JP5239023B2 - コイヘルペスウイルス（ｋｈｖ）病用ｄｎａワクチン - Google Patents

Description

本発明は、コイヘルペスウイルス（Koi herpesvirus；ＫＨＶ）の魚類への感染症に対する防御免疫を誘導するためのＤＮＡワクチンに関する。

コイヘルペスウイルス病は、コイヘルペスウイルス（ＫＨＶ）に感染することによりマゴイやニシキゴイに発生する病気で、発病すると行動が緩慢になったり餌を食べなくなるが、目立った外部症状は少なく、鰓の退色やびらん（ただれ）などが見られ、幼魚から成魚までに発生し、死亡率が高い病気である。

前記コイヘルペスウイルス病は、１９９８年５月にイスラエルにて、最初の発症の報告がなされた。その後、同じイスラエルにおいて、その年の秋と翌年の春との２度発症し、輸出用のコイを含めて約６００トンのコイが死滅した。被害総額は４００万ドルを超えるものであった。その後も世界各国（イスラエル、英国、ドイツ、オランダ、ベルギー、米国、インドネシア、台湾）で次々と発症の報告がなされた。

わが国においても２００３年（平成１５年）１１月に農林水産省が茨城県の霞ヶ浦においてコイヘルペスウイルス病を疑うコイを確認したと発表して以来、青森、山梨、三重、岡山、宮崎と各地でコイヘルペスウイルス病の発生が報告されている。農林水産省でも感染経路の特定をはじめとして、この病気の拡散防止について努めているところである。

細菌感染に関しては、いくつかの魚介類用ワクチンが開発されているものの、ウイルス性疾患又は寄生性疾患に効果のあるワクチンは、サケ科魚類の一部及びスズキ目のイリドウイルスに対するワクチン（例えば、特許文献１参照。）が開発されているのみでほとんど開発されていない。

ウイルス感染症の予防又は治療には、一般的にワクチンが使用されている。ワクチンには不活化ワクチン（日本脳炎、ワイル病など）、トキソイド（破傷風、ジフテリアなど）、弱毒ワクチン（ＢＣＧ、ポリオなど）、遺伝子組換えワクチン（Ｂ型肝炎ウイルスなど）などがある。不活化ワクチン及び外毒素を無毒化したトキソイドは、これらに対する抗体を誘導する比較的安全なワクチンである。遺伝子組換えワクチンは、不活化ワクチンと比較すると、不純物を含まないので、より安全なワクチンと考えられている。また、現在わが国で水産用ワクチンとして認可されているのは、ビブリオ病不活性化ワクチン、α溶血性レンサ球菌症不活性化ワクチン、イリドウイルス感染症不活性化ワクチン、β溶血性レンサ球菌不活性化ワクチンのみである。

しかしながら、これらのワクチンにおいて抗体産生は誘導することができるが、細胞性免疫は誘導されにくいのが欠点である。また、不活化ワクチン及び弱毒ワクチンは、抗原となるウイルスを産業的には大量に得ることが必要であり、適当な細胞の確保が必須である。更に、弱毒ワクチンで獲得した免疫効果は、長期間維持される場合が多いが、一方で副作用、危険性が指摘されている。不活化ワクチン及び遺伝子組換えワクチンは、抗原の持続性が宿主内において短いと考えられており、アジュバントなどを必要とする。これら従来型のワクチンは製造から被検体に接種するまでの間、冷蔵保存する必要があるため、コストの増加と効力の低下が生じる問題点があった。

最近、ワクチンの研究開発が進み、免疫原性タンパク質をコードするプラスミドＤＮＡの投与をすることにより、免疫誘発をもたらす新しいワクチン種（ＤＮＡワクチン）が開発され、次に述べるような従来型ワクチンの不利益が改善されてきている。すなわち、ＤＮＡワクチンは、体液性免疫応答のみならず、細胞性免疫を強力に誘導できるので、感染症に対する防御能を賦与することが可能となること、また、高度に純化できること、室温又は高温下でも安定であり、冷蔵保存は必須でなく長期間の貯蔵が可能であること、遺伝子工学的手法によりＤＮＡワクチンの迅速な改良がし易いこと、及びワクチン開発に費やす時間の短縮などの利点がある。

