DE2064092A1

DE2064092A1 - Inhibitoren für Glykosidhydrolasen aus Actinomyceten

Info

Publication number: DE2064092A1
Application number: DE19702064092
Authority: DE
Inventors: Werner Dr.; Puls Walter Dr.; 5600 Wuppertal; Schäfer Dietmar 6404 Neuhof; Schmidt DeIf Dr. 5600 Wuppertal-Vohwinkel Frommer
Original assignee: Bayer AG
Current assignee: Bayer AG
Priority date: 1970-12-28
Filing date: 1970-12-28
Publication date: 1972-07-20
Also published as: FI49774B; JPS57150395A; LU64319A1; ATA1111571A; SE398357B; FI49774C; RO63065A; AR193370A1; ZA718677B; CS167961B2; US3876766A; ES398358A1; NL7117893A; JPS6216638B2; AU3721471A; CH594051A5; BG26003A4; IL38441A; KR780000248B1; DK139533C

Description

2064092 FARBENFABRIKEN BAYER AG

LEVERKU S EN -Bayerwerk 25· DeZ . 1970 Patent-/bteiluBX Si/MH

Inhibi t ο ren für Glykosidhydrolaaen aus Actinomyceten

Es ist bekannt, daß os-Amylasen durch verschiedene niedermolekulare Substanzen, wie- z. B. Salicylsäure und Abiseisin, inhibiert werden können /T. Hemberg, J. Larsson, Physiol. Plant,'JM^ 861 (1961), T. Heiabcrg, Ac ta Chem« Scand. 21 , 1665 (196727· Es ist weiter bekannt, daß auch höhermolekulare Substanzen existieren, die die Aktivität von einigen Amylasen unspezifisch durch physikalische Adsorption /T. Cihvzaftzr.Zi J. Janicki, BiQeh. Z. 260, 354.(1933) und Bioch. J. 28^ 296 (193427 oder.durch Denaturierung und Ausfällung des Enzyms /ß. S. Miller, E. Kneen, Arch. Bioehem. 15j. 251 (1947), D. H. Struhmeyer, M, H. Malin, Biochem. Biophys. Acta 184 _Λ _ι 643 C1 969JJ7 zu hemmen vermögen. Weiterhin ist beobachtet worden, daß mit destilliertem Wasser aus Weizen eine Substanz eluiert werden kann, die die dextrifizierende Aktivität von Speichelamylase herabset-zt, die Aktivität von Pankreasamylase jedoch wenig beeinflußt /Έ. ^rÄ.neen_f R. M-. Sand--_ stedt, Arch. Bioch. 9j_ 235 (1946^7.

Ein Nachteil"der beschriebenen Substanzen ist, daß die Hemmung der Amylase entweder unspezifisch ist oder daß die Hemmaktivität der beschriebenen Stoffe besonders gegenüber Pankreasamylasen - wie' eigene Untersuchungen zeigten - gering ist, das heißt, daß erst bei sehr hohen Relationen von Inhi- . bitor : Enzym fast vollständige Hemmungen der Amylasen (bis zu 90 fo und höher) erreicht werden.

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Gegenstand zweier älterer Vorsehläge (Deutsche Patentanmeldungen P 2003934.3 und P,2028739.2) sind Amylase-Inhibitoren. * In den genannten älteren Vorschlägen wird nämlich gezeigt^ daß sich mit wäßrigen Elektrolyt-Lösungen, vorzugsweise verdünnten Säuren,oder vor allem mit Wasser-Alkohol-iC^-C,- , Alkohole)-Mischungen, vorzugsweise bei- sauren pH-Werten, aus Weizen (Weizenschrot, Weizennehl oder Weizenkleber) oln hochaktiver Inhibitor für Pankreasamylase in hohen Ausbeuten ..." extrahieren läßt, der die genannten Nachteile nicht zeigt. Diese so gewonnene Substanz inhibiert Pankreasamylase schon bei sehr niedrigen Inhibitor : Enzym-Relationen zu über 90 $.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind nun Inhibitoren für Glykosidhydrolasen aus Actinomyceten, und zwar insbesondere Inhibitoren für Glykosidhydrolasen vorzugsweise kohlenhydratspaltender Enzyme des Verdauungstrakts aus Actinomyceten. Diese Inhibitoren werden von Mikroorganismen der Ordnung Actinomycetales, besonders von solchen der Familie Streptomycetaceen, Mikromonosporaceen, Nocardien und vor allem von solchen der Familie Actinoplanaceen gebildet. In besonders hohem Maße werden sie gebildet von Stämmen der Gattungen Actinoplanes, Ampullariella und Streptosporangium.

Zur Auffindung wirksamer Stämme bedient man sich der nachstehend beschriebenen Methoden. '

Aus Erdproben isoliert man in bekannter Weise Stämme der Ordnung Actinomycetales, insbesondere solche der Familien Streptomycetaceen und Actinoplanaceen. Mit Abimpfungen dieser Stämme beimpft man Kulturkolben mit Nährlösungen, die das Wachstum dieser Stämme erlauben. Man kann z. B. die Glycerin-Glykokoll-Nährlösung nach von Plotho mit der Zusammensetzung 2 $ Glycerin, 0,25 $> Glykokoll, 0,1 «5 NaCl, 0,1 # K₂HPO₄-, 0,01 io FeSO₄ . 7 H₃O, 0,01 $> MgSO₄ · 7 H₂O und 0,01 # CaCO₃ verwenden. Des schnelleren Anwachsens wegen gibt man zweck-

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mäßigerweise in eine solche Nährlösung noch komplexe Kohlenstoff quellen, wie z. B..Maisquellwasser oder Sojamehl oder Hefeextrakt oder Proteinhydrolysate, z. B. NZ-Araine, oder Mischungen dieser Stoffe. In diesen Fällen muß der pH-Wert der Lösung eingestellt werden. Man bevorzugt ein Anfangs-pH der Nährlösung zwischen 6,0 und 8,0, insbesondere zwischen 6,5 und 7,5.

Das Glycerin der Nährlösung kann man auch durch andere Kohlenstoff quellen, wie z. B. Glukose oder Rohrzucker oder Stärke oder Mischungen dieser Stoffe, ersetzen. An Stelle des GIykokolls kann man auch andere Stickstoffquellen, wie z. B. Hefeextrakt, Sojamehl, NZ-Amine, Pharinamedia u. a., verwenden. Die Konzentrationen der Kohlenstoff- und Stiekstoffquellen wie auch die Konzentrationen der Salze können in weiten Grenzen schwanken. FeSO,, CaCO, und MgSO. können auch ganz fehlen. Von der Nährlösung füllt man z. B. 100 - 200 ml in I-Liter-Srlenineyer-Kolben, sterilisiert in bekannter Weise, beimpft mit dem zu untersuchenden Stamm und bebrütet den Kolben bei 15 - 45⁰C, vorzugsweise bei 24 - 32⁰C, auf Schüttelmäüchinen. Zeigt die Kultur Wachstum, was im allgemeinen nach 1-10 Tagen, meist nach 3-5 Tagen, geschieht, so entnimmt man eine Probe von z. B. 5 ml und trennt in dieser Probe das Mycel durch Filtration oder Zentrifugation ab. Von den Kulturbrühen verden 0—100 >ul in den nachfolgend beschriebenen Testen eingesetzt und die Hemmkapazität pro ml berechnet.

Die Mycelien werden 2 χ mit je 5 Vol. (bezogen auf Mycelvolumen) Aceton und anschließend mit 1x5 Vol. Diäthyläther extrahiert, der extrahierte Mycelrückstand im Vakuum bei 20° getrocknet und das erhaltene Myceltrockenpulver mit 4 - 8 Gewichtsteilen Dimethylsulfoxid (DMSÖ) extrahiert.

Die beiden Aceton- und der Äther-Extrakt werden vereinigt und fast zur Trockne im Vakuum eingeengt. Der Rückstand dieser

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Extrakte wird mit dem,.OJ^O-^.t^§tot^-jwis-;dem Trockenpulver aufgenommen und 0 - 1 (J© yul, davon in die nachfolgend beschriebenen Teste eingesetzt.

Amylaseteat .."..·:'... ^v

Eine Amylase-Inhibitor-Einheit (1 AIE) ist definiert als die Menge Inhibitor, die zwei Amylaseeinheiten zu. W $ inhibieren; Eine Amylaseeinheit (AE) ist die Menge an Enzym, die in einer Minute unter den unten angegebenen Testbedingungen 1 yu lq.uivalent glucosidiseher Bindungen in der Stärke spaltet* Die yuVal gespaltenen Bindungen werden als yuVal gebildeter reduzierender Zucker mit Dinitrosalicylsäurekolorimetrisch bestinimt und mit Hilfe einer Maltoseeiöhkurve äIs ·/uVal Maltöseäquivalente angegeben. Zuj· Durchführung des ieetes werden 0,1 ml Amylaselösung (20— 22 AE/ml) mit O - 400 yug Inhibitor oder 0-100 -Ml der zu testenden iCulturlÖBuiig bzw, Mycelextrakte in 0,4 ml 0_t02 m Natriuffiglycer^hpsphätpüffer / 0,001 m CaCl₂ pH 6,9 versetzt und eti*a 10 - 20 Minuten in einem Wasserbad von 35⁰G ä^uilibriert, Dann wird 5 Minuten mit 0,5 ml einer auf 35⁰G Torgewtoiten 1 1» Stärjkelösung löslich, der Eiraa Merck> j)armstadtv Nr# 125|7

bei 35⁰C inkubiert und anschließend mit T ml |)initrosalicylsäure-Reagens ^iach P.. Bernfeld in Colowick-Kaplan, Meth. Enzymol., Band ^ Seite 14Jp^ Versetzt» Zur !»arbentwicklung ■' wird der Ansatz 5 Minuten auf dem siedenden Wasserbad #rhitzt,.dann abgekühlt und mit 10 ml destilliertem Wasser\ versetzt. Die Extinktion bei 540 nm wird gegen einen entsprechend angesetzten Leerwert ohne Amyläse gemtesen. Zur Auswertung wird aus einer vorher aufgenommenen Ainyläseeichkurve die nach Inhibitorzueatz noch wirksame Amylasieäktivität abgelesen und daraus die prozentuale^ Hemmung der eingesetzten Amylase errechnet. Die prozentuale Hemmung wird .als Punktion des Quotienten > »

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Inhibitory ;- 2064092 ■

+ bezogen auf Trockensubstanz.

++ AE im nicht inhibierten Ansatz-der gleichen Serie

aufgetragen, der 50■$ Hemmungspunkt aus der Kurve abgelesen und auf AIE/mg Inhibitor umgerechnet.

Saccharasetest

Eine Saccharase—Inhibitor-Einheit (SIE) ist definiert als die Menge Inhibitor, die zwei Saccharaseeinhelten zu 50 $ inhibieren.. Eine Saccharaneeinheit (SE) ist die Menge an Enzym, die in einer Minute unter den unten angegebenen Testbedingungen 1 /uMol Saccharose in Glucose und Fructose spaltet. Die /uMol gespaltener Saccharose werden· als gebildete Glucose und Fructose mit Dinitrosalicylsäure kolorimetrisch bestimmt und mit Hilfe einer Glucose/Fructose-Bichkurve ermittelt.

