Uprawniony z patentu: Bayer Aktiengesellschaft, Leverkuson (Republika Federalna Niemiec) Sposób wytwarzania inhibitorów hydrolaz glikozydów Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania inhibitorów hydrolaz glikozydów.Wiadomo, ze mozna inaktywowac a-amylazy za pomoca róznych maloczasteczkowych substancji np. kwasu salicylowego i abiscyzyny [T. Hemberg, J. Larsson, Physiol, Plant. 14, 861 (1961), T. Hemberg, Acta Chem. Scand. 21, 1665 1967)]. Ponadto wiadomo, ze istnieja równiez substancje wyzejczasteczkowe, które moga wplywac hamujaco na aktywnosc, niektórych amylaz niespecyficznie przez fizyczna adsorpcje [T.. Chrzaszcz, J. Janicki, Bioch, Z'. 260.354 (1938) i Bioch. J. 28, 296 (1934) lub denaturacje i wytracenie enzymu (B.S. Miller.E. Kneen, Arch. Biochem. 15.251 (1947), D.H. Struhmeyer, M.H. Malic, Biochem. Biophys. Acta 184,643 (1969). Oprócz tego zaobserwowano, ze za pomoca destylowanej wody mozna eluowac z pszenicy substancje obnizajaca dekstryfikujaca aktywnosc amylazy zawartej w slinie, która jednak tylko nieznacznie wplywa na aktywnosc amylazy trzustkowej (E. Kneen, R.M. Sandstedt, Arch. Bioch. 9. 235 (1946)].Wada opisanych substancji jest to, ze hamowanie amylazy jest albo niespecyficzne, albo jak wykazaly wlasne badania jest nieznaczne, zwlaszcza w stosunku do amylazy trzustki, to znaczy, ze prawie calkowite hamowanie amylaz (do 90% i wyzej) mozna uzyskac przy bardzo wysokim stosunku inhibitor: enzym.Inhibitory amylazy sa przedmiotem dwóch publikacji UP RFN DOS nr 200 3934.3 i DOS nr 202 8739.2.W zgloszeniach tych wykazuje sie, ze za pomoca wodnych roztworów elektrolitów, korzystnie rozcienczonych kwasów, a zwlaszcza mieszanin woda-alkohol (alkohole o 1—3 atomach wegla), korzystnie przy kwasnych wartosciach pH mozna ekstrahowac z pszenicy (sruta pszeniczna, maka pszeniczna lub gluten) wysokoaktywny inhibitor amylazy trzustkowej nie wykazujacy wymienionych wad. Tak uzyskana substancja inaktywuje amylaze trzustkowa do ponad 90% juz przy niskich stosunkach inhibitor: enzym.Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania inhibitorów hydrolaz glikozydów, korzystnie inhibitorów hydrolaz glikozydów przewodu pokarmowego rozszczepiajacych weglowodany. Inhibitory te wytwarzane sa przez mikroorganizmy rzedu Actinomycetales, zwlaszcza rodzin Streptomycetaceae, Thermoactinomycetaese, Mieromonosporaceue, Nocardiacese, a przede wszystkim rodziny Actinoplanacese. W bardzo duzym stopniu wytwarzaja je szczepy gatunków Actinoplanes, Ampullariella, Streptosparangium, Streptomyces, Chainia, Pilimelia, Planomonospora, Actinobifida i Norcardia.2 82 900 Sposób wedlug wynalazku polega, na tym, ze mikroorganizmy rzedu Actinomycetales, dokladnie wyzej okreslone, hoduje sie na pozywce, zawierajacej zródlo wegla, azotu i kwas mineralny, w temperaturze 15—60°C, a nastepnie utworzony inhibitor hydrolaz glikozydów wyodrebnia sie z grzybni i/lub z roztworu hodowli. Nalezy przy tym zaznaczyc, ze kazdy szczep potrzebuje do optymalnej produkcji inhibitorów róznej jakosciowo pozywki i o innym skladzie ilosciowym. Charakterystyka stosowanych pozywek jest nizej podana.Po 1—10 dniowej fermentacji w temperaturze 15—60°C, korzystnie 24—50°C w kolbach wstrzasanych lub fermentatorach róznej wielkosci wydziela sie grzybnie z cieczy pofermentacyjnej i w zaleznosci od wystepowania inhibitorów, skladnik czynny uzyskuje sie z przesaczu hodowli lub grzybni.Inhibitory uzyskuje sie z brzeczki przez liofilizacje lub stracanie solami lub rozpuszczalnymi w wodzie rozpuszczalnikami organicznymi, np. nizszymi alkoholami i ketonami, lub przez adsorpcje substancji czynnych na wymiennikach jonowych.Natomiast z grzybni inhibitory uzyskuje sie przez ekstrakcje rozpuszczalnikami organicznymi np. alkohola¬ mi, ketonami, eterami, estrami i sulfotlenkami.W tym celu ciecz pofermentacyjna odwirowuje sie przez 10—60 minut, przy 3000-20000 obrotów na minute, korzystnie 6—10000 obrotów na minute lub saczy sie, korzystnie pod cisnieniem i przy uzyciu srodków ulatwiajacych saczenie, takich jak np. Klarzell i w ten sposób rozdziela sie na brzeczke hodowli i grzybnie.Wydzielenie inhibitora z brzeczki hodowli mozna przeprowadzic w rózny sposób: a) Przesacz hodowli zateza sie pod zmniejszonym cisnieniem (10—50 tor w temperaturze lazni wynoszacej 20—100°C, korzystnie 40—80°C do okolo 1/5—1/50 objetosci poczatkowej. Zatezony wyciag saczy sie lub odwirowuje i klarowny przesacz (lub klarowna ciecz znad osadu) liofilizuje sie ewentualnie po uprzednim odsoleniu. b) Inhibitory wytraca sie z przesaczu hodowli (lub wyciagu zatezonego wedlug a) przez dodanie rozpuszczalnych w wodzie rozpuszczalników organicznych, np. alkoholi lub ketonów, korzystnie metanolu, etanolu, acetonu do uzyskania zawartosci rozpuszczalników wynoszacej 60—90%. Poniewaz przy nizszych stezeniach rozpuszczalników wytracaja sie nieaktywne substancje towarzyszace, ten sposób wytracania nadaje sie bardzo dobrze do frakcjonowanego stracenia i oddzielenia niepozadanych substancji towarzyszacych. c) Inhibitory wytraca sie z wyciagów (lub wyciagów zatezonych wedlug a) przez wysalanie np. siarczanem amonu, sola kuchenna itp. Wytracony osad oddziela sie przez odwirowanie lub saczenie i albo przemywa sie bezposrednio acetonem i eterem i suszy sie pod zmniejszonym cisnieniem albo po rozpuszczeniu w wodzie dializuje sie i liofilizuje. d) Inhibitory adsorbuje sie na wymiennikach jonowych. Sposób d/ nadaje sie do wydzielania inhibitorów, które ze wzgledu na chemiczna budowe maja ladunki. Desorpcje inhibitora przeprowadza sie przez zmiane mocy jonowej lub wartosci pH eluenta.W brzeczce znajduja sie oprócz inhibitora niepozadane substancje towarzyszace. Oddzielenie tych substan¬ cji towarzyszacych mozna przeprowadzic w rózny sposób np. przez denaturacje cieplna substancji towarzysza¬ cych inhibitorom, które sa odporne na ogrzewanie lub, gdy inhibitory sa maloczasteczkowe, przez dialize przez odpowiednie membrany, przy czym niepozadane substancje czynne zatrzymywane sa przed membrana, lub przez frakcjonowane stracanie (b) lub adsorpcje substancji towarzyszacych na wymiennikach jonowych.Uzyskiwanie inhibitorów z grzybni odbywa sie przez ekstrakcje grzybni rozpuszczalnikami organicznymi, korzystnie przez dwukrotna 10—20 minutowa ekstrakcje 3-5 objetosciami acetonu (w stosunku do objetosci grzybni) i nastepnie jednorazowa 5—10 minutowa ekstrakcje eterem. Tak ekstrahowana grzybnie suszy sie pod zmniejszonym cisnieniem i nastepnie, mieszajac ekstrahuje sie 3—10 czesciami wagowymi sulfotlenku dwumety- lowego w ciagu 2—8 godzin, po czym odwirowuje sie przy 10000—20000 obrotów na minute. Wyciag z alkoholu i eterze zateza sie do sucha pod zmniejszonym cisnieniem i rozpuszcza sie w wyciagu sulfotlenkowym. Zamiast sulfotlenkiem dwumetylowym suchy proszek grzybni mozna ekstrahowac przez dluzszy czas, korzystnie w ciagu 12—24 godzin, woda lub rozcienczonymi roztworami elektrolitów.Nowe substancje rozpuszczaja sie dobrze w wodzie. Pewna grupa inhibitorów jest odporna na ogrzewanie przy obojetnych roztworach pH, odporna na kwasy (pH 2) i alkalia (pH 12), i daje sie dializowac powoli.Inhibitory te nie sa inaktywowane przez trypsyne i pepsyne i one nie inaktywuja tych enzymów. Typowe barwniki protein nie barwia ich, poza tym nie wykazuja one w ultrafiolecie przy 250 mm charakterystycznej absorpcji. Inhibitorów tych nie mozna inaktywowac mocznikiem i 0-merkaptoetanolem. Ciezar czasteczkowy tych inhibitorów, wedlug wyników filtracji zelowych, zawiera sie w granicach 500—6000. Przy hydrolitycznym rozszczepianiu otrzymuje sie monosacharydy, np. glikoze. Wedlug tych danych inhibitory te sa oligosacharydami lub polisacharydami lub ich pochodnymi.Najlepsze inhibitory tej grupy maja zdolnosc hamowania aktywnosci amylazy wynoszaca 8000 Al R/mg.82 900 3 Inna grupa inhibitorów jest odporna na wysoka temperature i nie daje sie dializowac lub dializuje slabo.Inhibitory te sa inaktywowane szybciej lub wolniej przez trypsyne. Wiekszosc tych inhibitorów jest inaktywowa- na przez mocznik i 0-merkaptoetanol. Inhibitory te sa prawdopodobnie substancjami o charakterze peptydowym.Najlepsze inhibitory tej grupy maja zdolnosc hamowania aktywnosci amylazy wynoszaca 80 Al E/mg.Wiadomo, ze u zwierzat i ludzi po spozyciu pokarmów i uzywek zawierajacych weglowodany (np. zboza, skrobi ziemniaczanej, owoców, soku owocowego, czekolady) wystepuje hiperglikemia powodowana szybka odbudowa weglowodanów przez hydrolazy glikozydów (np. przez amylaze sliny i trzustki, maltaze, sacharaze, wedlug schematu: skrobia lub glikogen—§52*1223-maltoza -E§Lt«5_g|jkoza lub sacharoza------—glikoza + fruktoza Hiperglikemie te wystepuja zwlaszcza ostro i przez dluzszy czas u diabetyków. U ludzi otylych pokarmo¬ wa hiperglikemia wywoluje czesto szczególnie silne wydzielanie insuliny, co prowadzi do wzmozonej syntezy tluszczów i obnizonej obudowy tluszczów. Ostatecznie w wyniku tych hiperglikemii u ludzi o normalnej przemianie materii i osób otylych wystepuje czesto hypoglikemia w wyniku wydzielania insuliny. Wiadomo, ze zarówno hypoglikemia, jak i papka pokarmowa znajdujaca sie w zoladku przyspieszaja wydzielenie soku zoladkowego, co z kolei wywoluje lub ulatwia powstanie gastritis, wrzodu zoladka lub dwunastnicy.Stwierdzono, ze otrzymane i wydzielone sposobem wedlug wynalazku inhibitory hydrolaz glikozydów zmniejszaja w znacznym stopniu pokarmowa hiperglikemie, hiperinsulinemie hypoglikemie, które wystepuja po spozyciu przez szczury i/lub ludzi akrobi pszenicznej lub sacharozy lub maltozy i przyspieszaja przejscie weglowodanów przez zoladek.Ponadto wiadomo, ze weglowodany wjami ustnej, zwlaszcza sacharoza, ulegaja rozszczepianiu przez mikroorganizmy, co przyspiesza proces próchnicy. Inhibitory hydrolaz glikozydów mozna stosowac zatem jako lek w nastepujacych stanach chorobowych' adipositas, hyperlipemia, (arterioskleroza), diabetea, prediabetes, gastritis, ulbus ventriculi, ulbus dwuodeni i karies.Dawkowanie: 100-100000 Al E/kg lub 2,5-250 MIE lub 100-10000 SIE jeden lub kilka razy dziennie przed i/lub w czasie i/lub po jedzeniu per os.Preparaty: tabletka, drazetka, kapsulka, roztwór, zawiesina, granulat, guma do zucia, pasta do zebów i jako dodatek do zawierajacych weglowodany pokarmów i/lub uzywek.Toksycznosc niektórych inhibitorów hydrolaz glikozydów jest krancowo mala. Substancja z przykladów XIV i XXXVII w dawce 5 x 10~6 AlE/kg ciala myszy lub szczura per os nie daje zadnych szkodliwych objawów.Myszy i szczury znosza dozylna injekcje 106 AlE/kg. Korzystne sa zestawy ze znanymi doustnymi srodkami antydiabetycznymi (/3-cytotropowe pochodne sulfonylomocznika i/lub biguanidyny obnizajace poziom cukru we krwi).Dla pozyskania wydajnosci szczepów stosowanych w sposobie wedlug wynalazku stosuje sie nizej podane metody.W znany sposób izoluje sie z próbek gleby szczepy rzedu Actinomycetales, zwlaszcza rodzin Streptomy- cetaceao i Actinoplanaceae lub nabywa sie w zbiorach szczepów szczepy tych rzedów.Po przeprowadzeniu hodowli posiewowej, szczepami tymi posiewa sie pozywki umieszczone w kolbach, umozliwiajace rozwój tych szczepów. Mozna stosowac np.. pozywke glicerynowo-glikokolowa wedlug Plotho zawierajaca 2% gliceryny, 0,25% glikolu, 0,1% NaCI, 0,1% K2HP04,0,01% FeS04. 