TW200835515A

TW200835515A - Treatment of pigs with PCV2 antigen

Info

Publication number: TW200835515A
Application number: TW096148111A
Authority: TW
Inventors: Vicky Fachinger; Knut Elbers; Axel Lischewski; Marion Kixmoeller; Francois-Xavier Orveillon; Von Richthofen Isabelle Freiin; Michael D Piontkowski
Original assignee: Boehringer Ingelheim Vetmed
Priority date: 2006-12-15
Filing date: 2007-12-14
Publication date: 2008-09-01
Also published as: HUE033130T2; DK2094872T4; WO2008076915A3; EP2481420A1; ES2726777T3; DK2481420T3; WO2008076915A2; US20180250380A1; JP5200223B2; EP2094872B1; KR20090088938A; HUE044410T2; EP2481420B1; AU2007333857A1; AR064363A1; US20170049876A1; CA2670836A1; AU2007333857B2; US20110091499A1; ZA200903299B

Description

200835515 九、發明說明：【發明所屬之技術領域】本發明係關於使用包含豬第二型環狀病毒（PC V2)抗原之免疫原性組合物來防止及治療具有抗PCV2特異性抗體之動物中之數種臨床表現（疾病）。較佳地，彼等抗PCV-2特異性抗體係母體抗體。【先前技術】豬第二型環狀病毒（PCV2)係小的（直徑為17-22奈米）、二十面體的、含有單鍵環狀基因組之無包被DNA病毒。 PCV2與豬第一型環狀病毒（PCV1)共享大約80%之序列一致性。然而，與通常係非病毒性之PCV1形成對比，豬之 PCV2感染最近已與許多疾病症候群有關’該等疾病症候群共同稱為豬環狀病毒相關疾病（PCVAD)(亦稱為豬環狀病毒疾病（PCVD))(Allan等人，2006，IPVS會議）。斷乳後多系統消耗性症候群（PMWS)通常視為PCVAD之主要臨床表現 ° (Harding等人·，1997, Swine Health Prod; 5: 201-203 ; Kennedy 等人·，2000, J Comp Pathol; 122: 9-24)。PMWS侵襲在5-18週齡間的豬。PMWS之臨床特徵在於消瘦、皮膚蒼白、生長遲滯、呼吸窘迫、腹丨寫、黃疸及黃疸病。在一些受侵襲之豬中，會明顯出現所有症狀之組合，而另一些受侵襲之豬僅會具有一種或兩種該等症狀。（Muirhead, 2002, Vet· Rec·; 150: 456)在屍體剖檢中，顯微鏡可見及肉眼可見之損傷亦會出現在多個組織及器官中，其中淋巴器官係損傷之最普遍部位。（Allan及Ellis，2000; J Vet. 126748.doc 200835515

Diagn· Invest·，12: 3-14)。已觀察到PCV2核酸或抗原的量與顯微鏡可見之淋巴損傷之嚴重性間之強烈相關性。受 PCV2感染之豬之死亡率可能接近80%。除PMWS外，PCV2 與數種其他感染有關，該等其他感染包括僞狂犬病、豬繁殖與呼吸症候群（PRRS)、格拉塞氏（Glasser’s)病、鏈球菌性腦膜炎、沙門氏菌病、斷乳後大腸桿菌病、營養性肝功能障礙及化膿性支氣管肺炎。然而，迄今研究仍未證實任何該等臨床症狀實際上是否為PCV2感染之直接結果。而且，仍未獲知能否藉助針對PCV2之活性劑有效減輕或治癒任何該等臨床症狀。基於DNA疫苗治療PCV2感染之方法闡述於美國專利第 6,703，023號中。在WO 03/049703中闡述包含PCV-1骨架之活嵌合疫苗之生產，在該PCV-1骨架中病原性PCV2菌株之免疫原性基因代替PCV-1骨架之一基因。WO 99/18214提供數種PCV2菌株及製備死PVC2疫苗之程序。然而，未報道功效數據。在WO 06/072065及WO 2007/028823中報道一有效之基於ORF-2之亞單位疫苗。任何該等疫苗皆擬用於大於3週齡之豬（swine或pig)之接種疫苗/治療。該等疫苗中無一經闡述用於小於3週齡或2週齡之幼小仔豬。已顯示源自母體之免疫性賦予一定程度之抵抗PCV2感染及與PCV2感染有關之臨床疾病之保護。已顯示該保護係效價依賴性的：較高之效價通常係保護性的，而較低之效價貝不然（McKeown 等人.，2005;(：1111.01狂§11.1^13· Immunol·; 12: 1347-1351)。估計斷乳幼畜中之平均抗體半 126748.doc 200835515 衰期為19.0天且在群體内PCV2-被動性抗體衰減期限相對較寬（Opriessnig等人· 2004，J. Swine Health Prod· 12:186-191)。人們發現在10-12日齡存在之低效價PCV2被動性獲得抗體在約4·9±1.2週齡時衰減，發現中等水平之抗體在約 8.1±1·9週齡時衰減且發現高水平之抗體在約11.1±2.5週齡時衰減（Opriessnig等人·，2006，第37屆美國豬獸醫協會年會（Annual Meeting of the American Association of Swine Veterinarians))。逐漸減小之抗體效價與時間之密切相關性表明PCVAD之第一臨床徵兆發生在仔豬約5週齡及12週齡時（Allan 等人，2000，Vet. Diagn. Investigation，12: 3-14)。此外，亦已自新生仔豬之淋巴結中分離出PCV2 (Hirai 等人，2001，Vet· Record; 148:482-484)，此表明即使較幼小之仔豬在無保護性母體抗體效價存在下亦可能受PCVAD 侵襲。抗體效價與保護間之明顯相關性在Spanish田間研究中已得到證實：具有低抗體效價之7週齡之豬（平均抗體效價1:100，在0至1:320範圍内）在隨後5週内比具有較高抗體效價之動物具有顯著較高之死亡率（Rodriguez-Arrioja等人·，2002, Am. J Vet. Res. 63:354-357)。源自母體之抗體的存在不僅可賦予一定程度之抵抗病毒感染之保護（然而其係不可預測的），且亦獲知會削弱免疫作用之功效。例如，較高效價之經典豬瘟病毒（CSFV)之源自母體之抗體抑制CSFV疫苗之細胞介導及體液免疫反應二者，但是較低效價沒有顯著影響（Suradhat及 Damrongwatanapokin，2003, Vet· Microbiol; 92: 187-194) ° 126748.doc 200835515 亦對於活PCV2疫苗，已預測當將其給予大於7或8週齡之仔豬時作用會最有效，因為此時母體抗體已大部分減弱。母體抗體干擾受所引發之免疫反應之類型（Thl對Th2)影響，免疫反應之類型端視（除其他外）疫苗類型、抗原類型、佐劑類型以及所投與抗原的量而定。因此，即使疫苗抵抗相同之病原體，其可能之母體抗體干擾亦可能不同。總而言之，源自母體之抗PCV2抗體可能賦予一定程度之抵抗PCV2之保護，但是另一方面彼等抗體可能削弱任何 PCV2疫苗之功效。以下事實進一步使主動免疫作用對動物之保護變得複雜：a)源自母體之抗體（MDA)之衰減時間各動物有所不同且b)許多疾病在抗體衰減之後不久發生。為應對該問題’數種接種疫苗策略預示對於幼小動物採用兩次注射接種疫苗方案：在生命早期給予第一次接種疫苗以保護彼等具有低MDA之動物。吾人認為該第一次接種疫苗由於疫苗抗原之干擾可能在具有高MDA效價之動物中不是有效的。同樣為保護該等動物，當預期高MDA量已下降時，需要第二次接種疫苗。該類接種疫苗方案可用於許多小動物疫苗 (抵抗（例如）犬細小病毒出血性胃腸炎、犬肝炎）、馬疫苗 (抵抗（例如）馬流行性感冒之疫苗）及豬疫苗（抵抗（例如）胸膜肺炎放線桿菌⑼·⑽^謂削★)、副豬嗜血桿菌尸⑽似心））。因為在5週齡或更大之動物中PCVAD之發作看來似乎與PCV2抗體之衰減有關，據報道PC V2抗體之衰減發生在4-Π週齡之動物中，因此已 126748.doc 200835515 闡述數種使用兩次注射接種疫苗方案以避免可能之母體抗體干擾之抵抗PCVAD之疫苗方法。在WO 2007/028823 中’闡述用大於20微克/劑量抗原使用兩次接種疫苗方案之具有源自母體之抗PCV2抗體之仔豬的接種疫苗。初始接種疫苗在1週齡與4週齡間投與。所有動物在初始接種疫备後3週（在具有高md A量之動物中之源自母體之抗體在第一次接種疫苗已下降或終止時）再次接種疫苗。因此，尚不存在闡述源自母體之抗PCV2抗體對保護或干擾程度之準確影響的資訊。為此，吾人建議不要對在三（3)週齡之前至少接文單次注射疫苗方案之仔豬接種疫苗。在3週齡之前之接種疫苗與免疫作用功效之相關性具有一定程度之不確定性。另一方面，儘管仍無人知曉較低量之準確意義，但具有較低量之源自母體之抗PCV2抗體之仔豬在3週齡之前不足以抵抗PCV2感染。換言之，在3週齡之前未實施接種疫苗之具有低MDA效價之畜群由於缺乏足夠之免疫體質具有PCV2感染之内在風險。而且，未曾有人闡述在已經具有抗pcv2抗體（較佳具有母體抗PCV2抗體）之豬中該等疫苗賦予抵抗]?(^2感染之保護性免疫性或減輕、減少與PCV2感染有關之任何臨床症狀之嚴重性或治癒該等任何臨床症狀。【發明内容】本發明克服在先前技術中固有之問題且提供當前技術水平之明顯進展。根據總體態樣，本發明提供治療或預防具有抗PCV2抗體之動物中PCV2感染或減輕由？(：^2感染引起 126748.doc -10- 200835515 或與PCV2感染有關之臨床症狀之方法，該方法包括向需要該治療之該動物投與有效量之PCV2抗原或包含PCV2抗原之免疫原性組合物的步驟。抗PCV2抗體（尤其係母體起源之抗PCV2抗體）之存在不會削弱包含PCV2抗原之疫苗的功效係一出人預料且令人驚奇之發現。【實施方式】本文所用術語’’疫苗”或π免疫原性組合物π(兩個術語同義使用）係指含有PCV2抗原之任何醫藥組合物，此組合物可用於防止或治療個體中與PCV2感染有關之疾病或病況。較佳之免疫原性組合物能夠誘發、刺激或增強抵抗PCV2 之免疫反應。因此該術語涵蓋如下文所述之亞單位免疫原性組合物以及含有全殺滅或減毒及/或不活化PCV2之組合物二者。因此，根據另一態樣，本發明提供治療或預防具有抗 PCV2抗體（尤其係源自母體之抗PCV2抗體）之動物中PCV2 感染或減輕由PCV2感染引起或與PCV2感染有關之臨床症狀之方法，該方法包括向需要該治療之該動物投與有效量之PCV2抗原或包含PCV2抗原之免疫原性組合物的步驟，其中該免疫原性組合物係亞單位免疫原性組合物、含有全殺滅或減毒及/或不活化PCV2之組合物。本文所用術語’’亞單位免疫原性組合物’’係指含有源自 PCV2或與PCV2抗原同源之至少一種免疫原性多肽或抗原 (但並非所有抗原）之組合物。此一組合物基本上無完整之 PCV2。因此，”亞單位免疫原性組合物’’係自至少部分純化 126748.doc -11 - 200835515 或分級分離（較佳為基本上純化）之PCV2免疫原性多肽或其重組類似物製備。亞單位免疫原性組合物可包含基本上不含來自PCV2之其他抗原或多肽、或呈經分級分離形式之 (若干）亞單位目標抗原。較佳之免疫原性亞單位組合物包含如下文所述之PCV2 0RF_2蛋白質。最佳者係包含貿〇 06/072065中提供之任何PCV2抗原之免疫原性亞單位組合物，其全文皆以引用方式倂入本文中。 π免疫反應"意指但不限於在宿主中出現對目標組合物或疫苗之細胞及/或抗體介導之免疫反應。通常，，，免疫反應，，包括但不限於一或多種下述效應：產生或激活（具體而言）針對目標組合物或疫苗中所含抗原之抗體、Β細胞、辅助性Τ細胞、抑制性τ細胞及/或細胞毒素τ細胞。較佳地，宿主會表現治療性或保護性免疫（記憶）反應以增強對新感染之抵抗及/或降低疾病之臨床嚴重性。該保護可藉由與 PCV2感染有關之症狀之數量減少或嚴重性減輕，或缺失一或多種該等症狀，病毒血症發作延遲，病毒持久性減弱，總病毒負荷減少及/或病毒排泄減少來表現。本文所用術語”抗原”係指引發如上所述免疫反應之胺基酸序列。本文所用抗原包括任何pcv2蛋白質之全長序列、其類似物或其免疫原性片段。術語"免疫原性片段，，係才曰包括一或多個抗原決定部位且因此可引發上述免疫反應之蛋白質片段。可使用任何數量之業内熟知之抗原決定部位定位技術鑒別該等片段。參見（例如）Epit〇pe Mapping Protocols in Methods in M〇lecular Bi〇1〇gy，第 66卷（〇卜仙 126748.doc -12- 200835515 E. Morris編輯，1996)Humana Press，Totowa，New Jersey。舉例而言，可藉由下述方法來確定線性抗原決定部位：例如在固態支撐體上同時合成大量肽，該等肽對應於蛋白質分子之部分，並在該等肽仍附著於支撐體上時使該等肽與抗體反應。該等技術為業内所習知且闡述於（例如）美國專利第 4,708,871 號；Geysen 等人（1984) Proc. Natl· Acad. Sci. USA 81:3998-4002 ； Geysen #、（1986)Molec· Immunol. 23:709-715。類似地，構象性抗原決定部位可藉由用（例如）x射線結晶照相術及二維核磁共振確定胺基酸空間構象容易地加以鐾別。參見（例如）上文Epitope Mapping Protocols 〇定義中亦可包括合成抗原，例如多抗原決定部位、側翼抗原決定部位及其他重組或合成來源抗原。參見（例如） Bergmann 等人（1993) Eur. J. Immunol. 23:2777-2781 ； Bergmann 等人（1996)，J· Immunol· 157:3242-3249 ； Suhrbier, A. (1997), Immunol, and Cell Biol. 75:402-408 ； Gardner 等人·，（1998)第 12 屆世界 AIDS 會議（World AIDS Conference)，Geneva，Switzerland，1998 年 6 月 28 曰-7 月 3 曰。根據又一態樣，本文所用免疫原性組合物最佳包含藉由 PCV2之ORF-2表現之多肽或其片段。本文所用於製備該等組合物且在本文所提供之方法範圍内之PCV2 ORF-2 DNA 及蛋白質係PCV2分離物中之高保守結構域且因此，任何 PCV2 ORF-2作為本文所用之PCV ORF-2 DNA及/或多肽之 126748.doc -13- 200835515 來源會係有效的。一較佳之PCV2 ORF-2蛋白質係WO 06/072065之 SEQ ID NO: 11 之 PCV2 ORF_2蛋白質。另一較佳之PCVORF-2多肽係以WO 06/072065之SEQIDNO:5提供。然而，彼等熟習此項技術者應瞭解，該序列之序列同源性可改變至多6-10%且仍保持使其可用於免疫原性組合物之抗原性特徵。免疫組合物之抗原性特徵可（例如）藉由如WO 06/072065之實例4所提供之攻擊實驗評估。而且，當經修飾抗原與PCV2 ORF-2蛋白質相比賦予至少70%(較佳為80%，更佳為90%)之保護性免疫性時，仍保留經修飾抗原之抗原性特徵，該PCV2 ORF-2蛋白質由WO 06/072065所提供之SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO: 4多核普酸序列編碼。因此根據又一態樣，本發明提供治療或預防具有抗 PCV2抗體（尤其係源自母體之抗PCV2抗體）之動物中PCV2 感染或減輕由PCV2感染引起或與PCV2感染有關之臨床症狀之方法，該方法包括向需要該治療之該動物投與有效量之PCV2抗原或包含PCV2抗原之免疫原性組合物的步驟，其中該PCV2抗原係與PCV2 ORF-2蛋白質相比具有至少 70%(較佳為80%，甚至更佳為90%)保護性免疫性之抗原 PCV2 ORF-2蛋白質，該PCV2 ORF-2蛋白質由WO 06/072065所提供之SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO: 4多核苷酸序列編碼。較佳地，該PCV2 ORF-2具有WO 06/072065之 SEQ ID NO: 11 或 SEQ ID NO: 5序列。在某些形式中，PCV2 ORF-2蛋白質之免疫原性部分用 126748.doc -14- 200835515 作包含PCV2抗原之免疫原性組合物中之抗原性組份。本文所用術語"免疫原性部分”分別係指PCV2 ORF-2蛋白質及/ 或多核苷酸之經截短及/或經取代形式或片段。較佳地，該等經截短及/或經取代形式或片段會包含至少6個全長 ORF-2多肽之鄰近胺基酸。更佳地，該等經截短或經取代形式或片段會具有至少10個（更佳為至少15個，且仍更佳為至少19個）全長PCV ORF-2多肽之鄰近胺基酸。在此態樣中之兩個較佳序列係以WO 06/072065之SEQ ID NO: 9及 SEQ ID NO: 10提供。應進一步瞭解，該等序列可係較大片段或經截短形式之一部分。

