TW200842189A - DNA vaccine for Koi herpes virus (KHV) disease - Google Patents

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200842189 九、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於一種用以誘導針對感染錦鯉疱疹病毒（Koi herpesvirus，KHV)之魚類感染症之防禦性免疫的DNA疫 苗。 【先前技術】 錦鯉疱疹病毒病，其係因感染錦鯉疱疹病毒（KHV)而由 黑經魚或錦鯉所產生之疾病，該疾病若發病，則患病黑魚里 或錦經之行動變得遲緩，且不吃餌食，但顯著之外部症狀 少，可見鰓部退色或糜爛（潰爛）等，其發生於魚苗至成魚 前，且死亡率高。 上述錦鯉疱疹病毒病，於1998年5月於以色列首次報告 發病。其後，同樣於以色列，於當年秋季與次年春節發病 2次，包括出口用錦鯉在内，約6〇〇噸之錦鯉全部死亡。損 失總額超過400萬美元。其後，於世界各國（以色列、英 國、德國、荷蘭、比利時、美國、印度尼西亞、臺灣）亦 陸續傳出發病之報告。 佈’於2003年（平成15年）叫，農林水產省於 麵縣之霞浦對疑似患上錦㈣㈣毒疾病的軸進行了 ::，其後，於青森、山梨、三重、㈣山、宮崎及各地報 轉病毒疾病之發生。農林水產省正以確 途徑為開端，努力防止該病擴散。 木 關於細菌感染， 性疾病或寄生性疾 已開發有若干魚貝類用疫苗，但對病毒 病有效果之疫苗，除僅開發有針對鮭备 120536.doc 200842189 科魚類之一部分以及驢形目之彩虹病毒的疫苗（例如，參 照專利文獻1。）以外，幾乎未獲得開發。 預防或治療病毒感染症通常使用疫苗。疫苗有不活化产 苗（曰本腦炎、威爾氏疾病（Weil，s disease)等）、類毒素（破 傷風、白喉等）、減毒疫苗（卡介苗（bacille caimette_Guerin vaccine，BCG)、脊髓灰白質炎等）、基因重組疫苗（b型肝 炎病毒等）等。不活化疫苗以及使外毒素無毒化之類毒 素，其係誘導針對該等之抗體之較為安全的疫苗。基因重 組疫苗，若與不活化疫苗進行比較，則因不含有雜質，故 一般認為係更為安全的疫苗。又，目冑，被日本認可為水 產用疫苗者，僅為弧菌症不活化疫苗、…容血性鏈球菌症

V.， 不活化疫苗、彩虹病毒感染症不活化疫苗、β溶血性鏈球 菌不活化疫苗。 然而’該等疫苗可誘導產生抗體，但缺點為不易誘導細 胞性免疫。又，不活化疫苗以及減毒疫苗，必須於產業水 平大量獲得成為抗原之病毒，故必須確保適當之細胞。進 ，二由，毒疫苗而獲得之免疫效果，長期維持之情形較 方面亦指摘其副作用、危險性。不活化疫苗以 及基因重組疫苗，一般認為其於宿主内之抗原持續性較 短故而要佐劑。該等先前類型之疫苗於自製造至接種於 被檢測體㈣，必須冷藏保存，故存在產生成本增加以及 效果降低之問題。 免::性2二=開發取得進展，開發.出藉由投與編碼 質體DNA，而進行免疫誘發之新穎疫苗 120536.doc 200842189 種株（DNA疫苗），且改善了如下所述之先前類型之疫苗的 不利之處。即，DNA疫苗，不僅可誘導體液性免疫反應， 亦可強力誘導細胞性免疫，因此，存在如下優點：可賦予 針對感染症之防紫能力；又，可高度精製；於室溫或高溫 下亦穩定，無須冷藏保存且可長期貯藏；藉由基因工程方 法可容易地迅速改良DNA疫苗；以及疫苗開發所花費之時 間短縮等。 例如報σ有精由將編碼棒狀病毒（Rhabdovirus)構成蛋 白質之糖蛋白的基因注射至肌肉中，·而刺激虹鱒之免疫反 應（例如’參照非專利文獻1。），及報告有DnA疫苗（例 如，參照非專利文獻2。）。又，提出有：針對比目魚之病 毒性出血性敗血症的DNA疫苗（例如，參照專利文獻 2。）’或針對傳染性造血器壞死症（ΙίίΝ)病毒之編碼誘導 洞亡蛋白質之病毒的DNA疫苗（例如，參照專利文獻 3 ° )’或使用可誘導免疫原性多肽之表現的基因表現系之 養殖種株用DNA疫苗（例如，參照專利文獻4。）等。但， 未報告用以刺激針對錦鯉之錦鯉疱疹病毒病之防禦性免疫 的DNA疫苗。 專利文獻1:曰本專利特開平9-176043號公報 專利文獻2:曰本專利特開2005-112726號公報 專利文獻3:曰本專利特開2002-125674號公報 專利文獻4:曰本專利特開平、“^…號公報 非專利文獻 1 : P· Boudinot等人，Virology，（USA)，1998， 第249卷，第297-306頁 120536.doc 200842189 非專利文獻2 : McLauchlan

Immunology，England，2003，第 【發明内容】 等人，Fish and Shellfish B卷，第39-50頁 發明所欲解決之問題 本發明之課題在於提供—種用以誘導針對錦㈣療病毒 (KHV)疾病之防禦性免疫的錦鯉用dna疫苗。 解決問題之技術手段 本卷明者等人，為了開發對錦鯉疱疹病毒（KHV)疾病有 效之疫苗而努力研究，結果發現：確定日本、美國、以色 列、印度尼西亞之各錦鯉疱疹病毒（KHV)基因DNA之全部 鹼基序列，自約180種基因中，選擇編碼錦鯉疱疹病毒 (KHV)之糖蛋白之5種基因或編碼膜蛋白質之5種基因，將 甘欠入有忒專基因之質體dna接種至錦經體内（肌肉注射）之 後，對錦經之錦經疱疹病毒（KHV)有免疫效果，最終完成 本發明。 即本發明係關於：（1) 一種DNA，其係編碼以下（a)、（b) 或0)之蛋白質者，（a)包含序列編號2、4、6、8或10所示 之胺基酸序列的錦鯉疱疹病毒（KHV)之糖蛋白，（b)包含序 列編號2、4、6、8或10所示之胺基酸序列中1或數個胺基 酸缺失、被取代或被加成的胺基酸序列，且對錦鯉疱疹病 毒（KHV)具有免疫原性的蛋白質，或（c)包含與序列編號 2、4、0、8或10所示之胺基酸序列具有至少80%以上之同 源性之胺基酸序列，且對錦鯉疱疹病毒（KHV)具有免疫原 性的蛋白質；或（2)—種DNA，其包含序列編號1、3、5、 120536.doc 200842189 7或9所示之鹼基序列或其互補序列；或（3) 一種DNa，其 包含於序列編號1、3、5、7或9所示之鹼基序列中1或數個 鹼基缺失、被取代或被加成之鹼基序列，且編碼對錦鯉癌 疹病毒（KHV)具有免疫原性的蛋白質；或（4)一種DNA，其 於嚴格條件下與包含序列編號1、3、5、7或9所示之鹼基 序列之互補序列的DNA雜交，且編碼對錦缠疮瘡病毒 (KHV)具有免疫原性的蛋白質；或一種〇ΝΑ，其係編碼 以下（d)、（e)或⑴之蛋白質者，⑷包含序列編號12、14、 16、18或20所示之胺基酸序列之錦鯉疱疹病毒（KHV)的膜 蛋白質，（e)包含序列編號12、14、16、18或20所示之胺基 酉文序列中1或數個胺基酸缺失、被取代或被加成的胺基酸 序列，且對錦鯉疱疹病毒（KHV)具有免疫原性之蛋白質， 或⑴包含與序列編號12、14、16、18或20所示之胺基酸序 列具有至少80%以上之同源性的胺基酸序列，且對錦鯉疱 疹病毒（KHV)具有免疫原性的蛋白質。 又本發明係關於：（6) —種DNA，其包含序列編號11、 13、15、17或19所示之鹼基序列或其互補序列；或（7)—種 DNA，其包含序列編號u、π、15、17或19所示之鹼基序 列中1或數個驗基缺失、被取代或被加成的鹼基序列，且 編碼對錦鯉疱疹病毒（KHV)具有免疫原性的蛋白質；或（8) 一種DNA，其於嚴格條件下與包含序列編號u、π、15、 1 7或19所示之鹼基序列之互補序列的DNA雜交，且編碼對 錦鯉疱疹病毒（KHV)具有免疫原性的蛋白質；或（9)一種錦 鯉疱療病毒（KHV)之糖蛋白，其包含序列編號2、4、6、8 120536.doc -10- 200842189 或10所示之胺基酸序列；或（10)—種蛋白質，其包含序列 編號2、4、6、8或1 〇所不之胺基酸序列中1或數個胺基酸 缺失、被取代或被加成的胺基酸序列，且對錦經疮療病毒 (KHV)具有免疫原性；或（11)一種錦鯉疱疹病毒（KHV)之膜 蛋白質，其包含序列編號12、14、16、18或20所示之胺基 酸序列；或（12) —種蛋白質，其包含序列編號丨2、14、 1 6、1 8或20所示之胺基酸序列中1或數個胺基酸缺失、被 取代或被加成的胺基酸序列，且對錦鯉疱疹病毒（KHv)具 有免疫原性。 進而本發明係關於：（13) —種重組載體，其包含自如上 述（1)〜（8)中任一項之DNA之中所選擇的以上之dna ; 或（14) 一種錦經用DNA疫苗，其包含自如上述（1)〜(8)中任 一項之DNA之中所選擇的i個或2個以上2dNA;或（15) 一 種錦經用DN A疫苗，其包含如上述（丨3)之重組載體；或 (16)—種錦經疱疹病毒（KHV)病之預防或治療方法，其特 倣在於·對錦鯉投與如上述（14)或（15)之錦鯉用dna疫 苗，或（17) —種上述（14)或（15)之錦鯉用dna疫苗之使用方 法，其係使用如上述（14)或（15)之錦鯉sDNA疫苗誘發針 對錦鯉之錦鯉疱疹病毒（KHV)病的免疫反應，·或（18) 一種 抗體，其特徵在於··其可特異性識別如上述（9)〜（12)中任 項之蛋白質，或（19) 一種對錦鯉疱疹病毒（KHV)具有抵 抗性基因轉殖之錦鯉類，其特徵在於：其藉由如上述 (9)〜（12)中任一項之蛋白質之基因表現載體進行基因導入 而獲得。 120536.doc 200842189 【實施方式】 作為本發明之DNA，若為（a)編碼包含序列編號2、4、 6、8或10所示之胺基酸序列之錦鯉疱疹病毒（KHV)的糖蛋 白的DNA ; (b)編碼包含序列編號2、4、6、8或10所示之 胺基酸序列中1個或數個胺基酸缺失、被取代或被加成的 胺基酸序列且對錦鯉疮療病毒（KHV)具有免疫原性之蛋白 質的DNA ;或（c)編碼包含與序列編號2、4、6、8或10所示 之胺基酸序列具有至少80%以上之同源性的胺基酸序列且 對錦缠疱疹病毒（KHV)具有免疫原性之蛋白質的dna ;或 包含序列編號1、3、5、7或9所示之驗基序列或其互補序 列的DNA ;包含序列編號1、3、5、7或9所示之鹼基序列 中1個或數個鹼基缺失、被取代或被加成的鹼基序列，且 編碼對錦鯉疱疹病毒（KHV)具有免疫原性之蛋白質的 DNA ;或於嚴格條件下與包含序列編號1、3、5、7或9所 示之鹼基序列之互補序列的DNA雜交，且編碼對錦鯉疱疹 病毒（KHV)具有免疫原性之蛋白質的DNA ;或（d)編碼包含 序列編號12、14、16、18或20所示之胺基酸序列之錦鯉疱 疹病毒（KHV)的膜蛋白質的DNA ;或（e)編碼包含序列編號 12、14、16、18或20所示之胺基酸序列中1或數個胺基酸 缺失、被取代或被加成的胺基酸序列且對錦鯉疱疹病毒 (KHV)具有免疫原性之蛋白質的DNA ;或（f)編碼包含與序 列編號12、14、16、18或20所示之胺基酸序列具有至少 80°/。以上之同源性的胺基酸序列且對錦鯉疱疹病毒（KHV) 具有免疫原性之蛋白質的DNA ;或包含序列編號11、13、 120536.doc -12- 200842189 15、17或19所示之鹼基序列或其互補序列之DNA;或包含 序列編號11、13、15、17或19所示之鹼基序列中1個或數 個驗基缺失、被取代或被加成的驗基序列，且編碼對錦魚里 癌療病毒（KHV)具有免疫原性之蛋白質的DNA ;或於嚴格 條件下與包含序列編號11、13、15、17或19所示之鹼基序 列之互補序列之DNA雜交，且編碼對錦鯉疮療病毒（KHV) 具有免疫原性之蛋白質的DNA，則並無特別限定，又，作 為本發明之蛋白質’若為包含序列編號2、4、6、8或10所 " 示之胺基酸序列的錦鯉疱疹病毒（KHV)之糖蛋白；或包含 序列編號2、4、6、8或10所示之胺基酸序列中“固或數個 胺基酸缺失、被取代或被加成的胺基酸序列，且對錦缠疮 疹病毒（KHV)具有免疫原性之蛋白質；或包含序列編號 12、14、16、18或20所示之胺基酸序列的錦鯉疱疹病毒 (KHV)之膜蛋白質；或包含序列編號12、14、16、18或20 所示之胺基酸序列中丨個或數個胺基酸缺失、被取代或被 加成的胺基酸序列，且對錦鯉疱疹病毒（KHV)具有免疫原 性之蛋自質，則並無特別限定，於本發日月+，所謂對錦經 疱疹病毒（KHV)具有免疫原性之蛋白質，係指可於進入錦 ^生體内之情形時，於身體内刺激·誘導針對錦鯉疱疹病 毒（KHV)的免疫（包括體液性免疫以及細胞性免疫）反應的 蛋白質。 ~

