SK285169B6 - Sekvencie nukleových kyselín, vektory tieto sekvencie nukleových kyselín obsahujúce, farmaceutické kompozície a ich terapeutické použitie - Google Patents
Sekvencie nukleových kyselín, vektory tieto sekvencie nukleových kyselín obsahujúce, farmaceutické kompozície a ich terapeutické použitie Download PDFInfo
- Publication number
- SK285169B6 SK285169B6 SK1568-95A SK156895A SK285169B6 SK 285169 B6 SK285169 B6 SK 285169B6 SK 156895 A SK156895 A SK 156895A SK 285169 B6 SK285169 B6 SK 285169B6
- Authority
- SK
- Slovakia
- Prior art keywords
- nucleic acid
- acid sequence
- intracellular
- antibody
- peptide
- Prior art date
Links
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 title claims abstract description 63
- 239000013598 vector Substances 0.000 title claims abstract description 37
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 title claims description 11
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 title abstract description 5
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 claims abstract description 77
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 71
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 claims abstract description 8
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 50
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 47
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 46
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 39
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 22
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 22
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 22
- 230000002950 deficient Effects 0.000 claims description 19
- 108700020796 Oncogene Proteins 0.000 claims description 17
- 102100025064 Cellular tumor antigen p53 Human genes 0.000 claims description 16
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 claims description 14
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 claims description 14
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 claims description 12
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 12
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 9
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 claims description 9
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 9
- 108700042226 ras Genes Proteins 0.000 claims description 7
- 102000043276 Oncogene Human genes 0.000 claims description 6
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 claims description 6
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 claims description 5
- 102000018898 GTPase-Activating Proteins Human genes 0.000 claims description 4
- 108010027920 GTPase-Activating Proteins Proteins 0.000 claims description 4
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 claims description 3
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 2
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 claims description 2
- 102000007999 Nuclear Proteins Human genes 0.000 claims description 2
- 108010089610 Nuclear Proteins Proteins 0.000 claims description 2
- 239000002502 liposome Substances 0.000 claims description 2
- 102000023732 binding proteins Human genes 0.000 claims 4
- 241000702421 Dependoparvovirus Species 0.000 claims 2
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 claims 2
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 claims 2
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 abstract description 13
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 abstract description 4
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 abstract description 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 48
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 38
- 238000000034 method Methods 0.000 description 34
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 25
- 102000016914 ras Proteins Human genes 0.000 description 23
- 108010014186 ras Proteins Proteins 0.000 description 23
- 102100022709 Putative alpha-1-antitrypsin-related protein Human genes 0.000 description 16
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 16
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 15
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 15
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 15
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 11
- 101710149951 Protein Tat Proteins 0.000 description 11
- 231100000590 oncogenic Toxicity 0.000 description 11
- 230000002246 oncogenic effect Effects 0.000 description 11
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 10
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 10
- 230000006870 function Effects 0.000 description 9
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 9
- 102100029974 GTPase HRas Human genes 0.000 description 8
- 101000584633 Homo sapiens GTPase HRas Proteins 0.000 description 8
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 8
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 8
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 8
- 241000701806 Human papillomavirus Species 0.000 description 7
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 7
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 7
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 7
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 7
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 6
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 6
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 6
- 230000003915 cell function Effects 0.000 description 6
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 6
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 6
- 230000007727 signaling mechanism Effects 0.000 description 6
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 6
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 5
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 5
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 5
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 5
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 5
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 5
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 5
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 5
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 5
- 108010035563 Chloramphenicol O-acetyltransferase Proteins 0.000 description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 4
- 101001012157 Homo sapiens Receptor tyrosine-protein kinase erbB-2 Proteins 0.000 description 4
- 241000700584 Simplexvirus Species 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 239000003443 antiviral agent Substances 0.000 description 4
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 4
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 235000015047 pilsener Nutrition 0.000 description 4
- -1 rRNA Proteins 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 4
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 3
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 3
- 101150029707 ERBB2 gene Proteins 0.000 description 3
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101150040459 RAS gene Proteins 0.000 description 3
- 102100030086 Receptor tyrosine-protein kinase erbB-2 Human genes 0.000 description 3
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 description 3
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 3
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 3
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 3
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 3
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 3
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 3
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 3
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 3
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 3
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 2
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- 241000701533 Escherichia virus T4 Species 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091006027 G proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000030782 GTP binding Human genes 0.000 description 2
- 108091000058 GTP-Binding Proteins 0.000 description 2
- NYHBQMYGNKIUIF-UUOKFMHZSA-N Guanosine Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O NYHBQMYGNKIUIF-UUOKFMHZSA-N 0.000 description 2
- 102100034349 Integrase Human genes 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 2
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 2
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 102000004022 Protein-Tyrosine Kinases Human genes 0.000 description 2
- 108090000412 Protein-Tyrosine Kinases Proteins 0.000 description 2
- 241000700647 Variola virus Species 0.000 description 2
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 2
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 2
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 2
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 230000003831 deregulation Effects 0.000 description 2
- 238000006471 dimerization reaction Methods 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 230000004064 dysfunction Effects 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 2
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 2
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 2
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 2
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 102000006240 membrane receptors Human genes 0.000 description 2
- 108020004084 membrane receptors Proteins 0.000 description 2
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 2
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 2
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 2
- 125000003835 nucleoside group Chemical group 0.000 description 2
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 2
- 208000003154 papilloma Diseases 0.000 description 2
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 2
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 2
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 2
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 2
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000005740 tumor formation Effects 0.000 description 2
- 210000000605 viral structure Anatomy 0.000 description 2
- 125000003088 (fluoren-9-ylmethoxy)carbonyl group Chemical group 0.000 description 1
- 101150066838 12 gene Proteins 0.000 description 1
- CNJLMVZFWLNOEP-UHFFFAOYSA-N 4,7,7-trimethylbicyclo[4.1.0]heptan-5-one Chemical compound O=C1C(C)CCC2C(C)(C)C12 CNJLMVZFWLNOEP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010052747 Adenocarcinoma pancreas Diseases 0.000 description 1
- 108020005544 Antisense RNA Proteins 0.000 description 1
- 101100067974 Arabidopsis thaliana POP2 gene Proteins 0.000 description 1
- 208000035143 Bacterial infection Diseases 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 108010041397 CD4 Antigens Proteins 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 108090000994 Catalytic RNA Proteins 0.000 description 1
- 102000053642 Catalytic RNA Human genes 0.000 description 1
- 206010008342 Cervix carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- MIKUYHXYGGJMLM-GIMIYPNGSA-N Crotonoside Natural products C1=NC2=C(N)NC(=O)N=C2N1[C@H]1O[C@@H](CO)[C@H](O)[C@@H]1O MIKUYHXYGGJMLM-GIMIYPNGSA-N 0.000 description 1
- NYHBQMYGNKIUIF-UHFFFAOYSA-N D-guanosine Natural products C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1C1OC(CO)C(O)C1O NYHBQMYGNKIUIF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 1
- 230000004543 DNA replication Effects 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102000012199 E3 ubiquitin-protein ligase Mdm2 Human genes 0.000 description 1
- 108050002772 E3 ubiquitin-protein ligase Mdm2 Proteins 0.000 description 1
- 101150071673 E6 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000001301 EGF receptor Human genes 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 102100038132 Endogenous retrovirus group K member 6 Pro protein Human genes 0.000 description 1
- 101710121417 Envelope glycoprotein Proteins 0.000 description 1
- 241001524679 Escherichia virus M13 Species 0.000 description 1
- 108091029865 Exogenous DNA Proteins 0.000 description 1
- 102100030708 GTPase KRas Human genes 0.000 description 1
- 101710113436 GTPase KRas Proteins 0.000 description 1
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 1
- 208000031886 HIV Infections Diseases 0.000 description 1
- 101100118549 Homo sapiens EGFR gene Proteins 0.000 description 1
- 101500025419 Homo sapiens Epidermal growth factor Proteins 0.000 description 1
- 101000891649 Homo sapiens Transcription elongation factor A protein-like 1 Proteins 0.000 description 1
- 108700003968 Human immunodeficiency virus 1 tat peptide (49-57) Proteins 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 1
- 208000026350 Inborn Genetic disease Diseases 0.000 description 1
- 108010061833 Integrases Proteins 0.000 description 1
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 1
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 108090001074 Nucleocapsid Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 241001631646 Papillomaviridae Species 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 1
- 102000015439 Phospholipases Human genes 0.000 description 1
- 108010064785 Phospholipases Proteins 0.000 description 1
- 102000009097 Phosphorylases Human genes 0.000 description 1
- 108010073135 Phosphorylases Proteins 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 102000001253 Protein Kinase Human genes 0.000 description 1
- 101710150344 Protein Rev Proteins 0.000 description 1
- 108700020978 Proto-Oncogene Proteins 0.000 description 1
- 102000052575 Proto-Oncogene Human genes 0.000 description 1
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 1
- 101100123851 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) HER1 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000040739 Secretory proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091058545 Secretory proteins Proteins 0.000 description 1
- 102100036011 T-cell surface glycoprotein CD4 Human genes 0.000 description 1
- 208000024770 Thyroid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 1
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 1
- 101800001690 Transmembrane protein gp41 Proteins 0.000 description 1
- 208000006105 Uterine Cervical Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 108020000999 Viral RNA Proteins 0.000 description 1
- 230000001594 aberrant effect Effects 0.000 description 1
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000036436 anti-hiv Effects 0.000 description 1
- 230000002072 anti-mutant effect Effects 0.000 description 1
- 230000002389 anti-papilloma Effects 0.000 description 1
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M caesium chloride Chemical compound [Cl-].[Cs+] AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 1
- 230000010307 cell transformation Effects 0.000 description 1
- 210000003850 cellular structure Anatomy 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 201000010881 cervical cancer Diseases 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012761 co-transfection Methods 0.000 description 1
- 208000029742 colonic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 239000003184 complementary RNA Substances 0.000 description 1
- 238000010668 complexation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 230000009144 enzymatic modification Effects 0.000 description 1
- 238000012869 ethanol precipitation Methods 0.000 description 1
- AINBZKYUNWUTRE-UHFFFAOYSA-N ethanol;propan-2-ol Chemical compound CCO.CC(C)O AINBZKYUNWUTRE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 210000001723 extracellular space Anatomy 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 description 1
- 108091006104 gene-regulatory proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000034356 gene-regulatory proteins Human genes 0.000 description 1
- 208000016361 genetic disease Diseases 0.000 description 1
- 230000005017 genetic modification Effects 0.000 description 1
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 229940029575 guanosine Drugs 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 229940116978 human epidermal growth factor Drugs 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 210000003000 inclusion body Anatomy 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 239000007972 injectable composition Substances 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 1
- 230000037041 intracellular level Effects 0.000 description 1
- 210000003093 intracellular space Anatomy 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 210000002510 keratinocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 description 1
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 238000001823 molecular biology technique Methods 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 229910000403 monosodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019799 monosodium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000003471 mutagenic agent Substances 0.000 description 1
- 231100000707 mutagenic chemical Toxicity 0.000 description 1
- 230000003505 mutagenic effect Effects 0.000 description 1
- 208000025113 myeloid leukemia Diseases 0.000 description 1
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 1
- GVUGOAYIVIDWIO-UFWWTJHBSA-N nepidermin Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O)C(C)C)[C@@H](C)CC)C(C)C)C(C)C)C1=CC=C(O)C=C1 GVUGOAYIVIDWIO-UFWWTJHBSA-N 0.000 description 1
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 229940046166 oligodeoxynucleotide Drugs 0.000 description 1
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 1
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 1
- 201000002094 pancreatic adenocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000002205 phenol-chloroform extraction Methods 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 description 1
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 230000004853 protein function Effects 0.000 description 1
- 108060006633 protein kinase Proteins 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000008844 regulatory mechanism Effects 0.000 description 1
- 238000004153 renaturation Methods 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 108091092562 ribozyme Proteins 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 1
- AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M sodium dihydrogen phosphate Chemical compound [Na+].OP(O)([O-])=O AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000010532 solid phase synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- BDHFUVZGWQCTTF-UHFFFAOYSA-M sulfonate Chemical compound [O-]S(=O)=O BDHFUVZGWQCTTF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 125000000999 tert-butyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(*)(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 201000002510 thyroid cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 1
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 1
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 1
- 238000003146 transient transfection Methods 0.000 description 1
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 description 1
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 1
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- 230000029812 viral genome replication Effects 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
- C07K16/081—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from DNA viruses
- C07K16/084—Papovaviridae, e.g. papillomavirus, polyomavirus, SV40, BK virus, JC virus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
- C07K16/10—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from RNA viruses
- C07K16/1036—Retroviridae, e.g. leukemia viruses
- C07K16/1045—Lentiviridae, e.g. HIV, FIV, SIV
- C07K16/1072—Regulatory proteins, e.g. tat, rev, vpt
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/32—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against translation products of oncogenes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Virology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- AIDS & HIV (AREA)
- Hematology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Abstract
Sú opísané sekvencie nukleových kyselín, vektory obsahujúce tieto sekvencie a ich terapeutické použitie, hlavne v génovej terapii. Opísané sú najmä sekvencie nukleových kyselín obsahujúce gén kódujúci väzbový intracelulárny proteín a ich použitie v génovej terapii, po ich zavedení do príslušných expresných vektorov.
