第一目標分 140513.doc -2 - 201000118 子為IGF-IR且該第二目標分子為VEGFR2。 13. 如請求項丨、2及6中任一項之多肽，其中該第一目標分 子為VEGFR2且該第二目標分子為IGF-IR。 14. 如請求項丨、2及6中任一項之多肽，其中該多肽經去免 . 疫’以移除一或多個T細胞抗原決定基。 • 15.如請求項i、2及6中任一項之多肽，其中該第一 1〇以3域 與该第二10Fn3域經由以甘胺酸-絲胺酸為主之連接子連 接。 16.如請求項15之多肽，其中該以甘胺酸_絲胺酸為主之連接 子係選自SEQ ID NO: 21及22之胺基酸序列。 I7·如請求項1、2及6中任一項之多肽，其中該第一 1〇1?113域 及該第二〗〇Fn3域係藉由包含以下步驟之方法來選擇· &) 產生一群各自包含與人類，n3域編碼序列不同之候選 1()Fn3域序列的候選核酸分子，該等核酸分子各自包含與 該候選1GFn3域編碼序列可操作連接之轉譯啟始序列及起 φ 始密碼子，且各自在3,末端與核酸-嗓吟黴素（puromycin) 連接子可操作連接；b)活體外轉譯該等候選^Fn；?域編碼 序列’以產生一群候選RNA_iGFn3融合體；c)使該群候 選RNA-1GFn3融合體與目標分子接觸；及句選擇rnA- • i〇Fn3融合體，該rNA J〇Fn3融合體之蛋白質部分對目標 分子相對於該人類1GFn3對該目標分子之結合親和力或特 異性’具有經改變的結合親和力或特異性。 18. —種包含如請求項1-17中任一項之多肽的醫藥學上可接 受之組合物’其中該組合物基本上不含内毒素。 140513.doc 201000118 19·如請求項丄'2及6中任一項之多肽，其中該第一、心域 與該第二10Fn3域經由以甘胺酸-脯胺酸為主之連接子連 接。 20. 如請求項19之多肽，其中該以甘胺酸_脯胺酸為主之連接 子係選自SEQ ID NO·· 32、33及34之胺基酸序列。 21. —種多肽，其包含： (a) 包含第一纖維連接蛋白出型第十域（1〇1?113)之1^末端 域，其中該10Fn3域⑴包含環AB、環BC、環CD、環 DE、環EF及環FG，（ii)具有至少一個選自環bc、DE及 FG的相對於人類1(>Fn3域之相應環之序列具有改變之胺 基酸序列的環，（iii)包含與SEQ ID NO·· 1至少60%—致之 胺基酸序列’及（iv)以小於500 nM之KD結合第一目標分 子； (b) 包含第二纖維連接蛋白Π][型第十域（i〇Fn3)2C_末端 域’其中該10Fn3域（i)包含環ab、環BC、環CD、環 DE、環EF及環FG，（ii)具有至少一個選自環bc、DE及 FG的相對於該人類iQFn3域之該相應環之該序列具有改 變之胺基酸序列的環’（iii)包含與SEq ID NO: 1之該胺 基酸序列至少60% —致之胺基酸序列，及（iv)以小於5 00 nM2KD結合第二目標分子； 其中該第一 10Fn3域與該第二1DFn3域經由以脯胺酸-丙 胺酸為主之多肽連接子連接。 22. 如請求項20之多肽，其係選自： ⑴包含SEQ ID NO: 63-70中任一者之胺基酸序列的多 140513.doc 201000118 肽；及 (ii)包含與SEQ ID NO: 63-70中任一者之該胺基酸序列 至少80% —致之胺基酸序列的多肽。 23. 如請求項21之多肽，其中該第一目標分子為IGF-IR且該 第二目標分子為VEGFR2。 24. 如請求項21之多肽，其中該第一目標分子為VEGFR2且 該第二目標分子為IGF-IR。
    140513.doc
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