7H20,0,01% MgS04 . 7H20 i 0,01% CaC03. W celu przyspieszenia namnazania, korzystnie dodaje sie do takiej pozywki kompleksowe zródla wegla, np. nanok kukurydziany, make sojowa, wyciag drozdzy lub hydrolizaty protein, np. NZ-aminy, lub mieszaniny wymienionych substancji. W tych przypadkach nalezy regulowac wartosc pH, przy czym poczatkowa wartosc pH pozywki wynosi korzystnie 6,0—8,0 zwlaszcza 6,5—7,5.Gliceryne zawarta w pozywce mozna zastapic równiez innymi zródlami wegla, np. glikoza, cukrem trzcinowym lub skrobia lub mieszanina tych substancji. Zamiast glikokoli mozna stosowac równiez inne zródla azotu, np. wyciag drozdzowy, make sojowa, NZ-aminy, Phaemanedia itp. Stezenia zródel wegla i azotu oraz stezenia soli moga wahac sie w szerokich granicach.Mozna nie wprowadzac FeS04, CaC03 i MgS04. Otrzymana pozywke w ilosci np 100-200 ml wprowa¬ dza sie do 1 litrowych kolby Erlenmayera, sterylizuje sie w zwykly sposób, posiewa sie badanym szczepem i fermentuje sie w temperaturze 15—60°C, korzystnie 24-50°C w kolbach umieszczonych na wstrzasarkach.Po stwierdzeniu rozwoju szczepu, co nastepuje na ogól po 1—10 dniach, przewaznie 3—5 dniach, pobiera sie próbke, np. 5 ml, w tej próbce oddziela sie grzybnie przez odsaczenie lub odwirowanie. Z otrzymanych przesaczy hodowli pobiera sie 0—100 ul i testuje sie wedlug nizej podanych sposobów, po czym oblicza sie zdolnosc inaktywowania w przeliczeniu na 1 ml.4 82 900 Grzybnie ekstrahuje sie 2 x 5 czesciami objetosciowymi (w stosunku do grzybni) acetonu, nastepnie 1 x 5 czesciami objetosciowymi eteru etylowego, pozostala grzybnie po ekstrakcji suszy sie pod zmniejszonym cisnieniem w temperaturze 20°C potrzymany suchy proszek grzybniowy ekstrahuje sie 4—8 czesciami wagowymi sulfotlenku dwumetylowego (DMSO).Wyciag acetonowy i eterowy laczy sie i zateza sie prawie do sucha pod zmniejszonym cisnieniem.Pozostalosc tych wyciagów rozpuszcza sie w wyciagu otrzymanym przy ekstrakcji suchego proszku za pomoca DMSO, pobiera sie 0—100 /ii otrzymanego roztworu i przeprowadza nizej podane testy.Testowanie inhibitora za pomoca amylazy.Jednostka inhibitora amylazy (1 AIE) jest taka ilosc inhibitora, która inaktywuje do 50% dwie jednostki amylazy.Jednostka amylazy (AE) jest taka ilosc enzymu, która wciagu 1 minuty rozszczepia w podanych warunkach doswiadczenia 1 minuty rozszczepia w podanych warunkach doswiadczenia i równowaznik glikozydo- wych wiazan w skrobi. Jeden ju-równowaznik wiazan glikozydowych oznacza sie kolometrycznie za pomoca kwasu dwunitrosalicylowego jako 1 ^-równowaznik wytworzonych cukrów redukujacych i nastepnie otrzymany wynik za pomoca krzywej odwzorcowania maltazy przelicza sie na /i-równowazniki maltozy.Przy przeprowadzaniu doswiadczenia 0,1 ml roztworu amylazy (20—22 AE/ml) traktuje sie 0—400^9 inhibitora lub 0—100/ii badanego przesaczu hodowli lub wyciagu grzybni w 0,4 ml 0,03 m buforu glicerynofos- foranu sodowego i 0,001 m CaC!^ o wartosci pH = 6,9 i wciagu okolo 10-20 minut utrzymuje sie na lazni wodnej w temperaturze 35°C. Nastepnie inkubuje sie w temperaturze 35°C przez 5 minut z 0,5 ml 1% roztworu skrobi ogrzewanego wstepnie do temperatury 35°C. (Skrobia rozpuszczalna, Firmy Merck, Dermstadt, Nr 125 (i nastepnie traktuje 1 ml kwasu dwunitrosalicylowego (wedlug P. Bernfeld w Colowock — Kaplan, Meth.Enzymol, toml, strona 149). Wsad ogrzewa sie wciagu 5 minut na wrzacej lazni wodnej do wystapienia zabarwienia, nastepnie chlodzi sie i traktuje 10 ml destylowanej wody. Ekstynkcje przy 540 mm liczy sie w stosunku do odpowiednio ustalonej wartosci bez amylazy.W celu przeprowadzenia obliczen odczytuje sie z przedtem otrzymanej krzywej odwzorcowania amylazy aktywnosc amylazy istniejaca jeszcze po dodaniu inhibitora i z tego oblicza sie procentowa wartosc inhibitowa- nia wprowadzonej amylazy. Procentowa wartosc hamowania aktywnosci nanosi sie jako funkcje ilorazu /xg inhibitora (w przeliczeniu na sucha substancje) do AE (AE we wsadzie tej samej serii bez inhibitora), po czym odczytuje sie z krzywej wartosc, przy której nastepuje hamowanie w 50% i przelicza sie na stezenie inhibitora w AJ E/mg.Testowanie inhibitora za pomoca sacharozy.Jednostka inhibitora sacharozy (SIE) jest ilosc inhibitora, która hamuje do 50% dwie jednostki sacharazy.Jednostka sacharazy (SE) jest ilosc enzymu, która rozszczepia w ciagu 1 minuty w podanych parametrach doswiadczenia 1 jLtmol sacharozy na glikoze i fruktoze. Ilosc jumoli rozszczepionej sacharozy oznacza sie kolorymetrycznie w przeliczeniu na wytworzona w wyniku rozszczepienia glikoze i fruktoze za pomoca kwasu dwunitrosalicylowego i nanosi na krzywa odwzorcowania glukozy/fruktozy.W celu przeprowadzenia testu 0,1 ml roztworu sacharazy (solubilizowana sacharaza z mukozy jelita swinskiego wg B. Borgatróm, H. Dalquist, Acta Chem. Scand. 12, (1958) strona 1997) (0,3-0,4 SE/ml) traktuje sie 0—400/ug inhibitora lub 0-50/z badanego przesaczu hodowli lub ekstraktu grzybni w 0,1 ml 0,1 m buforu z maleinianu sodu o wartosci pH = 6,0 i utrzymuje sie w ciagu okolo 10—20 minut na lazni wodnej o temperatu¬ rze 35°C. Nastepnie przez 60 minut inkubuje sie z 0,2 ml 0,056 m roztworu sacharozy wstepnie ogrzanego do temperatury 35°C (sacharoza Fs. Merck, Darmstadt, Nr 7652 w temperaturze 35°C i nastepnie traktuje 0,5 ml kwasu dwunitrosalicylowego) P. Bernfeld w Colowick -Kaplan, Meth. Enzymol, tom 1, strona 149). Wsad ogrze¬ wa sie na wrzacej lazni wodnej w ciagu 5 minut do wystapienia zabarwienia, nastepnie chlodzi sie i traktuje 5 ml wody destylowanej.Ekstynkcje przy 540 nm mierzy sie w stosunku do odpowiedniej slepej wartosci bez sacharazy.Przy ocenie wyniku ustala sie z krzywej odwzorcowania jednostki sacharazy aktywne jeszcze po dodaniu inhibitora i z tego oblicza sie procentowa wartosc hamowania wprowadzonej sacharazy.Procentowa wartosc hamowania nanosi sie jako funkcje ilorazu jug inhibitora (w odniesieniu do suchej substancji) do SE (SE we wsadzie z tej samej serii bez dodatku inhibitora), odczytuje z krzywej wartosc, przy której zachodzi 50% inaktywacja i przelicza na zawartosc inhibitora w SIE/mg- Testowanie inhibitora za pomoca maltazy.Jednostka inhibitora maltazy (1 MIE) jest ilosc inhibitora hamujaca do 50% aktywnosc dwóch jednostek maltazy. Jednostka maltazy (NE) jest ilosc enzymu, która wciagu jednej minuty rozszczepia w podanych warunkach doswiadczen 1 równowaznik wiazania glikozydowego w p-nitrofenylo- a-D-glukopiranozydzie. Mikro- równowaznik rozszczepionego wiazania oznacza sie fotometrycznie jako równowaznik p-nitrofenolanu.\ 82900 5 Przy przeprowadzaniu doswiadczenia utrzymuje sie na lazni wodnej wciagu okolo 10—20 minut w temperaturze 35°C 0,05 ml roztworu maltazy (Solubilizowana maltaza z mukozy jelita swinskiego wedlug B. Borgstróm, Acta Chem. Scand. 12, (1958) strona 1997 lub maltaza w postaci liofilizatu wydzieliny trzustki ludzkiej). (0,09—0,12 ME/ml) z 0-400/ug inhibitora lub 0-20/ii badanego plynu hodowlanego lub wyciagu grzybni w 0,05 ml 0,1 m buforu z maleinianu sodu o wartosci pH = 6,0. Nastepnie w ciagu 30 minut inkubuje sie z 0,1 ml ogrzanego wstepnie do temperatury 35°C 0,4% roztworu p-nitrofenyloa-D-glukopiranozydu (Fa. Serva, Heidelberg nr 30716) w 0,1 m buforze z maleinianu sodu o wartosci pH = 6 w temperaturze 35°C i nastepnie reakcje zatrzymuje sie przez dodanie 2 ml 0,565 m buforu trójfosforanowegp o wartosci pH = 7,6. Ekstynkcje przy 403 nm mierzy sie natychmiast w stosunku do odpowiednio ustalonej slepej wartosci bez maltazy.Obliczenia prowadzi sie przy zalozeniu molowego wspólczynnika ekstynkcji E403 = 13,8X103 dla anionu nitrofenolanowego przy wartosci pH = 7,6, ustalajac jeszcze aktywne po dodaniu inhibitora jednostki maltazy i obliczajac stad procentowe hamowanie aktywnosci wprowadzonej maltazy. Procentowe hamowanie nanosi sie jako funkcje ilorazu ilosci jug inhibitora (w odniesieniu do suchej) do ME (Me we wsadzie bez inhibitora), z krzywej odczytuje sie wartosc, przy której wystepuje 50% hamowanie i przelicza na zawartosc inhibitora wMIE/mg.Poniewaz w tym zwykle stosowanym tescie Routine pracuje sie z sztucznym substratem,a niewlasciwym substratem maltazy (maltozy), bada sie preparaty dodatkowo na ich skutecznosc inhibitowania maltazy stosujac bardziej pracochlonny test opisany przez Dahlquista (Enzym, biol.olin. 11. 