Description
Oblasť techniky
Vynález sa týka sekvencií nukleových kyselín, vektorov obsahujúcich tieto sekvencie nukleových kyselín a ich použitia, najmä v génovej terapii. Špecificky sa vynález týka sekvencií nukleových kyselín obsahujúcich gén, kódujúci intracelulámy väzbový proteín (PIL - protéine intracellulaire de liaison) a ich použitia v génovej terapii, pričom tieto sekvencie nukleových kyselín môžu byť zabudované do príslušných expresných vektorov.
Doterajší stav techniky
Génová terapia spočíva v korekcii nedostatočnosti alebo abnormality (mutácia, aberačná expresia a pod.) zavedením genetickej informácie do nesprávne fungujúcej bunky alebo do nesprávne fungujúceho orgánu. Táto genetická informácia môže byť zavedená buď in vitro do bunky extrahovanej z uvedeného orgánu, pričom takto korigovaná bunka je potom opätovne zavedená do organizmu, alebo in vivo priamo do príslušného tkaniva. V príslušnej odbornej literatúre sú opísané rôzne techniky transfekcie a techniky prenosu génov (pozri Roemer a Friedman, Eur. J. Biochem. 208 (1992) 211). Všetky doteraz známe techniky génovej terapie spočívajú v transfekcii génov kódujúcich aktívne polypeptidy implikované v genetických chorobách (hormóny, rastové faktory, atď.), antimediátorových génov alebo antigénnych peptidov na prípravu vakcín.
Vynález sa týka nového metodického prístupu génovej terapie, spočívajúceho v transfekcii a v expresii v cieľovej bunke (alebo tkanive) intracelulámeho peptidu schopného interakcie s bunkovými zložkami a takýmto spôsobom interferencie s bunkovými funkciami. Vynález spočíva hlavne v zistení, že je možné exprimovať in vivo modifikované protilátky, ktoré zostávajú v intracelulámej oblasti a ktoré môžu regulovať niektoré bunkové funkcie. Vynález spočíva taktiež v zistení, že je možné klonovať DNA sekvencie kódujúce intraceluláme protilátky vo vektoroch, hlavne vírusových vektoroch, na použitie v génovej terapii.
Použitie protilátok v humánnej terapii všeobecne umožňuje zistiť prítomnosť a neutralizovať biologické komplexy cirkulujúce a/alebo lokalizované na povrchu buniek spustením kaskády javov riadených imunitným systémom, čo má za následok elimináciu uvedených komplexov. Ale v mnohých prípadoch, a to napríklad v prípade rakoviny alebo chorôb spôsobených napríklad vírusmi, je takýto postup sterilný, pretože antigén, ktorý je zodpovedný za dereguláciu zasiahnutých buniek, je pre injikované protilátky nedosiahnuteľný. Vynález ponúka nový, zvlášť výhodný, terapeutický metodický postup, spočívajúci v tom, že sa kontinuálne a intraceluláme produkujú protilátky alebo terapeutické činidlá, ktorých väzba na ich epitop redukuje a/alebo anuluje uvedenú dcrcguláciu.
Možnosť exprimovať protilátky rekombinantným spôsobom už bola v literatúre opísaná. V európskom patente EP 88994 je opísaná expresia in vitro a purifikácia variabilných oblastí ťažkých alebo ľahkých reťazcov protilátok. Rovnako aj v patente US 4 946 778 sa opisuje expresia in vitro DNA sekvencií kódujúcich modifikované protilátky tvorené variabilnými oblasťami ťažkého a ľahkého reťazca protilátky spojené spojovníkom (linkerom). Protilátky opisované v tomto patente sú však inaktívne a všeobecne syntetizované vo forme nerozpustných inklúznych teliesok. Tieto protilátky musia byť teda purifikované a potom podrobené chemickým zásahom (denaturácia, renaturácia, atď.) s cieľom opätovného nadobudnutia účinnosti.
Tento vynález demonštruje možnosť použitia takýchto DNA sekvencií na priamu expresiu in vivo aktívnych intracelulámych protilátok a poukazuje týmto na možnosť použitia týchto DNA sekvencií kódujúcich intraceluláme protilátky pod kontrolou oblasti, ktoré umožňujú expresiu v cicavčích bunkách pri génovej terapii, hlavne u človeka. Táto nová metodika umožňuje teda odhaliť tie bunkové zložky, ktoré až doteraz neboli zasiahnuteľné klasickými očkovacími postupmi. Okrem toho, tento postup nevyvoláva rozvoj imunitnej odpovede, pretože pôsobí intraceluláme.
Podstata vynálezu
Predmetom vynálezu je sekvencia nukleových kyselín obsahujúca gén, kódujúci väzbový intracelulámy proteín (PIL) pod kontrolou oblasti umožňujúcej jeho expresiu v cicavčích bunkách.
Vynález sa taktiež týka vektorov obsahujúcich sekvenciu nukleových kyselín, ktorá je definovaná. Vektory podľa vynálezu sú hlavne vektory vírusového pôvodu, akými sú retrovírusy, adenovirusy, adenovírusom pridružené vírusy, vírus herpes, vírus kiahní, vírus HSV, atď.
Vynález sa taktiež týka použitia týchto sekvencií nukleových kyselín alebo týchto vektorov na prípravu farmaceutických kompozícii určených na chirurgické a/alebo konzervatívne liečenie ľudského alebo zvieracieho organizmu.
Vynález sa taktiež týka každej farmaceutickej kompozície obsahujúcej definovaný vektor, hlavne vírusový alebo uvedenú sekvenciu nukleových kyselín.
V rámci tohto vynálezu označuje výraz väzbový intracelulámy proteín (PIL) každý proteín alebo fragment proteínu, ktorý je schopný poznať zložku bunky, v ktorej je exprimovaný a vstúpiť selektívne do interakcie s touto zložkou. Môže ísť o kovalentnú alebo nekovalentnú chemickú interakciu. Interakcia s bunkovou zložkou (proteíny, lipidy, aminokyseliny, mRNA, tRNA, rRNA, DNA, atď.) umožňuje pôsobiť na bunkovú funkciu, pri ktorej sa uvedená zložka uplatňuje a takto danú funkciu regulovať (stimulovať, spomaliť alebo inhibovať).
Výhodne sú PIL podľa vynálezu tvorené molekulami odvodenými od protilátok, alebo molekulami, ktoré majú väzbové vlastnosti porovnateľné s väzbovými vlastnosťami molekúl protilátok. Hlavne ide o proteíny majúce selektivitu a afinitu dostatočnú na umožnenie interakcie in vivo majúcej neutralizačný účinok na antigén. Tieto molekuly sú v nasledujúcom texte nazvané, vzhľadom na ich vlastnosti a lokalizáciu ako intraceluláme protilátky.
Protilátky, ako molekuly rozsiahlej skupiny imunoglobulínov, sú syntetizované prirodzenou cestou (hlavne lymfocyty B) vo forme sekrečných proteínov. Tieto protilátky sú teda uvoľňované do extracelulámych priestorov (obehový systém), kde vykonávajú svoju aktivitu (rozpoznávanie antigénov a väzba na ne). V súčasnosti bolo dokázané, že je možné exprimovať in vivo modifikované gény kódujúce intraceluláme protilátky bez toho, aby došlo k ovplyvňovaniu špecifickosti a afinity protilátok. Sekvencie nukleových kyselín podľa vynálezu, ktoré kódujú intraceluláme protilátky, obsahujú gén protilátky modifikovaný tak, aby táto protilátka nebola z buniek vylučovaná. Ide najmä o gén protilátky, ktorý je modifikovaný deléciou alebo mutáciou sekvencií zodpovedných za sekréciu protilátky. PIL podľa vynálezu môžu byť tvorené najmä fragmentmi protilátky a napríklad fragmentmi Fab alebo F(ab)'2, ktoré nesú domény väzby antigénu. Použitie tohto typu intracelulámej protilátky implikuje expresiu sekvencie nukleových kyselín obsahujúcej niekoľko génov kódujúcich ťažké, resp. ľahké oblasti týchto fragmentov, pričom výsledkom uvedeného použitia je aj presné združovanie týchto reťazcov in vivo. Z tohto dôvodu je zvlášť výhodnou formou intracclulámych protilátok použiteľných v rámci vynálezu forma tvorená peptidom zodpovedajúcim miestu väzby variabilnej oblasti ľahkého reťazca protilátky spojeným peptidovým linkerom k peptidu zodpovedajúcemu miestu väzby variabilnej oblasti ťažkého reťazca protilátky. Použitie tohto typu intracelulámej protilátky označenej ako ScFv je zaujímavé, pretože ide o expresiu jediným génom. Konštrukcia sekvencií nukleových kyselín kódujúcich takéto modifikované protilátky podľa vynálezu je ilustrovaná v príkladoch uskutočnenia vynálezu.