上述所謂「i個或數個胺基酸缺失、被取代或被加成之 胺基酸序列」，意指例如卜汕個、較好的是丨〜^個、更好 的是卜1〇個、更好的是卜5個任意之數目的胺基㈣I 120536.doc •13- 200842189 被取代或被加成之胺基酸序列。又，上述所謂「1個或數 個鹼基缺失、被取代或被加成之鹼基序列」，意指例如 1〜20個、較好的是1〜15個、更好的是丨〜⑺個、更好的是 1〜5個任意之數目的鹼基缺失、被取代或被加成之鹼基序 列。 例如，該等包含1個或數個鹼基缺失、被取代或被加成 之鹼基序列的DNA(突變DNA)，可藉由化學合成、基因工 厂 程方法、誘發突變等業者已知之任意方法而製造。具體而 : 言，可對包含序列編號1、3、5、7或9所示之鹼基序列之 DNA，或包含序列編號u、13、15、17或19所示之鹼基序 列之DNA，使用與成為突變原之藥劑產生接觸作用的方 法、照射紫外線之方法、基因工程方法等，而於該等DNA 中導入突變，藉此取得突變DNA。作為基因工程方法之一 的部位特異性誘發突變法，係指可於特定位置導入特定突 變之方法，故較為有用，其可根據M〇lecular cl〇ning: A ^ Laboratory Mannual, 3rd Ed.5 Cold Spring Harbor

Laboratory，Cold Spring Harbor NY·，2001.(以後簡稱為，，分 子選殖第 3版 ”）、Current Prorocols in Molecular Biology，

Supplement 1 〜38，John Wiley & Sons (1987-1997)等所揭 示之方法進行。可藉由使用適當表現系使該突變DNA表 現而獲得包含1個或數個胺基酸缺失、被取代或被加成 之胺基酸序列的蛋白質。 上述所謂「於嚴格條件下雜交之鹼基序列」，意指藉由 使用DNA或RNA等核酸作為探針，且使用菌落·雜交法、 120536.doc -14 - 200842189 嗟菌斑雜交法、或南方墨點雜交法等而獲得之驗基序列， 具體可列舉·可藉由使用將來源於菌落或則斑之DNA或 該DNA之片段固定化的過濾器，於Q7〜iG μ之加存在 於65C下進行雜交後，使敎1〜2倍左右之SSC溶液（1 倍濃度之ssc溶液之組成為15G讀氯化納、15瘦摔樣酸 納），於65°C之條件下，；青洗過濾、器，進行鑑定之 DNA。雜交可根據分子選殖第3版等所揭示之方法進行。 即，所明於嚴袼條件了，係才旨形成所謂特異性雜交，而 不开/成非特異性之雜交之條件，具體可列舉：具有 50〜70%以上之同源性的DNA彼此雜交，與其相比同源性 較低之DNA彼此不雜交的條件；或者於通常之南方雜交之 清洗條件’即在相當於65t:、lxSSC、01% SDS，或者 Ο-lxSSC、0·1% SDS之鹽濃度下進行雜交的條件。例如， 作為可於嚴格條件下進行雜交之DN Α，可列舉與用作探針 之DNA之鹼基序列具有一定程度以上之同源性的dna，例 如可較好地例示：具有60%以上、較好的是7〇%以上、更 好的是80%以上、尤其好的是90%以上、特別好的是95〇/〇 以上、最好的是98%以上之同源性的DNA。 本發明之DNA之取得方法或製備方法並無特別限定，可 根據本㊂兒明書中所揭不之序列編號1、3、5、7咬9，或省 11、13、15、17或19所示之鹼基序列資訊；或序列編號 2、4、6、8或10，或者序列編號12、14、16、18或2〇所示 之胺基酸序列中所示的胺基酸序列資訊而製備適當之探針 或引子，使用彼等’篩選錦裡疮療病毒（KHV)之DNA基因 120536.doc -15- 200842189 庫，藉此分離目標基因，或 而製備目標基因。 —x 、吊方法利用化學合成 本發明之蛋白質之取 來自天然之蛋白質、… 並無特別限定，可為 龙白貝、化學合成之蛋 術製造之重組蛋白f。、卩用基因重組技 時，可藉由 '商a ,人、來自天然之蛋白質之情形 離.精製蛋白V之二自表現=關蛋白質之細胞或組織分 化學合成製備蛋白質之情开取日:本1明之蛋白1。於藉由 甲氧幾基法）、如法（第"/、/例如可根據Fmc)c^(第基 成本發明之蛋白質^二丁㈣基法）等化學合成法而合 而合成本發明之蛋白質市。之胜肽合成機 ^ ^ ^ 、9由基因重組技術製備蛋白質 之ί月形時，可藉由將包 ：貝

導入至較好的表料Μ 鹼基序列的DNA 較好的是#H 備本發明之蛋白質。該等中， 的疋精由比較容易操作且 之製備。 A里I備之基因重組技術 例如，於藉由基因重組技術製 時，為了自細胞培養物回收該蛋白所h蛋白質U月形 用包括硫酸銨或乙醇沈殿、酸萃取、陰離子=二吏 層析法，鱗酸纖維素層析法，疏水性作用=離：乂換 析法，_灰石層析法以及凝曰 的方法，較好的是高效液相層析法丄=眾所周知 層析法之管柱，例如使用 /、’作為用於親和 體m姓a 針對本發明之蛋白質的單株抗 體專抗體結合之管柱’或者於上述本發 通常之胜肽標記之情形時 貝加成 、使用於該胜肽標記上結合具有 120536.doc -16 - 200842189 親和性之物質的管柱’可藉此獲得該等蛋白質之精製物。 於本發明之蛋白質在細胞膜上進行表現之情形時，使 π肊臈刀解酶產生作用$ ’可藉由進行上述精製處理而獲

