SU648117A3

SU648117A3 - Способ получени антибактериального вещества

Info

Publication number: SU648117A3
Application number: SU752129801A
Authority: SU
Inventors: Коул Мартин; Трефор Говарт Томас; Ридинг Кристофер
Original assignee: Бичам Груп Лимитед (Фирма)
Priority date: 1974-04-20
Filing date: 1975-04-18
Publication date: 1979-02-15
Also published as: AT352270B; GB1508977A; CS231157B2; BE827926A; ZA752492B; ATA298575A; CS272175A2

Description

3 6 среда представл ет собой смесь соевой муки ( (во( ), высу- . шенных растворимых на основе винокуренного солода { ScotasoC ) и Лёкстрина. Добавление пеноудал ющих агентов, таких как РЕцгошс L 81 может быть необходимым дл контролировани пено рбраэовани некоторых сред в ферментаторах ./ В среды можно добавл ть минеральные соли, такие как NaCC , ксе, MgCej InCl2 I FeCe I Na2&O4 , FeS04 , ,. , a также натриевые и калиевыесоли фосфорной кислоты,- СаСО можно добавл ть в качестЕ-е источника ионов Са , в качестве микроэлементов, таких как никель, кобальт или марганец можно добавл ть их соли, по желанию в смесь могут быть добавлены витамины.. Культивирование Streptom jces etaNuEigerue провод т при 15-40 С,обыч но при 20-35 0 и при рН 5-8,5, предпочтительно 6-7,5. Strepiom jces ctavutigerus культивщэуют в среде в стекл нных конических колбах, которые продувают воздухом в результате встр хивани на ротационном аппарате дл встр хивани или в ферментаторе из нержа веющей стали с отбойными перегородками при перемешивании с помощью турбинной мешалки с лопастными диск ми и при аэрации с помощью разбрызгивани . Ферментацию можно также ос ществл ть непрерывным способом. Начальный рН ферментации обычно составл ет 7,О и максимальный выход антибактериального вещества (клавулановой кислоты) получают за 2-10 дней при 20-35С. Клавулановую кислоту экстрагируют из филйтрата разлйчньлми способамй. Экстракцию с помощью растворител и холодного экстракта культуры, в которой рН регулируетс так, чтобы Иметь значени в кислой области шка лы, провод т на анионообменных смолах . Клетки Streptom(ces cEavuBigeros обычно вначале удал ют из ферментатора в результате фильтрации или центрифугировани перед тем, как начинают процедуру экстракции. Дл экстракции используют раство ритель, фильтра культуры охлаада ют и рН понижают до 2-3 в результат добавлени кислоты при интенсивном перемешивании с несмешивающимс с в дои органическим растворителем, так как н - бутклацетат,- метилизобутилкетон , н-бутанол или этилацетат. Кислота, котора используетс дл понижени рН среды, обычно поедстав л ет собой минеральную кислоту, такую как хлористоводородна , серна , азотна , фосфорна . н-Бутанол вл етс наиболее применимым растворите лем дл использовани При экстракции подкисленного фильтрата культуры . После разделени фаз в результате центрифугировани р -лактамазаингибирующий метаболит экстрагируетс из фазы растворител в водный раствор бикарбоната натри или вторичный кислый фосфат кали (бу- . фер), суспензию СаСО, или воду, при этом рН поддерживаетс практически на нейтральном уровне, например равным 7,0. Этот водный экстракт после раз-, делени фаз может быть сконцентрирован при пониженном давлении и высушен на холоду с образованием, сырого продукта , представл ющего собой соль клавулановой кислотц. Такой продукт вл етс устойчивым при хранении в сухом твердом сбсто нии при -20с. Можно использовать еще один экстракционный способ, который заключа- . етс в контактировании фильтрата культуры {обычно при нейтральном рН), ; содержащего соль клавулановой кислоты , с органической фазой, в которой раствор етс нерастворимый в воде амин. Подход щие дл этих целей растворители включают такие несмешивающиес с водой пол рные растворители , как метилизобутилке он, трихлорэтилен и т.п. Подход щие амины включают вторичные или третичные амины , в которых одна из замещающих групп представл ет собой алифатическую группу с длинной цепью, например, из 12-16 углеродных атомов, а друга группа представл ет собой третич.ную арилалкильную группу, в результате чего молекула оказываетс липофильной . Amber&-ite LAU вл етс наиболее пригодным амином. Как правило , амин используетс как кисла соль присоединени . После такого способа экстракции клавуланова кислота присутствует в органической фазе в виде соли амина. Затем органическую фазу отдел ют от фильтрата культуры. Клавуланова кислота может экстрагироватьс обратно в водную фазу в результате обратной экстракции раствором соли, предпочтительно концентрированным раствором хлористого натри , аз1ртнокислого натри и т.