Sekvencie nukleových kyselín kódujúce intraceluláme protilátky podľa vynálezu môžu byť taktiež modifikované chemickou, enzymatickou alebo genetickou cestou s ohľadom na generovanie stabilizovaných intracelulámych protilátok a/alebo multifunkčných intracelulámych protilátok, a/alebo protilátok s redukovanou veľkosťou, a/alebo s cieľom uprednostniť ich lokalizáciu v tom, či onom intracelulámom priestore. Takto môžu sekvencie nukleových kyselín podľa vynálezu zahrňovať sekvencie kódujúce peptidy s jadrovou lokalizáciou (NLS). Hlavne je možné zlúčiť sekvencie podľa vynálezu so sekvenciou kódujúcou NLS vírusu SV40, ktorý má nasledujúcu peptidovú sekvenciu: MPKKKRK (Kalderon a kol., Celí 39 (1984) 499).
Ako už bolo uvedené, sekvencie nukleových kyselín podľa vynálezu zahrnujú sekvencie umožňujúce expresiu génu alebo génov kódujúcich PIL v cicavčích bunkách. Vo všeobecnosti sú gény PIL uložené pod kontrolou promočných oblastí transkripcie a translácie, ktoré sú funkčné v cicavčej bunke, v ktorej má dôjsť k expresii. Môže ísť o homológne sekvencie vzhľadom na uvedenú bunku, t. j. o sekvencie prirodzene zodpovedné za expresiu génov v uvedenej bunke. Taktiež môže ísť o sekvencie rôzneho pôvodu, t. j. sekvencie zodpovedné za expresiu proteínov v iných bunkových typoch, sekvencie zodpovedné za expresiu protilátok v prirodzených podmienkach, expresné vírusové sekvencie, napríklad prítomné vo vektore, v ktorom sú zabudované sekvencie podľa vynálezu, alebo tiež syntetické alebo polosyntetické sekvencie.
V prípade, že ide o použitie u ľudí, bolo v príslušnej odbornej literatúre opísaných mnoho funkčných promótorov, akými sú napríklad vírusové promótory CMV, SV40, E la, MLP, LTR, atď. Zaujímavé sú bunkové promótory, napríklad promótor génu papilomu, pretože umožňujú špecifickú expresiu v tkanive (obmedzenú v prípade papilomu na črevo).
Expresné sekvencie môžu byť taktiež modifikované, napríklad s cieľom prispôsobiť expresiu v danom type vektoru alebo bunky, s cieľom redukovať veľkosť, s cieľom zvýšiť ich promočnú aktivitu transkripcie, s cieľom generovať indukovateľné promótory, alebo s cieľom zlepšiť ich regulačnú hladinu, alebo tiež s cieľom zmeniť charakter ich regulácie. Takéto modifikácie môžu byť pripravené napríklad mutagenézou in vitro, zavedením dodatočných regulačných prvkov alebo syntetických sekvencií, alebo deléciami alebo substitúciami pôvodných regulačných prvkov. Zvlášť výhodné môže byť použitie tkanivovo špecifických promótorov s cieľom cielenej expresie PIL iba do jedného typu tkaniva.
V prípade, že sekvencia nukleových kyselín neobsahuje expresné sekvencie, môže byť táto sekvencia zabudovaná do expresného vektora a to za expresnú sekvenciu.
S cieľom pripraviť vektor podľa vynálezu je predovšetkým vhodné identifikovať bunkovú funkciu, ktorá jc napríklad implikovaná v určitej patológii, alebo ktorá je zodpovedná za takúto patológiu a ktorá má byť ovplyvnená. Potom je vhodné identifikovať bunkovú zložku implikovanú v tejto funkcii a stanoviť, ktorý PIL najviac zodpovedá tejto bunkovej zložke (protilátky, deriváty, atď.) pokiaľ ide o jeho lokalizáciu, jeho úlohu, jeho charakter, atď. Sotva je takýto PIL vybraný, môže byť zodpovedajúca sekvencia nukleových kyselín získaná technikami molekulárnej biológie (chemická syntéza, klonovanie, enzymatická modifikácia, atď.) a vložená do príslušného vektoru za použitia metodiky, ktorá je opísaná v príkladoch.
Ďalším predmetom vynálezu sú farmaceutické kompozície obsahujúce aspoň jednu sekvenciu nukleových kyselín alebo vektor, ktoré boli opísané v predchádzajúcom texte.
Sekvencie podľa vynálezu môžu byť použité samotné, napríklad po injekcii človeku alebo zvieraťu, s cieľom indukovať intracelulámu expresiu proteínu PIL na ovplyvnenie danej bunkovej funkcie. Hlavne môžu byť injikované v jednoduchej DNA forme technikou opísanou v patentovej prihláške WO 90/11092. Uvedené sekvencie môžu byť tiež podané v komplexnej forme, napríklad s DEAE-dextranom (Pagano a kol., J. Virol. 1 (1967) 891), s jadrovými proteinmi (Kaneda a kol., Science 243 (1989) 375), s lipidmi (Felgner a kol., PNAS 84 (1987) 7413), vo forme lipozómov (Fraley a kol,, J. Biol. Chem. 255 (1980) 10431), atď.
V rámci výhodnej formy uskutočnenia vynálezu sa definované sekvencie nukleových kyselín zabudujú do vektora. Použitie takýchto vektorov v skutočnosti umožňuje uprednostnenie penetrácie do buniek, zvýšenie rezistencie proti enzýmom a zvýšenie stability a intracelulámej hladiny. Vektory podľa vynálezu môžu byť plazmidové aj vírusové, ale preferuje sa použitie vírusového vektora.
V rámci výhodnej formy uskutočnenia vynálezu sa teda vynález týka definovaných sekvencií nukleových kyselín zabudovaných do vírusového vektora.
Vynález sa taktiež týka rekombinantného vírusu obsahujúceho aspoň jednu sekvenciu nukleových kyselín kódujúcu proteín PIL, ktorá je uložená do genómu rekombinantného vírusu.
Ako už bolo uvedené, na prenos a expresiu in vivo génov podľa vynálezu, môžu byť použité ako vektory rôzne vírusy. Ako príklady takýchto vírusov je možné uviesť retrovírusy (RSV, HMS, MMS, atď.), vírus HSV, vírusy združené s adenovírusmi, adenovírusy, vírus kiahní, atď.
Výhodne je rekombinantným vírusom podľa vynálezu defektný vírus. Výraz „defektný vírus“ označuje vírus, ktorý je neschopný replikovať sa v cieľovej bunke. Vo všeobecnosti je teda genóm použitých defektných vírusov v rámci vynálezu zbavený aspoň sekvencií, ktoré sú nevyhnutné na replikáciu uvedeného vírusu v infikovanej bunke. Tieto oblasti môžu byť buď eliminované (a to buď úplne alebo čiastočne), alebo znefunkčnené alebo nahradené ďalšími sekvenciami, hlavne sekvenciami nukleových kyselín podľa vynálezu. Ale defektný vírus si výhodne zachová svoje genómové sekvencie, ktoré sú nevyhnutné na enkapsidáciu vírusových častíc.
Defektné rekombinantné vírusy odvodené od retrovírusov, vírusov združených s adenovírusmi, vírusu HSV (vírus herpes simplex) alebo adenovírusov už boli opísané v príslušnej odbornej literatúre (Roemer a Friedmann, Eur. J. Biochem. 208 (1992) 211, Dobson a al., Neurón 5 (1990) 353, Chiocca a kol., New Biol. 2 (1990) 739, Miyanohara a kol., New. Biol. 4 (1992) 238, WO91/18088, Akli a kol., Náture Genetics 3 (1993) 224, Stratford-Perricaudet a kol., Human Gene Therapy 1 (1990) 241, EP 185 573, Levrero a kol., Gene 101 (1991) 195, EP 243204)).
SK 285169 Β6
Zvlášť výhodné je použiť sekvencie nukleových kyselín podľa vynálezu v inkorporovanej forme do defektného rekombinantného adenovírusu.
V skutočnosti existujú rôzne sérotypy adenovírusov, ktorých štruktúra a vlastnosti sa trochu menia, a ktoré nie sú patogénne pre človeka a hlavne pre neimunodeprimované subjekty. Tieto vírusy sa vlastne neintegrujú do buniek, ktoré infikujú, ale môžu inkorporovať dôležité fragmenty exogénnej DNA. Z týchto rôznych sérotypov sa v rámci vynálezu prednostne používajú adenovírusy typu 2 alebo 5 (Ad 2 alebo Ad 5). V prípade adenovírusu Ad 5 sú sekvenciami nevyhnutnými na replikáciu oblasti El A a E1B.
Malá veľkosť génov kódujúcich intraceluláme protilátky podľa vynálezu ďalej umožňuje výhodne súčasne inkorporovať do jedného a toho istého vektoru niekoľko génov kódujúcich intraceluláme protilátky pôsobiace proti rôznym oblastiam jednej alebo niekoľkých cieľových bunkových zložiek. Spôsob špecifického uskutočnenia vynálezu spočíva teda vo vektore, hlavne vírusovom, obsahujúcom aspoň dve sekvencie nukleových kyselín kódujúce väzbové intraceluláme protilátky riadené proti rôznym epitopom.
Defektné rekombinantné vírusy podľa vynálezu môžu byť pripravené homológnou rekombináciou medzi defektným vírusom a plazmidom, nesúcim okrem iného, aj uvedenú sekvenciu nukleových kyselín (Levrero a kol., Gene 101 (1991) 195, Graham, EMBO J. 3 (12) (1984) 2917). Táto homológna rekombinácia sa uskutoční po ko-transfekcii uvedeného vírusu a plazmidu do príslušnej bunkovej línie. Použitá bunková línia musí byť výhodne (i) transformovateľná uvedenými prvkami a (ii) musí zahŕňať sekvencie schopné komplementovať časť genómu defektného vírusu, výhodne v integrovanej forme s cieľom eliminovať riziko rekombinácie. Ako príklad bunkovej línie použiteľnej na prípravu defektných rekombinantných adenovírusov možno uviesť bunkovú líniu 293 z obličky ľudského embrya (Graham a kol., J. Gen. Virol. 36 (1977) 59), ktorá obsahuje v integrovanej forme vo svojom genóme ľavú časť genómu adenovírusu Ad 5 (12 %). Ako príklad bunkovej línie použiteľnej na prípravu defektného rekombinantného retrovirusu možno uviesť bunkovú líniu CR.IP (Danos a Mulligan, PNAS 85 (1988) 6460).
Následne sa multiplikované vírusy izolujú a puriftkujú klasickými metódami molekulárnej biológie.
Vynález sa taktiež týka farmaceutickej kompozície obsahujúcej aspoň jeden defektný rekombinantný vírus, ktorý bol uvedený.
Farmaceutické kompozície podľa vynálezu môžu byť formulované do galenických foriem vhodných na topické, perorálne, parenterálne, intranazálne, intravenózne, intramuskuláme, subkutánne, intraokulámc a ďalšie podanie.