得精製樣品。 X 進而，業者可根據分別表示編碼序列編號2 ϋ % ’或者序列編號12、14、16、18或2G所示之胺基酸序列 的鹼基序列之-例的序列編號1、3、5、7或9，或者序列 編號11、13、15、17或19所示之驗基序狀#訊，而適當 製備或取得包含序列編號2、4、6、8或1G，或序列編號 12 14、16、18或20所示之胺基酸序列中之1或數個胺基 酸缺失、被取代或被加成之胺基酸序列的蛋白質，或者包 含與序列編號2所示之胺基酸序列具有8〇%以上之同源性 之胺基酸序列的蛋白質。 作為本發明之重組載體，若為含有上述本發明之基因 DNA，且可於錦鯉之生體内表現對錦鯉疱疹病毒（khv)具 有免疫原性之蛋白質的重組載體，則並無特別限定，本發 明之重組載體，可藉由將本發明之基因DNA適當嵌入於表 現載體上而進行構建。作為表現載體，較好的是於宿主細 胞中可自主複製者’或可嵌入於宿主細胞之染色體中者， 又，較好地可使用於可表現本發明之基因的位置上含有啟 動子、促進子、終止子等控制序列者。作為表現載體，較 好的是使用動物細胞用表現載體之重組載體，尤其好的是 使用魚類細胞用表現載體之重組載體，可用於本發明之表 現載體之構建順序以及方法，可使用於基因工程領域常用 120536.doc -17· 200842189 者。 作為可用於本發明之控制序列，例如可列舉：構成啟動 子、誘導性或調節性啟動子、組織特異性啟動子、或來源 於獲得表現之抗原之基因的啟動子等，只要可於魚類之細 胞内表現，則並不㈣限定於此p作為構成啟動子，例 如可列舉.來源於細胞巨大病毒（cyt〇megal〇virus，CMV) 之啟動子序列，或勞斯肉瘤病毒（R〇us sare〇ma vi^s， RSV)、猴病毒·40 (SV-40)、肌肉β_肌動蛋白啟動子，或單 純疱疹病毒（HSV)等強力啟動子等。作為組織特異性啟動 子，例如可列舉料激酶啟料等。作為料性或調節性 啟動子，例何列舉：成長激素調節性啟動子、處於乳糖 操縱子序列之控制下之啟動子、或鋅誘導性金屬硫蛋白啟 動子。上述轉錄調節序列，可使之可操作地（即，以可調 節上述核皆酸序列之表現的方式）結纟於編碼免疫原性多 肽之核苷酸序列上。 上述控制序列可含有包含啟動子（例如，上述誘導性又 構成性啟動子）DNA序列之表現控制序列，可根據要求， 進而3有促進子要素、用以剪接轉錄或聚腺普酸化信號 [例如’來源於猴病毒·40 (SV，或牛成長激素]之内含子 序列或作為CpG單位而已知的免疫刺激DNA序列中、^ 個或其以上之複製體。 又’表現載體根據需要，可含有例如：細菌複製起點序 列’或者用以挑選之抗生素耐性（例如，康黴素等）基因或 非抗生素耐性基因（例如，β·半乳糖㈣基因等）等選擇性 120536.doc •18· 200842189 標記。 作為本發明之錦鯉用DNA疫苗’若為包含自上述本發明 之DNA之中所選擇的1或2種以上之DNA之組合物，或包含 上述本發明之重組載體之組合物，則無特別限定，較好的 是包含序列編號1、3、5、7以及9所示之鹼基序列之5種 DNA的混合物，或包含序列編號11、13、15、17以及19所 不之驗基序列之5種DNA的混合物，或該等1〇種£^八之混 合物，或可表現該等DNA混合物的重組載體。又，可於本 發明之錦經用DNA疫苗中添加·調配佐劑。佐劑係刺激免 疫系統而提高對抗原之免疫反應者，主要作為輔助劑而添 加於疫田中。作為代表性之佐劑，例如已知鋁化合物、聚 核苷酸或細菌之菌體成分等，較好地可例示錦鯉il_W或 斑馬IFN-α等；亦可製造以可於錦鯉之體内表現之方式插 入IL-Ιβ基因或iFN-a基因的質體，並將其與本發明之疫苗 同時接種於魚類。 藉由對錦鯉投與本發明之錦鯉用DNA疫苗，而誘發錦鯉 對錦鯉疱疹病毒（KHV)疾病之免疫反應，可預防或治療錦 鯉疱疹病毋（KHV)疾病。作為可適應本發明之錦鯉用dna 疫田之魚類，只要為可能會感染錦經疱療病毒（khv)之魚 類’則並無特別限定，例如可具體列舉黑Μ魚或錦經。 作2特異性結合於本發明之蛋白質上的抗體，可具體列 *單株抗體、多株抗體、嵌合抗體、單鏈抗體、人類抗 體等免疫特異性抗體，該等可使用上述糖蛋白或膜蛋白質 乍為抗原’且藉由常法而製造，纟中，就其特異性方面而 120536.doc -19- 200842189 言，更好的是單株抗體。相關單株抗體等特異性結合於本 發明之蛋白質上的抗體，例如於進行本發明之蛋白質之分 離·定量，或明確本發明之蛋白質的分子結構方面有用。 針對本發明之蛋白質的抗體，藉由使用慣用協定，對動 物（較好的是除人類以外）投與包含該蛋白質或抗原決定位 之片段、或者使該蛋白質表現於膜表面的細胞而產生，例 如於單株抗體之製備中，可使用由連續細胞系之培養物產 生抗體之融合瘤法（Nature 256、495_497，1975)、三體瘤 (trioma)法、人類 B細胞融合瘤法（Immunology Today 4，72, 1983)以及 EBV-鬲虫合瘤法（Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy，ρρ· 77-96，Alan R. Liss，Inc.，1985)等任意 方法。 又，於上述本發明之單株抗體等抗體中，例如可藉由使 用FITC(異硫氰酸螢光素,）或異硫氰酸四甲基玫瑰紅 (tetramethylrhodamine isocyanate)等勞光物質，或 1251、 32p、14c、35S或3H等放射性同位素，或以鹼性磷酸酶、過 氧化酶、β-半乳糖普酶或藻紅素等酶進行標記者，或使綠 色螢光蛋白質（GFP)等螢光發光蛋白質等融合之融合蛋白 質，而分析上述蛋白質之功能。又，作為免疫學測定方 法，可列舉：RIA法（radioimmunoassay，放射免疫分析 法）、ELISA法（enzyme-linked immunosorbent assay，酶結 合免疫吸附分析法）、螢光抗體法、噬菌斑法、斑點法、 血球凝集反應法、歐氏法（Ouchterlony method)等方法。 作為對本發明之錦鯉疱疹病毒具有抵抗性之基因轉殖錦 120536.doc •20· 200842189 =導=由將1或2種以上本發明之蛋白質之基因表現 载體^基因而獲得之㈣轉殖㈣類’則並無特別限 定，於構建向錦鯉類導入!或2種以上本發明之蛋白質基因 的表現載體之情形時，較好的是製造連接於在錦㈣^胞 中有效地表現本發明之蛋白質基因的啟動子之下游之表現 載體。作為該啟動子，可例示·· β_肌動蛋白啟動子、脂肪 細胞Ρ2 (adiP〇cyteP2，aP2)啟料、斑馬魚⑽似⑺: rerio myosin light p〇lypeptide 2 邮切）啟 動子、去偶合蛋白（uncoupling protein，UCP)啟動子、猴 病毒40啟動子、巨細胞病毒啟動子、延長因子Ια啟動子、 金屬硫蛋白啟動子、熱休克啟動子等，其中就表現效率方 面而言，較好的是青鏘β_肌動蛋白啟動子、或斑馬魚啟動 子。又，為使mRNA穩定化，較好的是於本發明之蛋白質 基因之下游連接牛成長激素聚腺苷酸化序列等聚腺苷酸化 序列。亦可根據其他需要，使用具有使基因之表現增強功 能的内含子序列或促進子序列，及發出轉錄終結指令之終 止子序列。可藉由對卵母細胞或受精卵之顯微注射法、病 毒載體感染法、粒子搶法、電穿孔法將所構建之表現載體 導入至錦鯉類。再者，本發明之基因轉殖錦鯉類，除導入 有本發明之蛋白質基因的錦鯉成體、其後代以外，於簡便 之角度出發，亦包括錦鯉受精卵細胞、錦經胚細胞等。 以下，根據實施例對本發明加以具體詳述，但本發明並 不限定於該等實施例。 實施例1 120536.doc -21- 200842189 本發明者藉由聚合酶鏈反應（P〇lymeraSe chain reaCti〇n: PCR)將由進行基因組分析之由日本、美國以及以色列分離 的KHV之基因組所編碼的$種糖蛋白基因與$種膜蛋白質基 因自翻譯開始密碼子擴增至翻譯終止密碼子。將所使用之 引子組示於表丨。進行PCR時之模板DNA使用由曰本分離 之KHV-J。PCR之條件為’以95C 30秒、55C 30秒、72C 30秒為1次循環，進行30次循環。 [表1] KHV-gl-F p年列編號21 5，-ATGCCTGCCACCTTTGGCAG-3， KHV-gl-R 库列編號22 5，-TCACCCCGCAGAGGTACCAT-3， KHV_g2-F 庠列編號23 5，-ATGTACCAGCAGCAATACCA-3， KHV-g2-R 序列編號24 5，-TCAGTTGTGAAGAGTAGATT-3， KHV-g3-F 庠列編號25 5,-ATGAGCCACAGACAGCCAGC-3f KHV-g3-R 庠列編號26 5?-TCAGTAATAGTAATAGTTGT-3f KHV-g4-F 庠列編號27 5，-ATGCCGTCGAGCATGACTGG-3， KHV-g4-R 庠列編號28 5f-TCAGAGTTCGTCTCTGATGG-3, KHV-g5-F 庠列編號29 5f-ATGTCTATGCGCCCGCACAA-3， KHV-g5-R 庠列編號30 5、CTACCGAGTGAGCCGTCTCT-3， KHV-ml-F 序列編號31 5，-ATGACGGAGCGGGCAGCGCT-3， KHV-ml-R 序列編號32 5，-TTAGAAGACGAGGAAGCCCT-3’ KHV-m2-F 序列編號33 5,-ATGTCTCCTTTGTGCGGTCT-3f KHV-m2-R 序列編號34 5，-CTATACGCGCTCATAACCCC-3， KHV-m3-F 序列編號35 5,-ATGAGCGGGTATAGGTACAA-3, KHV-m3-R 序列編號36 5f-TCAGACGAGCTCGTTGAGGA-3f KHV-m4-F 序列編號37 5，-ATGGCAGTCACCAAAGCTCA-3， KHV-m4-R 序列編號38 5，-TCACCACATCTTGCCGGTGT-3， KHV-m5-F 序列編號39 5，-ATGGATGCACCGGTCTTCTC-3 丨 KHV-m5-R 序列編號40 5，-TCAGGCGGCTGTCTTCCTCT-3， 將PCR擴增DNA於基因表現載體PCDNA3.1中進行選殖， 導入至大腸菌。大量培養該轉形大腸菌，提取精製質體 DNA。質體之精製係藉由使用氯化鉋之超離心法（分子選 120536.doc -22- 200842189 殖弟3版）而進行。 實施例2 疫苗試驗係使用注射器，對每條錦鯉，將5〇吨之dna 以及 100 μί之磷酸缓衝液（phosphate buffered saline:PBS) 接種至錦魚里之背部肌肉中。此時，分別接種各種糖蛋白基 因以及膜蛋白質基因。僅接種載體質體Dna作為陰性對 照。疫苗接種後30天内，於循環過濾式水槽中於23χ：下進 行培養。 感染實驗係使感染KHV之錦鰹之鰓於pb S中勻聚化，對 每條錦鯉接種1〇〇 pL之以0.22 μπι過濾器過濾之液體。接 種病毒液後，於循環過濾式水槽中，於23 °C下飼養錦缠。 KHV感染後，對錦缠連續觀察12天，算出錦鯉之累計死 亡率’將其結果示於圖1。試驗之結果：對照區之錦經之 累計死亡率約為50%，相對於此，疫苗試驗區之累計死亡 率約為13〜40(糠蛋白）％、I4〜4〇(膜蛋白質）％，因此，明確 了 DNA疫苗對KHV感染之防禦感染的有效性，即疫苗效 \ / 果。 實施例3 以與上述相同之方法進行疫苗試驗。此時，分別混合5 種糖蛋白基因（組2)與5種膜蛋白質基因（組3)而進行接種。 僅接種載體質體DNA(組1)作為陰性對照。疫苗接種後3〇 天内，於循環過濾式水槽中，於23°C下進行飼養，以與上 述所揭示之相同方法進行感染實驗。 KHV感染後，對錦鯉連續觀察3週，算出錦鯉之累計死 120536.doc •23- 200842189 亡率，將其結果示於圖2。試驗之結果：對照區之錦鯉之 累計死亡率約為60%，相對於此，疫苗試驗區之累計死亡 率約為ίο〜2〇%，因此，明確了，DNA疫苗對KHV感染之 防禦感染的有效性，即疫苗效果。 產業上之可利用性 使用本發明之錦鯉用DNA疫苗，可賦予針對由錦鯉疱疹 病毒（KHV)所產生之錦鯉疱疹病毒疾病的免疫能力。更詳 細而5，使用本發明之錦鯉用DNA疫苗，可誘導針對錦鯉 疱疹病毒疾病的免疫反應（包括體液性免疫反應以及細胞 性免疫反應），因此，其於預防感染錦鯉疱疹病毒（KHV)或 治療錦經疱療病毒疾病方面有效。 【圖式簡單說明】 圖1係表示針對KHV感染症之DNA疫苗之試驗結果的 圖。（A)係分別投與5種糖蛋白基因之情形時的試驗結果， (B)係分別投與3種膜蛋白質基因之情形時的試驗結果。 圖2係表示使用針對KHV感染症之DNA混合疫苗之試驗 π果的圖縱軸表不累計死亡率，橫軸表示感染KHV後之 天數。組1表示陰性對照試驗區，組2表示膜蛋白試驗區， 組3表示糖蛋白試驗區。 120536.doc -24- 200842189 序列表 <110〉國立大學法人東京海洋大學 <120〉錦鯉疱疹用DNA疫苗 <130> F2006-004 <140> 096114531 <141> 2007-04-24 <150〉JP 2006-111414 <151〉2006-04-13 <160> 40 <170〉Patent In第3.1版 <210> 1 <211> 1350 <212〉 DNA <213〉錦鯉疱疹病毒 <400> 1 atgcctgcca octttggcag gogocctgac ggggatgacc aagtetacct ggaagaggac acggatgaog ggggattceg tggoagagca ccagoaccac cccaggtggc octggccctg gacctggaot ttagggacag gcttaotcag tttcctcaco actotgotgc agtcaggggt ggcotgagag gctgcctggg caaggtaotg agcatctoca ggggcaggct gotgntgggg gtggtgggoc taggcctgct gotggcattc atcgtgttca tggtggagaa gacggaotco aggctgctgg acgaggccaa gtgtccagac caggcccgtg tgtactdcoc tctgaggaog cacaggogca agttcagctt catgttctgc tgccactgct gtgooctcaa gcagcoocac atctgctacg aggacatgtt caagtggctt gaccactggt acaacgacac gctgtcccaa gaggagcaga tgggctttgc ccaacatgtg tgggoagccg gcgtggtgag aggccacctg gagogcaagg ctgctcccct gtctcagcag gaccaggact cttggcctca gaacctgogc oagatgstca aacgcaogcg otgggttgag tggctgrtgg iggagcacta cgccaagagc ctcaaccaca cgotggctgg tacagaggac teogagcaoc tgagcaagca caccatcttt gacgactccg agoagctcag gcccatcaac agcacgcaca acggtactgc caagacctac 120536.doc 60 120 18。 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 200842189 aagctggaga ccttggtggt ggacaatgtg tacgcagcgg acgagctggt ggocttcatf gtggagtctg ggcacgctca egacactaco atgttcagga tggccttcaa ccagtactac ggcgcctaca acgtgtacga cgagctgtto cacaaggogc tggaoctcgc cggcgtggtg gactctgtcg cctacatgcc ctctgcggct gaggtgctga tcgdggctgc oatggacgag gccttctcgt acaaccctga cgaggaggat gocaggctca aogcttccag ggooaacgca acoagcaaca gcaccctgat gaacggcacc tgctctctgg agcagctgtg caaggcctat gatgttgotg ogactaccat gccgtctccc totgotctcc toagcaccag tgacgtcaca Qodocc^gca tcaggcocsg gdccagtgac gtodccgcgo ccdgoagcag gaoodgtcac aooacgccoc cttctggtac ccatgatggo tccaccgtgt ggactgttgg taacattaoa atgactgcta atggtaoctc tgcggggtga <210〉 2 <211> 449 <212> PRT <213〉錦鯉疱疹病毒 <400> 2

