SU454750A3 - Способ получени ингибитора глюкозидаз - Google Patents

Description

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИНГИБИТОРА ГЛЮКОЗИДАЗ

Мицелии экстрагируют два раза ацетоном, каждый раз п тикратно (по отношению к объему мицели ), а потом один раз п тикратным объемом диэтилового эфира. Извлеченный мицелиевый остаток высушивают в вакууме при 20°С, полученный сухой порошок из мицели  извлекают 4-8 вес. ч. диметилсульфоксида (ДМСО).

Ингибиторы глюкозидаз  вл ютс  пригодными терапевтическими средствами при следующих показани х: ожирение, гнперлипеми  (атеросклероз), диабет, предиабет, гастрит, Ulcus ventricLili, Ulcus duodeni и кариес. Токсичность ингибиторов глюкозпдаз чрезвычайно мала.

Пример 1. Каждую из трех колб Эрленмейера емкостью 1 л, которые содержат 200 мл жидкой питательной среды, состо ш,ей из 2% крахмала, 17о глюкозы, 0,5% NZ-аминов , 1% дрожжевого экстракта, 04% СаСОз (стерилизаци  30 мин при 121°С, перед стерилизацией рН 7,2) засевают 1 мл предварительной культуры штамма CBS 951.70. Abpullariellae regularis, полученной в той же жидкой питательной среде инокулированной культуралш, выращенными в нробирках со скощенным агаром на основе овс ных хлопьев, и инкубируют при 28°С на вращающемс  аппарате дл  встр хивани . После культивировани  в течение 5,5 дней соедин ют содержимое трех колб и отдел ют мицелий центрифугированием. Получают 425 мл жидкости, содержащей 100 ЕИА/мл.

Отделенную жидкость сгущают в ротационном испарителе при 15-20 торр и температуре вод ной бани 37° до 60 мл. В зкий раствор смешивают с 480 мл этанола. Выпадающий осадок собирают центрифугированием , раствор ют оп ть в 60 мл воды и подвергают диализу в течение 6 час с дистиллированной водой, диализат затем лиофилизуют.

Выход: 1,6 ГС 19-103 ЕИА/г.

Пример 2. Из среды, описанной в примере 1, при цептрифугировапии получают 440 мл отделенной жидкости с 100 ЕИА/мл. Эту жидкость сгущают в ротационном испарителе до 100 мл. Сгущенный раствор вмещивают в 800 мл этанола, осадок собирают центрифугированием и после двукратной промывки ацетоном и однократной промывки простым эфиром сущат при комнатной температуре в вакууме.

Выход: 2,2 ГС 15.103 ЕР1А/г.

Пример 3. Каждую из трех колб Эрленмейера емкостью 1 л, содержащие ио 200 мл жидкой питательной среды, состо щей из 3% глицерина, 3% осевой муки, 0,2% СаСОз (стерилизаци  30 мин при 121°С, после стерилизации рП 7,2) засевают 1 мл предварительной культуры штамма CBS Actinoplanes spec (полученной в той жидкой питательной среде , инокулированной культурами, выращенными в пробирках со скощенным пептонно -

казеиновым агаром Чапека) и подвергают трехдневной инкубации при 28°С на вращающемс  аппарате дл  стр хивапи .

После инкубации соедин ют содержимое колб и отдел ют мицелий центрифугированием . Получают 500 мл отделенной жидкости, содержащей 450 ЕИА/мл.

Отделенную жидкость смещивают при размещивапии отдельными порци ми с 250 г КП-сульфата, а затем цептрифугируют в течение 10 мип со скоростью 12000 об/мин.

Осадок раствор ют в 100 мл дистиллированной воды и смещивают с 400 мл ацетона. Получаетс  легко выпадающий осадок, его декантируют, два раза промывают ацетоном и один раз простым эфпром и сушат в вакууме .

Выход: 13,4 г 10-103 ЕИА/г.

П р и м е р 4. При засеве 120 мл жидкой питательной среды, оппсаппой в примере 1, наход щейс  в колбе Эрленмейера, емкостью в 1 л культурой штамма АТСС 3319 Streptomyces flaveolus, выращенной в пробирке со скощенным агаром, после культивировапи  в течение 3 дней при 28°С на вращающемс  аппарате дл  встр хивани  получают культуральный раствор, который содержит 25 ЕИА/мл.

Пример 5. Если засевают 24 колбы, содержащие но 120 мл жидкой питательной среды , описанной в нримере 3, нредварительной культурой штамма CBS 955.70 Actinoplanes spec, и подвергают их в течение 5 дней инкубации при 28°С, то в результате центрифугировани  получают 2,0 л отделенной жидкости 1,1 ЕИА/мл. Эту жидкость сгущают в ротациоппом испарителе до 200 мл и в течение суток подвергают диализу при комнатной темнературе с 2 л дистиллированной воды в диализационпом шланге Вискинга. Паружную среду, содержащую ингибитор, сгущают вращением до 100 мл и вканывают нри размешивании в 900 мл абсолютного этанола. Выпадающий почти неактнвный осадок отдел ют центрифугированием и удал ют, а отделенную центрифугированием спиртовую жидкость сгущают при вращении до 30 мл (1 мл этого концентрата содержит 70 ЕИА/мл.

Дл  дальнейшей очистки этот раствор пропускают через анионообменную смолу (амберлит типа IRA 410, ацетатна  форма в 0,05 М ацетате аммони , рП 7; размер сло  2,520 см), соедин ют активные фракции и подиергают гельфильтрации с помощью «Sephadex G 75 в воде. Активные фракции от гельфильтрации сгущают до 12 мл.

1 мл этого раствора содержит 150 ЕИА/мл. 500 мл мпцели  извлекают два раза с помощью 1 л ацетона и один раз с помощью 1 л простого эфира, экстракты соедин ют и сгущают при вращении в вакууме досуха. Получаемый мицелиевый остаток сушат в вакууме при 20°С, а получаемый сухой порошок

мицели  ( г) извлекают в течение 2 час 56

при комнатной температуре с помощью 150млПредмет изобретени  диметилсульфоксида. После центрифугировани  в течение 30 мин при 15000 об/мин) досу-Способ получени  ингибитора глюкозидаз, ха сгущенный ацетоново-эфирный экстракт по-отличающийс  тем, что, с целью повыщеглощаетс  наход щейс  над порощком жидко-5 ни  удельной активности и выхода целевого стью диметилсульфоксида.продукта, в качестве исходного сырь  испольВыход ингибитора: 120 мл с 3 ЕИА/мл.зуют мицелий и/или культуральную жидкость

454750

актиномицетов.