Výhodne obsahujú uvedené farmaceutické kompozície prijateľné vehikulum na injikovateľnú formuláciu. Môže ísť hlavne o sterilné izotonické roztoky soli (dihydrogenfosforečnan sodný, hydrogenfosforečnan sodný, chlorid sodný, chlorid draselný, chlorid vápenatý alebo chlorid horečnatý, atď. alebo zmesi týchto solí), alebo o suché kompozície, najmä lyofilizované, ktoré pridaním sterilnej vody alebo fyziologického roztoku umožňujú prípravu injikovatcľných roztokov.
Dávky nukleovej kyseliny (sekvencia alebo vektor) použité pri podaní, môžu byť modifikované v závislosti od rôznych parametrov a najmä v závislosti od použitého spôsobu podania, liečeného patologického stavu, génu, ktorý má byť exprimovaný a tiež od požadovanej doby liečenia. Vo všeobecnosti, ak ide o rekombinantné vírusy podľa vynálezu, sú tieto vírusy formulované a podávané vo forme dávok, ktoré sú v rozmedzí 104 až 1014 pfu/ml, výhodne 106 až 1O10 pfu/ml. Výraz pfu („plaque forming unit“) zodpovedá infekčnej potencii roztoku vírusov a stanoví sa infikovaním príslušnej bunkovej kultúry a obyčajne po 48 hodinách sa vyhodnotí počet oblastí infikovaných buniek. Techniky stanovenia titru pfu vírusového roztoku sú dobre dokumentované v odbornej literatúre.
Predmetom vynálezu je taktiež každá rekombinantná bunka obsahujúca definovanú sekvenciu nukleových kyselín.
Sekvencie podľa vynálezu, prípadne inkorporované do vektorov, a farmaceutické kompozície, ktoré ich obsahujú, môžu byť použité na liečenie mnohých patologických stavov. Takto môžu byť použité na prenos a expresiu génov in vivo do každého typu tkaniva. Liečenie môže byť v konečnom dôsledku stanovené podľa patologického stavu, ktorý má byť liečený (prenos na úrovni špecifického tkaniva môže byť uskutočnený hlavne voľbou vektora a expresia voľbou špecifického promótora). Sekvencie alebo vektory podľa vynálezu sú výhodne použité na produkciu proteínov (u človeka alebo zvieraťa), a to in vivo a intraceluláme, schopných pôsobiť špecifickým spôsobom na rôzne bunkové funkcie, akými sú bunková proliferácia, syntéza metabolitov, syntéza proteínov, replikácia a/alebo transkripcia DNA, atď. Vynález takto umožňuje liečiť špecificky, lokálne a účinne mnohé bunkové dysfunkcie primárneho charakteru alebo dysfunkcie, ktoré sú dôsledkom rôznych patologických stavov, hlavne rakoviny, vírusových alebo bakteriálnych ochorení, alebo všeobecne povedané, vynález umožňuje liečiť každý patologický stav, pri ktorom môže byť identifikovaný bunkový mediátor.
Použitie na liečenie patologických stavov spojených s bunkovou proliferáciou
V rámci zvlášť výhodnej formy uskutočnenia obsahujú sekvencie nukleových kyselín podľa vynálezu gény kódujúce proteíny PIL schopné vstúpiť do vzájomnej interakcie a interferovať s aktivitou faktorov implikovaných v bunkovej proliferácii. V rámci bunkovej proliferácie sa uplatňuje množina faktorov, akými sú membránové receptory (proteíny G), onkogény, enzýmy (proteínkinázy, famesyltransferázy, fosfolipázy, atď.), nukleozidy (ATP, AMP, GDP, GTP, atď.), aktivačné faktory [výmenné faktory guanozinov (GRF, GPA, atď.), transkripčné faktory, atď.], atď.
Intraceluláma expresia proteínov PIL podľa vynálezu, schopných viazať a neutralizovať takéto faktory, umožňuje regulovať proces bunkovej proliferácie. Tento fakt je zaujímavý hlavne v situáciách, v ktorých sa bunková proliferácia vymyká prirodzeným regulačným mechanizmom, a ktoré vedú k vzniku nádorov. Mnohé faktory (produkty onkogénnych génov a faktory implikované v signalizácii účinku týchto produktov) boli v skutočnosti spojované s týmito deregulačnými javmi bunkovej proliferácie. Takto 90 % adenokarcinómu pankreasu vykazuje onkogén Ki-ras zmutovaný na dvanástom kodóne (Almoguera a kol., Celí 53 (1988) 549). Rovnako bola prítomnosť mutagénu ras dokázaná v adenokarcinómoch hrubého čreva a pri rakovine štítnej žľazy (50 %) alebo v karcinóme pľúc a pri myeloidnej leukémii (30 %, Bos J. L. Cancer Res. 49 (1989) 4682). Doteraz boli identifikované aj mnohé ďalšie onkogény (myc, fos, jun, myb, ras, erb, atď.), ktorých mutantné formy sa zdajú byť zodpovedné za dereguláciu bunkovej proliferácie.
Expresia proteínov PIL, schopných viazať tieto bunkové faktory (prednostne ich onkogénnu formu), a teda spomaliť alebo inhibovať ich účinky, ponúka možnosť novej liečebnej metódy na liečenie rakoviny.
V rámci zvlášť zaujímavej formy uskutočnenia vynálezu sa vynález týka vektorov, obsahujúcich sekvencie nukleových kyselín, ktoré zahŕňajú gén kódujúci intraceluláme protilátky schopné vstúpiť do interakcie s expresným produktom onkogénu, alebo s faktorom intervenujúcim pri signalizačnom mechanizme onkogénu.
Z cieľových onkogénov možno uviesť v rámci vynálezu onkogény ras, fos, jun, myc, myb a erb.
Z faktorov intervenujúcich pri signalizačnom mechanizme onkogénu možno uviesť najmä membránové receptory, ktoré môžu byť zacielené na úrovni ich intracelulárnych domén (proteíny G (napríklad: tyrozínkináza) fosforylazy, famezyltransferázy), výmenné faktory nukleozidov (faktory GAP, GRF, atď.), atď.
Výhodne sa vynález týka vektorov, najmä vírusového pôvodu, obsahujúcich sekvenciu nukleových kyselín kódujúcu intracelulámu protilátku, ktorá je namierená proti onkogénu alebo faktoru intervenujúcom pri signalizačnom mechanizme onkogénu a tvorená peptidom, ktorý zodpovedá väzbovému miestu variabilnej oblasti ľahkého reťazca protilátky a spojeným peptidovým linkerom s peptidom, ktorý zodpovedá väzbovému miestu variabilnej oblasti ťažkého reťazca protilátky.
Špecifickejšie sa vynález týka defektných rekombinantných vírusov exprimujúcich intracelulámu protilátku namierenú proti faktoru ras-dependentného signalizačného mechanizmu.
Ako je to demonštrované v ďalej zaradených príkladoch uskutočnenia, expresia intracelulámych protilátok anti-p21 (expresný produkt génu ras), anti-GAP alebo antip53 umožňuje reverziu transformačného fenotypu rakovinovej bunky.
Použitie na liečenie vírusových patológií
Sekvenciami nukleových kyselín podľa vynálezu môžu byť tiež sekvencie kódujúce intraceluláme protilátky schopné vstúpiť do interakcie s infekčným cyklom patogénneho vírusu (HIV, vírus papilomu, atď.).
Bližšie je možné uviesť, že v prípade vírusu HIV, antivírusové činidlá, ktoré sú v súčasnosti k dispozícii alebo sú už v pokročilom štádiu klinických skúšok, neumožňujú blokovať multiplikáciu vírusu, pretože tieto činidlá len ťažko brzdia rozvoj ochorenia. Jeden z hlavných dôvodov, prečo je tomu tak, spočíva v existencii kmeňov, ktoré sú rezistentné na uvedené antivírusové činidlá. Rozvoj účinného očkovania naráža taktiež na mnohé prekážky. Genetická variabilita vírusu HIV neumožňuje definovať stabilnú antigénnu štruktúru vyvolávajúcu humorálnu alebo bunkovú imunologickú odpoveď proti rôznym existujúcim kmeňom. Rovnako ako v prípade antivírusových činidiel, keď vírus odoláva snahám dosiahnuť selektívneho účinku ohybným manévrom presných mutácií, zdá sa, že pokusy očkovania proti HIV uskutočnené až do dnešného dňa neposilňujú v tomto ohľade imunitný systém.
Vynález predstavuje nový prístup k liečeniu infekcií spôsobených vírusom HIV, pričom tento prístup spočíva v blokovaní vírusu pri jeho replikačnom cykle expresiou proteínov PIL, hlavne intracelulámych protilátok. Vynález hlavne umožňuje, na rozdiel od očkovania a použitia antivírusových činidiel, prekonať problém genetickej variability vírusu. V prípade klasického očkovania pôsobí imunitná odpoveď hlavne proti variabilným oblastiam. Na rozdiel od toho, umožňuje použitie intracelulámych protilátok podľa vynálezu zvoliť epitop, ktorý je nielen konzervovaný, ale tiež nevyhnutný pre funkciu vírusového proteínu. Výhodne je intraceluláma protilátka namierená proti epitopu dostatočnej veľkosti, aby sa zabránilo vírusu odolať a prispôso biť sa úhybným mechanizmom presne reagujúcich mutácií. Malá veľkosť génu kódujúceho intracelulámu protilátku podľa vynálezu umožňuje zasiahnuť niekoľko oblastí (jedného a toho istého, alebo niekoľkých proteínov) s použitím jediného vektoru génovej terapie.
Najdôležitejšími cieľmi na uskutočňovanie vynálezu sú dva hlavné regulačné proteíny vírusu, a to tat a rev. V skutočnosti sú oba tieto proteíny nevyhnutné na vírusovú replikáciu. Navyše, expresia antimediátorovej RNA alebo ribozýmov zasahujúcich mediátorovú RNA tat alebo rev, zabraňuje replikách vírusu. Mechanizmus účinku týchto proteínov je celkom dobre zdokumentovaný: tat je transaktivačným faktorom transkripcie, zatiaľ čo rev zaisťuje prechod medzi rannou a neskorou ľázou replikačného cyklu. Oba tieto proteíny sú aktívne tak, že sa fixujú na vírusové mediátorové RNA, pričom peptidová oblasť nevyhnutná na toto fixovanie a nutná na funkciu uvedených mediátorových RNA je relatívne dobre vymedzená. Navyše bolo dokázané, že nadexpresia ich fixačného miesta na RNA (oblasť TAR pre tat a oblasť RRE pre rev) inhibuje ich funkciu pri expresii vírusu.
Za týchto podmienok spočíva zvlášť výhodná forma uskutočnenia vynálezu v použití sekvencie DNA kódujúcej intracelulámu protilátku namierenú proti proteínom tat alebo rev a schopnú neutralizovať aktivitu týchto proteínov. Výhodne sú takéto protilátky namierené proti oblasti tat alebo rev, ktorá je zodpovedná za ich fixovanie na RNA.
Intraceluláme protilátky podľa vynálezu, pôsobiace proti týmto epitopom, môžu byť pripravené spôsobmi opísanými v ďalej zaradených príkladoch. Konkrétne, pokiaľ ide o protilátku anti-tat, táto protilátka môže byť získaná genetickou modifikáciou z monoklonálnej protilátky T-B( 12) (Hybridolab).