п. Сыра соль клавулано-j вой кислоты может быть затем получена в результате сушки на холоду. Другие способы выделени , которые могут быть использованы, это адсорбци на угле, осаждение, высаливание и молекул рна фильтраци , однако они обычно оказываютс не эффективными . . Дальнейшую очистку сырых твердых веществ можно осуществл ть многими способами, однакоионо-обменна колонна -хроматографи представл ет собой очень эффективный способ, особе нно при использовании Osopor de AcicJite FHP SPA 64 или DEAE целлюлозы, колонка с De Acidite ложет представл ть собой градиент, ко торый элюирует водным раствором соли такой как например хлористь;П натрий (О - 0,5 моль) / Колонку с DEAE целлю лозой в фосфатном буфере fO,Ol м) при рН.7 можно йлюировать раствором соли; обычно раствором МаСЕ (0,02 М) В фосфатном буфере (0,01 М) при рН 7 Активные фракции можно детектировать по их fi -лактамазаингибирующей акти ности и их антибактерицидной активно ти В отношении KCebsietta aerog enes в.результате проведени испытани на диффузионном агаре. Фракции, содержащие основную массу с такой активностью , затем объедин ют и ко.нцентри рук)т до небольшого объема в вакууме. Сырой препарат соли клавулановоЯ кис лоты затем обессоливают путем пропус кани через адсорбирующий слой Вто Get Р 2. Активный обессоленный материал концентрируют, смешивают с этанолом и подвергают дополнительному хроматографированию на колонке с целлюлозой с использованием в качест ве растворител верхней фазы бутанол - этанол -вода в соотношении 4:1:5. . Фракции, содержащие вещество, которое ингибирует fb-лактамазу, вырабатываемую Esctief Ichia coEi, сме шивают, выпаривают досуха в вакууме, повторно раствор ют в воде и сушат на холоду с образованием соли клавулановой кислоты в виде белого твердого вещества. . Способы, которые вл ютс наиболее эффективными при детектировании клавулановой кислоты в фильтратам культуры, представл ют собой бумажную хроматографию и биоаутографическую детекционную систему. Тонкослойна хроматографи может использовать с дл определени клавулановой кислоты в твердых препаратах. Способ получени клавулановой кислоты Или ее соли в числом виде включает выделение загр 5зненно формы клавулановой кислоты или ее солей , образование эфира клавулановой кислоты согласно известной методике очистку эфира -и дальнейшую регенерацию клавулановой кислоты или ее Соли из эфира. Загр зненна клавуланова кислота ее соли обычно содержат до 1 вес.% антибиотика. Пример 1 . StreptoiTTace% ctaVиtigeгu; , культивируют при на срезах агара, содержащих 1 вес.% дрожжевого экстракта, 1 вес.% глюкозы и 2 вес.% оксоидного агара 3, рН 6,8. Дл переноса мицели м спор со среза в 100 мл жидкой среды, наход щейс в эрленмейеровских колбах на 500мл используют стерильную лопатку . Жидка среда имеет следующий состав , г/л: Солодовый экстракт 10 Бактериологический пептон 10 Глицерин20 Водопроводна вода Остальное Среду поддерживают при рН 7,0 с помощью раствора гидроокиси натри , разливают в колбы по 100 мл, которые закупоривают пластиковыми пробками перед тем на 20 мин. Инокулированную засе нную колбу встр хивают в тече.ние 3 дней при 26°С на ротационной тр сучке со скоростью пор дка 240 об/мин. Колбы, дл получени , содержащие жидкую среду, инокулируют 5 вес.% вегета ивным прививочным материалом и прорастание осуществл ют в тех же услови х,что и в колбе с.посевом. Образцы фильтрата,культуры провер |6т на ингибиторное действие против ;4-лактамазы, вырабатываемой Eschenictiici coEi аТ4. Оптимальна активность достигаетс черрз 3 дн . Результаты представлены в табл. 1. Зона клавулановой кислоты R f 0,46 обнаруживаетс при ис.следовании фильтрата культуры методом бумажкой хроматографии. Strepiomyce& cEdvuEigfefu также повергают культивированию в двухлитровой колбе дл встр хивани ; содержащей 400 мл среды (стади по лучени ), при использовании такой же среды и услов-ий культурировани , ; как описано выще. В этих более крупных сосудах рост организма происходит более медленно и оптимальна j3 -лактамазаингибирующа активность достигаетс - через 7-9 дней инокул ций вегетативным прививочньт- материалом . Результаты также представлены в табл. i.

