CS231157B2 - Processing method of klavulan acid and corresponding salts and esters - Google Patents

Description

(54) Způsob výroby kyseliny klavulanové, odpovídajících solí a esterů

Způsob výroby kyseliny klavulanové, odpovídajících solí a esterů obecného vzorce I

ОДОН (I) vyznačený tím, že se kultivuje kmen Streptomyces clavuligerua ne živném prostředí e obsahem zdrojů dusíku a uhlíku, jekož i s obsahem nezbytných mnoHáních solí, a to aerobně za teploty 15 . až 40 ^C. obvykle 20 až 35 °C a . s výhodou 25 až 30 °C a za hodnoty pH 5.ež 8,5, s výhodou 6 až 7,5, načež ee izoluje z kultury kyselina klevulanová nebo její sůl po filtraci buněk extrakcí filtratu kiUtury do rozpoužtSďla po úpravě . pH do kyselé oblasti, nebo absorbováním produktu na uhlí, vysrážením, vysolením, nebo molekulární filtrací, načež se případně kyselina . ktavulanová nebo její sůl převádí esterifikací diezoalkmeem o 1 až 12 atomech ulhlíku nebo alkoholem obecného vzorce

R - OH a popřípadě se ester sloučeniny obecného vzorce I, v němž R znamená zbytek alkoholu, hydolyzuje.

Předložený vynález se týká způsobu výroby kyseliny klavulenové, odpovídajících solí • esterů, totiž nového Mtibatterlálo* působícího činidla, jež bylo isolováno ze Streptomyces 'clavuligerus. Tato nová sloučenina, jež byla pojmenována kyselina klavulaoová, má strukturní vzorce I

ČOOH

(I)

Kromě toho, že se kyselina klavulanová vyznačuje Širokým spektrem aOtibiotické účinnosti střední moohunoosi, má tato kyselině i její soli a estery schopnost zvySovab účinnost beta-laktmových antibiotik proti četným bakteriím, produkujícím beta-lakaamasu.

Strepoomyces claculigerus popisuje detailně Hggana * spii, v Int. J. Systém. Bscteriol. £21, 326 . (1971). Tento streptomycet je zajímavý, protože produkuje některá beta-lakeamová antibiotika, jako je penOcilío N, kyselina 7-(5-<mino-5-karboxyvaleramido)-3-karbamoyloxymethyl-3-cefem“4-karboxylová a kyselina 7-(5“^mino-5-karboxyvaleraeidt)-Зkkarbмюyloxyeethyl^-metboxy^-cefem-^-karboxylová. Uvedený strepoomycet je uložen ve sbírce Reseerch Service СоИтЬ^о pod označením NRRL 3585, a ve sbírce Americen Type Culture Ccnecti-oo pod označením ATXX 27064. Streptomyces tlav1ligerus je rovněž uváděn v americkém patentovém spise 3,770.590, a zmiňují se o něm Negacejan a spoo., J. lamp. chem. Soc. 23» 2308 (1971); Branoon a spoo. Antimicrob. Agenta Chhemohhe., J, 237 (1972), a £ , 247 (1972), dULe H.ggeos a spolu J. AOibbotlca £2, 298 (1974).

Jako betb-lakbebsy jsou označovány enzymy, otevra jící beta-akkamový kruh penicilinů a cefbltsporioů za vzniku produktů, prostých anltlbacteriCLoí účirnioisi· Tyto enzymy vznikají v četných mikroorganismech, zvláětě v kmenech či druzích Ke^acHa, Próteus,

Paeudteono8, E^t^<^nrobi^<^1te:r a Staphylttott1b, a v četných případech lze takto vysvěttit rezist^ci některých organismů či kmenů na některé penOcilioy nebo cefalospori^oy. Dllžžtost vzniku betb-lakbmbsy lze poc^i^oo^pit, před^tavím^ei^i _ai, ge vysoký podíl klinicky isolovaných mikroorganismů produkuje beta-lakaimasy, viz například M. Wilson a I. A. Pre^mao, BbCeritltа!^! Proceedlngs 196*9, str. 80. Tamže v článku, nadepsaném PenOiHlio ^ь^-уь^о by Gгмmnoegbive Bacili je dokazováno, že 84 % z gram-noeabivních mikroorganismů, isolovaných v aeerických nemoonOiích, produkuje betb-lakbaeas1.

V četných případech se ukazují být některé peniciliny a tefblt8porioy' neúčinným! při léčbě oemooc, připisovaných oa vrub eikrttrganieπům, neprodukujícím betb-lakbaebs1, a to v důsledku ko-iofekce působením . mikroorganismu, produk^ícího betb-lakbembs1, viz například K. May a spoo., Urit. J. Dis. Cheet. 66. 185 (1972). KoιDeiinate látky, iohibující beta-laktamasu, s penici-innem nebo cefblosptгnnee může vést podle očekávání k ochraně posléze uvedených před odbouráním bakteriální beterlaktmaaou, čímž se zvyšuje jejich antibekteeriáloí účinnost pro 1ti četným infekčním trgaoιiemům.

Tento způsob zvyšovaní antibakterieloí účionoosi se nazývá syne^i-smus, pokud antibakterieloí účinnost použité kombinace je patrně vyěěí ve srovnání s J·aIotí1uchým součtem účinnootí obou dvou oddělených látek. Složka směsi, iohibuuící be ^-18^^^8^ se označuje jako syna^^ky působbcí složka a takové látky jsou velmi ceněny se zřetelem oa zvyšování antibakteriáloí účionooti . penicilinů a tefblosptrioů proti ™8ΐ81βηΟ^ trganiemůe. Jedním předmětem tohoto vynálezu je způsob výroby takové s^e^ický účiooé složky.

Příklady pouužtí některých polysynthetictýth penOcilioů a cefblosptrioů_> resisteotoíth proti úěinkům . betb-laкbeasy, a to jako inhibitory beta-lakamasy a alergický účinné složky penicilinů a cefalosporinů byly již v literatuře popsány, viz například Sutherland a sppo., Nátuře 201. 868 (1964); Sabsth a apoo., Nstwre 204. 1066 (1964);O'Callbghbn a spoo., AiOim^c^rob. Agenta and Cheimoherapy #7, 1968 (1969). kle Žádné z těchto zná^ch činidel se ne vyznačuje sUým vlivem na spektrum dalších antibiotik, přítomných ve smsi.. Byly popsány něktaré kultury antimomycetů jako produkující látky, inhibující bets-lakamasu, působící synergicky s peniciliny nebo cefalosporiny, například kultury, popsané v briSském patentovém spise 1,363.075 a ty, které popsal Hsta a spoo., J. AnH-bi-otics 25. 473 (1972) a Urnmzswa a epoo., J. AnUbiotics 26» 51 (1973).

V žádném z těchto případů inhibitorů beta-laktmasy aktinomycetového původu nebylo zjištěno klinické poouití. Zvláště pozoruhodnou skutečnootí se zřetelem na odlišení kyseliny klαlulαnové od ostatních inhibitorů betα-laktamαsl tStinomycetovéht původu je moonoot extrakce do organických rozpouštědel z filtrátu kultury, okyseleného na pH 2, dále vysoká stabilita kyseliny kla^l^ové v lidské krvi a její široké spektrum antibtkSerilLoí účinnosti, jakož i účluoU se zřetelem na inhibtlání bett-laktamasy, . malá molekulová váha, . jakož i vysoké hodnoty Rf při na papíře za pouuití četných soustav rozpouštědel.

Bylo nalezeno, že aerobním ^Ι^νον^ι^ Strepoomyces claluliglrus v běžném živném prostředí za teploty asi 25 až 30 °C přibližně v neutrálním prostředí vzniká látka, inhibuuící beta-lakamasu, vy znající se rovněž tltiSakSeгilLoí účinnosí. OozoSčIí jsme tuto látku názvem Slalulaotlé kyselina; má tyto vlastnosti:

a) je to karboxylové kyselina, ‘

b) tvoří sodnou sůl s clhraktlrisiisУým infrаčevlOJlým spektrem, jak je v poddtatě na vyobr. 1.

c) může -οΚ^^β! růst kmenů Staphylococcus aureus,

d) je chopná a^ergiso^! tntibakSerilloí účinnost amiociinu pro 1ti kmenům Escherichis coli, K^esieUa aerogenes a Staphylococcus aureus, produkujícím beta-lakaamasu,

e) je chopná tylergistlat tntiStkSerilLoí účinnost ceftLtridiou proti .kmenům Próteus a Sta^ylo^^^ aureus, pridukujícím bett-laktmasu,

f) tvoří mH^j^l(^É^1te:r o molekulové hmotnotti 213,06 (dle hmotového spektra), což je v souladu s vzorcem CgH^O^N.

Lze tedy pokládat klalultolovou kyselinu za jednosytoou karboxllolou kyselinu uvedeného vzorce, tvořící sodnou sůl, jejíž infračervené spektrum je připojeno na výkresu.

Sloučenina, kterou produkuje Streptomlces cltluliglrus, a jež má výše uvedené. vlastnosti má strukturní vzorec II

COOH ch₂oh (II)

Lze tedy kyselinu kltlultnovou pojmenovat jako kyselinu 3-(Setα-hydrtxyethylideo)-7-txt-4-oxa-1-azabicyklo(3,2,0)-hepttn-2-ktτbtxylolOU.

Stereochemie na uhlíkových atomech v polohách -5- a -2- kyseliny klavulamové je stejná, jako u přírodních penicilinů a cefaloaporinů, takže přesněji lze kyselinu klavulanovou vyznačit strukturním vzorcem I

CH₂OH (I)

COOH

Takže přesné označení kyseliny klavulaniové v tomto smyslu zní kyselina Z-(2R,5R)-3-(beta-hydroxyethyliden) -7-oxo-4-oxa-1-azabicyklo(3 »2,0)heptan-2-karboxylová. ’

Velkou použitelnost kyseliny klavulanové lze snadno vyhodnnttt z toho, že v případě některých kmenů Klebbiella aerogenes A, jejichž růst není inhibován přítomnootí ampicilinu, amxycillnu, karboní-cilinu nebo benzylpinicil·Ciu v mnoitví 125/cg/iil nebo přítomnotí yg/ml klavulanové kyseliny, dochází k inhibování růstu za přítomno ti méně než 12,5ζ^/ρ1 některého z výše uvedených p^x^l^c^ili^i^ů, pokud je rovněž přítomná kyselina Havranová v miožtví 5/ug/ml. - ' j

Podobné výsledky byly pozorovány pro kombinace, obsahující četné různé estery kyseliny klavulanové. Nappíklad u kmenů Klee^ella aerogenes A, jejichž růst není inhibován ampiecci- · nem v miožtví 125 /ug/ml, nebo ρρΙϊ^Ιι^ιγορ kyseliny klpuuiιnlouá v mí^tv! 10yg/ml, dochází k inhCbování dávkou pod 12,5 jjg/ml p^píccICíu za současné přítomnooti 5 /ug/ml methylesteru kyseliny Havranové. Bylo rovněž zjištěno, že v případě kmenů Staphyltcticui aureus RjssU, jejichž růst není CnhCbován přítomnotí 100 yg/ml ippí-ci-íu nebo přítomno ti ^íggrnm kksseiny kkavujlnooé, ddocááz к inhibooórn růssu za ppítomioti ppo 1 Oyug/pm ζιψΡcilinu za současné přítomnost O hg/ml kyseliny Havranové. Při testech na samičkách myší bylo zjištěno, že hladiny kyseliny Havulanové v krvi a ve tkáních podstatně nad 5 /ug/ml lze snadno dosáhnout subkutánním podáním 100 mg/kg sodné soli kyselCny Havulpnové, a že použitelná hladina kyseliny klavulanové se dá dooHit orálním podáváním ' sodné soli kyseliny klavulanoué v miíožtví 100 mg/kg.

Podle toho je předmětem tohoto vynálezu způsob výroby kysel-ny Havjl-finové, odpovídajících solí a esterů.

Předmětem vynálezu je způsob výroby kyse^Cny klauuipntué, tdpioUddaícícá solí a esterů obecného vzorce I

(I) ··* kde

R znamená atom vodíku, Ιι^ι, například sodný, draselný, hořečnatý, hlinitý, amontový nebo substijuoviný amontový, jako je kat-on trimethylamonCouý, kat-oi odvozený od benzatáCnu, prokaCnu a podobných solí, které obvykle tvoří peniciliny a dále kat-oí lihný nebo stříbrný, dále R znamená iHylovou skupinu s O až 12 atomy uhlíku, případně subetijuovarnou halogenem, fenylovým zbytkem, nCtrolinyloutu'skupinou, ·lkoxyflnylouou skupinou s O až 3 atomy uhlíku v αil:txslovém zbytku, feíyialkoxyflnyltvou skupinou s O až 3 atomy uhlíku v aHoxylovém zbytku, hploglnfeíylouou či pyT-dstovou skupinou, naftytovým zbytkem, případně substijtuvnýp metátxyltutu skupinou, dále anthracernylovým zbytkem, alkoxylovou skupinou s 1 až 4 atomy Uh.íku, případně dtiLa sui8tiUoouanou fenoxyskup-nou nebo benzsloxyilupinou, dále allylthto81ulpilltu s O až 4 atomy uhlíku, aikαntyiouou skupinou s O až 4 atomy uhlíku nebo íiízosíovou skupinou, aminostaipinou, případně dále substituovanou alkylovou skupinou s 1 až 4 atomy uhlíku nebo bsnzyloxykarbonylovou skupinou, dá· karboxylovou skupinou, případně v· formě s>H nebo esteru, dále acyloxylovou Skupinou s 2 až 5 atomy uhlíku, fenylsulfonylovou nebo nitrilovou skupinou, ftalimidoslupinou nebo N-benzoxyzolonylovou skupinou, posléze alkoxykarboxnrloxylovou skupinou s 1 až 4 atomy uhlíku, kde dále R znamená nižší alkenylovou skupinu s 2 až 4 atomy uhlíku nebo nižěí alkinylovou skupinu s 2 až 4 atomy uhlíku, cyklostylovou skupinu s 3 až 7 atomy uhlíku, fenylovou nebo ftalidylovlu skupinu, poslední případně su^^tiu^c^i^an^ou methoxylovým zbytkem, vyznačený tím, že se krutivuje kmen Straptomrcas clavuligerus na živném prostředí s obsahem zdrojů dusíku a uhlíku, jakož i s obsahem nezbytných minerálních solí, a to aerobně za teploty 15 *ž 40 °C, obvykle 20 až 35 °C a s výhodou 25 až 30 °C a za hodnoty pH 5 až 8,5, s výhodou 6 až 7,5, načež se izoluje z kultury kyselina klavulanová nebo její sůl po filtraci buněk extrakcí filrrátu kiltury do rozpouštědla po úpravě pH do kyselé obXlaaS'!, nebo absorbováním produktu na uhlí, vysrážením, vysolením, nebo mooeJkrlární' filtrací, načež se případně kyselina klavulanová nebo její sůl převádí esterifikací diazoalkarnem o 1 až 12 atomech uHIíku nebo alkoholem obecného vzorce

R - OH kde

R má svrchu uvedený význam, či thiolem za přítommoti činidla, usnaduujcího koaddnnzci, na lipovídiajcí ester, nebo se působí na sloučeninu obecného vzorce I, kde R znamená některý z uvedených kationtů, sloučeninou obecného vzorce kde

R má svrchu uvedený význam a

Q znamená zbytek, který se při této reakci snadno odštěpí a nahradí, jako je atom chloru, bromu nebo jodu či zbytek esteru sulfonové kyseliny, jato je zbytek methiamulf onové kyseliny nebo p-toluensulfonové kyseliny, nebo to je aktivní esterová skupina, jako je skupina formylová nebo trifuuoracetylová, a popřípadě se ester sloučeniny obecného vzorce I, v němž R znamená zbytek alkoholu, hydrolyzuje.

Jako nejvhodiější soli kyseliny klavulanůvé lze uvést farmaceuticky přijatelné soli, jako jsou soli sodíku, draslíku, vápníku, hořčíku, hliníku, sůl amonná a aminů, jako je trimethyl amin, benzathin, prokain a podobné soli, jak se obvykle připravují v případě penicilinů a cefcllsplriěů. Do rozsahu tohoto vynálezu spadají rovněž farmaceuticky nezpůsobilé soli kyseliny klavulanové, pokud jsou vhodné jako meeiprodukty pro přípravu esterů kyseliny klavulanová, tedy například sůl liUrná nebo stříbrná, kterou lze pouužt při reakci s benzylbromidem za vzniku použitelného benzylesteru kyseliny klavulanové.

&>li kyseliny klavulanová jsou zřetelně stálejží ve srovnání s odp^^íd^jcí volnou kyselinou jako takovou, takže tvoří výhodný předmět postupu podle tohoto vynálezu. Mezi zvláště výhodné soli krajiny klavulanové patří sůl sodná ' a draselná, tedy sloučeniny vzorců III a IV v tom kterém případě

COOK

(III)

Krystalické formy těchto solí mohou obsahovat krystalickou vodu, liazi vhodné «starý kyseliny klavulanové patří látky, ktaré lza odvodit od takových alkoholů, jako ja methanol, athanol, propanol, butanol, 2,2,2-trichlorethanol, 2 ,2,2-trifluorethanol, benzylalkohol, p-nitrobenzylalkohol, fenol, acetoxymethanol, pivaloyloxymethanol, 2-dimethylaminoethanol a další běžné alkoholy. Četné různé estery kyseliny klavulanové jaou vhodnými meziprodukty při čistění této kyseliny, a četné estery kyseliny klavulanové jsou použitelnými synergicky působícími látkami. Účinnoat těchto esterů pochopitelně může být podmíněna jejich hydrolysou za vzniku matečné kyseliny.

Výraz ester, jak je zde použit, obvykle zahrnuje estery, odvozené od alkoholů nebo thiolů obecného vzorce ROH nebo RSH, kde R znamená organický zbytek. Jako vhodná významy pro symbol R lze uvést skupiny alkylové, alkenylové, alkinylové, arylové, arylalkylové a další podobné skupiny, z nichž každá může být substituována, je-li to vhodné. Se zřetelem na nevhodnost zvyšování molekulové váhy nad únosnou míru obsahuje skupina R obvykle do 16 atomů uhlíku, lépe do 12 atomů uhlíku, a nejvhodněji nejvýše β atomů uhlíku.

S výhodou je skupina R odvozena od alkoholu obecného vzorce ROH, nebo méně vhodně od thiolu obecného vzorce RSH, pol$ud jsou tyto látky farmaceuticky přijatelné.

Jako vhodné substituenty ve skupině R přicházejí v úvahu atomy halogenů nebo nižší alkoxylové skupiny, dále hydroxylové skupiny, nižší acyloxylové skupiny, nižší alkylaminoskupiny, nižší dialkylaminoskupiny a podobné·

Výrazem “nižší se míní skupiny, obsahující až do 6 atomů uhlíku, s výhodou 1 až 4 atomy uhlíku, a tedy může znamenat například R skupinu methylovou, ethylovou, n-propylovou, isopropylovou, přímou nebo větvenou skupinu butylovou, pentylovou, neptylovou, oktylovou, nonylovou, decylovou, undecylovou, dodecylovou, dále skupinu vinylovou, allylovou, butenylovou, cyklopropylovou, cyklobutylovou, cyklopentylovou, cyklohexylovou, cykloheptylovou, cyklohexenylovou,ccyklohexadienylovou, methylcyklopentylovou, methylcyklohexylovou, benzylovou, benzhydrylovou, fenylethylovou, naftylmethylovou, fenylovou, naftylovou, propinylovou, tolylovou, 2-chlorethylovou, 2,2,2-trichlorethylovou, 2,2,2-trifluorethylovou, acetylmethylovou, benzoylmethýlovou, 2-methoxyethylovou, 2-dimethylaminoethylovou, 2-diethyleminoethylovou, 2-piperidinoethylovou, 2-morfolinoethylovou, 3-dimethylaminopropylovou, p-chlorbenzylovou, p-methoxybenzylovou, p-nitrobenzylovou, p-brombenzylovou, m-chlorbenzylovou, 6-methoxynafty1-2-methýlovou, p-ohlorfenylovou, p-methoxyfenylovou, nebo jakoukoli podobnou skupinu, jakož i ty skupiny, které jsou známé na úseku penicilinů a cefalosporinů pro přípravu esterů, o nichž je dáleAsnámo, že se snadno hydrolysují in vivo za vzniku matečných antibiotik.

M«zi snadno hydrolyeující estery patří, ale výčet tím není jakkoli omezen, látky obecných vzorců V а VI

CO ^Xo-CH-Z

I I (V) (VI)

23Π57 kde Aj znamená vodík, alkylovou, arylovou nebo aralkylovou skupinu, Ag znamená vodík nebo methylovou skupinu, Aj znamená alkylovou, arylovou nebo aralkylovou skupinu, X znamená kyslík nebo síru, X znamená tyzlík nebo síru a Z znamená dvojvaznou organickou skupinu. Estery obecných vzorců V a VI, ze kterých es snadno uvolňuje klavulanová kalina v krvi po podání těchto esterů, jsou takové látky, kde A^ znamená vodík, Ag znamená vodík nebo methylovou skupinu, a Aznamená methylovou, ethylovou, propylovou, butylovou, benzylovou nebo fenylovou skupinu, jakož i ty, kde X znamená tyslík, X znamená kyslík a Z znamená skupinu

-CHg-CHg- nebo -CH=CH-, dále

Při použití ve spojitosti s výše uvedeiým obeciým vzorcem znamená výraz alkylová skupina takový zbytek ai do šesti atomů uhlíku, výraz arylová skupina znamená fenylový či naftylový zbytek, případně fenylovou skupinu, substituovanou inertním substituentem, jako je fluor nebo chlor, methylová či methooqylová skupina atd, a výraz aralkylová skupina znamená alkylovou skupinu, subзtituovβnou arylovým zbytkem.

Zvláště vhodnými estery obecných vzorců V a VI jsou sloučeniny obecných vzorců VII a VIII

(VII)' (VIII) kde Aa znamená vodík nebo methylovou skupinu, A^ znamená skupinu methylovou, terč.-butylovou nebo fe^l^ou, a Ag znamená vodík nebo methoxylovou skupinu.

Miohé estery kyseliny kla^l^ová se liší od obdobných esterů pwiicilinů a cefalosporinů potud, ie se vyznačují zvýšenou schopnootí hyfrolysovat se za mírných podmínek za vzniku kyseliny klavulanové. Tak například jednoduché alkylestery, jako je meethyester kyseliny klavulanová, se hydroHysují na kyselinu kla^l^ovou ve vodě, pufrováně na pH 7. Mezi estery, které se h^<^x^c^ol^i^i^;^:í ' za mírných podmnek, patří ts,kteoě spadají do rozsahu obecného vzorce IX

COOR¹

CH₂OH (IX) kde ^R' znamená uhlovodíkovou etopinu a 1 až 9 atomů uhlíku, případně substituovanou halogenem, nižší alkoxylovou skupinu či hydroxylovou skupinou, nebo případně bázickými stopinami o^becnýc^h vzorců ^nr2r\ ^řevei^ita^^Uý^^L do formy solí, toe ^r2 znamená vodík nebo nižSÍ alkylovou skupinu, rJ znamená vodík nebo nižší alkylovou skupinu, nebo se váže R² a ^r2 tak že ^sku^pin^a -KR^2r2 dohromady tvoří pět^lexrný ne^bo šestl-ČÍlemý cyklus.

Při pouužtí v ao^^^ÍL^l^<^i^1ti s obecným vzorcem IX znamená výřez ' nižší skupinu s jedním až čtyřmi atomy uhlíku.

Stopina ^r1 zahrnuje v^hodn^a a^lkylově s sralky^ově skupiny, ^případně substituované halo genem, mmthoxylovou, hydroxylovou skupinou nebo seskupením obecného vzorce NR RJ převeditenýfa do formy soli, kde R² znamená methylovou nebo ethylovou ekupinu a rJ znamená

1 2 1 methylovou nebo ethylovou skupinu, nebo je R^c i RJ vázána na dusik, takže seskupení NR R^J tvoří pyrrolidinový, piperidinový nebo morrolinový cyklus.

Nejvhod^ji tvoří alkylové stopiny ^r1 pHmý řettaec a^ž do Šeeti atomů uhlíky př^ípadn^a su^t^novaný mmH^^l^^ hydroxylovou stopino^ ne^bo sesto^pením ^NR²R², ^převediteným do formy soli, dále chlorem, bromem či jodem, nebo skupinou trichrormethylovru či trifluormethýlovou.