Ďalším cieľovým proteínom, dôležitým na replikáciu vírusu HIV, ktorého funkcia môže byť ľahko inhibovaná intracelulámou protilátkou, je proteín nukleokapsidu NCP7. V skutočnosti hrá tento proteín dôležitú úlohu pri retrotranskripcii (ranná fáza), pri integrácii a v neskorej, ale dôležitej fáze, ktorou je enkapsidácia. Táto mnohofunkčnosť sa vysvetľuje tým, že uvedený proteín má štruktúrnu enzymaticky aktívnu úlohu. Tento proteín bol taktiež opísaný ako hybridáza, ktorá by mala umožňovať komplexovanie vírusových nukleových kyselín: RNA/DNA a DNA/DNA v priebehu retrotranskripcie, ako aj RNA/RNA a RNA/tRNA-lvs3 na úrovni enkapsidácie. NCP7 sa ukazuje ako nevyhnutný na produkciu infekčných vírusov.
Cytoplazmatická expresia génovou terapiou intracelulámych protilátok, pôsobiacich proti NCP7 a inhibujúcich jeho funkciu pri dimerizácii vírusových RNA a pri enkapsidácii, predstavuje ďalšiu špecifickú formu uskutočnenia vynálezu.
Intraceluláme protilátky podľa vynálezu, pôsobiace proti neutralizujúcim epitopom uvedeného proteínu, môžu byť pripravené spôsobmi, ktoré sú opísané v ďalej zaradených príkladoch uskutočnenia.
Predmetom génovej terapie podľa vynálezu môžu byť aj ďalšie vírusové zložky, najmä: miesto fixovania k molekule CD4 (príklad: obalový glykoproteín (gpl20/41)), multimeračná oblasť obalu, štiepiace miesto gpl20/gp41, proteáza, integráza a vo všeobecnosti každý vírusový proteín. Tieto domény nie sú všeobecne dosiahnuteľné v prípade, že j c obal v natívnej forme. Z tohto dôvodu sú spomenuté domény veľmi málo imunogénne a očkovanie týkajúce sa týchto domén je nemožné. Vynález umožňuje odhaliť tieto vírusové zložky a predstavuje takto veľmi potentný terapeutický potenciál. Okrem toho, ako už bolo uvedené, malá veľkosť génov kódujúcich intracelulámu protilátku podľa
SK 285169 Β6 vynálezu umožňuje výhodne súčasne exprimovať v jednom a tom istom vektore niekoľko intracelulámych protilátok pôsobiacich proti rôznym oblastiam jedného alebo niekoľkých z uvedených cieľov.
Nukleové sekvencie podľa vynálezu môžu byť taktiež sekvenciami kódujúcimi proteíny PIL schopné vstúpiť do interakcie a interferovať s aktivitou faktorov implikovaných v syntéze metabolitov, v proteínovej syntéze alebo tiež pri replikácii a/alebo transkripcii DNA.
V nasledujúcej časti opisu bude vynález bližšie opísaný pomocou konkrétnych príkladov jeho uskutočnenia, pričom tieto príklady len ilustrujú, ale nijako neobmedzujú rozsah vynálezu, ktorý je jednoznačne vymedzený definíciou patentových nárokov.
Príklady uskutočnenia vynálezu
Na pripojenom obr. 1 sú znázornené A) reštrikčná mapa ScFv-ras, B) reštrikčná mapa ScFv-Gap a C) neutralizačný účinok tranzitnej expresie intracelulámej protilátky podľa vynálezu na transformačnú schopnosť onkogénu ras alebo Her2, kde: Py = kontrolné bunky,
ScFv = bunky transfektované samotným plazmidom psv2. ScFv. ras,
VAL = bunky transfektované vektorom exprimujúcim onkogénny ras Ha-ras, Vall2
VAL+ScFv = bunky kotransfektované plazmidom psv2. ScFv. ras a Ha-ras Val 12,
HER2 = bunky transfektované vektorom exprimujúcim onkogénny Her2
HER2+ScFv = bunky kotransfektované plazmidom psv2. ScFv. ras a Her2.
Základné techniky molekulárnej biológie
Klasické metódy používané v molekulárnej biológii, akými sú preparatívna extrakcia plazmidovej DNA, odstreďovanie plazmidovej DNA v gradiente chloridu cézneho, elektroforéza na agarózovom géli alebo akrylamide, purifikácia fragmentov DNA elektroelúciou, extrakcia proteínov fenolom alebo systémom fenol-chloroform, precipitácia DNA v soľnom prostredí etanolom alebo izopropanolom, transformácia v Escherichia coli, atď., sú pre odborníka veľmi dobre známe a často opisované v literatúre (Maniatis T. a kol., „Molecular Cloning, a Laboratory Manual“, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y., 1982, Ausubel F. M. a kol. (nakl.J, „Current Protocols in Molecular Biology“, John Wiley and Sons, New York, 1987).
Plazmidy typu pBR322, pUC a fágy série Ml3 sú komerčného pôvodu (Bethesda Research Laboratories).
S cieľom ligácie môžu byť fragmenty DNA separované podľa veľkosti elektroforézou na agarózovom géli alebo akrylamidovom géli, extrahované fenolom, alebo systémom tvoreným zmesou fenolu a chloroformu, vyzrážané etanolom a potom inkubovaná s DNA-ligázou fága T4 (Biolaps) podľa odporúčania dodávateľa.
Dosyntetizovanie 5'koncov môže byť uskutočnené pomocou Klenowovho fragmentu DNA-polymerázy I E. coli (Biolaps) podľa inštrukcií dodávateľa. Deštrukcia 3'koncov sa vykonáva za prítomnosti DNA-polymerázy fága T4 (Biolaps) použitej podľa odporúčania výrobcu. Deštrukcia 5'koncov sa uskutočňuje riadeným pôsobením nukleázy SI.
Mutagenéza in vitro riadená syntetickými oligodeoxynukleotidmi môže prebiehať metódou vyvinutou Taylorom a kol. (Nucleic Acids Res. 13 (1985) 8749 - 8764) s použitím súpravy distribuovanej firmou Amersham.
Enzymatickú amplifikácia fragmentov DNA technikou nazvanou PCR (Polymérase-catalyzed Chain Reaction, Saiki R. K. a kol., Science 230 (1985) 1350 - 1354, Mullis K. B. a Faloona F. A., Meth. Enzým. 155 (1987) 335 - 350) môže byť uskutočnená s použitím činidla „DNA thermal cycler“ (Perkin Elmer Cetus) podľa pokynov výrobcu.
Verifikácia nukleotidových sekvencií môže byť vykonaná pomocou metódy vyvinutej Sangerom a kol. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74 (1977) 5463 - 5467) s použitím súpravy distribuovanej firmou Amersham.
Príklad 1
Klonovanie a expresia sekvencie DNA kódujúcej intracelulámu protilátku anti-ras
Tento príklad opisuje klonovanie a expresiu sekvencie nukleových kyselín kódujúcej intracelulámy väzbový proteín reprodukciou vlastnosti monoklonálnej protilátky Y13-259. Táto protilátka Yl3-259 pôsobí proti proteínom Ras (ATCC CRL 1742) (J. Virol. 43, 294 - 304, 1982) a predstavuje neutralizačnú protilátku funkcie onkogénnych proteínov Ras potom, ako bola injikovaná do buniek (Smith a kol., (1986) Náture, 320, 540 - 543, Kung a kol., Exp. Celí. Res. (1986) 162,363 -371).
1.1. Príprava sekvencie DNA
Sekvencia DNA kódujúca intracelulámu protilátku (fragment ScFv) bola pripravená technikou opísanou v patente US 4 946 778. Táto sekvencia bola potom vložená pod kontrolu funkčného promótora v cicavčích bunkách.
RNA poly A sú izolované z bunkovej kultúry hybridómu, ktorý vylučuje protilátku Y13-259, technikou opísanou S. H. Chirguinom a kol. (Biochemistry 18, 5294 (1979)). Tieto RNA sa použijú na reakciu spätnej transkripcie pomocou primerov vytvorených z alcatvomých hexanukleotidov. Získaná cDNA má funkciu matrice pre dve reakcie PCR, z ktorých:
- jedna je určená na amplifikáciu variabilných fragmentov ťažkého reťazca (VH) protilátky Y13-259 so špecifickými primermi murínneho VH a
- druhá umožňuje získať fragment VL s použitím zmesi 10 primerov odvodených od murínnych sekvencií.
Takto sa získajú dva fragmenty 340 pb a 325 pb, ktoré sa potom zlúčia pomocou linkeru, ktorý umožňuje presné polohovanie cDNA VH v 5'DNA fragmente VL. Tento linker kóduje 15 aminokyselín vytvorených troma opakovaniami časti (Gly)4 Ser (Orlandi, R. a kol., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 3833 - 3837 (1979)). Sekvencia intracelulárnej protilátky je uvedená na pripojenom sekvenčnom diagrame SEQ ID č. 1 (zvyšok 28 až 270). Táto sekvencia umožňuje dostatok stupňov voľnosti pri fúzii VH-VL dovoľujúcich zostavenie fragmentov do paralelnej orientácie a zaisťujúcich presnú afinitu k antigénu.
Zlúčená sekvencia nukleových kyselín VH-linker-VL sa potom inzertuje do fagemidu, ktorý umožňuje expresiu intracelulámej protilátky (fragment ScFv) na povrchu fágu M13 (obr. IA). Táto expresia ľahko umožňuje identifikáciu a selekciu intracelulámych protilátok, ktoré presne rozpoznávajú antigén.
1.2. Funkčné zhodnotenie modifikovanej intracelulámej protilátky
Sekvencia DNA, ktorá kóduje modifikovanú intracelulámu protilátku anti-Ras (VH-linker-VL) sa izoluje z fagemidu reštrikciou, po ktorej sa inzertuje do vektoru sv2 pod kontrolou páru zosilňovač transkripcie-promótor od SV40 (Schweighoffer a kol. Science, 256, 825 - 827, 1992) s cieľom testovať jej schopnosti antagonizovať účinky onkogénneho Ras. Takto získaný plazmid je označený ako psv2. ScFv. ras. Funkčné vyhodnotenie bolo uskutočnené niekoľkými testami.
a) Tranzitná transfekcia v cicavčích bunkách
S cieľom vyhodnotiť tranzitnú transfekciu v cicavčích bunkách bol plazmid psv2. ScFv. ras kotransfektovaný do buniek NIH 3T3 podľa protokolu opísaného v Schweighoffer a kol., Science, 256, 825 - 827 (1992) s vektorom, ktorý umožňuje expresiu génu Ha-ras Val 12. Aktivačný stav študovaného signalizačného mechanizmu bol zaznamenaný meraním enzymatickej aktivity získanej z reportážneho génu „chloramphenikol-acetyl-transferáza (CAT)“ vloženého pod kontrolu promótoru obsahujúceho nukleotidová prvky zodpovedajúce v „trans“ účinku taktiež kotransfektovaných Ras (RRE): tieto prvky RRE sú tvorené systémom hybridný promótor TK-zosilňovač transkripcie polyómu (Wasylyk a kol., EMBO, J. 7,2475 1988).
