SU440847A1 - Способ получения антибиотика - Google Patents

Description

Изобретение относитс  к области микробиологии , а именно к микробиологическим сиособам получени  антибиотиков.

Известен способ получени  антибиотика путем культивировани  Bacillus circulans в аэробных услови х в водной питательной среде , содержащей источник углеводорода, азота и минеральные соли, с последующим выделением целевого продукта из фильтрата культуральной жидкости и хроматографическим разделением его на активные компоненты .

Предлагаемым способом антибиотик получают путем культивировани  щтамма микроорганизма Bacillus circulans АТСС 21656 в аэробных услови х в водной питательной среде , содержащей источник усво емого углерода , азота и минеральные соли, до накоплени  в культуральной жидкости значительной активности антибиотика.

Затем культуральную жидкость подкисл ют , выпавщий осадок отдел ют фильтрованием и промывают водой. Фильтрат и промывные воды объедин ют и экстрагируют спиртом, смещивающимс  с водой, предпочтительно н-бутанолом. Спиртовой раствор концентрируют , и антибиотик осаждают этилацетатом ацетонитрилом, эфиром или ацетоном. Продукт можно затем подвергать более тщательной очистке распределением в системе,

содержащей воду, спирт и органическую кислоту , например, н-пропанол, н-бутанол, воду и уксусную кислоту, или образованием соли гелиаптовой кислоты и регенерацией антибиотика из этой соли.

Этот процесс приводит к выделению антибиотика ЕМ-49 в виде соли с кислотой, соответствующей кислоте, примен емой дл  подкислени  бульона. Соль превращают в свободное основание нейтрализацией, водным раствором аммиака, гидроокисью натри , гидроокисью бари , и экстрагированием н-бутанолом . Полученный таким образом антибиотик

ЕМ-49 представл ет собой вещество с антимикробной активностью. При более тщательном разделении антибиотик можно разделить на четыре активные фракции, близкие по структуре друг другу, и п тую фракцию, содержащую активное вещество неопределенной структуры.

Все ИК-спектры сн ты в КВг, а ЯМРспектры - в диметилсульфоксиде de.

На фиг. 1 изображен ИК-спектр антибиотика ЕМ-49 в виде хлоргидрата; на фиг. 2 - ЯМР-спектр хлоргидрата антибиотика ЕМ-49 на фиг. 3 - ИК-спектр антибиотика ЕМ-49; на фиг. 4 - ЯМР-спектр антибиотика ЕМ-49:

на фиг. 5-9 ИК-спектры антибиотика ЕМ-49

альфа, бета, гамма, дельта и МПФ соответственно .

Антибиотик ЕМ-49 и фракци , полученные при его разделении, активны по отношению к грибкам, а также к грам-положительным и грам-отрицательным бактери м, например, видов Staphylococcus aureus. Streptococcus pyogenes, Pseudomonas aeruginosa, Esherichia coli и Candida albicans.

Поэтому антибиотик или его физиологически приемлемую соль с кислотой можно примен ть в качестве противомикробного средства либо дл  дезинфекции окружающей среды, например, в ф|0рмах дл  разбрызгивани  или распылени , содержащих примерно по 1 % вещества в обычно примен емом носителе , либо дл  борьбы с инфекци ми, поражающими различные виды животных, вызванные вышеуказанными микроорганизмами, например при нанесении в виде мазей, содержащих до 1 % вещества, или в виде инъекций в дозировке 50-125 мг/кг веса в день. Доза ЕД50 дл  мышей дл  борьбы с инфекцией, вызванной Esherichia coli, составл ет примерно 50 мг/кг веса. Штамм Bacillus circulans - продуцент антибиотика ЕМ-49, выделен из почвы и хранитс  в коллекции культур в США.

Морфолого-культуральные свойства. Спорообразующие бациллы грамм-отрицательные. Споры расположены центрально или субцентрально , овальные; стенки опор толстые и легко окрашиваютс ; спорангии отчетливо набухают . Палочки не образуют цепочек. Мазки, окрашенные 0,5% основным раствором фуксина , показывают наличие тонкой оболочки. Колонии на питательном огаре, содержащем глюкозу, блест щие с гладкими или неровными кра ми, очень клейкие, слизистые, подвижные , легко размазываютс  на поверхности агара особенно при увлажнении чашек.

В питательном бульоне наблюдаетс  мутность , т желый осадок, тонка  слизиста  плеика.

Физиологические свойства. Испытани  по Воже - Проскауэру на образование ацетилметилкарбинола отрицательные. Культура индол не образует, крахмал (казеин) гидрализует газ из углеводов ие образуетс . Не растет при 60-65°С.