Met Pro Ala Thr Phe Gfy Arg Arg Pro Asp 6ly Asp Asp 6ln Val Tyr 15 10 15

900 960 1020 1080 1140 1200 1260 1320 1350

Leu 6Iu Glu Asp Thr Asp Asp 6ly 6iy Phe Ser 6ly Arg Ala Pro Ala 20 25 30

Pro Pro Gin Val Ala Leu Ala Leu Asp Leu Asp Phe Arg Asp Arg Leu 35 40 45

Thr Gin Phe Pro His HU Ser Ala Ala Val Arg Gly Gly Leu Arg 6ly 50 55 60

Cys Leu 6!y Lys Val Leu Ser He Ser Arg Gly Arg Leu Leu Met Gly 65 70 75 80 120536.doc -2- 200842189

Val Val Gly Leu Gly Leu Leu Leu Ala Phe lie Val Phe Met Val Glu 85 90 95

Lys Thr Asp Ser Arg Leu Leu Asp Giu Ala Lys Cys Pro Asp 6In Ala 100 105 110

Arg Val Tyr Tyr Pro Leu Arg Thr Hi$ Arg Arg Lys Phe Ser Phe Met 115 120 125

Phe Cys Cys His Gys Cys Ala Leu Lys Gin Pro His lie Cys Tyr Glu 130 135 140

/ V

Asp Met Phe Lys Trp Leu Asp His Trp Tyr A$n Asp Thr Uu Ser 6ln 145 150 155 160

Glu QIu Gin Met Gly Phe Ala Qln His Val Trp Ala Ala Gly Val Val 165 170 175

Arg Gly His Leu Glu Arg Lys Ala Ala Pro Leu Ser Gin Qln Asp Gin 180 彳85 190

Asp Ser Trp Pro Gin Asn Leu Arg Qln Met Val Lys Arg Thr Arg Trp 195 200 205

Val Glu Trp Leu Val Gly Glu His Tyr Ala Lys Ser Leu Asn Hi$ Thr 210 215 220

Uu Ala Gly Thr Glu Asp Tyr Glu His Lou Ser Lys His Thr Me Phe 225 230 235 240

Asp Asp Ser Glu 6ln Leu Arg Pro Ile Asn Ser Thr His Asn Gly Thr 245 250 255

Ala Lys Thr Tyr Lys Leu Glu Thr Leu Val Val Asp Asn Val Tyr Ala 260 265 270 120536.doc 200842189

Ala Asp Glu Leu Val Ala Phe Met Val Glu Ser Qly His Ala Gin Asp 275 280 285

Thr Thr Met Phe Arg Met Ala Phe Asn 6tn Tyr Tyr 6ly Ala Tyr Asn 290 295 300

Val Tyr Asp 6lu Leu Phe His Ly$ Ala Leu Asp Leu Ala Gly Val Val 305 310 315 320

Asp Ser Val Ala Tyr Met Pro Ser Ala Ala Glu Val Leu Me Glu Ala 325 330 335

Ala Met Asp Glu Ala Phe Ser Tyr Asn Pro Asp Glu Glu Asp Ala Arg 340 345 350

Leu Asn Ala Ser Arg Ala Asn Ala Thr Ser Asn Ser Thr Leu Met Asn 355 360 365

Gly Thr Cys Ser Uu Glu Gin Lmi Cys Lys Ala Tyr Asp Val Ala Ala 370 375 380

Thr Thr Met Pro Ser Pro Ser Ala Leu Leu Ser Thr Ser Asp Val Thr 385 390 395 400

Thr Pro Ser lie Arg Pro Arg Thr Ser Asp Val Thr Ala Pro Ser Ser 40B 410 415

Arg Thr Ser Hi$ Thr Thr Pro Pro Ser Gly Thr His Asp Gly Ser Thr 420 425 430

Val Trp Thr Val Gly Asn lie Thr Met Thr Ala Asn Gly Thr Ser Ala 435 440 445

Gly 4- 120536.doc 60 60

200842189

<21〇> 3 <211> 1518 <212> DNA <2! 3>錦鯉疱疹病毒 <400> 3 atgtaccago agoaatacca gcagacga^ gacoagagga gcotgctgtg tctggggcgg gctcccctca cgctcaogct ogcctcacag cccatcacto gccgcctcgt ggcgtctgrt gagtacagca actctcctgc atoagcatca gtacccacag cagcatctgc agcatcagta ccoacagcag oaccagtaco agtggagtac cagcgccgtc ctgtggotgo actggagtao tgcaaogggg agagtggcgc aagcatcgag agtggecttt cgctgctggc caggcgtcct otcaagaggg oaaggagggc tgctgagstg gaggotpag gggotgadgg ggctaaaggg gctgaagggg ccgtagagga agacgctgaa gg&gccgtag aKaagacgc tgaggggacc gtcgaggagg acactgtQga ggacgaegaa gaaatggcgc aagcaccgtt ggtcaagaga aagaggcgca agagacgtgc gtcgtgctgg ggcaccaaga agagaaggso caccgcctct cactotgtgg cagaggactc tgtggcagag gtggcagagg acaccaccac dgtgaccgtc eaggaggagg acg^cgggga gtcacaaatg gcgcaagcac taattgtgac aatggggoac aacggcgotg aiggtdctgt ggacactgct gtgaccactt acactgtgga cactgaggao actgctgtgg acattgacac tgtgaccact gotgaggaca ctgatgtggt oatggttgac gctgaggngg aoactgagga ggacactgag gaggacactg aagtgaccat tgaaaccaat gacaaaggtg ttgtcgaaac ttatgiadda aacgcaaota cccttggtag tgatgacgaa cagggtggtg aoaaacggaa agagggtgoa gctgccgttg gcgccggggg tgaagattgc gcaaatateg cgtgtgaaag ggagggggca gtatctgaca aacaaatgtt cocggtacas tcaccgcaca cacccaaact cctcccctct gaatcacgco aaaggggagt g&taaocaat cagaagccaa tttcoacaga aggggtgggg ttattgagca ataaceegaa tgaotgttoc caacatactg gtttaotggo aaccacgooo cataccggtt tggtttcgto cacaccccat atMggtata agaaccctga ctctggagag gttoggcatt ctaocactga oactgccact 120536.doc 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 900 960 1020 1080 1140 1200 1260 200842189 t320 1380 1440 1500 1518 gccactgtct ccgttgacac cgtctttgac tctgttaccg ttgataotgt ctttgactct gttgactccg acgacttgtc gctactcttt gscactttgg tccagcaaaa gactctcgaa ctcagacaga gactcaagag catctacgaa cacagoacca gcttctgcac tooagapttc ^cccagdgdg cccacagcct cctgctagao tacaaggsct ttgcootcea agaactgcaa tctactcttc acaactga <210> 4 <211> 505 <212〉 PRT <213〉錦鯉疱疹病毒 <400〉 4