Získané výsledky sú uvedené na obr. 1C). Analýza aktivít CAT preukazuje schopnosť modifikovanej intracelulámej protilátky, pripravenej z protilátky Y13-259, antagonizovať aktivitu onkogénneho Ras.
Plazmid psv2. ScFv. ras kotransfektovaný s plazmidom umožňujúcim expresiu onkogénu obdareného aktivitou tyrozinkinázy, ktorým je onkogén HER2 (ľudský epidermálny rastový faktor typu 11), rovnako blokuje aktivitu na plazmide pri teste „CAT“ (obr. 1).
b) Tvorba ložísk transformovaných buniek
Rakovinové bunky majú vlastnosť tvoriť transformačné ložiská a najmä fibroblasty NIH 3T3 exprimujú onkogénny Ras (Barlat a kol., Oncogene (1993), B, 215 - 218).
Bunky NIH 3T3 sú kultivované rovnako ako pri predchádzajúcom teste v prostredí DMEM (Dulbecco-modifikované prostredie Eagle) obsahujúcom 10 % fetálneho teľacieho séra pri teplote 37 °C vo vlhkom prostredí obsahujúcom 5 % oxidu uhličitého. Tieto bunky sú potom kotransfektované s onkogénnym Ras: Ha-ras Val 12, plazmidom psv2. ScFv. ras (pozri uvedený odsek a) a 10-násobným prebytkom génu rezistentného proti neomycínu transfekčnou technikou pre katiónové lipidy (Schwe-ighoffer a kol., Science, 256, 825 - 827, 1992). Na každú Petriho misku sa transfektuje rovnaké celkové množstvo DNA.
hodín po transfekcii sa transfektované bunky pochádzajúce z každej Petriho misky s priemerom 100 mm, rozdelia v pomere 1 až 10 a kultivujú sa v rovnakom prostredí, ale za prítomnosti 0,4 mg G418 (GIBCO/BRL) na mililiter prostredia. Po 14 dňoch kultivácie je vyčíslený počet transformačných ložísk na mikrogram transfektovanej DNA.
Získané výsledky sú uvedené v nasledujúcej tabuľke. Tieto výsledky predstavujú priemerné hodnoty zo štyroch nezávislých testov.
Tabuľka
Transformácia buniek NIH 3T3 s použitím Ha-ras Vall2 v prítomnosti intracelulámej protilátky anti-ras
| Transfektované plazmidy | Počet ložísk na gg DNA transfektovanej |
| Ha-Ras Val 12 | 110 |
| psv2. ScFv. ras | 2 |
| Ha-Ras Val 12 + psv2. ScFv. ras | 30 |
Získané výsledky jasne ukazujú, že intraceluláma protilátka anti-ras veľmi silne znižuje transformačnú schopnosť onkogénneho génu ras.
Na druhej strane, vzhľadom na výsledky získané v odseku a), expresia uvedeného fragmentu ScFv protilátky Yl 3-159 by mala taktiež inhibovať transformáciu uskutočnenú ďalšími onkogénmi (HER1, HER2) uľahčujúc aktiváciu bunkových proteínov Ras.
Je samozrejmé, že odborník v danom odbore môže, na základe výsledkov opísaných v tejto prihláške vynálezu, reprodukovať vynález s použitím sekvencii nukleových kyselín kódujúcich intraceluláme protilátky (ako fragmenty ScFv) pôsobiace aj proti ďalším bunkovým zložkám. Tieto môžu byť pripravené buď zo známych protilátok pôsobiacich proti bunkovým zložkám, alebo identifikáciou antigénu určeného na neutralizáciu, imunizáciou pomocou tohto antigénu alebo jeho preferovaného epitopu a potom prípravou intracelulámej protilátky zo získanej protilátky, jej mRNA alebo hybndómu. Takto môžu byť zasiahnuté aj ďalšie zložky implikované v procese bunkovej transformácie. Rovnakým metodickým postupom môžu byť napríklad pripravené ďalšie sekvencie DNA kódujúce väzbové intraceluláme protilátky anti-ras z hybridómov M38, M8, M70, M90 a M30 (ATCC HB 9158), ktorých protilátky pôsobia proti zvyškom 1 až 23, 24 až 69, 90 až 106, 107 až 130 resp. 131 až 152 proteínu Ha-Ras. Okrem toho, ako už bolo uvedené, môžu byť pripravené, s cieľom dosiahnuť vynikajúcej neutralizačnej aktivity, vektory, nesúce súčasne niekoľko sekvencii kódujúcich rôzne intraceluláme protilátky.
Príklad 2
Klonovanie a expresia sekvencie DNA kódujúcej intracelulámu protilátku anti-GAP
Tento príklad opisuje klonovanie a expresiu sekvencie nukleových sekvencii, kódujúcu väzbový intracelulámy proteín, reprodukovaním vlastnosti monoklonálnej protilátky pôsobiacej proti proteínu GAP.
Proteín GAP (GTPase Activating Proteín) je implikovaný v ras-dependentnom signalizačnom mechanizme. Tento proteín vykazuje katalytický interakciu s proteínmi a 100- až 200-krát zvyšuje rýchlosť hydrolýzy GTP meranú in vitro pre normálny proteín p21. Rôzne práce dokazujú, že katalytická doména tohto proteínu s asi 1044 aminokyselinami je situovaná v karboxy-terminálnej oblasti (zvyšky 702 až 1044) a že táto oblasť je zodpovedná za interakciu proteínu GAP s proteínmi ras (pozri WO91/02749).
V súčasnosti bolo dokázané, že monoklonálna protilátka pôsobiaca proti doméne nazvanej „SH3“ proteínu GAP, neutralizuje funkcie onkogénnych proteínov Ras v „oeuf de Xénope“ (Duchesne a kol., Science, 259, 525 - 528, 1993).
Podľa metodiky opísanej v odseku 1.1. je možné syntetizovať sekvenciu DNA kódujúcu intracelulámu protilátku (fragment ScFv) zodpovedajúcu tejto protilátke (sekvenčný diagram SEQ ID č. 2, zvyšky 11 až 250, obr. 1B)). Takáto sekvencia inkorporovaná do vektora, môže umožniť inhibíciu transformačnej potencie onkogénneho génu ras v nádorových bunkách.
Okrem toho, prihlasovateľ identifikoval taktiež presnejším spôsobom epitopy rozpoznávané touto protilátkou. Spomenuté epitopy boli potom umelo syntetizované a môžu byť použité na generovanie nových neutralizačných protilátok, ktoré môžu byť užitočné na uskutočnenie vynálezu.
a) Presnejšia identifikácia
Uvedená identifikácia bola uskutočnená technikou „epitope scanning“. Táto technika je založená na zásade, že daná protilátka môže reagovať s peptidmi, dĺžky 5 až 15 aminokyselín. Takýmto spôsobom môže byť dosiahnutá identiflkácia sekvenčných epitopov, prípravou úplnej sady pokrývajúcich peptidov dĺžky 5 až 15 aminokyselín, ktoré zodpovedajú úplnej sekvencii uvažovaného antigénu. Táto technika bola použitá na stanovenie funkčných epitopov domény „SH3“ proteínu GAP. S týmto cieľom bola totalita domény skúmaná opätovným nadobudnutím sekvencii, a to syntézou dekapeptidu po každých dvoch aminokyselinách.
- Syntéza pokrývajúcich peptidov
Chemicky bolo syntetizovaných 35 peptidov pokrývajúcich totalitu fragmentu z obr. 1. Táto syntéza bola uskutočnená dvojmo na dvoch nezávislých nosičoch metódou Fmoc/t-butyl na pevnej fáze (súprava distribuovaná firmou Cambridge Research Biochemicals).
- Stanovenie funkčných epitopov
Funkčne epitopy rozpoznané protilátkou Ac200, boli indikované v rámci testu ELISA králičou protilátkou antisouris kopulovanou s peroxidázou. Použitým chromogénnym substrátom enzýmu je amino-di-(3-etylbenzotiazodinsulfonát) (ABTS).
Získané výsledky ukazujú, že epitopy rozpoznané protilátkou, sú:
-PVEDRRRVRAI
-EISF
-EDGWM
Tieto epitopy môžu byť použité klasickými postupmi na generovanie protilátok neutralizujúcich účinky proteínu ras. Tieto protilátky alebo hybridómy, ktoré ich produkujú, sú potom použité na generovanie sekvencii nukleových kyselín a vektorov podľa vynálezu s použitím opísanej metodiky.
Príklad 3
Príprava sekvencie nukleových kyselín kódujúcich intracelulámu protilátku anti-Ki-ras z mRNA extrahovaných z myších slezín, imunizovaných peptidmi, odvodenými od hypervariabiIných častí onkogénu Ki-Ras (2A a 2B).
Tento príklad opisuje prípravu sekvencii nukleových kyselín kódujúcich intraceluláme protilátky (také, ako fragmenty ScFv) podľa vynálezu identifikáciou antigénu určeného na neutralizáciu, imunizáciou pomocou tohto antigénu, alebo preferovaného epitopu tohto antigénu a potom prípravou sekvencie nukleových kyselín zo získanej protiíátky, jej mRNA alebo hybridómu.
Tento príklad demonštruje možnosť aplikovať vynález na ľubovoľný požadovaný antigén alebo epitop, a to dokonca aj v prípade, že nie je k dispozícii žiadna monoklonálna protilátka pôsobiaca proti uvedenému antigénu alebo epitopu.
Cieľovým antigénom je v tomto príklade protein Kiras. Presnejšie špecifikované, antigény použité na imunizáciu sú peptidy s 25 a 24 aminokyselinami zodpovedajúce terminálnym koncom proteínov Ki-Ras 2A a 2B:
- peptid 2A: QYRLKKISKEEKTPGCVKIKKCIIM
- peptid 2B: KYREKNSKDGKKKKKKSKTKCIIM
Po imunizácii myší týmito peptidmi klasickými postupmi imunológie sa extrahujú sleziny a cDNA sa pripraví z mRNA. cDNA kódujúce variabilné oblasti sa potom klonujú, čo vedie k zostaveniu banky fágov exprimujúcich ScFv zodpovedajúce totalite repertoáru použitých myší. Intraceluláme protilátky (fragmenty ScFv) rozpoznávajúce peptidy 2A a 2B sa potom identifikujú a izolujú postupnými selekčnými stupňami na báze afinity na stĺpci a na mikrotitračnej platni.
Tieto ScFv sa potom funkčne testujú podľa protokolu uvedeného v príklade 1.
Stratégia, zvolená v tomto príklade uskutočnenia, umožňuje výhodne zvoliť špecifické intraceluláme protilátky onko-génov Ki-Ras, ktoré neinterferujú s ostatnými protoonkogénmi Ras. Selektivita týchto nástrojov je teda nielen bunková (s ohľadom na dekopuláciu transdukčných ciest v bunkách transformovaných faktorom Ras), ale tiež molekulová.