Получение антибиотика

Штамм Bacillus circulans АТСС 21656 продуцирует антибиотика, обладающий активностью против грам-положительных и грамотрицательных бактерий, а также грибков типа Candida albicans. Дл  получени  антибиотика штамм Bacillus circulans АТСС 21656 выращивают в аэробных услови х в водной питатель среде, содержащей усво емый углевод и источник азота. Ферментацию провод т в течение 60-150 час, предпочтительно 144 час, затем образуетс  антибиотик.

После завершени  ферментации культуральную жидкость подкисл ют до рН 2 концентрированной сол ной кислотой, добавл ют осадитель, и всю суспензию фильтруют. Осадок промывают большим количеством воды, и промывные воды соедин ют с фильтратом. Промытый осадок отбрасывают. Фильтрат вместе с промывными водами экстрагируют н-бутанолом, насыщенным водой. Бутанольный экстракт концентрируют под вакуумом при температуре ниже 45°С до небольшого

объема. Концентрат затем разбавл ют 15 об. ч. ацетона. Полученный осадок промывают ацетоном, этилацетатом и эфиром и получают после высущивани  светло-бурый порошок. Антибиотик, содержащийс  в этом

неочищенном препарате, подвергают последующей очистке противоточным распределением с применением системы, содержащей н-пропанол, н-бутанол, воду и уксусную кислоту в соотношении по объему 50 : 75 : 100 : 2.

Материал, полученный после 29 операций противоточного распределени , примен ют дл  характеристики антибиотика.

Антибиотик ЕМ-49 представл ет собой пептид основного характера, образующий соли с

неорганическими и органическими кислотами. При подкислении культуральной жидкости сол ной кислотой получают хлоргидрат. При использовании других кислот, например неорганических , типа бромистоводородиой кислоты , серной кислоты можно получать соответствующие соли этих кислот. Образующуюс  соль, в виде которой сначала получают антибиотик, можно нейтрализовать основанием , например гидроокисью натри , с получением свободного основани . Соли, не растворимые в воде, например арилсульфокислоты , типа нафталин-2-сульфокислоты, метилоранжа , н-фенизазобензосульфокислоты, могут быть образованы реакцией кислой соли антибиотика ЕМ-49, например его хлоргидрата, с солью щелочного металла арилсульфокислоты .

Особенно рекомендуемым способом выделени  антибиотика ЕМ-49  вл етс  способ с

применением соли гелиаитовой кислоты. Светло-бурый порошок, полученный осаждением ацетоном из концентрата, обрабатывают водным раствором метилоранжа, полученным осаждением соли гелиантовой кислоты антибиотика ЕМ-49. Гелиантат, представл ющий собой аморфный порошок, в этом состо нии, подвергают очистке повторным осаждением из диметилформамида, смеси метанола и ацетонитрила и из подобных растворителей. Обработка сол ной кислотой способствует повторному превращению гелиантата в хлоргидрат .

Светло-бурый порошок, не растворимый в ацетоне, содержит антибиотик ЕМ-49. Порошок подвергают очистке. Очищенный порошок содержит близкие по строению антибиотики со структурой пептидов и характеризующиес  наличием четырех свободных аминогрупп , которые можно разделить с применением ионообменной хроматографии.

В том случае, когда водный раствор хлоргидрата антибиотика ЕМ.-49, полученный через соль гелиантовой кислоты подвергают хроматографии на колонне, заполненной карбоксиметилцеллюлозой в виде натриевой формы (например, «Ватман целлюлоза СМ-52) и элюируют разбавленным раствором хлористого натри , антибиотик раздел ют на четыре фракции в зависимости от поверхностного нат жени  вытекающего потока. Эти фракции обозначаютс  соответственно ЕМ-49 альфа, бета гамма и дельта в пор дке проведени  их элюировани . Некоторые фракции различаютс  по их аминокислотному составу и по различи м в структуре остатка жирной кислоты. Анализ аминокислот показал, что фракции ЕМ-49 альфа и бета не содержат фенилаланина, содержат п ть остатков 2,4- диаминомасл ной кислоты и три остатка лейцина . Фракции ЕМ-49 гамма и дельта содержат один остаток феиилаланина, два остатка лейцина и п ть остатков 2,4-диаминомасл ной кислоты. Фракции ЕМ-49 альфа и бета отличаютс  друг от друга по структуре жирных кислот, выдел юидихс  после гидролиза в кислой среде. Аналогично отличаютс  друг от друга фракции ЕМ-49 гамма и дельта.

Хроматографи  не растворимого в ацетоне порошка в некоторых системах показала малоподвижную фракцию (МПФ), обладающую также щироким спектром антимикробного действи . Эту фракцию выдел ют и подвергают очистке экстрагированием и-бутанолом с последующей хроматографией на диэтиламиноэтнлцеллюлозе и повторной распределительной хроматографией на колонне, заполненной кремниевой кислотой и целлюлозой, элюированием смесью, содержащей н-бутанол, изомасл ную кислоту, пиридин и воду (40 : 9 : :4:10). Фракцию антибиотика БМ-49 МПФ можно также выделить и очистить путем хроматографии порощка, не растворимого в адетоне , на «Сефадекс LH20 (алкилированный сшитый декстран) с элюированием метанолом . Фракцию МГ можно легко выдел ть посредством образовани  кристаллической соли Рейнеке, получаемую в виде  рко-красных кристаллов.