Zur Durchführung des Testes werden 0,1 ml Saccharaselösung ' (0,3 - 0,4 SE/ml) mit 0 - 400 /Ug Inhibitor bzw. 0. - 50 yul der zu untersuchenden Kulturlösung des Mycelextraktes in 0,1 ml 0,1 m Ua-Maleinatpuffer pH 6,0 versetzt und etwa 10 - 20 Minuten in einem Wasserbad von 35⁰C" äquilibriert. Dann v;ird 60 Minuten mit 0,2 ml einer auf 35°C vorgewärmten 0,056 m Saccharoselösung (Saccharose Fa. Merck, Darmstadt, Nr. 7652) bei 35⁰C inkubiert und anschließend mit 0,5 ml Dinitrosalicylsäure-Reagens (nach P. Bernfeld in Colowick-Kaplan, Meth. Enzymol, Band JT₁ Seite 149) versetzt. Zur Färbentwicklung wird der Ansatz 5 Minuten auf dem siedenden Wasserbad erhitzt, dann abgekühlt und mit 5 ml destilliertem Wasser versetzt. Die Extinktion bei 540 nm v/ird £egen einen entsprechenden leerwert ohne Saccharase gemessen.

1) Solubilisierte Saccharase aus Schweinedarmmucosa nach B. Borgström, A. Dahlquist, Acta Chem. Scand. 12, (1958) Seite 1997

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Zur Auswertung werden die nach Inhibitorzusatz noch wirksamen Saccharaseeinheiten aus der Eichkurve ermittelt und daraus die prozentuale Hemmung der eingesetzten Saccharase berechnet.. Die prozentuale Hemmung wird als Punktion des Quotienten

Inhibitor +

SE ++

+ bezogen auf Trockensubstanz .

++ SE in nicht inhibiertem Ansatz der gleichen Serie

aufgetragen, der 50 $ Hemmpunkt aus der Kurve abgelesen und auf SIE/mg Inhibitor umgerechnet.

Maltasetest

Eine Maltase-Inhibitor-Einheit (1 MIE) ist definiert als die Menge Inhibitor, die zwei Maltaseeinheiten zu 50 $ inhibieren, Eine Maltaseeinheit (ME) ist die Menge an Enzym, die in einer Minute unter den unten angegebenen Testbedingungen 1 ai Äquivalent glucosidischer Bindung im p-Nitrophenyl-a-D-Glucopyranosid spaltet. Die yuVal gespaltener Bindung werden als yuVal p-Nitrophenolat photometrisch bestimmt.

Zur Durchführung des Testes werden O₉05 ml Maltaselösung ' (0,09 - 0,12 ME/ml) mit 0 - 400 yug Inhibitor bzw. 0 - 20 yul der zu untersuchenden Kulturlösung bzw. des Mycelextraktes in 0,05 ml 0,1 m Na-Maleinatpuffer pH 6,0 etwa 10-20 Minuten in einem Wasserbad von 35⁰C äquilibriert. Dann wird 30 Minuten mit 0,1 ml einer auf 35⁰C vorgewärmten 0,4 # Lösung von p-Nitrophenyl-Oi-D-Glucopyranosid (Pa. Serva, Heidelberg,

1) Solubilisierte Maltase aus Schweinedarmniucosa nach . B. Borgström, A. Dahlquist, Acta Chem. Scand. V^_x (1958) Seite 1997 oder Maltase in Form von Humanpankreassaftlyophilisat

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Nr. 20716) in 0,1 m Na-Maleinatpuffer pH 6 bei 35 und die Reaktion anschließend durch Zusatz von 2 ml 0,565 m Trispuffer pH 7,6 abgestoppt. Die Extinktion bei 403 mn wird sofort gegen einen entsprechend angesetzten Leerwert ohne ' Maltese gerne6sen.

Zur Auswertung werden unter Zugrundelegung eines molaren Extinktionskoeffizienten von E._Q, = 13,2 χ 10* für das

p-Nitrophenolatanion bei pH 7,6 die nach Inhibitorzusatz noch wirksamen Maltaseeinheiten und daraus die prozentuale Hefimung der eingesetzten Maltase berechnet. Die prozentuale Hemmung wird als Punktion des Quotienten

Inhibitor +

MB ++

+ bezogen auf Trockensubstanz
++' ME in nicht inhibiertem Ansatz

aufgetragen, der 50 J* Hemmpunkt aus der Kurve abgelesen und auf MIE/mg Inhibitor umgerechnet.

Da bei diesem einfachen Routine-Test mit einem künstlichen Substrat und nicht dem eigentlichen Substrat der Maltase (Maltose) gearbeitet wird, werden die Präparate zusätzlich auf ihre maltaseinhibierende Wirksamkeit in einem aufwendigeren, von Dahlquist (Enzym, biol. elin. 11. 52/1970) beschriebenen Maltasetest geprüft. Hierbei wird die bei der Einwirkung von Maltase auf Maltose entstehende Glucose enzymatisch mit Hilfe von Glucoseoxidase, Peroxidase und Dianisidin kolorimetrisch gemessen. Alle hier beschriebenen Maltaseinhibitoren hemmen auch in diesem Test.

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• ." ■ * 2064032

Wach der oben beschriebenen Methode wurde eine ganze Reihe von Stämmen verschiedener Familien und Gattungen der Ordnung Actinomycetales geprüft. Dabei wurden in verschiedenen Familien und Gattungen, -wenn auch zum-Teil schwache, so doch

deutliche Glycosidhydrolasen inhibierende Aktivitäten ge-

funden. Am günstigsten hinsichtlich der Ausbeute waren die Stämme der Familie der Streptomycetaceae und besonders die der Familie der Actinoplanaceae.

Innerhalb dieser Familien wurden besonders in den Gattungen Streptomyces, Actinoplanes, Ampullariella und Streptosporangium wirksame Stämme gefunden. Von den geprüften Stämmen erwiesen sich die unten aufgeführten Stamme in einem oder mehreren der angeführten Teste als besonders wirksam.

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Täte 1 1 e

Stamrc-Nr.

Name

Hemmwirkung

Amylase Maltase Saccharase

eigene
Bezeichng.

CBS-Nr.

K M

SB	2	951	.70	Ampullariella	+++	+++	+++	+++	++	++	_m
				regularis
SB	5	952	.70	Il
SB	11	955	.70"	Actinoplanes	+++		+	++
				spec.	+++			- ■
SB	12	956	.70	Il	+++
SB	18	957	.70	Il	+++		++	++
SB	27	958	.70	Il
SB	46	959	.70	Il		++			+++	++
SE	5	960	-70	Actinoplanes	+++
				spec.		+			++	++
SE	21	953	.70	Ampullariella	+++		+++	++
				regularis	+++
SE	39	954	.70	It			++	++
SE	50	961	.70	Actinoplanes	++			++
				spec.
SE	55	962,	,70	■ '·?■				++
SS	2$	963-	70	Streptospo-			++	++
				rangium album			++	++
SS	45	964.	70	ⁿ spec.
SS	51	965,	70	Il M	++
ss·	53	966.	70	" roßeum
St	19			Streptomyces
				flaveolus

K =■ Kulturlösung M = Mycelextrakt + deutlich. wirksam ++ stark wirksam +++ sehr stark wirksam

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T a b e 1 1 e

Streptpsporangiuia album SS Streptοsporangium spec.
SS 45

S trep.t ο sporangiumspec SS 5,1:

Isolierungsdatum

2. 8. 1967

8. 11. 1968

9.11. 1968

Methode

Erdausstrich, Platte

Rhön, Heidelstein, Hasenerde, swischen Basaltblöcken pH 3,9 Er dauE.· strich,
Platte- . ■ ■ .

Srdausstrich, Platte - ■

Herkunft

Kenia,
bei Ruirxi
Kaffeefeld

pH 5.4-

Kenia,
bei Ruiru Kaffeefeld

pH 5,4

My c el

IM

weiß weiß - creme—
gelbl od rosa

weiß — .,creme-' l od rosa

SM

0,5 septiert 0,4 - 1,2

0,4 - 1,2 septiert

/U,

Sporangien-Form

kugelig, z.T. gerunzelt und deformiert kugelig,
glatt

; kugelig.-, glatt, manche auch . runzelig u. unregelmäßig, KÜmmerformen

Spg,-Größe

SL - 11 yu 0

11 /U β

7 - Il /U P

meist +^/oval,

Sporen-Porm

+ kugelig bis länglich meist + oval

z.

Sporen-Größe

0,6 - 0,9 x

Begeißelung 0,7 - 1*1 x
1,0 - 1,7 fr

0,7 - 1,0 χ

Anordnung der SporenimSpg.

spiralige Ketten spix-alige
Ketten

spiralige Ketten

Konidien,
Substratsporen usw.

Melanin

PEH CPC -

Gel -

PEH CPC -

Gel -

Nitratreduktion

(schwach)

Gelatine-Verfl.

Milch-Peptonis.

Wachstum
bei

20C 26⁰C 32^0 37°C ⁰C

37 42⁰C

NaCl-

Verträg-

lichkeit

2f

3 *

4 1o

+ V/. gering

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Portsetzung

Tabelle

	Streptpspo- rangium roseuir SS 53	Actinoplanes spec. SE 5	SE 55;
1so1ierungsdaturn	9. 11. 1968	16. 12. 1969	31. 12. 1969
Methode	Erdausstrich, Platte	Pollen	Pollen
Herkunft	Kenia, bei Euiru Kaffeefeld pH 5,7	Kenia, bei Ruiru Kaffeefeld pH 5,6	Kenia, Njoro, Eldoret Experimental Station pH 5,1
_Tfvrrl IM	rosa	0,4 - 1,3 /u	0,3 - 1,3 /u,- septiert ^x
nyccx _SM	0,4 - 1,2 /u
Sporangien- Forni	kugelig, zVT. ein wenig ge runzelt
■S£g.-Größe	3-10 /u 0
Sporen-Form	■ ' ^l ■■ /■ ^l- ■ meist Hh oval
Sporen-Größe	0,7 - 1,1 x 1,0 - 1,9 At
Begeißelung
Anordnung der Sporen im Spg.	spiralige Ketten	auf CPCi Sub strat sporen, meist kugelig (+), bis ca. 2"~ /u 0, einzeln od'zu mehreren, endständig oder interkalar
Konidien, Substratsporen USVi .		CPC -
Melanin	PEH - CPC - Ty - Gel -
Fitratreduktion	+
Gelatine-Verfl.	+
Milch-Peptonis.	+
26°C Wachstum 32^GC bei 37°C 42°C	++ ++ +
HaCl- I \|~~ Vertrag- \ £ lichkeit * %	+