Príklad 4
Príprava sekvencie nukleových kyselín kódujúcich intracelulámu protilátku anti-mutantný p53
Tento príklad opisuje prípravu sekvencii nukleových kyselín kódujúcich intraceluláme protilátky (také ako ScFv) pôsobiace proti mutantným proteínom p53. Tieto intraceluláme protilátky sa získavajú z rôznych monoklonálnych protilátok pôsobiacich proti uvedeným mutantným proteínom p53.
Gén kódujúci protein p53 sa alteruje vo veľmi vysokom počte nádorových buniek (Caron de Fromentel et Soussi, Genes, 4, 1 - 15, 1992). Mutantný protein p53 nemá rovnakú konformáciu ako divoký protein p53 (Lane a Benchimol, Genes Dev. 4, 1 - 8, 1990). Táto konformačná zmena môže byť detegovaná monoklonálnymi protilátkami (Milner a Cook, Virology, 154, 21 - 30, 1986, Milner, Náture, 310, 143 - 145, 1984).
Protilátky pAB 240 rozpoznávajú mutantné formy proteínov p53.
Intraceluláma expresia fragmentu ScFv špecifických protilátok mutantných proteínov p53 alebo proteínov vstupujúcich do špecifickej interakcie s týmito mutantnými proteínmi p53, by teda mala indukovať priaznivý liečebný účinok v nádoroch vykazujúcich mutantné formy proteínov p53.
Príklad 5
Klonovanie a expresia sekvencie DNA kódujúcej intracelulámu protilátku anti-vir papilomu
Tento príklad opisuje klonovanie a expresiu sekvencie DNA kódujúcej intracelulámu protilátku (fragment ScFv) pôsobiacu proti proteínu vírusu ľudského papilomu (HPV).
Cieľovým vírusovým proteínom je protein E6. Tento protein je produkovaný vírusmi HPV 16 a 18, ktoré sú zodpovedné za 90 % rakovín krčku maternice u žien a boli identifikované v prekancerogénnych cpitcliálnych léziách (Riou a kol., Lancet 335 (1990) 1 17). Produkt génu E6 vedie k tvorbe nádorov v dôsledku silného zníženia množstva divokého proteínu p53, t. j. antionkogénu v HPV-pozitívnych bunkách (Wrede a kol., Mol. Carcinog. 4 (1991) 171). V ďalších nádoroch je p53 inhibovaný odlišnými mechanizmami: mutáciou (pozri príklad 4) alebo združením s proteínmi, akými sú MDM2.
Sekvencia proteínu E6 bola opísaná v literatúre (Hawley-Nelson a kol., EMBO J. 8 (1989) 3905, Munger a kol., J. Vírol. 63 (1989) 4417). Jednotlivé oblasti tohto proteínu môžu byť identifikované metódou „epitope scanning“ (pozri príklad 2) a potom použité na imunizáciu myší podľa protokolu opísaného v príklade 3. Sekvencie DNA kódujúce intracelulámu protilátku (fragment ScFv) pôsobiacu proti proteínu E6 vírusu ľudského papilomu (HPV) sa potom pripraví s použitím opísanej metodiky. Funkčnosť tejto sekvencie sa po expresii in vivo zistí meraním:
- zvýšenia množstva divokého proteínu p53 v bunkách exprimujúcich E6
- reverznej morfológie buniek transformovaných vírusom HPV
SK 285169 Β6
- blokovania účinku E6 na transaktiváciu proteínu p53
- inhibície transformácie proteínom E6 ľudských keratinocytov a fibroblastov
SEC ID č.t (pokračovanie)
Sací
Príklad 6
Príprava sekvencie nukleových kyselín kódujúcich intracelulámu protilátku anti-HIV z mRNA extrahovanej zo slezín myší imunizovaných peptidmi odvodenými z aktívnych oblastí proteínov tat, rev a NCP7
Tento príklad opisuje prípravu sekvencií nukleových kyselín kódujúcich intracelulámu protilátku podľa vynálezu (také ako fragmenty ScFv) identifikáciou antigénu určeného na neutralizáciu, imunizáciou pomocou tohto antigénu alebo preferovaného epitopu tohto antigénu a potom prípravou sekvencie nukleových kyselín zo získanej protilátky, jej mRNA alebo hybridómu.
Tento príklad demonštruje ešte možnosť aplikovať vynález na ľubovoľný antigén alebo požadovaný epitop, a to dokonca aj v prípade, že v rámci doterajšieho stavu techniky nebola opísaná žiadna monoklonálna protilátka pôsobiaca proti uvedenému antigénu alebo epitopu.
Cieľovými antigénmi sú v tomto príklade proteíny tat, rev a NCP7 vírusu HIV. Presnejšie povedané, antigénmi použitými na imunizáciu sú nasledujúce peptidy so 6, 9 a 16 aminokyselinami zodpovedajúce oblastiam týchto proteínov zodpovedných za ich interakciu s mRNA (pre tat a rev), alebo za dimerizáciu RNA (pre NCP7):
- peptid tat: RKKRRQRRR
- peptid rev: RQARRNRRRRWRERQR
- peptid NCP7: RAPRKK
Po imunizácii myší týmito peptidmi, klasickými technikami imunológie, sa extrahujú z myší sleziny a cDNA sa pripraví z mRNA, cDNA kódujúce variabilné oblasti sa potom klonujú, čo vedie k zostaveniu banky fágov exprimujúcich ScFv, ktorý zodpovedá totalite „repertoáru použitých myší, Intraceluláme protilátky (fragmenty ScFv) rozpoznávajúce peptidy tat, rev a NCP7 sa potom identifikujú a izolujú následnými selekčnými stupňami na báze afinity na stĺpci a na mikrotitračnej platni.
Tieto ScFv sa potom funkčne testujú s cieľom stanoviť ich schopnosť blokovať replikačný cyklus vírusu HIV.
Claims (19)
- PATENTOVÉ NÁROKY1. Sekvencia nukleovej kyseliny obsahujúca gén kódujúci intracelulámy väzbový protein pod kontrolou promótora, ktorý je funkčný v bunkách cicavcov, vyznačujúca sa tým, že a) intracelulámy väzbový proteín je peptid zahrnujúci aspoň jeden peptid zodpovedajúci väzobnému miestu variabilnej oblasti ľahkého reťazca protilátky spojenému peptidovým linkerom k peptidu zodpovedajúcemu väzobnému miestu variabilnej oblasti ťažkého reťazca protilátky, b) intracelulámy väzbový protein je peptid namierený proti onkogénu alebo proti faktoru v signálnej ceste onkogénu.
- 2. Sekvencia nukleovej kyseliny podľa nároku 1, vyznačujúca sa tým, že kóduje peptid namierený proti produktu expresie ras onkogénu.
- 3. Sekvencia nukleovej kyseliny obsahujúca sekvenciu SEQ ID NO: 1 alebo jej časť.
- 4. Sekvencia nukleovej kyseliny podľa nároku 1, vyznačujúca sa tým, že kóduje peptid namierený proti proteínu GAP.
- 5. Sekvencia nukleovej kyseliny obsahujúca sekvenciu SEQ ID NO: 2 alebo jej časť.
- 6. Sekvencia nukleovej kyseliny podľa nároku 1, vyznačujúca sa tým, že kóduje peptid namierený proti proteínu p53.
- 7. Sekvencia nukleovej kyseliny podľa nároku 1, vyznačujúca sa tým, že kóduje peptid namierený proti mutantnému proteínu p53.
- 8. Sekvencia nukleovej kyseliny podľa jedného z nárokov laž 7, vyznačujúca sa tým, že promótor, ktorý je funkčný v cicavčích bunkách je vybraný z vírusových, bunkových alebo umelých promótorov.
- 9. Sekvencia nukleovej kyseliny podľa jedného z nárokov laž7, vyznačujúca sa tým, že je vložená do vektora.
- 10. Sekvencia nukleovej kyseliny podľa nároku 9, vyznačujúca sa tým, že je vložená do vírusového vektora.
- 11. Defektný rekombinantný vírus zahrnujúci vo svojom genóme sekvenciu nukleovej kyseliny podľa jedného z nárokov 1 až 8.
- 12. Defektný rekombinantný vírus podľa nároku 11, vyznačujúci sa tým, že je vybraný z retrovírusov, adenovírusov, adenoasociovaných vírusov, vírusu vakcinie a HSV vírusu.
- 13. Defektný rekombinantný vírus, vyznačujúci sa tým, že obsahuje vo svojom genóme sekvenciu nukleovej kyseliny zahrnujúcu aspoň gén kódujúci intracelulámu protilátku namierenú proti onkogénu alebo proti faktoru v signálnej ceste onkogénu a zahrnujúcu aspoň jeden peptid zodpovedajúci väzobnému miestu variabilnej oblasti ľahkého reťazca protilátky spojený peptidovým linkerom k peptidu zodpovedajúcemu väzobnému miestu variabilnej oblasti ťažkého reťazca protilátky.
- 14. Defektný rekombinantný vírus podľa nároku 13, vyznačujúci sa tým, že onkogén je vybraný z onkogénov myc, myb, ras, fos, jun a erb.
- 15. Defektný rekombinantný vírus podľa nárokov 13 alebo 14, v y z n a č u j ú c i sa tým, že je vybraný z retrovirusov, adenovírusov, adenoasociovaných vírusov, vírusu vakcinie a HSV vírusu.
- 16. Vektor, najmä vírusový vektor, zahrnujúci aspoň dve sekvencie nukleovej kyseliny podľa nároku 1 kódujúci intraceluláme väzbové proteíny namierené proti rozdielnym epitopom jedného alebo viacerých antigénov.
- 17. Farmaceutická kompozícia, vyznačujúca sa tým, že obsahuje aspoň jednu sekvenciu nukleovej kyseliny podľa jedného z nárokov 1 až 8 alebo jeden rekombinantný vírus podľa jedného z nárokov 11 až 16.
- 18. Farmaceutická kompozícia podľa nároku 17, vyznačujúca sa tým, že obsahuje aspoň jednu sekvenciu nukleovej kyseliny podľa jedného z nárokov 1 až 7 vo forme lipozómov alebo komplexu s jadrovými proteínmi, lipidmi alebo dextránom alebo v neupravenej forme.