如上所述，另一較佳之PCV2 ORF-2多肽係由SEQ ID NO. 3或SEQ ID NO: 4核苦酸序列編碼之任何pcv] ORF-2 多肽。然而，彼等熟習此項技術者應瞭解，該序列之序列同源性可改變至多6-20%且仍保持使其可用於免疫原性組合物之抗原性特徵。在某些形式中，該PVC2 〇RF_2多肽之經截短或經取代形式或片段用作該組合物中之抗原性組份。較佳地，該等經截短或經取代形式或片段會包含至少 18個（例如）SEQ ID NO: 3 或 SEQ ID NO: 4之全長 PCV2 ORF-2核苷酸序列之鄰近核苷酸。更佳地，該等經截短或經取代形式或片段會具有至少30個（更佳為至少45個，且仍更佳為至少57個）（例如）SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO: 4之王長PCV2 ORF-2核普酸序列之鄰近核苦酸。如業内已知，，，序列一致性”係指兩個或更多個多肽序列或兩個或更多個多核苷酸序列間之關係，即參考序列與相 126748.doc •15- 200835515 比於該參考序列之指定序列間的關係。序列一致性係對指定序列與參考序列實施能產生最高程度序列相似性（藉由該等序列串間之匹配確定）之最佳比對後藉由比較該等序列來確定。對於該比對，序列一致性係基於位置對位置原理確定，例如若在一特定位置上核苷酸或胺基酸殘基係一致的，則序列在該位置係” 一致"的。隨後用該等位置一致性之總數量除以參考序列中核苷酸或殘基之總數量得到％序列一致性。序列一致性可容易地藉由已知方法計算，該等已知方法包括但不限於彼等闡述於以下者： Computational Molecular Biology，Lesk，A. N.編輯，Oxford University Press， New York (1988) ; Biocomputing: Informatics and Genome Projects，Smith，D. W.編輯， Academic Press, New York (1993) ； Computer Analysis of Sequence Data，Part I，Griffin，Α·Μ·及 Griffin，H· G.編輯， Humana Press, New Jersey (1994) ； Sequence Analysis in

Molecular Biology， von Heinge， G” Academic Press (1987) ; Sequence Analysis Primer，Gribskov，M.及 Devereux，J·，編輯，M. Stockton Press，New York (1991); 及 Carillo，H.及 Lipman，D·，SIAM J. Applied Math·，48: 1073 (198 8)，其教示以引用方式倂入本文中。確定序列一致性之較佳方法經設計可給出所測試序列間之最大匹配。將確定序列一致性之方法編入可公開獲得之確定指定序列間序列一致性之電腦程序中。該等程序之實例包括（但不限於）GCG 程序包（Devereux，J·等人，Nucleic Acids 126748.doc -16- 200835515

