TW200938631A - 1B20 PCSK9 antagonists - Google Patents

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200938631 六、發明說明： 【先前技術】 亦稱為神經細胞凋亡調節轉化酶1(「NARC-1」）之前蛋 白轉化酶枯草桿菌蛋白酶-可新型9(在下文中稱為 「PCSK9」）為鑑別為分泌性枯草桿菌酶家族之第9成員的 蛋白酶K樣枯草桿菌酶；參見Seidah等人，2003 PNAS 100:928-933。PCSK9之基因定位於人類染色體1ρ33-p34.3 ; Seidah等人，上述。PCSK9表現於能夠增殖及分化 之細胞中，該等細胞包括（例如）肝細胞、腎臟間質細胞、 腸回腸及結腸上皮細胞以及胚胎腦端腦神經元；Seidah等 人，上述。 PCSK9之最初合成係呈約72 kDa之非活性酶前驅體或酶 原形式，其在内質網（「ER」）中經歷自動催化、分子内加 工以活化其功能。已報導此内部加工事件在SSVFAQ | SIPWNL158 基元（分別為 SEQ ID NO: 19 及 SEQ ID NO: 20)處 發生；Benjannet 等人，2004 ·/. Biol. Chem. 279:48865-48875。該内部加工已報導為退出ER所需；Benjannet等 人，上述；Seidah等人，上述。經裂解且藉此經活化之蛋 白質係與經裂解之肽結合分泌；上述。 人類PCSK9之序列（約22 kb長，具有12個編碼692胺基酸 蛋白質之外顯子）在一種情況下可以寄存編號NP_777596.2 獲得。已寄存人類、小鼠及大鼠PCSK9核酸序列；分別參 見，例如GenBank寄存編號：AX127530(以及 AX207686)、 NP_705793(以及 Q80W65)及 P59996。PCSK9具有見於其他 137315.doc 200938631 前蛋白轉化酶中之若干結構域，包括N-末端信號序列、原 結構域、催化結構域及富半胱胺酸C末端結構域。PCSK9 催化結構域與枯草桿菌酶之蛋白酶K家族及尤其D186、 H226及S386之催化三元體共同具有高序列相似性。 PCSK9係揭示及/或主張於包括（但不限於）以下專利公開 案之若干專利公開案中：PCT公開案第WO 01/3 1007號、 第 WO 01/57081 號、第 WO 02/14358 號、第 WO 01/98468 號、第 WO 02/102993 號、第 WO 02/102994 號、第 WO 02/46383號、第 WO 02/90526號、第 01/77137號及第 WO 01/34768號；美國公開案第US 2004/0009553號及第US 2003/0119038號及歐洲公開案第EP 1 440 981號、第EP 1 067 182號及第 EP 1 471 152號。 PCSK9已被視為在肝細胞及神經元細胞之分化中起作用 (Seidah等人，上述），高度表現於胚胎肝臟中且與膽固醇 體内平衡密切相關。研究已表明PCSK9在膽固醇生物合成 或吸收中之特定作用。在膽固醇餵養大鼠的研究中， Maxwell等人發現PCSK9係以與膽固醇生物合成中所涉及 之其他3種基因類似之方式得以下調，Maxwell等人，2003 J. Lipid Res. 44:2109-2119。實際上，已展示PCSK9之表現 受固醇調節元結合蛋白（「SREBP」）調節，此與關於膽固 醇代謝中所涉及之其他基因所見之情況類似；上述。隨 後，此等發現受到PCSK9轉錄調節之研究的支持，該研究 表明對於脂蛋白代謝中所涉及之其他基因而言該調節相當 典型；Dubuc^^ > 2004 Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. 137315.doc 200938631 24:1454-1459。已展示斯坦汀（statin)以某種方式上調 PCSK9表現，此係歸因於藥物之降膽固酵效應；上述。此 外，已展示PCSK9啟動子具有膽固醇調節中所涉及之兩個 保守位點，固醇調節元及Spl位點；上述。 若干條證據表明PCSK9尤其降低肝LDLR蛋白質之量且 因此有損肝臟自循環中移除LDL膽固酵之能力。腺病毒介 導之PCSK9在小鼠肝臟中的過度表現由於肝LDLR蛋白質 之顯著損失而導致循環LDL-C積聚，而對LDLR mRNA含 量不起作用；Benjannet等人，2004 ·/. CAem. 279: 48865-48875 ； Maxwell & Breslow > 2004 PNAS 101:7100-7105 ; Park等人，2004 J. Biol. Chem. 279:50630-50638 ； 及 Lalanne等人，2005 ·/· 心氕 46:1312-1319。PCSK9 過度表現對提高小鼠之循環LDL-C含量的作用完全依賴於 LDLR之表現，此再次指示PCSK9對LDL-C的調節係經由 LDLR蛋白質之下調所介導。根據此等發現，缺乏PCSK9 或PCSK9 mRNA已由反義寡聚核苷酸抑制劑降低之小鼠具 有較高的肝LDLR蛋白質含量及較強的清除循環LDL-C的 能力；Rashid等人，2005 P 见45 102:5374-5379 ;及 Graham 專尺，200Ί J. Lipid Res· 48(4):763-767。此外，siRNA對 經培養之人類肝細胞中之PCSK9含量的降低亦使得LDLR 蛋白質含量較高且溶解LDL-C的能力增加；Benjannet等 A > 2004 J. Biol. Chem. 279:48865-48875 ;及 Lalanne 等 人，2005 乂 Λα. 46:1312-1319。同時，此等資料指 示PCSK9作用藉由降低LDLR蛋白質含量而使得LDL-C增 137315.doc 200938631 加。 基因PCSK9中之許多突變亦確實與常染色體顯性高膽固 酵血症（「ADH」）相關，後者為一種遺傳代謝病症，其特 徵為在血漿中低密度脂蛋白（「LDL」）粒子顯著升高，其 可導致過早心血管衰竭；參見Abifadel等人，2003 Genetics 34:154-156 ; Timms 等人，2004 //"w/w· 114:349-353 ; Leren，2004 Gewei. 65:419-422。隨後 公開之關於S127R突變之研究（Abifadel等人（上述））報導帶 ® 有該突變之患者在血漿中呈現較高總贍固醇及apoBlOO， 此係歸因於（1)諸如低密度脂蛋白（「LDL」）、極低密度脂 蛋白（「VLDL」）及中間密度脂蛋白（「IDL」）之含apoBlOO 脂蛋白過度產生，及（2)該等脂蛋白之清除或轉化的相關降 低；Ouguerram 等人，2004 Arterioscler. Thromb. Vase. Biol· 24:1448-1453。 因此，毫無疑問PCSK9在LDL之調節中起作用。PCSK9 ^ 之表現或上調與LDL膽固醇之血漿含量增加相關，且 PCSK9之表現的相應抑制或缺乏與LDL膽固醇血漿含量降 低相關。已發現與PCSK9中序列變化相關之LDL膽固醇含 量降低賦予針對冠心病之防護；Cohen，2006 ·/. • U. 354:1264-1272。 極需要鑑別有效治療心血管病痛之化合物及/或藥劑。 在臨床試驗中，LDL膽固醇含量之降低與冠狀動脈事件之 比率直接相關；Law等人，2003 326:1423-1427。近 年來，發現血漿LDL膽固醇含量之中度終身降低與冠狀動 137315.doc 200938631 脈事件發病率的實質性降低有關；Cohen等人，上述。甚 至在具有非脂質相關心血管風險因素發病率之群體中更係 如此；上述。因此，對LDL膽固醇含量之可控控制將產生 極大益處。 本發明藉由提供用於抑制PCSK9活性之PCSK9拮抗劑及 PCSK9在各種治療狀況中所起之相應作用來使得此等受關 注問題取得進展。 【發明内容】 本發明係關於PCSK9拮抗劑，在特定實施例中，係關於 抑制人類與鼠類PCSK9之彼等拮抗劑及表現對經處理 PCSK9之優先靶向的彼等拮抗劑。概括而言，PCSK9之蛋 白質特異性拮抗劑（或如本文所稱之「PCSK9特異性拮抗 劑」）為有效與PCSK9選擇性結合及抑制PCSK9功能之 PCSK9蛋白結合分子。此等分子在治療與PCSK9功能相關 或受PCSK9功能影響之病況中具有重要性，該等病況包括 (但不限於）高膽固醇血症、冠心病、代謝症候群、急性冠 狀動脈症候群及相關病況。PCSK9特異性拮抗劑之特徵在 於對PCSK9之選擇性識別及結合。除非在拮抗劑經補充或 經設計以賦予PCSK9-特異性結合組份以額外不同特異性 之彼等特定情況下，否則PCSK9特異性拮抗劑不顯示與除 PCSK9外之蛋白質的顯著結合。 形成本文之特定實施例的PCSK9特異性拮抗劑包含（a)重 鏈可變區，其包含含有SEQ ID NO: 17或SEQ ID NO: 17之 等效物的CDR3結構域，該等效物之特徵為在CDR3結構域 137315.doc 200938631 中具有一或多個保守性胺基酸取代；及/或（…輕鏈可變 區’其包含含有SEQ ID NO: 7或SEQ ID NO: 7之等效物的 CDR3結構域，該等效物之特徵為在cdr3結構域中具有一 或多個保守性胺基酸取代。在特定實施例争，pCSK9特異 性拮抗劑以1.2X 1 Ο·6 Μ或更小之1^與人類及/或鼠類pcsK9 結合。在更特定實施例中’ PCSK9特異性拮抗劑以1χι〇_7 Μ或更小之KD與人類及/或鼠類PCSK9結合。在其他實施例 中，P C SK9特異性结抗劑以1 X10 8 Μ或更小之kd與人類及/ 或鼠類PCSK9結合。在其他實施例中，PCSK9特異性抄^ 劑以5X10·9 Μ或更小，或lxlO·9 Μ或更小之;^與人類及/或 鼠類PCSK9結合。在選定實施例中，PCSK9特異性拮抗劑 以lxl〇-1Q Μ或更小之KD、lxlO-11 ]y[或更小之〖£)或1)<1〇-12 Μ或更小之KD與人類及/或鼠類PCSK9結合。在特定實施例 中，PCSK9特異性拮抗劑不以上文對於PCSK9結合所指示 之程度與除PCSK9外之蛋白質結合。 本發明之特定實施例包括PCSK9特異性拮抗劑，其表現 以上指定之一種程度的PCSK9結合，且與1B20抗體分子競 爭以結合PCSK9。1B20抗體分子形成本文之重要pcsK9特 異性拮抗劑。1B20抗體分子之特徵為包含⑴含有seq id NO: 11之重鏈可變區（「VH」）；及（ii)含s有EQ ID NO: 27 之輕鏈可變區（「VL」）。該VH區及該VL區分別包含對於 VH區所揭示之CDR1、CDR2及CDR3的全互補序列（SEQ ID NO: 13、15及17)及對於VL區所揭示之CDR1、CDR2及 CDR3的全互補序列（SEQ ID NO: 3、5及7)。1B20抗體分子 137315.doc -9- 200938631 之實例包括（但不限於）：（i)Fab，其包含含有SEQ ID NO: 1 之輕鏈及包含含有SEQ ID NO: 9之胺基酸1-221(或SEQ ID NO: 9)之胺基酸的Fd鏈；及（ii)全長抗體分子，其包含含 有SEQ ID NO: 26之輕鏈及含有SEQ ID NO: 25之重鏈。 PCSK9特異性拮抗劑有效抵消PCSK9依賴性細胞LDL吸 收抑制作用，且尤其有效抵消人類及/或鼠類PCSK9依賴性 細胞LDL吸收抑制作用。再者，PCSK9特異性拮抗劑1B20 對PCSK9對LDL吸收之作用顯示劑量依賴性抑制作用。因 此，所揭示之PCSK9特異性拮抗劑對降低血漿LDL膽固醇 含量具有重要性。所揭示之拮抗劑亦適用於各種診斷性目 的，包括PCSK9之偵測及量化。選定1B20拮抗劑尤其有 用，此係因為其可與人類PCSK9與鼠類PCSK9兩者交叉反 應。此品質使得特定1B20拮抗劑能夠在鼠類模型中進行藥 理學研究，而不必確保小鼠表現人類PCSK9。在該等實驗 中，鼠類模型充分展現經靶向蛋白質之天然活性及拮抗劑 對該活性之抑制作用。 在特定實施例中，本發明涵蓋PCSK9特異性拮抗劑。在 特定實施例中，本發明涵蓋包含所揭示之重鏈及/或輕鏈 可變區、具有一或多個保守性胺基酸取代之該等區的等效 物及其同系物之抗體分子。選定實施例包含經分離PCSK9 特異性拮抗劑，該等經分離PCSK9特異性拮抗劑包含所揭 示之CDR結構域或重鏈及/或輕鏈CDR結構域組及其特徵為 具有一或多個保守性胺基酸取代之該等結構域之等效物。 如熟習此項技術者所瞭解，可將保留拮抗PCSK9之能力的 137315.doc -10- 200938631 PCSK9特異性拮抗劑之片段插入各種構架中；參見，例如 美國專利第6,818,418號及其中所含之參考文獻，其全部揭 示内容均以引用的方式併入本文中，其論及可用以表現先 前基於抗原結合選擇之抗體環的各種支架。在替代方法 中，可使用重組方法將編碼VL之基因及編碼VH之基因接 合，例如使用能將編碼VL之基因及編碼VH之基因製成單 一蛋白質鏈之合成連接子，其中VL及VH區配對以形成另 外稱為單鏈FV(「ScFV」）之單價分子；參見，例如Bird等 人 ’ 1988 242 : 423-426及 Huston等人 ’ 1988 dca£/.心丨· 85:5879-5883，其揭示内容以引用的 方式併入本文中。 PCSK9特異性拮抗劑及片段可呈各種非抗體基支架的形 式，包括（但不限於）高親和性多聚體（avimer，Avidia); DARPin(M〇lecular Partners);阿達結合素（Adnectin， Adnexus)、抗運載蛋白（Anticalin，Pieris)及親和體 (Affibody，Affibody)。用於蛋白質結合之替代支架的用途 在科學文獻中得以充分瞭解，參見，例如Binz & Pluckthun, 2005 Curr. Opin. Biotech. 16:1-11 ； S- 以引用的方式併入本文中。因此，非抗體基支架或拮抗劑 分子包含⑴所揭示之重鏈及/或輕鏈可變區CDR3序列（分別 為SEQ ID NO: 17及7)，（ii)所揭示之重鏈可變CDR1、 CDR2及CDR3序列或所揭示之輕鏈可變CDR1、CDR2及 CDR3序列：CDR1(分另 |J 為 SEQ ID NO: 13及 3)、CDR2(分 別為 SEQ ID NO: 15 及 5)及 CDR3(分別為 SEQ ID NO: 17 及 137315.doc -11 - 200938631 7) ’（iii)分別在人類重鏈及/或輕鏈序列之可變區構架内的 所揭示之重鏈及輕鏈CDR之全互補序列（SEq id NO: 13、 15、17、3、5及7)，或（iv)所揭示之重鏈及/或輕鏈可變區 SEQ ID NO: 11及/或SEQ ID NO: 27形成本發明之重要實施 例’其中該等支架或拮抗劑分子呈現對pCSK9之選擇性且 抵消PCSK9依賴性細胞LDL吸收抑制作用。在另一態樣 中’本發明提供編碼所揭示之PCSK9特異性拮抗劑之核 酸，且在特定實施例中，提供包含所揭示之重鏈及輕鏈、 所揭示之可變重鏈及輕鏈區及其選定組份（包括CDR i、 CDR 2及/或CDR 3)，尤其所揭示之各別CDR3區的p(：SK9 特異性拮抗劑。在另一態樣中，本發明提供包含該核酸之 載體。另外，本發明提供包含編碼所揭示之pcSK9特異性 结抗劑之核酸的經分離細胞。在另—態樣中，本發明提供 包含本發明之多肽或載體之經分離細胞。 本發明提供用於製造本文所揭示之PCSK9特異性拮抗劑 的方法，該等PCSK9特異性拮抗劑包括（但不限於）抗體、 抗原結合片段、衍生物、嵌合分子、上述任何物質與另一 多肽之融合物或包含所揭示序列的能夠特異性結合pcsK9 之替代結構/組合物。該等方法包含：⑴在允許pcsK9特 異性拮抗劑表現及/或組裝之條件下培育細胞，該細胞包 含編碼PCSK9特異性拮抗劑之核酸或包含編碼其一或多個 組份之個別核酸，該等核酸在表現時共同產生拮抗劑，及 (ii)自該細胞分離該（等）拮抗劑。熟習此項技術者亦可使用 標準重組D N A技術獲得本文所揭示之p c s κ 9特異性拮抗 137315.doc •12- 200938631 劑。 本發明提供一種用於拮抗PCSK9之活性或功能或PCSK9 之顯著作用的方法，其包含使所關注之表現PCSK9之細 胞、細胞群體或組織樣品（或用人類或鼠類PCSK9處理或 其中具有人類或鼠類PCSK9)與本文所揭示之PCSK9特異性 拮抗劑在允許該拮抗劑與PCSK9結合之條件下接觸。本發 明之特定實施例包括其中細胞為人類或鼠類細胞之該等方 法。其他實施例為其中細胞表現人類或鼠類來源之PCSK9 m ¥ 的該等方法。 在另一態樣中，本發明提供一種用於拮抗呈現與PCSK9 活性相關之病況或PCSK9之功能對於特定受檢者顯示不當 之病況的受檢者之PCSK9活性或功能或PCSK9之顯著作用 的方法，其包含向該受檢者投與治療有效量之呈醫藥或其 他組合物形式的本發明之PCSK9特異性拮抗劑。 因此，本發明涵蓋一種治療與PCSK9活性相關之病況或 π PCSK9之功能對於特定受檢者顯示不當之病況的方法，其

G 包含向受檢者投與治療有效量之呈醫藥或其他組合物形式 的本發明之PCSK9特異性拮抗劑。在選定實施例中，病況 '為高膽固醇血症、冠心病、代謝症候群、急性冠狀動脈症 候群或相關病況。 在特定實施例中，本發明涵蓋一種向受檢者投與所揭示 之PCSK9特異性拮抗劑的方法，其包含傳遞治療有效量之 包含如本文所揭示之PCSK9特異性拮抗劑的醫藥或其他組 合物。 137315.doc -13- 200938631 在另一態樣中，本發明提供一種包含本發明之PCSK9特 異性拮抗劑之醫藥組合物或其他組合物，其特徵為包含醫 藥學上可接受之載劑，該載劑包括（但不限於）賦形劑、稀 釋劑、穩定劑、緩衝劑或經設計以促進拮抗劑以所要量投 與所治療個體之替代物。 下表提供本申請案中所論述之序列的概述： 表1 SEQ ID NO: 描述 SEQ ID NO: 1 輕鏈（「LC」）；1B20 SEQ ID NO: 2 輕鏈（「LC」）核酸；1B20 SEQ ID NO: 3 VLCDR1 ； 1B20 SEQ ID NO: 4 VLCDR1核酸；1B20 SEQ ID NO: 5 VLCDR2 ； 1B20 SEQ ID NO: 6 VLCDR2核酸；1B20 SEQ ID NO: 7 VLCDR3 ； 1B20 SEQ ID NO: 8 VLCDR3核酸；1B20 SEQ ID NO: 9 包括連接子及標記在内之Fd鏈；1B20 SEQ ID NO: 10 Fd鏈核酸；1B20 SEQ ID NO: 11 VH ； 1B20 SEQ ID NO: 12 VH核酸；1B20 SEQ ID NO: 13 VHCDR1 ； 1B20 SEQ ID NO: 14 VHCDR1核酸；1B20 SEQ ID NO: 15 VH CDR2 ； 1B20 SEQ ID NO: 16 VH CDR2核酸；1B20 SEQ ID NO: 17 VH CDR3 ； 1B20 SEQ ID NO: 18 VHCDR3核酸；1B20 SEQ ID NO: 19 加工位點之片段 SEQ ID NO: 20 加工位點之片段 SEQ ID NO: 21 IgGl之恆定結構域 SEQ ID NO: 22 IgG2之恆定結構域 SEQ ID NO: 23 IgG4之恆定結構域 SEQ ID NO: 24 IgG2m4之怪定結構域 SEQ ID NO: 25 1B20 IgG2m4 重鏈（「HC」） SEQ ID NO: 26 1B20 IgG輕(κ)鏈 SEQ ID NO: 27 VL ； 1B20 SEQ ID NO: 28 VL核酸；1B20 SEQ ID NO: 29 1B20 IgG2m4 HC核酸 137315.doc -14- 200938631 SEQ ID NO: 30 1B20 IgG LC核酸 SEQ ID NO: 31 引子 SEQ ID NO: 32 引子 SEQ ID NO: 33 引子 SEQ ID NO: 34 引子 SEQ ID NO: 35 lB20IgG2m4HC 質體 SEQ ID NO: 36 lB20IgGLC 質體 【實施方式】 本發明係關於PCSK9拮抗劑，且在特定實施例中，係關 ' 於抑制人類與鼠類PCSK9之彼等拮抗劑及優先靶向經加工 PCSK9之彼等拮抗劑。本文之PCSK9之蛋白質特異性拮抗 ® 劑（或「PCSK9特異性拮抗劑」）有效與PCSK9選擇性結合 及抑制PCSK9功能，且因此在治療與PCSK9功能相關或受 PCSK9功能影響之病況中具有重要性，該等病況包括（但 不限於）高膽固醇血症、冠心病、代謝症候群、急性冠狀 動脈症候群及相關病況。使用術語「结抗劑」係指標的分 子可拮抗PCSK9之功能。使用術語「拮抗」或其派生詞係 指對抗、抵消、抑制、中和或削弱PCSK9之一或多種功能 之行為。本文提及PCSK9功能或PCSK9活性係指由PCSK9 驅動，需要PCSK9或由PCSK9加強或增強之任何功能或活 性。已證明如本文所述之PCSK9特異性拮抗劑有效抵消人 • 類及/或鼠類PCSK9依賴性細胞LDL吸收抑制作用。 - 本文之一重要實施例係關於1B20抗體分子。該等1B20 抗體分子之特徵為包含⑴含SEQ ID NO: 11之重鏈可變區 (「VH」）；及（ii)含SEQ ID NO: 27之輕鏈可變區 (「VL」）。該VH區及該VL區分別包含對於VH區所揭示之 CDR1、CDR2及 CDR3 的全互補序列（SEQ ID NO: 13、15及 137315.doc -15- 200938631 17)及對於VL·區所揭示之cdri、CDR2及CDR3的全互補序 列（SEQ ID NO: 3、5及7)〇 1B20抗體分子之實例包括（但不 限於）·（i)Fab ’其包含有含SEq id no: 1之輕鏈及含SEQ ID NO: 9之胺基酸^如（或SEq ID N〇: 9)之Fd鏈；及⑼