Met Tyr Gin Gin Qln Tyr 6ln Gin Thr Arg Asp Gin Arg Ser Leu Leu 15 10 15 (Jys Leu Gly Arg Ala Pro Leu Thr Leu Thr Leu Ala Ser Gin Pro 20 25 30

Thr Arg Arg Leu Val Ala Ser 6ly Glu Tyr Ser Asn Ser Pro Ala Ser 35 40 45

Ala Ser Val Pro Thr Ala Ala Ser Ala Ala Ser Val Pro Thr Ala Ala 50 SS 6〇

Pro Val Pro Val Glu Tyr Qln Arg Arg Pro Val Ala Ala Leu 6lu Tyr 65 70 75

Ala Arg Arg Pro Leu Lys Arg Ala Arg Arg Ala Ala Qlu Val 6lu Ala 100 105 110

Qlu Qly AU Glu Gly Ala Lys Gly Ala Qlu fily Ala Val Glu Glu Asp 115 120 125 120536.doc 6- 200842189

Ala Glu Qly Ala Val Glu GIu Asp Ala 6lu 6Iy Thr Val Glu Giu Asp 130 丨3S 140

Thr Val Glu Asp Glu Ala Glu Met Ala Girt Ala Pro Leu Val Lys Arg 145 150 155 160

Lys Arg Arg Lys Arg Arg Ala Ser Cy$ Trp Gly Thr Lys Lys Arg Arg 165 170 175

Thr Thr Ala Ser His Ser Val Ala Glu Asp Ser Val Ala Glu Val Ala 180 185 190

Glu Asp Thr Thr Thr Val Thr Val Glu Glu fiJu Asp Gly Gly Glu Ser 195 200 205

Gin Met Ala 6ln Ala Leu lie Val Thr Met Gly His Asn Gly Ala Glu 210 215 220

Gly Thr Val Asp Thr Ala Val Thr Thr Tyr Thr Val Asp Thr Glu Asp 225 230 235 240

Thr AU Val Asp He Asp Thr Val Thr Thr A!a 6lu Asp Thr Asp Val 245 250 255

Val Met Val Asp Ala 6Iu 6lu Asp Thr 6Iu Glu Asp Thr Glu Glu Asp 260 265 270

Thr Glu Vaf Thr lie Glu Thr Asn Asp Lys Qly Val Val Glu Thr Tyr 275 280 285

Gly Lys Asn Ala Thr Thr Leu Gly Ser Asp Asp Glu 6ln Gly Gly Asp 290 295 300

Lys Arg Lys Glu Gly Ala Ala Ala Val Gly Ala Gly Gly Giu Asp Cys 305 310 315 320 120536.doc 200842189

Ala Asn lie AI窃 Cys 6Ili Arg Glu Gly Ala Val Ser Asp Ly$ βΐη Met 325 330 335

Phe Pro Val Gin Ser Pro His Thr Pro Lys Leu Leu Pro Ser Glu Ser 340 345 350

Arg QIn Arg 6!y Val Val Thr Asn Gin Lys Pro Me Ser Thr Qlu Qly 355 360 365

Val Gly Leu Leu Ser Asn Asn Gly A$n Asp Cys Ser QIn His Thr Qly 370 375 380

Leu Leu Ala Thr Thr Pro His Thr Gly Uu Val Ser Ser Thr Pro His 385 390 395 400

Met Gly Tyr Lys A$n Pro Asp Ser Gly Glu Val Arg His Ser Thr Thr 405 410 415

Asp Thr Ala Thr Ala Thr Val Ser Va丨 A仲 Thr Va丨 Phe Asp Ser Val 420 425 430

Thr Val A$p Thr Val Phe Asp Ser Val Asp Ser Asp Asp Leu Ser Leu 43S 440 445

Leu Phe Asp Thr Uu Val 6ln Gin Lys Thr Leu Glu Leu Arg 6In Arg 450 455 460

Leu Lys Ser lie Tyr Glu His Ser Thr Ser Phe Cys Thr Pro Asp Phe 465 470 475 480

Thr Gin Arg Ala His $er Leu Leu Leu Asp Tyr Lys Asp Phe Ala Leu 485 490 495

Ly6 Glu Leu Gin Ser Thr Uu His Asn 500 505 120536.doc 200842189 <210> 5 <211> 4587 <212> DNA <213〉錦鯉疱疹病毒 <400> 5 atgagccaca gacagccagc oaagagocag ggcoagggco agggcaaggg caagggoaag 60 ccagccaaga ggcctgcacc tgctgcactc agcgcctttg actcttctga tgaggaggag 120 gataccacca coactettgc tccaaccaga cccaagaagc agcctgccaa acocaagtoo 180 aaggaggtcg tggaggtgtc ctotgcctcc tctgtctctg agtcctotgc ctcagattct 240 gagtotgagg ootoototgo ctootctgcc tcctctgcct cototgoctc ctotgootot 300 tcctctg^at cctcagcctc t^attctgac tctgacaacg fcggtgacaa gtacaacaag 360 gacgagccac catcctctga tcoagaatct gaacacgaga atgcccctgc accacccatc 420 ddccgcaaga tcaaaggcag aaccgototg gcaocctooa agggcaaggc caaggccacc 480 aagaagcagc cagagtcctc ctcctcgtcc tcttctgcat cctcctcttc tgoctcttca 540 gactctgaag actctgaaga cgaaccacct gcaoccagaa ccaaggtaat gcttgtcaaa 600 daagctgctc ctgctcctgc t^aaactgtt cctgtgtctg tacctgtaoc tgcaaaaccc 660 agcaagactg ttcctgtgoo tgtgcctgcc aagaagacta cacaaaoact tgaaaaaacc 720 atccagaaac c各dccdctac CdddddCCCa ag^rtgctcc tcctgctact 780 gttcctgttc GtgGGaagao tgccaagaca actcaacctc eacccaaggt 恥oecagoag 840 ooacoacctg coaagaocaa tacoacatca oaaccaaaac coaaaddtco cgcaagcaca 900 cagaggagag tgaccctgga ogaggaggac gactcaccct ttgtcaggtc caagagcagg 960 acgcctgrtga aggcgocttc odagtcgcca cctgctccco atgctgcacc catcactgcc 1020 aacatcootg tcattgaaga gtacgatocc accctgcctc agctgcctgc agstaagacc 1080 atttotaaat cattagcacc cacacctgtg cctgtacctg ttgttgtaga tgatgttaat 1140 gataatggta atgatagtga cgotaaggct aatgagactg dgactctgga tactctaaco 1200 120536.doc 1260 200842189 gctgatatac ccatgtctga ctctgaggat gaggatgaga ctcaagttga gattgctgat gataaagata atgatgttaa ggatddtgao gatgttdatg atgttgagat gagagagatg cagcagatga taa^ctctga catgatggtc aggccagtcd gccotctgcc tgctgatgat gcttctgatg agggatgcca agcagcctct cagagcatco ttgataatga taatgetaat ggtgats：ata atsgtaataa taatgatgdt gaggaggagg aggaggagga ggaggageag gaaatggagc aagcatcacc ttoacctgct ctcgotgtcc tggccgctat ggctggagac ttacoatgca ctgctcaacc tgagcctoag ccagagccdg aaccagaacc agagcctcag cotcagcctc agcotoocaa acagcagoot ctagaotttt tgacttctct gatctgcctc acatccaaao cctcoatcac agiotitgag gcagaggcss tcactgcttc tatoaatgca gacaactcta aaaatggtgo aagcacaggt gtgagtgatd atgttttttg caatcotgag cctcctgodt cacccacttc agtcacacca ccaccacctg ccaccatggt otctatgatc atcccaggot tgggtgacat agaagaaatg attgttgtag acactgctgc tgatectgat gctgatgctg atgctgatgc tgatgctgat aatggtgagg atgagdctga agtg：£Gtgat ^tgctggagc tcagtgctgg gcdaeagttt gagcccttgg aacctgcaag cagcaagacg cctaaaacoo ctaadgaaat aaagaaacct gagcagccca agccaagaac coataaagac agagscaccd gagacaccag agagagagag oagagagagg ^o^ggXggt gagacocaaa gaacgtagag aaaaggacaa gaaggagaga gagagggagg agaggagaag ggagaaatog agcaaacaca gcdgoaggte c&cgatggtg tgtgagacti tggcagagac tgccaogccg cotccaagcc etcgctcacc oaacatgccc acttoatoao ccacaactac tccogcaacg fftgcagtctg tggtggtgca gcccaoaccc tcaccctcag cctctcacag accctccaag gccaagcagc agoaagagga octcaagcag agtgctgaag cggccagact tgccatgatg: gagagggaga g£gaeagacg tceoagagac agacagaggg ctgatgcaga cgccgaggtt ^ccgcactca gaeracgtggc ccttgaaafd cgca^acaag agagacagcg oga^gctgag gagctggagg aggotgcact cagagacstc gcectcgccg ccaagcaaaa aggtaagaca 120536.doc -10- 1320 1380 1440. 1500 1560 1620 1680 1740 1800 1860 1920 1980 2040 2100 2160 2220 2280 2340 2400 2460 2520 2580 2640 200842189