Meei estery kyseliny klavulanové, které jsou zvláStě vhodné jako synergicky píůaobbcí látky, jsou ty, které se hyd>lyeují v tkáních savců, zvláStě pak v lidské krvi, za vzniku tyseliny klavulanové nebo její soli, protože se má za to, že tyselina klavulanové nebo její soli jsou poněkud vhodivšími synergicky působícími látkami, než jsou estery co takové. K tomuto účelu se hodí četné estery obecných vzorců V až IX.

Daší skupinu zvláŠtS vhodných esterů podle tohoto vynálezu tvoří ty látky, které jsou vhodnými meeiprodukty, snadno přecházejícími ns kyselinu klavulanovou nebo její soli chemickými nebo biochemickým, postupy, o kterých je známo z oblasti penicilinu nebo cefslosporinů, že jsou dostatečně mírné, aby nedocházelo k degradaci beta-aakaamlvého kruhu, reaktivního s labilního ve styku s kyselinami.

Je nsjvho<b]Lijšš, lze-li ester Štěpit hydrog^^^^cky. Mei použitelné estery v případě takového postupu patří bennylestery, substituované be^z^este^, benz^ddrleetery, substituované benz)wddylestery, tritylestery a podobné. Pro tento účel jsou zvláště ' vhodné, jak se to ukázalo, ^^a^z^^l^^tery.

Obecně řečeno je povaha jakéhoкоИ substituenta v esterové části neddleeitá, pokud tekový substituent nevydí při hydrogennoyse.

Protože kyselina klavulanové a její soli jsou vhodnými meeiproduktd při přípravě vhodných artibakteriálních esterů podle tohoto vynálezu, týká se tento - vynález rovněž kyseliny klavulanové a odjpoíddaících solí, poožíjí-li se jako chemické mesiprldukty.

Jak to zde již bylo uvedeno, vyznačuje se tyselina kLavul^amová a její soli cennými therapeuticlými vlastnostmi, takže podle dalšího předmětu tohoto vynálezu se poppsují farmaceutické komppozce, obsahujcí kyselinu klavulanlvlu, její sůl nebo její ester spolu s farmaceuticky vhodným nosičem.

Meei kompotce podle tohoto vynálezu patří ty, které se hodí pro orální, topické nebo pariaiterální podáván, a mohou se pouuít při léčbě infekcí savců, počítaje v to lidi.

Mezi vhodné formy koi^p^c a přípravků podle tohoto vynálezu patří tabletky, {eaple, krémy, sirupy, suspense, roztoky, p^ěky k další úpravě a sterilní formy, vhodné pro injekce či iníuse. Takové kompoosce mohou obsahovat farmaceuticky vhodné pomocné látky, jako jsou ředidla, pojivá, barviva, příchutě, konzervační činidla, látky, urychlující rozpad apodobně, vždy ve shodě s běžnou farmaceutickou praxí za pouUití postupu, který je odborníkům dobře znám na.úseku úpravy lékových forem antibiotik.

Injikovatelhé kompooice kyseliny klavulanové či odpooíddjících solí, dále infusní komppoSce jsou zvláště vhodné, protože po podání injekcí či infusí dojde k vysoká koncentraci kyseliny klavul anové v tkáni. ’ Takže výhodné komppoice podle tohoto vynálezu zahrnují klavulanovou tyselinu či její sůl ve sterilní formě.

Kommposce v jednotné dávkovači formě s obsahem kyseliny Havu-onové nebo její soli či estery, vhodné k orálnímu podávání, tvoří další výhodnou variaci podle tohoto vynálezu.

Za určitých okolností se může účinnost orální kommpoice klavulanové, její soli nebo esteru zlepšit, jestliže taková kommpoice obsahuje pufrovaci činidlo nebo krycí povlak pro počáteční podálí, takže sloučeniny podle tohoto vynálezu nejsou vystaveny déle trvajceímu účinku velmi kyselých žaludečních šláv. Takové pufrované nebo kryté kommpoice se mohou připravovat ve shodě s běžnou farmaceutickou praxí.

Kselina klavul.anové, její sil nebo ester může být v kommoosci jako jediné therapeuticky účíoHiuící činidlo, nebo může být obsažena tamže spolu s dalšími, therapeuticky účinnými látkami, jako jsou beta-Hkammová antibiotika. Mezi vhodná beta-aekamiová antibiotika, která se mohou přidávat do synergických kompposc, pstří nejen ta antibiotika, o nichž je známo, že snadno jsou napadána beta-lktamásomi, ale i ta, která se vyznačují dobrým stupněm vnitřní resistence proti beta-akkammásám. Takae mezi vhodná beta-akkammová antibiotika k přidání do komf>poic podle tohoto vynálezu pstří benzySpoeiiClin, fenoxymeehylpenicciin, karbeeiiciin, eethiHin, p^mpcd^, ^oppidi^ amooyytn, epi.ctlin, tikarcilin, cykkaadin, kyselina ^aminoopelcdanová, kyselina 7-aminocefalosporanová, kyselina 7-aminodesacetoxygalosporanová, cefaloridin, cefaLothin, cefazolin, cefalexin, cefoxitin, cefaceeril, cefamendol, ceTami-rin, cefaradin, cefaloglycin, jakož i další dobře známé peniciliny a cefalosporiny, nebo odpo^ídaící výchozí sloučeniny pro jejich přípravu, jako je hetacilin, peeaIImicdio, dále αcetoУsmitthSlsters, piíalosloxspethlS.e8tвrs . a . ft alidylestery benzyl» p^i^í(^c.1í^ou, appl^i-inu, amoyyd.inu nebo cefaloglycinu, nebo fenylestery, tolylestery nebo indany-ia-fa-estery karbenicdiou nebo tikarcilinu a podobně.

Je jasné, že pokud látka ze skupiny oeoicilioй nebo cefalosporinů, jež je v koi^ssc!, nebo vhodná pro orální podávání, upraví se koppoзice pro oarenteráloí podáváan. Je-li kyselina llaíulaooíé, její sůl Či ester ve farmaceutické komposSci spolu s beta-akktmoov^ antibiotkkem, pak poměr kyseliny klavulanové, její soli či esteru k beta-akktmoovému antibiotiku může činit od 20 : 1 k 1 : 12, obvyykeji od 10 : 1 k 1 : 10 a s výhodou činí od 3 : 1 až do 1 : 3.

Celkové množív! antibakteriálních činidel v kterékoli dávkovači formě činí obvykle 50 až! 500 mg, a zpravidla se jedná o rozmezí 100 až 1 000 mg.

Kommpsice podle tohoto vynálezu je možno použžt pro léčbu infekcí, kromě jiných dýchacího traktu, močového traktu a měkkých tkání u lidí.

K^mpasce podle tohoto vynálezu se může rovněž pouužt při léčbě infekcí domé^c^ích zvířat, jako je v případě hovězího dobytka zánět vemene.

Obvykle se podává denně 50 až 6 000 mg koi^olce podle tohoto vynálezu při léčení, obvvyieji mezi 500 až 3 000 mg kom^posice podle tohoto vynálezu denně. Avšak při léčbě obtížnějších infekcí, nebo infekcí, způsobených zvláště odolnými organismy se mohou pouužt vyšší dávky ve shodě s běžnou klinickou praxí.

Přesná forma komposice podle tohoto vynálezu bude záviset do jisté míry na mikroorganismu, jehož se léčba týká. Při léčbě největšího počtu infekcí se obvykle kommpoice podle tohoto vynálezu upraví tak, že se tím docílí vrchol hladiny v krvi nejméně 0,1 ju&/ml, lépe nejméně 0,25 fug/ml a a výhodou nejméně 1 synergicky působící složky, například 2,5 až /ug/ml synergicky působící složky.

Obsah pencc-Hnu nebo íefaLosporinu v synergické podle tohoto vynálezu činí obvykle až do obsahu, který se obvykle použije v případě pencHi-nu či crfalosρorinu jako jakového, pokud se taková látka použije jako jediná složka při láčbě infekce.

Zvláště výhodné kompotce podle tohoto vynálezu obsahují 1 50 až 1 000 mg aoocycCliou, amp0cClinu nebo výchozí látky, ze které takový prniíil0nolý derivát vzniká, a 50 až 500 mg kyseliny klavulanové, její soli, Si esteru, hydrolyscvatelnLého in vivo, a vho^ěji 200 až 500 mg a^oy^H^, app0cíliou nebo cdpoolddjící výchozí látky a 50 až 250 mg kyseliny klanulanové, soli či esteru, hydrolysovatelného in

Msatriály v takové kompposci mohou být hydratované, je-li to třeba. Hmoonost antibiotika v takové komppcici se vyjadřuje na základě antibiotika, jež je theoreticky dostupné z ^poposc^ nikoli na základě hpoOnc)oSi léčiva.

Podle předmětného postupu je předmětem tohoto vynálezu způsob výroby kyseliny klavulanové, cdpoolddjííííh solí a esterů, vyzunauujcí se tím, že se kiltivuje kmen Streptomycas ílaluligrržs a isoluje se kyselina klavul^ová nebo její sůl z prostředí kultury, načež se - je-li to žádoucí - připravuje volná kyselina, její sůl či ester za pouužtí jinak obvyklých a známých postupů.

S výhodou se používá Strepoonycea ílalžllgrržs ATCC 27064 nebo m^uia^lt, produkkujíci vysoký výtěžek účinné látky.

Výrazem kultivování se zde míní aerobní růst mikroorganismu, produkujícího kyselinu klavulanovcu za přítomnost asioilclatelΣýíh zdrojů uhlíku a dusíku, jakož i anorganických solí. K aerobnímu růstu může docházet na pevném či ooloorvnéo živném prostředí, nebo v kapalném prostředí, kde jsou živné složky rozpuštěny či suspendovány. Kužtilcváoí může probíhat na aerobním povrchu nebo v s^nrení kultuře. Živné prostředí může být složeno z komplexu živin, nebo může být chemicky definováno. Bylo zjištěno, že se zvláště hodí prostředí, obsatojící komml^ živin, jako je extrakt z kvasnic, sojová moučka a podobně.

Živná prostředí, která se mohou použžt ke kultivování Strrptopycrs clav^ligerus, mohou obsahovat v rozmezí 0,1 až 10 % zdroj organického dusíku, jako je extrakt z kvaimic, vývar z kukuřice, rostlixníé proteiny, proteiny ze semen, hydrolysáty takových proteinů, hydro lyséty proteinů z mléka, extrakt z ryb a masa a hydrolysáty, jako jsou peptony. Jinak se mohou použžt další zdroje dusíku, jako je oo0oolna, amidy, jednotlivé aminokyseliny nebo směsi běžných aminookysein, jako je valin, asparagin, kyselina glutamová, prolin a feny Alenin.

Do živného prostředí je možno přidávat v minožtví 0,1 až 5 % některé cukry, ale glukosa má v některých prostředích nežádoucí vliv, že totiž klesá výtěžek kyseliny klavulanové. Mohou se pouužt škroby nebo produkty hydrolysy škrobu, jako je dexyrin, dále sacharosa, laktosa nebo jiné cukry, dále glycerin nebo i estery glycerinu. Zdroje uhlíku mohou být rovněž založeny na rostUjných olejích a tucích živočichů. Jako zdroje uhlíku pro vzrůst mikroorganismu a produkci inhibitorů beta-lakamasy se mohou pouužt v prostředích karboxylové kyseliny a jejich soli, Zv^Stě vhodným a levným prostředím je prostředí, obsahující sojovou moučku (Árkasoy) a navíc sušené roupustné podíly z destilace sladu (Scotssol) s d^t^nem.

Přidání činidel proti tvorbě pěny (P^ronic D31) může být a i nutné ke zvládnutí plnění některých prostředí ve feraimtačních zařízeních.

Do f^n^m^j^itačního prostředí, jak je popsáno výše, a zvláště, je-li chemicky definováno, lze přidávat anorganické sol.!, jako je chlorid sodný, chlorid draselný, chlorid hořečnatý, chlorid zinečnatý, chlorid železit^,* síran sodný, síran železnatý, síran hořečnatý, nebo sodné či draselné soli kyseliny fosforečné; jako zdroj vápenatých iontů lze přidat uhličitan vápenatý, případně i pro účely pufrováií· Rovněž je možno přidat soli stopových prvků, jako je nikl, kobalt nebo mangan. A je-li to třeba, je možno přidávat vitamíny.

Kddksoi se zde pou^je výraz muutnt, zahrnuje tento pojem jakýkoli muuuuící kmen, který vzniká spontánně nebo vlivem vnějšího činidla, ať již se použije úmsSLoě či jinak. Vhodné způsoby získání muuuuících kmenů popisuje Η. I. Adler v Tectmiques for the Development of Microorgtoisms v Raadatioo aod faLddoisotopes for IoduutritL Mc^roi^irgani^ms“, Procudings of a . Sy^f^c^osium, Vídeň, 1973, str. 241, ‘^,Iotlroαtiooαl Atomic Eoergy A^ut^c^o^i^-ty, a patří sem:

i) ionisačoí záření (jako jsou X-paprsky a gama-zření) ultrafialové světlo, ultrafialové záření spolu s fttoslosibLlSt·čníu čioidlm (jako je 8-methoJφliatraen), kyselina dusitá, hydroxylamio, obdoby pyrimidinových bází (jako je S-bromuuaaii), látky ze skupiny akridLou,, alkylačoí činidla (jako je hořčičný plyn, lUeyluulhаnosUfonity), peroxid vodíku, fenoly, forteplo a

Li) genetická Ulcenikα, jako je rekombSnαce, transformace, UrtoLsdukcl, lysonehail, ^logeno! konverse, a selektivní postupy pro spontánní uuUιuoty.

А^О^^по! Stгeptouycls ilαluliglrus se obvykle provádí za teploty 15 až 40 °C, ob^Heji 20 až 35 °C a s výhodou za teploty 25 až 30 °C, přičemž hodnota pH činí obvykle 5 až 8,5, s výhodou 6 až 7,5.

Strepo^ces iLαluliglrus se může kultivovat ve výše zmíněných prostředích za pouuití konických skleněných baněk za provzdušňováií a třepání oa rotační třepačce, nebo to lze provádět ve feimentačních zařízeních z nerezové oceli, vybavených přepážkami, míchaných diskovými kotouči za provzdušňolání přívodem vzduchu. Komentování lze rovněž provádět kontinuálně.

VVchozí hodnota pH při ferulntováoí činí obvykle 7,0 a nejvyššího výtěžku kyseliny klavulanové se dosahuje za 2 až 10 dní při teplotě 20 až 35 °C. Ve feruentαčoíih zařízeních z nerezové oceli za pouuití prostředí Arkatoo^řlSčitαaot/deltrio, jak se. o něm zde výše mluví, se používá nejlУhodniji teploty 26 °C, a k maximu vzniku kyseliny klavulsnové dochází za 5 dní.

Klalulanolou tyseliou je možno extrahovat z prostředí, tedy z filtrátu kultury četnými způsoby. Jako zvláště použitelné postupy je možno uvést extrahování rozpouštědly z ochlazeného filtrátu kultury po úpravě hodnoty pH do kyselé jakož i postupy, založené na .

αnitnUové povaze jako je pouští a^xové iootouěničové pryskyřice. Buňky Streptomyces ilαluliglrus se obvykle nejprve odstraní po skončení fermentování filtrací oiSo odstředěním, a.pak se provede postup extrakce.

Při postupu extrakce rozpouštědly se filtrát z kultury ochladí, pH se sníží do kyselé omasti 2 až 3 přidělím kyseliny za energetického načež se okyselený filtrát energicky míchá s rozpouštědlem, ounísícím se s vodou, jako je o-butylester kyseliny octové,. uulhhlistSutylkeUtn, ο-Ι^ι^Ι^^Ι nebo ethylesto kyseliny octové. Jako kyieH“ oa se při okyselování filtrátu z kultury používá obvykle mnoráloí kyselina, jako je kyselina chlorovodíková, sírová, dusičná, fosforečná ' apod. Při pouští výše uvedených rozpouštědel je zvláště výhodnou látkou п-Ь^у^.^Ьо!·

Po oddělení obou fází odstředěním se uelutstLt, 0пС:1Ь1л^^zící Slta-laktяuasu, extrahuje opět z rozpouštědla do vodného roztoku kyselého uhličitanu sodného nebo do pufru kyselého fosforečnanu draselného, dále do suspenze uhličitanu vápenatého ve vodě, nebo i do vody z* udržování pH přibližně v neutrality, tj. okolo hodnoty 7,0. Vodný extrakt po oddělení obou fází je možno koncentrovat zassníženáho tlaku, načež se lyofiliaoviniím získá jako surový produkt sůl kyseliny klaotlanooé. Tento produkt je stálý při skladování v pevném stavu z· chlazení na -20 °C.

Při postupu pouuití anexové pryskyřice se vyčeřený filtrát z kultury za neutrálního nebo mírně kyselého pH, například v rozmezí 6 až 7, perkoluje dolů kolonou slabé nebo silné bázické anexové pryskyřice, jako je Amberllt IR4B nebo Zerrlit FFIF, až se pryskyřice nasytí a mtterál, inhibuuící beta-laktimasu, začne vytékat ode dna. Potom se kolona promj vodou, eluuje se vodným roztokem chloridu sodného, jímají se frakce, obsahuuící inhibitor beta-lakamasy, tyto frakce se spojí, zbaví se soli ' a lytfilStv válím se získá surová sodná sůl tyssliny klavulanové.

Aimerllt IR 4B je příklad slabě bázické anexové pryskyřice s polyaminovými aktivními skupinami a ecsíttoiou maticí z polystyrenu a divinylbenzenu. Zeerlit FFIP je silně bázické anexové pryskyřice s aktivním kvartérními amniovým skupinami a zesí^ou maarrcí z póly vinyl benzenu a divinslbemeenu. a Podobnými pryskyřicemi jsou Isopor FFIP a DíAccdete FFIP SRA«64, výrobce BDH Ciemic OLs Ltd, PpoIc, Dor set, Velká Britanie.

Jinou formou extrakce je postup, kdy se filtrát kultury, obvykle za neutrální hodnoty pH, sůl kyseliny klavulanové, uvádí do styku s organickou fází, ve které je rozpuětěn am.n, nerozpustný ve vodil· Med poudtelná vhodná rozpouštěna patří polární rozpouštědla, nemííitelná s vodou, jako je mbrhulisobutylketon, trichlorethylen a podobné látky. Mezi vhodné aminy patří sekundární a terciální aminy, ve kterých jednou ze substituujících skupin je alifaticliý dlouhý řetězec, obsahmu^cí například 12 až 16 atomů, a dalším itb8titueneeb na dusíku je terciární alkylové skupina, takže molekula má lipofilní charakter. Vhodným aminem pro tyto účely je Ammerlit LA2, a amin se obvykle používá ve formě adiční soli s kyselinou.

Po tomto způsobu extrakce se nalézá kyselina klav-ulamové v organické fázi ve formě soli aminu; organická fáze se oddělí od původního filtrátu z kultury, a kyselina klavulanová se extrahuje zpět do vodné fáze roztokem soli, s výhodou za pouužtí koncentrovaného roztoku chloridu sodného, dusičnanu sodného a podobně. Surovou sůl kyseliny klavulanové lze posléze získat iytfilitvvιnlm nebo podobnými postupy.

Mohou se pouužt též další postupy zásadní diTeežtOosi» jako je absorbování na uhlí, vysolení a molelNUární filtrace, ale žádný z těchto postupů se obvykle nedá použít s takovým úspěchem, jako obě dvě výše popsané metody, která lze právem oznaačt za výhodné. · —lší čistění surového produktu, jak se získá výše popisovanými postupy, se dá provádět četnými způsoby, ale zvláště je vhodná ionl^c^m^ničová sloupcová zvláště při pouUžtí Idopor-u, De^Acidite FFIP SRA64 nebo DlEA-celuUosy. K^o-ona s —eAcidte se má gradientově eluovat vodným roztokem soli, jako je chlorid sodný v konncirtraci 0 až 0,5 M). Kolona —ΑΑ--θ1ιι1^/ v 0,01 M fosfátovém pufru o pH 7 se má eluovat roztokem soli, obvykle roztokem chloridu sodného o konncntraci 0 až 0,2 M v 0,01 M ^sad^vém pufru o pH 7.

Aktivní frakce lze zjistit podle ^^biční účinnooti na Srtt-laktabasu, nebo podíle «ntibirtkeriální účininoti proti Klebstellt arrtgenes při testování zřeďováním na agaru. Frakce, tb8aluutíií hlavní poddl aktivity, se potom spo^jí, vše se zatnutí ve vakuu na mmlý objem, a získaný surový produkt, tedy sůl kyseliny klavultmtvé, se odsolí prrtolováníb kolonou Bio Gel-u P2 tokem směrem dolů.

Bio Gel P2 je příklad velmi lipofilní pryatyřice, na kterou lze absorbovat organické látky, ale jež nezadržuje anorganické soli, Je to polyakrylamidový gel, výrobce Bio Rad, Richmond, USA.

Aktivní mattriál se po odsolení zahrnutí, smíchá se s ethsrnolm a provede se další chromtoogmfie na koloně celulosy za použžtí směsi ^ty^l^boH/ethylalkohol/voda (4 : 1 : 5) jako horní fáze rozpouštědla.

Frakce, obsahující maaterál, který inhibuje beta-lakaarnasu z Escherichia cooi, se spojí, věe se zahnutí odpařením ve vakuu do sucha, zbytek se znovu rozpustí ve vodě, a lyoíflisováním se získá jako bílá pevná látka sodná sůl kyseliny klavulanové.

Jako způsoby, které jsou nejpouužielnější a n^vho^ější ke zjišťování přítomnost kyseliny klavulanové ve filtrátech kultury, lze uvést chrommatogafií na papíře · bioautografii· Přítomnost kyseliny klavulanové lze dokázat, vyižitím její účinnooti při inhibování beta-laktamasy. Chrommftgrrfir na tenkých vrstvách se dá použít k kyseliny klavulanové v pevných přípravcích. Takové způsoby důkazů, a postupy testů jsou popsány ještě zde dále.

Obměna způsobu isolování čisté formy kyseliny klavulanové nebo odpooídaaících solí záleží v isolaci nečisté formy kyseliny klavulanové nebo odppovddaící soli, načež se za pouuití běžných postupů připraví ester kyseliny klavulanové, který se a potom se regeneruje kyselina klavul^a^n^ová či její sůl z čistého esteru.

Nečistá kyselina klavulanové nebo sdppoídsaícd soli, použité při tomto postupu, obsanují obvykle hmoonostně nejméně 1% antibiotika.

Jako vhodné estery, kterých lze pouužt při takovém postupu, lze uvést ty, které je možno štěpit hydrogenolysou, enzymovými postupy nebo hydrplyticky za velmi mírných podmínek.

Jednu vhodnou skupinu esterů k pouužtí při tomto postupu tvoří sloučeniny obecného vzorce X

(X) kde A? znamená vodík nebo fenylovou skupinu, případně substiuuovanou, aΑθ znamená případně substituovanou fenylovou skupinu.

Je nejvyhí^d^něl^lí, znammená-i A,? vodík nebo skupinu fenylovou, tslylsíΌt, chlorfenylovou nebo methojtyfenylovou, a Αθ znamená skupinu fenylovou, to^^vou, chlorfenylovou nebo methoxyfenylovou.

S výhodou znamená A? vodík a Αθ znamená fenylovou skupinu. Estery obecného vzoirce X je možno štěpit hydrogenolysou za vzniku kyseliny klavulanové nebo její sdpρoídsaícd soli.

Daaší skupiny esterů, kterých je možno pouuít při tomto postupu, jsou látky dříve již zmíněných obecných vzorců V a VI, a takové estery je možno převádět na soli kyseliny klavulanové mírnou alkalickou hydrolysou, např. za hodnoty pH 7,5·

Neečstá forma kyseliny klavulanové či její sdppoídsaící spli, jež se má tímto postupem čistit, může být ve formě pevné látky nebo roztoku, který obvykle obsahuje rovněž podstatná miooství organických i anorganických nečistot.