52 (1970). W tym tescie oznacza sie kolorymetrycznie za pomoca oksydazy glikozy, peroksydazy i dianizydyny glikoze powstajaca podczas dzialania maltazy na maltoze. Wszystkie opisane tu inhibitory maltazy wykazuja aktywnosc równiez i w tym tescie Wedlug wyzej podanego sposobu zbadano caly szereg szczepów róznych rodzin i gatunków rzedu Aktiaonycetales. U róznych rodzin i gatunkach stwierdzono, jesli nawet czesciowo slaba, to jednak wyrazna zdolnosc inhibitowania hydrolaz glikozydów.Ze wzgledu na wydajnosc najbardziej korzystne sa szczepy rodziny Streptomycetaceae, a zwlaszcza rodziny Actinoplanaceae.U rodzin tych, zwlaszcza gatunków Streptomyces, Actinoplanes, Ampullariella i Streptosporangium, znaleziono szczególnie aktywne szczepy.Ze zbadanych szczepów szczególna skutecznosc w jednym lub kilku próbach wykazaly nizej zestawione szczepy.82 900 Tablica I Okreslenie wlasne 1 SB 2 SB 5 SB 11 SB 12 SB 18 SB 27 SB 46 SE 5 SE 21 SE 39 SE 50 SE 55 SE 26 SS45 SS51 SS53 St 19 St 50 St67 St45 RT36 RT33 ST 12 ST 51 ST 3 ST1 SS55.SS59 SS62 AT 8 AT 11 AT 13 AT 14 SE 89 SE 100 AT 4 AT 9 AT 10 SE 103 HN 6 HN2 AT 2 SE 101 SK 2 SE 82 SA 28 SA 8 AT 7 SE 45 ATCC CBS NRRL Nr w kolekcji 2 CBS 951 70 CBS 95270 CBS 95570 CBS 95670 CBS 95770 CBS 95870 CBS 95970 CBS 96070 CBS 95370 CBS 95470 CBS 96170 CBS 96270 CBS 96370 CBS 96470 CBS 96570 CBS 96670 ATCC 3319 CBS 69369 CBS 43259 CBS 43451 CBS 22865 CBS 29566 NRRL B-2286 CBS 49868 NRRL 2580 ATCC 11523 CBS CBS CBS KCC-A 0027 KCC-A 0025 CBS 19064 CBS 19364 CBS CBS CBS 19164 KCC-A 0028 ATCC 19190 CBS CBS CBS CBS 36766 CBS CBS CBS CBS CBS ATCC 1 2428 CBS Szczep Nazwa 3 Ampullariella regularis Ampullariella regularis Actinoplanes spec.Actinoplanes spec.Actinoplanes spec.Actinoplanes spec.Actinoplanes spec.Actinoplanes spec.Ampullariella regularis Ampullariella regularis Actinoplanes spec.Actinoplanes spec Streptosporangium album Streptosporangium spec.Streptosporangium spec.Streptosporangium roseum Streptomyces flaveolus Streptomyces heimii Streptomyces tendae Streptomyces aureofaciens Chainia rubra Chainia poonensis Streptomyces murinus Streptomyces fradiae Streptomyces chrysomalljs Streptomyces chrysomallus Streptosporangium roseum Streptoporangium amethystogenes Streptosporangium roseum Streptosporangium viridalbum Streptosporangium album Ampullariella campanulata Ampullariella regularis Ampullariella spec.Planomonospora spec.Ampullariella digitata Streptosporangium Yulgare Streptoporangium indianensis Actinoplanes spec.Actinobifida chromogena Actinobifida chromogena Actinoplanes utahensis Planomonospora porontospora Pilimelia spec.Actinoplanes spec Ampullariella digitata Actinoplanes spec.Streptosporangium roseum Ampullariella regularis = American Type Culture Collection = Centraalbureau voor Schimmelcultures, Baarn Amyli K 4 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + aza M 5 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + Dzialanie hamujace Maltaza K M 6 7 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + ; + + + + + + + + + = Culture Collection Unit. Fermentation Section, Northern Utilization Research, Brauch, Sacharaza K 8 + + + + + + + + + + + + + + + + + + M 9 + + + + + + ++ + + + + + + + + + + + + + + Peoria, lllinoisy USA KCC = Culture Collection, Research Division, Kaken Chemical Co. Ldt., Tokio, Japonia K = roztwór hodowli M = wyciag grzybni + = dzialanie wyrazne ++ = dzialanie silne + ++ = dzialanie bardzo silneData wyizolowania Metoda Pochodzenie Grzybnia LM Grzybnia Sm Ksztalt zarodni Srednica zarodni Ksztalt zarodników Wielkosc zarodników Wiciowanie Uklad zarodników w zaro dni Zarodniki konidialne Zarodniki substratowe itp.Melanina Redukcja azotanów Uplynnienie zelatyny Pepton izacja mleka Wzrost w temperaturze 20°C 26°C 32°C 37° C 42°C Odpornosc na NaCI 2% 3% 4% 7% Streptosporangium album SS26 2.8.1967 rozmaz gleby, plytka Rhón, Heidelstein. murawa, miedzy blokami bazaltu pH3,9 biala 0,5—1,2 z przegrodami 82 900 Tablica II Streptosporangium spec.SS45 8.11.1968 rozmaz gleby, plytka Kenia, kolo Ruiru pole kawowe pH 5,4 bialo-kremowo-zóltawa lub rózowa 0,4-1,2 kulista, czesciowo pomarszczona kulista, gladka i zdeformowana 3-7 ± kuliste do wydluzonych 0.6-0,9X0.6-1,3 - - spiralne lancuszki PEH- CPC- TY - Gel- + (slaba) + + + + + + + — - + W nieznaczna - - — - 3-11 przewaznie ± owalne 0,7-1,1X1,0-1,7 — spiralne lancuszki PEH - CPC- TY- Gel - - + + + + + + - + + + + + - 7 Streptosporangium spec.SS51 9.11.1968 ^ rozmaz gleby, plytka Kenia, kolo Ruiru pole kawowe pH5,4 bialo-kremowo-zóltawa lub rózowa 0,4—1,2 z przegrodami kulista, gladka niektóre pomar¬ szczone i nieregularne, postacie niewyksztalcone 3-11 przewaznie ± owalne, czesciowo kuliste 0,7-1,0X0,8-1,7 - spiralne lancuszki PEH - CPC- TY - Gel - - + + + + + ( + ) + - + + + + + — Hydroliza skrobi + +82900 Tablica Ma Streptosporangium roseum SS53 Actinoplanes spec.SF 5 SE 55 Data wyizolowania 9.11.1968 16.12.1969 31.12.1969 Metoda Pochodzenie Grzybnia SM Ksztalt zaródni Wielkosc zarodni Ksztalt zarodników Wielkosc zarodników Wiciowanie Uklad zarodników w zarbd- rozmaz gleby, plytka Kenia, kolo Ruiru, pole kawowe pH 5,7 LM kulista, czesciowo troche pomar¬ szczona 3-1 Om0 przewaznie ± owalne 0,7-1,1X1,0-1 ,9m pylek Kenia, kolo Ruiru, pole kawowe pH 5,6 rózowa 0,4—1,2ii vc^ona spiralne lancuszki pylek Kenia, Njoro Eldoret stacja doswiadczalna pH 5,1 0,3-1 ,3m z przegrodami nieregularna okolo 4-12/i ± kuliste ca 1/u klebuszkowate, lancuszki, lancu¬ chy zarodników miejscami prze¬ biegajace równolegle i prosto Zarodniki konidialne Zarodniki substratowe itp. na CPC: zarodniki substratowe przewaznie kuliste (±),do okolo 2 ju0 pojedyncze do kilku, umieszczone na koncu lub rozrzu¬ cone : Melanina Redukcja azotanów Uplynnienie zelatyny Peptonizacja mleka Wzrost w temperaturze .20° C 26° C 32° C 37° C 42°C Odpornosc na NaCI 2% 3% 4% 7% PEH- CPC- TY - Gel- • + + + + + + + + - + ( + ) + - — ?v-w _ CPC- TY - CPC + TY + + + + + + + Hydroliza skrobi82 900 Data wyizolowania Metoda Pochodzenie Grzybnia Ksztalt zarodni Wielkosc zarodni Ksztalt zarodników Wielkosc zarodników Wiciowanie T Ampullariella regularis SB 2 2.7.1966 pylek Neuhof, okreg Fulda, pod zbutwiala sloma, pH5,7 0.3—1/i szerokosci butelkowata, cylindryczna ,,miesz¬ kowata" 4-10X7-1 8m preciki 0.5-0,7X1.5-2,2/1 witki - Uklad zarodników w zaród- proste równolegle ni Zarodniki konidialne Zarodniki substratowe itp Melanina Redukcja azotanów Uplynnienie zelatyny Pepton izacja mleka Hydroliza skrobi Wzrost w temperaturze 20°C 26° C 32°C 37°C 42°C lancuszki CPC- ) TY - k ~ Gel - J + + + + + + + + + + - - gleba miedza a b I i c a Mb Ampullariella regularis SB 5 3.7.1966 pylek Neuhof, okreg Fulda, gleba pod zbutwiala sloma, miedza pH 5.7 0,3-1 m butelkowata, cylindryczna ,,mieszkowata 3,5-7X6-14/j preciki 0,5-0,7X1,5- witki f i -2,2/i proste równolegle lancuszki CPC- TY - Gel - \ J + + + + + + + + + + - - Ampullariella regularis SE 21 17.12.1969 pylek Kenia, kolo Ruiru pole kawowe pH 5,3 0,3-1 n butelkowata, cylindryczna ,,miesz- kowata" 3,5-9X6-13/u preciki 0,5-0,7X1,5-2,2/1 witki proste, równolegle lancuszki CPC + TY + + + + + + + + + + + — ^10 82 900 ' Data wydzielenia Metoda Pochodzenie Grzybnia Ksztalt zarodni Wielkosc zarodni Ksztalt zarodników Wielkosc zarodników Wiciowanie Uklad zarodników w ni Ampullariella regularis SE 39 22.12.1969 pylek Kenia, kolo Ruiru pole kawowe pH 5,6 0,3-1/i butelkowata, cylindryczna „mieszkowata" 3-10X5-16/4 preciki 0,5-0,7X1,5-2,2m witki zarod- Ta b I i ca Mc Actinoplanes spec.SB 11 9.11.1966 pylek Eschwege kolo Frankershausen „HielÓcher" PH7,7 0,3—1 ,3m z przegrodami i proste, równolegle lancuszki ' ' ' " ' tm Actinoplanes spec.SB 12 9.11.1966 pylek Arfurt, Oberlahnkreis, gleba w miejscu naslonecznionym na skalach pH 7,3 0,3-1 ,2m ± kulista, powierzchnia pomarszczona, czesciowo nierównomiernie 3,5-1 2m ± kuliste okolo 1 -1,3/i zarodniki ruchliwe lancuszki klebusz- kowate Zarodniki konidialne.Zarodniki substratowe itp.Melanina Redukcja azotanów Uplynnienie zelatyny Peptonizacja mleka Hydroliza skrobi Wzrost w temperaturze 20°C 26°C 32°C 37° C 42°C CPC + TY + ++ + + + + + + na CPC szerokie strzepki (okolo 1 ,3m) z przegrodami w odstepie okolo 2,5—4/x nieprzezroczyste; przetrwalniki CPC- Gel + + + + + + + ++ + + + CPC- TY - Gel + + + + ++ ++ + + + +82 900 11 Data wyizolowania Metoda Pochodzenie Grzybnia Ksztalt zaródni Wielkosc zarodni Ksztalt zarod¬ ników Wielkosc zarod¬ ników Wiciowanie Actinoplanes spec.SB 18 4.12,1966 pylek Hattenheim. Rheingau. pole ziemniaczane „Sandaue" PH 8,0 0,3-1 ,3*i przegrody nieregularna, pomarszczo¬ na, wypukla 6-16 ± kuliste czesciowo z wypuklosciami w kszta¬ lcie nosa 1-1,7*i Peczki witek Tab I i ca Md Actinoplanes spec.SB 27 8.12.1966 pylek Kiihkopf, rezerwat przyrody.Altrhein, las debowy ponizej lak pH 7,6 0,2-1 ,1*i Actinoplanes spec.SB 46 3.3.1967 pylek Neuhof, FuIda, murawa na obrzezu drogi pH6,1 0,3-1,4*i przegrody ± maczugowata lub nieregularna, owalna do cylindrycznej, postrzepiona, czesciowo nieregularna, wypukla powierzchnia pomarszczona 4-16*i ± kuliste 1-1,3** Zarodniki ruchliwe 6-20/1 ± kuliste okolo 1,2-2*i Actinoplanes spec.SE 50 22.12.1969 pylek Kenia, kolo Ruiru pole kawowe pH 62 0.4-1,3*1 nieregularna wypukla, pomarszczona, 4-13*i ± kuliste okolo 1*1 Uklad zarodników klebuszkowate lancuszki lancuszki slabo kle~ w zarodni buszkowate. czesciowo lancuszki równolegle i prostoliniowe Zarodniki koni- dialne Zarodniki substratowe itp.Melanina Redukcja azotanów Uplynnienie zelatyny Peptonizacja mleka Hydroliza skrobi Wzrost w tempera¬ turze 20°C 26°C 32°C 37°C 42°C CPC- TY- Gel + - + + + + + + + + + + _ CPC- TY - Gel - + + + + + + + + + + + i lancuszki klebuszkowate, lancuszki klebuszkowate czesciowo równolegle miejscami równolegle na CPC zarodniki substra¬ towe „do 3*10 pojedyncze lub rozrzucone kilka, je¬ den za drugim CPC -1 TY- | - Gel - J CPC TY :l + + + + + + + + + + + + + + + + + +12 82 900 Tablica Ile Actinoplanes spec.SA 8 Actinoplanes spec.SE 82 Actinoplanes spec.SE 103 Data wyizolowania 26.6.1966 26.2.1971 2.3.1971 Metoda Pochodzenie Grzybnia Ksztalt zaródni Wielkosc zarodni Ksztalt zarodników Wielkosc zarodników Wiciowanie pylek Marburg, ziemia kompostowa z Ogrodu Botanicznego 0,3-1 ,3m nieregularna 7-1 5X9-1 