Research, 12(1):387 (1984))、BLASTP、BLASTN 及 FASTA(Altschul，S. F·等人，J· Molec. Biol·，215:403-410 (1990))。該BLASTX程序可自NCBI及其他來源公開獲得 (BLAST Manual，Altschul，S·等人·，NCVI NLM NIH Bethesda，MD 20894, Altschul，S· F·等人·，j· Molec. Biol·， 215:403-410 (1990)，其教示以引用方式倂入本文中）。該等程序利用缺省空位權重最佳地比對序列以在指定序列與參考序列間產生最高程度之序列一致性。作為例示，就具有相對參考核苷酸序列具有至少（例如）85%，較佳為 90%，甚至更佳為95%”序列一致性”之核苷酸序列之多核苷酸而言’意味著除指定多核苷酸序列可能包括至多i 5 個，較佳至多10個，甚至更佳至多5個點突變/參考核苷酸序列之每100個核苷酸外，該指定多核苷酸之核苷酸序列與參考序列一致。換言之，在具有相對於參考核苷酸序列具有至少85%，較佳為90%，甚至更佳為95%一致性之核普酸序列之多核苷酸中，參考序列中至多丨5〇/。，較佳為 10 /〇,甚至更佳為5%之核苷酸可能經刪除或經另一核苷酸取代，或參考序列中總核苷酸之至多丨5%，較佳為丨〇%，甚至更佳為5%數量之核苷酸可能插入參考序列中。參考序列之該等突變可發生在參考核苷酸序列之5,或3,末端位置或彼等末端位置間之任何地方，其各散佈於參考序列中之核苷S文中或散佈於參考序列内之一或多個鄰近基團中。類似地，就具有相對參考胺基酸序列具有至少（例如）85/。，較佳為9〇%，甚至更佳為❹序列一致性之指定 126748.doc 200835515 胺基酸序列之多肽而言，意味著除指定多肽序列可能包含至多15個，較佳為至多10個，甚至更佳為至多5個胺基酸改變/參考胺基酸序列之每1〇〇個胺基酸外，多肽之指定胺基酸序列與參考序列一致。換言之，為獲得與參考胺基酸序列具有至少85%，較佳為90%，甚至更佳為95%序列一致性之指定多肽序列，參考序列中至多丨5%，較佳為至多 10%，甚至更佳為至多5%之胺基酸殘基可能經刪除或經另一胺基酸取代，或參考序列中胺基酸殘基總數量之至多 15%，較佳為至多10%，甚至更佳為至多5%數量之胺基酸可能插入參考序列中。參考序列之該等改變可能發生在參考胺基酸序列之胺基或羧基末端位置或彼等末端位置間之任何地方，其各散佈於參考序列中之殘基中或散佈於參考序列内之一或多個鄰近基團中。較佳地，不一致之殘基位置係因保守的胺基酸取代而不同。然而，在確定序列一致性時保守取代並不作為匹配包括在内。本文所用π序列同源性”係指確定兩序列相關性之方法。為確定序列同源性，將兩個或更多個序列進行最佳比對，且（若需要）引入空位。然而，與"序列一致性”相比，在確定序列同源性時保守胺基酸取代作為匹配計數。換言之，為獲得與參考序列具有95%序列同源性之多肽或多核苷酸，參考序列中85%，較佳為9〇%，甚至更佳為95%之胺基酸殘基或核苷酸必須匹配或包含經另一胺基酸或核苷酸之保守取代’或參考序列中總胺基酸殘基或核苷酸（不包括保守取代）之至多15%，較佳為至多1〇%，甚至更佳為至 126748.doc 18 200835515 多5%數量之胺基酸或核苷酸可能插入參考序列中。較佳地，同源序列包含至少50個，甚至更佳為至少1〇〇個，甚至更佳為至少250個，且甚至更佳為至少5〇〇個核苷酸之片段。 π保守取代”係指胺基酸殘基或核苷酸經另一具有相似特徵或特性（包括尺寸、疏水性等等）之胺基酸殘基或核苷酸取代，以使整體功能未顯著改變。 π經分離的η意指’’人工’’使其自其天然狀態改變，即，若其天然存在’將其自其起始環境改變或移出，或二者。例如，天然存在於活生物體内之多核苷酸或多肽不是"經分離的"，但是自其天然狀態之共存物質分離出之相同的多核普酸或多狀係π經分離的’’，如本文所使用術語。因此，根據又一態樣，本發明提供治療或預防具有抗 PCV2抗體（尤其係源自母體之抗PCV2抗體）之動物中pcv2 感染或減輕由PCV2感染引起或與PCV2感染有關之臨床症狀之方法，該方法包括向需要該治療之該動物投與有效量之PCV2抗原或包含PCV2抗原之免疫原性組合物的步驟，其中讜PCV2 ORF-2蛋白質係任一彼等上述者。較佳地，該PCV2 ORF-2蛋白質係 i)包含 W0 06/〇7〇65 之 SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 9、SEQ ID no: 1()或 SEQ ⑴ N〇: 11序列之多肽； 11)與i)之多肽具有至少80%同源性之任何多肽； iii) i)及/或ii)之多肽之任何免疫原性部分； 126748.doc -19- 200835515

iv) 丨丨丨）之免疫原性部分，其包含至少i 〇個包括於WO 06/072065之 SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 10或 SEQ ID NO: 11序列中之鄰近胺基酸； v) 藉由包含 WO 06/072065之 SEQ ID NO: 3 或 SEQ ID NO: 4序列之DNA編碼之多肽； vi) 藉由與v)之多核苷酸具有至少80%同源性之多核苷酸編碼之任何多肽； vii) 藉由v)及/或vi)之多核苷酸編碼之多肽之任何免疫原性部分； viii) vii)之免疫原性部分，其中編碼該免疫原性部分之多核苷酸包含至少30個包括於WO 06/072065之 SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO·· 4序列中之鄰近核脊酸。任何該等免疫原性部分較佳具有w〇〇6/〇7〇652SEq ID NO: 3或SEQ ID NO: 4序列編碼之PCV2 ORF-2蛋白質之免疫原性特徵。根據又一態樣，PCV2 ORF-2蛋白質係以有效誘發期望之免疫反應之抗原包括量提供於免疫原性組合物中，該期望之免疫反應即減少由PCV2感染造成或與PCV2感染有關之臨床症狀之發生，減輕該等臨床症狀之嚴重性，或防止或減少一或多種該等臨床症狀。該PCV2 ORF-2蛋白質包括量較佳為至少0·2微克抗原/毫升最終免疫原性組合物（微克/毫升），更佳為約〇·2至約400微克/毫升，仍更佳為約〇.3 126748.doc • 20- 200835515 至約200微克/¾升，甚至更佳為約〇 %至約ι〇〇微克/毫升，仍更佳為約0.4至約50微克/毫升，仍更佳為約0.45至約30微克/¾升，仍更佳為約〇·5至約18微克/毫升，甚至更佳為約0.6至約15微克/毫升，甚至更佳為約〇75至約8微克/ 毫升’甚至更佳為約1·〇至約6微克/毫升，仍更佳為約13 至約3.0微克/毫升，甚至更佳為約14至約2.5微克/毫升，甚至更佳為約1.5至約2.0微克/毫升，最佳為約16微克/毫升。根據又一態樣，該PCV ORF-2抗原包括量係至少0.2微克如上所述之PCV2 ORF-2蛋白質/劑量最終抗原性組合物（微克/劑量），更佳為約0.2至約400微克/劑量，仍更佳為約〇·3 至約200微克/劑量，甚至更佳為約〇·35至約ι〇〇微克/劑里’仍更佳為約0 · 4至約5 0微克/劑量，仍更佳為約〇 · 4 5至約3 0微克/劑量，仍更佳為約〇·5至約18微克/劑量，甚至更佳為約0.6至約15微克/劑量，甚至更佳為約〇·75至約8微克/ 劑量，甚至更佳為約1 ·〇至約6微克/劑量，仍更佳為約1 ·3 至約3.0微克/劑量，甚至更佳為約ι·4至約2.5微克/劑量，甚至更佳為約1.5至約2.0微克/劑量，最佳為約h6微克/劑量。令人驚奇地發現，小於20微克/劑量（較佳為約〇.5至18 微克/劑量）之PCV2 ORF-2蛋白質包括量（抗原含量）適宜在幼小動物及/或PCV2抗體呈陽性（尤其係抗PCV2源自母體之抗體呈陽性）之動物中賦予免疫性。因此，根據又一態樣，本發明提供治療或預防具有抗PCV2抗體（尤其係源自母體之抗PCV2抗體）之動物中PCV2感染或減輕由PCV2感 126748.doc -21 - 200835515 染引起或與PC V2感染有關之臨床症狀之方法，該方法包括向需要該治療之該動物投與小於20微克/劑量，較佳為約0.5至18微克/劑量之PC V2抗原或包含PCV2抗原之免疫原性組合物的步驟。該PCV2抗原係在該專利申請案中所述之任何PCV2抗原。較佳地，該PCV2抗原係任何pcv2 ORF-2蛋白質，更佳為本文所述之任何pcv2 ORF-2蛋白質。用於本發明免疫原性組合物之PCV2 ORF-2多肽可以包括PCV2 ORF2之分離及純化、標準蛋白質合成及重組方法之任何方式獲得。用於獲得PCV2 ORF-2多肽之較佳方法在WO 06/072065中提供，其教示及内容之全文以引用方式倂入本文中。簡言之’將易受感染細胞經含有PCV2 ORF-2 DNA編碼序列之重組病毒載體感染，ρ(：ν2 ORF-2多肽藉由重組病毒表現’且該經表現之PCV2 ORF-2多肽藉由過濾自上清液回收並藉由任何習用方法（較佳使用二元氮丙咬’其隨後經中和以終止不活化過程）不活化。本文所用免疫原性組合物亦係指包含以下之組合物：i) 任何上述PCV2 ORF-2蛋白質，較佳以上述濃度；及ii)至少一部分表現該PCV2 ORF_2蛋白質之病毒載體（較佳為重組杆狀病毒）。而且，該免疫原性組合物可包含i)任何上述PCV2 ORF-2蛋白質，較佳以上述濃度；及ii)至少一部分表現該PCV2 ORF-2蛋白質之病毒載體（較佳為重組杆狀病毒）；及iii) 一部分細胞培養物上清液。因此，根據又一態樣，本發明提供治療或預防具有抗 126748.doc -22- 200835515 PCV2抗體（尤其係源自母體之抗PCV2抗體）之動物中PCV2 感染或減輕由PCV2感染引起或與PCV2感染有關之臨床症狀之方法，該方法包括向需要該治療之該動物投與有效量之PCV2抗原或包含PCV2抗原之免疫原性組合物的步驟，其中該PCV2抗原係重組PCV2 ORF-2，較佳為經杆狀病毒表現之PCV2 ORF-2。較佳為彼等重組或經杆狀病毒表現之具有上述序列之PCV2 ORF-2。本文所用免疫原性組合物亦係指包含以下之組合物：i) 任何上述PCV2 ORF-2蛋白質，較佳以上述濃度；ii)至少一部分表現該PCV2 ORF-2蛋白質之病毒載體（較佳為重組杆狀病毒）；及iii) 一部分細胞培養物，其中約90%之組份具有小於1微米之尺寸。本文所用免疫原性組合物亦係指包含以下之組合物：i) 任何上述PCV2 ORF-2蛋白質，較佳以上述濃度；ii)至少一部分表現該PCV2 ORF-2蛋白質之病毒載體；iii) 一部分細胞培養物；iv)及不活化重組病毒載體之不活化劑，較佳為BEI，其中約90%之i)至iii)組份具有小於1微米之尺寸。較佳地，BEI係以有效不活化杆狀病毒之濃度存在，較佳以2至約8 mM BEI的量，較佳為約5 mM BEI。本文所用免疫原性組合物亦係指包含以下之組合物：i) 任何上述PCV2 ORF-2蛋白質，較佳以上述濃度；ii)至少一部分表現該PCV2 ORF-2蛋白質之病毒載體；iii) 一部分細胞培養物；iv)不活化重組病毒載體之不活化劑，較佳為BEI ;及v)終止由不活化劑介導之不活化作用之中和 126748.doc -23- 200835515 劑，其中約90%之i)至iii)組份具有小於1微米之尺寸。較佳地’若不活化劑係BEI ’則該組合物包含與BEI等效量之硫代硫酸鈉。將多肽納入可投與給易受PCV2感染之動物之組合物中。在較佳形式中，該組合物亦可包括彼等熟習此項技術者所習知之其他組份（亦參見Remington，s pharmaceutical