-Лактамаэна ингибирующа активность разновидности Streptom ces cf.avutigepus, растущей в колбах на 500.МЛ ( 1 ) и 2000 мл ТП) .

Таблица

1 2 3

)

Конечное разбавление фильтрата 1/2500 П р и м е р 2. Культивирование Sireptotnscea ctavutigferus. . колбу дл посева, подготовленйую согласно примеру 1, используют дл инокулировани конических колб на 500 мл, содержащих 100 мл алйквоты описанной ниже среды в деионизированной воде г вес,% Растворимый крахмал 2 Глицерин0,3 Скотазол ,,1 Ар1 авоч1 Среду подвергают стерилизации в автоклаве в течение 20 мин и инокулйруют путем добавлени 5 вес.% вегв ативного прививочного Ме териала. КёлбЫ встр хивают при 26°С на ротационной тр сучке , как описано в при мере 1. Оптимальный титр клавуланб ,вЬй кислоты достигаетс к 3-5 дн м. Разбавление фильтрата культуры в со отношении 1/2500 дает 60%-иое ингибирование в пробе на ингибироварие |Ь - лактамазы. Зона клавулановрй кислоты обнаруживалась при Rf 0,46 при использовании метода бумажной хроматографии. Эта зона увеличивает Си в рйэмере параллельно с увеличен ем активности в пробе на определени ингибировани р-лактамазы. П РИМ ер 3. Колбу дл кульTViaj посевного материала согласно примеру 1 используют дл инокулироваии криических колб на 500 мл, со держасцих 100 мл алйквоты приведенно HHJKe , вес.%: Декстрин2 Аркасой1 Скотазол0,1 reSQ 7HjO0,01

15 30 55 приготовленной в деиониэированной воде и стерилизованной. Содержание прививочного материала составл ет 5%. Инокулированные колбы встр хивают при 26°С. Оптимальна 5-лактамаэаингибирующа активность достигаетс за 3-5 дней. Эта активность аналогична активности в примере 2. И р и м ер 4. Культивирование Streptomijces c avu6ig-erua. Прививочную стадию, описанную в примере 1, используют дл инокулировани конических колб на 500 мл, содержащих следующую среду, приготовленную в деионизированной воде, вес.%: Декстроза1 Соера мука1 Скотазол 0,05 CaCOj1 Эти колбы обрабатывают точно таким же способом, как описано в предшествующих примерах, и культивируют при идентичных услови х. р-Лактамазаингибитррна активность достигаетс за 3-5 дней. Фильтрат культуры при конечном разбавлении 1/2500 дает 35-45%-ное ингибирование в пробе на определение р -лактамазаингибиторной активности. П р и м е р 5. Культивирование Strepiorrfaces ctavufcigfer-us i-Лактамазаингибиторную активность получают при использовании приведенной ниже среды, вес.%: Глицерин1 Соева мука1,5 MgSO40,1 К2НР04Ol при осуществлении стадии прививки в услови х культивировани аналогичны примеру 1. П ри м е р 6. Культивирование Streptom-sces ctavutigerus Следующую среду используют дл получени клавулановой кислоты при использовании таких же условий и ве гетативного прививочного материала что описаны в примере 1, вес.%: Глюкоза Lab. Lenico Оксидный дрожжевой экстракт CaCOj Среду готов т в деионизированной воде. Оптимальные титры достигают за 3-5 дней и разбавление фильтр ГЙ ку туры в соотношении 1/2500 дает 35-45%-ное ингибирование в пробе на определение ингибировани (Ъ-лакта мазногЬ энзима.. Пример 7. Культивирование Streptomvces ctavutligeru Аналогично примерам 4, 5 и б при веденна ниже среда, вес.%: Глюкоза Аркасой 0,02 СаСО} 0,0001 СоС1„ дает 35-45%-ное ингибирование (разбавление 1/2500) в р-лактамазной пробе при оптимальном титре, которы дбстигаетс . через 3-5 дней после инокулировани . Пример 8. Культивирование StreptomyceS ctavuEigerusОписанна ниже среда дл стадии получени , при ее использовании в стандартных услови х культивации, аналогичных описанным в предыдущих примерах дает 2Ь-30%-ное ингибирова ние при 1/2500 разбавлении в опыте на Ь-лактамазу за 3-5 дней после инокул ции. При использовании метода бумажной хроматографии зона кла вулановой кислоты. - Rf 0,46 при исследовании фильтрата культуры. Среда, вес.%: Скотаэол: 2 . Оксоидный дрожжевой экстракт1 Среду готов т в водопроводной во де, рН 7,О. .Пример 9. Культивирование Streptomiices ctavutigrerusПри стандартных услови х культи вации при использовании приведенно ниже среды получают клавулановую к лоту через 3-5 дней после инокулир ван-и вегетативным прививочным материалом . Разбавление культуры в с отношении 1/2500 приводит к 20-30% ному ингибированию в пробе на инги бирование -лактс1м зы. Среда, г/л: Глицерин15 Сахароза20 Пролин2,5 Мононатрий глутамат 1,5 NciCE5,0 KjHPO 2,0 Mnce.4H200,1 Fece бНгО . 0,1 ZnCCj 0,05 MgfSO TH O1,0 Среду готов т в деионизированной воде рН 7,1. Пример 10; Культивирование Sireptomvces cE.av(jeig-eru%. Дл получени посевного материала выращивают культуру на косом агаре в скл нке ROUX , инкубацию провод т при 26°С в течение 10 дней. После инкубации добавл ют 100 мл стерильной воды и получают суспензию мицели . Эту суспензию используют дл инокулировани 50 л стерилизованной прививочной среды следующего ниже состава в водопроводной воде, вес.%: Оксоидный солодовый экстракт1 Оксоидный бактериологический пептон - 1 Глицерин1 10% пеногаситель P urpnic U 81 в соевом масле 0,05 Среду помещают а дев ностолитровый ферментатор из нержавеющей стали и перемешивают с помощью лопастной , дисковой.или центробежной мешалки со скоростью 240 об/мин. Стерильный воздух подают со скоростью 50 л/мин и инкубацию провод т при 26С. Через 72 ч прививочный ферментатор используют дл инокулировани 150 л этой же среды, ввод ее стерильно в соотноше:гни 5% (об./об.). Эту на стадии получени помещают в трехсбтлитровый стсшьной ферментатор , приводимый во вращение с помощью дискового центробежного смесител при скорости враицени 210 об./ /мин. Стерильный воздух подают со скоростью 150 л/мий. Ферментацию провод т по 10 мл (10% P8uronic L 81 в соевом масле).Через определенные интервалы отбирают образцы дл анализа на ингибирование -лактамазы. Ферментатор разгружают через 4-5 дней при оптима тьном уровне (Ъ-лактамазной ингибиторной активности. В табл. 2 предс тавлена %-лактамазна ингибиторна активность образцов филырата культуры, вз тых из. трехсотлитрового ферментатора, содержащего Streptom ces ctavutigerus.