全長抗體分子’其包含有含SEQ ID NO: 26之輕鏈及含SEQ ID NO: 25之重鍵。選定群組之1B2〇抗體展示如本文所揭 之PCSK9特異性拮抗劑有效抑制人類與鼠類pcsK9且可 在鼠類杈型中在不表現人類PCSK9的情況下進行藥理學研 究。 PCSK9特異性分子亦適用於pcSK9之積測及量化中之各 種診斷性目的。 此外’所揭示之PCSK9特異性拮抗劑之獨特之處在於選 定實施例已展示優先識別經加工PCSK9(PCSK9之活化形 式）。 如本文所揭示之PCSK9特異性拮抗劑為降低血漿LdL膽 固醇含量之所需分子且適用於具有商業或養馴獸醫學價值 之任何靈長類動物、哺乳動物或脊椎動物。PCSK9特異性 枯抗劑亦適用於抑制任何具有LDl受體之細胞或組織群體 中之PCSK9活性。可直接藉由熟習此項技術者易於使用之 檢定量測所揭示之拮抗劑的效用。量測LDL吸收之方法描 述於文獻中；參見，例如Barak及Webb，1981 乂 Ce//历〇/. 90:595-604 及 Stephan 及 Yurachek，1993 ·/. 及以 34:325330。此外，量測血漿中LDL膽固醇之方法充分描述 於文獻中’參見，例如McNamara等人，2006 C/Wca 137315.doc 200938631 369:158-1 67。所揭示之结抗劑對於細胞LDL 吸收之特定影響亦可經由包含以下步驟之方法量測：向細 胞樣品提供經純化PCSK9及經標記LDL粒子；向細胞樣品 提供PCSK9拮抗劑；將該細胞樣品培育一段時間足以使 LDL粒子由細胞吸收；量化併入細胞中之標記物的量；及 鑑別使得所量化的由細胞溶解之標記物的量與單獨投與 PC SK9時所觀察之量比較增加的彼等拮抗劑。量測所揭示 拮抗劑之影響的另一方法包含向細胞樣品提供經純化 PCSK9及經標記LDL粒子；向細胞樣品提供PCSK9拮抗 劑；將該細胞樣品培育一段時間足以使LDL粒子由細胞吸 收；藉由移除上清液分離細胞樣品之細胞；減少經標記 LDL粒子（與培養盤、細胞或除LDL受體外之任何物）之非 特異性締合；溶解細胞；量化保留於細胞溶解產物内之標 記物的量；及鑑別使得所量化之由細胞溶解之標記物的量 與單獨投與PCSK9時所觀察之量比較增加的彼等拮抗劑。 使得所量化之標記物的量增加之拮抗劑為PCSK9拮抗劑。 帶有LDL受體之任何類型之細胞均可用於以上方法，該 細胞包括（但不限於）HEK細胞、HepG2細胞及CHO細胞。 源於任何來源之LDL粒子均適用於上述檢定。在特定檢定 中，LDL粒子為來源於血液之新鮮粒子。此可藉由熟習此 項技術者可用之任何方法實現，該方法包括（但不限 於）Havel 等人，1955 J. 34: 1345-1353 之方 法。可用螢光標記LDL粒子。經標記LDL粒子内部可併有 可見波長激發螢光團3,3’-二十八烷基吲哚碳菁碘化物 137315.doc 17 200938631 (dil(3))以形成極具螢光之LDL衍生物dil(3)-LDL。可使用 使熟習此項技術者能夠偵測細胞溶解產物中之LDL之任何 標記物。可使用LDL類似物，其將僅在經細胞内代謝時變 得可偵測（例如，在不同波長下變得具有螢光或發螢光等） 或（例如）若其將在内在化過程中與其他分子締合（或解 離）（例如FRET檢定，其中LDL類似物將與次級螢光染料缔 合或與抑止劑解離）。可採用此項技術中可用以偵測經標 記LDL粒子之内在化的任何方法。LDL粒子及PCSK9與細 胞之培育時間為長度足以使LDL粒子由細胞吸收之時間。 此時間可在5分鐘至360分鐘之範圍内。添加至細胞之 PCSK9的濃度可在1 nM至5 μΜ之範圍内，在特定方法中， 在0.1 ηΜ至3 μΜ之範圍内。熟習此項技術者可用來測定特 定PCSK9蛋白之濃度範圍的一特定方法為在LDL吸收檢定 中形成劑量反應曲線。可選擇促進接近於LDL-吸收之最大 損失且仍在劑量反應曲線之線性範圍中之PCSK9濃度。通 常，此濃度為自劑量反應曲線得到之蛋白質的EC-50之約5 倍。濃度可隨蛋白質而改變。 概括而言，如本文所定義之PCSK9特異性拮抗劑選擇性 識別PCSK9且與PCSK9特異性結合。當解離常數S1 μΜ、 較佳S100 ηΜ且最佳$10 ηΜ時通常認為抗體與抗原特異性 結合。本文使用術語「選擇性」或「特異性」進一步係指 除非在拮抗劑經補充或經設計以賦予PCSK9特異性結合部 分以額外不同特異性之彼等特定情況下（例如，在雙特異 性或雙功能分子中，該分子經設計以結合兩種分子或實現 137315.doc -18- 200938631 兩種功旎，其中至少一者將特異性結合pcSK9)，否則所 揭不之拮抗劑不展示與除pscK9外之蛋白質的顯著結合。 在特定實施例中，PCSK9特異性拮抗劑以丨2χ1〇_6 Μ或小 於丨_2><10 6 M2KD與人類及/或鼠類PCSK9結合。在更特定 • 實細1例中，PCSK9特異性拮抗劑以5xl〇-7 Μ或小於5x10-7 Μ之^、2χ10.7 Μ或小於2χ1〇-7 Μ之KD或mo·7 μ或小於 ixio7 M2Kd與人類及/或鼠類pcSK9結合。在其他實施例 參中，PCSK9特異性拮抗劑以lxl〇-8 M或小於1χ1〇_8 μ之％ 與人類及/或鼠類PCSK9結合。在其他實施例中，pcsK9特 異性拮抗劑以5X10-9 μ或小於5xl0-9 M之〖〇或1><1〇-9 M或 小於lxlO·9 MiKD與人類及/或鼠類PCSK9結合。在選定實 施例中，PCSK9特異性拮抗劑以lxl(rl〇 M或小於1><1〇七μ 之KD、ΐχ10_" Μ或小於1χ1〇·"厘之&〇或1><1〇七μ或小於 1χ1〇 12 Μ之尺〇與人類及/或鼠類PCSK9結合❶在特定實施 例中，PCSK9特異性拮抗劑不以上述艮〇結合除pcsK9外的 ❿ 蛋白質。Kd係指由Kd(特定結合分子·目標蛋白相互作用之 解離速率）與1(特定結合分子_目標蛋白相互作用之締合速 率）之比率，或以莫耳濃度（M)表示之1/!^獲得的解^常 數。KD值可使用在此項技術中充分確定之方法測定。用於 . 測定結合分子之KD的較佳方法係使用表面電漿共振，例如 採用諸如BiaC〇re™(GE Healthcare Life Sciences)系統之生 物感應器系統。 已展示本文所揭示之PCSK9特異性拮抗劑劑量依賴性抑 制對於LDL吸收之人類及/或鼠類PCSK9依賴性作用。因 137315.doc -19· 200938631 此，如本文所揭示之PCSK9特異性拮抗劑的特徵在於其抵 消對LDL吸收至細胞中的PCSK9依賴性抑制作用之能力。 此經由LDL受體將LDL吸收至細胞中之吸收在本文中稱為 「細胞LDL吸收」。在特定實施例中，PCSK9特異性拮抗 劑抵消或拮抗對LDL吸收至細胞中之人類及/或鼠類PCSK9 依賴性抑制作用，呈現小於1.〇χ 1(Γ6 Μ，或按照優先次序 小於 1χ1〇-7 Μ、1χ1(Γ8 Μ、1χ1〇-9 Μ、ΙχΙΟ-10 Μ、1χ1〇-η Μ及1χ10_12 Μ之IC5G。任何PCSK9特異性拮抗劑所達成之 抑制程度可藉由與對照組進行統計學比較或經由此項技術 中可用以評定對PCSK9功能之負性作用或抑制作用的任何 替代方法（亦即，能夠評定PCSK9功能之拮抗作用之任何 方法）來定量量測。在特定實施例中，該抑制作用為抑制 至少約10%。在其他實施例中，該抑制作用為至少20%、 30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或 95% ° 因此， 能夠實現此等程度之PCSK9功能抑制的PCSK9特異性拮抗 劑形成本文之特定實施例。 本文之PCSK9特異性拮抗劑可為特異性結合人類及/或 鼠類PCSK9蛋白質之任何結合分子，其包括（但不限於）如 下所定義之抗體分子、任何PCSK9特異性結合結構、特異 性結合PCSK9之任何多肽或核酸結構及併入各種蛋白質支 架中之上述任何分子；包括（但不限於）各種非抗體基支架 及能夠提供或允許與PCSK9選擇性結合之各種結構，包括 (但不限於）小分子免疫治療藥物（或「SMIP」；參見，Haan 及Maggos, 2004 5 1月26日）；免疫性蛋白質（參 137315.doc -20- 200938631 見，例如 Chak 等人，1996 /Voc. iVa". Zcai/. iSch 93:6437-6442)；細胞色素 b562(參見 Ku 及 Schultz, 1995 Proc. iSW. 92:6552-6556);肽 α2ρ8(參見

Barthe等人，2000 Proiek Scz·. 9:942-955);高親和性多聚 體（Avidia ;參見 Silverman 等人，2005 Λ/αί. Biotechnol. 23:1556-1561) ; DARPin(Molecular Partners ;參見 Binz 等 A > 2003 J. Mol. Biol. 332:489-503 ；及 Forrer 等人，2003 FEBS Lett. 539:2-6);四結合素（Tetranectin)(參見， Kastrup等人，1998 Jcia. 0>^仏//〇容广.£). 5ζ·ο/· 54:757-766);阿達結合素（Adnexus ;參見，Xu等人，2002 C/zem. 5ζ’σ/· 9:933-942)、抗運載蛋白（Pieris;參見Vogt及 Skerra, 2004 Chemobiochem. 5:1 9 1 -1 99 ; Beste等人，1999 Proc. 7VW/· jcafi?· 5W. 96:1898-1903 ; Lamia 及

Erdmann, 2003 J. Mol. Biol. 329:381 -388 ；及 Lamia 及 Erdmann, 2004 Protein Expr. Purif. 33:39-47) ； 白質（參見 North及 Blacklow，1999 A’ocAembirj; 38:3926-3935)、脂質運載蛋白（Lipocalin)(參見 Schlehuber及 Skerra, 2005 Drwg Zhjcov· Jbi/ay 10:23-33);諸如錯蛋白重複蛋白 質之重複基元蛋白質（參見Sedgwick及Smerdon, 1999 7>6«心 5j?〇c；Aem. <SW. 24:311-316 ; Mosavi等人，2002 iVoc. Natl. Acad. Sci. USA 99:16029-16034 ；及Binz等人，2004 TVai. 5zoiecA«o/· 22:575-582);昆蟲防禦素A(參見 Zhao 等 人，2004 25:629-635);庫尼結構域（Kunitz domain) (參見 Roberts 等人，1992 /Voc· A/W/· Jcai/· 5W. ί/5^4 89: 137315.doc -21 - 200938631 2429-2433 ; Roberts等人，1992 Gene 121:9-15 ; Dennis及 Lazarus, 1994 ·/. CAew. 269:22129-22136 ;及Dennis 及 Lazarus, 1994 /.价〇/. ChAw. 269:22137-22144) ; PDZ-結 構域（參見 Schneider等人，1999 17:170- 175);諸如卡律蛾毒素（Charybdotoxin)之联毒素（參見Vita 等人，1998 47:93-100);第 10 個III型纖維結 合蛋白結構域（或10Fn3 ;參見Koide等人，1998 ·/· Mo/. Biol. 284:1141-1151，及 Xu等人，2002 CAew. 5ζ·ο/. 9:933-942) ; CTLA-4(胞外結構域；參見Nuttall等人，1999 Proiez’ws· 36:217-227 ;及 Irving 等人，2001>/./»1»1««〇/· 248:31-45);打結素（Knottin)(參見 Souriau等人， 2005 Biochemistry 44:7143-7155 及 Lehtio 等人，2000 iVoie/ws 41:316-322);新制癌菌素（Neocarzinostatin)(參見 Heyd等人，2003 42:5674-5683);碳水化合物 結合模組4-2(CBM4-2 ;參見Cicortas等人，2004 尸roieiw Eng. Des. Sel. 17:213-221);澱粉酶抑肽（Tendamistat)(參 見 McConnell及 Hoess，1995 J. Mol. Biol. 250:460-470^1 Li 等人，2003 /Voiez'w 16:65-72) ; T 細胞受體（參見

Holler等人，2000 Proc. Jcad. t/5^4 97:5387- 5392 ; Shusta等人 » 2000 Nat. Biotechnol. 18:754-759 ;及 Li 等人，2005 Nat. 23:349-354);親和體 (Affibody I 參見 Nord等人 » 1995 Protein Eng. 8:601-608 ； Nord等人，1997 TVai. Biotechnol. 15:772-777 ； Gunneriusson 等人，1999 12:873-878);及文獻中所認可之 137315.doc -22- 200938631 其他選擇性結合蛋白或支架；參見，例如Binz及 Pltickthun, 2005 Curr. Ορίη. 16:1-11 ; Gill 及

Damle，2006 Cwrr· «.价17:1-6 ; Hosse等人， 2006 Protein Science 15:14-27 ; Binz 等人，2005 iVfli· 23:1257-1268 ; Hey 等人，2005 7Ve«i/·? 价oiecAno/· 23:514-522 ; Binz 及 Pliickthun，2005 Cwrr. Opin.价oiecA. 16:459-469 ; Nygren 及 Skerra，2004 J. Immunolog. Methods 290:3-28 ； Nygren^ Uhlen, 1997 Curr. 5zo/· 7:463-469 ;其揭示内容以引用的方式併 入本文中。抗體及抗原結合片段之用途在文獻中得以充分 定義及瞭解。用於蛋白質結合之替代支架之用途亦在科學 文獻中得以充分瞭解，參見，例如Binz及Pliickthun, 2005 Cwrr· (9/7/«· 5z'c>iecA· 16:1-11 ; Gill 及 Damle，2006 Cwrr. Ορίη. Biotechnol. 17:1-6 ; Hosse 等人，2006 Proiez’w «Science 15:14-27 ; Binz等人，2005 价oiecAwo/· 23: 1257-1268 ; Hey等人，2005 5z'oiec/i«o/· 23:514- 522 ; Binz及 Pltickthun, 2005 Curr. Opin. Biotech. 16:459-469 i Nygren^ Skerra, 2004 J. Immunolog. Methods 290:3-28 ; Nygren及 Uhlen，1997 Curr. Opin. Struct. Biol. 7:463-469 ;其揭示内容以引用的方式併入本文中。因此，本文 之對於PCSK9呈現選擇性並抵消PCSK9依賴性細胞LDL-吸 收抑制作用之非抗體基支架或拮抗劑分子形成本發明之重 要實施例。適體（能夠選擇性結合目標分子之核酸或肽分 子）為一特定實例◊其可選自隨機序列集合或自諸如核糖 137315.doc -23- 200938631 開關（riboswitch)之天然來源鑑別。肽適體、核酸適體（例 如，結構化核酸，包括DNA基結構與RNA基結構兩者）及 核酸誘餌可有效選擇性結合及抑制所關注之蛋白質；參 見，例如Hoppe-Seyler 及 Butz, 2000 乂 Mo/· Mei/. 78:426-430 ; Bock 等人，1992 Nature 355:564-566 ; Bunka 及 Stockley, 2006 Nat. Rev. Microbiol. 4:588-596 ； Martell^ 人，2002 Mo/ec. Ther. 6:30-34 ； Jayasena, 1999 Clin. C/iew. 45:1628-1650 ;其揭示内容以弓I用的方式併入本文 中〇 假定1B20具有顯著中和活性，鑑別以與1B20相同之方 式結合PCSK9之其他PCSK9特異性拮抗劑明顯受到關注。 鑑別結合與1B20所結合者相同之區域或抗原決定基或重叠 抗原決定基的拮抗劑且尤其抗體之一種方法係經由競爭或 類似檢定，其中候選抗體或結合分子將必須勝過1B20以結 合抗原決定基。本文所涵蓋之競爭性拮抗劑為在1 μΜ或小 於1 μΜ下在1Β20以其KD或低於其KD之情況下抑制（亦即， 與對照組相比阻止或干擾1B20結合）或降低至少50%、 60%、70%及80%(按遞增優先次序）（甚至更佳，至少90%且 最佳至少95%)之1B20結合之分子，且尤其拮抗（i)PCSK9與 LDL受體之結合，（ii)PCSK9至細胞中之内在化，或 (iii)PCSK9與LDL受體之結合與PCSK9至細胞中之内在化 兩者的彼等分子。可易於在活體外（例如）使用ELISA及/或 藉由監測抗體與PCSK9在溶液中之相互作用來檢定結合成 員之間的競爭。進行分析之確切方法並不關鍵。可將 137315.doc -24· 200938631 PCSK9固定至96孔板中或可使其處於均勻溶液中。在特定 實施例中，可使用放射性物質、酶或其他標記物量測未標 記之候選抗體阻斷經標記1B2〇之結合的能力。在逆相檢定 中’測定未標記抗體干擾經標記1B20與PCSK9之相互作用 的能力，其中該等1B2〇及PCSK9已結合。在特定實施例 中’⑴使PCSK9與經標記1B20(包含有含SEQ ID NO: 27之 VL及含SEQ ID NO: 11之VH的抗體分子）接觸；（ii)使 PCSK9與候選抗體或抗體之集合接觸；及⑴丨）鑑別能夠中 斷或阻止PCSK9與1B20之間的複合之抗體。該實例中之結 果讀出係經由量測經結合之標記物。可以任何次序或同時 添加1B20及候選抗體。 可測試在以上或其他合適檢定中鑑別為1B2〇競爭者之抗 體拮抗或中和（i)PCSK9與LDL受體之結合；及/或 (ii)PCSK9至細胞中之内在化的能力。可經由使用類似於 本說明書中所用或所述之檢定量測此等參數。在特定實施 例中，競爭抗體所顯示之抑制作用為抑制至少約10%。在 其他實施例中，抑制作用為至少20%、30%、40%、50%、 60%、70%、80%、90%或 95%。 本發明特別涵蓋選擇性結合與1B20所結合者相同之抗原 決定基或干擾1B20與PCSK9結合的重疊抗原決定基之 PCSK9特異性拮抗劑且尤其單株抗體分子（及其相應胺基 酸及核酸序列）。特異性結合1B20之抗原決定基或重疊抗 原決定基之單株抗體拮抗或中和（i)PCSK9LDL受體之結 合；（ii)PCSK9至細胞中之内在化或（iii)兩者。本文之單株 137315.doc -25- 200938631 抗體分子可為完整（完全或全長）抗體、大體上完整之抗體 或包含抗原結合部分之抗體部分或片段，例如鼠類抗體或 嵌合抗體或人源化抗體或人類抗體之Fab片段、Fab'片段或 F(ab’）2片段。如本文所用之單株係指均質或大體上均質（或 純）的抗體群體，亦即，在該群體中至少約90%、91 %、 92%、93%、94%、95%、96% ’ 更佳至少約 97% 或 98%， 或最佳至少99%之抗體一致且將在ELISA檢定中競爭結合 相同抗原或抗原決定基。在本發明之特定實施例中，本發 明提供單株抗體，該等單株抗體⑴在1 μΜ或小於1 μΜ下 在1Β20以其KD或低於其KD之情況下與1Β20抗體分子競爭 結合PCSK9，從而減少至少50%之1B20結合，（ii)阻斷 PCSK9與LDL受體結合，（iii)抑制PCSK9内在化至細胞 中’且（iv)包含特異性抗原結合區、VH、VL、CDR組或重 CDR3、重鏈及/或輕鏈或本文所述之此等組份之任何變化 形式。 在用於鑑別與1B20結合相同或重疊抗原決定區之抗體的 以上任何檢定中，已知結合者（亦即，182〇抗體分子）之結 合與候選結合者之結合相比應可區分。熟習此項技術者將 易於瞭解此可（但並非必須）經由對任一分子或兩分子使用 標記物來實現。如本文所用之標記物係指併入/附著至抗 體分子之另-分子或試劑。在-實施例中，標記物為可價 測標記，例如經放射性標記之胺基酸或附著至可由經標記 =生物素蛋白債測之生物素基部分之多肽（例如，含 #光學或比色方法偵測之螢光標記或酶活性之抗生蛋白 137315.doc -26- 200938631 鏈菌素）。此項技術中已知且可使用標記多肽及醣蛋白之 各種方法。用於多肽之標記物的實例包括（但不限於）以下 各者：放射性同位素或放射性核素（例如，3H、14C、、 35S、，、”Tc、⑴In、丨25卜、螢光標記物(例如， FITC、若丹明（rhodamine)、鑭系元素磷光體）、酶促標記 物（例如，辣根過氧化酶、β_半乳糖苷酶、螢光素酶、鹼性 碘酸酶）' 化學發光標記、生物素基、由第二報導體識別 之預先確定之多肽抗原決定基（例如，白胺酸拉鏈對序 列、第二抗體之結合位點、金屬結合結構域、抗原決定基 標記）、磁性試劑（諸如釓螯合劑）、毒素（諸如百日咳毒 素、泰克索（taxol)、細胞鬆她素β、短桿菌素d、溴化乙 錠、依米丁（emetine)、絲裂黴素、依託泊苷（et〇p〇side)、 鬼白噻吩苷（tenoposide)、長春新鹼（Vincristine)、長春花 驗（vinblastine)、秋水仙驗（colchicin)、阿徽素 (doxorubicin)、道諾黴素（daunorubicin)、二經基炭疽菌素 二酮、米托蒽醌（mitoxantrone)、米拉黴素（mithramycin)、 放線菌素D、1-脫氫睪固酮、糖皮質激素、普魯卡因 (procaine)、丁卡因（tetracaine)、利多卡因（lid〇caine)、普 萘洛爾（propranolol)及嘌吟黴素（pur〇myCjn))及其類似物或 同系物。在一些實施例中，標記物由各種長度之間隔臂連 接以降低可能之位阻。 用於競爭檢定之1B20抗體可為具有本文所提供之1B2〇 猫述的任何抗體分子（亦即對PCSK9具選擇性之任何抗體 分子，其包含有含SEQ ID NO: 27之VL及含SEQ ID NO: 11 137315.doc -27- 200938631 之VH)。該等抗體之實例包括（但不限於）：（i)Fab，其包含 有含SEQ ID NO: 1之輕鏈及含SEQ ID NO: 9之胺基酸1-221(或SEQ ID NO: 9)之Fd鏈；及（ii)全長抗體分子，其包 含有含SEQ ID NO: 26之輕鏈及含SEQ ID NO: 25之重鏈。 可使用合適技術達成本申請案中所述之任何PCSK9特異 性拮抗劑之表現及選擇，該等技術包括（但不限於）噬菌體 呈現（參見，例如國際申請案第WO 92/01047號，Kay等 人，1996 Phage Display of Peptides and Proteins: A Laboratory Manual, San Diego: Academic Press)、酵母呈 現、細菌呈現、T7呈現及核糖體呈現（參見，例如Lowe及 Jermutus, 2004 Cwrr.尸Ζζατ-m. 517-527)。 形成本發明之部分的特定PCSK9特異性拮抗劑為抗體分 子或抗體。如本文所述之「抗體分子」或「抗體」係指選 擇性結合人類及/或鼠類PCSK9之免疫球蛋白衍生之結構， 其包括（但不限於）全長或全抗體、抗原結合片段（實際上或 概念上衍生自抗體結構之片段）、上述任何物質之衍生 物、上述任何物質與另一多肽之融合物或為了選擇性結合 PCSK9/抑制PCSK9之功能之目的而併有上述任何物質之任 何替代結構/組合物。 「全」抗體或「全長」抗體係指包含由雙硫鍵互連之兩 個重（H)鏈及兩個輕（L)鏈的蛋白質，其包含：（1)對於重鏈 而言，可變區（本文縮寫為「VH」）及包含三個結構域 C Η 1、C η 2及C η 3之重鍵怪定區，及（2 )對於輕鍵而§ ’輕鍵 可變區（本文縮寫為「vL」）及包含一個結構域CL之輕鏈恆 137315.doc -28- 200938631 定區。 抗體片段且更特5之抗原結合片段為具有抗體可變區 或其鍵段（其視情況包含所揭示之CDR 3結構域（在重鍵及/ 或輕鏈構架區内之重及/或輕CDR 3結構域）中之一或多者） 之分子，該抗體可變區或其鏈段賦予對pcSK9且尤其對人 類及/或鼠類PCSK9之選擇性結合。含有該抗體可變區之抗 體片段包括（但不限於）以下抗體分子：Fab、F(ab，）2、Fd、 Fv scFv、雙特異性抗體分子（包含如本文所揭示之 特異性抗體或抗原結合片段與具有不同於該抗體之結合特 異性之第二功能部分（包括（但不限於）另一肽或蛋白質，諸 如抗體或受體配位體）之連接物的抗體分子）、雙特異性單 鏈Fv二聚體、經分離CDR3、微型抗體、，scAb,、dAb片 段、雙鏈抗體、三鏈抗體、四鏈抗體、微型抗體及基於蛋 白質支架之人工抗體，該等人工抗體包括（但不限於）nis 纖維結合蛋白多肽抗體（參見，例如美國專利第6,703，199 號及國際申請案第WO 02/32925號及第WO 00/34784號）或 細胞色素B;參見，例如Nygren等人，1997 Cwrr. 汾rwci· 5沁/. 7:463-469 ;其揭示内容以引用的方式併入本 文中。抗體部分或結合片段可為天然的，或部分或完整合 成式產生。該等抗體部分可藉由熟習此項技術者已知之各 種方法製備，該等方法包括（但不限於）習知技術，諸如木 瓜蛋白酶或胃蛋白酶消化。 如本文關於抗體分子、一般而言PCSK9特異性拮抗劑、 編媽核酸或其他物質所用之術語「經分離」描述—種有關 137315.doc -29· 200938631 於所揭示之PCSK9特異性拮抗劑、核酸或其他物質之特 該特性使得上述各物質不同於自然界中所發現之彼物 質。該差異可為（例如）上述各物質與自然界中所發現之彼 物質相比具有不同純度，或上述各物質與自然界中所發現 之彼物質相比具有不同結構或形成不同結構之部分。並非 自然界中發現之結構包括（例如）重組人類免疫球蛋白結 構其包括（但不限於）具有最佳化CDR之重組人類免疫球 蛋白結構。並非自然界中發現之結構的其他實例為大體上 不3其他細胞物質之PCSK9特異性拮抗劑或核酸。經分離 PC SIC9特異性括抗劑一般不含具有不同蛋白質特異性之其 他蛋白質特異性拮抗劑（亦即，對除PCSK9外之物質具有 親和力）。 在—特定態樣中’本發明提供拮抗pCSK9功能之經分離 PCSK9特異性拮抗劑。在特定實施例中，該等PCSK9特異 性拮抗劑藉由干擾PCSK9與LDL受體之結合及由此引起的 PCSK9細胞内在化而抑制人類及/或鼠類1>(：队9之細胞匕队 吸收拮抗作用。因此，所揭示之PCSK9特異性拮抗劑形成 降低血漿LDL-膽固醇含量之所需分子；參見，例如c〇hen 等人，2005 iVai. Gewei. 37:161-165(其中在等位基因 PCSIC9中雜合無意義突變之個體中注意到顯著較低之血漿 LDL 膽固醇含量）；Rashid 等人 2005 /VOC· •心αί/· 5c厂 102:5374-5379(其中PCSK9-基因剔除小鼠證明肝細胞 中數量增加之LDLR、加速之血漿LDL清除及顯著較低之 血漿膽固醇含量）；及Cohen等人，2006 Μ五叹/. 乂 137315.doc -30- 200938631 354:1264-1272(其中雜合突變（喪失功能）PCSK9之人類呈現 發生動脈粥樣硬化心臟病之長期風險顯著降低）。 經由重複實驗，如本文所揭示之1B20抗體分子劑量依賴 性抑制人類及/或鼠類PCSK9對於LDL吸收之作用。因此， 在特定實施例中，本發明涵蓋PCSK9特異性拮抗劑，且在 更特定實施例中，涵蓋抗體分子，其包含有含於此等1B20 抗體分子内之重鏈及/或輕鏈可變區（分別為SEQ ID NO: 11 及27)或重鏈及/或輕鏈（例如分別為SEQ ID NO: 9之胺基酸 1-221(或 SEQ ID NO: 9)及 SEQ ID NO: 1，或分別為5]^ ID NO: 25及26)，以及其等效物（其特徵為具有一或多個不使 1B20之pCSK9選擇特性退化之保守性胺基酸取代）或同系 物。特定實施例包含經分離PCSK9特異性拮抗劑，該等 PCSK9特異性拮抗劑包含本文所揭示之CDR結構域或本文 所揭示之重鏈及/或輕鏈CDR結構域組或特徵為具有—咬 多個保守性胺基酸取代之其等效物。 本文使用術語「結構域」或「區」簡單地係指抗體分子 中將存在所論述之序列或鏈段或在替代情況下當前已存在 所論述之序列或鏈段之各別部分。 在特定實施例中，本發明提供經分離PCSK9特異性# ^ 劑’且在更特定實施例中，提供抗體分子，其包含有含 SEQ ID NO: 11之重鏈可變區；特徵為具有一或多個保守 性胺基酸取代之其等效物及其同系物。所揭示之拮抗劑靡 抵消或抑制人類及/或鼠類PCSK9依賴性細胞LDL吸枚抑制 作用。在特定實施例中，本發明提供所揭示之拮抗劑的同 137315.doc 31 200938631 系物，其特徵為在重鏈可變區上與SEQ ID NO: u至少9〇0/〇 一致；抑制至少10%之人類及/或鼠類PCSK9依賴性細胞 LDL吸收抑制的該等拮抗劑。 在特定實施例中，本發明提供經分離PCSK9特異性拮抗 劑，且在更特定實施例中，提供抗體分子，其包含有含 SEQ ID NO: 27之輕鏈可變區；特徵為具有一或多個保守 性胺基酸取代之其等效物及其同系物。所揭示之拮抗劑應 抵消或抑制人類及/或鼠類PCSK9依賴性細胞LDL吸收抑制 作用。在特定實施例中，本發明提供所揭示之拮抗劑的同 系物，其特徵為在輕鏈可變區上與SEQ ID NO: 27至少90% 一致；抑制至少10%之人類及/或鼠類PCSK9依賴性細胞 LDL吸收抑制的該等拮抗劑。 在特定實施例中，本發明提供經分離PCSK9特異性抗體 分子，其包含有含SEQ ID NO: 11之重鏈可變區及含sEq ID NO: 27之輕鏈可變區；或特徵為在指定序列中具有— 或多個保守性胺基酸取代之其等效物。特定實施例為抑制 至少10%之人類及/或鼠類PCSK9依賴性細胞L〇l吸收抑制 作用之該等拮抗劑。在特定實施例中，本發明提供所揭示 之拮抗劑的同系物，其特徵為在重鏈及輕鏈可變區上分別 與SEQ ID NO: 11及27至少90%—致；抑制至少1〇%之人類 及/或鼠類PCSK9依賴性細胞LDL吸收抑制的該等拮抗齊|。 在特定實施例中，本發明提供經分離PCSK9特異性拮抗 劑，且在更特定實施例中，提供PCSK9抗體分子，其包含 可變重CDR3序列SEQ ID NO: 17 ;及特徵為具有_或多個 137315.doc -32- 200938631 保守性胺基酸取代之其等效物；其特定實施例抑制至少 10%之人類及/或鼠類PCSK9依賴性細胞LDL吸收抑制作 用。特定實施例提供經分離拮抗劑，其另外在重鏈可變區 中包含分別包含SEQ ID NO: 13及/或SEQ ID NO: 15之 CDR1及/或CDR2序列；或特徵為在任何一或多個CDR序列 中具有一或多個保守性胺基酸取代之其等效物。在特定實 施例中，本發明提供所揭示之拮抗劑的同系物，其特徵為 視情況在CDR3序列上與SEQ ID NO: 17或在CDR1、CDR2 及CDR3序列各者内分別與SEQ ID NO: 13、15及17至少 90%—致；抑制至少10%之人類及/或鼠類PCSK9依賴性細 胞LDL吸收抑制的該等拮抗劑。