Sciences. (1990)·第 18版，Mack Publ.，Easton)。另外， f' 該組合物可包括一或多種獸醫學可接受之載劑。本文所用 '”獸醫學可接受之載劑”包括任何及全部溶劑、分散介質、塗佈劑、佐劑、穩定劑、稀釋劑、防腐劑、抗細菌及抗真菌劑、等滲劑、吸附延遲劑及諸如此類。在一較佳實施例中，該免疫原性組合物包含此處提供之PCV2 〇RF_2蛋白質（較佳以上述濃度，其與佐劑（較佳為Carb〇p〇1)混合）及生理鹽水。彼等熟習此項技術者會瞭解，本文所用組合物可納入已 : 知之可'主射之生理學上可接受之無菌溶液。對於製備用於非經腸注射或輸注之即用溶液，水性等渗溶液（例如鹽水或相應之血漿蛋白質溶液）可容易地得到。另外，本發明之免疫原性及疫苗組合物可包括稀釋劑、等渗劑、穩定劑或佐劑。稀釋劑可包括水、鹽水、葡萄糖、乙醇、甘油及諸如此類。等滲劑可尤其包括氯化納、葡萄糖、甘露醇、木醇及礼糖。％定劑尤其包括乙二胺四乙酸之白鹼金屬鹽。本文所用佐劑彳包括氫氧化鋁及磷酸鋁；皂苷，例如 126748.doc -24· 200835515

Quil A、QS-21(Cambridge Biotech公司，Cambridge ΜΑ)、 GPI-0100 (Galenica Pharmaceuticals公司，Birmingham，AL); 油包水乳液；水包油乳液；水包油包水乳液。該乳液可尤其基於輕質液體石蠟油（歐洲藥典類型）；類異戊二烯油，例如由烯烴（尤其係異丁烯或癸烯）寡聚產生之角鯊烷或角鯊烯油；含有直鏈烷基之酸或醇之酯，更具體而言為植物性油、油酸乙酯、丙二醇二-(辛酸酯/癸酸酯）、甘油三-(辛酸酯/癸酸酯）或丙二醇二油酸酯；具支鏈脂肪酸或醇之酯，尤其係異硬脂酸酯。油可與乳化劑組合使用以形成乳液。乳化劑較佳係非離子型表面活性劑，具體而言係山梨醇酐、二縮甘露醇（例如無水甘露醇油酸酯）、二醇、聚甘油、丙二醇與油酸、異硬脂酸、蓖麻油酸或經基硬脂酸之視情況經乙氧基化之酯，及聚氧丙烯-聚氧乙烯共聚物嵌段，具體而言係普流尼克（Pluronic)產品，尤其係L121。參見 Hunter 等人·，The Theory and Practical Application of Adjuvants (Ed.Stewart-Tull, D. E. S.). JohnWiley and Sons, NY，第 51-94 頁（1995)及 Todd 等人·，Vaccine 15:564-570 (1997)。例如，可使用闡述於"Vaccine Design，The Subunit and Adjuvant Approachn(M· Powell及 M. Newman編輯 ’ Plenum Press，1995)第147頁上之SPT乳液及闡述於該書第183頁上之乳液MF59。佐劑之另一實例係選自丙烯酸或曱基丙烯酸之聚合物及馬來酸酐與烯基衍生物之共聚物之化合物。較佳之佐劑化 126748.doc -25- 200835515 合物係丙烯酸或甲基丙烯酸之聚合物，其尤其與糖類或多元醇之聚烯基晴交聯。已知此等化合物之名稱為聚魏乙稀製劑（Pharmeuropa，第8卷，第2期，1996年6月）。熟習此項技術者亦可參考美國專利第2,909,462號，其闡述與聚羥基化化合物交聯之該等丙烯酸系聚合物，該聚羥基化化合物具有至少3個（較佳不多於8個）羥基，至少3個羥基之氫原子經具有至少2個碳原子之不飽和脂肪族基團取代。較佳 ( 基團係彼等含有2至4個碳原子者，例如乙烯基、烯丙基及其他乙烯系不飽和基團。不飽和基團自身可含有諸如甲基卓"他取代基。以名稱 Carb〇p〇i (bf Goodrich，Ohio，USA) 出售之產品特別適合。其可與烯丙基蔗糖或與烯丙基異戊四醇父聯。其中可提及者係Carb〇p〇i 974P、934P及971P。最佳者係使用Carbopo卜尤其係使用Carb〇p〇1 97lp，較佳乂、力500极克至約5宅克/劑量的量使用，甚至更佳以約微克至約2.5毫克/劑量的量使用且最佳以約i毫克/劑量的 / 量使用。其他適宜佐劑尤其包括（但不限於）ribh々劑系統（RiM& 司）、喪段共聚物（CytRx, Atlanta GA)、SAF-M (Chiron， Emeryville CA)、單磷醯脂質A、阿夫立定（Avridine)脂質_ 胺佐劑、自大腸桿菌（Ε· c〇li)(重組的或其他方式）之不耐熱粉毋素、雈亂毒素、IMS 1314或胞壁醯二肽。較佳地，該佐劑係以約1〇〇微克至約1〇毫克/劑量的量添加。甚至更佳地’該佐劑係以約1 〇〇微克至約1 〇毫克/劑量的量添加。甚至更佳地，該佐劑係以約5〇〇微克至約$毫克 126748.doc -26 - 200835515 /劑量的量添加。A s $ a , 一赴至更佳地，該佐劑係以約750微克至約 2·5笔克/劑量的營灭里添加。最佳地，該佐劑係以約1毫克/劑量的量添加。另外亥組合物可包括一或多種醫藥上可接受之載劑。本文斤用、醫某上可接受之載劑"包括任何及全部溶劑、分散：質、塗佈齊卜穩定劑、稀釋劑、防腐劑、抗細菌及抗真g劑'等滲劑、吸附延遲劑及諸如此類。最佳地，由此 k ί、之、、且5物含有自活體外經培養細胞之上清液回收之 PCV2 ORF-2蛋白質，其中該等細胞經含有pcV2 〇rf_2 DNA且表現PCV2 〇RF-2蛋白質之重組病毒載體感染，且其中該細胞培養物係用不活化病毒載體之約2至約8 mM ΒΕΙ(較佳用約5 mM BEI)及等效濃度之中和劑（較佳為硫代硫酸鈉溶液，最終濃度為約2至約8 mM，較佳為約5 mM) 處理。本發明亦係關於包含以下之免疫原性組合物··丨）任何上述PCV2 ORF-2蛋白質，較佳以上述濃度；ϋ)至少一部分表現該PCV2 ORF-2蛋白質之病毒載體；iii)一部分細胞培養物；iv)不活化重組病毒載體之不活化劑，較佳為βΕΙ ; 及V)終止由不活化劑介導之不活化作用之中和劑，較佳為與BEI等效量之硫代硫酸鈉；及Vi)適宜佐劑，較佳為上述量之Carbopol 971 ;其中約90%之i)至iii)組份具有小於米之尺寸。根據又一態樣，該免疫原性組合物進—步包含醫藥上可接受之鹽，較佳為以生理學上可接受之丨農度之破本酸鹽。較佳地，將該免疫原性組合物之pH值調節至生理學 126748.doc -27- 200835515 pH值’意指介於約6.5與7·5之間。本文所用之免疫原性組合物亦係指每1毫升包含以下之組合物：i)至少1.6微克上述PCV2 ORF-2蛋白質，較佳小於20微克；ii)至少一部分表現該pcv2 〇RF_2蛋白質之杆狀病毒；iii)一部分細胞培養物；iv)約2至8 mM bei ; v)與 ΒΕΙ等效ϊ之硫代硫酸鈉；及vi)約1毫克Carb〇p〇i 971 ; 及vii)生理學上可接受之濃度之磷酸鹽；其中約9〇%之〇至iii)組份具有小於丨微米之尺寸且將該免疫原性組合物之 pH值調節至約6.5至7.5。該等免疫原性組合物可進一步包括一或多種其他免疫調節劑，例如介白素、干擾素或其他細胞因子。該等免疫原性組合物亦可包括慶大黴素（Gentamicin)及硫柳汞 (Merthiolate)。雖然熟習此項技術者可容易地確定用於本發明範圍之佐劑及添加劑的量及濃度，但本發明涵蓋包含約50微克至約2000微克佐劑且較佳約250微克/毫升劑量疫苗組合物之組合物。因此，本文所用之免疫原性組合物亦係指包含約1微克/宅升至約6 0微克/毫升抗生素，且更佳為小於約3 0微克/毫升抗生素之組合物。本文所用之免疫原性組合物亦係指包含以下之組合物： i)任何上述PCV2 0RF-2蛋白質，較佳以上述濃度；u)至少一部分表現該PCV2 ORF-2蛋白質之病毒載體；出）一部分細胞培養物；iv)不活化重組病毒載體之不活化劑，較佳為 BEI ;及v)終止由不活化劑介導之不活化作用之中和劑，較佳為與BEI等效量之硫代硫酸鈉；vi)適宜佐劑，較佳為 126748.doc -28- 200835515 上述量之Carbopol 971 ; vii)醫藥上可接受之濃度之鹽水 (較佳為磷酸鹽）緩衝劑；及viii)抗微生物活性劑；其中約 90%之i)至iii)組份具有小於1微米之尺寸。本文所用之免疫原性組合物亦係指Ingelvac® CircoFLEXTM(Boehringer Ingelheim Vetmedica 公司，St Joseph，MO，USA)、CircoVac® (Merial SAS，Lyon， France)、CircoVent(Intervet公司，Millsboro，DE，USA)或 Suvaxyn PCV-2 One Dose® (Fort Dodge Animal Health, Kansas City，KA，USA) o 因此，根據又一態樣，本發明提供治療或預防具有抗 PCV2母體抗體之動物中PCV2感染或減輕由PCV2感染引起或與PC V2感染有關之臨床症狀之方法，該方法包括向需要該治療之該動物投與有效量之PCV2抗原的步驟，其中該免疫原性組合物係 CircoFLEX®、CircoVac®、CircoVent 或Suvaxyn PCV-2 One Dose®。最佳地，該免疫原性組合物係 Ingelvac® CircoFLEX™，及/ 或該 PCV2抗原係 PCV2 ORF-2，較佳為經杆狀病毒表現之PCV2 ORF-2，最佳為包括於 Ingelvac⑧ CircoFLEXTM 中者。為研究PCV2抗原之可能的母體抗體干擾，實施一項研究，其中在接種疫苗時測定研究動物之抗體效價，隨後將該等抗體效價分成低、中及高抗體等級：小於1:100之幾何平均效價視為低抗體效價，1:100至1:1000之效價視為中抗體效價且大於1:1000之效價視為高抗體效價。該分組方式可與在Canadian田間研究中實施之分組方式相當，在 126748.doc -29- 200835515