Klavulanovou kyselinu či její odpovídající sůl je možno převést na ester esterifikační reakcí, jak je o tom zde dále ještě řeč. Výhodnou reakcí tvorby esteru kyseliny ilavulanové je reakce soli kyseliny.klavuloové a esterifiaačním činidlem, jako je reaktivní halogsnid, ester sulfonové kyseliny nebo podobná látka, jek o tom ještě bude řeč. tyto reakce se obvykle prováádjí v prostředí organického rozpouštědla o vysoké dielektr^ké konstantě, jako je dimethylforaamid, směs a acetonu, dimeetylaušioxid, N-meethlmcetamid, hexalneetyltriιmia kyseliny fosforečné a podobné látky.

Je-li to žádouuí, je možno rozouuait sůl kyseliny klavulanové v rozoouutědle obvyklým postupem, nebo ji lze vázat na polymerní podklad. Meei vhodné podklady k pouužtí při tomto postupu o^a1tř anexové iontomtoičové pryskyřice, silně bázické, zvláště ty, které se vyznačují makoreeikilární strukturou, což umožňuje pouužtí nevodné soustavy rrzpouštědal. Jak bylo zjištěno, je Amberlit A26 vhodný pro tyto účely. Sůl kyseliny klavulanové je možno absorbovat na pryalyíMci. z iiirrátu kultury, načež se pryskyřice suspenduje v dimethylformamidu, obsahujícím jodid sodný» nebo jinak se eluuje kolona roztokem jodi-du sodného v dimethyiformamidu, nebo ve sm^i aimethylremlamiau a acetonu.

Připravený nečistý aster kyseliny klavulanové se obvykle čistí chroimatograicky, a při takových postupech se ester obvykle rozpětí v organickém rrzpouštёdle, jako je eth^y-eeter kyseliny octové, mey^y^ll^j^c^c^lc^i^id, chloroform, cyklohexan nebo jako jsou podobná erepruŠtš<dLa· Pevnou fází, použitou při chromí^grafik^m postupu, je obvykle inertní materál, jako je silikegel, nebo chrrbaSoog··fickl oodobbý^/mbteeeál.

Frakce, vycHázejcí z kolony, je možno testovat na přítomnost kyseliny kLavul^a^nové za vybití zmíněných již syne^ic^ch vlastností. A^i^í frakce se obvykle spojí, a . organické rozpouštědlo se za -sníženého tlaku.

Ester z tohoto postupu se obvykle vyznačuje vyhov uící čistotou, ale získaný mae^e^i.ál je možno znovu ještě jednou chroimatogrfovat, je-li to žádoucí.

Takto vyčištěný ester kyseliny klavulanové je možno převést na kyselinu davu! «novou nebo její sůl za pouužtí postupů, o kterých zde již byla řeč.

Zvláště vhodným postupem získávání kyseliny klavulanové nebo její soli je lydrrgenrvání sloučeniny obecného vzorce X, jsk to zde již bylo popsáno. Reakce tohoto typu se obvykle prováddjí za přítomiooti iatallsátrru ze skupiny přechodových kovů, a za pomuž^í nízkého nebo středního přetlaku vodíku. Reakci je možno provádět za vysoké teploty, za teploty místnosti či nižší, například v rozmezí - od 0 až do 100 °C. Jako zvláště výhodné podmínky pro provedení takové hydrogenace lze uvést pouužtí mírně vySSího tlaku vodíku za teploty 12 až 20 °C. Reakce se provádí v obvyklých rrzpouštěaleih, jako jsou nižší alkano!! například ethanol. Jako zvláště vhodný kaHal^át^ je podle naSeho zjištění palladuum na uhH.

Pokud se hydrogenace provádí za přítomnost báze, pak vzniká sůl ^seliny klavulanové, například sodná nebo draselné za pouužtí kyselého uhličitanu sodného či draselného.

Klaíulaorvá kyselina, nebo její rdppoíddJící sůl, jak se získá z podobných reakcí, se vyznačuje obvykle dobrou čistotou.

Estery klaíulαnrvé tyseliny se mohou připravovat eβteeifirívιnríb kyseliny klavulBnové Mbo její soli za pouužtí bSžných postupů.

Meei vhodné postupy přípravy esterů je možno zařadit:

a) reakci soli kyseliny klavul^anové se sloučeninou obecného vzorce Q-R, kde Q znamená snadno raštSpite]nru a nahraditelnou skupinu, a R znamená organickou skupinu,

b) reakci kyseliny klavulanové s diazoalkinum,

c) reakci kyseliny klayulsoryé s alkoholm obecného vzorce ROH za přítomlooti konden- aaSního činidla, nebo činidla, podporujícího konddensai, jako je látka ze skupiny karbodiimidů či podobné. .

Jako vhodné soli kyseliny klavulanové, které se mohou použít př reakci a· sloučeninami obecného vzorce R-Q, lze uvést soli alkalických kovů, jako je sůl sodná či draselná, nebo další vhodné soli, jako je sůl stříbrná.

Jako vhodné skupiny Q, odštěpitelné · naJhadiielné, lze uvést takové atomy a skupiny, o nichž je známo, že se dají nalhraddt karloxylátovými anionty, a sem p^tří chlor, brom ' a jod, estery sulfonových kyselin, jako jsou estery typu -o-SD₂“CHj nebo -O-íWg-CgH^.CHp déle skupiny aktivních esterů, jako jsou skupiny -O-CO-H nebo -O-CO-CF^, a další běžné skupiny, které lze snadno nahradit oιUcl·ofilními činidly.

Předchozí reakce se obvykle provádí v organickém rozpouštědle o vysoké di·lektaiclé Ιομ^ο^, jako je dimethylforaamid, aceton, dloxan, t·trahydarlUaao nebo podobně, přičemž se pracuje v teplotním rozmezí od -5 °C až do 100 °C, obvykeji v rozmezí od *5 °C až do 30 °C, například za teploty mi^t^i^c^osi..

Reakce kyseliny klayulanoyé a diazosloučimiiMmi je mírnou reakcí přípravy alkylesterů, aralkylesterů nebo, podobných esterů· Tuto reakci s diazrsloučeoinru je možno provést za použití běžných rea^ních podmínek, například v obvyklém teplotním rozmezí a v běžných rozpouštědlech. Provádí se tedy taková reakce za teploty od asi -5 °C až do 100 °C, například za teploty míítn<oosi, a mezi vhodná . rozpouštědla pro tuto reakci pestří nižší šikano ly, jako je methan! a ethanol, a z pou^telných rozpouštědel lze jmenovat t·trahydarf’uaan_l ' dioxan a podobné látky. Jeko zvláště vhodné rozpouštědlo pro tuto reakci lze uvést ethylalkohol.

Reakce kyseliny klavulanové s alkoholem nebo thiolm za činidla, usnadňujícího kondd·ossi, se obvykle provádí v prostředí inertního organického rozpouštědla o poměrně vysoké iieleltaiclé konstantě, jako je třeba scetorCittl· Reakce obvykle probíhá za teploty mítrnoU Si nižSÍ, například v rozmezí od -10 °C až do *22 °C, obvykle! za teploty od -5 °C až do +18 °C, například ' nejprve za chlazení na 0 °C s postupným vyhřátím až asi na 15 °C. Jako činidlo, oodporrjící a usnadu jcX reakci, se obvykle používá látka, r(doímíSící vodu z reakční srnmsi, a mm zi vhodná činidla tohoto typu patří látky ze skupiny karbodiimidů, karbodiimidazolů nebo podobných činidel. Zvláětě vhodným kondi^i^ssční^m - činidlem je (Ι^ΙΙ^·xyllarlodiimld· Se zřetelem na ommziení samokondennace kyseliny Ha^lanové na nejmenší možnou míru se tato reakce provádí obvykle ve velkém nadbytku alkoholu nebo thiolu.

Dlším vhodným postupem přípravy esterů je:

d) odštěpení kysličníku uhličitého ze sloučenin obecného vzorce XI

(XI) kde R* znamená inertní organickou skupinu, a

e) reakce sloučeniny obecného vzorce XI s alkoholem obecného vzorce ROH, nebo méně výhodně s thiolm obecného vzorce RSH.

831157

Kysličník uhličitý lze eliminovat ze sloučenin obecného vzorce XI spontánně během přípravy, nebo jinak zahříváním sloučeniny obecného vzorce XI v prostředí inertního rozpouštědla. Jako vhodná inertní rozpouštědla lze jmernovat látky ze skupiny etherů, jako je diethylether, tetrahydrofuran, dioxan a podobné. V četných případech se sloučenina obecného vzorce XI rozkládá spontánně i za snížené teploty, například při -5 °C, takže vzniká ester obecného vzorce

kde ^r/ znamená inertní skupiny v rámci definice o^cnéto symbolu R.

Má-H se provést reakce sloučeniny obecného vzorce XI s alkoholem, nebo měně výhodně s thiolem, pak se tato reakce obvykle provádí v prostředí inertního rozpouštědla, jako je látka ze skupiny etherů, za přítomnosti nadbytku alkoholu nebo thiolu, to se zřetelem na znemožnění samokondensace derivátu kyseliny klavulanové.

Podobné postupy esterifikování nejsou - obecně řečeno - tak vhodné, jako jsou postupy, při nichž se používá sůl kyseliny klavulanové a její reakce se sloučeninou obecného vzorce R-Q, jak o tom zde již byla řeč.

Sloučeniny obecného vzorce XI lze připravovat reakcí soli kyseliny klavulanové se sloučeninou - obecného ^- vzorce Cl-CO-O-R^' nebo ' ' Odpovíddjící^: chertLckou obdobou· - Obvykle se^-tato reakce provádí za snížené teploty, například nejvýSe do 5 °C, a v prostředí inertního rozpouštědla, jako je například ΡΙ^ΙζΙ^^^ tetralyprvfuran, dioxan a podobné. NejvhocdiOji se používá jako sůl kyseliny klavulanové při - této reakci lipofiloí sůl, takže se tato rozpouští v rozpouštědle, ačkoliv - je-li to žádoucí - se může použít méně vhodná sodná sůl, to za ponuří suspense této soli v reakčním prostředí.

Popis 1

Testy, vhodné pro zjiStěoí přítomnost kyseliny klavulanové

Poddtata testů

Roztoky, obsah^jcí kyselinu klavul snovou kiltury, vzorky z isvlačoícl postupů a podobné) se inkubují po 15 minut - s beta-aktaannsovým přípravkem za pH 7 v - 0,05 M fosfátovém pufru při 37 °C. Během uvedené doby dojde i inhibování nebo Pe8aitivvvání enzymu, načež se přidá jako substrát bwuzypeeOidio, a v iokubováoí při 37 °C se pokračuje po 30 minut. Poddl enzymové degradace substrátu na oβnicilovos kyselinu se stanoví hyPrvxylaшinvvým testem ns p^j^Oc^i^li^o. Moossví pouHté beta-laktamssy je tak velké, že způsobí 75%oí hydrolysu banozypeeOiilioiu při 37 °C za 30 - minut.

Rozsah hydrolysy je mírou mnoství enzymu, který zůstává neinhibován. Výsledky se vyjadř^;^:í jako % inhibování enzymové aktivity daným zředěním křšaliny klavulanové, tedy roztokem, který kyselinu klavulадovvu obsahuje (například fittáttem z kultury) nebo koncentrací kyseliny klavulanové v pg/ml, kdy se doodí 50&oí inhi^bová^^ enzymu za výěe uvedených podmínek (I_5Q).

Enzym beta-laktmás*

Jako enzym se použije beta-iaktimása, kterou produkuje Kce«eichia coli JT4. Tato kultu ra je resistentní na ampiiClin, a její rezistence je podmíněna produkcí beta-laktaaásy, kontrolující R-faktor. Mohou se pouužt, je-li to žádoucí - další podobné beta-lakaamásy, kontrolující R-faktor.. :

Kuutura udržovaná na řezech z živného agaru, se přeočkuje do 400 ml sterilního tryptonového prostředí, jež je obsaženo ve dvouuitrové konické baňce. Prostředí má toto složení:

trypton ((Ooid) 32 g/litr, extrakt z kvasnic: (Oxoid) 20 g/litr, chlorid socdý 5 g/litr, a hexahydrát chloridu vpe^té^o 2,2 g/litr.

Konečná hodnota pH se upraví na 7,4 zředěným roztokem hydroxidu sodného. Baňka se potřepává 20 hodin za teploty 25 °C na rotační třepačce s 240 kyvy za minutu.

Mikkroiální buňky se shromáždí odstředěním, propijí se 0,05 M fusfáUavýp pufrem o pH 7 (za ^suspendování a centrifUgovíáíí, a resuspendovátním ve vodě se doClí koncentrace buněk, jež je 25to*ét vyšší, než jak tomu bylo v kultivačním prostředí. A tato suspense buněk se rozruší v MSE-ultrazlulkovém desintegrátoru za teploty 4 °C. Zbytky buněk se odstraní centrifugováním, a alikvotní podíly kapaliny nad sedlinou se uchovávají za hlubokého podchlazení. Při pouHtí k testovacímu postupu se kapalina nad sedlinou zředí 0,005 M iosfáoovým pu^em, až se tím.doccií asi 75% hydrolysy roztoku beány ypeeni dinu o koncentraci 1 mg/ml za 30 minut při 37 °C. .

Testovací postup

Vhodná ředění knlkii0orovélo přípravku a roztoku ietaulaktpmásy se smíchají a inkubuu jí se po 15 minut při 37 °C (test). Koonrolní pokus s pufrem msto ΐ^^^ο^νό^ přípravku se rovněž inkubuje. K testované a kontrolní směsi se potom přidá roztok benzzjpeatcilinu (s^b^trátu), a v inkubování se pokračuje po dalších 30 minut za teploty 37 °C. Zbylý benzylpennC-lin v každé směsi se potom stanoví za pouH^tí lydiuxyiamknoaélu testu, jak to popisuje Btchelor a spoo., Proč. Roy. Soc., Β .154. 498 (1961 ).

Z hydruχyi.apknoaélu reagens se přidává 6 ml do všech testů, kontrolních i slepých pokusů, a reakce se nechá probíhat 10 minut za teploty mfítnoosi, dříve než se přidávají 2 ml roztoku síranu želez^am^!:^^ jako dalšího reagens. Absorpce konečných roztoků se měří na E.E.L·.koloripetrl nebo na spektrofotometru při 490 nm proti slepému roztoku reagens. Složení roztoků, testů a slepých pokusů před lydruxyi.amkaélo roztoku jsou tyto:

Složky

(vše rozpuštěno, nebo zředěno přidáním'0,005 M fosfátového pufru o pH 7)	Test	ientzjpeatkClin, slepý pokus ml	kontrola ml	slepý pokus reagens ml
Roztok ietaulaktapásy
z E8Chlaichia coli	1,9	0,0	1,9	1,9
Roztok inhibitoru	0,1	0,0	0,0	0,0
BeatzjieatkClin 5 mg/ml	0,5	0,5	0,5	0,0
0,005 M fosfátového pufru,
pH 7	0,0	2,0	0,1	0,6

výsledků

Procento inhibování beta-lsktiraaay se propočte takto:

(absorpce beazylpeniciliaového slepého pokusu) - (absorpce kontrolního pokusu) neinhibovaná reakce) - x (absorpce testu, tj. inhlbovaná reakce) - absorpce koatrolního pokusu (tj. neinhibovaná reakce) = y

У % inhibování = - . 100 x

K dosažení hodnoty Iθθ se ředí inhibitorový přípravek tak, až se při výše uvedeném postupu docílí 50%ní inhibování beta-laktmásy bennylpeeiiClinž.

Popis 2

Důkaz tyseliny klavulanové chrommtografií na papíře

Filtrát z kultury a referenčni,rcztok kyseliny klavulanové (250 /ug/ml, částečné čištěný přípravek) se'nanesou ve stopě (20 μ1) na pruh filttačníhc papíru Whstman č. 1 o šíři 1 cm. Chromá togram se nechá běžet sestupně po 16 hodin za teploty 5 °C za použití n-butyltlkcholu-iзoprcpylalkchclu-vodt 7:7:6 (objemově) jako soustavy. Pruhy se vysuší při 40 °C, a položí se na agarové destičky, obsahnujc! 6 /u&/ml beniylpeeiiílinž, a očkované kmenem Klebsiella aerogenes, prodlím jícím be0t-taktamtsu (synergický systém). Destičky se uchovávej přes noc za teploty 30 °C, a kyselina kLavul^anová se projeví jako pásmo inhibovaného růstu. Hodnota Rf činí 0,46. Mn^sv! 6 /ug/ml bennylpeeicilinž jako takového je pod ^anan^scí, které je třeba k usmrcení K-obeseHa aerogeaes, ale za přítinhibitoru beti->taktamasy je tato koncentrace již toxická, to znamená jeví se zde synergismus.

Poiuití výše uvedeného synergického systému umooňuje dokázání kyseliny klavulanové za nižších než kdy se u ní projeví antibakteriáLní účinnost.

Popis 3

Důkaz sodné soli kyseliny klavul^anové chromatoograií na tenké vrstvě

Rjztoky přípravků s obsahem sodné soli kyseliny klavulanové se nanášej ve stopách (5 /il/roztoku s obsahem 1 ^gml) na skleněné destičky s vrstvou (F254, Merck) o 0lcžš0íe 0,25 mn. Ctaromatogram se nechá běžet za teploty 22 °C za pouuití horní fáze směsi n-butyltltchol-etylalkohol-vodt (objemově) 4 : 5 : 1. Chromatoogatické destičky se vysuší při 40 °C, a sodná sůl kyseliny klavulanové se zjistí biotžtcrrafiíty na agarových destičkách, obsah^ících 6 /ug/ml be^z^eenicu^ a očkovaných K-obeseHa aerogenes (synergi^c^ký systém, vysvětlení viz v sekci o chromatocr·afovώní na pepíře zde výše).

Agarový povrch se překryje jemnou filtrační látkou předtím, než se destička s tenkou vrstvou položí na agarový povrch. Za dalších 15 až 30 minut, nutných ke a difúzi, se destička s tenkou vrstvou odstraní za pomoci podložené fi^^tr^a^ční látky, a agarová destička se inkubuje přes noc za teploty 30 °C, čímž se odkryjí pásma inhibovaného růstu. Hodnota Rf sodné soli kyseliny klavulanové ve výše uvedené soustavě'rozpouštěde činí přibližtaě 0,37. Rovněž je možno ke zjištění pásma sodné soli kyseliny klavulanové dvě reagena, nanášená postřikem, to jest Ehlichovo a Orifeiyltertazoížumíhlcrid. Prvé z nich obsahuje 300 mg p-dimeOhylbenzaldehydu v 9 ml ethylalkoholu, 54 ml n-butíOLaltchclu a 9 ml koncentrované kyseliny chlorovodíkové.

Zahříváním postříkané destičky β tenkou vrstvou 1 až 2 minuty na 120 °C se objeví v místě sodné soli kyseliny klavulumové růžová skvrna. Trifenyltetraooliumchloridové reagens je směs 1 objemu 4%iího roztoku této sloučeniny .v mmthanolu a 1 objemu methunolického roztoku hydroxidu sodného. Po postřiku se zahřívá destička s tenkou vrstvou na 80 °C, načež vystoupí v místě sodné soli kyseliny klavulanové červená skvrna na bílém pozadí.

Příklad ' 1

Kultivování Streptomyces clavuligerus

Streptomyces cl^uli-gerus se kultivuje aa teploty 26 °C na agarových řezech, obsahujících 1% Yeatex-u (extrakt z kvasnic), 1% glukosy a 2 % agaru Oxoid č. 3, pH 6,8. Sterilní odškrabek ae pouužje k přenosu m^clla a spor z řezu do 100 ml kapalného prostředí v Erlenmayarově baňce objemu 500 ml. Kapalné prostředí má toto složení:

sladový extrakt Oxoid bakteriologický pepton Oxoid’ glycerin voda z vodovodu g/litr g/litr 20 g/litr litr

Hoodiota pH prostředí se upraví na 7,0 přidáním roztoku hydroxidu sodného, a objemy po 100 ml se rozdělí do baněk, které s· uzavřou pěnovou zátkou, . .dříve než s· sterilizují po 20 minut za tlaku 0,1-0,5 MPa. OČjkovaná láhev se potřepává 3 dny z* teploty 26 °C na rotační třepačce s rázem 5 cm s 240 kyvy za minutu. Baňky z produkčního.stupně, obsahující výěe uvedené kapalné prostředí, se očkují 5&iím vegetativním inokulem, a se růst za stejxých podmínek, jako předchozí. Vzorky filtrátu kultury se testují na inhibiční účinnost proti betl-laklaulse z Escheeichia coli JT4. Nejvyšší a nejvýhotanjgí účinnost se dosahuje za 3 dny- VVsledky jsou uvedeny v tabulce 1. Pásmo kyseliny klavularnové o hodnotě Rf 0,46 je patrné, testuje-li se filtrát kultury pomocí chгtmuloogtfie na papíře za pouuití postupů, které zde byly již popsány. Zvýšení velikosti pásma je přímo úměrné zvýšení inhi^bování beta-lakaamasy.

Streptomyces clavuligerus se rovněž kultivuje ve dvoulitrových potřepávaných baňkách s obsahem 400 ml prostředí z produkčního stupně, to za pouuíti téhož prostředí a kultivačních podmínek, jak to zde již bylo popsáno v tomto příkladu. V těchto větších nádobách je růst organismu ponmlejší a optimum inhibiční aktivity beta-laktuuasy se dosahuje za 7 až 9 dní po očkování vegetativním stadiem. VVsledky jsou rovněž patrné z tabulky 1.

Tabulka 1 ^^biční aktivity beta-lakamásy v případě Streptomyces cllvuligetus při pěstování v baňkách objemu 500 ml a 2 000-ml

Počet dnů fer medování

% Inhibování beta-lakamásy z ^cherichia coli za konečného ředění filtrátu z kultury 1/2 500 baňka 500 ml baňka 2 000 ml

15

30

Příklad 2

Kultivování Streptomyces clavuligerus

Očkovací baňka - viz příprava dle příkladu 1 - se pouUije k očkování konických baněk objemu 500 ml, obsah^ících 100 ml dále uvedeného prostředí v 100 ml iontů zbavené vody:

% (hmotnost dle objemu)

Rozpustný Škrob 2 % glycerin 0,3 % Scotasol 0,1 % Arkassoy 1 % heptahydrát síranu železnatého 0,01%

Prostředí se steril^uj® autoklévovéníím za tlaku 0,1-0,5 MPa po 20 minut, a očkuje se přidáním 5 % oček z vegetativního stupně. Baňky se potřepávají za teploty 26 °C na rotační třepačce jako v příkladu 1. Ootimální titr kyseliny klavulanová se dosahuje za 3 až 5 dní. Při zředění filtrátu tarltury v poměru 1/2 500 se dosahuje 60%ní inhibování při testu inhibování beta-laktmasy. Pásmo kyseliny klavulamové o hodnotě Rf 0,46 lze zjistit za pouHtí papírové chromatoogmfie (bioautograficky) postupem, který zde již byl dříve popsán. Toto pásmo se z hlediska velikosti zvětšuje přímo úměrně se zvětšením aktivity při testu inhibování beta-lakamasy.

Poznámky:

Rozpustný Škrob je výrobek Bitish Drug Houues, Poole, Velká Britanie

Scotasol je rozpustný podíl z destilace ethanolu, doddvaael Thomas Brthwich Ltd, Glasgow, Velká Bitanie, Arkasoy je sójová moučka, dodavatel Arkády Co, Mancheeser, Velká Britanie.

Příklad 3

Kuutivování Streptomyces clavuligerus baňka podle příkladu 1 se pouHje k očkování 500 ml konických baněk, obsahujících 100 ml dále uvedeného prostředí ve vodě, zbavené iontů, za sterilování postupem, který zde byl již popsán. Očkovací kapalina se pouHje v moožtví 5 %.

% (hmotnost dle objemu) dextrin 2 % Arkasoy 1 % Scotasol · 0,1 % Heptayhfdrát síranu železnatého 0,01%

Očkované baňky se potřásají za teploty 26 °C. Optimum inhibiční aktivity beoa-laktamtsy se dosahuje za 3 až 5 dií* AkUvita byla podobného stupně, jak to bylo pozorováno v příkladu 2.

Poznámka: De^tt^:Ln je výrobek C P C, ManchheSer, Velká Britanie.