Пример 1. Дрожжевом сной косой агар засевают микроорганизмом штамма Bacillus circulans АТСС 21656. Культуру выдерживают в термостате в течение ночи при 37°С, а затем смывают 50 мл водной среды из соевой муки в колбы Эрленмейера емкостью 250 мл. Состав ростовой среды, г:

Соева  мука15,0

Обезвоженный измельченный

картофель15,0

Глюкоза- 50,0

CoCl2-2H2O0,005

СаСОз10,0

Дистиллированна  вода до1000 мл.

Среду стерилизуют в течение 30 мин при 121°С и иаром под давлением 1,55 кг/см перед ее использованием. Посе нную культуру выращивают при 25°С в течение 72 час при посто нном перемешивании на ротационной мешалке (280 об/мин) и при перемещении

скл нки на два дюйма (5,08 см).

Из каждой колбы отбирают пипеткой по 2,5 об. % культуральной жидкости в колбу Эрленмейера, содержащую 100 мл жидкой питательной среды (рН 7,0) следующего состава , г:

Жидкий кукурузный экстракт 6,0

(NH4)H2P043,0

Дрожжевой экстракт2,5

Декстроза10,0

СаСОз2,5

Дистиллированна  водадо 1000 мл.

Колбы выдерживают в тех же услови х. Образцы отбирают через 3 и 6 дней и изучают с применением бумажной хроматографии и биоаиализа. Дл  бумажной хроматографии подход щее количество бутанольного экстракта подкисленной ферментативной жидкости нанос т на листы бумаги «Ватман Г,

и хроматограмму про вл ют растворителем следующего состава: н-бутанол, уксусна  кислота , вода 4:1:5 (по объему). Верхнюю фазу этой системы используют в качестве растворител .

Антибиотик ЕМ-29 (в виде хлоргидрата) имеет величину Rf 0,71. Антибиотик определ ют биологически по отношению к штаммам микроорганизмов Staphylococcus aureus ГДА 209Р и Esherichia coli АТСС 10536. Дл 

биоаиализа эти штаммы микроорганизмов примен ют обычным образом с использованием пробирок с различной степенью разбавлени . Пример 2. 250 литров культуры микроорганизма штамма Bacillus circulans АТСС

21656 подвергают ферментации в аппарате из

нержавеющей стали емкостью в 100 галлонов

(378,5 л) средой в услови х, описанных ниже.

Стади  1.

Инокулюм. Культуру микроорганизма штамма Bacillus circulans АТСС 21656 сохран ют в жидком азоте, выращивают на дрожжевом сном косом агаре следующего состава , г:

М сной экстракт1,5

Дрожжевой экстракт3,0

Пептон6,0

Декстроза1,0

Агар15,0

Дистиллированна  вода до1000 мл.

Среду стерилизуют под давлением 1,55 кг/см, при 121°С за 15 мин перед применением .

Ростовую среду из косого агара примен ют дл  инокул ции первых колб дл  роста. Состав среды, г:

Соева  мука15,0

Обезвоженный измельченный картофель15,0

Глюкоза50,0 CoCl2-2H2O0,005

СаСОз10,0

Дистиллированна  вода до1000 мл.

Стерилизацию провод т при 121°С в течение 30 мин.

100 мл этой среды, помещенной в колбу Эрлейнмейера, выдерживают в течение 72 час на роторной мешалке при 25°С. Мешалка работает со скоростью 280 об/мин, дава  перемеш ,ение скл нки 5,08 см.

Стади  2.

Инокулюм: 100 мл материала из первой стадии.

Среда така  же, как ростова  среда на стадии I. Инокулируемый материал и 1000 мл среды в колбе Эрленмейера емкостью 4000 мл прививают в течение 72 час при 25°С на роторной мешалке (280 об/мин), перемеш,а  скл нку на 5,08 см.

Стади  3.

Инокулюм: 3000 мл материала из второй стадии.

Примен ют среду (рН 7,0) следующего состава , г:

Кукурузный экстракт (жидкий) 6,0

(NH4)H2PO43,0

Дрожжевой экстракт2,5

Декстроза10,0

СаСОз2,5

Дистиллированна  водадо 100 мл.

Инокулированный материал добавл ют к 250 л среды и выдерживают при посто нных услови х в течение 144 час при аэрации со скоростью 0,61 мл/мин цод давлением 0,7 кг/см и перемешивании со скоростью 155 об/мин (0,4 вт/л).