在特定實施例中，本發明提供經分離PCSK9特異性拮抗 劑，且在更特定實施例中，提供抗體分子，其包含有含 SEQ ID NO: 7之可變輕CDR3序列；及特徵為具有一或多 個保守性胺基酸取代之其等效物；其特定實施例抑制至少 10%之人類及/或鼠類PCSK9依賴性細胞LDL吸收抑制作 用。特定實施例提供經分離拮抗劑，其另外在輕鏈可變區 中包含分別包含SEQ ID NO: 3及/或SEQ ID NO: 5之CDR1 及/或CDR2序列；或特徵為在任何一或多個CDR序列中具 有一或多個保守性胺基酸取代之其等效物。在特定實施例 中，本發明提供所揭示之拮抗劑的同系物，其特徵為視情 況在CDR3序列上與SEQ ID NO: 7或在CDR1、CDR2及 CDR3序列各者内分別與SEQ ID NO: 3、5及7至少90%— 致；抑制至少10%之人類及/或鼠類PCSK9依賴性細胞LDL 137315.doc -33- 200938631 吸收抑制的該等拮抗劑。 在特定實施例中，本發明提供經分離PCSK9特異性 劑，且在更特定實施例中，提供抗體分子，其包含分別& 含SEQ ID NO·· 17及7之重鏈可變區CDR3序列及輕鍵可變 區CDR3序列；及特徵為在任何一或多個CDR3序列中具有 一或多個保守性胺基酸取代之其等效物；其特定實施例抑 制至少10%之人類及/或鼠類PCSK9依賴性細胞LDL吸收抑 制作用。在特定實施例中，本發明提供所揭示之拮抗劑的 同系物，其特徵為在重鏈及輕鏈可變區CDR3序列上分別 與SEQ ID NO: 17及7至少90%—致；抑制至少1〇%之人類 及/或鼠類PCSK9依賴性細胞LDL吸收抑制的該等拮抗劑。 特定實施例提供經分離PCSK9特異性拮抗劑，且在更特 定實施例中，提供抗體分子，其包含分別包含SEQ ID NO: 13、15、17、3、5及 7之重鏈可變區 CDR1、CDR2 及 CDR3 序列及輕鏈可變區CDR1、CDR2及CDR3序列；及特徵為 在任何一或多個CDR序列中具有一或多個保守性胺基酸取 代之其等效物；其特定實施例抑制至少10%之人類及/或鼠 類PCSK9依賴性細胞LDL吸收抑制作用。在特定實施例 中，本發明提供所揭示之拮抗劑的同系物，其特徵為在重 鏈及輕鏈可變區CDR1、CDR2及CDR3序列上分別與SEQ ID NO: 13、15、17、3、5及7至少90% —致；抑制至少 10%之人類及/或鼠類PCSK9依賴性細胞LDL吸收抑制的該 等拮抗劑。 熟習此項技術者將瞭解保守性胺基酸取代為用賦予類似 137315.doc -34- 200938631 或較佳（對於預期目的而言）功能及/或化學特徵之胺基酸殘 基置換胺基酸殘基之取代。可使用此項技術中可用或本文 所述之功能檢定測試帶有該等保守性胺基酸取代之拮抗劑 的保留或較佳活性。具有一或多個保守性胺基酸取代並保 留以與如本文所述之1B20抗體分子相同或優於如本文所述 之1B20抗體分子之程度選擇性結合人類PCSK9及拮抗

PCSK9功此之能力的pcsK9特異性结抗劑在本文中稱為所 揭示拮抗劑的「功能等效物」且形成本發明之特定實施 例。保守性胺基酸取代通常為其中胺基酸殘基經具有類似 側鏈之胺基酸殘基置換之取代。此項技術中已定義具有類 似侧鏈之胺基酸殘基家族。此等家族包括具有鹼性側鏈之 胺基酸（例如，離胺酸、精胺酸、組胺酸）、具有酸性側鏈 之胺基酸（例如，天冬胺酸、麩胺酸）、具有不帶電極性侧 鏈之胺基酸（例如，甘胺酸、天冬酿胺酸、麩醯胺酸、絲 胺酸、蘇胺酸、酪胺酸、半胱胺酸、色胺酸）、具有非極 性側鏈之胺基酸（例如，丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白 胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、甲硫胺酸）、具有卜分支鍵側鍵 之胺基酸（例如，蘇胺酸、缔胺酸、異白胺酸）及具有芳族 側鏈之胺基酸（例如，酪胺酸、笨丙胺酸、色胺酸、組胺 酸）。該等修飾並非經設計以顯著降H_pcsK9特異 性拮抗劑之結合或功能抑制特徵，雖然其可改良該等特 性。產生取代之目的並不顯著且可包括（但決不限於）用能 夠維持或增強分子結構、分子之電荷或疏水性或分子之尺 寸的較佳絲置換絲。舉㈣言，可能需要㈣㈣具 137315.doc •35· 200938631 有相同極性或電荷之殘基取代較不需要之殘基。可藉由此 項技術中已知之諸如定點突變誘發及pCR介導之突變誘發 之標準技術引入該等修飾。熟習此項技術者達成保守性胺 基酸取代之一種特定方法為如以下文獻中所述之丙胺酸掃 描突變誘發：例如，MacLennan等人，1998心

Scawc?· 5卿/. 643:55-67及 Sasaki等人，1998 Ζί/ν· 35:1-24。在另一態樣中，本發明提供經分離PCSK9特異性 拮抗劑，且在更特定實施例中，提供抗體分子，其包含有 含與所揭不抗體之相應胺基酸序列同源之胺基酸序列的重 鏈及/或輕鏈可變區，其中該等抗體分子抑制pcSK9依賴性 細胞LDL吸收抑制作用。特定實施例為包含分別與所揭示 之重鏈及/或輕鏈可變區至少9〇%一致的重鏈及/或輕鏈可 變區之拮抗劑。提及「至少90%一致」包括沿本文所揭示 分子的全長至少 90%、91%、92%、％%、94%、％%、 96%、97%、98%、99%及 1〇〇%—致之序列。 通常產生具有與本文所述拮抗劑之胺基酸序列同源之胺 基酸序列的PCSK9特異性拮抗劑以改良該拮抗劑之一或多 種特性而不會對其對於PCSK9之特異性有負面影響。獲得 該等序列之一種方法（並非熟習此項技術者可用之唯一方 法）為使編碼PCSK9特異性拮抗劑或其特異性決定區之序 列突變’㈣包含突變序列之拮抗劑且使用可用功能檢定 (包括本文所述之彼等檢定）測試經編碼拮抗劑之保留功 能。突變可為經由定點突變誘發或無規突變誘發。然而， 熟習此項技術者將瞭解’突變誘發之其他方法可易於引起 137315.doc -36- 200938631 相同效果。舉例而言，在某些方法中，突變體之範圍受到 基於胺基酸化學或結構特徵之非隨機靶向保守性取代或受 到蛋白質結構因素的約束。在親和力成熟實驗中，可在單 一所選分子中發現若干種該等突變，不論其經隨機選擇抑 或非隨機選擇。如（例如）美國專利第7，117,096號、pCt公 開案第WO 02/084277號及第WO 03/099999號中所表明， 對於親和力成熟亦存在各種基於結構之方法；該等文獻之 揭示内容以引用的方式併入本文中。 如本文所用之兩個胺基酸或核酸序列之間的同源性百分 比等於兩個序列之間的一致性百分比，且在全文中此兩個 術語可互換使用。使用Karlin及Altschul之演算法測定如本 文所用之兩個核酸或胺基酸序列之一致性百分比（pr〇c. Natl. Acad. Sci. USA 90:5 873-5877，1993)。將該演算法併 入 Altschul 等人，1990 J. Mol. Biol. 215:403-410 之 NBLAST及XBLAST程式中。用NBLAST程式，分值=1〇〇, 字長=12實施BLAST核苷酸搜尋以獲得與本發明之核酸分 子同源的核酸序列。用XBLAST程式，分值=50，字長=3 實施BLAST蛋白質搜尋以獲得與本文所揭示胺基酸序列同 源的胺基酸序列。為獲得空位比對以達成比較目的，如 Altschul等人，1997 A^Mc/ez.c Jc/ds 及以.25:3389-3402 中所 述使用 Gapped BLAST。當利用 BLAST 及 Gapped BLAST 程 式時，使用各別程式之預設參數（例如，XBLAST及 NBLAST)。 利用一或多種所揭示之PCSK9特異性分子之組份以產生 137315.doc •37- 200938631 具有類似或較佳特異性之其他結合分子完全處於熟習此項 技術者之技能範圍内。此可（例如）使用重組DNA技術之技 術實現。此技術之一特定實例涉及將編碼抗體之免疫球蛋 白可變區或一或多個CDR之DNA視情況引入不同免疫球蛋 白之可變區、恆定區或恆定區加構架區中。該等分子形成 本發明之重要態樣。特定免疫球蛋白或相應序列（特定所 揭示序列可插入其中或在替代情況下形成其基本部分）包 括（但不限於）形成本發明之特定實施例的以下抗體分子： Fab(具有可變輕鏈（VL)、可變重鏈（VH)、恆定輕鏈（CL)及 恆定重鏈1(CH1)結構域之單價片段）、F(ab’)2(包含由雙硫 橋連接或另外在鉸鏈區連接之兩個Fab片段之二價片段）、 Fd(VH及CH1結構域）、Fv(VL及VH結構域）、scFv(VL及 VH由例如肽連接子之連接子連接的單鏈Fv，參見，例如 Bird等人，1988 Science 242:423-426，Huston等人，1988 P见451 85:5879-5 883)、雙特異性抗體分子（包含如本文 所揭示之PCSK9特異性抗體或抗原結合片段與具有不同於 該抗體之結合特異性之第二功能部分（包括（但不限於）另一 肽或蛋白質，諸如抗體或受體配位體）之連接物的抗體分 子）、雙特異性單鏈Fv二聚體（參見，例如PCT/ US92/09965)、經分離CDR3、微型抗體（自組裝至約80 kDa 之二價二聚體中之單鏈CH3融合物）、'scAb’（含有VH及VL 以及CL或CH1之抗體片段）、dAb片段（VH結構域，參見， 例如 Ward 等人，1989 iVaiwre 341:544-546，及 McCafferty 等人，1990 A/Wwre 348:552-554 ;或 VL結構域，Holt 等 137315.doc -38- 200938631 人，2003 rrewA /«价<?iec/i«o/og_y 21:484-489)、雙鍵抗體 (參見，例如Holliger等人 ’ 1993 户见90:6444-6448 及國際申請案第WO 94/13 804號）、三鏈抗體、四鏈抗體、 微型抗體（與CH3接合之scFv ;參見’例如Hu等人’ 1996 Cancer Res. 56:3055-3061) ' IgG > IgGl ' IgG2 ' IgG3 ' IgG4、IgM、IgD、IgA、IgE或其任何衍生物及基於蛋白 質支架之人工抗體，該等人工抗體包括（但不限於）ΠΙ型纖 維結合蛋白多肽抗體（參見，例如美國專利第6,703,199號 及國際申請案第WO 02/32925號）或細胞色素Β ;參見’例 如 Koide 等人，1998 /. Mo/ec. 5ζ·σ/. 284:1141-1151 及

Nygren等人，1997 Current Opinion in Structural Biology 7:463-469 ;其揭示内容以引用的方式併入本文中。某些抗 體分子（包括（但不限於）Fv、scFv、雙鏈抗體分子或結構域 抗體（Domantis))可藉由併有雙硫橋來連接VH及VL結構域 而穩定，參見，例如 Reiter 等人，1996 Λ/αίΜΜ Bz'oiec/i. 14:1239-1245 ;其揭示内容以引用的方式併入本文中。可 使用習知技術（參見，例如Holliger及Winter’ 1993 CwrreW 4:446-449，其特定方法包括化學上或 自雜合融合瘤產生）及其他技術產生雙特異性抗體，該等 其他技術包括（但不限於）BiTETM技術（具有具不同特異性之 抗原結合區及肽連接子的分子）及杵入臼工程化（knobs-into-holes engineering)(參見，例如Ridgeway等人，1996 尸9:616-621 ;其揭示内容以引用的方式併入本 文中）。雙特異性雙鏈抗體可在大腸桿菌（五.co/i)中產生， 137315.doc -39- 200938631 且如熟習此項技術者所瞭解，如同其他PCSK9特異性矜^ 劑’此等分子可使用噬菌體呈現在適當庫中選擇（參見 例如國際申請案第WO 94/13804號；其揭示内容以弓丨用的 方式併入本文中）。 插有所關注之CDR的可變結構域可自任何生殖系或重排 人類可變結構域獲得。可變結構域亦可以合成方式產生 可使用重組DNA技術將CDR區引入各別可變結構域中。可 用以達成此舉之一種方法描述於Marks等人，1992 此幻；10:779-783中；其揭示内容以引用的方式 併入本文中。可變重結構域可與可變輕結構域配對以提供 抗原結合位點。此外，獨立區（例如，單獨可變重結構域） 可用以結合抗原。熟習此項技術者亦熟知Fv片段之兩個結 構域（VL及VH)儘管可能由獨立基因編碼但仍可使用重組 方法由使該等結構域能夠製成單一蛋白質鏈之合成連接子 接合，其中VL及νΐϊ區配對以形成單價分子（scFv)。

特定實施例在生殖系構架區中提供CDR。構架區（包括 (但不限於）人類構架區）為熟習此項技術者所知（例如，人 類或非人類構架）。該等構架區可天然存在或為一致構架 區。在一態樣中，本發明之抗體的構架區為人類構架區 (關於人類構架區之清單’參見例如cl〇thia等人，1998 乂 Mo/· 5z〇/. 278:457-479 ;該揭示内容以全文引用的方式併 入本文中）。本文中特定實施例提供重鏈可變CDR3 SEQ ID NO: 17至VH5—3中替代相關CDR。本文中特定實施例提 供重鏈可變CDR1、CDR2及/或CDR3序列（分別為SEQ ID 137315.doc 200938631 NO: 13、15及17)至VH5_3中替代相關CDR。本文中特定實 施例提供輕鏈可變CDR3 SEQ ID NO: 7至VK4_3中替代相 關CDR。本文中特定實施例提供輕鏈可變CDR1、CDR2及/ 或CDR3序列（分別為SEQ ID NO: 3、5及7)至VK4_3中替代 相關CDR。特定實施例進一步提供重鏈可變CDR3 SEQ ID NO: 17及輕鏈可變CDR3 SEQ ID NO: 7分別至乂115_3及 VK4_3生殖系序列中。其他實施例提供重鏈可變CDR1、 CDR2及/或CDR3序列（分別為SEQ ID NO: 13、15及17)至 VH5_3中替代相關CDR ;及輕鍵可變CDR1、CDR2及/或 CDR3序列（分別為SEQ ID NO: 3、5及7)至VK4_3中替代相 關 CDR ° 本發明涵蓋人類、人源化、去免疫型、嵌合及靈長源化 分子抗體。本發明亦涵蓋藉由鑲飾方法產生之抗體分子； 參見，例如 Mark 等人，1994 Handbook of Experimental Pharmacology，第 113卷：The pharmacology of monoclonal Antibodies, Springer Verlag，第 105-134頁；其揭示内容以 引用的方式併入本文中。關於所揭示抗體分子之「人類」 特定係指具有來源於人類生殖系免疫球蛋白序列之可變 及/或恆定區的抗體分子，其中該等序列可（但非必須）經修 飾/改變以具有某些胺基酸取代或並非由人類生殖系免疫 球蛋白序列編碼之殘基。可藉由包括（但不限於）活體外隨 機或定點突變誘發之方法或藉由活體内體細胞突變引入該 等突變。文獻中所述之突變技術之特定實例為Gram等人’ 1992 P见89:3576-3580 ; Barbas等人，1994 尸见4S1 137315.doc • 4卜 200938631 91:3809-3813及 Schier等人 1996 J. Mo/·出〇/· 263:551- 567中所揭示之突變技術；其揭示内容以引用的方式併入 本文中。此等突變技術僅為特定實例且並不表示唯一可用 技術。在科學文獻中存在熟習此項技術者可用且廣泛瞭解 之許多突變技術。關於所揭示抗體分子的「人源化」特定 係指來源於另一哺乳動物物種（諸如小鼠）之(：]〇尺序列經移 . 植至人類構架序列上之抗體分子。關於所揭示抗體分子的 - 「靈長源化」係指非靈長類動物之Cdr序列經插入靈長類 動物構架序列中之抗體分子，參見，例如WO 93/02108及 〇 WO 99/55369 ;其揭示内容以引用的方式併入本文中。 本發明之特定抗體為單株抗體，且在特定實施例中呈以 下抗體形式中之一者：IgD、IgA、IgE、IgM、IgGl、

IgG2、IgG3、IgG4或上述任何抗體形式之任何衍生物。在 此情況下’語言「其衍生物」或「衍生物」尤其包括⑴在 一個或兩個可變區（亦即，VH及/或VL)中具有保守性修飾 抗體及抗姐为子’（丨丨）在重鍵及/或輕鏈之恒定區中具有