Příklad 4

KHtivotání Stxaptomycea clavullgeius

Očkovací stupeň jako v příkladu 1 ae použije k očkování konických baněk objemu 500 m., obsahujících dále uvedené prostředí, připravené za použití iontů zbavené vody:

% (váha dle objemu) glukosa 1 » sojová moučka 1 % Scotaaol 0,05 5» uhličitan vápenatý 1 ·

Baňky, se ošetřují a zpracovávají přesně jako v předchozích příkladech, a kiltivování se provádí přesně za stejných podránek. Aktivita inhibování beta-lakaamasy vzniká za 3 ai 5 U filtrátu tailtury za konečného ředění 1/2 500 se zjistí 35 ai 45%ií inhibování při testu na inhibování beta-laktamasy.

Příklad 5

Kuutivování Streptomyces clavuligerus

Inhibiční aktivita beta-laktimasy, kterou lze připsat vlivu kyseliny klavulanové, vzniká za p^i^2i1^:í dále uvedeného prostředí, a za pou2i1t:í totožného očkovacího stupně a kultivačních podmínek, jako tomu bylo v příkladu 1:

% (hmotnost dle objemu)

glycerin	2	%
sojová moučka	1,5	%
síran hořečnatý	O’	%
sek. fosforečnan draselný KgHPO^	0(,1	-%

Prostředí se připraví ve vodě, zbavené iontů. Inhibiční aktivita beta-lakaamasy dosahuje hladiny maxima za 3 ai 5 Λιϊ, a jedná se řádově o stejnou hladinu, jako tomu bylo v příkladu 4.

Příklad 6

Kuutivování Streptomyces clavuligerus

Za pouuiaí dále uvedeného prostředí vzniká kyselina klavul^anové za týchi podmínek a za pouuiaí stejného inokula z vegetativního stupně, jako tomu bylo v příkladu 1.

glukosa . 1 % Lab Lam co (Oxoid) . 1 % Ectrakt z kvasnic (Oxoid) 0,3 % uhH-čitan vápenatý 0,3 %

Prostředí se připravuje ve vodě, zbavené iontů.

Optimum titru ae dosahuje za 3 ai 5 daí, a při ředění filtrátu kultury 1/2 500 se dosahuje 35 ai 45%ií inhibování při testu Inhibování bets-SakSmmastvéht enzymu.

Kultivování Streptomyces clavuligerus

Jako v příkladech 4, 5 a 6 se za pouHtí dále uvedeného prostředí 35 až 45%ní inhibování (za zředění'1/2 500) při testech beta-laktmmasy za optimálního titru, který se · dosahuje za 3 až 5 dní po očkování· Všechny podmínky jsou stejné, jako to zde bylo předtím popsáno.

% (hmotnost dle objemu) glukosa 2 %

Arkasoy 1 % uhličitan vápenatý 0,½ % hexatydrát ch^rHu oobaltnatéoo 0,000 1 %

Prostředí se připraví ve vodě, zbavené iontů.

Příklad 8

Kultivování Streptomyces clavuligerus

Za pouuití dále zmíněného produkčního prostředí za stapartních kultivačních podmínek, jak je to popsáno v předchozích příkladech, dochází k 20 ai 30%nímu inhibování za zředění 1/2 500 při bela-akltamatovém testu za 3 ai 5 dní po očk<^’vř^x^í. A za pouuití chгtmatotg‘ifie na papíře, jak to zde jii bylo popsáno, lze zjistit pásmo kyseliny klavulanové o hodnotě Rf 0,46 při testování filtrátu kultury.

Scotasol 2 %

EXrakt z kvasnic (Oxoid) 0 %

Prostředí se připraví za použití vody z vodovodu, pH 7,0.

Příklad 9

Kultivování Streptomyces clavuligerus

Za pouřití standardizovaných podmínek kultivování produkuje dále uvedené prostředí za 3 ai 5 dní po očkování vegetativním stupněm. Za zředění 1/2 500 kultury se dooílí 20 ai 30%ní inhibování při testu bela-laktaщaatvé aktivity.

	g/lltr
glycerin	15
sacharosa	20
prolin	2,5
monosodná sůl kyseliny glutamové	1,5
chlorid sodný	5,0
sek· fosforečnan draselný	2,0
chlorid vápenatý	0,4
tetrahydrát chloridu melng«tnatéht	0,1
hexatyydit chloridu železitéCt	0,1
chlorid zinečnatý	0,05
heptahydrát síranu hořečnatého	1,0

Prostředí se připravuje ve vodě, zbavené iontů; konečné pH = 7,1·

Příklad 10

Kultivování Streptomyces clavuligerus

Zásobní agarový řez Yeatex a glukosou se použije к očkování agarového řezu Yeatex s glukosou v Roux-ově baňce za přípravy suspense mycelií a spor ve sterilní vodě· Rouxova baňka s řezem se inkubuje· při 26 °C po 10 dní. Po přidání 100 ! sterilní vody se připraví suspense mycelií, a tato suspense se použije к očkování 50 litrů párou sterilisovaného očkovacího prostředí dále uvedeného složení (za použití vody z vodovodu):

	% (hmotnost dle objemu)
sladový extrakt (Oxoid)		1 %
bakteriologický pepton (Oxoid)		1 %
glycerin		1 %
10%ní Pluronic L81 jako činidlo	proti
tvorbě pěny (v sojovém oleji)		0,05 %

Pluronic dodává Jacobs snd Van den Berg UK Ltd·, Londýn, a obsahuje blokový polymer polypropylenu a polyethylenu, a sojový olej, který dodává British Oil and Cake Mills Ltd., Hulí, Velká Britanie.

Tímto prostředím se naplní fermentační zařízení objemu 90 litrů, z nerezové oceli, vybavené přepážkami míchané diskovým míchadlem o průměru 13 cm za 240 otáček za minutu. Sterilní vzduch se připouští v množství 50 litrů za minutu, a tank se inkubuje při 26 °C.

Po 72 hodinách se očkovací feraentační zařízení použije к inokulací 150 litrů téhož prostředí za použití 5%ního přidávání (podle objemů) za sterilních podmínek. Produkční prostředí je obsaženo ve fermentačním zařízení objemu 300 litrů z nerezové oceli, vybaveném přepážkami, a míchaném diskovým míchadlem o průměru 20 cm s 210 otáčkami za minutu, přičemž se dodává do reakční směsi sterilní vzduch v množství 150 litrů za minutu a fermentování se provádí za teploty 26 °C. Jako činidlo se přidává v případě nutnosti po dávkách 10 ml sojový olej s obsahem 10 % ''Pluronic L81'’. V pravidelných časových odstupech se testují odebrané vzorky na inhibování beta-laktamasy. Nejvyěěí hladina inhibiční aktivity na beta-laktamasu se dociluje za 4 až 5 dní, viz tabulka 2.

Tabulka 2

Inhibiční aktivita na beta-laktamasu u vzorků, odebraných z filtrátu kultury po fermentování 300 litrů zápary s Streptomyces clavuligerus

Doba fermentování (dnů)	% inhibování beta-1aktamasy. Inhibiční test za konečného ředění 1/2 500
1,0 1.5 2,0 2.5 3,0 3.5 4,0 4.5 5,0	12 20 31 36 50 54 51 56 55

23OO 57

Příklad OO

Kujti. vování Streptomyces davjl-gerus

Očkovací fermentační zařízení pracuje přesně stejná, jako tomu bylo v příkladu 10 za použití stejného prostředí.

Za 72 hodin se očkovací prostředí poujžje jako 5%ní (podle objemů) uegelatCuní očko pro 150 litrů parou ster ho prostředí, obsaženého ve f^e^i^mentač^í^í^m zařízení z nerezové oceH, objemu 300 litrů^s přepážkami, a to za míchání diskovým míchadlem o průměru 20 cm s 210 otáčkami za minutu r a sa provsdušnování , sterilním vvddxchen v mrnžatví 150 ntiů za minutu. Teplota při ferůlntouání se udržuje na 26 °C, a podle nutnosti se přidává činidlo proti tvorbě pány v dávkách po 10 ml, totiž sojový Olej s obsahem 10 % P^ronic L8.

Prostředí, použité v produkčním stupni, je totožné a prostředím pode příkladu 3, a přidává se před steriCloválním 0,05 % (podle objemů) sojového oleje s obsahem 10 % Pluronic L81·

Akktvita -пИСЬ^И ieta-lakpaůass u vzorků z fermentování byla podobná, jako v příkladě 10, viz tabulka 2. ChrommPo^rpfováním na papíře lze zjistit pásmo kyseliny Havulanové o hodnotě Rf 0,46 za použití bioPutografL^í^k^ých postupů (syne^-smus), jak to zde již bylo popsáno. VvIíIosí pásma kyseliny klauulantuě se zvětšuje rovnoměrně se vzestupem testu inhibování iltP-lakPapais.

Příklad 12

KKUtivování Streptomyces davjl-gerus

100 ml sterilní vody se přidá do sporuj-ující kultury, jež byla pěstována na berme tt-ově agaru v R^uj^^-ových baňkách 10 dní za teploty 2 6 °C. Suspense myccHa a sporů se použije k očkování 75 litrů párou ^^1-^1110 ho prostředí dále uvedeného složení (za použí-tií vody z vodovodu) :

dextrin 2 % )motnoattoblpm

Arkasos 50 1 %P ^motnoit0bblpи

O 0%ní P^ronic L8O v sojovém oleji 0,03 %, podíle objemů

Ho&iota pH prostředí se udržuje na 7,0.

Medium je umístěno ve fermentačním zařízení z nerezové oceli s přepážkami, objemu 100 O a míchá se diskovým míchadlem průměru 17 cm s 140 otáčkami za minutu. V роЖу! 75 litrů za minutu se připouští vzduch a ^cn^lu^bouání se provál ⁷² todin př^{- 26} °C.

Obsah očkovacího fermentačního zařízení se použžje k očkování O 500 litrů parou steriCiouvanéát prostředí dále uvedeného složení (za poujžtí vody z vodovodu):

Ark_Psos 50 1,5 % hrnomotío dle objemu glycerin 1,0 % hrnomotío dle objemu prim fosforečnan draselný 0,1 % hrnomotno dle objemu sojový olej s obsahem 10 %

Pluronic L8O 0,2 % ppdle z obeuaů pH prostředí se udržuje na hodnotě 7,0 .Prostředí je ve feimentačním zařízení objemu 2 000 litrů, jež je konstruováno z nerezové oceli, obsahuje přepážky, přičemž je prostředí mícháno diskovým míchadlem o průměru. 45 - cm za 106 otáček za minutu.

Za minutu se do prostředí zavádí 1 200 litrů sterilního vzduchu, a jak je to třeba, přidává se v dávkách po 25 ml činidlo paro-ti tvorbě pěny, tj. sojový olej s obsahem _ 10 % Pluronic LB1. Teplota při fermentováiií se udržuje při 26 °C, a maximáání výtěžek kyseliny klavulanové se dosahuje za 3 až 5 dní; výtěžek odpovídá 200 až 300 /u&/ml kyseliny klavulanové.

Příklad 13

Kultivování Streptomyces clavuligerus

InokuLua se připraví v očkovacích bankách, jak to zde již bylo popsáno, ale použije se prostředí, popsané v příkladu 3 (hodnota pH tohoto prostředí se upraví na 7,0). Toto prostředí se pouHje k očkování 100 m. podílů dále uvedeného prostředí, připraveného ve vodě, zbavené iontů, a stertiStoaanéht. Uvedený poddl. 100 ml je obsažen vždy v konické baňce objemu 500 ml. Obsah očka činí 5 %.

Přichem P 224 1 % hmtaost dle objemu

Arkasoy 50 1,5 % hmotnost dle ojeemu prim, fosforečnan draselný O11 %t hmotnost dle ojemu pH prostředí se upraví na hodnotu 7,0.

Očkované baňky se popásají při 2 6 °C, a optimum inhibiční aktivity na beta-lakammasu se dosahuje za 3 až 5 dní. Doahuje se obsah kyseliny klavulanové 300 až 500 jig/ml.

Břichem P 224 je triglycerid (Prices Limited, Wirral, Chhehhre, Velká Britanie). Obsahuje 65 % kyseliny olejové, 11 % kyseliny palmitové a další podobné kyseliny.

Příklad 14

Isolování surové kyseliny klavularnové ve formě sodné soli

Kaaplina z kultury, získaná postupem podle příkladu 10, se vyčeří kontinuálním odstřelováním, přičemž oddělené ^celium není k potřebě. Za 150 litrů fermentační kapaliny se takto získá 120 litrů vyčeřené kapaliny z kultury, a u tohoto filtrátu se jeví 58%ií inhibování při testu inhi^bování betl-lakaimlsy za zředění 1/2.500·· - Filtrát se ochladí na 5 °C, přidá se 40 litrů n-butanolu, reakční směs se dále míchá za přidávání 25%^1ího roztoku kyseliny sírové, až se dosáhne pH 2,0. O kyselá směs se míchá po dalších 10 minut, dříve než obě fáze oddělí odstředěním. Vodný podíl není k potřebě. K n-butamolovému extraktu se přidá 0,5 % aktivního uhlí Nooit GJSX’, směs se míchá 15 minut, potom se uhlí odfiltruje (není k potřebě), přičemž se jako pomocný filtrační prostředek pouHje infustritvá hlinka.

K n-butanolové fázi se přidá voda, prostá iontů, a to v mlotství 0,25 objemu, a směs se míchá za přidávání 20%iího roztoku hydroxidu sodného, až se pH ustálí na hodnotě 7,0. Fáze se oddělí odstředěním, a n-butanolové fáze se dá stromou (není k potřebě). Vodný podíl se zahnutí za sníženého tlaku na objem 800 ml, a následujícím lsofi.iitvv!nííe se získá 35 g surového pevného přípravku kyseliny klavulanové o hodnotě ^X50 ^1,3 /íg/ml při testu na inhibování betl-laklaeasy· Tento pevný přípravek se uchovává za sucha za chlazení na -20 °C před dalším čištěním.

Příklad 15

Isolování surové sodné soli kyseliny k-avu-auové

Litr filtrátu kultury o hodnotě 53%ní inhibica při zředění 1/2.500 při testu na . inHbování beta-lakjimasy, získaného postupem podle příkladu 12, se perkoluje tokem směrem dolů kolonou o rozměrech průměr na výšku 2,5 cm na 15 cm, naplněnou pryskyřicí Penmutt Isopore resin FF IP (SRÍ 62) v chlorddovém cyklu (výrobek Permuuit Co, Isleworth, Middlesex, Velká Brrtjjnie). Potom se kolona pomyje za pouMtí 300 ml destilované .vody, a eluování aktivního Inhibitoru beta-lakamasy ae provede 0,2 M roztokem chloridu sodného. Jímají se frakce po 20 ml, a provedou se testy inhibování beta-lakamasy za konečného zředění 1/2.500. Akkivní frakce se spojí, zahuutí ae ve vakuu na objem 20 í-, a získaný roztok ae odsolí gelovou chromát opratí na koloně o průměru 3,6 cm a Biorad Blogelem P2 a ložem gelu o výši 40 cm za eluování 1%aím roztokem n-butanolu ve vod<6. Biogel P2 je výrobek Bio Rad Laboratories, Richmond, C^jifornLj, USA '. Spojí ae aktivní frakce podle vyhodnocení teakem na inhibování beta-lakjamasy, načež se po klavulanové kyselině eluuje chlorid sodný za sledování průběhu eluování roztokem dusičnanu stříbrného. Spojené aktivní frakce se zahustí a posléze lyofiliaují.

Z litru filtrátu kuLtury se tímto postupem získá 0,45 g surového pevného přípravku kyseliny klavul.amové o holotě I .. 0,92 pg/ml. _

Tevný produkt se uchovává za chlazení na -20 °C před dalším čistěním.

Příklad 16

Isolace surové sodné soli kyseliny k-avu-anové

Filtrát krltury a obsahem 300 jrg/ml kyseliny l-aíu-αnové se ok;^a^ť^3ií za míchání, načež ae provede extrakce n-butanov^m, a z tohoto rozpouštědla ae kyselina Ha^lanové extrahuje opět do vody za neutrální hodnoty pH.

Ochlazený filtrát z kiltury (5 až 10 °C) se čerpá vestavěiým míchacím zařízením, kdy se u přívodu přidává dostatečné množní óítaího roztoku (objemově) kyseliny dusičné, aby se pH u výpustě udrželo v rozmezí 2,0 - 0,1. Otyyelený filtrát se vede výměníkem tepla, jehož desky jsou chlazeny gl^y^kol^i^m (A. Ρ. V. Ltd) v množlv! 4 litry za minutu tak, aby se teplota udržovala v rozmezí 2 až 5°· Hodnota pH ae sleduje průtokovou celou dříve, než se tok vede do tříiUppňovélo protiproudého separátoru (Weatffjia Seppaator Ltd, Model EG 1006).

N-bbuylalkohol, nasycený vodou (za teploty asi 5 °C) se čerpá rychlostí 3 litry za minutu do protiproudého separátoru. Vodný vývod ze zmíněného rozdělovacího zařízení ae pouští do odpadu; z butamo-ového vývodu se stržená voda odstraňuje použitím odstředivého separátoru pro dělení kapalin od sebe (Alfa Laval Ltd, Moolel 3024X-G), a bukano-ová frakce ae jímé v nádobě z nerezové oceei, vybavené chladícím pláštěm, kde ae uskladňuje za teploty asi 5 °C.

Z tohoto zařízení ae odetbrají podíly po 40 litrech, a ty se pečlivě propíccn.! se 2 ' litry vychlazené vody, nasycené n-buiy-alkohjlťm. HodUa pH této amisi ae upraví na 6,8 í 0,1 za pouužtí 20%.^ roztoku hydroxidu sodného.

Získaná směs vodného extraktu a buky^-kohotu se vede do odstředivého sepurátoru pro dělení kapalin (Shiu^lea Cen0гilUιgj Ltd., Moilel Μ35ΡΪ-5 PH) ze rychlosti čerpání 2 litry za minutu.

Z 1 800 litrů kiltury získá 90 litrů vodné fáze, obsahující 39 % kyseliny klavulanové z možetví, jež bylo obsaženo ve filirátu kULtury.

V 15 litrech vodného extraktu ee upraví celkový podíl pevných látek z 2 % na 8 % přidáním 60 g chloridu sodného na litr, a vše se suší rozprašováním (Aclh^dro, Kodaň, Typ Lab S). PouUžté podmínky při práci: přívodní rychlost 2 litry za hodinu, napití rozprašovací ho zařízení 170 V, usazování ve vyhřívaném zařízení 6 až 7, přívodní teplota 150 °C, teplota při vyvádění 80 °C.

Sušený produkt o celkové h^ott^c^fl^t^ti 1 kg obsahuje 62 % z kyseliny klavulanové, původně obsažené v přívodu.

ZbbývJíc podíl 75 litrů vodného extraktu se koncentruje (De Dbnske

Sukkkefabrikker, Laboratory Mo^uUc, Mernmxrnový typ 900). Op pra ční postup je takový, že se recirkuluje zadržený zbytek ze zásobníku z nerezové oceli, kterýžto zásobník je vybaven chladícím zařízením, a to tak, že se vývodaí ventil nastaví tak, že se docílí diferenciální tlak 2,5 MPa přes 40 m^t^t^x^iác· Teplota se udržuje na hodnotě 2 až 5 °C, a pH na hodnotě 6,8 - 0,1 přidáváním 2 N roztoku kyseliny chlorovodíkové, je-li to třeba. Objem se tím sníží na 34 litrů s obsahem 72 % kyseliny klavulanové z původního přívodu.

Vodný koncentrát se uchovává za teploty asi 5 °C, upraví se na obsah 8 % pevných podílů, a suší se rozprašováním, jak je to uvedeno výše. Sušený bateeiál obsahuje 75 % z obsahu kyseliny klavulanové v přívodu do sušení rozprašováním.

Veškerý produkt ze sušení rozprašováním, získaný z 90 litrů vodného extraktu, absahuje

69,4 g kfzelicy klavulanové, což odpovídá 72 % z obsahu kyseliny klavulanové v přívodu do sušení rozprašováním, a 21 % kyseliny klavulanové z původního množlví, obsaženého v 1 800 litrech kultury.

Příklad 17

Částečné přečištění surové kyseliny klavulanové

Surový přípravek tyseliny klavulanové, jak je popsán v příkladu 15, se čistí iontoméničovou cUιržIbtotrrfii. 18 g maaeeiálu, připraveného. postupem, popsaným v příkladu 15, a hodnotou Iθθ 1,3 |ug/ml (konečná koncentrace) se rozpuutí v 25 ml destilované vody, a roztok se nanese na lože 3,6 cm na 40 cm PerrnuUit-u FF IP (SRA 62) v chloridovém cyklu. Kolona se eluuje gradientem chloridu sodného, vzniklým samovolným klesáním přívodu 0,5 M roztoku chloridu sodného do směšovacího zásobníku, obsah^ícího litr destilované vody, a odtud se vede přívod do chгombtotg^kafické kolony. Jímají se poddly po 10 ml, a aktivita se zřetelem na inhibování beta-lakamasy se testuje za pouUžtí 1/2 500 ředění frakcí. Akkivita se eluuje po hlavním pásu zbarvení mezi frakceri. 24 a 30· Activní frakce se q>ojí a zahustí se na 30 ml·

Získaný roztok se oddolí za pouuití lože 5 cm . na 45 cm Biorad Biogel-u P2, a eluování se provádí roztokem 1 % n-butylalttUtlu ve vodě. Frakce o objemu 20 ml se testují na obsah kyseliny klavulanové za pouUžtí testu inhibování beta-laktamasy· Frakce se rovněž nanášejí ve stopách na pruh papíru s postříkáním buď Eirlich-ovým reagens, nebo trif<mylletrztoltvvýb postřikem, jak je to uvedeno v popisu 3· Inhibiční akivita beia-lakaimasy je porovnatelná s růžovými či červenými skvrnami, které vznikly půaobení^m uvedených činidel. Ch^oma^a^t^^grafické p^i^i^ie, vyznaauUjcí se aktivitou, se po vyříznutí spo;jí, odddlí se ty, které obsahují chlorid sodný, a zahuutí se ve vakuu do suaha· Získá se tím 520 mg čáutečně čištěné sodné soli kyseliny klavulanové s hodnotou Iθθ 0,2 pg/ml při pouUžltí. standardizovaného testu na inhibování beas-laktamísy·

Při chromátografování na tenké vratvé silikagelu se v případě tohoto přípravku kyseliay klavulanové zjistí tyto hodnoty Rf: za použití horal fáze směsi a-butylalkohol/ethylalkohol/- voda 4 : 1 : 5, R_f 0,37;

za použití směsi a-butylalkohol, kyselina octová a voda 12 : 3 : 5, Rf 0,44; a za použití směsi isopropylslkoholu s vody 7 : 3 R^ 0,78 (všechny směsi míněny objemově).

Pásma se detegují postřikem Ehrlich-ovým reagens. Kyselina 6-aminopenicilaaová se použije jako značkař za detekce týmž postřikem, s má hodnoty R_f v tom kterém případě použití soustavy 0,30, 0,39 a 0,77.

Příklad 18

Částečné čistění sodné soli kyseliny klavulanové

Filtrát z kultury, jak se získá podle příkladu 12, se extrahuje rozpouštědlem, jak to bylo uvedeno v příkladu 14, a získá se tím pevný přípravek, který se dále čistí iontoměaičovou chromatografií za použití Whstman-ovy diethylamiaoethylcelulosy DE 52. Získaný pevný podíl ve váze 10 g se rozpustí v 20 ml destilované vody, a roztok se nanese na kolonu rozměrů 3,6 cm na 50 cm DE-52-celulosy, jež byla předtím uvedena do rovnovážného stavu za použití 0,01 M fosfátového pufru o pH 7,5· Kolona se eluuje za použití gradientu chloridu sodného. Do směšovacího prostoru, obsahujícího litr 0,01 M fosfátového pufru o pH 7,5, se vede 0,1 M roztok chloridu sodného v 0,01 M roztoku pufru fosforečnanu sodného o pH 7,5, přičemž řečený směšovací prostor je dále spojen a kolonou.

Jímají sa frakce po 10 ml, a ty se testují na aktivitu inhibování beta-laktamasy za zředění 1/2 500· Frakce se rovněž testují na mntibakteriální aktivitu vpichovacím postupem za použití postupu na živném agaru za očkování Klebaiella aerogenes. Frakce, jež se vyznačují nejvyšěí aktivitou na inhibování beta-laktamasy, a které se vyznačují pásmy inhibování při vpichovacím testu na destičce, se spojí, zahustí, načež se provede odsolení na koloně Biorad Biogel P2. Tyto frakce obsahují, jak to bylo dokázáno chromatografií na papíře a chromátografováním na tenké vrstvě, kyselinu klavulanovou.