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Fortsetzung

T ab e 11 e

	Ampullariella regularis SB 2	Ampullariella regularis SB 5	Ampullariella regularis' SE 21 .
Isolierungsdatum	2. 7. 1966	3. 7.1966	17. 12. 1969
Methode	Pollen	Pollen	Pollen
Herkunft	Neuhof, Kreis Fulda, Erde unter vermodertem Stroh, Feldrain pH 5,7	Neuhof, Kreis Fulda, Erde unter vermodert ein Stroh, Feldrain pH 5,7	Kenia, bei Euiru Kaffeefeld pH 5,3
My eel	0,3 - 1 /u breit '	0,3 - 1 /u	0,3 - 1 /U
Sporangien- Form	flaschen- ■ förmig, sylindrisch, "geldsack förmig"	flaschen- förmig, zylindrisch, "geldsack- , förmig"	flasehen- förmig, zylindrisch, "geldsack förmig"
Spg.-Größe	4 - 10 χ 7-18 Ai	3,5 - 7 x 6 - 14 /u	3,5 - 9 x 6 - 13 /u
Sporen-Form	■- Stäbchen	Stäbchen	Stäbchen
Sporen-Größe	0,5 - 0,7 χ 1,5 - 2,2 /u	0,5 - 0,7 x 1,5 - 2,2 _/U	0,5 - 0,7 x 1,5- 2,2 /u
Begeißelung	lophotrich	lophotrich	lophotrich
Anordnung der Sporen im Spg.	geradlinige • parallele Ketten	geradlinige parallele Ketten	geradlinige parallele Ketten
Konidien, Substratsporen usw.
Melanin	CPC -~) Ty -U GeI-J	CPC -Ί Ty - U GeI -J
Nitratreduktion	+	+
Gelatine-Verfl.	+	+
Mileh-Peptonis.	+	+

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Fortsetzung Tab ell e

Ampullariella Actinoplanes regularis spec. SE 39 SB 11	Isolierungsdatuni	22. 12. 1969	9. 11. 1966	Actinoplanes spec. SB 12 -
Methode	Pollen	- Pollen	9. 11. 1966
Herkunft	Kenia, bei Ruiru Kaffeefeld pH 5,6	Kr. Eschwege bei Frankers- hausen "Hielöcher" . pH 7,7	Pollen
My eel	0,3 - 1 /u	0,3 - 1,3 /u, septiert '	Arfurt, Ober lahnkreis, Erde von sonnenex ponierter Stelle auf Felsen pH .7,3
Sporangien- Form	flaschen- förmig, zylindrisch, ^ugeldsack- förmig"		0,3 - 1,2 /u
Spg.-Größe	3 - 10 χ 5-16 /u		+ kugelig mit runzliger Oberfläche, z. T. un regelmäßig
Sporen-Form	Stäbchen		3,5 - 12 yu
Sporen-Größe	0,5 - 0,7 x 1,5 - 2,2 /u		+ kugelig
Begeißelung	lophotrich		ca. 1-1,3 /u
Anordnung der Sporen im Spg.	geradlinige parallele Ketten		Sporen be weglich
Konidien, Substratsporen usw.		auf CPC breite -Hyphen' (ca. 1,3 /u), septiert im Abstand von ca. 2,5-4 /U, optisch dicht;, Dauerzellen ?	geknäuelte ECe t ten
Melanin		CPC -^s Gel +/
Ni tratred; ukt ion		+	CPC -Λ Ty - y + GeI +J
Gelatine-Verfl.		+	-
Milch-Peptonis.		+	+
+

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	Fortsetzung T a b e 1	1 e . 2	Actino- planes , SB 18	Actino- planes SB 27	Actino- planes SB 46	2064092
•		4. 12. 1966	8. 12. 1966	3. 3. 1967	Actino- planes SE 50
Isolierungs datum	Pollen	Pollen	Pollen	22. 12. 1969
Methode	Hattenheim, .Rheingau, Kartoffel feld in der "öandaue" pH 8,0	Kühkopf, Naturschutz gebiet, Alt rhein, Auen wald unter Weiden pH 7.6	Neuhof, Kr. Fulda, Rasenerde, Wegrand pH 6,1	Pollen
Herkunft	0,3-1,3 /u, septierv	0,2-1,1 /U	0,3-1,4/u, septierx	Kenia, bei Ruiru .' Kaffeefeld pH 6/2
My eel	unregel mäßig, runzlig, bucklig	+, keulenför mig od. oval bis zylin drisch, ζ. Τ unregelmäßig Oberfläche gerunzelt	unregel mäßig, ' gelappt',- ' bucklig	0,4-1,3 yu
Sporangien- Porm	6 - ΐδ /U	4 - 16 /u	6 - 20 /U	unregel mäßig, bucklig, runzlig
Spg.-Größe	+ kugelig, z. T. mit nasenarti- fjer Vorwölb.	+ kugelig	+ kugelig	4-13 /U
Sporen-Form	1 - 1.·/ /u	1 - 1.3 /u	ca. 1.2-2 /u	+ kugelig
Sporen-Größe	Geißel*- btischel	Sporen be weglich		ca. 1 /u
Begeißelung	geknäuelte Ketten	schwach geknäuelte, z.T. paral lel und ge rade verlau fende Ketten	geknäuelte Ketten, z. T. parallel
Anordnung der Sporen im Spg.			auf CPC Substrat sporen, bis 3/u 0y einzeln Qd interkalar zu mehreren hinter einander	geknäuelte Ketten, stellenwei se parallel
Konidien, Substrat sporen usw.	CPO - S Ty - J- + Gel + J	CPC - Ί Ty-V- GeI - J	CPC - Ί Ty - Y - Gel -J
Melanin	—	+	- -
Nitratreduk.	+	+	+
Gelatine-Verfl	+	+	+
Milch-Peptonis

Le A 13 428

-H-

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Tabelle

D

W.

SB 2 .·

W.

SB 5

W.

tf.

SB 11

•

orange,

•

gut

2)

SM.

sehr gut

SM.

gut

SM.

3M.

gut

ausbleichend

ocker

orange

gelborange

schön orange,

Agar goldgelb

orange

Caaanjino-

3)

SP.

3P.

ausbleichend^

—

-■

Pepton-

4)

Spg.

Agar gelbl

Spg.

Agar gelbl

Spg.

Agar gelbl

Czäpek-A.

+++;

-; ur-

Spg.

-

(CPC)

5)

K.

bereift

K.

sprüngl. +

K.

flach,

stark ge

mit gewunde

W.

glatt

W.

ädert

nen Wulsten -

sehr gut

gut bis

gut

Pepton-

SM.

sehr gut

SM.

Czapek-A.

orange,

orangerot

sehr gut

(PC)

SP.

bereift

SP.

bräunl orarge,

Spg.

-

Spg.

Agar gelbl

Spg.

wird blaß brain

K.

++

rf.

Agar

flach, z.T.

•

SM.

gelbbraun

W.

bucklig

W.

SP.

-; Casein

Ozapek-A.

SM.

mäßig

SM.

mäßig

Spg.

peptonis.

SP.

orange

SP.

blaß orange

\\jZ)

Agar scfcwach

Agar leicht

Spg.

oker

Spg.

gelblich

W.

—

SM.

gut

SM.

sehr gut

MiIch-Agar

bräunlich

(Oa)

SP.

orange

SP.

orange

Agar .·.-.

Agar

Spg.

bräunlich'

Spg.

goldbraun

-; Casein

W.

peptonis.

W.

peptonis.

Tyrosin-A.

SM.

mäßig - gut

SM.

gering

(Ty)

SP.

rötL braun

SP.

braun

Agar rötl.

Agar braun,

braun,

Kristallauf

KristaTlauf-

lösung -

Spg.

lös. gering

Spg.

XXUU JV. ti Ji-^
Hefe-A.

W.

+; bereift

W.

-

(HaH)

SM.

gut

SM.

gut

SP.

bräunlich

SP.

bräunlich

Spg.

orange

Spg.

orange

' +

1	W.	= Wachstum
2	SM.	= Substratmycel
3	SP.	= lösliches Pigment
4	Spg.	= Sporangien
5	K.	= Kolonieform
It	i A 13	428

209830/0836

Fortsetzung

Tabelle

SB 12 SB 18

SB

Casamino-

Pepton-

Czapek-A.

(CPC)

W. sehr gut SM. ο rang e b raun

SP. Agar gelblich-bräunlich Spg. +

K. flach mit radialen Rinnen, in der Mitte wulstig

W. sehr gut

SM. kräftig
rotbraun

SP. Agar braun

Spg. +(+)
K. flach,
radiale Rinnen
und Runzeln

W. gut bis ;

sehr gut SM. leuchtend # orange, später braunorange SP. Agar

gelbbraun Spg. +

K. flach, in der Mitte wulstig, stellenweise aufgesprungen

Pepton-Czapek-A.

(PC)

W. sehr gut

SM. braunrot SP. Agar

goldbraun Spg. -

W. gut bis

sehr gut SM. ockerorange SP. Agar gelbl.

Spg. -

Czapek-A.
(Cz)

W. gut
SM. orange bis bräunlich orange SP. Agar grünl. bis gelb fluoreszierend
Spg. -

W. SM. gut
rotbraun

Agar rötlich braun

SP. Spg. ++; bereift

W. SM.

sV.

gut braunrot

Agar leicht ocker

Spg. -

Milch-A.
(Ca)

W. sehr gut

SM. braunorange

SP. Agar goldbr

Spg. -;

' Casein pept

W. SM". SP. Spg.

sehr gut
braunorange Agar goldbr

nicht immer; Casein pept.

SM. SP. Spg.

sehr gut

bräunl orange

Agar goldbr.

nicht immer; Casein pept.

Tyrosin-A,

W. mäßig SM. braun

SP. Agar braun; Kr i ställauflösung ++

Spg. -

W. mäßig - gut SM. rötlich

orangebraun

SP. Agar orangebraun;

Kristallauflösung ++

Spg. -

W. mäßig - gut SM. ockerbraun

SP. -

Kri ställauflösung ++

Spg. -

Haferflocken-
Hefe-A.
(HaH)

W. gut

SM. Diaß orange

SP. -

Spg. +

W. SM. SP. Spg.

rotbraun

W. ΪΜ. SP. SPg.

gut orangebraun

Le A 13 428

- 16 -

2 098 30/08

Fortsetzung Tabelle

•	SB 46	SE 21	SE 39	Spg. ++	SE 50
Casamino- Pepton- - Gzapek-A. (CPC)	W. gut SM. orange, später bräunl. orange SP. Agar schv/ach ge IbI. Spg.+ K. flach, mit ra dialen Rinnen	W. gut SM. orange braun SP. Agar gelbbr Spg.+; einige	W. gut SM . rot braun SP. Agar goldbraun -rotbraun Spg.++; bereift	W. sehr gut SM. braun SP. Agar braun bis gelbl. braun Spg.-
Pepton- Czapek-A. (BC)	W. gut SM. orange SP. Agar goldgelb Spg.-
Czapek-A. (Cz)	W. gut SM. orange braun SP. Agar ockerfarben Spg.-		•
Milch- Agar (Ca)	W. sehr gut SM · orange SP. Agar gold farben Spg.-; Casein pept.
Tyrosin- Agar (Ty)	W. gut 3M. braun. SP. Agar goldbraun; Kristall auflösung ++ Spg,-
Hafer- flocken- Hefe-A. (HaH)	W. gut SM. orangebraun SP. - Spg —	Spg.++		Spg.+
"Emerson"- Agar _v (Hefe- ^E Stärke-A)			W. gut SM* braun SP. braun Spg.-