Canadian田間研究中1:80之抗體效價視為低，1:640之抗體效價視為中且大於1:1280之抗體效價視為高（Larochelle等人，2003，Can. J· Vet· Res·; 67: 114-120)。為分析接種疫苗時低、中及高抗體效價對病毒血症之影響，將接種疫苗及經安慰劑治療之動物關於病毒血症之發作、終點、持續時間、陽性取樣天數及病毒負荷進行比較。令人驚奇地發現，抗PCV2抗體（尤其係源自母體之抗體）之存在對任何彼等參數無顯著影響。換言之，令人驚奇地發現，PCV2抗原在防止及治療動物中PCV2感染或減輕由PCV2感染引起或與PCV2感染有關之臨床症狀中之功效在接種疫苗之曰並不受抗PCV2抗體存在之影響，抗PCV2抗體效價較佳高達1:100，較佳大於1:100，甚至更佳大於1··250，甚至更佳大於1:500，甚至更佳為1:640，甚至更佳大於1:750，最佳為大於1:1 000。該效果可在一次注射接種疫苗實驗中得以證實，一次注射接種疫苗實驗意味著僅投與一次PCV2抗原且無任何PCV2抗原之隨後投與。抗PCV2抗體之檢測及定量方法已為業内所熟知。例如 PCV2抗體之檢測及定量可藉由闡述於Magar*等人·，2000, Can. J. Vet Res·; 64: 184-186或 Magar等人.，2000，J. Comp. Pathol·; 123: 258-269中之間接免疫螢光法實施。用於定量抗PCV2抗體之其他分析闡述於Opriessnig等人·，2006，第 37屆美國豬獸醫協會年會中。而且，實例2亦闡述可由熟習此項技術者使用之間接免疫螢光法分析。在結果有爭議之情形下及在有疑問之任何問題中，本文所提及之抗 126748.doc -30- 200835515 PC V2效價係指彼等係/可藉由實例2中所述之分析評估者。因此，根據又一態樣，本發明提供治療或預防具有抗 PCV2抗體（尤其係母體抗體）之動物中pcv2感染或減輕由 PCV2感染引起或與pcv2感染有關之臨床症狀之方法，該方法包括向需要該治療之該動物投與有效量（較佳為小於 20微克/劑量）之PCV2抗原的步驟，其中該動物具有高達 1:100(較佳為大於1:100，甚至更佳為大於1:25〇，甚至更 ( 佳為大於1:500，甚至更佳為1:640，甚至更佳為大於 1:750 ’最佳為大於1:1〇〇〇)之可檢測之抗pcv2抗體效價。較佳地，彼等抗PCV2抗體效價在特異性抗pcV2免疫分析中（較佳在如實例2中所述之分析中）係可檢測且可定量的。更佳地，彼等抗PCV-2抗體係源自母體之抗體。最佳地，該PCV2抗原僅投與一次（較佳以小於2〇微克/劑量之劑量）。具有僅低效價（小於1:100)或中效價（小於1:1〇〇〇)之源自母體之抗PCV2抗體之仔豬不足以抵抗在3週齡前發生之 PCV2感染。因此，期望在生命之非常早期接種疫苗。由於本文提供之不可預測且意想不到之結果且表明無抗 PCV2抗體之PCV2抗原干擾，因此3週齡之前之動物之接種疫苗/治療成為現實。而且，令人驚奇地發現，不管現有初始抗體效價之量如何，大於1:1000之抗PCV2抗體效價對 PCV2疫苗之功效皆無影響。例如，與未接種疫苗之對照動物相比，高效價動物（抗PCV2抗體效價大於i:i〇〇〇)之接種疫苗達成病毒血症持續時間縮短9.5天，病毒血症終點 126748.doc -31- 200835515