例えば、ラブドウイルス（Rhabdovirus）の構成タンパク質のグリコプロテインをコードしている遺伝子を筋肉に注射することによって、ニジマスの免疫応答を刺激すること（例えば、非特許文献１参照。）や、ＤＮＡワクチンについて報告がなされている（例えば、非特許文献２参照。）。また、ヒラメのウイルス性出血性敗血症に対するＤＮＡワクチン（例えば、特許文献２参照。）や、伝染性造血器壊死症（ＩＨＮ）ウイルスのアポトーシス誘導タンパク質をコードするウイルスに対するＤＮＡワクチン（例えば、特許文献３参照。）や、免疫原性ポリペプチドの発現を誘導しうる遺伝子発現系を用いた養殖種用ＤＮＡワクチン（例えば、特許文献４参照。）などが提案されている。しかし、コイのコイヘルペスウイルス病に対する防御免疫を刺激するためのＤＮＡワクチンの報告はない。

特開平９−１７６０４３号公報 特開２００５−１１２７２６号公報 特開２００２−１２５６７４号公報 特開平９−２８５２９１号公報 P．Boudinot et.al ，Virology,（USA），1998，Vol.249，p.297-306 McLauchlan et.al，Fish and Shellfish Immunology ,England，2003，Vol.15，p.39-50

本発明の課題は、コイヘルペスウイルス（ＫＨＶ）病に対する防御免疫を誘導するためのコイ用ＤＮＡワクチンを提供することにある。

本発明者らは、コイヘルペスウイルス（ＫＨＶ）病に対する有効なワクチンを開発するために鋭意研究し、日本、アメリカ、イスラエル、インドネシアの各コイヘルペスウイルス（ＫＨＶ）遺伝子ＤＮＡの全塩基配列を決定し、約１８０ある遺伝子の中から、コイヘルペスウイルス（ＫＨＶ）のグリコプロテインをコードする５種類の遺伝子や膜タンパク質をコードする５種類の遺伝子を選択し、これらの遺伝子を組み込んだプラスミドＤＮＡをコイに接種（筋肉注射）したところ、コイのコイヘルペスウイルス（ＫＨＶ）に対する免疫効果を有することを見い出し、本発明を完成するに至った。

すなわち本発明は、（１）コイヘルペスウイルス（ＫＨＶ）のタンパク質をコードするＤＮＡを含むコイ用ＤＮＡワクチンであって、前記タンパク質が、（ａ）配列番号２、４、６、８、又は１０に示されるアミノ酸配列からなるＫＨＶのタンパク質；（ｂ) 配列番号１２、１４、１６、１８、又は２０に示されるアミノ酸配列からなるＫＨＶのタンパク質；（ｃ）配列番号２、４、６、８、又は１０に示されるアミノ酸配列において、１〜２０個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＫＨＶに対する免疫原性を有するタンパク質；（ｄ）配列番号１２、１４、１６、１８、又は２０に示されるアミノ酸配列において、１〜２０個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＫＨＶに対する免疫原性を有するタンパク質；の（ａ）〜（ｄ）のいずれかであるコイ用ＤＮＡワクチンコイ用ＤＮＡワクチンや、（２）ＤＮＡが、（ｅ）配列番号１、３、５、７、又は９に示される塩基配列、又はその相補的配列からなるＤＮＡ；（ｆ）配列番号１１、１３、１５、１７、又は１９に示される塩基配列、又はその相補的配列からなるＤＮＡ；（ｇ）配列番号１、３、５、７、又は９に示される塩基配列において、１〜２０個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつＫＨＶに対する免疫原性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、又はその相補的配列からなるＤＮＡ；（ｈ）配列番号１１、１３、１５、１７、又は１９に示される塩基配列において、１〜２０個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつＫＨＶに対する免疫原性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、又はその相補的配列からなるＤＮＡ；の（ｅ）〜（ｈ）のいずれかである上記（１）記載のワクチンや、（３）ＤＮＡが、発現ベクターに組み込まれていることを特徴とする上記（１）又は（２）記載のワクチンに関する。