變動之抗體及抗體分子’及/或（iii)含有通常不為免疫球蛋CI 白分子之部分的額外化學部分之抗體及抗體分子（例如， 聚乙二醇化）。 可變區之變動可在一或多個VH及/或VL CDR區域範圍 . 内。可使用定點突變誘發、隨機突變誘發或用於產生序列 或分子多樣性之其他方法以產生突變體，隨後可以可用活 體外或/舌體内檢定（包括本文所述之彼等檢定）測試該等突 變體之所關注之特定功能特性。 137315.doc •42- 200938631 本發明之抗體亦包括已對乂11及/或¥[内之構架殘基進行 修飾以改良所關注之抗體的一或多種特性之彼等抗體。通 节，進行該等構架修飾以降低抗體之免疫原性。舉例而 言，一種方法為使一或多個構架殘基「回復突變」至相應 生殖系序列。更特定言之，經歷體細胞突變之抗體可含有 不同於產生抗體之生殖系序列的構架殘基。該等殘基可藉 由將抗體構架序列與產生抗體之生殖系序列比較而鑑別。 該等「回復突變」之抗體亦意欲為本發明所涵蓋。另一類 構架修飾涉及使構架區内或甚至一或多個CDR區域内之— 或多個殘基突變以移除τ細胞抗原決定基藉此降低抗體之 潛在免疫原性。此方法亦稱為「去免疫化」且進一步詳細 描述於Carr等人之美國專利公開案第2〇〇3〇 153〇43號中； 其揭示内容以引用的方式併入本文中。 除在構架或CDR區内進行修飾之外或其他，本發明之抗 體可經設計以包括Fc或恆定區内之修飾，（當存在時）該等 修飾通常改變抗體之一或多種功能特性，諸如血清半衰 期補體固疋、F c受體結合及/或抗原依賴性細胞毒性。 產生包含多種抗體同型以便達成所要效應功能性之「雜 合」或「組合」IgG形式之概念已得以一般性描述；參 見’例如Tao等人，1991 乂 五叩.Med. 173:1025-1028。本 發明之特定實施例涵蓋在Fc區具有特定變動之抗體分子， 已發現該等變動使得該抗體部分上與FcyR受體或Cl q之結 合減少。因此’本發明涵蓋不引起（或在較低程度上引起） 抗體依賴性細胞毒性（「ADCC」）、補體介導之細胞毒性 137315.doc •43- 200938631 (「CMC」）或形成免疫複合物，同時保留正常藥物動力學 (「PK」）特性的符合本發明描述之抗體。本發明之特定實 施例提供一種如本發明所定義之抗體分子，其包含SEQ ID NO: 24作為其免疫球蛋白結構之部分，且在特定實施例 中，包含SEQ ID NO: 24之殘基107-326作為免疫球蛋白結 構之部分。本發明涵蓋包含以下各者之抗體分子：（i)包含 SEQ ID NO: 1之輕鏈，及（ii)包含SEQ ID NO: 11之重鏈， 其緊接（鄰接）或繼之以一系列選自由以下胺基酸組成之群 的胺基酸：SEQ ID NO: 21(IgGl)、SEQ ID NO: 22(IgG2) 、SEQ ID NO: 23(IgG4)及 SEQ ID NO: 24(IgG2m4)。圖6說明包含SEQ ID NO: 24之序列（尤其 IgG2m4)與IgGl IgG2及IgG4之比較。可發現成熟分泌型抗 PCSK9 IgG2m4重鏈及輕鏈之胺基酸序列分別為SEQ ID NO: 25及26。本文涵蓋至少部分由該序列編碼之抗體分 子。 特定PCSK9特異性拮抗劑可帶有可偵測標記物或可與毒 素（例如，細胞毒素）、放射性同位素、放射性核素、脂質 體、靶向部分、生物感應器、陽離子尾端或酶（例如，經 由肽鍵或連接子）結合。該等PCSK9特異性拮抗劑組合物 形成本發明之額外態樣。 在另一態樣中，本發明提供編碼所揭示之PCSK9-特異 性拮抗劑之經分離核酸。如先前所提及之「經分離」係指 有關於物質之特性，該特性使該等物質不同於在自然界中 所發現之彼物質。該差異可為（例如）該等物質與自然界中 137315.doc -44- 200938631 所發現之彼物質相比具有不同純度，或該等物質與自然界 中所發現之彼物質相比具有不同結構或形成不同結構之部 分。並非自然界中發現之核酸的實例為（例如）大體上不含 其他細胞物質之核酸。核酸可存在於完整細胞、細胞溶解 產物中或以部分純化或大體上純之形式存在。在特定情況 下’當（例如）使用包括（但不限於）驗性/SDS處理、CsCa 帶、管柱層析、瓊脂糖凝膠電泳及此項技術中已知之其他 合適方法的標準技術純化而純化遠離其他細胞組份或其他 污染物（例如，其他細胞核酸或蛋白質）時核酸可經分離。 核酸可包括DNA(包括CDNA在内）及/或RNA。可使用標準 分子生物學技術獲得本發明之核酸。對於由融合瘤（例 如，由帶有人類免疫球蛋白基因之轉殖基因小鼠製備之融 合瘤）表現之抗體而言，編碼由融合瘤製備之抗體的輕鏈 及重鏈之cDNA可藉由標準PCR擴增或cDNA選殖技術獲 侍。對於獲自免疫球蛋白基因庫之抗體（例如，使用噬菌 體呈現技術）而言，可自庫回收編碼抗體之核酸。 本發明涵蓋編碼所揭示之可變重鏈及/或輕鏈及其選定 組份，尤其所揭示之可變或各別CDRg且尤其cdr3的經 分離核酸。在本文之特定實施例中，CDIUS提供於抗體構 架區内，且在特定實施例中，提供於人類構架區内。特定 實施例提供編碼CDR之經分離核酸至生殖系構架區（包括 (但不限於）人類生殖系構架區）中。本文中特定實施例提供 編碼重鏈CDR SEQ ID N0:丨7之經分離核酸（在特定實施例 中，其中之該核酸包含SEQ ID N〇: 18)至VH5—3中替代編 137315.doc -45- 200938631 碼相關CDR之核酸。本文中特定實施例提供編碼重鏈可變 CDR1、CDR2及 /或 CDR3序列 SEQ ID NO: 13、15及 17(分 別）之核酸（且，在特定實施例中，其中之該核酸分別包含 SEQ ID NO: 14、16及18)至VH5_3中替代相關CDR。本文 中特定實施例提供編碼輕鏈CDR SEQ ID NO: 7之經分離核 酸（在特定實施例中，其中之該核酸包含SEQ ID NO: 8)至 VK4—3中替代編碼相關CDR之核酸。本文中特定實施例提 供編碼輕鏈可變CDR1、CDR2及/或CDR3序列SEQ ID NO: 3、5及7(分別）之核酸（且，在特定實施例中，其中之該核 酸分別包含SEQ ID NO: 4、6及8)至VK4_3中替代相關 CDR。特定實施例進一步提供重鏈可變CDR3 SEQ ID NO: 17(且，在特定實施例中，其中之該核酸包含SEQ ID NO: 18)及輕鏈可變CDR3 SEQ ID NO: 7(且，在特定實施例 中，其中之該核酸包含SEQ ID NO: 8)分別至VH5—3及 VK4—3生殖系序列中。其他實施例提供重鏈可變CDRi、 CDR2及 /或 CDR3序列 SEQ ID NO: 13、15及 17(分別）（且， 在特定實施例中，其中之該核酸分別包含SEQ ID NO: 14、16及18)至VH5—3中替代相關CDR ;及輕鏈可變 CDR1、CDR2 及 / 或 CDR3 序列 SEQ ID NO: 3、5 及 7(分 別）（且，在特定實施例中，其中之該核酸分別包含SEQ ID NO: 4、6及8)至VK4_3中替代相關CDR。 可在任何所要抗體分子形式内提供編碼可變區之經分離 核酸，該抗體分子形式包括（但不限於）以下各者： F(ab’）2、Fab、Fd、Fv、scFv、雙特異性抗體分子（包含如 137315.doc •46· 200938631 本文所揭示之PCSK9特異性抗體或抗原結合片段與具有不 同於該抗體之結合特異性之第二功能部分（包括（但不限於） 另一肽或蛋白質，諸如抗體或受體配位體）之連接物的抗 體分子）、雙特異性單鏈Fv二聚體、微型抗體、dAb片段、 雙鏈抗體、三鏈抗體、四鏈抗體、微型抗體、IgG、 IgGl、IgG2，IgG3、IgG4、IgM、IgD、IgA、IgE或其任 何衍生物。 特定實施例提供編碼PCSK9特異性拮抗劑，且在更特定 實施例中，編碼抗體分子之經分離核酸，該等PCSK9特異 性拮抗劑及抗體分子包含有含SEQ ID NO: 11之重鏈可變 結構域；其特定實施例包含核酸序列SEQ ID NO: 12。本 發明之特定實施例提供編碼PCSK9特異性拮抗劑，且在更 特定實施例中，編碼抗體分子之經分離核酸，其另外包 含：⑴編碼重鏈CDR1胺基酸序列SEQ ID NO: 13之核酸 (其特定實施例包含核酸SEQ ID NO: 14)及/或（ii)編碼重鏈 CDR2胺基酸序列SEQ ID NO: 15之核酸（其特定實施例包含 核酸SEQ ID NO: 16)。特定實施例提供編碼PCSK9特異性 拮抗劑，且在更特定實施例中，編碼抗體分子之經分離核 酸，該等PCSK9特異性拮抗劑及抗體分子包含有含SEQ ID NO: 27之輕鏈可變結構域；其特定實施例包含核酸序列 SEQ ID NO: 28。本發明之特定實施例提供編碼PCSK9特 異性拮抗劑，且在更特定實施例中，編碼抗體分子之經分 離核酸，其另外包含：（i)編碼輕鏈CDR1胺基酸序列SEQ ID NO: 3之核酸（其特定實施例包含核酸SEQ ID NO: 4)及/ 137315.doc •47- 200938631 或（Π)編碼輕鏈CDR2胺基酸序列SEQ m N〇: 5之核酸（其特 定實施例包含核酸SEQ [D NO: 6)。特定實施例提供編碼 PCSK9特異性拮抗劑’且錢^實施射，編碼抗體分 子之經分離核酸，該等PCSK9特異性拮抗劑及抗體分子包 含有含SEQ ID NO: 11之重鏈可變結構域；其特定實施例 包含核酸序列SEQ ID NO: 12 ;及含SEq ID no: 27之輕鏈 可變結構域，其特異性實施例包含核酸序列SEq ID N〇: 28。特定實施例提供編碼以下各者之經分離核酸··⑴重鏈 CDR1、CDR2及 /或 CDR3 序列（分別為 SEq ⑴ N〇: 13、15 及17 ;其特定實施例分別包含核酸SEq id N〇: 14、16及/ 或18)，較佳在構架區（包括（但不限於）人類構架區）中；及 (11)輕鏈CDR1、CDR2及/或COR3序列（分別為SEQ ID NO: 3、5及7 ;其特定實施例分別包含核酸SEq id NO: 4、6 及/或8)，較佳在構架區（包括（但不限於）人類構架區）中。 本發明在特定實施例中進一步提供以上所揭示之拮抗劑之 同系物，其特徵為視情況在重鏈及/或輕鏈可變區或CDR 區上（不論何者出現）與1B20之相應序列至少9〇%—致。 其他實施例提供編碼PCSK9特異性拮抗劑，且在更特定 實施例中，編碼抗體分子之經分離核酸，該等PCSK9特異 性拮抗劑及抗體分子包含有含SEQ ID NO: 1之輕鏈（其特 定實施例包含核酸SEQ ID NO: 2)及含SEQ ID NO: 9之胺基 酸1-221或SEQ ID NO: 9之重鏈或Fd鏈（其特定實施例分別 包含 SEQ ID NO: 10之核酸 1-663 或 SEQ ID NO: 10)。其他 實施例提供編碼PCSK9特異性拮抗劑，且在更特定實施例 137315.doc •48· 200938631 中，編碼抗體分子之經分離核酸，該等PCSK9特異性拮抗 劑及抗體分子包含有含SEQ ID NO: 26之輕鏈（其特定實施 例包含SEQ ID NO: 30)及含SEQ ID NO: 25之重鏈（其特定 實施例包含SEQ ID NO: 29)。在特定實施例中，本發明進 一步提供以上所揭示之拮抗劑的同系物，其特徵為在重鏈 及/或輕鏈上與1B20之相應序列至少90%—致。 本發明之特定實施例涵蓋編碼在Fc區具有變動之抗體分 子的核酸，該等變動使得該抗體部分上與FcyR受體或Clq 之結合減少。本發明之一特定實施例為編碼抗體分子之經 分離核酸，該等抗體分子包含SEQ ID NO: 24作為其免疫 球蛋白結構之部分，且在特定實施例中，包含SEQ ID NO: 24之殘基107-326作為其免疫球蛋白結構之部分。在特定 實施例中，合成PCSK9特異性拮抗劑可藉由自在合適表現 載體内合成及組裝之寡聚核苷酸所產生之核酸表現而產 生；參見，例如Knappick等人，2000 J. Mo厂 Bzo/. 296:57-86及Krebs等人，2001 J. /mmwwo厂 254:67-84。 本發明涵蓋編碼抗體分子之核酸，其包含：⑴編碼包含 SEQ ID NO: 1之輕鏈的核酸（其特定實施例包含核酸SEQ ID NO: 2)，及（ii)編碼包含SEQ ID NO: 11之重鏈的核酸 (其特定實施例包含核酸SEQ ID NO: 12)，其依次繼之以 (鄰接）編碼選自由以下胺基酸組成之群的一組胺基酸之一 組核苷酸：SEQ ID NO: 21(IgGl)、SEQ ID NO: 22(IgG2)、SEQ ID NO: 23(IgG4)及 SEQ ID NO: 24(IgG2m4)。可發現成熟分泌型抗PCSK9 IgG2m4重鏈及 137315.doc -49- 200938631 輕鏈之核苷酸序列分別為SEQ ID NO: 29及30。可發現包 含重鏈及輕鏈1B20抗PCSK9 IgG2m4抗體分子之質體序列 分別為SEQ ID NO: 35及36。編碼該等抗體分子之核酸形 成本文之重要實施例。 本發明亦包括包含與本文所述之全長核苷酸序列至少約 90% —致且更佳至少約95% —致之核苷酸序列的經分離核 酸，且該等核苦酸序列編碼PCSK9特異性拮抗劑，該等 PCSK9特異性拮抗劑抑制至少1〇%之PCSK9依賴性細胞 LDL吸收抑制作用。 本申請案通篇提及「至少約90% 一致」包括至少約 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、 99% 或 100%—致。 本發明進一步提供經分離核酸，該經分離核酸之至少一 部分在嚴格雜交條件下與由SEQ ID N0: 12及^SEQ ID NO: 28組成之核酸補體雜交’其中之該核酸賦予抗體分子 以特異性結合PCSK9且拮抗PCSK9功能之能力；及利用該 核酸表現之PCSK9特異性括抗劑。此項技術中熟知用於使 核酸雜交之方法；參見，例如Ausubel, Cwrrewi iVoioco/s in Molecular Biolosy> John Wiley & Sons, N.Y., 6.3.1-6.3.6, 1989。嚴格雜交條件涉及在68°C下在5><SSC/5x丹哈德溶液 (Denhardt’s solution)(或等效物）/1·〇% SDS中雜父’且在室 溫下在0.2xSSC/0.1% SDS中洗滌。中等嚴格條件包括在 42°C下在3><SSC中洗蘇。可改變鹽濃度及溫度之參數以達 成探針與目標核酸之間的最佳程度之一致性。熟習此項技 137315.doc -50- 200938631 術者可利用各種雜交及/或洗滌條件以特定靶向核酸中與 SEQ ID NO: 12 及 / 或 SEQ ID NO: 28 至少 80%、85%、 90%、95%、98%或99%—致之雜交部分。影響雜交條件之 選擇及引導設計合適條件的基本參數由Sambrook等人， Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y·，第 9章及 第 11 章，1989 及 Au sub el 等人（編），Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc.，第 2·10節及第 6.3節-第6.4節，1995(其揭示内容以引用的方式併入本文 中）闡明，且可易於由一般熟習此項技術者確定。具有一 或多個包含在嚴格雜交條件下與由SEQ ID NO: 12及/或 SEQ ID NO: 28組成之核酸補體雜交的核酸之可變區之 PCSK9拮抗劑應有效拮抗PCSK9之一或多種功能 因此， 該等拮抗劑及編碼核酸形成本發明之重要實施例。 在另一態樣中，本發明提供包含本文所揭示之核酸的載 體。本發明之載體包括（但不限於）適於以對於預期目的而 言適當之程度表現所要抗體分子之質體及其他表現構築體 (例如，視情況為嗔菌體或嗔菌粒）；參見，例如Sambrook 及 Russell，Molecular Cloning : A Laboratory Manual :第 3 版，Cold Spring Harbor Laboratory Press ;其揭示内容以 引用的方式併入本文中。為達成大多數選殖目的，可使用 DNA載體。典型載體包括質體、經修飾病毒、噬菌體、黏 質體、酵母人工染色體、細菌人工染色體及其他形式之游 離或整合DNA。確定用於特定基因轉移、產生重組PCSK9 137315.doc -51 - 200938631 特異性拮抗劑或其他用途之適當載體完全處於熟習此項技 術者之技能範圍内。在特定實施例中，除重組基因之外， 載體亦可含有用於在宿主細胞中自主複製之複製起點、適 當的調節序列（諸如啟動子、終止序列、聚腺苷酸化序 列、強化子序列、選擇標記、有限數目之有用限制酶位點 及/或視情況之其他序列）及高複本數之可能。用於產生蛋 白質特異性拮抗劑之表現載體的實例在此項技術中熟知； 參見’例如Persic等人 ’ 1997 Gew 187:9-18 ; Boel等人， 2000 ·/· 239:153-166及 Liang等人，2001 乂 /謂《«〇/. Μ以AoA 247:119-130 ;其揭示内容以引用的方 式併入本文中。若需要’則可使用此項技術中熟知之技術 將編碼拮抗劑之核酸整合至宿主染色體中；參見，例如 Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, john Wiley & Sons，1999及Marks等人，國際申請案第w〇 95/17516號。核酸亦可於保持游離或併入人工染色體中之 質體上表現；參見，例如Csonka等人，2000 «/. Ce// Mence 113:3207-3216 ; Vanderbyl等人，2002 ΤΤίααρ；； 5:10。特別對於抗體分子而言，可將抗體輕鏈基 因及抗體重鏈基因插入獨立載體中或，更通常可將兩個基 因插入同一表現載體中》可使用標準方法將編碼任何 PCSK9特異性拮抗劑或其組份之核酸插入表現載體中（例 如’核酸片段及載體上之互補限制性位點之連接，或若不 存在限制性位點則鈍端連接）。進行此舉之方式之另一特 定實例係經由使用重組方法，例如Clontech "InFusion"系 137315.doc -52- 200938631 統或Invitrogen "TOPO"系統（兩者均為活體外）或經由細胞 内方式（例如Cre-Lox系統）。特別對於抗體分子而言’可使 用輕鏈及重鏈可變區以藉由將其插入所要同型之已編碼重 鏈恆定區及輕鏈恆定區的表現載體中以便使VH鏈段與CH 鏈段在載體内有效連接且VL鏈段與CL鏈段在載體内有效

連接來產生任何抗體同型之全長抗體基因。另外或其他， 包含編碼PCSK9特異性拮抗劑之核酸的重組表現載體可編 碼促進拮抗劑自宿主細胞分泌之信號肽。可將核酸選殖至 載體中以便使編碼信號肽之核酸與編碼pCSK9特異性拮抗 劑之核酸同框相鄰連接。信號肽可為免疫球蛋白或非免疫 球蛋白信號肽。可利用熟習此項技術者可用之任何技術將 核酸引入至伤主細胞中’參見’例如M〇rris〇n，1985 229:1202。熟知將所關注之核酸分子次選殖至表 現載體中、轉型或轉染含有載體之宿主細胞的方法及製造 大體上純之蛋白質之方法（包含將各別表現載體引入宿主 細胞中及在適當條件下培養該宿主細胞之步驟）。可以習 知方法自宿主細胞收穫由此產生之pcSK9特異性拮抗劑。 適二於將核酸引人所關注之細胞中的技術將視所用細胞之 類^而定。一般技術包括（但不限於）磷酸鈣轉染、DEAE_ 葡聚糖、電穿孔、脂質體介導之轉染及使用適合於所關注 細胞株之病毒(例# ’反轉錄病毒、牛痘、桿狀病毒或嗤 菌體）的轉導。 另態樣中，本發明提供包含編碼所揭示之pcsK9特 異性拮抗劑之核酸㈣分離細胞。多種不同細胞株均涵蓋 137315.doc -53- 200938631 於本文中且可用於重組產生PCSK9特異性拮抗劑，包括 (但不限於）來自原核生物體（例如，大腸桿菌、芽孢桿菌 (Bacillus)及鏈徽菌（Streptomyces))及來自真核生物（例如， 酵母、桿狀病毒及哺乳動物）之彼等細胞株；參見，例如 Breitling 等人，Recombinant antibodies, John Wiley & Sons, Inc. and Spektrum Akademischer Verlag 1999 ;其揭 示内容以引用的方式併入本文中。亦涵蓋包含本文所揭示 之核酸或拮抗劑之植物細胞（包括轉殖基因植物）及動物細 胞（包括轉殖基因動物（除人類外））作為本發明之部分。包 括（但不限於）以下各者之合適哺乳動物細胞或細胞株形成 本發明之額外實施例：來源於中國倉鼠卵巢之彼等細胞或 細胞株（CHO細胞，包括（但不限於）與（例如）DHFR選擇標 記（例如，如 Kaufman及 Sharp，1982 Mo/.价<?/. 759:607-中所述）一起使用之DHFR-CHO細胞（描述於Urlaub及 Chasin, 1980 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220 中））、NSO骨髓瘤細胞（其中可使用如WO 87/04462、WO 89/01036及EP 338,841中所述之GS表現系統）、COS細胞、 SP2細胞、海拉細胞（HeLa cell)、幼倉鼠腎細胞、YB2/0大 鼠骨髓瘤細胞、人胚腎細胞、人類胚視網膜細胞及包含本 文所揭示之核酸或拮抗劑之其他細胞或細胞株；先前引用 之揭示内容以引用的方式併入本文中。包含編碼所揭示之 PCSK9特異性拮抗劑之核酸的本發明之特定實施例包括 (但不限於）大腸桿菌（參見，例如Pliickthun, 1991 扪o/hc/iwo/ogj 9:545-551)或諸如畢赤酵母（Pichia)之酵母 137315.doc -54· 200938631 及其重組衍生物（參見，例如Li等人，2006 24:21〇-215);先前揭示内容以引用的方式併入 本文中。本發明之特定實施例係關於包含編碼所揭示之 PCSK9特異性拮抗劑之核酸的真核細胞，參見Chadd& Chamow, 2001 Current Opinion in Biotechnology 12:188- 194，Andersen 及 Krummen，2002 Cwrrewi O/nwzon Biotechnology 13:117，Larrick 及 Thomas, 2001 Cwrrewi

❹ 幻；12:411-418;其揭示内容以引用 的方式併入本文中。本發明之特定實施例係關於包含編碼 所揭示之PCSK9特異性拮抗劑之核酸的哺乳動物細胞，其 能夠以適當轉譯後修飾產生PCSK9特異性拮抗劑。轉譯後 修飾包括（但決不限於）雙硫鍵形成及糖基化。另一類轉譯 後修飾為信號肽裂解。本文中較佳實施例具有適當糖基 化；參見，例如 Yoo 等人 ’ 2002 J. //nmwno/. 261:1-20 ;其揭示内容以引用的方式併入本文中。天然存 在之抗體含有至少一種與重鏈連接之N連接碳水化合物。 同上。不同類型之哺乳動物宿主細胞可用以提供有效轉譯 後修飾。該等宿主細胞之實例包括中國倉鼠印巢（CH〇)、 海拉細胞、C6、PC12及骨髓瘤細胞；參見，γ〇〇等人， 2002 J. Immunol. Methods 261:1-20 > iLPersic# A » 1997 Gene 187:9-18 ;其揭示内容以引用的方式併入本文中。 在另一態樣中，本發明提供包含本發明之多肽的經分離 細胞。 在另一態樣中’本發明提供一種製造本發明之PCSK9特 137315.doc -55- 200938631

異性括抗劑的方法，該方法包含將包含編碼PCSK9特異性 抬抗劑或對於人類及/或鼠類PCSK9具有特異性之所要 PCSK9特異性拮抗劑之重鏈及/或輕鏈或其片段（例如，vh 及/或VL’或所揭示之重鏈及/或輕鏈可變區cdr中之一或 多者由所要拮抗劑決定）之核酸的細胞在允許PCSK9特異 十生&抗劑表現或允許該等重鏈及/或輕鏈或片段表現及組 裝成PCSK9特異性拮抗劑之條件下培育，及自該細胞分離 該PCSK9特異性拮抗劑。產生特定所要重鏈及/或輕鏈序列 或片段之方法之一實例為首先使用PCR擴增（及修飾）生殖 系重鏈及/或輕鏈可變序列或片段。熟習此項技術者可易 於使用人類重及/或輕可變區之生殖系序列，參見，例如 「Vbase」人類生殖系序列資料庫（the 「Vbase」human germline sequence database)及 Kabat, E.A.等人，1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest，第 5版， 美國衛生與公幕服務部（U.S. Department of Health and Human Services)，NIH 公開案第 91-3242 號；Tomlinson， I.M.等人，1992 「The Repertoire of Human Germline VH

Sequences Reveals about Fifty Groups of VH Segments with Different Hypervariable Loops」J. Mol. Biol. 227:776-798 ;及 Cox J.P.L.等人，1994 「A Directory of Human