8m ± kuliste okolo 1.5/u ruchliwe Uklad zarodników w zaród- klebuszkowe ni lancuszki Melanina Redukcja azotanów Uplynnienie zelatyny Peptonizacja mleka TY + Gel +' + CPC - + (bardzo slabo) + + pylek Cejlon, gleba z plantacji kauczuku 0,3-1,3/u nieregularna 5-14/1 ± kuliste okolo 1—1 AU pylek Korsyka, kolo Ste Trinite. gleba miedzy debami korkowymi nieregularna okolo 5-1 3m ± kuliste okolo 1/i bardzo ruchliwe82 900 13 " Data wyizolowania Metoda Pochodzenie Grzybnia Ksztalt zaródni Wielkosc zaródni Ksztalt zarodników Wielkosc zarodników Melani na Redukcja azotanów Uplynnienie zelatyny Pepton izacja mleka Hydroliza skrobi Wzrost w temperaturze 37°C 42°C Odpornosc na NaCI 2% 3% 4% Tabl i ca Hf Streptosporangium roseum Streptosporangium amethystogenes Streptosporanogium roseum SS 55 10.11.1968 rozmaz gleby, plytka Kenia, kolo Ruiru, gleba z pola kawowego 0,4-1 ,2m kulista 3-1 Om przewaznie owalne okolo 0,8X 1 ,-1 ,2m - + + + + + + - + _ SS59 10.11.1968 rozmaz gleby plytka Kenia kolo Njoro, gleba uprawna kulista 3-1 5m - - + + + + - + - SS62 10.11.1968 rozmaz gleby.plytka Kenia, kolo Njoro, gleba uprawna 0,4-1 ,2m kulista 3-1 Om przewaznie owalne okolo 0,8-1,1X 1-1,5m - ++ + + + + . - + —14 82 900 Tablica Mg Data wyizolowania Ampullariella digitata SA 28 Ampullariella regularis SE 45 Ampullariella spec.SE 89 10.11.1967 23.12.1969 pylek Metoda grzybnia Pochodzenie Amcnau okreg Marburg rzysko Kenia kolo Ruiru, gleba z pola kawowego Grzybnia 0,3-1 /i Ksztalt zaródni bardzo waska i wzglednie dluga» butelkowata, cylindryczna, cze- obwodowo i czesciowo w ukladzie sto bardzo wydluzona bocznym nieregularna, czesciowo palczasta, maczugowata lub dlo- niasta Wielkosc zaród ni Ksztalt zarodników Uklad zarodników wzarodni MeLanina Redukcja azotanów Uplynnienie zelatyny 2-7X4-1 3m preciki w szeregach równoleglych Ty-I Gel - V + CPC+J + + 4-10X6-17/2 preciki w szeregach równoleglych Ty + 27.2.1971 pylek Ceylon, gleba ± cylindryczna, czesto szersza niz dluzsza, czesto nierówna na obwodowych zakonczeniach, chro¬ powata, czesciowo nieregularna i postrzepiona, niektóre palcza- ste 5-12x6X16/1 precikowate ruchliwe Peptonizacja mleka +82 900 15 Tablica llh Planomonospora spec.SE T00 Planomonospora parontospora SE 101 Pilimelia spec.SK 2 Data wyizolowania K3J971 27.2.1971 28.1.1968 Metoda Pochodzenie Grzybnia Ksztalt zaródni Wielkosc zaródni Ksztalt zarodników Wielkosc zarodników Uwiciowanie Uklad zarodników w zaródni Melanina Redukcja azotanów Uplynnienie zelatyny Peptonizacja mleka Wzrost w temperaturze 32° C 37° C pylek Korsyka na pólnoc od Aleria, gleba ze szkólki bawelnianej pylek : siresc myszy Cejlon, murawa Marburg. gleba ogrodowa, park szkolny 0,3-0,7/u waskie wydluzone.scisle przy- kulista, gruszkowata, owalna, legajace w podwójnych równoleg-zawierajaca Columella, która lych rzedach na grzybni powiet- jako przedluzenie sporangioforu rznej, na stronie wypuklej zwia- wchodzi do okolo 1/3 srednicy zane bezposrednio z podstawa lu- zarodni lub tez i dalej kowatych powietrznych strzepek okolo 1-1,3X3-4,5/u - okolo 7-15/u preciki, czesto slabo zakrzy¬ wione 0,35-0,45X0,8-1 ,5ju peczki witek, ruchliwe równolegle (równiez subpolarnie), zarodniki rozmieszczone w lancu¬ szkach wychodzacych z Columella w postaci czubów Ty + + + +16 82 900 Tablica III SB 2 SB 5 SB 11 Casaminopepton Czapek—A (CPC) Tyrozyna—A (Ty) Platki owsiane- drozdze—A (HA H) Skrobia-agar 1) W bardzo dobry 2) SM pomaranczowa 3) SP w agarze zóltawy 4) Spg + + +; obreczowata 5) K plaska, gladka W. dobry SM. zólto-pomaranczowa SP, w agarze zóltawy Spg -; poczatkowo + K. silnie zylkowana W. dobry do bardzo dobrego SM, pomaranczowo-czerwona SP. w agarze zóltawy SpgJ- W. umiarkowany SM. blado pomaranczowa SP. w agarze lekko zóltawy Spg-- W. bardzo dobry SM. brazowo-pomaranczowa SP. w agarze brazowawy SP.w agarze zloto-brazowy Spg. —; peptonizacja kazeiny Spg —; peptonizacja kazeiny W. umiarkowaniedobry W.nieznaczny SM. czerwonawo-brazowa SM. brazowawa SP. w agarze czerwonawo-brazowy SP. w agarze brazowy, slaba rozpuszczalnosc kr/szta- rozpuszczalnosc krysztalów lów Spg. + + ; obreczowata Spg. — Pepton-Czapek—A (PC) Czapek — A (Cz) Mleko-agar (Ca) W. bardzo dobry SM. pomaranczowa obreczowata SP. - Spg. + + K. plaska, czesciowo wypukla W. umiarkowany SM. pomaranczowa SP. w agarze barwa slabej ochry Spg.+ + W. dobry SM. brazowo-pomaranczowa W. dobry SM. brazowawo-pomaranczowa SP.- Spg. + + + W. dobry SM. brazowo-pomaranczowa SP.- Spg. + W dobry SM. pieknie pomaranczowa, ble¬ dnaca SP. w agarze zóltawy Spg-- K. z kretymi nabrzmialosciami W. dobry SM. pomaranczowa, blednaca SP. w agarze zloto-zólty Spg.- W. dobry SM. brazowo-pomaranczowa SP.- Spg-- W. bardzo dobry SM. brazowo-pomaranczowa nastepnie blado brazowa SP. w agarze zlotobrazowy Spg. —; peptonizacja kazeiny W. umiarkowany SM. blado pomaranczowv SP. krysztaly tyrazyny nie rozpuszczone W. dobry SM. ochrowo-pomaranczowa SV.- Spg.- W. umiarkowany do dobrego SM. bezbarwna do blado ochrowej SP.- Spg.- 1) W. = Rozwój/wzrost 2) Sm. = Grzybnia substratowa 3) SP. = Rozpuszczalny pigment 4) Spg. = Zarodnie 5) K. = ksztalt kolonii82 900 17 Tablica lila Casaminopepton- Czapek—A (CPC) Pepton-Czapek A (PC) Czapek—A (CZ) :F:i2 SB 12 W. bardzo dobry SM. pomaranczowo-brazowa SP. w agarze zóltawo-brazowa Spg. + K. plaska z promienistymi zlo¬ bkami, nabrzmiala w srodku W. bardzo dobry SM. brazowo-czerwona SP. w agarze zloto-brazowy Spg.- W. dobry SM. pomaranczowa do brazowo- SB18 W. bardzo dobry SM. intensywnie czerwono SP. w agarze brazowy Spg. + (+) K. plaska z promienistymi bkami i zmarszczkami W. bardzo dobry SM. brazowa SP. brazowy Spg„+ + W. dobry SM. czerwono-brazowa 1 ¦" ¦ ,m SB 27 W. dobry do bardzo dobrego -brazowa SM. blyszczaca pomaranczowa zlo- nastepnie brazowo-pomaranczowa SP. w agarze zólto-brazowy Spg..+ K. plaska, w srodku nabrzmiala, miejscami z wyrostkami W. dobry do bardzo dobrego SM. ochrowo-pomaranczowa SP.w agarze zóltawy Spg-- W.dobry SM. brazowo-czerwona Mleko-A (Ca) Tyrozyna—A (Ty) Platki owsiane drozdze (HaH) Skrobia-agar pomaranczowej SP. w agarze zielonkawy do zól¬ to fluoryzujacego Spg-- W. bardzo dobry SM. brazowo-pomaranczowa SP. w agarze zlotobrazowy Spg. —; peptonizacja kazeiny W. umiarkowany SM. brazowa SP. w agarze brazowy; rozpusz¬ czal nosc krysztalów + + Spg.- W. dobry SM. blado-pomaranczowa SP.- Spg. + SP.w agarze czerwonawo-braz owy SP..w agarze lekko ochrowy Spg. + + , obreczowata W. bardzo dobry SM. brazowo-pomaranczowa SP. w agarze zlotobrazowy Spg. + + , nie zawsze peptoniza¬ cja kazeiny Spg-- W. bardzo dobry SM. brazowo-pomaranczowa SP. w agarze zlotobrazowy Spg. +, nie zawsze peptoniza¬ cja kazeiny W. umiarkowany dobry W.umiarkowanie dobry SM. czerwonawo-pomaranczowo-bra- SM. ochrowo-brazowa, zowa SP. w agarze pomaranczowo-bra- SP. — rozpuszczalnosc zowy; rozpuszczalnosc krysztalów + + Spg~- W. dobry SM. czerwono-brazowa SP. czerwono-brazowy Spg. + + W. umiarkowany do dobrego W. umiarkowany do dobrego SM. blado-brazowawo-pomaranczo- SM.blada-brazowo- wa ',"' po maranczowa SP.- SP. - Spg.+ Spg-+ + Spg-- W.dobry SM. pomaranczowo-brazowa SP.- Spg.- W. umiarkowany do dobrego SM. blado-brazowawo-pomaranczo¬ wa SP.- Spg.. + +18 82 900 Tablica 11 Ib (c.d) Casaminopepton- Czapek-A , (CPC) Pepton- Czapek-A (PC) ¦ Czapek-A (CZ) •# Mleko-agar (Ca) - Tyrozyna-agar (Ty) Platki owsiane- drozdze-A #(Ha H) SB 46 W. dobry SM. pomaranczowa, nastepnie brazowawo- pomaranczowa SP.w agarze slabo zóltawy Spg. + K. plaska z promieni¬ stymi zlobkami W. dobry SM. pomaranczowa SP. w agarze zlocisto- zólty Spg. - W. dobry SM. pomaranczowo- brazowa SP. w agarze ochrowaty Spg.- W. bardzo dobry SM. pomaranczowa SP. w agarze zlocisty Spg.; pepton izacja kazeiny W. dobry SM. brazowa SP. w agarze zlocisto- brazowy; rozpuszczalnosc krysztalów ++ ' Spg.- W.dobry SM. pomaranczowo- brazowa SP.- Spg.- SE21 W. dobry SM. pomaranczowo- brazowa SP.w agarze zólto- brazowy czerwono-brazowy Spg. +; pojedyncze W. bardzo dobry* SM. ciemnobrazowa SP. brazowy Spg.+ W.dobry SM. pomaranczowo* • SP. do slabo zóltawego Spg. ++; obreczowate na SM W. dobry SM. brazowo- pomaranczowa SP. brazowy Spg. -; peptonizacja kazeiny W. umiarkowany SM. ciemnobrazowa SP. ciemnobrazowy Spg.,krysztaly tyro¬ zyny nierozpuszczone Spg.++ SE 39 W. dobry SM, czerwono-brazowa SP.w agarze zlocisto- brazowy Spg- ++; obreczowata * W. bardzo dobry SM. czerwonawo- ciemnobrazowa SP. ciemno-brazowy Spg. ++; obreczowate na SM W. dobry SM. brazowo-czerwona SP. czerwony Spg- + W. dobry SM. brazowo- pomaranczowa SP. ciemnobrazowy Spg. - brak peptonizacji kazeiny W. umiarkowany SM. ciemnobrazowa SP. ciemnobrazowy, Krysztaly tyrozyny nierozpuszczone , SE 50 W. bardzo dobry SM. brazowa SP. w agarze brazowy do zóltawo-brazowego Spg.- W. bardzo dobry SM. brazowa SP. ciemnobrazowy W. bardzo dobry SM. czerwono-brazowa SP. zlocistobrazowy W. dobry SM. pomaranczowo- brazowa SP. ciemnobrazowy, peptonizacja kazeiny W. umiarkowany SM. ciemne, jak agar SP. czarno-brazowy.Krysztaly tyrozyny nierozpuszczone Spg. + „Emerson" ¦ agar-E drozdze skrobia - A Skrobia- agar W. umiarkowany do dobrego SMJblado brazowawo- pomaranczowa SP.- Spg.+ Spg.++ W. umiarkowany do dobrego SM.blado brazowawo- pomaranczowa SP.- Spg.++ W. dobry SM. brazowa SP.brazowy Spg.- W.umiarkowany do dobrego SM.blado brazowawo- pomaranczowa, hydroliza skrobi Spg.+82 900 Tablica 111 o Casamino-pepton- Czapek—A (CPC) Platki owsiane drozdze-A (HaH) ,,Emerson"—A (E) Mleko-A (Ca) Czapek-agar (Cz.) Tyrozyna-agar (Ty) v SE 5 W. dobry SM. pomaranczowa LM.- SP. — do slabo zóltego.Powierzchnia kolonii w skosnych SE 55 W. dobry SE 103 W. bardzo dobry SM. ciemno-czerwonawo-brazowa SM. pomaranczowa LM.- SP. zólto-brazowy probówkach sluzowato blyszczaca W.dobry SM. pomaranczowa W.dobry SM. pomaranczowa LM.- SP.- Powierzchnia kolonii sluzowata W. dobry SM. pomaranczowa SP. — do zóltawego, brak pe¬ pton izacji kazeiny tylko nieznaczna bezposrednio przy grzybni W. dobry SM. pomaranczowa, powierzchnia wilgotnie sluzowata SP.