提早11.9天，病毒血症取樣天數減少19天且基因組當量數/ 写升之總數減少約2倍。在比較接種疫苗之”高π、，，中"及”低 :價動物"時，關於PCV2病毒血症之不同參數未觀察到顯者差異。該等結果表明，在有高抗？(：：”抗體效價之情形下用於接種疫苗之PCV2抗原仍同樣可顯著減輕血液中之病毒血症（病毒血症終點、病毒血症持續時間、病毒負荷）。與此結論一致，當比較接種疫苗組之低及高效價動物時關於活體重未發現差異。而且，與具有初始高抗體效價之經安慰劑治療之動物相比，在接種疫苗/治療時具有高抗PCV2抗體效價（大於1:1000)之接種疫苗之動物在病毒血症發作後亦顯示顯著較高之體重（見圖3)。因此，可能對 1日齡或更大之動物用PCV2抗原實施接種疫苗/治療。然而，接種疫苗應在最初8週齡，較佳在最初7週齡内實施。因此，根據又一態樣，本發明提供治療或預防動物中 PCV2感染或減輕由PCV2感染引起或與PCV2感染有關之臨床症狀之方法，該方法包括向需要該治療之該動物在i日齡或稍後（但較佳不遲於8週齡）投與有效量之pc V2抗原的步驟。根據一較佳實施例，賦予該動物免疫性需要小於2〇微克/劑量之PCV2抗原。根據一更佳實施例，向需要該治療之該動物僅投與一次PCV2抗原（較佳為小於20微克/劑量之PCV2抗原）。根據又一總體態樣，本發明提供治療或預防幼小動物中 PCV2感染或減輕由PCV2感染引起或與pcv2感染有關之臨床症狀之方法，該方法包括向需要該治療之該動物投與有 126748.doc -32- 200835515 效量之PCV2抗原的步驟。本文所用術語"幼小動物"係指i至22日齡之動物。較佳地，術語幼小動物意指i至2〇日齡之動物。更佳地，術語幼小動物係指1至15日齡之動物，甚至更佳為i日齡至14日齡之動物，甚至更佳為1至12日齡之動物，甚至更佳為1至 10日齡之動物，甚至更佳為丨至8日齡之動物，甚至更佳為 1至7日齡之動物，甚至更佳為1至6日齡之動物，甚至更佳為1至5日齡之動物，甚至更佳為丨至4日齡之動物，甚至更佳為1至3日齡之動物，甚至更佳為丨或2日齡之動物，最佳為1日齡之動物。因此，根據又一態樣，本發明提供治療或預防幼小動物中PCV2感染或減輕由pcv2感染引起或與 PCV2感染有關之臨床症狀之方法，該方法包括向如下之需要該治療之動物投與有效量之PCV2抗原的步驟：1至22 日齡，較佳為1至20日齡，更佳為日齡，甚至更佳為 1至14日齡，甚至更佳為丨至12日齡，甚至更佳為1至日齡，甚至更佳為1至8日齡，甚至更佳為丨至7日齡，甚至更么為1至6日齡，甚至更佳為丨至5日齡，甚至更佳為1至4日齡，甚至更佳為1至3日齡，甚至更佳為丨或2日齡，最佳為 ^齡。例如，證據表明在19至22日齡之接種疫苗/治療顯不較鬲之接種疫苗功效。此外亦顯示，在12至18(較佳為至14日齡）之接種疫备/治療非常有效地減輕與pcv^感染有關之臨床症狀，減少總病毒負荷，縮短病毒血症之持續時間’延遲病毒血症之發作，體重增加。此外亦顯示，在 1週齡之接種疫苗非常有效地減輕與p c v 2感染有關之臨床 126748.doc -33- 200835515 症狀，減少總病毒負荷，縮短病毒企症之持續時間，延遲病毒血症之發作’體重增加。較佳地，賦予彼等幼小動物免疫性需要小於20微克/劑量之PCV2抗原。根據更佳實施例，向需要該治療之幼小動物僅投與一次心2抗原^佳為小於20微克）。由於PCV2在該領域普遍存在，因此大部分仔豬就p⑺ 而言係血清陽性的。因此，根據又一態樣，本發明提供治療或預防幼小動物中PCV2感染或減輕由pc 一染有關之臨床症狀之方法，該等幼== 種疫苗之日具有抗PCV2抗體，該方法包括向如下之需要該治療之動物投與有效量之PCV2抗原的步驟：i至U曰齡，較佳為1至20日齡，更佳為1至15日齡，甚至更佳為^ 至14日齡，甚至更佳為丨至12日齡，甚至更佳為1至1〇日齡，甚至更佳為1至8日齡，甚至更佳為丨至7日齡，甚至更佳為1至6日齡，甚至更佳為丨至5日齡，甚至更佳為丨至#曰齡，甚至更佳為1至3日齡，甚至更佳為丨或2日齡，最佳為 1日齡。較佳地，該等幼小動物在接種疫苗/治療之日具有高達1:100(較佳為大於moo ,甚至更佳為大於1:25〇，甚至更佳為大於1:500,甚至更佳為1:64〇，甚至更佳為大於 1.750，最佳為在接種疫苗/治療之日大於uooo)之可檢測之抗PCV2抗體效價。較佳地，賦予彼等幼小動物足夠之免疫性需要小於20微克/劑量之PCV2抗原。根據更佳實施例，向需要該治療之幼小動物僅投與一次該pcv2抗原（較佳為小於20微克）。 126748.doc -34· 200835515 如上所述，與未接種疫苗之對照動物相比，用PCM抗原之幼小動物之接種疫苗/治療達成病毒血症期縮短。: 未接種疫苗之相同物種之對照動物相比，平均縮短時間為 9.5天。因此，根據又一態#，本發明亦提供治療或預防幼小動物中PCV2感染或減輕由PCV2感染引起或與pcVM 染有關之臨床症狀之方法，該方法包括向需要該治療之該動物投與有效量之PCV2抗原的步驟，其中與未經治療之相同物種之對照組動物相比該治療或預防達成5天或更多天之病毒血症期縮短，較佳為6天或更多天，甚至更佳為7 天或更多天，甚至更佳為8天或更多天，甚至更佳為9^，甚至更佳為ίο天，甚至更佳為12天，甚至更佳為14天，最佳為多於16天。在一些情形下，病毒血症期縮短多於“ 天。一般而言，幼小仔豬之接種疫苗達成降低之重量增加損失、較短之病毒血症持續時間、較早之病毒血症終點及較低病毒負荷。因此，根據又一態樣，本發明提供治療或預防幼小動物中PC V2感染或減輕由PCV2感染引起或與 PCV2感染有關之臨床症狀之方法，該方法包括向需要該治療之該動物投與有效量之PCV2抗原的步驟，其中與未經治療之相同物種之對照組動物相比該PCv2感染之治療或預防達成選自由下列組成之群之疫苗功效參數的改良：降低增重之損失’較短之病毒血症持續時間，較早終止病毒金症，較低之病毒負荷，或其組合。較佳地，達成任何上述改良之疫苗功效參數需要小於2〇微克/劑量之PCV2抗原。而且，該等改良之疫苗功效參數係藉由僅一劑量之單 126748.doc -35- 200835515 次投與達成。本文所用術語”有效量”意指，但不限於，抗原引發或能夠引發投與該有效劑量㈣以充原之動物免疫反應之量。有效里#乂佳疋義為抗原賦予至少1〇週免疫性持續時間 (DOI) ’較佺至少12週（D〇I)，更佳至少丨^週⑴⑺），最佳至少20週（DOI)之量。土有效量端視疫苗成份及投與時間表（schedule)而定。一般而言，當+活化病#或經修飾之活病毒製備品用於組合疫苗時，疫苗之量含有約10u至約1〇9.G TCID5〇/劑量，車1 佳約10至約1〇8.0 TCID5〇/劑量，更佳約1〇4.〇至約1〇8 0 TCIDso/劑篁。特別地，當經修飾之活％…用於疫苗時，向易受感染之動物投與之推薦劑量較佳為約1〇3 〇 TCID5〇(50%終點之組織培養物感染劑量}/劑量至約ι〇ό 〇 tcid5G/劑量，更佳為約1〇4·〇 TCId5()/劑量至約1〇5.0 TCID5〆劑量。一般而言，當使用經純化之抗原時，抗原的里N於0.2與5000微克之間，及介於ι〇2·ο與i〇9.o tcid50 之間，較佳介於103.〇與106.〇 TCID5〇之間，更佳介於1〇4.0與 l〇50TCID5()之間。亞單位疫苗一般以至少〇·2微克抗原/劑量之抗原包括量投與，較佳以約0.2至約400微克/劑量，仍更佳以約〇.3至約200微克/劑量，甚至更佳以約〇·35至約ι〇〇微克/劑量，仍更佳以約0·4至約50微克/劑量，仍更佳以約0.45至約30 微克/劑量，仍更佳以約0.5至約18微克/劑量，仍更佳以約 0.6至約16微克/劑量，甚至更佳以約〇·75至約8微克/劑量， 126748.doc -36- 200835515 甚至更佳以約1·〇至約6微克/劑量，仍更佳以約1.3至約3.0 微克/劑量之抗原包括量投與。出乎意料地，吾人發現上文所述免疫原性組合物之預防使用可有效減輕由PC V2感染引起或與pc V2感染有關之臨床症狀’較佳在幼小動物中及/或在治療之日具有抵抗 PCV2之被動免疫性之動物中。具體而言，吾人發現，本文所述免疫原性組合物且尤其包含PCV2 ORF-2抗原之組合物之預防使用可有效減輕在治療/接種疫苗之日感染 PCV2且具有母體抗Pd2抗體之動物中之淋巴結病、淋巴缺乏及/或多核/巨組織細胞。此外，吾人發現，本文所述免疫原性組合物且尤其包含PCV2 ORF-2抗原之組合物之預防使用可有效減輕（丨）小葉間水腫之間質性肺炎；（2)肉質蒼白或黃疸；（3)具斑點萎縮性肝；（4)胃潰瘍；（5)腎炎及（6)生殖障礙，例如流產、死產、乾屍化等等；（7)軟膜 (Pia)樣損傷，一般認為與細胞内勞森菌（Laws〇nia intracellularis)感染（迴腸炎）有關；（8)淋巴結病；（9)淋巴缺乏及/或（10)多核/巨組織細胞；（11)豬皮膚炎及腎病症候群（PDNS)，（12) PCVAD有關之大量死亡；（13) pcvAD有關之重量減輕；（14)降低之生長變異性；（15)降低之，，侏儒” 頻率，（16)降低之與豬生殖及呼吸疾病綜合症（pRRSv)之共感染。該免疫原性組合物亦可有效改良諸如屠宰時間、暑體重量、瘦肉率等經濟上重要之生長參S。因此，本文所用術語”臨床症狀”意指但不限於⑴小葉間水腫之間質性肺炎；（2)肉質蒼白或黃疸；（3)具斑點萎縮性肝；⑷胃潰 126748.doc •37- 200835515 瘍；（5)腎炎及（6)生殖障礙，例如流產、死產、乾屍化等等；（7)軟膜（Pia)樣損傷，一般認為與細胞内勞森菌感染 (迴腸炎）有關；（8)淋巴結病；（9)淋巴缺乏及/或（10)多核/ 巨組織細胞；（11)豬皮膚炎及腎病症候群（PDNS) ; (12) PCVAD有關之大量死亡；（13) PCVAD有關之重量減輕； (14)降低之生長變異性；（15)降低之，，侏儒”頻率；（16)降低之與豬生殖及呼吸疾病綜合症（PrrSV)之共感染。而且， ^, 本文所述抗原性組合物降低總環狀病毒負荷，包括較遲發作、較短之持續時間、較早之病毒血症終點及降低之病毒負荷及其在幼小動物（尤其係彼等在接種疫苗之日具有抗 PCV2抗體者）中之免疫抑制影響，從而達成較高程度之總體疾病抵抗性及降低之PCV2有關疾病及症狀之發生率。因此，根據又一態樣，本發明提供治療或預防幼小動物及/或具有抗PCV2抗體之動物中Pcv2感染或減輕由pCV2 感染引起或與PCV2感染有關之臨床症狀之方法，該方法 ( 包括向需要該治療之該動物投與有效量之PCV2抗原或包含PCV2抗原之免疫原性組合物的步驟，其中彼等臨床症狀係選自由下列組成之群：（1)小葉間水腫之間質性肺炎； • (2)肉質蒼白或黃疸；（3)具斑點萎縮性肝；（4)胃潰瘍；（5) 炎及（6)生殖障礙，例如流產、死產、乾屍化等等；（7)軟膜（Pia)樣損傷，一般認為與細胞内勞森菌感染（迴腸炎）有關；（8)淋巴結病；（9)淋巴缺乏及/或（1〇)多核/巨組織細胞，（H)豬皮膚炎及腎病症候群（PDNS) ; (12) PCVAD有關之大量死亡；（13) PCVAD有關之重量減輕；（14)降低之生 126748.doc -38- 200835515 長變異性；（15)降低之，，侏儒”頻率；（16)降低之與豬生殖及呼吸疾病綜合症（PRRSV)之共感染。根據又一態樣，本發明提供治療或預防幼小動物中pcv2感染或減輕由pcv2 感染引起或與PCV2感染有關之臨床症狀之方法，該方法包括向需要該治療之該動物投與有效量之？(：：¥2抗原的步驟，其中彼等臨床症狀係選自由下列組成之群：（1 )小葉間水腫之間質性肺炎；⑺肉質蒼白或黃疸；（3)具斑點萎縮性肝；（4)胃潰瘍；（5)腎炎及（6)生殖障礙，例如流產、死產乾屍化專荨，（7)軟膜（Pia)樣損傷，一般認為與細胞内勞森菌感染（迴腸炎）有關；（8)淋巴結病；（9)淋巴缺乏及/ 或（10)多核/巨組織細胞；（11)豬皮膚炎及腎病症候群 (PDNS); (12) PCVAD有關之大量死亡；（13) pcvAD有關之重里減輕，（14)降低之生長變異性；（1 5)降低之,，侏儒” 頻率；（16)降低之與豬生殖及呼吸疾病綜合症（pRRSv)之共感染。本發明組合物可口服、經真皮内、經氣管内或經陰道内施用。該組合物較佳可經肌内或經鼻内施用，最佳為經肌内施用。在動物體内，可證明經由靜脈内或藉由直接注射至目標組織中來施用該等上述醫藥組合物係有利的。對於全身施用，靜脈内、血管内、肌内、鼻内、動脈内、腹膜内、口服或鞘内途徑係較佳的。更局部施用可經皮下、經真皮内、經皮内、經心臟内、經葉内（intral〇bally)、經髓内、經肺内或直接在或靠近擬治療之組織（結締組織、骨組織、肌肉組織、神經組織、上皮組織）實現。端視治療 126748.doc •39- 200835515 所期望之持續時間及有效性，本發明組合物可投與—次或數次，亦可間歇投與，例如以每日計投與數天、數週或數月且以不同劑量。較佳地，一劑量之上述免疫原性組合物係經肌内投與至需要其之個體。根據又一態樣，pCV2抗原或上述包含任何該PCV2抗原之免疫原性組合物係裝入瓶中並以一〇)毫升/劑量投與。因此，根據又一態樣，本發明亦提供包= 上述PC V-2抗原之1毫升免疫原性組合物，其用於治療或預防幼小動物中PCV2感染或減輕由PCV2感染引起或與pcv2 感染有關之臨床症狀，包括向需要該治療之該動物投與有效量之PCV2抗原的步驟。根據又一態樣，本發明亦提供包含上述PC V-2抗原之1毫升免疫原性組合物，其用於治療或預防具有抗PCV2抗體之幼小動物中PCV2感染或減輕由 PCV2感染引起或與PCV2感染有關之臨床症狀，包括向需要該治療之該動物投與有效量之PC V2抗原或包含pcV2抗原之免疫原性組合物的步驟。根據又一態樣，至少向需要之個體另外投與一次至少一 WJ里之上述免疫原性組合物’其中第二次或任何另外投與係在初始或任何以前投與之後至少14天給予。較佳地，該免疫原性組合物係與免疫刺激劑一起投與。較佳地，該免疫刺激劑給予至少兩次。較佳地，在第一次與第二次或任何另外免疫刺激劑之投與中間有至少3天，更佳為至少5 天’甚至更佳為至少7天。較佳地，該免疫刺激劑係在本文所提供之免疫原性組合物之初始投與之後至少丨〇天，較 126748.doc -40- 200835515 佳為15天，甚至更佳為20天，甚至更佳為至少22天給出。較佳之免疫刺激劑係（例如）鑰孔蟲戚血蘭素（KLH)，較佳為經不完全弗羅因德氏（Freund’s)佐劑乳化之鑰孔蟲戚血蘭素（KLH/ICFA)。然而，同此應瞭解，亦可使用熟習此項技術者所習知之任何其他免疫刺激劑。本文所用術語，，免疫刺激劑”意指可觸發免疫反應（較佳地）而不引發或增加特定免疫反應（例如抵抗特定病原體之免疫反應）之任何試劑或組合物。進一步指示應以適宜劑量投與該免疫刺激劑。本文所用π動物π意指諸（swine4 pig)或仔豬。較佳實施例之詳細闡述以下實例闡明本發明之較佳材料及程序。儘管任何類似或等效於彼等本文所述者之方法及材料可用於本發明之實踐或測试中’但目前所述者係較佳之方法、裝置及材料。然而，應瞭解，該等實例僅為闡釋提供，且其中任何皆不應視為對本發明總範圍之限制。實例1 PCV2 ORF-2抗原之製備在持績攪拌下使來自液氮儲存器之初始SF+細胞培養物在 Excell 420 培養基（JRH Biosciences公司，Lenexa，KS)中在無菌旋轉燒瓶中之懸浮液中生長。使該等培養物在含有 25至150毫升Excell 420無血清培養基之1〇〇毫升至25〇 mL 旋轉燒瓶中生長。當細胞增殖至細胞密度為1·〇_8〇χ1〇6細胞/¾升時，將其以0.5-1.5Χ106細胞/毫升之種植密度分至新容器中。使隨後之擴展培養物在至多36公升尺寸之旋轉 126748.doc -41- 200835515 燒瓶中或在至多300公升之不銹鋼生物反應器中於25-29°C 下生長2-7天時間。接種後，將該等燒瓶在27°C下培育4小時。隨後，用含有PCV2 ORF-2基因（SEQ ID NO: 4)之重組杆狀病毒對每個燒瓶進行接種。含有PCV2 ORF-2基因之重組杆狀病毒係如WO 06/072065中所述產生。在接種杆狀病毒後，隨後將該等燒瓶在27=t2°C下培育7天且在此期間亦以100 rpm攪拌。該等燒瓶使用通風蓋以容許空氣流動。培育後，收穫所得上清液，將其過濾以移除細胞碎片並不活化。上清液係藉由使其溫度至37土2°C不活化並添加二元氮丙啶（BEI)至上清液中使得最終濃度為5 mM。隨後將樣品持續攪拌72至96小時。添加可使最終最小濃度為5 mM之1 ·0 Μ硫代硫酸鈉溶液以中和任何剩餘之BEI。在不活化後，將經磷酸鹽緩衝劑及Carpopol緩衝之PCV2 ORF-2 添加至約0.5至2.5毫克/劑量。最終劑量包含約16微克 PCV2 ORF-2抗原。實例2 抗PCV-2免疫分析將闡述於WO 02/07721中之PK15(例如ATCC CCL-33)或 VIDO R1細胞接種至96孔板上（約20.000至60.000個細胞/ 孔）。當單層約65°/◦至85%鋪滿時，將細胞用PCV2分離物感染。將經感染細胞培育48小時。移除培養基並用PBS將孔洗滌兩次。丟棄洗滌緩衝劑並將細胞在約-20°C下用冷 50/50甲醇/丙酮固著劑（約100微升/孔）處理約15分鐘。丟棄 126748.doc -42- 200835515 固著劑並空氣乾燥該等板。在pB S中製備豬血清樣品之連續稀釋液，添加至該等板中並在％」^^下將其培育約^ 小時以容許結合抗體（若存在於血清樣品中）。此外，抗 PC V2 %性及陰性對照樣品（陽性對照及陰性對照樣品）之連績稀釋液並行進行。隨後將該等板用PBS洗滌三次。丟棄 PBS。隨後將該等板用在PBS中以l1〇〇經稀釋之市售山羊抗豬FITC偶聯物染色並在36·5±Γ(：下培育約1小時，此容許檢測結合至經感染細胞之抗體。在培育完成後，自诗育箱中移出微板’丟棄偶聯物並用PBS將該等板洗條兩次。使用UV顯微術進行平板讀數且各孔以陽性或陰性報主。陽性對照及陰性對照樣品用以監測試驗系統。若對照在預期範圍内，則在試驗方法參數方面試驗結果係可接受的。使用顯示特異性IF A反應性之最高稀釋液計算血清抗體效價且使用適合之Reed-Muench公式計算每一稀釋液之陽性孔數量或50%終點。實例3 PCV2 ORF-2 (Ingelvac® CircoFLEXTM)在具有低或高抗 PCV2抗艘之幼小動物中之功效為研究疫苗之可能的母體抗體干擾，實施一項研究，其中在接種疫苗時測定所有研究動物之抗體效價，隨後將該等抗體效價分成低、中及高抗體等級：小於1 :丨〇〇之幾何平均效價視為低抗體效價’ 1 ·· 1 〇〇至1:10⑻之效價視為中抗體效價且大於1··1000之效價視為高抗體效價。研究實施 126748.doc -43- 200835515 該研究涵蓋約500只動物。均衡該等研究動物並根據初始體重及同胎幼仔分派（litter assignment)將其平均分配於兩個治療組中。在20日齡所有研究動物皆藉由在頸右側之肌内注射接受單一劑量（1毫升）之PCV2疫苗（研究用獸醫產品（Investigational Veterinary Product)，IVP)或單一（1 毫升）劑量之含有辅助性細胞培養物上清液之安慰劑（對照產品 (Control Product)，CP)。觀察研究動物直至育肥結束。收集所有研究動物之血液樣品並隨後藉由IFAT進行分析以測定接種疫苗時之抗體效價。此後，將初始抗體效價與重1增加相關聯。另外，端視初始抗體效價將動物分成三個等級（低、中及高抗體效價）且隨後將兩個治療組之，，高效價”動物關於重量增加及病毒血症之可能差異進行比較。結果初始抗體效價接種疫苗時大多數動物具有中抗體效價（定義為1:1〇〇至 1:1000)或咼抗體效價（定義為大於1:1〇〇〇)。僅大約之動物具有低抗體效價（定義為小於moo)。由於在研究開始時無PCV2感染，此可推斷在研究第〇天之抗體效價可能源自母體。兩個治療組間未觀察到研究第〇天之抗體效價之顯著差異。關於每效價等級動物之百分比之總覽在圖1 中給出。接種疫苗時之抗體效價與血液中病毒血症之相關性為確定接種疫苗時之高抗體效價（大於1:1〇〇〇)是否對病毒血症有影響，將接種疫苗及經安慰劑治療之具有高初始 126748.doc -44- 200835515 抗體效價之動物關於病毒血症之發作、終點、持續時間、陽性取樣天數及病毒負荷進行比較。表1概述兩個治療組之’’高效價動物’’之病毒血症參數的比較。表1 ··兩個治療組之”高效價動物11中病毒血症之比較所研究參數治療組豬之數量平均值中值 P 病毒血症之發作 CP 38 111.90 天 113.00 天 0.7843 IVP CP-IVP 36 109.50 天 2.4天 113.00 天 ns 病毒血症之持續時間 CP 38 27.00天 27.50 天 <04001 IVP CP-IVP 36 17.50 天 9.50 Λ 6.50 天病毒血症之終點 CP 38 138.90 天 141.00 天 0.0033 IVP CP-IVP 36 127.00 天 11.9 天 122.50 天 ** 陽性取樣天數 CP 39 3.70 天 3.00 天 0.0082 IVP CP-IVP 47 1.80 天 1.9天 1.00 天 ** 平均總gE (loglO) CP 39 18.79 gE 17.21 gE < 0.⑽ 01 IVP CP-IVP 47 9.12 gE 9.67 gE 5.38 gE *** gE :每毫升基因組當量數之總數