Příklad 19

Isolování pevné sodné soli kyseliny klavulanové

Částečně vyčištěný pevný přípravek kyseliny klavulanové o hmotnosti 500 mg, připravený podle popisu z příkladu 17, se nanese na kolonu s ložem 2,5 na 50 cm Whstman-ovy mikrokrystalické CC 31 celulósy· Jako chromatografické rozpouštědlo se použije horní fáze směsi a-butylalkoho1/ethylalkohol/voda 4:1:5 (objemově), načež se z kolony za postupu při teplotě R 4 °C jímají frakce po 4 ml. Tyto frakce se testují na přítomnost klavulanové kyseliny nanášením stop na filtrační papír s postřikem Ehrlich-ovým reagens (růžová skvrna) nebo trifenyltetrazoliem (červená skvrna). Bylo dokázáno, že tyto stopové testy odpovídají testům inhibování beta-laktamasy za zředění 1/1 250. Aktivní frakce se spojí, a spojený podíl se suší za vakua na rotační odparce. Pevný podíl se rozpustí v malém objemu destilované vody, a po lyofilisování se získá pevný bílý přípravek sodné soli kyseliny klavulanové o hmotnosti 40 mg o hodnotě ^T50 ⁰ ,08 jug/ml při testu na inhibování beta-laktamasy.

Příklad 20

Isolování pevné sodné soli kyseliny klavulanové

Koncentrovaný zpětný extrakt (6 litrů) z ultracentrifugování podle příkladu 16 a obsahem 10 g kyseliny klavulanové dle stanovení za použití testu inhibování beta-laktamasy podle popisu 1 se perkoluje v množství litr za hodinu do kolony 5 cm na 60 cm iontoměničové pryskyřice Permutit Zerolit FF 1 P SRÍ 62 v chloridovém cyklu· Kolona se promyjo za použití dvou litrů vody, zbavené iontů, dříve než se eluuje gradientem chloridu sodného.

Gradient vzniká v zásobníku, obsahujícím 4 litry 1,4 M chloridu sodného, a odtud se zásobuje za míchán zásobník, obsahující 4 litry 0,7 M roztoku chloridu sodného, který je naopak spojen s míchaný zásobníkem, obsahujícím 4 litry vody, zbavené iontů, a ten je napojen čerpadlem na kolonu. Kolona se eluuje rychlostí 2,5 ml za minutu, a jímají se frakce po 25 ml. Frakce se testují za použití testu na inhibování beta-lakamasy.

Aktivní frakce (č. 140 ai 230) a· spojí a zahustí se ve vakuu takřka - do sucha. Po přidání 500 ml ethanolu se pevné'podíly odfiltrují za energického míchán, a ethomolový extrakt se zaJ^iAs^ltí ve vakuu do sucha na rotační odparce, načei se znovu rozpuutí v 40 ml iontů zbavené vody. Tento roztok se nanáší na kolonu 10 cm na 60 cm Biorad Biogel-u P%, a kolona se eluuje 1%ním roztokem n-butanolu. Jímají se frakce po 25 ml a ty se testují na aktivitu inhibování beta-lskamasy za konečného zředění 1/2 500. Testy na obsah chloridu sodného se zředění 1/25 frakcí se využil za pouuití roztoku dusičnanu stříbrného. Tyto frakce, obsahují kyselinu klavulsnovou , prostou chloridu sodného, se spo;jí, zahnutí se odpařením rozpouštědla za sníženého tisku na 20 ml, a lyorilisují se. Získá se tím

4,6 g sodné soli kyseliny klavulanové (hodnota ^θ) činí asi 0,06 pg/ml).

Příklad 21

Příprava esteru kyseliny klavulanové (metlhyesteru)

COONa

CH₃I*

O

CH2OH

COOCH₃

19,6 g sodné soli kyseliny klavulanové se rozpuutí v 0,5 mil suchého dimethylformamidu, a přidá se 0,25 ml mee^yjodidu. Reakční směs se nechá stát 1,5 hodin za teploty místnosti v bezvodém prostředí, načei se rozpouštědla oddíttilují ve vakuu. Zbytek se čistí chromatografováním na tenké vrstvě tilikagtls (6OF254, Merck, Dearmtadt) za eluování ethylesterem kyseliny octové, takže se tím získá meehuУetter kyseliny klavulanové jako bezbarvý olej o Rf 0,38; červená barva se vyvolá postřikem tгite]ylleetгazoSiocuhloгíOovýo sprejem). Isolovaný ester má toto složení:

Analysa:

p^ro —H^- vypočteno: 50,49 % C, 5,43 % H, 6,29 % N nalezeno: 50,70 % C, 5,20 % H, 6,57 % N λ___(v z eez bsoorcevadd 21 dnm.

max <

vmax 3 300-3 600 (Široký pás), 1 800, 1 750, 1 695 cm .

Přibližné ММ-в^^очш prvého řádu v CDl^ = 2,49 (široké, S, 1, záměna při akci s DgO), 3,05 (d, 1, J = 17,5 Hz), 3,54 (dd, 1, J = 17,5 Hz) Jg = 2,5 Hz), 3,84 (S, 3), 4,24 (d, 2, J = 7 Hz), 4,93 (dt, 1, J = 7 Hz, J₂ = 1,5 HZ, 5,07 (d, 1, J = 1,5 Hz), 5,72 (d, 1, J = 2,5 HZ. Molelrnlová hmoonoot' dle hmotového spektra = 231,06. Vypočteno pro C^H^NOj = = 213,06.

Při cholmottlrotil na tenké vrstvě za oethyУe5ters se jeví jediné pásmo v každém z dále použitých systémů rozpouštědel:

iutшěol/etlcěol/voia 4:1:5, horní fáze, Rf ³ 0,75, isoprlpylalkllol/vlic, 7:3, Rf 0,95, ethylester kyseliny octové/ethylalkohol 8 : 2, Rf 0,87, vše objemové.

Pásma se zjistí iiocutogгaficky za pouužtí K<^I^ís(^S.1c a^^oge^es za přidání cilinu (synergiamua).

Příklad 22

Příprava ρ-eitroienzylsstsru kyseliny klavulanové

ch₂qh \

COONa

Reakcí sodné soli kyseliny klavulanové s p-nitгobenzyiroomidem v suchém dimethylfojmamidu vzniká po clromiColgrafování na tenké vrstvě bezbarvý olej, krys sálu jící ze směsi chloroformu a etheru, což je p-eitrlisnzyle8tsr kyseliny klavulanové, tvoří jemné bílé prachovité jehličky o t.t. 111 až 112 °C; překryatálováním stoupne t.t. na 117,5 až 118-°C.

Příklad 23

Příprava bennylesteru kyseliny klavulanové

Surová sodná sůl kyseli-ay klcvulcělvé, tedy kyseliny 3-(ieta-·lyiгlxyethyliieě)-7-lXl-4-oxc-1-czciicykll(3_l2,0)lSepCш-22-Cr?blxyllvé (za předpokladu, že pouuité minožtví odpovídá 55 mg čisté látky) se v prostředí 0,64 ml suchého iimetlylOormcmLdu smíchá s 0,18 g benzylbromidu, a získaný reakční roztok se ponechá za - teploty mítaooti (asi 17 až 18 °C) stát po 3 hodiny za nepřístupu vHkoosi. Reakční směs se frakcionuje na silika^el^ za eluování ethylesterem kyseliny octové, a získá se tak v poddtatě v čistém stavu bennylester výše uvedené kyseliny jako bezbarvý olej ve výtěžku 63 mg. V infračerveném spektru (ve flhu) j^sou ataorpční ^pás^y při ¹ 800, ^{1 74}5 a ^{1 6}95 cm~j v ^NM-sppktru v ^deuterovaném c^hlorofoamu jsou píky při 2,25 (s, 1, zaminntsleý s DgO), 3,05 (d, 1, J = 17 Hz), 3,51 (dd, 1, J 3 17 Hz, J₂ 3 2,5 Hz), 4,24 (d, 2, J 3 7,5 Hz), 4,92 (dt, 1, J « 7,5 Hz, — - 1,5 Hz), 5,15 (d, 1, J 3 1,5 Hz, 5m24 (s, 2) 5,71 (d, 1, J 3 2,5 Hz^ 7,45 delta (s, 5).

Příklad 24

Příprava benzylesteru kyseliny klavulanové ze surové směsi extraktů z filtrátu kultury Streptomyces clcauligsrup

Filtrát kultury o objemu 20 litrů, získaný, jak je to popsáno v příkladu 10, se zahnutí ve vakuu na objem 5 1 za pouužtí odpařování z filmu, načež se lyon-lisuje za pouužtí zařízení Edwarda E. F. 6. shelf freeze drier (výrobce Edwarda Ligh Vacuum Ltd). Pevný podíl o hmotnost 300 g, který se takto získá, obsahuje 3 g sodné soli kyseliny kla vulanové, jak to lze stanovit testem inhibováni enzymu. Získaný pevný podíl se suspenduje v 900 ml suchého dimethylforaamidu a přidá se 150 m benzylbromidu,' načež se reakční směs míchá 2 hodiny za teploty místnosti, a zředí se dále přidáním Litru ethylesteru kyseliny octové. Po filtraci reakiní směsi se filtrát zahnutí na tak malý objem, jak je to jen možno olejovitý zbytek se extrahuje do Litru ethylesteru kyseliny octové a extrakt se filtruje. ' Filtrát se zbovu zahuusí, a vzniklý olejovitý zbytek se v cyklohexanu nanese na kolonu siUka^lu (Biogel Bioes_l A, 100 mesh) velikosti 7,5 na 35 cm. Eluováním za pouužtí cyklohexanu se odstraní z kolony benzylbromid, načež se pouužje dále jako rozpouštědlo ethylester kyseliny octové, a jímají se frakce po 20 ml.

Frakce se testují na přítomnost benzylesteru kyseliny klavulanové nanášením na destičky s tenkou vrstvou silikfgčLj (Merck precoated silica r®l 60 F 254) s následujícím postřikem 2,3,Z-trčtrαyjleUrazoliumc01ýгidovým rearens. Frakce, které poskytují s tímto rearens intensivní červenou skvrnu, se dále testují chromatografováním na tenké vrstvě za pouužltí směsi chloroform--thyyester kyseliny octové 8 : 2 a s následujícím postřikem vyvolaných d<^s^1^:i— iek výše uvedeným rearens.

Benzyleeter kyseliny klavulanové má Ri 0,31 za teploty 22 °C. Frakce, jež obsahují tentc uvedený ester, se spojí, vše se zahnutí na objem 15 ml, a tento roztok se dále chromatografuje na koloně silikarelu (Merck silica rel H, typ 60) velikosti 3,6 na 40 cm za pouuití směěi chloroformu a ethylesteru kyseliny octové 8 : 2 k e^ován. Jímají se frakce o objemu 15 ml, a ty se testují na přítomnost benzzlesteru, jak je ^popsáno výše.

Frakce, které ester obsáhlí, se spoj, vše se zahnutí na 8 ml, a posléze se provede čistění na koloně silikfgčlu (Merc silica gel H, typ 60) velikosti 2,5 na 40 cm za pouuití směsi ethylesteru kyseliny octové a cyklohexanu 8 : 2 k eluovánn. Správně určené frakce se spoj, a zahuštěním ve vakuu se získá čistý beenz!ester ve formě oleje a ve výtěžku 160 mg.

Příklad 25

Příprava beány].esteru kyseliny klavulanové

3,3 kg pevjných pooílů, sušených rozprašováním a obsahujících 69,4 g Ikysliny klavulanové podle stanovení testem inhibováni enzymu se získá podle popisu z příkladu 26. Pevný podíl se rozmíchá do 5,5 litrů dimethylfomamidu, . přidá se 500 ml SenzllSrjmidu, a reakční směs se míchá 2 hodiny za teploty místnost; po přidání 12 litrů ethylesteru tyseliny octové se pevné podíly odífltru j, zahuštěním filtrátu ve vakuu se získá 212 r olejovi-tého zbytku, který se nanese na kolonu a ložem rozměrů 10 cm na 33 cm tiliitgčlj (Hopkkns & Williams MFC) v cyklohexan. Kolona se eluuje za pouuití 12 litrů cyklohexanu, tím se odstraní nadbytek SenУllSromidu, načež se k dalšímu eluování pouuije ethylester kyseliny octové a jímají se frakce po 500 ml. Ty se testují na obsah benzylesteru kresliny ^avulanové nanesením na destičku s tenkou vrstvou silikfgeLj (Merc precoated silica rel 60 F 254) s následujícím postřikem 2,3,5-trlfnyyltrtruzoUiuchljoríOovým rearens.

Frakce, p08kilující intensivní červenou skvrnu, se dále testují na tenké vrstvě silikagelu za po^iužti směsi chloroforau a ettylesteru tyseliny octové 8 : 2 k eluování a za postřiku vyvolaných destiček pomocí právě uvedeného - rearens· Frakce 5 až 13 obsahuj hlavní podíl esteru, spoj se, a vše se zahnutí na olej ve váze 79,3 r. Tento produkt se chromatorrafuje na koloně s^karel^ (Merck silica rel H, typ 60) rozměrů 10 cm na 45 cm za použití směsi chlorof o mu a ethylesteru kyseliny octové 8 : 2 jako rozpouštědla. Wiodné frakce se určí, jak je to popsáno zde již dříve, a zahuštěním se získá 45,9 r oleje o čistotě 62 % podle vyhodnocení NiM-spektrroskpií.

Tento produkt se posléze chromaat^í^r^af^;je . na koloně Sephadex-u LH 20 rozměrů 7 cm na 45 cm ve směěi cyklohexanu a chlorofomu 1 : 1. Po určení frakcí a zahuštění se získá 27,6 r

23И57 bezbarvého oleje, který je, jak to bylo zjiětěno, z 95 % čistý benzylester kyselily klavulanové podle stanovení pomocí NMR-spektroskopie.

Sephadex LH 20 je hydroxypropylovaný derivát Sephsdexu Q25, Pharaacia, Londýn, Velká Britanie.

Příklad 26

Příprava benzylesteru kyseliny klavulsnové

150 litrů filtrátu kultury o pH 7,0 obsahuje 16,2 sodné soli kyseliny klavulanové podle vyhodnocení testen inhibování enzymu. Tento filtrát se rozmíchá a 5 kg anexové pryskyřice Amberlyst A-26 v chloridovém cyklu (Rohm & Hase 0o«, Philsdephia, USA), vše se míchá hodinu, potom se pryskyřice odfiltruje, s filtrát se testuje a tím výsledkem, že byl odstraněn podíl kyseliny klavulsnové v množství 6,4 g. Pryskyřice se promyje ze použití 20 litrů iontů zbavené vody, dále za použití 20 litrů acetonu a 10 litrů dinethylformamidu, načež se po filtraci suspenduje pryskyřice v 2,3 litrech směsi dimethylformamidu s 0,2 M roztoku jodidu sodného, a po přidání 200 ml benzylbromidu se suspense energicky dokonale promíchá. Po stání 16 hodin za teploty místnosti se přidají 2 litry ethylesteru kyseliny octové, pryskyřice se odfiltruje, dále se promývá ethylesteren kyseliny octové, načež se podíly z promývání přidají do původního filtrátu.

Získaný extrakt se zahustí na malý objem, a zbytek se chromatografuje na koloně silikagelu (Merck silice gel H, typ 60) velikosti 7,5 na 45 cm za použití směsi ethylesteru kyseliny octové a cyklohexanu 8 : 2 jako rozpouštědla. Frakce, obsahující benzylester kyseliny klavulsnové, se vyhodnotí testováním na destičkách s tenkou vrstvou silikagelu 8 následujícím postřikem 2,3,5-trifenyltetrazoliumchloridovým reagens, jak je to zde již popsáno dříve v příkladu 24. Správně určené frakce se spojí, vše se zahustí na 20 ml a zbytek se chromatografuje na koloně silikagelu (Merck silice gel H, typ 60) rozměrů 3,6 cm na 45 cm za použití směsi chloroformu a ethylesteru kyseliny octové 8 : 2 jako rozpouštědla. Vhodně určené frakce se spojí, a zahuštěním se získá 440 mg bezbarvého oleje, který je podls vyhodnocení NMR-spektroskopií z 90 % benzylesteren kyseliny klavulsnové.

Příklad 27

Příprava benzyleeteru kyseliny klavulsnové ze surových extraktů filtrátu kultury ze Streptomyces clavuligerua

Část vodného zpětného extraktu butanolového roztoku z filtrátu kultury, jak se získá postupem v příkladu 14, se lyofilisuje. Pevný podíl o hmotnosti 24 g obsahuje 0,96 g sodné soli kyseliny klavulsnové podle vyhodnocení testem inhibévání enzymu. Tento pevný podíl ae suspenduje v 75 nl suchého dimethylformamidu, přidá se 75 ml benzylbromidu, a reakční směs se míchá 2 hodiny za teploty místnosti, načež se suspense zředí přidáním 500 ml ethylesteru kyseliny octové, a po filtraci se filtrát zahustí na malý objem olejovítého zbytku na rotační odparce.

Tento zbytek se nanese na kolonu silikagelu (biogel Biosil A) rozměrů 5 cm na 35 cm v cyklohexanu, benzylbromid se eluuje z kolony, načež se rozpouštědlo nahradí ethylesterem kyseliny octové, в jímají se při eluování frakce po 10 ml. Ty frakce, které obsahují benzylester kyseliny klavulsnové, se vyhodnotí postupem podle příkladu 24. Další čistění ae rovněž provádí postupem podle příkladu 24 chromatografováním na sloupci, s získá se tak 220 mg čistého benzylesteru.

Příklad 28

Příprava sodaé soli kyseliny klavulanové

⁴COONa 'cooch₂c₆h₅

Roztok 281 mg v podstatě čistého benzylesteru kyseliny klavulanové v 25 ml ethylalkoholu se za přítomnosti 82 mg kyselého uhličitanu sodného hydrogenuje na 90 mg 1Ofcního palladia na uhlí 25 minut za atmosferického tlaku a teploty místnosti. Po odfiltrování katalyzátoru se týž promyje vodou a ethylalkoholem, spojené podíly z filtrace a promývání se zahustí za sníženého tlaku, a zbylý polopevný podíl se trituruje s acetonem. Po filtraci a promytí etherem se takto získá 135 mg sodné soli kyseliny klavulanové.

Příklad 29

Hydrolysa methylesteru kyseliny klavulanové na kyselinu klavulanovou

2,17 mg methylesteru kyseliny klavulanové se rozpustí v 0,1 ml methylalkoholu, a přidá se 0,208 ml 0,0482 N roztoku hydroxidu sodného. Po hodinovém stání za teploty místnosti obsahuje reakční směs několik produktů. Podle chromatografie na tenké vrstvě je jasné, Že jeden z hlavních podílů obsahuje látku o shodném s hodnotou sodné soli kyseliny klavulanové; barevné testy a biologické vyhodnocení jsou rovněž v souladu s tím, že tato složka je sodnou solí kyseliny klavulanové.

Pomalé převedení esteru kyseliny klavulanové na kyselinu bylo pozorováno, uchovává-li se 1 mg/ml sloučeniny za teploty 37 °C,v 0,05 M fosfátovém pufru o pH 7« Reakce byla sledována chromatografii na papíře (bioautografický systém). Za použití soustavy butylalkohol/ethylalkohol/voda ke sledování reakce během 2 hodin bylo nalezeno, že pásmo methylesteru o hodnotě R^ 0,79 zmeněilo, jak se pásmo kyseliny klavulanové o hodnotě 0,12 zvětšilo.

Příklad 30

Antibakteriální spektrum kyseliny klavulanové

Antibakteriální aktivita sodné soli kyseliny klavulanové proti četným mikroorganismům byla stanovena za použití mikrotitračního způsobu· Sériová ředění sodné soli kyseliny klavulanové na zápaře pro test sensitivity (Oxoid) v mikrotitračním plastickém kelímku byla očkována na noc kulturou každého z mikroorganismů tak, že konečné ředění inokula bylo 0,5 · Ю“⁴. Kultury byly inkubovány přes noc, a místa růstu mikroorganismů byla zaznamenána příštího rána pozorováním zakalení kultury. Výsledky za vyjádření přibližnou hodnotou minimální inhibiční koncentrace jug/ml jsou uvedeny v tabulce 3, a odtud je jasně patrné, že se sloučenina vyznačuje Širokým spektrem antibakteriální účinnosti·

Tabulka 3

Antibakteriální spektru· sodná soli kyseliny klavulanové

Kmen

Minimální inhibiční koncentrace Hg/ml

Staphylococcue sureua (Oxford H) (Russeli) Bacillus eubtilie Streptococcus faecalis Streptococcus pyogenes CN 10 Escherichie coli NCTC 10418 Klebeiella aerogenes Klebsiella oxytocum Enterobscter aerogenes T 624 Ihterobacter cloacee Acinetobacter anitratus Provideatia stuartii Serratia marceecens Próteus nirabilis C977 Próteus vulgaris W090 Salmonella typhimurium Shigella sonnei Pseudomonas aeruginosa A

7,5 7,5 62 nad 500 125 31 31-62 62 31 62 125 125 125 62 31 31 62 500

Příklad 31

Příklady inhibování beta-laktamapy působením sodné soli kyseliny klavulanové

Klavulanové kyselina úspěšně a ireversibilně inhibuje beta-laktamasu z Escherichie coli. Způsob z popisu 1 ukazuje. Že i jiné beta-laktamasy - viz tabulka 4 - jsou rovněž inhibovány kyselinou klavulanovou.

Tabulka 4

Inhibování beta-laktamas kyseliny klavulanovou

Zdroj beta-laktamasy	Přibližná hodnota vctažaná na Bscherichia coli JT 4 = 1
Staphylococcus aureus (Russell) Escherichie coli JT4 Escherichie coli BI1 Klebeiella aerogenes A Pseudomoaas aeruginosa 1622 (R faktor) Pseudomonas dalgeish	1,0 1,0 2,0 0,6 5,0 0,1

S peniciline· 0 jako eubstrátem činí hodnota sodné soli kyseliny klavulanové proti beta-laktamase ze Staphylococcue aureus (Russeli) asi 0,06 jug/ml.

Příklad 32

Příklady aktivit. meehhyaitaru kyseliny klavulaniové

Z testů aatibacteriPLní účinní sil na zápaře je patrné, ie ae ne^ylest^ kyseliny klavulanové vyznačuje širolýT spektrem účinn^tl, ale nii^ího řádu ve srovnání s kyselinou klavulanovou· Není zatím jasné, jedná-li se o vlastní aktivitu.esteru, nebo o aktivitu kyseliny kla^volanové, jei se uvolňuje pomalou hydrolysou esteru ve vodě.

kyseliny klavulanaiové se vyznačuje zřeteLýT an^bakteriální· synergimm v kombbnaci s ampicilinem nebo ítfaltiidit.t* proti bakteriím, rezistentním aa tato antibiotika. Takie г1п1гР1п1 ^^biční koncentrace ^sp^dinu proti Sta^yl^o^^ aureus (--3^1) se sníH z 500 ps/ml na méně nei 0,4 za přítomn^ti 1,0 pg/ml rettyУ®8teiu kyseliny klavulantvé. Minim&ní inhibiční koncentrace ^f^oridimu ae sníií z 1,5 pod 0,03 pg/mL za. . přítomtotti 1 pg/ml bethcУeзteru kyseliny klavulanové.