.Пример 3. Культуральную жидкость, полученную по методике, описанной в примере 2 (209 л), подкисл ют до рН 2,0 1,5 л концентрированной сол ной кислоты и добавл ют фильтрующее средство («Гифло, 15 кг). Смесь фильтруют с образованием 41 кг нерастворимого материала. Нерастворимый осадок на фильтре промывают 10 л воды, и промывные воды соедин ют с фильтратом с образованием 190 л жидкости. Промытый мокрый осадок на фильтре (41 кг) отбрасывают.

Пример 4. Фильтрат (190 л), полученный ио методике, описанной в примере 3, экстрагируют трижды 56 л н-бутанола, насыщенного водой. Бутанольные слои (194 л) собирают и концентрируют под вакуумом при 45°С до небольшого объема (2,3 л).

Пример 5. 50 мл концентрата, полученного по методике, описанной в примере 4, разбавл ют 750 мл ацетона и центрифугируют. Осадок промывают ацетоном (60 мл), суспендированием его в растворителе, а затем центрифугируют . Операцию повтор ют с применением этилацетата (трижды по 60 мл) и эфира (трижды по 60 мл). Осадок высушивают на воздухе, измельчают и высушивают под

вакуумом. Получают 1,4 г светло-бурого порошка .

Пример 6. 1,4 г образца, не растворимого в ацетоне, полученного по методике, описанной в примере 5, подвергают последующей очистке противоточным распределением с использованием системы, содержащей н-пропанол , н-бутанол, воду и уксусную кислоту (50:75: 100:2 по объему). Провод т 29 переносов по 40 мл каждой фазы на пробирку. Максимальна  активность, определ ема  диффузией с применением бумажных дисков, наблюдаетс  в пробирке 11. Содержимое пробирок 8-14 соедин ют, и растворители удал ют под вакуумом. Остаток раствор ют в небольшом количестве метанола и осаждают антибиотик путем добавлени  ацетона и эфира . Осадок тщательно промывают эфиром, высушивают на воздухе, а затем под вакуумом и получают 0,466 г светло-бурого порошка . Этот порошок представл ет собой преимущественно основной антибиотик ЕМ-49 пептидного характера в виде хлористоводородной соли.

Найдено, %: С 45,58; Н 7,31; N 14,62; С1 11,86 (ионный); (,0, вода); -42+3° (589 ммк); --44° (578 ммк); -50° (546 ммк); -91° (436 ммк).

ИК-спектр поглощени  дл  хлоргидрата изображен на фиг. 1; ЯМР-спектр дл  хлоргидрата в диметилсульфоксиде de - на фиг. 2.

Дл  определени  антибиотика примен ют бумажную хроматографию (фильтровальна  бумага марки «Ватман 1), а также биологический анализ с применением Е. соИ АТСС 10536.

Система растворителей н-бутанол : уксусна  кислота : вода (4:1:5)0,71

н-пропанол : н-бутанол : вода

(2:3:4)0,57

Хлороформ : метанол : вода (5:4:2) 0,38 Хлороформ : метанол : 1%-на  уксусна  кислота (5:4:2)0,35

Хлороформ : метанол : 0,5 н. NH4OH (5:4:2)0,91

Хлоргидрат антибиотика ЕМ-49 имеет температуру плавлени  180-207°С (с разложением ), растворим в воде, метаноле, этаноле, диметилсульфоксиде и уксусной кислоте, не растворим в ацетоне, этилацетате, эфире и ацетонитриле.

Продукт гидролиза образца (2,30 мг) хлоргидрата антибиотика ЕМ-49, продуцируемого по описанной методике, получают нагреванием этого антибиотика в 6 н. растворе сол ной кислоты при 110°С в течение 16 час.

Анализ по известному способу Штейна- Мура показал присутствие лейцина (3,95 моль) и 2,4-диаминомасл ной кислоты (7,35 мкмоль). В продукте гидролиза обнаружен также фенилаланин (0,86 мкмоль), а

также следы других аминокислот. Продукт

содержит идентифицируемое количество треонина , что служит дл  отличи  антибиотика ЕМ-49 от других антибиотиков пептидного характера , например, циркулина, полимиксинов и полипептина. Из продукта гидролиза можно выделить неидентифицированную жирную кислоту, что показывает присутствие примерно 10 вес. % этой кислоты в антибиотике. Спектр ультрафиолетового поглощени  хлоргидрата в 0,05 н. растворе сол ной кислоты показывает наличие небольшого пика при 248 ммк (Е 25) и конечную адсорбцию. Интенсивность адсорбции при 248 ммк усиливаетс  окрашенными примес ми, что дает повышение пика поглощени  также и в видимой области спектра. Этот пик и конечна  адсорбци   вл ютс  (по крайней мере частично ) следствием наличи  фенилаланина.