ji-Лактамазна ингибиторна активность образцов фильтрата культуры, вз тых из трехсотлитрового ферментатора.

ферментации,

Ингибирование в пробе на ингидни ; бирование р-лактама5ы при конечном разбавлении пор дка 1/2500, % . - П ibH м е р li. Культиваци Streptunidceb cEotvuEig-epuS. -. Опыт провод т в прививочном ферм таторе точно таким же образом, как описано в ;примере 10,- при использо ванйи тойже среды. . . V Через; 62 ч содержимое прививочног фериёнта Ьра,, представл ющее 5% (об/об.) вегетативного прививочного МДтер:й 1;ла, перейос т в трехсотлитровы фермен 1атор йЗнержавеющей стали, сЬдер сащйй- 150 л стерйлизованнОй сре дьа, при: пе рёмё11ае ии с помощью дрскового центробежного смесител при скорости вращени 210 об/мин.Стерил ный вО-ЭйУх подают со скОростью 150 л/мйй. Ферментацию провод т при 26 С Антипенный агент при .необходимости д:оба:вл юг ПОЕ1ЦИЯМЙ по 10 мл (10% Pturonic L- 81 в соевом масле) . .СреДа, используема на стадии получени ,представл ет собой такую же реду; что и в примере 3 и в нее перед стерилизацией добавл ют О,05%(об об.) антипенного агента, представл rofijerp собой смесь 10% PturonicU 81 И соевого масла. 1Ь -Лактамазна ингибирующа ак тивность образцов ферментации аналогична образцам из примера 10 (см. табл. 2). Бумажнохроматографическое йссле о зание обнаруживает зону клавулановой кислоты при Rf 0,46 при использовании ранее описанного биоав тографического (синергетического) сп соба. Размер зоны, соответствующей клавулановой кислоте ;увеличиваетс параллельно увеличению ингибировани }i -лактамазы.