Germ-line V (Segments Reveals a Strong Bias in their Usage」五wr. /. /mwM«〇/· 24:827-836;其揭示内容以引用 的方式併入本文中。可使用標準方法進行生殖系序列之突 變誘發，例如，PCR介導之突變誘發（其中將突變併入PCR 137315.doc •56- 200938631 引子中）或定點突變誘變。若需要全長抗體’則可用人類 重鏈恆定區基因之序列；參見，例如Kabat. E.A.等人， 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest,第 5 版’美國衛生與公眾服務部，NIH公開案第91-3242號。可 (例如）藉由標準PCR擴增獲得含有此等區之片段。或者， 熟習此項技術者可利用已編碼重鏈及/或輕鏈恆定區之载 體。 存在用以重組產生保留原始抗體之特異性之其他抗體分 子的可用技術。其特定實例為將編碼免疫球蛋白可變區或 CDR之DNA引入另一抗體分子之恆定區，或恆定區及構架 區，或單獨構架區中；參見，例如EP-184，187、GB 218863 8及£卩-239400;其揭示内容以引用的方式併入本文 中。抗體分子（包括嵌合抗體）之選殖及表現描述於文獻 中；參見，例如EP 0120694及EP 0125023 ;其揭示内容以 引用的方式併入本文中。 在一種情況下’可使用已知技術產生本發明之抗體分子. 且接著篩檢本文所鑑別之特徵。製備單株抗體之基本技術 描述於文獻中，參見’例如Kohler及Milstein(1975, Nature 256:495-497);其揭示内容以引用的方式併入本文中。可 藉由可用方法產生完全人類單株抗體。此等方法包括（但 决不限於）使用基因工程小鼠品系，該等小鼠品系具有免 疫系統藉此使小鼠抗體基因失活且轉而經功能人類抗體基 因譜置換，同時使小鼠免疫系統之其他組份不改變。該等 基因工程小鼠允許產生高親和力、完全人類單株抗體之天 137315.doc •57· 200938631 然活體内免疫反應及親和力成熟過程。此技術在此項技術 中熟知且充分詳細描述於諸多公開案中，該等公開案包括 (但不限於）美國專利第5,545,806號；第5,569,825號；第 5,625，126 號；第 5,633,425 號；第 5,789,650 號；第 5,877,397 號；第 5,661，016 號；第 5,814,318 號；第 5,874,299 號；第 5,770,249 號（讓渡予 GenPharm International且可經由Medarex使用，在「UltraMab Human Antibody Development System」之保護下）；以及美國專利 第 5,939,598 號；第 6,075,181 號；第 6,114,598 號；第 6，150,584號及相關家族成員（讓渡予八匕861^，揭示其 XenoMouse®技術）；其揭示内容以引用的方式併入本文 中。亦參見 Kellerman 及 Green, 2002 Cwrr. Biotechnology 13:593-597，及 Kontermann 及 Stefan, 2001 Antibody Engineering, Springer Laboratory Manuals 之評 述；其揭示内容以引用的方式併入本文中。 或者，可使本發明之PCSK9特異性拮抗劑庫與PCSK9及 能顯示選定特異性結合者接觸。接著可進行功能研究以確 保適當功能性，例如對PCSK9依賴性細胞LDL吸收抑制作 用的抑制。熟習此項技術者可使用多種技術以便使用富集 技術自庫中選擇蛋白質特異性分子，該等技術包括（但不 限於）噬菌體呈現（例如，參見美國專利第5,565,332號；第 5,733,743 號；第 5,871,907 號；第 5,872,215 號；第 5,885,793 號；第 5,962,255 號；第 6,140,471 號；第 6,225,447 號；第 6,291,650 號；第 6,492,160 號；第 137315.doc -58- 200938631 6,521，404 號；第 6,544,731 號；第 6,555,313 號；第 6,582,915號；第6,593,081號以及其他美國專利家族成員 及/或申請案（其依賴於1992年5月24曰申請之GB 9206318 申請之優先權）中所揭示之Cambridge Antibody Technology(「CAT」）之技術）、核糖體呈現（參見，例如 Hanes及 Pluckthtin, 1997 Proc. iVVzi/. Jcai/. 5W. 94:4937-4942)、細菌呈現（參見’例如Georgiou等人’ 1997 iVaiwre S/okc/iwo/og'y 15:29-34)及 / 或酵母 1 現（參見，例如Kieke 等人，1997 10:1303-1310);先前揭示 内容以引用的方式併入本文中。舉例而言，庫可於噬菌體 粒子之表面上呈現，其中編碼PCSK9特異性拮抗劑或其片 段之核酸在噬菌體粒子表面上表現及呈現。接著可將呈現 所要程度之活性之核酸與噬菌體粒子分離且將該核酸用於 形成所要拮抗劑。噬菌體呈現已充分描述於文獻中；參 見，例如Kontermann及Stefan，上述，及國際申請案第WO 92/0 1047號；其揭示内容以引用的方式併入本文中。特別 對於抗體分子而言，本發明之個別重鏈或輕鏈純系亦可分 別用以篩檢能夠彼此相互作用以形成組合重鏈及輕鏈之分 子的互補重鏈或輕鏈；參見，例如國際申請案第WO 92/01047號。熟習此項技術者可用之任何淘選方法均可用 以鑑別PCSK9特異性拮抗劑。用於實現此舉之另一特定方 法為針對溶液中之目標抗原（例如生物素標記之可溶性 PCSK9)淘選’且接著將PcsK9特異性拮抗劑-噬菌體複合 物捕捉於經抗生蛋白鏈菌素塗佈之磁性珠粒上，接著將該 137315.doc -59- 200938631 等珠粒洗滌以移除非特異性結合之噬菌體。接著可以與如 本文所述自培養板（例如DTT)之表面回收所捕捉之噬菌體 相同之方式自珠粒回收所捕捉之噬菌體。 PCSK9特異性拮抗劑可藉由熟習此項技術者可用之技術 純化°可藉由各種血清學或免疫檢定測定相關拮抗劑製 劑、腹水、融合瘤培養液或相關樣品之效價，該等檢定包 括（但不限於）沈澱、被動凝集、酶聯結免疫吸附抗體 (「ELISA」）技術及放射免疫檢定（「RIA」）技術。 本發明在某種程度上係關於利用本文所述之PCSK9特異 性抬抗劑拮抗pCSK9功能的方法；該等方法在下文中作進 一步描述。本申請案通篇使用術語「拮抗」係指對抗、抑 制、抵消、中和或削弱PCSK9之一或多種功能之行為。可 根據此項技術已知之方法（參見，例如Barak及Webb，1981 j. Cell Biol. 90:595-604 ； Stephan 及 Yurachek，1993 /· Lipid Res. 34:325330 ;及 McNamara 等人，2006 Clinic a C/hVwka Jc/a 369:158-167)以及本文所述之彼等方法容易 地測定對一或多種PCSK9相關功能特性的抑制作用或拮抗 作用。抑制作用或拮抗作用將使得PCSK9活性相對於不存 在拮抗劑之情況下所見之活性或（例如）當存在具有不相關 特異性之對照拮抗劑時所見之活性降低。較佳地，本發明 之PCSK9特異性拮抗劑拮抗PCSK9功能至以下程度：所量 測參數（包括（但不限於）本文所揭示之活性）降低至少10%， 且更佳，所量測參數降低至少20%、30%、40%、50%、 60%、70%、80%、90%及95%。該對於PCSK9功能之抑制 137315.doc •60- 200938631 作用/拮抗作用在PCSK9功能至少部分促成對受檢者有負面 影響之特定表型、疾病、病症或病況之彼等情況下尤其有 效。 在一態樣中，本發明提供一種拮抗PCSK9活性的方法， 該方法包含使能夠受PCSK9影響之細胞、細胞群體或組織 樣品（亦即，其表現及/或包含LDL受體）與本文所揭示之 PCSK9特異性拮抗劑在允許該拮抗劑結合PCSK9(若存在） 且抑制PCSK9對細胞LDL吸收之抑制作用之條件下接觸。 ® 本發明之特定實施例包括細胞為人類細胞之該等方法。本 發明之其他特定實施例包括細胞為鼠類細胞之該等方法。 在另一態樣中，本發明提供一種拮抗受檢者之PCSK9活 性的方法，該方法包含向受檢者投與治療有效量之本發明 之PCSK9特異性拮抗劑。在特定實施例中，拮抗PCSK9功 能之方法係用於治療PCSK9相關之疾病、病症或病況，或 者可受益於PCSK9拮抗劑作用之疾病、病症或病況。該藥 A 劑將適用於呈現與PCSK9活性相關之病況或PCSK9之功能 φ 對於特定受檢者顯不不當之病況的受檢者。在選定實施例 中，病況可為高膽固醇血症、冠心病、代謝症候群、急性 冠狀動脈症候群或相關病況。 ’因此，本發明涵蓋本文所述之PCSK9特異性括抗劑在需 要拮抗PCSK9功能之各種治療方法中的用途。治療方法可 為預防性質或治療性質的。在特定實施例中，本發明係關 於一種治療與PCSK9活性相關/歸因於PCSK9活性之病況， 或PCSK9之功能對特定受檢者顯示不當之病況的方法，該 137315.doc -61 - 200938631 方法包含向受檢者投與治療有效量之本發明之pcsK9特異 性拮抗劑。在選定實施例中，病況可為高膽固醇血症、冠 心病、代謝症候群、急性冠狀動脈症候群或相關病況。 本發明之治療方法包含向個體投與治療（預防）有效量之 本發明之PCSK9特異性拮抗劑。關於量使用術語「治療有 效」或「預防有效」係指在預期劑量下達成所要治療性/ 預防性作用歷時所要時間所必需之量。所要作用可為（例 如）至少一種與所治療病況相關之症狀的改善。如熟習此 項技術者所瞭解，此等量將根據各種因素改變，該等因素 包括（但不限於）個體之疾病狀態、年齡、性別及體重，及 PCSK9特異性拮抗劑在個體甲引發所要作用之能力。反應 可藉由活體外檢定、活體内非人類動物研究記錄及/或進 一步經由臨床試驗予以支持。 PCSK9特異性拮抗劑可以醫藥組合物形式投與。因此， 本發明提供醫藥學上可接受之組合物’其包含本發明之 PCSK9特異性拮抗劑及醫藥學上可接受之載劑，該載劑包 括（但不限於）賦形劑、稀釋劑、穩定劑、緩衝劑或經設計 以促進拮抗劑以所要形式及所要量投與所治療個體之替代 物。 醫藥組合物可藉由此項技術中已知之許多策略調配，參 見例如 McGoff及 Scher, 2000 冲.: McNally，E丄編，pr〇tein F〇rmulati〇n and Delivery. New York, NY: Marcel Dekker，第 139-158 頁 ’ Akers 及 Defilippis ’ 2000， 137315.doc 200938631

Parenteral Solutions. Pharmaceutical Formulation Development of Peptides and Proteins. Philadelphia, PA: Taylor and Francis,第 145-177 頁；Akers等人，2002，P/iarm· 14:47-127。適用於投與患者之醫藥學上可接受之組合物將 在調配物中含有有效量之PCSK9特異性拮抗劑，其保留生 物活性同時亦促進在儲存期間在可接受之溫度範圍内之最 大穩定性。 在特定實施例中，基於拮抗劑之醫藥學上可接受之組合 物可呈液體或固體形式或呈氣體粒子或霧化粒子形式。可 使用產生液體或固體調配物之任何技術。該等技術完全處 於熟習此項技術者之能力範圍内。可藉由任何可用方法產 生固體調配物，該等方法包括（但不限於）冷凍乾燥、喷霧 乾燥或藉由超臨界流體技術乾燥。用於經口投與之固體調 配物可呈使得拮抗劑以指定量且在指定時間内為患者獲得 之任何形式。經口調配物可呈多種固體調配物形式，該等 固體調配物包括（但不限於）錠劑、膠囊或散劑。或者，可 將固體調配物冷凍乾燥且在投與之前製成溶液以供單次或 多次給藥。拮抗劑組合物一般應經調配成處於生物學相關 pH值範圍内且可經缓衝以在儲存期間維持適當pH範圍。 液體與固體調配物一般均需要在較低溫度（例如2-8°C )下儲 存以使穩定性保持較長時間。經調配之拮抗劑組合物、尤 其液體調配物可含有防止儲存期間發生蛋白水解或將其減 至最少的抑菌劑，該抑菌劑包括（但不限於）有效濃度（例 如，$1% w/v)之苄醇、苯酚、間甲酚、氯丁醇、對羥基苯 137315.doc -63- 200938631 曱酸甲酯及/或對羥基笨甲酸丙酯。抑菌劑可能對於一些 患者顯示不當。因此，冷凍乾燥之調配物可於含有或不含 該組份之溶液中復水。可將其他紐·份添加至經緩衝之液體 或固體拮抗劑調配物中，該等組份包括（但不限於）糖，如 低溫保護劑（包括（但不限於）聚經基烴，諸如山梨糖醇、甘 露糖醇、甘油及半乳糖醇，及/或雙醣，諸如蔗糖、乳 糖、麥芽糖或海藻糖）及在一些情況下，相關鹽（包括（但不 限於）NaCl、KC1或LiCl)。該等拮抗劑調配物、尤其預計 供長期儲存之液體調配物將依賴於適用的總容積滲透濃度 範圍以促進在（例如）2-8°C或更高溫度下之長期穩定性同時 亦使調配物適用於非經腸注射。視情況而定，可包括防腐 劑、穩定劑、緩衝劑、抗氧化劑及/或其他添加劑。調配 物可含有二階陽離子（包括（但不限於）MgCl2、CaCl2& MnCh);及/或非離子型界面活性劑（包括（但不限於）聚山 梨醇酯-80(Tween 80™)、聚山梨醇酯_6〇(Tween 6〇TM)、聚 山梨醇酯-40(Tween 4〇τΜ)及聚山梨醇酯_2〇(Tween 20™) ' 聚氧化乙烯烷基醚（其包括（但不限於）Brij 58TM、Brij35TM 以及其他’諸如 Trit〇n χ_1〇〇ΤΜ、Trit〇n 、 ΝΡ4〇ΤΜ、Span 85及Plur〇nic系列之非離子型界面活性劑 (例如，Phonic 121)))。該等組份之任何組合形成本發明 之特定實施例。 呈液體形式之醫藥組合物+ σ物可包括液體載劑，例如水、石 油、動物油、植物油、礦物油或合成油。液體形式亦可包 括生理食鹽水溶液、右旋糖或其㈣類溶㈣H如 137315.do, 200938631 乙二醇、丙二醇或聚乙二醇β 較佳地’醫藥組合物可呈非經腸可接受之水溶液形式， 其無熱原質’具有合適pH值、張力及穩定性。醫藥組合物 可經調配以便在等張媒劑中稀釋之後投與，例如氯化鈉注 射液林格氏注射液（Ringer's Injection)或乳酸林格氏注射 液。

抬抗劑治療劑之給藥完全處於熟習此項技術者之技能範 圍内’參見’例如Lederman等人，1991 /«i. J. 47: 659 664，Bagshawe等人，1991 Jn说〇办， 心山·⑽·ca/j ms%〗，且將基於許多因素 而改變，該等因素包括（但不限於）所用特定pcsK9特異性 拮抗劑、所治療之患者、患者之病況、所治療之區域、投 藥途徑及所要之治療。一般熟習此項技術之醫師或獸醫會 奋易也確疋且拮抗劑之；;台療有效量。劑量範圍可為每 公斤主體體重約0.01至100毫克，且更通常每公斤主體體 重〇·0:至25毫克。舉例而言，劑量可為每公斤體重0_3毫 克、母公斤體重1毫克、每公斤體重3毫克、每公斤體重5 毫克或每公斤體重1〇毫克戋在1 、 毛兄次在1·10 之範圍内。出於 說明之目的但不加以限制，在特 隹特疋實施例中，可使用5 mg 至2.0 g之劑量以全身傳遞拮抗 連幻處於產生功效而盈 毋性之範圍内之拮抗劑濃度的最 取1主檟度需要基於藥物對於 目才示位點之可用性的動力學 苗从从方案。此涉及考慮PCSK9特 異性括抗劑之分布、平衡及洁^ 太女所、可以適當劑量單獨使用 本文所述之拮杬劑。或者，可能 要，、同投與或依序投與 I37315.doc •65- 200938631 ί = ΐ二發明之咖特異性拮抗劑之治療給藥方案 =、/〇療方案聯合存在。舉例而言，PCSK9特里性 拮抗劑可與其#蠤从,ν ^ ^ 用，該等藥物U X性及/或預防性)組合或聯合使 吸收拙4丨、L (但不限於)降膽固醇藥物，例如膽固醇 及收，㈣如，及膽固醇合成抑制劑(例如醇 ，及h叫本發明涵蓋該等組合且其形成本發明 之要實施例。因此，本發明係關於如上所述之治療方 其中將PCSK9特異性拮抗劑與另外一或多種藥物（治 ’:戈預防性)同時投與/傳遞、在另外-或多種藥物之 1或之刖技與/傳遞’該或該等藥物包括（但不限於）降膽固 醇藥物、膽固醇吸收抑制劑及膽固醇吸收抑制劑。 能夠如本文所述治療之個體（受檢者）包括靈長類動物、 人類及非人類’且包括具有商業或養馴獸醫學價值之任何 非人類哺乳動物或脊椎動物。 可將PCSK9特異性拮抗劑單獨或與經設計以輔助治療個 體之其他藥劑組合’藉由此項技術巾所瞭解之任何投藥途 徑投與個體，該投藥途徑包括（但不限於）經口投與、藉由 注射投與（其特定實施例包括靜脈内、皮下、腹膜内或肌 肉内注射）、藉由吸入投與、鼻内投與或局部投與。投藥 途徑應基於熟習此項技術者所瞭解之許多因素而確定該 等因素包括（但不限於）治療之所要物理化學特徵。可基於 每曰、每週、每兩週或每月或以指定次數向個體傳遞適當 量之PCSK9特異性拮抗劑以便實現且維持所要治療之任何 其他方式提供治療。可以單次劑量或以一次以上劑量以分 137315.doc •66· 200938631 開時間投與調配物。 亦涵蓋在製造用於治療PCSK9相關之疾病、病症或病況 或可受益於PCSK9拮抗劑之作用的疾病、病症或病況之藥 劑中使用所揭示之拮抗劑的方法。該藥劑將適用於呈現與 PCSK9活性相關之病況，或PCSK9之功能對於特定受檢者 顯不不當之病況的受檢者。在選定實施例中’病況可為南 膽固醇血症、冠心病、代謝症候群、急性冠狀動脈症候群 或相關病況。

本文所揭示之PCSK9特異性拮抗劑亦可用作診斷PCSK9 之方法。在選定實施例中，本發明涵蓋鑑別存在於樣品 (包括（但不限於）生物樣品，例如血清或血液）中之PCSK9 或量化其含量的方法，該方法包含使樣品與本文所述之 PCSK9特異性拮抗劑接觸且分別偵測或量化與PCSK9之結 合。PCSK9特異性拮抗劑可用於熟習此項技術者已知之各 種檢定形式，且可形成套組之部分（以下進一步描述套組 之一般特徵）。 本發明進一步提供投與所揭示之抗PCSK9拮抗劑以達成 基因療法之目的。經由該等方法，用編碼本發明之PCSK9 特異性拮抗劑的核酸將受檢者之細胞轉型。接著包含該等 核酸之受檢者内源性產生PCSK9特異性拮抗劑。先前 Alvarez 等人，C7z'«z.ca/ Ca«cer 6:3081-3087 2000，使用基因療法將單鏈抗ErbB2抗體引入受檢者。 Alvarez等人，上述所揭示之方法可調適用於將編碼本發明 之抗PCSK9抗體之核酸引入受檢者。 137315.doc -67- 200938631 可將編碼任何PCSK9特異性拮抗劑之核酸引入受檢者。 可藉由此項技術中已知之任何方法將核酸引入受檢者之 細胞中。在較佳實施例中，將核酸作為病毒載體之部分引 入。可產生載體之較佳病毒的實例包括慢病毒、疮療病 毒、腺病毒、腺相關病毒、牛痘病毒、桿狀病毒、α病 毒、流感病毒及具有所要趨細胞性之其他重組病毒。 許多公司均商業生產病毒載體，該等公司包括（但決不 限於）Avigen，Inc.(Alameda, Calif. ； AAV 載體.）、Cell Genesys(Foster City, Calif.;反轉錄病毒、腺病毒、AAV 載體及慢病毒載體）、Clontech(反轉錄病毒及桿狀病毒載 體）、Genovo, Inc.(Sharon Hill，Pa.;腺病毒及 AAV 載體）、 Genvec(腺病毒載體）、IntroGene(Leiden，Netherlands ;腺 病毒載體）、Molecular Medicine(反轉錄病毒、腺病毒、 AAV及疮療病毒載體）、Norgen(腺病毒載體）、Oxford BioMedica(Oxford, United Kingdom ;慢病毒載體）及 Transgene(Strasbourg, France ;腺病毒、牛痘、反轉錄病 毒及慢病毒載體）。 用於建構及使用病毒載體之方法在此項技術中已知（參 見，例如Miller等人，BioTechniques 7:980-990, 1992)。較 佳地，病毒載體為複製缺陷型，亦即其不能在目標細胞中 自主複製，且因此不具感染性。較佳地，複製缺陷型病毒 為最小病毒，亦即其僅保持用殼體包裹基因組以產生病毒 粒子所必需之其基因組序列。較佳為完全或幾乎完全缺乏 病毒基因之缺陷型病毒。使用缺陷型病毒載體允許向細胞 137315.doc -68- 200938631 之特定、限定區域中投藥，而不必擔心該載體會感染其他 細胞。因此，可特定靶向特定組織。 包含減毒或缺陷型DNA病毒序列之載體的實例包括（但 不限於）缺陷型疱療病毒載體（Kanno等人，Cancer Ge«. 6:147-154, 1999 ; Kaplitt等人，《/. Me/A. 71:125-132，1997 及 Kaplitt 等人，/· iVewro Owe. 19:137-147, 1994)。 腺病毒為可經修飾以有效傳遞本發明之核酸至多種細胞 ® 類型之真核生物DNA病毒。在一些情況下，需要減毒型腺 病毒載體’諸如 Strafford-Perricaudet等人 ’ ·/· C7z·». //tveW. 90:626-630，1992所述之載體。已描述各種複製缺陷型腺 病毒及最小腺病毒載體（PCT公開案第W094/26914號、第 W094/28938號、第 W094/28152號、第 W094/12649號、第 WO95/02697號及第W096/22378號）。本發明之複製缺陷型 重組腺病毒可藉由熟習此項技術者已知之任何技術製備 ^ (Levrero等人，101:195，1991 ; EP 185573 ; Graham， β 五Μ50/· 3:2917, 1984 ; Graham等人，乂 Fzro/· 36:59, 1977)。 ‘腺相關病毒（AAV)為具有相對較小尺寸之DNA病毒，其 •可以穩定及定點方式整合至其所感染之細胞的基因組中。 該等病毒能夠感染廣泛範圍之細胞，而不對細胞生長、形 態或分化產生任何影響，且其似乎並不牵涉於人類病理學 中。已描述AAV產生之載體用於在活體外及活體内轉移基 因之用途（參見 Daly 等人，Gene Ther. 8:1343-1346, 2001， 137315.doc •69- 200938631

Larson等人，Adv. Exp. Med. Bio. 489:45-57, 2001 ; PCT公 開案第WO 91/18088號及第WO 93/09239號；美國專利第 4,797,368號及第 5,139,941 號及 EP 488528B1)。 在另一實施例中，可將基因引入反轉錄病毒載體中，例 如，如美國專利第5,399,346號、第4,650,764號、第 4,980,289 號及第 5，124,263 號；Mann 等人，Ce// 33:153, 1983 ; Markowitz 等人，·/· Wro/.，62:1120，1988 ; EP 453242及EP178220中所述。反轉錄病毒為感染分裂細胞之 整合病毒。 慢病毒載體可用作在若干組織類型（包括腦、視網膜、 肌肉、肝臟及血液）中直接傳遞且持續表現編碼本發明之 PCSK9特異性拮抗劑之核酸的介質。載體可在此等組織中 有效轉導分裂細胞及非分裂細胞且維持PCSK9特異性拮抗 劑之長期表現。對於評述參見Zufferey等人，《/· FVro厂 72:9873-80，1998 及 Kafri 等人，Cwrr. Opin. Mol. Ther. 3:316-326, 2001。此項技術中一般可用且已知慢病毒封裝 細胞株。其有利於產生用於基因療法之高效價慢病毒載 體。實例為四環素誘導性VSV-G假型慢病毒封裝細胞株， 其可產生大於1〇6 IU/ml之效價之病毒粒子歷時至少3至4 日；參見Kafri等人，6>〇厂73:576-584, 1999。由誘導性 細胞株產生之載體可視需要加以濃縮以便在活體外及活體 内有效轉導非分裂細胞。 辛德畢斯病毒（Sindbis virus)為α病毒屬之成員且自從其 在1 953年開始在世界各地被發現以來已得以廣泛研究。已 137315.doc -70· 200938631 在活體外充分研究基於α病毒、尤其辛德畢斯病毒之基因 轉導（參見 Straus 等人，M/crofez’c»/· 58:491-562, 1994 ; Bredenbeek等人，/. Wri?/.，67:6439-6446，1993 ; Ijima等人，又 Ca«cer 80:110-118, 1999及 Sawai等人，

Com/w. 248:315-323，1998)。α病毒 載體之許多特性使其成為開發中之其他病毒源性載體系統 的所需替代物，該等特性包括表現構築體之快速工程化、 高效價感染性粒子儲備物的產生、非分裂細胞之感染及高 程度表現（Strauss等人，1994上述）。已描述辛德畢斯病毒 用於基因療法之用途。（Wahl for s等人，Gene. ΓΛβΓ. 7:472-480, 2000 A Lundstrom, J. Recep. Sig. Transduct. Res. 19(1-从673-686, 1999)。 在另一實施例中，可藉由脂質轉染或用其他轉染促進劑 (肽、聚合物等）將載體引入細胞中。合成陽離子性脂質可 用以製備用於活體内及活體外轉染編碼標記之基因的脂質 體（Feigner 等人，/Voc. iVa". Jcad. 5W. ^/又4 料：7413-7417, \9%Ί 專 k、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84·.Ί%5\- 7855, 1987)。適用於轉移核酸之脂質化合物及組合物描述 於PCT公開案第WO 95/1 8863號及第WO 96/17823號及美國 專利第5,459,127號中。 亦可在活體内將載體以裸DNA質體形式引入。可藉由此 項技術中已知之例如電穿孔、顯微注射、細胞融合、 DEAE葡聚糖、磷酸鈣沈澱、使用基因槍或使用DNA載體 轉運體之方法將用於基因療法之裸DNA載體引入所要宿主 137315.doc -71 - 200938631