Le A 13 428

- 17 -

209830/0836

Portsetzung

Tabelle

•	Wr	SE 5	Schrägröhrchen	gut	V	W.	SB 55 .	W.	SS 26	gut bis mäßig'	gut
	SM.	gut	schleimig glänzend	orange		SM.	gut	SM.	gut	farblos	farblos +, weiß
Casamino-		orange					dunkel		farblos bis
Popton-	LM.		w.			LM.	rotbraun	LM.	blaß ocker	wenig, weiß	mäßig
Czapek-A.	SP.	—	SM.			SP.	-	SP.	wenig, weiß	;	blaß braun +, weiß
		- bis schwach		gut ·			gelbbraun	Spg.	_	mäßig	⁺
(CPC)	gelblich		orange				_	farblos
	Kolonieoberfläche		_				Kolonie flach mit	+, weiß
	im	W.	SP. - Kolonieoberfläche				einigen radialen .	—
	SM.	schleimig				Rinnen und konzen
	LM,			W.		trischen Wülsten	gut
				SM.	gut	W.	farblos
Hafer-			orange	SM.	—
flocken-		LM»	braun		Casein pept.
Hefe-A.	Hefe-Glucose-	SP.		LM.
(HaH)	Erdextrakt-»A		hell braun	SP. Spg.	W.
	(HGE)			W.	SM. LM.
¹¹ Emerson"-				SM.	SP.
A.				LM.	W
(E)				SP.	SM LM
	Mistextrakt-A.				Spg
	(Mi)			W.
Milch-A.				SM.
(Ca)				LM. SP.

Le A 13 428

- 18 -

209830/0636

49

Portsetzung Tabelle

-

*

Casamino-

W.

SS 45

gut
braunrot

schwach

+

gut
bräunl.rot

goldgelb

W.

SS 51

gut
braunrot

schwach

+

_

gut
braunrot

W.

SS 53

gut bis
sehr gut
purpurbr
rotbraun

gut
bräunlich

Pepton-

mäßig

+ »

gelbl. bis

gut
rot

+ ,

mit grünl.

mäßig

+ ,

gelblich mit

gut
braunrot

schwach

+, weiß

gut

++,schraut-

weinrot

Czapek-A.

SM.

(bis gut)

weiß u. rosa

gelbl.-grünl.

—

dünner Überzug

Stich

SM.

(bis gut)

weiß u. rosa

grünl. Stich

+ , wenig/

gelbl. bräunl.

SM.

weiß+rosa

++, rosa

(OPC )

rötl.

SP.

Spg.

SP.

mäßig
(bis gut) .

rötl.

SP.

Spg,

weiß

gelb mit

blaß hell

purpur-

rötlich

LM.

braun

W.
SM.

schwach

++, weiß

LM.

braun

W.
SM,

grünl.

LM.

braun

rotbraun

gelbbraun

SP.

—

LM,

gelblich mit

und rosa

SP.

_

LM.

Stich

SP.

weiß

—

grünl. Stich

W.

+

mäßig
(bis gut)

bräunlich

++

•

Kolonie flach,

SP.

LM.

Kolonie flach,

SP.

++, rosa

Kolonie flach,

gut.
rotbraun

Hafer-
flocken-
Hefe-A.

6 mm 0 nach 9

bis

Mitte ohne LM

++, rosa

(HaK)

Wochen

Spg.

Wochen

W.
SM.

+■_

W.
SM.

LM.

W.
SM.
bis

rotbraun

Ui.

LM.

++

SP.

zig

W.
SM.

SP.

gut

LM.

blaß hell
braun

"Emerson"-
Λ

W.

—

« ·

LM.

Spg.

Agar

(E)

W.
SM.

gelbbraun

Spg.

LM.

Casein pepton.

W.
SM.

SP.

Spg.

LM.

Milch-Α.

SP.

(Ca)

W

SM

LM

SP

Hefe-Glucose-

Erdextrakt-A.

(HGE)

Mistextrakt-A.

(Mi)

Le A 13 428

- 19 -

20 9830/0 8 36

Der Stamm St 19 ist von der American Type Culture Collection "bezogen als Streptomyces_tflaveolus (Waksman) Waksman and Henrici ATCC 3319. .

Die anderen Stämme sind unter den.in Tabelle 1 aufgeführten CBS-ITr. im Centraalbureau voor Schimmelcultures in Baarn/ Niederlande hinterlegt.

In den Tabellen 2 und 3 sind einige Merkmale der beschriebenen Stämme aufgeführt.

Zur Gewinnung der Glykosid-Hydrolasen-Inhibitoren v/erden die oben aufgeführten Stämme in den oben beschriebenen Nährlösungen kultiviert. Dabei· ist zu beachten, daß praktisch jeder Stamm zur optimalen Produktion eine andere qualitativ und quantitativ aniers zusammengesetzte Nährlösung benötigt.

Nach 1 - 10-tägiger Bebrütung bei 15 - 45⁰C, vorzugsweise 24 - 32 C, in Schüttelkolben oder in Permentern verschiedener Größe wird daß Mycel von der Kulturlösung abgetrennt und je nach dem Auftreten der Inhibitoren das' wirksame Prinzip aus der Kulturlösung oder und aus dem Mycel angereichert.

Aus den Kulturbrühen gewinnt man die Inhibitoren durch Lyophilisation, oder Fällung mit Salzen oder wasserlöslichen organischen Lösungsmitteln (wie z. B. niedere Alkohole und Ketone) oder durch Adsorption der Wirkstoffe an Ionenaustauscher.

Aus den Mycelien gewinnt man die Inhibitoren durch Extraktion mit organischen Lösungsmitteln, wie- z. B. Alkoholen, Ketonen, Äthern, Estern und SuIfoxiden.

Dazu wird der Permentationsansatz bei 3000 - 20000 Upm, vorzugsweise 6 - 10000 Upm, 10 - 60 Minuten, vorzugsweise 30 Minuten, zentrifugiert oder filtriert, vorzugsweise mit Druck und unter Zuhilfenahme von PiIterhilfsmitteln, wie

Le A 13 428 - 20 -

209830/0838

ζ. B, Klarzell, und derart in Kulturbrühe und Mycelrückstand getrennt. .t

Die Isolierung des Inhibitors aus der jeweiligen Kulturbrühe kann auf verschiedene Weise erfolgen:

a) Einengen der Kulturbrühen bei vermindertem Druck (10 - 50 Torr) bei Bad-Temperaturen von 20 - 100⁰C, vorzugsweise 40 - 8O⁰C, auf ca. 1/5 - 1/50 des Ausgangsvolumens. Der eingeengte Extrakt wird filtriert oder zentrifugiert und das klare Filtrat (der klare Überstand) evtl. nach vorheriger Entsalzung lyophilisiert.

b) Ausfällung der Inhibitoren aus der Kulturbrühe (oder den nach a) eingeengten Kulturbrühen) durch Zusatz von wasserlöslichen organischen Lösungsmitteln, wie z. B. Alkoholen oder Ketonen, vorzugsweise Methanol, Äthanol, Aceton, bis zu einem Gehalt von 60 - 90 ?&· Da bei .niederer Konzentration an Lösungsmittel inaktive Begleitsubstanzen gefällt werden, eignet sich dieees Fällungsverfahren besonders gut zur fraktionierenden Fällung zur Abtrennung von unerwünschten Begleitstoffen. .

c) Aussalzen der Inhibitoren aus den Extrakten (oder den nach a) eingeengten Extrakten), z. B. mit .-Ammonsulfat, Kochsale usw. Der ausfallende Niederschlag wird durch Zentrifugation oder Filtration gesammelt und entweder direkt mit Aceton und Äther gewaschen und im Vakuum getrocknet oder nach Rücklösen in Wasser dialysiert und lyophilisiert.

d) Adsorption der Inhibitoren an Ionenaustauscher.

Dieses Verfahren eignet sich zur Isolierung von solchen . Inhibitoren, die auf Grund ihrer chemischen Natur Ladungen tragen. Die Desorption des Inhibitors geschieht durch

Le A 13 428 - 21 -

209830/0838

Änderung der Ionenstärke oder des pH-Wertes des Elutions-

mediiuns. '

lieben dem Inhibitor finden 3ich in den Kulturbrühen häufig unerwünschte Begleitsubstanzen. Die Abtrennung dieser Begleitstoffe kann auf verschiedene Weise erfolgen, z. B. durch Hitzedenaturierung der Begleitstoffe bei Inhibitoren, die hitzestabil sind oder durch Dialyse durch enteprechende Membranen bei niedermolekularen Inhibitoren, wobei die ungewünschten Begleitstoffe von der Membran zurückgehalten werden oder durch fraktionierende Fällung (vgl. b) oder durch Adsorption der Begleitstoffe an Ionenaustauscher.

Die Gewinnung von Inhibitoren aus den Mycelien geschieht durch mehrmalige Extraktion des Mycels mit organischen Lösungsmitteln, Vorzugsweise 2maliger 10 - 20minütiger Extraktion mit 3-5 Vol. Aceton (bezogen auf Mycelfeuchtvolumen) und anschließend einmaliger 5 - lOminütiger Extraktion mit Äther. Das derart extrahierte Mycel wird im Vakuum getrocknet und anschließend mit 3-10 Gew.-Teilen Dimethylsulfoxid 2-8 Stunden unter Rühren extrahiert und anschließend bei 10000 bis 20000 Upm zentrifugiert. Die Alkohol- und Äther-Extrakte Werden im Vakuum zur Φ-roclcne eingeengt und mit dem DMSO-Extrakt aufgenommen.

Man kann das Myceltrockenpulver statt mit DMSO auch über längere Zeit, vorzugsweise 12-24 Stunden, mit Wasser oder verdünnten Elektrolytlöaungen extrahieren.

Die neuen Substanzen lösen sich gut in Wasser. Eine Gruppe der Inhibitoren ist bei neutralen pH-Werten hitzeetabil, säurestabil (pH 2), alkalistabil (pH 12) und langsam dialysierbar. Diese Inhibitoren werden durch Trypsin und Pepsin nicht inaktiviert, sie hemmen ihrerseits die ge-, nannten Enzyme nicht. Sie sind-mit den typischen Protein-

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206A092

färbestoffcn nicht anfärbbar, und sie zeigen in UV bis 250 nm keine charakteristische Absorption. Mit Harnstoff und ß-Hercaptoüihanol sind diese Inhibitoren nicht zu inaktivieren. Nach Abschätzungen cius der Gelfiltration liegt das Ilolekulargewicht dieser Inhibitoren über 500, aber unter GOüO. Bei der -hydro3..ytlschen Spaltung werden Monosaccharide, y. B. Glucose, erhallen. Nach djesen Befunden handelt es sich bei diesen Inhibitoren um Oligo- oder Polysacchariden bzw. deren Derivate.

Die besten Inhibitoren dieser Gruppe zeigen Hemmaktivitäten gegen Amylase von 8000 AIE/mg.