aagagcacca ccaacaaccc agaacagaot aaggocacca aggtotcccd cactcacact tacgatgagc aagctgccce aggdagaaca tggaactcta coagoctccg acaotgtgog gac^ttgtgt acgtctgacc accctgctgt atetatccct ggtggcactg cccgcoactg gagatgattg gtstccatgg ctgctgcact etcagagaag ccgtttgtac cocagga&at gcagcaagac ttcaaaacac cttotgcago agagagagag caccaccaoc cacagcagca agotoa^cat cactgacttc gcctggccgt gegctfccct tggtcactct ccaagttcct cctacatsat ccatgcagtt gcgaactgta ggctgctcaa cagccatsgc atggtgccgt gggtcatcat actttacagg acgoctccdt agcccot^ag cctccatcac gootgaotgo gcctgaaact tcacacttct o^cagcaaa gtgoagggag caagagaagg gcagcctcag cctoaagcag tgtagactac otttgtgaat ccaagcctcc gGaoatcato accagtggtg ggccagagag tgagtctccc ccacgcaaac stgcctgaac

tgOtgHOOtO cattggcgca ggotgoaaga tacagactgs ggtgcaggtc atggatgttt ototctggto agtoaotgas: cagcaaaacg： totoootott gactcaagca gatgagactc tcacctgcac cooatoatgc gtcaaggata aacctgagaa gcoctgcaag atcatgCddg atgcagcacg aacagcctec cgcaaaaaca attgagaggg ctctctggct ggcatcctgg ttggtgfccc agctiocacgt cacagsgagg gccaagttca tggggcaaca tgoaccctca cactatgtca ttgcagctgt ctgcagcagc aagacaccaa catcctccag cctcttcttc cacagggt〇9 ^agtcatgca tggctgccct tgtgtggaeo accaagaagt ccttcaacaa tgaccaggat KKagatga agctgtctga acaggcagca actctgtgta tgcagaaatc ccatggaggt ooaagctcct ccactct^tc accctcoaga

Aoegoaaect ggtggctaca atoagcacaa tcoagtcact 2700 a〇8£CggCC8 2760 gaaggacaag 2820 acgcagagac 2880 ttcacactct 2940 gaggatgtco 3000 ggcgtctgcc 3060 gagcgastgt 3120 tgagacgctc 3180 tgaaccocta 3240 gcacgasttc 3300 ^tccccagca 3360 tgtgcacga£ 3420 ggcctceagt 3480 oaccgccacc 3540 cggcaaggct 3600 acccgagctg 3660 gactgtgatg 3720 ggccgagatt 3780 ttccctgcag 3840 ggtgctgatg 3900 gccctacact 3960 ctccttcaga 4020 ggotgtegag 4080 120536.doc -11 - 200842189 aggggagaoa tgaccgctga cgaggtcaag atgtggcgtc tggacgatga ctttagcggt gdigtgaggt ctgtg^cect gagaaaogts tcctacctct gcaccca^aa accctttgcc actggctcct cacacgctgt oagggcagag attgaacccc tggtggaiiga cctcagagtc cagcagagaa ccactgoctc caaggtacca cgcaagtctg cdotoaagao acotgaacoo aocactgcoa ccgctgcagc caccacagga ggagaotctt ctgatgatga gcagcctcag cagcagcaga ggggaaggag a£tgagg£tc agcgcaccca gctccagaag aagcsgcaga gtgaggtoca ggtccaggtc cagagtggac tctgactctg atgatggcct gtocacacgc agcggagcoa gcagcttctc ctctagaagg tacagtttae tccattatgt tttttttata caatgttaca actattacta ttaotga <210> 6 <211〉 1528 <212> PRT <213〉錦鯉疱疼病毒 <400> 6

Het Ser Hrs Arg Gin Pro Ala Lys Ser Qln 6ly Gin 6ly Gin Gly Lya 15 i〇 15

Gly Lys Gly lys Pro Ala Lys Arg Pro Ala Pro Ala Ala Leu Ser Ala 20 25 30

4140 4200 4260 4320 4380 4440 4500 4560 4587

Phe Asp Ser Ser Asp CMu Glu Gilt A$p Thr Thr Thr Thr Va丨 Ala Pro 35 40 45

Thr Arg Pro Lys Ly$ Gin Pro Ala Ly$ Pro Ly$ Ser Ly^ Glu Val Val 50 55 60

Giu Val Ser Ser Ala Ser Ser Val Ser 6lu Ser Ser Ala Ser Asp Ser 65 70 ' 75 B0 6lu Ser Cllu Ala Ser $er Ale Ser Ser Ale Ser Ser Ala Ser Ser Ala 85 90 95 120536.doc -12 - 200842189

Ser Ser Ala Ser Ser Ser Glu Ser Ser Ala Ser Asp Ser A$p Ser Asp 100 105 110

Asn Gly Gly Asp Lys Tyr Asn Lys Asp Glu Pro Pro Ser Ser Asp Pro 115 120 U5

Glu Ser 6Iu His Glu A$n Ala Pro Ala Pro Pro He A$n Arg Ly$ lie 130 135 140

Lys Gly Arg Thr Ala Leu Ala Pro Ser Lys Gly Lys Ala Lys Ala Thr 145 150 155 160

Lys Lys 6ln Pro Glu Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ala Ser Ser Ser 165 170 175

Ser Ala Ser Ser Asp Ser 6Ιυ Asp Ser Glu Asp Glu Pro Pro Ala Pro 180 185 190

Arg Thr Lys Val Met Leu Val Lys Lys Ala Ale Pro Ala Pro Ala Lys m 200 205

Thr Val Pro Val Ser Val Pro Val Pro Ala Lys Pro Ser Lys Thr Val 210 215 220

Pro Val Pro Val Pro Ala Lys Lys Thr Thr 8ln Thr Leu 6lu Lys Thr 225 230 235 240 lie 6ln Lys Pro Thr Thr Thr Gin Thr Pro 6ln Lys Pro Lys Thr Ala 24S 250 255

Pro Pro Ala Thr Val Pro Vai Pro Ala Lys Thr Ala Lys Thr Thr Qln 260 265 270

Pro Gin Pro Lys Val Pro Gin 6ln Pro Pro Pro Ata Lys Thr Asn Thr 275 280 285 13- 120536.doc 200842189

Thr Ser Gin Pro Lys Pro Lys Asn Pro Ala Ser Thr Gin Arg Arg Val 290 295 300

Thr Leu Asp 6lu Gtu Asp Asp Ser Pro Phe Val Arg Ser Lys Ser Arg 305 310 315 320

Thr Pro Val Lys Ala Pro Ser Lys Ser Pro Pro Ala Pro His Ala Ala 325 330 335

Pro lie Thr Ala Asn lie Pro Val lie Glu 6lu Tyr Asp Pro Thr Leu 340 345 350

Pro 6!n Leu Pro Ala Gly Lys Thr lie Ser ty$ Ser Leu Ala Pro Thr 355 3$0 365

Pro Val Pro Val Pro Val Val Val Asp Asp Val Asn A$p Asn Gly Asn 370 375 380

Asp Ser Asp Ala Lys Ala Asn 61 u Thr Glu Thr Leu Asp Thr Leu Thr 385 390 395 400

Ala Asp lie Pro Met Ser Asp Ser filu Asp Glu Asp Glu Thr Gin Val 405 410 415

Glu lie Aid Asp Asp Lys Asp Asn Asp Val Lys Asp Asn A$p A$p Vat 420 425 430 \

Asn Asp Val Glu Met Arg Qlu Met Gin Gin Met He A$n Ser Asp Met 435 440 445

Met V$l Arg Pro Val Ser Pro Leu Pro AU A$p Asp Ala Ser Asp Glu 450 455 460

Gly Cys Gin Ala Ala Ser Gin Ser lie Leu Asp Asn Asp Asn Gly Asn 465 470 475 480 14- 120536.doc 200842189

Oly Asp Asp Asn 6ly Asn Asn Asn Asp Asp 6iu Glu Qlu QIu 6lu Glu 485 490 495 QIu QIu QIu 6tu Q\u Met Glu Gin Ala Ser Pro Ser Pro Ata Leu Ala 500 505 510

Val Leu Ala Ala Met Ala 61y Asp Uu Pro Cy$ Thr Ala Gin Pro 6lu 515 520 525

Pro Gin Pro Glu Pro QIu Pro 6iu Pro 6lu Pro Qln Pro Gin Pro Gin 530 535 540

Pro Pro Lys Gin 6In Pro Leu Asp Phe Leu, Thr Ser Leu He Cys Leu 545 550 555 560

Thr Ser Lys Pro Ser lie Thr Val Cy$ Glu Ala Glu Ala Val Thr Ala S65 570 575

Ser lie Asn Ata Asp Asn Ser Lys Asn Qly Aia Ser Thr 6ly Val Ser 580 . 585 590

Asp Asn Val Phe Cys Asn Pro δΙυ Pro Pro Ala Ser Pro Thr Ser Val 59S 600 605

Thr Pro Pro Pro Pro Ala Thr Met Vai Ser Met He Me Pro Giy Leu 610 S1S 620

Gly Asp lie Glu Glu Met lie Val Val Asp Thr Ala Ala A$p Ata Asp 625 630 635 640

Ala Asp Ala Asp Ala Asp AI& Asp Ala Asp Asn Gly Glu Asp Glu Thr 645 650 655

Glu Val Aid Asp Val Leu QIu Leu Ser Ala Qly Qln Glu Phe Glu Pro 660 665 670 15- 120536.doc 200842189

Leu Glu Pro Ala Ser S«r Lys Thr Pro Lys Thr Pro Lys Qlu lie Lys 675 680 685

Lys Pro Qlu Qln Pro Lys Pro Arg Thr His Lys Asp Arg Asp Thr Arg 690 695 700

Asp Thr Arg Glu Arg 6lu ein Arg G!u 6lu Gin Val Val Are Pro Lys 705 710 715 720

Glu Arg Arg Glu Lys Asp Lys Lys Qlu Arg 6iu Arg Glu Glu Arg Arg 725 730 735

Arg 6iu Lys Ser Ser Lys His Ser Ser Arg Cys Thr Met Val Cys Glu 740 745 750

Thr Val Ala Glu Thr Ala Thr Pro Pro Pro Ser Arg Arg Ser Pro Asn 755 760 765

Met Pro Thr S时 Ser Pro Thr Thr Thr Pro Ala Thr Va丨 Gin Ser Val 770 775 780

Val Val Gin Fro Thr Pro Ser Pro Ser Ala Ser Nis Arg Pro Ser Lys 785 790 795 800 AU Lys Gin Gin 6ln Glu Asp Leu Lys Gin Ser Ala Qlu Ala Ala Arg 805 810 815