また本発明は、（４）上記（１）〜（３）のいずれかに記載のコイ用ＤＮＡワクチンをコイに投与することを特徴とする、コイヘルペスウイルス（ＫＨＶ）病の予防又は治療方法に関する。

さらに本発明は、（５）上記（１）〜（３）のいずれかに記載のコイ用ＤＮＡワクチンの、コイのコイヘルペスウイルス（ＫＨＶ）病に対する免疫応答の誘発への使用方法に関する。

ＫＨＶ感染症に対するＤＮＡワクチン試験結果を示す図である。（Ａ）５種類のグリコプロテイン遺伝子それぞれを投与した場合の試験結果（Ｂ）３種類の膜タンパク質遺伝子それぞれを投与した場合の試験結果 ＫＨＶ感染症に対するＤＮＡ混合ワクチンを用いた試験結果を示す図である。縦軸は累積死亡率を、横軸はＫＨＶ感染後の日数を示した。Group1は陰性コントロール試験区Group2は膜プロテイン試験区Group3はグリコプロテイン試験区

本発明のＤＮＡとしては、(ａ)配列番号２，４，６，８又は１０に示されるアミノ酸配列からなるコイヘルペスウイルス（ＫＨＶ）のグリコプロテインをコードするＤＮＡや、(ｂ)配列番号２，４，６，８又は１０に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつコイヘルペスウイルス（ＫＨＶ）に対する免疫原性を有するタンパク質をコードするＤＮＡや、（ｃ）配列番号２，４，６，８又は１０に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつコイヘルペスウイルス（ＫＨＶ）に対する免疫原性を有するタンパク質をコードするＤＮＡや、配列番号１，３，５，７又は９に示される塩基配列若しくはその相補的配列からなるＤＮＡや、配列番号１，３，５，７又は９に示される塩基配列において、１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつコイヘルペスウイルス（ＫＨＶ）に対する免疫原性を有するタンパク質をコードするＤＮＡや、配列番号１，３，５，７又は９に示される塩基配列に相補的な配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつコイヘルペスウイルス（ＫＨＶ）に対する免疫原性を有するタンパク質をコードするＤＮＡや、(ｄ)配列番号１２，１４，１６，１８又は２０に示されるアミノ酸配列からなるコイヘルペスウイルス（ＫＨＶ）の膜タンパク質をコードするＤＮＡや、(ｅ)配列番号１２，１４，１６，１８又は２０に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつコイヘルペスウイルス（ＫＨＶ）に対する免疫原性を有するタンパク質をコードするＤＮＡや、（ｆ）配列番号１２，１４，１６，１８又は２０に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつコイヘルペスウイルス（ＫＨＶ）に対する免疫原性を有するタンパク質をコードするＤＮＡや、配列番号１１，１３，１５，１７又は１９に示される塩基配列若しくはその相補的配列からなるＤＮＡや、配列番号１１，１３，１５，１７又は１９に示される塩基配列において、１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつコイヘルペスウイルス（ＫＨＶ）に対する免疫原性を有するタンパク質をコードするＤＮＡや、配列番号１１，１３，１５，１７又は１９に示される塩基配列に相補的な配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつコイヘルペスウイルス（ＫＨＶ）に対する免疫原性を有するタンパク質をコードするＤＮＡであれば特に制限されるものでなく、また、本発明のタンパク質としては、配列番号２，４，６，８又は１０に示されるアミノ酸配列からなるコイヘルペスウイルス（ＫＨＶ）のグリコプロテインや、配列番号２，４，６，８又は１０に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつコイヘルペスウイルス（ＫＨＶ）に対する免疫原性を有するタンパク質や、配列番号１２，１４，１６，１８又は２０に示されるアミノ酸配列からなるコイヘルペスウイルス（ＫＨＶ）の膜タンパク質や、配列番号１２，１４，１６，１８又は２０に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつコイヘルペスウイルス（ＫＨＶ）に対する免疫原性を有するタンパク質であれば特に制限されず、本発明において、コイヘルペスウイルス（ＫＨＶ）に対する免疫原性を有するタンパク質とは、コイ生体内に入った場合にコイヘルペスウイルス（ＫＨＶ）に対する免疫（体液性免疫及び細胞性免疫を含む）応答を生体内で刺激・誘導することができるタンパク質をいう。