細胞中（參見，例如Wilson等人，乂5/〇/.(：/16讲_267:963-967，1992 ; Williams 等人，/Voc. Jcac?. C/M 88:2726-2730, 1991)。常用於轉染質體之其他試劑包括（但 決不限於）FuGene、Lipofectin及 Lipofectamine。亦可使用 受體介導之DNA傳遞方法（Wu等人，/.价〇/· C/iem. 263: 14621-14624， 1988)。美國專利第 5,580,859 號及第 5,5 89,466號揭示哺乳動物中不含轉染促進劑之外源DNA序 列的傳遞。近來，已描述相對較低電壓、較高效率的活體 内DNA轉移技術，稱為電轉移（Vilquin等人，Gene TTzer. 8:1097, 2001 ; Payen 等人，Exp. Hematol. 29:295-300, 2001 ; Mir, Sioe/ecirocAembirj 53:1-10，2001 ; PCT公開案 第 WO 99/01157號、第 WO 99/01158 號及第 WO 99/01175 號）。 適用於該等基因療法且包含編碼本發明之抗PCSK9拮抗 劑之核酸的醫藥組合物包括於本發明之範疇内。 在另一態樣中，本發明提供一種使用本發明之PCSK9特 異性拮抗劑鑑別、分離、量化或拮抗所關注之樣品中之 PCSK9的方法。PCSK9特異性拮抗劑可在以下方案中用作 研究工具：免疫化學檢定，諸如西方墨點法（Western blots)、ELISA、放射免疫檢定、免疫組織化學檢定、免疫 沈澱或此項技術中已知之其他免疫化學檢定（參見、例如 Immunological Techniques Laboratory Manual, Goers, J.編 1993, Academic Press)或各種純化方案。结抗劑可具有併 入其中或附著至其上之標記物以有利於簡便鑑別或量測與 137315.doc -72- 200938631 其相關之活性。熟習此項技術者易於知曉各種類型之可偵 測標記物（例如，容易偵測到或產生一些容易偵測到之行 為/結果之酶、染料或其他合適分子），該等標記物適用於 或可能適用於以上方案。 本發明之另一態樣為包含本文所揭示之？(：81^9特異性拮 抗劑或醫藥組合物及使用說明書之套組。套組通常（但並 非必需）包括指示套組内含物之預期用途的標記物。術語 標記物包括提供於套組上或與套組一起提供或另外伴隨該 套組之任何書面或記錄材料。 提供以下實例以說明本發明而不限制本發明： 實例1 重組Fab呈現噬菌體1B20之分離 經由如下簡單描述之方法針對固定重組人類及鼠類 PCSK9淘選重組Morphosys HuCAL Gold Fab噬菌體呈現庫 (參見，例如Knappik等人，2000 J. Mol. Biol. 296:57- 86):根據製造商之說明書將PCSK9蛋白質以化學方式進 行生物素標記（Pierce，目錄號21455)。將M〇prh〇sys噬菌 體Fab呈現庫彙集並3次預吸收至經阻斷之抗生蛋白鏈菌素 塗佈之珠粒（Dynal珠粒M280)上。為達到分離交叉反應性 Fab之目的’如下交替使用人類⑻及小鼠（m)pcSK9 :第 1/2/3輪使用 h/m/h之PCSK9。 對於3輪淘選中之每一輪而言，將預吸收之噬菌體庫與 固定至經抗生蛋白鏈菌素塗佈之Dynai珠粒上的經預阻斷 之生物素標記之PCSK9(第一輪為150 nM且隨後兩輪為100 137315.doc -73- 200938631 nM)—起培育。將經固定之噬菌體-PCSK9複合物相繼用 PBS/0.05% TweenTM 20快速洗滌5次，隨後用PBS快速洗滌 4次，且在PBS中轉移至新的經阻斷之管中。接著用20 mM DTT溶離經結合之噬菌體。用所溶離之噬菌體感染TG1細 胞。使彙集之帶噬菌粒細胞（耐氣黴素）培養物生長且製備 冷凍的帶噬菌粒培養物儲備物。藉由用輔助噬菌體協同感 染自培養物中拯救噬菌體，且製備用於下一輪淘選之噬菌 體儲備物。 在第三輪淘選之後，使經噬菌粒感染之細胞生長隔夜且 製備噬菌粒DNA。 將來自第三輪噬菌粒DNA之Xbal-EcoRI插入物次選殖至 Morphosys Fab表現載體pMORPH_x9_MH中以產生質體 pMORPHx9_MH/PCSK9_6_CXl_B20(參見，例如圖 1)，且 在大腸桿菌TGI F中產生Fab表現純系庫。將轉型物展布 於LB +氣黴素+葡萄糖板上且生長隔夜以產生菌落。選取 個別轉形物菌落且將其置於兩個96孔板之孔中使其生長且 針對Fab表現進行篩檢。 實例2 細菌表現之FAB的ELISA篩檢 使個別轉型物之培養物用IPTG誘發且生長隔夜以達成 Fab表現。將培養物上清液（候選Fab)與固定於96孔Nunc Maxisorp板之孔中之經純化V5-、His-標記之PCSK9蛋白一 起培育，使用板洗滌器用於PBS中之0.1% Tween™ 20洗 滌，與HRP偶合抗Fab抗體一起培育且再次用PBS/Tween™ 137315.doc -74- 200938631 20洗濂。藉由添加TMP受質偵測經結合之HRP，且用板讀 取器Ί買取孔之A450值。 包括如下陰性對照： 將每一板上用於非特異性Fab結合之對照與平行表現之 抗-EsB(—種不相關Fab)製劑一起培育。 僅生長培養基。 包括如下用於ELISA及Fab表現之陽性對照： 使EsB抗原結合至板之3個孔且隨後與抗-EsB Fab —起培 育。 為對照與重組PCSK9抗原之V5或His標記反應之Fab，使 用在與原始PCSK9抗原相同之細胞中表現且經類似純化之 V5-、His-標記之分泌型鹼性磷酸酶蛋白（SEAP)進行平行 ELISA。假定PCSK9反應性Fab係鑑別為當與？08〖9抗原一 起培育時產生大於3倍背景值，但當與SEAP—起培育時為 陰性。將在第一輪篩檢中記為PCSK9反應性之純系固定於 單一板上，再生長（一式三份），用IPTG再誘發且對比 PCSK9及SEAP以平行ELISA再檢定。如上所述包括陽性及 陰性對照。使3個複本中至少2個記為陽性之純系進行後續 表徵。在已知或疑似混合初級純系之情況下，藉由於 2xYT板上用氣黴素針對單一菌落劃線來將培養物再純 化，且再次藉由ELISA如上所述一式三份檢定來自3個或3 個以上獨立菌落之液體培養物。 實例3 PCSK9 ELISA-陽性FAB純系之DNA序歹ij測定 137315.doc -75- 200938631 藉由用來自陽性Fab之母甘油儲備物之氣黴素接種1.2 ml 2xYT液體培養基且生長隔夜來製備用於DNA製備之細菌 培養物。使用於BioRobot 9600上進行之Qiagen Turbo小規 模製備自隔夜培養物離心所得之細胞離心塊製備DNA。用 Morphosys明確定序引子對DNA進行ABI染料終止子循環測 序，且在ABI 3 100遺傳分析器上運作以獲得Fab純系之 DNA序列。將DNA序列相互比較以確定獨特純系序列及確 定F ab純系之輕鏈及重鏈亞型。 實例4 來自獨特PCSK9 ELISA-陽性純系之FAB的表現及純化 藉由IPTG誘導在大腸桿菌TG1F細胞中表現來自ELISA 陽性純系1B20之Fab及EsB(陰性對照）Fab。將培養物溶解 且藉由固定金屬離子親和層析（IMAC)純化His標記之Fab， 且藉由離心滲濾使蛋白質交換至25 mM HEPES pH 7.3/150 mM NaCl中.。將蛋白質藉由於Caliper Lab-Chip 90上電泳 且藉由習知SDS-PAGE來分析且藉由布萊德福蛋白質檢定 (Bradford protein assay)量化。使經純化Fab蛋白以連續稀 釋藉由ELISA再檢定以確定經純化Fab之活性。如前所述 運作陽性及陰性對照。接著如下所述分析經純化之Fab製 劑。 實例5 1B20 FAB至全長IgG之轉化 使用前置引子5'-

ACAGATGCCAGATGCGATATCGTGATGACCCAGA-3'(SEQ 137315.doc •76- 200938631 ID NO: 31)及反置引子5'- TGCAGCCACCGTACGTTTAATTTCAACTTTCGTACC-3, (SEQ ID NO: 32)藉由聚合酶鏈式反應自質體模板 pMORPHx9_MH/PCSK9_6_CXl_B20擴增編碼 1B20輕鏈κ可 變區之DNA序列。使用InFusion選殖系統（Clontech)將此擴 增之產物選殖至先前已用FspI及Bmtl消化之質體pVlJNSA-GS-FB-LCK中。藉由跨可變區之DNA測序驗證所得質體。 使用Qiagen無内毒素質體大規模製備套組進行無内毒素質 體製備。 使用前置引子5'· ACAGGTGTCCACTCGCAGGTGCAATTGGTTCAGAGC-3' (SEQ ID NO: 3 3)及反置引子5·- GCCCTTGGTGGATGCTGAGCTAACCGTCACCAGGGT-3' (SEQ ID NO: 34)藉由聚合酶鏈式反應擴增編碼 pMORPHx9_MH/PCSK9_6_CXl_B20之重 γ鏈可變區之 DNA 序列，且將擴增產物選殖至先前已用FspI及Bmtl消化之質 體pVlJNSA-BF-HCG2M4中。藉由跨可變區之DNA測序驗 證所得質體。使用Qiagen無内毒素質體大規模製備套組進 行無内毒素質體製備。 藉由用編碼1B20輕鏈之質體及編碼1B20重鏈之質體共 同轉染HEK293細胞來獲得全長IgG，之後對所表現之IgG 進行蛋白質A純化。 實例6 用表面電槳共振（「SPR」）對FAB:PCSK9相互作用作動力 137315.doc •77· 200938631 學評估 使用 BiacoreTM(Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Sweden)2000系統進行SPR量測。用於固定之感應器晶片 CM5及胺偶合套組係來自Biacore™。 使用固定嚮導在「對準固定」選項下使用Biacore™胺偶 合套組（目錄號BR-1000-50)將抗-Fab IgG(人類特異 性）（Sigma，目錄號15260)經由第一胺基共價偶合至感應器 晶片CM5之表面1及2。指定5000 RU之目標固定。該嚮導 使用經100 mM NHS(N-羥基琥珀醯亞胺）與400 mM EDC(1-乙基-3-(3-二甲基胺基丙基）-碳化二醯亞胺）之1:1混合物之 7分鐘活化，以若干脈衝注入配體以達成所要含量，接著 用乙醇胺之7分鐘脈衝使其餘表面失活。 將抗PCSK9 Fab捕捉於捕捉表面2上，且將表面1用作 Fab:PCSK9相互作用之動力學研究之參照。藉由使500 ng/ml溶液以5 μΐ/min或10 μΐ/min流動1 -1.5分鐘以達到目標 1來捕捉各？313，該反應之尺11^為100-150 10；。使5-10個濃 度之 hPCSK9v5His 或 mPCSK9v5His 抗原以 30 μΐ/min 流經表 面歷時3-4分鐘。在用10 mM甘胺酸（pH 2.0)之30秒脈衝再 生抗-Fab表面之前留有15-60分鐘解離時間。 使用BiaEvaluation軟體評估來自用各Fab分析之多個濃 度之PCSK9抗原的感應譜，以便估算Fab:PCSK9相互作用 之動力學常數。 動力學常數確定如下： 137315.doc •78- 200938631 表2 1B20 Fab hPCSK9v5His mI>CSK9v5liis ka(l/Ms) 6.6E+04 士 6.1E+03 1·41Ε+05± 1.2E+04 kd(l/s) 4.8E-05 ± 7.4E-06 7.2E-05 ± 2.9E-06 Ka(1/M) 1·5Ε+09±3·0Ε+08 2.0E+09 ± 1.5E+08 Kd(M) 7.4E-10± 1.6E-10 5.1E-10±3.8E-11 實例7 用表面電漿共振（「SPR」）對IgG:PCSK9相互作用作動力學 m 評估 使用 BiacoreTM(Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Sweden)2000系統進行SPR量測。用於固定之感應器晶片 CM5及胺偶合套組係來自BiacoreTM。 使用固定嚮導在「對準固定」選項下使用Biacore™胺偶 合套組（目錄號BR-1 000-50)將山羊抗-人類18〇((^1仏§，目 錄號H10700)經由第一胺基共價偶合至感應器晶片CM5之 表面1及2。指定5000 RU之目標固定。該嚮導使用經1〇〇 ❹ mM NHS(N-羥基琥ίό醯亞胺）與4〇〇 mM EDC(1-乙基-3-(3-二甲基胺基丙基）·碳化二酿亞胺）之1:1混合物之7分鐘活 • 化，以若干脈衝注入配體以達成所要含量，接著用乙醇胺 之7分鐘脈衝使其餘表面失活。 將抗PCSK9 IgG捕捉於捕捉表面2上，且將表面1用作 IgG:PCSK9相互作用之動力學研究之參照。藉由使10 nM 溶液以10 μΐ/min流動1-1.5分鐘以達到目標rl來捕捉IgG， 該反應之Rmax為100-150 RU。使5-10個濃度之hPCSK9v5His -79- 1373l5.doc 200938631 或mPCSK9v5His抗原以30或60 μΐ/min流經表面歷時4分 鐘。在用10 mM甘胺酸（pH 1.7)之6〇秒脈衝再生抗-IgG表 面之前留有15-60分鐘解離時間。 使用BiaEvaluation軟體評估來自用各IgG分析之多個濃 度之PCSK9抗原的感應譜，以便估算IgG:PCSK9相互作用 之動力學常數。 動力學常數確定如下： 表3 lB20IgG hPCSK9v5His mPCSK9v5His ka(l/Ms) 5.3E+04 ± 6.8E+03 8.9E+04 ± 3.2E+03 kd(l/s) 4.3E-05 ± 4.5E-06 1.2E-04±6.4E-06 Ka(1/M) 1.4E+09±2.8E+08 7.4E+08 ± 4.2E+07 Kd(M) 8.9E-10± 1.6E-10 1.4E-09±8.2E-11 實例8 1B20之PCSK9-LDLR TR-FRET檢定 此檢定為 Fisher 等人，2007 ·/.价〇/· C/2ew. 282:20502-20512中所述檢定之變化形式。使用96孔黑色〇71^16(：1111 型底板將AlexaFluor647標記之PCSK9(最終濃度10 nM)與 變化量之1B20組合且向此組合物中添加Eu(8044)標記之 LDLR胞外結構域以達到於10 mM HEPES(pH 7.4)、150 mM Naa、0.1 mM CaCl2、0.05%(w/v)BSA中約 4 nM之最 終濃度（總體積為50 pL)(足以在Rubystar上在Fl62〇 nM下得 到約20,000個計數）。在平衡至少90分鐘之後，在Rubystar 讀取器（BMG Corp)中使用每孔20次閃爍、50 usee整合延 137315.doc -80· 200938631 遲及200 usee總整合時間讀取樣品。數據表示為 (F1665/F162〇x10000)之比率且使用標準4參數擬合自S形劑量 反應曲線之拐點確定1B20之IC50。 圖2說明1B20在PCSK9-LDLR相互作用TR-FRET檢定中 之活性。1B20之Fab與IgG均有效且完全抑制PCSK9-LDLR 相互作用。 實例9 EXOPOLAR檢定：外源性PCSK9對細胞LDL吸收之作用 在第1日，將30,000個HEK細胞/孔平板接種於96孔經聚 D離胺酸塗佈之板中。在第2日，將培養基換為不含血清之 DMEM培養基。在第3日，移除培養基且將細胞用 OptiMEM洗滌。添加於100 μΐ含LPDS及dl-LDL之DMEM培 養基中的經純化之PCSK9。將板在37°C下培育6.5小時。將 細胞於含2 mg/ml BSA之TBS中快速洗滌；接著於TBS-BSA中洗滌2分鐘；且接著用TBS洗滌兩次（但快速）^將細 胞於100 μΐ RIPA緩衝劑中溶解。接著使用Ex 520、Em 580 nm量測板中之螢光性。使用BCA蛋白質檢定量測每一孔中 之總細胞蛋白質且接著將螢光單位針對總蛋白質正規化。 該Exopolar檢定有效表徵對LDL吸收之不同作用；參見 下表4，表4說明在Exopolar檢定中PCSK9突變體之效能與 血漿LDL-膽固醇之關係。 137315.doc -81 - 200938631 表4 x.'*' ' 、、 > iy 寒變 \ ,s ' W、 .... . 增加/減少 XDL-C〇mg/dI) , EC-50 (nM) Exopolar S127R 增加 277 14 D374Y 增加 388 1.3 野生型 140 51 R46L 減少 116 78 結果：lB20(Fab與IgG)劑量依賴性抑制人類PCSK9與鼠 類PCSK9兩者對LDL吸收之作用；該劑量依賴性作用可重 複觀察到。添加至細胞中之PCSK9的量為約60-320 nM。 lB20(Fab)包含 SEQ ID NO: 1 之輕鏈（包含 SEQ ID NO: 27 之VL)及包括連接子及標記在内之SEQ ID NO: 9之Fd鏈（包 含 SEQ ID NO: 11 之 VH)。 lB20(IgG)包含SEQ ID NO: 26之輕鏈，及包含冗。id NO: 25之重鏈。 圖3A-圖3D說明⑴iB20(Fab)對鼠類PCSK9依賴性細胞 LDL-吸收損失的劑量依賴性抑制作用（圖3A); (ii)lB20(Fab)對人類PCSK9依賴性細胞LDl_吸收損失的劑 量依賴佳抑制作用（圖3B) ; (111)1820^0)對鼠類PCSK9依 賴性細胞LDL、吸收損失的劑量依賴性抑制作用（圖3c);及 (iv) 1 B20(IgG)對人類pscK9依賴性細胞LDl•吸收損失的劑 量依賴性抑制作用（圖3D)。 1B20明確與人類PCSK9與小鼠PCSK9兩者交叉反應。圖 3A-圖3D具有兩個對照：⑴單獨細胞對照其展示細胞 LDL吸收之基礎程度，及（ii)pcSK9(5 μ§/如）對照其展示 PCSK9依賴|·生ldl吸收損失的程度。含有lB2〇及pcsK9之 137315.doc • 82· 200938631 滴定實驗係在圖中所示之固定PCSK9濃度（5 pg/ml)及遞增 1B20濃度下進行。 1B20可抑制PCSK9對細胞LDL吸收之作用。lB20(Fab) 對於小鼠及人類PCSK9蛋白之IC5〇分別為152 nM(n=5)及 145 nM(n=5)。1 B20(IgG)對於小鼠及人類PCSK9蛋白之 IC5〇分別為 13 nM及 22 nM。 實例10 PCSK9細胞吸收 以下檢定係根據Fisher等人，2007丄5ζ·ο/· C/jem. 282 : 20502-12之方法進行。 如下將用Alexa Fluor 647標記之PCSK9處理之細胞成 像。將CHO細胞以20,000個細胞/孔之密度平板接種於經聚 D離胺酸塗佈之96孔光學CVG無菌黑色板（Nunc)上。將細 胞平板接種於F-12K培養基中（營養混合物，Kaighn氏改良 (1 x))(Invitrogen)，該培養基含有100個單位之青黴素及100 pg/ml硫酸鏈黴素且補充有10% FBS。將板在37°C及5% C02下培育隔夜。次日早晨，將培養基移除且用100 μΐ含 有100個單位青黴素及100 pg/ml硫酸鏈黴素之F-12K培養 基置換。18 h之後，移除培養基。如「實驗程序」下所述 將經純化之PCSK9蛋白用Alexa Fluor 647標記。將Alexa Fluor 647 標記之 PCSK9(1、5或 20 pg/ml)於 50 μΐ 含有 10% 脂蛋白缺乏血清之F-12K培養基中添加至細胞中。將該等 板在37°C下培育4 h，且將細胞用Tris-緩衝生理食鹽水快速 洗滌，隨後成像。將Hoechst 33342以0.1 pg/ml之最終濃度 137315.doc -83- 200938631 添加至每一孔中以標記細胞核。將板於具有40倍水浸物鏡 之 Opera 成像儀（Evotec Technologies GmbH, Hamburg, Germany)上運作。對於螢光核使用405 nm之激發波長且對 於Alexa Fluor 647-標記之PCSK9使用635 nm之激發波長來 捕捉影像。對於每一孔而言，針對兩個發射波長捕捉11個 含有大於500個細胞之個別視場。使用以Acapella語言編寫 之定製演算法（Evotec Technologies GmbH)分析資料。該演 算法鑑別且標記個別細胞之核及細胞質區域，隨後量測細 胞之總細胞質強度。該強度用任意螢光單位表示。 為測試1B20 Ab，使用相同程序及HEK293細胞。 結果：圖4說明lB20(IgG)對PCSK9内在化的抑制作用。 實例11 活體内檢定 在小鼠中活體内測試人類1B20之完整IgG，且監測LDL 膽固醇含量之改變。此等研究中所用之小鼠為（B6xB6-Tg(C五7T) U/riw/)Fl小鼠，其對於人類CETP(小鼠缺乏）之 轉殖基因（Tg)表現以及LDL受體（iw/)之分裂為半合的。此 等小鼠因其類似於人類之脂質概況及富LDL性質而尤其適 用。 對每隻小鼠取血兩次，一次在研究開始時以破定個別 LDL膽固醇基礎含量（「前」）且第二次在3小時之後 (「後」）以評定處理後LDL含量發生何種改變。在3小時之 過程中每隻小鼠接受杜比可氏PBS(Dulbecco，s PBS)(作為 媒劑對照）、1B20 IgG(0.5 mg)或 1B20 Fab 片段（0.5 mg)之 137315.doc -84 - 200938631 兩次IV劑量。將1B20完整IgG在即將注射之前在230,000 χ g下離心以便移除凝集物。 在圖5中，每隻小鼠之LDL含量係由一組連接符號表示 且LDL之變化（取血後-取血前）顯示為每一處理組之平均值 (△mg/dL)。用PBS處理對LDL量測無影響（-4 mg/dL，降低 5%)。相比之下，用1B20完整IgG處理使血清LDL降低 20%(-19 mg/dL)。 實例12 1B20恆河猴PK/PD研究 為表徵1B20之藥物動力學、藥效學及目標接合，在雄性 怪河猴中分別以1、3及1 0 mg/kg(3.8-9.61^，每組n=3)進行 單次IV劑量研究。此研究中所用之所有恆河猴均未用過生 物製劑。 經由頭靜脈或隱靜脈對猴子給予1B20之單次IV劑量。在 給藥後的指定時間點自隱靜脈/股動脈血管收集血樣，且 將所得血漿/血清在進行分析之前儲存於-70°C下。 於100 mM組胺酸、100 mM精胺酸、6%蔗糖（pH 6.0)中 以 10 mg/mL(對於1 mg/kg劑量而言）或 37.1 mg/mL(3 mg/kg 劑量及10 mg/kg劑量）製備1B20之給藥溶液。將給藥溶液 儲存於4°C下且在給藥期間保持於濕冰上。 如下所述進行血清樣品之脂蛋白分析。使用市售試劑進 行抗人類IgG ELISA以量化1B20含量。 如圖7所示，1B20在所有3個測試劑量下皆使LDL-C降低 25 0%，且歷時>8日觀察到之25%之LDL-C降低。1B20之 137315.doc -85 - 200938631 ti/2(圖8)為39小時。 實例13 1B20恆河猴PK/PD研究之血漿/血清樣品的脂蛋白分析 為產生脂蛋白概況，將金漿或血清藉由於Superose-6尺 寸排除管柱（GE LifeSciences, Inc)上層析而分餾。用市售 酶比色膽固醇偵測試劑（Total Cholesterol E, Wako USA)經 由管線内混合物連續量測管柱流出物中之總膽固醇含量， 隨後在600 nm吸光度下進行反應產物之下游分光光度偵 測。自管柱溶離之膽固醇的第一個峰係歸屬為VLDL，第 二個峰係歸屬為LDL且第三個峰係歸屬為HDL ;使用 HPLC提供之軟體計算各峰下之面積。為計算各脂蛋白溶 離份之膽固醇濃度，將相應峰面積與總峰面積之比率乘以 樣品中所量測之總膽固醇濃度。 【圖式簡單說明】 圖1說明Fab表現載體pMORPH_x9_MH。 圖2說明1B20在PCSK9-LDLR相互作用TR-FRET檢定中 之活性。1B20之Fab與IgG均有效且完全抑制該相互作用。 對於該實驗而言，[AF647-PCSK9] = 10 nM，[Eu-sLDLR]為 約4 nM(在FI62〇nm下約20000個計數）。 圖3A-圖3D說明（i)lB20(Fab)對鼠類PCSK9依賴性細胞 LDL-吸收損失的劑量依賴性抑制作用（圖3A); (ii)lB20(Fab)對人類PCSK9依賴性細胞LDL-吸收損失的劑 量依賴性抑制作用（圖3B) ; (iii)lB20(IgG)斜鼠類pcsK9依 賴性細胞LDL-吸收損失的劑量依賴性抑制作用（圖3C);及 137315.doc -86- 200938631 (1V)1B2Q(IgG)對人類PSCK9依賴性細胞LDL-吸收損失的劑 量依賴性抑制作用（圖3D)。1B20明確與人類PCSK9與小鼠 PCSK9兩者交又反應。圖3A-圖3D具有兩個對照：⑴單獨 細胞對照’展示細胞LDL吸收之基礎程度，及（ii)PCSK9(5 pg/ml)對照，其展示pcsK9依賴性LDL吸收損失的程度。 含有1B20及PCSK9之滴定實驗係在圖中所示之固定PCSK9 濃度（5 及遞增1B20濃度下進行。如所示，1B20可抑 制PCSK9對細胞ldL吸收之作用。lB20(Fab)對小鼠及人類 PCSK9 蛋白之 IC50 分別為 152 nM(n=5)及 145 nM(n=5)。 lB20(IgG)對小鼠及人類PCSK9蛋白之IC50分別為13 nM及 22 nM 〇 圖4說明iB20(IgG)對PCSK9内在化的抑制作用。將 HEK293細胞平板接種且接著將AlexaFluor標記之PCSK9及 LDL添加至細胞中且在37°C下培育4小時。培育之後，使 用共焦顯微術測定經細胞内在化之PCSK9或LDL的量。對 照包括除添加50X(250 pg/ml)未標記PCSK9(50X冷野生型 (Cold Wt))外亦添加單獨細胞（未處理）及單獨AF標記之 PCSK9。除添加5 pg/ml野生型AF標記之PCSK9及10 pg/ml AF標記之LDL外，亦添加遞增量之1B20 IgG，從而引起隨 後對PCSK9内在化至細胞中之抑制。此等研究共同表明 lB20IgG阻止PCSK9内在化至細胞中。 圖5說明由一組連接符號表示之每隻小鼠之LDL含量； LDL之變化（取血後-取血前）顯示為每一處理組之平均值 (△mg/dL)。用PBS處理對LDL量測無影響（-4 mg/dL，降低 137315.doc •87· 200938631 5%)。相比之下，用1B20完整IgG處理使血清LDL降低 20%(-19 mg/dL)。 圖6說明以下同型之恆定結構域之序列比較：IgG 1(SEQ ID NO: 21 ;其Fc結構域由SEQ ID NO: 21之殘基110-130表 示）、IgG2(SEQ ID NO: 22，其 Fc結構域由 SEQ ID NO: 22 之殘基107-326表示）、IgG4(SEQ ID NO: 23 ;其Fc結構域 由 SEQ ID NO: 23 之殘基 107-327 表示）及 IgG2m4(SEQ ID NO: 24;其Fc結構域由SEQ ID NO: 24之殘基107-326表 示）。 圖7說明在恆河猴中在1、3及10 mpk下1B20使LDL-C降 低約50%。所繪製曲線為在抗體治療之單次IV劑量之後， 在不同測試時間點的血清中之LDL變化百分比。 圖8說明1B20在所示劑量水準下之藥物動力學概況。所 繪製曲線為在抗體之單次IV劑量之後，測試時間點的血清 藥物（1B20)含量。1B20之半衰期為39小時。 137315.doc 88- 200938631 序列表 <11〇>美國默克大藥廠 <120> 1B20PCSK9 拮抗劑 <130> MRL-ACV-22541 <140> 098103554 <141> 2009-02-04 <150> 61/063,980 <151> 2008-02-07 <160> 36 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0