Пример 7. Хлоргидрат антибиотика ЕМ-49 превращают в свободное основание противоточным распределением с применением системы, содержащей н-бутанол и 0,5 мл раствор Н4ОН 1,01 г хлоргидрата антибиотика ЕМ-49, полученного по методике, описанной в примере 6, подвергают 29-кратному переносу с применением 40 мл верхней и нижней фазы в пробирку. Содержимое пробирок 25-29 соедин ют, верхнюю фазу отдел ют и упаривают досуха под вакуумом. Остаток затем раствор ют в теплом метаноле (примерно 50 мл). Добавл ют этилацетат (50 мл), бензол (50 мл) и циклогексан (50 мл). Удал ют эту смесь растворителей под вакуумом и получают 0,75 г беловатого порошка, представл ющего собой свободное основание антибиотика ЕМ-49. Температура плавлени  полученного антибиотика 245-248°С. Найдено , %: С 56,64; Н 8,65; N 16,50; С1 0,0.

Молекул рный вес свободного основани  определ ют в этаноле посредством ультрацентрифугировани . Он составл ет примерно 1080. Эквивалентный вес, определ емый титрованием хлорной кислотой, составл ет 272. Эмпирическа  формула антибиотика ЕМ-49 в виде свободного основани  соответствует примерно CsiHgsNlsOig.

Спектр ультрафиолетового поглощени , определ емый в метаноле, имеет дополнительно к сильному концевому поглощению следующие пики.

Ямакс (), ммк;

247,5 (плато, 5,8), 252 (плато, 4,5), 258 (4,1), 265 (3,4), 268 (3,2).

ИК-спектр в КВг изображен на фиг. 3. ЯМР-спектр в диметилсульфоксиде de - на фиг. 4.

Раствор хлоргидрата антибиотика ЕМ-49 в воде (0,1 -10 мг/мл) обрабатывают растворами солей натри  и кали  (0,5 мл). Соли следующих анионов не образуют осадка: ОАс- НРО42-, J- СЮз-, С2О42-, ВгВ4О7 , JOs-. Следующие анионы образуют осадки в возрастающей степени растворимости: SO42-, МоО42- НРО42-, , Fe (СЫ)б-, Fe (СЫ)б СггОу -

Пример 8. Антибиотик ЕМ-49 можно также осаждать из водного раствора в виде соли с различными арилсульфокислотами путем обработки кислотой или соль кислоты. 1,00 г хлоргидрата антибиотика ЕМ-49 раствор ют в 50 мл воды и добавл ют раствор 1,25 г п-фенилазобензолсульфокислоты в 20 мл воды. Смесь перемешивают в течение 30 мин и выдерживают дл  отстаивани .

Верхний слой декантируют и осадок промьгвают дважды по 30 мл воды, а затем фильтруют . Осадок высушивают под вакуумом и получают 1,43 г аморфного твердого вещества . Полученную твердую соль п-фенилбензолсульфокислоты кристаллизуют из метанола. Образец перекристаллизовывают 4 раза из смеси метанола с ацетонитрилом (2:1) и получают продукт, разлагающийс  при температуре примерно 267°С при быстром нагреваНИИ под вакуумом. Полученный продукт высушивают в течение нескольких часов под давлением 0,02 мм рт. ст. и 100°С и получают повышение веса на 4,17% за счет атмосферной влаги.

Найдено, %: С 53,29; Н 6,42; N 13,10; О 21,33 (по разнице); S 5,86.

Дл  молекул рного веса 2103 (определенного исход  из наличи  четырех атомов серы) анализ соответствует формуле C97Hi3oN2iO2.iS4.

Пример 9. Смесь 130,8 мг хлоргидрата антибиотика ЕМ-49, 1 мл н-бутанола, 1 мл метилэтилкетона , 0,2 мл 1 М раствора 2,4 динитрофторбензола в толуоле и 2 мл 10% раствора бикарбоната натри  перемешивают при

комнатной температуре в течение 1,7 час. Верхнюю фазу отдел ют, а нижнюю фазу промывают несколько раз этилацетатом. Соедин ют верхние фазы, а промывные жидкости и растворители удал ют под вакуумом. Остаток раствор ют в минимальном количестве метилкетона, осадок удал ют центрифугированием и отбрасывают. Верхний слой обрабатывают досуха в потоке азота. Остаток раствор ют в небольшом количестве ацетона,

и продукт осаждают добавлением бензола. Твердое 2,4-динитрофенилпроизводное промывают несколько раз бензолом и высушивают под вакуумом. Получают 36,1 мг желтого порошка. Анализ с использованием тонкопленочной хроматографии на силикагеле после элюировани  смесью метанола с хлороформом (1:9) дает одно чистое п тно (Rf 0,51). Материал подвергают очистке с применением тонкослойной хроматографии и такой же системы растворителей. Собирают желтую ленту с величиной Rf 0,52-0,68. Продукт вымывают из силикагел  смесью ацетона и метанола (1:1) и превращают в порошкообразное состо ние (30,4 мг) осаждением из ацетонового раствора бензолом. УФ-спектр поглощени  в метилэтилкетоне дает Хмакс 352 ммк, . Образец высушивают при 100°С и давлении 0,02 мм рт. ст. и довод т до посто нного веса атмосферной влагой.