上記「１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列」とは、例えば１〜２０個、好ましくは１〜１５個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個の任意の数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を意味する。また、上記「１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列」とは、例えば１〜２０個、好ましくは１〜１５個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個の任意の数の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を意味する。

例えば、これら１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるＤＮＡ（変異ＤＮＡ）は、化学合成、遺伝子工学的手法、突然変異誘発などの当業者に既知の任意の方法により作製することもできる。具体的には、配列番号１，３，５，７又は９に示される塩基配列からなるＤＮＡや、配列番号１１，１３，１５，１７又は１９に示される塩基配列を含むＤＮＡに対し、変異原となる薬剤と接触作用させる方法、紫外線を照射する方法、遺伝子工学的な手法等を用いて、これらＤＮＡに変異を導入することにより、変異ＤＮＡを取得することができる。遺伝子工学的手法の一つである部位特異的変異誘発法は特定の位置に特定の変異を導入できる手法であることから有用であり、Molecular Cloning: A Laboratory Mannual, 3rd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY.,2001.（以後"モレキュラークローニング第３版" と略す）、CurrentProtocols in Molecular Biology, Supplement 1〜38,John Wiley & Sons (1987-1997)等に記載の方法に準じて行うことができる。この変異ＤＮＡを適切な発現系を用いて発現させることにより、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質を得ることができる。

上記「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列」とは、ＤＮＡ又はＲＮＡなどの核酸をプローブとして使用し、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法、あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られる塩基配列を意味し、具体的には、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡまたは該ＤＮＡの断片を固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０ＭのＮａＣｌ存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍程度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウム）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるＤＮＡをあげることができる。ハイブリダイゼーションは、モレキュラークローニング第３版等に記載されている方法に準じて行うことができる。

すなわち、ストリジェントな条件下とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいい、具体的には、５０〜７０％以上の相同性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いＤＮＡ同士がハイブリダイズしない条件あるいは通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である６５℃、１× ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、又は０．１× ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度でハイブリダイズする条件を挙げることができる。例えば、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができるＤＮＡとしては、プローブとして使用するＤＮＡの塩基配列と一定以上の相同性を有するＤＮＡが挙げることができ、例えば６０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上の相同性を有するＤＮＡを好適に例示することができる。

本発明のＤＮＡの取得方法や調製方法は特に限定されるものでなく、本明細書中に開示した配列番号１，３，５，７又は９、あるいは、１１，１３，１５，１７又は１９に示される塩基配列情報や、配列番号２，４，６，８又は１０、あるいは、配列番号１２，１４，１６，１８又は２０に示されるアミノ酸配列に示されるアミノ酸配列情報に基づいて適当なプローブやプライマーを調製し、それらを用いて、コイヘルペスウイルス（ＫＨＶ）のＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより目的の遺伝子を単離したり、常法に従って化学合成により調製することができる。