Leu Ala Met Met Glu Arg Glu Arg Glu kre Arg Arg Arg Asp Arg 6ln 820 825 830

Arg Ala Asp Ala A$p Ala filu Vai Ala Aia Uu Arg Asp Val Ala Leu 835 840 845

Qlu Arg Arg Arg 6ln 6Iu Arg 6ln Arg Qlu Ala Glu Glu Leu Glu Glu 850 855 860 16- 120536.doc 200842189

Ala Ala Leu Arg A^p Val Ala Leu Ala Ala Lys Gin lys Gly Lys Thr 865 870 875 880

Lys Ser Thr Ser Ser Lys Thr Pro Glu Thr Gin Gin Asn Val Ala Ala 885 890 895

Val Pro Val Thr Pro Thr Thr Leu Gin Asn Thr His Thr Ser Ser Pro 900 905 &10

Ser Ser Ala Ala Ala Qln Arg Pro Arg Thr Asp Ser Ser Ala Ala Ser 915 920 925 Γ

Ser Lys Asp Ser Ser Lys Asp Thr Lys Lys Asp Lys Ly$ Ala Thr Lys 930 935 940

Arg Glu Arg Cys Arg Glu A$p Glu Thr Pro Ser Ser Arg Arg Ar& Asp 945 950 955 960

Arg Ser Pro Thr Pro Pro Pro Lys Arg Arg Ser Pro Ala Pro Ser Ser 965 970 975

Ser Ser His Ser His Ser His Ser Gin Gin 6ln 6{n Pro 6ln Pro lie 980 985 990

Met Pro Gin Gly Gin Arg Met Ser Tyr Asp Glu 6ln Leu Ser He leu 995 1000 1005

Lys Gin Val Lys Asp Arg Val Met Gin Ala Ser Ala Lys Leu Pro 1010 1015 1020

Ala Leu Thr Ser Val Asp Tyr Asn Leu Arg Met Ala Ala Leu Ser 1025 1030 1035

Glu Gy冬 Arg Lys Asn Ser* Leu Ala Val Phe Val Asn Ala Leu Gin 1040 1045 1050 17- 120536.doc 200842189

Val Cys 6ly Ala Glu Thr Leu Trp Asn Ser Arg Ala 1055 1060 1065

Ala Leu Gin

Ala Ser lie Met Gin Asp 6ln Qlu Val Glu Pro Leu 1070 1075 1080

Pro Ala Ser

Val Val Thr Leu His lie He Met Gin His Ala Phe 1085 1090 1095 A$n Ly$ His

Qlu Phe Thr Leu Cys Ala Lys Phe Leu Pro Val Val 1100 1105 1110

Asn Ser Leu

Leu Thr Arg Met Ser Pro Ala Asp Vai Val Ser Tyr 1115 1120 1125

Met Met Ala

Arg Glu Arg Lys Asn Arg 6ly Asp Asp Vai His Glu 1130 1135 1140

Thr Ser Asp

Pro Het Qln Phe Glu Ser Pro lie Glu Arg Glu Leu 1145 1150 1155

Ser Glu Ala

Ser Ser Thr Leu Leu Cys Qtu Leu Tyr His Afa Asn 1160 1165 1170

Leu Ser Gly

Tyr Arg Gin His Thr Ala Thr Met Tyr Pro Trp Leu 1175 1180 1185

Leu Lys Cys

Leu Asn 6ly Πβ Leu Asp Ser Val Tyr Gly Lys Ala 1190 1195 1200

Gly Gly Thr

Ala Ala Met Ala Ala Asp Leu Leu Val Ala Leu Gtn 1205 1210 1215

Ly$ Ser Pro

Glu Leu Pro Ala Thr Asp Gly Ala Val lie Gly Ala 1220 1225 1230

Ser Thr Thr 120536.doc -18 - 200842189

Ser Met 6lu Val Thr Val Met Glu Met lie Gty Va! 1235 彳240 1245 lie Met Ala

Ala Arg His Arg Glu Ala Lys Leu leu Ala Glu lie 1250 1255 1260

Val Ser Met

Asp Phe Thr Gly Thr Asp Trp Ala Lys Phe Thr Thr 1265 1270 1275

Leu Ser Ser

Cln Uu Leu His Tyr Ala Ser Met Val Gin Val 1280 1285 1290

Trp Gly Asn

Asn Pro Pro Glu Val Leu Met Val Arg Gtu Glu Pro 1295 1300 1305

Leu Arg Trp

Met Phe Ala Val Lys Asn Arg Lys Uu Pro Tyr Thr 1310 1315 1320

Pro Phe Val

Pro S^r lie Thr Ser Uu Val Cys Thr Leu Arg Trp 1325 1330 1335

Leu His Ser

Phe Arg Pro Arg Arg Cys Leu Thr Ala Val Thr Glu 1340 1345 1350

His Tyr Val

Asn 6ln His Lys Ala Val Glu Arg Gly Asp Met Thr 1355 1360 1365

Ala Asp Glu

Val Ly$ Met Trp Arg Leu Asp Asp Asp Phe Ser 61 y 1370 1375 1380

Glu Val Arg

Ser Val Ala Leu Arg Asn Val Ser Tyr Uu Cys Thr 1385 1390 1395 6In Lys Pro

Phe Ala Thr Gly Ser Ser His Ala Val Arg Ala Glu 1400 1405 1410

Me Glu Pro 120536.doc 19- 200842189

Leu Val 6lu Asp Leu Arg Val 6ln Qln Arg Thr Thr Ala Ser Lys 1415 1420 1425

Val Pro Arg Lys Ser Ala Leu Ly$ Thr Pro Glu Pro Thr Thr Ala 1430 1435 1440

Thr Ala Ala Ala Thr Thr Gly 6ly Asp Ser Ser Asp Asp Glu Gin t445 1450 1455

Pro 6ln 6ln Gin Gin Arg Gly Arg Arg Val Arg Val Ser Ala Pro 1460 1465 1470

Ser Ser Arg Arg Ser Ser Arg Val Arg Ser Arg Ser Arg Ser Arg 1475 1480 1485

Val A$P Ser Asp Ser Asp Asp 6|y Leu Ser Thr Arg Ser Gly Ala 1490 1495 1500

Ser Ser Phe Ser Ser Arg Arg Tyr Ser Leu lie His Tyr Val PHe 1505 1510 1515

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Arg Arg Ser

Ser Thr Gly Ala Cys Pro Thr 35 200842189 tctcactctc ctctcccctc ttcacaacct cgaacoatgg cagcakoagc otcatcctcg cgacggcgac agcggcggcg actagatccc tagaggatac tcagactget ccctcaccco ggccgagctg cacaggcccc agatggtggo acagsgttcc ccttcacagt caagcacggc ggcgccgigt ccaccacctg agccccgagc gaccgotcga cggcttcacc cgcagcggcg tccacctcgc ttcadcctca ogcdccacca gctcttc辟o tao辟ccaog tcagggacca agftsctogg acgtgagggg agaggactcg gcccatcacg attttctctg cagaggtgsc ccgcgtgcga gtgcctcetg atcgccaggg agagcctcac cagtaccctc acgacgtcgt cotctcgcac ccctacgacg acatggactg aogctgcctg ocagdgacat cgtccccgag gcctsgaagg acatogagga cagacagdcg tgacccacac csacaa餅gg ggagagtgga uctottcac gtcgtcgacc acggcgtcga gggacaccac atcaaagaac acgtccggag tcgcgcgtga ggaaactcgt cgcgcagcac ctcgtaccca aatcctcatt cctcgagtag aaaccatcag agacsaacto tga

<210〉 8 <21t> 350 <212> PRT <213>錦鯉疱疼病毒 <400> 8

Met Pro Ser Ser Met Thr 6ty Ser Trp Ser Ser $er Ser Leu Arg 61 y 15 10 15

Ala Ala Ser Ser Ser Pro Ser Pro Pro Pro Cys 61y Ser 20 25 30

Arg Thr Ser Asn Asn Phe Pro Ser Thr 40 45 120536.doc -21 - 200842189

Cys Ala Arg Thr Ser Lys Leu Ser Pro Leu Ser Ser Pro Thr Leu Gin 50 55 60

Pro Ser Leu Pro Ser Ser Ala Ser Ser tie Leu Ala Pro Leu lie Ala 65 70 75 80

Ser His Ser Pro Leu Pro Ser Ser Gin Pro Arg Thr Met Ala Ala Ala 85 90 95

Ala lie Ala Vat Leu lie Leu Ala Thr Ala Thr Ala Ala Ala Thr Arg 100 105 110

Ser Leu 6lu Asp Thr Phe 6lu Gly Ser Asp Trp Ser Leu Thr Pro Ala 115 120 126

Glu Leu His Arg Pro 6ln Met Val Ala leu HU Arg Thr Gly Phe Pro 130 135 140

Phe Thr Vel Lys Hi$ 6ly Gly Ala Glu Ser Thr Thr Cys 6tn Cys fily 145 150 155 160

Ser Pro G!u Arg Pro Leu A$p Gly Phe Thr Arg Ser Gly Val His Leu 165 170 175

Ala Leu Arg Phe Phe Asn Leu Thr Hie His 6!n Leu Phe Asp Tyr Asp 180 185 190

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Asp Ser Ala His His Asp Phe Leu Cys Leu Ser Ala 6ln Arg Trp Pro 210 215 220

Ala Cys Gtu Cys Leu Met Ile Ala Arg Glu Ser Leu Thr Arg Pro Ser 225 230 235 240 22- 120536.doc 200842189

Gin Tyr Pro His Asp Val Val Leu Ser His Pro Tyr Asp Asp Met A$p 245 250 255

Trp Arg Arg Trp Thr Leu Pro Ala Arg Asp He Val Pro 6lu Ala Trp 260 265 270

Lys Αβρ Ile Glu Asp His Phe Phe Gin Thr Asp Val Thr His Thr Asp 275 280 285

Lys Arg Gly Glu Trp Met Leu Phe Thr Ala His Thr Val Val Asp His 290 295 300

Gly Val Glu Qly His His lie Lys Glu His Val Arg Arg Glu Gly Leu 305 310 315 320

Ser Arg Val Arg Ly$ Leu Val Ala Gin His Leu Val Pro Ly$ Ser Ser 325 330 335

Phe Ala Qln Tyr Pro Arg Val 6lu Thr lie Arg Asp Glu Leu 340 345 350 > > > > 0 12 3 ^ 1* 1» if 2 2 2 2 < < N/ < 699