И

Найдено, %: НгО 1,04; С 52,02; Н 6,13; N 16,61; О 25,24% (по разнице). Дл  молекул рного веса 1744 это соответствует эмпирической формуле CreHiosNgiOj Пример 10. 1,00 г порошка, не растворимого в ацетоне, полученного по методике, описанной в примере 5, раствор ют в 10 мл воды . Нерастворимую часть удал ют центрифугированием , промывают 10 мл воды и промывные жидкости соедин ют.

1,00 г метилоранжа суспендируют в 15 мл воды. Добавл ют 5 мл диметилформамида, и смесь нагревают до растворени  метилоранжа . Этот теплый раствор добавл ют к раствору антибиотика ЕМ-49. Смесь охлаждают до комнатной температуры, и осадок выдел ют центрифугированием, промывают трижды по 35 мл воды и высушивают под вакуумом .

Неочищенный гелиантат раствор ют в 3 мл диметилформамида и нерастворившуюс  часть удал ют центрифугированием, промыва  ее дважды по 3 мл диметилформамида. Соединенные растворы диметилформамида соедин ют с 90 мл воды, осадок выдел ют центрифугированием и промывают трижды по 30 мл воды.

Гелиантат антибиотика ЕМ-49 представл ет собой аморфное вещество, которое можно очистить перекристаллизацией из смеси метанола с ацетонитрилом (2: 1). Полученный продукт высушивают под давлением 0,02 мм рт. ст. и 100°С в течение 18 час, а затем довод т до посто нного веса атмосферной влагой. Температура плавлени  в гор чем состо нии по Кофлеру: 242-244°С (с разложением ).

Найдено, %: С 53,01; Н 6,74; N 14,19; S 5,44 (вода 5,05%). Дл  молекул рного веса 2238 элементарный анализ соответствует

эмпирической формуле Cio4Hi44N24O24S4.

Гелиантат антибиотика ЕМ-49 превращают в хлоргидрат перемешиванием с 10 мл 0,36 Н. раствора сол ной кислоты в течение 20 мин. Нерастворимый материал удал ют центрифугированием и промывают дважды по 5 мл 0,36 Н. раствора сол ной кислоты. Соединенные верхние слои жидкости затем перемешивают с 320 мг активированного угл  марки «Дарго С-60 и фильтруют через диатомовую землю с образованием почти бесцветного раствора.

Фильтрат экстрагируют дважды по 10 мл н-бутанола. После удалени  бутанола под вакуумом получают аморфное твердое вещество . Это вещество превращают в тонкоизмельченный порошок растворением в небольшом количестве метанола, добавлением этилацетата до осаждени  антибиотика с последующим удалением смеси растворителей под вакуумом. Порошок затем высушивают при 50°С и 0,02 мм рт. ст. в течение нескольких, например п ти, часов, а затем подвергают воздействию атмосферной влаги в течение ночи.

12

Пример И. Раствор 500 мг хлоргидрата: антибиотика ЕМ-49, полученный по методике примера 10, раствор ют в 5 мл воды и хроматографируют на колонне размером

2,5X60 см, заполненной целлюлозой марки «Ватман СМ-52 (натриева  форма карбоксиметилцеллюлозы ), выдерживаемой при 50°С, со скоростью потока 75 мл в час. Колонну элюируют 0,15 Н. раствором хлористого натри , собира  600 небольших фракций (примерно по 24 мл). Размер вытекающих фракций определ ют по поверхностному нат жению , так как антибиотики снижают поверхностное нат жение так, чтобы стекающие с

посто нной скоростью фракций, содержащие антибиотики, имели уменьщенный объем. Зависимость объема фракции от всего объема алюированного антибиотика - обратна . Элюирование продолжают (примерно 161) до

элюировани  трех веществ, названных ЕМ-49 альфа, ЕМ-49 бета и ЕМ-49 гамма. Колонну затем элюируют 0,2 н. раствором хлористого натри  дл  элюировани  четвертой фракции, показанной на графике поверхностного нат жени , обозначаемой ЕМ-49 дельта.

Фракции, содержащие, соответственно, ЕМ-49 альфа, бета, гамма и дельта соедин ют . Каждую фракцию экстрагируют 50%

(от ее объема) н-бутанола. Бутанольные экстракты промывают дважды равными объемами 0,36 н. раствора сол ной кислоты, а затем упаривают досуха.