本発明のタンパク質の取得・調製方法は特に限定されず、天然由来のタンパク質でも、化学合成したタンパク質でも、遺伝子組換え技術により作製した組換えタンパク質の何れでもよい。天然由来のタンパク質を取得する場合には、かかるタンパク質を発現している細胞又は組織からタンパク質の単離・精製方法を適宜組み合わせることにより、本発明のタンパク質を取得することができる。化学合成によりタンパク質を調製する場合には、例えば、Ｆｍｏｃ法(フルオレニルメチルオキシカルボニル法)、ｔＢｏｃ法(t−ブチルオキシカルボニル法)等の化学合成法に従って本発明のタンパク質を合成することができる。また、各種の市販のペプチド合成機を利用して本発明のタンパク質を合成することもできる。遺伝子組換え技術によりタンパク質を調製する場合には、該タンパク質をコードする塩基配列からなるＤＮＡを好適な発現系に導入することにより本発明のタンパク質を調製することができる。これらの中でも、比較的容易な操作でかつ大量に調製することが可能な遺伝子組換え技術による調製が好ましい。

例えば、遺伝子組換え技術によって、本発明のタンパク質を調製する場合、かかるタンパク質を細胞培養物から回収し精製するには、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈殿、酸抽出、アニオンまたはカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィーを含めた公知の方法、好ましくは、高速液体クロマトグラフィーが用いられる。特に、アフィニティークロマトグラフィーに用いるカラムとしては、例えば、本発明のタンパク質に対するモノクローナル抗体等の抗体を結合させたカラムや、上記本発明のタンパク質に通常のペプチドタグを付加した場合は、このペプチドタグに親和性のある物質を結合したカラムを用いることにより、これらのタンパク質の精製物を得ることができる。また、本発明のタンパク質が細胞膜に発現している場合は、細胞膜分解酵素を作用させた後、上記の精製処理を行うことにより精製標品を得ることができる。

さらに、配列番号２，４，６，８又は１０、あるいは、配列番号１２，１４，１６，１８又は２０に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号２に示されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質は、配列番号２，４，６，８又は１０、あるいは、配列番号１２，１４，１６，１８又は２０に示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列の一例をそれぞれ示す配列番号１，３，５，７又は９、あるいは、配列番号１１，１３，１５，１７又は１９に示される塩基配列の情報に基づいて当業者であれば適宜調製又は取得することができる。

本発明の組換えベクターとしては、前記本発明の遺伝子ＤＮＡを含み、かつコイヘルペスウイルス（ＫＨＶ）に対する免疫原性を有するタンパク質をコイの生体内で発現することができる組換えベクターであれば特に制限されず、本発明の組換えベクターは、本発明の遺伝子ＤＮＡを発現ベクターに適切にインテグレイトすることにより構築することができる。発現ベクターとしては、宿主細胞において自立複製可能であるものや、あるいは宿主細胞の染色体中へ組込み可能であるものが好ましく、また、本発明の遺伝子を発現できる位置にプロモーター、エンハンサー、ターミネーター等の制御配列を含有しているものを好適に使用することができる。発現ベクターとしては、動物細胞用発現ベクター、特に魚類細胞用発現ベクターを用いた組換えベクターが好ましく、本発明に用いることのできる発現ベクターの構築の手順及び方法は、遺伝子工学の分野で慣用されているものを用いることができる。

本発明で用いることのできる制御配列としては、例えば、構成プロモーター、誘導性又は調節性プロモーター、組織特異的プロモーター、又は発現されている抗原の遺伝子由来のプロモーター等が挙げられるが、魚類の細胞内で発現可能である限り、特にそれらに限定されない。構成プロモーターとしては、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）由来のプロモーター配列、又はラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、シミアンウイルス−４０（ＳＶ-４０）、筋βアクチンプロモーター、又は単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）などの強力プロモーター等が挙げられる。組織特異的プロモーターとしては、例えば、チミヂンキナーゼプロモーター等が挙げられる。誘導性又は調節性プロモーターとしては、例えば、成長ホルモン調節性プロモーター、ｌａｃオペロン配列の制御下にあるプロモーター、又は亜鉛誘導性メタロチオネインプロモーターを挙げることができる。前記転写調節配列は、免疫原性ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に、操作可能に（すなわち、前記ヌクレオチド配列の発現を調節することができるように）結合させることができる。