Таблица 2 Пример 12. Культивирование btreptomyces oEavubigerus. 100 мл стерильной вода добавл ют к спорообразующей культуре, котора прорастает на агаре Bennets в течение 10 дней при 2б°С. Готов т суспензию мицели и спор, которую используют дл инокул ции 75 л/стерилизованной среды следующего состава в водопроводной воде, вес.%: Декстрин , 2 Аркасой 1 10% РЕигошс 1,81 в соевом масле 0,03 рН среда поддерживают при7,О Среду помещают в столитровый ментатор, который приводитс вО вращение дисковой центробежной мёшалкОй со скоростью вращени 140 об./мин. СТериальный воздух подают соскоростью 75 л/мин и сосуд инкубируют в течение 72ч при 26°С. . - . Содержимое прививочного ферментатора используют дл инокулировани 1500 л стерилизованной средда следующего ниже состава в водопроводной воде, вес.%: Аркасой 501/5 Глицерин,1,0 КН2Р04 .0,1 10% PEuron-ic L 8-1 в соевом масле 0,2 рН среды поддерживают на уровне 7,0. , . Среду помещают в ферментатор на 2000 л, перемешиваемый двум дисковыми центробежными мешалками, при скорости вращени 106 об./мин. Стерильный воздух подают со скоростью 1200 м/мин.

При необходимости добавл ют 25 м антипенного агента 10% PEuronic 181 в соевом масле). Ферментацию провод т при 2бс в течение 3-5 дней и получают максимальный выход клавулановой кислоты, равный 200-300 мг/мл

Пример 13. Культивировани Streptorrrstcee c.qvue grerus

Прививочный материал получают р соответствии с описанным ранее способом при использовании среды, описанной в примере 3 (при поддержании рН среды на уровне 7,0). Его используют дл инокулировани конических колб на 500 мл,содержащих 100 мл аликвоты приведенной ниже среды, приготовленной в деионизированной воде и стерилизованной. Количество прививочного материала составл ет 5 вес.%.

Среда, вес.%:

Prictiem Р2241

Аркасой 501,5

КН2Р040,1

рН среды поддерживают на уровне 7,0.:

Инокулированчыв колбы встр хивают при и оптимальную р-лактамазаингибирукнда активкость достигаетс за 3-5 дней, В результате получают клавулановую кислоту (300500 мг/мл) .

Пример 14. Выделение сырой натриевой соли клавулановой кислоты.

Созревшую культуральнуто жидкость, полученную согласно примеру 10, осветл ют в результате непрерывного центрифугировани и мицелий отбрасывают . Из 150 л ферментационной жидкости получают 120 л очищенной культуральной жидкости. Этот фильтрат дает 58%-ное.ингйбирЬвание в пробе на ингибирьвание Ь-лактамазы при разбавлении 1/2500. Фильтрат охлаждают до 5°С и прибавл ют 40 л н-бутайола . Смесь перемешивают и добавл ют 25% HjSO до тех пор, пока не установитс рН, равный 2. Подкислённую смесь перемешивают в течение еще 10 мин .перед разделением фаз центрифугированием. Водную фазу отбрасывают . К н-бутанольному экстракту добавл ют 0,5% Norit Q5X угл и смесь перемешивают в течение 15мин Уголь после использовани отбрасывают путем фильтрации с помощью диатомовой земли в качестве фильтрующего средства. К н-бутанолу добавл ют 1/4 объема деионизированной воды и смесь перемешивают при добавлении 20%-ного раствора NaOH, устанавлива рН 7,0. Фазы раздел ют центрифугированием и н-бутанольную фазу отбрасывают, водную фазу концентрируют при пониженном давлении до 800 мл и затем сушат на холоде. В результате получают 35 г сырого препарата клавулановой кислоты. Этот твердый препарат хран т в сухом состо нии при -20С перед предсто щей дополнительно очисткой,

Пример 15. Выделение сырой натриевой соли клавулановой кислоты.

Один литр фильтрата культуры, дающего 53%-ное ингибирование в пробе на ингибирование f -лактамазы и полученного согласно методике, описанной в примере 12, перколируют через колонку. После фильтрата культуры пропускают 300 мл дистиллированной воды дл npONWBKK колонки. Элюирование активного Р -лактамазного ингибитора осуществл ют О,2 М раст вором MaCl. Собирают фракции (20 мл) и испытьгеают их при конечном разбавлении 1/2500 в опыте на ингибирование j -лактамазы. Активные фракдни объедин ют и концентрируют в вакууме до объема, равного 20 мл. Раствор обессоливают путем гельочищающей хроматографии на кблонке и элюируют 1%-нь м раствором н-бутанола в воде. . ,

Активные фракции объедин ют,;хлористый .натрий элюируют после клавулановой кислоты и определ ют с помощью раствора нитрата серебра. Обь-: единенные активные фракции концентрируют и сушат на холоде.

Один литр фильтрата культуры пос ,ле обработки дает 0,45 г сырого твердого препарата клавулановой кислоты, имеющей Lдо О,92 мг/мл.