- W. dobry SM. pomaranczowo-brazowa LM. - SP. jasnobrazowy - W. dobry SM. pomaranczowo-brazowa SP: brazowy brak pepton izacj i kazeiny, po okolo 2 miesiacach nieznaczna peptonizacja W.dobry SM. pomaranczowa SP.- W. nieznaczny do umiarkowanego SM. bezbarwna do blado pomaran- SP. zóltawo-brazowy Spg. - W. bardzo dobry SM. brazowa SP.- Spg- + + ; obreczowata W. bardzo dobry SM. pomaranczowa SP.- Spg. ++ obreczowata W. bardzo dobry SM. zólto-pomaranczowa SP.- Spg~- W. umiarkowany SM. ciemnobrazowa Pepton Czapek—A (PC) Skrobia—agar czowej SP.— SP. czarno-brazowy.Krysztaly tyrozyny nierozpusz- Krysztaly tyrozyny nierozpusz czone czone W. bardzo dobry SM. ciemno rózowawo-brazowa SP. ciemno-brazowy W. umiarkowany do dobrego SM. blado pomaranczowo-brazowa SP. -.Spg. +20 82 900 Tablica llld SS45 SS51 SS53 Casaminopepton- Czapek—A (CPC) Platki owsiane drozdze—A (HaH) „Emerson"—A (E) Mleko—A (Ca) Drozdze glikoza- wyciag gleby—A (HGE) Wyciag nawozu—A (Mi) W. umiarkowany (do dobrego) SM. — rózowawo-brazowa LM.- SP.- kolonie plaskie, o 6 mm 0 po 9 tygodniach W. dobry SM. brazowo-czerwona LM. + , bialy i rózowy SP. slabo zóltawy do zóltawo- zielonkawego Spg- + W.dobry SM. czerwona LM. - SP. - slabo zóltawy z zielonka¬ wym odcieniem W. dobry SM. blado-brazowawo-czerwona SP. w agarze zlocistozólty peptonizacja kazeiny LM.- W.dobry SM. brazowawo-czerwona LM. +, cienka powloka SP. zlocistozólty z zielonkawym odcieniem W. umiarkowany (do dobrego) LM. + + , biala i rózowa Spg. + W. umiarkowany (do dobrego) SM. rózowawo-brazowa LM. - SP. - kolonie plaskie o 6 mm0 po 9 tygodniach W. dobry SM. brazowo-czerwona LM. +, bialy i rózowy SP. slabo zóltawy z zielonka¬ wym odcieniem Spg. + W. dobry SM. brazowo-czerwona LM. +, malo. biala SP. —, do slabo zóltawego bra¬ zowawego W. dobry SM. blado brazowawo-czerwona LM.- SP. w agarze zlocistozólty peptonizacja kazeiny W. dobry SM. brazowo-czerwona LM. +, biala SP. zólty z zielonkawym odcie niem W. umiarkowany (do dobrego) LM. + + , rózowa Spg. + W. dobry SM. blado jasnobrazowa LM. biala SP. brunatnawy kolonie plaskie.srodek bez LM W. dobry do bardzo dobrego SM. purpurowo-brazowa do czer¬ wono-brazowej LM. + + , brudno-biala i rózowa SP. purpurowy czerwono-brazowy Spg. + + W. dobry SM. czerwonawo-brazowa LM. + +, rózowa SP.czerwono-brazowy Spg-+ + W. dobry SM. blado jasnobrazowa LM. - SP. w agarze zlocistozólty, peptonizacja kazeiny W. dobry SM. brazowawo-winnoczerwona LM. + + , rózowa SP. czerwonawy, zólto-brazowy82900 21 Casamino-pepton Czapek—A (CPC) Pepton Czapek—A PC Platki owsiane drozdze-A (HaH) „Emerson"—agar (E) Mleko-A (Ca) SA 8 W. bardzo dobry SM. pomaranczowa SP. zóltawo-brazowawy Spg. + W. bardzo dobry SM. pomaranczowa SP. zóltawo-brazowawy Spg. + W. dobry SM. brazowa SP.- Spg. + W. bardzo dobry SM. pomaranczowo-brazcwa Tablica llle SE 82 W. dobry SM. brazowa SP. brazowy W. bardzo dobry SM. pomaranczowa do brazowo- pomaranczowej SP. slabo zóltawo-brazowawy W. bardzo dobry SM. pomaranczowo-brazowa SP. brazowy SS26 W. dobry SM. bezbarwna do blado-ochrowej LM. — malo, biala SP.- Spg. — kolonie plaskie z pojedynczymi promienistymi zlobkami i kon¬ centrycznymi zgrubieniami W. dobry do umiarkowanego SM. bezbarwna LM. malo, biala SP.- Spg. + W. umiarkowany SM. bezbarwna LM. +, biala SP.- W. dobry SM. bezbarwna Czapek—A (CZ) Tyrozyna—A (Ty) Drozdze-glikoza wyciag gleby—A (HGE) Wyciag nawozu —A (Mi) SP. w agarze zlocisto-brazowy Spg. + Peptonizacja kazeiny W. dobry SM. brazowo-pomaranczowa SP. zólto-brazowy Spg.- W. umiarkowany SM. czarna SP.czarny; krysztaly tyrozyny rozpuszczone Spg-- W. dobry SM. brazowa SP. zlocisto-brazowy Spg. + LM. - SP.- Peptonizacja kazeiny W. dobry SM. czerwono-pomaranczowa SP. zóltawy W.dobry SM. bezbarwna LM. +, biala SP.- W. umiarkowany SM. blado-brazowa LM. +, biala Spg. +82 900 Tablica lllf Casamino-pepton Czapek-A (CPC) Mleko-A (Ca) * Tyrozyna—A (Ty) Platki owsiane drozdze—A (HaH) „Emerson"-agar (E) Drozdze gl ikoza wyciag gleby-agar (HGE) SE 55 W. dobry, kolonie plaskie SM. jasnobrazowa LM. biala SP. slabo jasnobrazowy W. dobry SM. blado jasnobrazowa LM.- SP.- peptonizacja kazeiny W.dobry SM. brazowa LM. - biala SP.- krysztaly tyrozyny roz rozpuszczone W. dobry do bardzo dobrego SM. czerwonobrazowa LM. brudnorózowa SP. czerwonobrazowy W. dobry SM. czerwonobrazowa LM. rózowa i biala SP. czerwono-brazowy W. dobry SM. czerwono-brazowa LM. rózowa SP. zólto-brazowy SS59 W. dobry SM. ciemnobrazowa LM.- SP. zólto-brazowy fioletowe krysztaly, peptonizacja kazeiny W.dobry SM. ciemnobrazowa LM.- SP. brazowy krysztaly tyrozyny - rozpuszczone W.dobry SM. ciemnobrazowe LM. malo, biala Spg-- SP. brazowawy duzo fioletowych krysztalów W. dobry SM. ciemnobrazowa SP. zóltobrazowy fioletowe krysztaly W. dobry SM. ciemno-brazowa LM. - SP.zóltobrazowy fioletowe krysztaly SS62 W. dobry, kolonie plaskie SM. blado jasnobrazowa LM. biala SP.- W. dobry SM. blado jasnobrazowa LM.- SP. w agarze zóltawobrazowy, peptonizacja kazeiny W. dobry SM. brazowa LM. malo, biala SP. brazowy, krysztaly tyrozyny roz rozpuszczone W. dobry do bardzo dobrego SM. czerwonobrazowa LM. brudnorózowa SP. czerwonobrazowy W. dobry SM. czerwonobrazowa LM. malo, cienka otoczka czesciowo grubsza, rózowa SP. czerwonobrazowy W.dobry SM. ciemno-czerwona LM. rózowa SP. zólto-brazowy82 900 23 Tablica Ulg SA 28 SE 45 SE 89 Casamino-pepton Czapek-A (CPC) Pepton Czapek—A (PC) Czapek—A (Cz) Mleko-A (Ca) Tyrozyna-agar (Ty) Platki owsiane drozdze—A (HaH) „Emerson"-agar (E) W. dobry do bardzo dobrego W. dobry SM. poczatkowo czerwono-brazowa, pózniej ciemnobrazowa do czarnej SP.ciemnooliwkowy SP.- intensywnie czerwono-bra- SP. — zowy Spg.- Spg.+ Spg. + W.dobry do bardzo dobrego SM. poczatkowo czerwono-brazowa, pózniej ciemnobrazowa do czar¬ nego SP.ciemnooliwkowy Spg.- W. dobry SM. czerwono-brazowa W. umiarkowany do dobrego, kolonie plaskie SM. pomaranczowobrazowa SP.slabo ochrowy Spg. +, czesciowo obreczowata W. bardzo dobry SM. czarno-brazowa SP. ciemnooliwkowy do zielonkawo-czarnego Spg-- peptonizacja kazeiny W. umiarkowany do dobrego SM. brazowa SP.- Spg-- krysztaly tyrozyny rozpuszczone krysztaly tyrozyny nie rozpusz- pod grzybnia czone W.dobry SM. brazowo-czerwona SP. brazowawoczerwony Spg.. + + , obreczowata W. dobry SM. pomaranczowobrazowa SP. brazowy Spg- + peptonizacja kazeiny W. umiarkowany SM. brazowa SP. ciemnobrazowy Spg-- W. dobry SM. ciemnobrazowa Sp. lekko brazowawy Spg. + W. dobry do bardzo dobrego SM. brazowa do czarno-brazowej Sp. ochrowy z zielonkawym odcie¬ niem Spg. + W. dobry Spg. + + , obreczowata na SM W. dobry SM. ciemnobrazowa SP. lekko zóltawobrazowy Spg. + + , obreczowata W. dobry do bardzo dobrego SM. pomaranczowa SP.- Spg. + + , obreczowata W. bardzo dobry SM. pomaranczowa SP.- SPg. + + , obreczowata24 82 900 Tablica III h Casamino-pepton Czapek—A (CPC) Czapek—A (Cz) „Emerson"-agar (E) Platki owsiane drozdze—A (HaH) Mleko—A (Ca i Ca/2) Tyrozyna-agar (Ty) SE 100 W. dobry SM. blado ochrowa LM. + + , biale SP. - W. dobry SM. bezbarwna LM.+ + , biala SP.- SE 101 W.dobry SM. czerwona LM. malo, biala SP.- W. umiarkowany SM. bezbarwna do rózowej LM- +. biala SK 2 W.dobry W. dobry SM. bezbarwna do blado ochrowej SM. bladoczerwona do czerwonej pózniej blaknaca LM.+ + , biala LM. - SP.- SP. - W. dobry SM. blado ochrowa LM. + + , biala SP.- W. dobry SM. rózowa LM. + +, brudno rózowa SP. zóltawo brazowawy Spg. + + W. umiarkowany SM. brazowa SP.- W. dobry (wzglednie) SM. zlocisto-zólta powierzchnia brodawkowata SP.- Spg-- peptonizacja kazeiny W. dobry SM. brazowawo-zlocisto-zólta do zólto-pomaranczowej SP.zlocisto-brazowy do czerwonawo-brazowego Spg-- krysztaly tyrozyny rozpuszczone82 900 25 G li koza Fruktoza Sacharoza Mannit L-arab i noza Rafinoza Inozyt D-ksyloza SB 2 + + + + + + + + + + - - + + - SB 5 + + + + + + + + - — + + SB 11 + + + + + + + + + + + + + + + + Wzrost na SB 12 + + + + + + + + + + - - + + Ta h I i c a IV róznych zródlach wec SB 18 + + + + + + + + + + — + + + + SB 27 + + + + + + + + + + — + + + + lla SB 46 + + + + + + + + + + — + + + + SE 21 + + + + + + - + + - - + + SE 39 + + + + SE 50 + + + + + + + + + + + - + + SE 55 + + + + + + + + + + + - + + + + Rozwój tak dobry jak na gl ikozie lub lepszy + Rozwój gorszy niz na glikozie. lepszy niz na pozywce sól mi nera I na-agar nie zawierajacej cukru — Wzrost na pozywce sól mineralna-agar bez zródla wegla Szczepy podane w tablicy I pochodza ze znanych zbiorów szczepów np. American Type Culture Collection, lub Centraalbureau voor Schimmelcultures lub sa zlozone w Centraalbureau voor Schimmelcultures w Bearn/Ho- landia pod numerami CBS podanymi w tablicy 1.W tablicach II i III podano niektóre cechy opisanych szczepów, a w tablicy IV okreslono wzrost szczepów na róznych zródlach wegla.Nizej podane przyklady blizej wyjasniaja sposób wedlug wynalazku.Przyklad I. Pozywke w ilosci 200 ml wprowadzona do 3 1 litrowych kolb Erlenmeyera zawierajaca 2% skrobi, 1% glikozy, 0,5% NZ-aminy, 1,0% wyciagu drozdzowego, 0,4% CaC03 (sterylizacja w ciagu 30 minut w temperaturze 121°C; wartosc pH = 7,2 przed sterylizacja) posiewa sie po 1 ml kultury posiewowej szczepu SE 2 (otrzymana w tej samej pozywce przez przeszczpienie z kultur w skosnym agarze otrzymanych na pozywce platki owsiane — agar) i zawartosc kolb fermentuje sie w temperaturze 28°C na obrotowej wytrzasarce.Fermentacje prowadzi sie wciagu 5,5 dni. nastepnie zawartosc 3 kolb laczy sie i oddziela grzybnie przez odwirowanie. Otrzymuje sie 425 ml plynu hodowlanego zawierajacego 100 Al E/ml.Odwirowany plyn zateza sie do objetosci 60 ml w wyparce rotacyjnej pod cisnieniem 15—20 tor, w temperaturze lazni wodnej wynoszacej 37°C. Gesty roztwór miesza sie z 8 objetosciami wynoszacymi 480 ml etanolu. Wytracony osad oddziela sie przez odwirowanie, rozpuszcza sie ponownie w 60 ml wody i dializuje w ciagu 6 godzin do destylowanej wody. Dializat liofilizuje