前記制御配列は、プロモーター（例えば、前記誘導性又は構成性プロモーター）ＤＮＡ配列を含む発現制御配列を含むことができ、所望により、更に、エンハンサー要素、転写又はポリアデニル化シグナル［例えば、シミアンウイルス−４０（ＳＶ−４０）又はウシ成長ホルモン由来］のスプライシングのためのイントロン配列、又はＣｐＧモチーフとして知られている免疫刺激ＤＮＡ配列のうち、１つ若しくはそれ以上のコピーを含むことができる。

また、発現ベクターは、所望により、例えば、細菌複製起点配列、あるいは、選別させるための抗生物質耐性（例えば、カナマイシンなど）遺伝子又は非抗生物質耐性遺伝子（例えば、β−ガラクトシダーゼ遺伝子など）等の選択性マーカーを含むことができる。

本発明のコイ用ＤＮＡワクチンとしては、前記本発明のＤＮＡの中から選ばれる１又は２以上のＤＮＡを含む組成物や、上記本発明の組換えベクターを含む組成物であれば特に制限されないが、配列番号１，３，５，７及び９に示される塩基配列からなる５種類のＤＮＡのカクテルや、配列番号１１，１３，１５，１７及び１９に示される塩基配列からなる５種類のＤＮＡのカクテルや、これら１０種類のＤＮＡのカクテルや、これらのＤＮＡカクテルを発現することができる組換えベクターが好ましい。また、本発明のコイ用ＤＮＡワクチンにアジュバントを添加・配合することができる。アジュバントは、免疫系を刺激して抗原に対する免疫反応を高めるものであり、主にワクチンに補助剤として添加される。代表的なアジュバントとしては、例えば、アルミニウム化合物、ポリヌクレオチド又は細菌の菌体成分などが知られているが、コイＩＬ−１βやゼブラＩＦＮ−α等を好適に例示することができ、これらはコイの体内で発現可能なようにＩＬ-１β遺伝子やＩＦＮ−α遺伝子を挿入したプラスミドを作製し、本発明のワクチンとともに魚類に接種することもできる。

本発明のコイ用ＤＮＡワクチンをコイに投与することで、コイのコイヘルペスウイルス（ＫＨＶ）病に対する免疫応答を誘発することができ、コイヘルペスウイルス（ＫＨＶ）病の予防又は治療をすることができる。本発明のコイ用ＤＮＡワクチンを適応することができる魚類としては、コイヘルペスウイルス（ＫＨＶ）が感染する可能性のある魚類である限り、特に限定されるものではないが、例えば、マゴイやニシキゴイを具体的に挙げることができる。

本発明のタンパク質に特異的に結合する抗体としては、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、ヒト化抗体等の免疫特異的な抗体を具体的に挙げることができ、これらは上記グリコプロテインや膜タンパク質を抗原として用いて常法により作製することができるが、その中でもモノクローナル抗体がその特異性の点でより好ましい。かかるモノクローナル抗体等の本発明のタンパク質に特異的に結合する抗体は、例えば、本発明のタンパク質の分離・定量や、本発明のタンパク質の分子機構を明らかにする上で有用である。

本発明のタンパク質に対する抗体は、慣用のプロトコールを用いて、動物（好ましくはヒト以外）に該タンパク質若しくはエピトープを含む断片、又は該タンパク質を膜表面に発現した細胞を投与することにより産生され、例えばモノクローナル抗体の調製には、連続細胞系の培養物により産生される抗体をもたらす、ハイブリドーマ法（Nature 256, 495-497, 1975）、トリオーマ法、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ法（Immunology Today 4, 72,1983）及びＥＢＶ−ハイブリドーマ法（Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, pp.77-96, Alan R.Liss, Inc., 1985）など任意の方法を用いることができる。