Eine andere Gruppe von Inhibitoren ist hitzelabil und nicht oder kaum dialysierbivr. Diese Inhibitoren werden durch Trypsin mehr oder weniger schnell inaktiviert. Auch Harnstoff und ß-Hercaptoäthanol inaktivieren die meisten dieser Inhibitoren. Bei diesen Inhibitoren handelt es sich wahrscheinlich um Stoffe von PeptidCharakter.

Die besten Inhibitoren dieser Gruppe zeigen Hemmaktivitäten gegen Amylase von 80 AI3/mg.

Es ist bekannt, daß bei Tieren und Menschen nach Aufnahme von kohl enliydraihaltigen I-Tahrungs- und Genußmitteln (z. B. Getreide-, Kartoffelstärke, Obst, Pruchtsaft, Schokolade) Hyperglykäiüien auftreten, die infolge eines raschen Abbaus der Kohlenhydrate durch Glykosidhydrolasen (z. B. Speichelunö Pankreasamylascn, Malta-sen, Saccharasen) nach folgendem Schema

Amyla.se Maltase

Stärke > Maltose > Glucose bzw.

bzw. Glykogeii

Saccharase

Saccharose — > Glucose + Pruktose

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bad

bewirkt werden. Diese Hyperglykämien sind bei Diabetikern besonders stark und anhaltend ausgeprägt. Bei Adipösen bewirkt die alimentäre Hyperglykämie oftmals eine besonders starke. Insulinsekretion, die ihrerseits zu vermehrtem Fettaufbau und vermindertem Fettabbau führt. .

Es wurde nun gefunden, daß erfindungsgemäße, nach obigen Methoden gewonnene und isolierte Inhibitoren der Glykosidhydrolasen die alimentäre Hyperglykämie und Hyperinsulinämie nach Belastung von Ratten und/oder Menschen mit Weizenstärke oder Saccharose oder Maltose erheblich vermindern.

Ferner ist bekannt, daß in der Mundhöhle Kohlenhydrate, besonders Saccharose, durch Mikroorganismen gespalten werden und dadurch die Kariesbildung gefördert wird.

Inhibitoren der Glykosidhydrolasen eignen sich deshalb als Therapeuticum für die folgenden Indikationen: „

Adipositas, Hyperlipidämie (A/thefosklerose), Diabetes, Prädiabetes und Karies.

Dosierung;

5000 - 500000 AIE oder 2,5 - 250 MIE oder 100 - 10000 SIE ein- oder mehrmals täglich vor und/oder während und/oder nach den Mahlzeiten p. os.

Zubereitungsformen;

Tablette, Dragee, Kapsel, Lösung, Suspension, Granulat, Kaugummi, Zahnpasta und als Zusatz zu kohlenhydrathaltigen Lebens- und/oder Genußmitteln.

Le A 13 428 . - 24 -

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Die Toxizität einiger dieser Inhibitoren der Glykosidhydrolasen ist extrem gering..3)er Yfirkstoff aus den Beispielen -H und 37 wurde in einer Dosierung von 5 x 10 AIE/kg Maus-, und Ratte p. os. symptomlos vertragen. Bei intravenöser Injektion tolerierten Mäuse und -Ratten 10 AIE/kg.

Vorteilhaft sind auch Korabinationen der erfindungsgemäßen Inhibitoren mit den bekannten oralen Antidiabetica (ß-cytotrope SuIfony!harnstoffderivate und/oder blutauckerwirksame Biguanide).

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2 0 9830/0836

Beispiel 1 „,

Man beimpft mit je 1 ml einer Vorkultur (gewonnen in derselben Nährlösung, beimpft aus Schrägröhrchenkulturen mit Haferflookenagar) des Stammes SB 2 3 1-Liter-Erlenmeyer-Kolben, die 200 ml einer Nahi'lösung der Zusamnensetzung 2 ^cß> Stärke, 1 ^c/o Glucose, 0,5 ?° NZ-Amine, 1,0$ Hefeextrakt, 0,4 fi CaCO₅ (Sterilisation: 30 Minuten, 121⁰C; pH vor der Sterilisation auf 7,2 eingestellt) enthalten und bebrütet diese Kolben bei 28 C auf einer Rundschüttelmaschine. Nach einer Kulturdauer von 5,5 Tagen wird der Inhalt der 3 Kolben vereinigt und das Mycel durch Zentrifugation abgetrennt. Man erhält 425 ml eines Überstandes der 100 AIE/ml enthält.

Der zentrifugierte Überstand wird am Rotationsverdampfer bei 15 - 20 Torr und ca. 37°C Wasserbadtemperatur auf 60 ml eingeengt. Die zähe Lösung wird unter Rühren in 8 Volumen = 480 ml Äthanol eingerührt. Der ausfallende Niederschlag wird durch Zentrifugation gesammelt, in 60 ml Wasser rückgelöst und 6 Stunden gegen destilliertes Wasser dialysiert. Das Dialysat wird lyophilisiert.
Ausbeute 1,6 g mit 19 x 1O^ AIE/g.

BeiBEIel 2

Bei einem Ansatz nach Beispiel 1 erhält man 440 ml zentrifugierten Überstand mit 100 AIE/ml.

Diese 440 ml zentrifugiert er Überstand werden aiii Rotationsverdampfer auf 100 ml einrotiert. Die eingeengte Lösung wird in 8 Volumen * 800 ml Äthanol eingerührt, der Niederschlag durch Zentrifugation gesammelt und nach 2mäligem Waschen mit Aceton und einmaliger Wäsche mit Äther im Vakuum bei Raumtemperatur getrocknet.
Ausbeute 2,2, g mit 15 x 10* AIE/g.

A,. .13. 4£B - ■· 26 -

209830/0836

Bei 3rd el 3

Bei einem Ansatz nach Beispiel 1 erhält man nach 5tägiger Kultur 500 ml eines zentrifugieren Überstandes mit 120 ΑίΕ/ml. "Diese 500 ml werden direkt lyophilisiert. Ausbeute 7,1 g mit 8,3 x 10** AIE/g.

Man "beimpft mit Je einem ml einer Vorkultur (gewonnen in derselben Nährlösung, beimpft aus Sehrägröhrchenkulturen mit Czapeek-Pepton-Casein-Agar) des Stammee SB 12 3 1-Liter-Erlenmeyer-Kolben, die 200 ml einer Nährlösung der Zusammensetzung 3 fo Glycerin, 3 # Sojamehl, 0,2 i» GaCO₅ (Sterilisation: 30 Minuten, 121⁰Cj pH nach Sterilisation 7,2) enthalten und bebrütet 3 Tage bei 28^C auf einer Rundschüttelmaschine. Nach der Bebrütung wird der Inhalt der Kolben vereinigt und das Mycel durch Zentrifugation abgetrennt. Man erhält 500 ml Überstand mit 450 AIE/ml. '

Der Überstand wird mit 250 g KH.-Sulfat portionsweise unter Rühren versetzt, anschließend 10 Minuten bei 12000. Upm zentrifugiert. Der Niederschlag wird in 100 ml dest. H₂O gelöst, mit 4 Volumen = 400 ml Aceton unter Rühren versetzt. Ee entsteht eine eich gut absetzende Ausfällung. Es wird abdekan- . tiert und der Niederschlag 2mal mit Aceton sowie einmal mit Äther gewaschen und im Vakuum getrocknet. Ausbeute 13,4 g mit 10 χ 10⁵ AIE/g.

Beispiel 5

Einen nach Beispiel 4 nach der Ammonsulfatfällung erhaltenen Niederschlag löst man in 100 ml Wasser und dialysiert 6 ,Stunden gegen destilliertes Wasser«- Man erhält ein Dialysat,. das eingefroren und lyophilisiert wird.
Ausbeute 1,5 g mit 80 AIE/mg.

Le A 13 428 - 27'-

209830/0836

Beispiel 6 . ^<σ

Beimpft man einen 1-Liter-Erlenmeyer-Kolben mit 120 ml einer · Nährlösung nach Beispiel 1 aus einer Schrägröbrchenkultur des Stammes St 19, so erhält man nach einer 3tägigen Kultur bei 28⁰C auf einer Runäschüttelmaschine eine Kulturlösung, die 25 AIE/ml enthält.

Beispiel 7

Bebrütet man einen Ansatz nach Beispiel 4 3 Tage bei 32⁰C, so erhält man nach Abfiltrieren des Mycels ein Kulturfiltrat, das 350 AIE/ml enthält.

Beispiel 8

Beimpft man eine Nährlösung nach Beispiel 1 nach Beispiel K_t so erhält man nach 3tägiger Bebrütung bei 28°C KuItürfiltrate, die 270 AIE/ml enthalten.

Beispiel 9

Man beimpft mit je 1 ml VorJtultur (gewonnen wie in Beispiel 1) des Stammes SB 5 6 1-Liter-Erlenmeyer-Kolben, die je 100 ml einer Nährlösung, bestehend aus 3 $ Glucose, 3 $ Sojamehl, 0,2 io CaCO₃ (Sterilisation: 30 Minuten," 121⁰C; pH nach Sterilisation 7,2), enthalten und bebrütet 4 Tage bei 28⁰C auf Rundschüttelmaschinen. Man vereinigt den Inhalt der Kolben und trennt das Mycel durch Zentrifugation ab. Die erhaltenen 500 ml Überstand wit 150 AIE/ml werden eingefroren und lyophilisiert.
Ausbeute 6,9 g mit 11 χ 10⁵ AIE/g.

Le A 13 428 - 28 -

2096 3 0/0838

Beispiel 10

,»
Beimpft man 24 Kolben eines Ansatzes nach Beispiel 4 mit je 120 ml Inhalt mit einer Vorkultur des Stammes SB 11 (gewonnen nach Beispiel 4) und "bebrütet 5 Tage bei 28⁰C, so erhält man nach Zentrifugation 2,0 Liter eines Überstandes mjt 1,1 MTE/ ml. Diese 2 Liter werden am Rotationsverdampfer aitf 200 ml einrotiert. Die 200 ml Konzentrat werden 24 Stunden in einem « Visking-Dialysierschlauch (Typ 27/100 PT, Union Carbide Corporation) gegen 2 Liter destilliertes Wasser bei Raumtemperatur dialysiert. Das Inhibitor enthaltende Außenmedium wird auf 100 ml einrotiert und in 900 ml absolutes Äthanol unter Rühren eingetropft. Der ausfallende, fast inaktive Niederschlag wird abzentrifugiert und verworfen, der alkoholische Überstand wird auf 30 ml einrotiert.

1 ml dieses Konzentrats enthält 70 MIE/ml.

Zur weiteren Reinigung wird diese Lösung über eine AnionenaListausehersäule (Amberlite IRA 410 Acetatform in 0,05 m NH. Acetat, pH 7, Säule 2,5 x 20 cm) gezogen, die aktiven Fraktionen vereinigt und an Sephadex ^V£y G 75 in HpO gelfiltriert. Die aktiven Fraktionen der Gelfiltration werden auf 12 ml eingeengt. 1 ml dieser Lösung enthält 150 Mll/ml.