- 19. Použitie sekvencie nukleovej kyseliny podľa nároku 1 na prípravu farmaceutickej kompozície na liečenie rakovin.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR9307241A FR2706486B1 (fr) | 1993-06-16 | 1993-06-16 | Séquences nucléiques, vecteurs les contenant, compositions pharmaceutiques et utilisations thérapeutiques. |
| PCT/FR1994/000714 WO1994029446A2 (fr) | 1993-06-16 | 1994-06-15 | Proteines intracellulaires de liaison (pil) et leurs utilisations |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| SK156895A3 SK156895A3 (en) | 1996-05-08 |
| SK285169B6 true SK285169B6 (sk) | 2006-07-07 |
Family
ID=9448183
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| SK1568-95A SK285169B6 (sk) | 1993-06-16 | 1994-06-15 | Sekvencie nukleových kyselín, vektory tieto sekvencie nukleových kyselín obsahujúce, farmaceutické kompozície a ich terapeutické použitie |
Country Status (24)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6159947A (sk) |
| EP (1) | EP0703980B1 (sk) |
| JP (1) | JP4384260B2 (sk) |
| KR (1) | KR100342233B1 (sk) |
| CN (1) | CN1076052C (sk) |
| AT (1) | ATE231916T1 (sk) |
| AU (1) | AU7076394A (sk) |
| BR (1) | BR9407512A (sk) |
| CA (1) | CA2165458C (sk) |
| CZ (1) | CZ289039B6 (sk) |
| DE (1) | DE69432075T2 (sk) |
| DK (1) | DK0703980T3 (sk) |
| ES (1) | ES2191031T3 (sk) |
| FI (1) | FI120311B (sk) |
| FR (1) | FR2706486B1 (sk) |
| HU (1) | HU219138B (sk) |
| NO (1) | NO319466B1 (sk) |
| NZ (1) | NZ268038A (sk) |
| PL (1) | PL180760B1 (sk) |
| RU (1) | RU2218400C2 (sk) |
| SK (1) | SK285169B6 (sk) |
| UA (1) | UA46709C2 (sk) |
| WO (1) | WO1994029446A2 (sk) |
| ZA (1) | ZA944303B (sk) |
Families Citing this family (22)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US8003342B1 (en) | 1990-04-18 | 2011-08-23 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Method for identifying farnesyl transferase inhibitors |
| US6790633B1 (en) * | 1990-04-18 | 2004-09-14 | Michael S. Brown | Method of inhibiting a farnesyl transferase enzyme |
| FR2724320B1 (fr) | 1994-09-13 | 1996-12-20 | Transgene Sa | Nouvel implant pour le traitement des maladies acquises |
| US5518042A (en) * | 1994-09-16 | 1996-05-21 | Huyck Licensco, Inc. | Papermaker's forming fabric with additional cross machine direction locator and fiber supporting yarns |
| FR2738151B1 (fr) * | 1995-09-04 | 1997-09-26 | Rhone Poulenc Rorer Sa | Antagonistes de l'activite oncogenique de la proteine mdm2, et leur utilisation dans le traitement des cancers |
| US7008776B1 (en) * | 1996-12-06 | 2006-03-07 | Aventis Pharmaceuticals Inc. | Compositions and methods for effecting the levels of high density lipoprotein (HDL) cholesterol and apolipoprotein AI very low density lipoprotein (VLDL) cholesterol and low density lipoprotein (LDL) cholesterol |
| KR100516561B1 (ko) | 1996-12-06 | 2005-09-22 | 아벤티스 파마슈티칼스 인크. | 사람 리파제-유사 유전자에 의해 암호화된 폴리펩타이드, 조성물 및 방법 |
| FR2758569B1 (fr) * | 1997-01-20 | 1999-04-02 | Centre Nat Rech Scient | Materiel biologique pour le traitement d'un mammifere par transfert de gene d'anticorps et composition pharmaceutique le concernant |
| AU3604800A (en) * | 1999-02-26 | 2000-09-14 | Mindset Biopharmaceuticals (Usa) Ltd. | Method for regulating the stability of recombinant proteins, and antibodies and products useful therein |
| FR2794771B1 (fr) | 1999-06-11 | 2001-08-10 | Aventis Pharma Sa | Adenovirus recombinants codant pour le transporteur specifique de l'iode (nis) |
| KR100811571B1 (ko) | 2000-03-31 | 2008-03-10 | 아벤티스 파마슈티칼스 인크. | 핵 인자 κＢ 유도 인자 |
| GB0018307D0 (en) | 2000-07-26 | 2000-09-13 | Aventis Pharm Prod Inc | Polypeptides |
| WO2002086096A2 (en) * | 2001-01-23 | 2002-10-31 | University Of Rochester Medical Center | Methods of producing or identifying intrabodies in eukaryotic cells |
| WO2012162628A2 (en) | 2011-05-25 | 2012-11-29 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Lipopeptide inhibitors of ras oncoproteins |
| KR101602876B1 (ko) | 2014-07-22 | 2016-03-11 | 아주대학교산학협력단 | 완전한 이뮤노글로불린 형태의 세포질 침투능을 갖는 항체를 이용하여 세포내 활성화된 ras를 억제하는 방법 및 그의 이용 |
| KR101602870B1 (ko) | 2014-07-22 | 2016-03-21 | 아주대학교산학협력단 | 완전한 이뮤노글로불린 형태의 항체를 세포막을 투과하여 세포질에 위치시키는 방법 및 그의 이용 |
| US20180072815A1 (en) | 2014-10-23 | 2018-03-15 | Singh Biotechnology, Llc | Single Domain Antibodies Directed Against Intracellular Antigens |
| CA2962275C (en) * | 2014-10-23 | 2019-11-05 | Singh Biotechnology, Llc | Single domain antibodies directed against intracellular antigens |
| TWI746473B (zh) | 2015-11-02 | 2021-11-21 | 美商辛分子醫藥有限公司 | 針對細胞內抗原之單域抗體 |
| US11155641B2 (en) | 2016-05-27 | 2021-10-26 | Orum Therapeutics Inc. | Cytosol-penetrating antibody and use thereof |
| KR20190143826A (ko) | 2018-06-21 | 2019-12-31 | 오름테라퓨틱 주식회사 | 세포/조직 특이적 세포 침투 항체 |
| CN110981943B (zh) * | 2019-12-02 | 2021-08-03 | 清华大学 | 多肽及其在制备药物中的用途和药物 |
Family Cites Families (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4946778A (en) * | 1987-09-21 | 1990-08-07 | Genex Corporation | Single polypeptide chain binding molecules |
| DE3915952A1 (de) * | 1989-05-12 | 1990-12-06 | Peter Werner | Wirkstoff/medikament/biotechnologisches verfahren zur behandlung von erkrankungen, die mit exo- oder endogenen intrazellulaeren proteinen (onkogene etc.) assoziert sind |
| JPH06503714A (ja) * | 1990-09-25 | 1994-04-28 | ユニバーシティ オブ コネチカット | 細胞内に導入されたポリヌクレオチドの長時間発現 |
| CA2072249C (en) * | 1991-06-28 | 2003-06-17 | Saiko Hosokawa | Human monoclonal antibody specifically binding to surface antigen of cancer cell membrane |
| JP3512795B2 (ja) * | 1991-09-30 | 2004-03-31 | アメリカ合衆国 | 組換免疫毒素 |
| CA2125396A1 (en) * | 1991-12-10 | 1993-06-24 | Wayne A. Marasco | Reactive neutralizing human anti-gp 120 recombinant antibody, dna coding the same and use thereof |
| DE69334095T2 (de) * | 1992-07-17 | 2007-04-12 | Dana-Farber Cancer Institute, Boston | Verfahren zur intrazellulären Bindung von zielgerichteten Molekülen |
-
1993
- 1993-06-16 FR FR9307241A patent/FR2706486B1/fr not_active Expired - Lifetime
-
1994
- 1994-06-15 WO PCT/FR1994/000714 patent/WO1994029446A2/fr active IP Right Grant
- 1994-06-15 EP EP94919711A patent/EP0703980B1/fr not_active Expired - Lifetime
- 1994-06-15 UA UA95125274A patent/UA46709C2/uk unknown
- 1994-06-15 US US08/564,164 patent/US6159947A/en not_active Expired - Lifetime
- 1994-06-15 DK DK94919711T patent/DK0703980T3/da active
- 1994-06-15 HU HU9503615A patent/HU219138B/hu not_active IP Right Cessation
- 1994-06-15 AU AU70763/94A patent/AU7076394A/en not_active Abandoned
- 1994-06-15 KR KR1019950705716A patent/KR100342233B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1994-06-15 CZ CZ19953295A patent/CZ289039B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1994-06-15 JP JP50143495A patent/JP4384260B2/ja active Active
- 1994-06-15 NZ NZ268038A patent/NZ268038A/en not_active IP Right Cessation
- 1994-06-15 ES ES94919711T patent/ES2191031T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1994-06-15 SK SK1568-95A patent/SK285169B6/sk not_active IP Right Cessation
- 1994-06-15 CN CN94192443A patent/CN1076052C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1994-06-15 PL PL94312213A patent/PL180760B1/pl not_active IP Right Cessation
- 1994-06-15 DE DE69432075T patent/DE69432075T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1994-06-15 BR BR9407512A patent/BR9407512A/pt not_active Application Discontinuation
- 1994-06-15 AT AT94919711T patent/ATE231916T1/de active
- 1994-06-15 CA CA2165458A patent/CA2165458C/fr not_active Expired - Fee Related
- 1994-06-15 RU RU96100240/13A patent/RU2218400C2/ru not_active IP Right Cessation
- 1994-06-16 ZA ZA944303A patent/ZA944303B/xx unknown
-
1995
- 1995-12-11 NO NO19955011A patent/NO319466B1/no not_active IP Right Cessation
- 1995-12-15 FI FI956057A patent/FI120311B/fi not_active IP Right Cessation
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| SK285169B6 (sk) | Sekvencie nukleových kyselín, vektory tieto sekvencie nukleových kyselín obsahujúce, farmaceutické kompozície a ich terapeutické použitie | |
| EP0690132B1 (en) | Anti-hiv monoclonal antibody | |
| KR101944263B1 (ko) | 에이치비브이 감염 및 관련 질병의 치료를 위한 폴리펩타이드 및 항체 | |
| JPH11507640A (ja) | Ｒｓｖ ｆ−タンパク質に特異的な高親和性ヒトモノクローナル抗体 | |
| JP2009159988A (ja) | 細胞内の物質移送のための抗体から誘導されたベクター | |
| JP2005511047A (ja) | 潜伏期膜タンパク質に対する抗体およびそれらの使用 | |
| WO2002085946A1 (en) | Bispecific antibodies that bind trail-r1 and trail-r2 | |
| KR100304333B1 (ko) | 재조합의사람화된항-사람면역결핍바이러스항체 | |
| US10689434B2 (en) | Antibody against hepatitis B surface antigen and use thereof | |
| KR20170110681A (ko) | Pcsk9 항체, 및 약제학적 조성물 및 이의 용도 | |
| JP4371178B2 (ja) | 抗ｐ５３一本鎖抗体フラグメント及びその使用 | |
| CN118255888A (zh) | 一种Anti-CXCR4膜蛋白抗体及其制备方法和应用 | |
| EP1002864A1 (en) | HIgR and related V domain for the manufacture of a medicament for preventing or treating HSV-1, HSV-2 and BHV infections | |
| WO2022127066A1 (zh) | 一种特异性中和辅助性T细胞TGF-β信号的双特异性抗体、其药物组合及其用途 | |
| CN115160435A (zh) | 一种双特异性抗hiv-1抗体 | |
| AU722702B2 (en) | Intracellular binding proteins and use thereof | |
| WO2017211278A1 (en) | Antibody fusion proteins for drug delivery | |
| EP2552958B1 (en) | Monoclonal antibody directed against the p17 protein of hiv, capable of neutralising the binding of p17 to the p17 receptor (p17r) |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | Patent lapsed due to non-payment of maintenance fees |
Effective date: 20130615 |