Minimáání ^dbi^í koncentrace ^f^oridimu . se sníi z 1,5 /ug/m. pod 0,03 pg/ml za 1 /ug/ml bethhУeзteiu kyseliny klavulanové. Mniminí inhibiční koncentrace ampiiClitu proti Próteus ρΙγζΙ^Ι^ C889 se sníií z 500 pg/ml na 31 ju^/ml. za přítomno o ti 5 j^g/ml mtt^^yl^s^teru kyseliny klavulanové. ,

Příklad 31

Příprava pivaltyltxyrethcУe8teru kyseliny klavulanové

Do míchaného roztoku 0,37 g brtrlbthcУltteru kyseliny piv^ové v 5 ml suchého d^etlh^!ftrrtmidu se přidá 0,49 g sodné soli.kyseliny klavulanové, reakční směs se uchovává 2 hodiny za teploty Гэ^о^!, nadei se zředí přidáním 20 ml . ethyles^^. octové, ml cyklohexanu a 20 П vody. Reakční směs se rozvrství na 2 vrstvy, nevodný . podíl se oddělí, pomyje se za pouští 20 ml vody a se símeem sodným. Zahuštěním vysušeného filtrátu se získá očekávaný produkt jako bledě ilutý olej; výtěiek 500 mg. NM-ssiktium v dtultrov^nlém chloroformu: 1,26 (s, 9), 3,13 (d, 1. J = 17 Hzz, 3,62 (dd, 1, J = 17 Hzj J, = 2,5 Hz), 4,3 (d, 2, J = 7,5 Hz), 5,0 (dt, 1, J » 7,5 Hz, J = 1,5 te), 5,16 (d, 1, J = 1,5 Hz\, 5,79 (d, 1, J = 2,5 Hz), 5,92 . δ (s, 2), infračervené spektrum (kapalný film), C“0 ^{1 800} cm^-1, ester C=^{0 1 760} cm“¹.

Příklad 34

Příprava ftaldoového esteru. kyseliny klavulanové

Do míchaného roztoku 0,43 3-&™ι^ alidu v 5 ml suchého dimethylformamidu se přidá 0,5 g sodné soli kyseliny klavulanové, · reakční směs se ponechá 2 hodiny za teploty rs^t^]^(^tti_k. K roztoku se potom přidá 20 ml ethylenem kyseliny octové, 10 ml cyklohexanu a 30 ml vody, a vše se dobře promíchá. Nevodný podíl se pomyje za pouští 20 ml vody, a po vysušení síranem sodným a zahuštění se jako zbytek získá bledě ilutá guma. Oba dva ěitslereoitortrní estery se odddlí za pouuití vysokotlakové kapalinové thitmbtltgifie na koloně tilikagtlu (Merckosorb SI 60, 5u) rozměrů 40 na 10 cm za eluovltí ethylesterer kyseliny octové a průtokovou rychlostí 3 Π za minutu.

Prvý ftalddový ester (retenční doba 7,15 min) krystaluje z ^1ν1№ kyseliny octové ve formě jehliček o b.t. 102° a má toto infračervené spektrum (v nujolu): beta-lakam C=^{O 1} 790 cm\ ester C=0 ¹ 755 cm“¹. Nlffi-s^ktrim v ^rdeut его vinném acetonu: 3^,14 1,

J « 17,5 Hs), 3,76 (dd, 1, J = 17,5 Hz, J₂ 2,5 Hz), 4,25 (d, 2, J = 7,5 Hz), 5,0 (dt, 1, J, . = 7,5 Hz, J =1,5 Hz), 5,4 (s, 1, J = 1,5 Hz), 5*82 (d, 1 , J = 2,5 te), 7,7 (s, 1), 8,06 δ (m, 4); motetauLtvl hmoonost podle hmotové siektrtreerie: 331,07, coi odpovídá vzorci ^6^3®°? (vypočteno 331107). Druhý ěitstereottober (retenční doba 8,85 min) má toto infra231157 červem spektrum (v mettylencWortoovép roztok^ mta-iaktim °0 1 600 cm^-1, ester 0=0 ^{1 780} cm roffiRS^ktrum v ^utorovittém cMoroformu): 2,42 ⁽ši.ro^ký ^pás^, S, 1, zatměn-telný s D₂O), 3,12 (d, 1 , J ' 16 Hz), 3,60 (dd, 1, = 16 Hz, J = 2,5 Hz), 4,30 (d, 2,

J = 7,5 Hz), 5,0 (dt, 1, Jj = 7,5 Hz, J₂ = 1,5 Hz), 5,12 (d, 1, J = 1,5 Hz^ 5,76 (d, 1, ,J = 2,5 Hz), 7,52 (S, 1), 7,65 á(m, 4)

Příklad 35

Příprava оonyУe8terl kyseliny klavularnové

K 44 mg sodné soli kyseliny klavuleniové se v prostředí 2 ml suchého dkmetlyiformamkdl přidá 76 mg nonyljodiu, a reakční směs se ponechá 2 hodiny za teploty mí^s^t^ť^osi. Potom se roztok zahusí, a zbytek se frakci-onuje na pilkkaueil za el^ování spPbí ethytesteru kyseliny octové a hexanu 2:1; produkt se získá ve formě oleje. Infračervené spektrum (film): ¹ 8°⁰, ¹ 745^{, 1 6}90 cm^-'. Bnmoová spektros^pie: mooelkn.ární hmoonost = 325.19 což odpovídá vzorci CjyHg^NOj (vypočteno 325.19).

Příklad 36

Příprava kyseliny klavularnové

Roztok 100m^g benzyУesteru kyseliny kiavlianloaé v 5 ml ethanol se hydrogenuje za přítomnost 30 mg 10%oí1o palladia na uhlí po 45 za atmooférického tlaku a teploty· mís Хао oSi. Po odfiltrování katalyzátoru se týž promyje ethano^m, a spojené kapalné podíly posкуtují zahuštěním ve vakuu kyselinu kiavulauluvuu ve formě nestálého, vkskusnShu oleje, který se získá ve výtěžku 56 mg. NlMR8ppktrum v pardaut его vinném pyridinu): 3,05 (d, 1, J = 16 Hz), 3,60 (dd, 1, J, = 16 Hz%J₂ = 2,5 Hz), 4,75 (d, 2, J = 7,5 Hz), 5,56 (t, 1, J = 7,5 Hzz, 5,66 (s, 1), 6,0 δ (d, 1, J » 2,5 Hz).

Příklad 37

Příprava peehhУe8terl klavulanové

Směs 130 mg kyseliny klavuiaоLUvé a 10 ml se smíchá a nadbytkem roztoku dkazumetlanf v etheru. Podle sledování na tenké vrstvě je reakce za 2 skončena. Zahuštěním roztoku ve vakuu ee získá zbytek, který se čistí chromtografováním na sloupci pdkkauelu za eluování ethylesiprem tyspliny octové. Frakce, obsahujcí meetyypeter kyseliny klavulanové, se spo;jí, a zahuštěním se zíeká 104 mg čirého oleje.

Příklad 38

Příprava methyyesteru kyseliny klav^rnové

Směs 200 mg kyseliny klavulanové a 5 ml se za míchání ochladí na 0°, přidá se 0,5 ml . methylalkoholu a potom 206 mg dicyklohexylkarbodiimidu, a reakční směs se míchá za teploty mísencoU přes noc. Suspense se filtruje, filtrát se zahnutí ve vakuu, a získá se tím surový οθΙϊ^ΙθιΙιγ kyseliny klavulsn^ové, který se čistí chromíΙο^ιfováním na sil.k^a^gel^u za použžtí ethylesteru octové k eluoviání. Jako produkt se isoluje čirý olej ve výtěžku 140 mg.

Příklad 39

Příprava fenylesteru kyseliny klavulanové

Směs 100 mg kyseliny klavularnové a 5 ml acetoolirilu se za míchaní ochladí na 0°, k získnému roztoku se přidá 0,94 g fenolu a 100 m dicyklohexylkatbodiioldu, načež se reakční směs míchá přes noc za teploty mítmooti. Suspense se filtruje, filtrát se zahustí, zbytek se frlkcioouje na silkkagelu za eluování smmsí ethyles^^ kyseliny octové a hexanu 1:1; získá se tím 70 mg fenylesteru kyseliny klavulanové. Infračervené spektrum (film): 1 800^, ' 1 770^, 1 690 cm”'. NIM-spektrum v ^deutero vinném cliloroformu: ^2,18 ^(šiгo^kS ^pás^, s, 1) 3,06 (dd, 1, J = 17 Hz , J₂»= 0,9 HO, 3,54 (dd, 1, J, = 17 Hz, Jg = 2,6 Hz), 4,29 (d, 2, J = 7,5 Hzz, 5,1 (dt, 1, J, = 7,5 . Hz, J = 1,5 HO, 5,29 (d, 1, J = 1,5 Hz), 5,76 (dd, 1, J, = 2,6 Hz, Jg - 0,9 Hz), 7,35 δ (m, 5)· Moleloilová hmoonost hmotové spektrometrie) = 275*08, což odpovídá vzorci (vypočteno 275,08).

Příklad 40

Příprava 2,2,2-tticУlotttУyltpttts kyseliny klavulanové

221 mg sodné soli kyseliny kl^vul^^n^ové se suspenduje v 5 ml suchého tetra^yrdrofurlos_í i susetnse se míchá za chlazení na 0°, Během 20 mimu se přidává do připravené suspense roztok 211 mg tricУlotttУyltpttts kyseliny v 1 ml suchého tetrahydrofurnu, teplota ^akční smmsi se potom nechá vystouppt na 20°, a reakční směs se míchá přes noc. Potom se s^pense filtruje a filtrát se zahnutí do sucha ve vakuu.

Zbytek se chromoloogaafs je na pilkklgtls za eluování smmuí ethy^ste™ kyseliny octové a hexanu 2 : 1 za vzniku očekávaného produktu, který se získá jako olej. V ioftaačereoдéo ^ektru (film) jsou absor^e při ^{1 8}00^, 1 760 a 1 69⁰ cm”¹. ^N]^M-8pektrum v touterovirném chloroformu: 1,56 (ěiroký pás S, 1), 3,07 (dd, 1, J, = 17,5 Hz, J* - 0,7 Hz), 3,56 (dd, 1, J = 17,5 Hz, = 2,5 Hz), 4,24 (d, 2, J = 7,5 Hz), 4,69 (d, 1, J = 12 Hz), 4,92 (d, 1, J = 12 Hz), 5,02 (dt, 1, J = 7,5 Hz, Jg = 1,3 Hzz, 5,19 (d, 1, J = 1,3 Hz), 5,735 (dd, 1, J| =2,5 Hz, Jg = 0,7 Hz. Molehulová hmotnoot podle hmotového spektra = 328,96, což odpovídá vzorci C^H^NO^Cl^ (vypočteno 328,96).

ČOONa

CICOOR r

CH₂OH

CO-O-COOR

COOR

P HíL i d 41

Příprava sodaé soli tysalloy klavulanové

S^d^is 840 mg benzyluteru kyseliny kLavulяnvvé, 30 m ethanolu a 5 ml vody se na - přítomnosti 267 mg palladia na uhlí a 244 mg kyselého uhličitanu sodného hydrogenuje 25 minut ze teploty -míítnoosi s ze atmovférickéhv tlaku. Po odfiltrování katalyzátoru se týž propne vodou a ethanolem, a spojené filtráty se zahi^e^ltí ve vakuu. Produkt krystaluje ze směsi vody a acetonu ve formě milk^ktVehliČei o lmovtovti 565 mg. Krrystlisací z vody a acetonu se získají jehličky, které Mjí po vysušení nad - kysličnkkem fosforeOným ve vakuu (24 hodin) toto složení:

nelezeno: 41,01 % C, 3,77 % H, 5,68 %N

40,86 % C, 3,64 % H, 5,51 » N

Infrčervené spektrum (v l^oaniém brom^u ^prlse^ln^ém): ^{1 7}65^, 1 ⁷⁰0 ^{1 62}0 cm¹; NlffiRspsktrum v DjO: 3,06 (d, 1, J = 18,5 Hz), 3,57 (dd, 1, J, = 18,5 Hz, J₂ = 2,5 Hz), 4,15 (d, 2, J = 8 fo), 5,3 (HOD), 4,9 (m), 5,71 (d, 1, J « 2,5 Hz).

Příklad 42

AOibbakteiláLoí synergismus wnpiiciinu a sodné soli kyseliny klavulanové

MinimPlní inhibiční koncentrace u^ppcIÍ.C^ou, sodné soli kyseliny klavulanvvé a ipppcílinu za přítomcnti 1 j^gg/mL· sodné soli tyselloy klaoullnvvé se stanoví pro velký počet mikroorganismů, iroduSkšjcích beta-laktimaay. Organismy se nanááejí očkováním na záparu senzitivního testu (Ccoodd, jež je umístěna v mmlých zvlněních na plastické podložce a obsahuje oddělané koncentrační gradienty ο^^ΙΙο^ sodné soli ^sellny klavulanové nebo ιιπρ^ΗΙnu a 1 /ig/pl sodné soli kyseliny kllvullnvoé (Htaxctttraění způsob).

_2

Konečné zředění zápory přes noc odpovídá koncentraci Ι^^Ιι 0,5 · 10 . Destička se inkubuje přes noc za teploty 37 °C, a příštího rána se provede záznam konečných bodů mikrobiálního růstu. MinimPliO iohibičoí koncentrace v /ug/ml jsou zaznamenány v tabulce 5, a je patrné, -že synergismus za nízké koncentrace 1 /ug/ml zřetelně zvyšuje Loí účlooost u^ppcdi^o^u proti některém grllmpivitivníp a grap-negatlvním mikrovrglnipmům. Pravděpodobně lze oyyvOttit tento synergismus tím, že dochází k СоНСЬ^-п! beta-laktapapy, jež by roznuáHa app^CHo, He nelze vyloučit funkci jiných mechanismů.

Podobné výsledky, jaké jsou v tabulce 5, byly dosaženy byy-li a^ppcClio nahrazen amooycilOnep nebo ftalPdyVoým esterem lmpiiClCou.

Tabulka 5

AntbblktrtιϋLoí synergiamus α^piiCli^ns a sodné soli kyseliny klaoullnvvé

Kmen	MinimPlní iohibičoí koncentrace /ug/ml
sodná sůl typsliny klaoullnvvé	a^ppiClin	a^ppcClin za přítomno oti 1 sodné soli kyseliny klavullnové
Escheer.cMa
coli - NCTC 10481	31	1,8	pod 0,4
Echerichia coli B 11	62	nad 500	125
^nebsí^a aerogenes A	31 '	125	pod 0,4

Kln^salla sp. 62

125 pod 0,4 kmen Minimální inhibiční koncentrace /ug/pl

	sodná sůl kyseliny klavulanové	ampicilin	«πρ^ϋ^ za přítomnosti X jug/PL· sodné soli kyseliny klavulanové
Ennerobscter cloacae	62	250	62
Serratia εριτ88^μ	125	nad 500	62
Staphylococcus aureus (RussU)	15	500	pod 0,4
Staphylococcus aureus (kmen, il8iseenení na	62 methimicin)	250	7,5

Příklad 43

AnibaOkeei£ILní eynergiemus cefaloridinu a sodné soli kyseliny klavulanové

Minimální inhibiční končentrnce cefaloridinu, sodné soli tyseliny klavulanové, jakož i cefaloridinu za přítomnost 5 /uug/pl sodné soli kyseliny klavulanové se stanoví za použití postupu z příkladu 42. Výsledky jsou v tabulce 6, a je z nich patrné, že existuje synergismus mezi sodnou . solí kyseliny klavulanové a cefaloridnnem, zvláště pro kmeny Staphylococcus aureus (Russll), produ^^ící beta-askamaau.

Tabulka 6

А^Ь^от^ synergismus mezi cefaloridnnem a sodnou solí kyseliny klavulenové

Kmen	Minimální inhibiční	koncentrace /u&/pl
	sodná sůl kyseliny klavulanové	cefaloridin	^Тв^г^п s 5 /ug/pl sodné soli kyseliny klavulanové
froteus p^íIíUs 899	nad	500+*//	62	7,5
Staphylococius aureus (Riussn)		15	3,1	pod 0,03+/
Staptylococcus aureus (kmen, resi^entní na ,¼'¼/iřlsahužíií bod	ppehimicin)	62	15	3,7

♦/ stejná hodnota byla dosažena, jestliže synergicky působící látka byla přidána v množ tví 1 /uug/ml místo 5 /uug/pi < Příklad . 44

ΑΜβΜ^Η&ηί synogismus mezi sodnou solí kyseliny klavulanové s různými peniciliny

Výsledky jsou uvedeny v tabulce - 7; byly dosaženy za pouužtí postupu, popsaného v příkladu 42.

Tabulka 7

Antibakteriální synergismus mezi sodnou solí kyseliny klavulanové a různými peniciliny proti kmenům Klebsiella aerogenes

Kmen	Amoxyciliá	Karb.nicilia+/	Benzylpenicilin
sám	* 5 Mg/ml synergický působící látky	sám	* 5 Mg/ml synergický působící látky	sám	* 5 pg/nl synergický působící látky
A	500	0,97	500	7,6	250	7,8
E 70	500	3,9	500	15	500	15,6
62	250	15,6	125	7,8	250	15,6
“^Podobných	výsledků bylo dosaženo při	použití fenyl-alfa-	esteru	karbenicilinu nebo
tikareilinu	místo	karbenicilinu.
P ř í к 1 a	d 45

Antibakteriální synergismus ampicilinu a esterů kyseliny klavulanové

Výsledky jsou uvedeny v tabulce 8; byly dosaženy za použití postupu z příkladu 42.

Tabulka 8

Antibakteriální synergismus ampicilinu a esterů kyseliny klavulanové proti kmenům Klebsiella aerogenea

Kmen	Ampicilin jako takový	Ampicilin * 5 jug/ml methylesteru kyseliny klavulanové	Ampicilin * 5 jug/ml beazylesteru kyseliny klavulanové
A	500	1,9	1,9
E 70	500	• 3,9	3,9
62	500	3,9	3,9

Ani methylester kyseliny klavulanové, ani benzylester této kyseliny neinhibuje růst testovaného organismu za koncentrace 100 /ug/ml.

Příklad 46

Amtibakteriáilní účinnost esterů kyseliny klavulanové

Za použití postupu z příkladu 30, ale za použití zředění 1/100 zápsry, byly dosaženy dále uvedené hodnoty minimální inhibiční koncentrace - viz tabulka 9 - některých esterů kyseliny klavulanové proti uvedeným mikroorganismům·

Tabulka	9
Antihakteriální	účinnost	esterů kýseliny klavulanové
Organismus		Minimální	inhibiční koncentrace	Min. inh. k.+/
		esterů kyseliny klavulanové	sodné soli
	benzyl	nonyl-	pivaloyl-	ftalidyl-	kyseliny kla-
	ester	ester	oxymethyleater	ester	vulanové
Bacillus subtilis A	250	31	62	125	62
Staphylococcus aureus Oxford	62	31	31	31	15
Staphylococcus aureus Russeli Escherichia	125	31	62	15	15
coli 10418	125	nad 500	125	125	125

^+/<Minimální inhibiční koncentrace sodné soli kyseliny klavulanové je připojena pro srovnání; vysoké hodnoty minimální inhibiční koncentrace (při srovnávání s hodnotami z příkladu 30) jsou dány použitím těžkého inokula.

Příklad 47

Extrakce kyseliny klavulanové za použití kapalné iontoměničové pryskyřice

200 ml filtrátu kultury, získaného podobně, jako v příkladu 3, ale za použití prostředí, obsahujícího objemově 0,1 % prim, fosforečnanu draselného místo 0,01 % heptahydrátu síranu železnatého, se extrahuje 30 minut při 5 °C Amberlit-em LA2* v chloridovém cyklu, objemově 15 % v methylisobutylketonu, 66 ml celkem. Amberlit LA2 je výrobek Rohm and Haas, Croydon, Velká Britanie.

Fáze se oddělí odstředěním (1 660 g, 20 minut), a získá se tím 60 ml fáze rozpouštědla, a tato fáze, odtažená pipetou, se rozdělí na 4 rovné dávky. Každá z nich se extrahuje za míchání a za teploty 5 °C po 20 minut použitím objemově čtvrtiny (3,75 ml) vodného extrakčního činidla, jak je to blíže uvedeno v následující tabulce. Vzniklá směs se centrifuguje (1 660 g, 15 minut), a z každé extrakce se získá 3,6 ml vodné fáze.

Vzorek	Objem (ml)	Koncentrace kyseliny klavulanové (pg/mT1)	Klavulanové kyselina (mg)
vyčeřená zápara	200	128	25,4
extrahovaná zápara	200	15	3,0
extrakt M NaCl	3,6	305	1,’
extrakt 2 M NaCl	3,6	598	2,5
extrakt M NaNO^	3,6	63Θ	3,3
extrakt 2 M NaNO^	3,6	758	2,73

Výsledek, dosažený za použití 2 M roztoku dusičnanu sodného, odpovídá isolnci z 43 % z vyčeřené zápary.

Příklad 48

Extrakce kyseliny klavulsnové za použití kapalné iontománičové pryskyřice litrů vyČeřené zápary, jak se získá v příkladu 12, se extrshuje za použití Amberlit LA2 (acetátový cyklus, objemové 15 % v methylisobutylketonu, 12,5 litrů), s to mícháním hodinu při 17 °C. Po přidání 500 ml 1-oktanolu se fáze oddělí kontinuálním odstředěním za vzniku 9,2 litrů fáze rozpouštědla, a tento podíl se dále míchá za chlazení na 5 °C po 90 minut s 2,3 litrů M roztoku dusičnanu sodného. Směs se dělí kontinuálním odstředěním za vzniku 2,4 litrů vodné fáze (to zahrnuje i vodu, použitou к doplňování). Hodnota pH vodné fáze (původně 8,0) se upraví přidáním koncentrované kyseliny chlorovodíkové na 7,0.

Vzorek	Objem (litrů)	Koncentrace	Kyselina
		kyseliny	klavulové
		klavulové	(mg)

tyl g/ml¹)

vyčeřená zápara	47	146	6 862
extrahovaná zápara	47	19	893
extrakt v M NaNO^	2,4	1 638	3 931
Účinnost extrakce	z vyčeřené zápery do	extraktu v dusičnanu	sodném odpovídá 57 %.

Příklad A p-brombenzylkyseliny klavulanové

К 70 mg sodné soli kyseliny klavulanové v prostředí 1,0 ml dimethylformamidu se přidá 245 mg p-brombenzylbromidu, a reakční směs se ponechá 2 hodiny za teploty místnosti. Rozpouštědlo se oddestiluje ve vakuu, a zbytek se frakcionuje na koloně silikagelu za eluování směsí ethylesteru a hexanu v poměru 3:1· Získá se tím očekávaný produkt ve formě jehliбек o t.t. 101 až 102 °C. Infrečerveaé spektrum (CHCl.j) 1 805, 1 750 a 1 695 cm’. HMR-spektrum (CDCl^), 61*94 (1H, singlet, OH), 3,12 (1H, dublet dubletu, J = 17,5 a 0,7 Hz, 6 0-CH), 3,62 (H, dublet dubletu, J » 17,5 a 2,5 Hz, 6«-CH), 4,32 (2H, dublet, J = 7,0 Hz, 9-CHg), 4,99 (1H, dublet tripletu, J = 7,0 a 1,5 Hz, =CHCH₂OH), 5,20 (1H, singlet, 3-CH), 5,28 (2H, ainglet. COOCHp, 5,81 (1H, dublet dubletu, J = 2,5 a 0,8 Hz, 5-CH), 7,45 (2H, dublet, J ³ 8,5 Hz, aromatické protony), a 7,68 (2H, dublet, J ³ 8,5 Hz, aromatické protony.

Příklad C /?-(N,N-Di.ethyl)amin°ethylester kyseliny klavulanové

a) Stříbrná sůl kyseliny Clavulaюoíé (vSechny dále uvedené postupy se provádějí takřka v úplné hemanOě).

2,93 g tetrahydrátu sodné seli klavulanové kyseliny v 6 ml iontů zbavené vody se smíchá s roztokem 1,69 g dusičnanu stříbrného v 2 ml iontů zbavené vody, za 5 minut se hnědavě žluto zbarvená sraženina odfiltruje, promyje se za použití 2 ml iontů zbavené vody, dále za pouuití 10 ml acetonu a sušením ve vakuu se získá 620 mg stříbrné soli kyseliny klavulanové ve formě hnědožluté pevné látky. Infračervené spektrum: v_m(nujol) 1 785, 1 695 Unflex), a ¹ 5⁸⁰ (S^oký ^pás) cm^-1.

b) Tvorba esteru

500 mg stříbrné soli kyseliny klavulanové se přidá k 135 mg (0,6 ekvivalentů /?-(N, N-diethyl)-aiinoeth,ylchlerifu v prostředí 3 ml dimethylformamidu, a reakční směs se míchá za temna a za teploty hodinu. Potom se suspense zředí přidáním 10 ml ethylesteru octové kyseliny, filtruje se a zahuštěním filtrátu do sucha se získá bledě žlutý olej, který ^post^u^^pn^ě tmavne stáním. ^In^fra^čtrven^é s^ktrum: ^(film): ^{1 800}, ¹ 75⁰, ^{1 6}95 cm^-1;

NIM-spektrum (CíI)), δ 1,04 (triplet, J = 7,5 Hz, HÍCHgCH^g, 2,.43-3,0(mltlplet, -CHgCHgNÍC^C^)^ 3,07 (^к^ег, J = 17 Hz, 6 /?-CH), 3,53 (dublet dubletu, J = 17 a 2,5 Hz, 6 a- CH), 3,62 (Široký singlet, OH), 4,32 (ι^^ρΐ^, 9-CHg a COOCHgCHgN), 4,98 (široký triplet, J = 7 Hz, 8-CH), 5,12 (široký singlet, 3-CH), 5,76 (dubbet, J = 2,5 Hz, 5-CH).