sie. Wydajnosc: 1,6 g o zawartosci 19X103 Al E/g.Przyklad II. Otrzymuje sie ze wsadu wedlug przykladu I 440 ml odwirowanego plynu o zawartosci 100 AlE/ml.Otrzymane 440 ml cieczy zateza sie w wyparce rotacyjnej do objetosci 100 ml. Zatezony roztwór miesza sie z 8 objetosciami = 880 ml etanolu, osad oddziela sie przez odwirowanie, dwukrotnie przemywa sie acetonem i jednorazowo eterem, po czym suszy sie w temperaturze pokojowej pod zmniejszonym cisnieniem. Wydajnosc: - 2,2 g o zawartosci 15X10 3 Al E/g.Przyklad III. Otrzymuje sie ze wsadu wedlug przykladu I po 5 dniach hodowli 500 ml odwirowanego przesaczu o zawartosci 120AIE/ml, który bezposrednio liofilizuje sie. Wydajnosc: 7,1 g o zawartosci 8,3X103 AlE/g.Przyklad IV. Do trzech kolb Erlenmeyera o pojemnosci 1 litra wprowadza sie po 200 ml pozywki zawierajacej 3% gliceryny, 3% maki sojowej, 0,2% CaC03 (sterylizacje prowadzi sie wciagu 30 minut w temperaturze 121°C; wartosc pH po sterylizacji wynosi 7,2) i posiewa sie po 1 ml hodowli posiewowej szczepu SB 12 (otrzymanej na tej samej pozywce, zaszczepionej kulturami ze skosnego agaru prowadzonymi na pozywce Czapek-pepton-kazeina-agar) i nastepnie prowadzi sie fermentacje wciagu 3 dni w temperaturze 28°C na wytrzasarce obrotowej. Po zakonczeniu hodowli zawartosc kolb laczy sie i oddziela grzybnie przez odwirowanie.Otrzymuje sie 500 ml przesaczu o zawartosci 450 Al E/ml.Przesacz, mieszajac, traktuje sie porcjami 250 g siarczanu amonu, nastepnie odwirowuje sie w ciagu 10 minut przy 12000 obrotów na minute. Osad rozpuszcza sie w 100 ml destylowanej H20 i mieszajac, traktuje26 82 900 4objetosciami = 400 ml acetonu. Powstaje dobrze osadzajacy sie osad. Ciecz dekantuje sie, a osad przemywa sie dwukrotnie acetonem oraz jednorazowo eterem i suszy pod zmniejszonym cisnieniem. Wydajnosc: 13,4 g 0 zawartosci 10X103 Al E/g.Przyklad V. Osad otrzymany w przykladzie IV przez stracenie siarczanem amonu rozpuszcza sie w 100 ml wody i dializuje sie przez 6 godzin do destylowanej wody. Otrzymany dializat zamraza sie i liofilizuje Wydajnosc: 1,5 g o zawartosci 80 AI E/mg.Przyklad VI. Wprowadza sie 120 ml pozywki wedlug przykladu I do kolby Erlenmeyera o pojemnos¬ ci 1 litra, posiewa sie kulture szczepu St 19 ze skosnego agaru i otrzymuje po 3 dniowej fermentacji w temperatu¬ rze 28°C na wytrzasarce obrotowej przesacz hodowli o zawartosci 25 Al E/ml.Przyklad VII. Wsad wedlug przykladu IV fermentuje sie w ciagu 3 dni w temperaturze 32°C i otrzy¬ muje sie po odsaczeniu grzybni przesacz hodowli zawierajacy 350 AlE/ml.Przyklad VIII. Pozywke wedlug przykladu I posiewa sie wedlug przykladu IV i otrzymuje sie po 3 dniowej fermentacji w temperaturze 28°C przesacz hodowli o zawartosci 270 Al E/ml.Przyklad IX. W 6 kolbach Erlenmaeyera o pojemnosci 1 litra umieszcza sie po 100 ml pozywki zawierajacej 3% glikozy, 3% maki sojowej i 0,2% CaC03 (sterylizacja w ciagu 30 minut w temperaturze 121°C; wartosc pH po sterylizacji 7,2) i posiewa sie je po 1 ml kultury posiewowej szczepu SB 5 (otrzymanej wedlug przykladu I), i prowadzi sie fermentacje przez 4 dni w temperaturze 28°C na wytrzasarkach obrotowych.Zawartosc kolb laczy sie i oddziela grzybnie przez odwirowanie. Otrzymane 500 ml przesaczu o zawartosci 150 AlE/ml zamraza sie i liofilizuje. Wydajnosc: 6,9 g o zawartosci 11X103 AlE/g.Przyklad X. Wsady po 120 ml wedlug przykladu IV wprowadzone do 24 kolb posiewa sie hodowla posiewowa szczepu SB 11 (otrzymana wedlug przykladu IV) i prowadzi fermentacje w ciagu 5 dni w temperatu¬ rze 28° C i po odwirowaniu otrzymuje sie 2,0 litry przesaczu o zawartosci 1,1 Ml E/ml, który zateza sie do objetosci 200 ml w wyparce rotacyjnej. Nastepnie 200 ml koncentratu dializuje sie w ciagu 24 godzin w dializa¬ torze Viskinga (typ 27/100 FT, Union Carbide Corporation) w temperaturze pokojowej do 2 litrów wody destylowanej. Srodowisko zewnetrzne zawierajace inhibitor zateza sie do 100 ml i mieszajac wkrapla do 900 ml absolutnego etanolu. Wytracony osad prawie nieaktywny odwirowuje sie i odrzuca, a alkoholowy przesacz zateza sie do 30 ml. Tak otrzymany koncentrat zawiera 70 Ml E/ml.W celu dalszego oczyszczania roztwór ton przepuszcza sie przez kolumne anionowymienna (Amberlite 1 RA 410 postac octanowa w 0,05 m octanu amonu, pH 7, kolumna 2,5X20 cm), aktywne frakcje laczy sie i poddaje filtracji zelowej na Sephadex®G 75 w H20. Aktywne frakcje filtracji zelowej zateza sie do 12 ml. Tak otrzymany roztwór zawiera 150 Ml E/ml.Grzybnie (~500 ml) ekstrahuje sie dwukrotnie 1 litrem acetonu i jednorazowo 1 litrem eteru, wyciagi laczy sie i zateza do sucha pod zmniejszonym cisnieniem. Pozostala grzybnie suszy w temperaturze 20°C pod zmniejszonym cisnieniem. Otrzymany suchy proszek grzybni (~51 g) ekstrahuje sie 150 ml suIfot Ienku dwumetylowego w temperaturze pokojowej wciagu 2 godzin. Po odwirowaniu (30 minut, 15000 obrotów na minute) ekstrakt acetonowo-eterowy zateza sie do sucha i rozpuszcza sie w odwirowanym roztworze suchej grzybni w su Ifotlen ku dwumetylowym. Wydajnosc: 120 ml o zawartosci 3 MIE/ml.Przyklad XI. Do kolby Erlenmeyera o pojemnosci 1 litra wprowadza sie 120 ml pozywki wedlug przykladu I, posiewa sie wedlug przykladu IX i prowadzi sie fermentacje w ciagu 6 dni w temperaturze 28°C na wytrzasarce obrotowej. Otrzymuje sie przesacz hodowli o zawartosci 0,9 MIE/ml.Przyklad XII. Do 5 kolb Erlenmeyera o pojemnosci 1 litra wprowadza sie po 120ml pozywki zawierajacej 2,5% skrobi, 0,5% glikozy, 0,5% NZ-aminy, 1,0% wyciagu drozdzowego i 0,4% CaC03 (sterylizacja 30 minut w temperaturze 121°C, przed sterylizacja doprowadzono do wartosci pH 7,2) i pozywki posiewa sie po 2 ml hodowli posiewowej szczepu SB 27 otrzymana wedlug przykladu I, nastepnie prowadzi sie fermentacje w ciagu 4 dni w temperaturze 28°C na wytrzasarkach obrotowych. Po polaczeniu zawartosci kolb i odwirowaniu grzybni otrzymuje sie 500 ml przesaczu o zawartosci 70 Al E/ml. Odwirowany przesacz zamraza sie i liofilizuje Wydajnosc: 7,7 g o zawartosci 3,5X103 AlE/g.Przyklad XIII. Wsad wedlug przykladu I posiewa sie 2 ml hodowli posiewowej szczepu SB 18 otrzymanej wedlug przykladu li prowadzi sie fermentacje wciagu 3 dni w temperaturze 28°C. Otrzymuje sie przesacz hodowli o zawartosci 1100 AlE/ml, 0,17 MIE/ml i 1,0 SIE/mL Przyklad XIV. Do 5 fermentatorów doswiadczalnych wprowadza sie po 8 litrów pozywki wedlug przykladu I i posiewa sie ja po 120 ml hodowli posiewowej otrzymanej wedlug przykladu I, nastepnie prowadzi sie fermentacje przy mieszaniu i napowietrzaniu w temperaturze 28°C wciagu 65 godzin, po czym laczy sie ciecze pofermentacyjne i otrzymuje po odwirowaniu grzybni 30 litrów przesaczu hodowli. Przesacz ten o zawar¬ tosci 0,57 MIE/ml, 6,2 SI E/ml. 8000 AlE/ml zateza sie pod zmniejszonym cisnieniem wynoszacym 20 torów82900 27 w temperaturze lazni 100°C do 5 litrów, koncentrat traktuje sie, mieszajac, 4 objetosciami = 20 litrów acetonu i wytracony czarny, mazisty osad oddziela sie przez odwirowanie przy 6000 obrotów na minute wciagu 30 minut, odwirowany osad rozpuszcza sie w 2,5 litrach wody i ciemno zabarwiony roztwór miesza sie w ciagu 60 minut z 500 g wilgotnego Amberlite I RA 410 (postac octanowa, pH 7).W czasie 10 minutowego wirowania przy 6000 obrotów na minute oddziela sie ciecz od osadu Amberlitu.Odwirowany przesacz miesza sie ponownie w ten sam sposób 3 krotnie kazdorazowo z 500 g Amberlite w ciagu 60 minut i nastepnie jeszcze raz z 500 g Amberlite przez noc (okolo 15 godzin). Po takiej obróbce przesacz ma jasnozólte zabarwienie, poniewaz czarne substancje towarzyszace zostaly zwiazane przez wymiennik jonowy Otrzymane pozostalosci Amberlitu przemywa sie dwukrotnie woda kazdorazowo po 1,5 litra i te przemywki laczy sie z przesaczem zawierajacym inhibitor.Przesacz polaczony z przemywkami zateza sie do objetosci 1 litra w wyparce rotacyjnej pod cisnieniem 15 torów i w temperaturze lazni wynoszacej 80°C, nastepnie przy intensywnym mieszaniu wkrapla sie do 10 litrów acetonu. Otrzymuje sie przy tym bialy klaczkowaty osad, który odsacza sie na nuczy, przemywa acetonem i eterem i osusza pod zmniejszonym cisnieniem. Wydajnosc: 150g bialego proszku o zawartosci:- 1X106 AIE/gi450SIE/g.Przyklad XV. W pozywce wedlug przykladu I zastepuje sie glikoze innym cukrem lub alkoholem z grupy cukrów i pozywki po 120 ml umieszczone w kolbach wstrzasanych posiewa sie po 1 ml hodowli posiewowej szczepu SB 18 otrzymanej wedlug przykladu I i otrzymuje sie po 3 dniowej lub 4 dniowej fermentacji w temperaturze 28°C na wstrzasarkach obrotowych ciecze pofermentacyjne o nastepujacych steze¬ niach inhibitora amylazy.Substancja dodatkowa (1%) Cukier trzcinowy Laktoza Maltoza Galaktoza Glikoza Sorbit Mannit Inozyt Skrobia AlE/ml po 3 dniach 5400 9100 7500 9100 7000 2600 8500 4800 6400 AlE/ml po 4 dniach 10 500 4 600 13 600 10 200 9 700 10 200 8 700 5 600 10 200 Przyklad XVI. Pozywke zawierajaca 3% maki sojowej. 2% skrobi, 1% glikozy, i 0,2% CaC03 posiewa sie wedlug przykladu XV i po 4 godzinnej fermentacji otrzymuje sie ciecz pofermentacyjna o zawartosci 5600 AlE/ml.Przyklad XVII. Wsad wedlug przykladu XIII posiewa sie szczepem SB 18 /5, bedacego wariantem szczepu SB 18 i prowadzi sie fermentacje wciagu 4dni i otrzymuje sie ciecz pofermentacyjna o zawartosci 27 400 AlE/ml. Szczep SB 18/5 jest zlozony w Centraalbureau voor Schimmelcultures w Baarn pod numerem- CBS 613.71.Przyklad XVIII. Wsad wedlug przykladu XIII posiewa sie szczepem SB 18/4, bedacym wariantem szczepu SB 18 i po 4 dniowej fermentacji otrzymuje sie ciecz pofermentacyjna o zawartosci 13 900 AlE/ml.Szczep SB 18/4 jest zlozony w Centraalbureau voor Schimmelcultures w Baarn pod numerem CBS 612.71.Przyklad XIX. Posiewa sie i fermentuje wedlug przykladu XII pozywke zawierajaca 2% skrobi, 1% glikozy, 0,3% glikolu, 0,25% namoku kukurydzianego, 0,4% maki sojowej 0,1% NaCI, 0,1% K2HP04, 0,01%FeSO4, 0,01% CaC03 i otrzymuje sie po 3 dniowej fermentacji ciecz pofermentacyjna o zawartosci 2900 AlE/ml.Przyklad XX. Wsad wedlug przykladu I wprowadzony do 2 kolb posiewa sie 1 ml hodowli posiewo¬ wej szczepu SB 46 i fermentuje przez 4 dni w temperaturze 28°C na wytrzasarce obrotowej. po czym otrzymuje sie po odwirowaniu 250 ml przesaczu hodowli o zawartosci 250 AlE/ml. Przesacz ten traktuje sie, mieszajac, porcjami 150 g siarczanu amonu, nastepnie odwirowuje sie przy 10 000 obrotów na minute w ciagu 15 minut.Pozostalosc rozpuszcza sie w 12 ml H20 i dializuje wciagu 3godzin do wody destylowanej 20 ml dializatu straca sie w kapieli lodowej 6 objetosciami = 120 ml acetonu, osad odsacza sie na nuczy i przemywa acetonem i eterem i nastepnie suszy pod zmniejszonym cisnieniem. Wydajnosc: 0,28 g o zawartosci 220X103 Al E/g.82 900 28 Przyklad XXI. Do kolby Erlenmeyera o pojemnosci 1 litra wprowadza sie 120 ml pozywki wedlug przykladu I i posiewa sie 2 ml hodowli posiewowej szczepu SE 5 otrzymanej wedlug przykladu IV i fermentuje sie w ciagu ? 