Это твердое вещество хран т при 20°С перед последующей очисткой. Пример.16. Выделение сырой .натриевой соли клавулановой кислоты . .;

-фильтрат культуры, содержащий зоб.мг/мл клавулановой кислоты подкисл ют , экстрагируют н-бутанолом и клавулановую кислоту подвергают

обратной экстракции в воду при нейтральном рН.

Охлажденный фильтрат культуры закачивают.в смеситель, через впускное отверстие которого добавл ют

6 вес,% азотной кислоты дл установлени рН на выходе из смесител 2 ,0V ±0,1. Подкисленный фильтрат пропускают со Ькоростью 4 л/мин через охлаждаемый гликолем пластинчатый теплообменник , поддержива температуру 2-5°С, рН концентрируют в проточной чейке перед пропусканием через трехсекционный противоточный сепаратор.

Охлажденную воду, насыщенную н-бутанолом, прокачивают со скоростью 3 л/мин через противоточный сепаратор . Водный раствор, выход щий из противоточного сепаратора, отбрасывают . Выход щую воду удал ют из бутанольного потока, вытекающего из противоточного сепаратора с использованием делительной центрифуги дл системы жидкость/жидкость. ВутаНОЛ собирают в сосуд из нержавеющей стали, снабженный рубашкой дл охлаждени , в котором его хран т при тем пературе около 5 С, Из этого сосуда отбирают 40 л аликвоты и тщательно перемешивают с 2 л, охлажденной воды ( 5°С), насыщенной н-бутанолом. -- ,РН этой смеси устанавливают равным 6,8 + 0,1 с использованием 20%ного раствора гидроокиси натри . Эту водную смесь экстракта и бутанола подают в смесительную центрифуту ДЛЯ систе}-ь1 жидкость/жидкость со скоростью 2 л/мин. Из 1800 л фильтрата культуры регенерируют 90 Л водной фазы, содержащей 39% клавулановой кислоты, присутствующей в фильтрате культуры. 15 л водного экстракта регулируют с помощью добавлени 60 г хлористого натри на I л таким образом, чтобы общее содержание твер дых веществ составл ло 2-3%, и сушат распылением. Сухой продукт, общий йес которого составл ет 1 кг, содержит 62% клавуланрвой кислоты, присутствующей в сырье, идущем на переработку. Оставшиес 75 л водного экстракта концентрируют ультрафцльтрацией. Вод ный экстракт хран т при +5°С, поддер жива содержание твердых веществ, равное 8%, и затем сушат распрыскиванйем . Высушенный материал содержит 75% клавулановой кислоты, присутствующей в сырье поступающем на сушку распылением. Общий высушенный распылением продукт из 90 л водного экстракта содержит 69,4 г клавулановой кислоты, что составл ет 72% клавулановой кислоты из сырь , идущего на сушку распылением и 21% клавулановой кислоты , присутствующей в 1800 л фильтрата культурыПример 17. Частична очист ка сырой клавулановой кислоты. Сырые препараты клавулановой кислоты , полученные по методике, описан ной в примере 15, очищают методом ионообменнойхроматографии. 18 г материала , полученного согласно примеру 15, раствор ют в 25 мл дистиллиро зайной воды и пропускают чёрё-з слой смолы в хлоридной форме. Колонку элюируют хлористым натрием, полученным .в результате подачи самотеком Of05М хлористого натри в смесительный резервуар, содержащий 1 л дистилированной воды, который в свою очередь подают в хроматографическую колонку. 10 мл фракции собирают и Р -лактамазаингибирующую активность провер ют при 1/2500 разбавлении . фракций, активность элюируют после основной полос цвета между фракци ми 24 и 30. Активные фракции собира .ют и концентрируют до объема 30 мл. Этот раствор -обессоливают и элюируют 1%-ным раствором н-бутанола . в в оде. 20 мл Фракции испытывают на содержание клавулановой кислоты-с использованием пробы на ингибирование (i-лактамазы . Фракции также нанос т на бумажные полоски и опрыскивают реагентом EhrCicfi или трифенилтетразола . р) -лактамазаингибирующа активность .