Das Mycel (^500 ml) wurde 2 χ mit 1 Liter Aceton und 1 χ mit 1 Liter ilther extrahiert, die Extrakte vereinigt und im Vakuum zur Trockne einrotiert. Der Mycelrückstand wurde im Vakuum bei 2O⁰C getrocknet und das erhaltene Myceltroekenpulver (~51 g) anschließend 2 Stunden mit 150 ml DMSO bei Raumtemperatur extrahiert. Nach dem Zentrifugieren (30 Minuten, 15000 Upm) wird der zur Trockne eingeengte Aceton/Äther-Extrakt mit dem DMSO-Überstand des Mycel- , trockenpulvers aufgenommen.
Ausbeute: 120 ml mit 3 MIE/ml.

Le A 13 428 - 29 -

20 9830/0836

Beispiel 11

.'t
Beimpft man einen 1-Liter-Erlenmeyer-Kolben mit je 120 ml einer Nährlösung nach Beispiel .1 nach Beispiel 9 und be- ' ■ brütet 6 Tage tei 23⁰C auf einer Rundschüttelmaschine, so erhält man ein KuIturfiltrat,- das 0,9 MIE/ml enthält.

Beispiel 12

Beimpft man mit .je 2 ml einer Vorkultur (gewonnen nach 'Beispiel 1) des Stammes SB 27 5 1-Liter-Erlenmeyer-Kolben, die je 120 ml einer Nährlösung der Zusammensetzung 2,5 i° Stärke, 0,5 1» Glucose, 0,5 ⁰Jo ITZ-Amine, 1,0 <fo Hefeextrakt., 0,4 Io OaCO₅ (Sterilisation: 30 Minuten, 121⁰O; pH vor der Sterilisation auf 7,2 eingestellt) enthalten und bebrütet diese Kolben 4 Tage bei 28⁰C auf einer Rundschüttelmaschine, so erhält man nach Vereinigung der Kolben und Abzentrifugieren des Mycels 500 ml Überstand mit 70 AIE/ml. Der zentrifugierte Überstand wird eingefroren und lyophilisiert.

"7

Ausbeute 7,7 g mit 3,5 x 10^J AlE/g.
Beispiel 13

Beimpft man einen Ansatz nach Beispiel 1 mit 2 ml einer Vorkultur des Stammes SB 18 (gewonnen nach Beispiel 1) und bebrütet 3 Tage bei 28⁰C, so erhält man eine Kulturbrühe, die 1100 AIE/ml, 0,17 MIE/al und 1,0 SIE/ml enthält.

Beispiel 14

Beimpft man 5 Versuchsfermenter mit je 8 Liter Kulturlösung nach Beispiel 1 mit je 120 ml Vorkultur (gewonnen nach Beispiel 1) und bebrütet unter Rührung und Belüftung 65 Stunden bei 28⁰C, so erhält man nach Vereinigung der Fermentationsbrühen und Abtrennung des Mycels 30 Liter Kulturbrühe» Diese

Le A 13428 - 30 -

209830/0 8 3$

30 Liter zentrifugierte Kulturbrühe (0,57 MIE/ml, 6,2 SIE/ml, 8000 AIE/ml) werden im Vakuum bei 20 Torr und 10O⁰C Badtemperatur auf 5 Liter eingeengt, das Konzentrat mit 4 Vol. =" 20 Liter Aceton imter Rühren versetzt und der ausfallende schwarze, schmierige Niederschlag durch Zentrifugation bei 6000 Upm in 30 Minuten gesammelt; der Niederschlag wird in 2,5 Liter Wasser gelöst und die sclwarzgefärbte Losung mit 500 g feuchtem Amberlite IRA 410 (Acetatform, pH 7) 60 Minuten gerührt. Es wird durch lOminütige Zentrifugation bei 6000 Upm in Überstand und Amberlite-Sediment getrennt, Der Überstand wird in der gleichen Weise noch 3mal mit je 500 g Amberlite für 60 Minuten und anschließend mit nochmals 500 g Amberlite über Nacht (~15 Stunden) gerührt. Nach dieser Behandlung zeigt der Überstand eine hellgelbe Färbung, wogegen die schwarzen Begleitfarbstoffe an den Ionenaustauscher gebunden waren. Die gesammelten Amberlite-Rückstände werden 2mal mit 1,5 Liter Wasser gewaschen und diese Waschwasser mit dem inhibitorhaltigen Überstand vereinigt,. Der mit den Waschwassern vereinigte Überstand wird auf 1 Liter im RotatioBSverdampfer bei 15 Torr und SO⁰G Badtemperatur ein- ■ geengt unä anschließend unter intensivem Rohren in 10 Liter Aceton getropft. Dabei entsteht eine weiße Ausflockung, die abgenutscht, mit Aceton und Äther gewaschen und im Vakuum getrocknet wird.

Ausbeute 150 g eines weißen Pulvers mit 1 χ 10 AIS/g und 450 SIE/g.

Beispiel 15

Ersetzt man in einer Nährlösung nach Beispiel 1 die Glucose durch andere Zucker oder Suckeralkohole und beimpft Schüttelkolben mit je 120 ml KuItürlösung mit je 1 ml Vorkultur des Stammes SB 18 (hergestellt nach Beispiel 1), so erhält man nach 3-bzw. 4tägiger Kultur bei 28⁰C auf Rundschüttelnaschinen Kulturlöcungen mit folgenden Anylase-Inhibitor-Konzentrationen:
Lc A 13 428 - 31 -

209 8 30/0836

Zusatzstoff	AIE/ml	AIE/ml
.1e 1 g	nach 3 Tagen	nach 4 Tagen
Rohrzucker	5 400	10 500
Lactose	¹ 9 100	. 4 600
Maltöse	7 500	13 600
Galactose	9 100	10 200
Glucose	7 000	9 700
Sorbit	2 600	10 200
Mannit	8 500	8 700
Inosit	4 800	5 600
Stärke	6 400	10 200
Beispiel 16

Beimpft und bebrütet man eine Nährlösung, bestehend aus 3 $> Sojamehl, 2 # Stärke, 1 i» Glucose und 0,2 $> CaCO^ nach Beispiel 15ι so erhält man nach 4tägiger Fermentation eine Kulturbrühe mit 5600 AIE/ml·

Beispiel 17 '·

Beimpft und bebrütet man einen Ansatz nach Beispiel 13 mit einer morphologischen Variante von SB 18, dem Stamm SB 18/5» so erhält man nach 4tägiger Fermentation eine Kulturbrühe mit 21 400 AIE/ml. ·- '

Beispiel 18

Beimpft und bebrütet man einen Ansatz nach Beispiel 13 mit einer morphologischen Variante von SB 18, dem Stamm SB 18/4, so erhält man nach 4tägiger Fermentation eine Kulturbrühe mit 13 900-AIE/ml.

Le A 13 428 . - 32 -

2098-30/013C

ΐ¹:"«!!¹¹:!!!!¹:!«!'""!!!: "¹¹I" '■■■} .!¹K ι

2064092	-JS-
Zusatzstoff	AIE/ml
.ie 1 fo	nach 3 Tagen
Rohrzucker	5 400
Lactose	9 100 ,
Maltose	7 500
Galactose	9 100
Glucose	7 000
Sorbit	2 600
Mannit	8 500
Inosit	4 800
Stärke	6 400
Beispiel 16

AIE/ml nach 4 lEagen

10 500

'4 600

13 600

1.0 200

9 700

10 200

8 700

5 600

10 200

Beimpft und bebrütet man eine Nährlösung, bestehend aus 3 i° Sojamehl, 2 $ Stärke, 1 fo Glucose und 0,2 $ CaCO, nach Beispiel 15, so erhält man nach 4tägiger Fermentation eine Kulturbrühe mit 5600 AIE/ml;

Beispiel 17

Beimpft und bebrütet man einen Ansatz nach Beispiel 13 mit einer morphologischen Variante von SB 18, dem Stamm SB 18/5, so erhält man nach 4tägiger Fermentation eine Kulturbrühe mit 27 400 AIE/ml. .

Der Stamm SB 18/5 wurde beim Centraalbureau voor Schimmelcultures in Baarn unter der Nummer CBS 613*71 hinterlegt.

Beispiel 18

Beimpft und bebrütet man einen Ansata nach Beispiel 13 Bit einer morphologischen Variante vom SB 18, dem Stamm SB 18/4 so erhält man nach 4tägiger Permentation eine Kulturbrühe mit

13.900 AIE/ml.

Der Stamm SB 18/4 wurde beim Centraalbureau voor Schimmelcultures

in Baarn unter der Nummer OBS 612.71 hinterlegt.

Le A 13 428 - 32%-

209830/0836

SH

Beispiel 19

Beimpft und bebrütet man eine Nährlösung der Zusammensetzung 2 ^c/o Stärke, 1 f> Glucose, 0,3 # GIykokoll, 0,25 $> Maisquellwasaer, 0,4 # Sojamehl, 0,1 $ NaCl, 0,1 # K₂HPO₄, 0,01 "Jo FeSO. 0,01 <f» GaCO₅ nach Beispiel 12, so erhält man nach 3tägiger Bebrütung eine Kulturbrühe mit 2 900 AIE/ml.

Beispiel 20

Beimpft man 2 Kolben eines Ansatzes nach Beispiel 1 mit T ml einer Vorkultur des Stammes SB 46 und bebrütet 4 Tage bei 28⁰G auf einer Rundschüttelmaschine, so erhält man nach der Zentrifugal; ion 250 ml Überstand mit 250 AIE/ml.

Diese 250 ml Überstand werden mit 150 g NH,-SuIfat portionsweise unter Rühren versetzt, anschließend 15 Minuten bei 10· 000 Upm zentrifugiert. Der Rückstand wird in 12 ml H₂O gelöst, 3 Stunden gegen destilliertes. Wasser dialysiert. Die 20 ml Dialyeat werden mit 6 Volumen = 120 ml Aceton im Eisbad gefällt, der Niederschlag abgenutscht und mit Aceton und Äther gewaschen und anschließend im Vakuum getrocknet.
Ausbeute 0,28 g mit 220 χ 10* AIE/g.

Beispiel 21

Beimpft man einen 1-Liter-Erlenmeyer-Kolben mit 120 ml einer Nährlösung nach Beispiel 1 mit 2 ml einer Vorkultur des Stammes SE 5 (hergestellt nach Beispiel 4) und Gebrütet 7- Tage auf einer Rundschüttelmaschine bei 28⁰C, dann erhält man eine Kulturbrühe mit 0,09 MIE/ml.