また上記本発明のモノクローナル抗体等の抗体に、例えば、ＦＩＴＣ（フルオレセインイソシアネート）又はテトラメチルローダミンイソシアネート等の蛍光物質や、^１２５Ｉ、^３２Ｐ、^１４Ｃ、^３５Ｓ又は^３Ｈ等のラジオアイソトープや、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ又はフィコエリトリン等の酵素で標識したものや、グリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）等の蛍光発光タンパク質などを融合させた融合タンパク質を用いることによって、上記タンパク質の機能解析を行うことができる。また免疫学的測定方法としては、ＲＩＡ法、ＥＬＩＳＡ法、蛍光抗体法、プラーク法、スポット法、血球凝集反応法、オクタロニー法等の方法を挙げることができる。

本発明のコイヘルペスウイルスに抵抗性を有するトランスジェニックコイ類としては、１又は２以上の本発明のタンパク質の遺伝子発現ベクターを遺伝子導入することによって得られるトランスジェニックコイ類であれば特に制限されず、コイ類に、１又は２以上の本発明のタンパク質遺伝子を導入する発現ベクターを構築する場合、本発明のタンパク質遺伝子をコイ類細胞で効率よく発現するプロモーターの下流に連結した発現ベクターを作製することが好ましい。かかるプロモーターとしては、β−アクチンプロモーター、adipocyteP2(aP2)プロモーター、Mylz2 (Danio rerio myosin light polypeptide 2 skeletalmuscle mylz2) プロモーター、UCPプロモーター、SV40プロモーター、サイトメガウイルスプロモーター、ＥＦ１αプロモーター、メタロチオネインプロモーター、熱ショックプロモーター等を例示することができるが、中でもメダカβ−アクチンプロモーターや、mylz2プロモーターが発現効率の点で好ましい。また、ｍＲＮＡを安定化させるために、本発明のタンパク質遺伝子の下流にウシ成長ホルモンポリアデニル化配列等のポリアデニル化配列を連結することが好ましい。その他必要に応じて、遺伝子の発現を増強させる機能を持つイントロン配列やエンハンサー配列、転写終結を指令するターミネーター配列を用いることもできる。構築した発現ベクターのコイ類への導入は、卵母細胞又は受精卵へのマイクロインジェクション法、ウイルスベクター感染法、パーティクルガン法、エレクトロポレーション法によって行うことができる。なお、本発明のトランスジェニックコイ類には、本発明のタンパク質遺伝子が導入されたコイ成体、その子孫の他、コイ受精卵細胞、コイ胚細胞なども便宜上含まれる。

以下、実施例によって本発明を具体的に詳述するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。

我々がゲノム解析を行った日本、アメリカおよびイスラエルで分離されたＫＨＶのゲノムにコードされている５種類のグリコプロテイン遺伝子と５種類の膜タンパク質遺伝子の翻訳開始コドンから翻訳終止コドンまでをポリメラーゼ連鎖反応（Polymerase chain reaction：ＰＣＲ）により増幅した。使用したプライマーセットを表１に示した。ＰＣＲの際の鋳型ＤＮＡは日本で分離されたＫＨＶ−Ｊを用いた。ＰＣＲの条件は、９５℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で３０秒を１サイクルとし、３０サイクル行った。

ＰＣＲ増幅ＤＮＡを遺伝子発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１にクローン化し、大腸菌へ導入した。この形質転換大腸菌を大量培養し、プラスミドＤＮＡを抽出精製した。プラスミドの精製は塩化セシウムを用いた超遠心法（モレキュラークローニング第３版）により行った。

ワクチン試験はコイ１尾あたり５０μｇのＤＮＡを１００μＬのリン酸緩衝液（phosphate buffered saline：ＰＢＳ）とともに、注射器を用いコイの背部筋肉へと接種した。この際、各種グリコプロテイン遺伝子及び膜タンパク質遺伝子をそれぞれ接種した。陰性コントロールとしてベクタープラスミドＤＮＡのみを接種した。ワクチン接種後３０日間は循環濾過式水槽で２３℃にて飼育した。

感染実験は、ＫＨＶ感染コイの鰓をＰＢＳ中でホモジナイズし、０．２２μmフィルターで濾過した液をコイ１尾あたり１００μＬ接種した。ウイルス液接種後、コイは循環濾過式水槽で２３℃にて飼育した。