Příklad i

An°hracen-2-ylietlhletttr kyseliny klavulanové

Směs 0,5 sodné soli kyseliny klavulanové a 1,0 g 9-chlormethylanthracenu se míchá v femethylformamidu za teploty mstnooti přes noc, potom se reakční směs ronděluje mezi ethyle ster octové kyseliny a vodu, a vrstva roztok v ethylesteru octové se zahustí za sníženého tlaku. Frakcionováním na silikagelu za eluování směsí ethylesteru octové kyseliny a hexanu (1 : 1) se získá žlutý krystalický produkt ve výtěžku 0,5 g, tj. 57 %, t.t. 120 °C. Infračervené spektrum (CHCl^): 1 805, 1 745 a 1 695 cm’¹. NIM-sppktrum (CD1₃ δ 1,35 (1H, široký pás, OH), 2,90 (1H, dublet, J = 47 Hz, 6 /J-CH), 3,35 (1H, dublet dubletu, J = 17 a 2,5 Hz, 6a-CH), 3,96 (2H, dublet, J = 7 Hz, 9’CH^g, 4,61 (1H, Široký triplet, J = 7 Hz, CH-C^OH), 4,98 (1H, singlet, 2-CH), 5,52 (1H, dublet, J = 2,5 Hz, 5-HH), 6,13 (2H, singlet, COOOHh), 7,2-8,5 (9H, muutiplet, aromatické protony).

Příklad E

N-Benzoxxzooonnymethhyeeser kyseliny klavulanové

K roztoku 0,6 g sodné soli kyseliny klavulanové (ve formě tetrahydrátu) v 6 ml N,N-dieethylforeaeidu se přidá oa teploty místnooti a oa míchání 0,4 N-chlormethylbenonxlonlonu; oa 4 hodiny se rozpouštědlo vydeesiluje ve vakuu a zlytek se rozd&.uje mmzi 25 ml ethylesteru octové kyseliny a 25 ml vody. Vrstva ethylesteru octové k/seliny se vysuší bezvodým síranem sodným a zahuštěním filtrátu do sucha se získá olej, který se čistí sloupcovou chromettngrffí na silikagelu oa pouuití cyklohexanu a ethylesteru kyseliny octové k eluováií. Po oddeeSilnvání rozpouštědel se získá 0,5 g produktu v pěnovité formě. Infračervené spektrum (film), 3 . 400 (ši^zrok^ý pás, OH), 1 790 (široký pás, leta-laktam, C=0 obou esterů), ¹ 695 cm’¹ (C=CC. NJM-s^ktrum: ^{1,6 (}1H, ^rcký sin^glet, zaměňuje se s ^D^O^, CH^H)^{, 3,0} (1H, dublet, u = 17 Hz, 6-/7-CH), 3,44 (1H, dublet dubletu, J = 17 Hz, J = 3 Hz, 6- a -CH, 4,08 (2H, dublet, J - 7 Hz, CHgOH, 4,79 (1H, triplet, J = 7 Hz, CH), 5,02 (1H, singlet, 3’CH), 5,60 (1H, dublet, J = 3 Hz, 5-CH), 5,86 (2H, singlet, C^-N), 7,12 (4H, široký singlet . C^H),

Ds1ší vzorek, připravený nbenbně, tuhne stáním a má potom t.t. 95 °C. Infračervené spe^ktrum (nujo^ 3 5⁶^ ³ 490 ^{1 70}5 ^{1 750} i ^{1 690} c^m’'.

Příklad F

2-(eenzzll>xχkklrlnyl))22benzzloxχkklrlnyll^lmnoCeehhlester kyseliny klavulanové

O

\ /

COOCChCC^

NHCOOCH2C₆H₅

COOCH2C6H₅

V prostředí suchého tetrahyerofuranu se vychladí 199 mg kl^u^nové kyseliny na 0 °C i přidá se 660 mg lenzylesteru N-beneyloxylkrblnel-’Lserieu i dicyklohexylklrlodiieie.

Reakční směs se nechá stát, ai teplota dostoupí 20 °C, ponechá se takto oa m^a^g^ee-ického míchání přes noc, i oddestioováním rozpouštědla oa sníženého tlaku , jakož i frakcConováním olytku na sil-kl^a^gelu se získá po eluování ethyles^^i^zeem kyseliny octové i hexanem ve smmsi

108 mg produktu ve formě deje.

Infračervené s^ktruo (ΟΗ^): ^{1 1 760}, ' ¹ 7²5 cm. NM-s^ktiuio CCDCl^) δ :2^,2 (1Щ široký pás, OH), 2,94 (1H, dublet, J = 17 Hz, 6 Č-CH), 3,33.(1H, dublet dubletu, J = 17 -2,5 Hz, 6u-CH), 4,99 (1H, singlet, 3-CH), 5,10 (2H, singlet, СООСН)/^, 5,18 (2H, sin/let, COOCHhHcH₅), 5,45 (1) dubbet, J = 2,5 Hz, 5-CH), 5,81 (1H, široký dubbet, J = 8 Hz, NH), 3,35 (10 H, sin/Let, 2 y C^).

Zbbwjící protony se jeví v obbasti 4,1 až 4,9S jako komplexní sestava.

Příklad G

3-Уyoorcopyee8ter kysebiny kbaluLL^010vé

NM-ssektrum (CIDCj 2,03 (2H, mžtip0et, CH₂C1H>CN), 2,50 (2H, triplet, J = 6 Hz, HHgCn, 2,68 (1H, široký pás, OH), 3,05 (1H, dubbet, J = 17,5 Hz, 60-CH), 3,55 (1H, dubbet dubbetu, j = 17,5 = 2,5 Hz, 6a-CH), 4,1 až 4,5 (4H, muLipbet, ΗΟΟΗ) a CHgOH), 4,93 (1H, triplet, J = 7,5 Hz, 8-CH), 5,13 (1H, singlLet,· 3-CH), 5,72 (1H, dubbet, 2,5 Hz, 5-CH).

V 50 Ol dimethylformaoidu se rozpuutí 2,9 η sodné sobi tyseliny klavulancvé, a za teploty oístnooti se přidá 2,2 g nitriLu kyseliny é-brommásLné) Reakční směs se míchá 3 hodiny za teploty oístloocPi, potom se vzorek testuje chromoaogHraií na tenké vrstvě silikagelu za vyv^ení ethylestereo octové kyseliny; je patrná značná tvorba esteru (Ry = 0,6).

Reakčinf směs se zpracuje obvyklým postupem, tj. extrakcí do ethylesteru octové kyoeeiny a oěkclikιnáSooboýo proutím organické vrstvy vodou, s vysoušením símeo hořena tým a následujícím cddestibováoLÍP rozpouštědla, až zbude žlutý olej. Podle NlM-spoetгa obsahuje produkt nadbytek nezrea/ovaného nitriLu, takže se dej rozpětí v chloroformu, a roztok se nanese na kolonu 20 g kysličníku křemičitého 060 s následujícím eluováním chL^d^of(rm^<^0) Frakce, obsahnuící podle vyhodnocení chrcmoaocнaaií na tenké vrstvě produkt, ,se jíoají, společně se zahuutí ve vakuu ' a ve formě bledě žlutého produktu se isoluje očekávaný produkt. Infračervené spektrum a NM-spoktrum jsou v souladu se strukturou produktu, obsahužííSho stopy rozpouštědel.

Příklad H

O-Tritylrthrr benzylesteru klavulaniové kyseliny

^°, zCHCH,OH ^0=Cíx/ XOON.

XK ^chch₂oh ^COOCHj -/^-OC(C_tH_s)₃

Z* teploty matrnooti se rozpuutí v 500 ml di^methyiormamidu 17,1 g- tetrahydrátu sodné soli klavulanové kyseliny a potom ae přidá 23 g p-tritylatharu bttnBylbromidu (vsLPL surový produkk). Roztok se míchá hodinu za teploty mι^1^l^ilt^i, a zpracuje se dále obvyklým způsobem extrakcí do ethy^ste^ octové kyseliny atd. Produkt se isoluje sloupcovou chjror^maoogaaií na 400 g sL10kagslt G60 za pouKtí soustavy chloroform a n-hexan (1 : 1).

Takto získaný produkt obsahu je stále nečistoty, citlivé na ultrafialové světlo, nikoli však ze skupiny ^svu^nové kyseliny, a další chrumatografické- čistění bylo provedeno na 40 g sL10kagslt 060 za pouužtí soustavy stUdlsatsa kyseliny octové a n-hexan (1 : 1) k eluoviérní. - ' Byl tak - získán vyhovující produkt. NMR spektrim je v souladu a uvedenou strukturou: v CD^^3- δ 2,94 (IH, dubbet, J » 17 Hz, 6 β -CH), 3,40 (1H, dubbet dubbetu, H = 17 a 2,5 Hz, a - -CH), 4,16- (2H, dubbet, J « 6,5 Hz, CH^O», 4,83 (1H, triplet, J = 6,5 Hz, 8-CH), . ' 4,99 (3H,- Široký - sing^t, С00<Ш₂ - a 3-CH), 5,61 (1H, ditbat, J - 2,3 Hs,- 5-CH, 6,6-7,7 (rnUltpp·*, salmpSické - protony). Infračervené spektrum v nujolu: 1 805, 1 747, a 1 695 cm'¹.

Příklad I

Е^охху^Ьу^с^г О^еИлу 01avulsmlvé

K roztoku 5,0 g bezvodé sodné soli klavulanlvé tyieliny v 50 m suchého dimethylformamidu se přidá za míchání 2,14 g (1,5 ml) ethlxymShhllhloridt, a sai za 30 - minut míchání za -teploty mlítnooti- se reskční.aměs zahustí ve vakuu, a ke zbytku se přidá voda a ethylesteru octové - kdaelLny· Roztok v uvedeném rozpouštědle se vysuší bezvodým sírinem sodným, a zahuSténím fLir^tu se získá olej, který se chromat Datuje na sL10ksgslt za použití směsi cyklohexamu a sthylsstsat (1 : 1) k elulván. Frakce, obsaHujcí- podle testování chrompSolraSií na tenké vrstvě produkt, se - spoj roztok se zahuutí za sníženého tlaku a - získá se tím 2,98- g bledě žlutého oLsís. Infračervené spektrum (film) ^vmx*‘ ³ 400 (Široký pás), 1 800, 1 746, 1 698 cm*¹. OTM-spektrum (COClj), £:^22 (3H, triplet, J * 7 to, CH}), 2,94 (IH, dubbet, J » 17 Hz, 60-CH), 3,13 (IH, singlet, OH), 3,50 - (IH, dubbetdubletu, J = 17 a 3 Hz, 6 a-^CH, 3,68 (2H, kv.druulet, J · 7 Hz, CHgCHj, 4,16 (2H, dubbet, J « 7 Hz, 9-CH,), 4,91 (IH, triplet, J = 7 Hz, 8-CH, 5,06 (IH, elnglet, 3-CH, 5,29, 5,37 (2H, ABkovadruplt, J » 6 Hz, CH₂0CcH₅) a 5,68 (IH, J « 3 Hz, 5-CH,

P ř íkn d J

2-Brompstud·ster 01auulamoué kyseliny

K- roztoku 2,05 g te^ah^^tu sodné soli kyseliny v 5 - ml dipethylforπapidu se přidá 1 ml 1,2-dbbromethanu, a reakcí směs se míchá 7 dní za teploty mfítnoosi. Potom se největší podíl rozpouSiSdla odstraní za vakua a teploty 30°C, 0e zbytku se přidá voda a ^akční směs se extrahuje do et^leste™ octové kyseliny. Získaný roztok v uvedeném rozpouštědle se promije vodou, vysuší se síranem hořečnatým, a po filtraci se rozpouštědlo

Produkt se isoluje sloupcovou cUrompStlgaail na silOksgslt za pouužtí ethylesteru octové kyseliny 0 sltluάmí.

Výtěžek činí 168 mg.

3,49 (2Н, triplet, J = 7 Hz), 3,48 (1H, dubletdubletu, J = 3 a 17 Hz), 4,18 (2H, dublet, J = 7 Hz), 4,43 (2H, triplet, J = 7 Hz), 4,93 (1H, triplet, J = 7 Hz), 5,05 (1H, singlet s jemnou kopulací), 5,67 (1H, dublet, J ^s 3 Hz).

Příklad К

Fenacylester kyseliny klavulanové

OH

COOCH₂COC_eH_s

К roztoku 0,5 g tetrahydrátu sodné soli kyseliny klavulanové v nejmenším možném množství dimethylformamidu se přidá 0,34 g fenscylbromidu, a reakční srnče se míchá za teploty místnosti 3 hodiny· Potom se rozpouštědlo vydestiluje ve vakuu, a zbytek se rozpustí v ethylesteru octové kyseliny, roztok v uvedeném rozpouštědle se promyje vodou, vysuší se sírsnem hořečnatým, a zahuštěním filtrátu se získá 400 mg fenacylesteru ve formě pevné látky o t.t. 89 až 90 °C. Infračervené spektrum (film): 3 450, 1 800, 1 760 a 1 700 cm^-1. NMB-epektrum (CDClj), δ 3,02 (1H, dublet dubletu, J » 17 Hz · 1 H2, 6 Д-СН), 3,65 (1H, dublet dubletu, J = 17 a 3 Hz, 6«-CH), 4,20 (2H, dublet, J = 8 Hz, 9-CH₂), 5,00 (1H, dublet tripletu, J ’ 8 Hz, »CHCH₂OH), 5,23 (1H, Široký singlet, 3-CH), 5,58 (2H, singlet, CH₂COOC₆H₅), 5,74 (1H, dublet dubletu, J = 17 a 1 Hz, 5-CH), 7,7 (5H, multiplet, COC^), molekulová hmotnost (hmotnostní spektroskopií):

vypočteno: 317,09 nalezeno: 317,09 Analysa: vypočteno: 60,57 % C, 4,73 % H, 4,42 % N nalezeno: 60,23 % C, 5,00 % H, 4,40 % N

Příklad L

2-Pyridylmethylester kyseliny klsvulanové

К roztoku 1,17 g tetrahydrátu sodné soli kyseliny klavulanové a 1,01 g hydrobromidu 2-pyridylmethylbromidu v 8 ml dimethylformamidu se přidá 552 mg uhličitanu draselného, a reakční směs se míchá po dobu noci. Po zředění stejným objemem ethylesteru octové kyseliny se roztok filtruje, filtrát se zahustí a zbytek se extrahuje do ethylesteru octové kyseliny, tento postup se opakuje, a produkt se potom Čistí chromatografováním na silikagelu sa eluování ethylestere· octové kyseliny.

Výtěžek činí: 335 mg· Infračervené spektrum (film): 3 450, 1 805, 1 750 a 1 695 cm¹. NMR-spektrum (CDCl^: Ó 2,48 (1H, široký, zaměnitelný pás), 3,01 (1H, dublet, J = 17 Hz), 3,45 (1H, dublet dub,letu, J = 17 a 3 Hz), 4,19 (2H, dublet, J = 7 Hz), 4,91 (1H, triplet s jemnou kopulací, J = 7 Hz), 5,1 (1H, singlet, s jemnou kopulací), 5,25 (2H, singlet), 5,66 (1H, dublet, J = 3 Hz), 7,1 - 7,4 (2H, multiplet), 7,67 (1H, dublet tripletu, J = б a 1 Hz), 8,52 (1H, dublet, J = 6 Hz).

Příklad Μ

N-βenoyloxykιt?bonoC-N-meehylαm^oethhCl8t·r kyseliny klavulanové ⁴ΟΟΟΟΗ₂ΟΗ₂ΟΗ₂Ν^

CH₃

OOOCH₂C_eH₅ g bennyCesteru kyseliny klavulanové sa hydrogenuje za přítomnnoti 400 mg 10%iího palladia na uxlí v prostředí 30 mL tetrahydrofuranu, až nelze zjistit přítomnost esteru. Potom sa roztok filtruje a použije, jak je to popisováno zde dále:

^-oztok 3^,71 ^g N-rneehyíL-N'-nitroso-N^,N^t-dibeoz^clox^ykarbon^oC-l^,2-dⁱamiooet^haou v ¹⁰ ' d mt^t^j^l.ft^(^l^].ori^du se ochladí na -30 °C, přidá se 0,71 g pyrTnlidinu, načež se reakční roztok míchá 30 minut za chlazení na -25 až -30 °C, ochladí se až na -35°C, a k této reakční směsi se přidá výše připravený -roztok klavulanové kyseliny za míchání tak, že teplota připraveného roztoku diazosloučeniny nevystoupí nad -30°C. -eakční směs sa míchá dalších 15 minut, přidá se 0,5 ml atherátu fluoridu toritého, roztok sa míchá ještě 5 minut, přidá se nadbytek roztoku hydroge^^^^anu sodného, vodný podíl se oddělí a extrahuje ae methyleochloridem. Spojené roztoky v meehyleochloridu se promyyí vodou, a po vysušení síroem hořečnatým a· zahuutí. Opakovanou chromttoerafí zbytku na silikaetlž H v ethylesteru kyseliny octové za eluovéní chlooomem a etherem se získá 180 mg bezbarvé gumy.

Infra^rvené spe^rim (tfLta): 3 450 ¹ 800^{, 1 7}45 a ¹ 60° cm”'. OT^-spektrum (CID^): δ 2,25 (1H, široký pás, single, zaměniel^), 2,93 (3H, single^, 3,00 (1H, dudee), 3,3-3,6 (5H, η^αρίβ^, 4,17 (2H, dudat, J 3 7 Hz), 3,85 (1H, triplet, J « 7 Hz s jemnou k^I^p^ui^aí), 4,98 (1H, singlet), 5,08 (2H, single*), 7,28 (5H, singl·*)·

Příklad N

1-AcceooχcthyCo8t·o klavulanové kyseliny

Do 5 ml suchého íimehhylfoгmamidu ae za chlazení na 0 °C přidá 1,025 g tetrahydrátu sodné soli klavulanové kyseliny, potom za 10 minut 1 ml 1-brome·tyCesh·ru octové kyseliny· -eakčrní směs se nechá stát po dobu noci v ledničce, potom ee rozpouštědlo oddítSiluje ve vakuu, ke zbytku se přidá voda, a reakční směs se extrahuje ·hhylett·г·m octové kyseliny· Organická fáze se promuje vodou, vysuší se síranem hořečnatým, a po zahuštění se zbytek chromatoog'·tfιj· na tiliktetl.ž 60 a za pouHtí ethylenu octové kyselily; zíaká se . tím 176 mg sloučeniny, jejíž složení je uvedeno v otdpPse, R? 3 0,49· , ^Iofrtčtov·o^é spektrum 3 ^{1 81}0 ^{1 770} a ^{1 695} cm“'. ^IR-spektrum δ 1,47 a 1,49 (3H, 2 dudá ty, J = 5 Hz, smša isomerů na prvém uhlíku ethylové skupiny), 2,04 (3H, singlat), 3,01 (1H, dublet, J » 17 Hz), 3,45 (1H, dublet dubletu, J « 17 a 3 Hz^ 3,15 (1H, široký a zarnČitelný pás), 4,17 (2H, duHei, J = 7 Hz), 4,80 (1H, muHiplet), 4,98 (1H, singlů s jemnou kopužaaí), 5,63 (1H, dudat, <J 3 3 Hz, 6,78 (1H, . kvadruplet, J 3 5 Hz).

	Příklad O 1-EthoxyУttObralooχsehlS·stcr kyseliay klalultnrvé a) kyseliny chloimrsvsjačí Za varu pod zpětným chladičem se míchá směs 108,5 g ethylesteru kyseliny chloimrsvenči a 0,5 g alfa-tzciscbtts*ooitrilt; roztokem se vede proud suchého chloru, ai se dosáhne hmotnostního přírůstku 34,5 g (olppoldatícího monachlorrai), a potom se kapalina foakciontje za atnocfárickéhc tlaku, a eíská se 33 g 1-illcoctlslestcot kyseliny illrxmra▼enčí o t.v. 117 ai 118 °C. b) EthlS-1-cllcrethylsctso kyseliny uHičité
4	H,3 g produktu es stupně (a) zde výše se vkapc do 50 ml ethanoíLu; teplota se přioom zvýSí samovolné ai na 62 °C. Po poklesu teploty na 30 °C se přidá 200 ml vody, vyloučí se tím těžký olej, který se odHLÍ. Vodná fáes se extrahuje třikrát vidy za pouuití 50 ml
L k	liihlo]methtnt, extrakty se spojí, a po vysušení síranem hořena tým se filtrát eahuusí. Zbylý olej se destiluje ea atm. tlaku, a eíská se tím 12,1 g očekávané sloučeniny o t.v. 155 ai 157 °C. Struktura byla potvrzena NM-spektřem L výsledky elementární analysa: Pro C5H9CIO3 vypočteno: 39,4 % C, 5,9 i H, 23,2 A Cl nalezeno: 39,5 Ca 6,2 % H a 23,25 Cl c) 1-(Etlcxskιu:,boonSooχ)eChlSeзter k^i^í^lL^ny klaDl^ové Roztok 3,04 g produktu ee stupně (b) v 5 ml dimethylfomamidu se přidá do míchaného roztoku 5,86 g sodné soli kyseliny kltvulancvě a 500 mg ÍoIíIu draselného v 15 ml Umethylformamldu. Za 21 hodin se reakční směs zředí přidáním 250 ml ctlylcstcot octové kyseliny, promyje se nasyceiýfa vodným roztokem lydrogenuUličittmu sodného, vysuší se síranem hořečnatýfa, a zahuštěním se isoluje olej. Ten se čistí ilromaaoog‘oaovlíáLÍm na scp^Icnu LH20 ea pouuití soustavy chloroform a cyklohexan (1 : 1) a výsledkem je 206 mg bledě dutého oleje. PřL chrrmatojg!‘afování na tenké vrstvě ea poudtí soustavy chloroform a iyklchexan (1 : 1) má látka jedinou skvrnu. Struktura této sloučeniny byla potvrzena NM-sppetry. Příklad P MeChloχ'methlSeetcr kyseliny klaDlano^ V 20 m dimethylrormamidu se rozpětí 2,93 g (0,01 mol) sodné soli kyseliny klaDlano-
Λ	vé, a ea chlazení L míchání se přidá 0,8 ml, tj. 0,86 g illooilimetlyletlsrt. Po dvou hodinách reakce ea teploty místnooti se limethylroгmtmil vyd^sil^e ve vakuu, a zbytek se rozpuutí ve saéěi 40 ml ethylesteiu octové kyseliny a 20 ml iyklolexant. Přidá se 7 g silL-
>	kagelu octové kyseliny a 20 ml cyklolextnu.
... '	Přidá se 7 g si^ka^e^ k poudtí při ilormaaojg?afolání na tenké vrstvě, nerozpustné poddly se odfiltrují, promyjí se malým mnoitvím čerstvého rozpou^ěd^, a dají stranou (nejsou k potřebě). Filtrát se zahltí za sníieného tlaku na malý objem a tento zbytek se hhromatojgrafuic na sloupci si^ka^e^ za poudtí ctlylsstsot octové kyseliny a cyklchcxtлu k elunání. Produkt se isoluje ve formě bezbarvého oleje, výtěiek: 2 g. Infračervené spektrum: u aax (film) 1 802 (C=0 beta-laktamu), 1 755 (C=0 esteru), 1 695 <»' (C=C). O

NMR-spektrum (CDC1 ): 2,3 (1H, Široký singlet, OH), 3,02 (1H, dublet, J » 17 Hz, 6-/9 -CH),

3,42 (3H, singlet, OCH^), 3,47 (1H, dublet dubletu, 17 Hz, 3 Hz, 6-a-CH), 4,16 (2H, dublet,

J « 6 Hz, CH₂OH), 4,89 (1H, Široký triplet, J » 6 Hz, CH=CH₂), 5,03 (1H, široký singlet,

3-CH), 5,21, 5,29 (2H, AVkvadruplot, J > 5,5 Hz, C^OCH^, 5,65 δ (1H, dublet, J » 3 Hz,

5-CH).