коррелируетс с розовыми или красными п тнами, полученными в результате действи этих реагентов. Активные фракции собирают за исключением тех, которые содержат хлористыГ натрий и концентрируют в вакууме досуха. Така методика дает 520 мг частично очищенной натриевой соли клавулановой кисЛ-оты. Тонкослойна хроматографи (силикагель ) такой клавулановой кислоты дает,следующие значени Rf . Верхн фаза смеси н-бутанол: этанол: :вода- 4:1:5, i-0,21; н-бутанол: :уксуска кислота : вода - 12:3:5, . Rf 0,44; изопропанол : вода - 7:3; Rf 0,78. Зоны определ ют в результате опрыскивани реагентом Ehr -icti 6-аминопенициллин, используемый в качестве метки и определ емый в результате опрыскивани этим же реагентом дает следующие значени Rf 0,3S, О , 39 и 0,77 соответственно. Пример 18. Частична очистка натриевой соли клавулановой кислоты . . Фильтрат культуры, полученный согласно примеру 12, подвергают экстракции растворителем согласно методике, описанной в примере 14 с образованием твердого препарата, который дополнительно очищают методом ионообменной хроматографии с -использованием шиэтиламиноэтилцеллюлозы. Это- твердое вещество раствор ют в 20 мл дистиллированной воды, пропускают через колонку, набитую Е-52 целлюлрЗОЙ , в которой заранее устанавливают рН 7,5 с помощью 0,01 М натрийфосфатного буфера. Колонку люируют NaCE- градиентом. 0,1 М NaCf в 0,01 М натрийфосфатном буфере при рН 7,5 подают в смесительную камеру, содержащую 1л 0,01 М фосфатного буфера, при рН 7,5, котора в свою очередь св зана с колонкой. Фракции собирают и лх испытывают на . (Ь -лактамазаингибирующую активность при разбавлении 1/2500. Эти фракции исследуют также на антибактериальную активность, объедин ют, концентрируют и затем обессоливают на колонке с Biorad BiogeE Р 2. Как было обнаружено с помощью методов бумажной и тонко-елейной хроматографии, эти фракции . содержат клавуланбвую кислоту. Приме-р 19. Выделение тверой натриевой соли кЛавулйновой кислоты .. Частично очищенный гверкл : препаат клавулановой кислоты (SOO мг), полученной согласно методике примера 17, загружают в колонку с микрокристаллической СС 31 целлюлозой, В качестве хроматографического растворител используют верхнюю фазу смеси н-бутанол : этанол : вода в соотношении 4:1:5. Хроматографированиё провод т при и 4 мл фракции собирают . Фракции испытывают на присут ствие клавулановой кислоты путем нанесени на фильтровальную бумагу и опрыскивани реагентом ElirEicii (розовое п тно) или триценилтетразолом (красное п тно). Делают пробы на ин гибирование р -лактамазы при 1/2500 ;разбавлении. Активные фракции объ;един ют и сушат в вакууме на рота:ционном испарителе. Твердое вещество раствор ют в небольшом объеме дистил лированной воды и сушат на холоду. Получают белый твердый препарат натриевой соли клавулановой кислоты. Пример 20. Выделение твердой натриевой соли клавулановой кислоты . . концентрированный экстракт, полученный в результате ультрафильтрации в примере 16, содержит 10 г клавулановой кислоты. Этот экстракт перколи руют со скоростью 1 л/ч через колонj y анибнробменной смолой в хлоридной форме. Затем колонку промывают 2. л деионизированной воды перед элюированием градиентом хлористого натри . Градиент создают пропусканием через резервуар, содержащий 4 л 1,4 М NaCl через перемешиваемый резервуар, содер жащий 4 л NaCl, который соединен с перемешиваемым резервуаром, содержащим 4 л деионизированной воды. Последний соединен с. помощью насоса с колонкой. Колонку элюируют со скоростью 2,5 мл/мг и 25 мл фракции собирают . Фракции испытывают на икгибирование Э-лактамазы. Активные фракции объедин ют и выпаривают в вакууме досуха. Затем до- бавл ют этанол (500 мл) и твердое ве щество отфильтровывают после интен .сивного перемешивани . Затем этаноль Нйй экстракт выпаривают в вакууме досуха на ротационном испарителе и повторно раствор ют в деионизированной воде (40 мл). Затем его загружают в колонку, набитую Bjorad р)-лактамазы Ингибирование