Das Mycel wird mit 50 ml Aceton* versetzt, eine Minute am-UltraturraX"*Homogenisator (Pa. Jarike u. Kunkel, Stauffen,

Le A...1,3 428 . - 53 -

20*830/0*1*

Breisgau) homogenisiert und anschließend "bei 3000 Upm 10 Minuten zentrifugiert. Der Rückstand wird in der gleichen Weise nochmals/mit 50 ml Aceton und anschließend einmal mit 50 ml Äther extrahiert, die drei Extrakte werden vereinigt und im Rotationsverdampfer Jaei ca. 10 - 20 mm Hg und einer "Wasserbadtemperatur von 37⁰C fast zur Trockne eingeengt. Der Mycelrückstand wird im Vakuum getrocknet und anschließend mit 15 ml Dimethylsulfoxid versetzt,

am Ultraturrax 2 Minuten homogenisiert und 2 Stunden unter Rühren (Magnetrtihrer) extrahiert. Anschließend wird 30 Minuten bei 20 000 Upm zentrifugiert. Danach wird der DMSQ-Extrakt von extrahierten Mycel abgegossen, zum Rückstand der Aceton/Äther-Extraktion gegeben und ca. 30 Minuten gerührt (Magnetrührwerk). Es wird nochmals 10 Minuten bei 20 000 Upm zentrifugiert und der klare Überstand als Mycelextrakt getestet. 0,14 MIE/ml.

Beispiel 22

Beimpft und bebrütet man 2 Schüttelkolben nach Beispiel 1 mit je 160 ml Xolbenfüllixng mit je 1 ml einer Vorkultur (nach Beispiel 1) des Stammes SE 21, so erhält man nach der Zentrifugation 200 ml eines Überstandes mit 360 AIE/ml.

Der zentrifugierte Überstand wird mit 100 g NH.-Sulfat portionsweise unter Rühren versetzt, zentrifugiert, der niederschlag in 20 ml Wasser gelöst und mit 2 Volumen = 40 ml Aceton gefällt. Der Niederschlag "wird mit Aceton und Äther ge-■waschen und im Vakuum getrocknet.
Ausbeute 2 g mit 25 x 10⁵ AIE/g.

Le A 13 4?8 - 34 -

209830/0836

Beispiel 23

Beimpft und bebrütet man einen Ansatz nach Beispiel 14 mit Vorkulturen vom Stamm SE 21, dann erhält man nach 65stündiger Fermentation Kulturbrühen mit 140 AIE/ml.

Beispiel 24

Beimpft man einen 1-Liter-Erlenmeyer-Kolben, der 120 ml einer Nährlösung der Zusammensetzung nach Beispiel 4 enthält, mit 1 ml einer Vorkultur nach Beispiel 1 des Stammes SE 39 und bebrütet nach Beispiel 1, so erhält man nach nur 3tägiger Fermentation eine Kulturlösung mit 50 AIE/ml.

Beispiel 25 "

Ersetzt man in einem Ansatz nach Beispiel 24 Glycerin durch Glucose, cc erhält man nach 3 Tagen Kulturlös_ungen mit 60 AIE/ml. /·■

Beispiel 26

Ändert inaji in einem Ansatz nach Beispiel 24 die Nährlösung nach Beispiel 1 und ersetzt die Stärke durch Glucose, dann erhält man nach 3tägiger Bebrütung Kulturlösungen mit 140 AIE/ml.

Beispiel 27

Beimpft man 5 1-Liter-Erlenmeyer-Kolben mit je 120 ml Nährlösung der Zusammensetzung 3 ^cp Glucose., 0,5 $ NZ-Amine, 1,0 ^c/i Hefeextrakt, 0,4 $ CaCO₇ (Ster: J isation: 30 Minuten, 121⁰O; pH vor der Sterilisation 7,2) mit 1 ml einer Vorkultur des Stammes SE 39 (he3"gestel]t nach Beispiel 4) und bebrütet 3 Tage auf einer Rundscbüttelmasehlne bei 28 C,

Le A 13 428 - 35 -

209830/0836 BADORIG.NAL

so erhält man nach der Zentrifugation 500 ml eines Überstandes mit 160 AIE/ml.

Die 500 ml des Überstandes v/erden mit 6 Volumen = 3 Liter Aceton unter Rühren gefällt, der hellbraune Niederschlag wird * abgemitscht, mit Aceton und Äther gewaschen und im "Vakuum getrocknet C
Ausbeute 3,5 g mit 13,5 χ 10⁵ AIE/g.

Beispiel 28

Beimpft man einen Erlenmeyerkolben mit 120 ml einer Nährlösung nach Beispiel 4 mit 1 ml einer Vorkultur des Stammes SE 50 (Vorkultur hergestellt nach Beispiel 4) und bebrütet ebenfalls" nach Beispiel 4, so erhält man nach 5 Tagen eine Kulturlösung mit 1,0 SIE/ml.

Beispiel 29

Arbeitet man nach Beispiel 28, jedoch in einer Nährlösung nach Beispiel 1, so erhält man nach Stägiger Bebrütung eine Kulturlösung mit 26 000 AIE/ml und 0,18 MIE/ml und 1,8 SIE/ml.

Beispiel 30

Arbeitet man nach Beispiel 29, jedoch mit einer Kolbenfüllung' von 200 ml, so erhält man nach 5tägiger Inkubation eine Kulturlösung mit 24 500 AIE/ml und 0,18 MIE/ml und 2,1 SIE/ml.

Beispiel 31

Arbeitet man nach Beispiel 28, jedoch mit einer Nährlösung der Zusammensetzung .2 $ Stärke, 1 °p Glucose, 0,3 $> Glykokoll, 0,25 $> Maisq.uellwasser, 0,4 $.Sojamehl, 0,1 ⁰Jo NaCl, 0,1 °p K₂HPO₄, 0,01 io MgSO₄, 0,01 fo OaCO₅, 0,01 io PeSO₄, so erhält

Le A 13 428 " _ 36 - .

209830/0836

man nach 3tägiger Fermentation eine Kulturlösung mit 12 900 AIE/ml.

Ersetzt man in einer Nährlösung nach Beispiel 1 die Glucose durch andere Zucker oder Zuckeralkohole und "beimpft und bebrütet nach Beispiel 28, so erhält man Kulturlösungen mit folgenden Amylase-Inhibitor-Konzentrationen:

Zusatzstoffe ( 1 fo)

Rohrzucker lactose Maltose Galaktose Glucose Sorbit Mannit Inosit Stärke

Beispiel 33

Ersetzt man in einem Ansatz nach Beispie'l 28 das Glycerin durch Glucose, so erhält man Kulturlösungen mit 330 AIE/ml.

Beispiel 34

Ersetzt man in einem Ansatz nach Beispiel 28 die Stärke durch Glucose, so erhält man Kulturlösungen mit 660 AIE/ml.

AIE/ml nach 3 Tagen	AIE/ml nach 5 Ta
	23 000
24 000	—
23 500	-
31 300	-
41 000	-
24 000
33 000
21 000	—
33 900

Le A 13 428; - 37 -

209830/0

Beispiel 35

Ersetzt man in Ansätzen nach Beispiel 29 HZ-Amine durch andere komplexe Stickstoffquellen, dann erhalt man nach 3tägiger Fermentation Kulturlösungen mit folgenden Amylase-Inhibitor-Einheiten:

AIE/ml

13	500
16	800
25	200
32	700
23	100

Ersatzstoff

Sojamehl Fishsolubles Trypton Fleischextrakt Phui-iiiamedia

Beispiel 36

Beimpft man einen Ansatz nach Beispiel 29 rat,einer morphol gischen Variante vom Stamm SE 50, dem Stamm SE 50/12, so erhält man nach 3tägiger Fermentation Kulturbrühen mit 51 500 AIE/ml.

Beispiel 3?

Beimpft man 5 Versuclisfermenter mit je 8 Liter Kulturlösung nach Beispiel 1, jedoch mit 0,1 Vol.-$ Antischaummittel Bayer E 100 mit je 120 ml einer Vorkultur (gewonnen nach Beispiel 1) und bebrütet unter Rührung und Belüftung 65 Stunden bei 28⁰G, so erhält man nach Vereinigung der Fermentationsansätze und Abtrennung des Mycels 24 Liter Kulturbrühe mit 13 000 AIE/ml und 6 SIE/ml. Die Kulturbrühe wird auf 1 Liter durch Eindampfen im Vakuum bei 20 Torr und 100°0 Badtemperatur eingeengt. Das schwarz gefärbte Konzentrat \nirde bei 15 000 Upm 60 Kinuten zentrifugiert, der dunkle Überstand wurde auf eine Amberlite IRA 410 Säule (9 cm 0,

Le A 13 428

209830/0836

50 cm Höhe, Amberlite IRA 410 Acetat pH 7 in H₂O) aufgetragen, mit .50 ml HpO/Stunde eluiert und 20 ml Fraktionen am Fraktionskollektor gesammelt. Die'inhibitorhaltige, hellgelb gefärbten-Fraktionen (insgesamt 300 = 6 Liter) werden vereinigt, am· Rotationsverdampf er auf 1 Liter eingeengt und. unter intensivem Rühren in 10 Liter absoluten Alkohol eingetropft, dabei fällt ein flockiger, fast weißer Niederschlag aus. Der Niederschlag wird abgenutscht, mit absolutem Alkohol und darauf mit Äther gewaschen und im Vakuum getrocknet. Ausbeute 60 g eines weißen Pulvers mit 3x10 AIE/g und 400 SIE/g.

Beispiel 38

Die Abtrennung der Hauptmenge der inaktiven Begleitstoffe, besonders der dunkle Farbstoff, kann auch durch Fällung mit gleichen Volumina Methanol erfolgen. Dazu werden_v26 Liter der zentrifugieren (hergestellt nach Beispiel 37, jedoch mit 0,02 Vol.-^o Antischaummittel Bayer Silicon E) Kulturbrühe (43 000 AIE/icl) durch Eindampfen im Vakuum bei 20 Torr und 10O⁰C Badtemperatur auf 1,2 Liter eingeengt. Die tief schwarze Lösung wird mit dem gleichen Volumen (1,2 Liter) Methanol unter Rühren versetzt, wobei sich eine flockige, schwarze Fällung bildet. Es wird durch ein Faltenfilter filtriert und das braune Filtrat (2,2 Liter) in 10 Liter Trockensprit unter intensivem Rühren eingetropft. Es bildet sich einhellbrauner Niederschlag, der abgenutscht, mit Aceton und Äther gewaschen und im Vakuum getrocknet wird.

Ausbeute 185 g eines hell-ockerfarbenen Pulvers mit 3700 AIE/mg.

Zur weiteren Reinigung löst man den gesamten Niederschlag (185 g) in 250 ml H₂O und zieht die dunkelbraune Lösung über eine 5 x 75 cm Säule von Amberlite IRA 410 (Acetat-

Le A 13 428 - 39 -

2098 30/0836

form, pH 7). Eluiert wird mit Yfasser, die ersten 500 ml Eluat v/erden als Vorlauf verworfen, die nächsten 5000 ml fast farblosen Eluats enthalten die irhibitorische Aktivität. Sie werden am Kotationsverdampfer eingeengt -auf 200 ml, der Inhibitor' daraus durch Eintropfen in 2 Liter absoluten Äthylalkohol, Abnutsehen des Niederschlage und Trocknen im Vakuum nach Waschen mit Äthanol und Äther gewonnen, Ausbeute 80 g eines weißen lulvers mit 8000 AIE/mg.