Каждый из перечисленных остатков раствор ют в метаноле, осаждают этилацетатом, промывают этилацетатом и эфиром, высушивают при 75°С и 0,02 мм рт. ст. в течение 1,5 час, а затем подвергают воздействию атмосферной влаги дл  равновеси , оставл   на

ночь.

Анализ каждой фракции, полученной в виде хлоргидратов, показал следующие результаты (табл. 1).

Образцы фракций ЕМ-49 альфа, бета, гамма и дельта подвергают гидролизу в 6 н. растворе сол ной кислоты при 110°С в течение ночи . Каждый гидролизат экстрагируют эфиром с целью удалени  жирных кислот. Остаток примен ют дл  анализа аминокислот. Аминокислотный анализ фракций показал, что фракции ЕМ-49 альфа и бета отличаютс  от фракций ЕМ-49 гамма и дельта по остаткам амипокислот следующим образом

(табл. 2).

ИК-спектры каждой из перечисленных фракций изображены соответственно на фиг. 5-8. Кажда  така  фракци , так же как

и хлоргидрат антибиотика ЕМ-49, растворима в воде, метаноле, этаноле, диметилсульфоксиде и уксусной кислоте и не растворима в ацетоне, этилацетате, эфире и ацетонитриле. Кажда  из этих фракций образует соли такого же типа,, как антибиотик ЕМ-49.

Таблица 1

Мол. вес и брутто-формулы приведены в расчете на безводные вещества. Таблица 2 Остаток на молекулу 2,4-Диаминомасл на  кислота. Эфирные экстракты гидролизатов содержат жирные кислоты, отщепл емые из антибиотика . Их обрабатывают диазометаном с образованием сложных метиловых эфиров. Полученные метиловые эфиры оценивают методом газовой хроматографии. Жирные кислоты, выделенные из фракции ЕМ-49 альфа, отличаютс  от жирных кислот, выделенных из фракции ЕМ-49 бета, а жирные кислоты, выделенные из фракции ЕМ-49 гамма, отличаютс  аналогичным образом от фракции ЕМ-49 дельта. Две фракции ЕМ-49 альфа и бета можно отличать от фракций гамма и дельта по небольшому иику при 696 в ИК-спектре последней пары фракций, что характеризует присутствие остатка фенилаланина. Аналогично УФ-спектр дл  нары фракций гамма и дельта имеет характерный пик поглощени , свойственный остатку фенилаланина, между 245 и 270 ммк и такой характерный рисунок спектра отсутствует в спектре поглощени  ультрафиолетовых лучей дл  пары фракций альфа и бета. Пример 12. 70 г порощка, не растворимого в ацетоне, полученного по методике, описанной в примере 5, экстрагируют дважды по 200 мл воды (рН 7,5) и бутанолом. Водные слои, не обладающие антибиотическими свойствами, отбрасывают. Бутанольные слои соедин ют и экстрагируют 4 раза по 200 мл воды, насыщенной бутанолом при рН 1,0. Соединенные водные экстракты содержат наибольщее количество активного материала, состо щего из антибиотика ЕМ-49 и малоподвижной фракции (МПФ). Водный экстракт концентрируют под вакуумом до состо ни  сиропа и осаждают ацетоном. Вес полученного порошка, не растворимого в ацетоне, составл ет примерно 15 г. Антибиотик ЕМ-49 и малоподвижную фракцию сначала грубо раздел ют растворением 15 г твердого вещества в 30 мл метанола и пропусканием этого раствора через колонну, заполненную диэтиламиноэтилцеллюлозой (4,5X60 см) в метаноле. После окончани  выхода из колонны окрашенного раствора элюируют МПФ 2%-ным раствором уксусной кислоты в метаноле. Собирают фракции объемом примерно 50 мл до прекращени  вытекани  из колонны активных веществ, что определ ют испытанием с применением дисков в отношении Е. соН (SC2927) на агаровых пластинах. Фракции затем подвергают анализу посредством тонкопленочной хроматографии на листах из кремневой кислоты по Гельману с применением системы растворителей: бутаНОЛ : изомасл на  кислота : пиридин : вода (40 : 9 : 4 : 10), а также биологически на агаровых пластинах, засе нных Е. соИ. Фракции, содержащие МПФ (Rf 0,15), соедин ют и концентрируют досуха с получением примерно 5 г. Это твердое вещество затем подвергают распределительной хроматографии на смеси кремневой кислоты с целлюлозой (2 : 1 по весу, размер колонны 3X60 см) с применением того растворител , что при тонкослойной хроматографии. Па этой колонне происходит разделение фракций ЕМ-49 и МПФ, их подвергают анализу путем тонкослойной хроматографии. Снова соедин ют нужные фракции и. упаривают их досуха, получа  приглерно 300 .vtr остатка. Дл  дальнейшей очистки соединени  операцию распределительной хроматографии повтор ют. Образец раствор ют в смеси ацетона и метанола (1:1) и пропускают через колонну с «Сефадексом Ln 20, которую пропитывают и заполн ют тем же растворителем. При про влении тем же растворителем можно заметить отдельные полосы. МПФ не вытекает с первыми порци ми растворител . Фракции снова

15

подвергают анализу путем тонкослойной хроматографии и фракции, расположение п тен у которых соответствует МПФ, соедин ют и упаривают досуха. Обпдий выход составл ет примерно 150 мл. Продукт имеет желтый цвет, не плавитс  до 310°С, от 270°С измен ет цвет до коричневого.