Источник р(лактамазы

Stapti &ococcus aureus (RusseE,,) Eschet icbia coti ЛТ 4 Escherictiia coti В RtebsieECa aerogrenes A Pseudomonas aerog inosa 822 (R factor) JPseudomonas daEgEeisti

Приблизительное значение X относительно Esctierichia coEi Т 4 si

1,0 1,0 2,0 0,6 5,0 0.1 Siog-eC ,Р2, элюируют 1%-ньш раствором н-бутанола. Фракции собирают и испытывают на (i-лактамаэаингибирующую активность при конечном разбавлении 1/2500. Опыты по определению содержан;и хлористого натрий при разбавлении фракцией в соотношении 1/25 осуществл ют с исполлзованием раствора нитрата серебра. ти фракции, содержащие клавулановую кислоту, свободную от хлористого натри , объедин ют, концентрируют путем выпаривани растворител при пониженном давлении до 20 мл и затем сушат на холоде. В результате этого получают 4,8 г натриевой соли клавулановой кислоты. Пример 21. Получение натриевой соли клавулановой кислоты. 0. еНгОН rf ч/ СОгСНгСбНб , 3 Практически чистый бензилклавуланат в этаноле, содержащем кислый углекислый натрий, гидрируют над 10%ным пеногасителем в течение 25 у5ин при комнатной температуре и атмосферном давлении. Катализатор отфильтровывают , промывают водой и этанолом/ и объединенные фильтраты выпаривают при пониженном давлении при комнатной температуре. Оставшеес полутвердое вещество растирают в порошок в присутствии ацетона, фильтруют и промывают эфиром с образованием натрийклавуланата , П р И м е р 22. Ингибирование р -лактамазы натриевой солью клавулановой .кислоты. Клавуланова кислота прогрессивно и необратимо ингибирует -лактамаЗУ , вырабатываемую Е setter ictiiaВ табл. 3 приведено ингибированиё р| -лактамазы клавулановой кислотой. Таблица 3 улановой кислотой При использовании совместно с пенициллином G в качестве субстрата, Jjo натриевой соли клавулановой кис лоты против Р -лактамаэы, вырабаты ваемой Slapti. (Jureus (RusseCK) сбставл ет приблизительно 0,06 мг/мл Пример 23. Получение клавулан ,ата натри . Бензил клавуланат (840 мг) SB этаноле (30 мл) и воде (5 мл) гидрируАнтибактериальный спектр натриевой соли клавулановой кислоты

Бактериальный штамм

Staph tococcue aureu%(0xfordh ) Staph-stococcus aureus (Ru5se &) BacieCus 5ubtif-is Streptococcus faecatis Streptococcus p-sogenes CN10 Esctierichio coti NCTC 10416 KCebsietCa aerogrenes

KEebbietEa oxvtocum Enterobacter aerogenes T624 Enterobacter c&oacae Acinetobacter anitratus Provldentia stuartiv Serratia marcescens Proteus miratiEis C977 Proteus votgans W09O SafcmonetCa isptiimurium

Sti-igreEto Sonnei

Pbeixk5monas aerugfinosa A

Предлагаемое антибактериальное вещество (клавуланова кислота) может быть представлено структурной формулой д tHzOH

О

COjH

Полное химическое наименование клавулановой кислоты - Z -(2В, 5R -3- ( fb -гидроксиэтиледен) -7-оксо-4-окса-1-азабицикло (3,2,0) гептан-2-карбрнова кислота.

Она способна ингибировать-рост штаммов разновидности Stapli- Eococ .Cus Qureus, обладает синергитическим действием в отношении анти бактер ицидного эффекта ампициллина

против р -лактамазапроиэвод щих , Esctierichia coei, Во aerog eries и Staplrseococcus аигеи, синергитическим действием в отношении антибактерицидного эффекта це64

Минимальна ингибирующа концентраци , мг/мл

7,5 7,5 62

500

125

31

31-62

62

31

62

125

62

31

62

500

фалоридина против fb -лактамазапро45 извод щих штаммов Proteus (biCi4 и StoiptivEococcus aufeusНаиболее применимыми сол ми клавулановой кислоты вл ютс например такие, как натриева , калиева , кальциева , магниева , алюминиева , аммонийна и замещенные аммониевое соли, такие как триметиламмониева , бензатин, прокаин, а также аналогичные соли, которые получают обычным способом при реакции с пенициллинами или цефалоспоринами.

Клавуланова кислота и ее соли обладают ценными терапевтическими свойствами и могут примен тьс дл лечени инфекции у млекопитающих, включа человека, в различных формах , таких, как таблетки, капсулы, кремы, сиропы (микстуры), суспензии, растворы, способные к повторному составлению порошки, а также стерильные 267 мг) и бикарбонают над 10% том натри (244 мг) в течение -25 мин при комнатной температуре и атмосферном давлении. Катализатор отфильтровывают , промывают водой и этанолом и объединенные фильтраты выпаривают , а продукт кристаллизуют. Предлагаемое вещество обладает широким спектром антибактериальной активности, что показано в табл. 4. Таблица 4

21648117 22

формы, пригодные дл инъекции илиотличающийс тем, что

вливани .штамм Streptom(ces cCavueigrePus

Claims

1. Способ получени антибактери- одой, и очисткой, и при необходимосального вещества Формулы р CH OHти перевод т в соль.

Г 2« Способ по п. 1, отличаюQ и и с тем, что экстракцию осуще СОгНствл ют н-бутиловым спиртом.