Příklad Q p-Chlorfenoхужеthylester kyseliny klavulanové

Ke studenénu (chlazení leden a vodou) a míchanému roztoku 6 g (0,02 mol) tetrahydrátu sodné soli kyseliny klsvulsnové v 60 ni dinethylfomanidu se přidá 3,5 g (0,02 nol) p-chlorfonoxymothylchloridu, s po chlazení 2,5 hodin na teplotu pod 10 °C ae dinethylfomamid z velké níry oddestiluje za sníženého tisku za teploty míatnosti (20 °C). К zbylénu sirupu se přidá 200 ml ethylesteru octové kyseliny a 20 ml leden vychlazené vody, * roztok v ethylesteru kyseliny octové se po oddělení vysuší síranem sodnýn, zahustí se na sirup s tento zbytek seechronatografuje na koloně silikagelu za použití ethylesteru octové kyseliny s cyklohoxanu s gradientem od 1 : 2 do 2 : 1 к eluování. Nejprve ae získá nalý t podíl p-chlorgenoxymothylesteru dlenu klavulanové kyaeliny, a poton hlavní podíl, 4,7 g čistého p—chlorfenoxymethylestoru klavulanové kyseliny. Tento produkt obsahuje velni nslé množství dlenu, zjistitelné chromatografií na tenké vrstvě v množství dostačujícím ke zjištění v NMR-spektru.

Infračervené spektrum: 3 400 (široký pás, OH), 1 805 (C=0 beta-laktamové skupiny), 1 765 (C^SO esterového seskupení), 1 695 cm ¹ (C=C).

NMR-spektrun (CDCl^): 1,5 (OH, 3,00 (1H, dublet, J % 17 Hz, 6- β- CH). 3,44 (1H, dublet dubletu, D x 17 » 3 Hz, 6-a -CH), 4,14 (2H, dublet, J = 7 Hz, CH^OH), 4,77 (1H, široký triplet, J x 7 Hz, СН»СН₂), 5,02 (1H, široký singlet, 3-CH), 5,60 (1H, dublet, J = 3 Hz, 5-CH), 5.70, 5,77 (2H, AB-kvadruplet, J χ 7 Hz, OCH₂O), 6,89, 7,218 (4H, AVkvadruplet, J χ 9 Hz, с₆н₄)·

Příklad R

Benzyloxynethylester kyseliny klavulanové

Ve 20 nl dimethylformamidu se rozpustí 2,93 g tetrahydrátu sodné soli kyseliny klavulanové, a zakalený roztok se filtruje· čirý žlutý filtrát se vychladí leden, a míchá se zs přikapávání 1,57 g benzyl-chlormethyletheru, který byl připraven postupem podle Grahama a McQuilllna, J. Chem. Soc. 1963. 4634)· Míchání a chlazení se udržují po 2,5 hodin, a potom se zahuštěním reakční směsi získá oranžově zbarvený olej, který ae extrahuje několikrát do ethylesteru octové kyseliny· Zahuštěním extraktu v uvedeném rozpouštědle se získá žlutý ' olej.

Při analyse oleje na tenké vrstvě destiček se silikagelen při eluování soustavou nethylestor octové kyseliny, ethylester octové kyseliny a methyleуklopentan 1 : 1 : 2 za vyvolání , skvrn postřikem manganistanem jsou patrná 2 pásma o hodnotách R? 0,21 a 0,55, přibližně stejné intensity· Olej se chromatografujo na koloně s náplní silikagelu za eluování směsí ethylesteru octové kyaeliny a cyklohoxanu (1 : 1). Složení eluovaných frakcí ae analysuje pomocí chromatografie na tenké vrstvě, a pomaleji se pohybující látko se shromáždí v čistém stavu, prostá jakékoli zjistitelná nečistoty. Zahuštěním se isoluje 0,7 g takřka bezbarvéhb o|eje.

NMR-spektrum (CSCl^): <$2,08 (1H, široký singlet), 3,02 (1H dublet, J = 16 Hz), 3,3β (1H, dublet dubletu, J « 16 Hz, J* « 3 Hz), 4,15 (2H, dublet, J « 7 Hz), 4,64 (2H, singlet),

4,87 (1H, široký triplet, J - 7 Hz), 4,99 (1H, Široký sioglet), 5,34 (2H, sioglet), 5,58 (1H, dublet, J = 2 Hz), 7,25 (5H, široký sioglet).

Příklad S '

Příprava 0“Oitгobeozyloxyeethhleβter1 kyseliny kebvulontvé

V 20 ml dieethylforeaeidu se rozpustí 2,93 g tetrahydrátu sodné soli kyseliny klavulanové, a zakalený roztok se filtruje. Čirý žlutý roztok se vychladí v ledu, a za míchání se do vychlazeného roztoku přikápavá 2,02 g thltreeehhllJo>oitrtleozylether1. Toto činidlo se připraví postupem, který popsal, D. N. Kursanov a P. A. Solodkov, Ž. Prikl. Chim. £6, 351 (1943) anglického vydíáoí.

Reakční směs se míchá 2 hodiny, a postup reakce se sleduje thrtιnebttgraií na tenké vrstvě destiček se silkbageeee za . eluování smmsí eethhlester1 octové kyseliny, ethylesteru octové kyseliny a eethylcyklopeotbO1 (1 : 1 : 2). Na konci reakční doby tvoří hlavní produkt p-oítrolenLzyeoxyeethhlesteг kyseliny klavulanové o Rp= 0,18 s malým podílem etherestei^u

(Rp = 0,35). Rozpouštědlo se tddíeStl1je, a surový reakčoí produkt se čistí chroeaboog·afováoím oa sloupci silkkbael1 za eluováoí smmsí cyklohexanu a ethylebteru octové kyseliny (5 : 4). Produkt se získá zahuštěním vhodných frakcí z chrteeboog‘af ování, původně tvoří žlutý olej, políčí krystaluje.

Difraktog^m prášku za pouužtí rentgenových paprsků (záření CuK), reflekce při 20

29,95.

NMRЗSPktгue (CDl₃j: £1^5 (1H, široký sioglet), 3,01 (1H, dUet, J = 16 Hz), 3,42 (1H, dublet dUet, J = 16 Hz, 3 Hz), 4,14 (2H, dublet, J = 7 Hz), 4,73 (2H, sioglet), 4,85 (1H, široký triplet, J = 7 Hz), 4,97 (1H, sioglet), 5,39 (2H, sioglet), 5,59 (1H,

J = 3 Hz), 7,75 (4H, dublet dubletu, J = 62 Hz, 7 Hz).

Příklad T

Allylester kyseliny klavulanové

COONa

COOCH2CH-CH2

K míchanému roztoku 2,05 g tetrahyíгát1 sodné soli kyseliny klavulaoové v 9 ml suchého dieethylforebeiíu se přidá 2,44 ml al^^rtmi^, reakční směs se míchá 3 hodiny za teploty mítnooti, a rozpouštědlo se vydíetil1)e za vakua pod teplotou 30 °C. Zbytek se rozděluje mezi vodu a ethylester octové kyseliny, vrstva ethylesteru octové kyseliny se promyje vodou, vysuší se bezvodým sírnem hořečnatým, a filtrát se zahusí. Zbytek se čistí chrteattgrbftvάníe na sloupci tilikbgee1 60 za puMtí ethylesteru octové kyseliny, Rp = pHHižoč 0,53. Získá se tím 1,31 g sloučeniny, jejíž složení je uvedeno v nadpise, a to ve formě oleje.

Infračervené spektrum (film): 3 -400, 1 805, 1 745, 16195. mш-bsoktr1m (CDC., 90ΜΗζ_β): 61,98 (1H, zaeeěOtelnУ sioglet), 3,02 (1H, dublet, J 17 Hz), 3,46 (1H, dublet dubletu,

J = 17 Hz = 3 Hz), 4,19 (2H, J = 7 Hz), 4,61 (2H, dublet s jemOtší kopuuncí,

J = 6 Hz), 4,88 (1H, triplet s jemnou kopu^cí, J - 7 Hz)$, 5,02 (1H, sioglet s jemnou ^^^0, 5,29 (2H, triplet s jemnou koppuací, J = 6 Hz), 5,64 (1H, J = 3 Hz),

5,7 - 6,1 (1H, mutiplet).

Příklad U

Acetonnleater kyseliny klavul.anové

O

CH₂OH

COONa

O

'COCHjCOCHj

K míchanému roztoku 2,05 g tetrahydrátu sodné soli kyseliny klavulanové v 9 ml suchého dinethyiooraanidu se přidá 2,35 m. bromaceOonu, reakční směs se míchá za teploty místnosti přes noc, a potom se rozpouštědlo oddassiluje ve vakuu za teploty nejvýše 30 °C· Zbytek se rozděluje mezi vodu a ethylester octové kyseliny. Roztok v uvedeném organickém rozpouštědle se promyje vodou, vysuší se sírirnem hořečnatým a filtrát ee zahnutí. Ester se isoluje chromatoorrflí na sloupci silkkagelu 60 za eluování ethylesteren octové kyseliny. *

Získá se tím 565 mg sloučeniny, jejíž složení je uvedeno v nadpise, -j = 0,36.

Infračervené spektru* (film): 3 400, 1 600, 1 755, 1 730 ί

NiR-ssektrum (CDCj 90 Miz) δ 2,14 (3H, singlet), 2,20 (1H, široký ^Λ^ΜβΙ^), 3,04 (1H, dubbet, 17 Hz^ 3,46 (1H, dubbet dubletu, J = 17 Hz a 3 Hz^ 4,20 (2H, dubbet s jemnou kopplací, J = 6 Hh), 4,7 (2H, singlet), 4,97 (1H, dubbet tripletu, 6 Hz, H^u aei 1,5 HO, 5,12 (1H, slng.et e jemnou ^ρ^^Ο, 5,67 (1H, duHet, J * 3 Hhz.

Příklad V

Cykklohxylester kyseliny klavulanové

⁴COOH 'coo

CH2OH <3

Za teploty 0 °C se přidá 0,62 *1 pyrrolidinu k roztoku 1,4 - N-ethuxykacbbuyllN-nitrU“ xocyklohexyleminu v 25 m1 dichlormethanu. Zmíněná látka se připraví reakcí kysličníku duuičitého-s N-eOhuжykarbooulcyklohexyluminem v chloridu uhličitém ze přítomnost bezvodého octanu sodného. Reakční směs se míchá 30 minut za teploty 0 °C, a během 5 minut se přidá k tonuto roztoku roztok kl^u^nové kyseliny v ,0'etrahldrolUιrcnu, který se připraví hydrogenací benzytesteru kalvul.cnovt kyseliny (1 g) a 30 ml 0etrahldrulUr:*cnu za pouHtí lOžaího palladia na uhhí. Ke vzniklému roztoku se přidá nadbytek roztoku h^<^z^c^o^<^s^nuh:li^i.Oanu sodného, vzniklá reakční směs se extrahuje někootkrát do chloroformu, a roztok v chloroformu se po vysušení sínutem hořečnatým zahuusí. Opakovanou chro^nlCoUгralí na silkkagelu ^л

H,a to dvakrát za pouHtí soucOcvi ethylester octové kyseliny a cyklohexan v poměru 1 : 1 a jednou za pouHtí chloroformu se získá 46 mg sloučeniny, jejíž složení je uvedeno v nadppse. <

^fratarve^ spe^ktrum ⁽¹i^m): ^{3 40}0 1 ⁸⁰0 1 ⁷⁴0 ^{1 695} cm \ ^NR-spe^korum ^DCl^): δ 1,1-2,0 (11H, тИОрЫ, 1 vodík zdmnittlný), 3,01 (1H, dublet, J = 16 H^z, 3,45 (1H, dublet dubletu, J = 16 = 3 Hz), 4,17 (2H, duWet, J = 7 Hz), 4,5-5,0 (1H, шUt0piet), ,

4,87 (1H, triplet, J . = 7 Jz), 4,96 (1H, singlet), 5,63 (1H. duWet, J = 3 Hz).

Příklad W

Propargylester kyseliny klavulanové

К roztoku 4,4 g (0,015 0 mol) tetrehydrétu sodné soli kyseliny klavulsnové v 25 11 suchého dimethylformamidu se přikapává pomalu a za míchání 1,6 ml (2,53 g, 0,021 2 mol) propargylbromidu. Reakční směs se míchá 2 hodiny za teploty místnosti, vlije se potom do 250 ml vody, a produkt se extrahuje třikrát vždy do 100 ni ethylestera octové kyseliny. Roztok v tomto rozpouštědle se promyje čtyřikrát vodou (vždy 100 ml), vysuěí ae síranem hořečnatým, a zahuštěním čirého a suchého roztoku v ethylesteru octové kyseliny se získá hustý olej, který ná podle vyhodnocení chronatogramu na tenké vrstvě silikagelu za použití ethylesteru octové kyseliny к vyvíjení 2 složky.

Olej se rozpustí v 2 ml chloroformu, a roztok se chromatografuje na sephadexu LH20 za použití směsi chloroformu s суklohexanu (1 : 1) к eluování. Frakce o objemu 25 ml ae testují chromatografií na tenké vrstvě a ty frakce, které obsahují rychleji ae pohybující složku, a to v podstatnějších množstvích, se spojí s vše se zahustí ve vakuu na hustý olej, kterého se isoluje 2,2 g. Olej tuhne stáním přes noc, a při testování chromatografií na tenké vrstvě obsahuje pouze jednu složku. Podle NMR-spektra obsahuje určitý podíl chloroformu.

Promytín produktu etherem se získá 700 mg pevné látky o t.t. 65 až 66 °C. Malý výtěžek je ovlivněn značnou rozpustností produktu v etheru. Výsledky různých testů jsou tyto:

Analysa:

pro C^H^NO^ vypočteno: 55,69 % C, 4,68 % H, 5,91 % N nalezeno: 55,55 % C, 4,68 % H, 6,12 % N

NMR-spektrum (CDCl^: 2,01 (ainglet, 1H), 2m6 (triplet, 1H), 2,95-3,75 (multiplet, 2H), 4,29 (dublet, 2H), 4,79-5,00 (multiplet, 3H), 5,13 (dublet, 1H), 5,75 (dublet, 1H).

Příklad X

6-Methoxynaft-2-ylmethylester kyseliny klavulanové

OCOONa

ОСН₃

Roztok 2,2 g (10 mmol) bezvodé sodné soli klavulanové kyseliny a 2,51 g (Ю mmol) 6-mothoxy-2-brommethylnaftalonu ее míchá v prostředí 80 ml suchého dimethylformamidu zs teploty místnosti; za 3 hodiny je možno zjistit chromatografií ns tenké vrstvě, že reakce proběhla a směs neobsahuje bromnethylnaftalenový derivát. Za teploty 30 °C se oddestiluje ve vskuu rozpouštědlo, ke zbytku se přidá 100 ml ethylesteru octové kyseliny, suspense se filtruje, a filtrát se promyje vodou (dvakrát po 25 ml). Po vysušení a filtraci použitého aíranu hořočnatého ae oddestilováním rozpouštědla získá 3,2 g oranžového oleje, a chromatografováním tohoto produktu na 100 g sephadexu LH20 za eluování směsí chloroformu a cyklohexanu 50 : 50 a jímání frakcí po 10 ml lze zjistit ve frakcích 12 a 20 očekávaný ester, jak to bylo zjiětěno chromatografováním na tenké vrstvě za vyvolání skvrn působením TTC-resgens (roztok 4% trifenyltetrazoliumchloridu v methanolu za přidání stejného objenu N-roztoku hydroxidu sodného v methanolu).

Zahuštěním uvedených frakcí se získá čirý olej, který tuhne stáním. Tento materiál se rozpustí v dechlomethanu a přidává se petrolether (b.v. 60 až 80 °C), až so roztok zakalí. Stáním v kádince se vyloučí gumovitý podíl, kapelina nad touto látkou se nechá dále odpařovat, a vznikne bílá krystalická pevná látka o t.t. 89 až 90°, výtěžek 2,52 g, tj. 68 Я.

Analysa:

pr° C₂₀H₎₉HO₆ vypoSteao: 65,04 % C, 5,15 % H, 3,79 % Я, a.l.z.ao: 64,91 % C, 5,00 % H, 3,77 % N

NBR-ep.ktrua (CDC1₃):6 1,45 (IH, Široký .iaglet, CHgOH), 2,9 (IH, dubl.t, 6β -H), 3,36 (IH, dubl.t dubletu, 6α H), 3,8 (3H, eiagl.t, OCH^, 4,03 (2H, dubl.t, CHgOH), 4,7 (IH, triplet ==^), 4,93. (IH, eiagl.t, CHCOO-), 5,27 (2H, eiagl.t, -CH₂OCO), 5,65 (IH, dubl.t, 5 -H), 7,37 (6H, multiplet, aromatické vodíky.

Příklad X

2-Methoxyethylester kyseliny klavulanové

a) 800.2 sodná sůl kyseliny klavulanové

CH₃0CH₂0H₂0H ----► CH₂0CH₂CH₂I jako totrahydrát

b) MaX I

COOCH₂CH₂OH

K roztoku 75 g (0,50 mol) jodidu sodného v 500 ml acetonu ' se přidá 43 g (0,455 mol)

2-methc>oyethhlchlotidu (viz J. Amer. Chem. Soc. 52, 653, 1930),.a reakční smis se zahřívá 3 ai 4 hodiny do varu pod zpětným chladičem. Většina acetonu se vydestiluje za normálního tlaku, zbytek se ochladí a zředí přidáním 200 ml etheru. Roztok v etheru ze zbaví anorganických nečletot filtrací, proývá se postupně za p^uui1^:í 100 ml roztoku chloridu sodného, 100 ml 5iního vodného roztoku ilitsíraat sodného, opit za pouuití 100 ml roztoku chloridu sodného, načei se vysuší sírinem hořečnatým. Po filtraci se ether tdeesSilt)e za normminího tlaku, produkt se isoluje eeetilací, přičemi se jímá frakce o t.t. 130 ai 140° za stoooférictélt tlaku. Produkt, který tvoří hustou, bledě ilutou kapalinu, se získá ve výtěiku 20 g (23 % za předpokladu čistoty 100 %.

K roztoku 6 g (0,020 5 mi) tetrahydrátu sodné sil kyseliny klavulinsivé v 100 m eioeihyl0trmíшidu za teploty míítnooti přidá 5,6 g (0,03 mol) 2-methoxyethyljtdieu, reakční směs se míchá 5 hodin, a potom lze zjistit chromatografováním na tenké vrstvě, ie d^ΐ^:Lt . k určité tvorbě esteru. ChlommSoortSie se provádí na tenké vrstvě silk^agelu za vyvolávání ethylesterem octové kyseliny, vrstvy se vyvooajl postřikem TTCCčinidlem (viz J příklad X), přičemi sodná sůl tlsvulsnové kyseliny zůstává na startu (R? =0,0), a Rj.

g esteru činí 0,5.

Reakční směs se ředí přidáním 200 ml ethylesteru octové kyseliny a 500 ml vody, vodný * oddělený se extrahuje do 100 ml ethylesteru octové kyseliny, spojené organické extrakty se promyjí čtyřikrát vodou, vidy 100 ml, dále za pouuití 100 ml N roztoku hydrogenuU-ičitHLu sodného, a znovu vodou za pouuití 3 dfivek po 100 ml. Roztok se vysuší síranem hořečnatým, a po filtraci se rozpouštědlo vyde8Silujs za sníieného tlaku. Získá se tím ve formě bledě Slutého oleje ester, který se suší za vysokého vakua, a tím se odstraní poslední stopy rozpouštědla i nezreagovaný Jtd^<^□rt^’^ι^1t. Podle NM-speetra je isolovaná sloučenina v postatě čistá. Výtěiek: pod 5 6.

NlMR-pekt^m (CIDC₃):ó 5,65 (1H, dubce), 5,05 (1H, singlet)a 4,9 (1H, triplet), překrývají se vzájemně, dále 4,2 (4H, mutipeet), 3,6 (2H, mutippet), 3,35 (3H singlet), překrývá

3,3 (1H, multielβ^s 2,9 (1H, singlet).

Claims (2)

1. PŘEDMĚT VYNÁLEZU

   1. Způsob výroby kyseliny klavulanové, odpooíddaících solí a esterů obecného vzorce I (I) kde

   R znamená atom vodíku, kation, například sodný, draselný, hořečnatý, hlinitý, amoniový nebo substituovaný amoonový, jako je kation tr methyl Jmoniový, kation odvozený od benzatUnu, p^kalnu a podobných solí, které obvykle tvoří peniciliny a c·fsltsettiny, dále kation lihný nebo stříbrný, dále R znamená azylovou skupinu s 1 ni 12 atomy uhlíku, případně sub8iituov8not halogenem, feayloým zbytkem, nitrofazylovou skupinou, slkoxyfenylovtu skupinou s 1 ai 3 atomy uhlíku v alkozylovém zbytku, fenylslt:oxyf·nyč lovou skupinou s 1 až 3 atomy uhlíku v alkoyylovém zbytku, halogenfenyliviu či pyridylovou skupinou, naftyrlovjfa zbytkem, případně subatituoviuýfa methpxylovou skupinou, dále anthracenylovým zbytkem, alkoxylovou skupinou a 1 až 4 atomy uhlíku, případně dále substituovanou fenoxyskupinou nebo benzyloxyskupinou, dále alkylthioakupinou a 1 až 4 atomy uhlíku nebo benzoylovou skupinou, aminoakupinou, případně dále subatituovanou alkylovou skupinou a 1 až 4 atomy uhlíku nebo benzyloxykarbonylovou skupinou, dále karboxylovoa skupinou, případná ve formě aoli nebo esteru, dále acyloxylovou skupinou s 2 až 5 atomy uhlíku, fenylsulfonylovou nebo nitrilovou skupinou, řtalimidoskupinou nebo N-benzoxyzolonylovou skupinou, posléze alkoxykarbonyloxylovou skupinou s 1 až 4 atomy uhlíku, kde dále R znamená nižěí elkenylovou skupinu в 2 až 4 atomy uhlíku nebo nižší alkinylovou skupinu s 2 až 4 atomy uhlíku, cykloalkylovou akupinu a 3 až 7 atomy uhlíku, fenylovou nebo ftalidylovou akupinu, poalední případně aubatituovanou methoxylovým zbytkem, vyznačený tím, že ae kultivuje kmen Streptomyces clavuligerus ns živném prostředí s obsahem zdrojů dusíku s uhlíku, jskož i s obsahem nezbytných minerálních solí, a to aerobně za teploty 15 až 40 °C, obvykle 20 až 35 °C a s výhodou 25 až 30 °C a za hodnoty pH 5 až 8y5, a a výhodou 6 až 7,5» načež ae izoluje z kultury kyaelina klavulanové nebo její aůl po filtraci buněk extrakcí filtrátu kultury do rozpouětědla po úpravě pH do kyaelé oblasti, nebo adsorbováním produktu na uhlí, vyarážením, vysolením, nebo molekulární filtrací, načež ae % případně kyaelina klavulanové nebo její sůl převádí esterifikací diesoalkaném o 1 až 12 atomech uhlíku nebo alkoholem obecného vzorce

   R - OH, kde

   R má ahora uvedený význam, či thiolem za přítomnosti činidla, usnadňujícího kondenzaci, na odpovídající ester, nebo se působí na sloučeninu obecného vzorce I, kde R znamená některý z uvedených kationtů, sloučeninou obecného vzorce

   R - Q, kde

   R má ahora uvedený význam a Q znamená zbytek, který ae při této reakci snadno odStěpí a nahradí, jako je atom chloru, bromu nebo jodu či zbytek esteru sulfonové kyseliny, jako je zbytek methansulfonové kyseliny nebo p-toluensulfonové kyseliny, nebo to je aktivní esterová skupina, jako je skupina formylová nebo trifluoracetylová, a popřípadě ae ester sloučeniny obecného vzorce I, v němž R znamená zbytek alkoholu, hydrolysuje.
2. 2. Způsob podlá bodu 1, vyznačený tím, že se kultivuje kmen Streptomyces clavuligerus

   ATCC 27064 nebo odpovídajícího mutantu.