Кристаллическую соль Рейнеке этого образца получают растворением 100 мг готового продукта в 5 мл воды, после чего довод т сол ную кислоту до рН 2-3. Затем добавл ют по капл м насыщенный водный раствор рейнеката аммони  до прекращени  выделени  осадка. Жидкость центрифугируют, и осадок промывают однократно 5 мл воды. Затем осадок высушивают и перекристаллизовывают из 50 мг смеси ацетона с гексаном. Кристаллический рейнекат МПФ представл ет собой порошок красного цвета, не растворимый в воде, но хорошо растворимый в ацетоне и метаноле. Он не дает четкой температуры плавлени , но разлагаетс  при 198-200°С. Испытани  на цветные реакции показали следующие результаты: нингидрин (-), антрон (-), гидролизат на нингпдрин (-f).

Антибиотик ЕМ-49 МПФ показывает конечную абсорбцию в УФ-спектре (см. фиг. 9).

Найдено, %: С 50,46; Н 6,47; N 11,69, нейтральный эквивалент 584.

Дл  молекул рного веса 12000 элементарный анализ соответствует формуле

C5oH76NioO24Гидролизат получают гидролизом 2,012 мг антибиотика в 6 мн. растворе сол ной кислоты при 110°С в течение 17 час и подвергают анализу на содержание аминокислот, которые присутствуют в следующих количествах, моль:

2,4-Диаминомасл на  кислота 1,74 NH4OH1,01

Треонинследы

Серии0,84

Глутаминова  кислотаследы

Алании0,51

Валин0,82

Лейцин0,45

Фенилаланнн0,47

Тирозинследы

Кристаллический рейнекат антибиотика ЕМ-49 МПФ имеет температуру плавлени  198-200°С (с разложением), а УФ-спектр имеет максимум поглощени  при 240 ммк (Е1« 450) и 315 ммк ( 350).

16

Полученный рейнекат не растворим в воде и растворим в ацетоне и метаноле.

Пример 13. Двухкратные испытани  на разбавление в пробирках дл  некоторых микроорганизмов дали следующие результаты. Антибиотик ЕМ-49 примен ют в данных опытах в виде хлоргидрата, и его чистота соответствует светло-бурому порошку, описанному в примере 6 (табл. 3). ТаблицаЗ

Staphylococcus aureus ГДА 209Р Streptococcus pyogenes С 203 Esherlchia coil АТСС 10536 Esherlchla соН SC 8294 Pseudomonas aeruginosa SC 8329 Candida alblcans SC 5314 Candida krusel SC 2616 Saccharomyces cerevlslae SC 1600 Asperglllus niger SC 2828 Fusarlum bulblgenum SC 5273 Trichophyton mentagrophytes SC 26 Trichomonas vaginaHs SC 8660

Организмы из коллекции культур Сквибба.

Пример 14. Дл  испытаний in vivo мышам ввод т внутрибрюшинно 100 доз LDso Streptococcus pyogenes С203. Испытани  показали , что выжило только 50% мыщей при введении всего 120 мг/кг антибиотика ЕМ-49 в виде хлоргидрата подкожно в два приема:

через 1 час и через 5 час после заражени . В контрольной группе мышей, не получавших антибиотика, выживших мышей нет.

Пример 15. Аналогично, при введении мышам внутрибрюшинно 500 до LDso штамма микроорганизма Esherichia coli SC 8294, суспендированного в 5% муцина, выделенного из свиного желудка, 50% мышей выжило при подкожном введении антибиотика ЕМ-49 в виде хлоргидрата в количестве 50 мг/кг

через 1 час после заражени . Все мыши, не получившие антибиотика, погибли.

Пример 16. Испытани  па двукратное разбавление в пробирках с указанными микроорганизмами дали следующие результаты (табл. 4).

Предмет изобретени 

Способ получени  антибиотика путем культивировани  культуры Bacillus circulans в аэробных услови х, в водной питательной среде , содержащей источник углерода, азота и минеральные соли, с последующим выделе4W J500

нием целевого продукта из фильтрата культуральной жидкости и хроматографическим разделением его на активные компоненты, о тличающийс  тем, что в качестве продуцента целевого продукта используют штамм Bacillus circulans АТСС 21656. 2000 1800 то Viiz.l 1UOO то woo SOO 62Ь 1600 шо то

9 10 12 15 20 3D +050