7 dni na wytrzasarce obrotowej, w temperaturze 28°C, po czym otrzymuje sie ciecz pofermentacyj¬ na o zawartosci 0,09 Ml E/ml.Grzybnie traktuje sie 50 ml acetonu, homogenizuje sie przez minute w homogenizatorze Ultraturrax (Fa.Janke u. Kunkel. Stauffen, Breisgau) i nastepnie odwirowuje sie wciagu 10 minut przy 3000obrotów na minute.Pozostalosc ekstrahuje sie w taki sam sposób 50 ml acetonu i nastepnie 50 ml eteru, trzy wyciagi laczy sie izateza prawie do sucha w wyparce rotacyjnej pod cisnieniem okolo 10—20 mm Hg, w temperaturze lazni wodnej wynoszacej 37°C. Pozostala grzybnie suszy sie pod zmniejszonym cisnieniem i nastepnie traktuje sie 15 ml sulfotlenku dwumetylowego, homogenizuje sie wcigu 2 minut w Ultraturrax, ekstrahuje sie, mieszajac, (mieszadlo magnetyczne) przez 2 godziny. Nastepnie odwirowuje sie przy 20 000 obrotów na minute przez 30 minut, po czym wyciag w sulfotlenku dwumetylowym zlewa sie z nad ekstrahowanej grzybni, do pozostalosci dodaje sie wyciag acetonowo-eterowy i miesza sie okolo 30 minut (mieszadlo magnetyczne). Odwirowuje sie ponownie w ciagu 10 minut przy 20000 obrotów na minute i klarowny przesacz testuje sie jako wyciag grzybni.Zawartosc inhibitora 0,14 MIE/mL Przyklad XXII. Wedlug przykladu I pozywki po 160 ml umieszczone w 2 kolbach posiewa sie po 1 ml hodowli posiewowej szczepu SE 21 (wedlug przykladu I) i fermentuje, a po odwirowaniu otrzymuje sie 200 ml przesaczu o zawartosci 360 Al E/ml. Odwirowany przesacz traktuje sie mieszajac, porcjami 100g siarczanu amonu i odwirowuje sie, nastepnie osad odwirowany rozpuszcza sie w 20 ml wody i straca sie 2 objetosciami ^40 ml acetonu. Osad przemywa sie acetonem i eterem i suszy sie pod zmniejszonym cisnieniem.Wydajnosc: 2 g o zawartosci 25X103 Al E/g.Przyklad XXIII. Wsad wedlug przykladu XIV posiewa sie hodowla posiewowa szczepu SE 21 i po 65 godzinnej fermentacji otrzymuje sie ciecz pofermentacyjna o zawartosci 140 Al E/ml.Przyklad XXIV. Pozywke w ilosci 120 ml o skladzie wedlug przykladu IV umieszczona w kolbie Erlenmeyera o pojemnosci 1 litra posiewa sie 1 ml hodowli posiewowej szczepu SE 39 otrzymanej wedlug s przykladu I i prowadzi sie fermentacje wedlug przykladu I i po 3-dniowej fermentacji otrzymuje sie ciecz pofermentacyjna o zawartosci 50 AlE/mL Przyklad XXV. Zastepuje sie w wsadzie wedlug przykladu XXIV gliceryne glikoza i otrzymuje po 3 dniach przesacze hodowli o zawartosci 60 Al E/ml.Przyklad XXVI. We wsadzie wedlug przykladu XXIV zamienia sie stosowana pozywke na pozywke wedlug przykladu I i zastepuje sie skrobie glikoza i otrzymuje po 3 dniowej fermentacji przesacze kultury o zawartosci 140 AlE/ml.Przyklad XXVII. Pozywki po 120 ml wprowadzone do 5 kolb Erlenmeyera o pojemnosci 1 litra i zawierajace 3% glikozy, 0,5% NZ-aminy, 1,0% wyciagu drozdzowego, 0,4% CaC03 (sterylizacja wciagu 30 minut w temperaturze 121°C; wartosc pH przed sterylizacja 7,2) posiewa sie po 1 ml hodowli posiewowej szczepu SE 39 (otrzymanej wedlug przykladu IV) i prowadzi sie fermentacje wciagu 3dni na wytrzasarce,, obrotowej w temperaturze 28° C i po odwirowaniu otrzymuje sie 500 ml przesaczu o zawartosci 160 AIE/mU ; Przesacz ten w ilosci 500 ml wytraca sie, mieszajac, 6 objetosciami = 3 litrami acetonu, jasno-brazowy osad ^ odsacza sie, przemywa acetonem i eterem, suszy sie pod zmniejszonym cisnieniem. Wydajnosc: 3,5 g o zawartosci 13,5X103 AlE/g.Przyklad XXVIII. Pozywke wedlug przykladu IV w ilosci 120 ml wprowadza sie do kolby Erlen¬ meyera i posiewa 1 ml hodowli posiewowej szczepu SE 50 otrzymanej wedlug przykladu IV i fermentuje równiez wedlug przykladu IV, przy czym po 5 dniach otrzymuje sie roztwór hodowli o zawartosci 1,0 SIE/ml.Przyklad XXIX. Postepuje sie wedlug przykladu XXVIII stosujac pozywke wedlug przykladu I.Otrzymuje sie po 5 dniach fermentacji roztwór hodowli o zawartosci 26000 AlE/ml i 0,18 MIE/ml i 1,8 SIE/ml.Przyklad XXX. Postepuje sie wedlug przykladu XXIX stosujac pozywke w ilosci 200 ml i otrzymuje sie po 5 dniowej fermentacji przesacz hodowli o zawartosci 24 500 AlE/ml i 0,18 MIE/ml i 2,1 SIE/ml.Przyklad XXXI. Postepuje sie wedlug przykladu XXVIII, przy czym stosuje sie pozywke zawierajaca 2% skrobi, 1% glikozy, 0,3% glikolu, 0,25% namoku kukurydzianego, 0,4% maki sojowej, 0,1% NaCI, 0,1% K2 HP04 0,01% MgS04, 0,01% CaC03, 0,01% FeS04 i otrzymuje sie po 4 dniowej fermentacji roztwór hodowli o zawartosci 12 900 Al E/ml.Przyklad XXXII. W pozywce wedlug przykladu I zastepuje sie glikoze innymi cukrami lub alkohola¬ mi grupy cukrów, posiewa sie i prowadzi fermentacje wedlug przykladu XXVIII, przy czym otrzymuje sie roztwory hodowli o nastepujacych zawartosciach inhibitora amylazy.82900 29 Substancje dodatkowe (1%) Cukier trzcinowy Laktoza Maltoza Galaktoza Glikoza Sorbit Mannit Inozyt Skrobia Al E/ml po 3 dniach 24 000 23 500 31 300 41 000 24 000 33 000 21 000 33 900 AlE/ml po 5 dniach 23 000 - - - - - - ' — _ P r s y k l i d XXXIII. Wt wsadzlt wedlug przykladu XXVIII ustepuja tle gliceryne glikoza I otrzymuje roztwory hodowli o zawartosci 330 Al E/mL Przyklad XXXIV. We wsadzie wedlug przykladu XXVIII zastepuje sie skrobie glikoza i otrzymuje sie < roztwory hodowli o zawartosci 660 Al E/ml.Przyklad XXXV. Zastepuje sie we wsadach wedlug przykladu XXIX NZ-aminy innymi komplekso¬ wymi zródlami azotu i po 3 dniowej fermentacji otrzymuje sie roztwory hodowli o nastepujacych zawartosciach inhibitora amylazy: Substancja wprowadzona zastepczo AlE/ml Makasojowa 13 500 Fishsolubles 16800 Trypton 25 200 Wyciagmiesny 32 700 Pharmamedia 23100 Przyklad XXXVI. Wsad wedlug przykladu XXIX posiewa sie szczepem SE 50/12 bedacym morfolo¬ gicznym wariantem szczepu SE 50 i po 3 dniowej fermentacji otrzymuje sie roztwory hodowli o zawartosci 51500 AlE/ml.Przyklad XXXVII. Do 5 fermentatorów doswiadczalnych wprowadza sie po 8 litrów pozywki wedlug przykladu I i oprócz tego 0,1% objetosciowego srodka przeciwpiennego Bayer E 100 i posiewa sie po 120 ml hodowli posiewowej szczepu SE 50 (otrzymanej wedlug przykladu I) i prowadzi sie fermentacje, mieszajac i napowietrzajac w temperaturze 28° C wciagu 65 godzin. Nastepnie po polaczeniu cieczy pofermentacyjnych i oddzieleniu grzybni otrzymuje sie 24 litry roztworu hodowli o zawartosci 13 000 AlE/ml i 6 SIE/ml. Roztwór zateza sie do objetosci 1 litra na lazni o temperaturze 100°C pod zmniejszonym cisnieniem wynoszacym 20 tor.Ciemno zabarwiony koncentrat odwirowuje sie przy 15 000 obrotów na minute wciagu 60minut, ciemny przesacz wprowadza sie na kolumne wypelniona Amberlite I RA 410 (srednica 9 cm, wysokosc 50 cm Amberlite. 410, postac octanowa pH 7 w H20), eluuje sie 50 ml H20 na godzine, zbiera sie 20 ml frakcje wrodbieralniku.Frakcje jasno-zólte, zawierajace inhibitor (ogólem 300 = 6 litrów) laczy sie, zateza sie w wyparce rotacyjnej do objetosci 1 litra i przy intensywnym mieszaniu wkrapla sie do 10 litrów absolutnego alkoholu, przy czym wytraca sie klaczkowaty, prawie bialy osad. Osad odsacza sie na nuczy, przemywa absolutnym alkoholem, nastepnie eterem i suszy pod zmniejszonym cisnieniem. Wydajnosc: 60 g bialego proszku o zawartosci 3X103 AIE/g i 400 SI E/g.Przyklad XXXVIII. W celu oddzielenia wiekszosci nieaktywnych substancji towarzyszacych, zwlasz¬ cza ciemnego barwnika, mozna przeprowadzic stracanie równa iloscia metanolu. W tym celu 26 litrów odwirowa¬ nego przesaczu (otrzymany wedlug przykladu XXXVII z dodatkiem 0,02% objetosciowych srodka przeciwpien¬ nego Bayer Silicon E/, zawierajacego 43 000 AlE/ml zateza sie do objetosci 1,2 litra przez odparowanie pod zmniejszonym cisnieniem wynoszacym 20 tor i w temperaturze lazni wynoszacej 100°C. Bardzo czarny roztwór traktuje sie, mieszajac, taka sama objetoscia metanolu (1,2 litra), przy czym tworzy sie czarny, klaczkowaty osad. Saczy sie przez filtr karbowany i brazowy przesacz (2,2 litra) wkrapla przy intensywnym mieszaniu do 10 litrów odwodnionego spirytusu. Tworzy sie jasno-brazowy osad, który odsacza sie na nuczy, przemywa acetonem i eterem i suszy pod zmniejszonym cisnieniem. Wydajnosc: 185g jasno-ochrowego proszku o zawartosci 3700 Al E/mg.30 82 900 W celu lepszego oczyszczania caly osad (185 g), rozpuszcza sie w 20 ml H2 O i otrzymany ciemno-brazowy roztwór przepuszcza sie przez kolumne 5X75 cm wypelniona Amberlitem I RA 410 (postac octanowa, pH 7).Eluuje sie woda, wstepny eluat w ilosci 500 ml odrzuca sie, nastepne 5000 ml prawie bezbarwnego eIuatu zawieraja inhibitor. Frakcje te zateza sie w wyparce rotacyjnej do objetosci 200 ml i wydziela sie z tego inhibitor przez wkroplenie do 2 litrów absolutnego alkoholu etylowego, odsaczenie osadu na nuczy, przemywanie osadu etanolem i eterem i suszenie pod zmniejszonym cisnieniem. Wydajnosc: 80 g bialego proszku o zawartosci - 8000 Al E/mg.Przyklad XXXIX. Pozywke wedlug przykladu IV w ilosci 120 ml wprowadzona do kolby Erlenmeye- ra o pojemnosci 1 litra posiewa sie 2 ml hodowli posiewowej szczepu SE 55 (otrzymanej wedlug przykladu IV) i prowadzi fermentacje na wstrzasarkach obrotowych