DNA 錦鯉疱疹病毒 <400> 9 atgtctatgc gooogoaoaa caggcaatgg gacgcggggt gcceatcgat ttgcttcagc 60 gtcagtt^a tattctcaag gagggccaga' gtcagcccca gaacagccag cagcdgctgc 120 togoccagct ccagaagcag ctcgctoaac tocagoaaca gcaEcagcag tefta^tcct 180 ctcacccccc ccooccttga ccttcaccct tcacccctaa ccccaacaac caaocatgtc 240 ttcatocgcg acggcgttca goacctcggt ctacgccggg gacgttatga tgaccocggt 300 ggcogtcagc gtggtggcgc tcacgctcag cgocgtoaoo ttoatcatca tgctgatggc 360 catcgccatg oagcgctacc aactgtgcga ggacgacggc tgcaagaact gcgccaagaa 420 120536.doc 23- 480 200842189 540 600 660 699 ccagtacagg atggacatgo gtcgoaacaa gatgggctac cccgga«g«g gcggtggtgc gggaggctgc tacgacaacc agtgcttcat ggagaaegdg aatcccttca gcgcgocgcc accgccagcc tacaccatg£ gccagctgca ctctcgcgga ggacccttga tgatgggGoo cctgacggcc gctccgccag catcatcctc gacgcdgadc g〇8taaaagg gctggtggcg cccgcaogac ccgggtcaga gagaoggetc actcggtag <210〉 10 <211〉 232

<212> PRT <213〉錦鯉疱瘆病毒 <400> 10

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200842189

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<212> DNA <213〉錦鯉疱疹病毒 <400> 19 60 120 180 240 300 360 420 480 atggatgcac cggtcttctc ctccgctgct ctcaagtgcg gcaaoggcga gctacctdgg gcggtggtgg aacctggctc ccgogatgtg ggtatcaooa agaatotttc stacctttac ccgacgtcta gcttgtacag ggccaagoa? cggattccga ttaaacttga gatcgacggt ctccaacaag atgtgtccga gcgcctggct aaaattttac adggtcgeat ttecaotaaa ccacaattaa ^tacggagct cctcaagcag ctaccggagg cgtgcaggga tagggocgag gacctggccg atagcgccgc cgaggtcctg tcccacgcre cgcccttcao cgtcoactcg gtcogocagg ccotcatcag gtooctcttc tacgtgagag tggggacgct ggtggwwg ctcgtoaagc gcgagttcoa tagoaggagg ggacccatcg tcgcoagcct ctaccgctcc tacggctgga gacccatcga cgccggcatc gcc^tcacct ccaggagacc toagggacac 120536.doc -40- 540 200842189 coace^caca 600 gatcaagacc 660 gacotggata 720 ccacagctac 780 cccogctgtg 840 oototgottc 900 gaaaactcct 960 gcagtacocg 1020 1053 cgctgcagag tttgtggaga cgtotccccg gcagccttcg acggtaacca gagctggacg gcgtcgccac ogacgcggag ggoaaottta tcctcgtcga cacggaggcg ccaccgtcag cgccgctctc ctcaaccgct acaagaccca ggcgagtgca tgttcaggca cacgttcggc otctgctgot ccagoaacgt atcgtotttg toagccGcag cacctacacc atcgacagcg tgatccaggt cccaagcgcc tccaccccag actcttctcc gtgttccctt ccctccccaa gtcaggcgga ctcagaadcc ceagaggcct gctgctgcgc agdgacctgc ggagacagac ccgctcgecc ttcctcctcs gceggacaga cggcggcgaa caccgctact acaagaggaa gacagccgcc tga ✓v > > > 0 12 3 if 1· 1m 2 2 2 2 20 350

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Asp Arg Ala 6lu Asp Leu Ala Asp Ser Ala Ala Glu Val Leu Ser His 100 10S 110

Ala Ala Pro Phe Thr Val His Ser Val Arg Gin Ala Leu lie Arg Ser 115 120 125

Leu Phe Tyr Val Arg Val 61y Thr Leu Val Asp Thr Leu Val Lys Arg 130 135 140

Glu Phe Hi$ Ser Arg Arg 6ly Pro lie Val Ala Ser Leu Tyr Arg Ser 145 ISO 155 160

Tyr 6ly Trp Arg Pro lie Asp Ala 6ly lie Ala Val Thr Ser Arg Arg 165 170 175

Pro Gin Gly His Arg Cys Arg Val Cys Gly Asp Val Ser Pro Ala Ala '180 185 190

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Ala Giu Gly Asn Phe lie Uu Val Glu lie Lys Thr His Gly Gly Ala 210 215 220

Thr Val Ser Ala Ala Leu Leu Asn Arg Tyr Lys Thr Gin Thr Trp lie 225 230 235 240 / * i

Gly Glu Cys Met Phe Arg His Thr Phe Gly Leu Cys Cys Ser Ser Asn 245 250 255

Val His Ser Tyr lie Val Phe Val Ser Pro Ser Thr Tyr Thr Me Asp 260 265 270

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Gin Ly$ Pro Ly$ Arg Pro Ala Ala Ala Gin Arg Pro Ala Lys Thr Pro 305 310 315 320 6ly Asp Arg Pro Ala Arg Pro Ser Ser Ser Ala Gly Gin Thr Ala Ala 325 330 335

Lys Gin Tyr Pro His Arg Tyr Tyr Lys Arg Lys Thr Ala Ala 340 345 350 <210〉 21 <211> 20 <212> DNA <213〉人工 <2Z0> <223> KHV-g1-F <400> 21 atgcctgcca cctttggcag 20 ah 2220DN人 > /N > > o it 2 3 1W If 1» 2 2 2 2 y\ <220〉 <223> KHV-gHt <400> 22 tcaccccgca gaggtacoat 20 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <2Ϊ3>人工 43- 120536.doc <220〉 200842189 <223> KHV-g2-F <400> 23 atgtaccagc agcaatacoa 20

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<210〉 26 <211> 20 <212> DNA <213〉人工 <220> <223> KHV-g3-R <400> 26 tcagtaatag taatagttgt 20 <210> 27 <211〉 20 <212> DNA <213>人工 120536.doc 44- <220〉 200842189 <223〉 KHV-g4- F <400> 27 atgccgtcga gcatgactgg <210〉 28 <211〉 20 <212> DNA <213>人工 <220〉 <223> KHV-g4-R <400> 28 20 tcagagttcg tctctgatgg <210〉 29 <211〉 20 <212〉 DNA <213〉人工 <220> <223〉 KHV-g5_F <400> 29 20 atgtctatgd gcccgcacaa

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Claims (1)

1. 200842189 十、申請專利範圍： 1· 一種DNA，其係將以下（a)、（b)<(c)之蛋白質編碼者， ⑷包含序列編號2、4、6、8或1〇所示之胺基酸序列的 錦鯉疱疹病毒（KHV)之糖蛋白； (b) 包含序列編號2、4、6、8或10所示之胺基酸序列中 1或數個胺基酸缺失、被取代或被加成之胺基酸序列， 且對錦鯉疱疹病毒（KHV)具有免疫原性之蛋白質； (c) 包έ與序列編號2、4、6、8或10所示之胺基酸序列 ，具有至少80%以上之同源性的胺基酸序列，且對錦鯉疱 療病毒（KHV)具有免疫原性之蛋白質。 2· 一種DNA，其包含序列編號i、3、5、7或9所示之鹼基 序列或其互補序列。 3· 一種DNA，其包含序列編號1、3、5、7或9所示之鹼基 序列中1或數個驗基缺失、被取代或被加成的驗基序 列’且編碼對錦經疱疹病毒（KHV)具有免疫原性的蛋白 質。 4· 一種DNA，其於嚴格條件下與包含序列編號1、3、5、7 或9所示之鹼基序列之互補序列的DNA雜交，且編碼對 錦缠疱疹病毒（KHV)具有免疫原性的蛋白質。 5· —種DNA，其係將以下（句、（勾或⑴之蛋白質編碼者， (d) 包含序列編號12' 14、16、18或20所示之胺基酸序 列的錦鯉疱疹病毒（KHV)之膜蛋白質； (e) 包含序列編號12、14、16、18或20所示之胺基酸序 列中1個或數個胺基酸缺失、被取代或被加成的胺基酸 120536.doc 200842189 序列’且對錦鯉疱疹病毒（KHV)具有免疫原性的蛋白 質； (f)包含與序列編號12、14、16、18或20所示之胺基酸 序列具有至少80%以上之同源性的胺基酸序列，且對錦 鯉疱疹病毒（KHV)具有免疫原性的蛋白質。 6· 一種DNA，其包含序列編號11、13、15、17或19所示之 鹼基序列或其互補序列。 7· —種DNA，其包含序列編號11、13、15、17或19所示之 鹼基序列中1個或數個鹼基缺失、被取代或被加成的鹼 基序列，且編碼對錦鯉疱疹病毒（KHV)具有免疫原性的 蛋白質。 8· —種DNA，其於嚴格條件下與包含序列編號u、13、 15、17或19所示之鹼基序列之互補序列的DNA雜交，且 編碼對錦鯉疱疹病毒（KHV)具有免疫原性的蛋白質。 9· 一種錦鯉疱疹病毒（KHV)之糖蛋白，其包含序列編號2、 4、6、8或1 0所示之胺基酸序列。 10· —種蛋白質，其包含序列編號2、4、6、8或10所示之胺 基酸序列中1個或數個胺基酸缺失、被取代或被加成的 胺基酸序列，且對錦鯉疱疹病毒（KHV)具有免疫原性。 11· 一種錦鯉疱疹病毒（KHV)之膜蛋白質，其包含序列編號 12、14、16、18或20所示之胺基酸序列。 12· —種蛋白質，其包含序列編號12、14、16、18或20所示 之胺基酸序列中1個或數個胺基酸缺失、被取代或被加成 的胺基酸序列，且對錦鯉疱疹病毒（KHV)具有免疫原性。 120536.doc

   200842189 13. —種重組載體，其含有自如請求項1至8中任一項之DNA 中選擇的1個或2個以上之DNA。 14. 一種錦鯉用DNA疫苗，其含有自如請求項1至8中任一項 之DNA中選擇的1個或2個以上之DNA。 15· —種錦鯉用DNA疫苗，其含有如請求項π之重組載體。 16. —種預防或治療錦鯉疱疹病毒（Khv)疾病之方法，其特 欲在於·對錦經投與如請求項14或15之錦經用DNA疫 苗。 17. —種如請求項14或15之錦鯉用苗之使用方法，其 係使用如請求項14或15之錦鯉用DNA疫苗而誘發對於錦 經之錦無疱疹病毒（KHV)病的免疫反應。 18· 一種抗體’其特徵在於：其可特異性識別如請求項9至 12中任一項之蛋白質。 種：錦經疮療病毒(KHV)具有抵抗性之基因轉瘦錦經 、、特徵在於：其係藉由對如請求項9至12中任一項 之蛋白質之基因表現載體進行基因導入而獲得。、 120536.doc