?:組間比較之\\^1〇)父〇11?^1111-\\/^^^檢驗之卩值；118:不顯著，卩>0.05;**顯著，卩< 0.01 ;***顯著，ρ<0·001 與經安慰劑治療之高效價動物相比，在研究期間接種疫苗之高效價動物之病毒血症持續時間縮短9.5天，病毒血症終點提早11.9天，病毒血症取樣天數減少1.9天且基因組當量數/毫升之總數減少約2倍。該等結果表明，在有高母體抗體效價之情形下IVP仍同樣可顯著減輕血液中之病毒血症（病毒血症終點、病毒血症持續時間、病毒負荷）。接種疫苗時之抗體效價與重量增加之相關性然後研究初始抗體效價是否對研究期間之重量增加有效 126748.doc -45- 200835515 果。表2給出藉由計算Spearman秩係數及p值確定之不同時間間隔之初始抗體效價與重量增加的相關性。兩個治療組均在研究第0至7週發現統計學上顯著之抗體效價與重量增加間的負相關性，此表明高母體抗體效價消極影響飼育階段之重量增加發展。未觀察到其他統計學上顯著之不同時間間隔期間初始抗體效價與重量增加間的相關性。因此，可推斷對於接種疫苗或經安慰劑治療之動物自10週齡（研究第7週）起母體抗體效價之量對重量增加均無影響。表2 :接種疫苗時之PCV2抗體效價與研究期間體重增加之相關性接，聲疫苗時之抗體效價與重量增加之相關性研究第研究第研究第研究第 0_7週 7-12 遇 12-17 週 17-22 週 r -0.09623 0.03501 -0.00521 -0.02774 CP P 0.0086 ** 0.3425 ns 0.8884 ns 0.4617 ns η 744 737 728 706 r -0.09748 0.04309 -0.00954 0.02694 IVP P 0.0077 ** 0.2440 ns 0.7974 ns 0.4710 ns η 746 733 727 718 r : Spearman秩相關係數 P :在r=0時之檢驗p值；ns:不顯著，p>0.05 ; **顯著，p^O.Ol η :動物數量與此結論一致，當比較接種疫苗組之低及高效價動物時關於活體重未發現差異。圖2顯示不管初始抗體效價之量如何病毒血症發作後（研究第17及22週）之體重係相當的（圖 2)。 126748.doc -46- 200835515 此外，與經安慰劑治療之具有初始高抗體效價之動物相比，接種疫苗時具有局抗體效價（大於1:1000)之接種疫苗之動物在病毒血症發作後亦顯示顯著較高之體重。如圖3 中可看出，在研究第17週及研究第22週，接種疫苗之，，高效價動物’’之體重（LSMean)(研究第17週：1·55公斤，p = 0.0328 ;研究第22週·· 3.06公斤，ρ = 〇·〇〇〇7)確實顯著高