<210> 1 <211> 220 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LC; 1B20 <400> 1

Asp lie Val Met Thr Gin Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly IS 10 15

Glu Arg Ala Thr lie Asn Cys Arg Ser Ser Gin Ser Val Leu Tyr Ser 20 25 30

Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin 35 40 45

Pro Pro Lys Leu Leu lie Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60

Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 lie Ser Ser Leu Gin Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gin Gin 85 90 95

Tyr Ser Ser Phe Pro lie Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie 100 105 1X0

Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe lie Phe Pro Pro Ser Asp 115 120 125

Glu Gin Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn 130 135 140

Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu 145 150 155 160

Gin Ser Gly Asn Ser Gin Glu Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp 165 170 175

Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser I^ys Ala Asp Tyr 180 185 190

Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser 195 200 205

Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Ala 210 215 220 <210> 2 137315.doc 200938631 <211> 660 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223> LC; 1B20 <400> 2 gatatcgtga tgacccagag cccggatagc ctggcggtga gcctgggcga acgtgcgacc 60 attaactgca gaagcagcca gtctgttctt tattcttcta acaataagaa ttatctggct 120 tggtaccagc agaaaccagg tcagccgccg aaactattaa tttattgggc ttctactcgt 180 gaaagcgggg tcccggatcg ttttagcggc tctggatccg gcactgattt taccctgacc 240 atttcgtccc tgcaagctga agacgtggcg gtgtattatt gccagcagta ttcttctttt 300 cctattacct ttggccaggg tacgaaagtt gaaattaaac gtacggtggc tgctccgagc 360 gtgtttattt ttccgccgag cgatgaacaa ctgaaaagcg gcacggcgag cgtggtgtgc 420 ctgctgaaca acttttatcc gcgtgaagcg aaagttcagt ggaaagtaga caacgcgctg 480 caaagcggca acagccagga aagcgtgacc gaacaggata gcaaagatag cacctattct 540 ctgagcagca ccctgaccct gagcaaagcg gattatgaaa aacataaagt gtatgcgtgc 6〇〇 gaagtgaccc atcaaggtct gagcagcccg gtgactaaat cttttaatcg tggcgaggcc 660 <210> 3 <211> 17 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223> VL CDR1; 1B20 <400> 3

Arg Ser Ser Gin Ser Val Leu Tyr Ser Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu 15 10 15

Ala <210> 4 <211> 51 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223> VL CDR1; 1B20 <400> 4 agaagcagcc agtctgttct ttattcttct aacaataaga attatctggc t 51 <210> 5 <211> 11 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223> VL CDR2; 1B20 <400> 5

Leu Leu lie Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser 15 10 <210> 6 <211> 33 <212> DNA <213>人工序列 <220> 137315.doc -2- 200938631 <223> VL CDR2; 1B20 <400> 6 ctattaattt attgggcttc tactcgtgaa age <210> 7 <211> 8 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223> VL CDR3; 1B20 <400> 7

Gin Gin Tyr Ser Ser Phe Pro lie 1 5 <210> 8 <211> 24 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223> VL CDR3; 1B20 <400> 8 cagcagtatt cttcttttcc tatt <210> 9 <211> 243 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223> FD鏈；1B20 <400> 9

Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu IS 10 15

Ser Leu Lys lie Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asn Tyr 20 25 30

Trp He Ser Trp Val Arg Gin Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45

Gly lie lie Tyr Pro Gly Asp Ser Tyr Thr Asn Tyr Ser Pro Ser Phe 50 55 60

Gin Gly Gin Val Thr lie Ser Ala Asp Lys Ser lie Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80

Leu Gin Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Asp Tyr Trp Tyr Lys Pro Leu Phe Asp lie Trp Gly Gin Gly 100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe 115 120 125

Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu 130 135 140

Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp 145 150 155 160

Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu 165 170 175

Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser 180 185 190

Ser Ser Leu Gly Thr Gin Thr Tyr lie Cys Asn val Asn His Lys Pro 195 200 205

Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Glu Phe Glu 210 215 220 137315.doc 200938631

Gin Lys Leu lie Ser Glu Glu Asp Leu Asn Gly Ala Pro His His His 225 230 235 240 His His His <210> 10 <211> 729 <212> DNA <213>人工序歹ij <220> <223>FD 鏈；1B20 <400> 10 caggtgcaat tggttcagag cggcgcggaa gtgaaaaaac cgggcgaaag cctgaaaatt 60 agctgcaaag gttccggata ttcctttact aattattgga tttcttgggt gcgccagatg 120 cctgggaagg gtctcgagtg gatgggcatt atctatccgg gtgatagcta taccaattat 180 tctccgagct ttcagggcca ggtgaccatt agcgcggata aaagcattag caccgcgtat 240 cttcaatgga gcagcctgaa agcgagcgat acggccatgt attattgcgc gcgtgattat 300 tggtataagc ctctttttga tatttggggc caaggcaccc tggtgacggt tagctcagcg 360 tcgaccaaag gtccaagcgt gtttccgctg gctccgagca gcaaaagcac cagcggcggc 420 acggctgccc tgggctgcct ggttaaagat tatttcccgg aaccagtcac cgtgagctgg 480 aacagcgggg cgctgaccag cggcgtgcat acctttccgg cggtgctgca aagcagcggc 540 ctgtatagcc tgagcagcgt tgtgaccgtg ccgagcagca gcttaggcac tcagacctat 600 atttgcaacg tgaaccataa accgagcaac accaaagtgg ataaaaaagt ggaaccgaaa 660 agcgaattcg agcagaagct gatctctgag gaggatctga acggcgcgcc gcaccatcat 720 caccatcac 729 <210> 11 <211> 119 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223> VH; 1B20 <400> 11

Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 15 10 15

Ser Leu Lys lie Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asn Tyr 20 25 30

Trp lie Ser Trp Val Arg Gin Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45

Gly lie lie Tyr Pro Gly Asp Ser Tyr Thr Asn Tyr Ser Pro Ser Phe 50 55 60

Gin Gly Gin Val Thr lie Ser Ala Asp Lys Ser He Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80

Leu Gin Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Asp Tyr Trp Tyr Lys Pro Leu Phe Asp lie Trp Gly Gin Gly 100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 12 <211> 357 <212> DNA <213 >人工序列 <220> <223> VH; 1B20 <400> 12 caggtgcaat tggttcagag cggcgcggaa gtgaaaaaac cgggcgaaag cctgaaaatt 60 -4- 137315.doc 200938631 agctgcaaag cctgggaagg tctccgagct cttcaatgga tggtataagc gttccggata gtctcgagtg ttcagggcca gcagcctgaa ctctttttga ttcctttact aattattgga tttcttgggt gcgccagatg 120 gatgggcatt atctatccgg gtgatagcta taccaattat 180 ggtgaccatt agcgcggata aaagcattag caccgcgtat 240 agcgagcgat acggccatgt attattgcgc gcgtgattat 300 tatttggggc caaggcaccc tggtgacggt tagctca 357 <210> 13 <211> 10 <212> PRT <213〉人工序列 <220> <223> VH CDR1; 1B20 <400> 13

Gly Tyr Ser Phe Thr Asn Tyr Trp lie Ser 15 10 <210> 14 <211> 30 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223> VH CDR1; 1B20 <400> 14 ggatattcct ttactaatta ttggatttct 30 <210> 15 <211> 20 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223> VH CDR2? 1B20 <400> 15

Trp Met Gly lie lie Tyr Pro Gly Asp Ser Tyr Thr Asn Tyr Ser Pro 15 10 15

Ser Phe Gin Gly 20

<210> 16 <211> 60 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223> VH CDR2; 1B20 <4 00> 16 tggatgggca ttatctatcc gggtgatagc tataccaatt attctccgag ctttcagggc 60 <2X0> 17 <211> 10 <212> PRT <213;>人工序列 <220> <223> VH CDR3; 1B20 <400> 17 137315.doc 200938631

Asp Tyr Trp Tyr Lys Pro Leu Phe Asp lie 1 5 10 <210> 18 <211> 30 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223> VH CDR3; 1B20 <400> 18 gattattggt ataagcctct ttttgatatt <210> 19 <211> 6 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223〉内部加工位點 <400> 19

Ser Ser Val Phe Ala Gin 1 5

<210> 20 <211> 6 <212> PRT <213 >人工序歹，J <220> <223>内部加工位點 <400> 20

Ser lie Pro Trp Asn Leu 1 5 <210> 21 <211> 330 <212> PRT <213>人工序列 <220> c223>含有IGG1之FC結構域 <400> 21

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 15 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gin Thr 65 70 75 80

Tyr lie Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95

Lys Ala Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125 -6 137315.doc 200938631

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met lie Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175

Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190

His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 200 205

Lys Ala Leu Pro Ala Pro lie Glu Lys Thr lie Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220

Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu 225 230 235 240

Leu Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu val Lys Gly Phe Tyr 245 250 255

Pro Ser Asp lie Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn 260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn 290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320

Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 330 <210> 22 <211> 326 <212> PRT <213 >人工序列 <220> <223>含有IGG2之FC結搆域 <400> 22

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg 15 10 15

Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Thr Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gin Thr 65 70 75 80

Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95

Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 100 105 110

Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp 115 120 X25

Thr Leu Met lie Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp 130 135 140

Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gin Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly 145 150 155 160

Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Phe Asn 165 170 175

Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gin Asp Trp 180 185 190

Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro 195 200 205

Ala Pro lie Glu Lys Thr lie Ser Lys Thr Lys Gly Gin Pro Arg Glu 210 215 220

Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn 137315.doc 200938631 225 230 235 240

Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp lie 245 250 255

Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr 260 265 270

Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys 275 280 285

Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys 290 295 300

Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu 305 310 315 320

Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 <210> 23 <211> 327 <212> PRT <213>人工序歹 <220> <223 >含有IGG4之FC結構域 <400> 23

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg 15 10 15

Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr 65 70 75 80

Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95

Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro 100 105 110

Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 115 120 125

Asp Thr Leu Met lie Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 130 135 140

Asp Val Ser Gin Glu Asp Pro Glu Val Gin Phe Asn Trp Tyr Val Asp 145 150 X55 160

Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Phe 165 170 175

Asn Ser Thr Tyr Arg Val val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gin Asp 180 185 190

Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu 195 200 205

Pro Ser Ser lie Glu Lys Thr lie Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg 210 215 220

Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gin Glu Glu Met Thr Lys 225 230 235 240

Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 245 250 255 lie Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 260 265 270

Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 275 280 285

Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Glu Gly Asn Val Phe Ser 290 295 300

Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser 305 310 315 320

Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 325 137315.doc 200938631 <210> 24 <211> 326 <212> PRT <213>人工序歹 <220> <223>含有IGG2M4之FC結構域 <400> 24

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg 15 10 15

Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Thr Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gin Thr 65 70 75 80

Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95

Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 100 105 110 ❹

Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp 115 120 125

Thr Leu Met 工le Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp 130 135 140

Val Ser Gin Glu Asp Pro Glu Val Gin Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly 145 150 155 160

Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Phe Asn 165 170 175

Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gin Asp Trp 180 185 190

Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro 195 200 205

Ser Ser lie Glu Lys Thr lie Ser Lys Thr Lys Gly Gin Pro Arg Glu 210 215 220

Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn 225 230 235 240

Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp lie 245 250 255

Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr 260 265 270

Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys 275 280 285

Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys 290 295 300

Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu 305 310 315 320

Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 <210> 25 <211> 445 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223> lB20IgG2m4重鍵 <400> 25

Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 15 10 15 -9- 137315.doc 200938631

Ser Leu Lys lie Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asn Tyr 20 25 30

Trp lie Ser Trp Val Arg Gin Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45

Gly lie lie Tyr Pro Gly Asp Ser Tyr Thr Asn Tyr Ser Pro Ser Phe 50 55 60

Gin Gly Gin Val Thr lie Ser Ala Asp Lys Ser lie Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80

Leu Gin Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Asp Tyr Trp Tyr Lys Pro Leu Phe Asp lie Trp Gly Gin Gly 100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe 115 120 125

Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu 130 135 140

Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp 145 150 155 160

Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu 165 170 175

Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Thr Ser 180 185 190

Ser Asn Phe Gly Thr Gin Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro 195 200 205

Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu 210 215 220

Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu 225 230 235 240

Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met lie Ser Arg Thr Pro Glu 245 250 255

Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gin Glu Asp Pro Glu Val Gin 260 265 270

Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys 275 280 285

Pro Arg Glu Glu Gin Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu 290 295 300

Thr Val Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys 305 310 315 320

Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser lie Glu Lys Thr lie Ser Lys 325 330 335

Thr Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser 340 345 350

Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys 355 360 365

Gly Phe Tyr Pro Ser Asp lie Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin 370 375 380

Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly 385 390 395 400

Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin 405 410 415

Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn 420 425 430

His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 445 <210> 26 <211> 220 <212> PRT <213>人工序列 <220> < 2 2 3 > 1B20 IgG 輕鍵 <400> 26

Asp lie val Met Thr Gin Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly •10- 137315.doc 15 15

200938631 15 10

Glu Arg Ala Thr lie Asn Cys Arg Ser Ser Gin 20 25

Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin 35 40

Pro Pro Lys Leu Leu 工le Tyr Trp Ala Ser Thr 50 55

Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr 65 70 75 lie Ser Ser Leu Gin Ala Glu Asp Val Ala Val 85 90

Tyr Ser Ser Phe Pro lie Thr Phe Gly Gin Gly 100 105

Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe lie 115 120

Glu Gin Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val 130 135

Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gin Trp Lys 145 150 155

Gin Ser Gly Asn Ser Gin Glu Ser Val Thr Glu 165 170

Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu 180 185

Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr 195 200

Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu 210 215 <210> 27 <211> 114 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223> VL; 1B20 <400> 2Ί

Asp lie Val Met Thr Gin Ser Pro Asp Ser Leu 15 10

Glu Arg Ala Thr lie Asn Cys Arg Ser Ser Gin 20 25

Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin 35 40

Pro Pro Lys Leu Leu lie Tyr Trp Ala Ser Thr 50 55

Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr 65 70 75 lie Ser Ser Leu Gin Ala Glu Asp Val Ala Val 85 90

Tyr Ser Ser Phe Pro lie Thr Phe Gly Gin Gly 100 105

Lys Arg <210> 28 <211> 342 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223> VL; 1B20 <400> 28 gatatcgtga tgacccagag cccggatagc ctggcggtga 137315.doc -11 -

Ser Val Leu Tyr Ser 30 Gin Lys Pro Gly Gin 45 Arg Glu Ser Gly Val 60 Asp Phe Thr Leu Thr 80 Tyr Tyr Cys Gin Gin 95 Thr Lys Val Glu lie 110 Phe Pro Pro Ser Asp 125 Cys Leu Leu Asn Asn 140 Val Asp Asn Ala Leu 160 Gin Asp Ser Lys Asp 175 Ser Lys Ala Asp Tyr 190 His Gin Gly Leu Ser 205 Cys 220

Ala Val Ser Leu Gly 15 Ser Val Leu Tyr Ser 30 Gin Lys Pro Gly Gin 45 Arg Glu Ser Gly Val 60 Asp Phe Thr Leu Thr 80 Tyr Tyr Cys Gin Gin 95 Thr Lys Val Glu lie 110 gcctgggcga acgtgcgacc 200938631 attaactgca gaagcagcca gtctgttctt tattcttcta acaataagaa ttatctggct 120 tggtaccagc agaaaccagg tcagccgccg aaactattaa tttattgggc ttctactcgt 180 gaaagcgggg tcccggatcg ttttagcggc tctggatccg gcactgattt taccctgacc 240 atttcgtccc tgcaagctga agacgtggcg gtgtattatt gccagcagta ttcttctttt 300 cctattacct ttggccaggg tacgaaagtt gaaattaaac gt 342 <210> 29 <211> 1335 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223> lB20IgG2m4重鏈 <400> 29 caggtgcaat tggttcagag cggcgcggaa gtgaaaaaac cgggcgaaag cctgaaaatt 60 agctgcaaag gttccggata ttcctttact aattattgga tttcttgggt gcgccagatg 120 cctgggaagg gtctcgagtg gatgggcatt atctatccgg gtgatagcta taccaattat 180 tctccgagct ttcagggcca ggtgaccatt agcgcggata aaagcattag caccgcgtat 240 cttcaatgga gcagcctgaa agcgagcgat acggccatgt attattgcgc gcgtgattat 300 tggtataagc ctctttttga tatttggggc caaggcaccc tggtgacggt tagctcagca 360 tccaccaagg gcccatccgt cttccccctg gcgccctgct ccaggagcac ctccgagagc 420 acagccgccc tgggctgcct ggtcaaggac tacttccccg aaccggtgac ggtgtcgtgg 480 aactcaggcg ccctgaccag cggcgtgcac accttcccgg ctgtcctaca gtcctcagga 540 ctctactccc tcagcagcgt ggtgaccgtg acctccagca actttggcac gcagacctac 600 acctgcaacg tagatcacaa gcccagcaac accaaggtgg acaagacagt tgagcggaaa 660 tgctgcgtgg agtgcccacc atgcccagca cctccagtgg ccggaccatc agtcttcctg 720 ttccccccaa aacccaagga cactctcatg atctcccgga cccctgaggt cacgtgcgtg 780 gtggtggacg tgagccagga agaccccgag gtccagttca actggtacgt ggatggcgtg 840 gaggtgcata atgccaagac aaagccgcgg gaggagcagt tcaacagcac gttccgtgtg 900 gtcagcgtcc tcaccgtcct gcaccaggac tggctgaacg gcaaggagta caagtgcaag 960 gtctccaaca aaggcctccc gtcctccatc gagaaaacca tctccaaaac caaagggcag 1020 ccccgagagc cacaggtgta caccctgccc ccatcccggg aggagatgac caagaaccag 1080 gtcagcctga cctgcctggt caaaggcttc taccccagcg acatcgccgt ggagtgggag 1140 agcaatgggc agccggagaa caactacaag accacgcctc ccatgctgga ctccgacggc 1200 tccttcttcc tctacagcaa gctaaccgtg gacaagagca ggtggcagca ggggaatgtc 1260 ttctcatgct ccgtgatgca tgaggctctg cacaaccact acacacagaa gagcctctcc 1320 ctgtctcctg gtaaa 1335 <210> 30 <211> 660 <212> DNA <213>人工序歹I! <220> <22 3> lB20IgG輕鏈 <400> 30 gatatcgtga tgacccagag cccggatagc ctggcggtga gcctgggcga acgtgcgacc 60 attaactgca gaagcagcca gtctgttctt tattcttcta acaataagaa ttatctggct 120 tggtaccagc agaaaccagg tcagccgccg aaactattaa tttattgggc ttctactcgt 180 gaaagcgggg tcccggatcg ttttagcggc tctggatccg gcactgattt taccctgacc 240 atttcgtccc tgcaagctga agacgtggcg gtgtattatt gccagcagta ttcttctttt 300 cctattacct ttggccaggg tacgaaagtt gaaattaaac gtacggtggc tgcaccatct 360 gtcttcatct tcccgccatc tgatgagcag ttgaaatctg gaactgcctc tgttgtgtgc 420 ctgctgaata acttctatcc cagagaggcc aaagtacagt ggaaggtgga taacgccctc 480 caatcgggta actcccagga gagtgtcaca gagcaggaca gcaaggacag cacctacagc 540 ctcagcagca ccctgacgct gagcaaagca gactacgaga aacacaaagt ctacgcctgc 600 gaagtcaccc atcagggcct gagctcgccc gtcacaaaga gcttcaacag gggagagtgt 660 <210> 31 <211> 34 <212> DNA <213>人工序列 12- 137315.doc 200938631 <220> <223>引子 <400> 31 acagatgcca gatgcgatat cgtgatgacc caga 34 <210> 32 <211> 36 <212> DNA <213> <220> <223>引子 - <400> 32 tgcagccacc gtacgtttaa tttcaacttt cgtacc 36 . <210> 33 * <211> 36 <212> DNA <213>人工序列 <220> 0 <223>引子 <400> 33 acaggtgtcc actcgcaggt gcaattggtt cagagc 36 <210> 34 <211> 36 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>引子 <400> 34 gcccttggtg gatgctgagc taaccgtcac cagggt 36 <210> 35 <211> 8539 <212> DNA <213>人工序列 <220> ❿ < 2 2 3 > 1B20 IgG2m4 HC 質體 <400> 35 cgatagattg tcgcacctga ttgcccgaca ttatcgcgag cccatttata cccatataaa 60 tcagcatcca tgttggaatt taatcgcggc ctcgagcaag acgtttcccg ttgaatatgg 120 ctcataacac cccttgtatt actgtttatg taagcagaca gttttattgt tcatgatgat 180 atatttttat cttgtgcaat gtaacatcag agattttgag acacaacgtg gctttccccc 240 ， cccccccatt attgaagcat ttatcagggt tattgtctca tgagcggata catatttgaa 300 tgtatttaga aaaataaaca aataggggtt ccgcgcacat ttccccgaaa agtgccacct 360 gacgtctaag aaaccattat 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agccgccctg ggctgcctgg tcaaggacta cttccccgaa ccggtgacgg tgtcgtggaa 5100 ctcaggcgcc ctgaccagcg gcgtgcacac cttcccggct gtcctacagt cctcaggact 5160 ctactccctc agcagcgtgg tgaccgtgac ctccagcaac tttggcacgc agacctacac 5220 ctgcaacgta gatcacaagc ccagcaacac caaggtggac aagacagttg agcggaaatg 5280 ctgcgtggag tgcccaccat gcccagcacc tccagtggcc ggaccatcag tcttcctgtt 5340 ccccccaaaa cccaaggaca ctctcatgat ctcccggacc cctgaggtca cgtgcgtggt 5400 ggtggacgtg agccaggaag accccgaggt ccagttcaac tggtacgtgg atggcgtgga 5460 ggtgcataat gccaagacaa agccgcggga ggagcagttc aacagcacgt tccgtgtggt 5520 cagcgtcctc accgtcctgc accaggactg gctgaacggc aaggagtaca agtgcaaggt 5580 ctccaacaaa ggcctcccgt cctccatcga gaaaaccatc tccaaaacca aagggcagcc 5640 ccgagagcca caggtgtaca ccctgccccc atcccgggag gagatgacca agaaccaggt 5700 cagcctgacc tgcctggtca aaggcttcta ccccagcgac atcgccgtgg agtgggagag 5760 caatgggcag ccggagaaca actacaagac cacgcctccc atgctggact ccgacggctc 5820 cttcttcctc tacagcaagc taaccgtgga caagagcagg tggcagcagg ggaatgtctt 5880 ctcatgctcc gtgatgcatg aggctctgca caaccactac acacagaaga gcctctccct 5940 gtctcctggt aaatgagcgg ccgcgatctg ctgtgccttc tagttgccag ccatctgttg 6000 tttgcccctc ccccgtgcct tccttgaccc tggaaggtgc cactcccact gtcctttcct 6060 aataaaatga ggaaattgca tcgcattgtc tgagtaggtg tcattctatt ctggggggtg 6120 gggtggggca gcacagcaag ggggaggatt gggaagacaa tagcaggcat gctggggatg 6180 cggtgggctc tatggccgct gagatctggc cgctgcggcc aggtgctgaa gaattgaccc 6240 ggttcctcct gggccagaaa gaagcaggca catccccttc tctgtgacac accctgtcca 6300 cgcccctggt tcttagttcc agccccactc ataggacact catagctcag gagggctccg 6360 ccttcaatcc cacccgctaa agtacttgga gcggtctctc cctccctcat cagcccacca 6420 aaccaaacct agcctccaag agtgggaaga aattaaagca agataggcta ttaagtgcag 6480 agggagagaa aatgcctcca acatgtgagg aagtaatgag agaaatcata gaatttcttc 6540 cgcttcctcg ctcactgact cgctgcgctc ggtcgttcgg ctgcggcgag cggtatcagc 6600 tcactcaaag gcggtaatac ggttatccac agaatcaggg gataacgcag gaaagaacat 6660 gtgagcaaaa ggccagcaaa aggccaggaa ccgtaaaaag gccgcgttgc tggcgttttt 6720 ccataggctc cgcccccctg acgagcatca caaaaatcga cgctcaagtc agaggtggcg 6780 aaacccgaca ggactataaa gataccaggc gtttccccct ggaagctccc tcgtgcgctc 6840 tcctgttccg accctgccgc ttaccggata cctgtccgcc tttctccctt cgggaagcgt 6900 ggcgctttct caatgctcac gctgtaggta tctcagttcg gtgtaggtcg ttcgctccaa 6960 gctgggctgt gtgcacgaac cccccgttca gcccgaccgc tgcgccttat ccggtaacta 7020 tcgtcttgag tccaacccgg taagacacga cttatcgcca ctggcagcag ccactggtaa 7080 caggattagc agagcgaggt atgtaggcgg tgctacagag ttcttgaagt ggtggcctaa 7140 ctacggctac actagaagga cagtatttgg tatctgcgct ctgctgaagc cagttacctt 7200 cggaaaaaga gttggtagct cttgatccgg caaacaaacc accgctggta gcggtggttt 7260 ttttgtttgc aagcagcaga ttacgcgcag aaaaaaagga tctcaagaag atcctttgat 7320 cttttctacg gggtctgacg ctcagtggaa cgaaaactca cgttaaggga ttttggtcat 7380 gagattatca aaaaggatct tcacctagat ccttttaaat taaaaatgaa gttttaaatc 7440 aatctaaagt atatatgagt aaacttggtc tgacagttac caatgcttaa tcagtgaggc 7500 acctatctca gcgatctgtc tatttcgttc atccatagtt gcctgactcc gggggggggg 7560 ggcgctgagg tctgcctcgt gaagaaggtg ttgctgactc ataccaggcc tgaatcgccc 7620 catcatccag ccagaaagtg agggagccac ggttgatgag agctttgttg taggtggacc 7680 agttggtgat tttgaacttt tgctttgcca cggaacggtc tgcgttgtcg ggaagatgcg 7740