Beispiel 39

Beimpft man einen 1-Liter-Brlenmeyer-Kolben mit 120 ml einer Nährlösung nach Beispiel 4 mit 2 ml einer Vorkultur des Stammes SE 55 (hergestellt nach Beispiel 4) und bebrütet die Kultur auf einer RundSchüttelmaschine bei 28⁰C 6 Tage, dann erhält man nach Abtrennung des Mycels eine Kulturbrühe, die 30 AIE/ml und 0,15 MIE/ml und 0,5 SIE/ml enthält.

Extrahiert man das Mycel nach Beispiel 20, so erhält man einen Extrakt mit 15 AIE/ml, 0,17 MIE/ml und 0,5 SIE/ml.

Beispiel 40 .,.

Arbeitet man nach Beispiel 39» jedoch mit einer Nährlösung nach Beispiel 1, so erhält man eine Kulturlösung mit 60. AIE/ml, 0,16 MIE/ml und 0,65 SIE/ml und einen Mycelextrakt mit 30 AIE/ml und 0,16 MIE/ml und 0,33 SIE/ml.

Beispiel 41

Beimpft man eine Nährlösung nach Beispiel 39 aus einer Schrägröhrchenkultur mit Haferflockenagar des Stammes SS 26 und bebrütet die Kultur nach Beispiel 40 5 Tage, dann erhält man nach Abtrennung der Kulturlösung nach Extraktion des Mycels nach Beispiel 21 einen Extrakt mit 0,14 MIE/ml.

le A 13 428 - 40 -

0983(1/0836

Beispiel 42 .

Verfährt man wie in Beispiel 41 mit einer Kultur des Stammes SS 45, dann erhält man einen Mycelextrakt mit 0,1 MIE/ml. ··

Beispiel 43

Verfährt man wie in Beispiel 41 mit einer Kultur des Stammes SS 53, so erhält man eine Kulturbrühe mit 0,05 MIE/ml und einen Mycelextrakt mit 0,07 MIE/ml,

Beispiel 44

Beimpft man einen 1-Liter-Erlenmeyer-Kolben mit 120 ml einer Nährlösung der Zusammensetzung 0,5 $ Bacto-Pepton, 0,5 9^ Fleischextrakt, 0,2 # Hefeextrakt, 0,03 # Caseinhydrolysat, 1 io i-Inoslt, 1 <fo Sorbit, 1 # D-Mannit, 1 # Glucose, 0,1 $> K₂HPO₄, 0,05 # MgSO₄, 0,05 # KCl, 0,01 J& FeSC₄, pH eingestellt auf 7,2, aus einer Schrägagarkultur (hergestellt nach Beispiel 1) des Stammes SS 51, so erhält man nach Kultur auf , einer Rundschüttelmaschine bei 28⁰C über 7 Tage eine Kulturlösung mit 0,072 MIE/ml und einem Myeelextrakt (hergestellt nach Beispiel 21) mit 0,054 MIE/ml.

Beispiel 45

Beimpft man eine Nährlösung nach Beispiel 4 aus einer Schräg- " röhrchenkultur mit Haferflockenagar des Stammes St 19 und bebrütet nach Beispiel 4 · 3 Tage, dann erhält man nach Abtrennung des Mycels eine Kulturlösung mit 20 AIE/ml.

Le A 13 428 - 4I -

209Ί30/0836

Beispiel 46

yeroi-ichsanordnun/; sum Wirkungsnachv.'eis von Glykosidhydrolasen- InMbi toren an Ratte und Mensch

Zur Erzeugung einer alimentären Hyperglykämie und Hyperinsulinänie nach Kohlenhydratfütterung erhalten Ratten (n = 6) 2,5 g Stärke odor Maltose oder Saccharose als Lösung oder Suspension/kg p. os (Kontrolltiere). Jeweils 6 andere Ratten erhallen zusätzlich zu einem der oben genannten Kohlenhydrate einen Glykosidhydrolasen-Inhibitor in der angegebenen Dosie- ■ rung p. os. Der Blutzucker wird in kurzen Abständen nach der Kohlenhydratgäbe im Blut aus dem retroorbitalen Venenplexus mit dem Auto-Analyser (Technicon ^ , nach Hoffman: J. biol. Chem. _1_20_j_ 51 (1937)) bestimmt. . M

Zur Erzeugung einer alimentären Hyperglykämie beim. Menschen werden 50 g Stärke/Vp. als wäßrige Suspension oral verabreicht, Der Blutzucker wird unmittelbar vor V-ersuchsbeginn und in kurzen Abständen danach wie oben angegeben im Kapillarblut der Fingerbeere bestimmt. In einem v/eiteren Versuch wird der V/irkstoff zu der Stärkesuspension hinzugegeben.

Im Serum von je 6 Ratten, von denen eine Gruppe 2,5 g Stärke/kg p. os (Kontrolle) und die anderen Gruppen ziisätzlich einen Glykosidhydrolasen-Inhibitor.bekommt, wird das Insulin in kurzen Abständen nach Kohlenhydratgabe bestimmt. . _Λ

Die IiisulinbeStimmung im Serum erfolgt radioimmunologisch in Anlehnung an die Doppelantikörpermethode von Haies und Rändle /Biochem. J. 8B_x 137 (196317·

Le A 13 428 ' - 42 -

209830/0838

Tabelle 1 zu Beispiel

Blutglucose in mg# (Mittelwert +Is) von nüchternen Ratten zu verschiedenen Zeiten nach oraler Gabe von Stärke +_ Wirkstoff aus Beispiel 5.

15

Kontrolle ohne Stärke Kontrolle mit Stärke

Stärke + 25 000 AIE/kg

61 + 16
UO + 11

106 + 20

60 min. 70 _z 3,4 145 + 15

128 + 11

Tabelle 2 zu Beispiel

Blutglucose in mgfo (Mittelwert + Is) von nüchternen Ratten JBU verschiedenen Zeiten nach oraler Gabe von Stärke + Wirkstoff aus Beispiel H.

JL5_

60 min.

Kontrolle ohne Stärke Kontrolle mit Stärke

72 + 8,5 78 + 12. 69+12 .159 +28 153 + 36 164 + 7,9

Stärke + 25 000 AIEAg 95+3,7 95 ± 8,7 96 + 7,2

Tabelle 3 zu Beispiel

Blutglucose in mg# (Mittelwert +.Ib) von nüchternen Ratten au verschiedenen Zeiten nach oraler Gabe von Stärke ± Wirkstoff aus Beispiel 37.

Kontrolle ohne Stärke Kontrolle mit Stärke Stärke + 25 000 AIEAg

15 30 60 min.

72 + 8,5 78 + 12 \ 69 +.12

159+28 153+36 164+ 7,9

83 + 6,5 105 + 5,2 104 + 6,5

ρ < 0,01 ===== P < 0,001

gegen Kontrolle mit Kohlenhydrat

Le A 13 428

- 43 -

209830/0

Tabelle 4 zu Beispiel 46

Blutglucose in mg/O einer gesunden Versuchsperson zu verschiedenen Zeiten nach oraler Gabe von Stärke +. Wirkstoff aus Beispiel 37.

0 15 30 . ' 60 90 min.

Stärke ohne Wirkstoff 106 128 150 146 136
Stärke + 60 000 ΑΙΕΛρ· 100 112 108 110 104

Tabelle 5 zu Beispiel 46

Blutglucose in mg^ (Mittelwert +_ Ib) von nüchternen Ratten zu verschiedenen Zeiten nach oraler Gabe von Maltose + Wirkstoff aus Beispiel 10. W

15 30 60 min.

Kontrolle ohne Maltose 70 +, 6,7 81+15. 72 + 9,6 Kontrolle mit Maltose 160+13 153 + 1,1 172 + 13

Maltose + 1,5 MIE 120 + 13 124 + 12 134 +. 9,4

Tabelle 6 zu Beispiel 46

Blutglucose in mg# (Mittelwert + Is) von nüchternen Ratten zu verschiedenen Zeiten nach oraler Gabe von Saccharose £ Wirkr stoff aus Beißpiel 14·

15 30 60 min. Kontrolle

ohne Saccharose

61 +16 77 + 4,7 70 + 3,4

Kontrolle _{125 u 129} ή ^ _{135 + θ}

mit Saccharose — ■'—■»-' — »

Saccharose +'50 SIE/kg 104 + 4,1 116 + 8,4 113 + 3

ρ < 0,05 P<0,01 ===== P <0,00iJ

Le A 13 428 - 44 -

209830/0836

Tabelle 7 zu Beispiel 46

Seruminsulin in /uE/ml (Mittelwert £■ Is) von nüchternen Hatter zu verschiedenen Zeiten nach oraler Gabe von 2,5g Stärke —Wirkatoff auo Beispiel 14; η ■= 6.

Das Seruminsulin von nüchternen Ratten ohne Stärkebelastung betrug in diesem Versuch 6—1 yuE/ml.

Min. nach

Stärkegäbe Stärkekontrolle · Stärke + 10 000 AIE/kg

5 52 i 29 ll_r_§

10 72 i 20 1[L==4

20 44 - 28 1§_Γ_2

30 .25-8 17 - 3

45 30 i 5 · Uj:J>.

60 . 21 i 8 13^8

120 9 ⁱ 3 10-3

180 8^2 . 9^2

Tabelle 8 zu Beispiel 46

Seruminsulin in yuE/ml (Mittelwert £ Is) von nüchternen Ratten zu verschiedenen Zeiten nach oraler Gabe von 2,5 g Stärke - Wirkstoff aus Beispiel 37; η = 6.

Min, nach	I	Stärkekontrolle	Stärke + 10 000 AIEAg '
Stärkegabe	52 i 29	18 £ 8
5	72 - 20
10	44 i 28	11-5
20	25 - 8	13 - 3
30	30 i 5	18 i 7
45	21 £ 8	15 * 5
60	9-3	13 £ 5
120	8-2	11 ± 5
180	P < 0,01 == P<	0 001 X gegen Kontrolle ' J mit Kohlenhydrat
P <0,05 ·	- 45 -
Le A 13 428

2098 30/08 3 6

Claims

Patentansprüche .

ev/innung von In-

//£] Inhibitoren für Glykosidhydrolasen, vorzugsv;eise des Verdauungstraktes, aus Actinomyceten, vorzugsv;eise aus Actinoplanacοcn und Strcptomycetaceen.

J jfr· Inhibitoren nach Anspruch 2, die Saccharase und/oder-'Maltase und/oder Amylase hemmen.

^X. Verfahren zur Herstellung der Inhibitoren nach Anspruch 2 und 3, dadurch gekennzeichnet, daß mau diese aus Actinoiayceten, insbesondere aus Actinoplanaceen und Streptomycetaceen, nach an sich bekannten Methoden gewinnt. .*

L·tf. Arznei- und/oder Lebensmittel, gekennzeichnet durch einen Gehalt an Inhibitoren nach Anspruch 2 und 3.

■· .nfo·* Anspruch 5, dadurch _Li ' ι im ι 11 Ium Ί ι il Ml um die Inhibito

ren gemäß

3 mit pharmazeutisch indifferen-

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/f. Verwendung der Inhibitoren gemäß Anspruch 2 und 3 als Therapeutica zur Behandlung von Adipositas und/oder A^therosklerose und/oder Diabetes und/oder Prädiabetes und/oder Karies.

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