i 於經安慰劑治療之”高效價動物”之體重。該等發現共同表明，接種疫苗時之抗體效價對IVP無干擾。結論為分析可能之母體抗體干擾，使初始抗體效價與兩個功效參數血液中之病毒血症及活體重相關聯。與經安慰劑治療之”高效價動物”相比，可注意到接種疫苗之，，高效價動物’’具有以下統計學上顯著之發現。、 - 降低增重之損失 -縮短病毒血症之持續時間及較早終止病毒血症 - 較低之病毒負荷 PCV2 〇购（Ingelvae@ CircoFLExTM)在具有抗pm抗趙之幼小㈣巾對於淋巴缺乏、淋巴發炎及淋巴免疫組織化學（IHC)之功效此盲法接種疫苗攻擊研究之目的係評價在源緒第二型環狀病毒（PCV2)抗體存在下在何齡期用第環狀病毒疫苗經殺滅杆狀病毒載體對猪進行接種疫：可產生免疫性。攻擊後對三個主要參數進行分析 126748.doc -47- 200835515 數包括淋巴缺乏、淋巴發炎及淋巴免疫組織化學（IHC)。為證實在PCV2源自母體之抗體存在下之免疫性，在3週齡或在8週齡用PCV2疫苗接種疫苗之常規飼養的豬與在3週齡用對照產品治療之攻擊對照豬相比必須對於淋巴缺乏、淋巴發炎及淋巴IHC展示統計學上之顯著差異（p<0.05)。研究實施將一百二十（12〇)只常規飼養的豬（在第〇天（D0)：21日齡）完全隨機地分配至5個治療組之1個組中。在D0，收集所有褚之血液樣品’ • 組la在3週齡用研究用獸醫產品（IVP ; PCV2參考疫苗）治療。 • 組lb在8週齡用研究用獸醫產品（IVP ; PCV2參考疫苗）治療。 • 組2在3週齡用對照產品（CP)治療。在接種疫苗後D-1至D59觀察豬之臨床評定。另外，在 D14、D28、D42、D5 6及D63採集攻擊前之血液樣品。攻擊前組PC V2血清學幾何平均效價（GMT)之概述顯示於下表 3中。表3 ··攻擊前組PCV2血清學幾何平均效價組-治療 PCV2血清學-GMT DO D14 D28 D42 D56 D63 組la 在3週齡投與IVP 556.5 252.8 142.0 56.2 32.0 51.3 組lb 在8週齡投與IVP 476.2 308.2 151.6 36.2 29.3 48.3 126748.doc •48- 200835515 組-治療 PCV2血清學-GMT D0 D14 D28 D42 D56 D63 組2 在3週齡投與CP 513.8 310.7 134.3 36.9 16.9 24.5

所有剩餘的豬在D60(攻擊後天數（DPC) -3)及D66 (DPC 3)肌内注射（IM)接受2.0毫升經不完全弗羅因德氏佐劑 (ICFA)乳化之鑰孔蟲戚血蘭素（KLH)。在D63 (DPC 0)，剩餘的豬肌内注射（IM)接受1.0毫升PCV2愛荷華州立大學獸醫診斷實驗室（Iowa State University Veterinary Diagnostic Laboratory)(lSUVDL)攻擊物質（4·75 log10 TCID5〇/毫升）及鼻内（IN)接受ΐ·〇毫升相同物質。在攻擊之日及攻擊後定時採集體重、直腸溫度、臨床觀察、血液樣品及鼻試樣。在每只豬之屍體剖檢時，記錄肉眼損傷並收集肺及淋巴組織樣品。藉由ISUVDL在顯微鏡下對肺及淋巴組織損傷進行檢測且藉由IHC檢驗檢測PCV2抗原之存在。該研究攻擊階段之概述顯示於下表4中。表4 :研究之攻擊階段組-治療數量 KLH/ICFA 在D60 (DPC -3) PCV2攻擊在D63 (DPC 0) KLH/ICFA 在D66 (DPC 3) 屍鱧剖檢之曰組la 投與IVP 在3週齡 20 是是是 D87(DPC24)或 D88 (DPC 25) 組lb 投與IVP 在8週齡 21 是是是 D87 (DPC 24)或D88 (DPC 25) 組2 投與CP 在3週齡 20 是是是 D87 (DPC 24)或D88 (DPC 25) 126748.doc •49- 200835515 在D86，幾何平均效價分別為906.6、2447.1、2014.9。結果在D63之PCV2攻擊暴露及隨後之屍體剖檢後，組la具有統計學上顯著較低之呈淋巴缺乏陽性之豬的比例（p = 0.0084)，較低之呈淋巴發炎陽性之豬的比例（p="079)，及較低之IHC淋巴陽性組織之豬的比例（ρ=0·0031)，以上全部與組2比較。PCV2攻擊後，組lb具有統計學上顯著較低之呈淋巴缺乏陽性之豬的比例（p==0.0148)，較低之呈淋巴發炎陽性之豬的比例（ρ=〇·〇〇36)，及較低之IHC淋巴-陽性組織之豬的比例（ρ==0·0013)，以上全部與組2比較。組 la、lb及2之主要功效參數結果之概述顯示於下表5中。表5 :組1 a及1 b與組2相比主要功效參數結果之概述組-治療在第0天之PCV2 血清學狀態淋巴缺乏 (+/總數）淋巴發炎 (+/總數）淋巴 IHC (+/總數）組la IVP在3週齡血清陽性 1/20 (5%) *p=0.0084 3/20 (15%) *ρ=0·0079 3/20 (15%) *ρ=0.0031 組lb IVP在8週齡血清陽性 2/21 (9.5%) *p=0.0148 3/21 (14.3%) *ρ=0·0036 3/21 (14.3%) Λρ=0.0013 組2 CP在3週齡血清陽性 9/20 (45%) 12/20 (60%) 13/20 (65%) *與組2比較之p值-費希爾氏（Fisher’s)確切檢驗與組2相比，組la與lb具有顯微鏡可見肺炎之顯著差異 (p^O.0407)，但是藉由IHC檢驗該等組之間PCV2抗原陽性之肺組織檢驗無顯著差異（p^O.23 17)。與組2相比，組la與 lb間接種疫苗後之臨床評定、ADG、攻擊後之臨床徵兆、發熱、PCV2之鼻排毒、總肺評分及淋巴結病無顯著差 126748.doc -50- 200835515 異。總之’與組2相比，可顯著保護組ia(在3週齡接種疫苗且接種疫苗時具有556·6 GMT)免於淋巴缺乏、淋巴發炎且藉由IHC檢驗淋巴組織檢驗呈PC V2抗原陽性。與組2相比’可顯著保護組lb(在8週齡接種疫苗且接種疫苗之前1 週具有151.6 GMT)免於淋巴缺乏、淋巴發炎且藉由IHC檢驗淋巴組織檢驗呈PCV2抗原陽性。當早在3週齡接種疫苗時，可保護具有PCV2源自母體之抗體的豬免於豬環狀病毒相關疾病。【圖式簡單說明】圖1 :接種疫苗時之抗PCV2抗體效價等級。圖2 :具有低（小於1:100)及高（大於1:1000)抗PCV2抗體之接種疫苗之動物之活體重比較。圖3 :與經安慰劑治療之對照動物（CP)相比，接種疫苗動物之體重差異（IVP)。 126748.doc -51 -

Claims

200835515 十、申請專利範圍： 1· 一種PCV2抗原於製備藥劑之用途，該藥劑係用於治療或預防具有抗PCV2抗體及/或1至22日齡之動物 a) PCV2感染，·或 b) 用於減輕由PCV2感染引起或與1>(：¥2感染有關之臨床症狀。 2·如請求項1之用途，其中該等抗PCV2抗體係母體抗體。 3.如請求項1或2之用途，其中該等動物在pcv特異性免疫分析中具有大於1:100之抗Ρ(：ν·2抗體效價。 4·如請求項1或2之用途，其中該等動物在pcv特異性免疫分析中具有大於1:1000之抗PCV_2抗體效價。 5·如請求項1或2之用途，其中該等治療動物在投與pcv2抗原時具有該抗PCV2抗體效價。 6·如請求項1或2之用途，其中該藥劑係用於7曰齡或之後投與。 7·如請求項1或2之用途，其中該藥劑係用於14曰齡或之後投與。 8·如請求項1或2之用途，其中該藥劑係用於不大於7週齡時投與。 9·如請求項1或2之用途，其中與未經治療之相同物種之對照組動物相比，該治療或預防達成5天或更多天之病毒血症期縮短。 10·如請求項1或2之用途，其中該PCV2抗原係一種與PCV2 之ORF-2具有至少80%同源性之多肽。 126748.doc 200835515 11·如請求項1或2之用途，其中該PC V-2抗原係一種重組杆狀病毒表現之PCV2之ORF-2。 12.如請求項1或2之用途，其中該PCV-2抗原係Ingelvac® CircoFLEXTM。 13·如請求項！或2之用途，其中〇.5至18微克/劑量之該PcV2 抗原存在於該藥劑中。 14·如請求項之用途，其中僅一劑量之p(：v2抗原存在於該藥劑中。 1 5·如晴求項1或2之用途，其中與未經治療之相同物種之對照組動物相比，該PCV2感染之治療或預防達成一個選自由下列組成之群之疫苗功效參數的改良：降低增重之損失，縮短病毒血症持續時間，較早終止病毒血症，較低之病毒負荷，或其組合。 16.如明求項丨或2之用途，其中該動物係豬。 126748.doc