tgatctgatc agtcagcgta atcgagcatc aaaaagccgt atcctggtat ctcgtcaaaa gaatggcaaa gtcatcaaaa acgaaatacg caggaacact ctggaatgct gataaaatgc ctcatctgta atcgggcttc cttcaactca atgctctgcc aaatgaaact ttctgtaatg cggtctgcga ataaggttat agcttatgca tcactcgcat cgatcgctgt gccagcgcat gttttcccgg ttgatggtcg acatcattgg ccatacaat gcaaaagttc agtgttacaa gcaatttatt aaggagaaaa ttccgactcg caagtgagaa tttctttcca caaccaaacc taaaaggaca caacaatatt ggatcgcagt gaagaggcat caacgctacc gatttattca ccaattaacc catatcagga ctcaccgagg tccaacatca atcaccatga gacttgttca gttattcatt attacaaaca ttcacctgaa ggtgagtaac aaattccgtc tttgccatgt acaaagccgc aattctgatt ttatcaatac cagttccata atacaaccta gtgacgactg acaggccagc cgtgattgcg ggaatcgaat tcaggatatt catgcatcat agccagttta ttcagaaaca cgtcccgtca agaaaaactc catatttttg ggatggcaag ttaatttccc aatccggtga cattacgctc cctgagcgag gcaaccggcg cttctaatac caggagtacg gtctgaccat actctggcgc 7800 7860 7920 7980 8040 8100 8160 8220 8280 8340 8400 8460 8B20 8539 <210> 36 <211> 9505 <212> DNA <213>人工序列 137315.doc -15- 200938631 <220> <223> iB20IgGLC質體 cccatttata cccatataaa <400> 36 cgatagattg tcagcatcca ctcataacac atatttttat cccccccatt tgtatttaga gacgtctaag ccctttcgtc gagacggtca tcagcgggtg ctgagagtgc tggtacaact aggggttctc agtggctttc atgtgtaact cccaggaaga taagcggacc aacgggtagc tagcatatgt aaggaacagc attccacgag ggcagtgaac ataactgctg tgacgccccc aatataaccc atatctttaa tcacacgaat ttaagatgtg aacaagggga cccgaaaatt cttttttttg ttggactgta tcaaaccact gggcgggcca gcctgagcgc tgggctaatg ctaatctata ctaatctata ctaatctata ctaatctgta ctaatttata tctatatctg tctatatctg tttatatctg tctatatctg tgcatataca gccgccadct tttaaacatt gagaaaatac atgtacattt agttattaat gttacataac acgtcaataa tgggtggagt agtacgcccc atgaccttat atggtgatgc tttccaagtc gactttccaa cggtgggagg catccacgct tcgcacctga tgttggaatt cccttgtatt cttgtgcaat attgaagcat aaaataaaca aaaccattat tcgcgcgttt cagcttgtct ttggcgggtg accatatgct tgccaactgg tgactgtagt atcctggagc cttggctgaa ctacgggagg ctcaagaggg atatgcttcc tacccaacgg gatatctccc ggtagtgaac tctcctgaat agttgtgaac 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tcatatgcca tgcccagtac cgctattacc ctcacgggga aaatcaacgg taggcgtgta ctggagacgc ccgcggccgg 60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 900 960 1020 1080 1140 1200 1260 1320 1380 1440 1500 1560 1620 1680 1740 1800 1860 1920 1980 2040 2100 2160 2220 2280 2340 2400 2460 2520 2580 2640 2700 2760 2820 2880 2940 3000 3060 3120 3180 3240 3300 3360 3420 3480 3540 3600 3660 16- 137315.doc 200938631

gaacggtgca ttggaacgcg gattccccgt gccaagagtg acgtaagtac cgcctataga 3720 gtctataggc ccaccccctt ggcttcttat gcatgctata ctgtttttgg cttggggtct 3780 atacaccccc gcttcctcat gttataggtg atggtatagc ttagcctata ggtgtgggtt 3840 attgaccatt attgaccact cccctattgg tgacgatact ttccattact aatccataac 3900 atggctcttt gccacaactc tctttattgg ctatatgcca atacactgtc cttcagagac 3960 tgacacggac tctgtatttt tacaggatgg ggtctcattt attatttaca aattcacata 4020 tacaacacca ccgtccccag tgcccgcagt ttttattaaa cataacgtgg gatctccacg 4080 cgaatctcgg gtacgtgttc cggacatggg ctcttctccg gtagcggcgg agcttctaca 4140 tccgagccct gctcccatgc ctccagcgac tcatggtcgc tcggcagctc cttgctccta 4200 acagtggagg ccagacttag gcacagcacg atgcccacca ccaccagtgt gccgcacaag 4260 gccgtggcgg tagggtatgt gtctgaaaat gagcgtggag attgggctcg cacggctgac 4320 gcagatggaa gacttaaggc agcggcagaa gaagatgcag gcagctgagt tgttgtattc 4380 tgataagagt cagaggtaac tcccgttgcg gtgctgttaa cggtggaggg cagtgtagtc 4440 tgagcagtac tcgttgctgc cgcgcgcgcc accagacata atagctgaca gactaacaga 4500 ctgttccttt ccatgggtct tttctgcagt caccgtcctt gacacgaagc ttgccgccac 4560 catgagtgtg cccactcagg tcctggggtt gctgctgctg tggcttacag atgccagatg 4620 cgatatcgtg atgacccaga gcccggatag cctggcggtg agcctgggcg aacgtgcgac 4680 cattaactgc agaagcagcc agtctgttct ttattcttct aacaataaga attatctggc 4740 ttggtaccag cagaaaccag gtcagccgcc gaaactatta atttattggg cttctactcg 4800 tgaaagcggg gtcccggatc gttttagcgg ctctggatcc ggcactgatt ttaccctgac 4860 catttcgtcc ctgcaagctg aagacgtggc ggtgtattat tgccagcagt attcttcttt 4920 tcctattacc tttggccagg gtacgaaagt tgaaattaaa cgtacggtgg ctgcaccatc 4980 tgtcttcatc ttcccgccat ctgatgagca gttgaaatct ggaactgcct ctgttgtgtg 5040 cctgctgaat aacttctatc ccagagaggc caaagtacag tggaaggtgg ataacgccct 5100 ccaatcgggt aactcccagg agagtgtcac agagcaggac agcaaggaca gcacctacag 5160 cctcagcagc accctgacgc tgagcaaagc agactacgag aaacacaaag tctacgcctg 5220 cgaagtcacc catcagggcc tgagctcgcc cgtcacaaag· agcttcaaca ggggagagtg 5280 ttaggcggcc gcgatctgct gtgccttcta gttgccagcc atctgttgtt tgcccctccc 5340 ccgtgccttc cttgaccctg gaaggtgcca ctcccactgt cctttcctaa taaaatgagg 5400 aaattgcatc gcattgtctg agtaggtgtc attctattct ggggggtggg gtggggcagc 5460 acagcaaggg ggaggattgg gaagacaata gcaggcatgc tggggatgcg gtgggctcta 5520 tggccgctga gatctggccg ctgcggccct gtggaatgtg tgtcagttag ggtgtggaaa 5580 gtccccaggc tccccagcag gcagaagtat gcaaagcatg catctcaatt agtcagcaac 5640 caggtgtgga aagtccccag gctccccagc aggcagaagt atgcaaagca tgcatctcaa 5700 ttagtcagca accatagtcc cgcccctaac tccgcccatc ccgcccctaa ctccgcccag 5760 ttccgcccat tctccgcccc atggctgact aatttttttt atttatgcag aggccgaggc 5820 cgcctctgcc tctgagctat tccagaagta gtgaggaggc ttttttggag gcctaggctt 5880 ttgcaaaaag ctgtcgacca ccatggccac ctcagcaagt tcccacttga acaaaaacat 5940 caagcaaatg tacttgtgcc tgccccaggg tgagaaagtc caagccatgt atatctgggt 6000 tgatggtact ggagaaggac tgcgctgcaa aacccgcacc ctggactgtg agcccaagtg 6060 tgtagaagag ttacctgagt ggaattttga tggctctagt acctttcagt ctgagggctc 6120 caacagtgac atgtatctca gccctgttgc catgtttcgg gaccccttcc gcagagatcc 6180 caacaagctg gtgttctgtg aagttttcaa gtacaaccgg aagcccgcag agaccaattt 6240 aaggcactcg tgtaaacgga taatggacat ggtgagcaac cagcacccct ggtttggaat 6300 ggaacaggag tatactctga tgggaacaga tgggcaccct tttggttggc cttccaatgg 6360 ctttcctgga ccccaaggtc cgtattactg tggtgtgggc gcagacaaag cctatggcag 6420 ggacatcgtg gaggctcact accgcgcctg cttgtatgct ggggtcaaga ttacaggaac 6480 aaatgctgag gtcatgcctg cccagtggga gttccaaata ggaccctgtg aaggaatccg 6540 catgggagat catctctggg tggcccgttt catcttgcat cgagtatgtg aagactttgg 6600 ggtaatagca acctttgacc ccaagcccat tcctgggaac tggaatggtg caggctgcca 6660 taccaacttt agcaccaagg ccatgcggga ggagaatggt ctgaagcaca tcgaggaggc 6720 catcgagaaa ctaagcaagc ggcaccggta tcacattcga gcctacgatc ccaagggggg 6780 cctggacaat gcccgtggtc tgactgggtt ccacgaaacg tccaacatca acgacttttc 6840 tgctggtgtc gccaatcgca gtgccagcat ccgcattccc cggactgtcg gccaggagaa 6900 gaaaggttac tttgaagacc gccgcccctc tgccaattgt gacccctttg cagtgacaga 6960 agccatcgtc cgcacatgcc ttctcaatga gactggcgac gagcccttcc aatacaaaaa 7020 ctaagtcgac aacttgttta ttgcagctta taatggttac aaataaagca atagcatcac 7080 aaatttcaca aataaagcat ttttttcact gcattctagt tgtggtttgt ccaaactcat 7140 caatgtatct tatcatgtct ggatcggcgc gccggccgct gcggccaggt gctgaagaat 7200 tgacccggtt cctcctgggc cagaaagaag caggcacatc cccttctctg tgacacaccc 7260 tgtccacgcc cctggttctt agttccagcc ccactcatag gacactcata gctcaggagg 7320 gctccgcctt caatcccacc cgctaaagta cttggagcgg tctctccctc cctcatcagc 7380 ccaccaaacc aaacctagcc tccaagagtg ggaagaaatt aaagcaagat aggctattaa 7440 gtgcagaggg agagaaaatg cctccaacat gtgaggaagt aatgagagaa atcatagaat 7500 ttcttccgct tcctcgctca ctgactcgct gcgctcggtc gttcggctgc ggcgagcggt 7560 atcagctcac tcaaaggcgg taatacggtt atccacagaa tcaggggata acgcaggaaa 7620 -17· 137315.doc 200938631 gaacatgtga gcaaaaggcc agcaaaaggc caggaaccgt aaaaaggccg cgttgctggc 7680 gtttttccat aggctccgcc cccctgacga gcatcacaaa aatcgacgct caagtcagag 7740 gtggcgaaac ccgacaggac tataaagata ccaggcgttt ccccctggaa gctccctcgt 7800 gcgctctcct gttccgaccc tgccgcttac cggatacctg tccgcctttc tcccttcggg 7860 aagcgtggcg ctttctcaat gctcacgctg taggtatctc agttcggtgt aggtcgttcg 7920 ctccaagctg ggctgtgtgc acgaaccccc cgttcagccc gaccgctgcg ccttatccgg 7980 taactatcgt cttgagtcca acccggtaag acacgactta tcgccactgg cagcagccac 8040 tggtaaca9g attagcagag cgaggtatgt aggcggtgct acagagttct tgaagtggtg 8100 gcctaactac ggctacacta gaaggacagt atttggtatc tgcgctctgc tgaagccagt 8160 taccttcgga aaaagagttg gtagctcttg atccggcaaa caaaccaccg ctggtagcgg 8220 tggttttttt gtttgcaagc agcagattac gcgcagaaaa aaaggatctc aagaagatcc 8280 tttgatcttt tctacggggt ctgacgctca gtggaacgaa aactcacgtt aagggatttt 8340 ggtcatgaga ttatcaaaaa ggatcttcac ctagatcctt ttaaattaaa aatgaagttt 8400 taaatcaatc taaagtatat atgagtaaac ttggtctgac agttaccaat gcttaatcag 8460 tgaggcacct atctcagcga tctgtctatt tcgttcatcc atagttgcct gactccgggg 8520 ctgaggtctg cctcgtgaag aaggtgttgc tgactcatac caggcctgaa 8580 tcgccccatc atccagccag aaagtgaggg agccacggtt gatgagagct ttgttgtagg 8640 tggaccagtt ggtgattttg aacttttgct ttgccacgga acggtctgcg ttgtcgggaa 8700 gatgcgtgat ctgatccttc aactcagcaa aagttcgatt tattcaacaa agccgccgtc 8760 ccgtcaagtc agcgtaatgc tctgccagtg ttacaaccaa ttaaccaatt ctgattagaa 8820 aaactcatcg agcatcaaat gaaactgcaa tttattcata tcaggattat caataccata 8880 tttttgaaaa agccgtttct gtaatgaagg agaaaactca ccgaggcagt tccataggat 8940 ggcaagatcc tggtatcggt ctgcgattcc gactcgtcca acatcaatac aacctattaa 9000 tttcccctcg tcaaaaataa ggttatcaag tgagaaatca ccatgagtga cgactgaatc 9060 cggtgagaat ggcaaaagct tatgcatttc tttccagact tgttcaacag gccagccatt 9X20 acgctcgtca tcaaaatcac tcgcatcaac caaaccgtta ttcattcgtg attgcgcctg 9180 agcgagacga aatacgcgat cgctgttaaa aggacaatta caaacaggaa tcgaatgcaa 9240 ccggcgcagg aacactgcca gcgcatcaac aatattttca cctgaatcag gatattcttc 9300 taatacctgg aatgctgttt tcccggggat cgcagtggtg agtaaccatg catcatcagg 9360 agtacggata aaatgcttga tggtcggaag aggcataaat tccgtcagcc agtttagtct 9420 gaccatctca tctgtaacat cattggcaac gctacctttg ccatgtttca gaaacaactc 9480 tggcgcatcg ggcttcccat acaat 9505 18- 137315.doc

Claims (1)

1. 200938631 七、申請專利範圍： 1· 一種經分離PCSK9特異性拮抗劑，其包含： (a) 重鏈可變區，其包含含有SEQ ID NO: 17或其等效 物之CDR3結構域，該等效物之特徵為在該CDR3結構域 中具有一或多個保守性胺基酸取代；及/或 (b) 輕鏈可變區，其包含含有SEQ ID NO: 7或其等效物 • 之CDR3結構域，該等效物之特徵為在該CDR3結構域中 具有一或多個保守性胺基酸取代； © 其中該PCSK9特異性拮抗劑拮抗PCSK9對細胞LDL吸 收之抑制作用。 2. 3. 4.

   5. 6.

   8. 如請求項1之PCSK9特異性拮抗劑，其中該（等）CDR3結 構域係位於人類生殖系區中之CDR3區中。 如請求項1之PCSK9特異性拮抗劑，其以小於1200 nM之 平衡解離常數（KD)結合人類PCSK9。 如請求項1之PCSK9特異性拮抗劑，其以小於500 nM之 KD結合人類PCSK9。 如請求項1之PCSK9特異性拮抗劑，其以小於100 nM之 KD結合人類PCSK9。 如請求項1之PCSK9特異性拮抗劑，其以小於5 nM之KD 結合人類PCSK9。 如請求項1之PCSK9特異性结抗劑，其以小於500 nM之 IC50结抗PCSK9對細胞LDL吸收之抑制作用。 如請求項1之PCSK9特異性拮抗劑，其以小於200 nM之 IC50拮抗PCSK9對細胞LDL吸收之抑制作用。 137315.doc 200938631 9. 如請求項1之PCSK9特異性拮抗劑，其以小於100 nM之 IC50拮抗PCSK9對細胞LDL吸收之抑制作用。 10. 如請求項1之PCSK9特異性拮抗劑，其拮抗至少20%之 PCSK9對細胞吸收之抑制作用。 11. 如請求項1之PCSK9特異性拮抗劑，其為抗體分子。 12. 如請求項1之PCSK9特異性拮抗劑，其進一步包含： (a) 包含SEQIDNO: 13之重鏈可變CDR1序列； (b) 包含SEQIDNO: 15之重鏈可變CDR2序列； (c) 包含SEQ ID NO: 3之輕鏈可變CDR1序列；及/或 (d) 包含SEQ ID NO: 5之輕鏈可變CDR2序列。 13. 如請求項12之PCSK9特異性拮抗劑，其中該（等）CDR1、 CDR2及/或CDR3結構域係位於人類生殖系區之各別 CDR1、CDR2及 / 或 CDR3 區中。 14. 如請求項1之PCSK9特異性拮抗劑，其包含： (a) 包含有含SEQ ID NO: 17之CDR3結構域的重鏈可變 區， (b) 包含有含SEQ ID NO·· 7之CDR3結構域的輕鏈可變 區， (c) 包含SEQIDNO: 13之重鏈可變CDR1序列； (d) 包含SEQIDNO:3之輕鏈可變CDR1序列； (e) 包含SEQIDNO: 15之重鏈可變CDR2序列；及 (f) 包含SEQ ID NO: 5之輕鏈可變CDR2序列。 15. 如請求項14之PCSK9特異性拮抗劑，其中該（等）CDR1、 CDR2及/或CDR3結構域係位於人類生殖系可變區之各別 137315.doc 200938631 CDRl、CDR2及/或CDR3可變區中。 16. 如請求項12之PCSK9特異性拮抗劑，其包含含有SEQ ID NO: 11之重鏈可變區及/或含有SEQ ID NO: 27之輕鏈可 變區。 17. 如請求項12之PCSK9特異性拮抗劑，其包含具有含有 SEQ ID NO: 24之恆定序列之重鏈。 18. 如請求項16之PCSK9特異性拮抗劑，其包含具有含有 SEQ ID NO: 24之恆定序列之重鏈。 ® 19. —種PCSK9特異性拮抗劑，其包含： (a) 包含SEQ ID NO: 1之輕鏈；及 (b) 包含SEQ ID NO: 11之重鏈； 其中該PCSK9特異性拮抗劑為拮抗PCSK9對細胞LDL 吸收之抑制作用之抗體分子。 20. 如請求項19之PCSK9特異性拮抗劑，其中SEQ ID NO: 11 係依次繼之以選自由以下胺基酸序列組成之群的胺基酸 序列：SEQ ID NO: 21、SEQ ID NO: 22、SEQ ID NO: 23 及 SEQ ID NO: 24。 21. —種PCSK9特異性拮抗劑，其包含： (a) 包含SEQ ID NO: 26之輕鏈；及 (b) 包含SEQ ID NO: 25之重鏈； 其中該PCSK9特異性拮抗劑為拮抗PCSK9對細胞LDL 吸收之抑制作用之抗體分子。 22. —種組合物，其包含如請求項1-21中任一項之PCSK9特 異性拮抗劑及醫藥學上可接受之載劑。 137315.doc 200938631 23. —種鑑別、分離、量化或拮抗樣品中之PCSK9之方法， 其利用如請求項1-21中任一項之PCSK9特異性拮抗劑。 24. —種如請求項1-21中任一項之PCSK9特異性拮抗劑的用 途，其係用於製造改善由PCSK9功能引起及/或加劇之病 症、病況或疾病的藥劑。 25. —種經分離核酸，其編碼如請求項1-21中任一項之 PCSK9特異性拮抗劑。 26. —種經分離核酸，其編碼如請求項1之PCSK9特異性拮抗 劑；其中該重鏈可變區之CDR3結構域係由包含SEQ ID NO: 18之核苷酸序列所編碼；且/或其中該輕鏈可變區之 CDR3結構域係由包含SEQ ID NO: 8之核苷酸序列所編 碼。 27. 如請求項26之經分離核酸，其進一步包含： (a) 重鏈可變區中之CDR1及/或CDR2結構域，其分別係 由包含SEQ ID NO: 14及SEQ ID NO: 16之核苷酸序列所 編碼，及/或 (b) 輕鏈可變區中之CDR1及/或CDR2結構域，其分別 由包含SEQ ID NO: 4及SEQ ID NO: 6之核苷酸序列所編 碼0 28. —種經分離核酸，其編碼如請求項1之PCSK9特異性拮抗 劑；其中該PCSK9特異性拮抗劑包含： (a) 由包含SEQ ID NO: 12之核苷酸序列所編碼的重鏈 可變區；及/或 (b) 由包含SEQ ID NO: 28之核苷酸序列所編碼的輕鏈 137315.doc 200938631 可變區。 29. 30. ❹3i. 32. 33. 一種經分離核酸，其編碼如請求項1之PCSK9特異性拮抗 劑；其中該PCSK9特異性拮抗劑包含： (a) 由包含SEQ ID NO: 29之核苷酸序列所編碼之重鏈 區；及/或 (b) 由包含SEQ ID NO: 30之核苷酸序列所編碼的輕鏈 區。 一種載體，其包含如請求項25-29中任一項之核酸。 一種在活體外或原位經分離之宿主細胞或宿主細胞群 體，其包含如請求項25-29中任一項之核酸。 一種產生PCSK9特異性拮抗劑之方法，其包括： (a) 在適於產生該PCSK9特異性拮抗劑之條件下培養如 請求項3 1之細胞；及 (b) 分離所產生之PCSK9特異性拮抗劑。 一種在活體外或原位經分離之宿主細胞或宿主細胞群 體，其包含如請求項1之PCSK9特異性拮抗劑。 137315.doc