wciagu 6 dni w temperaturze 28°C, nastepnie po oddzieleniu grzybni otrzymuje sie przesacz hodowli o zawartosci 30 AlE/ml i 0,15 MIE/ml i 0,5 SIE/ml.Grzybnie ekstrahuje sie wedlug przykladu XX i otrzymuje sie wyciag o zawartosci 15 AlE/ml, 0,17 MIE/ml i 0,5 SIE/mL Przyklad XL. Postepuje sie wedlug przykladu XXXIX stosujac pozywke wedlug przykladu I, przy czym otrzymuje sie roztwór hodowli o zawartosci 60 AlE/ml, 0,16 MIE/ml i 0,65 SIE/ml oraz wyciag grzybni o zawartosci 30 AlE/ml, 0,16 MIE/ml i 0,33 SIE/mL Przyklad XLI. Pozywke wedlug przykladu XXXIX posiewa sie. kultura szczepu SS26 w skosnym agarze na pozywce platki owsiane —agar i prowadzi sie fermentacje wedlug przykladu XL wciagu 5dni, po czym otrzymuje sie, po odsaczeniu grzybni i jej ekstrakcje wedlug przykladu XXI wyciag o zawartosci 0,14 MIE/ml.Przyklad XLII. Wedlug przykladu XLI prowadzi sie hodowle szczepu SS 45 i otrzymuje sie wyciag grzybni o zawartosci 0,1 MIE/ml.Przyklad XLIII. Wedlug przykladu XLI prowadzi sie hodowle szczepu SS 53, po czym otrzymuje przesacz hodowli o zawartosci 0,05 MIE/ml oraz wyciag grzybni o zawartosci 0,07 MIE/ml.Przyklad XLIV. Pozywke w ilosci 120 ml zawierajaca 0,5% Bacto-pepton, 0,5% wyciagu miesnego, 0,2% wyciagu drozdzowego, 0,03% hydrolizatu kazeiny, 1% i-inozytu, 1% sorbitu, 1% D-mannitu, 1% glikozy, 0,1% K2HP04, 0,05% MgS04, 0,05% KCI, C,01% FeS04, przy wartosci pH = 7,2, wprowadza sie do kolby Erlenmeyera o pojemnosci 1 litra i posiewa kultura szczepu SS 51 w skosnym agarze (otrzymana wedlug przykladu I) i prowadzi sie fermentacje na wytrzasarce obrotowej w temperaturze 28°C wciagu 7 dni, przy czym otrzymuje sie przesacz hodowli o zawartosci 0,072 MIE/ml i wyciag grzybni (otrzymany wedlug przykla¬ du XXI) o zawartosci 0,054 MIE/mL Przyklad XLV.Pozywke wedlug przykladu IV posiewa sie kultura szczepu St 19 w skosnym agarze na pozywce platki owsiane-agar i prowadzi sie fermentacje wedlug przykladu IV przez 3 dni, po czym po oddzieleniu grzybni otrzymuje sie przesacz hodowli o zawartosci 20 AlE/ml.Przyklad XLVI. Sposób przeprowadzenia prób oznaczenia aktywnosci inhibitorów hydrolaz glikozy¬ dów u szczurów i ludzi.W celu wywolania pokarmowej hiperglikemii i hiperinsulinemii za pomoca pozywienia weglowodanowego podaje sie szczurom (n = 6) per os 2,5 g/kg skrobi lub maltozy lub sacharozy w postaci roztworu lub zawiesiny (zwierzeta kontrolne). Innym 6 szczurom podaje sie per os dodatkowo inhibitor hydrolaz glikozydów wyzej wymienionych weglowodanów w podanej ilosci. Poziom cukru we krwi oznacza sie za pomoca Auto-Analizera (Technicon,® Hoffmann, I. Biol. Chem. 120,51(1937) w krótkich odstepach czasu po podaniu weglowodanów we krwi pobranej ze zylnego splotu nadoczodolowego.W celu wywolania pokarmowej hiperglikemii u ludzi podaje sie per os 50 g skrobi na osobe w postaci wodnej zawiesiny. Cukier we krwi oznacza sie bezposrednio przed poczatkiem doswiadczenia i w krótkich odstepach po podaniu weglowodanów, równiez w sposób wyzej podany we krwi kapilarnej pobranej z opuszki palca. W dodatkowym doswiadczeniu dodaje sie substancje czynna do zawiesiny skrobi.W surowicy 6 szczurów, którym podano per os 2,5 g skrobi/kg (grupa kontrolna) i surowicy 6 szczurów, którym podano dodatkowo inhibitor hydrolazy glikozydów, oznacza sie insuline w krótkich odstepach po podaniu weglowodanów.Oznaczenie insuliny w surowicy przeprowadza sie radioimmunologicznie w oparciu o metode podwójnych antycial (Hales i Randle, Biochem. I. 88.137 (1963)].Oznaczenie skrobi w przewodzie zoladkowo-jelitowym szczurów przeprowadza sie w krótkich odstepach po podaniu per os 300 mg skrobi dla jednego szczura. W tym celu po usmierceniu zwierzat preparuje sie poszczególne wycinki przewodu pokarmowego, plucze sie i oznacza zawarta w nich niestrawiona skrobie przeliczajac ja na glikoze otrzymana po kwasnej hydrolizie skrobi.82 900 15 minut 61±16 140±11 106±20 60 minut 70± 3,4 145±15 128±11 15 minut 72± 8,5 159±28 95± 3,7 30 minut 78±12 153±36 95± 8,7 60 minut 69±12 164± 7,9 96± 7,2 Tablica 1 do przykladu XLVI.Glikoza we krwi w mg% (srednia wartosc ±1 s) u szczurów na czczo w róznych odstepach czasu po podaniu per os skrobi x substancja czynna wedlug przykladu. V Grupa kontrolna bez skrobi Grupa kontrolna po podaniu skrobi Skrobia + 25 000 Al E/kg Tablica 2 do przykladu XLVI.Glikoza we krwi w mg% (srednia wartosci 1 s) u szczurów na czczo w róznych odstepach czasu po podaniu per os skrobi tsubstancja czynna wedlug przykladu XIV.Grupa kontrolna bez skrobi Grupa kontrolna po podaniu skrobi Skrobia + 25 000 Al E/kg Tabl ca 3 do przykladu XLVI.Glikoza we krwi w mg % (srednia wartosc ± 1 s) u szczurów n& czczo w róznych odstepach czasu po podaniu per os skrobi ± substancja czynna wedlug przykladu XXXVII.Grupa kontrolna bez skrobi Grupa kontrolna po podaniu skrobi Skrobia + 25 000 Al E/kg P< 0,01 = P< 0,001 w stosunku do grupy kontrolnej bez weglowodanów Tablica 4 do przy kladu XLVI.Glikoza we krwi w mg % u zdrowej osoby w róznych odstepach czasu po dodaniu per os skrobi ± substancja czynna wedlug przykladu XXXVII. 0 15 30 Skrobia bez substancji czynnej Skrobia + 60 000 Al E/osobe Tablica 5 do przykladu XLVI.Glikoza we krwi mg % (srednia wartosc ± 1 s) u szczurów na czczo w róznych odstepach czasu po podaniu per os maltozy ± substancja czynna wedlug przykladu X.Grupa kontrolna bez maltozy Grupa kontrolna z maltoza Maltoza + 1,5 MlE 15 minut 72± 8,5 159±28 83± 6,5 30 minut 78±12 153±36 105± 5,2 60 minut 69±12 164± 7,9 104± 6,5 106 100 128 112 150 108 146 110 136 104 15 70± 6,7 160±13 120±13 30 81±15 153±11 124±12 60 minut 72± 9,6 172±13 134± 9,432 82 900 Tablica 6 do przykladu XLVI.Glikoza we krwi w mg % (srednia wartosc ± 1 s) u szczurów na czczo w róznych odstepach czasu po podaniu per os sacharozy ± substancja czynna wedlug przykladu XIV.Grupa kontrolna bez sacharozy Grupa kontrolna z sacharoza Sacharoza i 50 SIE/kg 15 61±16 125±14 104± 4,1 30 77±4,7 129±7,9 116±8,4 60 minut 70±3,4 135±8,5 113±3 P< 0,05; P< 0,01 * P 0,001 w stosunku do grupy kontrolnej z weglowodanem Figury 1—3 do przykladu XLVI. Figury 1-3 przedstawiaja srednia zawartosc skrobi w mg (rzedna), (szczur) (n = 6) w zoladku: fig. 1; jelicie cienkim (fig. 2) i jelicie grubym (fig. 3) w róznych czasach podanych w minutach (odcieta) po podaniu za pomoca zglebnika 300 mg surowej skrobi pszenicznej dla kazdego szczura.Na fig. 1—3 krzywa 1 (przedstawia wyniki oznaczen u zwierzat kontrolnych (grupa 1), którym podano skrobie bez inhibitora amylazy, natomiast krzywa 2) przedstawia wyniki oznaczen u zwierzat (grupa 2), którym podano takie same dawki skrobi z dodatkiem 1000 AIE inhibitora amylazy. * Wynik.Zawartosc skrobi pszenicznej w zoladku po 15 + 60 minutach po dodaniu (fig. 1) jest mniejsza (P<0,001 lub P przechodzenie skrobi przez zoladek po dodaniu inhibitora amylazy wynika równiez z fig. 2.Zawartosc skrobi w jelicie cienkim grjpy 2 jest po 15—180 minutach znacznie (P<0,001) podwyzszona.Fig. 3 wykazuje, ze skrobia przechodzi niestrawiona do jelita grubego, jesli do skrobi jest dodany inhibitor amylazy w wymiennej ilosci.Figury 4—6 do przykladu XLVI. Figury 4—6 przedstawiaja zmiane stezenia glikozy we krwi w mg (100 ml) rzedna (fig. 4); stezenie insuliny reagujacej immunologicznie wjz E/ml surowicy (rzedna) (fig. 5) i stezenie niezestryfikowanych kwasów tluszczowych w mikrorównowaznikach (litr plazmy/rzedna) (fig. 6) w stosunku do wartosci poczatkowej (0) w zaleznosci od czasu (rzedna) po doustnym podaniu 60 g ugotowanej skrobi dla 1 osoby.Krzywa 1/ przedstawia przebieg wymienionego parametru (glikoza we krwi, insulina w surowicy), plazma - UFS/ w próbie kontrolnej. Krzywa 2/ przedstawia zmiane tego parametru po podaniu takiej samej dawki skrobi z dodatkiem 0,25 mg AIE inhibitora amylazy, a krzywa 3/ przedstawia zmiany tego parametru po dodaniu 0,5 mega AIE inhibitora amylazy do 60 g ugotowanej skrobi na osobe.Wynik. ' • Po przejsciowej hiperglikemii w czasie 0 + 30 minut na fig. 4 obniza sie stezenie glikozy we krwi po 45—180 minutach wyraznie ponizej wartosci poczatkowej. W wyniku poczatkowej hiperglikemii wzrasta ostro stezenie insuliny w surowicy w próbie kontrolnej (krzywa 1). Dodatek 0,25 (krzywa 2) lub 0,5 mega AIE (krzywa 3) do skrobi powoduje silne zmniejszenie objawów hipoglikemii (fig 4) oraz hiperinsulinemii (fig. 5).Zawartosc niezestryfikowanych kwasów tluszczowych w plazmie jest w przyblizeniu taka sama we wszystkich trzech próbach.Tablica 7 do przykladu XLVI.Stezenie insuliny w surowicy wV E/ml (wartosc srednia ±1 s) u szczurów na czczo w róznych odstepach czasu po podaniu per os 2,5 g skrobi ± substancja czynna wedlug przykladu XIV, n = 6.Stezenie insuliny we krwi u szczurów na czczo bez podania skrobi wynosi w tym doswiadczeniu 6 ±1 /i E/ml Czas w minutach po podaniu skrobi 5 10 - 20 30 45 60 120 180 Grupa kontrolna po podaniu skrobi 52±29 72±20 44±28 25± 8 30± 5 21± 8. 7± 3 8± 2 Skrobia + 10 000AIE/kg 17±8 15±4 16±7 17±3 13±6 13±8 10±3 9±282 900 33 Tablica8 do przykladu XLVI.Stezenie insuliny w surowicy w fi E/ml (srednia wartosc ± 1 s) u szczurów na czczo w róznych odstepach czasu po podaniu per os 2,5 g skrobi ± substancja czynna wedlug przykladu XXXVII, n¦¦ 6.Stezenie insuliny w surowicy u szczurów, którym nie podano skrobi wynosi w tym doswiadczeniu 6±1 jx E/mL Czas w minutach po podaniu skrobi 5* 10 20 30 45 60 120 180 Grupa kontrolna której podano skrobie 52±2Ó 72±20 44±28 25± 8 30± 5 21± 8 9± 3 8± 2 Grupa której podano skrobie + 10000 AlE/kg 18± 8 24±11 11± 5 13± 3 18± 7 15± 5 13± 5 11± 5 P<0,05; P<0,01; P<0,001 w stosunku do grupy kontrolnej z weglowodanem Przyklad XLVII. Pozywki podane w tablicy wprowadzone do kolb Erlenmeyera posiewa sie odpo¬ wiednimi szczepami i prowadzi sie fermentacje na wstrzasarkach obrotowych w podanych temperaturach i otrzymuje sie po kilku dniach roztwory hodowli lub po obróbce wedlug przykladu XXI wyciagi grzybni o podanych w tablicach stezeniach inhibitora. PL PL