ＫＨＶ感染後、コイを１２日間観察し続け、コイの累積死亡率を算出し、その結果を図１に示した。試験の結果、コントロール区のコイは約５０％の累積死亡率であったのに対し、ワクチン試験区での累積死亡率は約１３−４０（グリコプロテイン）、１４−４０（膜タンパク質）％であったことから、ＫＨＶ感染に対するＤＮＡワクチンの感染防御の有効性、すなわちワクチン効果が明らかとなった。

前記の方法と同様にワクチン試験を行った。この際、５種類のグリコプロテイン遺伝子(group2)と５種類の膜タンパク質遺伝子(group3)をそれぞれ混合して接種した。陰性コントロールとしてベクタープラスミドＤＮＡのみ(group1)を接種した。ワクチン接種後３０日間は循環濾過式水槽で２３℃にて飼育し、前記記載と同様に感染実験を行った。

ＫＨＶ感染後、コイを３週間観察し続け、コイの累積死亡率を算出し、その結果を図２に示した。試験の結果、コントロール区のコイは約６０％の累積死亡率であったのに対し、ワクチン試験区での累積死亡率は約１０−２０％であったことから、ＫＨＶ感染に対するＤＮＡワクチンの感染防御の有効性、すなわちワクチン効果が明らかとなった。

本発明のコイ用ＤＮＡワクチンによれば、コイヘルペスウイルス（ＫＨＶ）によるコイヘルペスウイルス病に対する免疫能を付与することができる。より詳細には、本発明のコイ用ＤＮＡワクチンによれば、コイヘルペスウイルス病に対する免疫応答（体液性免疫応答及び細胞性免疫応答を含む）を誘導することができるので、コイヘルペスウイルス（ＫＨＶ）の感染の予防又はコイヘルペスウイルス病の治療に有効である。

Claims (5)

1. コイヘルペスウイルス（ＫＨＶ）のタンパク質をコードするＤＮＡを含むコイ用ＤＮＡワクチンであって、前記タンパク質が以下の（ａ）〜（ｄ）のいずれかであるワクチン。
   （ａ）配列番号２、４、６、８、又は１０に示されるアミノ酸配列からなるＫＨＶのタンパク質；
   （ｂ) 配列番号１２、１４、１６、１８、又は２０に示されるアミノ酸配列からなるＫＨＶのタンパク質；
   （ｃ）配列番号２、４、６、８、又は１０に示されるアミノ酸配列において、１〜２０個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＫＨＶに対する免疫原性を有するタンパク質；
   （ｄ）配列番号１２、１４、１６、１８、又は２０に示されるアミノ酸配列において、１〜２０個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＫＨＶに対する免疫原性を有するタンパク質；
2. ＤＮＡが、以下の（ｅ）〜（ｈ）のいずれかである請求項１記載のワクチン。
   （ｅ）配列番号１、３、５、７、又は９に示される塩基配列、又はその相補的配列からなるＤＮＡ；
   （ｆ）配列番号１１、１３、１５、１７、又は１９に示される塩基配列、又はその相補的配列からなるＤＮＡ；
   （ｇ）配列番号１、３、５、７、又は９に示される塩基配列において、１〜２０個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつＫＨＶに対する免疫原性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、又はその相補的配列からなるＤＮＡ；
   （ｈ）配列番号１１、１３、１５、１７、又は１９に示される塩基配列において、１〜２０個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつＫＨＶに対する免疫原性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、又はその相補的配列からなるＤＮＡ；
3. ＤＮＡが、発現ベクターに組み込まれていることを特徴とする請求項１又は２記載のワクチン。
4. 請求項１〜３のいずれかに記載のコイ用ＤＮＡワクチンをコイに投与することを特徴とする、コイヘルペスウイルス（ＫＨＶ）病の予防又は治療方法。
5. 請求項１〜３のいずれかに記載のコイ用ＤＮＡワクチンの、コイのコイヘルペスウイルス（ＫＨＶ）病に対する免疫応答の誘発への使用方法。